Brevet FR2944425A1 — publié le 20101022

La présente invention se rapporte à l'observation des matières kératiniques. L'invention concerne plus particulièrement mais non exclusivement les procédés visant à déterminer la distribution, notamment la quantité et/ou la répartition, de la mélanine dans des matières kératiniques, en vue notamment d'évaluer l'action d'un produit cosmétique. Par � matières kératiniques �, on entend les cheveux, les cils, les sourcils, la peau, les ongles, les muqueuses, le cuir chevelu, entre autres. Les matières kératiniques selon l'invention peuvent être naturelles ou artificielles. Arrière-plan La couleur des matières kératiniques, et notamment de la peau humaine, est principalement due à. la présence de la mélanine. Cette dernière est fabriquée â l'intérieur des mélanosomes, eux-mêmes produits par les mélanocytes. Le nombre de mélanosomes produits par les mélanocytes, leur taille, leur charge mélanique et la nature de celle-ci sont des caractéristiques héréditaires qui influent fortement sur la pigmentation. Il est connu d'utiliser des traitements à base de produits comportant des actifs dépigmentants et/ou propigmentants afin de modifier la couleur des matières kératiniques en exerçant une action sur la quantité et/ou la répartition de la mélanine. De tels produits peuvent être utilisés pour homogénéiser le teint, améliorer ou lutter contre les effets de l'exposition aux rayons ultraviolets (UV), notamment au rayonnement solaire, pour favoriser ou pour réduire la production de mélanine, ou traiter les taches hyper pigmentées, entre autres. Afin d'évaluer l'efficacité des produits agissant sur la mélanine, on connaît diverses méthodes plus ou moins appropriées. L'effet d'actifs sur la pigmentation des matières kératiniques peut par exemple être évalué in vitro par extraction chimique et dosage de la mélanine à l'aide d'un spectrodensitomètre, ou bien par des mesures colorimétriques à la surface des matières kératiniques, notamment de l'épiderme de la peau, ou bien encore par quantification de la mélanine sur coupe histologique par analyse d'images. Cependant, ces méthodes s'avèrent généralement fastidieuses, peu sensibles et elles sont, de plus, pour la plupart invasives. De la sorte, l'efficacité des actifs dépigmentants et/ou propigmentants reste difficile à évaluer. Parmi les méthodes non invasives de microscopie optique, on connaît également l'utilisation de la microscopie confocale à balayage laser, en mode réflexion, pour visualiser la mélanine présente dans l'épiderme de la peau humaine. Habituellement, des longueurs d'onde proche infrarouge (IR) sont utilisées pour ce type d'imagerie et la lumière rétrodiffusée par les différents composants de la peau est collectée pour former l'image de leur distribution. La détection et la quantification spécifique de la mélanine est donc rendue quasiment impossible compte-tenu du signal important réfléchi par les autres constituants épidermiques. Résumé Il existe ainsi un besoin pour bénéficier d'un procédé sensible, facile à mettre en oeuvre, non invasif, pour permettre de déterminer la distribution, notamment la quantité et/ou la répartition, de la mélanine dans les matières kératiniques, permettant d'obtenir des résultats fiables, rapides et pertinents. Un tel procédé pourrait utilement permettre de quantifier la mélanine et d'en connaître sa répartition, notamment selon une représentation et une quantification tridimensionnelle. Il existe en particulier un besoin pour connaître de manière efficace la distribution, notamment la quantité et/ou la répartition, de la mélanine dans des matières kératiniques, ces matières kératiniques ayant ou non subi l'exposition à un stimulus et/ou un traitement, par exemple à base d'actifs dépigmentants et/ou propigmentants, pour permettre par exemple de vérifier l'efficacité d'un produit utilisé lors du traitement et/ou de prescrire un produit adapté à ces matières kératiniques. Il y a encore un intérêt à caractériser la pigmentation, notamment cutanée, pour objectiver les différences de quantité et répartition de la mélanine selon le type de peau, la population, la localisation géographique, ou encore l'alimentation..., et pour caractériser les désordres pigmentaires, notamment cutanés tels que les lentigos actiniques ou les éphélides. L'invention vise à répondre à tout ou partie de ces besoins. L'invention a ainsi pour objet, selon l'un de ses aspects, un procédé pour évaluer la pigmentation ou l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement sur la pigmentation, notamment d'un traitement cosmétique, censé agir sur la distribution, notamment la répartition et/ou la quantité, de la mélanine présente dans des matières kératiniques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle. 11 peut comporter notamment les étapes consistant à a) effectuer, avant exposition des matières kératiniques au stimulus et/ou avant le traitement, une première acquisition représentative de la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques, par microscopie multiphotonique, b) effectuer, après exposition des matières kératiniques au stimulus et/ou après le traitement, une deuxième acquisition, par exemple sensiblement au même emplacement que la première acquisition, par microscopie multiphotonique, cette deuxième acquisition étant représentative de la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques, e) comparer les première et deuxième acquisitions et générer sur la base au moins de cette comparaison une information représentative de l'action dudit stimulus et/ou dudit traitement sur la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques. La première acquisition peut s'effectuer alors que les matières kératiniques sont exposées à un placebo. Le placébo est par exemple le même milieu cosmétique que celui du produit utilisé pour le traitement cosmétique, mais sans le ou les actifs correspondants. Le procédé peut ainsi comporter les étapes consistant à effectuer au moins une acquisition représentative de la distribution de la mélanine, par microscopie multiphotonique, dans les matières kératiniques d'un individu ou sur des échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un composé cosmétique, et au moins une acquisition représentative de la distribution de la mélanine dans les matières kératiniques du même individu ou des mêmes échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un placebo du composé cosmétique. Une valeur représentative, par exemple moyenne ou médiane, de la distribution ou de la quantité de la mélanine peut être calculée, pour comparer à l'aide d'outils statistiques les deux traitements. Avantageusement, l'utilisation de la microscopie multiphotonique, notamment de la fluorescence excitée à 2 photons, facilite la détermination de la distribution, notamment de la quantité et/ou de la répartition, de la mélanine dans les matières kératiniques, en vue notamment d'évaluer la pigmentation et/ou l'efficacité d'un stimulus et/ou d'un traitement sur lesdites matières kératiniques, sur la pigmentation. La microscopie multiphotonique facilite l'observation en profondeur des matières kératiniques, notamment des tissus vivants très diffusants. En effet, la lumière infrarouge pénètre mieux dans les tissus car elle est moins diffusée et moins absorbée et le fait d'utiliser un mécanisme non-linéaire pour produire le signal introduit un critère plus fort de sélection des signaux en milieu diffusant. Ce mécanisme non-linéaire implique l'interaction simultanée de plusieurs photons (2 ou plus) avec la molécule ou la structure qu'on cherche à détecter. Généralement, le faisceau excitateur est focalisé et balayé dans l'échantillon, et le signal non-linéaire créé est détecté afin d'obtenir une image. La particularité de ce type d'imagerie repose sur la capacité de sectionnement optique qu'elle procure du fait de la dépendance non-linéaire (au carré ou plus) du signal avec la puissance d'excitation. La densité de puissance excitatrice étant très élevée au niveau du point focal, c'est seulement dans un volume focal limité que l'effet non-linéaire considéré aura lieu de façon efficace; cette propriété essentielle assure un confinement du signal obtenu dans l'échantillon et permet donc d'obtenir une résolution tridimensionnelle intrinsèque de l'ordre du micromètre. En fonction des tissus, la profondeur d'imagerie varie de 100 à 600 �m, elle peut être d'environ 130-200 !am pour la peau. Les systèmes de microscopie multiphoton couramment utilisés sont des microscopes de table tels que par exemple un microscope droit constitué d'un plateau optique en hauteur portant des dispositifs de balayage et de détection pour la constitution d'images. Le procédé peut par exemple mettre en oeuvre l'utilisation d'un microscope multiphoton du type ZEISS LSM 510 Meta. D'autres systèmes de microscopie multiphotonique sont utilisables. La demande GB 2 338 568 décrit ainsi un dispositif de microscopie multiphoton qui utilise une seule fibre optique pour transporter les impulsions du laser vers l'échantillon. Afin de limiter le phénomène de dispersion linéaire et non linéaire des impulsions dans la fibre optique, des moyens de compensation notamment par prismes sont divulgués. L'utilisation de la microscopie multiphotonique peut permettre une automatisation des étapes d'acquisition des images des matières kératiniques. Le procédé selon l'invention peut comporter, notamment après la première acquisition et avant la deuxième acquisition, l'exposition des matières kératiniques à un stimulus choisi parmi : un rayonnement lumineux, notamment solaire, ultra-violet (UVA et/ou UVB), infrarouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire, une action mécanique (tension, pression, pelage, décollement, exfoliation, peeling, abrasion). Il peut également comporter l'exposition des matières kératiniques à un stimulus choisi parmi : un rayonnement lumineux. notamment solaire, ultra-violet (UVA et/ou UVB), infrarouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire_ une action mécanique (tension, pression, stripping, exfoliation, peeling, abrasion) après traitement par un composé cosmétique ou son placebo. Le procédé peut comporter, notamment après la première acquisition et avant IO la deuxième acquisition, un traitement choisi parmi : l'application. l'injection, l'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d'un produit cosmétique. Le traitement peut correspondre à la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments. Il peut également comporter l'exposition des matières kératiniques à un traitement choisi parmi : l'application, l'injection, l'ingestion, l'inhalation d'un produit, notamment d'un produit 15 cosmétique ou la prise de compléments alimentaires et/ou de médicaments en comparaison à un traitement placebo. Par � produit cosmétique �, on entend un produit tel que défini dans la Directive 93/35/CEE du 14 juin 1993, modifiant la Directive 76/768/CEE. Les étapes d'acquisitions a) et b) peuvent être effectuées sur des matières 20 kératiniques d'un même individu. Il est ainsi possible d'évaluer l'efficacité du stimulus et/ou du traitement. Les étapes d'acquisitions a) et b) peuvent être effectuées respectivement sur des matières kératiniques d'un premier individu et sur des matières kératiniques d'un deuxième individu, distinct du premier individu. Le procédé peut comporter l'étape 25 consistant à comparer les informations obtenues selon l'étape e) pour chaque individu. De la sorte, il est par exemple possible de comparer l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement sur des individus ayant le même type ou non de matières kératiniques. Il est par exemple possible d'évaluer statistiquement l'efficacité du stimulus et/ou du traitement ou d'adapter le stimulus et/ou le traitement à des types particuliers de matières kératiniques, 30 notamment des types de peaux particuliers. Il est également possible de comparer des individus ou population différentes. Le procédé peut permettre de quantifier la surface et/ou le volume occupé par la mélanine dans les matières kératiniques. En particulier, l'information représentative de l'action du stimulus et/ou du traitement peut renseigner sur l'évolution de la surface et/ou du. volume occupé par la mélanine dans les matières kératiniques. Le procédé peut être utilisé in vitro, ex vivo et/ou in vivo sur des matières kératiniques. Le procédé peut comporter, notamment après la première acquisition et avant la deuxième acquisition, l'exposition à un stimulus et/ou un traitement ayant un effet dépigmentant. Le traitement peut correspondre à l'application d'un produit, notamment 1 0 cosmétique. Le produit peut par exemple être sous la forme d'une crème, une lotion, une pommade, une huile, une poudre, cette liste n'étant pas limitative. Le produit peut également être contenu dans un support à appliquer sur les matières kératiniques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle, par exemple un patch, un pansement, un bandage ou un masque. 15 Le produit peut ne pas être un produit pigmentant ou dépigmentant destiné uniquement à agir sur la quantité et/ou la répartition de la mélanine dans les matières kératiniques. Le produit peut ainsi être destiné par exemple au maquillage, à l'hydratation, à la protection des matières kératiniques, notamment solaire, ou à la réparation des matières kératiniques, tout en ayant des effets sur la quantité et/ou la répartition de la 20 mélanine dans les matières kératiniques. Le produit peut ainsi contenir différents composés, notamment des actifs autres que des actifs destinés à agir sur la mélanine des matières kératiniques. Le produit peut avoir un effet dépigmentant. Le produit peut par exemple comporter du rucinol. Ainsi, le traitement peut comporter l'application de rucinol ou tout 25 autre agent chimique modulateur de la pigmentation. Le rucinol est décrit dans l'article intitulé � Evalauation of ef icacy and safety of rucinol serunz in patients with melasma : a randomized controlled trial � (A.Khemis et al., British Journal of Dermatology, 2007 156, pp. 997-1004). Le procédé peut comporter un traitement d'images des première et/ou 30 deuxième acquisitions pour déterminer une information liée à la mélanine, notamment la quantité et/ou la répartition. On peut réaliser les étapes a), b) et c) du procédé selon l'invention pour des régions différentes des matières kératiniques, notamment sur au moins deux régions exposées différemment à un stimulus et/ou un traitement. par exemple deux régions exposées différemment à un rayonnement ultraviolet (UV) et/ou infrarouge (IR) et/ou deux régions ayant été traitées différemment par au moins un produit, notamment cosmétique. et on peut comparer les résultats obtenus pour ces régions quant à la distribution de la mélanine dans lesdites régions. On peut également comparer deux traitements dont l'un avec un composé cosmétique et l'autre avec son placebo. On peut, selon un aspect de l'invention, effectuer uniquement l'étape a), pour des populations différentes. On peut procéder à plusieurs acquisitions en des endroits différents des matières kératiniques et l'on peut traiter statistiquement les résultats des diverses acquisitions pour obtenir une valeur représentative d'un paramètre observé, notamment une valeur moyenne ou médiane. On peut comparer un résultat des première et/ou deuxième acquisitions avec des données de référence, lesquelles peuvent provenir de l'individu observé ou d'une population de référence. On peut comparer une information résultant de l'acquisition dans un premier intervalle de temps à une information résultant de l'acquisition dans un deuxième intervalle de temps, différent du premier. Cela peut permettre d'établir un diagnostic, un pronostic, ou de déterminer l'effet d'un stimulus et/ou d'un traitement, notamment d'un produit. Le traitement mis en oeuvre dans le procédé selon l'invention est avantageusement un traitement non thérapeutique. Le procédé peut permettre de visualiser la mélanine dans les matières kératiniques. Le procédé peut par exemple permettre de connaître la répartition de la mélanine dans les différentes couches de l'épiderme de la peau. L'étape e) du procédé selon l'invention peut par exemple comporter la représentation et/ou la quantification tridimensionnelle de la mélanine au sein des matières kératiniques. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, une méthode pour promouvoir un traitement, notamment non thérapeutique, dans laquelle on fait état d'une action du traitement sur la mélanine, mise en évidence par microscopie multiphotonique. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects. un procédé comportant l'étape consistant à faire état, lors de la commercialisation d'un produit, par exemple dans la publicité ou sur un emballage, du fait que l'efficacité du produit a été vérifiée par un procédé mettant en oeuvre une méthode de microscopie multiphotonique, notamment par un procédé tel que défini plus haut. L'invention a encore pour objet. selon un autre de ses aspects, un procédé de prescription d'un traitement, notamment non thérapeutique, notamment d'un produit cosmétique, censé agir sur la distribution. notamment la répartition et/ou la quantité, de la mélanine dans des matières kératiniques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle, comportant les étapes suivantes : effectuer au moins une acquisition représentative de la distribution. de la mélanine dans les matières kératiniques par microscopie multiphotonique, et au vu du résultat de l'acquisition, prescrire au moins un traitement. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé de traitement non thérapeutique des matières kératiniques, notamment de la peau humaine, reconstruite ou artificielle, comportant les étapes suivantes : - localiser au moins un mélanosome par microscopie multiphotonique, notamment en profondeur z et en xy, traiter à l'aide d'un système optique, notamment par microscopie multiphotonique, ledit au moins un mélanosome ainsi localisé de façon à modifier la distribution, notamment la quantité et/ou la répartition, de la mélanine dans les matières kératiniques. La localisation par microscopie multiphotonique peut avantageusement mettre en oeuvre l'utilisation d'un laser et d'un système de focalisation. Le système optique permettant de traiter ledit au moins un mélanosome peut comporter par exemple ledit laser et/ou tout ou partie dudit système de focalisation. L'invention pourra être mieux comprise à la lecture qui va suivre, de la description d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de celle-ci, et à l'examen des figures du dessin annexé, sur lequel : - la figure 1 illustre sous la forme d'un schéma-bloc des étapes d'un procédé conforme à l'invention, - la figure 2 représente, de façon schématique et partielle, un exemple de microscope multiphoton pouvant être mis en oeuvre dans un procédé selon l'invention, la figure 3a représente un exemple d'acquisition par microscopie multiphoton de matières kératiniques non traitées, - la figure 3b représente un exemple d'acquisition par microscopie multiphoton de matières kératiniques traitées au Lucinol�, et - les figures 4 et 5 illustrent graphiquement les quantités de mélanine en pourcentage, déterminées en fonction d'échantillons testés pour différents modèles de peau artificielles. On a illustré sur la figure 1, sous la forme d'un schéma-bloc, des étapes de mise en oeuvre d'un exemple de procédé conforme à l'invention. Dans une première étape 1, on effectue une première acquisition des matières kératiniques d'un individu, cette première acquisition étant représentative de la distribution, notamment de la quantité et/ou de la répartition, de la mélanine dans ces matières kératiniques. L'acquisition se fait par microscopie multiphotonique, par exemple à l'aide d'un microscope tel que représenté sur la figure 2, par exemple un microscope multiphoton du type ZEISS LSM 510 Meta. Dans une deuxième étape 2, on expose les matières kératiniques à un stimulus et/ou à un traitement, par exemple tels que ceux décrits précédemment. En particulier, le stimulus peut correspondre à une exposition à une source lumineuse, par exemple solaire. Le traitement peut aussi correspondre à l'application d'un produit, notamment cosmétique, par exemple pigmentant ou dépigmentant. Puis dans une troisième étape 3, on effectue une deuxième acquisition des matières kératiniques, de préférence sensiblement au même emplacement que pour la première acquisition, cette deuxième acquisition étant représentative de la distribution, notamment de la quantité et/ou de la répartition, de la mélanine dans les matières kératiniques. L'acquisition se fait par microscopie multiphotonique, par exemple avec le même microscope que celui utilisé pour la première acquisition, ou un autre microscope, de type différent ou non. Dans la quatrième étape 4, on compare les première et deuxième acquisitions et dans la cinquième étape 5, on génère une information représentative de l'action du stimulus et/ou du traitement sur la distribution de la mélanine des matières kératiniques. L'information ainsi générée peut permettre d'évaluer l'efficacité du stimulus et/ou du traitement sur la distribution de la mélanine pour l'individu considéré, ou bien encore pour un type d'individus par répétition du procédé selon l'invention sur différents individus et par traitement statistique des informations générées. En outre, l'information générée peut aussi permettre d'établir des diagnostics adaptés à l'individu et par exemple de prescrire un traitement, notamment un produit cosmétique, qui soit adapté à l'individu. Les étapes 4 et 5 peuvent être réalisées successivement ou simultanément. Les étapes 1 à 5 du procédé peuvent être automatisées, en partie ou totalement. On a représenté sur la figure 2, de façon schématique et partielle, un exemple de microscope multiphoton 100 pouvant être mis en ouvre dans un procédé selon l'invention. Le microscope multiphoton 100 est par exemple du type Zeiss LSM 510 Meta. Le microscope 100 comporte un laser femtoseconde 10, par exemple un laser Titane-Saphir (Ti : Sa) du type Mai Tai C> Haute Performance, accordable dans une gamme des longueurs d'onde infrarouge (par exemple entre 700 et 1000 nm) et pouvant fournir des impulsions de l'ordre de 1.00 femtosecondes à un taux de répétition autour de 80 MHz. Le laser 10 émet un faisceau infrarouge 11, qui est dirigé vers un dispositif de balayage 12 du faisceau laser sous la forme d'un � scanner XY �. Un balayage du faisceau laser peut être obtenu en déplaçant angulairement deux miroirs galvanométriques du dispositif de balayage 12. Le faisceau passe ensuite à travers un miroir dichroïque 14 et il est focalisé sur les matières kératiniques 13 à l'aide de l'objectif 15. Ainsi, les deux miroirs galvanométriques permettent un balayage du point de focalisation dans le plan (x, y) perpendiculaire à la direction de propagation du faisceau (axe z). Une platine de translation verticale motorisée permet de translater l'objectif 15 ou les matières kératiniques 13 et de changer ainsi le plan de focalisation dans les matières kératiniques 13. De la sorte, il est possible de reconstituer la distribution tridimensionnelle de la mélanine dans les matières kératiniques par superposition des images acquises. Pour ce faire, les signaux créés au point focal peuvent alors être détectés soit en transmission à travers un condenseur, soit en épicollection à travers l'objectif d'excitation 15. Le premier miroir dichroïque 14 permet de réfléchir les signaux multiphoton créés, notamment l'autofluorescence (AF) provenant des matières kératiniques 13, et permet aussi de bloquer le faisceau laser infrarouge (III). Puis, un deuxième miroir dichroïque 16 permet de séparer les signaux d'autofluorescence (AF) des autres signaux multiphotonS, correspondant par exemple à la génération de seconde harmonique (SHG). Dans tous les cas, les signaux passent au travers de filtres spectraux 17 et arrivent sur les détecteurs 18, 19, par exemple du type tube photomultiplicateur, permettant de cette façon de faire une image combinée, par exemple AF/S%1G. Les premier et deuxième détecteurs 18 et 19 permettent respectivement de générer des signaux 18a et 19a qui sont transmis à un dispositif électronique 20 d'acquisition et de traitement des signaux. Exemples On a réalisé une étude par microscopie multiphoton de deux modèles industriels d'épidermes reconstruits pigmentés, à savoir Episkin� et Skinethiet Pour chaque modèle d'épiderme pigmenté étudié, on a évalué l'effet d'un traitement par un actif dépigmentant du type Lucinol�, par une analyse statistique de la surface mélanique intra-épidermique. Protocole expérimental On a reproduit plusieurs échantillons à partir des modèles Episkin`a; et SkinethicCi En particulier, quatre séries de trois échantillons ont été réalisées à partir du modèle Episkin", chaque série étant respectivement traitée par 3 �L (microlitres) d'une solution de Lucinol� à 700 �M (micromol/L), 3 �L d'une solution de Lucinol� à 500 �M, 3 pal de solvant du Lucinol� (placebo), à savoir le diméthylsulfoxyde (DMSO), et non traitée. Concernant le modèle Skinethice, trois séries de trois échantillons ont été réalisées, chacune de ces séries étant respectivement traitée par 3�L d'une solution de Lucinol e à 700 11M, 3 p L d'une solution de Lucinol� à 500 1M, 3�l de solvant (placebo) DMSO. Le récapitulatif des échantillons réalisés figure dans les tableaux 1 et 2 ci- dessous. Traitement Nombre d'échantillons aucun (témoin) 3 DMS0 Episki~L Lucinole 500 �M 3 1 n Lucinole 700 uni Tableau 1 Traitements Nombre d'échantillons DMSO 3 Lucinol?7 500 �M 3 Skinethice Luci.nol ~~ 700 �m 3 Tableau 2 A l'aide d'un microscope multiphoton, notamment du type ZEISS LSM 510 Méta, on a réalisé plusieurs acquisitions des échantillons précités, selon des coupes bidimensionnelles dans l'épiderme. La superposition des coupes optiques bidimensionnelles (x, y) ainsi obtenues IO selon un axe vertical (z) à l'aide d'un logiciel de traitement d'images adapté permet alors de visualiser la répartition et la quantité de la mélanine présente dans l'épiderme des échantillons étudiés, par observation des pixels noirs ainsi visibles après un seuillage adapté. Analyse des résultats 15 A titre d'exemple, la figure 3a illustre l'image observée dans le cas d'un échantillon traité par le placebo du Lucinole, et la figure 3b illustre l'image observée dans le cas d'un échantillon traité par une solution de Lucinol�. On constate que le Lucinol� ayant un effet dépigmentant, on observe une quantité moindre de zones noires sur la figure 3b que sur la figure 3a. 20 En outre, les figures 4 et 5 illustrent, respectivement pour le modèle Skinethic� et pour le modèle Episkin�, la quantité de mélanine en pourcentage déterminée pour chacun des échantillons. Il est ainsi possible de visualiser graphiquement, de façon précise et simple, l'efficacité du Lucinol� et de son solvant (DMSO) sur la répartition et la quantité de 25 mélanine dans les échantillons testés. Les acquisitions réalisées à l'aide de la technologie par microscopie multiphotonique sur les échantillons peuvent ainsi permettre d'évaluer l'efficacité de l'application d'un produit sur les matières kératiniques, notamment de l'application de I'actif dépigmentant du type Lueinol� sur les deux modèles de peau Episkin"t\ et Skinethic. En particulier, la comparaison des acquisitions réalisées sur les échantillons traités avec une solution de Lucinol� et des échantillons traité par le placebo du Lucinol�, peut permettre d'évaluer quantitativement l'efficacité du Lucinol�. Une étude statistique des résultats obtenus sur les échantillons peut égaiement 5 être réalisée afin de déterminer l'efficacité du Lucinol e. L'expression � comportant un � doit être comprise comme étant synonyme de � comportant au moins un �. 10 REVENDICATIONS1. Procédé pour évaluer la pigmentation ou l'action d'un stimulus et/ou d'un traitement cosmétique sur la pigmentation censé agir sur la distribution, notamment sur la répartition et/ou la quantité, de la mélanine dans des matières kératiniques, notamment la peau humaine, reconstruite ou artificielle, comportant les étapes consistant à : d) effectuer, avant exposition des matières kératiniques au stimulus et/ou avant le traitement, une première acquisition représentative de la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques, par microscopie multiphotonique, e) effectuer, après exposition des matières kératiniques au stimulus et/ou après le traitement, une deuxième acquisition, par exemple sensiblement au même emplacement que la première acquisition, par microscopie multiphotonique, cette deuxième acquisition étant représentative de la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques, f) comparer les première et deuxième acquisitions et générer sur la base au moins de cette comparaison une information représentative de l'action dudit stimulus et/ou dudit traitement sur la distribution de la mélanine dans lesdites matières kératiniques. 2. Procédé selon la revendication 1, comportant, notamment après la première acquisition et avant la deuxième acquisition, l'exposition des matières kératiniques à un stimulus choisi parmi : un rayonnement lumineux, notamment solaire, ultra-violet (UV), infra-rouge (IR), un stimulus provoquant une réponse inflammatoire, une action mécanique. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, comportant, notamment 25 après la première acquisition et avant la deuxième acquisition, l'application d'un produit cosmétique. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les étapes d'acquisition a) et b) étant effectuées sur des matières kératiniques d'un même individu. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, les étapes 30 d'acquisition a) et b) étant effectuées respectivement sur des matières kératiniques d'un premier individu et sur des matières kératiniques d'un deuxième individu distinct dupremier individu, le procédé comportant une étape consistant à comparer les informations obtenues selon l'étape c) pour chaque individu. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, l'information représentative de l'action du stimulus et/ou du traitement renseignant sur 5 l'évolution de la surface et/ou du volume occupé par la mélanine dans les matières kératiniques. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les matières kératiniques étant choisies parmi la peau humaine, la peau reconstruite et la peau artificielle. 10 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, étant mis en oeuvre in vivo sur des matières kératiniques. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant l'exposition, notamment après la première acquisition et avant la deuxième acquisition, à un stimulus et/ou un traitement cosmétique ayant un effet dépigmentant. 15 10. Procédé selon la revendication précédente, le traitement comportant l'application de rucinol ou tout autre agent chimique modulateur de la pigmentation. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel on réalise les étapes a), b) et c) pour des régions différentes des matières kératiniques, notamment au moins deux régions exposées différemment à un stimulus et/ou 20 à un traitement, par exemple deux régions exposées différemment à un rayonnement ultraviolet (UV) et/ou infrarouge (IR) et/ou deux régions ayant été traitées différemment par au moins un produit cosmétique, et dans lequel on compare la distribution de la mélanine dans lesdites régions au vu des résultats obtenus pour ces régions. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 25 lequel on réalise l'étape a) uniquement, pour des populations différentes. 13. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape a) est réalisée avec un placébo d'un produit et l'étape b) avec ce produit. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape c) comporte une représentation tridimensionnelle de la mélanine au sein des 30 matières kératiniques. 15. Procédé comportant les étapes. consistant à : - effectuer au moins une acquisition représentative de la distribution de la mélanine, par microscopie multiphotonique, dans des matières kératiniques d'un individu ou sur des échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un composé cosmétique, et au moins une acquisition représentative de la distribution de la mélanine dans les matières kératiniques du même individu ou des mêmes échantillons de peau artificielle ou reconstruite qui ont été traités par un placebo du composé cosmétique, calculer une valeur représentative, notamment moyenne ou médiane, de la distribution ou de la quantité de la mélanine et comparer à l'aide d'au moins un outil statistique les deux traitements.10