Brevet FR2938343A1 — publié le 20100514

L'invention concerne le criblage de composés modulateurs des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 (GPD1), utiles pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200�g/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. La dermite séborrhéique est une dermatose inflammatoire cutanée fréquente se présentant sous la forme de plaques rouges, recouvertes de squames grasses et jaunâtres, plus ou moins prurigineuses, prédominantes dans les zones séborrhéiques. Il existe pour ces maladies un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. La demanderesse a maintenant découvert que les gènes codant pour les protéines CYP2B15 et glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 (GPD1) étaient exprimés préférentiellement dans les glandes sébacées de rat en comparaison avec l'épiderme.30 La demanderesse a plus particulièrement démontré que ces gènes sont exprimés dans un modèle de pharmacologie animale (rat Fuzzy), pertinent pour la pathologie acné et les hyperseborrhéee (Ye et al, 1997, Skin Pharmacol, 10(5-6) :288-97). Plus particulièrement elle démontre que l'expression de ces gènes est modulée in vivo au niveau des glandes sébacées suite à un traitement topique par un ligand PPARy (le 5-{4-[2-(Methyl-pyridin-2-yl-amino)-ethoxy]-benzyl}-thiazolidine-2, 4-dione, l'acide (S)-2-Ethoxy-3-{4-[6-(3-heptyl-1 -methyl-ureido)-pyridin-2-yl]-phenyl}-propionique ou la Rosiglitazone, qui est l'acide 6-(2-Methoxy-ethoxymethoxy)-naphthalene-2-carboxylique [4'-(2,4-dioxo- thiazolidin-5-ylmethyl)-biphenyl-3-ylmethyl]-methyl-amide, à 1%). Il est par ailleurs connu que le traitement par un agoniste PPAR induit une forte diminution de la taille des glandes sébacées, et une réduction de l'hyperséborrhée induite par un androgène (WO2007/093747). Comme les gènes identifiés agissent en aval du récepteur PPAR, ils peuvent servir pour identifier les composés les plus actifs en tant que modulateurs PPAR, les classer, et les sélectionner. Sur cette base, il est donc également proposé une utilisation des gènes CYP2B15 et/ou GPD1 ou des protéines CYP2B15 et/ou GPD1 comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Plus précisément, on peut déterminer la capacité d'un modulateur PPAR à moduler l'expression ou l'activité de CYP2B15 et/ou GPD1 ou l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, in vivo et clinique basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité des protéines CYP2B15 et/ou GPD1. CYP2B15 Le terme "CYP2B15" pour "cytochrome P450, family 2, subfamily b, polypeptide 15" désigne une enzyme de la famille du cytochrome P450, encore appelée EC 1.14.14.1 ou CYPIIB15. GPD1 Le terme "GPD1" désigne la glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, aussi appelée EC 1.1.1.8, GPD-C ou encore GPDH-C; Le gène de GPD1 a été cloné par Menaya, et al, 1995, Biochim. Biophys. Acta 1262: 91-94. Brown, et al, 2002, (J. Biol. Chem. 277: 32899-32904) ont montré que les souris déficiences en Gpd cytosolique étaient phénotypiquement normales, bien qu'elles présentent des anormalités dans certains tissus. Dans le contexte de l'invention, le terme � gène CYP2B15 � ou � gène GPD1 � ou � acide nucléique CYP2B15 � ou � acide nucléique GPD1 � signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou leur produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une CYP2B15 hétérologue et/ou une glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour la ou les enzymes. Chez le rat, il existe trois transcrits alternatifs des gènes CYP2B15 codant pour trois isoformes de CYP2B15 différentes. Des séquences d'ADNc de la CYP2B15 sont reproduites en annexe (SEQ ID No.1, SEQ ID No.3 et SEQ ID No.5). Il s'agit respectivement de la séquence XM_001070774 (Genbank) dont le cadre de lecture ouvert contient 1903 paires de bases, de la séquence XM_001070818 (Genbank) dont le cadre de lecture ouvert contient 1918 paires de bases et de la séquence XM_001070869 (Genbank) dont le cadre de lecture ouvert contient 1879 paires de bases. Le terme "CYP2B15" inclut ces trois isoformes. Une séquence d'ADNc humain de la GPD1 est reproduite en annexe (SEQ ID No.7). Il s'agit de la séquence NM_005276 (Genbank) dont le cadre de lecture ouvert contient 2909 paires de bases. Méthodes de criblage Un objet de l'invention est une méthode in vitro ou in vivo de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de l'une et/ou l'autre de ces enzymes, ou l'expression de leur gène, ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. De préférence, la méthode de criblage comprend la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine CYP2B15 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, et à moduler l'expression ou l'activité de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant, pour l'une et/ou l'autre des enzymes visées, les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de l'une et/ou l'autre enzyme, de l'expression de leur gène ou de l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de l'une et/ou l'autre enzyme, de l'expression de leur gène ou de l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Une méthode de criblage in vivo peut être réalisée chez tout animal de laboratoire, par exemple un rongeur. Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de criblage comprend l'administration à l'animal, de préférence par application topique, du composé à tester, puis éventuellement l'euthanasie de l'animal, et le prélèvement d'un feuillet épidermique, avant évaluation de l'expression du ou des gène(s) marqueur(s) dans le feuillet épidermique, par toute méthode décrite ici. Par � modulation �, on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'une et/ou l'autre de ces enzymes, l'expression du gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité des enzymes, l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par � expression d'un gène � on entend la quantité d'ARNm exprimé ; Par � expression d'une protéine �, on entend la quantité de cette protéine ; Par � activité d'une protéine �, on entend son activité biologique ; Par � activité d'un promoteur �, on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. En particulier, l'invention vise l'utilisation des gènes CYP2B15 et/ou GPD1 ou des protéines CYP2B15 et/ou GPD1 comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Plus précisément, on détermine la capacité d'un modulateur PPAR à moduler l'expression ou l'activité de CYP2B15 et/ou GPD1 ou l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. De préférence, on détermine la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine CYP2B15 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, et à moduler l'expression ou l'activité de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. De manière préférentielle, le modulateur est un modulateur PPARy. Le modulateur PPAR est un agoniste ou un antagoniste PPAR, de préférence un agoniste PPAR. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant les gènes CYP2B15 et/ou GPD1 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. Dans ces méthodes, l'expression des gènes CYP2B15 et/ou GPD1 ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité l'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), RT-PCR quantitative (qRT-PCR), protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûCYP2B15 ou GPD1 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSES pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leur propriété physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme CYP2B15 et/ou GPD1 et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. Les enzymes CYP2B15 et/ou GPD1 peuvent être produites selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elles peuvent également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. La détermination de l'activité enzymatique de GPD1 comprend de préférence la détermination de l'activité déshydrogénase. Une mesure de l'activité GPD est par exemple décrite dans l'article MacDonald et Marshall, 2000, Arch Biochem Biophys, 384(1) :143-53. Les composés sélectionnés par les méthodes de criblage définies ici peuvent ensuite être testés sur d'autres modèles in vitro et/ou in vivo (chez l'animal ou l'homme) pour leurs effets sur l'acné, la dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples : A. DONNEES EXPERIMENTALES CONCERNANT L'ENZYME CYP2B15 25 Exemple 1 : Expression de la protéine CYP2B15 dans l'épiderme de rat Données d'expression sur feuillet (� split �) épidermique de rat Fuzzy Les études sont conduites chez le rat Fuzzy femelle (Hsd : FUZZY-fz) âgé de 10 30 semaines en début d'étude. Les animaux sont traités à la dose de 1% (agoniste PPARg Rosiglitazone en solution dans l'acétone) une fois par jour pendant 8 jours. 2 heures après le dernier traitement, les animaux sont euthanasiés et la peau du dos est prélevée. Après incubation dans de la dispase, l'épiderme portant les glandes sébacée est détaché du derme (feuillet épidermique). Après broyage des échantillons, l'ARNm est préparé à 35 l'aide de colonnes Qiagen, en accord avec les instructions du fournisseur. Le matériel ainsi préparé est soumis à une analyse du transcriptome à large échelle sur une plate-20 forme Affymetrix. Les données sont ensuite normalisées et après analyse statistique les résultats rendus sont exprimés en unité arbitraire d'expression (voir ci-dessous) accompagné pour chaque donnée d'une valeur statistique de présence du transcrit (présence=1 ; absence=0). Tableau 1 : Mesure de l'expression de la CYP2B15 dans un feuillet épidermique après 8 jours de traitement topique de la femelle rat FUZZY par un agoniste PPARy (Rosiglitazone) à 1 %. Identifiant Nom du gène Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix dans la après de de condition traitement l'expression* l'expression* contrôle par dans la après (DMSO) Rosiglita- condition traitement par zone 1% contrôle Rosiglitazone 1% 1387722_ cytochrome 120 35 1 1 at P450, family 2, subfamily b, polypeptide 15 *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). 15 Exemple 2 : Données d'expression dans la glande sébacée de rat après traitement par un agoniste du récepteur PPARgamma : Matériels et méthodes : Animaux: Espèces: rat 20 Souche: Ico : Hsd: FUZZY-fz Sexe: femelle Âge: 10 semaines Nombre par lot : 40 (8 animaux par groupe) 25 Traitement: Voie d'administration : topique Composé/lot : agonistes de PPARgamma: 10 - A : 5-{4-[2-(Methyl-pyridin-2-yl-amino)-ethoxy]-benzyl}-thiazolidine-2,4-dione - B : acide 2-Methoxy-ethoxymethoxy)-naphthalene-2-carboxylique [4'-(2,4-dioxothiazolidin-5-ylmethyl)-biphenyl-3-ylmethyl]-methyl-amide ou rosiglitazone - C : acide (S)-2-Ethoxy-3-{4-[6-(3-heptyl-l-methyl-ureido)-pyridin-2-yl]-phenyl}- propionique Doses : 1% Véhicule : acétone (001) Durée 96 heures Méthode d'évaluation : On réalise une pesée des animaux au début et à la fin de l'étude. Des biopsies de peau sont effectuées (6 échantillons de peau excisées par rat) pour analyser l'expression des gènes (extraction d'ARN, transcriptase inverse et PCR en temps réel). Les échantillons sont conservés la nuit à 4°C avant incubation dans du bromure de sodium (NaBr) 1M pendant 2 heures à 37°C. Après incubation, les échantillons sont séparés en épiderme ou derme. Les échantillons épidermiques sont conservés à 20°C. Dans ces conditions, les glandes sébacées se trouvent dans le feuillet épidermique. Des PCR sont réalisées en commençant par les ADNc provenant des feuillets épidermiques contenant des glandes sébacées de rats contrôle ou rats traités avec un agoniste du PPARy : l'ARNm est extrait en utilisant une colonne et quantifié. La qualité des ARNm est mesurée et est représenté par le rapport 18S/28S. Les résultats sont normalisés au 18S exprimés en induction relative versus animaux non traités (groupe véhicule). L'analyse statistique est obtenue en utilisant un logiciel interne basé sur une analyse statistique Monte-Carlo modifiée. Résultats: CYP2B15 Induction Relative ù Cinétique (Heures) Traitement 0 8 24 48 96 A 1 1.56 0.68 0.29 0.08 B 1 1.05 1.25 0.63 0.83 C 1 0.61 0.18 0.11 0.04 B. DONNEES EXPERIMENTALES CONCERNANT L'ENZYME GPD1 Exemple 3 : Expression de la protéine GPD1 dans l'épiderme de rat Données d'expression sur feuillet (� split �) épidermique de rat Fuzzy30 Les études sont conduites chez le rat Fuzzy femelle (Hsd : FUZZY-fz) âgé de 10 semaines en début d'étude. Les animaux sont traités à la dose de 1% (agoniste PPARg Rosiglitazone en solution dans l'acétone) une fois par jour pendant 8 jours. 2 heures après le dernier traitement, les animaux sont euthanasiés et la peau du dos est prélevée. Après incubation dans de la dispase, l'épiderme portant les glandes sébacée est détaché du derme (feuillet épidermique). Après broyage des échantillons, l'ARNm est préparé à l'aide de colonnes Qiagen, en accord avec les instructions du fournisseur. Le matériel ainsi préparé est soumis à une analyse du transcriptome à large échelle sur une plate-forme Affymetrix. Les données sont ensuite normalisées et après analyse statistique les résultats rendus sont exprimés en unité arbitraire d'expression (voir ci-dessous) accompagné pour chaque donnée d'une valeur statistique de présence du transcrit (présence=1 ; absence=0). Tableau 3 : Mesure de l'expression de la GPD1 dans un feuillet épidermique après 8 jours de traitement topique de la femelle rat FUZZY par un agoniste PPARy (Rosiglitazone) à 1 Identifiant Nom du gène Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix dans la après de de condition traitement l'expression* l'expression* contrôle par dans la après (DMSO) Rosiglita- condition traitement par zone 1% contrôle Rosiglitazone 1% 1371363 glycerol-3- 66 243 1 1 at phosphate dehydrogenase 1 *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). Exemple 4 : Données d'expression dans la glande sébacée de rat après traitement par un agoniste du récepteur PPARgamma : 25 Matériels et méthodes : Animaux: Espèces: rat20 Souche: Ico : Hsd: FUZZY-fz Sexe: femelle Âge: 10 semaines Nombre par lot : 40 (8 animaux par groupe) Traitement: Voie d'administration : topique Composé/lot : agonistes de PPARgamma: - A : 5-{4-[2-(Methyl-pyridin-2-yl-amino)-ethoxy]-benzyl}-thiazolidine-2,4-dione - B : acide 2-Methoxy-ethoxymethoxy)-naphthalene-2-carboxylique [4'-(2,4-dioxo- thiazolidin-5-ylmethyl)-biphenyl-3-ylmethyl]-methyl-amide ou rosiglitazone - C : acide (S)-2-Ethoxy-3-{4-[6-(3-heptyl-l-methyl-ureido)-pyridin-2-yl]-phenyl} -propionique Doses : 1% Véhicule : acétone (001) Durée 96 heures Méthode d'évaluation : On réalise une pesée des animaux au début et à la fin de l'étude. Des biopsies de peau sont effectuées (6 échantillons de peau excisées par rat) pour analyser l'expression des gènes (extraction d'ARN, transcriptase inverse et PCR en temps réel). Les échantillons sont conservés la nuit à 4°C avant incubation dans du bromure de sodium (NaBr) 1M pendant 2 heures à 37°C. Après incubation, les échantillons sont séparés en épiderme ou derme. Les échantillons épidermiques sont conservés à 20°C. Dans ces conditions, les glandes sébacées se trouvent dans le feuillet épidermique. Des PCR sont réalisées en commençant par les ADNc provenant des feuillets épidermiques contenant des glandes sébacées de rats contrôle ou rats traités avec un agoniste du PPARy : l'ARNm est extrait en utilisant une colonne et quantifié. La qualité des ARNm est mesurée et est représenté par le rapport 18S/28S. Les résultats sont normalisés au 18S exprimés en induction relative versus animaux non traités (groupe véhicule). L'analyse statistique est obtenue en utilisant un logiciel interne basé sur une analyse statistique Monte-Carlo modifiée. Résultats: GPD1 Induction Relative ù Cinétique (Heures) Traitement 0 8 24 48 96 A 1 18.52 12.53 6.93 3.42 B 1 6.56 3.66 3.02 0.91 C 1 7.59 11.56 7.50 3.44 13 REVENDICATIONS1. Méthode in vitro ou in vivo de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 (GPD1) ou l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de l'une et/ou l'autre enzyme, de l'expression de leur gène ou de l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de l'une et/ou l'autre enzyme, ou une modulation de l'expression de leur gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de leurs promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de l'une et/ou l'autre enzyme, l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. 30 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, et en ce que l'étape c) 35 consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 20 25 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le ou les gènes codant pour la ou les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes. 7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les cellules sont des cellules 10 transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour les protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste 20 à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant la détermination de la 25 capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine CYP2B15 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, et à moduler l'expression ou l'activité de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 30 12. Utilisation des gènes ou des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. 15 35 13. Utilisation selon la revendication 12, comprenant la détermination de la capacité d'un modulateur PPAR à moduler l'expression ou l'activité des protéines CYP2B15 et/ou glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de leur gène ou l'activité d'au moins un de leurs promoteurs. 14. Utilisation selon la revendication 13, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine CYP2B15 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, et à moduler l'expression ou l'activité de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase 1 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 15. Utilisation selon l'une des revendications 12 à 14, dans laquelle le modulateur PPAR est un modulateur PPARy. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, dans laquelle le modulateur est un agoniste du récepteur PPAR.