Brevet FR2944713A1 — publié le 20101029

Substrats poreux micro-structurés, leur procédé de préparation et leurs utilisations La présente invention concerne le domaine des substrats poreux tels que les membranes. Généralement, celles-ci sont commercialisées à des formes et dimensions fixes (par exemple, sous forme de disque de 25 mm ou 47 mm de diamètre ou sous forme de feuilles de grande dimension). Elles sont généralement fabriquées par des procédés complexes, et leur forme et leur porosité ne peuvent pas être aisément modifiées. Certaines membranes sont fragiles et ne peuvent pas être découpées. A l'inverse, les membranes souples sont généralement trop fines pour être découpées en petits morceaux et manipulées ensuite facilement. Or, il est souvent désirable d'obtenir des membranes dont les zones poreuses sont de formes et de tailles variables. Les membranes actuelles sont donc peu ou pas adaptées à ces modifications et/ou des usages spécifiques. Il est donc désirable de mettre à disposition de nouvelles membranes présentant des zones poreuses de tailles et de formes prédéfinies selon des motifs variables. Il est également désirable de mettre au point un procédé aisé à mettre en oeuvre permettant d'obtenir de telles membranes, à partir des membranes existantes. Ainsi, selon un premier objet, la présente invention concerne un substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif(s) prédéfinis, confiné(s) au sein d'un substrat poreux. L'invention concerne également lesdits modes de réalisation particuliers suivants du substrat poreux micro-structuré selon l'invention, ainsi que l'une quelconque de leurs combinaisons : - la ou les zones poreuse(s) sont délimitées par une ou plusieurs zone(s) non poreuse(s) confinant ainsi la ou les zone(s) poreuse(s) au sein du substrat poreux ; - la ou lesdites zone(s) non poreuse(s) comprennent un polymère compatible avec ledit substrat poreux ; - ledit polymère est déposé sur le ledit substrat poreux. Selon un autre objet, la présente invention concerne un substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif prédéfinis confinée(s) au sein dudit substrat poreux, susceptible d'être obtenu par dépôt sur ledit substrat d'un polymère compatible avec ledit substrat au moyen d'un tampon souple présentant sur une de ses surfaces en négatif et en relief, les tailles, formes et motifs desdites zones poreuses. 10 On entend ici par � substrat poreux �, tout filtre ou membrane habituellement utilisé, notamment à des fins de filtration et/ou séparation de protéines, micro-organismes, etc. On peut ainsi citer les membranes à base d'alumine, polyester, polycarbonate, PTFE, etc. La taille des pores dépend généralement des utilisations envisagées. On peut ainsi citer les membranes dont 15 la taille de pores est comprise entre 0,01 et 1 pm. On peut notamment citer les membranes disponibles commercialement, telles que les membranes Anodisc� commercialisées par Whatman, sous forme de disque de 13, 25 ou 47 mm de diamètre avec des tailles de pores de 0,2 pm. Le terme � compatible � utilisé ici fait référence à la capacité du polymère à 20 imprégner les pores du substrat et/ou possédant un effet mouillant approprié en fonction du substrat poreux utilisé. Ledit polymère pourra être choisi parmi les polymères hydrophobes ou hydrophiles, de préférence hydrophobes. 25 Ledit polymère compatible avec le substrat poreux peut être choisi parmi tout polymère permettant l'imprégnation dudit substrat poreux, tel que les élastomères, les polysiloxanes, tel que notamment le poly(diméthylsiloxane) ou PDMS. On distingue ainsi notamment les polymères biocompatibles, et 30 particulièrement le PDMS ; à titre de PDMS, on peut notamment citer le kit Sylgard� 184 commercialisé par la société Dow Corning. Le PDMS est utilisé notamment pour créer des chambres microfluidiques ou réaliser des substrats micro-fabriqués. Par chauffage en présence d'un réticulant, le PDMS passe de l'état liquide à un état élastomère réticulé. Selon un autre objet, la présente invention concerne également un procédé de préparation d'un substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif prédéfinis, confinée(s) au sein d'un substrat poreux, ledit procédé comprenant l'obstruction sélective de pores d'un substrat poreux selon des formes, tailles et motif prédéfinis au moyen d'un polymère compatible avec ledit substrat poreux. Plus précisément, ledit procédé comprend l'application d'un polymère compatible avec le substrat poreux sur ledit substrat poreux au moyen d'un tampon souple, ledit tampon souple présentant en négatif et en relief les tailles, formes et motifs des zones poreuses souhaitées sur le substrat poreux micro-structuré. L'application dudit polymère hydrophobe compatible peut être réalisée au moyen d'un tampon souple sur lequel est gravé le motif désiré, par réticulation du 20 prépolymère correspondant. On entend par � prépolymère � le polymère non réticulé, se présentant généralement sous forme liquide, qui, en présence d'un agent réticulant conduit au polymère durci par réticulation. La réticulation peut s'effectuer spontanément, par exemple dans le cas des colles ou des polymères mono composants qui 25 réticulent à l'air libre ou en présence d'un agent réticulant. Par � agent réticulant �, on entend tout agent chimique ou physique capable de réticuler un polymère, par exemple en créant des liens entre les différents brins de polymère. On entend par agent physique, l'activation du processus de réticulation par tout procédé physique, par exemple par 30 rayonnement UV ou rayonnement gamma (Journal of Inorganic and Organometalic Polymers, 2008, 18, 207). Plus précisément, ladite application est réalisée par : - l'application sur le tampon souple d'un mélange liquide de prépolymère hydrophobe compatible avec le substrat poreux et éventuellement d'un agent réticulant ; - l'application du tampon ainsi imbibé sur le substrat poreux à 5 microstructurer ; - éventuellement le retrait du tampon souple ; - la réticulation du polymère ainsi déposé sur le substrat poreux. Selon un autre objet, la présente invention concerne également un système 10 comprenant un substrat poreux micro-structuré selon l'invention. Ledit système peut comprendre, en outre, ledit tampon souple qui n'aurait pas été retiré et/ou un autre substrat poreux micro-structuré selon l'invention, Ledit tampon souple présente sur une de ses surfaces, en relief et en négatif, le motif de formes et de tailles désirées que l'on souhaite transférer sur le 15 substrat poreux. En d'autres termes, le tampon souple présente des zones saillantes correspondant aux zones non poreuses du substrat micro-structuré selon l'invention sur lesquelles le polymère compatible est déposé, et, en négatif, les zones complémentaires sur lesquelles le polymère n'est pas déposé et 20 correspondant donc aux zones confinées restées poreuses du substrat micro-structuré selon `invention. On entend par tampon souple un tampon en matériau non rigide, de type élastomère par exemple. Ce tampon peut être réalisé par application ou adaptation de méthodes 25 connues en soi, telles que la lithographie douce. Ainsi, Xia et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 550-575 décrit la préparation d'un tampon de type élastomère par moulage d'un prépolymère et de son agent réticulant sous forme liquide sur un moule possédant sur sa surface la structure du motif en relief, en négatif par rapport à celle désirée pour le tampon. 30 Cette technique permet donc d'obtenir un tampon flexible qui est le négatif du motif que l'on souhaite transférer au substrat poreux. A titre d'élastomère, on peut notamment citer les polysiloxanes, tel que notamment le poly(diméthylsiloxane) ou PDMS, tel que le PDMS issu du kit Sylgard� 184 commercialisé par la société Dow Corning ; les polyuréthanes, polyimides, les résines réticulées de polymère phénol-formaldéhyde, de type Novolac. Les moules présentant sur leur surface la structure du motif en relief, en négatif par rapport à celle désirée pour le tampon peuvent être réalisés par application ou adaptation de méthodes connues en soi pour la fabrication de moules en métal, par exemple par silanisation du support métal par exposition à CF3(CF2)6(CH2)2SiCI3 (vap). 10 L'application d'un mélange liquide de prépolymère hydrophobe compatible avec le substrat poreux et d'un agent réticulant sur le tampon souple peut être avantageusement réalisée en appliquant un mélange du prépolymère avec l'agent réticulant sur une feuille absorbante, par exemple une feuille de papier filtre. 15 L'excès de liquide est retiré. Il reste alors une fine couche piégée dans la feuille absorbante. Le tampon souple est alors appliqué sur la feuille absorbante puis retiré. Le tampon ainsi modifié présente une fine couche de prépolymère liquide et de son réticulant à sa surface, partout sauf sur le motif gravé dans le tampon. Cette étape permet de contrôler finement l'épaisseur du mélange liquide du 20 prépolymère et de l'agent réticulant éventuel qui reste sur le tampon. Avantageusement, la quantité de prépolymère déposée sur le tampon souple est telle que tout excès est retiré, par exemple par flux d'air comprimé, de sorte que le motif puisse s'imprimer correctement. En effet, un excès de mélange liquide pourrait déborder sur les gravures du motif. 25 Selon un autre aspect avantageux, la quantité de polymère est suffisante de sorte que le motif puisse être entièrement imprimé. Il peut être avantageux d'homogénéiser l'épaisseur de la couche de liquide en pressant, par exemple, à l'aide d'un substrat en latex souple. 30 L'application du tampon ainsi imbibé sur le substrat poreux à micro-structurer est réalisée par dépôt du substrat poreux sur le tampon imbibé : le mélange liquide non encore réticulé présent sur le tampon souple pénètre alors dans le substrat poreux en respectant le motif du tampon. Le retrait du tampon souple du substrat poreux est réalisé précautionneusement ; le substrat poreux pouvant être fragile, il est avantageux que le tampon soit souple pour pouvoir facilement retirer le substrat poreux sans que celui-ci ne se brise. La réticulation du prépolymère est réalisée par tout moyen connu en soi, tel que notamment spontanément, ou par chauffage en présence d'agent réticulant ou encore par irradiation. Ainsi, dans le cas du PDMS, la réticulation peut être réalisée par chauffage, par exemple à température comprise entre la température ambiante et 80°C, selon la nature du polymère, notamment entre 50 et 80°C, et 10 plus préférentiellement entre 60 et 70°C. La durée de la cuisson dépend généralement de la nature du polymère et des quantités utilisées ainsi que de la température. Ainsi, la réticulation peut être réalisée par chauffage en quelques heures ou à température ambiante pendant plusieurs heures. La cuisson peut être généralement réalisée pendant une durée comprise entre quelques minutes et 15 plusieurs heures, par exemple entre 2 et 5 heures. Après cuisson, le substrat poreux n'a conservé sa porosité qu'aux endroits qui n'ont pas été en contact avec le mélange liquide du prépolymère et de son agent réticulant éventuel, c'est-à-dire selon le motif initial du moule. 20 Le procédé selon l'invention peut être réalisé autant de fois que nécessaire avec le même polymère ou des polymères différents et/ou le même tampon ou des tampons différents pour créer des structures complexes. Le procédé selon l'invention permet donc de mettre en oeuvre une méthode simple, efficace et peu onéreuse pour micro-structurer des membranes ou tout 25 autre substrat poreux. Cette méthode procure de nombreux avantages aux membranes commercialisées. En effet, le procédé permet de concevoir de nombreux outils facilitant l'analyse, la filtration, la séparation, le confinement, l'envoi et le stockage d'organismes biologiques et de protéines. 30 Le procédé selon l'invention permet de modifier de manière locale la porosité des substrats poreux disponibles commercialement. Il permet d'imprégner selon un motif prédéfini choisi un substrat poreux avec un polymère qui, après réticulation, obstruera certaines zones du substrat tandis que d'autres conserveront les mêmes propriétés de porosité que le substrat initial. Cette méthode permet donc d'imprimer un motif quelconque avec une résolution de l'ordre de dix micromètres. Il est ainsi possible de réaliser des structures poreuses complexes pour un surcoût très faible, comparé au prix initial des membranes. Par exemple, il est possible de transformer une membrane circulaire poreuse de 25 mm ou 47 mm de diamètre en un réseau de micro-membranes, de quelques centaines de micromètres, séparées les unes des autres par le polymère réticulé. Il est ainsi possible de transformer des membranes avec des propriétés de filtration et de rétention de protéines bien définies en produits dérivés multiples dont l'application est directement reliée au motif que l'on a imprimé. Le procédé selon l'invention est très versatile puisqu'il fonctionne avec tout type de substrat poreux et qu'il est possible de modifier à loisir la taille et la géométrie des zones obstruées selon le motif prédéfini. Il est possible d'atteindre une résolution supérieure ou égale à 10 �m. De plus, l'ajout du polymère à l'intérieur des pores des substrats poreux ne modifie ni les propriétés mécaniques, ni les propriétés optiques des zones restées poreuses. Les propriétés de porosité (tels que la taille des pores, la rétention des protéines, l'hydrophobicité, le degré de filtration) des zones poreuses demeurent identiques à celles du substrat poreux initial. Les zones obstruées par le polymère acquièrent les propriétés du polymère. Elles deviennent hydrophobes dans le cas du PDMS, ce qui présente un avantage considérable pour l'utilisation de fluides aqueux qui resteront localisés au niveau du motif. Si désiré, il est également possible de modifier les propriétés physico-chimiques du polymère ou du substrat poreux selon le motif micro-structuré. Ainsi, le procédé selon l'invention comprend l'étape supplémentaire consistant à modifier le polymère, par exemple par silanisation et/ou par traitement plasma. Le procédé selon l'invention peut comprendre également l'étape supplémentaire consistant à modifier sélectivement les propriétés physico-chimiques des zones poreuses, par exemple par application ou adaptation de méthodes connues en soi telles que l'absorption de protéines non spécifiques de protéines en solution aqueuse. Ceci est avantageusement facilité par l'hydrophobicité du polymère obstruant qui permet de confiner le dépôt d'agent chimique en solution aqueuse aux zones poreuses. Ses applications concernent notamment le champ de la microbiologie tels que la culture cellulaire confinée, l'analyse et la détection de micro-organismes, le transport et le stockage, la séparation génétique, les tests microbiologiques ; de la microfluidique tridimensionnelle et de l'analyse et du traitement de biomolécules (protéines, ADN, etc.) sur un grand nombre d'échantillons parallèles. En effet, il devient possible de réaliser ces opérations sur les multiples zones poreuses de taille submillimétrique bien délimitées au sein d'une même membrane. Ceci permet donc le confinement d'échantillons biologiques permettant de limiter le nombre de membranes utilisées, l'automatisation, etc. Ceci permet également de déposer plusieurs échantillons biologiques sur la même membrane sans risquer d'inter-contamination, de réduire le volume des échantillons utilisés et de les traiter, les analyser, les stocker en parallèle sur un substrat de petites dimensions. Les différentes pratiques couramment utilisées souffrent en effet de plusieurs défauts : - il est difficile de contrôler le confinement et la croissance d'échantillons biologiques ; - il est difficile de travailler en parallèle avec un grand nombre de souches différentes sur des petites boîtes de Pétri sans risquer d'inter-contaminations ; - la croissance sur milieu de culture gélifié peut apparaître n'importe où à la surface du gel selon la façon dont on a étalé les cellules, ce qui ne facilite pas l'automatisation des observations ; - le stockage par congélation dans des tubes est très efficace mais vite fastidieux si l'on désire décongeler régulièrement un grand nombre de souches cellulaires ; - de la même manière, la méthode de transport après déshydratation sur papier filtre fonctionne, mais est limitée dans le sens ou chaque goutte absorbée sur le papier filtre donne une tache étendue ; le risque de contamination est donc élevé si l'on essaye d'envoyer un grand nombre d'échantillons biologiques. Les méthodes usuelles, très utiles pour des études sur un petit nombre d'échantillons biologiques, ne sont donc pas optimales pour des procédures répétitives, automatisées ou concernant un grand nombre d'échantillons biologiques. Même s'il existe des méthodes alternatives pour traiter un grand nombre d'échantillons biologiques en parallèle en culture liquide, celles-ci sont également limitées par la nécessité de travailler avec des liquides, ce qui nécessite une instrumentation complexe (tuyauterie, agitation des échantillons, etc.). Ces différents inconvénients peuvent être efficacement évités grâce à l'utilisation des membranes micro-structurées selon l'invention. Selon un autre objet, la présente invention concerne donc également l'utilisation d'un substrat poreux micro-structuré selon l'invention pour la culture 10 d'échantillons biologiques, tels que les micro-organismes, notamment les levures ou bactéries, ou encore tels que les nématodes de type C. elegans ou les amibes. Plus précisément, l'utilisation selon l'invention comprend la mise en oeuvre d'un substrat poreux micro-structuré selon l'invention déposé sur un milieu de culture gélifié, face micro-structurée vers le haut et l'ensemencement desdits 15 échantillons au niveau des zones poreuses dudit substrat poreux micro-structuré. A titre illustratif, grâce à l'utilisation d'un motif permettant d'imprimer un réseau de zones millimétriques régulièrement espacées, la membrane Anodisc� de 25 ou 47 mm de diamètre peut être utilisée comme support multiple, en étant 20 transformée en un disque comportant entre une dizaine et une cinquantaine de zones poreuses et permettant de confiner autant de souches cellulaires. Selon un autre objet, la présente invention concerne également un kit pour la culture d'échantillons biologiques, comprenant : 25 - un milieu de culture gélifié ; - un substrat poreux micro-structuré selon l'invention. Il est maintenant possible de confiner plusieurs souches microbiennes dans un espace restreint sans risquer d'inter-contamination. Une fois déposées sur un milieu de culture gélifié, les zones poreuses laissent passer les nutriments qui diffusent. Si l'on veut déposer des gouttes de liquides comprenant des micro-organismes, le liquide disparaît par évaporation et absorption dans le milieu gélifié, et les micro-organismes restent à la surface de la membrane (les pores de celle-ci étant suffisamment petits pour qu'ils ne puissent la traverser). Chaque zone poreuse se comporte alors comme un milieu de culture indépendant : les microorganismes sont confinés dans les zones poreuse et poussent verticalement sans déborder de la zone poreuse, ce qui assure, d'une part, qu'il n'y aura pas d'inter-contamination entre les zones poreuses, et, d'autre part, que les conditions de croissance d'une zone poreuse à l'autre et d'une membrane à l'autre sont identiques, permettant a priori un gain de reproductibilité d'une expérience à l'autre. Le confinement permet également de proposer toutes sortes d'applications pour la microbiologie, comme des tests de chimiotaxie, de mesure de vitesse de croissance cellulaire dans des conditions contrôlées, de sélections de mutants moyennant un choix adéquat du motif imprimé sur les membranes. Il est également possible, par la même méthode, de confiner les organismes dans des canaux fermés. Il suffit pour ce faire d'utiliser un substrat poreux micro-structuré selon l'invention, comprenant le tampon en élastomère. En effet, le tampon souple, collé par réticulation au substrat, permet ainsi de faire pousser très rapidement des couches cellulaires et de manière contrôlée, dans de micro-canaux incorporant le substrat. Il est également possible de coller par réticulation tout autre tampon comprenant un motif sur un membrane déjà micro-structurée. Cela permet ainsi de fabriquer des microcanaux avec une paroi poreuse selon le motif. Compte tenu du fait que les micro-organismes poussent de manière localisée sur un motif régulier, il est très facile d'automatiser un certain nombre de procédures et d'obtenir des conditions identiques et reproductibles de culture. Cela permet ainsi des études automatisées en parallèle comme, par exemple, l'analyse de plusieurs souches mutantes dans les mêmes conditions de culture (pour étudier par exemple la réponse à un antibiotique, un agent mutagène, etc.). II est également possible, et cela peut être particulièrement utile, de transférer les membranes d'un milieu de culture à un autre et d'analyser automatiquement l'évolution des différentes colonies. Les supports micro-structurés selon l'invention peuvent également être avantageusement utilisés pour des diagnostics. D'une part, lors de la filtration d'un liquide à analyser, les micro-organismes se concentrent au niveau des seules zones poreuses, où le liquide traverse la membrane. D'autre part, les analyses en parallèle d'un grand nombre d'échantillons sont facilitées par le fait que l'on connaît par avance où peuvent pousser les cellules. L'utilisation de supports poreux micro-structurés selon l'invention permet donc d'améliorer significativement certaines méthodes de microbiologie standard, notamment en permettant le confinement (conservé lors de la croissance des colonies) d'organismes variés, en minimisant par la même occasion les risques de contamination et en offrant une solution peu coûteuse pour faciliter les observations et les procédures automatisées, le transport, le stockage et la croissance de micro-organismes, le tout sur des substrats de petite taille limitant l'encombrement. Les supports poreux micro-structurés selon l'invention trouvent une autre application dans la séparation par sélection génétique. Ainsi, selon un autre objet, la présente invention concerne également un l procédé de séparation d'un mélange de micro-organismes par sélection génétique, comprenant la culture desdites population sur un kit selon l'invention, dans lequel le substrat poreux micro-structuré comprend un motif présentant au moins une zone poreuse suffisamment longue. Ladite utilisation met notamment en oeuvre l'ensemencement du mélange 20 de population à séparer à une extrémité de ladite zone poreuse, la croissance puis le prélèvement de la population à l'extrémité opposée de ladite zone poreuse. Le procédé selon l'invention est basé sur le phénomène de dérive génétique : si l'on suit une petite population d'individus comprenant un mélange de deux souches qui s'étend spatialement par croissance, on observe, après une 25 certaine distance (c'est-à-dire un certain temps de croissance), ce qu'on appelle la fixation : une seule espèce finit par être présente au niveau du front de croissance. Par exemple, lorsque ladite population à tester est mise en culture sur au moins une zone poreuse de longueur suffisante au sein du substrat poreux micro-structuré selon l'invention, par exemple au centre d'un motif en forme de croix sur 30 un substrat poreux micro-structuré selon l'invention, la croissance se fera en respectant la forme de la zone poreuse. La zone de longueur suffisante présente généralement une forme de type longiligne. Ladite forme longiligne peut être rectiligne ou curviligne. Les branches sont suffisamment longues et étroites selon des tests que l'homme du métier sera en mesure d'effectuer pour déterminer les formes et tailles adéquates, pour que l'on obtienne systématiquement la fixation d'une souche par branche. Il devient ainsi possible de séparer passivement un mélange de micro-organismes (bactéries ou levures par exemples) sur des membranes micro-structurées. Ce procédé peut notamment être utilisé pour s'assurer que les cellules utilisées sont monoclonales : dans chaque branche, au niveau du front de croissance, il est certain que toutes les cellules sont identiques. Ce procédé est donc tout à fait avantageux pour séparer génétiquement des colonies comportant plusieurs souches cellulaires. II trouve notamment son application pour la séparation d'une population de bactéries et de levures comprenant essentiellement deux ou plusieurs souches qui poussent approximativement à la même vitesse (mutation neutre) et donc ne pourraient être séparées simplement. Les supports poreux micro-structurés selon l'invention trouvent également une application dans le domaine de la microfluidique. Selon un autre objet, la présente invention concerne également des dispositifs microfluidiques comprenant une membrane poreuse micro-structurée selon l'invention. Les chambres d'écoulement micro-fluidiques 3D sont généralement formées en empilant des couches de PDMS dans lesquelles sont gravés des motifs. L'utilisation d'un substrat poreux micro-structuré selon l'invention permet de faire contact entre deux couches successives tout en permettant l'échange sélectif de liquide entre les différents canaux des deux couches. Les substrats selon l'invention permettent donc de résoudre le problème de l'adhésion entre les couches de manière optimale via un substrat poreux : en utilisant le même polymère pour boucher les pores de substrats et pour réaliser les couches comprenant les canaux, on s'assure ainsi qu'après cuisson la cellule sera parfaitement hermétique, sans avoir recours à des colles ou autres procédés moins efficaces et non nécessairement biocompatibles. Selon un autre objet, la présente invention concerne également l'utilisation d'un substrat poreux micro-structuré selon l'invention pour la collecte, l'extraction, le transport et/ou le stockage de matériel biologique, tels que les protéines et/ou l'ADN. Les produits disponibles actuellement à ces fins présentent en effet une limitation en raison du nombre d'échantillons que l'on peut déposer sur les membranes, sans risque de contamination croisée au sein d'une membrane. L'utilisation de membranes micro-structurées selon l'invention résout ce problème et permet d'améliorer la technologie existante. II devient possible d'analyser un grand nombre d'échantillons de manière automatisée sans risquer d'inter-contamination, tout en travaillant sur de petites surfaces et donc de réduire considérablement le volume des échantillons utilisés. Cette technologie est tout à fait appropriée à l'utilisation de plates-formes robotisées. De plus, il devient possible d'analyser la présence de plusieurs protéines (ou d'ADN, d'ARN, ...) dans le même échantillon biologique par ajout de gouttes d'échantillons sur les zones poreuses, filtration pour assécher ces zones et dépôt d'agents chimiques (dosage immunologique, anticorps, etc.) permettant la détection de protéines particulières. L'invention sera mieux comprise en regard des figures jointes illustrant des modes de réalisation particuliers selon l'invention. La figure 1 représente de façon schématique le procédé de préparation d'un substrat poreux micro-structuré selon l'invention. Plus précisément, la figure 1A représente l'étape d'application d'un mélange de prépolymère et d'agent réticulant liquide (2), sur un tampon souple en polymère (1). La figure 1B représente l'application d'un substrat poreux (3) sur le motif du tampon souple (1), imbibé par le mélange liquide de prépolymère et d'agent réticulant (2). La figure 1C représente le système comprenant le substrat (3) dont la surface a été micro-structurée, de façon à comprendre des zones non poreuses (5), imprégnées par le polymère et des zones restées poreuses (4) où le polymère n'a pas été déposé, et le tampon souple (1). Le système obtenu peut être cuit pour réticulation. La figure 1 D représente, après retrait du tampon souple préalablement à la réticulation, le substrat (3) dont la surface a été micro-structurée, de façon à comprendre des zones non poreuses (5), imprégnées par le polymère, et des zones restées poreuses (4) où le polymère n'a pas été déposé. Le système ainsi obtenu peut être cuit pour réticulation. La figure 2 représente une comparaison de croissance de colonies de micro-organismes sur une membrane disponible commercialement (Anodisc�), non traitée ou micro-structurée selon l'invention. La figure 2A illustre que les colonies se mélangent rapidement si elles sont trop proches. La figure 2B représente la croissance des mêmes micro-organismes sur une membrane micro-structurée selon l'invention, démontrant la possibilité et l'intérêt de la croissance confinée. La figure 2C montre que la croissance reste confinée dans le temps comme le montre le cliché pris plusieurs jours après. Les membranes font 25 mm de diamètre. La figure 3 représente un procédé de séparation par sélection génétique passive selon l'invention, illustrant une colonie comprenant deux souches de bactéries marquées respectivement par fluorescence rouge ou verte. La figure 3A illustre l'évolution sur une membrane micro-structurée présentant une structure en croix selon l'invention. La figure 3B illustre l'évolution libre directement sur gel d'agar. Les exemples suivants illustrent de façon représentative et non limitative l'invention. Exemple 1 : Procédé d'une membrane micro-structurée selon l'invention 1. Etape préliminaire : création du moule pour produire le tampon souple, par exemple par lithographie douce. a. On se munit d'un support en silicium (5 cm de diamètre) et on le traite dans une chambre à plasma pendant l mn pour nettoyer sa surface. b. On place le support sur une tournette et on dépose une goutte de résine photosensible SU8 (Microchem). c. On utilise le spin coater pour étaler la goutte de résine de manière 10 homogène pour atteindre une épaisseur donnée. Cette épaisseur dépend de la résine utilisée et de la vitesse de rotation de la tournette (cf. données de calibration) ; d. On précuit la résine à 65°C. e. On précuit la résine à 90°C. 15 f. On insole avec une lampe UV au travers d'un masque sur lequel est dessiné le motif désiré. g. On cuit la résine à 65°C. h. On cuit la résine à 90°C. i. On développe la résine en baignant le support dans un bain de 20 développeur spécifique de la résine SU8 (Microchem). j. On rince le support avec de l'isopropanol. k. On silanise le support avec du trichlorosilane en phase vapeur pendant 1 heure. 25 2. Création du tampon souple en PDMS a. On prépare un mélange du prépolymère et de l'agent réticulant dans les proportions 10:1. b. On mélange fortement pour homogénéiser. c. On dégaze le mélange pour faire disparaître les bulles d'air en le 30 plaçant dans une chambre de dessiccation à basse pression pendant 30 minutes. d. On verse le mélange dégazé sur le moule préparé précédemment (par exemple par lithographie douce ù voir 1). On prend soin de faire disparaître les bulles d'air qui peuvent se former lors de cette procédure. e. On cuit à 65°C pendant 4 heures. f. On démoule délicatement l'élastomère. 3. Enduisage du tampon a. On prépare un mélange prépolymère réticulant du kit Sylgard 184 dans les proportions 10:1. b. On mélange fortement pour homogénéiser le mélange c. On dégaze le mélange en le plaçant dans une chambre de dessication à basse pression. d. On prend quelques millilitres du mélange dégazé et le placer sur plusieurs feuilles superposées de papier absorbant (Kimwipes). e. On retire l'excès de mélange liquide, notamment en appliquant une feuille absorbante (Kimwipes) et en la retirant. f. On place délicatement le tampon sur les feuilles imbibés du mélange prépolymère/réticulant, on presse doucement pour imprégner sa surface, comme représenté selon la figure 1A, et on le retire. g. Si nécessaire, on homogénéise l'épaisseur de la couche de prépolymère/réticulant sur le tampon. h. Pour les petites structures, il est possible d'utiliser un souffle d'air pour chasser le mélange prépolymère/réticulant qui peut déborder sur le motif du tampon. i. On dépose délicatement la membrane sur le tampon imprégné comme illustré sur la figure I B. j. On appuie délicatement pour faire rentrer le mélange prépolymère/réticulant dans les pores de la membrane (si nécessaire) k. On décolle la membrane du tampon délicatement (l'utilisation d'un tampon souple évite de briser la membrane si celle-ci est rigide) comme représenté sur la figure 1C. 1. On fait cuire 4h à 65'C. m. La membrane peut être ensuite stérilisée (traitement plasma par exemple) puis stockée avant utilisation. n. On refait les étapes précédentes en sautant l'étape (k), ce qui permet de coller le tampon sur la membrane et donc de créer des structures fermées comprenant une paroi poreuse, comme illustré sur la figure 1 D. o. Après l'étape m, on associe un autre tampon pour créer des structures fermées complexes dédiées à la microfluidique 3D. Exemple 2 : 1. On prépare une membrane micro-structurée selon un motif quelconque (par exemple plusieurs cercles de l mm de diamètre, ou une série de lignes parallèles ou encore une croix), à partir d'une membrane Anodisc de 0,2 microns selon l'exemple 1. 2. On stérilise la membrane par traitement plasma ou autoclave 3. On prépare une culture de levures S. cerevisiae selon les protocoles standards de biologie (culture pendant quelques heures à 30°C dans un milieu liquide de type YPD ou SC à partir d'une solution saturée de cellules de levures). Alternativement, on prépare une culture de l'organisme micro-biologique désiré, comme par exemple des bactéries E. col/ (culture à 37°C dans du milieu de culture liquide LB) 4. On dépose la membrane sur un milieu de culture gélifié (type YPD avec 2% d'agar pour S. cerevisiae ou LB avec 2% d'agar pour E. coli) contenu dans une boîte de pétri. 5. On dépose des gouttes de 1 microlitre sur chaque zone circulaire poreuse ou sur chaque zone désirée (au centre d'un motif en croix, sur les lignes, etc...). 6. On laisse sécher la goutte dans un environnement stérile. 7. On place la boîte de pétri dans un incubateur à 30°C pour S. cerevisiae (ou 37°C pour E. coli). 8. On observe la croissance confinée à intervalles réguliers à l'aide d'un microscope ou d'une binoculaire. 9. Ceci permet notamment d'étudier soit la croissance confinée stricte dans le cas des zones poreuses circulaires (la zone poreuse étant fermée, les cellules poussent verticalement), soit la croissance dirigée dans le cas des lignes (la zone poreuse étant étendue, les cellules poussent en remplissant petit à petit la zone poreuse tout en respectant sa géométrie). Exemple 3 : 1. On prépare une membrane micro-structurée en forme de croix ou d'étoile et comprenant une zone centrale et plusieurs bras partant de cette zone centrale. 10 2. On stérilise ladite membrane. 3. On cultive deux souches cellulaires bactériennes quasi-identiques E. Coli. Leur différence provient du fait que l'une exprime une protéine fluorescente YFP (Yellow Fluorescent Protein) tandis que l'autre souche exprime une protéine fluorescente CFP (Cyan Fluorescent Protein). Les 15 deux souches sont connues pour se développer à la même vitesse. 4. On dilue les cultures cellulaires et on réalise un mélange 50% - 50 % par exemple. On mélange bien. 5. On prépare un milieu de culture gélifié (LB avec 2% d'agar) dans une boîte de pétri. 20 6. On dépose la membrane micro-structurée sur ce milieu de culture. 7. On dépose une goutte de 2 microlitres de ce mélange au centre de la zone poreuse de la membrane micro-structurée. 8. On laisse sécher dans un environnement stérile. 9. On place la boîte de pétri dans un incubateur à 37°C. 25 10.On observe par fluorescence à intervalles réguliers la démixion des deux souches bactériennes le long des branches du motif de la membrane micro-structurée. Dans la représentation 3A, il y a eu sélection génétique passive dans les branches de la croix. Cette sélection (démixtion) a également eu lieu sur gel 30 d'agar, mais, contrairement au cas 3A, il n'est pas possible de choisir en aveugle une zone qui ne contient qu'une sorte de cellule. REVENDICATIONS1.- Substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif prédéfinis, confinée(s) au sein d'un substrat poreux. 2.- Substrat poreux micro-structuré selon la revendication 1 tel que la ou les zone(s) poreuse(s) sont confinée(s) par une ou plusieurs zone(s) non poreuse(s) au sein du substrat poreux. 10 3.- Substrat poreux micro-structuré selon la revendication 1 ou 2 tel que la ou lesdites zone(s) non poreuse(s) comprennent un polymère compatible avec ledit substrat poreux,déposé sur le ledit substrat poreux. 15 4. Substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que le substrat poreux est choisi parmi les filtres ou les membranes. 5. Substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que ledit polymère est un polymère hydrophobe. 6. Substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que ledit polymère compatible avec le substrat poreux est un polysiloxane. 7. Substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que ledit polymère compatible avec le substrat poreux est le poly(diméthylsiloxane) ou PDMS. 30 8. Substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif prédéfinis confinée(s) au sein dudit substrat poreux, susceptible d'être obtenu par dépôt sur ledit substrat d'un polymère compatible avec ledit substrat au moyen d'un tampon souple présentant 20 25sur une de ses surfaces en négatif et en relief, les tailles, formes et motifs desdites zones poreuses. 9. Procédé de préparation d'un substrat poreux micro-structuré comprenant une ou plusieurs zone(s) poreuse(s) de taille(s), forme(s) et motif prédéfinis, confinée(s) au sein d'un substrat poreux, ledit procédé comprenant l'obstruction sélective de pores d'un substrat poreux selon des formes, tailles et motif prédéfinis au moyen d'un polymère compatible avec ledit substrat poreux. IO 10. Procédé selon la revendication 9 comprenant l'application d'un polymère compatible avec le substrat poreux sur ledit substrat poreux au moyen d'un tampon souple, ledit tampon souple présentant en négatif et en relief les tailles, formes et motifs des zones poreuses souhaitées sur le substrat poreux 15 micro-structuré. 11. Procédé selon la revendication 10 tel que ladite application est réalisée en mettant en oeuvre les étapes suivantes : - l'application sur le tampon souple d'un mélange liquide de prépolymère 20 compatible avec le substrat poreux et éventuellement d'un agent réticulant ; - l'application du tampon ainsi imbibé sur le substrat poreux à microstructurer ; - éventuellement le retrait du tampon souple ; - la réticulation du polymère ainsi déposé sur le substrat poreux. 25 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11 tel que le tampon est en polysiloxane. 13. Utilisation d'un substrat micro-structuré selon l'une quelconque des 30 revendications 1 à 8, pour la culture d'échantillons biologiques. 14. Kit pour la culture d'échantillons biologiques comprenant un milieu de culture gélifié et un substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 15. Procédé de séparation d'une population de micro-organismes par sélection génétique, comprenant la culture de ladite population sur un kit selon la revendication 14, dans lequel le substrat poreux micro-structuré comprend un motif présentant au moins une zone poreuse de forme longiligne. 16. Dispositif microfluidique comprenant une membrane poreuse micro-10 structurée selon l'une quelconque des revendications 1 à 8. 17. Utilisation d'un substrat poreux micro-structuré selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la collecte, l'extraction, le transport et/ou le stockage de matériel biologique. 15