Brevet FR2946349A1 — publié le 20101210

SEQUENCES, ANTICORPS, PROCEDES ET NECESSAIRES POUR LA DETECTION ET LE DOSAGE IN VITRO DE LA PERIOSTINE, EN VUE DU DIAGNOSTIC DU SUIVI OU DU PRONOSTIC DE PATHOLOGIES OU DE 5 PHENOMENES BIOLOGIQUES IMPLIQUANT LA PERIOSTINE DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION Le domaine de l'invention est celui des outils et des méthodes de détection et de dosage in 10 vitro de la périostine, notamment en vue du diagnostic, du suivi (évaluation) et du pronostic de pathologies ou de phénomènes biologiques impliquant la périostine. Concernant les pathologies, il s'agit notamment de maladies osseuses comme l'ostéoporose, de maladies ostéo-articulaires comme l'arthrose et la polyarthrite rhumatoïde mais également de certains cancers à forts pouvoirs métastatiques comme le cancer du sein, le cancer de la prostate. 15 Concernant les phénomènes biologiques non pathologiques impliquant la périostine, il peut s'agir de la modification ou le remodelage du périoste et du cartilage articulaire, ceci étant lié par exemple à la croissance de l'individu, au changement de son activité motrice ou à des changements hormonaux. Plus précisément, l'invention vise des séquences protéiques de détection in vitro de la 20 périostine, des moyens de reconnaissance de ces séquences (de préférence des anticorps), des procédés d'obtention de ces moyens de reconnaissance, des procédés et des nécessaires de détection et de dosage mettant en oeuvre ces moyens, en vue d'applications du type diagnostic, suivi et pronostic des maladies susvisées, notamment les maladies osseuses, ostéo-articulaires et des cancers métastatiques. 25 L'invention concerne également les séquences nucléiques codant pour ces séquences protéiques de détection. ART ANTERIEUR ET PROBLEME TECHNIQUE 30 Le squelette est constitué d'os de différentes natures : les os longs, les os courts, les os plats et les os intermédiaires. Ils ont des rôles physiologiques essentiels. En effet, outre un rôle de charpente et de protection des organes internes, ils sont impliqués, entre autres, dans la formation des cellules sanguines et immunitaires, dans le métabolisme calcique et minéral et dans la croissance de l'individu. Ils sont également impliqués dans le système locomoteur 35 grâce aux muscles s'insérant sur eux et au système articulaire. Le périoste est la membrane entourant la face externe des os plats, ainsi que des os longs au niveau de leurs diaphyses et métaphyses. Il a plusieurs particularités et fonctions. En effet, il est le � passage � par lequel les systèmes vasculaire et nerveux vont atteindre l'intérieur de l'os. Il sert d'interface avec les éléments extra-osseux tels que les tendons et les ligaments. Il réagit aux contraintes mécaniques (transmises par les ligaments et tendons, forces de torsion, de compression) par des adaptations structurales. Par ailleurs, il est le siège de l'ostéogenèse périphérique qui est déterminante pour la croissance du diamètre externe des os longs et donc pour leur solidité. Le métabolisme du périoste est régulé par des signaux d'origine endogène (hormones) ou exogène (agents thérapeutiques). L'os est une structure qui évolue au cours de la vie de l'individu. Cette évolution est liée à un équilibre physiologique (homéostasie) entre l'activité de deux types cellulaires : d'une part. les cellules assurant la formation et la minéralisation de l'os (les ostéoblastes, OBL), et, d'autre part, les cellules assurant la dégradation de l'os (les ostéoclastes, OCL). Certains évènements, pathologiques ou non, peuvent perturber cet équilibre physiologique dans l'os, tels que certains cancers ou une variation du taux d'oestrogènes. Certains cancers ont un fort pouvoir métastatique comme le cancer du sein ou de la prostate. Les métastases osseuses sont des complications fréquentes de ces cancers. Elles sont responsables, sur le plan clinique, de fractures, d'hypercalcémie et de douleurs qui peuvent engager le pronostic vital ou aggraver rapidement la qualité de vie des patients. Ces métastases modifient dramatiquement l'homéostasie de l'os avec un impact principalement ostéolytique dans le cancer du sein ou ostéoblastique dans les cas de cancer prostatique. L'une des protéines majeures constituant le périoste et impliquée dans le métabolisme de l'os est la périostine. Cette protéine fait partie de la matrice extracellulaire osseuse. Elle est sécrétée majoritairement par les précurseurs des OBL et les OBL mais aussi par les OCL, et a un rôle dans l'adhésion, le recrutement et la différenciation des progéniteurs ostéoblastiques (1-loriuchi K, Kudo A. Identification and characterization of a novel protein, Periostin, with restricted expression to periosteum and periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor P. J Bone Miner Res. 1999;14(7): 1239-1249 et Litvin J, Safadi FF. Expression and function of periostin-isoforms in bone. J Cell Biochem. 2004; 92: 1044-1061). Son expression est activée par divers facteurs de croissance. La périostine peut subir des modifications post-traductionnelles comme par exemple la gamma-carboxylation (Coutu DL, Wu JH, Monette A, Rivard GE. Blostein MD, Galipeau J. Periostin : a member of a novel family of vitamin k-dependent proteins is expressed by mesenchymal stromal cells. J. Biol. Chem. 2008 Apr 30). Cette modification entraîne, d'une part, un changement de conformation tridimensionnelle et, d'autre part, un gain d'affinité de la périostine vis-à-vis de la matrice minérale. Connaissant l'implication de cette protéine dans le métabolisme osseux, il a été envisagé de l'utiliser pour le diagnostic, le pronostic et le suivi de pathologies liées à l'os. Le brevet EP-B-1442295 divulgue ainsi une méthode de diagnostic de ces pathologies exploitant le fait que les taux sériques de périostine sont élevés dans les cas de cancer du sein et de pré-éclampsie. Cette méthode se base sur l'utilisation de différentes isoformes de la périostine et des anticorps les reconnaissant spécifiquement. Ces derniers servent à doser dans un échantillon toutes les isoformes de la périostine ou une isoforme particulière par une technique d'ELISA en sandwich. Cette méthode n'est cependant pas économique car elle nécessite la génération de tout un panel d'anticorps pour doser la périostine totale et présente un risque dans la fiabilité du dosage étant donnés les différents problèmes de réactions croisées possibles et par conséquent le manque de spécificité. En outre, cette méthode permet certes le diagnostic mais ne donne pas accès au pronostic et au suivi des patients ayant reçu un traitement médical et/ou chirurgical pour des pathologies impliquant des isofonnes particulières de la périostine. Par ailleurs, la périostine a été utilisée dans le diagnostic de pathologies autres que celles liées à l'os. La demande de brevet WO-A-2007/077934 décrit la réalisation d'anticorps spécifiques de la périostine ainsi que leur utilisation dans un procédé de détection de cette protéine pour le diagnostic de pathologies telles que des pathologies cardiaques, l'anévrisme, les cancers hautement métastatiques. Dans ce but, il est fabriqué en réalité une multitude d'anticorps, chacun étant spécifique d'une isoforme particulière de la périostine. Ceci présente les mêmes inconvénients économiques (coût, temps, spécificité) que le brevet précité EP-B-1442295. La demande de brevet WO-A-2007/096142 décrit une méthode d'identification des maladies ou des conditions associées à une néo-vascularisation dans un tissu, ceci grâce à la détection d'au moins une protéine spécifique dudit tissu et par l'utilisation d'anticorps spécifiques de cette(ces) protéine(s). Une des protéines utilisées dans ce but est la périostine sous forme de précurseur, ses isoformes et de nouveaux variants protéiques. Les maladies visées sont la dégénérescence maculaire, l'arthrite, l'athérosclérose etlou les tumeurs, en particulier les tumeurs du rein. Ainsi, est générée une multitude d'anticorps dirigés contre des antigènes de séquences protéiques différentes avec les mêmes inconvénients qu'exposés précédemment. La demande de brevet WO-A-2005/019471 décrit une méthode pour diagnostiquer les maladies liées au PLF (periotin like factor), une isoforme particulière de la périostine. Cette méthode se base sur l'utilisation d'un test immuno-enzymatique avec un anticorps spécifique de cette isoforme, l'épitope reconnu par ledit anticorps se trouvant dans la partie variable de la périostine. Cette méthode ne permet de doser qu'une forme particulière de périostine et non la périostine totale exprimée. OBJECTIFS PRINCIPAUX DE L'INVENTION Au vu de cet art antérieur, il était donc souhaitable de trouver de nouveaux moyens spécifiques, simples, fiables, précis et économiques pour déterminer in vitro le taux de périostine totale exprimée ainsi que le taux de périostine sous-carboxylée (totalement ou partiellement) et de périostine carboxylée de manière directe ou indirecte, afin de permettre un diagnostic, un suivi, un pronostic et le traitement des pathologies impliquant la périostine et/ou pour évaluer des phénomènes biologiques non pathologiques tels que l'activité métabolique de l'os. Aussi, les inventeurs ont-ils développé une séquence de détection de la périostine totale ainsi qu'un moyen de reconnaissance de cette séquence de détection permettant de doser in vitro la périostine totale, voire la périostine carboxylée et la périostine sous-carboxylée, dans les fluides biologiques. Un autre objectif de l'invention est de fournir des moyens et des procédés de détection et de dosage de la périostine totale, sans distinction des différentes isoformes, ainsi que de la périostine sous-carboxylée et indirectement ou directement (par l'utilisation spécifique d'anticorps reconnaissant la forme carboxylée uniquement de la périostine) de la périostine carboxylée, en vue de visualiser et/ou de comprendre des phénomènes biologiques impliquant la périostine, mais aussi en vue d'améliorer le diagnostic précoce, le traitement, le suivi et le pronostic de maladies impliquant la périostine. Un autre objectif de la présente invention est de fournir des procédés économiques et performants d'étude des phénomènes biologiques impliquant la périostine, ainsi que de diagnostic précoce, de suivi de traitement et de pronostic de maladies impliquant la périostine. Un autre objectif de la présente invention est de fournir des nécessaires de détection et de dosage de la périostine utiles dans les procédés susvisés. BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION Après de longues recherches et grâce à l'utilisation d'outils sophistiqués et à des modélisations avec des critères de sélection particuliers (exposition, immunogénicité...), les inventeurs ont atteint ces objectifs en développant une nouvelle séquence peptidique de détection de la périostine totale. Ce moyen de détection permet de détecter la périostine totale sans distinction des différentes isoformes de cette protéine et indépendamment des clivages qui se produisent fréquemment aux extrémités des protéines. En effet, à l'aide de modélisations, les inventeurs ont pu mettre en évidence dans la partie constante de la périostine, une séquence peptidique restreinte et très exposée. Cette séquence de détection correspond à une séquence peptidique donnée et ses homologues. Cette séquence de détection permet de détecter de façon simple, précoce, fiable, performante, spécifique et économique des phénomènes biologiques ou des pathologies impliquant la périostine. La présente invention concerne donc une séquence peptidique SP de détection de la périostine, caractérisée en ce qu'elle comprend de 6 à 30 (de préférence 15 à 26) acides aminés et inclut tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 La séquence nucléique codant la séquence de détection SP forme un autre objet de l'invention. La présente invention concerne également : • Des moyens de détection de la périostine, comprenant un outil de reconnaissance spécifique de SP, constitué par au moins un anticorps anti-périostine et/ou au moins l'un de ses fragments fonctionnels (Ac anti-périostine), spécifiques de SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. • Un procédé de production de ces moyens de détection de la périostine, en particulier d'Ac anti-périostine, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à : a. mettre en oeuvre au moins un antigène représenté par une séquence peptidique SP de détection de la périostine comprenant de 6 à 30 acides aminés et incluant tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3, b. coupler ledit antigène à au moins une molécule porteuse, c. récupérer du sang/plasma/sérum d'un animal auquel a été préalablement injecté le couple antigène-molécule porteuse, d. sélectionner les anticorps spécifiques de SP en mettant le sérum/plasma récupéré à l'étape d) avec des antigènes SP, e. éventuellement purifier les anticorps. • Un procédé de détection et éventuellement de dosage de la périostine totale dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à : 1. mettre en oeuvre un échantillon biologique, II. mettre en présence ledit échantillon biologique avec les moyens de détection susvisés, III. mettre en évidence les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés; IV. éventuellement doser ces complexes Ac anti-périostine/SP foiinés pour en déduire la concentration en périostine dans l'échantillon. • Un procédé de détection et éventuellement de dosage de la périostine sous-carboxylée (psc), à distinguer de la périostine carboxylée (pc), caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à: IPSO.- mettre en oeuvre un échantillon biologique, IPS`.1- mettre en présence dans un milieu donné ledit échantillon biologique avec un support apte à fixer la pc de préférence à la psc ou inversement, ledit support étant : • avantageusement un support ayant une affinité vis-à-vis du pc supérieure à celle vis-à-vis du psc, • et, de manière plus avantageuse, un support comprenant de l'hydroxyapatite, • et, de manière encore plus avantageuse, un support comprenant de la matrice 5 minérale osseuse, IPS`.2- éventuellement agiter ledit milieu, IPS`.3- une fois la fixation effectuée, séparer (de préférence par gradient de densité, et, plus préférentiellement encore, par centrifugation) le support de fixation chargé en pc ou en psc (de préférence en pc) du reste du milieu, 10 IIPS`. mettre en présence le support de fixation chargé en pc ou en psc (de préférence en pc) ou le reste du milieu avec les susdits moyens de détection, cette dernière alternative étant préférée, IIIPS`. mettre en évidence les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés; IVPS`. doser ces complexes Ac anti-périostine/SP formés pour en déduire la concentration en 15 périostine pc dans le support de fixation ou en périostine psc dans le reste du milieu, cette dernière alternative étant préférée, et in fine dans l'échantillon. • Un procédé de mise en évidence et d'évaluation d'un phénomène biologique non pathologique impliquant la périostine, ou de diagnostic, de suivi ou de pronostic d'une pathologie impliquant la périostine, ou de détermination de l'efficacité d'un médicament 20 adapté au traitement d'une pathologie impliquant la périostine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre le susdit procédé de détection et éventuellement de dosage de la périostine totale dans un échantillon biologique. • Un nécessaire de détection et de dosage in vitro de la périostine, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les susdits moyens de détection de la 25 périostine, des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés, selon les étapes III, voire IV, du procédé susvisé de détection et éventuellement de dosage de la périostine totale, et une notice de mise en oeuvre. • Un nécessaire de détection et de dosage de la périostine sous-carboxylée psc, caractérisé en 30 ce qu'il comprend les susdits moyens de détection de la périostine, des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac antipériostine/SP formés selon les étapes III, voire IV, du procédé susvisé de détection et éventuellement de dosage de la périostine totale, un support pour la mise en oeuvre des étapes I' .et IIPS' du procédé susvisé procédé de détection et éventuellement de dosage de la 35 périostine sous-carboxylée (psc), c'est-à-dire un support apte à fixer la pc de préférence à la psc ou inversement, ledit support étant : • avantageusement un support ayant une affinité vis-à-vis du pc supérieure à celle vis-à-vis du psc, • et, de manière plus avantageuse, un support comprenant de l'hydroxyapatite ou du sulfate de barium, • et, de manière encore plus avantageuse, un support comprenant de la matrice minérale osseuse comprenant de l'hydroxyapatite sous forme de cristaux. et une notice de mise en oeuvre. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La périostine est une protéine de la matrice extracellulaire osseuse. Elle se compose d'une partie principale constante et d'une partie C-terminale plus courte dont la composition en acides aminés est variable. Cette variabilité mène donc à différentes isoformes. Au sens de l'invention, on désigne e.g. par "périostine", toutes les isoformes connues de la périostine sans distinction, quelles que soient les modifications comme les modifications posttraductionnelles (carboxylation, glycosylation, acétylation...) ou autres. On distingue ainsi dans le présent exposé, la périostine ou périostine totale, la périostine carboxylée -ci-après dénommée "pc"-, la périostine sous-carboxylée ou décarboxylée-ci-après dénommée "psc"-... A défaut de précision, le terme � périostine � désigne la périostine totale. Les termes "peptide", "polypeptide" et "protéine" seront utilisés de façon interchangeable et ils signifient n'importe quelle chaîne d'acides aminés liés entre eux indépendamment de la longueur de la chaîne et de ses modifications post-traductionnelles. Squeriçes_ SP_de_déteçtion Les séquences de détection selon l'invention SP comprennent de 6 à 30 (de préférence 15 à 26) acides aminés et incluent tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique homologue. Ces séquences SP permettent de détecter la périostine totale sans distinction des différentes isoformes de cette protéine. Ces séquences proviennent de la partie constante de la périostine. Ce sont des séquences peptidiques courtes, très exposées et hautement conservées entre les différentes espèces, en particulier entre l'homme et la souris. Ces séquences de détection données et leurs homologues permettent de détecter de façon précoce et de façon fiable des phénomènes biologiques ou des pathologies impliquant la périostine et ceci sans être limité à une isoforme particulière de la périostine. Ces nouvelles séquences de détection spécifiques de la périostine et leurs homologues comprennent tout ou partie des trois séquences originelles annexées SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. SEQ ID N°1 se retrouve intégralement dans la périostine humaine, du rat, de la souris, du singe, etc, comme cela ressort des séquences peptidiques annexées SEQ ID N°4 à SEQ ID N°54 (figure 2). SEQ ID N°2 est spécifique de la périostine humaine (SEQ ID N°4). SEQ ID N°3 est spécifique de la périostine murine (SEQ ID N°5).40 Numéro de séquence SEQ ID Référence de la séquence de la protéine dans la base de données NCRI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ SEQ ID N°6 XP 001512245 SEQ ID N°7 XP 001085920 h-- XP 001085575 SEQ ID N°8 SEQ ID N°9 XP 001085814 SEQ ID N°10 XP 001085700 SEQ ID N°l 1 XP 001148441 SEQ ID N°12 XP 001148156 SEQ ID N°13 XP_ 001 1 48083 SEQ ID N°14 XP_001148381 SEQ ID N°15 XP 001148299 SEQ ID N°16 XP 001 148230 SEQ ID N°17 XP 001148006 SEQ ID N°18 XP 001147936 SEQ ID N°19 XP 001147873 SEQ ID N°20 XP_509634 SEQ ID N°21 XP 001147730 SEQ ID N°22 13AA02836 SEQ ID N°23 NP 006466 SEQ ID N°24 AAN17733 SEQ ID N°25 CAI-170104 SEQ ID N°26 CAH70105 SEQ ID N°27 CAH70106 SEQ ID N°28 AAY 15840 SEQ ID N°29 Q15063 SEQ ID N°30 EAX08592 SEQ ID N°31 XP 534490 SEQ ID N°32 XP 856272 SEQ ID N°33 XP 856313 SEQ ID N°34 XP 856355 SEQ ID N°35 XP 001495882 SEQ ID N°36 XP 001495899 SEQ ID N°37 XP 001495863 SEQ ID N°38 1 X1' 001495934 ù ----- SEQ ID N°39 NP 001035569 ------ --- SEQ ID N°40 NP 056599 SEQ ID N°41 AAH31449 SEQ ID N°42 I3AC27122 Q62009 SEQ ID N°43 AAT48882 SEQ ID N°44 SEQ ID N°45 BAE32339 SEQ ID N°46 EDL35258 SEQ ID N°47 EDL35259 SEQ ID N°48 EDL35260 SEQ ID N°49 lDL35261 SEQ ID N°50 I DM 14934 SEQ ID N°51 EDM14935 SEQ ID N°52 EDM 14936 SEQ ID N°53 EDM14937 SEQ ID N°54 _ NP00 1 1 02020 Au sens de l'invention, on désigne e.g. par "séquence homologue", on entend une séquence ayant quelques variations par rapport à la séquence originelle, ici SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Ces variations viennent du fait que dans les protéines il peut y avoir des délétions, des additions, des substitutions et/ou des insertions de un plusieurs acides aminés mais sans que celles-ci n'affectent de façon majeure la structure et la fonction de la protéine intégrant ladite séquence, en l'occurrence la périostine. Cette dernière conserve ainsi par exemple son activité (telle que l'activité enzymatique) et/ou son repliement tridimensionnel. Selon la présente invention. les substitutions sont définies e.g. en tant qu'échanges dans un des groupes suivants : - petit résidu aliphatique, non polaire ou faiblement polaire : Ala, Ser, Thr, Pro, Gly - résidu chargé négativement, polaire et leur amide : Asp, Asn, Glu, Gln - résidu chargé positivement, polaire : I-Iis, Arg, Lys grand résidu aliphatique, non polaire : Met, Leu, [le, Val, Cys - grand résidu aromatique : Phe, Tyr, Trp. Ainsi les changements qui résultent d'une substitution d'un résidu chargé négativement par un autre (tel que l'acide glutamique par l'acide aspartique) ou un résidu chargé positivement par un autre (tel que Lysine par Arginine) ou des modifications post-traductionnnelles comme glysosylation, nitration, isomerisation...peuvent donner des produits équivalents au plan fonctionnel et tridimensionnel. Au sens de l'invention, une séquence est dite "homologue" de SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, si son degré d'homologie avec SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, est, selon un index croissant de préférence, supérieur ou égal à 80%, 85%, 90%, 95%, et 97%. Les positions sur lesquelles les acides aminés sont modifiés et le nombre d'acides aminés sujets à une modification dans la séquence d'acide aminé SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 n'est pas limité. L'homme de l'art est capable de reconnaître les modifications qui peuvent être introduites sans affecter l'activité et/ou le repliement de la protéine. Par exemple, une modification dans la région N ou C terminale d'une protéine est supposée ne pas altérer l'activité fonctionnelle ou le repliement de la protéine dans certaines circonstances. Dans une première forme préférée de réalisation, SP correspond à SEQ ID N°1. Cette séquence SEQ ID N° l est une séquence peptidique de la périostine hautement 10 conservée. En effet, SEQ ID N°1 (dont la séquence est KGFEPGVTNILKTTQGSK) est conservée avec 100% d'homologie entre la souris, l'homme et de nombreuses autres espèces telles que le singe, le chien, le cheval, le rat (figure 2). Dans une deuxième forme préférée de réalisation, SP correspond à SEQ ID N°2. Dans une troisième forme préférée de réalisation, SP correspond à SEQ ID N°3. 15 Ces séquences SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3 sont des séquences peptidiques de la périostine hautement conservées. SED ID N°2 (dont la séquence est ETLEGNTIEIGCDGDSI) est spécifique de la périostine humaine (SEQ ID N°4) et SEQ ID N°3 (dont la séquence est EAITGGAVGEAITGGAV) est spécifique de la périostine murine (SEQ ID N°5) qui contient la séquence monomérique EAITGGAV. 20 La (ou les) séquence(s) peptidique(s) de détection SP selon l'invention est un peptide qui peut exister en tant que tel ou être inclus dans un (poly)peptide plus long. Ainsi, au sens de l'invention, l'expression "séquence(s) peptidique(s) de détection SP" englobe également tout (poly)peptide immunogène incluant SP telle que définie dans la présente 25 demande et comportant plus de 30 acides aminés. Comme cela sera vu infra, aussi bien SP que tout (poly)peptide immunogène incluant SP permet la production d'anticorps spécifiques, en particulier dirigés contre tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ou une séquence homologue à l'une des susdites séquences. 30 Avantageusement, SP est isolée de son environnement naturel ou produite à l'aide d'un procédé technique. Par "isolée", on entend e.g. au sens du présent exposé, une séquence peptidique ou une protéine qui a été séparée ou purifiée des composés qui l'accompagne dans son milieu naturel, 35 par exemple dans son tissu d'origine tel que l'os, le coeur, un tissu tumoral ou d'un liquide corporel tel que le sang, la lymphe, l'urine, la salive. Selon la présente invention, la séquence peptidique SP en question est de préférence isolée de l'os et plus préférentiellement du périoste. 2946349 ll Une séquence peptidique isolée selon l'invention peut être obtenue, par exemple, par extraction de sa source naturelle (tel que des tissus ou des liquides corporels) ; par expression par un acide nucléique recombinant codant pour ladite séquence peptidique ; ou par synthèse chimique. Le degré de séparation/purification de ladite séquence peptidique peut être vérifié par différentes méthodes connues de l'homme de l'art telles que la chromatographie sur colonne, des analyses en chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) ou par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. SP peut être également produite à l'aide d'un procédé technique connu, e.g. : synthèse peptidique, synthèse génétique, ou technique du type de celle décrite dans "Ed Harlow and David Lune � Antibodies . a laboratory mamial � Cold Spring Harbor Laboratory press 1988". Séquences miçléiques çodant_pour.les séquences_pe,ptidiques_SP_ de détection L'invention concerne également les outils génétiques de synthèse des séquences peptidiques SP, en particulier des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ou de leurs séquences homologues. Ces outils génétiques de synthèse sont les séquences nucléiques codant au moins l'une des séquences SP de détection de la périostine telles que définies ci-dessus, y compris les "(poly)peptides immunogènes" susvisés. Les séquences nucléiques en question peuvent être des séquences d'ADNc, d'ADN génomiques ou synthétiques ou des séquences d'ADN. Elles peuvent être à simple brin ou à double brin. Ces séquences peuvent être produites par PCR ou à l'aide d'enzymes de restriction. Ces séquences peuvent contenir également des séquences qui diffèrent de celles générées naturellement mais qui, du fait de la dégénérescence du code génétique, permettent tout de même de coder la même séquence protéique et en particulier une séquence contenant SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ou une séquence homologue à l'une des susdites séquences avec un degré d'homologie tel que défini ci-dessus. Ces séquences nucléiques ne sont bien évidemment pas limitées à des séquences codantes uniquement, elles peuvent contenir des séquences non-codantes. On aura compris que grâce aux séquences nucléiques ci-dessus décrites, par des procédés d'isolation ou de production protéique connus, on obtiendra les séquences peptidiques isolées de leur environnement naturel ou produites artificiellement telles que décrites ci-dessus et que ces séquences peptidiques correspondent à des peptides immunogènes capables d'engendrer la formation d'anticorps spécifiques. Mp}.ens_de_détecion_ de, la périosfine ___antiçorps Conformément à l'invention, les séquences peptidiques SP de détection sont d'excellentes cibles spécifiques de la périostine et repérables dans un procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative de la périostine. Il convient donc de prévoir, dans un tel procédé. des sondes capables de reconnaître lesdites cibles. C'est là un autre objet de la présente invention, à savoir des moyens de détection de la périostine, qui comprennent un outil de reconnaissance spécifique d'une ou plusieurs séquences peptidiques SP. Cet outil comporte au moins un anticorps anti-périostine et/ou au moins l'un de ses fragments fonctionnels (Ac anti-périostine), spécifiques de SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. L'outil de reconnaissance spécifique de la périostine est de préférence un anticorps anti- périostine ou au moins l'un des fragments fonctionnels de celui-ci. Dans une forme tout particulièrement préférée de réalisation, l'anticorps selon l'invention est dirigé contre au moins l'une des séquences: SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans la présente demande, le terme "anticorps" désigne e.g. des immunoglobulines (Ig), par exemple de type Gamma (Ig G) ou Mu (Ig M), de préférence IgG. Ces anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils sont issus d'immunisation d'animaux tels que le lapin (polyclonaux), la souris (monoclonaux) et tous les animaux que l'on peut immuniser et connus de l'homme de l'art mais ils peuvent être produits par génie génétique. Par ailleurs, les anticorps selon l'invention peuvent être des anticorps d'origine animale (de préférence du lapin ou de la souris) naturels ou humanisés. Par extension, les anticorps selon la présente invention peuvent être un des fragments fonctionnels desdits anticorps comme le fragment Fv, le fragment Fab qui contient le site de reconnaissance spécifique à l'antigène, le fragment F(ab')2 qui contient au moins les deux sites de reconnaissance spécifique à l'antigène. Il peut également s'agir d'anticorps chimères. Dans la présente demande, le terme "épitope" désigne e.g. une molécule ou une région de celle-25 ci qui peut être reconnue par la partie de reconnaissance spécifique d'un anticorps (le paratope). Un antigène est caractérisé par ses épitopes. Ainsi, conformément à l'invention, les antigènes aptes à être reconnus et se complexer avec les moyens de détections de la périostine, sont les séquences SP telles que définies dans le présent exposé. En outre, les épitopes correspondant sont notamment les séquences 30 peptidiques SP de 6 à 30 acides aminés correspondant en tout ou partie à SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou à une séquence homologue à l'une de celles-ci. Il est connu de l'homme de l'art qu'un site antigénique contient généralement 5 à 20 acides aminés mais selon un mode préféré de l'invention, l'épitope antigénique spécifique reconnu par l'anticorps peut contenir un nombre inférieur d'acides aminés, c'est-à-dire de 6 acides aminés à 16 acides 35 aminés sans se limiter à ce nombre. L'épitope contient de préférence 12 acides aminés. Par "spécifique", on entend e.g. au sens du présent exposé que les anticorps reconnaissent et se lient à un épitope donné via leur paratope selon les principes connus de l'immunologie. En particulier, l'antigène reconnu est défini par son épitope particulier et ceci selon la structure ou la conformation de celui-ci. Ainsi, les anticorps selon la présente invention permettent de reconnaître spécifiquement toutes les isoformes de la périostine contenant SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou une séquence homologue à l'une de ces séquences. Procédé_ de_ production _ de_ moyens de_ détection__(anticorps)_ de_ la périostine Ce procédé selon l'invention comprend les étapes abcde(f) définies ci-dessus et détaillées ci-après. Etape a: Plus précisément et selon une l efe modalité avantageuse de l'invention permettant de générer ces anticorps spécifiques de la périostine via l'épitope de séquence SEQ ID N°l ou une séquence homologue à celle-ci telle que décrite ci-dessus, il est prévu d'utiliser par exemple une séquence peptidique dérivée des séquences de périostine humaine SEQ ID N°4, murine SEQ ID N°5 et toute autre séquence citée SEQ ID N°6 à SEQ ID N°54 (fig.2) produite artificiellement et comprenant au moins SEQ ID N°1 ou une séquence homologue à celle-ci. Cette séquence peptidique isolée ou produite artificiellement mime la région identique ou homologue de la périostine native ou d'une isoforme. Plus précisément et selon une 2è"7e modalité avantageuse de l'invention permettant de générer ces anticorps spécifiques de la périostine via l'épitope de séquence SEQ ID N°2 ou une séquence homologue à celle-ci telle que décrite ci-dessus, il est prévu d'utiliser par exemple une séquence peptidique dérivée des séquences de périostine humaine SEQ ID N°4, SEQ ID N°22 à SEQ ID N°30. Plus précisément et selon une 3e"1e modalité avantageuse de l'invention permettant de générer ces anticorps spécifiques de la périostine via l'épitope de séquence SEQ ID N°3 ou une séquence homologue à celle-ci telle que décrite ci-dessus, il est prévu d'utiliser par exemple une séquence peptidique dérivée des séquences de périostine murine SEQ ID N°5, SEQ ID N°40 à SEQ ID N°49. Etape b: Une fois l'antigène produit ou isolé (étape a), il est couplé à une protéine porteuse. Par le terme � couplé �, on entend par exemple lié ou conjugué. Cette liaison ou conjugaison peut se faire chimiquement, par exemple par une liaison covalente, adsorption ou un autre mode de fixation connu de l'homme de l'art. De préférence, le couplage se fait de préférence par un agent de couplage comme par exemple le carbodiimide ou la glutaraldéhyde. La molécule porteuse à laquelle est couplé l'antigène est une molécule de poids moléculaire suffisamment important pour induire une réaction immunitaire et la production d'anticorps circulants. Cette molécule peut être une protéine, un polymère naturel ou synthétique. Elle est de préférence une protéine et en particulier une protéine de poids moléculaire supérieur ou égal à 5 kDaltons telle que la BSA (Bovine Serum Albumin), l'ovalbumine, la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine). Dans une forme préférée de l'invention, on utilise la protéine KLI-1 en tant que protéine porteuse. Etape c: Le couple antigène-molécule porteuse est injecté à un animal à immuniser. Le couple antigène- molécule porteuse est de préférence en suspension et de préférence mélangé avec une solution d'adjuvant de Freund qui est composée d'huile minérale additionnée d'un agent émulsifiant (adjuvant incomplet) et de particules de bacille inactivé de la tuberculose (adjuvant complet). L'animal auquel est injecté ledit couple antigène-molécule porteuse en suspension peut être le lapin, la souris, le rat, la chèvre, le mouton, le cheval ou le cobaye, de préférence le lapin, le rat et la souris. L'injection dudit couple peut se faire en une seule fois ou en plusieurs fois selon les méthodes classiques et connues d'immunisation. Les principales voies d'administration sont des injections sous-cutanées, intradermiques, ou intramusculaires; les injections intraveineuses et intra-péritonéales ne sont employées que dans des cas particuliers. S'il y a plusieurs injections du couple antigène-molécule porteuse, les types d'anticorps produits, spécifiques de l'antigène tel que défini ci-dessus, sont différents. En effet, il peut s'agir d'immunoglobulines de type G ou M. Les méthodes d'injection sont connues et sont des méthodes classiques dans les protocoles d'immunisation d'animaux, particulièrement de lapins. Ainsi, on injecte de préférence en intramusculaire environ 0,5 à I mg dudit couple antigénique à un lapin et environ 50 à 100 �g à une souris. Le sang de l'animal contenant, entre autres, lesdits anticorps spécifiques de l'antigène injecté est récupéré par prélèvement ou par exsanguination. De préférence, on prélève du plasma ou du sérum contenant également, entre autres, les anticorps spécifiques de l'antigène tel que défini ci-dessus. Le sérum contenant les anticorps recherchés, dirigés contre ledit antigène, contient normalement plusieurs espèces d'anticorps différents dirigés contre plusieurs épitopes du même antigène, on appelle cette préparation polyclonale. On peut également mettre en oeuvre des techniques permettant d'isoler et de cloner des lymphocytes ne produisant qu'une espèce moléculaire (i.e. clonotype) d'anticorps : les anticorps qui ne reconnaissent qu'un seul épitope de l'antigène. Etape d: L'étape de sélection (ou titration) des anticorps spécifiques dudit antigène tel que défini ci-dessus se fait à l'aide de la technique ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Cette technique de sélection est largement décrite dans la littérature. Etape e: Lorsque cette étape facultative de purification des anticorps est réalisée, cette dernière peut être faite en phase liquide ou solide et de différentes façons à savoir la chromatographie d'affinité en utilisant soit des colonnes de séparation, des billes magnétiques ou des résines portant ledit antigène en tant que ligand. On préfère un support solide tel qu'une colonne de sépharose sur laquelle les antigènes ont été fixés, de préférence par liaison covalente. On fait passer le sang/sang/plasma/sérum sur ladite colonne de fixation où seuls les anticorps contre l'antigène devraient s'attacher sur la colonne, toutes les autres protéines du sérum étant lavées dans l'éluat permettant la sélection des anticorps spécifiques des antigènes. Procédé de__détectipn et._é.entuellement de dosage,de la__périostine totale_ dans_ un_ échantillon biologique La présente invention donne accès aux séquences de détection SP, lesquelles permettent de produire des moyens de détection constitués e.g. par un outil reconnaissance de la périostine, de préférence les anticorps anti-périostine. Cet outil spécifique rend possible la détection in vitro (analyse quantitative) voire le dosage (analyse quantitative) de la périostine totale porteuse de tout ou partie de SP, par le procédé défini ci-avant et comportant les étapes I-II-III-(IV). Les séquences SP de détection de la périostine telles que définies dans le présent exposé sont particulièrement avantageuses car elles permettent de distinguer, quantifier et/ou localiser la périostine exprimée dans l'organisme et ceci sans distinction entre ses différentes isoformes (5) jusqu'à présent répertoriées (fig. 2), ni des modifications post traductionnelles telles que la carboxylation, la glycosylation... La détection et/ou la quantification (concentration) du marqueur protéique qu'est la périostine, via les séquences de détection SP selon l'invention, dans un échantillon biologique d'un sujet (animal ou humain) est particulièrement intéressante car elle renseigne de façon précoce et fiable sur les phénomènes biologiques non pathologiques se produisant dans certains tissus chez cet individu, en particulier l'os mais également sur d'éventuelles pathologies impliquant la périostine. Elle constitue ainsi un indice majeur soit de l'état physiologique d'un sujet au plan du métabolisme osseux, en particulier du périoste et/ou du cartilage, notamment lors de la croissance ou lors de l'andropause ou la ménopause, soit de l'état pathologique de l'individu atteint ou susceptible d'être atteint par des maladies impliquant la périostine, notamment les pathologies osseuses telles que l'ostéoporose, les métastases osseuses du cancer du sein et de la prostate et d'autres origines, le myélome, ou les pathologies ostéoarticulaires telles que l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite, les fibroses notamment hépatique, et les maladies cardiovasculaires. L'invention apporte donc à un progrès technique significatif au travers de cet outil spécifique, fiable et facile d'utilisation de reconnaissance et de détection de ce marqueur périostine, lequel outil constituant le fondement du procédé dont il est question dans cette rubrique et sur les étapes duquel on donne quelques précisions ci-après. Dans ce cadre, la détection du complexe antigène-anticorps peut être déclinée selon plusieurs technologies telles que les tests ELISA, EIA ou RIA, l'immunoturbidimétrie, l'agglutination de latex sur lame, la néphélométrie, la turbidimétrie, la turbidimétrie ou néphélométrie amplifiée par particules de latex, l' immunohistochimie/cytochimie colorimétrique, l'immunofluorescence (sur lame), microplaque, latex fluorescent, latex magnétique, test sur membrane, biochips etc...), les buvardages en western (western blot), les transferts en point (dot blot), les techniques de chromatographie liquide à haute performance (I-IPLC), par électrophorèse, par spectroscopie, ou par les techniques d'analyse protéomique ou "microarray", et de façon générale peut être utilisé tout procédé permettant d'identifier et/ou de quantifier une réaction entre un antigène et plus particulièrement un épitope et un anticorps, quelque soit l'isotype. De préférence, on utilise un test ELISA. Dans une forme particulière de réalisation de l'invention, ledit procédé de détection de la périostine consiste en un dosage ELISA, de préférence un dosage ELISA dit � par compétition � ou dit � sandwich �. Dans une variante, on peut utiliser des techniques permettant la détection directe des anticorps 10 en tant que complexes anticorps-épitope telle que la réfractométrie, la diffraction de rayons lumineux par la surface réactionnelle, des méthodes de modification de la conductivité électrique ou du champ magnétique etc.... Les méthodes d'immunochimie de détection utilisent généralement une réaction enzymatique 15 (peroxydase, glucose oxydase, phosphatase alcaline). De préférence, la réaction immunologique, à savoir la reconnaissance de l'anticorps ou de au moins l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention avec l'antigène tel que défini ci-dessus, est suivie par une réaction indicatrice qui produit un signal coloré amplifié par des enzymes et leurs substrats chromogènes ou qui permet la détection photométrique, électrochimique 20 fluorescente ou radioactive etc. de l'activité enzymatique liée à la concentration du complexe anticorps-antigène. Ces techniques génériques peuvent ainsi s'inscrire dans les étapes I-II-III-(IV) suivantes. Elape 1: 25 Au sens de l'invention, on désigne e.g. par le terme "échantillon biologique" tout type d'échantillon, utilisable in vitro, de toute substance susceptible de contenir ledit antigène en question correspondant à une séquence peptidique SP, à savoir : • une substance liquide tels que le sérum, le plasma, le sang, de la lymphe, de l'urine, de la salive, le surnageant de cellules mises en culture, la moelle osseuse, un broyat 30 d'organe, des extraits cytoplasmiques de cellules données; • ou une substance solide, par exemple des coupes de tissus (par exemple osseux ou tumoraux), un organe ou une coupe de celui-ci. Ces échantillons sont prélevés sur des animaux ou des patients sains ou atteints de maladies, par exemple le cancer du sein ou de la prostate. 35 De préférence, on utilise du sérum. Les anticorps peuvent être (technique sandwich) ou pas (technique de compétition) préalablement fixés sur support adapté. Les supports de réactions immunologiques utilisés peuvent être de natures différentes et sont choisis parmi : les lames, les microplaques, les latex fluorescents, les latex magnétiques, les membranes d'immuno-filtration ou les membranes d'immuno-migration, les biochips, les billes, les ailettes, les tubes mais également les liposomes, les vésicules lipidiques, les microparticules biologiques ou obtenues à partir de polymères, les émulsions ou tout autre support connu de l'homme de l'art et adapté à la mise en oeuvre desdits procédés. Les éventuels lavages servent à éliminer les fixations non spécifiques ou les produits en excès non fixés. Selon des méthodes connues de l'homme de l'art, l'anticorps spécifique peut être utilisé en phase liquide, en solution. De préférence, l'outil de reconnaissance de la séquence de détection (anticorps ou l'un de leurs fragments fonctionnels) selon la présente invention est, au préalable, fixés sur un support essentiellement solide ou tout support réactionnel permettant de réaliser un test immunologique. La fixation au support est réalisée, de préférence, par adsorption ou liaison covalente. Une éventuelle étape de lavage permet de supprimer après ladite fixation les anticorps non fixés audit support le cas échéant. Etapes 11-111-(1V): Lorsque l'échantillon contient des molécules contenant au moins cet antigène, des molécules de périostine, ces dernières via l'épitope vont se lier spécifiquement aux anticorps pouvant être (technique sandwich) ou pas (technique de compétition) préalablement fixés sur support adapté. Ainsi, la détection de la périostine permet de déterminer le niveau d'expression de cette protéine et, compte tenu du fait que l'anticorps est dirigé contre un épitope très exposé dans la partie commune de la périostine, ce procédé de détection permet de déterminer le niveau d'expression de la périostine totale, toutes formes confondues de la protéine. La mise en oeuvre de ce procédé de détection, grâce aux séquences de détection SI' selon l'invention et l'anticorps tels que définis ci-dessus, est particulièrement intéressant car il va permettre de mieux comprendre ou définir les rôles de la périostine dans certains processus biologiques car cette protéine de la matrice extracellulaire du périoste est impliquée dans différents métabolismes et phénomènes biologiques, pathologiques ou non encore mal compris. Ainsi, ce procédé de détection permet de mieux définir, comprendre et déterminer entre autres, l'activité métabolique de l'os au cours de la vie d'un individu donné. Puisque la périostine est fortement exprimée au niveau périostéal et que le périoste est une structure dont le rôle est capital pour la solidité osseuse, il a été envisagé d'utiliser cette protéine comme marqueur de l'activité métabolique du périoste. Ainsi, le niveau d'expression de ce marqueur pourra être un indicateur de l'action d'hormones ou d'agents thérapeutiques sur le périoste. Contrairement à l'implication de la périostine dans les mécanismes du cancer, aucune publication n'a encore fait état de son utilité comme marqueur du remodelage osseux, et plus particulièrement du métabolisme périostéal. Dans une variante de mise en oeuvre, le procédé de détection de la périostine, dans un échantillon biologique in vitro, est basé sur la technique de dosage ELISA par compétition et comprend les étapes suivantes I'. Fixer sur un support approprié un peptide SP antigène synthétique biotinylé comprenant tout ou partie de l'épitope contenu dans SP et en particulier dans SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 SEQ ID N°3 et/ou dans une séquence homologue à l'une de celles-ci, le degré d'homologie étant tel que défini ci-dessus, II'. Mettre en présence ledit support de l'étape I' avec, d'une part, un échantillon biologique susceptible de contenir la périostine et, d'autre part, des anticorps dirigés contre au moins l'un desdits peptides SP tels que décrits ci-dessus ou l'un de leurs fragments fonctionnels, II'.1. Effectuer au moins un lavage, I O III'. Révéler les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés, IV'. Doser les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés par mesure du marquage ou de la densité optique pour en déduire la concentration de la périostine contenue dans l'échantillon. Plus la densité optique est faible, plus l'échantillon biologique contient de périostine. 15 Dans une autre variante de mise en oeuvre, le procédé de détection de la périostine, dans un échantillon biologique in vitro, est basé sur la technique ELISA dite � sandwich � et comprend les étapes suivantes : I". éventuellement fixer sur un support approprié les anticorps ou au moins l'un de 20 leurs fragments fonctionnels tels que définis ci-dessus, II". mettre en présence un échantillon contenant potentiellement ledit antigène correspondant à tout ou partie de SP et en particulier de SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 SEQ ID N°3 et/ou d'une séquence homologue à l'une de celles-ci, avec les anticorps ou au moins l'un de leurs fragments fonctionnels tels que définis précédemment, 25 II".1. effectuer au moins un lavage, III". détecter/révéler les complexes anticorps-antigènes éventuellement formés. Proçédé_de-déteçt-gn et___. ge__de-la--pçnost.iie sous -carboxylée _à distinguer de-1a périostine-çarboxylée (pc) 30 Ce procédé défini supra comprend les étapes IP"IP"`.1 IPs` 2 IPs` 3 1IP" IIIP'IVP" Les séquences de détection SP et les moyens de détection y associés (outil de reconnaissance de SP -de préférence les anticorps-), permettent aussi de détecter et de doser des formes particulières pc et psc de la périostine. En effet, il est du mérite des inventeurs d'avoir observer que la périostine pc carboxylée présente plus d'affinité pour certains supports de 35 fixation et en particulier pour l'hydroxyapatite (de préférence en cristaux) qui entre dans la constitution de la matrice minérale de l'os. On décrit ci-après un mode préféré de mise en oeuvre. Etape I°".1- Tout d'abord l'échantillon biologique contenant la périostine est mis en contact avec des cristaux d'hydroxyapatite. l''.2- On agite puis on centrifuge. Le surnageant contenant la périostine psc est récupéré. III'. On met en présence ce surnageant avec des moyens de détection selon l'invention : Ac anü périostine. IIh'. On met en évidence les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés; IVE On dose ces complexes Ac anti-périostine/SP formés pour en déduire la concentration 10 en périostine psc dans le surnageant, et in. fine dans l'échantillon. Le taux de périostine pc est quant à lui déterminé indirectement, c'est-à-dire qu'il correspond à la différence entre le taux de périostine totale (déterminé par dosage de l'échantillon biologique n'ayant pas subi de traitement) et le taux de périostine psc (déterminé par dosage 15 de l'échantillon biologique traité à l'hydroxyapatite tel que mentionné ci-dessus). En d'autres termes, ce procédé de détection et dosage de la périostine pc consiste essentiellement à: t. mettre en oeuvre un échantillon biologique, 2. doser la périostine totale dans cet échantillon biologique, 20 3. doser la périostine psc dans cet échantillon biologique, 4. faire la différence entre la concentration en périostine totale et la concentration en périostine psc dans cet échantillon biologique, de façon à obtenir la concentration en périostine pc dans cet échantillon biologique. 25 Comme autres supports de fixation de pc ou de psc par affinité, on peut citer notamment le sulfate de barium. De préférence, les procédés de détermination du niveau d'expression de la périostine totale et sous-carboxylée se font directement par ELISA avec les anticorps tels que définis dans la présente demande, dirigés contre tout ou partie de la SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID 30 N°3 ou l'une de leurs séquences homologues présentant un degré d'homologie vis-à-vis de l'une des susdites séquences tel que défini ci-dessus. Le taux de carboxylation de la périostine a un impact dans certaines pathologies, par conséquent la détermination de ces deux taux de périostine (carboxylée et sous-carboxylée) 35 peut s'avérer essentielle dans le diagnostic, le suivi ou le pronostic de pathologies. Les inventeurs ont pu détecter des formes carboxylées de périostine dans le sérum de patients sains. Ils ont également constaté une augmentation des taux sériques de périostine totale chez des patients atteints de cancer de la prostate avec métastases osseuses ainsi qu'une augmentation des taux sériques de périostine carboxylées chez ces mêmes patients en comparaison avec les patients sains. Il apparaît donc que les procédés et moyens selon la présente invention (séquence de détection et/ou outil de reconnaissance des séquences de détection SP, de préférence les anticorps anti- périostine) sont utilisés afin de déterminer essentiellement : - le niveau d'expression de la périostine totale (sans distinction d'isoformes ou de modifications post-traductionnelles comme carboxylation, glycosylation, nitration, isomérisation... - le niveau d'expression respectivement de la périostine décarboxylée et de la périostine carboxylée (indirectement) par rapport au niveau d'expression de la périostine totale, - l'activité métabolique du périoste, le niveau de remodelage osseux et/ou du cartilage articulaire, a) lié à l'âge, h) lié à un changement hormonal, e) lié à l'activité physique d) lié à la présence de cellules tumorales, - le niveau de minéralisation vasculaire, - la présence ou non de métastases osseuses, de préférence de métastases osseuses du cancer du sein et de la prostate, - le niveau de réponse stromale aux métastases osseuses du cancer du sein, - la présence ou non des réactions de fibrose liées aux tumeurs. Appliçatipps__,du_..procédé___de.._détecion__selon__ l'invention___ dans __ l'étude__ de.__phénomènes biologiques__ impliquant__ la_ périostine,._dans_ __le__diagnostic,__le___suivi__ou_ le_pronostiç__d°une pathologie impliquant _la_périostinou_dans _la_determinati l'efficacité _d'un _médicament adapté au traitement_ d'une_pathologie impliquant la_ périostine Les moyens et procédés selon l'invention ouvrent de nombreuses portes pour la compréhension et le traitement de pathologies impliquant la périostine, telles que le cancer, les pathologies osseuses telles que l'ostéoporose, les métastases osseuses du cancer du sein et de la prostate et d'autres origines, le myélome, ou les pathologies ostéoarticulaires telles que l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite, les fibroses notamment hépatique, et les maladies cardiovasculaires. Par ailleurs, en plus de son rôle physiologique dans l'os, de nombreuses études utilisant des modèles in vitro et in vivo ont montré l'implication de la périostine dans différents mécanismes pathologiques tels que le cancer. En effet, on sait que la périostine interagit avec des protéines d'adhésion cellulaires. Elle pourrait avoir un rôle dans l'invasion cellulaire, la survie tumorale, l'angiogenèse et le potentiel métastatique des cellules tumorales. De plus, la périostine joue un rôle dans l'ostéoblastogenèse et pourrait avoir un effet indirect sur l'ostéoblastogenèse, et par conséquent sur l'ostéolyse maligne qui caractérise les métastases osseuses. Ainsi, la détection de la périostine, par le biais d'au moins une nouvelle séquence de détection telle que définie précédemment et au moins un moyen de reconnaissance d'une nouvelle séquence de détection (de préférence un anticorps), est intéressante dans des études cliniques visant non seulement à diagnostiquer, suivre, faire un pronostic ou suivi de traitement, entre autres, des métastases osseuses, des pathologies ostéo-articulaires mais également à constituer une nouvelle approche thérapeutique, entre autres, de l'ostéolyse maligne et de la dégradation du cartilage. De plus, les inventeurs ont pu montrer que lors d'injections de cellules du cancer du sein humaines à une souris, les cellules stromales murines expriment la périostine en réponse à la présence des cellules tumorales humaines. Ainsi, le dosage de la périostine peut être intéressant pour estimer son rôle potentiel dans la réaction stromale et permettre ainsi la détection très précoce de la périostine lors des processus métastatiques osseux avant la résorption de l'os et donc avant la détection possible par imagerie et avant la détection d'une modification dans le dosage des marqueurs connus du remodelage osseux. D'où il s'ensuit que l'invention concerne également: i. un procédé de mise en évidence et d'évaluation d'un phénomène biologique non pathologique impliquant la périostine, ii. un procédé de diagnostic, de suivi ou de pronostic d'une pathologie impliquant la périostine, iii. et un procédé de détermination de l'efficacité d'un médicament adapté au traitement d'une pathologie impliquant la périostine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre le procédé selon l'invention tel que décrit supra. Ces procédés (i), (ii) & (iii) consistent plus précisément et essentiellement : 1. à mettre en oeuvre un échantillon biologique susceptible de contenir de la périostine ou provenant du sujet faisant l'objet d'un diagnostic, d'un suivi, d'un pronostic d'une pathologie impliquant la périostine ou d'une détermination de l'efficacité d'un médicament adapté au traitement d'une pathologie impliquant la périostine, H. à mettre en présence ledit échantillon biologique avec un outil de reconnaissance spécifique de la périostine tel que défini précédemment, de préférence un anticorps ou l'un des fragments fonctionnels de celui-ci tel que défini ci-dessus, II1. à mettre en évidence la périostine en détectant les éventuels complexes immunologiques Ac anti-périostine/SP éventuellement formés, IV. et éventuellement à doser ces complexes Ac asti périostine/SP formés pour en déduire la concentration en périostine dans l'échantillon. Suivant une modalité intéressante de l'invention, il est prévu dans le procédé (i) que le phénomène est choisi dans le groupe de phénomènes comprenant: l'activité métabolique de l'os, en particulier du périoste, le remodelage de l'os et/ou du 5 cartilage articulaire en fonction de l'âge, du changement hormonal, de l'activité physique, l'ossification intramembranaire, le phénomène de minéralisation vasculaire. Suivant une autre modalité intéressante de l'invention, il est prévu dans le procédé (ii), qu'au terme de l'analyse quantitative (étapes I-II-III-IV) in vitro de la périostine présente dans un 10 échantillon biologique d'un sujet, on compare la concentration en périostine mesurée dans l'échantillon avec une concentration de référence correspondant à l'existence ou à l'absence de pathologie impliquant la périostine chez un sujet témoin de la même espèce . De préférence, la concentration de référence correspond soit à une absence de pathologie, soit à l'existence d'une pathologie à un stade déterminé. Ce choix peut être fait par l'homme du 15 métier en fonction du marqueur sélectionné ainsi que de la technique utilisée. A titre d'exemple, la concentration de référence qui délimite l'état pathologique de l'état non pathologique pour différentes techniques, correspond à la valeur au dessus du 95'ème de préférence au dessus du 97,51en1e percentile des valeurs des sujets sains ou contrôles. 20 La pathologie considérée dans les procédés (ii) & (iii), est e.g. choisie dans le groupe de pathologies comprenant: • les pathologies osseuses de préférence dans le sous-groupe comprenant l'ostéoporose, les métastases osseuses du cancer du sein et de la prostate et d'autres origines, le myélome, et la dysplasie fibreuse 25 • et les pathologies ostéoarticulaires de préférence dans le sous-groupe comprenant l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite • les fibroses notamment hépatique et les maladies cardiovasculaires. Néçessaire_de_détection_et_de_d____sage_in vitro de.la_périostine, dans.un_chantillon biologique 30 Ce nécessaire regroupe un certain nombre d'élément utiles pour la mise en oeuvre du procédé susdécrit de détection et de dosage in vitro de la périostine totale, dans un échantillon biologique, à savoir notamment : des moyens de détection de la périostine selon l'invention, qui sont de préférence des Ac anti périostine générés au moyen des séquences SP, 35 -* des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac anti périostine/SP formés, selon les étapes III, voire IV, décrites ci-dessus, --> et une notice de mise en oeuvre. L'invention vise également un nécessaire de détection et de dosage de la périostine souscarboxylée psc comprenant: --> des moyens de détection de la périostine ù> des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac anii-périosline/SP formés selon les étapes III, voire IV décrites ci-dessus, ù > un support pour la mise en oeuvre des étapes I"''.et II' ° décrites ci-dessus, c'est-à-dire un support apte à fixer la pc de préférence à la psc ou inversement, ledit support étant : • avantageusement un support ayant une affinité vis-à-vis du pc supérieure à celle vis-à-vis dupsc, • et, de manière plus avantageuse, un support comprenant de l'hydroxyapatite, • et, de manière encore plus avantageuse, un support comprenant de la matrice minérale osseuse comprenant de l'hydroxyapatite sous forme de cristaux. ù > et une notice de mise en oeuvre. 20 EXEMPLES Les exemples qui suivent illustrent la présente demande. L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère aux figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente les séquences peptidiques des SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ 25 ID N°3. - la figure 2 représente les séquences des isoformes (SEQ ID N°4 à SEQ ID N°54) ainsi que les espèces dans lesquelles la séquence SEQ ID N°1 est présente avec 100% d'homologie, ainsi que les séquences humaine SEQ ID N°4 et murine SEQ ID N°5 avec lesquelles les séquences SEQ ID N°2 et SFQ ID N°3 présentent 100% d'homologie 30 respectivement. - la figure 3 montre des courbes de titration pour la détermination de la concentration en anticorps spécifique du peptide de séquence SEQ ID N°1 en fonction de la quantité de peptide (SEQ ID N°1) biotinylé fixé sur la plaque (figure 3A) et une courbe de titration de l'antisérum pour différentes concentrations du peptide (SEQ ID N°1) adsorbé sur la plaque ELISA 35 (comme indiqué). - la figure 4 représente la courbe standard de dosage par ELISA du peptide contenant la SEQ ID N°1 15 - la figure 5 représente une analyse en western blot de la reconnaissance des périostines recombinantes humaine et marine par l'antisérum spécifique du peptide de séquence SEQ ID N°1. - la figure 6 est une représentation graphique de dosages de la périostine à l'aide de l'anticorps spécifique de la séquence de détection SEQ ID N°1 selon l'invention, chez des individus sains et des individus atteints de cancer du sein avec ou sans métastases osseuses. - la figure 7 montre une analyse immunohistochimique de section de tissu osseux de tibia de souris en cours croissance (fig.7 A) et adulte (fig.7 B) marqué avec l'antisérum spécifique du peptide de séquence SEQ ID N°1. IO Exemple 1 : Procédé de production de l'anticorps anti-périostine selon l'invention. 1. Analyse bioinformatique pour identification de la séquence peptidique immunogène, séquence de détection de la périostine. La sélection bio-informatique se base pour chaque protéine sur: 15 a ù Prédiction d'accessibilité de la séquence de détection : - prédiction d'accessibilité de la séquence à un solvant sur la base de la séquence d'acides aminés, - prédiction de la structure secondaire, - prédiction d'un domaine trans-membranaire 20 - une analyse de l'accessibilité en surface, si un modèle en trois dimensions est disponible, b Antigénicité : évaluation de la présence de déterminants antigéniques au niveau de la séquence protéique de détection de la périostine : - une prédiction de l'antigénicité basée sur les caractéristiques de la séquence d'acides aminés, 25 - une analyse des paramètres influençant l'antigénicité (possibilité de mutations, flexibilité, modifications post-traductionnelles) c ù Analyse du potentiel de réactivité croisée : - recherche d'homologies intra-espèces - recherche de courtes similitudes intra-espèces 30 d ù Application d'un mode de sélection intégrant les précédentes informations pour sélectionner 3 à 5 peptides (environ 17 acides aminés) 2. Préparation de la séquence peptidique immunogène, de détection de la périostine contenant au moins SEQ ID N°1 (étape a) 35 Le peptide de séquence SEQ ID N°1, dérivé de la séquence de la périostine (numéro d'accession dans GenBank : Q15063) a été produit par la technique de synthèse peptidique sur phase solide en utilisant un blocage réversible de l'amine de l'acide aminé par le Fmoc (9-fluorénylméthylox_ycarbonyl ). La pureté du peptide a été vérifiée par HPLC et par spectrométrie de masse. 20 3. Couplage de la séquence peptidique immunogène de détection de la périostine à une protéine porteuse (étape h) Le peptide servant d'immunogène, synthétisé avec une cystéine supplémentaire du coté C- terminal, est couplé du côté C-terminal à une protéine porteuse qui est la KLH (keyhole limpet hemocyanine) ce qui va permettre une meilleure réponse immunologique vis-à-vis de ce peptide. Le peptide synthétique qui est adsorbé sur les microplaques a été couplé à la biotine (Harlow et Lane, 1988). 4. Injection dudit couple antigène-molécule porteuse à un animal et récupération du sang/sérum (étape c) 2 lapins ont reçu 4 injections par voies intra-péritonéale et sous-cutanée aux jours JO, J14, J28 et J58 de lml d'un mélange (50%/50%) d'une solution contenant 200�g du peptide conjugué à la KLH et de l'adjuvant de Freund selon le protocole d'immunisation dans le tableau ci- dessous (étape c). Des prélèvements réguliers (à JO, J36, J70 et J90) de sang ont été effectués pour contrôler la réponse immunitaire (étape d et e). Ce sang est laissé à coaguler pendant 30 minutes puis est centrifugé pendant 10 minutes à 2500 tours par min afin de récupérer le sérum et tester l'immuno-réactivité des anticorps. Jour Protocole 0 TO : Prélèvement de sérum contrôle (4 - 5 ml) et conservation à +4°C 0 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Complet 14 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 28 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 36 Tl : Prélèvement de sérum test (4-5 ml) et conservation à +4°C 58 Injection sous-cutanée (1 ml / lapin) 0,5 ml Antigène + 0,5 ml Adjuvant Freund Incomplet 70 T2 : Prélèvement de sérum test (15 ml) et conservation à +4°C 90 T3 : Prélèvement final et conservation à +4°C 5. Sélection des anticorps spécifiques de 1 'épitope dans les sérums : Titration des antisérums (étape d) Les anticorps anti-périostine spécifiques sont sélectionnés dans le sérum avec l'antigène synthétique de séquence peptidique comprenant au moins une séquence de 6 à 30 acides aminés contenant au moins la séquence SEQ ID N°1 produits ci-dessus grâce à la détermination de l'immunoréactivité du sérum de lapin par la technique ELISA. L'antisérum avec le meilleur titre a été sélectionné pour la mise au point de l'ELISA de compétition (Harlow et Lane, 1988). Les titres des antisérums ont été réalisés en adsorbant, 2h à température ambiante, le peptide antigénique conjugué à la biotine dilué avec du tampon de revêtement ("coating") sur des plaques revêtues de streptavidine (Nunc, Danemark). Le peptide antigénique biotinylé est dilué à 0 ; 2 ; 5 ; 10 ; 15 et 50 ng/ml. Après lavage, 50 pl d'antisérums dilué du 1/100 au 1/1.000.000 sont ajoutés à 50 �l de tampon de dilution dans les puits et sont mis à incuber pendant 2h à température ambiante. Après lavage, 100 �l d'anticorps secondaire, couplé à la peroxydase, dirigé contre les immunoglobulines de lapins sont ajoutés pendant une heure à température ambiante. Les puits sont lavés et 100 �l de substrat (TMB) sont ajoutés. La réaction est stoppée avec 100 �l d'H2SO4. La figure 3 A illustre cette titration de l'antisérum contenant l'anticorps dirigé contre le peptide de détection de la périostine contenant SEQ ID N°1. On lit en abscisses les différentes dilutions de l'antisérum (de 0 à 1/16384000) et en ordonnées la densité optique à 450 nm. La figure 3 B illustre la relation entre la concentration en peptide biotinylé coaté et la dilution en anticorps. Le IC 50 est la dilution de l'anticorps correspondant à 50% de la densité optique maximale obtenue avec la plus forte concentration d'anticorps donc la plus petite dilution. Le � coating � à 10 ng/ml sera choisi car on atteint une phase plateau à cette concentration. L'IC50 pour un coating à 10 ng/ml est de 197800. 6. Purification des anticorps (étape e) Les étapes d'immuno-purification des anticorps sont réalisées suivant les protocoles décrits 25 dans la publication Thomas V et al dans J Immunol Methods. 2004 Sep;292 (1-2):83-95. Exemple 2 - ELISA de compétition pour la périostine via la séquence de détection SEQ Ill N°1 Le peptide contenant au moins la SEQ ID N°1 conjugué à la biotine dilué avec du tampon de 30 revêtement ("coating") est adsorbé sur des plaques, revêtues de streptavidine, pendant 2h à température ambiante. Après lavage, 50 �l d'antisérums (lapin) dilués au titre optimal sont ajoutés à 50 pl de standard (peptide synthétique dilué dans du tampon) ou à 50 �l d'échantillons à doser susceptible de contenir de la périostine et sont laissés à incuber pendant 2h à température ambiante. Après lavage, 100 �l d'anticorps secondaire couplés à la 35 peroxydase dirigés contre les immunoglobulines de lapins sont ajoutés pendant une heure à température ambiante. Les puits sont lavés et 100 �1 de substrat (TMB) sont ajoutés. La réaction est stoppée avec 1001.11 d'H2SO4. En affinant le titre par un test de déplacement, on obtient un titre de 180000 et on détermine les différents points de la gamme standard. Une courbe standard ou de calibration a été obtenue sur un graphe semi logarithmique en dosant les 7 standards (de 1,33 à 1000 ng/ml) avec l'antisérum dirigé contre la séquence SEQ ID N°1 sélectionné pour son titre (figure 4). La concentration en périostine dans les échantillons est obtenue par extrapolation de la courbe de calibration. La détection limite de cet essai a été déterminée par le calcul de la moyenne de 20 déterminations du standard 0 auquel on retranche trois fois la déviation standard. La détection limite est de 0,39 ng/ml. Les performances analytiques de l'ELISA ont été vérifiées en effectuant : 1) des tests de dilution : un échantillon sérique est dosé pur et dilué (cf Tableau 1). Tableau 1 : Tests de dilution de 3 sérums dans le dosage de la périostine par ELISA Pourcentage Concentration de dilution en périostine Recouvrement (%) du sérum (ng/ml) 1-(valeur attendue - valeur mesurée/valeur attendue) A 100% 20,53 100 90% 20,38 110 100 80% 22,00 134 121 •100 70% 19,44 135 123 101 100 60% 18,76 152 138 114 113 100 50% 17,01 166 150 124 122 109 100 40% 12,84 156 142 117 116 103 94 100 30% 9,93 161 146 120 119 106 97 103 100 20% 5,43 132 120 99. 98 87 80 85 82 100 10% 1,18 58 52 43 43 38 35 37 36 44 B 100% 5,96 100 90% 5,38 100 100 80% 5,43 114 114 .100 70% 4,71 113 113 99 100 60% 4,48 125 125 110. 111 100 50% 3,63 122 121 107-. 108 97 100 40% 2,53 106 106 93 94 85 87 100 30% 2,06 116 115 101- 102 92 95 109 100 20% 1,61 135 134 118 119 108 111 127 117 100 10% 0,43 73 72 64 64 58 60 69 63 54 15 28 2946349 C 100% 2,89 100 90% 2,22 86 100 80% 2,50 108 126 . -100- 70% 2,25 111 130 03 100 60% 1,88 108 127 100 97 100 50% 1,86 129 151 119 116 119 100 40% 1,11 96 112 89 86 89 80 100 30% 1,16 134 157 124 121 124 104- 140 100 20% 0,59 102 119 '94 92 94 79 106 76 100 10% 0 05 17 20 16 16 16 13 18 13 17 Comme le montre le tableau 1 en partant du sérum pur les dilutions ne sont pas correctes (gris clair). Pour chacun des 3 échantillons, en partant du sérum dilué à 80%, de bons recouvrements sont obtenus pour les dilutions de 10 en 10% (gris foncé). Ainsi, par soucis 5 d'économie des échantillons, des sérums dilués à 50% soit au '/2 seront utilisés et ces sérums pourront encore être dilués de 10 en 10% jusqu'à 20% soit 1/5 du sérum pur. 2) des tests de précision intra et inter essai : le même échantillon (sérum contrôle ou peptide standard) est mesuré 20 fois sur une même plaque (intra-essai) ou le même échantillon 10 (sérum contrôles ou peptide standard) est mesuré dans 10 plaques différentes (inter-essai) afin de vérifier la variabilité des valeurs obtenues (Tableau 2 et 3). Tableau 2 : Précision de la mesure du peptide de gamme de séquence SEQ ID N°1 intra et inter-essai: Infra-essai Inter-essai Peptide Concentration en Coefficient de Concentration en CV, % gamme peptide périostine variabilité (CV), peptide périostine (ng/ml) (ng/ml) 1,33 1,362 -~- 0,293 21,5 1,3 � 0,25 19,1 2 2,15 � 0,31 12,3 1,92 � 0,25 12,9 4 3,965 � 0,406 10,2 4,01 � 0,52 13 10 10,045 + 0,906 9 9,98 � 0,7 7 40 40,607 + 3,582 8,8 39,8 + 2,48 6,2 100 98,197 � 10,93 11,1 100,84 � 8,24 8,2 400 425,426 + 39,816 9,4 420,25 + 37,75 9 1000 898,435 :E 77,993 8,7 901,65 � 62,66 6,9 On constate une répétabilité correcte (CV 15 Exemple 3 - Analyse Western blot de la spécificité de l'antisérum contenant l'anticorps anti-périostine Cette technique d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet de séparer des protéines préalablement dénaturées, selon leurs poids moléculaire. Les échantillons sont repris dans une 20 solution de Lithium Dodecyl Sulfate (tampon NuPAGE"' LDS) et d'agent réducteur. Ils sont ensuite dénaturés à 70°C pendant 10 minutes puis déposés sur gel pour migration des protéines à 200V (180mA) pendant 40min. Le transfert des protéines du gel de polyacrylamide sur une membrane de PolyVinyliDene Fluoride (PVDF) est suivi d'une détection des protéines immobilisées par l'antisérum 25 spécifique de la periostine. Pour l'immunodétection, la membrane est placée dans un tampon de saturation TBS-Tween 0.1%-Lait 3% pendant une heure à température ambiante. La membrane est lavée rapidement dans du tampon de lavage puis incubée avec l'antisérum dilué au 1/1000 pendant une heure à température ambiante. Après trois lavages de 5 minutes, la membrane est incubée l h à température ambiante en présence de l'anticorps secondaire anti- 30 lapin dilué au 1/10000. La membrane est à nouveau rincée 3 fois 5 minutes. La membrane est incubée 1 minute dans une solution chimioluminescente (kit ECL, Amersham). Elle est5 exposée au contact d'un film photographique pendant un temps variable (lmin-5min) dans une cassette d'autoradiographie. Le film est ensuite révélé par incubation de quelques secondes à une ou deux minutes dans du révélateur puis rincée à l'eau et fixé une minute dans du fixateur. La figure 5 correspond à une photographie d'un western blot sur lequel les périostines recombinantes murine et humaine servent d'échantillons contrôles. Une bande pour chaque échantillon respectif est observée entre 80 et 110 kDa. La périostine ayant une taille théorique de 90kDa, on constate donc que l'antisérum contenant les anticorps anti-périostine spécifiques de l'antigène synthétique de séquence peptidique comprenant au moins une séquence de 6 à 30 acides aminés contenant au moins la séquence SEQ ID N°l, reconnait spécifiquement la périostine humaine et murine. Exemple 4 - Détermination du niveau de périostine sérique chez des patients atteints de 15 cancer du sein avec métastases osseuses et des sujets contrôles Des échantillons sériques issus de 30 patientes à jeun atteintes de cancer du sein (département de médecine de l'Institut Jules Bordet de Bruxelles) sont analysés. Avant d'effectuer les dosages, tous les échantillons sériques avaient été conservés à -70°C. Le cancer du sein a été 20 confirmé par analyse histologique pour chacune des patientes. Parmi les 30 patientes atteintes du cancer du sein, 15 présentent des métastases osseuses visibles en radiologie. Les patientes étaient sous traitement antinéoplasique stable depuis au moins 4 semaines et n'ont pas reçu de traitement aux bisphosphonates au cours des 4 mois précédents. Les patientes n'ont pas d'antécédents d'autres maladies osseuses métaboliques. Les taux de périostine sérique ont 25 aussi été mesurés chez 18 femmes saines et non traitées (âge moyen 53 ans, répartition entre 46 et 60 ans) recrutées à partir d'un programme de don du sang et ne présentant pas d'antécédents de maladie du sein ou de maladies osseuses métaboliques. Aucun des contrôles sains n'ont eu de traitement qui pourrait interférer avec le métabolisme osseux, incluant l'hormonothérapie substitutive chez les femmes ménopausées. 30 L'âge médian des patientes présentant un cancer du sein avec ou sans métastases osseuses est respectivement de 58 et 66 ans, elles sont positives aux récepteurs aux oestrogènes respectivement dans 40% et 87% des cas. Ces patientes présentent majoritairement des carcinomes mammaires de type ductal (67%). Pour les patientes présentant un cancer du sein avec métastases osseuses, le type de métastases osseuses se réparti également entre le type 35 lytique, blastique et mixte avec une charge métastatique ?5 dans 67% des cas. La figure 6 correspond à un graphique illustrant les résultats d'une étude clinique sur des individus sains et des individus atteints de cancer du sein présentant ou pas des métastases osseuses, à l'aide du marqueur périostine via la séquence de détection SEQ ID N°1 selon l'invention. On constate que le taux de périostine sérique moyen détecté est significativement plus élevé chez les individus métastasés (5,16 � 15,12 ng/ml) que chez les individus sans métastases osseuses (3,14 � 4,84 ng/ml) ou sains (2,37 � 2,56 ng/ml). Ceci montre que la périostine globale sérique via la séquence de détection SEQ ID N°1 selon l'invention est un bon indicateur de la présence des métastases osseuses du cancer du sein. Exemple 5 : Expression de la périostine dans un environnement de métastases osseuses provenant de cancer du sein. L'expression de la périostine est évaluée par PCR et par ELISA avec l'anticorps selon la présente invention dirigé contre la SEQ ID N°1 dans plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer du sein et de prostate qui métastase dans l'os. Les cellules MDA-B02 du cancer du sein sont ensuite injectées dans l'artère de la queue de souris recevant de l'acide zolédronique (biphosphonate) ou un placébo. L'expression de la périostine est déterminée par immunohistochimie (IHC) et PCR quantitative. La périostine sérique et les marqueurs osseux classiques sont également mesurés dans les souris. Les niveaux de périostine sérique sont mesurés chez 30 patientes atteintes de cancer du sein avec métastases osseuses (n=15) ou non (n=15) et chez 16 patientes saines. Aucune des lignées cellulaires humaines cultivées in vitro n'exprime ou ne sécrète la périostine. La périostine murine ùmais non humaine- est cependant exprimée de façon marquée dans le microrenvironnement osseux des souris ayant reçu une injection de cellules MDA-B02 par rapport aux souris contrôle. Les cellules murines stromales secrétent donc de la périostine en réponse à la présence des cellules tumorales humaines injectées. L'immunohistochimie montre que la périostine est localisée dans les cellules stromales de la moëlle osseuse. Grâce à la radiographie et les marqueurs biochimiques classiques du renouvellement osseux, on constate que le traitement à l'acide zolédronique diminue de façon marquée les lésions osseuses mais il a seulement un effet faible sur l'expression de l'ARNm de la périostine et les taux circulants. Ceci montre que l'expression de la périostine n'est pas liée au remodelage osseux en contexte métastatique. Les taux de périostine sériques sont significativement plus élevés chez les patientes atteintes d'un cancer du sein et de métastases osseuses que chez les patientes atteintes d'un cancer du sein mais sans métastases (+64 %, p=0.02) et chez les patientes saines (+117 %, p==0.01). Par conséquent, les métastases osseuses issues du cancer du sein induisent une surexpression de périostine via les cellules stromales. Ainsi, la périostine pourrait-elle être un marqueur biochimique de la réponse précoce des cellules stromales aux métastases osseuses provenant de cancer du sein. Cette détection permettrait de détecter la présence de métastases osseuses avant la résorption de l'os et donc avant la détection possible par imagerie et avant la modification des marqueurs du remodelage osseux d'où la précocité du diagnostic possible. Exemple 6 - Analyse immunohistochimique de sections d'os de souris Les os fixés dans le paraformaldéhyde sont décalcifiés avec une solution d'Osteosoft (Merck, VWR, Val de Fontenay, France) avant déshydratation et inclusion dans de la paraffine selon les techniques usuelles de laboratoire. L'immunohistochimie a été réalisée sur des sections de 7 �m. Brièvement, les sections sont déparaffinées, les péroxydases endogènes sont bloquées et l'antigène est démasqué par une incubation de 1h à température ambiante dans du tampon TRIS-Glycine. Les sites non spécifiques sont bloqués 1 h à température ambiante avec du tampon "PRIS contenant 5% de sérum normal de chèvre (� normal goat serum � NGS). Les sections sont par la suite mises à incuber durant une nuit à 4°C avec l'anticorps primaire dirigé contre la séquence SEQ ID N°1. Comme contrôle de spécificité l'anticorps primaire est préincubé l h à 37°C avec le peptide de séquence SEQ ID N°l puis mis en contact avec les sections durant une nuit à 4°C. Après lavage, suit une incubation à température ambiante pendant 1h avec un anticorps anti IgG de lapin couplé à la peroxydase du raifort (Rabbit IgG HRP-linked Whole Ab; Source: Donkey ; GE I-Iealthcare). Enfin, la peroxydase est mise en présence de DAB (diaminobenzidine) qui donne un marquage brun aux sites immunoréactifs. Une contre coloration est réalisée avec l'hematoxyline de Mayers qui colore les noyaux des cellules en bleu. La figure 7 montre une analyse immunohistochimique réalisée avec l'anticorps spécifique de la SEQ ID N°1 de coupes de tissus osseux. Lorsque des sections d'os de souris en cours de croissance sont mises à incuber en présence de l'antisérum spécifique, une coloration apparait au niveau du périoste (cf. fig. 7A). Au cours de la croissance, l'activité d'apposition périostée (qui permet la croissance radiale de l'os par � ossification intramembranaire �) diminue. Notre analyse montre que le périoste des souris adultes est plus fin et non marqué par l'anticorps spécifique de la SEQ ID N°1 (cf. fig. 7B). Cela suggère que la SEQ ID N°1 est un marqueur de l'ossification intramembranaire et de l'apposition périostée. REVENDICATIONS1- Séquence peptidique SP de détection de la périostine, caractérisée en ce qu'elle comprend de 6 à 30 acides aminés et inclut tout ou partie de la séquence peptidique SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 84%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. 2- Séquence nucléique codant la séquence de détection SP telle que définie dans la revendication 1. 3- Moyens de détection de la périostine, caractérisés en ce qu'ils comprennent un outil de reconnaissance spécifique d'une ou plusieurs séquences peptidiques SP selon la revendication 1; cet outil comportant au moins un anticorps anti-périostine et/ou au moins l'un de ses fragments fonctionnels (Ac anti-périostine), spécifiques de SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3 ou d'une séquence peptidique présentant un degré d'homologie supérieur ou égal à 80%, de préférence supérieur ou égal à 85% vis-à-vis d'au moins l'une des séquences SEQ ID N°1, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. 4- Procédé de production de moyens de détection de la périostine, en particulier d'Ac anti-périostine, selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à : a. mettre en oeuvre au moins un antigène représenté par une séquence peptidique SP telle que définie dans la revendication 1, b. coupler ledit antigène à au moins une molécule porteuse, c. récupérer du sang/plasma/sérum d'un animal auquel a été préalablement injecté le couple antigène-molécule porteuse, d. sélectionner les anticorps spécifiques de SP en mettant le sérum/plasma récupéré à l'étape d) avec des antigènes SP, e. éventuellement purifier les anticorps. 5- Procédé de détection et éventuellement de dosage de la périostine totale dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à : 1. mettre en oeuvre un échantillon biologique, II. mettre en présence ledit échantillon biologique avec des moyens de détection selon la revendication 3, III. mettre en évidence les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés; IV. éventuellement doser ces complexes Ac anti-périostine/SP foiniés pour en déduire la concentration en périostine dans l'échantillon. 6- Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend une étape (iv) qui consiste en un dosage ELISA, de préférence un dosage ELISA dit � par compétition � ou � sandwich �. 7- Procédé selon la revendication 5 ou 6 caractérisé en ce que la périostine à détecter et à doser est la périostine sous-carboxylée (psc), à distinguer de la périostine carboxylée (pc) et en ce qu'il consiste essentiellement à: IPSO.- mettre en oeuvre un échantillon biologique, I" . 1- mettre en présence dans un milieu donné ledit échantillon biologique avec un support apte à fixer la pc de préférence à la psc ou inversement, ledit support étant : • avantageusement un support ayant une affinité vis-à-vis du pc supérieure à celle vis-à-vis du psc, • et, de manière plus avantageuse, un support comprenant de l'hydroxyapatite, • et, de manière encore plus avantageuse, un support comprenant de la matrice minérale osseuse, I"'.2- éventuellement agiter ledit milieu, IPS` 3- une fois la fixation effectuée, séparer (de préférence par gradient de densité, et, plus préférentiellement encore, par centrifugation) le support de fixation chargé en pc ou en psc (de préférence en pc) du reste du milieu, IIP". mettre en présence le support de fixation chargé en pc ou en psc (de préférence en pc) ou le reste du milieu avec des moyens de détection selon la revendication 3, cette dernière alternative étant préférée, IIIPS°. mettre en évidence les éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés; IVP". doser ces complexes Ac anti-périostine/SP formés pour en déduire la concentration en périostine pc dans le support de fixation ou en périostine psc dans le reste du milieu, cette dernière alternative étant préférée, et in fine dans l'échantillon. 8- Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la périostine à détecter et à doser est la périostine carboxylée (pc) et ce qu'il consiste essentiellement à: 1. mettre en oeuvre un échantillon biologique, 2. doser la périostine totale dans cet échantillon biologique, 3. doser la périostine psc dans cet échantillon biologique, 4. faire la différence entre la concentration en périostine totale et la concentration en périostine psc dans cet échantillon biologique, de façon à obtenir la concentration en périostine pc dans cet échantillon biologique. 9- Procédé de mise en évidence et d'évaluation d'un phénomène biologique non pathologique impliquant la périostine, ou de diagnostic, de suivi ou de pronostic d'une pathologie impliquant la périostine, ou de détermination de l'efficacité d'un médicament adapté au traitement d'une pathologie impliquant la périostine, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en oeuvre le procédé selon au moins l'une des revendications 5 à 8. 10- Procédé selon la revendication 5 et éventuellement au moins l'une des revendications 6 à 9 caractérisé en ce qu'au terme de l'analyse quantitative (étapes I-II-III-IV) in vitro de la périostine présente dans un échantillon biologique d'un sujet, on compare la concentration en périostine mesurée dans l'échantillon avec une concentration de référence correspondant à l'existence ou à l'absence de pathologie impliquant la périostine chez un sujet témoin de la même espèce . 11- Procédé selon la revendication 9 de mise en évidence et d'évaluation d'un phénomène biologique non pathologique impliquant la périostine, caractérisé en ce que ledit phénomène est choisi dans le groupe de phénomènes comprenant: l'activité métabolique de l'os, en particulier du périoste, le remodelage de l'os et/ou du cartilage articulaire en fonction de l'âge, du changement hormonal, de l'activité physique, l'ossification intramembranaire, le phénomène de minéralisation vasculaire. 12- Procédé selon la revendication 9 de diagnostic, de suivi ou de pronostic d'une pathologie impliquant la périostine, ou de détermination de l'efficacité d'un médicament adapté au traitement d'une pathologie impliquant la périostine, caractérisé en ce que cette pathologie est choisie dans le groupe de pathologies comprenant: • les pathologies osseuses de préférence dans le' sous-groupe comprenant l'ostéoporose, les métastases osseuses du cancer du sein et de la prostate et d'autres origines, le myélome, • et les pathologies ostéoarticulaires de préférence dans le sous-groupe comprenant l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite, les fibroses notamment hépatique, et les maladies cardiovasculaires. 13- Nécessaire de détection et de dosage in vitro de la périostine, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection de la périostine selon la revendication 3, des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés, selon les étapes III, voire IV, du procédé selon la revendication 5, et une notice de mise en oeuvre. 14- Nécessaire de détection et de dosage de la périostine sous-carboxylée psc, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection de la périostine selon la revendication 3, des réactifs et du matériel pour la mise en évidence, voire le dosage, des éventuels complexes Ac anti-périostine/SP formés selon les étapes III, voire IV, du procédé selon la revendication 5, un support pour la mise en oeuvre des étapes IP".et II' du procédé selon la revendication 7, c'est-à-dire un support apte à fixer la pc de préférence à la psc ou inversement, ledit support étant : • avantageusement un support ayant une affinité vis-à-vis du pc supérieure à celle vis-à-vis du psc, • et, de manière plus avantageuse, un support comprenant de l'hydroxyapatite, • et, de manière encore plus avantageuse, un support comprenant de la matrice minérale osseuse comprenant de l'hydroxyapatite sous forme de cristaux. et une notice de mise en oeuvre.