Brevet FR2947908A1 — publié le 20110114

UTILISATION DE LA CREATININE COMME AGENT DE DILUTION POUR DETERMINER LA COMPOSITION CORPORELLE D'UN MAMMIFERE La présente invention concerne un procédé pour déterminer la composition corporelle d'un mammifère en mesurant le volume de distribution de créatinine exogène préalablement administrée. Ce procédé permet de déterminer rapidement la teneur en eau d'un organisme humain ou animal. A partir de cette teneur en eau et grâce à des équations bien établies on peut calculer la masse grasse et la masse maigre de cet organisme humain ou animal. La mesure de la composition corporelle est une donnée essentielle pour évaluer l'état général des mammifères. Elle permet notamment une appréciation globale de l'état nutritionnel ainsi qu'une une analyse des variations de la composition corporelle. La seule mesure du poids et de la taille sont très insuffisants pour déterminer l'état nutritionnel d'un mammifère. En effet, il est essentiel de pouvoir déterminer précisément la teneur en eau, en masse grasse et en masse maigre chez l'homme comme chez l'animal. Ceci est particulièrement vrai en cas de surcharge pondérale. Par exemple, au cours d'une réduction pondérale chez un organisme humain ou animal, il est préférable de cibler une perte de masse grasse et d'épargner la masse musculaire. La simple mesure du poids s'avère alors très insuffisante. De plus, chez certains animaux il peut être très difficile de déterminer avec certitude l'existence ou l'ampleur d'une surcharge pondérale ou d'une obésité. Ceci est particulièrement vrai par exemple pour les chiens en raison de l'existence d'un grand nombre de races ayant des formats très hétérogènes. Le poids normal est ainsi très variable d'une race à l'autre. Une mesure précise de la teneur en eau, en masse grasse et en masse maigre constitue alors un outil de diagnostic précieux pour déterminer l'état nutritionnel de l'animal. L'organisme est constitué d'éléments de nature très différentes : eau, protéines, graisses, os, etc. De nombreuses techniques ont été décrites pour déterminer la composition corporelle chez l'homme et chez l'animal. Cependant ces techniques sont souvent trop imprécises ou trop lourdes employant des outils réservés à la recherche qui ne conviennent pas au clinicien qui doit pouvoir faire un diagnostique rapide de la composition corporelle. Une des méthodes communément utilisées est la méthode de dilution isotopique au deutérium. Cette dernière est utilisée pour déterminer la composition corporelle chez l'homme comme chez l'animal. Burkholder et Thatcher (Burkholder WJ et CD Thatcher, 1998) ont validé en particulier l'utilisation d'oxyde de deutérium pour déterminer la composition corporelle des chiens. La mesure de l'espace deutérium est efficace pour mesurer la teneur en eau et de déterminer ainsi par calcul la teneur en graisse, en protéines et en éléments minéraux. Dans un domaine très différent, la créatinine est le marqueur le plus utilisé dans l'estimation indirecte ou directe du débit de filtration glomérulaire (DFG) en néphrologie des carnivores domestiques. C'est également le marqueur classiquement utilisé chez l'homme. La créatinine est une molécule de petite taille qui provient de la déphosphorylation de la créatine phosphate et de la déshydratation interne de la créatine. Ces deux molécules sont contenues principalement dans les muscles. La conversion en créatinine est spontanée, non enzymatique et irréversible. Elle affecte environ 2% de la créatine corporelle totale quotidiennement et est pratiquement constante au cours du temps. L'excrétion de la créatinine est uniquement rénale : elle est totalement filtrée par les glomérules, est sécrétée en quantité négligeable par les tubules et n'est pas réabsorbée. Un test de clairance plasmatique de créatinine exogène a été développé et validé chez le chien (Watson et al.). La clairance urinaire et plasmatique de la créatinine permet de mesurer le DFG considéré comme le meilleur indicateur de la fonction rénale. Cependant, l'utilisation de la créatinine pour mesurer la composition corporelle chez l'homme ou chez l'animal n'avait jamais été décrite ni même envisagée. La demanderesse a maintenant trouvé de manière surprenante qu'après l'injection de deutérium ou de créatinine exogène à un mammifère, les volumes de distribution du deutérium et de la créatinine sont très fortement corrélés. Cette corrélation est observée pour différents états nutritionnels (organismes normaux ou obèses par exemple). Ainsi, il est possible de remplacer le deutérium par de la créatinine dans les méthodes de dilution permettant de calculer la composition corporelle des animaux à partir de la détermination du volume distribution d'un agent de dilution. A partir de la détermination de l'espace créatinine, l'on déduit ainsi aisément la teneur en eau de l'organisme pour ensuite calculer la masse maigre et la masse grasse selon des équations classiques. L'utilisation de la créatinine présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation du deutérium ou d'autres isotopes. La créatinine est d'emploi facile, elle ne présente pas de risque de toxicité et son utilisation comme agent de dilution peut se faire à faible coût. Par ailleurs, les techniques de dosage de la créatinine sont déjà bien connues de l'homme du métier. En clinique vétérinaire par exemple, la créatinine est déjà fréquemment utilisée pour déterminer le DFG qui est un bon indicateur de la fonction rénale. Ces cliniques vétérinaires disposent ainsi fréquemment d'appareils ou de matériel permettant le dosage rapide de la créatinine dans le sang ou le plasma. Ces outils pourront être mis à profit pour déterminer rapidement et facilement la composition corporelle d'un mammifère. L'invention se rapporte à un procédé in vitro pour déterminer la composition corporelle d'un mammifère comprenant les étapes suivantes : a) mesure de la concentration plasmatique basale en créatinine sur un 15 échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère à jeun avant l'administration d'une dose de créatinine, b) mesure de la concentration plasmatique en créatinine sur au moins un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine, 20 c) détermination du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, d) calcul de la composition corporelle du mammifère à partir du volume de distribution de la créatinine déterminé à l'étape précédente. Avantageusement, à l'étape d) la masse corporelle en eau du mammifère est égal au 25 volume de distribution de la créatinine préalablement administrée. Dans un premier mode de réalisation, à l'étape d) on calcule la masse maigre du mammifère à partir du volume de distribution de la créatine préalablement administrée. Dans un autre mode de réalisation, à l'étape d) on calcule la masse grasse du mammifère à partir du volume de distribution de la créatine préalablement administrée. 30 De préférence, à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine comprise entre 40mg/kg et 160mg/kg, de préférence d'une dose de 40mg/kg. De préférence, à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine par voie orale, par injection intraveineuse ou par injection sous-cutanée. Préférentiellement, à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après un temps d'équilibrage d'au moins 30 minutes et de préférence d'au moins 45 minutes après l'administration d'une dose de créatinine. Selon un mode de réalisation préféré, à l'étape d) le volume de distribution de la 10 créatine dans le mammifère est calculé en divisant la dose administrée par la concentration plasmatique en créatinine exogène. Les procédés selon la présente invention permettent avantageusement de déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse chez l'homme. 15 De préférence, les procédés selon l'invention permettent de déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse chez le chien. De préférence, les procédés selon l'invention permettent de déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse 20 chez le chat. L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de la créatinine pour la fabrication d'un agent de dilution pour déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse d'un mammifère. L'invention a aussi pour objet, un agent de dilution pour déterminer la composition 25 corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse d'un mammifère caractérisé en ce qu'il comprend de la créatinine. L'invention se rapporte aussi à un programme d'ordinateur enregistré sur un support pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. De préférence, ce programme d'ordinateur enregistré sur un support comprend au moins : 30 - les instructions pour le calcul du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, - les instructions pour le calcul de la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse du mammifère, à partir de la concentration plasmatique en créatinine et de la dose de créatinine administrée préalablement enregistrées. L'invention a donc pour objet des méthodes de diagnostic de la composition corporelle d'un mammifère. Dans un premier mode de réalisation, l'invention se rapporte à des méthodes pour déterminer la teneur en eau d'un mammifère comprenant les étapes suivantes : - mesure de la concentration plasmatique basale en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère à jeun avant l'administration de créatinine, - administration d'une dose de créatinine exogène, - mesure de la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère après l'administration de la créatinine, - détermination du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, - détermination de la teneur en eau du mammifère à partir du volume de distribution déterminé à l'étape précédente. Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention se rapporte à des méthodes pour déterminer la teneur en masse maigre d'un mammifère comprenant les étapes suivantes : - mesure de la concentration plasmatique basale en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère à jeun avant l'administration de créatinine, - administration d'une dose de créatinine exogène, - mesure de la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère après l'administration de la créatinine, - détermination du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, - détermination de la teneur en masse maigre du mammifère à partir du volume de distribution déterminé à l'étape précédente. Dans un troisième mode de réalisation, l'invention se rapporte à des méthodes pour déterminer la teneur en masse grasse d'un mammifère comprenant les étapes suivantes : - mesure de la concentration plasmatique basale en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère à jeun avant l'administration de créatinine, - administration d'une dose de créatinine exogène, - mesure de la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère après l'administration de la créatinine, - détermination du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, - détermination de la teneur en masse grasse du mammifère à partir du volume de distribution déterminé à l'étape précédente. De préférence, la créatinine est administrée par voie orale, par injection intraveineuse ou par injection sous-cutanée. De préférence, on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur au moins un échantillon de sang prélevé sur le mammifère après l'administration de la créatinine. La concentration plasmatique en créatinine peut ainsi être mesurée sur des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers après l'administration de la créatinine. Préférentiellement, on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang prélevé sur le mammifère au moins 45 minutes après l'administration de la créatinine. L'invention concerne donc un procédé pour déterminer la composition corporelle, d'un mammifère en utilisant la créatinine comme agent de dilution. Le procédé repose sur la détermination du volume de distribution de créatinine exogène préalablement administré au mammifère. Par � détermination de la composition corporelle �, on entend la détermination d'au moins la teneur en eau, la teneur en masse maigre et/ou la teneur en masse grasse. La distribution peut se définir comme le processus de répartition de la créatinine dans l'ensemble des tissus et organes suite à son administration au mammifère. Le volume de distribution Vd se définit comme le volume apparent dans lequel se distribue la créatinine pour être en équilibre avec la concentration plasmatique C. De préférence, le volume de distribution de la créatinine exogène est calculé à partir de la concentration plasmatique de créatinine exogène une fois cet équilibre atteint. Le volume de distribution de la créatinine également appelé � espace � créatinine peut être mesuré et calculé selon des méthodes classiques de pharmacocinétique. Dans la présente invention, il a été trouvé de façon surprenante que le volume de distribution de la créatinine permet de déduire directement la teneur en eau de l'organisme. A partir de la teneur eau, la masse maigre et la masse grasse sont également déduites selon des équations classiques abondamment décrites dans la littérature. Etant donné que la créatinine est présente naturellement dans le sang des mammifères, il est nécessaire de déterminer au préalable la créatininémie c'est-à-dire la concentration basale en créatinine dans le sang. Cette concentration basale plasmatique sera ensuite soustraite aux concentrations plasmatiques en créatinine mesurées après l'administration de la créatinine exogène. Il est ainsi possible de mesurer la concentration plasmatique en créatinine exogène. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. En outre, des facteurs extérieurs peuvent affecter la valeur de la concentration plasmatique de la créatinine. La prise de nourriture est le facteur majeur de variation, en effet, la créatininémie augmente en moyenne de 45% dans les premières heures suivant un repas composé de viande cuite, puis reste élevée pendant 12 heures. Cette augmentation dépend de la composition des repas et il existe des différences interindividuelles de variation post-prandiale de la créatininémie. L'homme du métier comprendra donc que pour obtenir une mesure fiable de l'espace créatinine, les mesures des concentrations plasmatiques doivent être effectuées sur des échantillons de sang préalablement prélevés sur un mammifère ayant reçu une dose de créatinine à jeun. Pour la détermination du volume de distribution, de la créatinine exogène est préalablement administré au mammifère par injection intraveineuse (IV), par injection sous cutanée, par voie orale ou par toute autre méthode appropriée. La dose de créatinine administrée est comprise entre 40 mg/kg et 160 mg/kg. De préférence, la dose de créatinine préalablement administrée est de 40mg/kg. Lors de l'administration d'une dose de l'ordre de 40mg/kg, il n'est pas nécessaire ultérieurement de diluer les plasmas pour la mesure de la concentration en créatinine. Après administration de la créatinine, celle-ci se distribue dans l'organisme. Avant de mesurer la concentration plasmatique en créatinine exogène, il est donc préférable de laisser s'écouler un temps suffisant de distribution de la créatinine c'est-à-dire un temps suffisant d'équilibrage de la concentration plasmatique de la créatinine. Ce temps d'équilibrage est compris entre 45 minutes et 240 minutes. De préférence, ce temps d'équilibrage est d'au moins 45 minutes, d'au moins 1 heure, d'au moins 2 heures, d'au moins 3 heures ou au moins de 4 heures. La concentration plasmatique en créatinine peut être déterminée sur une série d'échantillons de sang prélevés au cours du temps suite à l'administration de la créatinine au mammifère. L'établissement d'une cinétique complète de la concentration plasmatique en créatinine permet de mesurer le volume de distribution de la créatinine avec une grande précision. Cependant, pour de nombreuses applications de diagnostic, il pourra être suffisant de mesurer la concentration plasmatique dans un seul échantillon de sang prélevé un temps suffisamment long après l'administration de la créatinine. Dans les exemples, il est ainsi montré que le volume de distribution de la créatinine peut être déterminé de façon suffisamment fiable à partir de la mesure de la concentration plasmatique sur un seul prélèvement de sang effectué après l'administration de la créatinine. De préférence, l'échantillon a été prélevé au moins 45 minutes après l'administration de la créatinine. La mesure de la concentration plasmatique de créatinine s'effectue selon des techniques connues décrites dans la littérature. On citera en particulier les méthodes de dosage colorimétriques ainsi que les méthodes de dosage enzymatiques. On utilisera par exemple la méthode de Jaffé reposant sur l'utilisation de l'ion picrate ou plus préférentiellement une méthode enzymatique employant la créatinine amidohydrolase ou créatininase. Cependant, toute méthode permettant le dosage de la créatinine dans le plasma pourra être mise en oeuvre dans les procédés de la présente invention. La concentration plasmatique en créatinine mesurée sur un échantillon de sang permet de déterminer le volume de distribution de la créatinine administrée. Ce volume de distribution est obtenu en divisant la dose administrée par la concentration plasmatique. Le volume de distribution de la créatinine est déterminé par la formule Vd=D/C dans laquelle D représente la dose de créatinine exogène ayant été préalablement administrée au mammifère et C représente la concentration plasmatique en créatinine à laquelle a été soustraite la concentration plasmatique basale en créatinine. En utilisant le deutérium comme agent de dilution, l'on détermine le volume de distribution du deutérium puis l'on déduit par des équations classiques la teneur en eau, la teneur en masse maigre et la teneur en masse grasse. La présente invention repose sur l'observation inattendue selon laquelle le volume de distribution de la créatinine est corrélé de façon linéaire avec le volume de distribution du deutérium. Ainsi, la détermination du volume de distribution de la créatinine permet de déduire la teneur en eau puis la teneur en masse maigre et en masse grasse en utilisant les équations bien connues de l'homme du métier déjà utilisés pour le deutérium. Ces équations classiques permettent d'estimer de façon précise la composition corporelle à partir du volume de distribution d'un agent de dilution comme le deutérium. La fiabilité de la mesure de la composition corporelle à partir du volume de distribution d'un agent de dilution a notamment été validée chez le chien (Burkholder WJ et CD Thatcher, 1998), chez l'homme (Forbes GB, 1994) et chez le chat (Backus RC et al, 2000). Dans un premier mode de réalisation, on effectue une seule mesure de concentration de l'agent de dilution (créatinine) sur un échantillon de plasma préalablement prélevé. De préférence, l'échantillon de plasma est préalablement prélevé une fois que la concentration en créatinine dans le sang a atteint l'équilibre. Le volume corporel d'eau est ensuite calculé à partir du volume de distribution selon l'équation suivante : Veau=Vd=D/C dans laquelle Vd représente le volume de distribution de la créatinine qui est égal au volume corporel d'eau (ou à la masse corporelle en eau), D est la dose de créatinine administrée et C la concentration plasmatique mesurée (de laquelle il faut retrancher la concentration basale en créatinine). Ce volume de distribution peut être exprimé en ml ou g car un 1 ml d'eau = 1 g. Dans un deuxième mode de réalisation, on effectue de multiples mesures de concentration de l'agent de dilution (créatinine) sur différents échantillons de plasma préalablement prélevés. Le volume corporel d'eau est ensuite calculé à partir du volume de distribution selon l'équation suivante : Veau=Vd= D x AUMC/AUC2 dans laquelle Vd représente le volume de distribution de la créatinine qui est égal au volume corporel d'eau (ou à la masse corporelle d'eau), D est la dose de créatinine administrée, AUC (area under the curve) est la surface sous la courbe qui intègre la concentration en fonction du temps (durée mesurée par exemple 0 à 240 min) et AUMC (first moment curve) qui est la surface sous la courbe de concentration du temps 0 à l'infini. Ces méthodes de calcul et équations classiques de pharmacocinétique sont par exemple décrites par Gibaldi et Perrier (1982). La masse maigre est directement calculée à partir de la masse corporelle en eau en utilisant l'équation suivante : Masse maigre (g)= masse en eau (g)/ constante Les constantes utilisées sont bien connues de l'homme du métier et largement décrites dans la littérature. Typiquement, constante chez l'homme = 0.73 (Forbes GB, 1994), constante chez le chien et le chat = 0.744 (Ferrier L et al, 2002, Backus RB et al 2000). La masse grasse est directement déduite de la masse maigre selon l'équation suivante : Masse grasse (g) = poids (g) ù masse maigre (g) dans laquelle le poids désigne le poids vif de l'homme ou d'un animal mammifère. Les procédés de la présente invention peuvent s'appliquer à la détermination de la composition corporelle de tout mammifère. Dans un premier mode de réalisation, les procédés de la présente invention 10 permettent de déterminer la composition corporelle chez l'homme. Dans un deuxième mode de réalisation, les procédés de la présente invention permettent de déterminer la composition corporelle d'animaux mammifères comme en particulier le chien ou le chat. 15 EXEMPLES Exemple 1 : Etude comparative du volume de distribution du deutérium et de la créatinine chez le chien normal puis obèse : Stratégie à plusieurs prélèvements. 20 1. Détermination du volume d'eau corporelle par multiple mesure de la prise d'eau Un groupe de 6 chiens beagles en condition corporelle optimale a été utilisé; au matin de l'étude, les chiens ayant reçu le dernier repas la veille au matin, une prise de sang de 2 mL est effectuée à la veine jugulaire et le plasma récolté pour la mesure basale de créatinine et 25 du D2O. Après placement d'un cathéter dans la veine céphalique, les doses de D2O (500 mg/kg poids vifs, 99,9% D2O contenant 0.9 %NaC1), et Créatinine (40 mg/kg poids mélangé à 5 mL de sérum physiologique) sont injectés et le cathéter flushé avec du sérum physiologique. Des prélèvements de sang sont ensuite effectués au temps 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360 et 480 minutes après l'injection. Le poids de l'animal le jour de 30 l'essai et les temps exacts des prises de sang sont enregistrés. Le plasma est récolté après centrifugation des échantillons de sang et est maintenu à 4°C en attendant les mesures de concentration de D2O et créatinine. Les chiens sont ensuite nourris à volonté avec un aliment commercial pour chien riche en matières grasses de manière à stimuler la prise de poids. Lorsque les animaux présentent une condition corporelle obèse, le même protocole est répété. Le tableau 1 illustre les variations de concentration de créatine dans le plasma du chien A en condition corporelle optimale et après prise de poids Cinétique créatinine chiens maigres vs chiens obèses Chien A maigre (09/03/07) Chien A obèse (11/09/07) 0,0113 0,0113 Temps (mm) C (�mo l/L) C (mg/dL) Temps (min) C (�mol/L) C (mg/dL) 0 78,2 0,88 0 82,6 0,93 2 1624,7 18,36 4 1892,3 21,38 5 1149 12,98 10 1502,4 16,98 993,3 11,22 15 1131,8 12,79 830,9 9,39 30 839 9,48 30 644,6 7,28 45 688,3 7,78 46 552,6 6,24 60 583 6,59 60 468,2 5,29 94 453,6 5,13 90 389,6 4,40 122 389,7 4,40 120 335,9 3,80 243 241,1 2,72 240 244,6 2,76 361 176,5 1,99 358 171,3 1,94 478 139 1,57 486 131,7 1,49 Les figures 3 à 10 illustrent les cinétiques de concentrations plasmatiques en créatinine 10 avant et après la prise de poids. Le tableau 1 et les courbes 3-10 illustrent le niveau de créatinine basale au temps 0, la rapide augmentation de créatinine plasmatique suite à l'injection de créatinine exogène, la chute progressive de la concentration en créatinine plasmatique jusqu'à 480 minutes après l'injection. Des courbes de cinétiques similaires ont été observées pour l'évolution de la concentration 15 du D2O. 2. Calcul de la teneur en eau corporelle A partir des courbes de cinétiques des concentrations de deutérium et de créatinine dans le 20 plasma, il est possible de calculer le volume de distribution de ces marqueurs dans l'organisme. Il a été validé chez l'homme, le chien, le chat et d'autres mammifères que le volume de distribution du D20 est équivalent au volume d'eau corporelle. La méthode de calcul du volume de distribution est une méthode couramment utilisée en pharmacocinétique, c'est une méthode non compartimenté basé sur la théorie statistique des moments (Gibaldi et Perrier, 1982). Brièvement, cette méthode détermine le volume de distribution en se basant sur l'équation suivante : Volume de distribution = Dose administrée x AUMC /AUC2 Le tableau 2 résume les volumes de distribution du deutérium et de la créatinine avant et après la prise de poids Résultats Dog Status Vd Vd Mean Delta deuterium creatinine m Llkg m Llkg m Llkg m Llkg A Normal 594,2 553,2 573,7 -41 C Normal 547,4 501,8 524,6 -45,6 E Normal 560,4 536,2 548,3 -24,2 F Normal 566,9 545,8 556,35 -21,1 G Normal 558,8 523,9 541,35 -34,9 H Normal 557,2 602,3 579,75 45,1 A Obese 423,3 419,5 421,4 -3,8 C Obese 394,6 389,8 392,2 -4,8 E Obese 408,1 407,9 408 -0,2 F Obese 422 428 425 6 G Obese 399,7 398,1 398,9 -1,6 H Obese 439,8 403,4 421,6 -36,4 Moyenne 489,4 475,8 482,6 -13,5 ET 79,7 75,2 25,7 On peut voir de ces données que le volume de distribution de la créatinine exogène corrèle très bien avec le volume de distribution de la créatinine figure 1. On voit aussi que le volume de distribution moyen de la créatinine est environ de 97.2 % du volume de distribution du D20 (Tableau 2 et Figure 2). Comme le D20 surestime le volume d'eau corporelle par 2-3 % chez le chien (voir ci-dessus), le volume de distribution de la créatinine représente bien le volume d'eau corporelle. 13 3. Calcul de la composition corporelle en masse maigre et masse grasse Une fois le volume (ou poids d'eau corporelle) déterminé par la méthode ci-dessus, il est facile de calculer la composition en masse maigre par des méthodes bien connues de 5 l'homme du métier. (Forbes GB, 1994, Ferrier L et al, 2002, Backus RB et al 2000). Dans l'exemple ci-dessus (Tableau 2), le volume moyen de distribution du deutérium est de 489.4 ml/kg de poids, pour déterminer le volume d'eau corporelle on doit utiliser un facteur de correction de 0.98 chez le chien (voir plus haut), donc le volume d'eau 10 corporelle = 489.4*0.98= 479.22 mL d'eau/kg poids vifs. De façon inattendue nous avons trouvé que le volume moyen de la distribution de la créatinine donnait une valeur très similaire soit 475.8 mL d'eau/kg poids vifs. Pour déterminer la proportion de masse maigre, on utilise l'équation suivante : 15 Proportion de masse maigre = Masse d'eau corporelle en g/kg/0.744 donc dans notre exemple : 475.8/0.744 = 639.5 g/kg de poids. La proportion de masse grasse peut être calculée par différence : Proportion de masse grasse = 1000 û proportion de masse maigre = 1000 û 639.5 = 360.5 g/kg de poids vifs. Exemple 2 : Etude comparative du volume de distribution du deutérium et de la créatinine chez le chien normal puis obèse : Stratégie limitée à 2 prélèvements pour l'obtention d'une estimation du volume de distribution de la créatinine après administration intraveineuse de créatinine exogène. 25 Le principe de l'étude est le même que pour la stratégie à prélèvement multiple mais cette fois seulement 2 prélèvements sont effectués : un prélèvement avant administration de créatinine pour déterminer la valeur basale (TO) et un second 45 minutes post administration. Comme dans le premier exemple, la dose injectée est de 40 mg 30 (354 �mole)/kg de poids. Pour déterminer le volume de distribution de la créatinine (Tableau 3), on divise la dose injectée (�mole ou mg) par la concentration (C) de créatinine dans le plasma (�mole/L ou mg/L) observée à 45 minutes, de laquelle la valeur 20 basale pré-administration (base) a été soustraite. Si la concentration est exprimée en mg/L, la dose doit être exprimée en mg. Tableau 3 ù Estimation du volume de distribution à 45 minutes. Statut Dog Time C-base Dose/C-base min �moUkg mL/kg Normal A 46 474.4 746 Normal C 43 566.3 625 Normal E 45 569.6 621 Normal F 48 498.1 711 Normal G 45 522.3 678 Normal H 45 451.2 785 Obèse A 45 605.7 584 Obèse C 45 512.1 691 Obèse E 45 667.2 531 Obèse F 45 590.5 599 Obèse G 45 704 503 Obèse H 47 514 689 Lorsqu'on compare le volume de distribution avec la méthode à 2 prélèvements versus la méthode avec la cinétique complète (tableau 4 et fig.11) on observe une corrélation significative 10 Tableau 4 ù Comparaison volume de distribution estimé à partir de la concentration plasmatique de créatinine mesurée à 45 minutes (Vd45) et le volume de distribution (Vss) obtenue avec une cinétique complète. Statut Dog Vss Vd45 (mL/kg) Normal A 553.2 746 Normal C 501.8 625 Normal E 536.2 621 Normal F 545.8 711 Normal G 523.9 678 Normal H 602.3 785 Obèse A 419.5 584 Obèse C 389.8 691 Obèse E 407.9 531 Obèse F 428 599 Obèse G 398.1 503 Obèse H 403.4 6895 La corrélation entre Vss et Vd 45 est montrée à la figure 11. L'équation suivante permet donc d'estimer la Vss à partir de Vd 45 : : Vss estimé=(Vd45-287.93)/0.7545 (équation 1) (R2=0.4481) ou encore Vss estimé =1.325 * Vd 45 ù 380.782 On peut constater (Tableau 5) que cette équation permet d'estimer la VSS réelle, et donc la teneur en eau corporelle, chez le chien en condition corporelle optimale avec un écart de - 17.6 à 9.3% et chez les chiens obèse avec un écart de -28.5 à +37.1%. Ces variations sont acceptables dans le cadre d'une pratique clinique. Tableau 5- Estimation du Vss à partir de Dose/C-base Vss= Vss calculé avec la cinétique complète ; Dose/C-base : volume de distribution estimé à partir de la concentration à 45 minutes ; V estimé : Vss estimé à partir de l'équation 1 Statut Dog Vss Dose/C- V estimé Delta (%) (mL/kg) base (mL/kg) Normal A 553.2 746 607 9.8 Normal C 501.8 625 447 -10.9 Normal E 536.2 621 442 -17.6 Normal F 545.8 711 560 2.7 Normal G 523.9 678 517 -1.4 Normal H 602.3 785 658 9.3 Obese A 419.5 584 393 -6.3 Obese C 389.8 691 535 37.1 Obese E 407.9 531 322 -21.2 Obese F 428 599 413 -3.5 Obese G 398.1 503 285 -28.5 Obese H 403.4 689 531 31.7 Moyenne 476 647 476 SD 75 85 112 Chez le chien sain, l'écart entre Vestimé et Vss varie de -17.6 à 9.3% 15 Chez le chien obèse, l'écart varie de -28.5 à +37.1% A partir de l'estimation du VSS, le calcul de la teneur en eau, en masse maigre et grasse se fait de la même manière que pour l'example 1. REFERENCES Backus RC, Havel PJ, Gingericj RL, Rogers QR. Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats. AJVR 2000, 61:796-801. 10 Burkholder WJ et Thatcher CD, AJVR, Vol. 59, No. 8, 1998 Ferrier L, Robert P, Dumon H, Martin L et Nguyen P. Evaluation of body composition of dogs by isotopic dilution using a low cost technique, Fourier-Transform Infrared 15 spectroscopy. J Nutr 2002, 132:17255-17275. Forbes GB, Body composition : influence of nutrition, disease, growth and aging. In Modem Nutrition in Health and Disease, Eds Shils ME, Oison JA, Shike M, Philadelphia:Lea&Febiger, 2004; 781- 801. Gibaldi M et Perrier D, Noncompartemental analysis based on statistical moment theory. In Pharmakokinetics, Marcel Dekker, Inc. New York, 1982, 409-417. Watson et al., J. Vet Intern Med, 16 :22-33, 2002 20 REVENDICATIONS1. Procédé in vitro pour déterminer la composition corporelle d'un mammifère comprenant les étapes suivantes : a) mesure de la concentration plasmatique basale en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère à jeun avant l'administration d'une dose de créatinine, b) mesure de la concentration plasmatique en créatinine sur au moins un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine, c) détermination du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, d) calcul de la composition corporelle du mammifère à partir du volume de distribution de la créatinine déterminé à l'étape précédente. 2. Procédé in vitro selon la revendication 1 dans lequel à l'étape d) la masse corporelle en eau du mammifère est égal au volume de distribution de la créatinine préalablement administrée. 3. Procédé in vitro selon la revendication 1 dans lequel à l'étape d) on calcule la masse maigre du mammifère à partir du volume de distribution de la créatine préalablement administrée. 4. Procédé in vitro selon la revendication 1 dans lequel à l'étape d) on calcule la masse grasse du mammifère à partir du volume de distribution de la créatine préalablement administrée. 5. Procédé in vitro selon l'une des revendications précédentes dans lequel à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine comprise entre 40mg/kg et 160mg/kg, de préférence d'une dose de 40mg/kg. 6. Procédé in vitro selon l'une des revendications précédentes dans lequel à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après l'administration d'une dose de créatinine par voie orale, par injection intraveineuse ou par injection sous-cutanée. 7. Procédé in vitro selon l'une des revendications précédentes dans lequel à l'étape b) on mesure la concentration plasmatique en créatinine sur un échantillon de sang préalablement prélevé sur le mammifère après un temps d'équilibrage d'au moins 30 minutes et de préférence d'au moins 45 minutes après l'administration d'une dose de créatinine. 8. Procédé in vitro selon la revendication 7 dans lequel à l'étape d) le volume de distribution de la créatine dans le mammifère est calculé en divisant la dose administrée par la concentration plasmatique en créatinine exogène. 9. Procédé in vitro selon l'une des revendications précédentes pour déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse chez l'homme. 20 10. Procédé in vitro selon l'une des revendications 1-8 pour déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse chez le chien. 11. Procédé in vitro selon l'une des revendications 1-8 pour déterminer la composition 25 corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse chez le chat. 12. Utilisation de la créatinine pour la fabrication d'un agent de dilution pour déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre 30 et/ou la masse grasse d'un mammifère.15 13. Agent de dilution pour déterminer la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse d'un mammifère caractérisé en ce qu'il comprend de la créatinine. 14. Programme d'ordinateur enregistré sur un support pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1-11. 15. Programme d'ordinateur enregistré sur un support selon la revendication 14 comprenant au moins : - les instructions pour le calcul du volume de distribution de la créatinine administrée au mammifère, - les instructions pour le calcul de la composition corporelle, la masse corporelle en eau, la masse maigre et/ou la masse grasse du mammifère, à partir de la concentration plasmatique en créatinine et de la dose de créatinine administrée préalablement enregistrées.