Brevet FR2948026A1 — publié le 20110121

Dérivés aminés de dihydro-1,3,5-triazine pour le traitement du stress oxydatif Domaine de l'invention La présente invention concerne des dérivés aminés de dihydro-1,3,5-triazine pour leur utilisation dans le traitement du stress oxydatif et des maladies qui lui sont associées, notamment chez les individus hyperglycémiques. Arrière plan technique Le stress oxydatif (ou stress oxydant) est reconnu comme étant un élément important du déclenchement ou de la progression de maladies comme les maladies cardiovasculaires, les neuropathies diabétiques, les maladies neurodégénératives, les cancers, ou encore de phénomènes tels que le vieillissement. Le stress oxydatif trouve son origine dans l'action de composés pro-oxydants, notamment des radicaux libres, qui sont en général des espèces réactives de l'oxygène (ROS), comme le peroxyde d'hydrogène (H2O2). Ces composés endommagent de nombreuses structures cellulaires, telles que les lipides membranaires, les protéines, ou les acides nucléiques. Il apparaît en outre que les composés pro-oxydants peuvent être responsables du déclenchement de l'apoptose, c'est-à-dire de la mort cellulaire programmée. Les composés pro-oxydants, notamment les ROS, semblent ainsi provoquer l'ouverture du pore transitoire de perméabilité (PTP) mitochondrial, une des étapes précoces dans le processus d'apoptose. La principale source de ROS de l'organisme est la mitochondrie. La mitochondrie est le siège de la phosphorylation oxydative, qui permet la synthèse d'ATP par l'ATP synthase grâce à la force protomotrice liée au gradient électrochimique de part et d'autre de la membrane interne mitochondriale. Ce gradient est créé par l'action de la chaîne respiratoire, située dans la membrane interne mitochondriale, qui catalyse, par l'intermédiaire de plusieurs complexes d'oxydoréduction, l'oxydation de coenzymes d'oxydoréductions (comme le NADH et le FADH2) par l'oxygène moléculaire (02). Les coenzymes réduits proviennent quant à eux de l'oxydation de différents substrats énergétiques, tels que le glucose par exemple. A l'heure actuelle, il apparaît que c'est au niveau de la chaîne respiratoire que les ROS sont produits, notamment au niveau des complexes I et III, et plus particulièrement au niveau du complexe I. De plus, il semble que ce soit lorsque le complexe I fonctionne en flux électronique inverse que cette production soit la plus importante. Les principaux tissus cibles du stress oxydatifs sont ainsi généralement ceux présentant un métabolisme oxydatif important, comme le tissu nerveux, les tissus vasculaires, le coeur, les muscles et le foie. Par ailleurs, la part importante du métabolisme oxydatif dans le stress oxydatif permet d'expliquer que les troubles hyperglycémiques, comme le diabète de type Il, soient souvent à l'origine de maladies liées au stress oxydatif, du fait de l'augmentation du métabolisme oxydatif du glucose qui en découle. Plusieurs stratégies sont envisagées à l'heure actuelle pour lutter contre le stress oxydatif et ses conséquences. L'une d'elle consiste à réaliser un apport en composés anti-oxydants, tels que la vitamine C, la vitamine E, la N-acétyl-L-cystéine, ou encore en glutathion. L'efficacité de cette approche reste toutefois encore à démontrer. Alternativement, il est proposé d'utiliser des composés permettant de limiter l'apoptose consécutive au stress oxydatif ou la production de ROS par la mitochondrie. Ainsi, la cyclosporine A (CsA), l'inhibiteur de référence de l'ouverture du PTP, a été proposée comme agent de neuroprotection ou de cardioprotection (Mattson & Kroemer (2003) Trends in Molecular Medicine 9:196-205). Toutefois, la CsA étant également un composé immunosuppresseur, de nombreux effets secondaires limitent son utilisation clinique. Il a par ailleurs été proposé d'utiliser la metformine, un agent antidiabétique, pour limiter la production de ROS par la mitochondrie, et la mort cellulaire qui en découle, dans le cadre du traitement des maladies vasculaires et des troubles neuropathiques liés au diabète de type Il (Detaille et al. (2005) Diabetes 54:2179-2187 ; El-Mir et al. (2008) J. Mol. Neurosci. 34:77-87). La metformine agit notamment par une inhibition du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, à la fois sur le flux classique mais aussi sur le flux reverse des électrons, ce qui provoque une diminution de la production d'ATP par la mitochondrie, et par voie de conséquence une diminution de la néoglucogenèse (i.e. la synthèse de glucose par le foie). Toutefois, l'inhibition du complexe I semble également être à l'origine de l'acidose lactique parfois associée à l'utilisation de ce composé, notamment du fait de la stimulation de la glycolyse et de la fermentation lactique qui compense la diminution de la production énergétique mitochondriale (Owen et al. (2000) Biochem. J. 348:607-614). Il reste donc encore à trouver un composé permettant de lutter contre le stress oxydatif dépourvu d'effets secondaires susceptibles de limiter son utilisation. Par ailleurs, il est connu du brevet européen EP 1250 328, des dérivés aminés de dihydro-1,3,5-triazine de formule générale (I) suivante : R2 H R4 R1IlN\/N.R3 NxN R5 R6 Résumé de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu'un composé de formule générale (I), le composé E 0008 permettait 20 de réduire l'apoptose, liée au stress oxydatif, de cellules endothéliales, ainsi que la production de ROS par le complexe I de la chaine respiratoire de ces cellules, en inhibant exclusivement le flux électronique inverse, mais sans inhiber la respiration mitochondriale. L'action de ce composé ne s'accompagne donc pas d'une surproduction de lactate 25 Ainsi, la présente invention concerne un composé de formule générale (I) suivante : (I) Il a pu être démontré que ces composés présentaient une activité antidiabétique dans un modèle expérimental de diabète non insulinodépendant, 15 induit chez le rat par la Streptozotocine. R2 H R4 R1-NIIN\/N-R3 Nx TN R5 R6 dans laquelle : • R1, R2, R3, et R4 sont choisis indépendamment parmi les groupes : - H, - alkyle (C1-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), cycloalkyle (C3-C8), alkènyle (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkyne (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05) - aryl (C6-C14) alkyle (C1-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - hétéroaryle (C1-C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R1 et R2, d'une part, et R3 et R4, d'autre part, pouvant former avec l'atome d'azote un cycle à n chaînons (n compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants : amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- (I) C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, • R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes : - H, -alkyle (C1-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - alkényle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - alkynyle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, -cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (Cl-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (Cl-05), alkoxy (Cl-05), alkylthio (Cl-05), alkylamino (Cl-05), aryl (C6C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, -hétéroaryle (C1-C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (Cl-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6- C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) alkyle (C1-05) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R5 et R6 pouvant former avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, 0, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (Cl-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, ou pouvant former avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R5 et R6 pouvant également représenter ensemble le groupement =0 ou =S, l'atome d'azote d'un groupe hétérocycloalkyle ou hétéroaryle pouvant être substitué par un groupe alkyle (C1-05), cycloalkyle (C3-C8), aryl(C6-C14), aryl(C6-C14)alkyle(C1-05) ou acyle(C1-C6), ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement du stress oxydatif et des pathologies associées au stress oxydatif. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus, ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du stress oxydatif et des pathologies associées au stress oxydatif. La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement du stress oxydatif et des pathologies associées au stress oxydatif chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'un composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus, ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci. Description détaillée de l'invention Par � cycle à m chaînons formé par R5 et R6 �, on entend en particulier un cycle saturé tel qu'un groupe cyclohexyle, pipéridinyle ou tétrahydropyrannyle. Par � groupe polycyclique formé par R5 et R6 �, on entend un groupe polycyclique carboné éventuellement substitué et en particulier un reste de stéroïde. Un groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans laquelle R5 est l'hydrogène. Un autre groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans laquelle R5 et R6 forment avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons, (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants: alkyle (C1-05), amino, hydroxy, alkylamino(C1-05), alkoxy(C1-05), alkylthio(C1-05), aryl (C6-C14), aryl(C6-C14)-alkoxy(C1-05), ou forment avec l'atome de carbone un reste polycyclique en Cl 0-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (Cl C5), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle. Un autre groupe particulier de composés de formule générale (I) est celui dans laquelle R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes : alkyle (C1-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle. L'invention se rapporte également aux formes tautomères, aux énantiomères, diastéréoisomères, épimères et aux sels organiques ou minéraux des composés de formule générale (I). Les composés de l'invention de formule générale (I) définis tels que précédemment possédant une fonction suffisamment acide ou une fonction suffisamment basique ou les deux, peuvent inclure les sels correspondants d'acide organique ou minéral ou de base organique ou minérale pharmaceutiquement acceptables. En particulier, les composés de formule générale (I) possèdent des atomes 10 d'azote basiques qui peuvent être monosalifiés ou disalifiés par des acides organiques ou minéraux. De préférence, R6 est un groupe alkyle (C1-C20), notamment un groupe méthyle. De préférence, R1 et/ou R2 représente(nt) un groupe alkyle (C1-C20), 15 notamment un groupe méthyle. De préférence, R3 et/ou R4 représente(nt) un atome d'hydrogène. De préférence, R1 et R2 sont un groupe méthyle et R3 et R4 représentent un hydrogène. Parmi les composés de formule générale (I) préférés, on peut citer 20 notamment le composé E 008 de formule (la) : CH3 H H C,NN~NH2 3 I NyN CH3 (la) ainsi que ses formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et/ou sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, 25 Selon la présente invention, les radicaux � alkyle � représentent des radicaux hydrocarbonés saturés, en chaîne droite ou ramifiée, de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont linéaires, les radicaux méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle, hexyle, octyle, nonyle, décyle, dodécyle, hexadécyle, et octadécyle. On peut notamment citer, lorsqu'ils sont ramifiés ou substitués par un ou plusieurs radical alkyle, les radicaux isopropyle, tert-butyl, 2-éthylhexyle, 2-méthylbutyle, 2-méthylpentyle, 1 -méthylpentyle et 3-méthylheptyle. Les radicaux � alkoxy � selon la présente invention sont des radicaux de formule ûO-Alkyle, l'alkyle étant tel que défini précédemment. � Alkylthio � désigne un groupe alkyl-S-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus. � Alkylamino � désigne un groupe alkyl-NH-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus. Parmi les atomes d'halogène, on cite plus particulièrement les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode. Les radicaux � alkényle � représentent des radicaux hydrocarbonés, en chaîne droite ou linéaire, et comprennent une ou plusieurs insaturations éthyléniques. Parmi les radicaux alkényle, on peut notamment citer les radicaux allyle ou vinyle. Les radicaux � alkynyle � représentent des radicaux hydrocarbonés, en chaîne droite ou linéaire, et comprennent une ou plusieurs insaturations acétyléniques. Parmi les radicaux alkynyle, on peut notamment citer l'acétylène. Le radical � cycloalkyle � est un radical hydrocarboné mono-, bi- ou tri- cyclique saturé ou partiellement insaturé, non aromatique, de 3 à 10 atomes de carbone, tel que notamment le cyclopropyle, cyclopentyle, cyclohexyle ou adamantyle, ainsi que les cycles correspondants contenant une ou plusieurs insaturations. Les radicaux � hétérocycloalkyles � désignent les systèmes mono ou bicycliques, saturés ou partiellement insaturés, non aromatiques, de 3 à 8 atomes de carbone, comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O ou S. � Aryl � désigne un système aromatique hydrocarboné, mono ou bicyclique de 6 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux aryl, on peut notamment citer le radical phényle ou naphtyle, plus particulièrement substitué par un moins un atome d'halogène. Les radicaux � arylalkyles � ou � aralkyles � sont des radicaux aryl-alkyl-, les groupes aryles et alkyles étant tels que définis ci-dessus. Parmi les radicaux arylalkyle, on peut notamment citer le radical benzyle ou phénétyle. � Aryloxy � désigne un groupe aryl-O-, le groupe aryl étant tel que défini ci-dessus. � Arylalkoxy � désigne un groupe aryl-alkoxy-, les groupes aryles et alkoxy étant tels que définis ci-dessus. Les radicaux � hétéroaryles � désignent les systèmes aromatiques comprenant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène ou le soufre, mono ou bicyclique, de 5 à 10 atomes de carbone. Parmi les radicaux hétéroaryles, on pourra citer le pyrazinyle, le thiényle, l'oxazolyle, le furazanyle, le pyrrolyle, le 1,2,4-thiadiazolyle, le naphthyridinyle, le pyridazinyle, le quinoxalinyle, le phtalazinyle, l'imidazo[1,2-a]pyridine, l'imidazo[2,1-b]thiazolyle, le cinnolinyle, le triazinyle, le benzofurazanyle, l'azaindolyle, le benzimidazolyle, le benzothiényle, le thiénopyridyle, le thiénopyrimidinyle, le pyrrolopyridyle, l'imidazopyridyle, le benzoazaindole, le 1,2,4-triazinyle, le benzothiazolyle, le furanyle, l'imidazolyle, l'indolyle, le triazolyle, le tétrazolyle, l'indolizinyle, l'isoxazolyle, l'isoquinolinyle, l'isothiazolyle, l'oxadiazolyle, le pyrazinyle, le pyridazinyle, le pyrazolyle, le pyridyle, le pyrimidinyle, le purinyle, le quinazolinyle, le quinolinyle, l'isoquinolyle, le 1,3,4-thiadiazolyle, le thiazolyle, le triazinyle, l'isothiazolyle, le carbazolyle, ainsi que les groupes correspondants issus de leur fusion ou de la fusion avec le noyau phényle � Carboxyalkyle � désigne un groupe HOOC-alkyl-, le groupe alkyle étant tel que défini ci-dessus. Comme exemple de groupes carboxyakyles, on peut citer notamment le carboxyméthyle ou le carboxyéthyle. L'expression � sels pharmaceutiquement acceptables � fait référence aux sels d'addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, et les sels d'addition de base, des composés de la présente invention. Ces sels peuvent être préparés in situ pendant l'isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d'addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d'addition acide on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valérate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, methanesulfonates, éthanesulfonates, benzenesulfonates, p-toluenesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues (Voir par exemple S.M. Berge et al. � Pharmaceutical Salts � J. Pharm. Sci, 66 :p.1-19 (1977)). Les sels d'addition acide peuvent également être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme acide avec une base organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Les sels d'addition acide comprennent les sels aminés et métalliques. Les sels métalliques adaptés comprennent les sels de sodium, potassium, calcium, baryum, zinc, magnésium et aluminium. Les sels de sodium et de potassium sont préférés. Les sels d'addition inorganiques de base adaptés sont préparés à partir de bases métalliques qui comprennent hydrure de sodium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, hydroxyde de calcium, hydroxyde d'aluminium, hydroxyde de lithium, hydroxyde de magnésium, hydroxyde de zinc. Les sels d'addition aminés de base adaptés sont préparés à partir d'amines qui ont une alcalinité suffisante pour former un sel stable, et de préférence comprennent les amines qui sont souvent utilisées en chimie médicinale en raison de leur faible toxicité et de leur acceptabilité pour l'usage médical : ammoniac, éthylènediamine, N-méthyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N,N'- dibenzylethylenediamine, chloroprocaïne, diéthanolamine, procaïne, N-benzylphénéthylamine, diéthylamine, pipérazine, tris(hydroxymethyl)-aminomethane, hydroxyde de tétraméthylammonium, triéthylamine, dibenzylamine, éphénamine, dehydroabiétylamine, N-éthylpiperidine, benzylamine, tétra-méthylammonium, tétraéthylammonium, méthylamine, diméthylamine, triméthyl-amine, éthylamine, acides aminés de base, par exemple lysine et arginine, et dicyclohexylamine, et analogues. Les composés de formule générale (I) peuvent être préparés par application ou adaptation de toute méthode connue en soi de et/ou à la portée de l'homme du métier, notamment celles décrites par Larock dans Comprehensive Organic Transformations, VCH Pub., 1989, ou par application ou adaptation des procédés décrits dans EP 1 250 328. Les composés pharmaceutiques selon l'invention peuvent être présentés sous des formes destinées à l'administration par voie parentérale, orale, rectale, permuqueuse ou percutanée. Les compositions pharmaceutiques incluant ces composés de formule générale (I) seront donc présentées sous forme de solutés ou de suspensions injectables ou flacons multi-doses, sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules, de pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions, pour l'usage percutané dans un solvant polaire, pour l'usage permuqueux. Les excipients qui conviennent pour de telles administrations sont les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalinoterreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides. Pour l'usage rectal, le beurre de cacao ou les stéarates de polyéthylèneglycol sont les excipients préférés. Pour l'usage parentéral, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques sont les véhicules les plus commodément utilisés. La posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) en fonction de l'indication thérapeutique et de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet. Comme on l'entend ici l'expression � stress oxydatif � désigne un état dans lequel l'organisme est confronté à des quantités excessives de composés pro-oxydants, tels que des espèces réactives de l'oxygène (ROS), c'est-à-dire à des quantités dépassant les systèmes naturels de lutte de l'organisme contre ces composés. Le stress oxydatif est notamment défini par Cardoso Susana et coll. Dans Radical Biology & Medecine, (2008), 45, 1395. L'expression � maladies associées au stress oxydatif � désigne l'ensemble des maladies dont le déclenchement ou l'entretien trouve son origine, au moins partiellement, dans le stress oxydatif. De préférence, les maladies associées au stress oxydatif sont sélectionnées dans le groupe constitué de l'athérosclérose, des maladies cardiovasculaires, des neuropathies diabétiques, des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, de la maladie chronique du poumon (� Chronic Lung disease �) et des cancers. De préférence, l'invention vise la prévention ou l'inhibition de l'apoptose liée au stress oxydatif, notamment l'apoptose de cellules des tissus nerveux, vasculaires, cardiaques, musculaires ou hépatiques. De manière préférée également, l'invention vise la prévention ou le traitement du stress oxydatif, ou des maladies associées au stress oxydatif, qui sont liés à un trouble hyperglycémique. Comme on l'entend ici l'expression � trouble hyperglycémique � désigne l'ensemble des maladies atteignant un individu, dans lesquelles la glycémie de l'individu en l'absence de traitement est supérieure à la normale, de façon chronique. Ces troubles sont généralement observés chez le sujet obèse, insulinorésistant en période postprandiale et chez le diabétique de type Il en période de jeun et postprandiale. En particulier, le trouble hyperglycémique est un trouble de l'homéostasie glucidique et plus particulièrement le diabète de type Il. De manière particulièrement préférée, l'invention vise la prévention ou le traitement des maladies microvasculaires et des neuropathies liées à un diabète de type Il. Les maladies microvasculaires et les neuropathies sont des conséquences bien connues du diabète de type Il est sont notamment définis et évalués à partir des tests de Ewing (Mestivier D, American Journal of Physiology, (1997), 272 ; Gerritsen J, Diabetologia, (2000), 43 ,561) et des approches cliniques par une évaluation de la neuropathie appelée � Michigan Score � (Ziegler Dan and al : Diabetes Care (2007), 30,664 ; Andrew J.M. Boulton, Diabetes Care ,(2004), 27, 1458). De préférence, le composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus exerce son activité préventive ou thérapeutique selon l'invention en inhibant la production d'espèce réactives de l'oxygène, notamment d'H2O2, par la mitochondrie et/ou en diminuant l'apoptose liée à un stress oxydatif ou à un trouble hyperglycémique. Plus particulièrement, le composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus exerce son activité préventive ou thérapeutique selon l'invention en inhibant le flux électronique inverse au niveau du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. Description des figures Figures 1, 2, 3, 4, 5 et 6 Effet de la CsA ou de l'E 008 sur l'apoptose des cellules endothéliales induite par le tBH Les figures 1 à 5 représentent la distribution en cytométrie de flux de cellules HMEC-1 marquée par l'annexine V (FL3-H) et l'iodure de propidium (IP) (FL1-H) cultivées dans un milieu sans drogue (controle) ou incubée avec 500 �M de tBH en l'absence ou en présence de CsA ou d'E 008 aux concentrations indiquées. Les cellules en début d'apoptose se trouvent dans le quart du bas à droite, les cellules en apoptose tardive se trouvent dans le quart en haut à droite, les cellules nécrotiques dans le quart du haut à gauche, et les cellules viables dans le quart du bas à gauche. La figure 6 représente le pourcentage de mort cellulaire mesurée par l'annexine V (barres noires) ou par le test d'exclusion du bleu Trypan (barres hachurées) dans les conditions indiquées. Chaque barre représente la moyenne � ESM de cinq expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p Figures 7, 8, 9, 10, 11 et 12 Effet de la CsA, de la N-acétyl-cystéine, ou de l'E 008 sur l'apoptose des cellules endothéliales induite par une forte concentration en glucose Les figures 7 à 11 représentent la distribution en cytométrie de flux de cellules HMEC-1 marquée par l'annexine V (FL3-H) et l'iodure de propidium (IP) (FL1-H) cultivées dans un milieu supplémenté par 5,5 mM de glucose (Fig. 7) ou 33 mM de glucose (Fig. 8-11), et en présence de CsA (Fig. 9), de N-acétylcystéine (Fig. 10) ou d'E 008. Les cellules en début d'apoptose se trouvent dans le quart du bas à droite, les cellules en apoptose tardive se trouvent dans le quart en haut à droite, les cellules nécrotiques dans le quart du haut à gauche, et les cellules viables dans le quart du bas à gauche. La figure 12 représente le pourcentage de mort cellulaire mesurée par l'annexine V (barres noires) ou par le test d'exclusion du bleu Trypan (barres hachurées) dans les conditions indiquées. Chaque barre représente la moyenne � ESM de quatre expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p Figure 13 Evaluation de la mort cellulaire induite par le tBH par détermination en marquage Western de la libération de cytochrome c La figure 13 représente la quantification des niveaux mitochondriaux (barres noires) et cytosolique (barres blanches) en cytochrome c mesurés par densitométrie (axe des ordonnées, unités arbitraires). Chaque barre représente la moyenne � ESM de trios expériences indépendantes. Le symbole étoile (*) représente p Figures 14 à 20 Effet de la CsA ou d'E 008 sur l'ouverture du PTP dans les cellules HMEC-1 perméabilisées Les figures 14 à 19 représentent la concentration en calcium externe (axe des ordonnées, en �M) en fonction du temps (axe des abscisses) pour des cellules HMEC-1 perméabilisée à la digitonie témoins (Fig. 14 et 17), directement exposées à 1 �M de CsA (Fig. 15 et 18) ou incubées avec 100 �M d'E 008 et en présence de 5 mM de succinate (Fig. 14-16) ou de 5 mM de glutamate/malate (Fig. 17-19). Les impulsions de 10 �M Ça++ ajoutées toutes les deux minutes sont représentées par des flêches. La figure 20 représente la capacité de rétention de calcium (axe des ordonnées, en nmol pour 106 cellules) pour les conditions ci-dessus, les barres noires représentant les conditions en présence de succinate et les barres hachurées les conditions en présence de glutamate/malate. Chaque barre représente la moyenne � ESM pour cinq expériences séparées. Le symbole étoile (*) représente p Figures 21 et 22 Effet du pré-traitement par l'E 008 sur la production d'H2O2 par des cellules HMEC-1 perméabilisées et vivantes La figure 21 représente la production de ROS mesurée (H2O2) comme la fluorescence relative de l'Amplex Red (axe des ordonnées, unités arbitraires) en fonction du temps dans des cellules HMEC-1 perméabilisée et incubées pendant 4 h sans (témoins) ou avec 10 mM d'E 008 en présence de glutamate/malate (GM), succinate (S) ou les deux (GMS), avec l'ajout séquentiel des inhibiteurs roténone (Rot) et antimycine A (AA). La figure 22 représente la fluorescence intracellulaire du DCF (axe des ordonnées, pourcentage d'unités de fluorescence relative (UFR)) pour des cellules vivantes préincubées avec 10 mM d'E 008 ou directement exposées à la roténone ou à l'antimycine A. Les résultats sont exprimés en prenant la fluorescence basale des cellules témoins non traitées comme la référence 100%. Le symbole étoile (*) représente p EXEMPLE Matériels et méthodes Conditions de culture cellulaire La lignée cellulaire endothéliale microvasculaire dermique humaine (HMEC-1) (CEA Grenoble, Angioinserm EM/0105) a été utilisée. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence dans le milieu de culture MCBD 131 supplémenté par 15% de sérum de veau foetal (SVF) inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 50 Ul/ml de pénicilline, 50 pg/ml de streptomycine, 10 ng/ml de facteur de croissance endothélial (EGF) , 1 pg/ml d'hydrocortisone, et maintenues dans une atmosphère humidifiée (5% CO2) à 37°C. Les cellules ont été traitées à la trypsine puis récoltées par centrifugation à 1000 tpm pendant 10 min. Dosage du complexe 1 mitochondrial isolé Des monocouches confluentes de cellules HMEC-1 ont été incubées en absence et en présence de 10 mM ou 100 �M d'E 008, pendant 4 h ou 24 h respectivement. L'E 008 peut être préparé notamment selon EP 1 250 328. Les cellules ont été récoltées puis immédiatement remises en suspension dans une solution froide constituée de 20 mM de Tris, pH 7.2, 40 mM de KCI, 250 mM de saccharose, 2 mM d'EGTA, et 200 pg/ml de digitonine. Après une incubation de 5 min sur de la glace, les cellules ont été culottées (10,000 tpm pendant 10 min) pour éliminer les activités enzymatiques cytosoliques contaminantes. Les culots cellulaires perméabilisés ont été lavés avec précaution puis remis en suspension dans le tampon ci-dessus sans digitonine avant de déterminer la vitesse d'oxydation du NADH par fluorimétrie (excitation-émission, 340-460 nm) comme décrit précédemment (Detaille et al, 2005). Mesure de la vitesse de consommation d'oxygène dans des cellles endothéliales intactes Après une préincubation en milieu MCDB-131 avec ou sans 10 mM d'E 008, des cellules intactes HMEC-1 (1,5 x 10' cellules/ml) ont été placée dans le récipient d'un oxygraphe à agitation, maintenu thermostatiquement à 37°C et équipé d'une électrode à oxygène Clark. La vitesse de consommation d'oxygène a été tout d'abord mesurée en l'absence de tout ajout ; ensuite, 2 pg/ml d'oligomycine, 125 �M de dinitrophénol (DNP), 3,8 �M de myxothiazol, et 1 mM de tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD) + 5 mM d'ascorbate ont été ajoutés successivement. Evaluation du métabolisme énergétique Après l'ajout d'E 008, la réaction a été arrêtée par l'addition de 105 �L d'acide perchlorique (PCA) à 70%, et les cellules ont été détachées du fond. Le milieu externe et le lysat cellulaire ont été centrifugés à 10,000 g pendant 8 min. Après neutralisation du surnageant avec un mélange KOH (2 M) / MOPS (0,3 M), les métabolites ont été mesurés enzymatiquement sur des aliquots de cette suspension déprotéinisée. Le lactate a été dosé en ajoutant du NAD+ et de la lactate deshydrogenase (LDH) puis en mesurant l'appariaiton de NADH à 340 nm. Le pyruvate a été mesuré en ajoutant du NADH et de la LDH puis en mesurant l'oxydation du NADH à 340 nm. Le rapport lactate/pyruvate, qui est proportionnel au rapport NADH/NAD+ ratio, a été pris comme index du potentiel redox des cellules. Pour la détermination du contenu nucléotidique total, les cellules ont été récupérée par centrifugation et incubées sur de la glace pendant 5 min dans un mélange PCA (2,5%) / EDTA (6,25 mM). Le matériel insoluble a été éliminé par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min, et le surnageant résultant a été neutralisé avec le mélange KOH / MOPS. Après retrait du KCIO4 précipité par centrifugation (12 000 g pendant 10 min), l'extrait final a été conservé et analysé ultérieurement par HPLC. Les concentrations d'ATP, d'ADP, et d'AMP dans les échantillons ont été calculées par comparaison avec des étalons connus. Détection de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) La vitesse de production de H2O2 dans des cellules perméabilisées a été déterminée en utilisant l'oxydation de l'indicateur fluorogénique Amplex Red en présence de peroxydase de raifort. Typiquement, 2,5 x 10' cellules perméabilisées ont été incubées à 30°C dans un milieu KCI supplémenté par 1 mM EDTA et oligomycine. La production de H2O2 a été démarrée en utilisant soit un mélange glutamate/malate (2,5 mM) soit du succinate (2,5 mM) comme substrats. De la roténone (2-5 �M) ou de l'antimycine A (0,25 �M) ont été ajoutées séquentiellement dans le milieu d'incubation pour inhiber les activités du complexe I et du complex III respectivement. La fluorescence a été enregistrée sur un fluorimètre à double rayon PTI Quantamaster C61 à une longueur d'onde d'excitation de 560 nm et d'émission à 582 nm. Par ailleurs, des aliquots de cellules témoins ou de cellules traitées ont été retirés puis analysés pour la production de ROS intracellulaires par la méthode au colorant diacétate de 2,7'- dichlorofluorescéine (DCF-DA). Cette méthode de mesure de l'oxydation cellulaire est basée sur la conversion, par les ROS, d'un composé non fluorescent (DCFDA) en un composé fortement fluorescent (DCF). Après exposition à la metformine ou à l'E 008, les cellules (5 x 106) ont été récoltées, incubées dans 2 ml de NaCl 110 mM, KCI 4 mM, MgCl2 10 mM, glucose 5,5 mM, CaCl2 1,6 mM, NaHCO3 14 mM, HEPESûNa 20 mM, pH 7,4, puis laissées incorporer 5 pM de DCF-DA à 37°C pendant 10 min. Après incorporation, la fluorescence du DCF fluorescence est mesurée par excitation à 503 nm et émission à 521 nm. Détermination de la transition de perméabilité dans des cellules perméabilisées Des cellules HMEC-1 (1 x 10') ont été incubées avec ou sans E 008 comme décrit précédemment. Les cellules ont ensuite été centrifugées et remises en suspension dans un milieu contenant 250 mM de saccharose, 10 mM de MOPS, 1 mM de Pi-Tris et 50 pg/ml de digitonine (pH 7,35) puis placées dans une cuve de spectrofluorimètre en quartz, sous agitation continue puis maintenue thermostatiquement à 25°C. Après 2 min, les cellules ont été perméabilisées et 1 �M de CsA ou un véhicule a été ajuté au milieu comme indiqué (?). Après stabilisation du signal, des pulses de 5 pl de Cal+ à 4 mM ont été appliqués successivement à des intervalles de deux minutes jusqu'à l'ouverture du PTP, comme indiqué par la libération de Cal+ dans le mileu. Les mesures de Cal+ ont été effectuées en fluorimétrie à l'aide d'un spectrofluorimètre PTI Quantamaster C61. Le Cal+ libre a été mesuré en présence de 0,25 �M de Calcium Green-5N avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission réglées à 506 et 532 nm respectivement. Détermination de la transition de perméabilité dans des cellules intactes La coloration à la calcéine sur cellules vivantes a été réalisée après que les cellules (8 x 104) ont été cultivées pendant 48 heures sur des lamelles en verre circulaires de 22 mm de diamètre et exposées pendant 15 minutes à 37°C à un milieu tampon salin phosphate (PBS) supplementé par 5 mM de glucose, 0,35 mM de pyruvate, 1 mM de CoCl2 et 1 �M d'ester de calcéine-acétométhoxyl. Après incorpration, les cellules ont été lavées pour les débarrasser de la calcéine et du CoCl2 puis incubées pour encore é0 minutes à 37°C dans le milieu PBS/glucose/pyruvate. Les lamelles ont alors été montées sur le champs d'un microscope inversé et l'ouverture des PTP a été réalisée par l'ajout de 100�M d'hydropéroxyde de tert-butyl (tBH). Les prises de vue des cellules ont été effectuées à l'aide d'un microscope confocal LEICA TCS SP2 à laser argon émettant à 488 nm et deux lasers hélium-néon émettant à 543 et 633 nm, respectivement. Les images de cellules ont été enregistrées toutes les minutes avec un temps d'exposition constant à l'aide d'un objectif à immersion en eau 63X/1.20 Plan Apo. Quantification de la mort des cellules endothéliales Les cellules HMEC-1 ont été préincubées soit avec 10 mM soit avec 100�M d'E 008 comme décrit précédemment. Les cellules ont ensuites ont été lavées avec du PBS avant d'être exposées à 0,5 mM de tBH pendant 45 minutes dans un milieu de culture dépourvu de SVF et de facteurs de croissance. Les cellules ont à nouveau été lavées par du PBS puis incubées à 37°C pendant 24 heures dans un mileu MCDB complet . Pour l'induction de la mort cellulaire par le glucose, les cellules ont été exposées à 5,5 mM glucose (cellules témoins) ou à 33 mM glucose pendant 48 h. La cytotoxicité a été évaluée soit par le test d'exclusion du bleu trypan (5%) soit par cytométrie de flux à l'aide du kit Annexin V-Fluoprobes. Etude de la libération du cytochrome c par marquage Western et immunohistochimie Le cytochrome c a été évalué à la fois dans les espaces mitochondriaux et cytoplasmiques après que les cellules HMEC-1 ont été fractionnées à l'aide de digitonine comme décrit auparavant pour le dosage du complexe I. Les protéines cytosolique (15 �g) et mitochondriales (25 �g) ont été séparées par SDS/PAGE (gel à 10%) en tampon MES, puis analysées par marquage Western. Les membranes ont été marquées par l'anticorps monoclonal clone 7H8.2C12 dirigé contre le cytochrome c (1 pg/ml), et révélées à l'aide d'un anticorps de chèvre antisouris secondaire marqué à la peroxydase de raifort et d'une détection chimioluminescente. Pour la visualisation de la libération du cytochrome c par immunohistochimie, les cellules ont été fixées dans un mélange paraformaldehyde 3,7% / PBS pendant 20 min, perméabilisées dans 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min, puis bloquées dans 2% de sérum albumine bovine (SAB) / PBS (tampon de blocage) pendant 1 h. Les cellules ont ensuites été incubées avec un anticorps monoclonal de souris anti-cytochrome c (clone 6H2.B4,) pendant 2 h, puis exposées à un anticorps secondaire anti-souris marqué à l'Oregon Green pendant 1 h à température ambiante dans le noir. Après des lavages finaux, un mélange composé de 0,2 M de Tris-HCI, pH 7.8, 90% de glycérol, et 2,3% de 1,4- diazobicyclo-[2.2.2]-octane (DABCO, agent antidécoloration) a été appliqué et les préparations cellulaires ont été visualisées à l'aide d'un microscope confocal avec l'objectif à immersion en eau 63X/1.20 Plan Apo. Les longeurs d'onde d'excitation et d'émission pour l'Oregon Green étaient de 488 et 525 nm, respectivement. Des images de cellules, choisies au hasard en microscopie inversée à contraste de phase, ont été numérisée à une résolution de 512 x 512 pixels. Généralement, huit champs de vue distincts ont été numérisés par lamelle de verre. Résultats Prevention de la mort cellulaire par l'E 008 L'effet de l'E 008 sur la mort cellulaire endothéliale due au tBH (Fig. 1-6) ou par exposition à une concentration élevée de glucose (Fig. 7-12) a été étudiée par cytométrie de flux et le test d'exclusion du bleu trypan. L'exposition de cellule HMEC-1 au tBH a conduit à une augmentation conséquente de l'apoptose/nécrose tardive dans la mesure où la plupart des cellules endothéliales endommagées étaient positives à la fois à l'annexine V et à l'iodure de propidium. Des pourcentages semblables de coloration ont été obtenus avec le bleu trypan, indiquant que les cellules mortes étaient pour l'essentiel nécrotiques. De façon intéressante, l'effet délètere du tBH a été complètement empêché par l'E 008, de façon indépendante de la durée et de la concentration utilisée (10 mM ou 100 �M, respectivement pendant 4 heures ou 24 heures). De plus, cette réponse n'était pas différente de celle de la cyclosporine A (CsA), l'inhibiteur de référence du PTP dont les effets bénéfiques vis-à-vis de la toxicité due au stress oxydatif ont été largement documentés (Bernadi P., Biochimica et Biophysica Acta (1996), 1275, 5). Par ailleurs, lorsque les cellules HMEC-1 ont été cultivée en présence de concentrations élevées de glucose (33 mM), une augmentation significative d'un facteur 2,5 de la mort cellulaire a été obtenue après une durée d'incubation de 48 heures. Comme cela a été démontré précédemment, l'effet délétère d'une grande concentration de glucose est complètement supprimé par la N-acétyl-cystéine (un agent anti-oxydant) et la CsA. De manière remarquable, l'E 008 permet de diminuer de manière marquée la mort cellulaire endothéliale quel que soit la dose. Sur la base de ces résultats prometteurs, l'impact de l'E 008 sur la voie mitochondriale controlant la mort cellulaire a été davantage étudié. L'E 008 previent la libération de cytochrome c liée au tBH et à une forte concentration de glucose Afin de s'assurer de manière certaine de l'effet positif de l'E 008 sur la mort cellulaire, les inventeurs ont étudié la distribution subcellulaire du cytochrome c dans des cellules HMEC-1 traitées ou non par cet agent antidiabétique, puis transitoirement exposées à 500 �M de tBH. En effet, il est reconnu que la libération de cytochrome c à partir de l'espace intermembranaire mitochondrial est une étape clef du processus d'engagement de la mort cellulaire (Shahzidi and al. ; Toxicology and Oncology (2006), 25, 159, Liu Yajun, Shandong Daxue Xuebao, Yixueban (2007), 45, 336). Le contenu en cytochrome c des compartiments mitochondriaux et cytosolique a été déterminé par une analyse en marquage Western. Les inventeurs ont remarqué que bien que le cytochrome c soit fortement détecté dans le cytoplasme des cellules témoins, le traitement au tBH a provoqué une augmentation significative des niveaux cytosoliques (Fig. 13). Cette augmentation a été complètement empêchée par 10mM ou 100�M d'E 008, ainsi que par la CsA. Ni l'E 008 aux deux concentrations, ni la CsA n'ont modifié le contenu mitochondrial en cytochrome c, ce qui indique que seule une proportion très limitée a diffusé vers l'extrérieur de la mitochondrie. De ce fait, la relation entre la cytotoxicité due à une forte concentration en glucose, la fuite du cytochrome c et l'effet de l'E 008, a été contrôlée de façon différente, i.e. par imagerie confocale à fluorescence. Il est ainsi observé que le cytochrome c, dans les cellules HMEC-1 témoins, est localisé dans la mitochondrie, qui apparaît comme une fine structure filamenteuse autour du noyau. Après 48 h d'incubation, le glucose à 33 mM a induit une libération du cytochrome c dans certaines cellules endothéliales. De façon remarquable, cet événement a été empêché par l'E 008 aux deux concentrations. L'E 008 module l'ouverture du PTP dans les cellules HMEC-1 perméabilisées 5 et vivantes Comme l'E 008 produit un effet protecteur prononcé comparable à celui de la CsA, les inventeurs se sont ensuite demandé si l'E 008 modulait l'ouverture sensible à la CsA du PTP opening dans les cellules endothéliales. Il a ainsi pu être montré qu'en présence de succinate comme substrat 10 respiratoire, les cellules HMEC-1 perméabilisée à la digitonine, absorbent et retiennent le Ca2+ jusqu'à ce que la charge de Cal+ atteigne une valeur seuil induisant la transition de perméabilité mitochondriale, comme déterminé par une libératio rapide de Ca2+ dans le milieu (Fig 14). De plus, les inventeurs on montré que (i) cet événement avait également lieu lorsque les mitochondries de ces 15 cellules perméabilisées avaient pour source d'énergie du glutamate/malate (Fig. 17, 20), et (ii) la CsA retardait pareillement l'ouverture du PTP dans les deux conditions expérimentales (Fig. 15, 18, 20). Il est notable que bien qu'il soit légèrement moins puissant de la CsA, l'inhibiteur de l'ouverture du PTP de référence, l'E 008 augmente de manière significative la quantité de calcium 20 nécessaire pour l'ouverture du PTP, quelle que soit la nature des substrats respiratoires (Fig. 16, 19, 20). Par comparaison, la roténone ou la metformine n'inhibent l'ouverture du PTP qu'en présence de succinate seul, une condition dans laquelle ces composés n'affectent pas la chaine respiratoire. 25 Afin de mieux juger ce dernier résultat, les inventeurs ont également analysé l'effet de l'E 008 sur la modulation sensible à la CsA du PTP in situ, l'ouverture du pore induite par le tBH étant directement déterminée dans des cellules HMEC-1 en controlant la perméabilité mitochondriale à la calcéine et au 30 cobalt comme décrit précédemment (Detaille et al. (2005) Diabetes 54:2179-2187 ; El-Mir et al. (2008) J. Mol. Neurosci. 34:77-87). Il apparaît que 10 mM ou 100 �M d'E 008 diminuent de manière conséquente l'effet du tBH sur le quenching de fluorescence liée à la calcéine. Ainsi, après un changement de perméabilité dû à une exposition des cellules endothéliales vivantes à du tBH seul, la fluorescence intracellulaire s'est progressivement décompartimentalisée et a subit un quenching en quelques minutes, toutefois l'hétérogénéité cellulaire et l'intensité de fluorescence ont persisté jusqu'à 10 min en présence de l'E 008. A partir de ces résultats, il convient de considérer ce composé comme un nouvel inhibiteur du PTP dans la mesure où il empêche, comme la CsA et la metformine, la transition de perméabilité mitochondriale à la fois dans les cellules endothéliales perméabilisée et intactes. Impact de l'E 008 sur la respiration mitochondriale : absence d'effet sur le complexe I de la chaine respiratoire Il a pu être démontré ces dernière années que l'inhibition du complexe I de la chaine respiratoire empêchait la mort cellulaire induite par les ROS par l'intermédiaire d'un processus dépendant de l'ouverture du PTP mitochondrial (Chauvin et aI, 2001; Guigas et aI, 2004; Detaille et aI, 2005). Comme l'E 008 diminue fortement la mort cellulaire des cellules endothéliales liée à l'ouverture du PTP, les inventeurs ont ensuite déterminé si les effets préventifs de l'E 008 pouvaient trouver leur origine dans une modulation de l'activité de la chaine respiratoire. Contrairement à la metformine, l'E 008, à 10 mM ou 100 �M, n'inhibe pas l'activité du complexe I sensible à la roténone dans les cellules endothéliales (Tableau 1, partie A). De plus, ce composé, même à la concentration la plus élevée, n'inhibe pas de manière significative la consommation d'oxyène et le métabolisme énergétique cellulaire dans les cellules HMEC-1 intactes (Tableau 1, partie B). Une conséquence majeure de cette absence d'effet est qu'aucune augmentation conséquente de la production de lactate n'a été enregistrée dans ces cellules. En parallèle, aucune modification significative du contenu en nucléotides de type adénine n'a pu être mise en évidence. Ces dernières conclusions s'opposent fortement aux résultats obtenus à partir de plusieurs études conduites à partir de différents antidiabétiques bien connus comme la metformine et les thiazolidinediones (TZD). Au-delà de son action protectrice sur la mort cellulaire induite par la stress oxydatif, la metformine est reconnue comme inhibiteur du complexe I de la chaine respiratoire dans différents types cellulaires. Ceci peut conduire à une stimulation de la glycolyse qui est caractérisée à la fois par une augmentation de la production de lactate et un rapport ATP/ADP diminué (Tableau 1). Ces réponses défavorables sont vraisemblablement responsables, au moins en partie, des effets secondaires de la metformine, notamment chez les patients diabétiques présentant des prédispositions au développement de différentes complications. Effet de l'E 008 sur la production de ROS détectée par fluoresence dans des cellules endothéliales vivantes et après perméabilisation Devant cette absence d'effet d'E 008 sur la respiration cellulaire versus son impact sur la transition de perméabilité mitochondriale (Fig. 14-20), les inventeurs se sont intéressé à la production de ROS. En effet, ce paramètre a été récemment identifié comme étant beaucoup plus sensible à l'ouverture du PTP qu'à l'inhibition du complexe I de la chaine respiratoire (Batandier et al, 2004). La production de ROS a été déterminée comme étant la fluorescence relative de l'Amplex Red ou de la sonde DCF, dans des cellules HMEC-1 perméabilisées ou intactes respectivement. Il convient de noter que les cellules perméabilisée ont dû être étudiées durant la respiration de stade 4, c'est à dire en présence d'oligomycine, pour détecter une production de départ d'H2O2 quels que soient les substrats respiratoires. Comme cela est représenté dans la Fig. 21, Tableau 2, un unique ajout des substrats du complexe I glutamate-malate à des cellules témoins HMEC-1 perméabilisées a conduit à une production conséquente de ROS, qui a été encore augmentée par la roténone et l'antimycine ajoutées séquentiellement, bien qu'à un niveau moindre. De façon inattendue, la production basale de ROS n'a pas été exacerbée lorsque ces cellules ont été alimentée en succinate uniquement, comme c'est la cas pour pour les mitochondires isolées (Batandier et al, 2006). Toutefois, l'ajout de roténone inhibe de manière marquée la formation d'H2O2 dans cette condition particulière, mais également lorsque le succinate est présent en même temps que le glutamate/malate, ce qui reflète de manière évidente l'existence d'un flux inverse d'électron à travers le complexe 1 dans les cellules endothéliales perméabilisées. De façon particulièrement remarquable, l'E 008 ne modifie pas la production de ROS en présence de glutamate/malate mais diminue significativement la production de ROS liée au flux inverse d'électrons. Au contraire, la production de ROS liée à l'antimycine n'est pas modifiée par un pré-traitement à l'E 008. Ces résultats ont également été confirmés sur des cellules HMEC-1 vivantes pour lesquelles la production de ROS endogènes a été mesurée après avoir chargé des cellules intactes avec du DCFDA . Par ailleurs, lorsque le succinate et le glutamate/malate sont ajoutés de manière séquentielle, la production de ROS est réduite de manière marquée par l'E 008. Ce dernier effet reflète vraisemblablement une situation physiologique car il se produit en présence d'un apport d'électron au deux sites 1 et 2, comme cela est le cas dans les cellules vivantes. Les résultats montrent que l'E 008 est capable de moduler la production intracellulaire de ROS dans les cellules HMEC-1 quiescentes. Comme la production de ROS due au flux inverse d'électrons au niveau du complexe I est également régulée par l'oxydation du glutamate/malate, la propriété unique de l'E 008 d'inhiber le flux inverse d'électron sans affecter l'activité du complexe I contribuent vraisemblablement à son intérêt comme nouvel agent thérapeutique. Tableau 1 : Effet de l'E 008 sur l'activité sensible à la roténone du complexe I, sur la vitesse de consommation de l'oxygène, et sur le métabolisme énergétique dans les cellules HMEC-1. (A) Les cellules endothéliales ont été incubées pendant 4 ou 24 h en l'absence (témoins) ou en présence de l'E 008 aux concentrations indiquées. Des cellules perméabilisées ont été utilisées pour la détermination de l'activité du complexe I. Les données sont la moyenne � ESM de quatre préparations différentes. (B) Après l'incubation des cellules HMEC-1 avec 10mM d'E 008, la vitesse de respiration celulaire (JO2) a été mesurée avant et après les différents ajouts représentés. Par ailleurs, la production de lactate, le rapport lactate/pyruvate, le contenu en nucléotide, et le rapport ATP/ADP ont été déterminés. Les résultats sont exprimés comme la moyenne � ESM de cinq préparations différentes. (A) E 008 E 008 Témoins) (10mM - 4 h) (100�M - 24 h) Acitivité totale J NADH (nmol NADH/min/10' cellules) Après l'ajout de roténone (10�M) (nmol NADH/min/10' cellules) Activité du complexe I sensible à la roténone (nmol NADH/min/107cells) (B) J02 Métabolisme énergétique cellulaire (Natome O/min/mg protéine) Témoins E 008 Témoins E 008 J lactate Sans ajout 4,95 � 0,14 4,63 � 0,22 (pmolNADH/30min/mg 3,65 � 0,27 3,81 � 0,30 protéine) Rapport + Oligomycine 1,62 � 0,04 1,57 � 0,03 Lactate/Pyruvate 1,59�0,11 1,65�0,13 Contenu en ATP + DNP 9,1 � 0,76 9,18 � 0,41 (nmol/mg prot) 83,9 � 4,37 81,6 � 1,7 Cotenu en ADP 17,28 � 17,38 � + myxothiazol 0,92 � 0,13 0,92 � 0,13 (nmol/mg prot) 3,07 1,38 + TMPD-a 18,97 � 1,43 19,20 � 1,11 Rapport ATP/ADP 5,09 � 0,70 4,8 � 0,25 Tableau 2 : Production d'H202 dans des cellules HMEC-1 perméabilisée et incubées pendant 4 h sans (témoins) ou avec 10 mM d'E 008 en présence de glutamate/malate, succinate, ou les deux, avec l'ajout séquentiel des inhibiteurs roténone et antimycine A. Les résultats sont exprimés come la moyenne de cinq expérience distinctes. Le symbole étoile (*) représente p Revendications1. Composé de formule générale (I) suivante : R2 H R4 R1'NIlNN•R3 N>N R5 R6 dans laquelle : • R1, R2, R3, et R4 sont choisis indépendamment parmi les groupes : - H, 10 - alkyle (C1-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), cycloalkyle (C3-C8), alkènyle (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkyne (C2-C20) substitué ou non par halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), 15 - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05) - aryl (C6-C14) alkyle (C1-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, 20 carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, 25 - hétéroaryle (C1-C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, (I)R1 et R2, d'une part, et R3 et R4, d'autre part, pouvant former avec l'atome d'azote un cycle à n chaînons (n compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements suivants : amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, • R5 et R6 sont choisis indépendamment parmi les groupes : - H, -alkyle (C1-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - alkényle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - alkynyle (C2-C20) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6- C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, -cycloalkyle (C3-C8) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - hétérocycloalkyle (C3-C8) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6C14) oxy,aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - hétéroaryle (C1-C13) portant un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, 0, S et substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - aryl (C6-C14) alkyle (C1-05) substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R5 et R6 pouvant former avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8) comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, 0, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (Cl-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, ou pouvant former avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, R5 et R6 pouvant également représenter ensemble le groupement =0 ou =S, l'atome d'azote d'un groupe hétérocycloalkyle ou hétéroaryle pouvant être substitué par un groupe alkyle (C1-05), cycloalkyle (C3-C8), aryl(C6-C14), aryl(C6-C14)alkyle(C1-05) ou acyle(C1-C6), ainsi que les formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et les sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement du stress oxydatif et des maladies associées au stress oxydatif. 2. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1, dans laquelle R5 est l'hydrogène. 3. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1, dans laquelle R5 et R6 : - forment avec l'atome de carbone sur lequel ils sont fixés un cycle à m chaînons (m compris entre 3 et 8), comprenant ou non un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O, S et pouvant être substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle, - ou forment avec l'atome de carbone un reste polycyclique en C10-C30 substitué ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle. 4. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1, dans laquelle R5 est un groupe alkyle (C2-C20) substitué par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (C1-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (C1-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle. 5. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1, dans laquelle R5 et R6 sont choisis parmi des groupes alkyle (C1-C20) substitués ou non par amino, hydroxy, thio, halogène, alkyle (C1-05), alkoxy (C1-05), alkylthio (C1-05), alkylamino (Cl-05), aryl (C6-C14) oxy, aryl (C6-C14) alkoxy (Cl-05), cyano, trifluorométhyle, carboxy, carboxyméthyle ou carboxyéthyle. 6. Composé selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle R6 est un groupe alkyle (C1-C20). 7. Composé de formule générale (I) selon la revendication 6, dans laquelle R6 est un groupe méthyle. 8. Composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle R1 et/ou R2 représente(nt) un groupe alkyle (C1-C20). 9. Composé de formule générale (I) selon la revendication 8, dans laquelle R1 et R2 représentent un groupe méthyle. 10. Composé de formule générale (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle R3 et/ou R4 représente(nt) un atome d'hydrogène. 11. Composé de formule générale (I) selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de formule générale (I) est le composé de formule (la): CH3 H C,NNrNH2 3 I NYN CH3 (la) ainsi que ses formes tautomères, énantiomères, diastéréoisomères et épimères et/ou sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci, 12. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel les maladies associées au stress oxydatif sont sélectionnées dans le groupe constitué de l'athérosclérose, des maladies cardiovasculaires, des neuropathies diabétiques, des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, de la maladie chronique du poumon (� Chronic Lung disease �) et des cancers. 13. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 12, pour la prévention ou l'inhibition de l'apoptose liée au stress oxydatif. 14. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 13, dans lequel le stress oxydatif est lié à un trouble hyperglycémique.25 15. Composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 14, pour la prévention ou le traitement des maladies microvasculaires et des neuropathies liées à un diabète de type Il.