Brevet FR2943428A1 — publié le 20100924

DISPOSITIF DE MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE ET METHODE D'OBSERVATION ASSOCIEE La présente invention concerne un dispositif de 5 microscopie de fluorescence et une méthode d'observation associée. La microscopie de fluorescence est une technique de microscopie optique qui tire profit du phénomène de fluorescence pour observer divers composés. La fluorescence 10 est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière fluorescente par eux-mêmes. La fluorescence d'un composé à observer peut être primaire si ce composé est fluorescent par lui-même (par exemple : chlorophylle, huile) ou secondaire quand on 15 marque le composé à observer avec une substance fluorescente, dite fluorochrome ou marqueur fluorescent. En biologie cellulaire, un grand nombre d'événements moléculaires intervenant à la surface des cellules sont étudiés en microscopie de fluorescence comme par exemple 20 l'adhésion cellulaire, la fixation d'hormones sur des récepteurs de la membrane plasmique, la sécrétion de neurotransmetteurs ainsi que la dynamique membranaire (endocytose, exocytose). Un dispositif de microscopie de fluorescence 25 comprend usuellement une source de lumière pour l'excitation, des moyens pour séparer les photons d'excitation des photons d'émission, un système de lentilles pour collecter les photons et en général des moyens d'imagerie. 30 Les techniques de fluorescence peuvent être utilisées avec différents types de microscope notamment : - un microscope optique classique où la lumière d'excitation peut passer par l'échantillon ou par l'objectif. Dans ce dernier cas, on parle alors de microscopie à épifluorescence ; - un microscope confocal, par exemple à balayage laser qui permet notamment de réaliser des images en trois dimensions de l'échantillon ; - un microscope de fluorescence par réflexion totale interne (en anglais : � total internai reflection fluorescence � usuellement appelée TIRF) qui utilise une onde évanescente pour n'exciter la fluorescence que sur une très faible profondeur, immédiatement adjacente à l'interface du support de l'échantillon (en général en verre) et du milieu liquide (en général de l'eau) dans lequel est disposé l'échantillon. L'éclairage est réalisé par un faisceau incident d'un laser suivant un angle surcritique pour créer une onde évanescente (exponentiellement décroissante orthogonalement à l'interface). La microscopie TIRF, bien qu'actuellement en plein essor et permettant des observations précises, présente néanmoins certains inconvénients. En effet l'utilisation d'une source laser adaptée se révèle onéreuse et le champ d'excitation ainsi généré peut ne pas être homogène (suite aux interférences provenant de la cohérence du faisceau). En outre on constate qu'un éclairage par l'objectif ne permet pas une excitation homogène et que la profondeur de pénétration résultante n'est pas constante sur l'ensemble du champ à observer. De plus, il existe des pertes de confinement du champ excitateur liées à la diffusion intrinsèque de la lumière par les cellules. Le but de la présente invention est de proposer un dispositif de microscopie de fluorescence permettant d'obtenir des images de fluorescence de grande qualité avec un dispositif peu onéreux ou d'améliorer la qualité des images obtenues en microscopie TIRF. L'invention propose ainsi un dispositif de microscopie de fluorescence pour observer l'émission de fluorescence d'un échantillon comprenant des composants fluorescents dans un milieu liquide d'indice de réfraction nL disposé sur un support transparent d'indice de réfraction ns supérieur à nL et inférieur ou égal à 1,55, ledit dispositif comprenant un objectif plein champ à immersion dont l'ouverture angulaire numérique, ON, est supérieure ou égale à 1,33 et inférieure ou égale à ns et un ensemble de lentilles pour former une image dans au moins un plan image et qui comprend en outre un cache disposé dans le plan focal arrière de l'objectif à immersion ou dans un plan conjugué dudit plan focal arrière de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon dans les directions angulaires où l'angle e est inférieur ou égal à un angle critique 9,, avec 0, = arcsin (nL/ns) et l'angle 9 défini comme l'angle d'une direction angulaire d'émission de fluorescence par rapport à la direction perpendiculaire de la surface du support sur laquelle est disposé l'échantillon à observer. On entend par objectif � plein champ �, un objectif permettant de former une image plein champ. De manière avantageuse, un tel objectif est un objectif commercial d'usage standard en microscopie de fluorescence. Grâce au dispositif selon l'invention, il est possible d'obtenir des images de microscopie de fluorescence de très grande qualité, permettant par exemple d'obtenir des informations précieuses pour l'étude de matériaux biologiques. En effet, le dispositif selon l'invention permet d'obtenir des images de fluorescence plein champ avec une grande sensibilité, notamment de zones localisées à l'interface du support d'indice de réfraction ns et du milieu liquide d'indice de réfraction nL. On peut ainsi visualiser des événements se produisant près de cet interface, sur une profondeur d'environ du sixième de la longueur d'onde de la lumière d'excitation. A titre d'exemple, la profondeur sur laquelle s'effectue l'observation est de l'ordre de 50 nm à 100 nm pour des longueurs d'onde dans le visible. Les supports communément utilisés en microscopie de fluorescence sont en verre et il est avantageux de choisir des verres standard, d'indice de réfraction inférieur ou égal à 1,55, dont le coût est faible. L'adjonction du cache dans le plan focal arrière de l'objectif ou dans un plan conjugué peut se faire de manière simple et notamment être mise en œuvre avec des microscopes de fluorescence commerciaux. Il en résulte un dispositif amélioré dont le coût de l'amélioration est très modeste. La fonction du cache consiste à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon dans les directions angulaires où l'angle 0 est inférieur ou égal à l'angle critique 0c. Les figures 5a et 5b ci-annexées rappellent les principes d'émission de fluorescence. Un fluorochrome se comporte comme une antenne susceptible d'émettre un signal. Cet émetteur possède dans son environnement immédiat (quelques dizaines de nanomètres) des composantes électromagnétiques qui sont évanescentes lorsqu'il est placé dans un milieu homogène. Ces composantes peuvent devenir propagatives lorsque le fluorochrome est placé à proximité d'une interface. Elles se propagent alors dans des angles supérieurs à l'angle critique dans le milieu d'indice de réfraction le plus élevé. La figure 5a représente les composantes d'émission de fluorescence d'un émetteur 12 situé à l'interface entre 10 un support 20 et un milieu liquide 11. L'émission de fluorescence de l'émetteur 12 comprend une composante 14 émise pour e compris entre 0 et e, et une composante 15 émise pour 0 supérieur à ec, dite � lumière interdite � ou � lumière supercritique � et correspond aux 15 composantes évanescentes dans le milieu liquide 11 devenue propagative dans le support transparent 20. On constate que près de l'interface la lumière supercritique peut représenter jusqu'à environ un tiers de la lumière totale émise. 20 La valeur de l'angle critique est donnée par les lois de la réfraction de Snell-Descartes où e, = arcsin (nL/ns) . Dans le cas où le liquide est de l'eau (nL = 1,33) et le support est en verre standard (ns = 1,52), e, vaut 61°. 25 La figure 5b représente les composantes d'émission de fluorescence d'un émetteur 12 situé à une distance supérieure à environ 100 nm. On constate que la lumière émise comprend la même composante 14, émise pour e compris entre 0 et e, mais ne 30 comprend plus de composante émise à un angle supérieur à ec, correspondant à de la lumière supercritique. La disposition du cache du dispositif selon l'invention permet de sélectionner seulement la lumière supercritique et ainsi de produire des images donnant des informations sur les événements se déroulant dans environ les 100 nm de profondeur par rapport à l'interface milieu liquide / support. Ces informations sont particulièrement précieuses pour les biologistes. Dans la suite de la présente description, on appellera � image de champ proche � une image effectuée avec le cache du dispositif selon l'invention, et � image d'épifluorescence � une image effectuée sans ledit cache. L'ouverture numérique, ON, d'un objectif est définie par ON = n. sin (amax) où n est l'indice du milieu de fonctionnement de l'objectif et OEmax est l'angle maximum de collection de l'objectif. Des objectifs commerciaux actuels de grande ouverture numérique à immersion à huile (n=1,51) ont été développés. Ils possèdent des ON par exemple de 1,45 et de 1,49. Les angles maximums collectés sont supérieurs à l'angle critique 6c. Ainsi, ces objectifs permettent de collecter la majeure partie de la lumière supercritique. De préférence, ces objectifs sont corrigés des aberrations chromatiques et sphériques et permettent ainsi d'obtenir une image plein champ d'excellente qualité. Le dispositif selon l'invention peut comprendre l'une ou les caractéristiques suivantes qui peuvent être combinées entre elles : - le cache est amovible ; il est ainsi possible d'effectuer successivement des images avec et sans cache ; on peut ainsi faire des images d'épifluorescence et de champ proche ; - le cache est composé d'un disque opaque et optionnellement d'anneaux concentriques opaques ; - le cache est choisi parmi la liste des dispositifs occultables constituée d'un dispositif à cristaux liquides, 5 un dispositif microfluidique, un dispositif mécanique ; - l'ouverture angulaire numérique, ON, de l'objectif à immersion est supérieure ou égale à 1,45 et inférieure ou égale à 1,50 ; - une source d'éclairage polychromatique ou 10 monochromatique est disposée de manière à éclairer l'échantillon à travers le support sur lequel il est disposé ; - le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre un sténopé disposé dans un plan image 15 situé dans le trajet optique au-delà du cache de manière à permettre des observations de microscopie confocale ; - le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre une source d'éclairage laser de manière à permettre des observations de microscopie TIRF (� total 20 internal reflection fluorescence �, pour � fluorescence par réflexion totale interne �) ; il est également possible de mettre en oeuvre le microscope TIRF en utilisant une source classique qui est focalisée ; - le cache est amovible et comprend en outre des 25 moyens pour actionner ce cache amovible de manière à permettre une succession d'observations de l'échantillon avec et sans cache ; - le dispositif comprend en outre des moyens d'acquisition de l'image de l'échantillon et des moyens 30 d'interfaçage desdits moyens d'acquisition pour permettre l'acquisition en alternance d'images avec et sans cache. La présente invention vise également une méthode d'observation par microscopie de fluorescence mettant en oeuvre le dispositif de microscopie par fluorescence selon l'invention et mentionné ci-dessus, où l'échantillon à observer est éclairé à travers le support sur lequel il est disposé. Selon différents modes de réalisation qui peuvent être combinés entre eux : - l'échantillon à observer est un échantillon 10 biologique comprenant des cellules dans le milieu liquide d'indice de réfraction nL; - le cache du dispositif de microscopie de fluorescence est amovible et la méthode comprend une étape d'observation sans le cache et une étape d'observation avec 15 le cache suivies d'une étape de comparaison des deux images ainsi obtenues ; selon ce mode de réalisation, l'étape de comparaison peut comprendre une étape de calcul par combinaison de l'image obtenue sans le cache et de l'image obtenue avec le cache ; 20 - les images sont acquises par des moyens d'acquisition vidéo et la succession des étapes d'observation avec et sans le cache est synchronisée à la cadence vidéo desdits moyens d'acquisition vidéo ; - on dispose un composant semi-réfléchissant dans le 25 faisceau émis et les images sont acquises avec deux moyens d'acquisition vidéo afin d'acquérir simultanément les images avec et sans cache ; le composant semi-réfléchissant est notamment une lame séparatrice ou un cube semiréfléchissant. 30 L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre une vue schématique d'un dispositif de microscopie de fluorescence selon 5 l'invention ; - la figure 2 illustre une variante selon l'invention du dispositif selon la figure 1, adapté à la microscopie confocale ; - la figure 3 illustre une variante selon 10 l'invention du dispositif selon la figure 1, adapté à la microscopie TIRF ; - la figure 4 illustre un exemple de cache utilisé dans le dispositif selon l'invention ; - les figures 5a et b illustrent les composantes 15 d'émission de fluorescence selon différentes configurations et ont été commentées ci-dessus ; - la figure 6 illustre les profils de fluorescences de billes fluorescentes de référence avec et sans cache ; - les figures 7a et 7b illustrent des observations 20 de fluorescences d'une même cellule respectivement sans et avec le dispositif selon l'invention. Pour des raisons de clarté, les différents éléments représentés sur les figures ne sont pas nécessairement à l'échelle. Sur ces figures, des références identiques 25 correspondent à des éléments identiques. La figure 1 présente une vue schématique d'un dispositif de microscopie de fluorescence 100 selon l'invention. Celui-ci comprend un objectif à immersion 110 dont l'ON est supérieur ou égal à 1.33. Un support en verre 30 20 est disposé au-dessus de cet objectif à immersion 110. De l'huile est disposée entre l'objectif à immersion 110 et le support en verre 20. Un échantillon 10 à observer est disposé sur le support en verre 20. Cet échantillon 10 comprend par exemple des composants fluorescents dispersés dans de l'eau. Le plan focal arrière de l'objectif est référencé 400. De la lumière d'excitation est produite par un faisceau 200 issu d'une source lumineuse qui traverse un filtre d'excitation 210 et est réfléchie par un miroir dichroïque 120 pour aller illuminer l'échantillon 10 après avoir traversé le support transparent 20. Un exemple de trajet de la lumière d'excitation incidente est figuré par les flèches dirigées vers le haut de la figure. La lumière d'excitation incidente peut être en partie réfléchie et est alors filtrée par un filtre d'émission 130 de manière à ce que l'image formée dans un plan image ne comprenne que de la lumière de fluorescence émise par l'échantillon 10. La lumière de fluorescence émise par l'échantillon 10 20 traverse le support transparent 20, le miroir dichroïque 120, le filtre d'émission 130. Selon le mode de réalisation représenté en figure 1, cette lumière est réfléchie sur un miroir 140 et la suite du dispositif fonctionne avec la lumière réfléchie. 25 Selon un autre mode de réalisation (non représenté), la lumière de fluorescence n'est pas réfléchie et la suite du dispositif fonctionne avec la lumière transmise. Une lentille 150, dite lentille de tube, permet de focaliser la lumière sur un plan image intermédiaire 410. 30 La lumière est ensuite parallélisée grâce à une lentille 160 et focalisée ensuite par une lentille 180 sur le plan image 430 où l'image est acquise par un dispositif adapté, notamment une caméra 300. Les plans 430 et 410 sont des plans images conjugués du plan d'observation. Les lentilles 160 et 180 sont disposées de manière à ce qu'un plan conjugué 420 du plan focal arrière de l'objectif à immersion 110 soit situé entre ces lentilles 160 et 180. Un cache 170 est disposé dans ce plan focal arrière de l'objectif à immersion, de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon 10 dans les directions angulaires où l'angle e est inférieur ou égal à l'angle critique Oc. Les rayons lumineux émis suivants un certain angle par les émetteurs fluorescents de l'échantillon 10 situés dans le plan d'observation interceptent le plan focal arrière 400 de l'objectif (ou tout plan conjugué 420 de ce plan 400) à une certaine distance r(e) du centre (défini par l'axe optique) de ce plan. r(8) est une fonction croissante de 0. Pour des objectifs dits aplanatiques par exemple, r(8) est sensiblement proportionnel à sin(e). Ainsi, l'ensemble des rayons émis suivant l'angle e (formant un cône) décrit un cercle de rayon r(8) dans le plan focal arrière. Quand le cache 170 est disposé dans le plan focal 25 arrière 400 de l'objectif 110, la relation entre r(6) et sin(e) s'exprime : r(9)= ni x fo x sin(e), où fo est la distance focale de l'objectif à immersion 110 (en général de l'ordre de quelques millimètres) et ni est l'indice du milieu 30 d'immersion utilisé pour l'objectif (en général de l'huile). Selon un exemple de réalisation, on a un objectif à immersion de grossissement G = 100 et la distance focale de la lentille de tube 150 vaut ft = 200 mm. On a alors fo = ft/G = 2 mm. On obtient dans cette 5 configuration : r (00) = 2,66 mm. Quand le cache 170 est disposé dans le plan conjugué du plan focal arrière, il convient de tenir compte du facteur de grandissement lié au système optique. A titre d'exemple le cache 170 est disposé dans le plan 420 et il 10 convient d'introduire un facteur multiplicatif G' = f16o/f15o, où f15o est la distance focale de la lentille de tube 150 et f16o est la distance focale de la lentille 160. L'émission suivant les angles sous-critiques 0 Selon un exemple de réalisation, on utilise un microscope inversé de fluorescence de type Ti de Nikon comprenant un module (réf. TI-T-BPH, MEB55810) qui permet d'imager le plan focal arrière et de positionner un cache annulaire pour permettre le contraste de phase (externe) avec les objectifs de grandes ouverture numérique. Il est possible de mettre un cache 170 du dispositif selon l'invention dans ce type de module. Le système de centrage et du réglage de la position du plan sont tout à fait adaptés pour un cache filtrant les angles sous-critiques. Le système comprend plusieurs positions pour les différents objectifs ainsi qu'une position sans cache. La figure 4 présente une vue schématique d'un cache 170 destiné à être disposé sur le plan focal arrière 400 de l'objectif à immersion 110 ou dans un plan conjugué 420 dudit plan focal. Le cache 170 est composé d'une zone centrale 171 sous forme de disque et de deux zones annulaires 172, 173, concentriques à la zone centrale 171. De fines zones intermédiaires 174, 175 séparent respectivement la zone centrale 171 de la première zone annulaire 172 et les deux zones annulaires 172, 173 entre elles. Les zones centrales 171 et annulaires 172, 173 sont des zones dont la transmission peut être variée, notamment entre une configuration d'occultation et une configuration laissant passer la lumière. Le cache peut comprendre plus de deux zones annulaires concentriques et selon l'exemple représenté, seules deux zones annulaires concentriques et la zone centrale ont été occultées. Selon un premier mode de réalisation, le cache 170 est un système microfluidique et des canaux 177, 178, 179 alimentent en fluide opaque les zones centrales 171 et annulaires 172, 173 et les zones intermédiaires 174, 175 sont des parois de séparation. Selon un autre mode de réalisation, le cache 170 est un système à cristaux liquides et chaque zone, centrale 171, annulaires 172, 173 peut être adressée par des électrodes 177, 178, 179 de manière à faire varier la transmission des cristaux liquides. Le système à cristaux liquides peut être modulable en transmission de type � SLM � pour � spatial light modulator � (modulateur spatial de lumière). Grâce au cache selon la figure 4, il est possible de faire varier aisément le rayon d'occultation désiré. On peut ainsi activer une pluralité de zones annulaires dans le cache 170 de manière à occulter la lumière passant dans le plan focal arrière ou dans un plan configuré selon un rayon r(6,) désiré. Le cache illustré en figure 4 permet aisément de faire varier le rayon d'occultation, notamment quand des observations sont menées avec une pluralité d'objectifs. Selon un autre mode de réalisation, le cache 170 est un dispositif de réflexion susceptible de réfléchir la lumière dans une zone de diamètre choisi. Un tel cache peut par exemple être obtenu avec des dispositifs de pixels modulables en réflexion, également dénommés � Digital Mirror Device �. Il peut également être du type SLM en réflexion. Les caches exemplifiés ci-dessus permettent d'obtenir des cycles transmission / obturation très courts, susceptibles par exemple de suivre le rythme d'acquisition des images avec une caméra. Selon un exemple de réalisation, on utilise un microscope de fluorescence inversé Nikon type �Ti-U�� avec une base de tube binoculaire de phase �TI-T-BPH��, un objectif à immersion à huile x100 d'ouverture numérique 1,49. On utilise un cube de filtres dénommé usuellement �TRITC A� avec filtre excitation à 543 nm, un filtre d'émission à 593 nm et une lame dichroïque de référence 499/555 nm. La source lumineuse utilisée est une source fibrée de référence commerciale �Nikon Intensilight�� avec une lampe Hg de 130 W et un générateur �C-HGFI��. La caméra utilisée est une Caméra Hamamatsu, de référence EMCCD C9100-13, refroidie à sensiblement -65°. Le cache 170 utilisé a été réalisé par peinture d'une contre-lamelle circulaire d'épaisseur comprise entre 0,13 et 0,16 mm et de diamètre 16 mm. Le disque formant cache est réalisé par rotation de la lamelle autour de son axe central. La lamelle est placée horizontalement sur une tournette équipée d'un variateur. Un pinceau est fixé perpendiculairement à la lamelle sur un support équipé de 2 platines de translation micrométriques dans deux directions orthogonales afin d'ajuster finement la distance pinceau / lamelle et la position radiale du pinceau (c'est-à-dire distance par rapport au centre de rotation). La peinture utilisée est une peinture noire opaque pour verre. Le cache est ensuite positionné dans le module Nikon MEB55810 (�TI-T-BPH�) à la place de l'anneau de phase. La position du cache est réglée à l'aide de la lentille de Bertrand du microscope et des déplacements du module grâce à des vis de centrage et de position axiale). La procédure suivie est identique à celle du réglage de l'anneau de phase fourni par le constructeur avec ce module. Des mesures de la résolution latérale ont été effectuées avec des billes fluorescentes Fluosphere� (commercialisées par Invitrogen) excitation/émission : 580/605 nm déposées à la tournette (� spin-coating �) sur une contre-lamelle de verre standard (épaisseur 0.13-0.16 mm), puis immergées dans de l'eau distillée. La figure 6 illustre le profil d'intensité de fluorescence de ces billes (intensité de signal normalisé en ordonnée en fonction du déplacement latéral en abscisse, exprimé en lm). On constate que le profil obtenu sans cache (601) et celui avec cache (602) sont similaires. On obtient une largeur à mi-hauteur des profils de l'ordre de 450 nm. Il n'y a donc pas de perte de résolution avec et sans cache. Des observations ont été effectuées sur des cellules d'embryon de rein humain marquées à la Cholératoxine (qui se lie à des glycolipides sur la membrane et les constituants des radeaux lipidiques) couplée à Alexa 488 et excitées par la lampe Nikon Intensilight Hg 130 W (lampe classique). Le cube de filtres utilisé est composé d'un filtre d'excitation à bande passante de 450 à 490 nm, d'un miroir dichroïque à 500 nm et d'un filtre d'émission à bande passante de 510 à 550 nm. Les figures 7a et b montrent deux images obtenues sans cache, 7a, et avec cache, 7b. Le temps de pause est T=150 ms et le gain G=255 pour l'image obtenue avec cache (Figure 7b) et T=100 ms et G=105 pour l'image obtenue en épifluorescence standard (Figure 7a). On constate une différence de forme entre les deux images et on observe avantageusement des variations d'intensité que l'on associe à des phénomènes membranaires sur l'image 7b, obtenue avec cache, que l'on ne peut observer distinctement sur l'image obtenue sans cache 7a. On note que ces observations ont été avantageusement réalisées avec une lampe � classique � et qu'il n'a pas été nécessaire de mettre en oeuvre un laser pour les obtenir. L'invention ne se limite pas à ces types de réalisation et doit être interprétée de façon non limitative, et englobant tous les modes de réalisation équivalents. REVENDICATIONS1. Dispositif de microscopie de fluorescence (100) pour observer l'émission de fluorescence d'un échantillon (10) comprenant des composants fluorescents dans un milieu liquide d'indice de réfraction nL disposé sur un support transparent (20) d'indice de réfraction ns supérieur à nL, et inférieur ou égal à 1,55, ledit dispositif comprenant un objectif plein champ à immersion (110) dont l'ouverture angulaire numérique, ON, est supérieure ou égale à 1,33 et inférieure ou égale à ns, et un ensemble de lentilles (150, 160, 180) pour former une image dans au moins un plan image (410, 430) caractérisé en ce que ledit dispositif comprend en outre un cache (170) disposé dans le plan focal arrière (400) de l'objectif à immersion (110) ou dans un plan conjugué (420) dudit plan focal arrière de manière à occulter les composantes d'émission de fluorescence de l'échantillon (10) dans les directions angulaires où l'angle e est inférieur ou égal à un angle critique 6c, avec 0, = arcsin (nL/ns) et l'angle 0 défini comme l'angle d'une direction angulaire d'émission de fluorescence par rapport à la direction perpendiculaire de la surface du support (20) sur laquelle est disposé l'échantillon (10) à observer. 2. Dispositif de microscopie de fluorescence selon la revendication précédente caractérisé en ce que le cache (170) est amovible. 3. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le cache (170) est composé d'un disque opaque et optionnellement d'anneaux concentriques opaques. 4. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le cache (170) est choisi parmi la liste des dispositifs occultables constituée d'un dispositif à cristaux liquides, un dispositif microfluidique, un dispositif mécanique. 5. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'ouverture angulaire numérique, ON, de l'objectif à immersion (110) est supérieure ou égale à 1,45 et inférieure ou égale à 1,50. 6. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence 15 comprend en outre une source d'éclairage polychromatique ou monochromatique (200) disposée de manière à éclairer l'échantillon (10) à travers le support (20) sur lequel il est disposé. 7. Dispositif de microscopie de fluorescence selon 20 la revendication précédente caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre un sténopé (190) disposé dans un plan image (430) situé dans le trajet optique au-delà du cache (170) de manière à permettre des observations de microscopie 25 confocale. 8. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le dispositif de microscopie par fluorescence comprend en outre une source d'éclairage laser (250) de manière à 30 permettre des observations de microscopie TIRF (� total internai reflection fluorescence �, pour fluorescence par réflexion totale interne). 9. Dispositif de microscopie de fluorescence selon l'une quelconque des revendications 2 à 8 où le cache (170) est amovible, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens pour actionner le cache (170) amovible de manière à permettre une succession d'observations de l'échantillon (10) avec et sans cache. 10. Dispositif de microscopie de fluorescence selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens d'acquisition (300, 350) de l'image de l'échantillon (10) et des moyens d'interfaçage desdits moyens d'acquisition (300, 350) pour permettre l'acquisition en alternance d'images avec et sans cache. 11. Méthode d'observation par microscopie de fluorescence mettant en oeuvre le dispositif de microscopie par fluorescence (100) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 où l'échantillon (10) à observer est éclairé à travers le support (20) sur lequel il est disposé. 12. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon la revendication précédente caractérisée en ce que l'échantillon (10) à observer est un échantillon biologique comprenant des cellules dans le milieu liquide d'indice de réfraction nL. 13. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 et où le cache (170) du dispositif de microscopie de fluorescence est amovible comprenant une étape d'observation sans le cache (170) et une étape d'observation avec le cache (170) suivies d'une étape de comparaison des deux images ainsi obtenues. 14. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon la revendication précédente caractériséeen ce que l'étape de comparaison comprend une étape de calcul par combinaison de l'image obtenue sans le cache (170) et de l'image obtenue avec le cache (170). 15. Méthode d'observation par microscopie à fluorescence selon l'une des revendications 13 ou 14 caractérisée en ce que les images sont acquises par des moyens d'acquisition vidéo (300) et que la succession des étapes d'observation avec et sans le cache (170) est synchronisée à la cadence vidéo desdits moyens d'acquisition vidéo (300).