Brevet FR2940112A1 — publié le 20100625

Procédé d'extraction de composés présents au sein d'un matériau végétal par cryobroyage et enzymolyse La présente invention a trait à un nouveau procédé permettant l'extraction de constituants présents dans des matériaux végétaux, qui se révèle notamment adapté pour l'extraction de principes actifs végétaux, en particulier des molécules et macromolécules végétales utiles pour la formulation de compositions cosmétiques. Le procédé de l'invention permet une extraction efficace d'un nombre important des constituants présents dans le matériau végétal et, en particulier, il permet d'accéder à des constituants difficiles à extraire par des méthodes conventionnelles, en particulier ceux emprisonnés au sein des membranes cellulaires ou au sein des parois primaires et secondaires des cellules. Les "matériaux végétaux" dont on extrait les constituants dans le procédé d'extraction de l'invention sont des plantes, des fruits ou des graines ; ou bien des organes ou éléments constitutifs de plantes, fruits ou graines. Il s'agit le plus souvent de plantes, ou bien des organes ou éléments constitutifs de plantes tels que des feuilles, racines, tiges ou fleurs ; ou bien de fruits ou d'éléments constitutifs de fruits. Ces matériaux végétaux peuvent être utilisés dans leur entièreté ou seulement en partie, il peuvent être employés seuls ou en mélange. A l'heure actuelle, il existe différentes méthodes permettant d'extraire des composés, en particulier des molécules ou macromolécules, présentes au sein de tels matériaux végétaux. Typiquement, pour réaliser une extraction de ce type, les matériaux végétaux peuvent être broyés par voie mécanique (le matériau broyé étant ensuite le plus souvent extrait au sein d'un solvant) ou bien, si leur nature le permet, être pressés, ou bien encore être entaillés pour laisser s'écouler le contenu de leurs tissus. Bien que relativement intéressantes pour extraire certains principes actifs végétaux, ces techniques se révèlent limitées, dans la mesure où elles permettent en fait d'extraire un nombre relativement restreint de composés présents dans les matériaux végétaux, aussi bien quantitativement que qualitativement. En particulier, certaines molécules ou macromolécules présentes dans le matériau végétal se révèlent inaccessibles avec ces méthodes. C'est en particulier le cas pour certains composés intimement emprisonnés au sein des végétaux, et pour de nombreux constituants macromoléculaires constitutifs des parois végétales qui sont par nature insolubles, et qui restent de ce fait emprisonnés dans le matériau végétal avec les méthodes précitées. En vue d'accéder à ces composés, qu'un broyage ou pressage classique ne permet pas d'extraire, il a été décrit des techniques plus spécifiques, qui permettent une extraction plus poussée. Dans ce cadre, une première technique qui a été proposée consiste à employer une enzymolyse. Selon cette technique, le matériau végétal dont on souhaite extraire les extraits est mis en présence d'une enzyme propre à hydrolyser les zones des plantes où sont emprisonnés les composés ou principes actifs qu'on souhaite extraire (typiquement, on emploie des enzymes qui sont capables d'hydrolyser les parois cellulaires). Cette technique d'enzymolyse s'avère intéressante pour extraire des composés encapsulés ou emprisonnés dans des zones spécifiques du matériau végétal, et elle présente l'avantage de conduire à une extraction plus poussée des constituants présents, notamment dans la mesure où elle permet d'hydrolyser des macromolécules insolubles (macromolécules constitutives des parois cellulaires par exemple) en des molécules de dimensions plus restreintes, et donc plus aisées à extraire). Cela étant, elle nécessite néanmoins l'emploi d'un solvant (en général de l'eau) à titre de milieu dispersant de l'enzyme, pour permettre d'obtenir l'effet recherché de digestion par l'enzyme des parties de la plante comprenant les principes actifs ou composés à extraire. Elles conduisent de ce fait à des extraits végétaux qui sont nécessairement dilués dans le solvant employé. Pour obtenir des extraits plus concentrés, des étapes de concentration ultérieures s'avèrent nécessaires, qui se traduisent généralement en termes de coûts de procédé (notamment en termes de coûts énergétiques), et qui ne peuvent, dans certains cas, pas être mises en oeuvre sans remettre en cause la stabilité des actifs extraits. Une autre méthode qui a été développée pour effectuer une extraction plus poussée des actifs présents dans des matériaux végétaux consiste à employer des méthodes dites de cryobroyage ou "broyage cryogénique", dans lesquelles on effectue un broyage du matériau végétal à extraire en opérant sur un matériau à l'état congelé (typiquement à des températures inférieures à -18°C). Selon ces techniques, l'action conjointe du froid et du broyage conduit à une fragilisation du matériel végétal qui conduit à une qualité de broyage qui s'avère supérieure à un broyage classique. Cette qualité de broyage accrue s'explique au moins en partie par le fait que la congélation induit un éclatement de certaines structures végétales sous l'effet de la congélation des liquides aqueux qu'elles contiennent ; une rigidification des tissus induisant une friabilité de ces tissus ; et la formation de cristaux solides au sein du matériau végétal, qui sont propres à jouer le rôle d'agents abrasifs lors du broyage. Les techniques d'extraction par cryobroyage permettent, certes, le plus souvent, une extraction plus efficace que les broyages effectués à des températures supérieures à la température de congélation du matériau végétal, mais elle restent néanmoins, elles aussi, relativement limitées et elles permettent d'accéder à un nombre réduit d'actifs. En particulier, elles ne permettent généralement pas d'extraire certains composés présents au sein des parois cellulaires. Un but de la présente invention est de fournir une méthode d'extraction améliorée, permettant d'obtenir une extraction des composés et principes actifs présents au sein d'un matériau végétal plus efficace qu'en utilisant les techniques de broyage et de cryobroyage actuellement connues, et donnant en outre accès à des extraits plus riches en principes actifs que les extraits obtenus selon les techniques d'enzymolyse précitées. A cet effet, la présente invention fournit un nouveau procédé d'extraction de composés et/ou principes actifs présents dans un matériau végétal, dans lequel : (A) le matériau végétal est soumis à un broyage, à une température inférieure à la température de congélation du matériau végétal, ce par quoi on obtient un broyat végétal comprenant des éléments solides au sein d'un milieu liquide ; (B) on ajoute au matériau végétal issu du traitement de l'étape (A) au moins une enzyme propre à lyser tout ou partie des éléments solides présents dans le broyat végétal obtenu. A l'issue de ces étapes, on obtient un milieu liquide qui comprend les composés et/ou principes actifs à l'état dissous ou dispersé, ce milieu liquide pouvant être aisément récupéré, typiquement par une simple filtration et/ou par centrifugation. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé comprend, suite à l'étape (B) une étape (C) où on filtre le milieu obtenu à l'issue de l'étape (B), puis où on centrifuge le filtrat obtenu. Avantageusement, dans ce cas, le surnageant de la centrifugation peut à nouveau être filtré. Le procédé mettant en oeuvre les étapes (A) et (B) spécifiques ci-dessus présente l'avantage de conduire à une extraction particulièrement efficace du matériau végétal, qui permet en particulier d'accéder à la fois au contenu des cellules végétales présentes dans le matériau végétal et au contenu des parois de ces cellules végétales. A ce sujet, les travaux conduits par les inventeurs dans le cadre de la présente invention ont permis de mettre en évidence que l'extraction selon l'invention assure une extraction plus efficace que lorsque l'on met uniquement en oeuvre soit une enzymolyse, soit une extraction par cryobroyage. Sans vouloir être liés par une théorie particulière, les travaux des inventeurs permettent d'avancer que la mise en oeuvre spécifique d'une enzymolyse à la suite d'un cryobroyage, telle qu'elle est mise en oeuvre dans le cadre de la présente invention, permet d'obtenir une enzymolyse plus efficace que dans le cas d'une enzymolyse classique, dans la mesure où le cryobroyage préliminaire permet une rupture mécanique préalable des cellules présentes, ce qui induirait une action plus efficace des enzymes à tous les niveaux du matériau, contrairement au cas d'une enzymolyse plus classique, où certaines zones de la plante restent inaccessibles aux enzymes. On obtient ainsi une efficacité d'extraction poussée qui est susceptible de permettre, au moins dans certains cas, d'accéder à des composés et principes actifs que ne permettent pas d'obtenir ni les méthodes de cryoextraction, ni les méthodes d'enzymolyse, lorsqu'elles sont prises isolément. En outre, le procédé de la présente invention présente l'avantage de pouvoir être conduit en l'absence de solvant, ce qui permet d'obtenir un extrait particulièrement riche en principes actifs et constitué essentiellement des composés de la plante elle-même, non dilués dans un milieu dispersant, contrairement aux extraits obtenus par les techniques usuelles d'enzymolyse. En fait, dans le procédé de la présente invention, l'étape d'enzymolyse nécessite uniquement l'introduction d'enzymes qui n'ont pas besoin d'être mises en milieu solvant, dans la mesure où l'extrait de la plante obtenu par le cryobroyage de l'étape (A) comprend un milieu liquide suffisant pour assurer la dispersion des enzymes. Ainsi, bien qu'il soit envisageable, selon certains modes de réalisation spécifiques, de mettre en oeuvre un solvant dans les étapes (A) et/ou (B), il est le plus souvent préférable que les étapes (A) et (B) (et plus préférentiellement encore l'ensemble des étapes du procédé) soient mises en oeuvre sans ajouter aucun solvant au milieu réactionnel. A cet effet, les enzymes employées dans l'étape (B) sont avantageusement introduites sous forme sèche, et en tout état de cause sous la forme la plus concentrée possible, dans le broyat obtenu à l'issue de l'étape (A). On peut concrètement employer en tant que telles la plupart des enzymes de type commercial, qui se présentent soit sous forme de poudres, soit à l'état concentré dans une faible quantité de milieu dispersant. A noter que, lorsqu'on emploie dans l'étape (B) une enzyme concentrée véhiculée dans un milieu dispersant, la quantité de milieu dispersant introduite dans le milieu d'extraction est négligeable par rapport à la quantité d'extrait obtenue in fine (typiquement, le milieu dispersant introduit représente au plus de l'ordre de 0,5 à 1% en masse dans l'extrait récupéré in fine) et elle est sans commune mesure avec les quantités de solvant qui sont requises lorsqu'on met en oeuvre les méthodes d'enzymolyse de l'état de la technique qui sont conduites sans mettre en oeuvre au préalable l'étape (A) de la présente invention. Lorsque les étapes du procédé de l'invention sont mises en oeuvre sans solvant ajouté, le procédé de l'invention conduit à un extrait particulièrement concentré en composés présents dans le matériau végétal initial ce qui en outre présente l'avantage d'être entièrement naturel. Le procédé de l'invention permet ainsi l'accès à des extraits végétaux riches en principes actifs et dénués de tout solvant propre à les diluer, ce qui constitue un avantage notable en comparaison avec des extraits obtenus par les techniques d'enzymolyse actuellement connues. Un autre avantage notable que présente le procédé de l'invention par rapport aux techniques de broyage et de cryobroyage classiques est qu'il permet une limitation de la quantité de déchets d'extraction (solides résiduels obtenus à l'issue de l'extraction). En effet, dans le cadre du procédé de l'invention, au moins une partie des éléments solides obtenus dans le broyat végétal à l'issue de l'étape (A) sont solubilisés ou hydrolysés dans l'étape (B), ce qui limite in fine la quantité de résidus et limite encore les coûts de production du procédé, ce qui le rend bien adapté à une mise en oeuvre à une échelle industrielle. Le procédé de l'invention présente en outre les avantages inhérents aux techniques de cryobroyage et d'enzymolyse. En particulier, il permet d'obtenir une extraction sans affecter la qualité des composés présents dans le matériau végétal (en effet, le broyage de l'étape (A), conduit à faible température, présente l'avantage de s'affranchir des phénomènes d'échauffement qui pourraient être observés à plus haute température). Par ailleurs, la digestion enzymatique opérée dans l'étape (B) permet quant à elle, entre autres, une hydrolyse de composés macromoléculaires présents dans le matériau végétal, notamment au sein des parois végétales, qui donne accès à des composés de dégradation de ces composés macromoléculaires qui ne seraient pas accessibles par des procédés d'extraction ne mettant pas en oeuvre d'enzymolyse. Notamment de façon à optimiser ces différents avantages, le procédé de l'invention est de préférence mis en oeuvre dans les conditions ci-après. L'étape (A) : Le broyage réalisé dans l'étape (A) peut être conduit selon toute méthode de cryobroyage ou cryoextraction connue en soi. Par exemple, le broyage réalisé peut être conduit en utilisant des dispositifs de type presse, pilon ou broyeur à marteau. L'étape (A) est spécifiquement conduite en plaçant le matériau végétal à une température inférieure à sa température de congélation, et de préférence en conservant le matériau végétal à une température inférieure à sa température de congélation pendant toute la durée de l'étape (A). Pour ce faire, et compte tenu de l'échauffement dû au broyage, il est préférable de conduire l'étape (A) à une température maintenue inférieure d'au moins 5°C à la température de congélation du matériau, et plus préférentiellement inférieure d'au moins 10°C, voire d'au moins 15°C à sa température de congélation. Typiquement, l'étape (A) est conduite en portant le matériau végétal à une température inférieure à -10°C, et plus préférentiellement inférieure ou égale à -18°C. Le matériau végétal est plus avantageusement porté à des températures inférieures, par exemple en le plongeant dans un milieu cryogénique de type azote liquide (-196°C). Selon un mode de réalisation qui se révèle généralement intéressant, l'étape (A) est conduite sur des matériaux végétaux qui ont été précongelés ou surgelés aux températures précitées préalablement à l'étape (A). Alternativement l'étape (A) peut être conduite sur des végétaux frais qui ne sont portés à une température inférieure à leur température de congélation qu'au moment de la mise en oeuvre de l'étape (A). Selon ce mode de réalisation, l'étape (A) peut typiquement être mise en oeuvre en plongeant le matériau végétal dans l'azote liquide ou un autre fluide cryogénique, ou en versant un fluide cryogénique de type azote liquide sur le matériau végétal frais (par exemple dans un dispositif de broyage (broyeur, pressoir, mortier) où le matériau végétal frais a été initialement introduit). A titre de méthodes de cryobroyage ou de cryoextraction utilisables dans le cadre de l'étape (A), on peut par exemple citer celles du type décrit dans la demande FR 2 652 265. L'étape (B) : Dans l'étape (B) du procédé de l'invention, le broyat végétal qui a été obtenu à l'issue de l'étape (A) est traité par au moins une enzyme. L'enzyme employée (ou le mélange (� cocktail �) d'enzymes employé) vise à digérer, en tout ou partie, les éléments solides présents dans le broyat végétal, ce par quoi on libère dans le milieu liquide tout ou partie des composés ou principes actifs présents dans ces éléments solides. Dans cette étape (B), le milieu liquide présent dans le broyat végétal est propre à servir de solvant pour les enzymes employées, ce qui permet d'introduire les enzymes à l'état non solvanté. Les enzymes utilisables dans le cadre de l'étape (B) peuvent notamment être choisies parmi les cellulases, les hemicellulases, les pectinases, les xylanases, et les mélanges de ces enzymes. Des mélanges comprenant une association d'au moins une cellulase ; au moins une pectinase ; et au moins une hémicellulase se révèlent en particulier intéressants. A titre d'exemple d'enzymes bien adaptées à la mise en oeuvre de l'étape (B), on peut notamment citer les enzymes suivantes : l'exopolygalacturonase, l'endopolygalacturonase, la polygalacturonase, la rhamnogalacturonane hydrolase, la rhamnogalacturonane lyase, la rhamnogalacturonane acetylesterase, la rhamnohydrolase, la galacturonohydrolase, la xylogalacturonane hydrolase, la pectine acetylesterase, la pectine methylesterase, l'endo-arabinase, la beta-arabinofuranosidase, la beta-1,4-galactanase, la beta-1,3-galactanase, la beta-galactosidase, l'alpha-galactosidase, la feruloyl acetyl esterase, l'alpha-fucosidase, la beta-apiosidase, l'alpharhamnosidase, la beta-rhamnosidase, l'alpha-arabinopyranosidase, la betaglucuronidase, l'alpha-glucuronidase, la beta-xylosidase, l'alpha-xylosidase ; la pectine methylesterase, la pectine lyase ou la pectate lyase ; l'endoxylanase, l'endo-beta-glucanase. Des enzyme commerciales intéressantes pour la mise en oeuvre de l'invention sont notamment les cellulases du type de la cellulyve AN3500 �; les pectinases du type de la peclyve V extraction liquide �; les hémicellulases du type de la Feedlyve AXC 1500L� ou la Feedlyve AGL 1500P�. Quelle que soit sa nature exacte, l'enzyme est employée dans l'étape (B) à une température où elle est efficace, et, de préférence aux alentours de (et plus préférentiellement à une température égale à) sa température optimale d'activité. Cela nécessite généralement de réchauffer le milieu entre l'étape (A) et l'étape (B). A cet effet, on peut par exemple laisser le milieu de l'étape (A) se réchauffer jusqu'à température ambiante, ou bien chauffer plus activement le milieu en évitant dans ce dernier cas toute surchauffe qui pourrait dégrader l'enzyme (typiquement en plaçant le milieu dans un milieu thermostaté (bain marie ou bain d'huile par exemple), ou bien encore en contrôlant la vitesse de montée en température). Le procédé de l'invention s'avère tout particulièrement efficace pour extraire les principes actifs au sein de végétaux riches en eau. En effet, plus le matériau végétal sera riche en eau plus l'extrait obtenu à l'issue de l'étape (A) aura tendance à être riche en milieu liquide et donc propre à dissoudre les enzymes, ce qui permettra d'éviter d'autant plus la mise en oeuvre d'un solvant dans l'étape (B). De préférence, un matériau végétal soumis au procédé d'extraction selon l'invention a une teneur totale en eau d'au moins 80% en masse, plus préférentiellement d'au moins 85% en masse, et plus avantageusement encore au moins 90% en masse, par rapport à la masse totale du matériau végétal. En particulier, des matériaux végétaux présentant une teneur en eau de 85% à 99%, par exemple de 90% à 98%, conviennent particulièrement bien à la mise en oeuvre du procédé de l'invention. De ce fait, des matériaux végétaux particulièrement adaptés à la mise en oeuvre du procédé d'extraction de l'invention sont typiquement tout ou partie de plantes grasses riches en eau, de plantes aquatiques, de fruits ou bien des parties charnues de plantes (feuilles par exemple). En particulier, le procédé d'extraction de la présente invention se révèle adapté pour des végétaux du type plantes aquatiques ou pour des plantes grasses du type des genres suivants : Agave, Abe, Opuntia, Crassula, Carpobrotus ou Mesambryanthemum. Selon un mode de réalisation particulier, le matériau végétal traité selon le procédé de l'invention est tout ou partie d'une ficoïde glaciale (Mesembryanthemum crystallinum), par exemple des parties aériennes d'une ficoïde glaciale. La présente invention et ses avantages seront encore davantage illustrés dans l'exemple ci-après. EXEMPLE Extraction de parties aériennes de ficoïde glaciale Dans cet exemple, on a effectué l'extraction de parties aériennes de ficoïde glaciale selon le procédé de l'invention, dans les conditions décrites ci-après. A des fins de comparaison, on a effectué des extractions en employant d'autres techniques d'extraction. Les résultats obtenus, exposés ci-après, démontrent clairement la supériorité du procédé d'extraction de l'invention aussi bien en termes quantitatif que qualitatif, ce procédé conduisant à des extraits à la fois riches en composés et moins dilués qu'avec les autres techniques. 1. Le matériau végétal employé L'extraction a été réalisée sur des parties aériennes de plants de ficoïde glaciale (Mesembryanthemum crystallinum) cultivés en serre, la récolte des parties aériennes ayant été effectuée au bout de 3 mois environ. Les parties aériennes ainsi récoltées ont été utilisées dans les extractions décrites ci-après, soit à l'état frais, soit après congélation. Le cas échéant, la congélation des parties aériennes a été effectuée à -18°C. 2. Extraction du matériau végétal selon le procédé de l'invention Cryobroyage On a introduit 500 g du matériau végétal, à l'état congelé, dans un mortier. On a versé de l'azote liquide dans ce mortier et le matériau ainsi porté à -196°C a été broyé au pilon jusqu'à l'obtention d'une poudre (cryobroyat). Enzymolyse Le cryobroyat obtenu à l'issue de l'étape précédente a été transféré dans un bécher placé dans un bain-marie à 50°C (qui correspond à la température optimale de fonctionnement des enzymes employées dans cette étape). Lorsque la température a atteint le point de fusion, et que le cryobroyat est devenu liquide, on y a ajouté 2,5 g d'un cocktail enzymatique comprenant, en masse par rapport à la masse totale du cocktail enzymatique : 33.3% de cellulyve AN3500 � (cellulase) ; 33.3% de peclyve V extraction liquide �(pectinase), 33.3% d'un mélange d'hémicellulases comprenant, en masse par rapport à la masse dudit mélange : 50% de Feedlyve AXC 1500L� et 50% de Feedlyve AG L 1500P�) Il est à noter que la quantité d'enzymes ainsi ajoutée est très faible : elle correspond en effet à 0,5% en masse par rapport à la masse totale du matériau végétal, et environ 10% en masse par rapport à la matière sèche contenue dans le matériau végétal. Si besoin est, le pH du milieu est ajusté à 4,5, la quantité d'acide ou de base à introduire pour réguler le pH étant alors négligeable (quelques microlitres tout au plus). En outre aucun solvant (eau par exemple) n'est ajouté, le cryobroyat décongelé ayant une teneur en eau suffisante pour assurer la dispersion des enzymes. L'ajout d'enzyme n'induit de ce fait aucun effet notable de dilution du milieu d'extraction, contrairement au cas des enzymolyses usuelles. Le mélange obtenu a été agité par une hélice, à 400 tours/minute pendant 1 heure ; puis à 250 tours/minute pendant 7 heures. Le mélange obtenu à l'issue de ces différents traitements a été filtré, sur une toile de nylon de 55 �m. Le filtrat a été centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. On a ainsi obtenu un extrait végétal E. 3. Préparation de témoins : extraction du matériau végétal selon d'autres procédés Six témoins ont été réalisés en utilisant le même matériau végétal (parties aériennes de plants de ficoïde glaciale), dans les conditions ci-après : 3.1 Témoin 1 "plante fraîche + broyage" 500 g du matériau végétal à l'état frais (parties aériennes de plants de ficoïde glaciale non congelées) ont été introduites dans un mortier puis broyées à température ambiante (20°C environ). Le broyat obtenu a ensuite été soumis aux mêmes étapes de purification que pour l'extrait E préparé précédemment. Ainsi, il a filtré sur toile de nylon de 55 �m. Le filtrat est centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. 3.2 Témoin 2 "plante décongelée+broyage" Le protocole suivi est le même que pour le témoin précédent, à la différence qu'on part du matériau végétal à l'état congelé qu'on décongèle en le portant à température ambiante (20°C) avant le broyage au mortier. 3.3 Témoin 3 "plante + cryobroyage" Le protocole suivi est le même que pour la préparation de l'extrait E, à la différence que le cryobroyat issu de l'étape de cryobroyage est simplement décongelé sans ajout ultérieur d'enzyme. Le cryobroyat décongelé est filtré sur toile de nylon de 55 pm. Le filtrat est centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. 3.4 Témoin 4 'plante décongelée + enzymes" Pour ce témoin, on est parti du matériau végétal à l'état congelé qu'on a placé dans un bécher au bain-marie à 50°C, puis on a ajouté 130 mL d'eau, nécessaires pour obtenir un milieu suffisamment liquide pour assurer la dispersion des enzymes. L'enzymolyse a ensuite été effectuée comme pour la préparation de l'extrait E (ajout de 0,5 g du cocktail d'enzyme mélange à 400 tours/minute pendant 1 heure ; puis à 250 tours/minute pendant 7 heures). Le mélange obtenu à l'issue de ces différents traitements a été filtré, sur une toile de nylon de 55 �m. Le filtrat a été centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 pm. 3.5 Témoin 5'p/ante décongelée + broyage + enzymes" Pour ce témoin, le protocole suivi est le même que pour la préparation de l'extrait E avec comme différence qu'on a effectué le broyage à température ambiante (20°C) après avoir laissé décongelé le matériau à cette température. 3.6 "blanc-enzymes" Afin de corriger les valeurs obtenues lors des analyses chimiques, un blanc-enzymes, sans plante, sans cryobroyage, a été réalisé. Il permet de s'affranchir des artéfacts apportés par les enzymes. On introduit 0.5% (p/p) du cocktail enzymatique employé pour la préparation de l'extrait E dans de l'eau. Dans un bain-marie à 50°C, le mélange a été agité par une hélice, à 400 tours/minute pendant 1 heure puis à 250 tours/minute jusqu'à 8 heures de réaction. Au bout de 8 heures, le mélange réactionnel a été filtré sur toile de nylon de 55 �m. Le filtrat est centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. 4. Résultats Pour l'extrait E et les témoins réalisés, on a mesuré la teneur en matière sèche (à l'aide d'un dessiccateur halogène), la teneur en sucres totaux (par la méthode colorimétrique à l'orcinol), ainsi que la teneur en glucose/fructose/mannitol (par HPLC). Sur la base de ces résultats, on a calculés différents rendements d'extraction reflétant l'efficacité de l'extraction réalisée. Les résultats obtenus, reportés dans les tableaux ci-dessous, font nettement ressortir la supériorité de l'extrait E par rapport aux extraits obtenus avec les témoins. Tableau 1 : teneur en sucre dans les extraits (mesurée selon la méthode colorimétrique à l'orcinol) Teneur en sucres dans Teneur en sucres dans Rendement : l'extrait (en g/L) la matière sèche de masse de sucres l'extrait (en g/100g) extraits / masse totale du matériau végétal (en mg/g) Moyenne Ecart-type Moyenne Ecart-type Moyenne Ecart-type TEMOIN 1 2,1 0,0 9,1 0,1 0,5 0,1 plante fraîche + broyage TEMOIN 2 1,4 0,3 4,1 0,2 1,1 0,2 plante décongelée + broyage TEMOIN 3 5,0 3,0 12,0 6,0 3,1 1,9 plante + cryobroyage TEMOIN 4 4,6 1,0 16,9 5,2 3,9 1,0 plante décongelée + enzymes TEMOIN 5 10,8 0,9 23,0 0,1 8,6 0,3 plante décongelée + broyage + enzymes EXTRAIT E 14,3 3,1 28,4 5,8 11,1 2,1 (cryobroyage + enzymolyse) 15 Tableau 2.1 et 2.2 : teneurs en glucose, fructose et mannitol (mesurée par HPLC) Tableau 2.1 teneur en glucose, fructose et mannitol dans les extraits Teneur dans l'extrait (g/L dans les jus) glucose fructose mannitol TEMOIN 1 0,6 1,4 0,0 plante fraîche + broyage TEMOIN 2 0,6 1,2 0,0 plante décongelée + broyage TEMOIN 3 2,2 2,3 0,3 plante + cryobroyage TEMOIN 4 3,4 1,8 0,2 plante décongelée + enzymes TEMOIN 5 3,5 1,3 0,1 plante décongelée + broyage + enzymes EXTRAIT E 5,6 2,3 0,4 (cryobroyage + enzymolyse) Tableau 2.2 Rendement : masses en glucose, fructose et mannitol extraites rapportées à la masse totale du matériau végétal Teneur en sucres et polyols Rendement en sucres et polyols / à la (méthode HPLC) plante fraîche (mg/g) glucose fructose mannitol TEMOIN 1 0,1 0,3 0,0 plante fraîche + broyage TEMOIN 2 0,5 0,9 0,0 plante décongelée + broyage TEMOIN 3 1,3 1,4 0,2 plante + cryobroyage TEMOIN 4 2,8 1,5 0,2 plante décongelée + enzymes TEMOIN 5 2,8 1,1 0,1 plante décongelée + broyage + enzymes EXTRAIT E 4,3 1,7 0,3 (cryobroyage + enzymolyse) REVENDICATIONS1. Procédé d'extraction de composés et/ou principes actifs présents dans un matériau végétal, dans lequel : (A) le matériau végétal est soumis à un broyage, à une température inférieure à la température de congélation du matériau végétal, ce par quoi on obtient un broyat végétal comprenant des éléments solides au sein d'un milieu liquide ; (B) on ajoute au matériau végétal issu du traitement de l'étape (A) au moins une enzyme propre à lyser tout ou partie des éléments solides présents dans le broyat végétal obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, qui est conduit en l'absence de solvant. 3. Procédé selon la revendication 2, où, dans l'étape (B), les enzymes sont introduites sous forme sèche dans le broyat obtenu à l'issue de l'étape (A). 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le matériau végétal est pré-congelé ou surgelé à une température inférieure à -10°C, préalablement à l'étape (A). 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où le matériau végétal employé dans l'étape (A) est un matériau végétal frais qui est porté à une température inférieure à sa température de congélation uniquement lors de la mise en oeuvre de l'étape (A), typiquement en plongeant le matériau végétal frais dans un fluide cryogénique ou en versant un fluide cryogénique sur le matériau végétal frais. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où l'enzyme employée est choisie parmi les cellulases, les hémicellulases, les pectinases, les xylanases, et les mélanges de ces enzymes. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, où le matériau végétal a une teneur totale en eau d'au moins 80% en masse, et plus préférentiellement d'au moins 85% en masse par rapport à la masse totale du matériau végétal. 8. Procédé selon la revendication 7, où le matériau végétal a une teneur totale en eau d'au moins 90% en masse, par exemple de 90% à 98%, par rapport à la masse totale du matériau végétal. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où le matériau végétal est tout ou partie d'une plante grasse riche en eau, d'une plante aquatique, d'un fruit ou bien d'une partie charnue de plante, telle qu'une feuille. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, où le matériau végétal est tout ou partie d'une ficoïde glaciale, par exemple les parties aériennes d'une ficoïde glaciale.15