Brevet FR2941961A1 — publié le 20100813

La présente invention concerne un procédé de détermination rapide des résistances ou de sensibilités prévisionnelles de micro-organismes aux antibiotiques. Lorsqu'une infection est suspectée chez un individu, pouvant être un patient ou un animal, un prélèvement est envoyé pour être analysé dans un laboratoire. Lorsque l'infection est supposée être bactérienne, deux opérations doivent être réalisées. Toute d'abord, la première opération consiste à identifier, dans le prélèvement, le microorganisme en cause : type de bactéries, de levures ou de champignons. Puis, la deuxième opération consiste à effectuer un test de sensibilité du microorganisme identifié aux antibiotiques. Le test de plusieurs antibiotiques vis à vis d'un organisme s'appelle l'antibiogramme. Les méthodes utilisées jusqu'à présent pour réaliser ces deux étapes exigent un délai de plusieurs jours, voire de plusieurs semaines pour obtenir ces résultats. La première étape consiste à réaliser une culture du micro-organisme. Cette étape prend généralement une journée pour les organismes communs, mais peut s'étaler sur plusieurs jours (champignons, levures), voire semaines (par exemple pour les mycobactéries). Elle se réalise par ensemencement du prélèvement sur un ou plusieurs milieux de culture, ou bien par utilisation d'automates dans des cas prédéfinis, tels que les hémocultures (culture des prélèvements sanguins), ou la recherche de mycobactéries par exemple. Lorsque la culture est réalisée, des tests chimiques permettent généralement de définir le type de bactéries. L'identification des micro-organismes est alors lancée à partir des colonies isolées, généralement, l'antibiogramme est lancé simultanément. L'antibiogramme consiste à déterminer la sensibilité des antibiotiques (ou antifungiques) vis à vis du micro-organisme isolé. Son but est de déterminer, pour chaque antibiotique (ou antifongique), la plus petite croissance d'antibiotique (antifongique) permettant d'inhiber la croissance du micro-organisme : c'est la concentration minimale inhibitrice ou cmi. Plusieurs antibiotiques (antifongiques) sont testés vis à vis d'un micro-organisme. L'identification consiste à trouver le nom du micro-organisme responsable de l'infection. Plusieurs méthodes sont utilisées. Lors de la méthode d'identification biochimique, plusieurs tests sont réalisés vis à vis du micro-organisme. La combinaison de ces tests donne une probabilité de présence de tel ou tel micro-organisme, le résultat est obtenu par comparaison statistique des résultats avec une base de données pré-établie de micro-organismes documentée vis à vis des tests effectués. C'est la méthode utilisée universellement. Depuis plusieurs années, l'apparition de milieux de culture chromogènes (milieux additionnés de substrats) permettent de réaliser la culture des organismes, mais également d'avoir une présomption d'identification pour certains organismes ciblés (changement de couleur des colonies en présence de tel ou tel organisme) ; cette méthode, très utilisée dans certains pays, ne cible qu'un nombre très restreint de micro-organismes, et exige plus ou moins souvent une confirmation ou des tests complémentaires. Dans des cas ciblés, généralement pour des pathologies importantes (septicémies,...), il est possible d'utiliser des méthodes de biologie moléculaire (généralement, analyse de l'adn) ; ces méthodes ont plusieurs inconvénients : elles ne ciblent que quelques organismes (il faut développer une amorce minimum par type d'organisme), elles sont assez lourdes à mettre en oeuvre (contraintes d'infrastructure, personnel spécialisé), elles sont très onéreuses, et le délai d'obtention des résultats reste de quelques heures ; Dernièrement, une nouvelle technologie d'identification des micro-organismes a été introduite : l'identification se réalise par la technologie MALDI-TOF (spectrométrie de masse à Temps de vol et désorption / ionisation laser assisté par matrice). L'identification repose sur l'analyse des masses moléculaires des échantillons. Le principe MALDI est de réaliser une ionisation � douce � du micro-organisme afin de garder les grosses protéines. L'organisme est extrait à partir d'un milieu de culture, d'une suspension ou d'un prélèvement ; il est déposé sur une plaque à une position donnée ; une solution de matrice est rajoutée. La position où se trouve l'organisme est bombardée par des tirs lasers ; les molécules sont alors ionisées puis accélérées par un champ magnétique ; elles sont séparées selon leur rapport masse/charge. Les ions séparés sont détectés et ce signal est envoyé à un système de données où les rapports masse/charge sont stockés ainsi que leur abondance relative ; le système constitue alors un spectre de masse de l'organisme à analyser. Celui-ci est traité par un logiciel et comparé à une base de données de spectres correspondant à des organismes identifiés. On obtient ainsi le nom de l'organisme analysé. Quelle que soit la méthode utilisée pour la réalisation de l'antibiogramme, un délai important est requis pour obtenir les résultats : 10 au minimum de plusieurs heures (5 minimum). Dans l'extrême majorité, les résultats sont disponibles dans la matinée suivant le jour de lancement (car, même si les résultats sont disponibles 8 heures ou 10 heures après lancement, il n'y a personne pour les valider, et il n'y a d'ailleurs personne pour les réceptionner côté 15 médical). Pour certains micro-organismes, plusieurs jours sont nécessaires, voire plusieurs semaines (mycobactéries). De plus, dans un grand nombre de cas, des tests complémentaires doivent être réalisés, pour confirmer des mécanismes de résistance suspectés. Ces tests complémentaires prennent généralement une 20 journée. Compte tenu du délai d'obtention des résultats de l'antibiogramme, le traitement thérapeutique est toujours engagé avant d'avoir les résultats du laboratoire. Généralement, un prélèvement est effectué et le traitement est engagé juste après. Le traitement engagé est 25 défini empiriquement, à partir de critères variés : signes cliniques donnant une présomption de la pathologie ; état du patient (immunodéprimé, allergies...) ; protocoles établis (conférences de consensus) ; habitudes locales, etc. Généralement, le type de bactérie et les résultats de 30 l'antibiogramme n'étant pas connus, des antibiotiques à large spectre (couvrant une multitude de cas) sont prescrits. Ceci a l'avantage de généralement protéger le patient ponctuellement, mais implique des inconvénients majeurs : - les antibiotiques à large spectre ont généralement des effets 35 secondaires non négligeables pour le patient ; - la prescription d'antibiotiques à large spectre développe la résistance des bactéries vis à vis de ces antibiotiques ou vis à vis d'autres classes d'antibiotiques ; c'est le problème le plus aigu car il entraîne certaines impasses thérapeutiques pour des bactéries qui deviennent multi-résistantes (résistantes à plusieurs classes d'antibiotiques) ; - enfin, la prescription d'antibiotiques à large spectre a un impact économique important car les traitements coûtent généralement cher. Le traitement est généralement ré-évalué à deux ou trois jours, lorsque le clinicien se trouve en présence des résultats de l'antibiogramme. La ré-évaluation s'opère en fonction des résultats reçus en provenance du laboratoire et en fonction de l'évolution de l'état du patient. L'information rapide des cliniciens sur les sensibilités et résistances des micro-organismes est donc un objectif majeur. La présente invention a pour but un procédé de détermination des résistances ou de sensibilités prévisionnelles de micro-organismes aux antibiotiques qui évite tout ou partie des inconvénients précités. Par micro-organisme, on entend tous organismes vivants microscopiques, tels que les bactéries, les levures, les protozaires, les virus, archaea, etc, pathogènes ou non. Egalement, on entend par � résistance ou sensibilité aux antibiotiques �, la capacité d'un micro-organisme à résister aux effets des antibiotiques. Plus un micro-organisme sera résistant ou insensible à un antibiotique, moins cet antibiotique conviendra pour le traitement de l'infection ou maladie engendrée par ce micro-organisme. A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de détermination des résistances prévisionnelles de micro-organismes aux antibiotiques consistant à analyser un premier micro-organisme par spectrométrie de masse, de sorte à obtenir un premier spectre de masse dudit premier micro-organisme, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'un dispositif d'analyse effectue les étapes suivantes : (i) comparer ledit premier spectre de masse à des spectres de masse contenus dans une base de données, de sorte à obtenir une liste d'un ou de plusieurs micro-organismes identiques ou au moins similaires audit premier micro-organisme, et dont la résistance à des antibiotiques donnés est connue, (ii) effectuer une analyse prévisionnelle de la résistance aux antibiotiques dudit premier micro-organisme en fonction de la résistance aux antibiotiques du ou des micro-organismes identiques ou au moins similaires obtenus à l'étape (ii). L'invention permet donc d'informer le clinicien le plus tôt possible de risque de résistance de certains antibiotiques (antifongiques) vis à vis de micro-organismes. Cela permet d'adapter très rapidement un traitement thérapeutique en le modifiant soit parce qu'il conduit à un échec, soit parce qu'il est mal adapté et peut entraîner des conséquences fâcheuses pour le patient ou l'environnement (antibiotiques à large spectre). Avantageusement, la spectrométrie de masse est une spectrométrie de masse à temps de vol et désorption par ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF). De préférence, la base de données est une base de spectres locale à un laboratoire et/ou une base de spectres pré-définis, dans lesquelles la résistance des organismes associés à ces spectres est connue. De manière avantageuse, le dispositif d'analyse comprend un ordinateur et un logiciel. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description suivante d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné uniquement à titre illustratif et non limitatif. Un échantillon urinaire d'un patient X a été analysé conformément à l'étape (i) par un spectromètre de masse. En particulier, le spectromètre était un MALDI-TOF, c'est-à-dire un spectromètre de masse à temps de vol et désorption par ionisation laser assisté par matrice. Suite à cette analyse, il est apparu que cet échantillon contenait un Escherichia Coli. Un spectre de masse de ce micro-organisme a également été réalisé et obtenu par le spectromètre MALDI-TOF. Grâce à un dispositif d'analyse comprenant entre autres un ordinateur et un logiciel, ce spectre de masse d'Escherichia coli a été comparé avec une liste de spectres similaires d'autres souches d'Escherichia coli. Cette liste de spectres similaires est préalablement stockée dans une base de données présente dans le logiciel. Cette base de données comporte en outre la résistance des micro-organismes associés à cette liste de spectres, c'est-à-dire que la résistance de microorganismes spécifiques a déjà été analysée par un antibiogramme par exemple et à été enregistrée dans la base de donnée. Le dispositif d'analyse définit ensuite une limite de la similarité (en % ou en seuil) du spectre d'Escher~ichia coli avec les spectres contenues dans la base de données, par exemple les spectres d'autres souches d'Escherichia coli. Dans l'exemple de l'échantillon urinaire, le dispositif d'analyse 10 donne des souches très proches répertoriées dans le tableau I ci-dessous : Tableau I Espèce Genre Commentaire ID.spectre Score 1 Escherichia coli Escherichia Gélose sang TYYYOTPPORRE 98,5 2 Escherichia coli Escherichia Gélose sang TVVVYSQAEGG 97,8 3 Escherichia coli Escherichia Gélose sang TVVFGSGFDRGG 84,2 4 Escherichia coli Escherichia Gélose sang TYYYOTFDRRRE 83,6 Puis, le dispositif d'analyse calcule les résistances des souches similaires trouvées et établit un rapport (comme le tableau II) de 15 résistances prévisionnelles. Ce rapport peut ne comporter que les résistances et/ou indiquer les sensibilités. Les résultats prévisionnels sont calculés statistiquement à partir des résultats des souches similaires. Il est possible d'utiliser différents tests statistiques (moyenne, etc). 20 Tableau II LISTE MO'i~ DANS 1 2 3 4 RESISTANCES BASE DE DONNEES PREVISION-NELLES ANTI- BIOTIQUES TESTES SIMILARITE 98,5% 97,8% 84,2% 83,6% / AMOXICILLINE R R R R 100% (12) AMOXI+CLAVU I I R I 100% (12) PIPERACILLINE R R R R 100% (11) CEPHALOTINE R R R R 100% (12) CETRIAXONE s s s s 0% (12) GENTAMICINE S S S S 0% (12) CIPROFLOXACINE R R NI I 100% (11) TRIMETHO+SULFA S S S S 0% (12) (1) MO : Micro-organisme Dans le tableau II ci-dessus, � R � signifie � résistance significative�, � I � signifie � résistance moyenne �, � S � signifie � sans résistance � et � NI � correspond à non indiqué. Ainsi, on peut voir très rapidement que les espèces d'Escherichia coli 1 à 4, similaires entre 98,5 à 83, 6% à l'Escherichia coli de l'échantillon urinaire analysé sont résistantes à l'amoxicilline, la pipéracilline, la céfalotine, tandis qu'elles ne sont pas résistantes à la cétriaxone, à la gentamicine et au mélange triméthoprimesulfaméthoxazole. Par conséquent, la souche d'Escherichia coli de l'échantillon d'urine présente une faible probabilité d'être résistant ces trois derniers antibiotiques. Le patient X pourra ainsi être traité avec un de ces antibiotiques sans attendre le délai nécessaire à l'analyse par antibiogramme. Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS1. Procédé de détermination des résistances prévisionnelles de mico-organismes aux antibiotiques consistant à analyser un premier micro-organisme par spectrométrie de masse, de sorte à obtenir un premier spectre de masse dudit premier micro-organisme, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'un dispositif d'analyse effectue les étapes suivantes : (i) comparer ledit premier spectre de masse à des spectres de masse contenus dans une base de données, de sorte à obtenir une liste d'un ou de plusieurs micro-organismes identiques ou au moins similaires audit premier micro-organisme, et dont la résistance à des antibiotiques donnés est connue, (ii) effectuer une analyse prévisionnelle de la résistance aux antibiotiques dudit premier micro-organisme en fonction de la résistance aux antibiotiques du ou des micro-organismes identiques ou au moins similaires obtenus à l'étape (ii). 2. Procédé de détermination selon la revendication 1, dans lequel la spectrométrie de masse est une spectrométrie de masse à temps de vol et désorption par ionisation laser assistée par matrice (MALDI- TOF). 3. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel la base de données est une base de spectres locale à un laboratoire et/ou une base de spectres pré-définis, dans lesquelles la résistance des organismes associés à ces spectres est connue. 4. Procédé de détermination selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le dispositif d'analyse comprend un ordinateur et un logiciel.30