Brevet FR2937143A1 — publié le 20100416

TITRE Epreuve de compatibilité sanguine chez l'animal par une technique Immunochromatographique NOMS DES INVENTEURS 1) Docteur Dominique RIGAL 4, chemin de Chantemerle 69370 Saint Didier au Mont D'Or 2) Madame Alice RIGAL 9 rue de la Monnaie 69002 LYON 3) Monsieur Gabriel RIGAL 9 rue de la Monnaie 69002 LYON 2937143 II DESCRIPTION Indication du domaine technique La présente invention a pour objet un procédé capable de réaliser une épreuve de compatibilité sanguine chez les animaux avant la réalisation d'une transfusion. 5 La transfusion animale est maintenant devenue une technologie courante dans de nombreuses espèces animales comme le chat, le chien, le cheval, le furet Cependant pour assurer une parfaite sécurité dans ce domaine, il convient de réaliser les groupages sanguins du donneur et du receveur dans les systèmes de groupes sanguins les plus immunogènes comme par exemple le système DEA1.1 (Dog Erytrocyte Antigen) chez le chien, le système AB chez le chat, les systèmes 10 Aa et Ca chez le cheval de façon à éviter les situations d'allo-immunisation et des réactions transfusionnelles immédiates ou retardées pouvant être délétères chez le receveur. Toutefois le respect des compatibilités sanguines ne protége pas nécessairement le receveur d'un d'accident transfusionnelle par incompatibilité sanguine dans les systèmes de groupes qui n'ont pas été déterminés au préalable. 15 Indication de l'Etat de l'art Cependant, le seul moyen d'assurer une transfusion très fiable consiste à réaliser un test de compatibilité (encore appelé Cross match) entre les globules rouges du donneur et le plasma ou le sérum du receveur. Ce test est encore appelé test de compatibilité majeur. Le test de compatibilité mineur consiste à mettre en présence le plasma du donneur avec les globules rouges du receveur. Il existe plusieurs méthodes pour réaliser les tests de compatibilité. La méthode historique est encore appelé le test de Coombs indirect en tube ou sur plaque. Dans cette méthode les globules rouges du donneur sont lavés 3 à 4 fois en solution saline puis mis en contact avec le plasma ou le sérum du receveur pendant 15 à 35 min à 35° puis de nouveau lavés 3 à 4 fois en solution saline, ensuite on ajoute une anti-globuline spécifique de l'espèce et les tubes sont centrifugés et lus après agitation douce. Cette méthode est longue (1 à 2 heures) et fastidieuse. Elle nécessite la production d'un anti-globuline d'espèce d'une grande qualité. Elle demande à être réalisé par un laboratoire spécialisé. Une seconde technique consiste à utiliser la méthode de gel filtration. Dans cette méthode une anti- globuline spécifique d'espèce est dispersée dans un gel de Sephadex déposé dans des micro- colonnes de chromatographie. Les globules rouges du donneur et le plasma ou sérum du receveur sont mélangés au sommet de la colonne. Le mélange est laissé 15 à 30 min à 37° puis les colonnes sont centrifugées durant 10 minutes. La présence d'anticorps dans le plasma du donneur va provoquer une agglutination des globules rouges qui restent bloqués au sommet de la colonne. En revanche, en l'absence d'anticorps, les globules rouges vont passer entre les billes de Sephadex et se retrouver en bas de la colonne. Cette technique nécessite un équipement spécifique et ne peut être 2937143 III réalisé que dans un laboratoire spécialisé. Par ailleurs, elle va prendre entre 30 et 45 minutes. Cette technique nécessite la production d'un anti-globuline d'espèce d'une grande qualité. C'est pourquoi, nous avons mis au point une nouvelle technologie qui va permettre de réaliser en 5 moins de 10 minutes un test de comptabilité tout en s'affranchissant d'une Anti-globuline spécifique de l'espèce et de matériel de centrifugation. Ce test ultra rapide permet de résoudre en particulier l'épreuve de compatibilité en situation d'urgence ou au cabinet d'un vétérinaire non spécialisé. 10 Exposé de l'invention Cette invention comporte 2 parties : Fixation des anticorps anti globules rouges sur les GR du donneur avec un facilitateur de l'agglutination Lecture de la réaction par une technique Immunochromatographique 15 Première partie : Fixation des anticorps anti globules rouges sur les globules rouges du donneur Une suspension de GR du donneur de 1 à 20% dans un tampon A de type PBS (phosphate buffer solution ph 7.2) de base force ionique est déposé dans une cupule à fond arrondis ou plat d'un volume de 5(411 à l000�1. A cette suspension de globule rouge d'un volume de 5�l à 10011l et 20 préférentiellement 25�l, on ajoute 5�i à l00�1 de sérum ou de plasma du donneur et préférentiellement 25111. Apres une période d'incubation d'1 minute à 3 minutes et préférentiellement 1,30 min, on ajoute dans la cupule 241 d'un tampon B contenant des macro molécules polycationiques (polyvinyle pyrolidone, methylcelullose, polylysine, héparine, bromure d'hexadimethrine...) à des concentrations de 0,0001% à 1% et préférentiellement à 0,02%. 25 Apres 3 minutes et préférentiellement 1,30 min, on ajoute un volume de 5�l à 100�l et préférentiellement 2511l de tampon C (tampon salin avec un pH acide). Au terme de 15 à 75 sec, une agglutination des globules rouges est évaluée en effectuant la 2eme partie de l'invention. Deuxième partie: Lecture de la réaction par une technique Immunochromatographique 30 Dans la première partie de ce test, il a été réalisé une réaction d'agglutination des globules rouges du receveur, grâce à un polycation facilitateur de l'agglutination. En milieu acide, l'agglutination va disparaître rapidement si le globules rouges n'ont pas été revêtus par des anticorps présents dans le plasma du receveur. En revanche, il n'y aura pas de disparition de l'agglutination en milieu acide si les globules rouges ont été recouverts par des anticorps du plasma 35 du receveur. L'évaluation de l'agglutination est une observation subjective de la part de l'opérateur. C'est pourquoi dans cette invention, nous utilisons des bandelettes de nitrocellulose permettrant la migration des globules rouges libres entre les mailles de la membrane de nitrocellulose. 2937143 IV La lecture de la réaction se réalisera donc en trempant cette bandelette de nitrocellulose dans la cupule réactionnelle avec 2 résultats possibles : Les globules rouges restent sous forme d'agglutinats dans la cupule et de ce fait ne peuvent pas migrer dans les mailles de la membrane nitrocellulose qui restera blanche ou rose pale avec une 5 bande rouge intense à son extrémité inférieure (test positif Fig.1). Si les agglutinats de globules rouges se dissocient en présence du tampon acide, ceci témoigne d'une absence de revêtement des globules rouges par des anticorps présents dans le plasma du receveur. Alors les globules rouges vont migrées le long de la membrane de nitrocellulose et la teinter en rouge sans bande rouge à son extrémité inférieure (test négatif Fig.2). 10 Présentation des figures Les dessins annexés illustrent l'invention : La figure 1 représente la membrane de nitrocellulose avec un résultat positif. Les globules rouges sont retenus à l'extrémité inferieure de la membrane sous forme d'agglutinats laissant une bande 15 rouge intense apparaitre. Le reste de la membrane étant blanche ou rosé. La figure 2 représente la membrane de nitrocellulose avec un résultat négatif. Les globules rouges ont migrés le long de la membrane entrainant une teinte rouge tout au long de la membrane. Première exemple : compatibilité entre le sérum d'un chat de groupe B et les globules rouges d'un 20 chat de groupe A. On sait que les chats de groupe B possèdent des anticorps naturels Anti globules rouges de groupe A (Anti-A). Avec cette technologie nous avons évalué le sérum de 10 chats de groupes B contre un panel de globules rouges de groupe A. Dans tous les cas il a été possible de démontrer la présence d'anticorps anti-A avec des titres du 1/8 au 1/256. 25 Inversement, il a été testé des plasmas de chat de groupe A vis a vis de globules rouges B. La présence d'anticorps Anti-B a été retrouvée dans 30% des cas avec des titres allant de 1/2 à 1/64. Deuxième exemple : compatibilité entre le sérum de chien de différents groupes des systèmes DEA et des globules rouges cible porteur des antigènes DEA d'intérêts. 30 Nous avons pu évaluer des sérum contenant des anticorps anti DEA1.1, 1.2, DEA-2, DEA-3, DEA-4, DEA-7 obtenu auprès de la Midwest Animal Blood services (Michigan,USA). Dans tous les cas, il a été possible d'identifier la présence d'une incompatibilité entre ces sérums et les globules rouges porteurs des antigènes cibles. Les titres des anticorps ont variés du 1/2 au 1/64. 35 Troisième exemple : Démonstration d'un revêtement érythrocytaire par des auto-Anticorps. 2937143 V Cette invention a été appliquée à des globules rouges provenant d'animaux atteints d'auto immunisation anti- érythrocytaire attesté par la présence d'un test de Coombs direct positif. Cette technique a parfaitement visualisé la persistance de l'agglutination de ce type de globules rouges revêtus par des auto-anticorps. Cette technique représente donc une alternative facile et rapide au 5 test de Coombs direct qui peut être appliqué dans les espèces que nous avons étudié (Chien, chat, cheval, bovins, ovins, caprins, cochons, furet....) Application industrielle : L'invention est particulièrement destinée à fabriquer une trousse contenant l'ensemble du 10 matériel (cupules, bâtonnets agitateurs, embouts de pipette, mode d'emploi), les réactifs (tampons) et les membranes nitrocellulose nécessaires à la réalisation du test de compatibilité immunochromatographique. 10 15 20 Revendications: 1. Un test de compatibilité pré transfusionnelle à 2 étapes : une étape de facilitateur de 5 l'agglutination en présence du sérum du receveur et une étape de lecture objective avec une membrane de nitrocellulose perméable aux globules rouges animaux. 2. Selon la revendication 1, le test utilise des polycations facilitateurs de l'agglutination des globules rouges. 3. Selon la revendication 1 et 2 le test se réalise dans des cupules à fond ronds ou plats de 5 à 1000�l 4. Selon la revendication 1, 2 et 3 le test se réalise en moins de 5 minutes dans la même cupule. 5. Selon les revendications 1,2,3 et 4, le test s'applique à toutes les espèces animales. 6. Selon la revendication 1, le test met en oeuvre des membranes de nitrocellulose perméables aux globules rouges animaux. 7. Selon les revendication 1,2,3,4,5,6 ce test permet de se substituer au test de Coombs direct pour mettre en évidence la présence d'auto anticorps sur les globules rouges animaux.