Brevet FR2938849A1 — publié le 20100528

PROCÉDÉ ET DISPOSITIF POUR L'ANALYSE GÉNÉTIQUE DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention appartient au domaine de la biologie moléculaire et, plus particulièrement, au domaine de l'amplification des acides nucléiques. La présente invention propose un dispositif miniaturisé, transportable, facile à réaliser et à utiliser et un procédé mettant en oeuvre un tel dispositif, tous deux permettant l'amplification d'acides nucléiques à partir d'échantillons et notamment d'échantillons de faible volume. ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE La technique de réaction en chaîne par polymérase ou technique PCR (pour � Polymerase Chain Reaction �) est une technique de biologie moléculaire permettant l'amplification in vitro de séquences nucléiques. Cette technique basée sur des cycles thermiques avec une étape de dénaturation et une étape d'hybridation-élongation a commencé à être utilisée à la fin des années 80. Elle constitue maintenant une technique classique et incontournable qui s'applique à tous les domaines d'analyse dans lesquels les acides nucléiques jouent un rôle direct ou indirect. Ces domaines englobent notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou 2 tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces... Les outils actuels pour la PCR de routine avec notamment une plaque à puits, un système de chauffage et un système de détection sont relativement encombrants et ne permettent pas de développer des systèmes totalement portables pour l'analyse de terrain. Ils ne permettent pas non plus de développer des systèmes d'analyse très rapides car les matériaux constitutifs tels que le plastique et le volume de chaque analyse souvent de l'ordre de la dizaine de pl entraînent une cinétique, lors des changements de température, incompressible. La recherche dans le domaine de la PCR vise à faire évoluer cette technique vers la miniaturisation aussi bien au niveau de l'échantillon à analyser par PCR qu'au niveau de l'analyse elle-même. En effet, une telle miniaturisation permettrait d'opérer sur des échantillons de très faible volume, d'être moins invasifs lors de leur prélèvement, d'obtenir un procédé plus rapide et d'avoir des outils plus compacts et avantageusement portables pour l'analyse de terrain. Aussi, il existe une forte activité de recherche dans le domaine des microsystèmes pour la PCR. Une telle activité de recherche est notamment développée par la société Fluidigm. De plus, à l'heure actuelle, il est impossible de faire de nombreuses analyses impliquant une PCR à partir d'un même échantillon de volume 3 réduit, à moins de mettre en oeuvre des outils compliqués, lourds à utiliser ou encore en développement, tels que le robot de pipettage MosquitoTM de la société TTP LabTech (Royaume-Uni) et les lames AmpligridTM A480F de la société Advalytix (Allemagne). Seuls les microsystèmes permettent d'envisager les analyses multiples pour un même échantillon de volume réduit mais aucun ne prévoit de phase de pré-enrichissement en acides nucléiques, ce qui peut conduire à des seuils de sensibilité assez mauvais puisque l'échantillon analysé est très petit. La demande internationale WO 02/20845 (Thomas Jefferson University) vise à résoudre ce problème de sensibilité et propose une méthode de PCR en deux étapes permettant d'empêcher la formation de dimères d'amorces (ou � primer-dimer � en anglais). Dans cette méthode, la première étape de pré- amplification présente au plus 10 cycles de dénaturation et d'hybridation-élongation, et met en oeuvre les deux amorces spécifiques de l'acide nucléique à amplifier en une quantité faible (inférieure à 0,0625 pM), alors que la seconde étape d'amplification utilise les mêmes amorces en plus grande quantité et ce, pendant 30 à 35 cycles. Toutefois, le procédé de la demande internationale WO 02/20845 ne s'intéresse qu'au problème de la sensibilité sans aborder le problème des analyses multiples pour un même échantillon de volume réduit. La demande internationale WO 2004/051218 (Applera Corporation) décrit une méthode pour réaliser une PCR en 2 étapes avec une première amplification 4 multiplexe utilisant un ensemble de paires d'amorces permettant d'amplifier différentes séquences polynucléotidiques puis une seconde avec addition de paires d'amorces spécifiques pour une séquence donnée. Le plus gros désavantage de cette méthode réside dans la nécessité d'ajouter des réactifs, voire d'aliquoter le produit de la réaction d'amplification multiplexe et donc d'ouvrir les tubes après cette première phase. Cela présente un risque très fort vis-à-vis des phénomènes de contamination par amplicons qui est bien connu des laboratoires travaillant avec la technique de PCR. Par ailleurs, le cas d'échantillons rares de très petit volume n'est pas visé dans cette demande. La demande internationale WO 2008/106719 (Corbett Research) propose un dispositif et un procédé pour l'amplification d'acide nucléique en deux étapes. Le dispositif présente un ter compartiment pour la 1ère étape d'amplification qui peut être une amplification multiplexe et plusieurs autres compartiments pour la 2nde étape d'amplification. Les échantillons liquides passent du ter compartiment aux autres compartiments par centrifugation, ce ter compartiment étant connecté, directement ou indirectement, aux autres compartiments. Ainsi, la demande internationale WO 2008/106719 résout le problème de la contamination des échantillons en évitant des manipulations entre les deux étapes d'amplification mais le dispositif décrit reste lourd à utiliser et ne peut être portable puisqu'il nécessite des moyens permettant de le centrifuger, de le porter à différentes températures et éventuellement des valves de cire pour interrompre les communications fluidiques entre compartiments. Il existe donc un réel besoin d'un procédé d'amplification de molécules nucléotidiques utilisant 5 un dispositif, avantageusement miniaturisé et transportable, permettant de réaliser un grand nombre d'analyses PCR en parallèle à partir d'un même échantillon tel qu'un échantillon de volume réduit. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention permet de remédier, au moins en partie, aux inconvénients et problèmes techniques listés ci-dessus. En effet, cette dernière propose un procédé et un dispositif d'amplification de molécules nucléotidiques, basés sur l'électromouillage qui permettent de mettre en oeuvre le procédé d'amplification sur le terrain, - de faire un grand nombre d'analyses en parallèle à partir du même échantillon et notamment d'un même � micro-échantillon �, i.e. un échantillon de volume faible ou réduit, et ce, sans perdre en sensibilité. Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé d'amplification d'au moins une molécule nucléotidique contenue dans un échantillon (E) comprenant les étapes successives suivantes consistant à : 6 a) soumettre ledit échantillon (E) à une 'ère étape d'amplification sur une zone (Z1) d'un support ; b) amener par électromouillage au moins une partie de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) de la zone (Z1) sur au moins une zone (Z2) dudit support, distincte de la zone (Z1) ; c) soumettre l'échantillon (Ea) à une 2nde étape d'amplification sur ladite zone (Z2). Par � amplification �, on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien une amplification par réaction en chaîne par polymérase (ou � PCR �) classique que toute variante de PCR connue de l'homme du métier telle qu'une PCR asymétrique, une PCR asymétrique thermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel, une RT-PCR (acronyme anglais pour � Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction �) ou une PCR quantitative. Par � RT-PCR �, on entend une transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase. Une RT-PCR comporte donc deux étapes : une étape de transcription inverse, i.e. de synthèse d'un ADN simple brin complémentaire d'une séquence d'ARN, mettant en oeuvre une transcriptase inverse suivie d'une étape d'amplification en chaîne par polymérase. Par � PCR multiplexe �, on entend une méthode d'amplification visant à amplifier plus d'un amplicon à la fois. Cette technique utilise un ensemble de paires d'amorces d'amplification, chaque paire 7 d'amorces étant conçue ou adaptée pour amplifier une molécule nucléotidique différente. Par � RT-PCR multiplexe �, on entend une PCR multiplexe telle que précédemment définie précédée d'une transcription inverse telle que précédemment définie. Par � PCR en temps réel �, on entend une méthode d'amplification qui permet de détecter et/ou de quantifier la présence des amplicons durant les cycles de PCR notamment grâce à un marqueur fluorescent. L'augmentation des amplicons ou du signal lié à la quantité d'amplicons formés durant les cycles de PCR est utilisée pour la détection et/ou la quantification d'une séquence nucléotidique donnée dans la solution soumise à la PCR. Par � amplicon �, on entend une molécule nucléotidique cible résultant de l'amplification par PCR d'une molécule nucléotidique présente dans l'échantillon (E). La taille des amplicons, dans le cadre de la présente invention, peut être comprise entre 40 et plusieurs milliers de paires de bases (pb), notamment entre 50 et 1000 pb, en particulier, entre 60 et 500 pb et, tout particulièrement, entre 60 et 150 pb. L'expression � molécule nucléotidique � utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : � acide nucléique �, � polynucléotide �, � séquence nucléotidique �, � séquence polynucléotidique �. Par � molécule nucléotidique �, on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un 8 polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; une portion ou un fragment de ceux-ci. L'échantillon (E) mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut être de nature très variée. Cet échantillon (E) est un échantillon d'un élément avantageusement choisi dans le groupe constitué par une solution liquide contenant au moins une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudat racinaire ; une ou plusieurs cellules animales ou végétales ; un tissu animal ou végétal ; une matrice alimentaire ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; etc.... ou un de leurs mélanges. Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout 9 fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'échantillon (E) mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention présente un volume compris entre 0,01 et 1000 pl, notamment entre 0,02 et 500 pl, en particulier, entre 0,05 et 100 pl et, plus particulièrement, entre 0,1 et 20 pl. La quantité de molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E) est très variable : elle peut être comprise entre 1 et 101° molécules nucléotidiques/échantillon (E). Les molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E) peuvent être synthétiques ou naturelles, issues d'un même organisme ou de différents organismes. Le procédé selon la présente invention met en oeuvre un dispositif comprenant : - un support présentant au moins deux zones 25 distinctes (Z1) et (Z2) ; - ladite lere zone (Z1) , ci-après désignée par l'expression � grand réservoir �, étant adaptée pour une première étape d'amplification ; - ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour 30 une seconde étape d'amplification ; 10 des moyens permettant d'amener un fluide de ladite zone Z1 vers ladite zone Z2 par électromouillage. Par conséquent, le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape préalable de fourniture d'un tel dispositif ou de toute variante de ce dispositif qui sera présentée ci-après. Dans le cadre du procédé selon la présente invention et préalablement à l'étape (a) de ce dernier, l'échantillon (E) est mis en contact avec le mélange réactionnel nécessaire à l'amplification de l'étape (a). Le mélange réactionnel mis en oeuvre lors de l'étape (a) peut être tout mélange de réactifs pour PCR disponible dans le commerce tel que les kits vendus par les sociétés Roche Applied Science ou Applied Biosystems. En variante, le mélange réactionnel mis en oeuvre lors de l'amplification de l'étape (a) peut avoir n'importe quelle composition parmi tous les mélanges réactionnels décrits dans l'état de l'art pour la PCR. L'homme du métier saura préparer un tel mélange réactionnel en fonction du type de PCR mis en oeuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention. Le mélange réactionnel comprend un ou plusieurs éléments parmi une polymérase thermostable telle que la Taq polymérase et éventuellement une transcriptase inverse ; un sel tel que du TRIS (pour � trishydroxyméthylaminométhane �), du KC1, du NaCl ou du MgC12 ; des déoxyribonucléotides triphosphates tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; au 11 moins une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, pouvant comprendre de 15 à 35 paires de base ; et éventuellement au moins une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse. En outre, le mélange réactionnel peut contenir d'autres additifs et notamment des additifs connus pour améliorer l'efficacité d'une PCR tels que de la BSA (pour � Bovine Serum Albumin �), de la bétaine, de la formamide, du diméthylsulfoxyde, de l'Acetamide ou Amide C2, du Tween-20, du polyéthylène glycol (PEG) 6000, des protéines telles que la � Single Strand binding protein from E. Coli � commercialisée par Sigma Aldrich (augmentation de la spécificité de la réaction), ou la � T4 Gene32 Protein from E. Coli B infected with phage T4am134/amBL292/amE219 � commercialisée par Roche Applied Science (augmentation du rendement de production des longs produits de PCR, ou le rendement de la réaction en presence d'inhibiteurs tels que l'acide humique), des inhibiteurs de Rnases tels que le � Ribonuclease Inhibitor � ou le Diéthyl pyrocarbonate qui améliorent le rendement de l'étape de transcription inverse lors d'une RT-PCR. Ce mélange réactionnel peut contenir, lorsque l'amplification de l'étape (a) est une RT-PCR multiplexe ou une PCR multiplexe, de 2 à 100 paires d'amorces différentes, chaque paire d'amorces étant spécifique ou dégénérée et pouvant comprendre de 15 à 35 paires de base. 12 Un exemple de mélange réactionnel utilisable pour l'amplification de l'étape (a) du procédé selon la présente invention comprend entre 50 et 100 mM de Tris, entre 10 et 100 mM et, avantageusement, 50 mM de KC1 (ou de NaCl), entre 1 et 5 mM de MgC12, entre 20 pM et 1 mM d'un mélange de dNTP contenant des dCTP, dATP, dTTP, dGTP et éventuellement dUTP, de la Taq Polymérase hot start ou non à 0,1 U/pl, des amorces comprenant entre 15 et 35 paires de bases et pouvant être spécifiques ou dégénérées. Chaque amorce est avantageusement présente, dans ce mélange réactionnel, à une concentration comprise entre 1 et 200 nM et, en particulier, entre 10 et 100 nM. De plus, il a été constaté que les résultats obtenus sont meilleurs lorsqu'il est ajouté, au mélange réactionnel, entre 0,1 à 1 mg/ml de BSA et de la Taq Polymerase en excès par rapport aux recommandations des fournisseurs. A titre d'exemple, dans le cas de la TaqGold ABI, une concentration de 0,5 U/pl est utilisée au lieu de la concentration de 0,1 U/pl recommandée par ABI. L'échantillon (E) qui est électriquement conducteur est amené sur ladite zone (Z1) par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte(s). L'échantillon (E) peut être amené directement sur la zone (Z1) ou sur une zone (Z10) , distincte de (Z1) puis sur la zone (Z1) . La mise en contact entre l'échantillon (E) et le mélange réactionnel préalablement à l'étape (a) du procédé selon l'invention peut se faire de différentes façons : 13 - elle peut avoir lieu préalablement à la disposition de l'échantillon (E) sur la zone (Z1) du support, dans ce cas, c'est l'échantillon (E) associé au mélange réactionnel qui est disposé sur ladite zone (Z1) par électromouillage ; - elle peut avoir lieu sur la zone (Z1) du support, après ou simultanément à la disposition de l'échantillon (E) sur ladite zone (Z1) . Cette dernière mise en oeuvre peut présenter plusieurs variantes. Dans une première variante, le mélange réactionnel est amené, par électromouillage, avantageusement sous forme d'une goutte, jusqu'à la zone (Z1) où il se mélange à l'échantillon (E) par coalescence. Dans cette variante, le mélange réactionnel peut être présent : - soit sur le support et notamment sur une zone (Z3) du support, ladite zone (Z3) étant distincte des zones (Z1) et (Z2) précédemment définies, soit dans un réservoir de mélange réactionnel situé à l'extérieur du dispositif mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, et peut être amené sur le support via un orifice traversant un substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de mélange réactionnel directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Dans une seconde variante, le mélange réactionnel ou du moins certains de ses constituants a(ont) été préalablement séché(s) ou lyophilisé(s) sur 14 la zone (Z1) dudit support, lors de sa fabrication ou suite à cette dernière. Des additifs connus dans l'état de la technique peuvent être mis en oeuvre pour l'étape de séchage ou lyophilisation du mélange réactionnel ou de certains de ses constituants tels que les amorces ou les sondes sur la zone (Z1) du support. Ces additifs sont notamment choisis parmi des sucres ou sucres-alcools tels que le mannitol, le sucrose, le tréhalose, le glucose, etc. ; des polymères tels que du dextran, du PEG, du polyvinylpyrrolidone (PVP) ou de l'acétate de polyvinyle (PVA)... ; ou encore l'EDTA. La quantité de réactifs déposés pour le séchage ou la lyophilisation peut être augmentée pour éviter une perte de réactifs lors de l'amplification de l'étape (a) due à la perte de réactifs sur les surfaces à cause du séchage ou de la lyophilisation. Il a été constaté que, sans augmentation de la quantité de constituants du mélange réactionnel séchés, l'efficacité de l'amplification lors de l'étape (a) est diminuée par rapport à celle obtenue en conditions standards, i.e. sans réactifs séchés. Avantageusement, la quantité des constituants du mélange réactionnel à sécher doit être multipliée par un facteur d'environ 2 par rapport à la quantité utilisée en absence d'une quelconque étape de séchage ou de lyophilisation. Lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention, toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation), connues de l'homme du 15 métier et appropriées au type de PCR utilisé lors de cette étape, sont utilisables. Avantageusement, l'amplification mise en oeuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par une PCR multiplexe et une RT-PCR multiplexe. Cette étape constitue une étape de pré-amplification des molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E). Lors de l'étape (a) du procédé, la PCR multiplexe est effectuée avec une première étape de dénaturation à 95°C, durant de 1 seconde à 10 minutes en fonction de la taille des molécules nucléotidiques présentes dans l'échantillon (E) et de la nature de l'enzyme employée, suivie de 5 à 15, avantageusement, 10 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C durant 1 à 30 secondes et une étape d'hybridationûélongation à une température inférieure, notamment comprise entre 50 et 70°C, avantageusement de 60°C, pendant 5 à 300 secondes et, en particulier, pendant 5 à 30 secondes. Lors de l'étape (a) du procédé et dans le cadre d'une RT-PCR multiplexe, l'étape de transcription inverse peut durer de 5 à 90 minutes à 37°C et les cycles de PCR multiplexe suivant cette 1ere étape peuvent être au nombre de 5 à 20, avantageusement au nombre de 10. Les cycles thermiques lors de la PCR peuvent . - comprendre deux températures avec un palier d'hybridationûélongation compris entre 50 et 70°C, préférentiellement 60°C, maintenu pendant 5 à 16 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes - comprendre trois températures avec un palier d'hybridation compris entre 50 et 65°C, avantageusement de 60°C, maintenu pendant 5 à 300 secondes, un palier d'élongation entre 65°C et 75°C, avantageusement de 72°C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; ou être des cycles � touch clown � consistant à diminuer progressivement la température d'hybridation de 1°C par cycle par exemple. Les températures mises en oeuvre à chaque cycle lors de l'amplification de l'étape (a) du procédé selon l'invention sont atteintes, maintenues et contrôlées en utilisant des moyens permettant de chauffer le support mis en oeuvre et notamment la zone (Z1) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en oeuvre et notamment de la (ou des) zone (s) (Z2) de ce dernier. La concentration pour chaque paire d'amorces pendant les cycles de PCR multiplexe lors de l'étape (a) du procédé est comprise entre 10 et 200 nM, avantageusement de l'ordre de 50 nM, et pourra être différente pour les différentes molécules nucléotidiques à amplifier. Elle pourra notamment être ajustée si cela permet de corriger les biais d'amplification dus aux phénomènes de compétition bien connus pour l'amplification multiplexe. La durée des cycles pourra également être adaptée pour corriger tous 17 les biais de compétition lors de la PCR multiplexe. Le nombre de séquences amplifiées en parallèle lors de cette première étape peut être compris entre 2 et plusieurs centaines, avantageusement être de l'ordre de plusieurs dizaines. L'étape (b) du procédé selon la présente invention consiste plus particulièrement à former au moins une goutte à partir de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) du procédé par électromouillage et à déplacer ladite goutte de ladite zone (Z1) vers ladite zone (Z2) par électromouillage. Avantageusement, l'étape (b) consiste à former, par électromouillage, x goutte(s) à partir de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) du procédé et à déplacer, par électromouillage, ladite (ou lesdites) goutte(s) de ladite zone (Z1) vers y zone(s) (Z2) avec x ? y et x et y représentant un entier compris entre 1 et 500, avantageusement entre 1 et 50, notamment entre 2 et 30 et, en particulier, entre 2 et 20. Les zones (Z2) du support sont également désignées, dans la présente, par l'expression � petits réservoirs �. Dans une variante particulière, x est égal à y. La (ou les) goutte(s) formée(s) lors de l'étape (b) du procédé présente(nt) un volume extrêmement réduit, de l'ordre du nanolitre. Ce volume est notamment compris 0,1 et 100 nl, en particulier, entre 1 et 80 nl et, plus particulièrement, un volume de 10, 30, 50 ou 65 nl. Dans le cas où plusieurs gouttes sont formées à partir de l'échantillon (Ea), 18 ces dernières peuvent présenter un volume identique (gouttes de volume calibré) ou différent. Il est clair pour l'homme du métier que l'échantillon (Ea) correspond à l'échantillon (E) complété du mélange réactionnel utilisé pour l'amplification de l'étape (a) et des amplicons produits lors de cette première étape d'amplification. L'amplification lors de l'étape (c) du procédé selon la présente invention est avantageusement une PCR simplex, dans la mesure où on a principalement une PCR mettant en oeuvre au moins une paire d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique de ladite molécule nucléotidique. Par � sonde marquée �, on entend, dans le cadre de la présente invention, une sonde fluorescente susceptible de se fixer soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon) et qui n'est fluorescente qu'une fois fixée à l'ADN. Les sondes marquées spécifiques peuvent être de n'importe quelle sorte parmi les sondes connues et décrites dans l'état de l'art. A titre d'exemples de sondes marquées spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les sondes TaqMan, les molecular Beacons, les sondes Scorpion et les sondes LNA. Avantageusement, l'étape (c) met en oeuvre de 1 à 4 paires d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée (ou d'un organisme donné) et 19 éventuellement de 1 à 4 sondes marquées spécifiques de ladite molécule nucléotidique (ou dudit organisme), munies de 1 à 4 marqueurs différents. Dans le cadre de la présente invention, après la disposition d'au moins une goutte d'échantillon (Ea) sur au moins un zone (Z2) du support et préalablement à l'étape (c) dudit procédé, ladite goutte est mise en contact avec la (ou les) paire(s) d'amorces spécifiques et éventuellement avec la (ou les) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) nécessaire(s) à l'amplification de l'étape (c). La mise en contact entre l'échantillon (Ea) et la (ou les) paire(s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) préalablement à l'étape (c) du procédé selon l'invention peut avoir lieu sur la zone (Z2) du support, après ou simultanément à la disposition de l'échantillon (Ea) sur ladite zone (Z2). Dans une première variante, une solution (S) électriquement conductrice contenant la (ou les) paire(s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) est amenée, par électromouillage, avantageusement sous forme d'une goutte, jusqu'à la zone (Z2) où elle se mélange à l'échantillon (Ea). Dans cette variante, ladite solution (S) peut être présente : - soit sur le support et notamment sur une zone (Z4) du support, ladite zone (Z4) étant distincte des zones (Z1) , (Z2) et (Z3) précédemment définies, 20 - soit dans un réservoir de solution (S) situé à l'extérieur du dispositif mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, et peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution (S) directement ou indirectement et ce, par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Dans une seconde variante, la (ou les) paire(s) d'amorce(s) spécifique(s) et éventuellement la (ou les) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) a(ont) été préalablement séchée (s) ou lyophilisée (s) sur la zone (Z2) dudit support, lors de sa fabrication ou suite à cette dernière. Les particularités précédemment décrites pour l'étape de séchage ou de lyophilisation du mélange réactionnel ou de certains de ses constituants sur la zone (Z1) du support telles que l'ajout d'additifs et la quantité de réactifs s'appliquent mutatis mutandis à l'étape de séchage ou de lyophilisation de la (ou des) paire(s) d'amorces spécifiques et éventuellement de la (ou des) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) sur la zone (Z2) dudit support. La concentration d'amorces et de sondes, spécifiques, séchées, après mélange avec la goutte d'échantillon (Ea) sera comprise entre 100 et 2000 nM, avantageusement de l'ordre de 600 nM. Que la (ou les) paire(s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde(s) marquée(s) spécifique(s) se présente(nt) sous forme liquide ou sous forme séchée ou lyophilisée, leur mélange avec l'échantillon (Ea) au niveau de la zone 21 (Z2) est réalisé par un mouvement d'aller-retour sur des électrodes adjacentes à ladite zone (Z2). Lors de l'étape (c) du procédé de la présente invention, toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation), connues de l'homme du métier et appropriées pour une amplification PCR avec amorces et éventuellement sondes spécifiques, sont utilisables. Avantageusement, l'amplification mise en oeuvre lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention comprend de 20 à 40 cycles, notamment 30, chaque cycle incluant une étape de dénaturation et une étape d'hybridationûélongation. De plus, l'amplification mise en oeuvre lors de l'étape (c) du procédé permet d'obtenir des amplicons de taille réduite comprenant de 50 à 200 pb et, en particulier, de 60 à 150 pb. Les cycles thermiques lors de l'amplification mise en oeuvre lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention peuvent être compris entre 50 et 70°C pour l'hybridationûélongation, avantageusement de l'ordre de 60°C, et être de l'ordre de 95°C pour la dénaturation. Ils peuvent durer entre 5 et 180 secondes, avantageusement entre 5 et 30 secondes, pour l'hybridationûélongation et entre 1 et 30 secondes, avantageusement entre 1 et 5 secondes pour la dénaturation. Les températures mises en oeuvre à chaque 30 cycle lors de l'amplification de l'étape (c) du procédé selon l'invention sont atteintes, maintenues et 22 contrôlées en utilisant des moyens permettant de chauffer le support mis en oeuvre et notamment la (ou les) zone(s) (Z2) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en oeuvre et notamment de la (ou des) zone(s) (Z2) de ce dernier. Lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention et lorsque cette dernière met en oeuvre au moins une sonde marquée spécifique, la fluorescence des gouttes peut être mesurée à chaque cycle thermique pour une analyse en temps réel ou bien à la fin de l'étape (c) pour une analyse en point final. La détection fluorescente de l'ADN amplifié utilise, pendant l'étape (c) du procédé selon l'invention, un fluorophore tel que le Sybr green ou un fluorophore classique pour le marquage des sondes de PCR tel que Alexa Fluor488, Alexa Fluor546, Carboxy-Rhodamine 6G, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluorescein, HEX, JOE, TAMRA, TET, Texas Red. Lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention et lorsque cette dernière ne met en oeuvre aucune sonde marquée spécifique, aucune détection des amplicons n'est effectuée lors de cette étape. Les amplicons peuvent nécessiter une analyse ultérieure par une autre technique telle que de l'hybridation sur puce à ADN ou de l'électrophorèse. Dans ce cas, il peut être nécessaire d'associer le dispositif mis en oeuvre lors du procédé selon l'invention et plus particulièrement la (ou les) zone(s) (Z2) vers un autre dispositif d'analyse. Ainsi, dans cette variante, le produit obtenu après l'étape (c) peut être récupéré sur chaque zone (Z2) manuellement ou par électromouillage. 23 Dans ce dernier cas, au moins une goutte est formée par électromouillage à partir du produit obtenu après l'étape (c) et cette dernière est, par électromouillage, amenée vers une structure telle qu'un orifice traversant le substrat disposé en regard du support, un orifice traversant ledit support ou tout dispositif hybride adaptable par l'homme du métier permettant de manipuler des gouttes discrètes et/ou transformer l'échantillon sous forme de gouttes en échantillon en veine fluidique. En fonction de la nature de l'échantillon (E) mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention et tel que précédemment défini, le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape préalable de purification de l'échantillon (E), cette dernière impliquant la préparation dudit échantillon et éventuellement l'isolement des molécules nucléotidiques contenues dans ce dernier. Cette étape préalable peut être réalisée de différentes façons et peut mettre en oeuvre des détergents conduisant à des lysats, des enzymes telles qu'une lysosyme ou la protéinase K, un traitement aux ultrasons ou une agitation mécanique en présence de billes. Dans certains cas, il peut être nécessaire de purifier les molécules nucléotidiques extraites afin de les débarrasser d'éventuels contaminants tels que des nucléases ou des molécules inhibitrices de PCR. Cette purification des molécules nucléotidiques peut être réalisée par extraction au phénol-chloroforme, par 24 chromatographie, par échange d'ions, par électrophorèse, par centrifugation à l'équilibre et/ou par capture par hybridation sur un support solide. Des trousses ou kits de purification et d'extraction disponibles dans le commerce peuvent être utilisés lors de l'étape préalable de purification de l'échantillon (E). Ainsi, le dispositif mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention peut éventuellement être interfacé avec un module de préparation automatique d'échantillons permettant d'obtenir une solution de molécule(s) nucléotidique(s) pure de volume adapté audit dispositif, i.e. un volume compris entre 0,1 à 20 pl. Ce module de préparation d'échantillon peut être directement présent sur le dispositif. Dans ce cas, il sera préférentiellement utilisé une technique de purification des molécules nucléotidiques reposant sur l'utilisation de particules magnétiques telles que des billes magnétiques sur laboratoire sur puce fonctionnant par électromouillage, comme il est décrit dans la littérature (Fouillet et al. � Digital microfluidic design and optimization of classic and new fluidic functions for lab on a chip systems � 3rd Microfluidics French Conference pFlu2006-101 ; Yizhong Wang et al., � Efficient in-droplet separation of magnetic particles for digital microfluidics � J. Micromech. Microeng. 17 (2007) 2148-2156). Cette technique de purification utilise un aimant placé à proximité du dispositif mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention lors des étapes de capture des billes magnétiques. Cet aimant est éloigné lors des 25 étapes de redispersion des billes. La redispersion se fait en agitant le fluide par des déplacements des gouttes par activation des électrodes. Dans une forme de mise en oeuvre particulière, le procédé selon la présente invention comprend une étape préalable de purification de l'échantillon (E) comprenant les étapes consistant à : i) mettre en contact l'échantillon (E) avec une solution de lyse ; ii) mettre en contact l'échantillon (E) lysé obtenu après l'étape (i) avec au moins une bille magnétique susceptible d'adsorber au moins une molécule nucléotidique ; iii) laver ladite bille magnétique ; iv) mettre en contact ladite bille lavée obtenue après l'étape (iii) avec une solution d'élution et éventuellement chauffer la solution ainsi obtenue ; v) isoler la (ou les) molécule (s) nucléotidique(s) obtenue(s) après l'étape (iv). Lors de l'étape (ii), les billes magnétiques sont avantageusement dans une solution saline dans laquelle la concentration en sels et le pH sont optimaux pour la capture de molécules nucléotidiques sur les billes. Les billes magnétiques utilisées sont avantageusement issues du commerce et peuvent être génériques pour la capture de molécules nucléotidiques (billes silanol Chemicell,) ou spécifiques (billes Dynabeads Streptavidine), ou tout autre type de billes que l'on peut fonctionnaliser avec un oligonucléotide. 26 Les compositions des solutions de lyse, de lavage et d'élution sont bien connues de l'état de la technique et l'homme du métier peut les préparer sans aucun effort inventif. De façon alternative, les solutions de lyse, de lavage ou d'élution peuvent être obtenues à partir de kits commerciaux. Des kits commerciaux de purification d'ADN génomique ou plasmidique, d'ARN messagers ou total ou ribosomal peuvent être utilisés (kits développés par Dynal, Polysciences, Novagen, Bilatec, ...) en choisissant le kit adapté au type d'échantillon (E) testé et à l'application visée. La réalisation de la purification d'acides nucléiques à base de kits commerciaux sur puce peut toutefois demander des adaptations : (1) éventuellement modification des volumes préconisés et (2) éventuellement addition de tensioactif(s) dans certaines solutions pour permettre l'introduction de ces dernières sur le support mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemples de tensioactifs utilisables, on peut citer du Tween20 ou du Triton X-100, plus particulièrement, utilisé à des concentrations finales de 0,05% à 2%. Lors de l'étape préalable de purification de l'échantillon (E), ce dernier peut être disposé sur le support, avantageusement par électromouillage, a) préalablement à l'étape (i) (échantillon (E) brut), R) suite à cette dernière et préalablement à l'étape (ii) (échantillon (E) lysé), 27 y) suite à l'étape (ii) et préalablement à l'étape (iii) (échantillon (E) lysé et mélangé avec une (ou des) bille(s) magnétique(s)). L'échantillon (E) peut être déposé soit sur la zone (Z1) telle que précédemment définie, soit sur une zone (Z5) distincte des zones (Z1) , (Z2), (Z3) et (Z4) telles que précédemment définies. L'échantillon peut être amené sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir d'échantillon (E) directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Dans la variante (a), l'échantillon (E) déposé sur la zone (Z1) ou sur une zone (Z5) est mélangé avec la solution de lyse électriquement conductrice, amenée sur ladite zone par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte(s). Ladite solution de lyse peut être présente sur le support sur une zone (Z6) distincte des zones (Z1) à (Z5) telles que précédemment définies ou peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de lyse directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Par la suite ou dans la variante (R), l'échantillon (E) lysé, présent sur la zone (Z1) ou (Z5), est mélangé avec la solution de billes magnétiques, électriquement conductrice, amenée sur ladite zone par électromouillage et ce, sous forme 28 d'une (ou de plusieurs) goutte(s). Ladite solution de billes magnétiques peut être présente sur le support sur une zone (Z-7) distincte des zones (Z1) à (Z6) telles que précédemment définies ou peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de billes magnétiques directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Par la suite ou suite à la variante (y), les billes magnétiques sont capturées à l'aide d'un aimant pour former un culot de billes magnétiques et le surnageant est évacué du dispositif par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte(s). Le surnageant est avantageusement dirigé vers une � poubelle � présente sur le dispositif. Cette dernière se présente avantageusement comme un orifice traversant le substrat disposé en regard du support, un orifice traversant ledit support ou une enclave dans le capot. Par � enclave �, on entend que le capot est creusé dans son épaisseur de façon à aménager un espace plus important entre capot et support. Préalablement à l'étape (iii) de lavage des billes magnétiques, la solution de lavage, électriquement conductrice, peut être amenée jusqu'au culot de billes magnétiques, par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte(s). Ladite solution de lavage peut être présente sur le support sur une zone (Z8) distincte des zones (Z1) à (Z-7) telles que précédemment définies ou peut être 29 amenée via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de lavage directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Lors de l'étape (iii), les billes magnétiques peuvent être redispersées dans la solution de lavage par un mouvement d'aller-retour de cette dernière, induit par électromouillage. Les billes magnétiques peuvent à nouveau être recapturées en un culot compact en approchant l'aimant de la zone (Z1) ou (Z5). Le surnageant est à nouveau évacué via la poubelle telle que précédemment définie. Une nouvelle solution de lavage identique ou différente à la précédente peut être mise en contact avec le culot de billes magnétiques selon les variantes protocolaires précédemment définies et ce, pour répéter l'étape (iii) de lavage au moins une fois. L'étape (iii) de lavage peut être répétée autant de fois que nécessaire avec la même solution de lavage ou avec une ou plusieurs autres solutions de lavage. L'étape (iv) consiste à mettre en contact une solution d'élution des molécules nucléotidiques sur le culot de billes magnétiques obtenu suite à la dernière étape de lavage. L'introduction de ladite solution d'élution électriquement conductrice utilise avantageusement l'électromouillage. Ladite solution de lavage peut être présente sur le support sur une zone (Z9) distincte des zones (Z1) à (Z8) telles que précédemment définies ou peut être amenée via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au 30 réservoir de solution d'élution directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Lors de l'étape (iv), les billes magnétiques peuvent être redispersées dans la solution d'élution par un mouvement d'aller-retour de cette dernière, induit par électromouillage. Lors de l'étape (iv), la solution d'élution en contact avec les billes magnétiques dispersées peut être chauffée afin de � décrocher � plus efficacement les molécules nucléotidiques retenues sur lesdites billes. Ce chauffage peut impliquer l'utilisation de moyens permettant de chauffer le support mis en oeuvre et notamment la zone (Z1) ou (Z5) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en oeuvre et notamment de la zone (Z1) ou (Z5) de ce dernier. L'étape (v) consiste à capturer les billes magnétiques débarrassées des molécules nucléotidiques en un culot compact à l'aide d'un aimant. Le surnageant ainsi obtenu est la solution pure contenant les molécules nucléotidiques qui constitue l'échantillon (E) purifié mis en oeuvre à l'étape (a) du procédé selon l'invention. Lorsque les étapes de purification ont eu lieu sur la zone (Z5) du support, il convient d'amener, préalablement à la mise en oeuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, l'échantillon (E) purifié sur la zone (Z1) par électromouillage et ce, sous formes d'une (ou de plusieurs) goutte(s). La présente invention concerne également un dispositif susceptible d'être mis en oeuvre dans un 31 procédé tel que précédemment défini, ledit dispositif comprenant un support présentant au moins deux zones distinctes (Z1) et (Z2), - ladite 1ere zone (Z1) étant adaptée pour une lere étape d'amplification ; - ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour une 2nde étape d'amplification ; - des moyens permettant d'amener un fluide de ladite zone (Z1) vers ladite zone (Z2) par électromouillage. Avantageusement, ladite zone (Z2) du support présente au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique telle(s) que précédemment définie(s), lyophilisée(s) ou séchée(s). De plus, le support peut présenter au moins une zone supplémentaire, distincte des zones (Z1) et (Z2) et choisie dans le groupe constitué par : - une zone (Z3) sur laquelle est disposé un 20 mélange réactionnel tel que précédemment défini, utile pour la lere étape d'amplification ; - une zone (Z4) sur laquelle est disposée une solution S telle que précédemment définie, contenant au moins une paire d'amorces spécifiques et 25 éventuellement au moins une sonde marquée spécifique telle(s) que précédemment définie(s), utile pour la 2nde étape d'amplification ; - une zone (Z5) adaptée pour la purification d'un échantillon tel que l'échantillon (E) précédemment 30 défini ; 32 - une zone (Z6) sur laquelle est disposée une solution de lyse telle que précédemment définie ; une zone (Z9) sur laquelle est disposée une solution contenant des billes magnétiques, telle que précédemment définie - une zone (Z8) sur laquelle est disposée une solution de lavage telle que précédemment définie ; et - une zone (Z9) sur laquelle est disposée une solution d'élution telle que précédemment définie. Le support également désigné dans la présente par le terme � puce � comprend, dans une vue en coupe, un substrat, présentant une matrice d'électrodes, une couche isolante (i.e. diélectrique) recouvrant substrat et électrodes et une couche hydrophobe recouvrant ladite couche diélectrique. Les différentes zones (Z1) à (Z9) telles que précédemment définies se situent donc à la surface de ladite couche hydrophobe. Par � zones �, on entend donc principalement un agencement d'électrodes définies en surface de la puce, chacune de ces électrodes présentant une fonction particulière et éventuellement une forme adaptée à la fonction. Par exemple, on peut avoir des électrodes réservoirs, des électrodes de transfert pour acheminer les gouttes, des électrodes dévolues au mélange des réactifs, etc Le support peut être réalisé suivant les méthodes décrites dans l'état de l'art (Fouillet Y et 30 al. � Digital microfluidic design and optimization of 33 classic and new fluidic functions for lab on a chip systems � Microfluid. Nanofluid. (2008) 4 :159-165). Le support présente non seulement des moyens permettant d'amener un fluide de la zone (Z1) vers la zone (Z2) mais aussi . - des moyens permettant d'amener un fluide de la zone (Z4) vers la zone (Z2) et - des moyens permettant d'amener un fluide d'une zone choisie dans le groupe constitué par les zones (Z3), (Z6), (Z7), (Z8) et (Z9) vers une zone choisie entre la zone (Z1) et la zone (Z5). Ces moyens permettent de manipuler et de déplacer des gouttes de fluide et mettent en oeuvre des séries d'électrodes adjacentes dans un plan, pouvant être disposées de manière linéaire mais aussi en deux dimensions et ce, pour définir un plan de déplacement d'un fluide sous forme de gouttes. Dans la technique d'électromouillage, le déplacement des gouttes implique également une contre-électrode maintenant un contact électrique avec la goutte pendant ce déplacement et un générateur de tension pour appliquer une différence de potentiel entre les électrodes et la contre-électrode. Les électrodes peuvent être réalisées par dépôt d'une couche métallique telle qu'une couche en Au, Al, ITO, Pt, Cr ou Cu par photolithographie. La couche diélectrique peut être en Si3N4, en parylène ou en SiO2. Le dispositif de l'invention peut présenter une configuration � ouverte �. Dans ce cas, il n'est constitué que du support tel que précédemment défini et 34 la contre-électrode se présente avantageusement sous forme d'un fil caténaire. Toutefois, afin de favoriser la portabilité du dispositif selon la présente invention, ce dernier présente avantageusement une configuration � fermée �. Dans cette dernière, le support du dispositif tel que précédemment défini est associé à un substrat disposé en regard dudit support. Ce substrat également désigné dans la présente par le terme � capot � comporte des moyens conducteurs afin de former une contre-électrode. Il est avantageusement fabriqué dans un matériau adapté pour les mesures de fluorescence et possède une couche électrique et une couche hydrophobe. Les couches hydrophobes du support et du capot seront préférentiellement déposées suivant la méthode décrite dans l'article de Thery et al., � SiOC as a hydrophobic layer for electrowetting on dielectric applications � llth International Conference on Minaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (MicroTas - 07-11/10/2007 - Paris France). Les gouttes disposées sur le support ou déplacées sur ce dernier sont confinées entre le support et le substrat disposé en regard dudit support, l'espace entre le support et le substrat étant compris entre 10 et 1000 nm, avantageusement entre 50 et 100 nm. Compte tenu du faible volume de liquide déplacé via les gouttes, on peut rajouter une huile visant à confiner les gouttes et prévenir tout risque d'évaporation. Ladite huile peut être, par exemple, une huile minérale comme une huile M3516 de chez Zigma- 35 Aldrich ou toute autre huile adaptable par l'homme du métier. Outre sa fonction liée à l'évaporation, il est important de choisir une huile favorisant le déplacement des gouttes par électromouillage. L'huile possède également un rôle passif de protection contre la contamination des échantillons. Le substrat présente, comme déjà expliqué, au moins un orifice ou trou d'aspiration pouvant avoir avantageusement une forme convergente vers l'espace entre le support et le substrat et permettant le dépôt d'un liquide sur le support ou son aspiration à partir de ce dernier. En effet, l'aspiration d'un liquide sur une zone donnée du support est possible lorsque les électrodes connexes à l'orifice traversant le capot sont activées. De même, le dépôt d'un liquide sur une zone donnée du support est possible via ledit orifice lorsque ce dernier est connecté à un dispositif d'injection. Le dispositif selon la présente invention peut comprendre des moyens permettant de porter le support ou du moins une zone donnée de ce support et, plus particulièrement, les zones (Z1) , (Z2) et (Z5) telles que précédemment définies à une température donnée notamment lors de l'étape (a), lors de l'étape (c) et/ou lors de l'étape de purification de l'échantillon (E). Ces moyens permettant de porter le support à une température donnée peuvent être soit un élément chauffant du type Peltier en contact avec la face du support opposée à la face portant les zones (Z1) , (Z2) et les éventuelles autres zones (Z3) à (Z9) , 36 soit une (ou plusieurs) résistance(s) chauffante(s) intégrée(s) au dispositif. Ces résistances chauffantes intégrées peuvent être réalisées à partir d'une couche mince métallique telle qu'une couche mince en platine, en aluminium, en silicium dopé, etc.... en définissant des motifs par des techniques classiques de microfabrication (photolithographie et gravure par exemple) ou par exemple par sérigraphie d'un matériau conducteur tel que du platine. La conception de ces résistances chauffantes (épaisseur, section, longueur) sera effectuée de manière à générer une puissance de chauffage donnée pour une tension fixée, en obtenant une valeur de résistance électrique bien définie. Avantageusement, ces résistances chauffantes peuvent permettre de localiser le chauffage sous les zones d'intérêt, telles que les zones Z1r Z2 et Z5...etc., dans le cadre du procédé mis en oeuvre dans l'invention. Par ailleurs, le dispositif selon la présente invention peut également comprendre une (ou plusieurs) sonde(s) de température qui permet(tent) de contrôler la température des échantillons et des réactifs au plus près des zones (Z1) , (Z2) et (Z5) telles que précédemment définies. Le procédé de fabrication de telles sondes de température est identique au procédé de fabrication des résistances chauffantes précédemment exposé. Il est, par exemple, possible d'asservir les sondes au bloc Peltier de manière à contrôler avec précision la température du support. 37 Par définition, les technologies de fabrication des dispositifs utilisant l'électromouillage font intervenir des étapes de définition de motifs dans des couches métalliques. La réalisation des résistances chauffantes et des sondes de température ne rajoute donc pas de complexité dans le procédé global de fabrication du dispositif selon l'invention. Le dispositif selon la présente invention se distingue des dispositifs de l'art antérieur, par le fait . qu'il est portable car il y a miniaturisation des volumes et de l'encombrement du consommable d'analyse ; - qu'il permet des analyses très rapides puisque les températures lors des étapes d'amplification PCR sont rapidement atteintes compte-tenu de la miniaturisation du volume d'échantillon à traiter et du matériau utilisé pour le dispositif qui est un très bon conducteur thermique ; - qu'il n'a pas à être ouvert entre la phase de pré-amplification et la phase d'amplification avec détection spécifique, pour l'ajout de réactifs, voire entre la purification de l'échantillon à traiter et la phase d'amplification avec détection spécifique ; ce qui évite tous les risques reconnus et très sérieux de contamination par amplicons. De plus, le dispositif peut présenter un grand nombre de zones telles que les zones (Z5) à (Z9) précédemment définies, et l'organisation des zones (Z1) 38 à (Z9) précédemment définies à la surface du support et leurs dispositions les unes par rapport aux autres sont plus libres et ne sont pas imposées contrairement au cas du dispositif décrit dans la demande internationale WO 2008/106719, dans lequel la disposition est imposée par la force centrifugeuse qui déplace les liquides d'un compartiment à un autre. Il convient de remarquer que le dispositif une fois l'échantillon (E) introduit sur ce dernier peut ne plus être en contact avec l'environnement à potentiel contaminant. C'est notamment le cas d'un dispositif fermé sur lequel le (ou les) réactif(s) nécessaire(s) aux différentes étapes d'amplification PCR et à l'éventuelle étape de purification de l'échantillon à analyser ont été préalablement embarqués sous forme liquide, séchée ou lyophilisée. Enfin, le dispositif selon l'invention offre la possibilité d'amplifier et d'analyser au moins deux échantillons différents, voire 3, 4, 5 ou plus échantillons différents. Les figures 1 et 2 proposent des architectures optimales pour l'amplification de molécules nucléotidiques pour deux échantillons (El) et (E2) suivant l'invention (figure 1) avec éventuellement une étape préalable de purification des molécules nucléotidiques contenues dans ces échantillons (figure 2). La figure 1 propose un dispositif vu de dessus, en configuration � fermée � dont seul le support est matérialisé, ledit dispositif présentant : 39 - deux zones (Z10_1) et (Z10_2) sur lesquelles les échantillons (E1) et (E2) sont respectivement déposés ; - deux zones (Z3_1) et (Z3_2) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la lèse étape d'amplification ; - une pluralité de réservoirs formant les gros réservoirs (Z1_1) et (Z1_2), sur lesquels la lèse étape d'amplification respectivement des échantillons (E1) et (E2) est mise en oeuvre ; - une 2 X 13 zones (Z2), sur lesquelles la 2nae étape d'amplification est mise en oeuvre. Sur chaque zone (Z2), des réactifs spécifiques (amorces et éventuellement sondes marquées) identiques ou différents sont séchés. Avec le dispositif d'architecture optimisée de la figure 1, il est possible de réaliser simultanément pour deux échantillons (E1) et (E2) . 1) Un mélange entre l'échantillon et les réactifs liquides pour la lèse étape d'amplification et envoi du mélange dans un gros réservoir (Z1_1) ou (Z1_2) pour la lèse étape PCR ; 2) La lèse étape PCR dans deux gros réservoirs (Z1_1) et (Z1_2) notamment en parallèle ; 3) La distribution et l'envoi de gouttes de 65 nl en fin de lèse étape PCR ; 4) La 21eme étape PCR avec détection spécifique dans 13 petits réservoirs (Z2). 40 La figure 2 propose un dispositif vu de dessus, en configuration � fermée �, ledit dispositif présentant : - deux zones (Z10_1) et (Z10_2) sur lesquelles les échantillons (E1) et (E2) sont respectivement déposés ; - deux zones (Z1_1) et (Z1_2), sur lesquelles la purification et la lere étape d'amplification respectivement des échantillons (E1) et (E2) sont mises en oeuvre ; - deux zones (Z3_1) et (Z3_2) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la 1ere étape d'amplification ; - 6 zones (ZA) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la 1ere étape d'amplification et/ou les réactifs pour la purification des échantillons (E1) et (E2), ces zones (ZA) pouvant avantageusement être choisies parmi les zones (z3), (Z6) r (Z7) r (z8) et (z9) telles que précédemment définies ; - un orifice (T1) sur le substrat disposé en regard du support, par lequel sont évacués les différents surnageants obtenus lors de l'étape de purification ; - une 2 X 11 zones (Z2), sur lesquelles la 2nde étape d'amplification est mise en oeuvre. Sur chaque zone (Z2), des réactifs spécifiques (amorces et éventuellement sondes marquées) identiques ou différents sont séchés. Avec le dispositif d'architecture optimisée de la figure 2, il est possible de réaliser 30 41 simultanément pour deux échantillons (E1) et (E2) en parallèle : 1) la purification des molécules nucléotidiques à partir de deux échantillons (E1) et (E2) ; 2) une 1ere étape d'amplification des deux échantillons (E1) et (E2) purifiés ; 3) une 21ème étape d'amplification avec des sondes spécifiques dans 11 petits réservoirs pour les deux échantillons (E1) et (E2) purifiés. La présente invention concerne également un kit d'amplification comprenant : un dispositif tel que précédemment défini, et - au moins un élément choisi dans le groupe constitué par une polymérase thermostable, une transcriptase inverse, des déoxyribonucléotides triphosphates, une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse et une sonde marquée. Chacun de ces éléments est tel que précédemment défini. Le procédé, le dispositif et le kit d'amplification selon la présente invention permettent et sont utiles dans des analyses de terrain telles que la surveillance environnementale, la surveillance civile, la sécurité alimentaire, les analyses médicales qui peuvent passer de la prise de sang avec seringue au prélèvement capillaire, les analyses de marqueurs cancérologiques sur microbiopsies, les analyses 42 criminelles sur traces, les contrôles qualité agroalimentaires, les analyses vétérinaires avec notamment la recherche de pathogènes viraux, bactériens, parasitaires ou mycologiques sur des prélèvements capillaires ou des microbiopsies. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 propose un dispositif d'architecture optimisée pour réaliser l'analyse d'un échantillon par amplification génique en deux étapes avec pré-amplification de l'échantillon en microcomposant fermé fonctionnant par électromouillage. La figure 2 propose un dispositif d'architecture optimisée pour réaliser la purification des acides nucléiques de deux échantillons en parallèle, suivie de l'analyse par amplification génique en deux étapes avec pré-amplification de l'échantillon en microcomposant fermé fonctionnant par électromouillage. La figure 3 propose une illustration de la réalisation du protocole d'amplification en deux étapes sur un micro dispositif fonctionnant par électromouillage. La figure 4 présente l'augmentation de fluorescence obtenue dans 3 petits réservoirs lors de 43 la deuxième étape d'amplification du protocole permettant de détecter la présence des pathogènes E. Coli, Bacillus Subtilis et adénovirus 2 dans l'échantillon de départ. La figure 5 présente l'alimentation en réactifs, la position de l'aimant et des électrodes reliant la zone d'alimentation des réactifs, la zone de purification et la poubelle pour la purification d'acides nucléiques sur puce EWOD à partir d'un échantillon sanguin. La figure 6 présente l'analyse par PCR de l'ADN purifié sur puce EWOD fonctionnant par électromouillage à partir d'un échantillon sanguin. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS I. Exemple d'une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'invention. 1. Echantillon et réactifs. Un échantillon provenant d'une préparation d'acides nucléiques contenant 106 copies de la bactérie Gram- Escherichia Coli, 103 copies du virus Adénovirus type II et 103 copies de la bactérie Bacillus Subtilis est mélangé aux réactifs PCR (BSA 0,8 mg/ml, tampon de l'enzyme AmpliTaq Gold sans MgC12 lx, MgC12 3 mM, nucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 200 pM, bétaine 450 mM, AmpliTaq Gold (0,5 U/pl) et des amorces spécifiques aux pathogènes étudiés à des concentrations différentes (Escherichia Coli 20 nM/ Adenovirus 20 nM/ Bacillus subtilis 80 nM). Dans les 4 petits réservoirs de stockage Z3_2, Z3_2r Z3_3 et Z3_4 (Figure 3) du microcomposant, les amorces et sondes spécifiques à 44 chaque pathogène recherché ont été pré-embarquées (dépôts de gouttelettes de solutions au robot de spotting puis séchage). Les quantités déposées correspondent à une concentration de 600 nM après remise en suspension. 2. Réalisation des étapes. L'échantillon est tout d'abord mélangé en tube avec les réactifs PCR pour la première étape d'amplification et chauffé 10 minutes à 95°C en tube (étape de dénaturation de l'ADN et d'activation de la Taq Gold). Cette solution est ensuite introduite sur la puce à travers un trou du capot (T1) et par activation des électrodes. La première étape de la PCR cascade est effectuée dans le gros réservoir (Z1) (Figure 3) : 10 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C (5 secondes) et une étape d'hybridationûélongation à 60°C pendant 20 secondes. A la fin de cette première étape, l'échantillon est distribué en gouttes de 65 nl et chaque goutte est envoyée dans les petits réservoirs de stockage Z2-1, Z2-2, Z2-3 et Z2-4. Le mélange de la goutte d'échantillon et des réactifs spécifiques préalablement embarqués est réalisé par un mouvement d'aller-retour des gouttes sur des électrodes adjacentes au petit réservoir (10 A/R). La deuxième étape de PCR cascade est effectuée dans les petits réservoirs. Elle consiste en 40 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C (5 secondes) et une étape d'hybridationûélongation 45 à 60°C pendant 20 secondes. Pendant cette deuxième étape de PCR, la fluorescence des gouttes est mesurée à chaque cycle thermique en fin de l'étape d'hybridation-élongation. Le signal de fluorescence obtenu pendant cette deuxième étape d'amplification est donné Figure 4. II. Exemple d'une autre mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Pour prouver qu'il est possible de coupler une préparation d'échantillons directement sur le micro-dispositif selon l'invention et une amplification en deux étapes, un exemple de purification d'ADN sur le micro-dispositif est donné. Des réactifs commerciaux (Bilatest Genomic DNA kit) ont été utilisés. Un mélange de sang, tampon de lyse, tampon de fixation et billes magnétiques a été introduit sur puce (volume total du mélange : 5 pl contenant 0,26 pl de sang) par le trou (T1) (Figure 5). Les électrodes n°1 à 8 sont activées pour déplacer la solution du trou d'entrée (T1) vers la poubelle constituée par le trou (T2). Lorsque le liquide est déplacé du trou (T1) vers le trou (T2), les billes sont collectées en culot compact lors du passage à proximité de l'aimant (A) placé sur le capot au-dessus de l'électrode 3. La première solution de lavage (tampon de lavage A du Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (T1) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. 46 Les billes sont redispersées dans la solution de lavage en éloignant l'aimant (A) du capot et en activant successivement les électrodes 2 et 3 pendant 2 minutes. L'aimant (A) est ensuite à nouveau approché du capot de la puce pour reformer un culot compact de billes. Le surnageant est ensuite amené dans la poubelle constituée par le trou (T2) en activant les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8 puis en désactivant successivement les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8. L'ensemble de ces étapes pour le lavage des billes magnétiques avec la solution de lavage A est répété trois fois (Figure 5). La seconde solution de lavage (tampon de lavage B du Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (T1) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. Les billes ne sont pas redispersées dans cette solution de lavage et le surnageant est amené dans la poubelle constituée par le trou (T2) en activant les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8 puis en désactivant successivement les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8. La solution d'élution de l'ADN (Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (T1) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. Les billes sont redispersées dans la solution d'élution en éloignant l'aimant (A) du capot, en activant successivement les électrodes 2 et 3 pendant 10 minutes et en chauffant la puce à 55°C. L'aimant (A) est ensuite à nouveau approché du capot de 47 la puce pour reformer un culot compact de billes. Le surnageant est la solution d'ADN purifié. Il a été vérifié que la solution ainsi obtenue sur puce contient bien de l'ADN à la concentration attendue en réalisant une PCR en temps réel de génotypage (détection de la délétion OF508 du gène CFTR). Nous avons comparé l'allure des courbes de fluorescence pour un échantillon purifié sur puce et un échantillon purifié en tube en suivant le protocole fourni par Bilatec avec le kit (Figure 6). Les courbes obtenues sont absolument similaires dans les deux cas avec des Ct (pour � Threshold cycle �, i . e . le cycle à partir duquel la fluorescence augmente significativement et se déconnecte du bruit de fond et grâce auquel on peut remonter à la quantité de molécules d'ADN initialement présente) montrant que la concentration d'ADN obtenue sur puce et en tube est tout à fait similaire (6,8 ng d'ADN obtenu par pl de sang purifié dans les deux cas).20 REVENDICATIONS1) Procédé d'amplification d'au moins une molécule nucléotidique contenue dans un échantillon (E) comprenant les étapes successives suivantes consistant à . a) soumettre ledit échantillon (E) à une lère étape d'amplification sur une zone (Z1) d'un support ; b) amener par électromouillage au moins une partie de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) de la zone (Z1) sur au moins une zone (Z2) dudit support, distincte de la zone (Z1) c) soumettre l'échantillon (Ea) à une e étape d'amplification sur ladite zone (Z2). 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon (E) est un échantillon d'un élément choisi dans le groupe constitué par une solution liquide contenant au moins une molécule nucléotidique ; un fluide biologique ; un fluide végétal ; une ou plusieurs cellules animales ou végétales ; un tissu animal ou végétal ; une matrice alimentaire ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que, préalablement à ladite étape (a), ledit échantillon (E) 49 est mis en contact avec le mélange réactionnel nécessaire à l'amplification de ladite étape (a). 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit échantillon (E) est amené sur ladite zone (Z1) par électromouillage. 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification lors de ladite étape (a) est choisie dans le groupe constitué par une PCR multiplexe et une RT-PCR multiplexe. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite étape (b) consiste à former, par électromouillage, x goutte(s) à partir dudit échantillon (Ea) et à déplacer, par électromouillage, ladite (ou lesdites) goutte(s) de ladite zone (Z1) vers y zone (s) (Z2), avec x ? y et x et y représentant un entier compris entre 1 et 50. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification lors de ladite étape (c) met en oeuvre au moins une paire d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique de ladite molécule nucléotidique. 50 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape préalable de purification de l'échantillon (E). 9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape préalable de purification comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact l'échantillon (E) avec une solution de lyse ; ii) mettre en contact l'échantillon (E) lysé obtenu après l'étape (i) avec au moins une bille magnétique susceptible d'adsorber au moins une molécule nucléotidique ; iii) laver ladite bille magnétique ; iv) mettre en contact ladite bille lavée obtenue après l'étape (iii) avec une solution d'élution et éventuellement chauffer la solution ainsi obtenue ; v) isoler la (ou les) molécule (s) nucléotidique(s) obtenue(s) après l'étape (iv). 10) Dispositif susceptible d'être mis en oeuvre dans un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit dispositif comprenant un support présentant au moins deux zones distinctes (Z1) et (Z2), - ladite lere zone (Z1) étant adaptée pour une lere étape d'amplification ; - ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour 30 une 2nde étape d'amplification ; et 51 - des moyens permettant d'amener un fluide de ladite zone (Z1) vers ladite zone (Z2) par électromouillage. 11) Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ladite zone (Z2) du support présente au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique, lyophilisées ou séchées. 12) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le support présente au moins une zone supplémentaire, distincte des zones (Z1) et (Z2) et choisie dans le groupe constitué par : - une zone (Z3) sur laquelle est disposé un mélange réactionnel, utile pour la lere étape d'amplification ; - une zone (Z4) sur laquelle est disposée une solution S, contenant au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique, utile pour la 2nde étape d'amplification ; - une zone (Z5) adaptée pour la purification d'un échantillon ; - une zone (Z6) sur laquelle est disposée une solution de lyse ; - une zone (Z-7) sur laquelle est disposée une solution contenant des billes magnétiques ; - une zone (Z8) sur laquelle est disposée une solution de lavage ; et 52 - une zone (Z9) sur laquelle est disposée une solution d'élution. 13) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ledit support est associé à un substrat disposé en regard dudit support. 14) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend des moyens permettant de porter le support ou du moins une zone donnée de ce support à une température donnée. 15) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend au moins une sonde de température. 16) Kit d'amplification comprenant : - un dispositif tel que défini à l'une quelconque des revendications 10 à 15, et - au moins un élément choisi dans le groupe constitué par une polymérase thermostable, une transcriptase inverse, des déoxyribonucléotides 25 triphosphates, une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse et une sonde marquée. 20