Brevet FR2947837A1 — publié le 20110114

t PROCEDE DE CULTURE DE MICRO-ORGANISMES INTRACELLULAIRES UTILISANT UN PROTOZOAIRE COMME HÔTE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de culture de micro-organismes intracellulaires tels que des bactéries, des levures, des protozoaires ou des virus, dans lequel la cellule-hôte est un protozoaire. 10 ARRIERE PLAN DE L'INVENTION Il est bien connu de cultiver des micro-organismes intracellulaires pathogènes ou non pathogènes à l'intérieur de cellules. Pour ce faire, on met en oeuvre in vitro au laboratoire ou à l'échelle industrielle, des 15 lignées cellulaires animales ou humaines. Ces lignées cellulaires peuvent être adhérentes ou non adhérentes. On entend par � lignées adhérentes � des cellules nécessitant pour leur développement d'adhérer à un support et par � lignées non adhérentes � des lignées de cellules cultivées en suspension dans leur milieu nutritif. Il est nécessaire de choisir une lignée cellulaire appelée � cellule-hôte � en fonction 20 du micro-organisme à cultiver. Ce type de procédé de culture présente de nombreux inconvénients. Le temps de doublement des � cellules-hôtes � est particulièrement long, de l'ordre de 24 h. Par ailleurs, les milieux de culture de cellules sont complexes, coûteux et nécessitent pour la plupart l'utilisation d'additifs d'origine animale, tels que du sérum de veau foetal par 25 exemple, qui est non recommandée par la pharmacopée européenne, et/ou l'ajout d'antibiotiques. De plus, il est particulièrement difficile d'extrapoler la culture de ces � cellules-hôtes � à l'échelle industrielle pour deux raisons essentielles : - Quand les cellules sont adhérentes, on est limité par la surface de culture. - Quand les cellules sont non adhérentes, on est limité par les problèmes de transfert 30 d'oxygène car les milieux riches en protéines moussent très rapidement et aucun antimousse compatible n'est connu à ce jour.5 BREVE DESCRIPTION DE L'INVENTION L'un des buts de l'invention est donc de remédier à ces inconvénients en proposant comme alternative à la culture de cellules de mammifères adhérentes ou non adhérentes un procédé de culture de micro-organismes intracellulaires tels que des bactéries, des protozoaires ou des virus par exemple, de conception simple, peu onéreuse et procurant un rendement élevé. A cet effet, et conformément à l'invention, il est proposé un procédé de culture de micro-organismes intracellulaires remarquable en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser une culture d'au moins un protozoaire comme cellule-hôte dans lequel ces micro-organismes intracellulaires prolifèrent. D'autres avantages et caractéristiques ressortiront mieux de la description qui va suivre de plusieurs variantes d'exécution, données à titre d'exemples non limitatifs, du procédé de culture de micro-organismes intracellulaires conforme à l'invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Le procédé de culture de micro-organismes intracellulaires conforme à l'invention consiste à utiliser une culture de protozoaires ciliés ou non, pathogènes ou non, comme cellules-hôtes d'un ou plusieurs types de micro-organismes intracellulaires, apte à franchir la paroi des protozoaires et à se multiplier dans le cytoplasme de ces derniers. Ces micro-organismes se comportent donc en commensaux ou en parasites des protozoaires qui leur servent de milieu de culture. Le procédé conforme à l'invention propose ainsi une alternative au choix d'une lignée cellulaire pour la culture in vitro de micro-organismes intracellulaires. Suivant un. premier mode de _mise en _oeuvre de l'invention, le procédé comporte au moins les étapes suivantes : (a)- culture d'au moins une souche de protozoaire dans un milieu de culture approprié, (b)- ensemencement de la culture de l'étape (a) avec au moins une souche d'un micro-organisme intracellulaire, 3 (c)- incubation, de préférence à une température comprise entre 35 et 39°C, avantageusement voisine de 37°C (+/- 1°C), au cours de laquelle, de préférence pendant une durée comprise entre 2 et 3 jours, les micro-organismes intracellulaires se développent dans le cytoplasme des protozoaires au plus tard jusqu'à la lyse naturelle de ces derniers, (d)-éventuelle lyse des protozoaires anticipée et provoquée, de préférence par un stress mécanique et/ou thermique et/ou chimique û avantageusement par variation de pH- et/ou osmotique et/ou enzymatique, (e)- récupération des micro-organismes intracellulaires produits. La lyse des protozoaires met fin à leur croissance et à la croissance de leurs micro-organismes commensaux ou parasites, et permet de libérer ces derniers, éventuellement de les séparer des débris de protozoaires lysés, puis de les recueillir. Ces micro-organismes multipliés peuvent être ensuite utilisés dans de nombreuses applications. De préférence, l'étape (c) est conduite jusqu'à la lyse naturelle des protozoaires parasités par les micro-organismes intracellulaires. Avantageusement, ce procédé avec une étape (c) conduite jusqu'à la lyse naturelle, comprend une étape (ai) de synchronisation de la culture du protozoaire-hôte avant ensemencement (étape b) en la soumettant à un stress modéré, de préférence un stress physique (température, centrifugation) et/ou chimique, de manière à uniformiser le niveau de développement des protozoaires avant qu'ils ne soient parasités par les micro-organismes intracellulaires et permettre ainsi une culture puis une lyse naturelle ou anticipée et provoquée ([étape (d)] sensiblement synchrone desdits protozoaires et subséquemment une libération également sensiblement synchrone des micro-organismes intracellulaires, ce qui régularise la production de ces derniers. Ce stress modéré selon (al) est à distinguer du stress plus sévère utilisé pour la lyse (totale) anticipée et provoquée, qui peut se substituer ou s'ajouter à la lyse naturelle intervenant conformément à l'étape (c) du premier mode de mise en oeuvre. Ce stress modéré selon (al) n'entraîne pas la lyse des protozoaires, mais fige le développement des protozoaires qui en sont à des stades de développement les plus avancés et cale ainsi le développement de tous les protozoaires à un même stade. L'application d'un stress modéré à une culture de protozoaires est une technique connue de l'homme de l'art : LIOU, JJ; 4 FREDRICKSON, AG; SRIENC, F (1998). Selective synchronisation of Tetrahymena pyriformis tell populations and tell growth kinetics during the tell cycle. Biotechnology Progress 14 Issue:3, 450-456. Cette synchronisation selon (ai) permet de libérer les micro-organismes intracellulaires au 5 même moment et donc d'avoir une production plus régulière de ceux-ci, ce qui représente un atout certain pour une production industrielle. Il importe que la lyse provoquée anticipée de l'étape (d) du premier mode et a fortiori le stress modéré de l'étape(ai) de synchronisation visent spécifiquement les protozoaires et préservent l'intégrité des micro-organismes intracellulaires à produire. 10 Ainsi, même s'il est plus drastique que le stress modéré mis en oeuvre dans l'étape (ai) de synchronisation, le stress de lyse provoquée et anticipée selon l'étape (d) reste avantageusement tempéré en particulier lorsqu'il s'agit d'un stress par choc thermique. Suivant un_deuxieme_mode_de_mise_en oeuvre de_l'invention, le procédé comporte au 15 moins les étapes suivantes: (a')- culture d'au moins une souche de protozoaire dans un milieu de culture approprié, (b')- ensemencement de la culture de l'étape (a) avec au moins une souche d'un micro-organisme intracellulaire, 20 (c')- incubation, de préférence à une température comprise entre 35 et 39°C, avantageusement voisine de 37°C (+/- 1°C), au cours de laquelle, de préférence pendant une durée comprise entre 2 et 3 jours, les micro-organismes intracellulaires se développent dans le cytoplasme des protozoaires sans aller jusqu'à la lyse naturelle de ces derniers, 25 (e')- récupération des protozoaires parasités par les micro-organismes intracellulaires. Contrairement au premier mode de mise en oeuvre, les protozoaires ne sont pas lysés et constituent de ce fait des conteneurs, voire des transporteurs, pour les micro-organismes commensaux ou parasites qui se sont développés dans leurs cytoplasmes. Ces ensembles 30 constituent des produits industriels nouveaux, pour lesquels de nombreuses applications sont également envisageables. Dans ces deux modes de mise en oeuvre, les étapes (a) (a') de culture des protozoaires sont effectuées dans un milieu de culture approprié, tel que le milieu de culture décrit dans la publication DE CONINCK J., BOUQUELET S., DUMORTIER V., F.DUYME & VERDIER-DENANTES I.(2000) Industrial media and fermentation processes for improved growth and protease production by Tetrahymena thermophila BIII Journal of industrial Microbiology and Biotechnology, 24, 285-290. Il est bien évident que les protozoaires peuvent être cultivés sur tout autre milieu de culture approprié bien connu de l'homme de métier, sans pour autant sortir du cadre de l'invention. De tels milieux de culture sont généralement à base d'extrait de levure et de glucose ou de lait écrémé. Ce sont des milieux de culture simples, peu coûteux, sans ajout de sérum de veau foetal ou d'antibiotiques ou autres molécules. De plus, la culture en bioréacteur, également appelé fermenteur ou propagateur, bien connue de l'homme du métier, des protozoaires a été conduite avec succès jusqu'à l'échelle 100 L et également selon la technique en continu avec recirculation des cellules, décrites dans la publication DE CONINCK J., BOUQUELET S., DUMORTIER V., F.DUYME & VERDIER-DENANTES I.(2000) Industrial media and fermentation processes for improved growth and protease production by Tetrahymena thermophila BIII Journal of industrial Microbiology and Biotechnology, 24, 285-290. Les cultures selon l'invention des protozoaires et des commensaux ou parasites qu'ils 20 hébergent peuvent être également effectuées dans un bioréacteur. Après l'obtention d'une biomasse de protozoaire adéquate, l'ensemencement selon les étapes (b) ou (b') de cette culture avec le micro-organisme intracellulaire à produire à grande échelle, est effectué de manière connue en soi et appropriée. Par exemple, un 25 inoculum du micro-organisme, sous forme de suspension liquide, sous forme de poudre ou sous forme de colonies, est mis en contact avec la culture de protozoaires. Les conditions d'incubation dans les étapes (c) ou (c') sont choisies pour optimiser la croissance des micro-organismes à produire dans le cytoplasme de ces protozoaires. La 30 température idéale est généralement entre 35 et 39 °C, avantageusement voisine de 37°C (+/- 1°C). La durée dépend des protozoaires et des micro-organismes à produire, de la température et du milieu de culture, mais elle est par exemple de 2 à 3 jours. Les étapes (e) et (e') de récupération des micro-organismes intracellulaires produits contenus ou non dans leurs hôtes protozoaires sont avantageusement réalisées par tout procédé connu de l'homme du métier. Généralement, les techniques de séparation utilisées sont la décantation, la centrifugation, la filtration, ou analogues. Pour l'étape (e) dans laquelle le milieu de culture comprend les lysats de protozoaires, cette récupération comporte de préférence une phase de filtration pour éliminer les débris de la cellule-hôte. Conformément à l'invention, il est possible d'employer une ou plusieurs souches de protozoaires et une ou plusieurs souches de micro-organismes à multiplier. De préférence, le choix du ou des protozoaires s'opère parmi la liste des espèces suivantes : Tetrahymena thermophila, Colpidium, Paramecium, les amibes, les dinoflagellés, les euglènes et les associations de protozoaires appartenant à tout ou partie de ces espèces; le protozoaire cilié non pathogène Tetrahymena thermophila B3 ATCC 30387 étant particulièrement préféré. Ce protozoaire Tetrahymena thermophila de souche B3 ATCC 30387 peut réaliser des phagocytoses. De plus, il dispose d'un cytostome lui conférant un avantage incontestable supplémentaire par rapport à d'autres souches de protozoaires comme les amibes par exemple qui ne réalisent que la phagocytose. Cet avantage évite la recherche de l'association optimale lignée cellulaire/micro-organismes intracellulaires. Le développement du micro-organisme intracellulaire se fait dans le cytoplasme du protozoaire jusqu'à lyse de celui-ci ou arrêt par lyse par exemple mécanique et/ou thermique modérée et/ou chimique û avantageusement par variation de pH- et/ou osmotique. Par ailleurs, on observera que le protozoaire Tetrahymena thermophila présente l'avantage d'être un organisme G.R.A.S, selon l'acronyme anglo-saxon � Generally Recognized As Safe � procurant une absence de pathogénicité pour l'homme, de pouvoir se cultiver sur des milieux simples et peu coûteux, extrapolable à l'échelle industrielle, avec un temps de génération particulièrement court d'environ 2 h. D'une façon générale, tous les protozoaires pouvant être le siège d'endocytose comme mode de passage de la paroi cellulaire par des particules sont des candidats potentiels pour le procédé selon l'invention. Les micro-organismes intracellulaires commensaux ou parasites des protozoaires support de culture, peuvent être notamment des bactéries, des protozoaires parasites ou non ou des virus. A titre d'exemples de micro-organismes susceptibles d'être produits par le procédé selon l'invention, on peut citer: parasites appartenant ou non au phylum des apicomplexes, virus ou bactéries particulièrement difficiles à cultiver in vitro du fait des conditions environnementales qu'elles nécessitent, à savoir : Listeria, Legionella, Bifidobacterium .. S'agissant des applications du procédé selon l'invention, elles correspondent à tous les cas où l'on a besoin de produire en nombre, en qualité, en rapidité et dans des conditions économiques des micro-organismes d'intérêt. Cela vise notamment les domaines de la santé, de l'alimentaire, de la diététique, du phytosanitaire, de la cosmétique, de la fermentation industrielle, de la biotransformation industrielle (par exemple de matières premières géologiques) et de l'épuration biologique. En particulier, l'invention vise un procédé de culture tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il est appliqué à la multiplication du ou des agents infectieux constituant le ou les principes actifs de vaccins, dans le cadre de la fabrication desdits vaccins. L'invention peut ainsi concerner un procédé de fabrication de vaccins faisant intervenir le 20 procédé de culture tel que défini ci-dessus pour la multiplication du ou des agents infectieux constituant le ou les principes actifs de vaccins. Un autre objet de l'invention est un procédé de culture tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il est appliqué à la culture de micro-organismes pour la production de métabolites d'intérêt par fermentation. 25 Un autre objet de l'invention est un procédé de culture tel que défini ci-dessus caractérisé en ce que les micro-organismes produits sont des ferments. Un autre objet de l'invention est un procédé de culture tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il est appliqué à la culture de micro-organismes d'intérêt destinés à la biotransformation industrielle ou à l'épuration biologique. 30 L'invention peut ainsi concerner un procédé biotransformation industrielle ou d'épuration biologique faisant intervenir le procédé de culture tel que défini ci-dessus pour la multiplication du ou des agents actifs dans la biotransformation industrielle ou l'épuration biologique. En rapport avec le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de culture selon l'invention, un autre objet de ladite invention est l'utilisation des protozoaires dans lesquels les micro-organismes ont proliférés et qui sont recueillis à l'issue du procédé de culture tel que défini ci-dessus, à titre de composant d'aliment diététique (alicament) ou à titre de principe actif dans une composition phytosanitaire ou cosmétique. Toujours en rapport avec le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de culture selon l'invention, un autre objet de ladite invention est un médicament comprenant des protozoaires dans lesquels les micro-organismes ont proliférés et qui sont recueillis à l'issue du procédé de culture tel que défini ci-dessus. L'invention vise enfin un � kit prêt à l'emploi � pour la mise en oeuvre du procédé de culture tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il comprend : - des cellules hôtes de protozoaire(s) sous forme vivante (culture) et/ou sous forme régénérable, de préférence sous forme lyophilysée et/ou sous forme sèche et/ou sous forme congelée; - au moins un milieu de culture pour ces protozoaires, ce milieu pouvant être sous forme prête à l'emploi ou sous forme reconstituable à l'aide de produits de préférence liquides; - éventuellement des moyens de régénération des cellules hôtes de protozoaire(s); - éventuellement des moyens de reconstitution du milieu de culture; - éventuellement des supports de culture; - éventuellement une notice de mise en oeuvre Exemple : A titre de premier exemple, la production d'un Apicomplexe sous sa forme infectieuse tachyzoite est décrite ci-dessous. Le phylum des Apicomplexa constitue un groupe ancien et diversifié de parasites comprenant plus de 4000 espèces. Ils sont responsables de maladies à fort impact économique et sanitaire en santé vétérinaire (toxoplasmose, néosporose, cryptosporidiose, coccidiose, babésiose, etc...) mais également en santé humaine (toxoplasmose, paludisme, babésiose, etc...).De ce fait, produire ces Apicomplexes présente un intérêt en recherche fondamentale mais aussi pour la production de vaccins et autres formes thérapeutiques. Parmi ces Apicomplexes, le premier exemple choisi est la production de Toxoplasma gondii, agent de la toxoplasmose, dont nous décrivons en détail le mode d'obtention. La première étape (a) consiste à cultiver la souche de Tetrahymena thermophila B3 ATCC 30387 sur un des milieux de culture décrits dans la publication DE CONINCK J.,. BOUQUELET S., DUMORTIER V., F.DUYME & VERDIER-DENANTES I.(2000) Industrial media and fermentation processes for improved growth and protease production by Tetrahymena thermophila BIII Journal of industrial Microbiology and Biotechnology, 24, 285-290 : un milieu dit YEG (extrait de levure et glucose) et un milieu dit MYE (lait écrémé et extrait de levure). La culture a été réalisée en tubes à essai bouchés (9 mL) à 28°C pendant 2 jours (culture non optimisée). La quantité de protozoaires produits dans ces conditions non aérées sur YEG est de 1.8 x 104/mL. Nous rappelons qu'en présence d'air, la quantité atteinte en fermenteur est de l'ordre de 2 x 107/mL (DE CONINCK J... BOUQUELET S., DUMORTIER V., F.DUYME & VERDIER-DENANTES I.(2000) Industrial media and fermentation processes for improved growth and protease production by Tetrahymena thermophila BIII Journal of industrial Microbiology and Biotechnology, 24, 285-290). Afin d'ensemencer ces protozoaires produits (cellules-hôtes), des tachyzoites de Toxoplasma gondii WTD ATCC 50779 sont produits par culture sur la lignée cellulaire HFF (Human Foreskin Fibroblast) en flacon de 25 cm2 contenant 5 mL de milieu DMEM (Dulbecco's Moditied Eagle's Medium). Après 3 jours d'infection à 37°C, en présence d'air enrichi à 5% de CO2, environ 8 x 106 tachyzoites /mL sont produits dans le surnageant de culture. Un volume de 2 mL de la culture de Tetrahymena sur le milieu YEG précédemment décrit, a été placé dans un flacon de culture cellulaire de 25 cm2 avec bouchon ventilé. Cette culture a été infectée par 100 �L de tachyzoites Toxoplasma gondii fraîchement sortis d'une culture sur la lignée HFF après 3 jours d'infection. La température d'incubation est de 37°C. Après 2 jours d'infection, 100 �l de surnageant sont prélevés et servent à ensemencer 30 2 mL de Tetrahymena u frais � : c'est un premier passage. Au total, 7 passages d'infection ont été réalisés successivement, prouvant ainsi la viabilité et l'infectiosité des tachyzoites produits sur la souche de Tetrahymena. 2947837 io Des comptages sont effectués sur une partie du surnageant après filtration sur filtre 5 �m pour éliminer les débris cellulaires et les tachyzoites produits ont été quantifiés : 2.5 x 107/mL en moyenne par passage. Pour vérifier l'infectiosité des tachyzoites produits, 100 �L de surnageant de tachyzoites prélevés sur la culture de Tetrahymena ont été ajoutés 5 à 5 mL de milieu DMEM contenant les cellules HFF à 80% de confluence. Les plages de lyse ont été déterminées après seulement 2 jours d'infection, prouvant la nature infectieuse des tachyzoites produits par le protozoaire Tetrahymena. On trouvera ci-dessous un tableau comparatif récapitulatif entre une culture de micro-organismes intracellulaires utilisant un protozoaire cilié comme milieu de culture 10 conformément à l'invention et une culture de micro-organismes intracellulaires à partir d'une lignée cellulaire de mammifère conformément aux procédés de l'art antérieur. 2947837 Il Culture à partir de protozoaires Culture à partir de cellules de mammifères - organisme GRAS (absence pathogénicité pour l'homme) - Entretien des souches faciles, similaires aux bactéries - temps de génération court -2 h - Possibilité d'atteindre des densités supérieures à 2.107 cellules/ml en seulement 24h - culture sans sérum milieux simples : le milieu de culture (par exemple PPYS) peut revenir jusqu'à cent fois moins cher que ceux utilisés pour les cultures de cellules de mammifères - facilement cultivable en culture axénique à grande échelle, culture maîtrisée, simple et de bas coût, permettant de produire un grand nombre de cellules sans limitation de taille du récipient - Tolère de fortes variations de pression osmotique (pas d'osmolyse dans l'eau distillée) et de température - En flacon de 25 cm2, sur 2 mL de milieu contenant Tetrahymena, soit 3.6 x 104 cellules, on produit 2.5 x 10' tachyzoites/mL en 2 jours - Lignées cellulaires animales ou humaines pouvant être d'origine cancéreuse - Entretien avec beaucoup plus de précautions, avec des techniques plus élaborées (trypsination des cellules adhérentes) - temps de génération de 24h - densités de population de l'ordre de 106 cellules/ml en 3 jours en moyenne - milieux complexes à base de sérum d'origine animale - pour les cellules adhérentes, culture limitée définie par la surface du récipient donc nombre de cellules limité et des techniques complexes et coûteuses Pour les cellules non adhérentes, difficulté d'aération et d'agitation due à leur fragilité, ce qui limite à la fois la taille et les performances des installations industrielles - Fragilité des cellules aux conditions environnementales - En flacon de 25 cm2, sur 5 mL de milieu contenant les cellules HFF, soit 5 x 105cellules, on produit 8 x 106 tachyzoites/mL en 4 jours 12 Enfin, il est bien évident que les exemples que l'on vient de donner ne sont que des illustrations particulières, en aucun cas limitatives, quant aux domaines d'application de 5 l'invention. REVENDICATIONS1 - Procédé de culture de micro-organismes intracellulaires, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à utiliser une culture d'au moins un protozoaire comme cellule- hôte dans lequel ces micro-organismes intracellulaires parasites prolifèrent. 2 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes suivantes: (a)- culture d'au moins une souche de protozoaire dans un milieu de culture approprié, (b)- ensemencement de la culture de l'étape (a) avec au moins une souche d'un micro-organisme intracellulaire, (c)- incubation, de préférence à une température comprise entre 35 et 39°C, avantageusement voisine de 37°C (+/- 1°C), au cours de laquelle, de préférence pendant une durée comprise entre 2 et 3 jours, les micro-organismes intracellulaires se développent dans le cytoplasme des protozoaires au plus tard jusqu'à la lyse naturelle de ces derniers, (d)- éventuelle lyse des protozoaires anticipée et provoquée, de préférence par un stress mécanique et/ou thermique et/ou chimique û avantageusement par variation de pH- et/ou osmotique et/ou enzymatique, (e)- récupération des micro-organismes intracellulaires produits. 3 û Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (c) est conduite jusqu'à la lyse naturelle des protozoaires parasités par les micro-organismes intracellulaires et en ce qu'il comprend éventuellement une étape (al) de synchronisation de la culture ensemencée de l'étape (a) en la soumettant à un stress modéré, de préférence un stress physique et/ou chimique, de manière à uniformiser le niveau de développement des protozoaires avant d'être parasités par les micro-organismes intracellulaires et permettre ainsi une culture puis une lyse naturelle sensiblement synchrone desdits protozoaires et subséquemment une libération également sensiblement synchrone des micro-organismes intracellulaires, ce qui régularise la production de ces derniers. 14 4 - Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins les étapes suivantes: (a')- culture d'au moins une souche de protozoaire dans un milieu de culture approprié, (b')- ensemencement de la culture de l'étape (a) avec au moins une souche d'un micro-organisme intracellulaire, (c')- incubation, de préférence à une température comprise entre 35 et 39°C, avantageusement voisine de 37°C (+/- 1°C), au cours de laquelle, de préférence pendant une durée comprise entre 2 et 3 jours, les micro-organismes intracellulaires se développent dans le cytoplasme des protozoaires sans aller jusqu'à la lyse naturelle de ces derniers, (e')- récupération des protozoaires parasités par les micro-organismes intracellulaires. 5 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce 15 que le protozoaire est non pathogène et/ou comporte au moins un cytostome. 6 û Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le protozoaire est choisi parmi la liste des espèces suivantes : Tetrahymena thermophila, Colpidium, Paramecium, les amibes, les dinoflagellés, les euglènes et les associations de 20 protozoaires appartenant à tout ou partie de ces espèces, le protozoaire cilié non pathogène Tetrahymena thermophila B3 ATCC 30387 étant particulièrement préféré. 7 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la multiplication du ou des agents infectieux constituant le ou les principes 25 actifs de vaccins, dans le cadre de la fabrication desdits vaccins. 8 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la culture de micro-organismes pour la production de métabolites d'intérêt par fermentation. 9 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les micro-organismes produits sont des ferments. 30 15 10 - Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est appliqué à la culture de micro-organismes d'intérêt destinés à la biotransformation industrielle ou à l'épuration biologique. 11 ù Utilisation des protozoaires dans lesquels les micro-organismes ont proliférés et qui sont recueillis à l'issue du procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, à titre de composant d'aliment diététique (alicament) ou à titre de principe actif dans une composition phytosanitaire ou cosmétique. 12.- Médicament comprenant des protozoaires dans lesquels les micro-organismes ont proliférés et qui sont recueillis à l'issue du procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6. 13 - Kit prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend : - des cellules hôtes de protozoaire(s) sous forme vivante (culture) et/ou sous forme régénérable, de préférence sous forme lyophilysée et/ou sous forme sèche et/ou sous forme congelée; - au moins un milieu de culture pour ces protozoaires, ce milieu pouvant être sous forme prête à l'emploi ou sous forme reconstituable à l'aide de produits de préférence liquides; - éventuellement des moyens de régénération des cellules hôtes de protozoaire(s); - éventuellement des moyens de reconstitution du milieu de culture; - éventuellement des supports de culture; - éventuellement une notice de mise en oeuvre.