Brevet FR2942476A1 — publié le 20100827

La présente invention concerne l'utilisation de composés de type pyridocarbazole en tant que médicament, et plus particulièrement leur application en chimiothérapie anticancéreuse ainsi que pour le traitement d'autres types de maladies (psychiatriques, virales, parasitaires, fongiques) ; ces composés répondent à la formule (I), dont l'archétype structural peut être assimilé à celui de l'ellipticine ; la présente invention est également relative à des composés de formule (I) particuliers, ainsi qu'à des compositions pharmaceutiques comprenant les composés de formule (I). Le fuseau mitotique a depuis longtemps été identifié comme une cible importante en chimiothérapie anticancéreuse étant donné le rôle crucial qu'il joue dans la division cellulaire. L'altération de la fonction des microtubules peut avoir des effets drastiques sur la viabilité des cellules causant un arrêt du cycle cellulaire et pouvant même induire l'apoptose de la cellule. Les microtubules forment, avec les microfilaments d'actine et les filaments intermédiaires, le cytosquelette des cellules eucaryotes. Ce sont des agrégats tubulaires creux, constitués d'une protéine dimérique unique, la tubuline. Dans les cellules de mammifères, les réseaux microtubulaires sont en général nucléés sur un centre organisateur : le centrosome. Ces réseaux exercent des fonctions multiples et vitales comme l'organisation du cytoplasme, le positionnement des organelles, la motilité cellulaire et la division cellulaire. Ainsi, en mitose, le réseau microtubulaire se réorganise pour former le fuseau mitotique, qui permet la ségrégation correcte du matériel génétique dans les cellules filles. L'intégrité du fuseau est contrôlée dans les cellules par des systèmes de vérification (check-points). Toute anomalie du fuseau non détectée est une source d'instabilité génomique et donc potentiellement tumorigène (Castillo et al., 2007 ; Kops et al., 2005). Les microtubules sont des structures dynamiques, capables de polymériser rapidement à partir des dimères libres de tubuline et capables de dépolymériser tout aussi rapidement. Le caractère dynamique de l'assemblage des microtubules est notamment crucial pour le bon déroulement de la mitose (Jordan and Wilson, 2004 ; Niethammer et al., 2007). L'état de polymérisation ou de dépolymérisation du réseau microtubulaire est étroitement contrôlé par les cellules, notamment grâce à un ensemble de protéines capables de stabiliser le réseau microtubulaire ou au contraire de le dépolymériser. Selon les types cellulaires, on trouve ainsi les MAPs (Microtubule Associated Proteins), les protéines STOP, les protéines tau, la survivine, la stathmine/Op18 et les kinésines dépolymérisantes comme par exemple MCAK et Kif2A. De plus, des protéines capables d'interagir avec les extrémités des microtubules comme CLIP 170, peuvent provoquer une stabilisation des microtubules. Toutes ces protéines, sans lien apparent, présentent pourtant la propriété commune d'interagir avec le dimère de tubuline, qu'il soit isolé, ou bien inclus dans la paroi des microtubules ou à leurs extrémités. La liaison de ces protéines à la tubuline est un phénomène rigoureusement régulé dans les cellules, notamment par des processus de phosphorylation/déphosphorylation, ou bien par des modifications post-traductionnelles de la tubuline comme par exemple le cycle de détyrosination/tyrosination. Au cours de ce cycle, la tyrosine C-terminale de la sous-unité a de la tubuline est clivée par une carboxypeptidase (TCP) et ré-ajoutée par une tubuline tyrosine ligase (TTL) (figure 1). La TTL n'ajoute la tyrosine que sur des molécules de tubuline libres, non incorporées dans les microtubules et elle semble agir plus rapidement que la TCP. Par conséquent, les réseaux microtubulaires dynamiques sont massivement constitués de tubuline tyrosinée (tubuline Tyr). La tubuline détyrosinée (tubuline Glu) n'est présente que dans une petite sous-population de microtubules dépourvus d'activité dynamique. Elle s'accumule lorsque les microtubules sont stabilisés par des protéines effectrices ou des drogues comme le paclitaxel. A l'heure actuelle, le succès clinique de plusieurs agents connus pour modifier la dynamique des microtubules fait de la tubuline l'une des cibles les plus intéressantes en chimiothérapie anticancéreuse. Par ailleurs, en plus du cancer, l'implication du cytosquelette microtubulaire dans l'étiologie d'un grand nombre de maladies a été décrite, comme par exemple les maladies mentales (Andrieux et al., Biol. Psychiatry 2006 60(11) : 1224-30) et neurodégénératives, les infections virales et parasitaires. Les agents pharmacologiques ciblant le cytosquelette microtubulaire et ses différents effecteurs peuvent donc présenter un intérêt thérapeutique pour le traitement d'un grand nombre de maladies. Ainsi, les traitements utilisés en chimiothérapie anticancéreuse ciblent de manière privilégiée le comportement dynamique des microtubules. En particulier, il peut être bloqué par de nombreux agents pouvant se lier sur des sites distincts de la tubuline. Ces sites ont été mis en évidence, sur la base de données structurales. Ainsi, la modélisation de la liaison du paclitaxel (taxane) à la tubuline a été décrite, après reconstruction de la structure tridimensionnelle obtenue à partir de feuillets induits par un traitement au zinc de protofilaments de tubuline stabilisés par le paclitaxel. I1 a ainsi été montré que le paclitaxel se lie au monomère 3 de la tubuline, à l'intérieur des microtubules (Snyder et al., 2001). Par ailleurs, la structure aux rayons X de la vinblastine liée à la tubuline complexée à la stathmine a montré que la vinblastine se lie à l'interface entre deux dimères de tubuline, compromettant ainsi l'assemblage des microtubules (Gigant et al., 2005). Ces études ont conduit à la caractérisation, à ce jour, de trois sites de liaison des poisons des microtubules au niveau de la tubuline : le domaine des alcaloïdes de la pervenche, situé à l'interface entre deux dimères de tubuline a/13, le site des taxoïdes situé sur la sous-unité et celui de la colchicine situé à l'interface entre la sous-unité a et la sous-unité R. Ces différents agents sont classés selon qu'ils déstabilisent ou stabilisent les microtubules : - Agents qui déstabilisent les microtubules : Les alcaloïdes de la pervenche, capables de dépolymériser les microtubules, ont été identifiés comme des agents capables d'arrêter les cellules en mitose, avec des fuseaux mitotiques aberrants. Par la suite, la vincristine et la vinblastine ont été introduites en clinique dans les années 60 et sont encore très utilisées en chimiothérapie du cancer testiculaire, de la maladie de Hodgkin ou de la leucémie lymphoïde aiguë. On peut également citer la colchicine ou la combretastatine, qui inhibent la polymérisation des microtubules ainsi que le nocodazole. - Agents qui stabilisent les microtubules : Les taxanes, et plus particulièrement le paclitaxel, interagissent de façon spécifique et réversible avec les microtubules avec une stoechiométrie d'une mole de taxane pour une mole de tubuline. Cette interaction s'accompagne d'une stabilisation des microtubules qui deviennent alors résistants à une dépolymérisation induite par un abaissement de la température, ou par la présence d'ions Cal+. Le paclitaxel et les autres taxanes se distinguent des autres poisons anti-tubuline principalement par l'effet stabilisant qu'ils exercent sur les microtubules. D'une manière générale, le mécanisme d'action commun proposé pour ces composés antimitotiques (taxanes comme alcaloïdes de la pervenche) serait l'abolissement du comportement dynamique des microtubules, plutôt qu'une dépolymérisation ou une polymérisation excessive des microtubules. Malgré leur efficacité anti-tumorale, notamment dans les cancers du sein, des ovaires et des poumons, les taxanes sont extrêmement toxiques car ils agissent également sur les microtubules des cellules non cancéreuses en prolifération (cellules hématopoïétiques, muqueuses...). Enfin, ils peuvent affecter les neurones périphériques et provoquer des effets secondaires importants. D'autres produits naturels présentant des propriétés stabilisatrices de microtubules, les épothilones et le discodermolide, sont actuellement étudiés en phase clinique chez l'homme pour leurs propriétés anti-tumorales. Le succès thérapeutique du paclitaxel a maintenu l'intérêt pour la recherche d'agents thérapeutiques ciblant la tubuline. Compte-tenu du succès clinique de ces agents, la tubuline est aujourd'hui l'une des cibles les mieux validées en chimiothérapie anticancéreuse (Giannakakou et al., 2000 ; Jackson et al., 2007 ; Zhou and Giannakakou, 2005). Toutefois, bien que très utiles, les substances connues de l'état de l'art ne sont pas idéales. Elles présentent en effet de nombreux effets secondaires (myélosuppression et neurotoxicité périphérique). Cette neurotoxicité n'est en elle-même pas surprenante, compte-tenu des autres fonctions des microtubules, indépendantes de leur fonction lors de la mitose. De plus, beaucoup de cancers sont ou deviennent résistants à ces agents. En particulier, dans certains cas, les cellules tumorales, deviennent insensibles aux taxanes car elles développent des mécanismes de résistance, tels que l'expression du gène mdrl de résistance aux drogues, la modification de structure et d'expression de la tubuline. Ainsi, cette résistance est souvent le résultat de la surexpression de pompes d'efflux comme la glycoprotéine-P ou BCRP. D'autres formes de résistance peuvent provenir d'une expression accrue d'isotypes de tubuline ou de mutations de la tubuline, se traduisant par une diminution d'affinité d'une drogue donnée pour la tubuline. Plusieurs stratégies ont été proposées pour le développement de drogues plus puissantes et moins toxiques. L'une d'elle consiste à améliorer les drogues existantes ou d'en découvrir de nouvelles. Une autre approche consiste à cibler d'autres protéines, qui ne s'expriment en principe que dans les cellules en division, comme par exemple les protéines impliquées dans le point de contrôle mitotique (kinases et kinésines). On a longtemps pensé que, du fait des fonctions hautement spécialisées et spécifiques de certaines phases précises de la mitose, l'inhibition de ces protéines devrait présenter un meilleur index thérapeutique (c'est-à-dire l'équilibre entre efficacité et toxicité) que les poisons microtubulaires connus. Toutefois, des données récentes, mettant en évidence une implication centrale de ces protéines à d'autres phases du cycle cellulaire, vont à l'encontre de ces hypothèses (Pan and Snell, 2007 ; Pugacheva et al., 2007). D'une manière générale, la recherche d'agents perturbant la dynamique microtubulaire, ciblant directement la tubuline (ou les microtubules), ou bien ciblant des protéines capables de réguler la dynamique microtubulaire (Bhat and Setaluri, 2007 ; Muller et al., 2007), reste un enjeu important en cancérologie. La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que les composés de formule (I) selon la présente invention présentent plusieurs avantages par rapport aux composés connus de l'état de l'art : - ils sont capables de générer de la tubuline Glu et d'induire une résistance du réseau microtubulaire à une dépolymérisation induite par le nocodazole. In vitro, ils n'agissent pas directement sur la tubuline. Ils stabilisent donc les microtubules mais présentent un mode d'action différent de celui d'autres composés stabilisateurs des microtubules connus, capables de se fixer sur la tubuline, comme les taxanes ou les épothilones ; - ils sont significativement moins toxiques que les composés connus de l'art antérieur, et sont actifs même dans des cas de résistance élevée observée avec les composés de l'art antérieur ; - ils ont de surcroît un effet sur le cytosquelette d'actine. Celui-ci se réorganise et devient plus résistant à une dépolymérisation induite par la latrunculine. La motilité cellulaire est inhibée. Ainsi, en inhibant la motilité cellulaire, ces composés peuvent réduire la dissémination à distance des tumeurs ; ils présentent ainsi des propriétés antimétastasiques additionnelles ; - ils constituent ainsi des traitements alternatifs intéressants, notamment lorsque l'on observe par exemple l'apparition d'une résistance aux autres traitements (taxanes). La présente invention a donc pour objet les composés de formule (I) en tant que médicament. Ainsi, le premier objet de la présente invention concerne les composés tétracycliques répondant à la formule (1) suivante : (I) dans lesquels : RO 25 RI représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, un groupement aminoalkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, ou un groupement mono- ou di-alkylaminoalkyle dans lequel les deux radicaux alkyles présentent 1 à 4 atomes de carbone ; - R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - R3 représente un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - -OR4 représente un radical hydroxyle, un radical alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone ou un radical alcoxy de formule -O-(CH2),,-Z, ou un radical ester ayant 1 à 4 atomes de carbone ou un radical ester de formule -OC(0)Z, dans lesquels : / Z est un groupement cycloalkyle ayant 3 à 6 atomes de carbone, ou un groupement aryle, choisi parmi les groupements phényle, benzyle, pyridyle, pyrimidyle, triazyle et oxazolyle, ledit groupement aryle pouvant éventuellement être substitué en position ortho, méta ou para, par un, deux ou trois substituants, identiques ou différents, choisis parmi les atomes d'halogène, les groupements -OH, -NO2 ou -NH2, les radicaux alkyles ayant 1 à 4 atomes de carbone, les radicaux alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone et les radicaux mono- ou di-alkylamino ayant 1 à 4 atomes de carbone, et / n est un nombre entier allant de 1 à 4, et de préférence égal à 1 ; ou un radical -OR4 répondant à la formule : /--\ v -(CH2)n-0- dans laquelle : 25 / V est choisi parmi CH2, O, NH ou N-alkyle, le groupement alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, et / n' est égal à 2 ou 3 ; R5 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement di- alkylaminométhyle dans lequel le radical alkyle présente 1 à 4 atomes de carbone ; 30 - R6 représente un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison, un atome d'halogène, ou un radical alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - R7 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; 20 _ R8 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical (C,-C4 alkyle)ù0 hydroxyalkyle, un radical alkyle carboxyalkylène de formule (C,-C4 alkylène) ou un radical di-alkylphosphatealkylène de formule (C1-C4 alkyle) -0 0 \ / PùO / \ (C1-C4 alkylène) -0 Où(C1-C4 alkylène) dans lesquels les radicaux alkyles et alkylènes présentent 1 à 4 atomes de carbones, ou un 5 radical ester ayant 1 à 4 atomes de carbone, et R8 étant présent uniquement lorsque R6 est un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison ; et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, en tant que médicament. Les composés de formule (I) peuvent être représentés par les structures suivantes : R6 = OH 10 Structure (la) Structure (Ib) Parmi les applications avantageuses desdits composés, on peut citer le traitement des cancers, le traitement des métastases, ainsi que le traitement d'autres types de maladies, telles que les maladies psychiatriques, virales, parasitaires et fongiques. De manière surprenante, les composés de formule (I), tels que définis ci-dessus, sont 15 aptes à pénétrer dans les cellules et à stabiliser les microtubules et les microfilaments provoquant une formation de tubuline Glu, un ralentissement du comportement dynamique des microtubules, une réorganisation et une stabilisation des microfilaments d'actine. Ces composés présentent un mode d'action différent de celui d'autres composés stabilisateurs des microtubules connus comme les taxanes ou les épothilones, ou de celui de composés 20 stabilisateurs connus des filaments d'actine comme le jasplakinolide. L'archétype structural des composés selon l'invention est similaire à celui de l'ellipticine, alcaloïde purifié à l'origine à partir de plantes issues de la famille des tlpocynaceae, et répondant à la formule suivante : H1C 25 CH3 L'ellipticine est connue pour son activité anticancéreuse et cytotoxique dans certains cancers (Dalton et al., Aust. J. Chem., 1967, 20, 2715 ; Mathe et al., 1998) ; son mode d'action repose essentiellement sur ses propriétés d'intercalant de l'ADN, d'inhibition de la topoisomérase II, et de formation d'adduits covalents avec l'ADN, via les cytochromes P450 et les peroxydases. Contrairement aux composés selon l'invention, l'ellipticine ne présente aucun effet sur la stabilisation des microtubules cellulaires, ni sur celle des microfilaments d'actine. De nombreux dérivés ou analogues de l'ellipticine ont été décrits : - La Demande Internationale PCT WO 2007/135538 décrit l'utilisation de dérivés de l'ellipticium (hydroxy-9 ellipticine) pour le traitement de cancers métastatiques ou de cancers échappant aux chimiothérapies cytotoxiques conventionnelles. Les composés décrits induisent un remodelage du cytosquelette de l'actine dans les cellules tumorales, impliquant une diminution de la mobilité cellulaire et la récupération de la propriété d'adhésion cellulaire. - La Demande européenne EP 209 511 décrit des chlorhydrates de chlorure de dérivés d'aminoalkyl-2 hydroxy-9 ellipticiniums de formule : Cl- HO CH3 où -Alk représente un groupe alkylène inférieur, et -Am représente un groupe di-(alkyle inférieur)-amino, ces composés pouvant être utilisés en tant que principe actif dans une 20 composition pharmaceutique ayant une action anti-tumorale. Les composés selon l'invention, dont les structures sont différentes de celles des composés décrits dans ces différents documents, présentent de manière surprenante des propriétés de stabilisation des microtubules ; ils peuvent présenter en outre des propriétés de réorganisation et surtout de stabilisation du réseau d'actine. 25 Les composés selon l'invention sont ainsi toxiques sur différentes lignées cancéreuses (IC50 de l'ordre de 1 à 60 �M selon les lignées et les composés), notamment sur des lignées ayant développées des mécanismes de résistance aux drogues utilisées en chimiothérapie anticancéreuses (taxanes, vinca-alcaloïdes, antracyclines, etc.). Les composés selon l'invention représentent donc une nouvelle classe d'anticancéreux, particulièrement utiles pour les cancers résistants aux chimiothérapies actuelles. Le composé de formule (I) de l'invention peut également se présenter sous la forme d'un sel. Dans ce cas, il s'agit de préférence d'un sel de l'acide chlorhydrique, de l'acide bromhydrique, de l'acide maléique ou de l'acide méthanesulfonique. De manière avantageuse, le radical RI est un atome d'hydrogène. Toutefois, le radical RI peut également être un groupement di-alkylaminoalkyle de formule -(CH2)n>>NR'R", dans laquelle - R' et R", identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, et n" varie de 1 à 4. De manière préférée, le composé de formule (I) répond à une structure dans laquelle les radicaux R2 et/ou R3 sont des groupements méthyles. Le radical -OR4 peut avantageusement être un groupement -OH ou un radical méthoxy. Lorsque le radical -OR4 est un radical alcoxy de formule -O-(CH2)n-Z ou un radical ester de formule -OC(0)Z, ledit radical -OR4 est de préférence un radical benzyle éther de formule -O-CH2-C6H5 ou un radical ester de formule -OC(0)C6H5, ces derniers pouvant éventuellement être substitués en position ortho, méta ou para, par un substituant choisi parmi les groupements -NO2, -NH2, -N(CH3)2, -CN, -CH2NH2, -CH2N(CH3)2. Le radical R5 est préférentiellement un atome d'hydrogène ou, lorsque le radical R5 est un groupement di-alkylaminoalkyle, le di-méthylaminornéthyle. Le radical R6 peut avantageusement être un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison ou un atome d'halogène. Selon un mode de réalisation préféré, le radical R6 représente un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison, et le radical R8 représente un atome d'hydrogène, la liaison entre l'atome de carbone porteur du radical R6 et l'atome d'azote porteur du radical R8 étant dans ce cas une liaison simple. Dans ce cas, les composés de formule (1) selon l'invention répondent à la structure (Ib) suivante : 10 15 Structure (Ib) Selon une autre variante, le radical R6 représente un atome d'halogène, et plus préférentiellement un atome de chlore, ou un radical alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone. Dans ce cas, les composés de formule (I) selon l'invention répondent à la structure (Ia) suivante : � � \ N N R7 R~ R3 Structure (Ia) Dans les modes de réalisation les plus préférés, le composé de formule (I) répond à la formule : Composé 1 ou à la formule : Composé 3 20 ou à la formule : Composé 4 ou à la formule : Composé 9 ou à la formule : HO CH3 Composé I l La présente invention a également pour objet les composés de formule (I) particuliers 10 suivants : Composé 7 Composé 10 La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique anticancéreuse comprenant en tant que principe actif au moins un composé tel que défini ci-dessus et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition pharmaceutique, elle comprend en outre un autre principe actif anticancéreux. Lesdites compositions pharmaceutiques incluent aussi bien les compositions sous forme solide (comprimés, gélules, capsules etc..), que les compositions sous forme liquide (solutions, suspensions ou émulsions) et incluent les excipients adaptés à une administration orale, topique ou parentérale. L'administration des composés ou des compositions selon l'invention est effectuée de préférence par voie orale ou par voie parentérale (perfusion ou injection IV, notamment). L'administration par perfusion sur une période convenable, généralement comprise entre 2 h et 24 h, et de préférence entre 2 h et 12 h est généralement préférée. Les doses de composés varient selon la formulation sélectionnée, le mode d'administration et la tumeur à traiter. D'autres facteurs tels que l'âge, le poids, la taille, le sexe ainsi que certains paramètres biologiques (taux d'excrétion, association avec d'autres médicaments, allergies...) sont également à prendre en compte. Les exemples ci-dessous permettent à l'homme du métier de déterminer les doses les plus appropriées. La présente invention a également pour objet un procédé d'évaluation de l'activité stabilisante des microtubules d'un composé de formule (I), tel que défini ci-dessus. Un test de criblage a fait l'objet d'une publication dans J. Biomol. Screen (Vassal et al., 2006) ; toutefois, il a été adapté pour l'évaluation de composés de formule (I). Ainsi ledit procédé comprend : 1. après incubation de cellules eucaryotes avec le composé à tester, la perméabilisation des cellules avec un tampon qui préserve le réseau microtubulaire mais permet l'élimination de la tubuline dépolymérisée. 2. après fixation des cellules, la tubuline Tyr est marquée avec un anticorps primaire anti-tubuline tyrosinée et un anticorps secondaire qui émet à une longueur d'onde [par exemple dans le rouge (Cyanine 3)], la tubuline Glu est marquée avec un anticorps primaire anti-tubuline détyrosinée et un anticorps secondaire qui émet à une longueur d'onde X2 [par exemple dans le vert (Alexa Fluor� 488)], suivie de la quantification de la fluorescence aux différentes longueurs d'ondes, notamment à l'aide d'un simple lecteur, pour identifier les microtubules dynamiques plus sensibles aux agents dépolymérisants et les microtubules stabilisés. 3. un marquage supplémentaire des noyaux (Hoechst), afin d'évaluer l'état du tapis cellulaire. 4. incubation du composé à tester avec des cellules HeLa dans les mêmes conditions qu'à l'étape 1 et élimination du composé si l'on observe une fluorescence à la longueur d'onde X2 (par exemple à la même longueur d'onde que l'anticorps Alexa Fluor� 488) ; ceci permet l'élimination des faux-positifs par une analyse du réseau microtubulaire en immunofluorescence par la visualisation de l'effet réel du composé à évaluer sur les microtubules ; en effet, un marquage vert d'agrégats, qui persiste même après lavage des cellules, n'est pas spécifique aux microtubules. 5. une analyse des effets sur la localisation des mitochondries en comparant l'effet de l'azide de sodium et du composé à tester sur les mitochondries, et exclusion du composé à tester s'il présente un mode d'action similaire à l'azide de sodium par marquage avec un marqueur de mitochondries, tel que la chlorométhyl-X-rosamine (marqueur MitoTracker�), qui a la propriété de diffuser de façon passive à travers la membrane mitochondriale et de s'accumuler dans les mitochondries actives. Il est connu que l'azide de sodium est capable de provoquer une stabilisation des ricrotubules, générant ainsi de la tubuline Glu (De Brabander et al., 1982 ; Gundersen et al., 1987). L'azide de sodium est un inhibiteur de la respiration mitochondriale. L'explication de ce phénomène serait que, en bloquant le transfert d'électron lors de l'oxydation phosphorylante, cette substance provoque une déplétion en ATP. Celle-ci va bloquer une étape non identifiée de la dépolymérisation des microtubules et provoquer l'augmentation de tubuline Glu dans la cellule. 6. une étape d'analyse de l'effet du composé à tester sur la dynamique du réseau microtubulaire. Pour cela, des cellules HeLa sont incubées pendant 2 h avec le composé à tester, puis traitées ou non au nocodazole à 10 �M pendant 30 minutes. L'effet protecteur éventuel du composé à tester vis-à-vis d'une dépolymérisation induite par le nocodazole est ensuite révélé par une analyse du marquage en immunofluorescence du réseau microtubulaire et une quantification à l'aide d'un lecteur. 7. une étape d'analyse de l'effet du composé à tester sur le réseau d'actine, par incubation de cellules HeLa avec le composé à tester. Cette étape d'incubation est prolongée ou non par une étape de co-incubation avec un agent dépolymérisant du réseau d'actine, la latrunculine B. Enfin, un marquage de l'actine F par une phallotoxine couplée à un fluorophore (émission à X2, par exemple, Alexa Fluor 488). Lorsque le réseau d'actine est stabilisé, on observe une dépolymérisation réduite à l'actine filamentaire en présence de latrunculine. L'actine, tout comme la tubuline, forme des réseaux. Ces réseaux soutiennent mécaniquement la membrane plasmique, déterminant ainsi sa forme et sa plasticité, et permettent à la cellule de migrer, d'endocyter des particules et de se diviser. Il est connu que le réseau d'actine et le réseau microtubulaire, même s'il existe des substances spécifiques pour chacun des réseaux, sont étroitement inter-régulés. De ce fait, certaines molécules agissant sur les microtubules peuvent aussi avoir un effet sur le réseau d'actine (Enomoto 1996). Enfin, la présente invention a également pour objet l'utilisation des composés de formule (I) comme pesticides. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples mettant en évidence les propriétés stabilisatrices de composés tétracycliques de formule (I) selon l'invention, ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 correspond au cycle de détyrosination/tyrosination de la tubuline, - la figure 2 représente l'effet dépolymérisant du nocodazole sur les microtubules de cellules HeLa, - la figure 3 représente l'effet du composé 1 de l'invention sur la stabilité des microtubules au froid. Les cellules HeLa sont incubées avec du paclitaxel ou sans avec le compose 1 de l'invention pendant 2 h puis exposées 30 minutes à 4°C. La quantité de tubuline dans les cellules traitées avec le composé 1 de l'invention est mesurée puis rapportée en pourcentage de la quantité de tubuline mesurée dans les puits contenant les cellules traitées au taxol (100%), - la figure 4 représente l'effet du nocodazole sur les microtubules des cellules HeLa traitées avec le composé 1 de l'invention. Les cellules HeLa sont incubées avec le composé 1 de l'invention pendant 2 h puis exposées 30 minutes à du nocodazole. La quantité de tubuline dans les cellules traitées avec le composé 1 de l'invention est mesurée puis rapportée en pourcentage de la quantité de tubuline mesurée dans les puits contenant les cellules traitées au taxol, - la figure 5 compare les effets du composé 1 de l'invention et du paclitaxel sur l'assemblage de la tubuline purifiée in vitro. De la tubuline purifiée (1 mg/mL) est incubée dans du tampon PEM en présence de GTP (1 mM), de MgCl2 (5 mM), de DAPI (10 �M) à 37°C. L'effet du composé 1 de l'invention à différentes concentrations ( 25 �M, 50 �M et • 100 �M) est comparé à celui du taxol e,) et du DMSO (e), - la figure 6 montre l'effet de protection du composé 1 d'une dépolymérisation induite par la latrunculine B sur le réseau d'actine, - la figure 7 montre la toxicité du composé 1 de l'invention sur les cellules NCI H460. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations du composé 1 de l'invention pendant 48 h et la viabilité cellulaire a été mesurée à l'aide du test MTT, - la figure 8 représente l'effet du composé 1 sur la localisation et la morphologie des microtubules. Exemple 1 : Caractérisation des produits Chromatographie sur colonne de silice : On réalise une chromatographie sur colonne de silice. Elle est effectuée sur un gel de silice d'épaisseur 0,040-0,063 �m (Merck), préalablement mis en suspension dans un solvant-éluant indiqué (la quantité de silice devant être égale de 10 à 100 fois la quantité de mélange réactionnel brut à purifier). Le mélange de produits à séparer est adsorbé sur une quantité minimale de gel de silice, ou dissous dans un minimum de solvant, délicatement déposé au sommet de la colonne, puis chromatographié à l'aide d'un éluant adapté. Les composés 1 à 6 et 9 à 11 du Tableau I ont été synthétisés et évalués. Tableau I : Composé Formule Stabilité des Stabilité du microtubules réseau d'actine 1 O H3C ° +++ +++ O NH N CH3 CH3 Ô CH3 NH 2 +/- - N H CH3 3 O H3C ° +++ +++ NH N CH3 HO CH3 O NH 4 ++ ++ N H CH3 CH3-O CH CI +/- - N H CH3 6 CI CH3- O N H CH3 0 11 9 ++ ++ HO Cl 10 N ++ - H CH3 11 HO cH3 0 ++ ++ N CH3 NCH3 H Les composés 1 à 6 et 8-9 ont été décrits dans la littérature comme intermédiaires de synthèse Synthèse du composé 1 : Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Med. Chem., 1983, 26, 181. Synthèse du composé 2 : Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706, et Tetrahedron, 1993, 2915. Synthèse du composé 3 : Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706. Synthèse du composé 4 : Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Med. Chem., 1983, 26, 181. Synthèse du composé 5 : 1 -chloro-9-méthoxy-5,1 1-diméthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706, et Tetrahedron, 1993, 2915. Synthèse du composé 6 : 1-chloro-9-méthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706. Synthèse du composé 7 : 9-benzyloxy- l -méthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3- b]carbazole Composé 7 Une solution de bromure de benzyle (230 �L, 1,9 mmol) dans de l'acétone (6 mL) est ajoutée à température ambiante, en 15 minutes, à un mélange contenant du 1-chloro-9- hydroxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (composé 10) (490 mg, 1,73 mmol), de l'acétone (7 mL), du DMF (2 mL) et du K2CO3 (400 mg). L'ensemble est laissé sous agitation pendant 24 h puis les solvants sont ensuite évaporés sous vide. De l'eau est ensuite ajoutée (30 mL). L'ensemble est de nouveau laissé sous agitation pendant 24 h. Le solide formé est recueilli par filtration, lavé à l'eau puis séché à température ambiante pendant 18 h. Un intermédiaire, le 1-chloro-9-benzyloxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (330 mg, 51% de rendement) est obtenu, après une chromatographie sur colonne de silice utilisant le dichlorométhane-acétate d'éthyle (de 99-1% à 95-5%) comme éluant. Le produit obtenu est identique à celui obtenu selon la méthode décrite dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706. Le mélange de 1-chloro-9-benzyloxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole obtenu ci-dessus (320 mg, 0,86 mmol), de DMF (7 mL) et de méthoxyde de sodium (solution à 30% dans le méthanol, 10 mL) est chauffé au reflux pendant 20 h. Le mélange réactionnel est versé dans 60 mL d'eau, puis laissé sous agitation pendant 2 h. Le solide formé, recueilli par filtration, est lavé à l'eau puis séché. C)n obtient alors 280 mg (88% de rendement) du composé 9-benzyloxy-l-méthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (composé 7) attendu, après une chromatographie sur colonne de silice utilisant le dichlorométhane-acétate d'éthyle (de 99,5-0,5% à 99-1%) comme éluant. L.e spectre RMN du proton du composé 7 est le suivant : CDC13 b (ppm) : 8,87 (s, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,88 (br s, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,55-7,33 (m, 8H), 5,21 (s, 2H), 4,22 (s, 3H), 2,76 (s, 3H). Micro-analyses : calculé pour C24H2ON2O1,75 H2O : C, 72,09 ; H, 5,88 ; N, 7,01 ; trouvé : C, 72,22 ; H, 5,51 ; N, 7,18. Synthèse du composé 8 : 1,9-diméthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole CH O 3 / Composé 8 Le mélange de 1-chloro-9-méthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (préparé selon J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706) (427 mg, 1,44 mmol), de DMF (1,5 mL) et de méthoxyde de sodium (solution à 30% dans le méthanol, 3 mL) est chauffé au reflux pendant 24 h. Le mélange réactionnel est ensuite versé dans 50 mL d'eau, puis laissé sous agitation pendant 2 h. Le solide formé, recueilli par filtration, est lavé à l'eau puis séché. On obtient alors 400 mg (95% de rendement) du composé 1,9-diméthoxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (composé 8) attendu, après une chromatographie sur colonne de silice utilisant le dichlorométhane-éthanol (de 99-1% à 98-2%) comme éluant. Le spectre RMN du proton du composé 8 est le suivant : CDCI3 8 (ppm) : 8,85 (s, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,91 (br s, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,41 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,11 (dd, 1H), 4,21 (s, 3H), 3,95 (s, 3H), 2,72 (s, 3H). Micro-analyses: calculé pour C18HI6N2O2 0,5 H2O : C, 71,79 ; H, 5,65 ; N, 9,30 ; trouvé : C, 71,84 ; H, 5,49 ; N, 9,12. Synthèse du composé 9 : 9-benzyloxy-5-méthylpyrido[4,3-b]carbazol-1(6H)-one Synthèse telle que décrite et publiée dans J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706. Synthèse du composé 10 : 1-chloro-9-hydroxy-5-méthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole Dans un tube scellé de 5 mL, un mélange de 1-chloro-9-méthoxy-5-méthyl-6H- pyrido[4,3-b]carbazole (75 mg, 0,25 mmol) (préparé selon J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706), de chlorure de benzyltriéthylammonium (225 mg, 1 mmol) et d'acide chlohydrique à 37% (4 mL) est chauffé dans un bain d'huile à 140°C pendant 24 h. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé, sous vide, puis 20 mL d'eau sont ajoutés. Le milieu est alors rendu basique par addition d'hydroxyde d'ammonium à 28% (0,5 mL), et le solide est recueilli par filtration à froid, puis lavé à l'eau et séché au déssicateur sous vide, à une température de 200°C pendant 18 h. On obtient alors 65 mg (90% de rendement) du composé 10, dont le spectre RMN du proton est le suivant : DMSO-d6 S (ppm) : 11,30 (s, 1H), 9,21 (s, 1H), 8,87 (s, I H), 8,16 (d, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,71 (d, 1H), 7,40 (d, I H), 7,07 (dd, 1H), 2,83 (s, 3H). Micro-analyses : calculé pour C16H>>C1N2O 0,25 H20 : C, 66,91 ; H, 4,04 ; N, 9,75 ; trouvé : C, 66,99 ; H, 4,26 ; N, 9,34. Synthèse du composé 11 : 9-hydroxy-2,5,11-triméthylpyrido[4,3-b]carbazol-1(6H)-one Un mélange de 1-chloro-9-méthoxy-5,11-diméthyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole (250 mg, 0,81 mmol) (composé 5, préparé selon la réf. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1979, 1706, et Tetrahedron, 1993, 2915), d'acétonitrile (50 mL) et d'iodométhane (10 mL) est chauffé à une température de 65°C pendant 3 h. Le mélange obtenu est ensuite évaporé, sous vide, puis 30 mL de soude 3N sont ajoutés. Le mélange est alors laissé sous agitation pendant 30 minutes. Le solide rouge brique obtenu est recueilli par filtration, puis lavé à l'eau et séché à température ambiante pendant 18 h. On obtient alors un intermédiaire, le 9-méthoxy-2,5,11-triméthylpyrido[4,3-b]carbazol-1(6H)-one, qui est utilisé en tant que tel, sans aucune autre purification. Un mélange comprenant le composé intermédiaire 9-méthoxy-2,5,11-triméthylpyrido[4,3- b]carbazol-1(6H)-one obtenu ci-dessus et du chlorhydrate de pyridine (2 g) est chauffé au reflux pendant 30 minutes. La solution résultante est versée dans 60 mL d'eau glacée, et le solide formé est alors recueilli par filtration à froid, lavé avec deux fois 5 mL d'eau, puis séché au déssicateur sous vide, à une température de 20°C pendant 18 h. Le solide est ensuite mélangé à 20 mL de toluène, puis porté à ébullition pendant 5 minutes, avant d'être refroidi à 20°C. On obtient alors 130 mg (55% rendement) du composé 11, qui est recueilli par filtration, lavé avec 2 fois 5 mL de toluène, puis séché à température ambiante pendant 18 h, et dont le spectre RMN du proton est le suivant : DMSO-d6 8 (ppm) : 11,07 (s, 1H), 9,01 (d, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,38 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 6,95 (dd, 1H), 6,68 (d, 1H), 3,45 (s, 3H), 3,39 (s, 3H), 2,59 (s, 3H). Micro-analyses : calculé pour C18H16N202 1,33 H2O : C, 68,35 ; H, 5,90 ; N, 8,86 trouvé : C, 68,22 ; H, 5,74 ; N, 9,27. Exemple 2 : Matériels et méthodes 1) Lignées cellulaires Le nom, la référence et l'origine des lignées sont répertoriés dans le Tableau II ci-dessous. Tableau II : Nom Référence Espèce Morphologie Origine Pathologie ATCC _ HeLa CCL-2 humaine Cellules épithéliales Col de Adenocarcinome l'utérus NCI-H460 HTB-177 humaine Cellules épithéliales Poumon Carcinome 786-0 CRL-1932 humaine Cellules épithéliales Rein Adenocarcinome MCF-7 HTB-22 humaine Cellules épithéliales Stein Adenocarcinome MES-SA CRL-1976 humaine Fibroblaste Utérus Sarcome utérin MES-SA DX5 CRL-1977 humaine Fibroblaste Utérus Sarcome utérin 2) Anticorps primaires Les anticorps primaires utilisés sont listés dans le Tableau III suivant : Tableau III : Nom Espèce Type Epitope Dilution d'origine Fluorescence Western Blot YLI/2 Rat Monoclonal Tubuline tyrosinée 1/4000 1/50 000 Epitope : EGEEF ou EGEEY en C-terminal L4 Lapin Polyclonal Tubuline détyrosinée 1/4000 1/400 000 Epitope : EGEE en C- terminal a 3A2 Souris Monoclonal Tubuline a 1/20 000 Epitope : DMAALE 3) Anticorps secondaires Les anticorps secondaires utilisés sont les suivants : Tableau IV : Nom Espèce Fournisseur Dilution d'origine Fluorescence Western Blot Anti-rat Cyanine 3 Chèvre Rockland 1/500 à 1/1000 Anti-lapin Alexa Fluor� Chèvre Molecular Probes 1/500 à 1/1000 488 Anti-rat HRPo Singe Jackson 1/5000 Immunoresearch Anti-lapin HRPo Chèvre Biosource _ 1/5000 4) Biologie cellulaire Culture cellulaire : Toutes les lignées sont cultivées dans 15 mL de milieu de culture dans des flacons T75 clans une étuve humidifiée à 37°C et à 5% de CO2. Pour le maintien de la culture, les cellules sont divisées lorsqu'elles atteignent la confluence en les dissociant avec une solution de trypsine 0,5%-EDTA (Gibco, Invitrogen) et réensemencées à des dilutions variant de 1/5 à 1/20. Afin d'éviter toute dérive et variations des propriétés cellulaires, ces lignées sont utilisées pendant 20 passages au maximum exceptée la lignée MEF (cellules primaires) qu'il est déconseillé d'utiliser au-delà de 6 passages car ces cellules arrêtent de se diviser après un certain nombre de passages. - Les lignées HeLa, NCI H460 et 786-0 sont cultivées dans du RPMI-1640 avec G1utaMAXITM (Gibco, Invitrogen) contenant 10% de sérum de veau foetal (SVF, Hyclone, Thermo Fisher Scientific) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco, Invitrogen). - Les lignées MCF-7 sont cultivées dans du EMEM - ATCC) avec 10% de SVF, 1% de pénicilline/streptomycine et 0,1 mg/mL d'insuline (Sigma Aldrich). - Les lignées MES-SA et MES-SA DX5 sont cultivées dans du McCoy's 5A (ATCC) avec 10°/, de SVF et 1% de pénicilline/streptomycine pendant les premiers passages puis dans du RPMI-1640 contenant 10% de SVF et 1% de pénicilline/streptomycine. Immunofluorescence : Marquage de la tubuline (Tyr, Glu) et des noyaux : Environ 10000 cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre déposées dans des puits de plaques 24 puits et incubées à 37°C 5% CO2 pendant 72 h, ceci afin que les cellules puissent suffisamment adhérer au support. Après élimination du milieu, les cellules sont perméabilisées avec du tampon OPT (PIPES 80 mM, EGTAI mM, MgCl2I mM, Triton X- 100 0,5%, glycérol 10% pH = 6,7) préalablement chauffé à 37° C pendant 3 minutes à 37°C puis fixées dans du méthanol préalablement maintenu à -20° C pendant 10 minutes. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS/Tween 20 0,1% et incubées pendant 15 minutes minimum à température ambiante avec les anticorps primaires adéquats (cf. Les anticorps Tableau III) dilués dans une solution de PBS/BSA 0,3% NaN3 0,02%. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS/Tween 20 0,1%. Elles sont incubées pendant 15 minutes à température ambiante avec une solution d'anticorps secondaires et de Hoechst à I �g/mL final, dilués dans du PBS/BSA 0,3% NaN3 0,02%. Finalement, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS/Tween 20 0,1% puis déshydratées avec de l'éthanol pur et fixées sur des lames à l'aide d'une solution de montage FluorsaveTM (Calbiochem, Merck). Marquage de l'actine : Les cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre et incubées comme pour le marquage de la tubuline. Après élimination du milieu, les cellules sont lavées avec du PBS tiède puis fixées par ajout d'une solution de PBS/formaldéhyde 3,7% pendant 30 minutes à 37° C. Les cellules sont lavées avec du PBS puis perméabilisées avec une solution de PBS/Triton X100 0,2% pendant 15 minutes à température ambiante. Après un autre lavage avec du PBS, les cellules sont incubées avec une solution de PBS/BSA 1% pendant 30 minutes à température ambiante. Les cellules sont ensuite incubées avec de la phalloïdine (0,165 �M final) marquée à l'Alexa Fluor� 488 (Molecular Probes, Invitrogen) pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules sont lavées une dernière fois avec du PBS puis déshydratées avec de l'éthanol pur. Enfin, les cellules sont fixées sur des lames à l'aide d'une solution de montage FluorsaveTM. Marquage des mitochondries : Comme pour le marquage de la tubuline, les cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre et incubées à 37°C 5% CO2. Trois jours après l'ensemencement, du MitoTracker� Red CMXRos (Molecular Probes, Invitrogen) est ajouté dans le milieu de culture de façon à avoir une concentration finale de 250 nM. Les cellules sont ensuite incubées 30 minutes à 37°C 5% CO2. Ce marqueur diffuse de façon passive à travers la membrane plasmique et s'accumule dans les mitochondries actives. Après élimination du milieu, les cellules sont lavées avec du milieu tiède puis fixées par ajout d'une solution de PBS/forrnaldéhyde 3,7% pendant 30 minutes à 37°C. Les cellules sont rincées avec du PBS, puis peuvent être perméabilisées avec une solution de PBS/Triton X100 0,2% pendant 15 minutes à température ambiante pour réaliser, si nécessaire, d'autres marquages en immunofluorescence. 5) Microscopie Les lames d'immunofluorescence sont lues à l'aide de microscopes droits Zeiss (Axioskop) équipés d'une caméra CCD (CollSnap ES, Ropper Scientific). Les microscopes sont équipés d'objectifs x20 sec, x40 et x100 à immersion dans l'huile (Neofluar, Zeiss). Tout l'équipement est commandé par le logiciel MetavueTM (Universal Imaging, Molecular Devices). Alternativement, les lames sont lues sur différents microscopes à fluorescence ou au microscope confocal. 6) Test de croissance cellulaire Les tests de croissance cellulaire sont réalisés en microplaques 96 puits transparentes (Greiner) après avoir ensemencé 100 pl d'une solution cellulaire de 2.105 cellules/mL à 5.105 cellules/mL (en fonction des lignées cellulaires). Après 24 h d'incubation à 37°C, 5% CO2, le milieu de culture est enlevé et remplacé par des solutions de molécule à tester à différentes concentrations. Les cellules sont incubées avec ces molécules pendant 48 h supplémentaires à 37° C, 5% CO2. Après élimination du milieu, les cellules sont lavées avec du RPMI blanc (Gibco, Invitrogen) puis incubées avec du 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ou MTT (0,5 mg/mL final) pendant 4 h à 37°C 5% CO2. Le MTT (Sigma Aldrich) permet d'estimer la viabilité des cellules par la mesure de l'activité d'une enzyme mitochondriale. En effet, dans les cellules vivantes, les déshydrogénases mitochondriales sont capables de cliver le cycle tétrazolium, entraînant ainsi la formation de cristaux de formazan insolubles en milieu aqueux. Ces cristaux sont solubilisés grâce à l'ajout d'une solution de solubilisation (Isopropanol, Triton X100 10%, HC1 0,IN). Après agitation, l'absorbance est mesurée à 570 nm à l'aide du lecteur de microplaque FLUOstarOPTIMA. 7) Test permettant la détection des molécules stabilisant ou déstabilisant les microtubules en microplaques Des cellules HeLa sont ensemencées dans des microplaques 96 puits noires à fond noir (Greiner 655086), en distribuant 90 pl par puits d'une solution cellulaire à 40.000 cellules/mL, et incubées à 37°C 5% CO2. 24 h après, les cellules sont incubées avec les molécules à tester pendant 2 h à 37°C 5% CO2. Les cellules sont ensuite perméabilisées avec du tampon OPT tiède pendant 6 minutes à 37°C puis fixées dans du méthanol pendant 10 minutes à température ambiante. Les cellules sont rincées 2 fois avec du PBS/Tween 20 0,1% et incubées avec les anticorps primaires YL 1 /2 et L4 (cf. Les anticorps Tableau III) diluées au 1/4000 dans une solution de PBS/BSA 0,3% NaN3 0,02% toute la nuit à température ambiante. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS/Tween 20 0,1% puis incubées pendant 1 h à température ambiante avec une solution de Hoechst à 1 �g/mL final et d'anticorps secondaires anti-rat Cyanine 3 et anti-lapin Alexa Fluor� 488 respectivement dilués au 1/500 et 1/1000 dans du PBS/BSA 0,3% NaN3 0,02%. Après 3 lavage au PBS/Tween 20 0,1%, du PBS/Glycérol 50°./o est distribué dans chaque puits. Les différentes intensités de fluorescence sont mesurées grâce au lecteur FLUOstarOPTIMA. 8) Test d'action sur le cytosquelette d'actine : protocole pour évaluer, sur cellules, la stabilité du réseau d'actine à une dépolymérisation induite par la latrunculine B 3 jours avant l'expérience, des lamelles de verre sont déposées dans des conditions stériles dans des microplaques 24 puits. Dans chaque puits, des cellules HeLa en phase exponentielle de croissance sont déposées, à raison de 15 000 cellules par puits, dans 500 pl de milieu RPMI. Réactifs : En stock : PBS (Phosphate Buffered Saline, réf. P4417, Sigma), PBS/1% BSA (Albumine bovine, Réf. A3059, Sigma), aliquots de 15 mL, stockés à -20°C ; PBS/0,2% Triton X 100 (Réf. T8787, Sigma) ; PBS/0,01% Tween 20 (Réf. P9916, Sigma) ; PBS/0,3% BSA/0,02% NaN3 (Réf. du NaN3 : 6688, Merck), aliquots de 15 mL stockés à -20°C. Phalloïdine A488, (Réf Al2379, Invitrogen). L4 : anticorps polyclonal de lapin anti-tubuline détyrosinée (cf. Fonrose et al., Cancer Res., 207, 67 : 3371-3378). Anticorps anti-lapin couplé à la Cyanine 3 (Réf. 111.165.144, Jackson Laboratories). Hoechst (bisBenzimide H 33258, Réf. B2883, Sigma), solution stock à 1 mg/mL dans H20 bidistillée. Liquide de montage Fluorsave� (Réf. 345789, Calbiochem). Éthanol (Réf. 414-587, Carlo Erba). A préparer le jour même : Latrunculine B (Réf. L5298, Sigma) 5 �M : 5 �l de latrunculine à 500 �M dans 500 pl de RPMI DMSO (Diméthyle Sulfoxyde, Réf. D5879, Sigma) 0,25% : 2,5 �l de DMSO pur dans 1000 pl de RPMI. Paclitaxel (Réf. T1912, Sigma) 5 �M : 5 pl de paclitaxel 1 mM dans 1000 �l de RPMI. Composés à tester 25 �M : 2,5 pl de composé à 10 mM (dans DMSO) dans 1000 �l de RPMI. PBS/formaldéhyde 3,7% : 1,2 mL de formaldéhyde à 37% (Réf. F1635, Sigma) + 12 mL de PBS, à préparer extemporanément. Diluer la phalloïdine A488 à 0,165 pM dans PBS/BSA 1%. Diluer dans PBS/0,3% BSA/0,02% NaN3 : Anticorps primaire L4 au 1/4000. Anticorps secondaire anti-lapin Cyanine 3 au 1/1000. 1-loechst au 1/1000 (= 1 �g/mL). Centrifuger ces différents produits dilués pendant 10 minutes à 15 000 g, de manière à éliminer les agrégats éventuels. Réalisation du test : Ajouter dans chaque puits les composés à tester, à la concentration de 25 �M. Le DMSO 0,25% et le paclitaxel 5�M sont utilisés à titre de contrôle. Toutes les conditions sont réalisées en double. Incuber 2 h dans un incubateur à cellules (à 37°C, 5% CO2, sous atmosphère humide). Au bout de 2 h, 10 �L de latrunculine à 5�M sont ajoutés dans un puits sur deux (concentration finale de latrunculine : 0,1 �M). L'incubation est poursuivie 10 minutes, avant de fixer les cellules et de réaliser l'immunomarquage de la tubuline détyrosinée et le marquage de l'actine. Fixation des cellules et marquages de la tubuline détyrosinée et du réseau d 'actine . Lavage des puits avec 500 .tL de PBS à 37°C. Fixation des cellules par addition de 500 �L/puits de PBS/formaldéhyde 3,7% à 37°C. Incubation 30 minutes à 37 °C. Les étapes suivantes se déroulent à température ambiante. Aspiration du PBS/formaldéhyde 3,7%. 3 lavages avec 500 �l/puits de PBS. Les lamelles sont ensuite récupérées à l'aide d'une pince et déposées sur un support adapté. Perméabilisation avec du PBS/0,2% Triton X 100 (100 �l/lamelle). Les lamelles sont � essorées � puis lavées 3 fois avec du PBS. Saturation avec du PBS/1% BSA (100 �l/lamelle) pendant 30 minutes. Les lamelles sont � essorées � puis lavées 3 fois avec du PBS. Incubation avec de la phalloïdine fluorescente A488 0,165 �M (50 �L/lamelle) pendant 20 minutes. Les lamelles sont � essorées � puis lavées 3 fois avec du PBS 0,1% Tween. Incubation avec l'anticorps primaire L4 dilué au 1/4000 (50 !1L/lamelle) pendant 15 minutes. Les lamelles sont � essorées � puis lavées 3 fois avec du PBS 0,1% Tween. Incubation avec l'anticorps secondaire fluorescent anti-lapin Cyanine 3 (1/1000) et avec du Hoechst (1/1000) (50 gL/lamelle) pendant 15 minutes. Les lamelles sont � essorées � puis lavées 3 fois avec du PBS 0,1% Tween. Déshydratation de la préparation en trempant les lamelles dans un bain d'éthanol 100%. Montage des lamelles à l'aide de Fluorsavee. Exemple 3 : Mise en évidence des propriétés stabilisatrices des composés de formule (I) de l'invention Dans la cellule vivante, les microtubules sont des structures dynamiques, oscillant entre des phases d'assemblage et de désassemblage. Différents types de tests peuvent être mis en oeuvre pour apprécier l'effet stabilisant des molécules sur le réseau microtubulaire. Ainsi, la liaison de paclitaxel aux microtubules, ou encore celle de protéines stabilisatrices comme les protéines STOP (Bose et al., 2003) peut protéger le réseau microtubulaire d'une dépolymérisation induite par une incubation des cellules à 4°C. Par ailleurs, des molécules capables de ralentir la dynamique des microtubules peuvent être mises en évidence en analysant la résistance des microtubules cellulaires à une dépolymérisation induite par le nocodazole. En l'absence de composé stabilisant, les microtubules dépolymérisent en présence de nocodazole (figure 2). L'effet stabilisant du composé 1 de l'invention sur les microtubules cellulaires a été comparé à celui du paclitaxel, à l'aide de ces différents tests. Ces expériences ont montré que si ce composé n'est pas capable de protéger les microtubules d'une dépolymérisation induite par le froid (figure 3), il empêche, de manière dose-dépendante, leur dépolymérisation induite par le nocodazole (figure 4). Ce composé est donc capable de ralentir la dynamique des microtubules. Le tableau I ci-dessus résume les propriétés stabilisatrices de composés selon l'invention, selon des critères qualitatifs, par évaluation en double aveugle au microscope. Exemple 4 : Effet stabilisant du composé 1 de l'invention par l'intermédiaire d'un effecteur Pour savoir si le composé 1 de l'invention exerce son effet stabilisant par une action directe sur la tubuline, comme le paclitaxel, ou par l'intermédiaire d'un effecteur, nous avons analysé son effet sur l'assemblage in vitro de la tubuline en microtubules. Les premières expériences ont été réalisées sur de la tubuline purifiée (1 mg/mL). Seul le paclitaxel peut induire l'assemblage de la tubuline dans ces conditions. On n'observe aucun assemblage avec le composé 1 de l'invention, quelle que soit la concentration testée (figure 5). Ce résultat montre que l'effet stabilisant de ce composé ne résulte probablement pas d'une interaction directe de ces molécules avec la tubuline des microtubules et qu'il présente donc un mode d'action original. Exemple 5 : Effet sur l'actine des composés selon l'invention Un autre effet des composés selon l'invention est le fait qu'ils sont capables de ralentir considérablement la migration des cellules. Cet effet résulte d'une action sur le cytosquelette d'actine caractérisée par les expériences d'immunofluorescence telles que définies à l'exemple 3. Toutefois, comme pour la tubuline, l'effet des composés sur le cytosquelette d'actine ne résulte pas un effet direct sur la polymérisation de l'actine. La figure 6 illustre les résultats obtenus avec le composé 1 de l'invention qui montrent que ce composé protège le réseau d'actine d'une dépolymérisation par la latrunculine B (figure 6). Observation au microscope à fluorescence, avec les filtres adaptés. Dans ces conditions, en l'absence d'une stabilisation du réseau d'actine (DMSO ou paclitaxel), la latrunculine provoque une dépolymérisation quasi-totale du réseau d'actine. Dans ces conditions, quand le réseau microtubulaire est stabilisé, on observe une très forte augmentation de microtubules détyrosinés (avec le paclitaxel, par exemple) par rapport aux cellules traitées au DMSO. La figure 8 illustre les résultats obtenus. Exemple 6 : Étude de la cytotoxicité vis-à-vis de lignées cancéreuses Afin d'évaluer l'effet de ces composés sur la croissance de lignées cancéreuses, la viabilité d'un certain nombre de lignées cellulaires transformées, comme les cellules HeLa (adénocarcinome utérin), les 786-0 (adénocarcinome de rein), les NCI H460 (carcinome du poumon), les MCF-7 (adénocarcinome du sein) les MES-SA (sarcome utérin) et les MES-SA DX5 (sarcome utérin), en présence des composés actifs a été comparée à leur viabilité en présence de DMSO. Plus particulièrement, la lignée MES-SA DX5 est une lignée cancéreuse exprimant un niveau élevé de glycoprotéine P et résistant de ce fait à la toxicité induite par le traitement à de nombreux agents pharmacologiques. La glycoprotéine P a été identifiée comme l'une des causes majeures de chimiorésistance des cancers. Elle est codée par un gène appelé MDR1 (pour � multidrug resistance �). Sa fonction normale est d'évacuer hors des cellules les substances étrangères et les toxines de notre environnement. Les médicaments concernés sont les anthracyclines, les épipodophyllotoxines, les vinca-alcaloïdes, le taxol, quelques intercalants comme la mitoxantrone et la dactinomycine, certains dérivés de la camptothécine. La viabilité des cellules a été évaluée à l'aide d'un test MTT après 48 h d'exposition avec différentes concentrations de molécules (de 100 �M à 0,001 .iM). Des courbes dose-effet ont ainsi été obtenues, qui ont permis de déterminer la concentration nécessaire pour inhiber 50% de la croissance cellulaire (IC50). Un exemple de courbe de cytotoxicité est illustré à la figure 7. L'effet des composés 1 et 3 de l'invention sur les différentes lignées cellulaires a été analysé. Les valeurs des IC50 obtenues sont présentées dans le Tableau V ci-dessous : Tableau V : IC50 des composés 1 et 3 de l'invention sur différentes lignées cancéreuses Composé 1 Composé 3 HeLa 1,21 pM 3,05 pM 786-0 55,09 pM 3,34 pM NCI H460 6,65 pM 1,52 pM MCF-7 62,20 pM ND MES-SA 26,04 pM 33,90 pM MES-SA DX5 27,41 pM 13,92 pM La toxicité des molécules varie en fonction des lignées cellulaires. La lignée MCF-7 semble être la lignée la plus résistante. Pour cette lignée, l'IC50 du composé 3 de l'invention, difficilement soluble aux concentrations élevées, n'a pas pu être déterminée. En revanche, la lignée multi drogues-résistantes MES-SA DX5 est sensible aux deux molécules. Enfin, le composé 3 de l'invention est plus toxique que le composé 1 de l'invention vis-à-vis des lignées 786-0, NCI H460 et MES-SA DX5. Exemple 7 : Effet sur les mitochondries Après 2 h de traitement à 25 �M (voir exemples 2 à 4), le composé 1 n'induit pas de phénotype de type azide de sodium (Figure 9). Exemple 8 : Détermination de l'EC50 : Dans le but d'évaluer la bio-activité des molécules in vivo et de comparer leurs 25 activités, l'EC50 des molécules sélectionnées (concentration effective à 50% de l'effet total) a été détenniné. Des courbes dose-effet, qui permettent de mesurer la variation du signal tubuline Tyr ou tubuline Glu dans les cellules en fonction de la concentration des molécules, ont été établies. Il est ensuite possible de définir, à l'aide de ces courbes, la concentration de molécule bio-active qui produit une activité correspondant à 50% de l'effet total recherché. Une courbe dose-effet mesurant la variation de la quantité de tubuline Glu a été réalisée pour le composé 1 de l'invention. Pour cela, des cellules HeLa ont été incubées 2 h avec différentes concentrations de molécules, puis traitées selon le protocole d'immunofluorescence en microplaques. L'intensité de fluorescence a ensuite été mesurée à l'aide du lecteur de microplaques. Le pourcentage du signal mesuré représente sa distance relative au contrôle de bio- activité (taxol�) et au contrôle de bio-inactivité (DMSO). L'EC50 a été déterminé à l'aide du logiciel KaleidaGraph� 3.60. Le composé 1 de l'invention est capable, aux concentrations les plus élevées, de provoquer une élévation du signal Glu proche de celle du taxol�. Références bibliographiques : Aimova, D., L. Svobodova, V. Kotrbova, B. Mrazova, P. Hodek, J. Hudecek, R. Vaclavikova, E. Frei, and M. Stiborova. 2007. The anticancer drug ellipticine is a potent inducer of rat cytochromes P450 l A 1 and 1A2, thereby modulating its own metabolism. Drug Metab Dispos. 35:1926-34. 13hat, K.M., and V. Setaluri. 2007. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clin Cancer Res. 13:2849-54. I3osc, C., A. Andrieux, and D. Job. 2003. STOP proteins. Biochemistry. 42:12125-32. Castillo, A., H.C. Morse, 3rd, V.L. Godfrey, R. Naeem, and M. J. Justice. 2007. 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Composés tétracycliques caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) suivante : R6 R40 (I) dans lesquels : - R1 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, un groupement aminoalkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, ou un groupement mono- ou di-alkylaminoalkyle dans lequel les deux radicaux alkyles présentent 1 à 4 atomes de carbone ; - R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - R3 représente un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; -OR4 représente un radical hydroxyle, un radical alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone ou un radical alcoxy de formule -O-(CH2)ä-Z, ou un radical ester ayant 1 à 4 atomes de carbone ou un radical ester de formule -OC(0)Z, dans lesquels : / Z est un groupement cycloalkyle ayant 3 à 6 atomes de carbone, ou un groupement aryle, choisi parmi les groupements phényle, benzyle, pyridyle, pyrimidyle, triazyle et oxazolyle, ledit groupement aryle pouvant éventuellement être substitué en position ortho, méta ou para, par un, deux ou trois substituants, identiques ou différents, choisis parmi les atomes d'halogène, les groupements -OH, -NO2 ou -NH2, les radicaux alkyles ayant 1 à 4 atomes de carbone, les radicaux alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone et les radicaux mono- ou di-alkylamino ayant 1 à 4 atomes de carbone, et / n est un nombre entier allant de 1 à 4, et de préférence égal à 1 ; ou un radical -OR4 répondant à la formule : 25/--\ VN dans laquelle : / V est choisi parmi CH2, 0, NH ou N-alkyle, le groupement alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, et / n' est égal à 2 ou 3 ; - R5 représente un atome d'hydrogène, ou un groupement di-alkylaminométhyle dans lequel le radical alkyle présente 1 à 4 atomes de carbone ; - R6 représente un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison, un atome d'halogène, ou un radical alcoxy ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - R7 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone ; - R8 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle, un radical (C1-C4 alkyle)ù0 hydroxyalkyle, un radical alkyle carboxyalkylène de formule (C1-C4 alkylène) ou un (C1-C4 alkyle)ùO /0 Pùo \ radical di-alkylphosphatealkylène de formule (C1-C4 alkylène)ù0 Où(C1-C4 alkylène) dans lesquels les radicaux alkyles et alkylènes présentent 1 à 4 atomes de carbones, ou un radical ester ayant 1 à 4 atomes de carbone, et R8 étant présent uniquement lorsque R6 est un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison ; et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, en tant que médicament. 2) Composés selon la revendication 1, caractérisés en ce que RI est un atome 20 d'hydrogène. 3) Composés selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisés en ce que R2 est un radical méthyle. 4) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que R3 est un radical méthyle. 25 5) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le radical -OR4 est un groupement -OH ou un radical méthoxy. 6) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que le radical -OR4 est un radical benzyle éther de formule -O-CH2-C6H5, ou un radical ester de formule -OC(0)C6H5, ces derniers pouvant éventuellement être substitués en position ortho, 30 méta ou para, par un substituant choisi parmi les groupements -NO2, -NH2, -N(CH3)2, -CN, - CH2NH2, -CH2N(CH3)2. 34 7) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisés en ce que le radical R5 est un atome d'hydrogène ou un radical di-méthylaminométhyle. 8) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que le radical R6 est un atome d'oxygène lié au noyau D par une double liaison ou un atome d'halogène. 9) Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) suivante : Composé 1 ou la formule : Composé 3 ou à la formule :36 Composé 4 ou à la formule : Composé 9 ou à la formule : HO CH3 Composé 11 10) Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (I) suivante : Cl CH3 Composé 10 11) Composition pharmaceutique anticancéreuse, caractérisée en ce qu'elle comprend en tant que principe actif au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 12) Composition anticancéreuse selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un autre principe actif anticancéreux. 13) Procédé d'évaluation de l'activité anticancéreuse d'un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend : 1. après incubation de cellules eucaryotes avec le composé à tester, perméabilisation des cellules avec un tampon qui préserve le réseau microtubulaire mais permet l'élimination de la tubuline dépolymérisée. 2. après fixation des cellules, la tubuline Tyr est marquée avec un anticorps primaire anti-tubuline tyrosinée et un anticorps secondaire qui émet à une longueur d'onde 21, la tubuline Glu est marquée avec un anticorps primaire anti-tubuline détyrosinée et un anticorps secondaire qui émet à une longueur d'onde X2, suivie de la quantification de la fluorescence aux différentes longueurs d'ondes pour identifier les microtubules dynamiques plus sensibles aux agents dépolymérisants et les microtubules stabilisés. 3. un marquage supplémentaire des noyaux, afin d'évaluer l'état du tapis cellulaire. 4. incubation du composé à tester avec des cellules HeLa dans les mêmes conditions qu'à l'étape 1 et élimination du composé si l'on observe une fluorescence à la longueur d'onde a2. 5. marquage d'un échantillon des cellules incubées avec un marqueur de mitochondries, et marquage d'un échantillon de cellules incubées avec de l'azide de sodium et comparaison de l'effet de l'azide de sodium et du composé à tester sur les mitochondries et exclusion du composé s'il présente un mode d'action similaire à l'azide de sodium. 6. incubation de cellules HeLa avec la molécule à tester, traitement ou non au nocodazole, puis analyse du marquage en immunofluorescence du réseau microtubulaire et quantification à l'aide d'un lecteur. 7. incubation des cellules avec le composé à tester, suivi ou non d'une co-incubation avec la latrunculine, et marquage de l'actine F par une phallotoxine couplée à un fluorophore (émission à ? 2) pour analyser l'effet dudit composé à tester sur le réseau d'actine et éliminer le composé s'il n'inhibe pas le réseau d'actine.