Brevet FR2943418A1 — publié le 20100924

PROCEDES DE MESURE DE LA QUANTITE INTRACELLULAIRE DE MOLECULES D'INTERET INTRINSEQUEMENT FLUORESCENTES PAR CYTOMETRIE EN FLUX ET LEURS APPLICATIONS L'invention concerne des procédés de mesure de la quantité intracellulaire de molécules d'intérêt intrinsèquement fluorescentes par cytométrie en flux et leurs applications. La quantification intracellulaire de molécules d'intérêt dans les cellules vivantes est un enjeu majeur. En effet, dans tous les domaines de la science, la possibilité de mesurer la quantité exacte d'une molécule directement dans une cellule vivante, amène à de nombreuses applications notamment dans le domaine de la médecine, puisqu'une telle mesure reflète au plus près l'état réel in vivo/in situ de la cellule, aucune détérioration du matériel biologique n'ayant été effectuée. Pourtant, jusqu'à aujourd'hui, aucune technique connue ne permet d'effectuer une telle mesure : on dispose soit de la mesure du taux plasmatique qui influence mais ne reflète pas la quantité intracellulaire, soit de la quantification réalisée sur des lysats cellulaires, c'est-à-dire sur du matériel dénaturé, notamment par HPLC, qui ne correspond pas exactement au contenu cellulaire. Il existe donc un besoin pour développer une technique permettant de mesurer la 20 quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt, directement dans une cellule vivante. Les inventeurs ont ainsi eu le mérite d'inventer un procédé de mesure de la quantité intracellulaire de molécules d'intérêt intrinsèquement fluorescentes dans les cellules d'un échantillon à l'aide d'un cytomètre en flux. En effet, alors que la cytométrie en 25 flux ne permettait jusqu'alors que de détecter des molécules fluorescentes, les inventeurs ont mis au point une technique permettant de quantifier les molécules fluorescentes, et cela directement dans les cellules vivantes, sans dénaturation ou traitement préalable. Plus particulièrement, l'invention concerne en premier lieu un procédé de mesure de la 30 quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente par cytométrie en flux à l'aide d'une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt. En second lieu l'invention concerne un procédé permettant d'établir ladite courbe de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt. Un premier objet de l'invention concerne donc un procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes de : mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré avec les spectres d'émission et d'absorption de ladite molécule d'intérêt, cette valeur de fluorescence étant reportée sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt. Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt, (3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé tel que décrit 25 précédemment est caractérisé en ce que l'étape (3) comprend les sous-étapes suivantes : (a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), (b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, 30 (c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration, (d) mesurer l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle correspondante mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt. Un mode de réalisation particulier de l'invention concerne un procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes suivantes : (A) une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, comprenant les étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt, (3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire, (B) mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré comme décrit à l'étape (2), reporter cette valeur de fluorescence dans une droite de corrélation obtenue comme décrit à l'étape (A), et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt, les étapes (A) et (B) étant susceptibles d'êtres mises en oeuvre par des opérateurs différents et/ou séparément dans le temps. De manière particulière, le procédé tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que l'étape (A)(3) comprend les sous-étapes suivantes : (a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), (b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration, (d) mesurer l'intensité de fluorescence associée à chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt. Une caractéristique de l'invention est que l'étape consistant à établir la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt et l'étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt sont susceptibles d'être mises en oeuvre de manière séparée dans le temps et par des opérateurs différents. En effet, l'étape consistant à établir la droite de corrélation doit être établie spécifiquement pour chaque molécule d'intérêt, mais une fois que cette droite de corrélation est établie, celle-ci est directement utilisable pour mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt chez n'importe quel patient, afin de pouvoir calculer la valeur additionnelle liée à l'accumulation de ladite molécule. Ainsi, en pratique, dans une majorité des cas, l'opérateur ne mettra en oeuvre que l'étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt par mesure de fluorescence et report sur la droite de corrélation. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, l'opérateur dispose d'un catalogue de droites de corrélation établies selon le procédé de l'invention pour toute une série de molécules. Ce catalogue peut se présenter sous forme papier, mais également sous forme numérique, notamment sous forme de logiciel. Le logiciel peut être installé sur une station informatique d'interprétation des données du cytomètre en flux et permettre de reporter directement les valeurs mesurées par le cytomètre en flux sur la droite de corrélation adéquate et de fournir ainsi à l'opérateur la valeur de concentration intracellulaire en molécule d'intérêt. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'établissement de la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un processus en deux étapes. Une première étape, réalisée à l'aide d'un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, consiste à établir une première droite de corrélation (Droite de Corrélation 1 ou DC1) entre l'intensité de fluorescence intra cellulaire et la concentration de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire. La deuxième étape consiste à établir une droite de corrélation (Droite de Corrélation 2 ou DC2) entre l'intensité de fluorescence induite par ladite molécule d'intérêt et la quantité de ladite molécule dans les cellules. Ainsi, l'invention concerne typiquement un procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes : (A) établir, pour un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, une première droite de corrélation ou DC1 entre l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire et la concentration correspondante de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire, et (B) établir une deuxième droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la concentration correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules. 30 De manière particulière, ce procédé est caractérisé en ce que l'étape (A) comprend les sous étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à la sous étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt dans les cellules, (3) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), (4) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (5) mesurer l'intensité de fluorescence brute (IFB) des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute la valeur de fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (3), l'intensité de fluorescence obtenue correspondant à une fluorescence additionnelle (IFA) proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (6) corréler l'intensité de fluorescence additionnelle (IFA) obtenue mesurée en (5) à la valeur correspondante de concentration de ladite molécule dans le milieu de culture et tracer une droite de corrélation ou DC1 entre l'intensité de fluorescence et la concentration de ladite molécule dans le milieu de culture dudit modèle cellulaire, et l'étape (B) comprend les sous étapes suivantes : (a) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, dans les mêmes conditions qu'à la sous étape (A)(4), (b) récupérer les cellules à chaque concentration, puis les laver et les compter, (c) constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules, (d) lyser les cellules dudit culot puis mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans le lysat cellulaire, (e) extraire la molécule d'intérêt du lysat cellulaire à l'aide d'un solvant approprié, (f) quantifier ladite molécule d'intérêt, (g) corréler les intensités de fluorescence additionnelles mesurées à la sous étape (A)(5) et les quantités intracellulaires mesurées à partir du lysat cellulaire à l'étape (B)(f), et tracer une droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la quantité correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules. L'utilisation de la droite de corrélation DC2 peut alors être validée et l'extrapolation de la quantité de ladite molécule intrinsèquement fluorescente peut être précisée, à partir des valeurs de fluorescence additionnelle (IFA). En effet, la valeur de fluorescence additionnelle lue par le cytomètre correspond à la quantité de molécule présente dans la cellule selon la droite de corrélation DC2 ; il suffit donc de reporter la valeur de l'IFA sur l'axe correspondant pour lire la quantité de ladite molécule sur l'autre axe. Ainsi, le report de l'intensité de fluorescence sur la DC2 permet d'évaluer directement la quantité de ladite molécule d'intérêt, sans obligation à chaque fois de réaliser le dosage de la molécule par méthode classique (HPLC...). Par ailleurs, selon l'invention, les étapes consistant à établir la DC1 et l'étape consistant à établir la DC2 sont susceptibles d'être mises en oeuvre de manière séparée dans le temps et par des opérateurs différents. Dans un mode réalisation particulier de l'invention, le procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente tel que décrit précédemment est caractérisé en ce que ladite droite de corrélation est établie conformément au procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt tel que défini précédemment. Les procédés selon l'invention tels que décrits précédemment présentent l'avantage majeur de permettre une mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt directement dans une cellule vivante, sans dénaturation ou traitement préalable. Un tel avantage est considérable puisque la concentration intracellulaire mesurée avec le procédé selon l'invention reflète de manière fidèle l'état in situ des cellules testées. Un autre avantage est de pouvoir délimiter sur des critères morphologiques simples une population d'intérêt au sein d'une population cellulaire, sans séparation préalable. Encore un autre avantage est de pouvoir réaliser, en même temps que la mesure de la fluorescence des cellules, un immunophénotypage capable d'identifier des cellules exprimant un ou des antigènes particuliers (ex : cellules CD34+). Par ailleurs, un autre avantage de ce procédé est qu'il s'applique à tout type de molécule d'intérêt, à l'unique condition que cette molécule soit intrinsèquement fluorescente, c'est-à-dire qu'elle possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Particulièrement, une molécule fluorescente selon l'invention fluoresce dans la gamme spectrale allant de 190nm à 800nm. En pratique, pour déterminer si une molécule est fluorescente, il suffit de déterminer son spectre d'émission et d'absorption comme mentionné à l'étape (1) du procédé de l'invention. Si aucune fluorescence n'est détectée, ou si son spectre de fluorescence est en dehors du spectre de détection du cytomètre en flux, alors cette molécule ne pourra pas être quantifiée avec le procédé de l'invention. Typiquement, cette étape (1) est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre de gamme spectrale comprise entre 190nm à 800nm, particulièrement avec un spectrophotomètre UV-visible de gamme spectrale comprise entre 190nm à 800nm. L'homme du métier est à même de choisir l'appareil le plus approprié en fonction de la molécule étudiée. D'autres exemples non limitatifs de spectrophotomètres convenant à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sont les spectrophotomètres UV-visible mono ou double faisceaux, possédant une gamme spectrale de 190 nm à 3200 nm environ, particulièrement de 190 nm à 1100 nm. D'autres avantages du procédé selon l'invention sont sa rapidité et sa reproductibilité. En effet, une fois que la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt est établie, les mesures de concentrations intracellulaires de cette molécule dans les échantillons est extrêmement rapide, et cela grâce à la rapidité d'acquisition des données du cytomètre en flux. Par ailleurs, aucun marquage biologique ni traitement préalable de la cellule n'est nécessaire puisque la technique est basée sur la fluorescence naturelle de la molécule d'intérêt. De plus, selon l'invention, l'étape des procédés tels que décrits précédemment consistant à paramétrer un cytomètre en flux, comprend en particulier de standardiser les réglages de l'appareil. Une telle standardisation permet d'évaluer la fluorescence liée à la présence de la molécule d'intérêt dans les mêmes conditions quelles que soient les cellules, le moment de l'expérience et le cytomètre en flux utilisé. Pour standardiser le cytomètre en flux, on peut notamment utiliser des billes de latex calibrées pour la fluorescence de la molécule d'intérêt. L'analyse systématique des billes et le réglage du cytomètre pour que l'intensité de fluorescence des billes soit identique d'une expérience à l'autre, permet de s'affranchir des variations liées à la technique. Cette technique de standardisation est réalisable en routine par l'homme du métier. L'homme du métier est par ailleurs libre de choisir une autre méthode permettant de standardiser le cytomètre en flux. Par ailleurs, selon l'invention, l'homme du métier est à même de choisir le modèle de cytomètre en flux le plus adapté à la fluorescence de la molécule d'intérêt qu'il souhaite étudier. Un exemple de cytomètre convenant à la mise en oeuvre de l'invention est le cytomètre Coulter EPICS EliteTM Selon l'invention, l'étape consistant à mesurer la fluorescence des cellules dudit échantillon dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt, est réalisée en préparant les cellules de manière à obtenir une suspension cellulaire, c'est-à-dire des cellules individualisées en suspension dans une solution. Cette suspension cellulaire peut être réalisée à l'aide de toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par séparation sur ficoll (cellules sanguines ou médullaires), immunosélection, trypsination (cellules adhérentes) ou dilacération de tissus (dissociation mécanique associée à une digestion enzymatique) Si nécessaire, un immunophénotypage classique peut être réalisé et permettre d'étudier une sous-population d'intérêt dans une population cellulaire donnée. Cette approche nécessite l'installation du laser UV en décalé par rapport aux autres lasers du cytomètre. Dans les procédés de l'invention, l'étape comprenant de mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, comprend typiquement d'incuber une suspension du modèle cellulaire avec différentes concentrations de molécule d'intérêt, éventuellement pendant différents temps d'incubation, ou d'incuber une suspension du modèle cellulaire pendant différents temps d'incubation dans une même concentration de molécule d'intérêt, le temps d'incubation étant proportionnel à la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt. Le nombre de cellules incubées ou densité cellulaire de la suspension, exprimé par exemple en cellules/mL, convenant à cette incubation peut être déterminé en routine par l'homme du métier, ce nombre dépendant de chaque modèle cellulaire. Une concentration cellulaire convenable permet typiquement d'assurer la survie des cellules dans le milieu d'incubation et de conserver une autofluorescence stable des cellules au cours du temps. Par exemple et de manière non limitative, la concentration cellulaire est comprise entre 50.000 cellules/mL et 1.106 cellules/mL. Par ailleurs, dans les procédés de l'invention, l'étape comprenant de mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans les cellules est typiquement réalisée en suivants les étapes suivantes : récupérer les cellules, les laver puis les compter, constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules, lyser les cellules dudit culot, extraire la molécule d'intérêt du lysat à l'aide d'un solvant approprié, puis quantifier la molécule d'intérêt ainsi extraite par une méthode connue de l'homme du métier, comme notamment par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance). Les procédés selon l'invention tels que décrits précédemment possèdent de nombreuses applications dans les domaines de la biologie cellulaire, la microbiologie, la médecine humaine et vétérinaire, la biologie environnementale, etc. En effet, dans tous ces domaines scientifiques, la mesure d'une concentration intracellulaire peut avoir des applications importantes, notamment diagnostiques, pronostiques, ou descriptives. Un exemple d'application du procédé de l'invention est par exemple la mesure de la quantité intracellulaire d'un xénobiotique afin de détecter un éventuel risque de toxicité. Des exemples de xénobiotiques sont les pesticides, les médicaments, les polluants, etc. Par ailleurs, les médecins cherchent à optimiser la prise en charge des patients en personnalisant l'adaptation des doses de médicaments. En effet, il est bien connu que différents patients peuvent réagir différemment à un même médicament pour des raisons diverses, notamment liées au patrimoine génétique et à l'environnement du patient. Les médecins devraient donc pouvoir adapter chaque traitement à chaque patient ; ainsi, de plus en plus, sont développés des tests diagnostics ou pronostic permettant de comprendre la qualité de la réponse de la maladie et/ou les effets secondaires. Cependant, peu de biomarqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie sont actuellement disponibles. Par ailleurs, au vu des coûts de plus en plus élevés des nouvelles molécules mises sur le marché, il devient fondamental pour les médecins de disposer d'outils permettant d'éviter toute prescription médicamenteuse inutile car inadaptée. Une des caractéristiques essentielles pour déterminer l'efficacité d'un médicament chez un patient est de mesurer la quantité de ce médicament effectivement délivré à sa cible. De nombreuses méthodes proposent de mesurer le taux plasmatique du médicament. Cependant, une telle mesure n'est pas suffisante pour déterminer si le médicament a bien été délivré jusqu'aux cellules cibles. En effet, pour une même dose de médicament, le taux plasmatique peut varier non seulement significativement d'un patient à l'autre mais également pour un même patient au cours du traitement. Ainsi, le moyen le plus approprié pour savoir si un médicament a effectivement été délivré à sa cible est de mesurer la quantité intracellulaire dudit médicament dans les cellules cibles. Or, les méthodes connues jusqu'à aujourd'hui ne permettent pas de mesurer la quantité intracellulaire d'un médicament dans des cellules vivantes issues du patient. En effet, actuellement, pour connaître une quantité intra-cellulaire d'un médicament, il est nécessaire de lyser au préalable les cellules pour pouvoir mesurer la quantité moyenne de médicament pour un nombre de cellules donné. Ce type de technique comporte de nombreux désavantages : longue à mettre en oeuvre, peu reproductible et réalisée sur des cellules mal identifiées (mélange des cellules cibles et de cellules normales) et sur du matériel dénaturé non vivant et donc ne reflétant pas l'état in vivo/in situ des cellules. Un exemple d'application du procédé selon l'invention concerne donc la mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt, dans une population cellulaire vivante issue du patient. L'évaluation de la quantité intra-cellulaire du médicament peut-être directement corrélée à la réponse de la maladie et/ou aux effets secondaires. Ainsi, une application de l'invention concerne un procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente susceptible d'être utilisée dans une méthode de traitement dudit patient, comprenant une étape consistant à mesurer in vitro la cinétique d'accumulation intracellulaire de la molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient au cours du temps pour différentes concentrations de molécule d'intérêt, la mesure de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt étant réalisée selon l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment. Cette mesure de la cinétique d'accumulation intracellulaire permet de déterminer une concentration maximale d'accumulation de la molécule d'intérêt dans les cellules. La cinétique d'accumulation et la quantité maximale de ladite molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon constituent deux paramètres prédictifs de résistance au traitement. Ces paramètres doivent être évalués dans chaque système impliquant une molécule donnée et/ou un type cellulaire donné. Par ailleurs, ces mêmes paramètres appliqués à des cellules normales (non malades) pourraient constituer un paramètre prédictif de toxicité (ou effet secondaire) de la molécule d'intérêt. Une autre application de l'invention concerne un procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, ledit patient étant en cours de traitement par ladite molécule d'intérêt, comprenant une étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient selon l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment, l'absence de molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un paramètre indicatif de résistance du patient à ladite molécule d'intérêt, la présence de molécule d'intérêt dans les cellules de l'échantillon dans une quantité supérieure à une concentration maximale seuil étant quant à elle un paramètre indicatif de toxicité (ou effet secondaire) de ladite molécule d'intérêt. Par ailleurs, lesdites concentrations minimale et maximale seuils dépendent de chaque molécule d'intérêt étudiée et de chaque type de cellule (de chaque échantillon). Selon chaque traitement et chaque maladie, l'homme du métier est apte à déterminer ces concentrations. Encore une autre application de l'invention concerne un procédé de suivi d'un patient traité par une molécule d'intérêt fluorescente comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, à différentes phases du traitement, la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt dans des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient à l'aide de l'un quelconque des procédés tels que définis précédemment, et (2) comparer les taux intracellulaire de la molécule d'intérêt aux différentes phases du traitement. Un tel procédé permet notamment d'évaluer les conséquences d'un changement de dose de molécule d'intérêt sur la concentration intracellulaire. En pratique, grâce à la méthode de suivi de la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt fluorescente selon l'invention, le médecin est à même d'ajuster les doses de molécule d'intérêt à administrer au patient. En particulier, si le suivi du patient au cours du temps révèle une diminution de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt alors que les doses de molécules d'intérêt administrées sont restées identiques, le médecin peut prendre la décision d'augmenter les doses de cette molécule d'intérêt pour rétablir un taux intracellulaire de molécule d'intérêt suffisant pour obtenir l'effet escompté. Selon un mode de réalisation de l'invention, les procédés tels que décrits précédemment sont caractérisés en ce que, de manière simultanée, séparée ou séquentielle, est mis en oeuvre un procédé consistant à mesurer le taux plasmatique de ladite molécule d'intérêt. La mesure du taux plasmatique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par HPLC, comme notamment décrit dans le document WO 2008/036792. Selon l'invention, on entend par � échantillon � tout type de prélèvement contenant des cellules individualisables et viables. Ces échantillons peuvent être prélevés chez l'homme, chez l'animal ou chez un végétal, mais également dans le milieu naturel, lorsqu'il s'agit de prélever par exemple des microorganismes (dans le sol, dans l'eau, dans l'air...). Un échantillon selon l'invention peut également être tout type de lignée de cellules utilisée en laboratoire. Des exemples d'échantillons prélevés chez l'homme ou l'animal sont typiquement les échantillons biologiques ou biopsies, incluant par exemple les biopsies d'organes, de tumeurs, notamment les tumeurs intestinales, les ganglions lymphatiques, la moelle osseuse hématopoïétique, les échantillons de sang, à la condition que les cellules prélevées soient individualisables. Une méthode classique pour individualiser les cellules d'un échantillon, c'est-à-dire rompre les contacts entres les cellules et/ou leur matrice, est un traitement à la trypsine. Toute autre méthode connue de l'homme du métier (dissociation mécanique associée à une digestion enzymatique) est également envisageable, dans la mesure où les cellules des échantillons se trouvent alors sous la forme de suspensions cellulaires, prêtes à être analysées par cytomètre en flux. Toujours selon l'invention, par � patient � on entend un humain ou un animal, en particulier un mammifère. Dans un autre aspect, l'invention concerne tout particulièrement l'utilisation du procédé tel que décrit précédemment pour l'optimisation du traitement de patients atteints de Leucémie Myéloïde Chronique (LMC). Dans la LMC, une translocation réciproque entre les chromosomes 9 et 22 (nommée t(9;22)(g34;g11) ou chromosome de Philadelphie) dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) induit la formation d'un gène hybride Bcr-Abl. Ce gène de fusion code pour une protéine chimérique possédant une tyrosine kinase constitutivement active, qui induit une dérégulation de la prolifération des CSH, produisant l'envahissement de la moelle osseuse et du sang de granulocytes proliférant de manière non contrôlée. En mai 2001, le sel de mésylate du N-{5-[4-(4-méthyl-pipérazino-méthyl)-benzoylamido]-2-méthylphényl}-4- (3-pyridyl)-2-pyrimidine-amine (Imatinib mesylate, STI571, Glivec�) a été approuvé par la FDA pour le traitement de la LMC ; il appartient à la classe des inhibiteurs de tyrosine kinase, ou ITK. L'Imatinib est donc la première thérapie ciblée par rapport à une anomalie moléculaire caractérisant un cancer. Ce traitement a permis une amélioration considérable du taux de survie des patients. En effet, une étude récente a montré que 89% des patients ayant reçu de l'Imatinib comme médicament de première ligne ont survécus (Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al., New Eng J Med 2006; 355:2408-17).Pour autant, un certain nombre de patients présente des réponses insatisfaisantes à l'Imatinib, ce qui a justifié le développement d'autres ITK (appelés ITK de seconde génération). Les résistances et les intolérances à l'imatinib restent mal comprises. Deux paramètres biologiques sont aujourd'hui disponibles pour tenter d'expliquer un cas de réponse non satisfaisante : 1) la présence d'une mutation ponctuelle de la molécule BCR-ABL, gênant ou empêchant la fixation de l'imatinib sur sa molécule cible ; ce mécanisme ne concerne qu'une minorité des cas de résistance à la phase chronique (Jabbour et al., 2006 20 :1767-73) ; 2) le taux plasmatique d'Imatinib. En effet, il semble exister une relation entre le taux plasmatique de l'imatinib et la qualité de la réponse de la LMC, suggérant d'utiliser ce paramètre pour adapter le traitement. (Mahon et al., Blood. 106(11,Part 1) Nov. 16 2005. 565A ; Peng B. et al, J. Clin. Oncol. 2004, 22, 935-942). Ainsi, le document WO2008/036792 propose une méthode de traitement basé sur l'adaptation du taux plasmatique d'Imatinib pour améliorer la réponse des patients traités. Cependant, il existe une grande hétérogénéité des valeurs des taux plasmatiques avec une même dose d'imatinib, et un chevauchement important des valeurs des groupes de réponse. De plus, on observe une variabilité importante chez un même patient, sans explication satisfaisante. C'est pourquoi il est très difficile de prendre une décision à partir du taux plasmatique d'imatinib d'un patient donné, alors qu'une différence statistique a été observée de part et d'autre d'un seuil de 1000 ng/mL. Ainsi, ces mesures n'ont pas suffit à élucider les mécanismes de résistance des patients à l'Imatinib. Une telle mesure ne permet pas de savoir si l'Imatinib a bien été délivré aux cellules cibles, en particulier au niveau des granulocytes malins, une inconnue qui pourrait expliquer certains cas de résistance à taux plasmatique satisfaisant. Ainsi, le moyen le plus approprié pour savoir si l'Imatinib a effectivement été délivré à sa cible serait de mesurer la quantité intracellulaire d'Imatinib dans les cellules cibles. Malheureusement, les méthodes connues jusqu'à aujourd'hui ne permettent pas de mesurer la quantité intracellulaire d'un médicament dans des cellules vivantes. La seule méthode fiable est l'utilisation d'imatinib marqué au 14C, inutilisable chez l'homme. Une méthode alternative consiste, comme expliqué précédemment, à lyser préalablement les cellules cibles en laboratoire puis à mesurer la quantité de la molécule d'intérêt dans le lysat notamment par HPLC. Ce type de technique comporte de nombreux désavantages : longue à mettre en oeuvre, peu reproductible et réalisée sur du matériel dénaturé non vivant, comprenant un mélange variable de cellules leucémiques ou cibles et de cellules normales, et donc ne reflétant pas l'état des cellules cibles in vivo/in situ. Un objet de la présente invention propose donc d'appliquer les procédés tels que décrits 30 précédemment au traitement de la LMC. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les procédés tels que décrits précédemment sont caractérisés en ce que ledit patient est un patient atteint d'une LMC. De même, selon ce mode de réalisation, dans les procédés tels que décrits précédemment, lesdites cellules dont on mesure la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente sont des cellules d'un échantillon obtenu chez un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC). Par ailleurs, de manière particulière, ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK). Les caractéristiques de mise en oeuvre de ces procédés particuliers appliqués aux ITK sont telles que décrites précédemment pour les procédés généraux et ne sont donc pas répétées ici. En plus des procédés décrits précédemment et appliqués aux ITK, l'invention concerne également un procédé particulier, intitulé "test fonctionnel". Ce procédé permet de déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, et avant même le début du traitement, si celui est sensible à un ITK particulier. Un tel procédé permet au médecin d'éviter de commencer un traitement inefficace et de sélectionner en amont la ou les ITK les mieux adaptés au patient. Ce mode de réalisation concerne donc un procédé pour déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, la sensibilité de ladite LMC à un ITK, comprenant les étapes suivantes : (1) incuber in vitro des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient avec différentes concentrations dudit ITK, et (2) mesurer à l'aide d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6 la quantité intracellulaire en ITK présente dans les cellules incubées en (1), l'absence dudit ITK dans les cellules ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un indice de résistance du patient audit ITK, la présence dudit ITK au-delà de ladite concentration minimale seuil étant indicative d'une sensibilité de la LMC audit ITK.De manière particulière, les cellules dudit échantillon obtenu chez le patient atteint de LMC sont des cellules de la lignée neutrophile. Toujours en plus des procédés décrits précédemment et appliqués aux ITK, l'invention concerne également un autre procédé particulier, appliqué au suivi des patients atteints de LMC au cours de leur traitement. En effet, une fois la thérapie mise en place par le médecin, il est très important d'assurer un suivi du patient pour s'assurer de la bonne réponse au traitement du patient dans la durée. Ainsi, l'invention concerne également un procédé de suivi d'un patient atteint de LMC et traité par un ITK, comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, avant le début du traitement, la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, cette valeur correspondant à la 10 fluorescence non spécifique des cellules de l'échantillon étudiée, (2) mesurer à différentes phases du traitement la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, lesdites cellules dudit échantillon étant cytologiquement équivalentes aux cellules de l'échantillon obtenu en (1), (3) soustraire à la valeur de fluorescence mesurée en (2) la valeur de fluorescence 15 non spécifique mesurée en (1) et obtenir une valeur de fluorescence résiduelle, (4) reporter la valeur de fluorescence résiduelle obtenue en (3) sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence induite par ledit ITK et la quantité dudit ITK dans les cellules, ladite droite ayant été obtenue selon un procédé tel que décrit précédemment, et lire la quantité intracellulaire en ITK à chaque 20 phase du traitement. Par des cellules � cytologiquement équivalentes � on entend des cellules de même origine et de même lignée. Plus particulièrement, ces cellules sont à un même stade de différenciation. Selon ce procédé particulier de l'invention, l'étape (3) permettant d'obtenir une valeur 25 de fluorescence résiduelle permet d'évaluer de manière précise la fluorescence liée à la seule présence de l'ITK. Le médecin ou le technicien, au vu de l'évolution des quantités intracellulaires d'ITK au cours du temps, va pouvoir par exemple augmenter la posologie de l'ITK puis vérifier si cette augmentation de dose a permis d'augmenter la quantité de ladite 30 molécule dans les cellules cibles. Dans les procédés appliqués aux ITK selon l'invention, le modèle cellulaire utilisé pour établir la ou les droites de corrélation est notamment la lignée cellulaire K562 (Lozzio and Lozzio, 1975). Selon ce mode réalisation, on utilise typiquement une suspension de cellules K562 dans une concentration de l'ordre de 150.000 cellules/mL, densité cellulaire correspondant à la phase exponentielle de croissance pour cette lignée. Par ailleurs, de manière particulière, l'étape des procédés tels que décrits précédemment consistant à mettre en contact les cellules dudit échantillon avec différentes concentrations de molécule d'intérêt est caractérisé en ce que, lorsque la molécule d'intérêt est un ITK, l'on met en contact pendant différentes durées d'incubation (5, 15, Toujours dans les procédés appliqués aux ITK selon l'invention, ledit échantillon du patient atteint de LMC est typiquement un échantillon de sang, de moelle osseuse, ou de ganglion. Plus particulièrement, les cellules de l'échantillon sont des cellules granulocytaires correspondant à la lignée hématopoïétique leucémique. Si les cellules prélevées ne sont pas individualisées dans leur état natif, alors ces cellules sont préalablement individualisées comme décrit précédemment et une suspension cellulaire est préparée pour l'analyse au cytomètre en flux. Encore selon cette application particulière, les différentes phases du traitement auxquelles peuvent être réalisées une mesure de la concentration intracellulaire en ITK sont par exemple : - après 14 jours de traitement (J14) - après un mois (30 jours) de traitement (M1), - après trois mois de traitement (M3), - après 6 mois de traitement (M6), - après 12 mois de traitement (M12), et/ou - après 18 mois de traitement (M18). 30, 60, 120 ... minutes) les cellules K562 avec différentes concentrations (0, 0.2, 1, 5, 25, 50, 125 ....�M) d'ITK.30 Pour disposer d'éléments complémentaires permettant de comprendre les mécanismes de pénétration des ITK dans les cellules cibles, la quantification de l'ITK intracellulaire selon l'invention peut être associée à : (1) une mesure du taux plasmatique en ITK. La mesure du taux plasmatique peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, en particulier par HPLC, comme notamment décrit dans le document WO 2008/036792. De manière particulière, la mesure du taux plasmatique d'ITK est réalisée aux mêmes phases du traitement que la mesure de la concentration intracellulaire, à savoir durant les premiers jours du traitement, par exemple le jour même du début du traitement ou le lendemain du début du traitement, à J14, Ml, à M3, à M6, à m12 et/ou à M18 ; et/ou à (2) une évaluation de l'expression et/ou de l'activité des pompes membranaires. L'expression peut être évaluée au niveau transcriptomique (qRT-PCR), protéomique (western blot et /ou cytométrie en flux) ; l'activité des pompes s'étudie notamment sur les cellules vivantes, en présence d'un substrat et d'inhibiteurs choisis permettant d'évaluer les fonctions d'influx et d'efflux. Selon l'invention, on entend par � ITK � ou � inhibiteur de tyrosine kinase � des composés organiques permettant d'inhiber une protéine tyrosine kinase et en particulier la protéine tyrosine kinase Bcr-Abl. De manière particulière, les ITK selon l'invention possédent une valeur d'IC50 inférieure à 0,1�M mesurée par exemple avec le test décrit par B.J. Druker dans Nat. Med. 1996, 2, 561-566. Un exemple d'ITK conforme à l'invention est l'Imatinib et ses sels pharmaceutiquement actifs, plus particulièrement l'Imatinib mésylate (STI571, Glivec�). D'autres exemples non limitatifs d'ITK sont le dasatinib, l'erlotinib, le gefitinib, le lapatinib, le nilotinib, le sunitinib et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. D'autres aspects et avantages de la présente invention sont décrits dans les figures et exemples suivants, qui doivent être considérés à titre illustratif et comme ne limitant pas la portée de l'invention. Figures30 Fig. 1 : Schéma présentant les principales étapes d'un procédé selon l'invention. A : les cellules d'un échantillon sont incubées avec différentes concentrations de molécule d'intérêt et la fluorescence des cellules est mesurée à l'aide d'un cytomètre en flux. B : Une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence (unités de fluorescence) et la concentration en molécule d'intérêt dans le milieu d'incubation est établie (DC1). C : Pour chaque concentration de molécule d'intérêt dans le milieu, des cellules sont prélevées puis lysées, et la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt est mesurée par HPLC à partir du lysat. Une droite de corrélation entre la concentration intracellulaire en molécule d'intérêt et l'intensité de fluorescence est alors établie (DC2). Fig. 2 : Mesure de l'autofluorescence des différentes populations cellulaires de la lignée cellulaire K562 (unités de fluorescence en fonction du temps). Fig. 3-5 : Cinétique de pénétration de l'Imatinib Mésylate dans les différentes populations cellulaires de la lignée cellulaire K562 (unités de fluorescence en fonction du temps). Fig. 6 : Relation entre les valeurs de fluorescence et la concentration en Imatinib initialement déposée dans le milieu de culture. Fig. 7: Influence de l'anticoagulant (EDTA, héparinate de lithium) sur l'autofluorescence des cellules. Exemples Un exemple de réalisation du procédé de l'invention est décrit ci-après. Les inventeurs ont mesuré la quantité intracellulaire d'un inhibiteur de tyrosine kinase, l'Imatinib (Novartis Pharma), thérapie ciblée adaptée au mécanisme physiopathologique de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC). Cette molécule est disponible depuis 2001, son dosage plasmatique est réalisable en routine, et il existe des lignées cellulaires issues de clones de LMC sensibles à l'Imatinib. 1. Etablissement du spectre de l'Imatinib On a réalisé le spectre d'absorption de l'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau à l'aide 30 d'un spectrophotomètre BIOWAVE II. Les résultats montrent une absorbance maximale à 258 nm. On a également réalisé le spectre d'émission de l'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau à l'aide d'un spectrophotomètre BIOWAVE II. Les résultats montrent une émission maximale à 412 nm. 2. Evaluer la capacité à détecter en Cytométrie en Flux la fluorescence UV en utilisant les caractéristiques déterminées en 1) L'Imatinib Mésylate est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK) intrinsèquement fluorescent dans l'UV ; il est donc possible de suivre son accumulation dans la cellule par la technique de cytométrie en flux. Une quantification directe de la quantité d'Imatinib présent dans le compartiment intracellulaire peut alors être réalisée, celle-ci étant proportionnelle à la quantité de lumière émise par chaque cellule. Cependant, il existe une fluorescence intrinsèque propre à chaque cellule. Il est donc préférable de connaître, pour chaque population cellulaire, la quantité de lumière émise naturellement. Ainsi, la différence d'unités de fluorescence cellules traitées/cellules témoins sera proportionnelle à la quantité de molécules ayant pénétré dans la cellule. 2.1 Etudier l'effet-dose avec un modèle de lignée cellulaire Le modèle de choix utilisé pour la mise au point de la détection de l'Imatinib Mésylate intracellulaire chez les patients atteints de LMC est la lignée cellulaire K562 (Lozzio and Lozzio, 1975). Elle présente des avantages suivants : (i) lignée d'origine humaine positive pour le chromosome de Philadelphie et (ii) sensible à l'Imatinib Mésylate (pénétration rapide de la molécule et fixation sur la protéine cible BCR-ABL). 2.1.1. Choix de la concentration cellulaire Une première série d'expérience a permis de choisir la concentration cellulaire la plus adaptée. Différentes concentrations ont été testées : 1.106, 500.000, 250.000 et 150.000 cellules/mL. Pour chaque test, les cellules K562 sont ensemencées la veille de l'expérience dans des flasques 75cm . Un suivi de l'autofluorescence des cellules a ensuite été réalisé au cours du temps. A chaque temps, un aliquote de suspension cellulaire est prélevé et directement placé dans la glace, permettant de ralentir au maximum l'activité cellulaire. La concentration retenue est 150.000 cellules/mL, ce qui permet d'avoir des cellules vivantes pour la plupart actives et dont l'autofluorescence est stable au cours du temps. Aux concentrations élevées, on observe dans nos conditions de culture une perte cellulaire non spécifique significative. Notre procédé permet de différencier les différentes sous-populations cellulaires (� petites �, � moyennes � et � grandes � cellules), Fig. 2, caractéristiques de la lignée K562. 2.1.2. Etablissement d'une cinétique d'accumulation intracellulaire de l'Imatinib dans la lignée cellulaire K562 La veille de l'expérience, les cellules sont ensemencées à raison de 150 000 cellules/ml dans des flasques de 75 cm', ce qui permet d'obtenir le jour de l'expérience des cellules vivantes et pour la plupart actives. Le traitement par l'Imatinib Mésylate est réalisé en introduisant directement dans chaque flasque une fraction d'une solution mère d'Imatinib Mésylate solubilisé dans l'eau. Différentes concentrations ont ainsi été testées (5/10 et 50�M). A chaque temps, un millilitre de suspension cellulaire est prélevé et directement placé dans la glace, permettant de bloquer le métabolisme cellulaire et de diminuer au maximum l'activité des pompes membranaires. La cinétique de pénétration de l'Imatinib Mésylate est ainsi établie en mesurant, à chaque temps (To, l5min, 30min, 1h, 2h et 4h), la quantité de lumière émise dans l'UV par des cellules témoins et des cellules traitées (Fig. 3-5). 2.2. Etablir une relation de proportionnalité entre les unités de fluorescence et la concentration d'Imatinib et standardiser la technique Nous avons tout d'abord standardisé les réglages du cytomètre en flux pour évaluer la fluorescence UV liée à la présence de la molécule cible dans les mêmes conditions quelles que soient les cellules et le moment de l'expérience. La méthode choisie est l'utilisation de billes de latex calibrées pour la fluorescence dans l'UV. En analysant systématiquement les billes et en réglant le cytomètre pour que leur intensité de fluorescence soit identique d'une expérience à l'autre, nous nous affranchissons des variations liées à la technique. A partir des valeurs de fluorescence obtenues au temps 1h (plateau), nous pouvons établir une courbe représentant les valeurs de fluorescence en fonction de la concentration en Imatinib initialement déposée dans le milieu de culture (Fig. 6). En parallèle, un nombre précis de cellules, préalablement incubé en présence d'une concentration définie d'Imatinib durant 30 minutes, est recueilli, lavé avec du PBS pour éliminer l'excès d'Imatinib et lysé. L'Imatinib intracellulaire est ensuite extrait à partir du lysat cellulaire en utilisant un solvant approprié, et dosé par HPLC. Ces valeurs permettent d'établir une droite de corrélation entre la dose et la quantité intracellulaire d'Imatinib. Cette droite de corrélation servira de référence pour les dosages intracellulaires d'Imatinib des cellules des patients. Ainsi, il est possible d'établir la relation entre la valeur de fluorescence et la quantité réelle d'Imatinib intracellulaire (Fig. 1). 3. Etude des conditions pré-analytiques : influence de l'anticoagulant Les cellules (150.000 cellules/mL) sont incubées l5min à température ambiante : - Sans anticoagulant - En présence d'EDTA - En présence d'héparinate de lithium Une fois le temps d'incubation terminé, les cellules sont immédiatement placées dans la glace puis une mesure de l'autofluorescence UV est réalisée (Fig. 7). Contrairement à 1EDTA, l'héparinate de lithium n'influence pas l'autofluorescence des cellules. Les prélèvements des patients atteints de Leucémie Myéloïde Chronique effectués en vue du dosage intracellulaire d'Imatinib sont donc réalisés sur héparinate de lithium. REVENDICATIONS1. Procédé de mesure de la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans des cellules, comprenant les étapes de : mesurer la fluorescence des cellules dont on souhaite connaître la quantité intracellulaire en ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre en flux paramétré avec les spectres d'émission et d'absorption de ladite molécule d'intérêt, cette valeur de fluorescence étant reportée sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt, et lire la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt. 2. Procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à l'étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt, (3) établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt dans un modèle cellulaire. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape (3) comprend les sous- étapes suivantes : (a) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), (b) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (c) mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt pour chaque concentration,(d) mesurer l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à l'étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence l'intensité de fluorescence liée à la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (a), l'intensité de fluorescence résiduelle étant alors proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (e) corréler chaque valeur de concentration intracellulaire de la molécule d'intérêt mesurée en (c) à l'intensité de fluorescence résiduelle correspondante mesurée en (d), et tracer la droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt. 4. Procédé pour établir une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire pour une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, comprenant les étapes suivantes : (A) établir, pour un modèle cellulaire incubé avec différentes concentrations de molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, une première droite de corrélation ou DC1 entre l'intensité de fluorescence des cellules du modèle cellulaire mesurée à l'aide d'un cytomètre en flux et la concentration correspondante de ladite molécule d'intérêt dans le milieu de culture du modèle cellulaire, et (B) établir une deuxième droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la concentration correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape (A) comprend les sous étapes suivantes : (1) déterminer les spectres d'émission et d'absorption de fluorescence de ladite molécule d'intérêt, (2) paramétrer un cytomètre en flux avec les spectres d'émission et d'absorption obtenus à la sous étape (1) de manière à pouvoir détecter spécifiquement ladite molécule d'intérêt dans les cellules, (3) mesurer la fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2),(4) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, (5) mesurer l'intensité de fluorescence brute (IFB) des cellules du modèle cellulaire pour chaque concentration de ladite molécule d'intérêt à l'aide d'un cytomètre paramétré comme décrit à la sous étape (2), retrancher à cette intensité de fluorescence brute la valeur de fluorescence naturelle dudit modèle cellulaire telle que mesurée en (3), l'intensité de fluorescence obtenue correspondant à une fluorescence additionnelle (IFA) proportionnelle à la quantité de ladite molécule d'intérêt ayant effectivement pénétré dans la cellule, (6) corréler l'intensité de fluorescence additionnelle (IFA) obtenue mesurée en (5) à la valeur correspondante de concentration de ladite molécule dans le milieu de culture et tracer une droite de corrélation ou DC1 entre l'intensité de fluorescence et la concentration de ladite molécule dans le milieu de culture dudit modèle cellulaire, et l'étape (B) comprend les sous étapes suivantes : (a) mettre en contact le modèle cellulaire avec différentes concentrations de ladite molécule d'intérêt, dans les mêmes conditions qu'à l'étape (A)(4), (b) récupérer les cellules à chaque concentration, puis les laver et les compter, (c) constituer un culot cellulaire contenant un nombre fixe de cellules, (d) lyser les cellules dudit culot puis mesurer la quantité intracellulaire de molécule d'intérêt dans le lysat cellulaire, (e) extraire la molécule d'intérêt du lysat cellulaire à l'aide d'un solvant approprié, (f) quantifier ladite molécule d'intérêt, (g) corréler les intensités de fluorescence additionnelles mesurées à l'étape (A)(5) et les quantités intracellulaires mesurées à partir du lysat cellulaire à l'étape (B)(f), et tracer une droite de corrélation ou DC2 entre l'intensité de fluorescence des cellules et la quantité correspondante de ladite molécule dans lesdites cellules. 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence et la concentration intracellulaire de ladite molécule d'intérêt est établie selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2-5. 7. Procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente susceptible d'être utilisée dans une méthode de traitement dudit patient, comprenant une étape consistant à mesurer in vitro la cinétique d'accumulation intracellulaire de la molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient au cours du temps pour différentes concentrations de molécule d'intérêt, la mesure de la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt étant réalisée selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6. 8. Procédé pour évaluer la sensibilité d'un patient à une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente, ledit patient étant en cours de traitement par ladite molécule d'intérêt, comprenant une étape consistant à mesurer la quantité intracellulaire en molécule d'intérêt dans les cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient selon le procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6, l'absence de molécule d'intérêt dans les cellules dudit échantillon ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un paramètre indicatif de résistance du patient à ladite molécule d'intérêt, la présence de molécule d'intérêt dans les cellules dudit échantillon dans une quantité supérieure à une concentration maximale seuil étant quant à elle un paramètre indicatif de toxicité ou d'un effet secondaire de ladite molécule d'intérêt. 9. Procédé de suivi d'un patient traité par une molécule d'intérêt fluorescente comprenant les étapes suivantes : (1) mesurer, à différentes phases du traitement, la quantité intracellulaire de la molécule d'intérêt dans des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient à l'aide du procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6, et (2) comparer les taux intracellulaire de la molécule d'intérêt aux différentes phases du traitement. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7-9, caractérisé en ce que ledit patient est un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC). 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 6, 7-10, caractérisé en ce qu'il est associé, de manière simultanée, séparée ou séquentielle, à un procédé consistant à mesurer le taux plasmatique de ladite molécule d'intérêt. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 6, caractérisé en ce que lesdites cellules dont on mesure la quantité intracellulaire d'une molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente sont des cellules d'un échantillon obtenu chez un patient atteint d'une leucémie myéloïde chronique (LMC). 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite molécule d'intérêt intrinsèquement fluorescente est un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK). 14. Procédé pour déterminer, chez un patient atteint d'une LMC, la sensibilité de ladite LMC à un ITK, comprenant les étapes suivantes : (1) incuber in vitro des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient avec différentes concentrations dudit ITK, et (2) mesurer à l'aide d'un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 ou 6 la quantité intracellulaire en ITK présente dans les cellules incubées en (1), l'absence dudit ITK dans les cellules ou sa présence dans une quantité inférieure à une concentration minimale seuil étant un indice de résistance du patient audit ITK, la présence dudit ITK au-delà de ladite concentration minimale seuil étant indicative d'une sensibilité de la LMC audit ITK. 15. Procédé de suivi d'un patient atteint de LMC et traité par un ITK, comprenant les étapes suivantes :(1) mesurer, avant le début du traitement, la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, cette valeur correspondant à la fluorescence non spécifique des cellules de l'échantillon étudiée, (2) mesurer à différentes phases du traitement la fluorescence des cellules d'un échantillon obtenu chez ledit patient, lesdites cellules dudit échantillon étant cytologiquement équivalentes aux cellules de l'échantillon obtenu en (1), (3) soustraire à la valeur de fluorescence mesurée en (2) la valeur de fluorescence non spécifique mesurée en (1) et obtenir une valeur de fluorescence résiduelle, (4) reporter la valeur de fluorescence résiduelle obtenue en (3) sur une droite de corrélation entre l'intensité de fluorescence induite par ledit ITK et la quantité dudit ITK dans les cellules, ladite droite ayant été obtenue selon un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2-5, et lire la quantité intracellulaire en ITK à chaque phase du traitement. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce la quantification de l'ITK intra-cellulaire est associée à une mesure du taux plasmatique d'ITK et/ou à une évaluation de l'expression et/ou de l'activité des pompes membranaires. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13-16, caractérisé en ce que l'ITK est l'Imatinib ou un de ses sels pharmaceutiquement actifs.