Brevet FR2941959A1 — publié le 20100813

PROCEDES DE PRODUCTION D'ACIDE SUCCINIQUE La présente invention concerne des procédés de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation en conditions anaérobies. L'acide succinique (ou acide butanedioïque) est un acide organique avec deux groupes carboxyles, de formule semi-développée COOH-CH2-CH2-COOH, qui intervient dans le métabolisme cellulaire, comme intermédiaire métabolique du cycle de Krebs dans la mitochondrie. Il trouve de nombreuses applications dans les domaines cosmétiques, agroalimentaires, pharmaceutiques, textiles et dans les plastiques. Ainsi il est par exemple utilisé comme intermédiaire de synthèse des plastiques pour la fabrication de 1,4 butanediol, de tétrahydrofuranne et de gammabutyrolactone. De nouveaux produits dérivés de l'acide succinique sont en constant développement, incluant le développement de polyesters. Généralement, les esters de l'acide succinique ont le potentiel d'être de nouveaux solvants "verts" qui peuvent substituer les solvants plus nuisibles pour l'homme et l'environnement. La production d'acides carboxyliques, tels que l'acide malique, l'acide succinique ou l'acide fumarique, à partir de matières premières renouvelables (en l'occurrence par le 20 biais des processus de fermentation) est connue de l'Homme du métier. Le succinate est un intermédiaire métabolique lors de la fermentation anaérobie par des bactéries produisant du propionate, mais ces procédés de fermentation résultent en la production de très faibles rendements et titres en acide succinique. Ces dernières années, beaucoup de microorganismes producteurs d'acide succinique ont 25 été isolés, comme par exemple les bactéries anaérobies du rumen, Bacteroides ruminicola et Bacteroides amylophilus. Toutefois, les organismes du Rumen sont très instables lors des procédés de fermentations, et ne sont donc pas utilisables de manière industrielle pour la production d'acide succinique. On sait depuis longtemps qu'un mélange de plusieurs acides, dont l'acide succinique est 30 produit à partir de la fermentation de E. coli en présence de glucose et de CO2 comme substrats carbonés, comme décrit par JL Stokes en 1949 � Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli � J. Bacteriol., 57: 147-158. Cependant, pour chaque mole de glucose fermentée, seule 0.3 à 0.4 Moles d'acide succinique sont produites. Des études ont donc été menées sur des bactéries, en particulier Escherichia coli, modifiées génétiquement de manière à inactiver les voies métaboliques consommant le NADH nécessaire à la fabrication de l'acide succinique et de manière à activer les voies métaboliques de production du succinate (sel de l'acide succinique). En effet, le chemin métabolique fermentaire qui permet la conversion de l'oxaloacétate en malate, puis fumarate et enfin succinate nécessite deux moles de NADH par mole de succinate produit. Le verrou métabolique majeur pour la production de succinate et donc la biodisponibilité cellulaire en NADH. Pour solutionner cette difficulté, le document US 7.223.567 décrit l'utilisation d'une souche Escherichia coli recombinante surproductrice de succinate pour la même quantité de NADH disponible. Cette souche Escherichia coli SBS550 MG pHL 413 présente une inactivation des produits des gènes adhE, ldhA (impliqués dans les voies consommatrices de NADH), et une inactivation des produits des gènes ack-pta et du gène iclR (activant la voie glyoxylate), et contient un vecteur plasmidique surexprimant un gène PYC exogène. L'article de Sanchez et al. (intitulé �Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity � in Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239), le brevet américain US 7 223 567 et la demande de brevet américain US 2005/0042736 ont développé de nouvelles conditions de culture et de production associées à cette souche pour améliorer ses rendements de production en acide succinique. L'homme du métier recherche constamment de nouveaux procédés améliorés de production d'acide succinique. En particulier, l'homme du métier cherche à optimiser le rendement et la productivité obtenus. En outre, la production d'acide succinique par des souches d'Escherichia coli s'accompagne généralement d'une production d'acide orotique (et/ou d'ions orotates). La présence d'acide orotique dans les moûts de fermentation est indésirable, car cet acide rend la purification d'acide succinique plus complexe et plus onéreuse. L'homme du métier cherche donc à minimiser la production d'acide orotique, tout en maintenant par ailleurs des rendements acceptables pour la production d'acide succinique. Selon un aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'acide succinique, comprenant : (a) une étape de culture d'une souche d'Escherichia coli dans un milieu de culture, où ladite étape (a) comprend : (a-1) une étape de culture de la souche en conditions aérobies lors de laquelle du glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, et durant laquelle la concentration en glucose dudit milieu de culture est inférieure ou égale à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure ou égale à 0,3 g/L et plus préférentiellement encore inférieure ou égale à 0,1 g/L ; (a-2) optionnellement, une étape de culture intermédiaire ; (b) une étape de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) en conditions anaérobies en présence de CO2; (c) une étape de conversion des ions succinate formés à l'étape (b) en acide succinique ; (d) optionnellement, une étape de purification de l'acide succinique. Les techniques de culture de souches d'Escherichia coli font partie des connaissances générales du domaine technique de la présente invention. En particulier, l'homme du métier sait déterminer des milieux et conditions de culture (température, agitation, ...) adaptés pour une souche donnée. Selon un mode de réalisation, l'étape (a) peut comprendre une étape de pré-culture (a-0) avant l'étape de culture (a-1). La notion de � fed-batch � est également connue de l'homme du métier, et correspond généralement à une alimentation programmée au cours du temps (apport ou ajout contrôlé au cours du temps) d'au moins un substrat ou un ingrédient du milieu de culture, ou un réactif gazeux. Le mode � fed-batch � selon l'invention peut être notamment exponentiel ou linéaire. Selon un mode de réalisation, l'ajout du glucose en � fed-batch � peut être piloté par un système informatique. Avantageusement selon l'invention, et de manière totalement inattendue, en comparaison avec un ajout de glucose selon un mode de batch simple (apport en une fois à un instant donné), non seulement le mode � fed-batch � permet de réduire drastiquement la production d'acide orotique et d'augmenter le rendement en biomasse, mais également, de manière surprenante, le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement de production en acide succinique et la productivité spécifique d'une souche donnée. Le glucose peut être ajouté sous forme de sirop. De préférence, le glucose est ajouté dans le milieu de culture sous forme de sirop, par exemple de sirop à des concentrations de 100 à 700 g/L. L'homme du métier sait mesurer la concentration en glucose d'un milieu de culture. Par exemple, il est possible d'opérer des prélèvements dudit milieu de culture et de procéder à un dosage, par exemple de type dosage enzymatique ou quantification par CLHP. Une autre possibilité est d'analyser la composition du gaz en sortie de fermenteur, notamment par le mesure du ratio [02] / [CO2]. Cette méthode peut avantageusement être implémentée en ligne en continu en sortie du fermenteur. Selon un mode de réalisation, l'étape (a) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,75. L'homme du métier est par ailleurs familier avec les techniques de fermentation (telles que notamment décrites dans Fermentation & Biochemical Engineering Handbook : principles, process design & equipment, 2nd ed 1996 de VOGEL Henry C. et TODARO Celeste L.). La fermentation est une réaction biochimique qui consiste généralement à libérer de l'énergie, ou à produire certains métabolites d'intérêt, à partir d'un substrat organique sous l'action d'enzymes microbiennes. La fermentation est généralement conduite dans des dispositifs (fermenteurs) adaptés au processus de fermentation, c'est-à-dire adaptés à la culture de microorganismes dans les conditions voulues (dispositifs permettant le cas échéant de contrôler les équilibres gazeux du milieu de culture, notamment par des conduits d'entrée et/ou de sortie en gaz, évents, etc ; dispositifs permettant l'introduction de milieu de culture et autres substances ; dispositifs permettant de contrôler, réguler, modifier d'autres types de paramètres, tels que l'agitation, la température, le pH, etc). L'homme du métier est également familier avec la fermentation en conditions anaérobies. Selon la présente invention, ceci désigne des conditions de culture en l'absence d'oxygène. De manière préférée, des conditions de culture anaérobies sont des conditions de culture en présence de dioxyde de carbone. Selon un mode de réalisation, les conditions de fermentation anaérobies en présence de CO2 et/ou avec apport de CO2 sont des conditions de fermentation en saturation de CO2. Selon un mode de réalisation, l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,75. Selon un mode de réalisation, l'étape (c) comprend une acidification. L'acidification peut notamment être réalisée par ajout d'au moins un acide choisi parmi l'acide orthophosphorique, l'acide oxalique, l'acide sulfurique. Ces acides peuvent être ajoutés purs ou sous forme de solutions aqueuses concentrées. Selon un mode de réalisation, l'étape optionnelle de purification (d) comprend une purification éthanolique qui se déroule comme suit : - filtration (élimination d'un précipité protéique), par exemple sur Büchner et/ou sur terre de filtration du mout acidifié, - optionnellement, concentration du filtrat par évaporation sous vide (de préférence, suivant un facteur de concentration entre environ 2 et 8), - ajout d'éthanol, par exemple de l'éthanol 95%, dans un rapport 1/1 à 5/1, pour provoquer la précipitation des sels (l'acide succinique reste soluble), - séparation du précipité salin par filtration, par exemple sur une membrane, - récupération de l'éthanol par évaporation sous vide, - traitement sur charbon actif, puis filtration sur plaque et terre de filtration. En outre, l'étape de purification peut être suivie d'une étape de cristallisation de l'acide succinique purifié. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-1), le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch � à une vitesse G(t) telle que : G(t) L'homme du métier sait déterminer le taux de croissance u d'une souche donnée en conditions aérobies : dans des conditions de croissance exponentielle, la population de cellules de la souche suit généralement une équation du type : N1 / No = exp [u . (T1 ùTo)] où : - No = nombre de cellules au temps To - N1 = nombre de cellules au temps T1 > To. L'homme du métier sait donc déterminer la valeur de u de manière expérimentale, par exemple avec des mesures de densité optique. En optimisant les conditions de croissance, l'homme du métier peut ainsi déterminer la valeur �max pour une souche donnée. Selon un mode de réalisation, 0,25 �max a �max ; de préférence 0,50 �max a �max ; de préférence 0,60 �max Selon un autre mode de réalisation, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch � exponentiel puis linéaire. Ainsi, dans ce cas, le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch � tel que l'étape (a-1) comprend : (a-1)(i) une étape (de to à t1) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, tel que : G(t) = Go . exp(a.t) et (1/4) �max a �max ; et (a-1) (ii) une étape (de tl à t2) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, tel que G(t) = Go . exp(a.ti) avec G(t), Go, a, u et �max tels que décrits ci-dessus. Selon un mode de réalisation préférentiel, au début de l'étape (a-1) (� fed-batch � linéaire ou exponentiel), le milieu de culture contient une concentration en glucose 0 à 0,5 g/L, de préférence 0 à 0,2 g/L. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a-1) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7.0. Dans tous les cas, en fin d'étape (a-1), la concentration en glucose dans le milieu de culture est de préférence 0-5, de préférence 0-2, de préférence 0-1, de préférence 0-0,5 g/L de glucose. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend une étape de culture intermédiaire (a-2). Lors de l'étape (a-2), on peut ajouter dans le milieu de culture : - du glycérol, et/ou - de l'acide gluconique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide succinique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. Selon un premier mode préférentiel de réalisation du procédé selon l'invention, lors de l'étape (a-2) on peut ajouter dans le milieu de culture : - de l'acide acétique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci. Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon l'invention, lors de l'étape (a-2) on peut ajouter dans le milieu de culture de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. L'ajout peut se faire selon différentes modalités : ajout d'une suspension et/ou ajout d'une solution et/ou ajout d'un solide (par exemple sous forme de poudre). Avantageusement, l'ajout de ces composés permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 5-15 g/L, de préférence 7-12 g/L, de préférence environ 10 g/L de glycérol. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 5-15 g/L, de préférence 7-12 g/L, de préférence environ 10 g/L d'acide gluconique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide gluconique peut être ajouté sous forme de gluconate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2-15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide pyruvique peut être ajouté sous forme de pyruvate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2-15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide malique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide malique peut être ajouté sous forme de malate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2- 15 g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide succinique (ou équivalent de l'un de ses sels). L'acide succinique peut être ajouté sous forme de succinate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2) on ajoute dans le milieu de culture 2- g/L, de préférence 3-12 g/L, de préférence environ 4 g/L d'acide acétique (ou 15 équivalent de l'un de ses sels). L'acide acétique peut être ajouté sous forme d'acétate de sodium. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide malique ou un sel de celui-ci. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : - 2-10 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et - 2-10 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture - 3-5 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et - 3-5 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : - 2-10 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), - 2-10 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et - 1-10 g/L d'acide acétique (ou équivalent d'un sel de celui-ci). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : - 3-5 g/L d'acide pyruvique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), - 3-5 g/L d'acide malique (ou équivalent d'un sel de celui-ci), et - 1,5-2,5 g/L d'acide acétique (ou équivalent d'un sel de celui-ci). Toutes les concentrations et combinaisons de concentrations mentionnées ci-dessus pour les ajouts de glycérol, acide gluconique, acide pyruvique, acide malique, acide succinique, acide acétique et le cas échéant de leurs sels peuvent être préférentiellement utilisées lorsque la concentration en biomasse en fin de l'étape (a-1) est d'environ 10 g/L. En outre, ces concentrations peuvent avantageusement être doublées pour une concentration en biomasse d'environ 20 g/L en fin de l'étape (a-1) ; triplées pour une concentration en biomasse d'environ 30 g/L en fin de l'étape (a-1), etc. Selon un mode de réalisation particulier, le glycérol et les acides organiques mentionnés ci-dessus (et/ou leurs sels) peuvent être ajoutés par ajout, dans le milieu de culture, de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation. Ceci permet avantageusement de recycler une partie des eaux-mères de cristallisation obtenues précédemment comme source d'acides organiques et autres substrats. Plus généralement, selon un mode de réalisation avantageux, lors de l'étape (a-2), on ajoute, dans le milieu de culture, toute composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique. Ceci peut notamment inclure l'ajout de différents éluats obtenus lors de tels procédés de production ou de purification. Avantageusement, ceci permet de recycler une partie des sous-produits obtenus. Selon un autre mode de réalisation préféré, lors de l'étape (a-2), - on ajoute du glucose dans le milieu de culture, et - on maintient une valeur de pression partielle en 02 dans le milieu de culture dans un intervalle de 0-5%, de préférence 0-2%, de préférence 0-1% ; et - on régule la valeur du pH du milieu de culture. L'homme du métier est familier avec la notion de pression partielle d'un gaz dans un milieu liquide. En particulier, l'homme du métier sait déterminer et réguler la pression partielle en 02 (pO2) dans un milieu de culture. Par exemple, il est possible de maintenir une certaine valeur de pO2 dans un fermenteur en ajustant les paramètres d'agitation du milieu de culture. L'homme du métier sait parfaitement réguler le pH du milieu de culture. Par �réguler le pH �, on entend selon la présente invention, l'action de maintenir la valeur du pH du milieu de culture dans un certain intervalle ou sélection de valeurs. Selon l'invention, le pH peut être régulé de différentes façons : - régulation dans un intervalle : la valeur du pH est maintenue dans un certain intervalle de valeurs. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois sortir de l'intervalle considéré ; - régulation � point bas � : la valeur du pH est maintenue au dessus d'une valeur seuil. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois descendre en deçà de la valeur seuil ; - régulation à une valeur unique : la valeur du pH est maintenue à cette valeur de manière constante au cours du temps. L'homme du métier peut notamment utiliser des acides (par exemple, acide sulfurique concentré, acide chlorhydrique concentré) ainsi que des bases (solutions concentrées de 20 NaOH, solutions de NH3, etc). Selon l'invention, lors de l'étape (a-2), le glucose peut être ajouté en une ou plusieurs fois. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en une fois. Par exemple, il est possible d'ajouter en une fois dans le milieu de culture 5-15, de 25 préférence 8-12, de préférence environ 10 g/L de glucose en une fois. Le pH du milieu de culture peut être régulé par ajout d'au moins un acide minéral. L'acide minéral peut typiquement être choisi parmi l'acide chlorhydrique ou l'acide sulfurique, pur(s) ou concentrés(s). Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en plusieurs 30 fois. Par exemple, il est possible d'ajouter du glucose dans le milieu de culture en 5 à 15 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois). Selon un mode de réalisation, on peut ajouter dans le milieu de culture environ 1, 1,5 ou 2 g/L de glucose en 5 à 15 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois). On peut également ajouter du glucose dans le milieu de culture en 20 à 40 fois (ou en 25 à 35 fois, ou en 30 fois). Par exemple, on peut ajouter dans le milieu de culture environ 0,1, 0,3, ou 0,5 g/L de glucose en 15 à 30 fois (ou en 8 à 12 fois, ou en 10 fois). Dans ce cas, le pH peut avantageusement être régulé de la manière suivante : après un premier ajout de glucose (par exemple de 1 g/L), l'ajout de glucose suivant (par exemple, de lg/L) est effectué dès qu'une augmentation de pH de 0,2 unités est observée ; et ainsi de suite. Alternativement, les ajouts de glucose peuvent être programmés dans le temps à intervalles réguliers, et le pH peut être régulé à une valeur unique ou dans un intervalle par ajout d'au moins un acide minéral. Selon un mode de réalisation, lors de l'étape (a-2), le pH du milieu de culture est régulé par ajout de glucose : l'ajout du glucose est asservi aux variations du pH du milieu de culture. Il est ainsi possible, par exemple, de fixer une valeur de consigne (régulation à une valeur unique), et de fixer une tolérance (par exemple 0,01 ou 0,02 unités de pH), et d'ajouter le glucose de sorte à ce que le pH du milieu de culture soit maintenu à la valeur de consigne (dans la tolérance choisie). Avantageusement, les procédés ci-dessus permettent de minimiser les ajouts de neutralisants (acides et bases, notamment acides et bases minéraux), et ainsi de minimiser la charge saline (force ionique) du milieu de culture. Ceci permet avantageusement de faciliter la purification ultérieure de l'acide succinique. Avantageusement, cette étape (a-2) permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique. Selon un mode de réalisation préféré, lorsque l'on ajoute du glucose lors de l'étape (a- 2), la pression partielle en 02 du milieu de culture est maintenue à une valeur pO2 = 0 %. Selon un mode de réalisation préféré, l'étape (a-2) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7.0. Dans tous les cas, si une étape (a-2) est effectuée, en fin d'étape (a-2), le milieu de culture a de préférence une concentration de 0-5, de préférence 0-2, de préférence 0-1, de préférence 0-0,5 g/L en glucose. Selon un mode de réalisation, l'étape (a-1) et/ou l'étape (a-2) et/ou l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,5-7,0, de préférence 6,4-7.0. Selon un mode de réalisation préféré, la souche d'Escherichia Coli est une souche qui possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC. Ce génotype permet avantageusement de favoriser la production d'acide succinique par fermentation en présence de CO2. Le symbole A indique que le gène en question a été inactivé, par exemple par mutation, délétion, interruption, insertion, ou � clown �-régulation, par exemple par introduction d'un codon stop, insertion ou délétion résultant en un changement du cadre de lecture, mutation ponctuelle, etc. Le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC correspond donc â : - AadhE : inactivation de l'alcool déshydrogénase ; - AldhA : inactivation de la lactate déshydrogénase ; - AiclR : inactivation du répresseur de l'isocitrate lyase (également connue sous le 15 nom de aceA) - Aackpta : inactivation de l'acétate kinase-phosphotransacétylase ; - PYC : expression d'un gène de pyruvate carboxylase. Ceci indique que la souche exprime le gène PYC, par exemple grâce à une transformation par un plasmide portant un exemplaire fonctionnel de ce gène, ou par intégration génomique d'un 20 exemplaire fonctionnel de PYC. Le gène PYC est avantageusement le gène pyc de Lactococcus lactis. Selon un mode de réalisation très préféré, la souche d'Escherichia Coli est la souche SBS550MG ù pHL413. Cette souche est décrite dans Sanchez et al., Metabolic Engineering, 7 (2005) 229-239, et dans les documents US 7,223,567 et US 25 2005/0042736. La souche SBS550MG ù pHL413 possède une valeur de �max de 0,38. Par ailleurs, la présente invention concerne également l'utilisation d'un ajout en glucose selon un mode � fed-batch �, notamment exponentiel ou linéaire, pour minimiser la production d'acide orotique dans un procédé de production d'acide succinique et/ou 30 d'ions succinate par fermentation d'une souche d'Escherichia coli. Enfin, la présente invention concerne l'utilisation d'une composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition liquide étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation, pour la préparation d'un milieu de culture destiné à l'étape (a-2) selon l'invention, telle que décrite ci-dessus. L'invention est illustrée par les exemples de réalisation ci-dessous, qui sont non-limitatifs. Exemples La souche utilisée est la souche SBS550MG ù pHL413. (Toutes les concentrations indiquées ci-dessous sont sur la base du volume initial du milieu de culture à l'étape considérée). Pour chaque exemple, le schéma du protocole est le suivant : Phase de croissance, production de biomasse : - Pré-culture en Erlenmeyer ; - Culture en conditions aérobies avec ajout de glucose ; - Optionnellement, étape de culture intermédiaire. - 250 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ; - Composition du milieu : Tryptone 10 g/L Extrait de levure 5 g/L NaCl 10 g/L - Antibiotiques (ampicilline, carbenicilline, oxacilline) 67 mg/L Durée : 24 h ; température : 37°C ; agitation : 100 rpm. Production d'acide succinique : - Culture en conditions anaérobies en présence de CO2. Chaque étape est détaillée ci-dessous : Pré-culture : 30 La pré-culture est ensuite transférée dans un fermenteur de 30L de type Sartorius. Culture en conditions aérobies avec ajout de glucose : - Milieu : voir composition Tableau 1 ci-dessous. Volume initial de milieu 15 L ; - pH régulé à 6,75 avec NH3; ; - Ajout en glucose : o Soit en mode batch (simple) : ajout de 30 g/L (en une fois) ; o Soit en mode � fed-batch � : ajout de 5g/L, puis, après consommation, étape (a-1) avec ajout exponentiel d'une concentration cumulée de 25 g/L (valeur de a indiquée dans le Tableau 2) ; - Durée : 15 - 20 h ; température : 37°C ; - Aération : 1 vvm ; - pO2 (pression partielle en 02) maintenue à 20% par l'agitation. Culture intermédiaire = étape (a-2) (le cas échéant) : - Milieu : voir composition Tableau 1 ci-dessous ; - pH régulé à 6,75 par ajout d'une solution de NaOH (8N) et/ou de H2SO4 (4N) ù sauf mention contraire dans le Tableau 2 ; - Ajout en divers composés (dont glucose) : voir Tableau 2 ; - Durée : 1- 8 h ; température : 37°C ; - Aération : 1 vvm ; - pO2 maintenue à 20% par agitation (agitation variant entre 300 et 1 000 rpm) ou à 0% (agitation fixée à 350 rpm). Production d'ions succinates = étape (b) : - pH régulé à 6,75 par ajout d'une solution de NaOH (8 N) ; - Ajout de glucose : 60 g/L en une fois ; - Durée : 24 - 48 h ; température : 37°C ; - Apport en CO2 (débit d'injection) : 0,2 vvm ; - Agitation : 200 rpm. Résultats : Avantageusement selon l'invention, et de manière totalement inattendue, en comparaison avec un ajout de glucose selon un mode de batch simple, non seulement le mode � fed-batch � (étape (a-1) selon l'invention) permet de réduire drastiquement la production d'acide orotique, mais également, de manière surprenante, le procédé selon 5 l'invention permet d'augmenter le rendement en biomasse, ainsi que le rendement de production en acide succinique et la productivité spécifique d'une souche donnée. En outre, l'étape (a-2) selon l'invention permet d'augmenter encore le rendement de production d'acide succinique et la productivité spécifique. Tableau 1 : Composition du milieu de culture Les concentrations indiquées sont exprimées par rapport au volume initial. g/L K2HPO4 3,6 MgSO4.7H2O 1,0 Acide citrique 8 Glucose Selon les protocoles/étapes Voir Tableau 2 NH3 28% (mL) 90 mg/L ZnSO4.7H2O 30 CuC12.2H20 10 MnSO4.H2O 30 CoC12.6H20 1,2 H3BO3 1 Na2MoO4.2H20 6 Al2(SO4)3.18H2O 7,5 NiSO4.6H2O 4 FeSO4.7H2O 90 CaC12.2H20 300 Biotine 1 Thiamine 1 Ampicilline 200 Tableau 2 : Description des protocoles et résultats E Etape (a-1) Etape (a-2) C 'cl,' .E" -a L c; (ajout de -oglucose) E. ô ô ô ~ ~ Q 1 Batch 30 g/L - 0,24 390 63,0 0,10 2 Batch 30 g/L Ajouts multiples glucose 10 x 1 g/L 0,23 410 87,0 0,19 (ajouts déclenchés quand le pH = 7) pO2=0 % sans ajout de NaOH ou de H2SO4 3 Fed-batch - 0,29 138 71,7 0,15 exponentiel a = 0,28 4 Fed-batch Ajout en batch 0,29 120 95,2 0,21 exponentiel 4 g/L acide pyruvique a = 0,28 + 4 g/L acide malique + 2 g/L acide acétique p02 = 20 % Fed-batch en batch 10 g/L glucose 0,31 94 93,0 0,19 exponentiel p02 = 0 % exponentiel a = 0,28 6 Fed batch Ajouts multiples glucose 10 x 1 g/L 0,30 80 85,9 0,18 exponentiel (ajouts déclenchés quand le pH = 7) a = 0,28 pO2=0 /o sans ajout de NaOH ou de H2SO4 7 Fed-batch Ajouts multiples glucose 30 x 0,3 0,28 80 91,0 0,24 exponentiel g/L (ajouts déclenchés quand le pH a=0,28 = 7) pO2=0% sans ajout de NaOH ou de H2SO4 8 Fed-batch en batch 10 g/L glycérol 0,31 135 79,0 0,14 exponentiel p02 = 20 % exponentiel a = 0,28 9 Fed-batch en batch 10 g/L glycérol 0,29 129 89,4 0,19 exponentiel p02 = 0 % exponentiel a = 0,28 Fed-batch Ajout en batch 10 g/L acide 0,30 112 83,6 0,14 exponentiel gluconique a=0,28 pO2=20% 11 Fed batch Ajouts multiples glucose 10 x 1 g/L 0,30 250 84,7 0,18 exponentiel (ajouts déclenchés quand le pH = 7) a = 0,34 p02=0 /o sans ajout de NaOH ou de H2SO4 E Etape (a-1) Etape (a-2) C c E ô c.; (ajout de E. ô Q ô glucose) ~ ~ 12 Fed-batch Ajouts multiples glucose (7,5 g/L 0,29 110 93,9 0,25 exponentiel total) ù asservis à la régulation de a=0,28 pH (consigne 6,8 û tolérance 0,05) pO2=0% sans ajout de NaOH ou de H2SO4 13 Fed batch Ajout en batch 0,27 120 82,5 0,18 exponentiel 4 g/L acide pyruvique a=0,28 + 4 g/L acide malique pO2=20% 14 Fed-batch Ajout en batch 0,28 100 95,4 0,17 exponentiel 4 g/L acide acétique a=0,28 pO2=0% 15 Fed batch Ajout en batch 0,29 140 86 0,18 exponentiel 4 g/L acide pyruvique a = 0,28 + 4 g/L acide malique + 2 g/L acide acétique + 4 g/L acide succinique pO2=0% Légende du tableau 2 : - a : coefficient d'ajout du glucose lors de l'étape (a-1) ; - Ajout en batch : ajout en une fois (batch dit � simple �) ; - Ajouts multiples : ajouts en plusieurs fois (pulses); - RDT Biom Yxs (%) : rendement de conversion du glucose en biomasse lors de l'étape (a-1) ; - RDT Prod Yps (%) : rendement de conversion du glucose en acide succinique lors de l'étape (b) ; - Acide orotique produit et acide succinique produit : mesurés par CLHP ; - Prod. Spec. qp (g/g/h) : productivité spécifique de la biomasse lors de l'étape (b) = quantité de succinique produit par g de biomasse par heure. Revendications1. Procédé de production d'acide succinique, comprenant : (a) une étape de culture d'une souche d'Escherichia coli dans un milieu de culture, où ladite étape (a) comprend : (a-1) une étape de culture de la souche en conditions aérobies lors de laquelle du glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, et durant laquelle la concentration en glucose dudit milieu de culture est inférieure ou égale à 0,5 g/L, préférentiellement inférieure ou égale à 0,3 g/L et plus préférentiellement encore inférieure ou égale à 0,1 g/L ; (a-2) optionnellement, une étape de culture intermédiaire ; (b) une étape de production d'ions succinate par fermentation de la souche cultivée à l'étape (a) en conditions anaérobies en présence de CO2; (c) une étape de conversion des ions succinate formés à l'étape (b) en acide succinique ; (d) optionnellement, une étape de purification de l'acide succinique. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch � à une vitesse G(t) telle que : G(t) 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lors de l'étape (a-1) le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch � tel que :G(t) = Go . exp(a.t) et (1/4) �max a �max avec : G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape (a-1), - Go = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1), - a = coefficient d'ajout du glucose, - �max = taux de croissance � maximal de la souche en conditions aérobies. 4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape (a-1) comprend : (a-1)(i) une étape (de to à fi) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, tel que : G(t) = Go . exp(a.t) et (1/4) �max a �max ; et (a-1) (ii) une étape (de tl à t2) lors de laquelle le glucose est ajouté dans le milieu de culture selon un mode � fed-batch �, tel que G(t) = Go . exp(a.ti) avec : - G(t) = vitesse d'ajout du glucose dans le milieu de culture à l'instant t de l'étape (a-1), - Go = vitesse maximale à laquelle le glucose peut être consommé par la quantité de biomasse présente dans le milieu de culture à l'instant to de début de l'étape (a-1), - a = coefficient d'ajout du glucose, - �max = taux de croissance � maximal de la souche en conditions aérobies. . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : - du glycérol, et/ou - de l'acide gluconique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide succinique ou un sel de celui-ci, et/ou - de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture : - de l'acide pyruvique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide malique ou un sel de celui-ci, et - de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. 7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute dans le milieu de culture de l'acide acétique ou un sel de celui-ci. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-7, dans lequel, lors de l'étape (a-2), on ajoute, dans le milieu de culture, toute composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition étant issue d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple on ajoute tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel, lors de l'étape (a-2), - on ajoute du glucose dans le milieu de culture,- on maintient une valeur de pression partielle en 02 dans le milieu de culture dans un intervalle de 0-5%, et - on régule la valeur du pH du milieu de culture. 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en une fois. 11. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le glucose est ajouté en plusieurs fois. 12. Procédé selon la revendication 9, dans lequel, lors de l'étape (a-2), le pH du milieu de culture est régulé par ajout de glucose. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-12, dans lequel, lors de l'étape (a-2), la pression partielle en 02 du milieu de culture est maintenue à une valeur de pO2 = 0 %. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-13, dans lequel l'étape (a-1) et/ou l'étape (a-2) et/ou l'étape (b) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,5, de préférence 6,4-7. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-14, dans lequel la souche d'Escherichia coli possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC, de préférence la souche d'Escherichia coli est la souche SBS550MG û pHL413. 16. Utilisation d'un ajout en glucose selon un mode � fed-batch � pour minimiser la production d'ions orotates dans un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation d'une souche d'Escherichia coli. 17. Utilisation d'une composition liquide contenant au moins un acide organique ou du glycérol, ladite composition liquide étant issue d'un procédé de productiond'acide succinique par fermentation et/ou d'un procédé de purification d'acide succinique, par exemple de tout ou partie des eaux-mères de cristallisation issues d'un procédé de production d'acide succinique par fermentation, pour la préparation d'un milieu de culture destiné à l'étape (a-2) selon l'une quelconque des revendications 5-7.