Brevet FR2938335A1 — publié le 20100514

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase (IVD) pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies. Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200�g/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. La dermite séborrhéique est une dermatose inflammatoire cutanée fréquente se présentant sous la forme de plaques rouges, recouvertes de squames grasses et jaunâtres, plus ou moins prurigineuses, prédominantes dans les zones séborrhéiques. Il existe pour ces maladies un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase (IVD) était exprimé préférentiellement dans les glandes sébacées humaines en comparaison avec l'épiderme, et que son expression était régulée in vitro par un cocktail favorisant la différenciation de précurseurs de sébocytes, contenant un androgène (R1881 encore appelé methyltrienolone à 1 nM) et un ligand PPARy (Rosiglitazone, qui est l'acide 6-(2-Methoxy-ethoxymethoxy)-naphthalene-2-carboxylique [4'-(2,4-dioxo-thiazolidin-5-ylmethyl)-biphenyl-3-ylmethyl]-methyl-amide, à 100 nM), dans une culture primaire de sébocytes humains. La demanderesse a également démontré que cette même cible est présente dans un modèle de pharmacologie animale, sur glande sébacée de rat. Elle propose dès lors de cibler le gène IVD ou son produit d'expression, pour prévenir 10 et/ou améliorer l'acné, la dermatite séborrhéique ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Il est par ailleurs connu que le traitement par un agoniste PPAR induit une forte diminution de la taille des glandes sébacées, et une réduction de l'hyperséborrhée induite par un 15 androgène (WO2007/093747). Comme la cible proposée est en aval du récepteur PPAR, c'est elle qui est responsable des effets observés au niveau des glandes sébacées et de l'excrétion en sébum. 20 Ainsi le gène identifié peut servir pour identifier les composés les plus actifs en tant que modulateurs PPAR, les classer, et les sélectionner. Sur cette base, il est donc également proposé une utilisation du gène IVD ou de la protéine IVD comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Plus précisément, 25 on peut déterminer la capacité d'un modulateur PPAR à moduler l'expression ou l'activité de IVD ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les 30 acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, in vivo et clinique basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité de l'IVD. IVD 35 Le terme "IVD" désigne l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase.5 L'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase est une enzyme de la matrice mitochondriale catalysant la troisième étape du métabolisme de la leucine (conversion de l'isovalérylcoenzyme A en méthylcrotonyl-CoA) qui est un des précurseurs de la voie de biosynthèse des lipides dans le tissu adipeux. L'IVD est une flavoprotéine appartenant à la famille des acyl-coA déhydrogénases (Nagao et al, 1993, J Biol Chem, 268(32):24114-24). Lors de la conversion des fibroblastes 3T3-L1 en adipocytes, la biosynthèse lipidique à partir de la leucine est fortement induite et s'accompagne d'une augmentation de l'expression de l'IVD. Ces observations suggèrent un rôle potentiel de cette enzyme dans la différentiation adipogénique (Frermanet al, 1983, J Biol Chem., 258(11):7087-93). Le gène codant l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase est appelé, dans le contexte de la présente demande, gène IVD. Il est connu qu'une déficience du gène IVD se traduit par l'apparition d'une maladie autosomale récessive : l'acidémie isovalérique (Tanaka et aI, 1966, PNAS USA. 56:236-242). Celle-ci implique une accumulation de l'acide isovalérique, toxique pour le système nerveux central. Dans le contexte de l'invention, le terme � gène IVD � ou � acide nucléique IVD � signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme. Une séquence d'ADNc humain de l'IVD est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NM_002225 (Genbank) dont le cadre de lecture ouvert contient 2216 paires de bases (Matsubara et al, 1990, J Clin Invest ; 85(4) : 1058-64). Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou d'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase (IVD), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine IVD selon une des méthodes telles que le Western-Blot, l'immunohistochimie, l'analyse par spectrométrie de masse (Maldi-TOF et analyse LC/MS), le radioimmunoessai (RIA) ou l'ELISA ou toute autre méthode connue de l'homme du métier. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène IVD, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant. Un dosage de l'activité de l'IVD peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet � contrôle � est un sujet � sain �. Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le � sujet contrôle � fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence d'expression ou d'activité de la IVD, ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la IVD, tel qu'envisagé plus haut, ou un autre traitement contre l'acné, une dermatite séborrhéique ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques, une dermatite séborrhéique ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase (IVD), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine IVD peut être déterminée par un dosage de cette protéine par immunoessai, par exemple par dosage ELISA ou par toute autre méthode citée plus haut. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène IVD, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de l'IVD peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée, une dermatite séborrhéique ou une acné. Le sujet � contrôle � dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence � saine �. La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné, une dermatite séborrhéique ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.35 Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. Méthodes de criblage Un objet de l'invention est une méthode in vitro ou in vivo de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de l'IVD, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine isovalérylcoenzyme A déhydrogénase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase , de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.35 Une méthode de criblage in vivo peut être réalisée chez tout animal de laboratoire, par exemple un rongeur. Selon un mode de réalisation préféré, la méthode de criblage comprend l'administration à l'animal, de préférence par application topique, du composé à tester, puis éventuellement l'euthanasie de l'animal, et le prélèvement d'un feuillet épidermique, avant évaluation de l'expression du gène dans le feuillet épidermique, par toute méthode décrite ici. Par � modulation �, on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, l'expression du gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par � expression d'un gène � on entend la quantité d'ARNm exprimé ; Par � expression d'une protéine �, on entend la quantité de cette protéine ; Par � activité d'une protéine �, on entend son activité biologique ; Par � activité d'un promoteur �, on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. En particulier, l'invention vise l'utilisation du gène de l'IVD ou de la protéine IVD comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR ou AR (récepteur aux androgènes) candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Plus précisément, on détermine la capacité d'un modulateur PPAR ou AR à moduler l'expression ou l'activité de l'IVD ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. De manière préférentielle, le modulateur est un modulateur PPARy. Le modulateur PPAR est un agoniste ou un antagoniste PPAR, de préférence un agoniste. Le modulateur AR est un agoniste ou un antagoniste AR, de préférence un agoniste. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène IVD de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. Dans ces méthodes, l'expression du gène IVD ou du gène rapporteur peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité l'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), RT-PCR quantitative (qRT-PCR), protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûisovaléryl-coenzyme A déhydrogénase peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leur propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. L'enzyme isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité déhydrogénase, par exemple par mesure de la quantité de substrat disparu. Des dosages de l'activité enzymatique de l'IVD sont décrits dans la littérature (voir par exemple Beckmann et al, 1981, Biochem Biophys Res Commun, 102(4):1290-4 méthode inspirée de Hall et al, 1978, Methods Enzymol, 53:502-18 ou Rhead et al, 1981, J Biol Chem, 256(4):1616-24). Ainsi, Beckmann et al, 1981, supra, décrit l'évaluation de l'activité de l'isovalérylcoenzyme A déhydrogénase de la manière suivante : Les cellules adipocytaires préalablement mises en culture sont d'abord rincées dans 4 ml de tampon phosphate PBS (10 nM NaPO4 à pH 7.4), récupérées des plaques de culture puis centrifugées à 1000g pendant 5 minutes. Les culots sont soumis à un cycle de congélation/décongélation afin de rompre les membranes des cellules et des organites subcellulaires et de préserver l'activité déhydrogénase de l'enzyme. Les préparations sont suspendues à une concentration de 2 à 5 mg de protéine/ml dans un tampon KPO4 à 10 mM, pH 7.4 contenant 0.1 mM d'EDTA et 0.1 mM de pyrophosphate thiamine puis sont soumises à une sonication de 45 secondes à 4°C et centrifugées pendant 30 minutes à 50 000g. Le surnageant est alors testé pour l'activité isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase. Le principe du dosage de l'activité isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase repose sur la mesure de la diminution de fluorescence, elle-même associé à la réduction de la flavine ETF (Electron Transfert Flavoprotéine). Le mélange d'incubation de 1.5 ml contient du Tris-HCI à 20mM, pH 8, du glucose à 18 mM, de l'isovalérylCoA à 0.1 mM et de la flavine ETF à 1 pM. La réaction se déroule sur 15 cycles anaérobie d'évacuation et de purge avec de l'argon ; 30 unités de glucose oxydase et 5 unités de catalase sont ajoutées tandis que le mélange est équilibré à 30°C. La réaction est initiée par addition de 5 à 90 �g de la préparation enzymatique. La flavine ETF est excitée à 340 nm et la fluorescence est mesurée à 496 nm. Dans ces conditions d'expérimentations, le taux de décroissance de la fluorescence est proportionnelle au temps et à la concentration enzymatique. Rhead et al, 1981, décrivent quant à eux une technique de dosage de l'activité isovalérylcoenzyme A déhydrogénase basée sur l'action de l'enzyme sur son substrat (acide isovalérique) tritié. L'activité de l'enzyme peut ainsi être mesurée en fonction de la quantité de tritium relargué dans le milieu. Cette mesure peut être réalisée à partir d'homogénats cellulaires bruts, par exemple d'homogénats de foie. Le mélange réactionnel utilisé est le suivant: le substrat de l'enzyme marqué au tritium ([2, 3-3 H] acide isovalérique) est mélangé à 0.1 ml d'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, 0.2 ml d'eau distillée et 0.2 ml de KPi 12.5 mM, pH 7.5. Le mélange réactionnel final de 0.5 ml est préincubé 5 minutes à 37°C et la réaction est initiée par l'ajout de 0.05 !mol d'acide isovalérique [2, 3-3 H] dans 10 �l d'eau, pH 4 à 5. (Concentration finale du substrat: 100 �M). La réaction se déroule à 37°C pendant 30 minutes et est stoppée par addition de 40 �l d'acide chlorhydrique (HCI) à 0.5 N. Le mélange est alors refroidi à 0°C puis passé sur résine échangeuse d'anion. La résine est rincée à l'eau distillée et la mesure de tritium est effectuée. Les composés sélectionnés par les méthodes de criblage définies ici peuvent ensuite être testés sur d'autres modèles in vitro et/ou in vivo (chez l'animal ou l'homme) pour leurs effets sur l'acné, la dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme � inhibiteur� se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase. Le terme � substantiellement � signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement, il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés du type inhibiteur compétitif ou non compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1�M, de préférence moins de 0,1�M, de préférence encore moins de 0,01�M. Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01�g par ml à environ 100�g/ml, de préférence d'environ 1�g par ml à environ 5�g/ml. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci). Le composé modulateur peut également être un aptamère. L'aptamère est une classe de molécules représentant en termes de reconnaissance moléculaire une alternative aux anticorps. Ce sont des séquences d'oligonucléotides ayant la capacité de reconnaître pratiquement toutes le classes de molécules cibles avec haute affinité et spécificité. De tels ligands peuvent être isolé par évolution systématique de ligand par enrichissement exponentiel (SELEX) d'une banque de séquence aléatoire comme décrit par Tuerk et Gold, 1990. La banque de séquence aléatoire peut être obtenue synthèse chimique combinatoire d'ADN. Dans cette banque, chaque membre est un oligomère linéaire, éventuellement chimiquement modifié, d'une séquence unique. De possibles modifications, utilisations et avantages de cette classe de molécules ont été revus dans Jayasena, ,1999. Un inhibiteur de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase connus est l'hypoglycine A. Un autre est l'acide aketo-méthylènecyclopropylpropionique (Tanaka et al, 1971, PNAS, 68(1): 20-24,). L'invention comprend l'utilisation de tels composés inhibiteurs de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut sont également utiles.35 Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de l'IVD allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de l'isovaléryl-coenzyme A déhvdroqénase dans la qlande 10 sébacée humaine et dans l'épiderme humain Les échantillons d'épiderme et de glande sébacée humaine ont été préparés par microdissection laser à partir de trois liftings de peaux humaines saines (donneurs femmes). L'expression de l'ARN messager codant pour la protéine IVD a été analysée par RT-PCR 15 quantitative (qRT-PCR) en utilisant la technologie des Microfluidics Cards développée par Applied Biosystems. Le Ct correspond au nombre de cycles de PCR permettant d'atteindre un même niveau de fluorescence pour tous les échantillons. Le niveau d'expression est représenté dans chaque tissu par la moyenne des Ct et l'écart type obtenus sur les trois donneurs. 20 L'expression différentielle entre les deux tissus est mesurée par un facteur d'induction moyen (F.I) entre la glande sébacée et l'épiderme après normalisation des Ct par l'expression des trois gènes de ménage (ARN ribosomal 18S, Glyceraldehyde 3-phosphate deshydrogenase GAPDH, beta-actine). 25 Tableau 1 : mesure par qRT-PCR de l'expression de isovaleryl coenzyme A dehydrogenase (IVD) dans l'épiderme et la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des Microfluidic Cards (Applied Biosystems). Nom du Nombre de Ecart type Nombre de Ecart type Facteur gène cycles cycles d'induction nécessaire pour nécessaire moyen de détecter pour détecter l'expression l'expression l'expression dans la glande moyen dans la moyen dans sébacée versus glande sébacée l'épiderme l'épiderme humaine (Ct) humain (Ct)) humain (Fi) isovaleryl 28 0.60 31 0.39 5.6 coenzyme A dehydrogen ase Exemple 2: Expression de l'isovalérvl-coenzvme A déhvdropénase dans les sébocvtes humains en culture primaire a. Isolement et culture des sébocytes humains La culture de sébocytes humains est réalisée à partir de liftings de donneurs sains humains d'après la méthodologie décrite par Xia et al. (J Invest Dermatol. 1989 Sep;93(3):315-21) après séparation de l'épiderme du derme sous l'action de la dispase et microdissection des glandes sébacées sous loupes binocculaire. Les glandes sébacées sont ensemencées en plaque 6 puits sur une couche nourricière de fibroblastes 3T3 soumis à de la mitomycine en milieu DMEM-Ham's F12 (3:1) supplémenté en 10% Sérum Veau Foetal (SVF); 10ng/mI facteur de croissance de l'épiderme (EGF); 10-10M toxine cholerique (CT); 0.5pg/ml hydrocortisone (HC); 5pg/ml insuline (INS); 2mM L-Glutamine (GIn); 1000I/ml de penicilline-streptomycine (PS). Les premiers foyers de sébocytes humains apparaissent 3 jours après ensemencement des glandes. Les cellules sont alors traitées pendant 6 jours par le cocktail sébogénique correspondant à l'association de l'agoniste PPARy Rosiglitazone (lpM) et de l'androgène R1881 (10nM), ou par le Dimethyl sulfoxide (DMSO) servant de véhicule. b. Données d'expression en PCR L'expression de l'ARN messager codant pour la protéine IVD a été analysée par qRT- PCR en utilisant la technologie des Microfluidics Cards développée par Applied Biosystems, comme décrit précédemment (exemple 1), sur une culture de sébocytes humains correspondant à un donneur. Le niveau d'expression (Ct) est représenté pour chaque condition de traitement. L'induction de l'expression de IVD par le cocktail sébogénique est mesurée par un facteur d'induction (F.I) versus le contrôle DMSO après normalisation des Ct par l'expression des trois gènes de ménage (ARN ribosomal 18S, Glyceraldehyde 3-phosphate deshydrogenase GAPDH, beta-actine). Tableau 2 : mesure par qRT-PCR de l'expression de IVD dans une primoculture de sébocytes humains traités 6 jours par le cocktail sébogénique (association agoniste PPARy Rosiglitazone l pM ; androgène R1881 10nM) ou par le DMSO, via l'utilisation de la technologie des Microfluidic Cards (Applied Biosystems). Nom du Nombre de cycles Nombre de cycles Facteur d'induction gène nécessaire pour nécessaire pour de l'expression dans détecter détecter l'expression la condition traitée l'expression moyen moyen dans les par le mix dans les sébocytes sébocytes humains sébogénique versus humains traités par traités par le cocktail la condition DMSO le DMSO (Ct) sébogénique (Ct) (F.I) isovaleryl 31 30 2.9 coenzyme A dehydrogenase Exemple 3 : Expression de l'isovalérvl-coenzvme A déhvdrogénase dans la glande préputiale de rat en culture primaire. Les cultures primaires de sébocytes de glandes préputiales de rat (Rosenfield et al., J. 10 Invest. Dermatol. 1999;112:226-32) ont été utilisées pour évaluer des cocktails de différenciation tels que la combinaison d'agonistes de PPARy et des récepteurs aux androgènes. Après l'ensemencement sur plaques 24 puits, les cellules préputiales sont cultivées pendant 3 jours en milieu DMEM contenant 10% de Sérum de Veau Foetal (SVF), 10-10M de toxine cholérique (CT), 10-10M de cortisol, 5pg/ml d'insuline et des 15 antibiotiques. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu sans sérum (milieu Cellgro complet) et traitées avec l'agoniste PPARy (Rosiglitazone, 100nM) et l'agoniste des récepteurs aux androgènes (R1181, 1nM) de 3 à 9 jours avec un changement de milieu tous les 2 jours. Les cellules sont récupérées au Sème jour et l'analyse à grande échelle de l'expression des gènes est réalisée grâce à des puces Affymetrix RAE230A. 20 Tableau 3: mesure de l'expression de l'isovaleryl coenzyme A dehydrogenase dans les cellules de glandes préputiales en culture en réponse à un cocktail d'un androgène (R1881 à 1 nM) et d'un ligand PPARy (Rosiglitazone à 100 nM) via l'utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Le mélange est connu pour induire la différenciation 25 cellulaire caractérisée par l'augmentation de la lipogenèse. Identifiant Nom du gène Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix dans la après de de condition traitement par l'expression* l'expression* contrôle R1881 et dans la après5 (DMSO) Rosiglitazone condition traitement par contrôle R1881 et le C D3145 1370232 at isovaleryl 120 646 1 1 coenzyme A dehydrogenase *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). Exemple 4 : Données d'expression dans la qlande sébacée de rat après traitement par un agoniste du récepteur PPARgamma : Matériels et méthodes : Animaux: Espèces: rat Souche: Ico : Hsd: FUZZY-fz Sexe: femelle Age: 10 semaines Nombre par lot : 40 (8 animaux par groupe) Traitement: Voie d'administration : topique Composé/lot : agoniste de PPARgamma (rosiglitazone) Doses : 1% Véhicule : acétone (001) Durée 96 heures Méthode d'évaluation : On réalise une pesée des animaux au début et à la fin de l'étude. Des biopsies de peau sont effectuées (6 échantillons de peau excisées par rat) pour analyser l'expression des gènes (extraction d'ARN, transcriptase inverse et PCR en temps réel). Les échantillons sont conservés la nuit à 4°C avant incubation dans du bromure de sodium (NaBr) 1M pendant 2 heures à 37°C. Après incubation, les échantillons sont séparés en épiderme ou derme. Les échantillons épidermiques sont conservés à 20°C. Dans ces conditions, les glandes sébacées se trouvent dans le feuillet épidermique. Des PCR sont réalisées en commençant par les ADNc provenant des feuillets épidermiques contenant des glandes sébacées de rats contrôle ou rats traités avec l'agoniste du PPARy : l'ARNm est extrait en utilisant une colonne et quantifié. La qualité des ARNm est mesurée et est représenté par le rapport 18S/28S. Les résultats sont normalisés au 18S exprimés en induction relative versus animaux non traités (groupe véhicule). L'analyse statistique est obtenue en utilisant un logiciel interne basé sur une analyse statistique Monte-Carlo modifiée. Résultats: Agoniste de PPARgamma à 1% T=96h Nom du gène -Expression Facteur Valeur p basale d induction (nombre de Ct qRT-PCR) PPARy 32.4 0.11 0.0010 IVD 26.2 0.11 0.0010 S18 (normalisation) 11.90 - - REVENDICATIONS1. Méthode in vitro ou in vivo de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de l'isovalérylcoenzyme A déhydrogénase (IVD) ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges 15 réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins 20 un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase , ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au 25 moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine isovaléryl- 30 coenzyme A déhydrogénase, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière 35 opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour l'isovaléryl-coenzymeA déhydrogénase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons 5 biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des 10 sébocytes. 7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour l'isovalérylcoenzyme A déhydrogénase. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène 20 est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme isovalérylcoenzyme A déhydrogénase et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) 25 consiste à mesurer l'activité enzymatique. 11. Méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution d'une acné, d'une 30 dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. 15 35 12. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par immunoessai. 13. Méthode selon la revendication 12, dans laquelle l'immunoessai est un dosage 5 ELISA. 14. Méthode selon la revendication 11, dans laquelle l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant. 10 15. Méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une acné, une dermatite séborrhéique ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un 15 sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. 16. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle l'expression de la protéine est déterminée par un dosage de cette protéine par un immunoessai. 20 17. Méthode selon la revendication 16, dans laquelle l'immunoessai est un dosage ELISA ou un radioimmunoessai. 18. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle • l'expression du gène est déterminée par mesure de la quantité d'ARNm correspondant. 19. Utilisation du gène de l'isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase ou de la protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase comme marqueur pour cribler des modulateurs PPAR candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. 30 20. Utilisation selon la revendication 19, comprenant la détermination de la capacité d'un modulateur PPAR à moduler l'expression ou l'activité de l'IVD ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 35 21. Utilisation selon la revendication 19 ou 20, dans laquelle le modulateur PPAR est un modulateur PPARy. 25 22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, dans laquelle le modulateur est un agoniste du récepteur PPAR. 23. Utilisation d'un gène isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase ou d'une protéine isovaléryl-coenzyme A déhydrogénase comme marqueur pour cribler des modulateurs AR (récepteur aux androgènes) candidats pour le traitement de l'acné, d'une dermatite séborrhéique ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. 24. Utilisation selon la revendication 23, comprenant 1a détermination de la capacité d'un modulateur AR à moduler l'expression ou l'activité de l'IVD ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 23 ou 24, dans laquelle le modulateur est un agoniste du récepteur aux androgènes.