Brevet FR2940087A1 — publié le 20100625

La présente demande concerne des érythrocytes contenant du facteur VIII, leur préparation et leurs utilisations, notamment pour le traitement de l'hémophilie. L'hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire, liée â une anomalie du chromosome X, à transmission récessive liée au sexe. Cette pathologie a pour origine des mutations sur les gènes de protéine intervenant dans la coaagulati_on et se traduit donc par une incapacité à coaguler chez les personnes atteintes. Il en existe deux variétés. soit un déficit en facteur VIII, soit un déficit en facteur IX. L'hémophilie A est causée par la déficience en facteur VIII et reste la plus commune des déficiences affectant la coagulation sanguine : elle touche en. France 1 homme sur 5000, et représente 80% des patients atteints d°hémophilie. L'hémophile B, causée par une déficience en facteur IX, touche 20% des patients atteints d'hémophilie. Le traitenient actuel de l'hémophilie de type A ou. B connsiste à administrer par voie intraveineuse le facteur de coagulation déficient ou manquant. Le facteur VIII joue un rôle central dans la coagulation. Activé par la thrombine, il devient le catalyseur de la réaction d'activation du facteur X par le facteur IX activé, en présence d'ion calcium et de phospholipides. La réaction d'activation du facteur X est accélérée environ 200 000 fois en présence du facteur VIII. Le facteur X activé acquiert une activité catalytique qui lui permet de transformer la prothrombine en thrombine. Celle-ci dégrade le fibrinogène en fibrine. Le caillot ainsi formé sera stabilisé par le facteur XIII, ce qui permet l'arrêt du saignement. Dans le plasma, le facteur VIII circule sous forme d'un dimère stabilisé par le facteur de Von WILLEBRAND. La source principale du facteur VIII semble être le foie (Leon et al, 1981, Blood). Cependant l'augmentation du taux de facteur VIII dans les insuffisances hépatocellulaire, suppose d'autres sources. Ceci a pu être confirmé par la mise en évidence de l'ARNm de ce facteur au niveau d'autres organes, en particulier, le rein, la rate et au niveau des lymphocytes (Wion, 1985, Nature). L'ADN codant pour le Facteur Vlll a Maté isolé et exprimé dans des cellules de mammifères (Wood et e, 1984. Nature), et sa séquence en acides aminés déduite à partir de l'ADNc. Son gène est localisé sur l'extrémité distale du bras long du chromosome X. Il a une longueur de 186 000 paires de bases (bp), ce qui représente 0,1 % du chromosome X. L'ADN codant pour l'ARNm est constituée de 26 exons contenant 69 à 3 106 bp. Les 25 introns se répartissent entre 207 à 32 400 bp. Le Facteur VIII sécrété est, une glycoprotéine de niasse moléculaire de 300 Kda (2332 acides aminés). L'analyse de la molécule facteur VIII montre qu'elle est constituée de trois domaines distincts A, B, C, de l'extrémité 1N-terminale à l'extrémité C-tern hale (Bihoreau et al, 1992, Med. Sciences ; Philip et al, 1993, Thrombosis and Haemostasie ; White et al, 1989, Blood). Le domaine A est constitué de trois segments Al, A2, A3 :Al (résidus 1-372), A2 (résidus 373-740), A3 (résidus 1649-2019). Le domaine B (résidus 741-1648) est unique. Le domaine C est constitué de deux segments Cl, C2 d'environ 150 acides aminés chacun : Cl (résidus 2020-2172) et C2 (résidus 21732332). La séquence des différents domaines à partir de l'extrémité amino-terminale est Al-A2-B-A3-C 1-C2. Il existe des homologies de structure entre, les domaines A du facteur VIII et celle du facteur V (30 à 40 %) et la céruloplasmine. Plusieurs serines protéases peuvent activer le facteur VIII (Bihoreau et al, 1992, Med. Sciences , Pittman et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.l. Apres sécrétion, le facteur VIII interagit avec le facteur ion Willebrand (VWF) qui le protège des protéases plasmatiques. C'est sous cette forme que le facteur Viii circule dans le sang. Le facteur VllI se dissocie du VWF après clivage par la thrombine. Ce clivage aboutit, à l'élimination du domaine B et à l'activation du facteur '[ll sous la forme d'an hétérodirnére. Cet hetérodimére est constitue d'une chaîne lourde (Al, A2) et d'une chaîne légère (A3, Cl, C2). Lorsqu'il est perfusé à un patient hémophile, le facteur VIII se fixe sur le VWF dans la circulation sanguine du patient. Depuis longtemps, le traitement des hémophiles est basé sur l'utilisation de produits plasmatiques. La production de facteur VIII recombinant a permis de produire une molécule dépourvue de tous risques infectieux. Son efficacité hémostatique a été démontrée chez de nombreux patients (Bihoreau et al, 1992, Med. Sciences ; Brinkhous, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. ; Kaplan, 1993, Med. Sciences ; White et al, 1989, Blood). En France, le facteur VIII destine au traitement des hémophiles est désormais disponible sous fbrane de médicament dérivé du sang ainsi que sous forme de médicament recombinant, comprenant du facteur Viii produit par génie génétique. Ces traitements solit administrés par voir in_t_raveineuse. Ugine difficulté réside néanmoins dans la formulation du facteur Vlll et dans sa durée d'action in vivo, qui nécessitent des préparations el des admini_suations répélée,s. La présente invention propose un nouveau mode d'administration du facteur VIII. Plus précisément, la présente invention propose d'encapsuler le facteur VIII dans des érythrocytes, et d'administrer les érythrocytes à des patients ayant besoin d'un traitement par le facteur VIII. La présente demande montre qu'il est possible d'encapsuler une protéine aussi volumineuse que le facteur VIII dans des érythrocytes, et que les érythrocytes sont capables de libérer le facteur VIII actif in vivo. L'invention offre ainsi une nouvelle approche avantageuse pour l'administration de facteur VIII. Un objet de l'invention réside donc dans un érythrocyte caractérisé en ce qu'il contient du facteur VIII ajouté, également désigné érythrocyte � chargé � en facteur VIII. Un autre objet de l'invention réside dans une suspension cellulaire comprenant des érythrocytes tels que définis ci-dessus. Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un érythrocyte tel que défini ci-dessus et un support ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Un autre objet de l'invention concerne une poche souple pour perfusion comprenant des érythrocytes ou une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'érythrocytes tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une composition pour la délivrance de facteur VIII à des patients ayant besoin de facteur VIII, notamment des patients hémophiles. Un autre objet de l'invention réside dans des érythrocytes tels que définis ci-dessus pour 5 la délivrance de facteur VIII à des patients hémophiles. Un autre objet de l'invention concerne une méthode d'administration de facteur VIII à un sujet, comprenant l'encapsulation in vitro ou in vivo de facteur VIII dans des érythrocytes et l'administration des érythrocytes au sujet. Un autre objet de l'invention réside dans une méthode pour fournir du facteur VIII à un 10 sujet, notamment un patient hémophile, la méthode comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité efficace d'érythrocytes tels que définis ci-dessus. L'invention concerne également un procédé de préparation d'érythrocytes chargés en facteur VIII, comprenant le traitement perméabilisant in vitro ou ex vivo d'érythrocytes en présence de facteur VIII, et la récolte d'érythrocytes ayant encapsulé du facteur VIII. 15 L'invention propose une nouvelle approche pour la délivrance de facteur VIII in vivo. Au sens de l'invention, on entend par facteur VIII une protéine biologiquement active telle que définie précédemment, c'est-à-dire notamment une protéine capable de catalyser l'activation du facteur X. Il peut s'agir d'une protéine naturelle (plasmatique) 20 ou d'une protéine recombinante. Par ailleurs, le facteur VIII peut être libre ou sous forme complexée, notamment au vWF. On utilise de préférence une protéine d'origine humaine. Néanmoins, toute protéine mammifère ou tout variant ou analogue du facteur VIII peut être administré selon la méthode de la présente invention. 25 L'utilisation d'érythrocytes pour véhiculer des principes actifs a déjà été proposée dans la littérature. Ainsi notamment, la demande W02007/042647 propose d'encapsuler du 5-FU et la demande W02006/114691 propose d'encapsuler de l'arginine déiminase. Millan et al., Journal of Controlled Release 95, 2004 : 27-49, rapporte par ailleurs différentes études visant à encapsuler des agents anti-cancéreux dans des érythrocytes. Cependant, les travaux réalisés jusqu'à présent portent principalement sur l'encapsulation de petites molécules et non de protéines de structure complexe et de haut poids moléculaire. Par ailleurs, comme souligné par Labrude et al. (1985 Lyon Pharmaceutique 1985, 36, 4 : 181- 187), l'utilisation d'érythrocytes pour délivrer des principes actifs nécessite la réalisation d'études spécifiques pour chaque molécule candidate, pour évaluer (i) la capacité des érythrocytes à servir de véhicule, (ii) développer une méthode d'encapsulation et (iii) vérifier la libération appropriée in vivo. La présente invention propose pour la première fois d'encapsuler une protéine de haut poids moléculaire dans des érythrocytes, le facteur VIII. L'invention propose différentes approches pour la production de ces érythrocytes et pour la libération du facteur VIII in vivo. L'invention permet ainsi d'offrir une nouvelle solution pour la fourniture de facteur VIII aux patients, notamment dans le cadre du traitement de l'hémophilie. Un objet de l'invention réside donc dans un érythrocyte contenant du facteur VIII ajouté. Au sens de l'invention, le terme facteur VIII � ajouté � désigne le fait qu'il s'agit de facteur VIII introduit dans la cellule, mais pas de facteur VIII produit de manière endogène et naturelle par l'érythrocyte. Par ailleurs, le terme "contenant" désigne le fait que le facteur VIII est présent à l'intérieur de la cellule, soit sous forme libre soit sous forme liée à une membrane. Pour la mise en oeuvre de l'invention, on peut utiliser des érythrocytes d'origine variée, de préférence de mammifère, tout particulièrement des érythrocytes humains. Il peut s'agir d'érythrocytes autologues (c'est-à-dire obtenus à partir du patient auquel le traitement est destiné), allogéniques (de la même espèce, mais non autologues) ou xénogéniques (d'une espèce différente de celle du patient). Le facteur VIII peut être encapsulé dans les érythrocytes selon différentes techniques. Ainsi, les érythrocytes de l'invention sont typiquement obtenus en soumettant in vitro ou ex vivo des érythrocytes à un traitement perméabilisant en présence de facteur VIII, suivi de la récupération des érythrocytes chargés. Le traitement perméabilisant peut être suivi d'un traitement renaturant, le cas échéant. Le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre par dilution Presswell ou, de préférence, par un procédé de lyse/rescellement. La technique de lyse-rescellement a été décrite dans plusieurs brevets antérieurs, et notamment dans les demandes n° EP882 448, EP101341, EP679101, ou EP1773452. Selon ce procédé, on soumet des érythrocytes à un choc osmotique, induisant leur lyse au moins partielle, puis à un traitement de reconstitution (� rescellement �), en présence de l'agent actif. Ainsi, dans un mode particulier de réalisation, les érythrocytes chargés en facteur VIII 10 selon l'invention sont préparés par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique ; b) lyse des érythrocytes dans une solution hypotonique ; c) rescellement des érythrocytes dans une solution hypertonique, en présence de facteur VIII ; et 15 d) récolte comprenant d'érythrocytes chargés en facteur VIII, généralement sous forme d'une suspension. Le facteur VIII peut être ajouté à la suspension à l'étape a), b) ou c). Avantageusement, l'ensemble du procédé est réalisé à une température inférieure à 10°C. Dans un mode de 20 mise en oeuvre particulier, le procédé est réalisé dans une unité de dialyse en continu. Par ailleurs, le procédé peut comprendre une étape supplémentaire de mesure de la fragilité osmotique des érythrocytes, afin d'ajuster les paramètres de la lyse. Dans un mode de mise en oeuvre particulier, on introduit en continu la suspension d'érythrocytes dans le compartiment primaire d'un élément de dialyse. Le compartiment 25 secondaire est prévu pour contenir une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes. De ce fait, lors du passage des érythrocytes dans le compartiment secondaire, les érythrocytes sont lysés. On induit ensuite le rescellement des érythrocytes, en présence du facteur VIII, en augmentant la pression osmotique, de préférence dans un autre compartiment. Les érythrocytes ainsi chargés en facteur VIII peuvent ensuite être récupérés, sous forme de suspension. Le culot globulaire mis en oeuvre est avantageusement un culot déleucocyté et dépourvu de pathogène. Il peut en outre avoir été irradié. Dans un mode préféré, le culot globulaire initial a été traité pour être enrichi en érythrocytes, voire pour éliminer tout composant sanguin autre que les érythrocytes. Ce traitement peut consister par exemple en un lavage en présence d'une solution saline ou de conservation, éventuellement en présence du facteur VIII. De préférence, on utilise dans le procédé un culot globulaire dont le groupe sanguin est 10 compatible avec le receveur, lorsque ce dernier est identifié. La lyse des érythrocytes est réalisée au moyen d'une solution saline hypotonique par rapport à la suspension de l'étape a). Il peut s'agir par exemple d'une solution ayant une osmolarité comprise entre 40 et 150 mOsm, de préférence entre 60 et 120 mOsm. L'étape de rescellement est avantageusement réalisée par ajout d'une solution 15 hypertonique à la suspension lysée et, de préférence, chauffage jusqu'à une température comprise entre 25°C et 42°C, plus préférentiellement entre 35°C et 40°C, pendant une période de temps comprise entre quelques minutes et quelques heures, typiquement moins de 2h. Les érythrocytes obtenus peuvent être lavés, par exemple en présence d'une solution saline, notamment pour éliminer les débris cellulaires ou les cellules 20 incorrectement reconstituées. Le procédé peut en outre comprendre une ou des étapes supplémentaires de traitement ou conditionnement des érythrocytes pour faciliter ou adapter la libération ultérieure du facteur VIII in vivo. Cette ou ces étapes peuvent être réalisées de manière préalable, concomitante ou postérieure au procédé d'encapsulation, notamment aux étapes a)-d) 25 ci-dessus. Compte tenu de la taille importante du facteur VIII, sa libération à partir des érythrocytes chargés de l'invention peut en effet être augmentée ou mieux contrôlée en modifiant les érythrocytes. Ainsi, le profil de libération du facteur VIII selon l'invention peut être modifié par un traitement dénaturant des érythrocytes, permettant de provoquer une libération massive ou graduelle du facteur VIII. Dans un mode de réalisation particulier, les érythrocytes de l'invention sont traités, avant, pendant ou après l'encapsulation, de manière à favoriser leur reconnaissance et leur destruction par les macrophages. Ce type de traitement entraîne une libération plus rapide du facteur VIII in vivo. Le traitement peut être chimique ou physique. Par exemple, les érythrocytes peuvent être traités par le glutaraldéhyde ou la neuraminidase, comme décrit dans e.g., Millan et al., supra. En variante, les érythrocytes peuvent être soumis à un traitement dénaturant thermique à une température comprise par exemple entre 40°C et 65°C. Dans un autre mode de réalisation, qui peut éventuellement être combiné avec le précédent, les érythrocytes de l'invention sont traités, avant, pendant ou après l'encapsulation, de manière à exprimer ou sur-exprimer un antigène du rhésus D. Les érythrocytes ainsi obtenus sont en effet sensibles ou plus sensibles in vivo à une lyse par des anticorps anti-Rhésus D. Les érythrocytes chargés de l'invention peuvent être conservés dans différentes solutions adaptées, telles que des solutions de conservation de globule rouge, des solutions salines, etc., de préférence à une température comprise entre 1 et 10°C. Le taux d'hématocrite final du produit est de préférence compris entre 40 et 70%. De préférence, les érythrocytes de l'invention sont conservés sous forme de suspension en présence dans une solution saline adaptée (par exemple NaCl éventuellement supplémenté de mannitol ou de glucose), contenant le cas échéant d'autres agents conservateurs, stabilisants. La quantité de facteur VIII encapsulée peut être adaptée par l'homme du métier. Elle correspond de préférence à la quantité adaptée pour qu'une composition ou poche selon l'invention contienne une dose correspondant à une prescription médicale du facteur VIII. Par ailleurs, les érythrocytes de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs autres principes actifs, ou être utilisés en mélange avec d'autres principes actifs. Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un érythrocyte tel que défini ci-dessus et un support ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Le véhicule est avantageusement choisi parmi des solutions salines, stériles, de préférence isotoniques, éventuellement supplémentées de différents agents conservateurs. Dans un mode particulier, les compositions sont sous forme lyophilisée, remise en solution juste avant administration. Un autre objet de l'invention concerne une poche souple pour perfusion comprenant des érythrocytes ou une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'érythrocytes tels que définis ci-10 dessus pour la préparation d'une composition pour la délivrance de facteur III à des patients ayant besoin de facteur VIII, notamment des patients hémophiles. Un autre objet de l'invention réside dans des érythrocytes tels que définis ci-dessus pour la délivrance de facteur VIII à des patients hémophiles. Un autre objet de l'invention concerne une méthode d'administration de facteur VIII à 15 un sujet, comprenant l'encapsulation in vitro ou in vivo de facteur VIII dans des érythrocytes et l'administration des érythrocytes au sujet. Un autre objet de l'invention réside dans une méthode pour fournir du facteur VIII à un sujet, notamment un patient hémophile, la méthode comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité efficace d'érythrocytes tels que définis ci-dessus. 20 Les compositions de l'invention sont particulièrement adaptées à une administration systémique, de préférence par voie intraveineuse, par injection ou perfusion. Lorsque les érythrocytes utilisés sont autologues, le traitement comprend avantageusement une étape préalable de prélèvement de sang du patient, d'obtention d'un culot globulaire, de préparation du médicament comme décrit ci-dessus, et de réinfusion. Typiquement, les 25 compositions de l'invention comprennent un volume ou un nombre d'érythrocytes chargés suffisant pour fournir au patient la dose requise de facteur VIII, c'est-à-dire une dose comprise entre 10 et 200 UI de protéine par jour et par kg de poids corporel. Les administrations peuvent être répétées, selon le protocole thérapeutique approprié au patient. Dans une variante particulière de mise en oeuvre, la méthode de l'invention comprend en outre un étape d'administration d'un anticorps anti-Rhésus D. En effet, les érythrocytes expriment l'antigène Rhésus D et l'administration de tels anticorps permet d'accroitre la vitesse de libération in vivo. La co-administration d'anticorps anti-Rhésus D permet ainsi de contrôler le profil de libération du facteur VIII in vivo. De plus, comme indiqué précédemment, il est possible dans une variante particulière de l'invention de modifier les érythrocytes de l'invention pour qu'ils sur-expriment un antigène Rhésus D, de manière à accroitre encore leur sensibilité aux anticorps anti-Rhésus D. Un objet particulier de l'invention réside donc dans une méthode pour fournir du facteur VIII à un sujet, notamment un patient hémophile, la méthode comprenant l'administration au dit sujet d'une quantité efficace d'érythrocytes tels que définis ci-dessus et d'un anticorps anti-Rhésus D. L'anticorps anti-Rhésus D peut être administré avant, pendant ou après l'administration des érythrocytes, de préférence pendant et/ou après. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant des érythrocytes tels que définis ci-dessus et un anticorps anti-Rhésus D, en vue d'une administration sous forme groupée ou séparée, simultanée ou espacée dans le temps. REFERENCES BIHOREAU N., Le facteur VIII (anti-hémophilique A) recombinant : relation structure/ fonction. Médecine, Sciences, 1992, 8, 1043-1050. BRINKHOUS K.M., Purifed human factor VIII procoagulant protein : comparative hemostatic response after infusions into hemophilic and Von WILLEBRAND disease dogs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, 82, 8752-8756. 10 KAPLAN J.C., DELPECH M, Biologie moléculaire et médecine, de la biologie à la clinique. Ed. Médecine, Sciences, Flammarion, 2ème édition 1993. LEON W., HOYER., The factor VIII complex : structure and function. Blood, 1981, 15 vol. n° 1, (july), 1-13. PHILIP J., FAY; Factor VIII : structure and function. Thrombosis and Haemostasis, 1993, 70 (1), 63-67. 20 PITTMAN D.D., KAUFMAN R.J., Proteolytic requirements for thrombin activation of antihemophilic factor (factor VIII). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 2429-2433. WHITE C., SHOEMAKER C.B., Factor VIII gene and haemophilia A. Blood 1989, vol. 73, n° 1, 1-12. WION K.L., KELLY D., Distribution of factor VIII mRNA and antigen in human liver and other tissues. Nature, 1985, 317-326. 25 30 REVENDICATIONS1. Erythrocyte caractérisé en ce qu'il contient du facteur VIII. 2. Erythrocyte selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est obtenu par traitement pennéabilisant ex vivo ou in vitro d'un érythrocyte en présence de facteur VIII dans des conditions permettant l'encapsulation du facteur VII! dans l'érythrocyte. 3. Erythrocyte selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est modifié ou traité pour faciliter ou adapter la libération ultérieure du facteur VIII in vivo. 4. Erythrocyte selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est soumis à un traitement dénaturant permettant de provoquer une libération massive ou graduelle du facteur V111. 5. Erythrocyte selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est modifié pour exprimer ou sur-exprimer un antigène du rhésus D. 6. Erythrocyte selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en cc qu'il 20 s'agit d'un érythrocyte humain. 7. Erythrocyte selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le facteur VIII est un facteur VIII humain. 25 8. Composition pharmaceutique comprenant un érythrocyte selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et un support ou excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. 9. Composition selon la revendication 8, ou érythrocyte selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour le traitement de l'hémophilie. 10. Utilisation d'érythrocytes selon l'une des revendications 1 à 7 pour préparation d'une composition pour la délivrance de facteur VIII à des patients hémophiles. 5 15I l . Utilisation selon la revendication 10, comprenant en outre une étape de traitement in vitro des érythrocytes permettant d'augmenter la lyse in vivo des érythrocytes contenant du facteur VIII. 12. Procédé de préparation d'érythrocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant le traitement perméabilisant in vitro ou ex vivo d'érythrocytes en présence de facteur VIII, et la récolte d'érythrocytes ayant encapsulé du facteur VIII. 10 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le traitement perméabilisant est un traitement par lyse/rescellement. 14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que les érythrocytes sont en outre modifiés pour exprimer un antigène du Rhésus D. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que les érythrocytes sont soumis à un traitement dénaturant destiné à favoriser leur reconnaissance par les cellules érythrophagocytaires. 20