Brevet FR2938552A1 — publié le 20100521

SOUCHE HYPOCHOLESTEROLEMIANTE DE LACTOBACILLUS DELBRUECKII La présente invention est relative à une nouvelle souche de Lactobacillus delbrueckii dotée de propriétés 5 hypocholestérolémiantes. Il a été rapporté que certains produits laitiers fermentés peuvent exercer des effets hypocholestérolémiants. Ces effets dépendent notamment de la présence, dans ces produits, de souches spécifiques de bactéries lactiques, 10 appartenant à certaines espèces déterminées Il s'agit notamment de souches d'entérocoques, telles qu'Enterococcus faecium (Demande EP0101209), ou Enterococcus mundtii (Demande PCT WO 2007/108583), de bifidobactéries (Demande PCT WO 2007/029773) (XIAO et al., J Dairy Sci, 86, 2452-61, 2003), et 15 de lactobacilles. Chez les lactobacilles, des souches hypocholestérolémiantes n'ont été identifiées que dans quelques espèces, telles que Lactobacillus casei (BRASHEARS et al., J Dairy Sci, 81, 2103-10, 1998; KAPILA & SINHA, Indian J 20 Med Sci, 60, 361-70, 2006; KAWASE et al., J Dairy Sci, 83, 255-63, 2000), Lactobacillus fermentum ((GILLILAND & WALKER, J Dairy Sci, 73, 905-11, 1990; PEREIRA et al., Appl Environ Microbiol, 69, 4743-52, 2003), et surtout Lactobacillus acidophilus (GILLILAND et al., Appl Environ Microbiol, 49, 25 377-81, 1985; LIN et al., J Dairy Sci, 72, 2885-99, 1989; GILLILAND & WALKER, J Dairy Sci, 73, 905-11, 1990; GUPTA et al., Int J Food Microbiol, 29, 105-9, 1996; ANDERSON & GILLILAND, J Am Coli Nutr, 18, 43-50, 1999). En revanche, d'autres espèces de lactobacilles, et 30 notamment Lactobacillus delbrueckii qui est l'une des espèces les plus utilisées dans la fabrication de produits laitiers fermentés, car elle constitue, en association avec Streptococcus thermophilus, la classique � symbiose du yoghourt � était jusqu'à présent considérée comme dépourvue 35 d'effets hypocholesterolémiants. Ainsi, il a été montré que des yoghourts classiques (obtenus par fermentation avec Lactobacillus delbrueckii + Streptococcus thermophilus) ne possédaient pas les effets hypocholestérolémiants de produits laitiers obtenus par fermentation avec Lactobacillus acidophiles et Streptococcus thermophilus (AKALIN et al., J Dairy Sci, 80, 2721-5, 1997), ou avec Bifidobacterium longum (XIAO et al., J Dairy Sci, 86, 2452-61, 2003). Il a également été rapporté que l'administration de Lactobacillus delbrueckii à des souris axéniques induisait une diminution de l'excrétion du cholestérol fécal, mais aucun changement au niveau du cholestérol sanguin ou hépatique. Lorsque Lactobacillus delbrueckii était administré à des souris déficientes en apolipoprotéine E (souris ApoE KO), aucun effet n'était observé, que ce soit sur le cholestérol fécal, hépatique, ou sanguin (PORTUGAL et al., Braz J Med Biol Res, 39, 629-35, 2006). Les Inventeurs ont maintenant isolé une souche de Lactobacillus delbrueckii, qui de manière surprenante, possède des propriétés hypocholestérolémiantes. Cette souche possède en outre les capacités de croissance sur lait et de propagation des souches de Lactobacillus delbrueckii classiquement utilisées dans la fabrication de yoghourts, et peut donc être utilisée commodément dans la fabrication de produits laitiers fermentés, et notamment de yoghourts. La présente invention a en conséquence pour objet la souche de Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis déposée le 6 avril 2007 sous le numéro I-3741, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) 25 rue du Docteur Roux, à Paris. Les caractéristiques de cette souche sont les suivantes : - Morphologie microorganisme Gram-positif, assez petits bacilles granuleux plus ou moins longs. - Fermentation des sucres suivants (résultats obtenus sur une galerie API 50 CH - Milieu MRS API à 37°C pendant 48h): D-glucose, D-fructose, D-mannose, N-acétylglucosamine, maltose, lactose, saccharose, trehalose. La présente Invention a pour également pour objet un ferment lactique comprenant la souche de Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis CNCM I-3741 associée avec une ou plusieurs autre(s) souche(s) de bactéries lactiques. La(les)dite(s) autre autre(s) souche(s) peuvent notamment appartenir aux espèces suivantes : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus cremoris, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Bifidobacterium iongum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium animalis sp. Lactis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis. Selon un mode de réalisation préféré d'un ferment lactique conforme à la présente Invention, la souche de Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis CNCM I-3741 est associée avec au moins une souche de Lactobacillus delbruekii bulgaricus et au moins une souche de Streptococcus thermophilus. La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit fermenté, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend la fermentation d'un milieu approprié avec la souche CNCM I-3741, ou avec un ferment lactique conforme à l'Invention, contenant ladite souche. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de ce procédé, le milieu utilisé pour la fermentation est du lait ou un milieu à base de lait, ou un jus végétal (jus de fruits et/ou de légumes) ou un mélange de ces milieux. La présente Invention a également pour objet les produits fermentés, notamment les produits laitiers fermentés, contenant des bactéries de la souche CNCM I-3741, et éventuellement des bactéries d'une ou plusieurs autres souches de bactéries lactiques. Selon un mode de réalisation préféré d'un produit 10 fermenté conforme à l'Invention, il contient après fermentation au moins 1x106 UFC (Unités Formant Colonie), de préférence au moins 1x10' UFC et de manière tout à fait préférée entre 1x10' et 1x109 UFC par ml de bactéries de la souche CNCM I-3741. La présente Invention a également pour objet l'utilisation de la souche CNCM I-3741, ou de ferments lactiques, ou de produits fermentés contenant ladite souche, pour l'obtention de produits induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin, notamment du cholestérol LDL. La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés hypocholestérolémiantes de la souche CNCM I-3741. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration 25 de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : EFFET HYPOCHOLESTEROLEMIANT IN VIVO DE LA SOUCHE CNCM I-3741. 30 L'effet de la consommation de la souche CNCM I-3741 (également dénommée ci-après DN 111 244), et à titre de contrôle positif, de la souche de Lactobacillus acidophiles I-2273 décrite dans le brevet EP1251860 (également dénommée ci-après DN 112 001), a été évalué in vivo chez les souris 35 déficientes en apolipoprotéine E (apoE KO). La souche I-2273 est une souche qui possède une activité hypocholestérolémiante in vitro mais qui ne peut être facilement utilisée pour 15 20 l'obtention de produits laitiers fermentés, car elle a une très mauvaise croissance sur du lait. Le protocole expérimental est le suivant : 40 souris apoE KO âgées de 9 à 10 semaines ont été réparties en 4 groupes de 10 souris. Ces souris ont été fournies par CHARLES RIVER LABORATORIES, L'ARBRESLE (France). Toutes les souris ont reçu pendant 28 jours une alimentation enrichie en lipides, complémentée, par gavage, avec : - 300 �l/jour d'une culture à 6 x 108 UFC de la souche DN 111 244, obtenue dans les conditions de culture sur milieu lait-MRS (groupe 1) ; - 300 �l/jour d'une culture à 6 x 108 UFC de la souche DN 112 001, obtenue en utilisant les mêmes conditions de 15 culture sur milieu lait-MRS que celles décrites pour la souche DN 111 244 (groupe 2) ; - 300�l/jour d'un lait contrôle, dont la composition est la suivante : lait écrémé. (Contrôle). Les souches DN 112 001 et DN 111 244 (CNCM I-3741) ont été 20 cultivées sur du milieu MRS. Elles ont ensuite été resuspendues dans du lait de façon à obtenir un lait comprenant 6 x 108 UFC bactéries. La prise alimentaire des animaux dans les trois groupes a été identique. Les animaux ont été pesés au début de 25 l'expérimentation, puis à intervalles de 5 jours au cours du traitement. Aucune différence significative entre les différents groupes n'a été observée. Le taux de cholestérol plasmatique total et le taux de Cholestérol LDL ont été mesurés au début de 30 l'expérimentation, et à l'issue des 28 jours de traitement. Dosage des lipides plasmatiques Les résultats sont illustrés par les Figures 1 et 2. Ces résultats montrent, qu'à l'issue des 28 jours 35 de traitement, on observe une baisse du cholestérol total et du cholestérol LDL (le � mauvais � cholestérol) chez les animaux des groupes 1 et 2 par rapport au groupe contrôle. Exemple 2 : Croissance sur lait de la souche CNCM I-3741 Les propriétés de croissance sur lait de la souche CNCM I-3741 ont été testées en utilisant le protocole suivant : Un milieu constitué de lait écrémé reconstitué (120 g de poudre de lait écrémé dans un litre d'eau distillée additionnée de 2g/1 d'extrait de levures) été ensemencé avec la souche CNCM I-3741 ou à titre de comparaison avec la souche de L. delbrueckii subspecies bulgaricus CNCM I-1519 (cette souche, qui est décrite dans la Demande EP 0858501, possède des propriétés classiques en termes de fermentation). L'activité fermentaire des souches, reliée à leur croissance, est mesurée en suivant en continu le pH du milieu de croissance. Les résultats sont illustrés par la Figure 3. Ces résultats montrent que la souche CNCM I-3741 est capable de croître efficacement sur du lait, et qu'elle peut donc être utilisée dans la fabrication de produits laitiers fermentés. 10 15 REVENDICATIONS1) Souche de Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis déposée le 6 avril 2007 sous le numéro I-3741, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de 5 Microorganismes). 2) Ferment lactique comprenant la souche de Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis selon la revendication 1, associée avec une ou plusieurs autre(s) souche(s) de bactéries lactiques. 3) Ferment lactique selon la revendication 2, caractérisé en ce que la(les)dite(s) autre(s) souche(s) de bactéries lactiques est (sont) choisie(s) parmi des souches appartenant aux espèces suivantes : Lactobacillus delbrueckii bulgaricus et Streptococcus thermophilus. 4) Produit fermenté contenant des bactéries de la souche CNCM I-3741. 5) Utilisation de la souche CNCM I-3741, pour l'obtention d'un produit induisant une baisse du taux de cholestérol sanguin, notamment du cholestérol LDL. 20