Brevet FR2940317A1 — publié le 20100625

SUBSTRAT D'EXORIBONUCLEASE, PROCEDE D'ANALYSE DE L'ACTIVITE D'UNE EXORIBONUCLEASE, ET UTILISATIONS DU SUBSTRAT DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à un substrat d'exoribonucléase, à un procédé d'analyse de l'activité d'une exoribonucléase, ainsi qu'à l'utilisation du substrat. Elle concerne, de façon générale, le domaine de la biologie moléculaire, et plus particulièrement celui de l'étude de la régulation de l'expression génétique. La présente invention trouve par exemple une application dans la mise en place de tests robotisés utilisés sur les plateformes de criblage. Elle est notamment adaptée au criblage à grande échelle d'activateurs ou d'inhibiteurs d'une exoribonucléase donnée. En effet, elle permet d'envisager un criblage à grande échelle pour identifier de nouveaux antimitotiques, antifongiques ou antibiotiques. Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([x]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte. Etat de la technique Une exoribonucléase est une enzyme qui dégrade l'ARN simple brin par l'une de ses extrémités et libèrent des nucléotides. Pour leur capacité à dégrader une molécule d'ARN, les exoribonucléases sont présentes dans tous les systèmes vivants, des procaryotes aux eucaryotes sans omettre les virus, dans des processus importants voire essentiels. Dans le contrôle de l'expression des gènes au niveau posttranscriptionnel, les ribonucléases, et les exoribonucléases en particulier, interviennent pour assurer la maturation et la dégradation de l'ARN. In vitro, la mesure de l'activité d'une exoribonucléase s'effectue au travers de différents tests permettant de mesurer la quantité des nucléotides libérés, ou bien la quantité d'ARN simple brin restant. A l'heure actuelle, ces tests requièrent le marquage du substrat ARN par incorporation d'un marqueur radioactif. De cette façon, la dégradation de l'ARN est mesurée par le comptage, soit des nucléotides marqués libérés, soit de l'ARN marqué pleine longueur. Dans les approches les plus courantes, les nucléotides sont séparés de l'ARN pleine longueur, soit lors d'une précipitation à l'acide trichloroacétique (TCA), soit par électrophorèse sur un gel polyacrylamide (Mathy, N., Benard, L., Pellegrini, O., Daou, R., Wen, T., and Condon, C. (2007), � 5'-to-3' exoribonuclease activity in bacteria: rote of RNase J1 in rRNA maturation and 5' stability of mRNA �, Cell 129, 681-92, [1]). Pour exemple, les résultats des comptages de mononucléotides libérés peuvent être reportés sur un graphique en fonction du temps et définir ainsi une cinétique de cette réaction de dégradation. Ces tests classiques ont été utiles pour mesurer l'activité d'une nouvelle exoribonucléase et ont permis de révéler l'existence d'inhibiteurs pour d'autres activités exoribonucléase ([1]; Dichtl, B., Stevens, A., and Tollervey, D. (1997), � Lithium toxicity in yeast is due to the inhibition of RNA processing enzymes �, Embo J 16, 7184-95, [2]). Cependant, ces tests sont fastidieux et très coûteux en temps et en matériel, notamment lorsqu'il faut réaliser de nombreuses cinétiques de dégradation d'ARN, ou lorsqu'il devient nécessaire de connaître l'effet d'un co- facteur de la réaction. Il n'existe pas à l'heure actuelle de test simple permettant d'analyser en temps réel la digestion d'un ARN par une exoribonucléase. On connaît la technologie de FRET, acronyme pour l'anglais � Fluorescence Resonance Energy Transfer �. Aujourd'hui, des techniques de modification de nucléotides permettent l'ajout de fluorophores sur des molécules d'acide nucléique, ARN ou ADN. Le principe général classique du FRET est fondé sur la présence d'un émetteur de fluorescence placé à proximité d'un extincteur de fluorescence. Ces émetteur et extincteur sont généralement placés sur la même molécule. La rupture de la molécule permet la détection d'une émission de fluorescence. Une rupture de ce type de molécule est envisageable par des enzymes capables de couper en un site interne, comme les endoribonucléases, comme décrit par exemple dans Jiang, X., and Belasco, J.G. (2004), � Catalytic activation of multimeric RNase E and RNase G by 5'-monophosphorlated RNA �, PNAS 101, 9211-9216, [3]. Toutefois, les ARN comportant des nucléotides modifiés par la présence de fluorophores sont nettement résistants aux attaques par des exoribonucléases. II existe donc un réel besoin en un substrat d'exoribonucléase palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un substrat permettant de faciliter l'analyse de l'activité exoribonucléase notamment en en réduisant le temps, et d'en réduire les coûts. Description de l'invention La présente invention a précisément pour but de répondre à ce besoin en fournissant un substrat d'exoribonucléase comprenant un premier brin d'acide nucléique qui est un brin d'ARN, et un second brin d'acide nucléique qui est hybridé au premier brin, ledit substrat comportant, à une extrémité, une zone d'arrimage qui permet à l'exoribonucléase de se fixer et de dégrader ledit premier brin, ledit substrat étant marqué d'une part par un émetteur de fluorescence et d'autre part par un extincteur de fluorescence, l'un étant fixé sur le premier brin et l'autre sur le second brin, lesdits émetteur et extincteur étant fixés l'un par rapport à l'autre à une distance d'extinction de la fluorescence émise par l'émetteur, et n'empêchant pas l'activité de l'une exoribonucléase sur le substrat., Contrairement aux substrats ARN de l'art antérieur connus pour une endoribonucléase ([3]), le substrat selon l'invention présente un couple émetteur-extincteur portés par deux brins d'acide nucléique distincts et hybridés ensemble. Ce substrat permet l'étude d'une exoribonucléase. Ce substrat d'exoribonucléase selon l'invention présente l'avantage d'éviter la manipulation des radionucléides utilisés actuellement pour le marquage de l'ARN, et utilisés dans les seules méthodes aujourd'hui disponibles et performantes pour la mesure de la dégradation d'un ARN. Ce substrat permet la mise en oeuvre, facilitée par rapport aux tests connus, de test d'activité d'exoribonucléase pour la détection d'exoribonucléase connue ou inconnue, ou pour la purification d'exoribonucléase, ou pour la mesure rapide et précise d'une activité exoribonucléase, ou encore pour la recherche de co-facteurs ou de co-enzymes d'une exoribonucléase. On entend par co-facteur toute molécule susceptible d'interagir avec l'enzyme pour réguler son activité. Un activateur ou un inhibiteur de l'enzyme sont notamment des co-facteurs. On entend par co-enzyme toute molécule susceptible d'interagir avec l'enzyme et essentielle à son activité. En outre, un tel test est adaptable aux approches robotisées comme celles mises en place lors de criblage de chimiothèques. Ce test permet en effet un criblage à grande échelle de molécules bioactives, tels qu'activateurs ou inhibiteurs d'une exoribonucléase, afin par exemple d'identifier notamment de nouveaux antimitotiques, antifongiques, ou antibiotiques. Le premier brin est donc un brin d'acide ribonucléique. Ce premier brin est destiné à pouvoir être dégradé par une exoribonucléase dans le cas où elle serait présente dans un échantillon avec lequel le substrat serait mis en contact. Il est donc essentiel que ce brin présente les caractéristiques lui permettant d'être dégradé par une exoribonucléase. Il est constitué, comme tout ARN, de bases azotées choisies parmi l'adénine (A), l'uracile (U), la cytosine (C), la guanine (G), et leurs dérivés tels que la dihydrouridine (DHU), l'inosine ou encore la xanthine ou la pseudo- uracile. L'homme du métier comprendra aisément que toute séquence du premier brin d'ARN, de même que toute longueur de ce brin, peut être choisie pour l'invention dans la mesure où cette séquence et cette longueur permettent la manipulation et la stabilité du brin, et permettent une dégradation de ce brin, de préférence relativement rapide, par l'exoribonucléase. Ce premier brin peut être de toute longueur permettant la réalisation du substrat selon l'invention. Toute longueur de ce brin est en effet envisageable dans la mesure où son hybridation avec le second brin, qui permet le rapprochement dans l'espace entre l'émetteur et l'extincteur de fluorescence, reste réalisable. En général, la longueur d'un brin d'ARN est comprise entre 8 et 10 000 bases, notamment entre 10 et 5000 bases, par exemple entre 20 et 3000 bases. Le premier brin comporte une extrémité 5' ou 3' adaptée à sa dégradation par l'exoribonucléase étudiée, respectivement 5'-3' ou 3'-5'. Généralement, pour être dégradé par une exoribonucléase 5'-3', le premier brin présente une extrémité 5'p, soit une extrémité 5' monophosphatée. En ce qui concerne les exoribonucléases 3'-5', le premier brin présente le plus souvent une extrémité 3'OH. Selon une version préférée de l'invention, le premier brin présente une queue non hybridée au second brin, qui comprend la zone d'arrimage. Par � zone d'arrimage � on entend, dans la présente, la partie d'acide nucléique qui est reconnue et sur laquelle se fixe l'exoribonucléase pour dégrader le premier brin. Cette zone d'arrimage est sur la queue du premier brin. Cette queue doit donc permettre à une exoribonucléase de se fixer à l'ARN et de le dégrader. On choisit donc la longueur de cette queue par exemple en fonction de l'exoribonucléase lorsqu'on sait quelle exoribonucléase est présente dans l'échantillon étudié. La queue peut être de toute longueur répondant à l'exigence de fixation et action de l'exoribonucléase. Généralement, une telle longueur est d'au moins 5 bases, ou d'au moins 7 bases, ou encore d'au moins 10 bases. Le substrat selon l'invention peut ne pas inclure une telle queue dans le cas, plus rare, où une exoribonucléase sera en mesure de se fixer et de démarrer la dégradation à partir d'une extrémité du premier brin qui sera hybridée au second brin. Dans ce cas, la zone d'arrimage est double brin au lieu d'être simple brin en se trouvant au niveau de la queue du premier brin. Le second brin peut être un brin d'ADN ou un brin d'ARN. II doit être complémentaire, au moins en partie, au premier brin afin d'être soit totalement hybridé au premier brin, soit de préférence qu'une partie du premier brin reste non hybridée et forme une queue pour la fixation de l'exoribonucléase. Si c'est un brin d'ARN, il est constitué, comme tout ARN, de bases azotées choisies parmi l'adénine (A), l'uracile (U), la cytosine (C), la guanine (G), et leurs dérivés tels que la dihydrouridine (DHU), l'inosine ou encore la xanthine ou la pseudo-uracile. Si c'est un brin d'ADN, comme toute molécule d'acide désoxyribonucléique, il est constitué de bases azotées choisies parmi l'adénine (A), l'uracile (U), la cytosine (C), la guanine (G), et leurs dérivés tels que la dihydrouridine (DHU), l'inosine ou encore la xanthine. L'homme du métier comprendra aisément que toute séquence du second brin, de même que toute longueur de ce brin, peut être choisie pour l'invention dans la mesure où cette séquence et cette longueur permettent sa manipulation et sa stabilité, et où la séquence présente une complémentarité avec le premier brin adaptée à permettre leur hybridation. Le second brin peut être en effet de toute longueur permettant la réalisation du substrat selon l'invention. En général, la longueur d'un brin d'ADN ou d'ARN est comprise entre 8 et 10 000 bases, notamment entre 10 et 5000 bases, par exemple entre 20 et 3000 bases. Pour le choix des longueurs de premier et second brins, l'homme du métier prendra en compte que plus le premier brin et/ou le second brin sera long, plus l'énergie requise pour séparer ces deux brins hybridés sera élevée. Une autre caractéristique essentielle des premier et second brins est d'être le support d'un émetteur et d'un extincteur de fluorescence, et de pouvoir se séparer l'un de l'autre lorsque l'exoribonucléase va dégrader le premier brin, si elle est présente dans l'échantillon à étudier. Le premier brin peut ou non être hybridé sur toute sa longueur au second brin. En effet, en plus de la queue, le premier brin peut comporter une ou plusieurs parties non hybridées au second brin, soit à l'extrémité opposée à celle de la zone d'arrimage, soit en position interne de la molécule. On entend par position interne d'un brin ou d'une molécule d'ARN ou d'ADN, toute partie de cette molécule à l'exception de ses extrémités. Le second brin peut lui-même n'être hybridé au premier brin que sur une partie de sa longueur. En effet, le second brin peut comporter une ou plusieurs parties non hybridées au premier brin, soit à une au moins de ses extrémités, soit en position interne de la molécule. L'hybride formé par le premier brin et le second brin doit être suffisamment stable pour permettre l'extinction de fluorescence du fait de la position respective des émetteur et extincteur de fluorescence. L'émetteur peut être fixé sur le premier brin ou sur le second brin. L'extincteur est alors fixé sur l'autre brin. De toute préférence, la position respective des émetteur et extincteur de fluorescence ne gêne pas l'activité de l'exoribonucléase. En effet, cette position ne doit empêcher ni la fixation de l'enzyme, ni son action de dégradation du premier brin, ni la séparation des premier et second brins sous l'effet de cette action de dégradation. L'émetteur et/ou l'extincteur peut être par exemple fixé à l'extrémité du premier brin et/ou du deuxième brin opposée à la zone d'arrimage. L'émetteur et/ou l'extincteur peut autrement être placé en une position interne sur le premier brin et/ou le second brin, dans la mesure où l'extinction de fluorescence a lieu au sein du susbtrat et que la présence de l'émetteur ou de l'extincteur sur le premier brin n'empêche en rien la dégradation de celui-ci par l'exoribonucléase. Les émetteur et absorbeur sont fixés l'un par rapport à l'autre à une distance d'extinction de la fluorescence émise par l'émetteur. Il est connu dans le domaine de la biologie moléculaire que cette distance dépendra de la nature des molécules formant le couple émetteur-extincteur et de leurs spectres d'émission et d'absorption respectifs. L'homme du métier saura déterminer cette distance. Généralement, elle est au plus de 30 bases, voire au plus de 20 bases, voire au plus de 15 bases, ou encore au plus de 10 bases. Cette distance exprimée en nombre de bases indiquent le nombre de bases décomptées sur un même brin. A titre d'exemple, dans l'invention, l'émetteur de fluorescence peut être choisi parmi FAM�, TET�, HEX�, JOE�, CY5�, ROX�, CY3�, et la fluorescéine, et l'extincteur de fluorescence peut être choisi parmi TAMRA�, BHQ-1�, BHQ-2�, BHQ-3�, DABCYL�, Deep Dark Quencher 1�, et Deep Dark Quencher 2�. Tous ces fluorophores sont notamment commercialisés par Eurogentec et/ou Eurofins MWG Operon. Un tableau ci-dessous indique à chaque ligne un couple émetteur-extincteur de fluorescence qui peut être utilisé dans l'invention : Emetteur de fluorescence: Extincteur de fluorescence: FAM TAMRA TET TAMRA HEX TAMRA JOE TAMRA FAM BHQ-1 TET BHQ-1 HEX BHQ-1 CY5 BHQ-2 ROX BHQ-2 CY3 BHQ-2 CY5 BHQ-3 FAM/BHQ-1 DABCYL TET/BHQ-1 DABCYL HEX/BHQ-1 DABCYL JOE/BHQ-1 DABCYL TAMRA/BHQ-2 DABCYL Le substrat selon l'invention peut être le substrat de tout type d'exoribonucléase connu de l'homme du métier, ou même inconnu. Par exemple, l'exoribonucléase peut être une exoribonucléase 5'-3' telle que l'exoribonucléase I, l'exoribonucléase Il, RNase J1, et Xrn1, ou une exoribonucléase 3'-5' telle que RNase R, RNase Il, Rrp44, RNase D, RNase T, PM/Scl-100, Oligoribonucléase, RNase BN, PNPase, PM/Scl-75, et RNasePH. L'exoribonucléase est appelée exoribonucléase 5'-3' lorsqu'elle dégrade l'ARN en enlevant le ou les nucléotides de l'extrémité 5'. L'exoribonucléase est appelée exoribonucléase 3'-5' lorsqu'elle dégrade l'ARN en enlevant le ou les nucléotides de l'extrémité 3'. Une exoribonucléase libère soit des mononucléotides, ou nucléotides monophosphates, par hydrolyse, soit des nucléotides diphosphates par phosphorolyse. L'invention concerne, selon un deuxième de ses aspects, un procédé d'analyse de l'activité d'une exoribonucléase dans un échantillon, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - addition à l'échantillon du substrat selon l'invention, dans des conditions permettant à l'exoribonucléase d'être active si elle est présente dans l'échantillon, et - mesure de la fluorescence émise par l'émetteur de fluorescence, ladite émission étant provoquée par la dégradation du premier brin par l'exoribonucléase, si celle-ci est présente dans l'échantillon. II existe une multitude d'exoribonucléases ayant chacune des conditions optimales d'activité, telles que température et pH, différentes. Par exemple, pour les conditions de température, il peut exister des exoribonucléases cryorésistantes et des exoribonucléases thermorésistantes. Toutes les conditions de températures, pH, etc. restent envisageables dans la mesure où l'hybride du substrat selon l'invention peut se former, et que la fluorescence peut être analysée. Pour une exoribonucléase donnée, l'homme du métier saura déterminer avec un minimum d'effort les conditions permettant son activité. A titre d'exemple, les conditions optimales pour l'activité de quelques exoribonucléases sont les suivantes : - pour Xrn1 : 30 mM Tris-HCI pH 8, 2 mM MgCl2, 50 mM NH4CI, 0,5 mM DU, 20 mg/mi BSA acétylée (Acetylated Bovine Serum Albumin) entre 30 et 37°C ; - pour la RNase J1 : 20 mM Tris-HCI pH 8, 8 mM MgCl2, 100 mM NH4CI, 0,1 mM DTT, entre 30 et 37°C ; - pour la RNAse PH : 50 mM Tris-HCI pH 8, 2,5 mM MgCl2, 30 mM NaCl, 10 mM K2HPO4, 0,1 mM DTT, entre 30 et 37°C ; - pour la Rnase II : 50 mM Tris-HCI pH 8, 2,5 mM MgCl2, 30 mM NaCl, 0,1 mM DTT, entre 30 et 37°C. L'appareil de mesure de fluorescence peut être tout appareil adapté à détecter et/ou quantifier la fluorescence. L'obtention des résultats d'analyse par le procédé selon l'invention s'effectue avec une extrême rapidité, et en temps réel après mélange des réactifs. Ce procédé permet de quantifier avec facilité et précision l'activité d'une exoribonucléase donnée dans des conditions variées, permet ainsi d'optimiser la réaction de dégradation de l'ARN, et de détecter des co-facteurs de cette réaction. II permet aussi d'éviter la manipulation des radionucléides utilisés dans le marquage des ARN, seule méthode actuelle et performante pour la mesure de la dégradation d'un ARN. L'invention concerne, selon un troisième de ses aspects, l'utilisation du substrat selon l'invention pour détecter et/ou pour mesurer une activité exoribonucléasique dans un échantillon, ou son utilisation pour identifier un cofacteur, tel qu'un inhibiteur ou un activateur, d'une exoribonucléase. En effet, l'invention permet, à l'aide du substrat, de mesurer en temps réel la dégradation d'un ARN par une exoribonucléase, dans le sens 5'-3' ou dans le sens 3'-5', de détecter la présence d'une activité exoribonucléase connue ou inconnue, de faciliter la purification d'une exoribonucléase, et d'identifier des facteurs associés à cette activité. L'utilisation du substrat selon l'invention permet en effet notamment de mesurer une activité spécifique d'hydrolyse de l'ARN constituant le premier brin, exprimée par exemple en pmoles de mononucléotides libérés par seconde.milligramme (s.mg) d'exoribonucléase, grâce à une bonne corrélation entre les mesures de fluorescence et celles du nombre de mononucléotides hydrolysés. Pour mesurer une activité spécifique, on réalise de préférence au préalable des gammes, sur un appareil de mesure de fluorescence, donnant la relation entre la concentration d'ARN fluorescent, et donc hydrolysé, et les unités relatives de fluorescence. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif. Brève description des figures - La figure 1 représente schématiquement une utilisation du substrat selon l'invention pour tester l'activité d'une exoribonucléase. La figure 2 est un diagramme en colonnes représentant la quantité de fluorescence émise d'une part par un substrat selon l'invention (colonnes de gauche), d'autre part par un premier brin non hybridé au second brin (colonnes de droite), en fonction de la concentration en premier brin. En abscisse : concentration d'ARN en pM ; en ordonnée : fluorescence en unité relative. La figure 3 représente des courbes de mesure de fluorescence en fonction du temps, pour d'une part un substrat selon l'invention seul, d'autre part un substrat selon l'invention en présence d'une exoribonucléase 5'-3'. En abscisse : temps en seconde (s) ; en ordonnée : fluorescence en unité relative. - La figure 4 représente des courbes de mesure de fluorescence en fonction du temps, pour un substrat selon l'invention en présence d'une exoribonucléase, avec ou sans inhibiteur de cette enzyme. En abscisse : temps en seconde (s) ; en ordonnée : fluorescence en unité relative. - La figure 5 représente des courbes de mesure de fluorescence en fonction du temps, pour d'une part un substrat selon l'invention seul, d'autre part un substrat selon l'invention en présence d'une exoribonucléase 3'-5'. En abscisse : temps en seconde (s) ; en ordonnée : fluorescence en unité relative. - Les figures 6 à 8 représentent les résultats de tests d'activité d'exoribonucléase réalisés à l'aide du substrat selon l'invention, lors de la purification de l'enzyme. En abscisses : temps en seconde (s) ; en ordonnées : fluorescence en unité relative. EXEMPLES Exemple 1 : Mise au point d'un test d'activité exoribonucléase par fluorescence L'exoribonucléase étudiée est l'enzyme Xrn1. C'est une exoribonucléase 5'-3' sensible aux structures secondaires ARN (Muhlrad, D., Decker, C.J. and Parker, R. (1995). Turnover mechanisms of the stable yeast PGK1 mRNA. Mol Cell Biol. 4, 2145-56, [4]), dont le choix permet d'envisager que, si le test d'activité fonctionne pour une telle enzyme, celui-ci sera applicable pour un bon nombre d'autres exoribonucléases. L'ARN substrat � R30F � (marque déposée) est un ARN de trente nucléotides, 5'-monophosphorylé. Cette extrémité 5' fait de cet ARN un excellent substrat pour Xrn1 (Stevens, A. (2001), � 5'-exoribonuclease 1: Xrn1 �, Methods Enzymol 342, 251-9, [5]). Cet ARN possède un fluorophore à son extrémité 3'. Ce fluorophore est le � FAM � (marque déposée), qui absorbe à une longueur d'onde de 494 nm et émet à 520 nm lorsqu'il est excité, et qui joue le rôle d'émetteur de fuorescence. Le fuorophore FAM présente la formule suivante : II a pu être vérifié que la présence d'un fluorophore de type FAM placé en position interne de la molécule d'ARN bloquait la progression de l'exoribonucléase Xrn1. Un oligonucléotide ADN � PolyT-TAM � (marque déposée) est utilisé pour s'hybrider avec l'ARN R30F dans sa partie 3'. Cet ADN possède une extrémité 5'OH, ce qui le rend insensible aux attaques par Xrn1. Seule la dégradation de l'ARN 5'p R30F dans l'hybride ARN/ADN est donc possible, et expérimentalement observée. Cet oligonucléotide PolyT-TAM possède à son extrémité 5' un fluorophore � TAMRA � (marque déposée) qui absorbe à une longueur d'onde de 565 nm et émet à 580 nm, et qui joue le rôle d'extincteur de fluorescence. Le spectre d'émission du FAM recouvre le spectre d'absorption du TAMRA de telle manière que la fluorescence émise par le FAM soit absorbée par le TAMRA quand l'ARN R30F et l'ADN PolyT-TAM sont hybridés. Le fuorophore TAMRA présente la formule suivante : O o Quand le R30F et le PolyT-TAM sont hybridés, le TAMRA absorbe la fluorescence émise par le FAM. Le principe reste généralisable à la production de tout hybride ARN/ADN ou ARN/ARN, les séquences ARN et ADN restant modulables, de même que le choix du couple des fluorophores émetteur et extincteur de fluorescence. Comme représenté à la figure 1, lorsque Xrn1 dégrade l'ARN R30F, 1C l'hybride ARN/ADN est détruit, le dernier nucléotide N portant le FAM étant alors libéré de l'environnement du TAMRA, ce qui permet la détection d'une émission de fluorescence correspondante à celle du FAM. Extinction de fluorescence au sein du substrat 15 Il a au préalable été vérifié que l'extinction du FAM par la présence du TAMRA était aisément atteinte avec le substrat selon l'invention, pour différentes quantités de R3OF, et en particulier dans des conditions où le rapport stoechiométrique R3OF/PolyT-TAM était inférieur ou égal à 1. Sur la figure 2 est reportée la quantité de fluorescence émise par le FAM en fonction de la concentration de l'ARN R3OF. Les mesures ont été effectuées sur un appareil Rotor-Gene (Corbett Research) et pourraient être effectuées sur tout autre appareil adapté à la mesure d'émission de fluorescence. II a été vérifié que l'hybride ARN/ADN, produit par un mélange R3OF 4pM /polyT-TAM, pour une stoechiométrie '/2, n'émettait quasiment plus de fluorescence. Le bruit de fond est faible. Des dilutions successives de ce mélange ont été effectuées et on a constaté que le bruit de fond restait minime pour des rapports de concentrations du mélange R3OF/PolyT-TAM supérieures à 0,125 pM/O,25OpM (figure 2). Pour l'obtention du substrat selon l'invention, le rapport stoechiométrique entre le premier brin et le second brin est donc avantageusement d'au moinset est de préférence compris entre'/2 et 1. Activité de l'enzyme Pour tester l'activité de Xrn1, l'enzyme purifiée, et diluée à une concentration inférieure à 20 nM, est ajoutée à un mélange de R3OF 1 pM/PolyT-TAM 2pM. L'activité de l'exoribonucléase Xrn1 est alors suivie au travers de l'augmentation de la fluorescence émise par le FAM. Les résultats sont représentés à la figure 3. Les courbes atteignent des plateaux qui correspondent à l'hydrolyse complète de l'ARN R3OF, soit à la libération totale du nucléotide portant le FAM. La mesure de la fluorescence émise par l'ARN R3OF à différentes concentrations a permis de reporter la quantité de fluorescence (en unités relatives de fluorescence de l'appareil Rotor Gene), en fonction de la concentration d'ARN R3OF. Dans la gamme de fluorescence qui nous intéresse, on constate que la fluorescence est une fonction affine de la concentration en ARN R3OF. De cette manière, les cinétiques obtenues par mesure de fluorescence peuvent être converties en une activité spécifique d'hydrolyse de l'ARN en pmole de mononucléotides libérés/seconde.mg d'enzyme. Un des avantages de l'invention est qu'elle permet des mesures en temps réel. On peut obtenir à titre d'exemple des résultats par intervalles de 15 secondes sur une durée presque illimitée sur l'appareil Rotor Gene (marque de commerce). Elle permet aussi de travailler avec de petits volumes de réaction. La réaction peut s'effectuer par exemple dans un volume final de 10 à 20 pI, tout en permettant l'obtention d'une cinétique complète. Un autre avantage est de ne pas nécessiter l'utilisation de radioactivité. Efficacité L'hydrolyse de l'ARN R30F par l'exoribonucléase Xrn1, même si celle-ci apparaît très efficace, pourrait être fortement ralentie par la présence de l'ADN PolyT-TAM hybridé. Cette éventualité a donc été considérée, en analysant sur gel dénaturant (20% acrylamide-bisacrylamide, 7M urée) la dégradation au cours du temps de l'ARN R30F, avec ou sans son hybride PolyT-TAM. La fluorescence du FAM peut être détectée à partir d'un gel grâce à un analyseur Typhoon. Après quantification des molécules associées au FAM et libérées au cours de l'hydrolyse par Xrn1 (logiciel Image Quant), il est apparu que la cinétique d'hydrolyse était sensiblement identique, que l'ARN R30F soit hybridé au PolyT-TAM ou non. L'utilisation d'un scanner Typhoon permet d'analyser en parallèle l'émission de fluorescence plus spécifique au TAMRA, ce qui permet de confirmer la présence de cet ADN-TAMRA et l'absence de dégradation de cette espèce par Xrn 1. Le comptage de tous les oligonucléotides entre 1 et 14 nucléotides associés au FAM, produits au cours de l'hydrolyse, montre que Xrn1 relargue très majoritairement des mononucléotides. La fluorescence émise lors de la dégradation de l'ARN tire donc principalement son origine du relargage des mononucléotides associés au FAM. Ceci est d'autant plus remarquable au cours des deux premières minutes de la réaction où la quantité des espèces plus longues (oligoribonucléotides de 2 à 14 nucléotides associés au FAM) reste très négligeable en regard des mononucléotides. Cette observation permet de vérifier que l'émission de fluorescence est fortement relative à la dégradation de la molécule d'ARN dans sa totalité via une activité exoribonucléase, et n'est pas le résultat d'une activité de type ARN- hélicase (qui ouvrirait l'hybride ARN/ADN sans aucune dégradation du brin d'ARN) ou bien d'un clivage endonucléasique inattendu de l'ARN ou de l'ADN, libérant l'émetteur ou l'extincteur de fluorescence par un procédé autre qu'une dégradation de type exoribonucléasique. Exemple 2 : Mesure des inhibitions de l'activité d'une exoribonucléase in vitro Le 3'-phosphoadénosine-5'phosphate (pAp) est un inhibiteur de l'activité de Xrn1 ([2]; Todeschini, A. L., Condon, C., and Benard, L. (2006), � Sodium-induced GCN4 expression controls the accumulation of the 5' to 3' RNA degradation inhibitor, 3'-phosphoadenosine 5'-phosphate �, J Biol Chem 281, 3276-82, [6]). Cette molécule a été utilisée pour valider le substrat selon l'invention qui peut être destiné à la détection d'effecteurs potentiels de l'activité de toute exoribonucléase. Le pAp s'accumule in vivo du fait de l'inhibition de Met22, l'enzyme dédiée à la modification du pAp en AMP, et son action inhibitrice in vivo est caractérisée. Des expériences d'inhibition de l'activité de Xrn1 par le pAp avaient été réalisées in vitro par des approches classiques. Comme attendu, les vitesses initiales d'émission de fluorescence dépendent de la concentration de substrat (0,5 et 1 pM d'ARN R30F) pour une concentration donnée d'enzyme (20 nM). En présence de pAp (100 pM), l'inhibition de l'activité de Xrn1 est décelable par la chute de la vitesse initiale d'émission de fluorescence (figure 4). D'autres molécules n'ayant pas d'activité connue d'inhibition de Xrn1 ont été testées. Des dérivés proches du pAp, tels que l'ATP, l'ADP et l'AMP, à des concentrations de 250 pM, ont été testés sans effet sur l'activité de Xrn1, alors que le pAp, à cette même concentration, inhibe fortement Xrn1. Les différents NTP ont de même été testés à une concentration élevée (1 mM) sans réel effet sur l'activité, alors que cette concentration en pAp bloque l'activité de Xrn1 (non montré). Exemple 3 : Mesure d'autres activités exoribonucléase 1 o D'autres ARN-FAM et ADN-TAMRA ont été utilisés en vue de tester les activités exoribonucléase dans le sens 3'-5', pour des exoribonucléases qui attaquent l'ARN par l'extrémité 3'. L'émission de fluorescence par le FAM provenant d'un ARN � OL2 �, et son extinction par la présence d'un hybride � polyT-TAM2 � sont en tout 15 point comparables avec les constructions précédentes R30F et PolyT-TAM. On a ainsi détecté les activités de deux exoribonucléases 3'-5', la RNase II et la RNasePH, de Escherichia coli (Condon, C. (2003), � RNA processing and degradation in Bacillus subtilis", Microbiol Mol Biol Rev 67, 157-174, [7]). Un résultat type obtenu avec la RNase Il est présenté dans la figure 20 5. De manière similaire à la figure 3 obtenue pour l'activité Xrn1, la fluorescence est mesurée quand le substrat selon l'invention, ici OL2/PolyT-TAM2, est mis en présence de l'enzyme RNase II. Le substrat selon l'invention se prête donc aisément à l'étude d'activité de toute exoribonucléase, que celle-ci dégrade l'ARN dans le sens 5'- 25 3' ou dans le sens 31-5'. Exemple 4 : Purification une exoribonucléase Des extraits bruts ont été obtenus à partir de cultures de Saccharomyces cerevisiae en vue d'isoler la protéine Xrn1 selon un protocole 30 de purification adapté à cette enzyme (Johnson, A. W., and Kolodner, R. D. (1991), � Strand exchange protein 1 from Saccharomyces cerevisiae. A nove/ multifunctional protein that contains DNA strand exchange and exonuclease activities", J Biol Chem 266, 14046-54, [8]; [5]). Le suivi de l'activité de Xrn1 a ensuite été effectué avec le substrat selon l'invention. Contrairement à un test classique, le test avec le substrat selon l'invention ne nécessite pas le radiomarquage de l'ARN. L'analyse de la totalité des fractions issues des colonnes de séparation de protéines a pu être effectuée dans un temps minimal. Dans les figures 6 à 8 sont présentées une partie des analyses qui ont suivi les élutions de chaque colonne : colonne héparine d'abord (figure 6), puis colonne MonoQ (marque déposée) (figure 7), et enfin colonne Superdex 200 (marque déposée) (figure 8). Au préalable, pour l'obtention de protéines, un surnageant issu d'une préparation de levures cassées par application d'une pression à la French Press a été passé sur colonne DEAE-cellulose (Whatman DE52) montée en série avec la colonne héparine. La figure 6 présente les tests d'une partie des fractions récoltées après élution de la colonne héparine. Les fractions sélectionnées, après élution de la colonne héparine, 2C sont passées sur colonne MonoQ HR 5/5 (marque déposée, GE Healthcare), éluées et testées chacune pour l'activité Xrn1 (figure 7). La colonne MonoQ HR 5/5 est une colonne à haute résolution, échangeuse d'anion. Les fractions sélectionnées sont enfin passées sur une colonne Superdex 200 HR 10/30 (marque déposée, GE Healthcare), éluées et testées 25 (figure 8). En parallèle, des échantillons issus des fractions d'intérêt ont été soumis à une électrophorèse sur gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie, confirmant l'enrichissement des fractions en protéine Xrn1. L'approche conforme à l'invention apporte donc des informations 30 dans la minute sur la présence de l'activité Xrn1. Les fractions qui contiennent le pic d'activité sont repérées et peuvent être traitées immédiatement, ce qui nécessite une journée avec un test classique d'activité Xrn1 par exemple. L'ensemble de la purification nécessite deux semaines dans une 5 approche classique, ce temps est réduit de plus de moitié avec ce test de fluorescence selon l'invention. Liste des références [1] Mathy, N., Benard, L., Pellegrini, O., Daou, R., Wen, T., and Condon, C. (2007). 5'-to-3' exoribonuclease activity in bacteria: rote of RNase J1 in rRNA maturation and 5' stability of mRNA. Cell 129, 681-92. [2] Dichtl, B., Stevens, A., and Tollervey, D. (1997). Lithium toxicity in yeast is due to the inhibition of RNA processing enzymes. Embo J 16, 7184-95. [3] Jiang, X., and Belasco, J.G. (2004). Catalytic activation of multimeric RNase E and RNase G by 5'-monophosphorlated RNA. PNAS 101, 9211-9216. [4] Muhlrad, D., Decker, C.J. and Parker, R. (1995). Turnover mechanisms of the stable yeast PGKI mRNA. Mol Cell Biol. 4, 2145-56. [5] Stevens, A. (2001). 5'-exoribonuclease 1: Xrn 1. Methods Enzymol 342, 251-9. [6] Todeschini, A. L., Condon, C., and Benard, L. (2006). Sodium-induced GCN4 expression controls the accumulation of the 5' to 3' RNA degradation inhibitor, 3'-phosphoadenosine 5 '-phosphate. J Biol Chem 281, 3276-82. [7] Condon, C. (2003). RNA processing and degradation in Bacillus subtilis. Microbiol Mol Biol Rev 67, 157-174. [8] Johnson, A. W., and Kolodner, R. D. (1991). Strand exchange protein 1 from Saccharomyces cerevisiae. A nove) multifunctional protein that contains DNA strand exchange and exonuclease activities. J Biol Chem 266, 14046-54. REVENDICATIONS1. Substrat d'exoribonucléase caractérisé en ce qu'il comprend un premier brin d'acide nucléique qui est un brin d'ARN, et un second brin d'acide nucléique qui est hybridé au premier brin, ledit substrat comportant, à une extrémité, une zone d'arrimage qui permet à l'exoribonucléase de se fixer et de dégrader ledit premier brin, ledit substrat étant marqué d'une part par un émetteur de fluorescence et d'autre part par un extincteur de fluorescence, l'un étant fixé sur le premier brin et l'autre sur le second brin, lesdits émetteur et extincteur étant fixés l'un par rapport à l'autre à une distance d'extinction de la fluorescence émise par l'émetteur, et n'empêchant pas l'activité de l'exoribonucléase sur le substrat. 2. Substrat selon la revendication 1, dans lequel le premier brin présente une queue non hybridée au second brin, qui comprend la zone d'arrimage. 3. Substrat selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le second brin est un brin d'ADN. 4. Substrat selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le second brin est un brin d'ARN. 5. Substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'émetteur ou l'extincteur est fixé à l'extrémité du premier brin ou du deuxième brin opposée à la zone d'arrimage. 6. Procédé d'analyse de l'activité d'une exoribonucléase dans un échantillon, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :- addition à l'échantillon du substrat tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans des conditions permettant à l'exoribonucléase d'être active si elle est présente dans l'échantillon, et - mesure de la fluorescence émise par l'émetteur de fluorescence, ladite émission étant provoquée par la dégradation du premier brin par l'exoribonucléase, si celle-ci est présente dans l'échantillon. 7. Utilisation du substrat tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour détecter et/ou pour mesurer une activité exoribonucléase dans un échantillon. 8. Utilisation du substrat tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour identifier un co-facteur, tel qu'un inhibiteur ou un activateur, d'une exoribonucléase.15