Brevet FR2939314A1 — publié le 20100611

Nouvelles compositions et méthodes pour la potentialisation des signaux d'apoptose dans les cellules tumorales La présente invention concerne dans ses différents aspects de nouvelles compositions et méthodes visant à augmenter l'apoptose dans les cellules tumorales, et en particulier à augmenter la sensibilité de ces cellules aux traitements anticancéreux conventionnels. Elle est basée sur la découverte que l'administration d'agents susceptibles de moduler directement ou indirectement le calcium intracellulaire en association avec des agents anticancéreux ou des ligands de mort (FasL, TRAIL) permettait de potentialiser de manière importante l'effet pro-apoptotique desdits agents. L'apoptose est un processus physiologique de mort cellulaire au cours duquel des mécanismes complexes sont activés pour aboutir à la destruction de la cellule. Ce processus permet l'élimination d'un nombre important de cellules de façon programmée par le biais de systèmes complexes de régulation, tels que notamment les signaux activateurs ou inhibiteurs qui proviennent d'autres cellules (voie paracrine) ou de la cellule elle-même (voie autocrine). Ce � suicide cellulaire � est donc un événement clé en biologie qui assure un équilibre entre prolifération et mort cellulaire dans les différents organes et tissus, c'est à dire le maintien de leur homéostasie. Il permet en effet d'éliminer certaines cellules, et évite la prolifération cellulaire lorsque celle-ci n'est pas souhaitable. L'apoptose survient naturellement au cours de l'embryogenèse, du renouvellement tissulaire et lors du vieillissement. Cependant, elle peut également se produire dans diverses conditions pathologiques. De plus, un dysfonctionnement des mécanismes régulateurs de l'apoptose va donner lieu à de graves pathologies. Il existe notamment des liens étroits entre le processus d'apoptose et le cancer. L'apoptose agit comme un processus de défense contre les cellules cancéreuses, et des altérations fréquentes de l'apoptose ont été mises en évidence dans différents types de tumeurs. Ces altérations autorisent l'accumulation d'aberrations chromosomiques et de mutations qui peuvent conduire à la formation d'une tumeur. Ainsi, un défaut d'apoptose entraîne des syndromes prolifératifs associés aux processus de tumorigenèse, tout particulièrement au niveau des tissus à renouvellement rapide comme le système immunitaire (lymphome, leucémie). Il est maintenant établi que le récepteur de mort Fas (également désigné Apo-1 ou CD95) qui est une protéine transmembranaire appartenant à la superfamille des récepteurs au Tumor Necrosis Factor (TNF), est impliqué dans l'activation du processus apoptotique. Le récepteur Fas induit l'apoptose dans des cellules cibles sensibles lorsqu'il se lie à son ligand physiologique FasL, une protéine membranaire. Si le récepteur Fas est exprimé dans une grande variété de tissus, tels que notamment le foie, le coeur, les poumons, les ovaires, les reins et le thymus, l'expression de FasL est au contraire limitée aux cellules effectrices du système immunitaire, telles que les lymphocytes T cytotoxiques activés et les cellules NK (Natural Killer). FasL se trouve également exprimé à la surface des cellules tumorales après chimiothérapie. Les programmes d'apoptose induits par Fas ont montré l'importance de cette voie notamment dans l'homéostasie du système immunitaire, dans certaines pathologies comme les désordres auto-immuns ainsi que dans l'élimination des cellules tumorales par la voie autocrine ou paracrine. Plus précisément, deux voies de signalisation apoptotique ont été identifiées: (i) la voie extrinsèque qui déclenche la mort des cellules lors de l'activation de récepteurs membranaires appelés récepteurs de mort (TNFR1, Fas, DR3 ou Tramp/Wsll/Lard/Apo3, TrailRl ou DR4/Apo2, TrailR2 ou DR5/Trick/Killer et DR6), et (ii) une voie intrinsèque qui lors d'un stress intracellulaire, tel que l'accumulation de cassures dans l'ADN génomique ou d'un stress du réticulum endoplasmique, induit la libération par la mitochondrie de facteurs apoptotiques (Kroemer G et al., Nat Med 2000. 6: 513-519). Des liens existent entre ces deux voies et dans les deux situations, des protéases appelées caspases sont activées. Le mécanisme intracellulaire de la voie extrinsèque à médiation Fas aboutissant au déclenchement de l'apoptose est illustré dans la Figure 1. Les effecteurs de la transduction du signal pro-apoptotique en aval de Fas ont été partiellement identifiés et impliquent notamment le macro-complexe Fas/FADD/Caspase-8/c-FLIP, également désigné macro-complexe DISC ou Death Inducing Signaling Complex. Au niveau moléculaire, la fixation du ligand naturel FasL sur le récepteur Fas permet son oligomérisation et entraîne le recrutement et l'activation des caspases 8 et 10 grâce à la protéine adaptatrice FADD (� Fas Associated Death Domain �). La caspase 8 active à son tour la caspase 3, soit directement par clivage, soit en activant la voie apoptotique mitochondriale. La formation du macro-complexe d'activation DISC est donc une étape cruciale dans la signalisation du signal apoptotique. La cascade d'activation est par ailleurs inhibée lors de la surexpression de la protéine cFLIP pour cellular FADD-like IL-1 b Protein. c-FLIP présente en effet des similitudes de structure avec la caspase 8 mais est dépourvue de l'activité enzymatique essentielle à la signalisation apoptotique. Par conséquent, la protéine c-FLIP interfère avec l'apoptose cellulaire à médiation Fas par inhibition compétitive de la liaison de la caspase 8 sur le domaine FADD. La plupart des traitements anti-tumoraux provoquent la mort cellulaire, vraisemblablement par apoptose et par activation des récepteurs de mort (Friesen A. et al, Leukemia 1997. 11: 1833-1841; Gajate C. et al. Blood 2001. 98: 3860-3863, Rebillard A. et al., Cancer Res 2007. 67: 7865-7874; Vega M I et al., Oncogene 2005. 24: 8114-8127). Ces chimiothérapies restent toutefois des traitements lourds, difficiles à supporter par les malades du fait de leur cytotoxicité non spécifique, et sont encore insuffisants du fait de l'apparition de mécanismes de résistance. La restauration et/ou l'amplification de la signalisation apoptotique dans les cellules cancéreuses présentent donc un intérêt majeur en cancérologie. Les Demandeurs ont donc mis en évidence de manière surprenante, que l'on pouvait potentialiser la formation du macro-complexe DISC et l'induction du signal pro- apoptotique des agents anticancéreux à médiation � récepteurs de mort � en diminuant la concentration de calcium intracellulaire libre et/ou en modulant l'activité de canaux calciques de la membrane plasmique. L'hypercalcémie qu'elle soit modérée à sévère >3mM, a été observée dans 55% des cas d'hyperparathyroïdie, dans 30% des cas de cancer, et pour 15% lors d'autres pathologies. Il faut noter que dans le cas de maladies néoplasiques, telles que des carcinomes mammaires, des cancers du poumon et des reins, des cancers de la prostate, des lymphomes, ou des myélomes multiples, l'hypercalcémie est généralement associée à l'apparition de métastases osseuses, à une accélération de la résorption osseuse ainsi qu'à une augmentation de la rétention de calcium par les reins. En plus de ces phénomènes, les cellules néoplasiques sécréteraient des substances similaires à la PTH ou parathyroid hormone related protein (PTH-rP) qui non seulement stimuleraient l'activité ostéoclastique, mais aussi modifieraient l'absorption, l'excrétion, et la résorption des ions calcium et phosphate. Par conséquent, 10-20% des patients atteints de cancer présentent des hypercalcémies et ces hypercalcémies sont les maladies métaboliques les plus graves associées aux maladies néoplasiques. Ces patients sont en général traités avec des hypocalcémiants afin de réduire les complications résultant des métastases osseuses, et d'augmenter la survie et la qualité de la vie des patients. Toutefois, aucune étude clinique n'a jamais été envisagée afin de tester les associations particulières d'agents modulateurs de la concentration intracellulaire de calcium avec des traitements anticancéreux en vue d'augmenter la mort des cellules cancéreuses et ainsi d'augmenter les chances de rémission des patients atteints de cancer. Résumé de l'invention La présente invention concerne de nouvelles compositions pharmaceutiques comprenant l'association en quantités thérapeutiques efficaces, d'un agent modulateur du calcium intracellulaire, susceptible de diminuer la concentration du calcium sérique (hypocalcémiants, chélateurs du calcium) et/ou la concentration du calcium intracellulaire (inhibiteur de l'entrée de calcium par les canaux, chélateurs perméants du calcium) et au moins d'un agent anticancéreux en vue de la potentialisation de la formation du macro- complexe DISC. Les nouvelles associations thérapeutiques selon l'invention sont particulièrement utiles pour le traitement du cancer et/ou pour la prévention des rechutes cancéreuses. La présente invention a également pour objet l'association d'un agent modulateur du calcium intracellulaire, susceptible de diminuer la concentration du calcium sérique (hypocalcémiants, chélateurs du calcium) et/ou la concentration du calcium intracellulaire (inhibiteur de l'entrée de calcium par les canaux membranaires, chélateurs perméants du calcium) avec un traitement par chimiothérapie en vue de la potentialisation de la formation du macro-complexe DISC et du signal pro-apoptique, ainsi que l'utilisation des associations selon la présente invention pour la préparation d'un médicament anticancéreux. La présente invention a en outre pour objet des méthodes de traitement du cancer et/ou de la prolifération cellulaire, des méthodes de prévention des rechutes cancéreuses et des méthodes de sensibilisation des cellules tumorales aux agents anticancéreux conventionnellement utilisés en chimiothérapie. La présente invention a enfin pour objet une méthode de screening des compositions susceptibles de potentialiser l'effet pro-apoptotique des agents anticancéreux dans les cellules tumorales ex vivo. Brève description des Figures Figure 1 : est une représentation schématique de la cascade d'induction du signal apoptotique à médiation Fas. FADD: Fas-associated via Death Domain; Cyt c: cytochrome C; Apaf-1: Apoptotique protease activating factor 1; DISC: Death-inducing Signalling Complex. Figure 2 : illustre l'évolution de la concentration de Cal+ intracellulaire (nM) mesurée à l'aide d'un microspectrofluorimétre Nikon (sonde Indo-1) après injection de 100ng/mI de ligand Fas soluble (sFasL) directement autour des cellules à l'aide d'une micropipette en verre. Les cellules testées sont les lignées cellulaires H9 issues de lymphome à cellules T, les cellules de la lignée leucémique T Jurkat exprimant le récepteur Fas fonctionnel (Jurkat) ou un allèle muté du récepteur Fas (Fas Q257K), et différents clones cellulaires défectifs pour la caspase 8 (caspase-8 ou défectifs pour l'adaptateur FADD (FADD Figure 3A : visualise par la technique de Western blot et par immunoprécipitation de Fas la formation du macro-complexe DISC dans la lignée cellulaire H9 (lymphome à cellules T). Les cellules sont non traitées (contrôle), ou pré-incubées avec un chélateur perméant du calcium tel que le BAPTA-AM (10�M), la thapsigargine (1�M) un inhibiteur des SERCA, ou un ionophore induisant l'augmentation du calcium intracellulaire la ionomycine (1�M) suivi d'une activation pendant 15 min à 37°C (15 min) ou à 4°C (0 min) en présence de 1 �g/ml d'anticorps agoniste anti-Fas APO1-3. Les cellules sont alors lysées et Fas est immunoprécipité et le complexe associé analysé par Western blot. Figure 3B : représente l'analyse quantitative par densitométrie (programme ImageJ) des différents composants présents dans le macro-complexe DISC lors de I'immunoprécipitation de Fas dans les cellules incubées avec les réactifs indiqués précédemment. Figure 4A: illustre l'augmentation du pourcentage de mort cellulaire dans différents modèles cellulaires : les lymphocytes T activés provenant de sujets sains (PBLs), les cellules de la lignée lymphocytaire T (Jurkat, H9, CEM, CEM-IRC) et les cellules de la lignée lymphocytaire B (SKW6.4, Raji, et BL2) pré-incubés avec le chélateur de calcium perméant BAPTA-AM à 1 �M puis traités avec les doses indiquées de FasL. La mort cellulaire est quantifiée à l'aide d'un test MTT. Figure 4B : montre l'expression du récepteur Fas à la surface des lignées lymphomateuses B Raji et BL2 comparée à un marquage isotypique (contrôle négatif) à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-Fas et mesure de l'intensité de fluorescence par cytométrie en flux. Figures 5A-D: montrent les pourcentages d'apoptose dans les lignées cellulaires de lymphome de Burkitt, Raji et BL2, préalablement incubées dans un milieu contenant un agent chélateur perméant BAPTA-AM (1�M), puis traitées avec du rituximab ou de l'édelfosine. Le % d'apoptose a été mesuré par la chute du potentiel membranaire mitochondrial Ayrm. Figures 6A-B : illustrent les effets de la chélation du calcium sur le signal apoptotique induit par le ligand TRAIL. La Figure 6A montre le % d'apoptose dans la lignée cellulaire BL2, traitée pendant 24h avec le ligand TRAIL avec ou sans incubation préalable (15 minutes) dans un milieu contenant le chélateur perméant de calcium BAPTA-AM (1�M). Figure 7A : représente des mesures, par fluorométrie (sur population cellulaire à l'aide d'une sonde calcique Indo-1), de la concentration du calcium intracellulaire dans la lignée Raji. Une variation de 3mM de la concentration de calcium extracellulaire induit une augmentation rapide (quelques secondes) de la concentration du calcium intracellulaire (environ 30nM) (Figure 7A - graphe de gauche). Les cellules Raji incubées dans un milieu contenant 3mM de Ca2+ voient la concentration du calcium intracellulaire diminuer lorsqu'elles sont prétraitées avec un chélateur perméant du calcium, le BAPTA-AM (10�M) (Figure 7A - graphe de droite). Figure 7B : montre la mesure de la concentration basale du calcium intracellulaire en nM en fonction de la concentration de calcium extracellulaire imposée (0 et 2 mM) dans des lymphocytes B humains normaux (graphe de gauche) et dans des lymphocytes B tumoraux issus d'une biopsie de ganglion lymphatique (graphe de droite). Figure 7C : représente la mesure du % d'apoptose dans la lignée Raji pré-incubée dans un milieu RPMI additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF) contenant 0,8 mM ou 3mM de calcium, puis traitées avec des concentrations croissantes de rituximab. Le 0/0 d'apoptose a été mesuré par la chute du potentiel membranaire mitochondrial Ayrm. Figure 7D : représente la mesure du % d'apoptose dans la lignée Raji pré-incubée dans un milieu défini contenant 0,5 mM ou 4 mM de calcium, puis traitées avec des concentrations croissantes de rituximab. Le % d'apoptose a été mesuré par la chute du potentiel membranaire mitochondrial Ayrm. Figures 8A-B : illustrent l'effet du 2-APB (44�M), un inhibiteur de l'entrée de calcium par des canaux calciques, sur l'induction de l'apoptose. L'inhibiteur bloque l'augmentation de la concentration de calcium intracellulaire basale induite par augmentation de la concentration extracellulaire de calcium de 0 à 5 mM (graphe de droite) ou lors de l'utilisation de la thapsigargine (1�M) (induisant l'activation de canaux calciques). Le 2-APB sensibilise de manière dramatique le signal apoptotique Fas notamment dans les cellules leucémiques T et B. Figures 9 A-D : illustrent les effets d'un modulateur des canaux calciques sur l'apoptose induite par le ligand TRAIL ou l'anticorps anti-CD20 Rituximab. Les Figures 9 A et B montrent les pourcentages d'apoptose dans les lignées de lymphomes B Raji et SUDHL4, traitées pendant 24h avec le Rituximab avec ou sans pré-incubation (15min) avec le modulateur des canaux calciques thapsigargine (5 nM). Les Figures 9 C et D montrent les pourcentages d'apoptose dans les lignées de lymphomes B BL2 et SUDHL4, traitées pendant 24h avec le ligand TRAIL avec ou sans pré-incubation (15 min) avec le modulateur des canaux calciques thapsigargine (5nM). Description détaillée de l'invention La présente invention a pour objet de nouvelles compositions pour la potentialisation de la formation du macro-complexe DISC et de l'induction du signal apoptotique dans les cellules tumorales, comprenant l'association en quantités thérapeutiques efficaces d'un agent modulateur du calcium intracellulaire susceptible de diminuer la concentration intracellulaire du calcium (via la diminution de la concentration extracellulaire ou sérique ou l'utilisation de modulateurs des canaux calciques) et d'au moins un agent anticancéreux conventionnellement utilisé en chimiothérapie. Dans le cadre de la présente invention, les Demandeurs ont démontré de manière surprenante que l'activité tumoricide des agents anticancéreux induite par les récepteurs de mort pouvait être augmentée de manière significative lorsque ceux-ci étaient administrés en association avec au moins un agent susceptible de réduire le calcium intracellulaire et/ou de moduler l'activité des canaux calciques dans les cellules tumorales. La diminution du calcium intracellulaire a ainsi permis de potentialiser la formation du macro-complexe DISC ainsi que le signal de mort cellulaire des différents agents chimiothérapeutiques. De façon tout aussi surprenante, la thapsigargine a les mêmes effets potentialisants sur la formation du DISC. D'une façon générale, les associations selon l'invention augmentent considérablement l'efficacité des traitements contre le cancer. En d'autres termes, l'effet thérapeutique des agents anticancéreux est potentialisé de manière inattendue par l'administration d'un agent modulateur de la concentration de calcium intracellulaire. Un autre avantage subséquent majeur produit par les associations selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des doses efficaces en agents anticancéreux plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire les risques d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de cytotoxicité. Selon l'invention, on entend par agent modulateur du calcium intracellulaire, tout agent ayant une action directe ou indirecte sur la concentration intracellulaire de calcium dans les cellules tumorales. Il s'agit selon l'invention (i) des agents susceptibles de diminuer la concentration de calcium intracellulaire, tels que les inhibiteurs de l'entrée de calcium par les canaux : inhibiteurs des canaux calciques et inhibiteurs de la SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Cal+ ATPase), et les chélateurs perméants du calcium, ou (ii) des agents dont l'activité vise à réduire la concentration du calcium sérique tel que les hypocalcémiants et les chélateurs du calcium extracellulaire (non perméants). En effet, les Demandeurs ont montré que la concentration de calcium intracellulaire est strictement régulée par la concentration de calcium extracellulaire. Ainsi, les Demandeurs ont également démontré qu'en diminuant la concentration de calcium extracellulaire, la réponse apoptotique, par exemple au rituximab, était potentialisée dans des lignées de lymphocytes B. Selon l'invention, les agents modulateurs de la concentration de calcium intracellulaire permettent de potentialiser l'effet pro-apoptotique des agents anticancéreux utilisés. Ces agents modulateurs du calcium intracellulaire sont bien connus dans le domaine. A titre d'exemple, le 2-Aminoéthoxydiphényl borate (2-APB) et la thapsigargine peuvent être choisis respectivement en tant qu'inhibiteur des canaux calciques et inhibiteur de la SERCA. Parmi les hypocalcémiants utilisés, on peut citer par exemple les biphosphonates, les antidotes d'hypercalcémie, les sels de phosphate, les chélateurs de calcium, les corticostéroides, les inhibiteurs de synthèse des prostaglandines, ou les calcimimétiques. Parmi les biphosphonates, on peut citer le palmidronate, l'acide zolédronique ou zolédronate, l'étidronate, ou le clodronate. Parmi l'antidote des hypercalcémies, on peut citer la calcitonine, le nitrate de gallium, ou la plicamycine. Le sel de phosphate utilisé peut être par exemple le phosphate de potassium. Les corticoistéroides utilisés en tant que modulateurs du calcium intracellulaire peuvent être choisis par exemple parmi l'hydrocortisone, la prednisone, la prednisolone, la méthylprednisolone ou la dexaméthasone. Les inhibiteurs de la synthèse des prostaglandines sont par exemple l'aspirine ou l'indométhacine. Les calcimimétiques sont entre autres le cinacalcet. Parmi les chélateurs de calcium, il y a le BAPTA (acide 1,2-bis(o-amino phénoxy)éthane-N,N,N',N'-tetraacétique), I'EGTA (acide glycol-bis(2-aminoéthylether)-N,N,N',N'-tétraacétique), I'EDTA (acide 2-[2-(bis(carboxyméthyl)amino)éthyl- (carboxyméthyl)amino] acétique), ou le CDTA (acide trans-1,2-cyclohéxane diam ine-tétraacétique) qui sont des agents non-perméants, ou les formes perméantes correspondantes, à savoir le BAPTA-AM (acide 1,2-bis-(o-Amino phenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetique tétra-(acétoxyméthyl) Ester), les formes dérivées de BAPTA-AM telles que le 5,5'-difluoro-BAPTA-AM, ou le 5-5'-diméthyl-BAPTA-AM, l'EGTA-AM, EDTAAM, et CDTA-AM. Selon la présente invention, on entend par agent anticancéreux toutes les substances cytotoxiques conventionnellement utilisées pour le traitement du cancer. De préférence, les agents anticancéreux utilisés pour favoriser la transmission des signaux apoptotiques et l'élimination des cellules tumorales par activation des récepteurs de mort. Par agents anticancéreux ou agents thérapeutiques anti-cancer, il faut comprendre une substance cytotoxique qui, lorsqu'elle est administrée à un patient, induit un signal de mort cellulaire par l'intermédiaire des récepteurs de mort, et traite ou prévient le développement du cancer chez le patient. De tels agents sont, par exemple, cités dans le VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne � Cytotoxiques �, ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés. A titre d'exemples non limitatifs pour de tels agents anticancéreux, on peut citer les agents alkylants, les inhibiteurs des topoisomérases, les antimétabolites, les agents interférants de la tubuline ou inhibiteurs mitotiques, les inhibiteurs des histonedésacétylases (HDACi), les anti-oestrogènes, les anti-CD20, les anticorps anti-Fas, les FasL et TRAIL multimériques solubles. On entend par récepteur de mort, les récepteurs TNFR1, Fas ou Apol/CD95, DR3 ou Tramp/Wsll/Lard/Apo3, TrailRl ou DR4/Apo2, TrailR2 et DR5/Trick/Killer et DR6 qui sont impliqués dans la voie extrinsèque de signalisation de l'apoptose. Par conséquent, les associations d'agents visant à diminuer la concentration de calcium intracellulaire et d'agents anticancéreux selon la présente invention présentent un effet synergique sur l'induction du signal apoptotique via les récepteurs de mort. Les � agents alkylants � font référence à toutes substances qui peuvent se coupler de manière covalente ou alkyler toute molécule, préférentiellement un acide nucléique au sein d'une cellule. Comme exemples de tels agents alkylants susceptibles d'induire un signal apoptotique via les récepteurs de mort, on peut citer de préférence le cisplatine, la mitomycine C, le temozolomide, et le N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG). Les inhibiteurs des topoisomérases font référence à des substances qui inhibent la fonction normale des protéines modelant la chromatine comme les topo-isomérases I et Il. On utilise de préférence les anthracyclines, la doxorubicine, l'irinotécan, ou le topotécan. Les � antimétabolites � font référence à des substances qui bloquent la croissance et/ou le métabolisme cellulaire en interférant avec certaines activités, généralement la synthèse d'ADN. Selon l'invention, on utilise de préférence le 5-fluorouracile, le raltitrexed, le pemetrexed, l'actinomycine D, ou le cycloheximide. Les inhibiteurs mitotiques préviennent la progression normale du cycle cellulaire et de la mitose. En général, les inhibiteurs des microtubules ou � taxoides � comme le taxol et ses dérivés, le paclitaxel, et le docétaxel sont capables d'inhiber la mitose. Les alcaloïdes de vinca, comme la vinblastine, la vincristine, la vindésine et la vinorelbine sont également capables d'inhiber la mitose. Selon la présente invention, on utilise de préférence, la vinblastine, et le taxol. Les inhibiteurs des histone-désacétylases susceptibles d'induire un signal apoptotique via les récepteurs de mort peuvent être choisis par exemple parmi les trichostatines, les depsipeptides, l'acide suberoylanilide hydroxamique (SANA), ou le LAQ824. Les anti-oestrogènes ou agents anti-oestrogéniques font référence à toutes substances qui diminuent, antagonisent ou inhibent l'action des oestrogènes. Des exemples de tels agents sont le tamoxifène, le toremifène, le raloxifène, le droloxifène, l'iodoxyfène, l'anastrozole, le letrozole, et l'exemestane. On utilise de préférence le tamoxifène. Parmi les anticorps monoclonaux, on peut citer les anticorps anti-CD20, tel que le Rituximab. L'anticorps monoclonal anti-CD20 ou Rituximab et son activité tumoricide Fas dépendante ont été précédemment reportés par Stel AJ, et al. (J Immunol 2007. 178: 2287-2295) et Vega, M. I. (Oncogene 2005. 24: 8114-8127). Les Demandeurs ont notamment démontré que l'ajout de rituximab aux lymphocytes B agissait via la signalisation apoptotique Fas (Figure 5). D'autres agents anticancéreux susceptibles d'induire un signal apoptotique via les récepteurs de mort et d'être utilisés dans les associations synergiques selon la présente invention sont par exemple l'aplidine, la thalidomide, le lenalidomide, la doxazosine, l'édelfosine, la périfosine, ou le resvératrol. Pour plus de détails, l'homme de l'art pourra se reporter au manuel édité par l'Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique intitulé �traité de chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, édition TEC & DOC, 2003 �. Alternativement, ces agents anticancéreux peuvent être choisis parmi le ligand FasL du récepteur Fas, le ligand naturel TRAIL, les parties solubles de ceux-ci et plus généralement tous ligands des récepteurs de mort TNFR1, Fas ou Apol/CD95, DR3 ou Tramp/Wsll/Lard/Apo3, TrailRl ou DR4/Apo2, TrailR2 ou DR5/Trick/Killer et DR6. Enfin, selon un autre aspect, la présente invention a pour objet des associations synergiques en quantités thérapeutiques efficaces d'au moins un agent modulateur de la concentration de calcium intracellulaire et d'au moins un inhibiteur de la voie de signalisation phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K). Selon la présente invention, ces associations antitumorales permettent de sensibiliser de manière importante les cellules tumorales à la chimiothérapie. De préférence, l'agent inhibiteur de la voie de signalisation PI3K est l'edelfosine, le LY294002, ou la wortmannin. De manière encore plus préférentielle, l'inhibiteur utilisé dans les associations selon la présente invention est l'edelfosine et ses dérivés qui est entre autres décrite par Beneteau M. et al. (Mol Cancer Res 2008. 6: 604-613). Ces inhibiteurs semblent agir sur la redistribution de Fas dans les rafts lipidiques (Wymann MP et al. Trends Pharmacol Sci 2003. 24: 366-376). Les Demandeurs ont par ailleurs démontré que la calmoduline kinase de type Il (CaMKII) n'était vraisemblablement pas impliquée dans la modulation de la formation de DISC et/ou dans la potentialisation du signal pro-apoptotique selon la présente invention. Selon l'invention, les associations précédemment décrites d'agent modulateur de la concentration intracellulaire de calcium et d'agent anticancéreux sont administrées aux patients en dose thérapeutique suffisante pour obtenir une diminution de la croissance tumorale, telle que par exemple dans le cas des tumeurs du lymphome B, des tumeurs de cancer de la prostate, ou des tumeurs de cancer du sein, allant de 10 à 90 % ; 15 à 90% , 20 à 90% ; 25 à 90% ; 30 à 90% ; 35 à 90% ; 40 à 90% ; 45 à 90% ; 50 à 90% ; 55 à 90%;60à90%;65à90%;70à90%;75à90%;80à90%;ou85à90%. Selon l'invention, l'agent modulateur de la concentration de calcium intracellulaire et l'agent anti-cancéreux peuvent être administrés de manière simultanée, séparée ou étalée dans le temps. On entend par "utilisation simultanée", l'administration des deux composés de l'association selon l'invention compris dans une seule et même forme pharmaceutique. On entend par "utilisation séparée", l'administration, en même temps, des deux composés de l'association selon l'invention, compris dans des formes pharmaceutiques distinctes. On entend par "utilisation étalée dans le temps", l'administration successive des deux composés de l'association selon l'invention, compris chacun dans une forme pharmaceutique distincte. Selon un protocole d'administration préférentiel, l'agent modulateur de la concentration intracellulaire de calcium est administré avant l'agent anticancéreux. Il est administré quelques jours avant, par exemple entre 1 et 10 jours avant l'agent anticancéreux. Egalement, les doses d'agent modulateur de la concentration de calcium administrées au patient cancéreux sont plus faibles que celles qui sont traditionnellement utilisées dans le cadre des traitements des maladies métaboliques ou des métastases osseuses. Selon un second mode de réalisation, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif l'association telle que précédemment décrite, de préférence additionnée d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration des associations, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des agents choisis. De préférence, ces composés sont administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. Les modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement et adaptés à chaque patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention a pour objet l'utilisation des associations telles que précédemment décrites pour la potentialisation de la formation du macro-complexe DISC et de l'induction du signal pro-apopotique dans les cellules tumorales, et la sensibilisation de ces cellules aux agents chimiothérapeutiques. La présente invention a également pour objet l'utilisation des associations telles que précédemment décrites pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer et/ou à la prévention des rechutes cancéreuses. De tels cancers sont par exemples les cancers du colon, du sein, de la prostate, du poumon (à petites cellules et non à petites cellules), de l'ovaire, du pancréas, du rein, du cerveau, des cellules sanguines (lymphomes et leucémies) et du foie. La présente invention a en outre pour objet une méthode de traitement, de prévention et/ou de sensibilisation des cellules tumorales à la chimiothérapie conventionnelle comprenant l'administration de doses thérapeutiques des associations telles que précédemment décrites. Parmi les cancers qui peuvent être traités, on peut citer de préférence le cancer du colon, du sein, de la prostate, du poumon (à petites cellules et non à petites cellules), de l'ovaire, du pancréas, du rein, du cerveau, des cellules sanguines (lymphomes et leucémies) et du foie. Selon l'invention, les agents modulateurs de la concentration intracellulaire de calcium ainsi que les agents anticancéreux sont administrés aux patients en quantité thérapeutique efficace de sorte à obtenir une diminution de la croissance tumorale, notamment dans le cas des tumeurs du lymphome B, des tumeurs de cancer de la prostate, ou des tumeurs de cancer du sein, allant de 10 à 90 % ; 15 à 90% , 20 à 90% ; 25 à 90% ; 30 à 90% ; 35 à 90% ; 40 à 90% ; 45 à 90% ; 50 à 90% ; 55 à 90% ; 60 à 90% ; 65 à 90% ; 70 à 90% ; 75 à 90% ; 80 à 90% ; ou 85 à 90%. Les associations peuvent être en outre co-administrées avec des agents antitumoraux susceptibles de prévenir ou d'inhiber la synthèse d'ADN, d'ARN et/ou de protéines, tels que par exemple la daunorubicine, la idarubicine, la valrubicine, le mitoxantrone, la dactinomycine, la mithramycine, la plicamycine, la bleomycine, et la procarbazine ; ou encore avec des immunomodulateurs qui stimulent le système immunitaire car celui-ci (cellules NK et lymphocytes T activés) exprime du FasL et du TRAIL, tels que les interférons, les interleukines comme l'aldesleukine, OCT-43, denileukin diflitox ou rinterleukine-2, les facteurs de nécrose tumorale comme la tasonermine, ou d'autres types d'immunomodulateurs comme le lentinan, le sizofiran, le roquinimex, le pidotimod, la pégadémase, et la thymopentine. Les associations selon la présente invention peuvent par ailleurs être coadministrées avec des anticorps ayant une activité anti-tumorale. A titre d'exemples non limitatifs, peuvent être cités les anticorps anti Her2/neu (Herceptin), anti-EGFR (Erbitux) ou encore anti-IGF-IR. Selon un dernier mode de réalisation, la présente invention a pour objet une méthode de screening visant à détecter les compositions susceptibles de potentialiser l'effet pro-apoptotique des agents anti-cancéreux impliquant les récepteurs de mort dans les cellules tumorales. Les méthodes de screening comprennent l'administration desdites compositions à des cellules issues de biopsies ou à des lignées cancéreuses, et l'évaluation de la formation du macro-complexe DISC en présence et en l'absence de l'agent modulateur de la concentration de calcium intracellulaire, indiquant ainsi une potentialisation sélective. Les pourcentages de mort cellulaire sont alors évalués dans les différentes conditions de traitement des lignées cellulaires. Plus précisément, l'induction de l'apoptose peut être suivie par exemple par la mesure du potentiel électrique transmembranaire mitochondrial, de la perméabilité membranaire, de la fragmentation de l'ADN, de la morphologie cellulaire, par Western blot, ou encore par la mesure de l'activité caspase. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-dessus. EXEMPLES Exemple 1 : Les Lignées cellulaires Les lignées cellulaires d'origine leucémique T Jurkat, CEM et H9, la lignée lymphoïde B transformée EBV (Epstein Barr Virus) SKW 6.4, les lignées cellulaires provenant de lymphomes de Burkitt EBV induits RAJI et BL2 proviennent de l'ATCC (American Type Culture Collection). Elles ont été cultivées dans un milieu RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) complémenté avec 8% de sérum de veau foetal (SVF, Sigma) (décomplémenté 30 minutes à 56°C) et 2mM de L-glutamine (Gibco). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur humide à 37°C et 5% de CO2. La lignée CEM Fas-déficiente (CEM-IRC) a été maintenue en culture pendant plusieurs générations dans un milieu contenant du FasL et les cellules résistantes ont été clonées, puis sur la base de l'expression de Fas, un clone déficient a été isolé. Le clone Jurkat Q257K est issu de la lignée Jurkat qui a été cultivée pendant 3 semaines en présence d'une dose de 200 ng/ml d'anticorps agoniste anti-Fas (clone 7C11) correspondant à deux fois la dose permettant d'atteindre le plateau du maximum de mort cellulaire des cellules parentales. Les lignées cellulaires d'origine leucémique T Jurkat déficientes pour la caspase 8 ou FADD proviennent de l'ATCC. Exemple 2 : Les lymphocytes T activés Les PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) de sujets sains ont été obtenus après centrifugation dans un gradient de Ficoll, puis les monocytes/macrophages ont été éliminés par une étape d'adhérence de 1 heure sur flasque de culture. Les PBL (peripheral blood lymphocytes) ainsi isolés ont été activés pendant 20 heures avec 1�g/ml de PHA-L (Phytohemagglutinin type L) puis lavés et stimulés pendant 6 jours avec 50 U/ml d'IL2 (Interleukine-2) dans un milieu de culture constitué de RPMI, contenant 10% de sérum humain, 2mM de L-glutamine, 1.105 unités de pénicilline, 1.105�g de streptomycine (Gibco). Une analyse par cytométrie en flux des marquages membranaires CD3 et CD19 a été réalisée après Ficoll pour analyser la répartition initiale des populations cellulaires B et T. Exemple 3 : Réactifs et anticorps utilisés Le FasL a été généré par Legembre P. et al. (J Immunol 2003. 171: 5659-5662). Le TRAIL (TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand) humain recombinant soluble provient de chez Alexis Biochemicals Covalab (Villeurbanne, France). Les anticorps agonistes anti- Fas 7C11 (IgM) et APO1-3 (IgG3) proviennent respectivement de chez BD-Biosciences (Franklin Lakes, USA) et Alexis Biochemicals Covalab. Les anticorps utilisés pour le Western blot sont l'anti-Fas humain C20 (Santa Cruz) et l'anticorps secondaire polyclonal de chèvre anti-lapin couplé HRP (Zymed, San Francisco, USA). L'anti-Fas utilisé pour les marquages en cytométrie en flux est le clone DX2 (IgG1). Le DX2 provient de chez BD Biosciences, les anticorps secondaires de chèvre anti-IgG de souris sont couplés soit à la phycoerythrine (PE) pour la cytométrie en flux soit au fluorochrome Alexa555 (Invitrogen, Carlsbad, USA) pour la microscopie confocale. L'edelfosine et l'étoposide proviennent de chez Calbiochem (VWR International, Fontenay-sous-Bois, France), le 2-APB, le BAPTA-AM, la thapsigargine, la ionomycine, le DAPI proviennent de chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, USA). Le Rituximab est fourni par la pharmacie de l'Institut Bergonié. Marquages cellulaires et analyse par cytométrie en flux Cette technique a permis de détecter la présence d'une protéine à la surface cellulaire. Toutes les étapes se sont déroulées à 4°C afin de diminuer l'endocytose des protéines membranaires et la perte du marquage cellulaire. La membrane cellulaire des cellules (106 cellules par marquage) a été saturée pendant 5 minutes dans l ml de PBS contenant 1% (w/v) de BSA (bovin serum albumin) et 1% (v/v) de sérum de veau foetal (SVF). Cette solution a été utilisée pour les lavages et les dilutions d'anticorps. Les cellules ont été incubées pendant 30 minutes avec 501.1I de l'anticorps primaire (clone anti-Fas DX2 à 10�g/ml), lavées deux fois avec la solution PBS/BSA/FCS, puis incubées avec 501.1I de l'anticorps secondaire couplé à la phycoerythrine pendant 30 minutes. Après 3 lavages, les cellules ont été resuspendues dans 2001.1I de PBS/BSA/SVF et analysées immédiatement par cytométrie en flux (FACsCalibur, BD Biosciences). L'intensité de fluorescence a été analysée avec le logiciel Cellquest. Exemple 4 : Mesure des concentrations de Cal+ intracellulaire sur cellule unique ou population cellulaire Exemple 4.1 Mesure sur cellule unique Principe : La [Ca2+ a été mesurée par microspectrofluorimétrie grâce à l'utilisation d'une sonde fluorescente sensible au calcium : l'indo-1. Lorsqu'elle est excitée à une longueur d'onde de 360 nm, la sonde indo-1 dite monoexcitation/double émission, réémet dans un spectre allant de 400 à 500 nm. La liaison avec du Ca2+ à l'indo-1 provoque un déplacement du spectre d'émission de la molécule après excitation. Le maximum d'émission de la forme libre se situe autour de 480 nm. Celui de la forme complexée se situe autour de 405 nm. Une élévation de la concentration en calcium provoque donc une augmentation de l'émission à 405 nm et une décroissance de l'émission à 480 nm. Le rapport des deux intensités de fluorescence, dit 'ratio', a permis de s'affranchir de la dépendance à la quantité de la sonde et de déterminer la [Ca2+ selon l'équation de Grynkiewicz : [Ca2+]; (nM)=Kd.[3 x (R-Rmin)/(Rmax-R) avec : Kd : constante de dissociation de l'indo-1 R : rapport des fluorescence à 480nm en absence et en saturation de calcium R : rapport F405/480 mesuré après correction de l'autofluorescence Rmax : rapport F405/480 mesuré quand l'indo-1 est saturé de calcium Rmin : rapport F405/480 mesuré quand l'indo-1 est libre de calcium Rmax, Rmin et Kd. R sont déterminés en combinant électrophysiologie (patch clamp) et spectrofluorimétrie. Rmax est déterminé en plaçant dans la pipette de patch un milieu contenant 10 mM de CaCl2. Rmin est obtenu en plaçant comme solution intrapipette un milieu dépourvu de calcium (10 mM EGTA). Avec une concentration connue de calcium libre dans la solution de la pipette de patch (300 nM, mélange de calcium + EGTA) et connaissant Rmin et Rmax, il est possible de calculer la valeur du produit Kd. R. Protocole : Les cellules ont été incubées à l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante dans une solution d'HBSS (Hank's Balanced Salt Solution : NaCl 142,6mM ; KCI 5,6mM ; Na2PO4 0,17mM ; KH2PO4 0,22mM ; glucose 5,6mM ; NaHCO3 4,2mM) additionnée de 1�M d'acétoxyméthylester indo-1 (indo-1/AM), d'acide pluronique (0,02%) et de Cal+ (à la concentration voulue). Les cellules ont été ensuite rincées avec de l'HBSS (centrifugation 800 rpm pendant 2 minutes), et placées dans une chambre d'observation sur une lamelle de verre. Les cellules ont été observées en contraste de phase à l'aide d'un microscope inversé à épifluorescence (Nikon). La lumière d'excitation est fournie par une lampe au Xénon (100W). Un système de miroir dichroïque et de filtres interdifférentiels a permis de mesurer en continu la fluorescence émise à 405 et 480nm. Un diviseur analogique donne en continu le ratio F405/F480 et traduit ce ratio en variation de calcium à partir de l'équation de Grynkiewicz (donnée ci-dessus) et des constantes de calibration déterminées au préalable. L'application des substances à tester a été effectuée via une pipette de verre positionnée à une vingtaine de pm de la cellule étudiée reliée à un système pneumatique. Exemple 4.2 : Mesure sur population cellulaire Le principe ainsi que le chargement des cellules ont été en tous points identiques avec les mesures réalisées sur cellules uniques. Dans ce cas, environ 40 000 cellules ont été placées dans une cuve en quartz sous agitation constante. La cuve est ensuite placée dans un spectrofluorimètre Hitachi dont le monochromateur d'excitation a été réglé à 350nm. La fluorescence émise par la sonde calcique Indol a été captée et mesurée alternativement (toutes les secondes) à 405 et 480nm par un photomultiplicateur. Les signaux ont été transmis à un ordinateur via un convertisseur analogique/digital. Afin de pouvoir appliquer l'équation de Grynkiewicz (voir ci-dessus) et traduire les ratios de fluorescence mesurés en valeurs de calcium, les paramètres de calibration ont été entrés dans le logiciel. L'application des substances à tester a été fait directement dans la cuve sous agitation continue. Exemple 5 : Mesure de la mort cellulaire 2 à 4.104 cellules ont été déposées par puits dans une plaque 96 puits. Les cellules ont été incubées, en présence des différents réactifs pendant les temps indiqués, à 37°C dans un volume final de 100 ou 2001.11. Exemple 5.1 : Mesure de la viabilité cellulaire au MTT Le test MTT a permis de mesurer l'activité d'une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase qui transforme le MTT (ou bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) de couleur jaune et soluble en cristaux de formazan bleus et insolubles en phase aqueuse. A la fin des différents traitements, les cellules vivantes ont été quantifiées en ajoutant dans chaque puits 151.1I de PBS (Phosphate Buffered Saline) contenant 5 mg/ml de MTT. Après 4h d'incubation à 37°C, les cristaux de formazan ont été dissous dans 1051.1I d'une solution contenant 95% d'isopropanol et 5% d'acide formique. Une lecture spectrophotométrique de l'absorbance a été faite à 570nm. La mesure de la densité optique est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes et le pourcentage de mort cellulaire a été calculé avec la formule suivante : 100-[(DO cellules traitées/DO cellules non traitées)*100]. Exemple 5.2 : Mesure de la fragmentation de l'ADN Les cellules ont été perméabilisées en utilisant une solution contenant une faible concentration de détergent et leur contenu en ADN a été estimé via un marquage par l'iodure de propidium. L'iodure de propidium est une molécule fluorescente qui s'intercale dans l'ADN double brin. Les cellules perméabilisées ayant subi le processus apoptotique perdent l'ADN dégradé qui diffuse à travers les pores nucléaires et cellulaires. Cette population apoptotique possédant une quantité d'ADN inférieure aux cellules vivantes s'appelle population sub-G1 ou aneuploïde. Les cellules traitées (2.105 par puit) ont été incubées pendant 4 heures à 4°C avec 2001.1I d'un tampon contenant 0,1% (w/v) citrate de sodium et 0,1% (v/v) Triton-X-100 avec 50�g/ml d'iodure de propidium (Sigma). La fluorescence émise par l'iodure de propidium présent dans la cellule a été mesurée par cytométrie en flux car il est excitable par un laser argon (488 nm) et sa longueur d'onde d'émission est de 637 nm. Exemple 5.3 : Mesure de la chute du potentiel électrique mitochondrial Les cellules apoptotiques ont été identifiées dans les populations cellulaires en mesurant la dépolarisation mitochondriale. La baisse du potentiel de la membrane interne mitochondriale (A1Pm), événement précoce des mécanismes de l'apoptose, a été mesurée par les sondes fluorescentes tétraméthylrhodamine méthyl ester (Xex=488 nm, Xem=525 nm) (TMRM, Sigma) ou 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6). Ces sondes potentiométriques ont permis de suivre les variations du potentiel membranaire mitochondrial. Dans des conditions basales, la membrane mitochondriale est hyperpolarisée (-180 mV) et les sondes s'accumulent dans les mitochondries (les cellules sont fluorescentes), alors qu'en conditions apoptotiques, la membrane mitochondriale est dépolarisée et les sondes ne s'accumulent plus dans les mitochondries (les cellules ne sont pas fluorescentes). Après traitement des cellules avec les différentes drogues, celles-ci ont été mises en présence de TMRM ou de DIOC6 à la concentration de 10 nM, pendant 20 minutes à 37°C puis la fluorescence des cellules a été analysée en cytométrie en flux. Exemple 6: DISC, Lysat cellulaire, Western Blot Les cellules ont été incubées avec 1 �g/ml d'APO1-3 pendant 30 minutes à 4°C. Après lavage, les cellules ont été incubées pendant 15 minutes à 4°C (0 minutes) ou à 37°C (15 minutes) et immédiatement lysées pendant 30 minutes à 4°C dans un tampon de lyse (25mM HEPES pH 7,4, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, cocktail contenant des inhibiteurs de protéases (Sigma)). Les cellules lysées ont été ensuite centrifugées pendant 15 minutes à 15000 rpm afin d'éliminer l'ADN génomique, et le surnageant a été conservé. Les billes de sépharose couplées à la protéine A ont été ajoutés au lysat et le mélange a été incubé pendant 2 heures. Les billes ont été récupérées, lavées intensivement et les protéines immunoprécipitées ont été resuspendues dans un tampon de charge dénaturant et réducteur (0,01M Tris-HCI pH6,8, 10% glycérol (v/v), 85mM sodium dodécyl sulfate (SDS), 5%(v/v) R-mercaptoéthanol et 0,005% (w/v) bleu de bromophénol) puis chauffées à 100°C pendant 5 minutes. Les échantillons ont été déposés dans un gel d'acrylamide/Bisacrylamide et séparés par électrophorèse. Les protéines ont été transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose par une technique de transfert en milieu semi-sec pendant 2 heures à ampérage constant (0,8 mA/cm2). Le tampon de transfert est composé de 25mM Tris, 192mM glycine, 0,1% SDS, 20% éthanol. Après transfert, la membrane de nitrocellulose a été saturée en protéines pendant 30 minutes avec un tampon TBST (50 mM Tris pH=8, 0,15M chlorure de sodium, 0,05% (v/v) Tween-20) contenant 5% (w/v) de lait écrémé en poudre (TBSTM). Après lavage avec du TBST, la membrane a été incubée 2 heures avec l'anticorps primaire dans du TBST. La membrane est a été lavée intensivement puis mise en présence pendant une heure de TBST contenant l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase. La présence de la protéine d'intérêt a été révélée avec une solution ECL (Enzyme Chemoluminescence, Pierce). Cette solution contient un substrat métabolisé par la péroxydase pour donner un composé luminescent, qui permet de marquer un film radiographique (hyperfilm ECL, Amersham). Exemple 7: Microscopie confocale en fluorescence Les cellules ont été laissées adhérer sur une lame pré-traitée avec de la poly-L-Lysine (ESCO, VWR) pendant 5 minutes puis incubées avec les différents réactifs. Les cellules activées avec l'anticorps agoniste anti-Fas APO1-3 ont été lavées et marquées directement avec l'anticorps secondaire anti-souris couplé au fluorochrome Alexa555. Les cellules incubées avec le Rituximab (anti-CD20) ont été lavées dans un tampon PBS froid puis fixées avec une solution PBS/4% PFA (paraformaldehyde) pendant 15 min. Après lavage, les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-Fas (clone DX2) (30 min à 4°C) et ensuite avec l'anticorps secondaire (30 min à 4°C) comme décrit précédemment. Les cellules ont été lavées en milieu PBS puis la lame a été séchée et les cellules ont été placées dans un milieu de montage Fluoroprep (Biomerieux) et analysées par microscopie confocale en fluorescence (LSM SF5, Leica, Allemagne) avec un objectif x 63. Le DAPI (200 ng/ml) permet la coloration des noyaux. Exemple 8 : Induction par le ligand FasL Cet exemple montre que l'engagement du ligand FasL permet d'induire une augmentation rapide et transitoire de la concentration du calcium intracellulaire (Ca2+) (Figure 2). Le pic de calcium est apparu quelques secondes avant la formation du complexe DISC, la formation de ce dernier ayant été observée environ entre 5 et 15 minutes selon les cellules. L'augmentation du Ca2+ intracellulaire semble indépendante de l'intégrité du domaine DD de Fas ou des autres composants du complexe DISC, tels que le FADD, la caspase 8 ou 10. En effet, l'expression hétérozygote d'un mutant FasQ257K dans la lignée lymphomateuse T Jurkat a permis de bloquer la formation du DISC mais n'a pas eu d'impact sur l'augmentation du Ca2+. Exemple 9: Mise en évidence d'un effet de potentialisation de la formation du macro-complexe DISC Comme cela a été démontré dans la Figure 3, la diminution de la concentration de calcium intracytoplasmique par incubation préalable des cellules avec de faibles concentrations (1-10uM) du chélateur de calcium tels que BAPTA-AM (acide 1,2-bis-(o-Amino phénoxy)éthane-N,N,N',N'-tétraacétique tétra-(acétoxyméthyl) Ester) a permis de potentialiser de manière significative la formation du macro-complexe DISC suite à la stimulation de Fas. De plus, le prétraitement des cellules à la thapsigargine, un inhibiteur des SERCA (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase) a aussi permis d'inhiber l'apparition d'un pic intracytoplasmique de calcium ([Ca2+];) et ainsi de potentialiser la formation du complexe DISC. Au contraire, il a été démontré que l'augmentation du calcium intracellulaire [Ca2+]; induite par l'utilisation d'un ionophore à calcium, la ionomycine, interférait avec la formation du complexe DISC et avait pour effet de diminuer la liaison du FADD ainsi que l'activation de la caspase-8. Ces résultats ont bien mis en évidence que le calcium jouait un rôle dans la fonction anti-apoptotique pendant les étapes précoces du signal Fas, avant le recrutement de FADD et la formation de DISC. Exemple 10: Mise en évidence d'une coopération entre la déplétion du calcium intracellulaire et les récepteurs de mort Fas Les résultats présentés dans la Figure 4A montrent que de nombreuses lignées cellulaires dérivées de leucémies, de lymphomes, ou des lymphocytes du sang périphériques activés (activated PBLs, peripheral blood lymphocytes) ont été sensibilisées au signal apoptotique à médiation Fas suite au traitement à l'aide de chélateur du calcium BAPTA-AM. A l'opposé, les lignées cellulaires BL2 du lymphome de Burkitt, déficientes pour le récepteur Fas n'ont pas été sensibilisées par ce traitement. Ces résultats confirment que la combinaison d'un inducteur d'apoptose impliquant le récepteur de mort Fas avec un agent susceptible de diminuer la quantité de calcium intracellulaire a permis de significativement potentialiser l'induction du signal d'apoptose et l'élimination des cellules tumorales. Exemple 11 : Mise en évidence d'un effet de potentialisation de l'activité apoptotique lors de l'administration d'un inhibiteur de certains canaux calciques 20 SOCs Les résultats montrent que de l'utilisation de fortes doses de 2-APB inhibant certains canaux calciques SOCs, a permis de diminuer la concentration intracellulaire de calcium et de potentialiser la réponse au FasL dans des lignées cellulaires lymphomateuses T ou B (Figure 8). 25 Exemple 12 : Mise en évidence d'un effet de potentialisation de l'activité apoptotique lors de l'association d'un agent anti-cancéreux avec la thapsigargine (modulateur des canaux Cal+). Les résultats présentés dans la Figure 9 montrent que différentes lignées de lymphomes 30 B (BL2, Raji, SUDHL4) ont été sensibilisées à l'apoptose induite par le rituximab (A et B) ou par TRAIL (C et D) en présence d'une faible concentration de thapsigargine (5nM). Exemple 13: Association d'agents susceptibles de diminuer le calcium extracellulaire et d'au moins un agent anticancéreux 35 Cet Exemple vise à montrer l'effet synergique obtenu par l'association d'agent susceptible de diminuer la concentration de calcium intracellulaire par une action au niveau de la concentration extracellulaire ([Ca2+]e) et un agent anticancéreux conventionnel. L'effet du calcium extracellulaire sur la concentration de calcium intracellulaire a été étudié par microfluorométrie à double longueur d'onde dans des cellules humaines de lymphomes. Les résultats présentés à la Figure 7A et B montrent que les changements des concentration du calcium extracellulaire ([Ca2+]e), +/- 3 mM ont eu un impact substantiel sur les concentrations du calcium intracellulaire [Ca2+];. Egalement, l'ajout de calcium extracellulaire a inhibé le signal de mort cellulaire induit par l'administration de rituximab (Figure 7C û graphe de droite). Par contre, un milieu contenant de faibles concentrations de calcium (0,5 mM) a permis de potentialiser le signal de mort par apoptose induit par le rituximab (Figure 7C, graphe de gauche). Ces résultats montrent bien que la modulation du [Ca2+]e potentialise la médiation du signal apoptotique véhiculé par les agents anti-tumoraux dépendants des récepteurs de mort. Exemple 14: Association synergique d'un agent chélateur du calcium et d'au moins un agent anticancéreux Les résultats présentés dans cet Exemple montrent que l'incubation préalable des lignées cellulaire de lymphome B avec un chélateur du calcium tel que le BAPTA-AM a permis de potentialiser les signaux apoptotiques médiés par des agents chimiothérapeutiques tels que l'edelfosine ou le rituximab (Figure 5). Par contre, aucune augmentation du signal apoptotique n'a été observée lorsque la lignée cellulaire BL2, dépourvue du récepteur Fas et résistante au rituximab, a été traitée avec le rituximab associé au BAPTA-AM. Ces résultats confirment bien l'implication du récepteur Fas dans cette voie de signalisation apoptotique selon l'invention (Figure 5). Exemple 15 : Potentialisation du signal apoptotique impliquant le récepteur de mort DR4 ou DR5 Henson ES et al. (Leuk Lymphoma 2008. 49: 27-350) ont décrit que le ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis-lnducing Ligand), utilisé seul ou en association avec des agents anticancéreux présentait une action tumoricide puissante sur les cellules leucémiques ou sur les cellules dérivés de lymphomes. Le ligand TRAIL appartient à la famille TNF et se fixe sur les récepteurs de mort DR4 ou DR5 induisant ainsi un signal de mort cellulaire comparable à celui du récepteur Fas. Les résultats présentés dans la Figure 6 montrent que l'induction de la mort cellulaire par l'addition du ligand TRAIL était également potentialisée par la chélation du calcium. Exemple 16: Association synergique d'un agent modulateur susceptible de diminuer le calcium intracellulaire et d'un inhibiteur PI3K Les résultats présentés aux Figures 5C et 5D montrent que l'association d'un inhibiteur de la voie de signalisation PI3K, l'edelfosine, avec un agent susceptible de réduire le calcium intracellulaire a permis de potentialiser le signal apoptotique véhiculé par l'edelfosine dans les lignées de cellules tumorales. Exemple 17 : Effets des hypocalcémiants ou de la thapsigargine en association avec des agents anti-cancéreux sur la croissance tumorale : étude chez le petit animal. L'implantation des tumeurs se fait en sous-cutané dans le flanc des souris Rag2-/-y-/-âgées de 5 à 7 semaines. Après implantation des tumeurs, les souris sont séparées par groupe de 8 à 10 animaux pour chaque traitement. Chaque jour, la taille de la tumeur est estimée en mesurant sa largeur (w) et sa longueur (I). Son volume est calculé selon la formule : V=1w2/2 Le Zoledronate et le BAPTA-AM sont utilisés comme hypocalcémiants. Le Zoledronate et le BAPTA-AM sont administrés selon le paradigme expérimental et à la concentration efficace pour diminuer la calcémie d'environ 30% (limite inférieure de normo-calcémie) avant l'implantation de la tumeur et durant toute la durée du traitement avec l'agent anticancéreux d'intérêt. La thapsigargine est utilisée comme modulateur des canaux calciques. Après implantation de la tumeur, la thapsigargine est testée aux concentrations de : 0.05, 0.1 et 0.5 mg/kg à raison d'une injection iv par jour pendant 5 jours suivi d'un arrêt d'une semaine puis d'une injection iv par jour pendant 5 jours (Denmeade SR et a1, JNCI, 95 : 990-1000). Le traitement avec la thapsigargine débute 24h avant le traitement avec l'agent anti-tumoral d'intérêt. Pour chaque substance testée, les réactifs correspondant au(x) véhicule(s) de la (des) substance(s) active(s) sont testés sur la croissance tumorale d'un groupe d'animaux désigné comme � groupe contrôle �. Modèle 1 : Effets d'une association Rituximab avec Zoledronate ou BAPTA-AM ou Thapsigargine sur la croissance d'une tumeur de lymphome B. De 106 à 10' cellules Raji sont implantées en sous-cutané dans le flanc des souris. Les effets du Rituximab seul, du Zoledronate seul, du BAPTA-AM seul et de la thapsigargine seule sont évalués sur la croissance des tumeurs. Le rituximab est administré selon les protocoles connus par l'homme de l'art, le Zoledronate, le BAPTA-AM et la thapsigargine sont administrés selon le protocole décrit ci-dessus. Dans ces conditions, la croissance tumorale est diminuée de : 0 à 50% ; 5 à 50% ; 10 à 50% ; 15 à 50% ; 20 à 50% ; 25 à 50% ; 30 à 50% ; 35 à 50% ; 35 à 50% ; 40 à 50% ; 45 à 50%. Lorsqu'on associe le Rituximab avec le Zoledronate ou le BAPTA-AM ou la thapsigargine, la croissance tumorale est diminuée de:10à90%; 15 à 90% , 20 à 90% ; 25 à 90% ; 30 à 90% ; 35 à 90%;40à90%;45à90%;50à90%;55à90%;60à90%;65à90%;70à90%;75 à 90% ; 80 à 90% ; 85 à 90%. Modèle 2 : Effets d'une association TRAIL soluble (KillerTRAIL, Alexis) avec Zoledronate ou BAPTA-AM ou Thapsiparpine sur la croissance d'une tumeur de lymphome B. De 106 à 107 cellules BL2 sont implantées en sous-cutané dans le flanc des souris. Les effets du TRAIL soluble seul, du Zoledronate seul, du BAPTA-AM seul et de la thapsigargine seule sont évalués sur la croissance des tumeurs. Le TRAIL soluble est administré selon les protocoles connus par l'homme de l'art, le Zoledronate, le BAPTAAM et la thapsigargine sont administrés selon le protocole décrit ci-dessus. Dans ces conditions, la croissance tumorale est diminuée de : 0 à 50% ; 5 à 50% ; 10 à 50% ; 15 à 50% ; 20 à 50% ; 25 à 50% ; 30 à 50% ; 35 à 50% ; 35 à 50% ; 40 à 50% ; 45 à 50%. Lorsqu'on associe le TRAIL soluble avec le Zoledronate ou le BAPTA-AM ou la thapsigargine, la croissance tumorale est diminuée de : 10 à 90 % ; 15 à 90% , 20 à 90%;25à90%;30à90%;35à90%;40à90%;45à90%;50à90%;55à90%;60 à90%;65à90%;70à90%;75à90%;80à90%;85à90%. Modèle 3: Effets d'une association Docetaxel avec Zoledronate ou BAPTA-AM ou Thapsiparpine sur la croissance d'une tumeur de cancer de la prostate. De 106 à 107 cellules DU145 hormono-résistantes, sont implantées en sous-cutané dans le flanc de souris mâles. Les effets du docetaxel seul, du Zoledronate seul, du BAPTA- AM seul et de la thapsigargine seule sont évalués sur la croissance des tumeurs. Le docetaxel est administré selon les protocoles connus par l'homme de l'art. Le Zoledronate, le BAPTA-AM et la thapsigargine sont administrés selon le protocole décrit ci-dessus. Dans ces conditions, la croissance tumorale est diminuée de : 0 à 50% ; 5 à 50% ; 10 à 50% ; 15 à 50% ; 20 à 50% ; 25 à 50% ; 30 à 50% ; 35 à 50% ; 35 à 50% ; 40 à 50% ; 45 à 50%. Lorsqu'on associe le docetaxel avec le Zoledronate ou le BAPTA-AM ou la thapsigargine, la croissance tumorale est diminuée de : 10 à 90 % ; 15 à 90% , 20 à 90%;25à90%;30à90%;35à90%;40à90%;45à90%;50à90%;55à90%;60 à90%;65à90%;70à90%;75à90%;80à90%;85à90%. Modèle 4 : Effets d'une association 5-Fluorouracile (5-FU) avec Zoledronate ou BAPTAAM ou Thapsiparpine sur la croissance d'une tumeur de cancer du sein. De 106 à 107 cellules MCF-7 hormono-sensibles, sont implantées en sous-cutané dans le flanc de souris femelles. Les effets du 5-FU seul, du Zoledronate seul, du BAPTA-AM seul et de la thapsigargine seule sont évalués sur la croissance des tumeurs. Le 5-FU est administré selon les protocoles connus par l'homme de l'art, le Zoledronate, le BAPTAAM et la thapsigargine sont administrés selon le protocole décrit ci-dessus. Dans ces conditions, la croissance tumorale est diminuée de : 0 à 50% ; 5 à 50% ; 10 à 50%; 15 à 50%; 20 à 50%; 25 à 50%; 30 à 50%; 35 à 50%; 35 à 50%; 40 à 50%; 45 à 50%. Lorsqu'on associe le 5-FU avec le Zoledronate ou le BAPTA-AM ou la thapsigargine, la croissance tumorale est diminuée de : 10 à 90 0/0; 15 à 90% , 20 à 90%;25à90%;30à90%;35à90%;40à90%;45à90%;50à90%;55à90%;60 à90%;65à90%;70à90%;75à90%;80à90%;85à90%.5