Brevet FR2941708A1 — publié le 20100806

MODELE ET METHODE D'IDENTIFICATION DE NOVO DE MARQUEURS DE SURFACE DE CELLULES SOUCHES CANCEREUSES ET DE CELLULES CANCEREUSES METTANT A PROFIT L'EFFET WARBURG INTRODUCTION: Au fur et à mesure que les connaissances progressent sur les cellules souches, le concept de cellules souches cancéreuses (10), assez ancien, tend à s'imposer à la lumière de récentes découvertes, selon ce que l'on nomme le 10 modèle hiérarchique. En effet, en cancérologie, le concept de modèle stochastique des tumeurs tend à s'effacer au profit de celui de modèle hiérarchique. En voici les définitions. Dans le modèle stochastique, la capacité de générer de la masse tumorale se trouve uniformément répartie au sein des cellules de la tumeur, et ce dès sa formation initiale. Dans le modèle hiérarchique, dès la formation initiale de la tumeur, voire même à son origine, il y a eu quelques 15 cellules particulières, qui ont eu le potentiel d'une part de donner naissance à une masse tumorale très largement supérieure aux masses tumorales que peuvent engendrer chacune des autres cellules, d'autre part d'avoir, contrairement aux cellules qu'elles engendrent, une capacité d'auto-renouvellement très majoritairement sinon exclusivement par division asymétrique, et enfin d'avoir cette capacité d'auto-renouvellement maintenue intacte dans le temps. Ces cellules souches sont appelées � cellules souches cancéreuses �. 20 Les cellules souches cancéreuses ont, comme leur définition le laisse supposer, la particularité d'être rares au sein d'une tumeur. Un autre ancien concept en Cancérologie ressurgit avec tout autant de vigueur. Otto Warburg avait souligné, des années 20 aux années 50 du siècle dernier, que les cellules cancéreuses, même 25 lorsqu'elles étaient en normoxie, n'avaient pas accès au mode respiratoire qui engage le pyruvate dans le cycle de Krebs dans la mitochondrie. Elles n'ont accès qu'à la glycolyse qui transforme le pyruvate en lactate non pas dans la mitochondrie, mais dans le cytoplasme. C'est ce que l'on a appelé la �glycolyse aérobie des cellules cancéreuses �, appellation soulignant l'opposition aux cellules normales qui n'adoptent la glycolyse qu'en milieu anaérobie (11-13, 16, 18-26), par exemple pendant l'effort musculaire. 30 ETAT DE L'ART: Les cellules souches sont des cellules dont la descendance va créer un individu ou un organe ou un tissu ou une lignée cellulaire manière coordonnée. Elles ont la capacité de s'autorenouveler par division cellulaire symétrique (on ne peut pas déterminer si les deux cellules issues de la mitose vont avoir une destinée commune ou différente) 35 ou asymétrique (l'une des deux cellules issue de la mitose va se différencier et l'autre pas). (1) Elles utilisent les divisions symétriques pour augmenter leur propre effectif. Elles font usage de divisons asymétriques pour se différencier en différents types cellulaires sous l'influence de leur micro-environnement, leur � niche �, selon le terme consacré. Dans les premières étapes de leurs différenciation, elles se différencient 40 progressivement en progéniteurs, et chaque lignée de progéniteurs donne naissance à ses propres types de cellules différenciées fonctionnelles. On peut pour les progéniteurs continuer d'utiliser le terme � cellules souches �, à condition de compléter leur dénomination par le nom de la lignée à laquelle le progéniteur donne naissance: cellules souche hématopoiétique, cellule souche hépatique, cellule souche nerveuse,etc. On peut les trouver dans la masse interne d'un blastocyte (ce sont les cellules souches embryonnaires) ou dans les 45 tissus de l'adulte au sein de leur niche (ce sont les cellules souches adultes). La niche des cellules souches progénitrices est un milieu hypoxique, où la pression en oxygène est un déterminant fondamental de leur différenciation (2,3,4,5,6,7,8). L'expression des gènes des cellules souches en hypoxie dans leur niche est finement liée à la pression locale en oxygène, c'est une notion de plus en plus confirmée, affinée et répandue, mais est aussi étroitement dépendante du pH local (9). C'est une notion qui, comme la précédente, est 50 mise à profit dans cette invention. La réflexion sur la glycolyse aérobie des cellules cancéreuses a été rapprochée d'un autre domaine d'étude, celui sur de l'embryogénèse. En effet, la pression en oxygène s'est d'abord avérée être un déterminant fondamental dans5 l'embryogénèse de l'embryon d'oursins (11). Par la suite, la pression en oxygène a vu son rôle fondamental (27, 55 34) confirmé dans l'embryogénèse de tous les métazoaires, y compris celle des Mammifères. Aujourd'hui, les déterminants que sont: la pression en oxygène (34), en liaison aussi avec la présence, l'abondance, l'hétérogénéité de répartition et l'activité des mitochondries (11-15, 23), 60 ^ les résidus du stress oxydatif (35-37), et nitrique (38), et les enzymes de détoxification correspondants . • la disponibilité en glucose (39), l'ATP extracellulaire (40-41), et le ratio AMP/ATP intra-cellulaire. • le calcium, et pour nombre de progéniteurs, l'ostéopontine (42,43), peuvent être considérés comme des déterminants fondamentaux dans l'Embryogénèse (11, 27-29, 34) et la 65 Cancérogénèse (l0, 34), avec peut-être un rôle hiérarchique prédominant pour la pression en oxygène, qui est finement compartimentée entre différentes localisations intra-cellulaires, et en gradients de pression dans la matrice extra-cellulaire et dans les tissus (44-46). Pourtant, ces données expérimentales n'ont pas encore été exploitées pour la mise à jour DE NOVO de marqueurs, de surface ou non, de cellules souches et de cellules souches cancéreuses. C'est ce que se propose 70 de faire la méthode d'investigation selon l'invention à travers son modèle original d'études. Comme méthode systématique dans le domaine de l'identification de marqueurs de cellules souches, on dispose seulement aujourd'hui d'une voie très majoritairement utilisée, et à partir de laquelle se font une majorité des travaux sur les cellules souches. C'est la méthode de l'identification par cytométrie de flux des populations 75 cellulaires marginales SP (side population) pour l'efflux de marqueurs colorants (Rhodamine 123 ou Hoescht 33342) (47,48). Cette méthode repose sur la fait que nombre de cellules souches expulsent de leur cytoplasme les marqueurs colorants par certaines pompes membranaires de détoxification que sont certains transporteurs ABC (la méthode vérifie aussi qu'elles perdent cette propriété lorsqu'elles sont soumises au Verapamil, un inhibiteur de certains desdits transporteurs ABC). 80 Cependant, la méthode n'est considérée ni comme exhaustive, ni comme d'une fiabilité totale (47), ni pour la caractérisation de marqueurs de cellules souches, ni par conséquent pour celle de cellules souches cancéreuses (87). Et ceci bien que cellules souches et cellules cancéreuses partagent cette propriété de pompage hors du cytoplasme de métabolites indésirables, une propriété qu'on dénomme MDR (Multi-Drug Resistance) chez les cellules cancéreuses. Par ailleurs, en l'absence de méthodes, les laboratoires vérifient aujourd'hui leurs hypothèse 85 avec un outil qui lui-même demande, on voit le paradoxe, des améliorations ou des vérifications alternatives complémentaires. Une autre série de méthodes existe: elles reposent sur l'expression différentielle comparée de deux types cellulaires qui différent par leur état de différenciation, par exemple des cellules normales et des cellules souches. Les méthodes d'expression différentielle transcriptomiques sont bien entendu beaucoup moins informatives que 90 les méthodes d'expression différentielle protéomique (49-57). Toutes les méthodes qui viennent d'être évoquées présentent l' inconvénient de devoir faire les expérimentations des cellules souches par définition en petit nombre. Elles ont aussi l'inconvénient de présupposer aux lots de cellules souches ou progénitrices étudiés un caractère � cellule souche � ou �progéniteur � qu'elles n'ont peut-être pas totalement, mais qui leur est attribué au vu de l'utilisation de méthodes désignées pour leur attribuer ce 95 caractère, fût-ce avec quelques imperfections. Ce caractère un peu arbitraire est un facteur de blocage des connaissances dans le domaine. On voit dans l'Etat de l'Art actuel la difficulté de découvrir des nouveaux marqueurs en recrutant des cellules souches avec des marqueurs déjà connus (et dont certains sont imparfaits) et avec les méthodes existantes, alors que les chercheurs travaillant sur les cellules souches cherchent à sortir de ce champ de 100 marqueurs anciens qui a fait faire des progrès considérables mais qui ne donne plus entièrement satisfaction (47). Dans ce contexte pourtant, une équipe de chercheurs des Universités de Manchester et de Leeds en 2006 sous la direction d'Anthony Whetton a conduit une approche protéomique par expression différentielle qui, bien que se basant sur des populations de cellules en faible nombre et isolées grâce à des marqueurs connus, 105 a permis d'entrevoir les possibilités offertes par les différentiels protéomiques dans le métabolisme énergétique des cellules souches. Cette approche est décrite dans l'article (57): �Unwin RD, Smith DL, Blinco D, Wilson CL, Miller CJ, Evans CA, Jaworska E, Baldwin SA, Barnes K, Pierce A, Spooncer E, Whetton AD; Quantitative proteomics reveals posttranslational control as a regulatory factor in primary hematopoietic stem cells. Blood. 2006 Jun 15;107(12):4687-94. � 110 En voici le résumé publié dans l'article et traduit en français: � Le protéome est déterminé par des taux de transcription, de translation, et de renouvellement des protéines. Il s'ensuit que la définition même des cellules souches requiert qu'on définisse leur signature protéomique. Cependant, le nombres limité de cellules disponibles en a limité l'analyse protéomique extensive. Nous présentons une méthode par spectrométrie de masse qui utilise une modification covalente isobarique pour une quantification relative de 115 peptides, appelée i-TRAQ. Nous l'avons utilisée pour comparer les protéomes d' approximativement un million de cellules souches hématopoïétiques reconstitutives sur le long terme (Lin Sca+Kit+; LSK+) de celui de cellules souches hématopoïétiques reconstitutives à moyen terme (Lin Sca+Kit ; LSK. Une séparation extensive de peptides par chromatographie liquide en deux dimensions en préalable à la spectrométrie de masse a permis d'améliorer la couverture protéomique de l'analyse, avec une quantification 120 relative de 948 protéines. Sur les 145 protéines dont l'expression change, 54% ne furent pas détectées par des expressions différentielles transcriptomiques. Les expressions protéomiques différentielles détectées sont en relation avec l'hypoxie et contrôlent le métabolisme, ainsi que la protection du stress oxydatif, ce qui indique que les cellules LSK+ sont adaptées à un environnement anaérobique. Cette approche peut définir des changements d'expression d'échantillons au stade primaire, et par là caractériser la signature 125 moléculaire de cellules souches et de leur progéniture.� Et voici la conclusion de l'article: � La valeur de toute nouvelle technologie repose sur l'apport de nouvelles visions dans la biologie du système étudié. Le protéome des cellules LSK+ protège des dommages oxydatifs en permettant aux cellules de concentrer leur métabolisme sur la glycolyse anaérobie en augmentant l'expression d'enzymes glycolytiques, de transprteurs du glucose et d'enzymes anti-oxydantes. � 130 La publication d'Anthony WHETTON et al. confirme de manière claire et précise le rôle prédominant des enzymes glycolytiques dans la différenciation cellulaire, et apporte une confirmation spectaculaire de l'efficacité d'une expérimentation protéomique différentielle quantitative avec la méthode i-TRAQ (séparation des digestions trypsiques des protéines de l'échantillon en deux dimensions puis identification et quantification par la spectrométrie de masse i-TRAQ avec étiquetage massique, la quantification étant faite 135 sur l'étiquette massique et l'identification étant faite sur la comparaison en base de données informatiques des masses des peptides marqués, une fois que les collisions dans la chambre de l'appareil de spectrométrie de masse ont induit la séparation peptide - étiquette) . Par rapport aux travaux des équipes d'Anthony Whetton, voici l'étape supplémentaire que pourraient franchir le modèle original et la méthode proposés dans cette invention: découvrir des marqueurs de surface 140 de cellules souches cancéreuses DE NOVO, inclusifs de cellules souches cancéreuses et non exclusifs, sans prendre appui sur les marqueurs de cellules souches déjà existants. La publication d'Anthony WHETTON et al. met en avant le rôle prédominant des enzymes glycolytiques dans la différenciation cellulaire. Le micro-environnement d'une niche hypoxique de cellules souches normales n'est pas acide, bien que 145 l'hypoxie de cette niche amène une glycolyse anérobie produisant du lactate. En effet, les cellules souches normales, bien qu'en glycolyse anaérobie, ne devraient pas acidifier le milieu, car elles sont très minoritaires au sein de leur micro-environnement où évoluent des cellules en voie de différenciation délaissant petit à petit la glycolyse anaérobie pour acquérir progressivement la respiration mitochondriale. Compte tenu de ce faible nombre de cellules souches au milieu de cellules en voie de différenciation, ce 150 seraient plutôt les cellules environnantes de la niche qui imposeraint le pH. Celles-ci, beaucoup plus nombreuses, diminuent progressivement leur production de lactate au fur et à mesure qu'elles se différencient (les conditions de différenciations des cellules souches sont très dépendantes de l'hypoxie et du pH existant dans les niches (9,71)). Par contre, on peut s'attendre à ce que le micro-environnement d'une niche hypoxique de cellules souches 155 cancéreuses soit acide (73-76). En effet, d'une part les cellules souches cancéreuses dans leur niche hypoxique sont en glycolyse anaérobie produisant du lactate, d'autre part, comme l'a montré Otto Warburg, les cellules cancéreuses environnantes de cette niche, comme toute cellule cancéreuse, sont aussi en glycolyse et produisent elles aussi du lactate, que leur micro-environnement soit aérobie ou anaérobie. La présente invention vise à établir une nouvelle méthode d'identification DE NOVO de marqueurs de 160 surface caractéristiques de cellules souches cancéreuses et de cellules cancéreuses en exploitant les données acquises sur le métabolisme énergétique des cellules souches et des cellules tumorales, et particulièrement sur le métabolisme de la cellule en glycolyse ou en respiration mitochondriale. Les cellules cancéreuses ont ceci en commun avec les cellules souches qu'elles utilisent fondamentalement la glycolyse et non pas la respiration mitochondriale. Les cellules souches le font parce qu'un micro- 165 environnement de niche hypoxique est nécessaire au bon déroulement de leur différenciation, les cellules cancéreuses n'ont quant à elles pas la possibilité d'utiliser la respiration mitochondriale, car leur métabolisme les prive d'un accès du pyruvate à la mitochondrie et au cycle de Krebs et leur impose de transformer le pyruvate en lactate. Les expérimentations proposées vont aussi mettre à profit le fait que les cellules cancéreuses évoluent plutôt 170 dans un environnement acide, alors que les cellules normales s'accommodent mieux d'un pH normal Le nouveau modèle d'étude et la nouvelle méthode de l'invention mettent aussi à profit le fait selon lequel le le dichloroacétate (DCA) a la propriété de faire basculer les cellules cancéreuses, qui utilisent la glycolyse en situation d'aérobie, vers la respiration mitochondriale (59, 60). De ce point de vue, les actions d'un PK2 A sh RNA (88, 89), ou d'un LDH-A (90) sh RNA, ou d'un PDK1 sh RNA (92) sont comparables à 175 celle du DCA, car ces molécules biologiques elles aussi ouvrent l'accès des cellules cancéreuses à la respiration mitochondriale (un sh RNA PK2 est un petit ARN en épingle à cheveux inhibant la puruvate kinase 2; de même un sh RNA LDH-A inhibe la lactate dehydrogénase A, un PDK1 sh RNA inhibe la pyruvate dehydrogenase kinase 1). Pour partie, le nouveau modèle d'étude de l'invention vise à étudier par une expression différentielle un 180 changement spécifique d'expression des marqueurs de surface de la cellule cancéreuse en respiration mitochondriale avec une apoptose retardée, et tirer profit de la comparaison, pour finalement mieux cerner l'expression de surface des cellules cancéreuses � par nature� en glycolyse aérobie. Le raisonnement proposé dans ce document est le suivant: si une méthode arrive à caractériser des marqueurs de surface spécifiques des cellules en glycolyse, il est possible de répertorier un lot de marqueurs 185 de surface dont certains s'exprimeront sur les cellules souches et seulement sur les cellules souches, certains s'exprimeront sur les cellules cancéreuses et seulement sur les cellules cancéreuses (cellules souches cancéreuses non comprises), et un petit nombre à la fois sur les cellules souches cancéreuses et les cellules cancéreuses. Ces derniers, que l'on peut appeler � marqueurs inclusifs mais non exclusifs de cellules souches cancéreuses � devraient être des marqueurs caractéristiques de cellules souches cancéreuses et de 190 cellules cancéreuses. Voilà pour le modèle d'étude. Ces marqueurs de surface pourront entre autres être utilisés dans le diagnostic ou dans une stratégie de ciblage pour une immunothérapie anti-cancéreuse. Précisons déjà sur un mode anticipatif qu'au stade ultime où peut aller cette stratégie, c'est à dire le ciblage de tumeurs par des lymphocytes, on préconisera aux patients, pendant la période de traitement, de ne pas faire d'efforts musculaires pouvant conduire leurs 195 cellules musculaires à être en glycolyse anaérobie. La description de l'invention ci-après va rendre cette observation évidente. L'identification de ces marqueurs selon l'invention vise aussi à faciliter une identification de cibles thérapeutiques pour le cancer. L'identification de ces marqueurs selon l'invention vise aussi à servir une stratégie de ciblage des drogues 200 anti-cancéreuses sur les tumeurs. En effet, les drogues anti-cancéreuses pourront être couplées de façon covalente ou non covalente à des peptides, des pseudo peptides, des fragments d'anticorps ou des anticorps ciblant les marqueurs identifiés par l'invention. L'identification de ces marqueurs selon l'invention vise aussi à rendre possible une meilleure compréhension des pathologies liées au métabolisme énergétique, telles que diabète ou obésité, et enfin à 205 rendre possible une meilleure compréhension du vieillissement. DESCRIPTION DE L'INVENTION: La méthode de découverte et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle est basée sur une 210 première expression différentielle protéomique comparant d'une part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire de surface (1) des cellules d'une tumeur ou d'une lignée de cellules cancéreuses à pH légèrement acide et en normoxie ou en hypoxie, dont on sait 215 que, comme toute tumeur ou toute lignée de cellules cancéreuses, elle n'a pas accès à la respiration mitochondriale, mais seulement à la glycolyse dite � glycolyse aérobie � et ce quelles que soit les conditions de pressions d'oxygène, et d'autre part 220 l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire de surface (2) des cellules de la même tumeur ou de la même lignée de cellules cancéreuses à pH légèrement acide, en normoxie, et soumise à une action chimique ou biochimique ou biologique leur ouvrant l'accès à la respiration mitochondriale, les marqueurs de surface exprimés différentiellement par les cellules de la tumeur ou de la lignée de 225 cellules cancéreuses non soumises à une action chimique ou biochimique ou biologique leur ouvrant l'accès à la respiration mitochondriale représentant un ensemble (3) de marqueurs de surface des cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses en glycolyse � aérobie �, avec interférence possible avec des marqueurs de surfaces de cellules normales, 230 ledit ensemble (3) pouvant être restreint par un deuxième ensemble (6) détecté par une deuxième expression différentielle comparant d'une part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranàire de surface (4) des cellules d'un tissu normal 235 à pH neutre en hypoxie, dont on sait qu'elles sont en glycolyse anaérobie et d'autre part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire de surface (5) des cellules du même tissu normal à pH neutre en normoxie, dont on qu'elle sont en respiration mitochondriale, les marqueurs de surface exprimés différentiellement par les cellules normales en hypoxie à pH neutre représentant l'ensemble (6) de marqueurs de surface de cellules normales à pH neutre en glycolyse anaérobie dont peuvent faire éventuellement partie tout ou partie des marqueurs de surface de cellules souches normales (en glycolyse anaérobie), la restriction de l'ensemble (3) par l'ensemble (6) représentant l'ensemble (7) des marqueurs de surface spécifiques de celules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses en glycolyse aérobie sans interférence avec des marqueurs de cellules normales en glycolyse anaérobie dont peuvent faire éventuellement partie les marqueurs de surface de cellules souches normales 250 Selon une version de l'invention, l'expérimentation protéomique différentielle de l'invention peut être effectuée sur uhe plateforme i-TRAQ de la société Applied Biosystems. Sur une plateforme de ce type, on effectue une séparation des digestions trysiques des protéines de l'échantillon en deux dimensions puis une identification - quantification par la spectrométrie de masse i-TRAQ avec, comme il est dit plus haut, un 255 étiquetage massique. La quantification est faite sur l'étiquette massique et l'identification est faite gràce à la comparaison en base de données informatiques des masses des peptides marqués, une fois que les collisions dans la chambre de l'appareil de spectrométrie de masse ont induit la séparation peptide ù étiquette massique . 240 245 260 FIGURE: LA FIGURE 1 illustre la méthode et le modèle de l'invention. Un moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut être 265 l'action d'une molécule chimique comme l'acide dichloroa-acétique (DCA) assistée par l'action de la mélatonine. Voici comment l'équipe de Michelakis(60) décrit l'action du DCA dans Cancer Cell 2007 Jan; 11(1):37-51. Il est suggèré qu'un des effets en chaîne du dichloracétate (DCA), après avoir fait sauter sur la cellule cancéreuse le verrou d'accès à la respiration mitochondriale, mène à une dépolarisation de la membrane mitochondriale, à l'efflux hors de la mitochondrie du cytochrome c et de l'apoptosis inducing 270 factor AIF, le tout menant à l'apoptose. C'est seulement sur les cellules cancéreuses que le DCA a cet effet apoptotique. Il ne rend pas apoptiques les cellules normales. Cette propriété fait du dichloroacétate un anti-cancéreux potentielement sélectif et efficace, et ceci a fait l'objet d'un dépôt de brevet �WO/2006/108276. A method of treating cancer using dichloroacetate. Michelakis E, Archer S. � 275 Dans l'invention, l'action de la mélatonine est combinée à celle du DCA au titre de son pouvoir antioxydant pressenti pour retarder l'apoptose des cellules cancéreuses sous DCA, car la cellule apoptotique n'est pas le sujet d'étude recherché dans ces expériences d'expressions différentielles, et l'apoptose des cellules cancéreuses étudiées ne donnerait pas de sens auxdites expressions différentielles. 280 Les expressions différentielles protéomiques ou glyco-protéomiques se feront donc sur cellules cancéreuses avant DCA+ mélatonine, et après DCA + mélatonine. Alternativement la méthode pourra se baser sur des expressions différentielles protéomiques de cellules cancéreuses surexprimant la survivine avant et après dichloroactétate, ou avant et après un mix 285 (dichloroacetate + autre anti-apoptotique), ou avant et après un mix (dichloroacetate + autre antioxydant). La mélatonine est la molécule privilégiée dans l'invention pour accompagner le DCA. En fait, la surexpression d'un anti-apoptotique comme la survivine aurait pu convenir, et des variantes de la méthode 290 utiliseront les expressions différentielles des cellules cancéreuses surexprimant le survivine avant et après DCA. De même, tout autre anti-oxydant peut convenir, pourvu qu'il y ait une action synergique avec les enzymes de détoxification du stress oxydatif, à la lumière de la description faite par l'équipe de Michelakis(60) dans le brevet et dans Cancer Cell 2007 Jan; 11(1):37-51. Celle-ci suggère qu'un des effets en chaîne du dichloracétate (DCA) mène d'abord à un retour à la normale de l'hyperpolarisation de 295 la membrane mitochondriale des cellules cancéreuses, puis à leur dépolarisation sous l'effet d'espèces réactives à l'oxygène , ainsi qu'à l'efflux hors de la mitochondrie du cytochrome c et de l'apoptosis inducing factor AIF, le tout menant à l'apoptose. La mélatonine est envisagée ici pour amoindrir la dépolarisation de la membrane mitochondriale et donc retarder l'apoptose des cellules cancéreuses en respiration mitochondriale. La surexpression de la survivine peut être aussi utilisée pour contrer une 300 éventuelle action pro-apoptotique de l'hypoxie indésirable pour les expériences. Les résultats obtenus gràce à l'action du DCA pourront être comparés avec ceux de obtenus avec le radicicol et l'AZD7545, actifs sur la pyruvate dehydrogenase kinase PDK, inhibiteur de la pyruvate dehydrogenase, et avec l'oxamate, inhibiteur de la lactate déhydrogenase, l'enzyme qui permet la 305 transformation du pyruvate en lactate. Un autre moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut être l'action d'un LDH-A sh RNA (petit ARN en épingle à cheveux inhibant la lactate dehydrogénase A) (90) D'autres moyens employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peuvent être la surexpression de la PK1 (isoforme 1 de la pyruvate kinase), l'action d'un PK2 sh RNA (petit ARN en épingle à cheveux inhibant la pyruvate kinase 2) (87, 88, 89) 315 Un autre moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut 310 être l'action d'un l'action d'un PDK1 sh RNA (92). Selon une version de l'invention, on pourra élargir le champ des expérimentations décrites en prenant pour cellules � normales � des cellules de tumeurs bénignes. 320 Par exemples, une comparaison de l'expression protéomique ou glyco-protéomique déterminant ledit ensemble (3) peut être faite sur une tumeur maligne telle qu'un carcinome, un adénocarcinome ou un sarcome (liposarcome ou myosarcome ou neurofibrosarcome) soumise ou non aux molécules chimiques ou biologiques qui les basculent sur la respiration mitochondriale. Si tel est le cas, la deuxième expérience de protéomique ou de glyco-protéomique d'expression différentielle qui serait judicieuse pour 325 déterminer ledit ensemble (6) serait respectivement celle d'une tumeur bénigne, respectivement un adénome, un lipome, un fibrome, un neurinome, en hypoxie ou en normoxie. On peut noter que la méthode conçoit et exploite un nouvel objet biologique, jusque-là absent des labos de recherche: la cellule cancéreuse en respiration mitochondriale, dont on espère faire grand usage dans 330 ces expressions différentielles. Ce faisant le nouvel objet d'études biologiques non identifié que l'on espère désormais exploiter est donc plus précisément la � cellule cancéreuse non apoptotique en respiration mitochondriale �. La méthode serait donc en mesure de contourner la difficulté essentielle de l'identification marqueurs de cellules souches, et à fortiori de cellules souches cancéreuses: disposer de cellules souches. 335 Dans une variante de la méthode, et afin de l'affiner, les expressions différentielles protéomiques des cellules cancéreuses avant et après le mix (DCA + mélatonine) se feront non seulement sur extraits totaux de membranes plasmiques, mais encore sur la composante � lipid rafts �. 340 Sans que cela doive être strictement superposé aux données établies sur la signalétique moléculaire induite par la prise en compte de la pression d'oxygène (le � 02 sensing � en anglais� (61, 77-82), désigne le traitement de l'information �pression d'oxygène� à l'intérieur de la cellule et à l'extérieur de la cellule, et des informations communiquées par la cellule), 345 le nouveau modèle d'étude et la nouvelle méthode selon l'invention prévoient que les cellules normales, cellules souches normales ou cellules normales différenciées, ont des marqueurs de surface spécifiques d'un état en respiration mitochondriale dominante, et d'autres marqueurs de surface spécifiques d'un état en glycolyse dominante. Il est donc évoqué ici non pas les informations que la cellule reçoit sur la pression en oxygène et qu'elle traite par 350 différentes transductions du signal pour l'intégrer dans son métabolisme énergétique, mais plutôt les signaux qu'elle communique par secrétion ou excrétion ou exocytose à son environnement, en particulier aux cellules voisines et à la matrice extra-cellulaire. Plus qu'aux informations reçues par la cellule sur la pression en oxygène, et à la manière dont son métabolisme subit ce paramètre à l'intérieur de la cellule, la méthode s'intéresse aux signaux que la cellule donne à son 355 environnement sous l'influence de ce paramètre, à charge pour les cellules voisines d'exploiter ces signaux. A ce jour, excepté peut-être pour l'expression de surface des cellules endothéliales en voie d'angiogénèse ou de vasculogénèse, ce deuxième aspect de la communication cellulaire donnée par la cellule sous l'influence de la pression en oxygène n'a apparemment été ni systématisé, ni exploité, à fortiori pour l'étude des cellules souches. Seul le premier aspect, celui des signaux transduits à l'intérieur de la cellule et à l'usage de la cellule en hypoxie l'a 360 été, comme dans l'étude des voies de signalisation induites par HIF-1 alpha et HIF-lbeta (HIF=hypoxia inducible factor). Depuis peu, on sait que l'ensemble du domaine du � 02 sensing� est intimement lié à la polarité de cellule (77-82), qui est un domaine de toute première importance en cancérologie: l'une des marques fondamentales des cellules cancéreuses est leur perte de polarité, et l'asymétrie de la mitose est au centre des mécanismes de 365 différenciation (84) et de la cancérogénèse (83). Par exemple, les interactions entre LKBI, impliquee dans la polarite cellulaire, et AMPK, impliquee dans le metabolisme energétique, sont de plus en plus explorées. Dautres voies sont aussi tres révélatrices comme celles qui lient SIRT-1 (polarité, metabolisme energétique) aux proteines exprimées specifiquement dans les cellules souches. 370 Par ailleurs, dans une variante de la méthode, et afin de l'affiner, les expressions différentielles protéomiques des cellules normales en normoxie puis en hypoxie voire en anoxie se feront non seulement sur extraits de membranes plasmiques, mais encore sur la composante �microdomaines� desdites membranes plasmiques (62), ceux que l'on nomme � lipid rafts � ou � radeaux lipidiques �, et qui correspondent à la partie � résistante aux détergents � 375 des membranes plasmiques. En effet, bon nombre de protéines mitochondriales, lors de changements radicaux dans le métabolisme énergétique, font une translocation vésiculaire de la membrane mitochondriale à la membrane plasmique, et la méthode s'attachera à préciser si les marqueurs de surface retenus n'en font pas partie. La méthode serait donc en mesure de contourner la difficulté essentielle de l'identification marqueurs de cellules 380 souches, et à fortiori de cellules souches cancéreuses: disposer de cellules souches. Le ou les marqueurs sélectionnés par la méthode pourront être ensuite être caractérisés sur la manière dont leur expression s'effectue en surface de cellules souches ou de cellules progénitrices déjà caractérisée et isoléees, et en particulier si elle est concommittante ou non avec l'expression des marqueurs non surfaciques fondamentaux dans l'étude des cellules souches comme Oct-4, Nanog, Sox-2, c-Myc, Klf4. 385 Si les expressions différentielles sur membranes plasmiques posent des problèmes spécifiques qui sont évoquées plusieurs publications (49,50), la méthode des expressions différentielles protéomiques a représenté un progrés par rapport aux expressions différentielles transcriptionnelles (51-58) . Une meilleure compréhension de ce ou ces marqueurs de surface sélectionnés s'effectuera en répondant à la 390 question: Dans une cellule normale en normoxie, quelle est la localisation de la ou des molécules sélectionnées? Sont-elles, en normoxie, dans l'environnement mitochondrial? Subissent-elles une translocation de l'environnement mitochondrial vers la membrane plasmique en situation d'hypoxie pour devenir de facto un marqueur de surface de la glycolyse ? (le terme � environnement mitochondrial � fait référence à la zone d'interface entre le 395 cytoplasme et la mitochondrie, où des protéines du cytoplasme telles que hsp6O, bax, hexokinase II interagissent avec des complexes protéiques de la membrane externe de la mitochondrie tels que les porines VDAC (66, 86)). Si les marqueurs de surface caractéristiques des cellules cancéreuses des cellules souches cancéreuses et des cellules cancéreuses sont identifiés, et que ces marqueurs sont aussi exprimés en surface des membranes 400 plasmiques des cellules normales en hypoxie à pH acide, une voie à suivre pour mieux comprendre leur fonction est de voir si cette expression ne correspond pas à une translocation commandée par l'hypoxie et le pH. Plus précisément, il faut vérifier si dans les cellules normales à pH neutre, au lieu d'être exprimés en surface des membranes plasmiques, ces marqueurs n'étaient pas exprimés dans l'environnement mitochondrial. De plus, les résultats obtenus gràce à l'action du DCA pourront être comparés avec ceux de obtenus avec le radicicol et 405 l'AZD7545, actifs sur la PDK, et avec l'oxamate, inhibiteur de la lactate déhydrogenase, l'enzyme qui permet la transformation du pyruvate en lactate. POURSUITE DES INVESTIGATIONS SUR L'UTILSATION DES MARQUEURS SELECTIONNES DANS UNE APPLICATION EN IMMUNO-THERAPIE ANTI-CANCEREUSE: 410 Il faut préciser qu'une stratégie d'immuno-therapie anti-cancéreuse ou de chimiotherapie cancéreuse n'a pas besoin de marqueurs exclusifs de cellules souches cancéreuses, mais a besoin de marqueurs inclusifs de cellules souches cancéreuses. En effet, il ne s'agit pas de vouloir détruire seulement les cellules souches cancéreuses, mais si possible toutes les cellules cancéreuses, y compris les cellules souches cancéreuses. Il y a donc un besoin de marqueurs de surface qui s'expriment sur les cellules cancéreuses ordinaires si 415 possible et de manière encore plus souhaitable sur les cellules souches cancéreuses. Les expérimentations proposées vont aussi mettre à profit le fait que les cellules cancéreuses évoluent plutôt dans un environnement acide, alors que les cellules normales s'accomodent mieux d'un pH normal. Certaines molécules méritent dans ce domaine une cetaine attention. Par exemple le complexe F 1 FO ATP synthase est normalement localisé dans la membrane mitochondriale. On le retrouve exceptionellement à la 420 surface des membranes plasmiques (62), où il prend le nom d'ecto-FI FO ATP synthase. Là il est souvent retrouvé complexé à l'Apoliproteine A-I. Il est aussi exprimé en surface des cellules de certaines tumeurs, où il peut être la cible de lymphocytes gamma 9 delta2 (62,63). Enfin, il est aussi exprimé à la surface des cellules endothéliales où il peut avoir l'angiostatine comme ligand et participe à la régulation de l'ATP extracellulaire dans l'environnement de la membrane plasmique (62, 64-65), et par conséquent sans doute 425 du pH. De leur côté les lymphocytes Gamma 9 Delta 2 qui cibleraient des cellules souches cancéreuses le feraient, comme d'autres lymphocytes (72), seulement à une pression d'oxygène précis et à un pH précis dans un environnement légèrement acide et en anaérobie. Avant vérification expérimentale du modèle original et de la méthode présentés dans ce document, il existe une bonne présomption pour qu'un des marqueurs de surface mis à jour soit l'ecto-ATP synthase, qui serait alors une cible dans une stratégie 430 d'immuno-thérapie cancéreuse utilisant les lymphocytes Gamma Delta. Par des considérations analogues, il se pourrait que gràce au modèle et à la méthode présentés dans cette invention, hsp60 soit révélé comme un marqueur de surface caractéristique de cellules cancéreuses et de cellules 435 souches cancéreuses et exploitable dans une stratégie d'immuno-thérapie cancéreuse utilisant les NK. En effet, hsp60 (66-70), au moins dans les cardiomyocytes, perd sa localisation cytoplasmique et mitochondriale lorsque la cellule est en hypoxie, et subit alors une translocation sur la membrane plasmique (66). Il devient alors de facto un marqueur de surface de la cellule en glycolyse. Par ailleurs hsp60 est un ligand de certains récepteurs de la famille des Toll-like-receptor (67,68) que peuvent exprimer les cellules Natural Killer NK. Enfin hsp60 est un marqueur 440 tumoral co-régulé avec CD44 v5/v6 (70) (CD44 v5/v6 est un marqueur métastatique), et interagissant avec la survivine (69), une protéine anti-apoptotique qui elle-même interagit avec Oct-4, une protéine impliquée dans la différenciation cellulaire en milieu hypoxique. Concernant l'hypothèse d'une utilsation en Immunothérapie anti-cancéreuse des marqueurs pouvant être 445 découverts selon l'invention, les trois questions complémentaires auxquelles il faudra répondre seront les suivantes: 1) les marqueurs de surface identifiés par la méthode sont-ils de bons marqueurs pour le ciblage par immuno-thérapie anti-cancéreuse? 2) Quels sont les conditions optimales de micro-environnement qui mènent à la réussite du ciblage? 450 3) Si les conditions de micro-environnement sont définies, quelles sont celles qui feront qu'un lymphocyte ciblera une cellule souche cancéreuse préférentiellement à une cellule souche normale chargée du renouvellement cellulaire, par exemple de la peau ou de l'intestin ou des cellules hématopoiétiques? La réponse à ces deux dernières questions est une piste fondamentale d'investigation. Certes on peut penser à un chimiotactisme sélectif qui dirige les lymphocytes de l'Immunité Naturelle sur 455 les cellules souches cancéreuses plutôt que vers les cellules souches normales. Mais celà transformerait en zones interdites à l'Immunité Naturelle les zones où il y a du renouvellement cellulaire. Or celui-ci existe dans la plupart des tisus. Cette hypothèse n'est donc pas satisfaisante. Voici la piste de réflexion proposée dans cette invention: Deux facteurs fondamentaux du micro-environnement de la cible président à la réussite du ciblage du 460 lymphocyte: la pression locale d'oxygène et le pH précis auxquels la cible et le lymphocyte exposent respectivement leurs bons marqueurs en surface (70-75). La réflexion selon laquelle l'Immunité Naturelle anti-tumorale est une réalité, et que son bon fonctionnement impose que le lymphocyte soit sélectif pour éliminer seulement la cellule souche cancéreuse et non pas les cellules souches normales, cette réflexion donc incite à penser que le lymphocyte NK ou le lymphocyte Gamma Delta subissent une régulation très 465 fine (72) liée aux conditions précises (pression en oxygène, pH) du micro-environnement dans la � niche de l'exécution cytotoxique�. Ce terme de la �niche de l'éxécution cytotoxique� - introduit ici pour la clarté du document - de la cellule souche cancéreuse par le lymphocyte est employé en référence à la niche dans laquelle la cellule souche normale exprime ses marqueurs de surface. La sélectivité du lymphocyte entre cellules souches normales et cellules souches cancéreuses peut se jouer sur ce terrain-là. 470 L'Immunité Naturelle ne peut avoir lieu sans sélectivité qui préserve les cellules souches normales, et cette sélectivité se joue vraisemblablement au niveau des conditions micro-locales des paramètres physico-chimiques comparés des � niches des cellules souches normales � et des � niches d'exécution cytotoxique � des lymphocytes de l'Immunté Naturelle. Si tel n'était pas le cas, il faudrait imaginer que l'expression des marqueurs de surface des cellules souches, cancéreuses ou normales, puisse se faire � en 475 amont � des paramètres physico-chimiques. Au vu de l'exposé qui est fait dans la première partie du document, qui s'est attaché à montrer le rôle en amont de la pression très locale d'oxygène et des autres conditions de milieu, celà paraît peu fondé. C'est la raison pour laquelle il est proposé corrélativement d'affiner le modèle à des conditions très 480 précises de pH et de pression d'oxygène dans les conditions d'expérimentation des expressions différentielles protéomiques prévues. Le modèle affiné pourra donc être contraint à des conditions de pression d'oxygène et de pH physiologiques pouvant exister soit dans les niches de cellules normales, soit au sein d'une tumeur. Dans 485 une application du modèle pour l'Immunotoxicicité naturelle contre les tumeurs, ce sont les marqueurs obtenus dans les conditions de la � Niche d'Exécution Cytotoxique � qui prévaudront, ceux qui créent la sélectivité sur la cible de l'attaque cytotoxique. POURSUITE DES INVESTIGATIONS SUR L'UTILSATION DES MARQUEURS SELECTIONNES DANS 490 UNE APPLICATION DANS LES PATHOLOGIES LIEES AU METABOLISME ENERGETIQUE ET VIEILLISSEMENT: L'identification de ces marqueurs vise certainement aussi à une meilleure compréhension du cancer, dont on découvre qu'un domaine fondamental d'étude, celui de la perte de polarité des cellules cancéreuses (83-84), est 495 intimement lié au métabolisme énérgétique (77-82), mais aussi à une meilleure compréhension des pathologies liées au métabolisme énergétique (diabète, obésité, etc), car sur fond de stress oxydatif et d'espèces moléculaires résultant le provoquant ou en résultant (ROS, RONS), le métabolisme du glucose, celui du stress oxydatif, celui de l'oxygène et celui du stress hypoxique s'interpénètrent étroitement, ainsi qu'il est dit en début de document. Les retombées existent aussi dans l'approfondissement des connaissances liées au vieillissement, un processus en 500 grande partie sous la dépendance du métabolisme énergétique. L'implication très variée de SIRT-1 dans ces domaines en est un bon exemple (85): cette protéine est impliquée dans la polarité cellulaire et la division asymétrique, l'activité de la télomérase et le métabolisme énergétique. AVANTAGES PREVISIBLES DU MODELE ORIGINAL PROPOSE DANS L'INVENTION 505 * Utilisation d'un nouveau modèle original: la cellule cancéreuse non-apoptotique en respiration mitochondriale. * Découverte potentielle DE NOVO de marqueurs de cellules souches cancéreuses et de cellules cancéreuses, et sans doute par ricochet de cellules souches. * Démarche spécifique DE NOVO dans le domaine des cellules souches cancéreuses dont la fiabilité tient au fait 510 qu'elle est strictement circonscrite au domaine du métabolisme énergétique ( par conséquent non liée directement aux autres démarches existant dans le domaine, avec leurs qualités et leurs défauts) * Démarche ouvrant de nouvelles perspectives dans le domaine des cellules souches du fait de son originalité. * Découverte potentielle de marqueurs de cellules souches cancéreuses DE NOVO sans pour autant avoir isolé préalablement ces cellules au sein de la tumeur. 515 * Découverte potentielle de marqueurs de surface ciblés par les lymphocytes Natural Killer NK et par les lymphocytes Gamma Delta. * Investigation possible en Immunologie des mécanismes moléculaires sous-tendant l'expression de cibles, et des conditions de micro-environnement de l'Immunité Naturelle. * Meilleure connaissance du métabolisme énergétique du cancer qui est lié à un des aspects les plus 520 fondamentaux de la carcinogénèse, à savoir la perte de polarité de cellules cancéreuses. • Investigation possible des mécanismes du métabolisme énergétique et des pathologies afférentes. • Investigation possible des mécanismes moléculaires liés au au vieillissement. AVANTAGES PREVISIBLES DE LA METHODE PROPOSEE DANS L'INVENTION 525 Méthode non interférente avec les méthodes du domaine du fait qu'elle s'appuie sur un modèle original. * Méthode dirigée aujourd'hui vers la découverte de marqueurs de surface Méthode utilisant des outils de routine dèjà utilisés et même banalisés dans d'autres domaines, comme les systèmes d'expressions protéomiques différentiels. • Méthode pouvant être étendue à d'autres marqueurs que les marqueurs de surface en diversifiant les 530 extractions sur les prélèvements de cellules pour les expressions différentielles. FORCE DE L'INVENTION (MODELE ET METHODE) : Exploitation synthétique de données multi-disciplinaires (cancer, embryogénèse, cellules souches, métabolisme 535 énergétique, immunologie, etc) dont la très grande majorité sont très largement vérifiées par l'expérience sur des méthodes éprouvées de Protéomique. L'invention représente un projet de cancérologie avec une méthodologie voisine de celles appliquées en Métaprotéomique. En effet, en considérant d'une part l'hétérogénéité des tumeurs et l'hétérogénéité des cellules d'une même tumeur, d'autre part qu'il n' y a pas de marqueurs fiables pour distinguer les cellules cancéreuses des cellules souches cancéreuses, l'on est bien obligé de considérer une tumeur comme 540 une population hétérogène dont on connait peu de aractéristiques communes ou spécifiques.Sur le plan d'une comparaison méthodologique avec la Métaprotéomique, le manque d'informations sur les individus (microbes) d'une population microbienne hétérogène (microbiome) dans un environnement donné ressemble fort conceptuellement au manque d'informations qu'on est obligé de constater sur les individus hétérogènes (cellule cancéreuse x, cellule cancéreuse y, cellule souche cancéreuse) d'une tumeur dans un environnement donné. Dans 545 les microbiomes, cette difficulté, rencontrée en Métagénomique, est contournée par la Métaprotéomique en s'intéressant à une fonction d'intérêt. Il est à noter que la puissance de ces expérimentations est encore augmentée lorsqu'on procède aux expérimentations de Métaprotéomique d'Expression Différentielle sur le même microbiome dont on fait varier l'environnement. Dans la méthode de l'invention pour identifier des marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses, il est également utilisé une Protéomique d'Expression 550 Différentielle, en comparant ses modes de production d'ATP. De cette manière qui consiste à la privilégier l'observation d'une fonction choisie judicieusement; la méthodologie de l'invention ressemble à bien des égards à celle appliquée en Métaprotéomique. BIBLIOGRAPHIE: 555 1. Lin H. Cell biology of stem cells: an enigma of asymmetry and self-renewal. J Cell Biol. 2008 Jan 28;180(2):257-60 2. Ezashi T, Das P, Roberts RM. Low 02 tensions and the prevention of differentiation of hES tells. Proc Natl Acad Sci U SA. 2005 Mar 29;102(13):4783-8 560 3. Grayson WL, Zhao F, Izadpanah R, Bunnell B, Ma T. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem tell expansion and plasticity in 3D constructs. J Cell Physiol. 2006 May;207(2):331-9. 4. Lin Q, Lee YJ, Yun Z. Differentiation arrest by hypoxia. J Biol Chem. 2006 Oct 13; 281(41) : 30678-83. 5. D'Ippolito G, Diabira S, Howard GA, Roos BA, Schiller PC. Low oxygen tension inhibits osteogenic differentiation and enhances stemness of human MIAMI cells. Bone. 2006. Sep;39(3):513-22. 565 6. Jang YY, Sharkis SJ. A low level of reactive oxygen species selects for primitive hematopoietic stem tells that may reside in the low-oxygenic niche. Blood. 2007 Oct 15;110(8):3056-63 7. Parmar K, Mauch P, Vergilio JA, Sackstein R, Down JD. Distribution of hematopoietic stem tells in the bone marrow according to regional hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 27; 104(13):5431-6. 8. Zhang J, Li L. Stem cell niche - Microenvironment and beyond. J Biol Chem. 2008 Feb 13 570 9. Sorensen BS, Alsner J, Overgaard J, Horsman MR. Hypoxia induced expression of endogenous markers in vitro is highly influenced by pH. Radiother Oncol. 2007 Jun;83(3):362-6. 10. Tang C, Ang BT, Pervaiz S. FASEB J. 2007 Dec;21(14):3777-85. Cancer stem cell: target for anti-cancer therapy. l 1. Coffman JA, Denegre JM. Mitochondria, redox signaling and axis specification in metazoan embryos. Dev 575 Biol. 2007 Aug 15;308(2):266-80. 12. Wu M, Neilson A, Swift AL, Moran R, Tamagnine J, Parslow D, Armistead S, Lemire K, Orrell J, Teich J, Chomicz S, Ferrick DA. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2007 Jan;292(l):C 1 25-36. 580 13. Zhou S, Kachhap S, Sun W, Wu G, Chuang A, Poeta L, Grumbine L, Mithani SK, Chatterjee A, Koch W, Westra WH, Maitra A, Glazer C, Carducci M, Sidransky D, McFate T, Verma A, Califano JA. Frequency and phenotypic implications of mitochondrial DNA mutations in human squamous tell cancers of the head and neck. Proc Natl Acad Sci USA. 2007 May 1;104(18):7540-5. 14. Klimova T, Chandel NS. Mitochondrial complex III regulates hypoxic activation of HIF. Cell Death Differ. 585 2008 Jan 25; 15. Archer SL, Gomberg-Maitland M, Maitland ML, Rich S, Garcia JG, Weir EK. Mitochondrial metabolism, redox signaling, and fusion: a mitochondria-ROS-HIF-1 {alpha}-Kvl.5 02-sensing pathway at the intersection of pulmonary hypertension and cancer 16. Koukourakis MI, Giatromanolaki A, Sivridis E, Gatter KC, Harris AL; Tumor and Angiogenesis Research 590 Group. Pyruvate dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase kinase expression in non small cell lung cancer and tumor-associated stroma. Neoplasia. 2005 Jan;7(1):1-6. 17. Seagroves TN, Ryan HE, Lu H, Wouters BG, Knapp M, Thibault P, Laderoute K, Johnson RS. Transcription factor HIF-1 is a necessary mediator of the pasteur effect in mammalian cells. Mol Cell Biot 2001 May;2 I (10):3436-44. 595 18. Roche TE, Hiromasa Y. Pyruvate dehydrogenase kinase regulatory mechanisms and inhibition in treating diabetes, heart ischemia, and cancer. Cell Mol Life Sci. 2007 Apr;64(7-8):830-49. 19. Ma W, Sung HJ, Park JY, Matoba S, Hwang PM. A pivotai rote for p53: balancing aerobic respiration and glycolysis. J Bioenerg Biomembr. 2007 Jun;39(3):243-6. 20. Kim JW, Tchernyshyov I, Semenza GL, Dang CV. HIF-1-mediated expression of pyruvate dehydrogenase 600 kinase: a metabolic switch required for cellular adaptation to hypoxia. Cell Metab. 2006 Mar;3(3):177-85 21. Lu H, Forbes RA, Verma A. Hypoxia-inducible factor 1 activation by aerobic glycolysis implicates the Warburg effect in carcinogenesis.J Biot Chem. 2002 Jun 28;277(26):23111-5. 22. Robey IF, Lien AD, Welsh SJ, Baggett BK, Gillies RJ. Hypoxia-inducible factor-lalpha and the glycolytic phenotype in tumors. Neoplasia. 2005 Apr;7(4):324-30. 605 23. Kroemer G. Mitochondria in cancer. Oncogene. 2006 Aug 7;25(34):4630-2. 24. Godinot C, de Laplanche E, Hervouet E, Simonnet H. Actuality of Warburg's views in our understanding of renal cancer metabolism. J Bioenerg Biomembr. 2007 Jun;39(3):235-41. 25. Brahimi-Horn MC, Chiche J, Pouysségur J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biot. 2007 Apr;19(2):223-9. Epub 2007 Feb 15. 610 26. Kim JW, Gao P, Liu YC, Semenza GL, Dang CV. Hypoxia-inducible factor 1 and dysregulated c-Myc cooperatively induce vascular endothelial growth factor and metabolic switches hexokinase 2 and pyruvate dehydrogenase kinase 1. Mol Cell Biol. 2007 Nov;27(21):7381-93. 27. Simon MC, Keith B. The rote of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Feb 20 615 28. Grayson WL, Zhao F, Bunnell B, Ma T. Hypoxia enhances proliferation and tissue formation of human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Jul 6;358(3):948-53. 29. Schipani E, Ryan HE, Didrickson S, Kobayashi T, Knight M, Johnson RS. Hypoxia in cartilage: HIF-lalpha is essential for chondrocyte growth arrest and survival. Genes Dev. 2001 Nov 1;15(21):2865-76. 620 30. Olivotto M, Sbarba PD. Environmental restrictions within tumor ecosystems select for a convergent, hypoxiaresistant phenotype of cancer stem cells. Cell Cycle. 2007 Nov 14;7(2) 31. Tavaluc RT, Hart LS, Dicker DT, El-Deiry WS.Effects of low confluency, serum starvation and hypoxia on the side population of cancer cell lines. Cell Cycle. 2007 Oct 15;6(20):2554-62. 32. Rigi A, Ora I, Nilsson H, Lindeheim A, Makino Y, Poellinger L, Axelson H, Pâhlman S. Hypoxia alters gene 625 expression in human neuroblastoma cells toward an immature and neural crest-like phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 May 14; 99(10):7021-6. 33. Keith B, Simon MC. Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell. 2007 May 4;129(3):465-72. Review. 34. Covello KL, Kehler J, Yu H, Gordan JD, Arsham AM, Hu CJ, Labosky PA, Simon MC, Keith B. HIF-lalpha 630 regulates Oct-4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth. Genes Dev. 2006 Mar 1;20(5):557-70 35. Archer SL, Gomberg-Maitland M, Maitland ML, Rich S, Garcia JG, Weir EK. Mitochondrial metabolism, redox signaling, and fusion: a mitochondria-ROS-HIF-1 {alpha}-Kvl.5 02-sensing pathway at the intersection of pulmonary hypertension and cancer. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 Feb;294(2):H570-8. 635 36. Noble M, Smith J, Power J, Mayer-Proschel M. Redox state as a central modulator of precursor cell function. Ann N Y Acad Sci. 2003 Jun;991:251-71. 37. Smith J, Ladi E, Mayer-Proschel M, Noble M. Redox state is a central modulator of the balance between selfrenewal and differentiation in a dividing glial precursor cell. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Aug 9;97(18):10032-7. 640 38. Kaminski A, Ma N, Donndorf P, Lindenblatt N, Feldmeier G, Ong LL, Furlani D, Skrabal CA, Liebold A, Vollmar B, Steinhoff G. Endothelial NOS is required for SDF-lalpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem tells. Lab Invest. 2008 Jan;88(1):58-69. 39. Zhang E, Li X, Zhang S et al. Cell cycle synchronization of embryonic stem tells: Effect of serum deprivation on the differentiation of embryonic bodies in vitro. Biochem Biophys Res Commun 2005;333:1171û1177. 645 40. Sak K, Boeynaems JM, Everaus H . Involvement of P2Y receptors in the differentiation of haematopoietic tells. J Leukoc Biol. 2003 Apr;73(4):442-7. . 41. Lemoli RM, Ferrari D, Fogli M et al. Extracellular nucleotides are potent stimulators of human hematopoietic stem cells in vitro and in vivo. Blood 2004;104:1662ù1670 42. Stier S, Ko Y, Forkert R, Lutz C, Neuhaus T, Grünewald E, Cheng T, Dombkowski D, Calvi LM, Rittling SR, 650 Scadden DT. Osteopontin is a hematopoietic stem cell niche component that negatively regulates stem cell pool size. J Exp Med. 2005 Jun 6;201(11):1781-91. 43. Kang JA, Zhou Y, Weis TL, Liu H, Ulaszek J, Satgurunathan N, Zhou L, van Besien K, Crispino J, Verma A, Low PS, Wickrema A. Osteopontin regulates actin cytoskeleton and contributes to cell proliferation in primary erythroblasts. J Biol Chem. 2008 Jan 3. 655 44. Russell S Richardson, Sandrine Duteil, Claire Wary,3 D Walter Wray, Jan Hoff, Pierre G Carlier. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 2006 March 1; 571(Pt 2): 415û424. 45. O'Riordan TC, Zhdanov AV, Ponomarev GV, Papkovsky DB. Analysis of intracellular oxygen and metabolic responses of mammalian tells by time-resolved fluorometry. Anal Chem. 2007 Dec 15;79(24):9414-9. 660 46. Eiji Takahashi, Keiko Sato, Hiroshi Endoh, Zhe-Long Xu, and Katsuhiko Doi Direct observation of radial intracellular P02 gradients in a single cardiomyocyte of the rats. Vol. 275, Issue 1, H225-H233, July 1998. 47. Challen GA, Little MH. A sicle order of stem tells: the SP phenotype. Stem Cells. 2006 Jan;24(1):3-12. 48. Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC. . Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem tells that are replicating in vivo. J Exp Med. 1996 Apr 1;183(4):1797-806 665 49. Gu S, Chen J, Dobos KM et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a mycobacterium tuberculosis strain. Mol Cell Proteomics 2003;2:1284ù1296. 50. Zhao Y, Zhang W, Kho Y et al. Proteomic analysis of integral plasma membrane proteins. Anal Chem 2004;76:1817û1823. [Medline] 51. Ramalho-Santos M, Yoon S, Matsuzaki Y, Mulligan RC, Melton DA. "Stemness": transcriptional profiling of 670 embryonic and adult stem cells. Science. 2002;298: 597-600. 52. Ivanova NB, Dimos JT, Schaniel C, Hackney JA, Moore KA, Lemischka IR. A stem tell molecular signature. Science. 2002;298: 601-604. 53. Zhong JF, Zhao Y, Sutton S, et al. Gene expression profile of murine long-term reconstituting vs. short-term reconstituting hematopoietic stem tells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102: 2448-2453 675 54. Prudhomme W, Daley GQ, Zandstra P et al. Multivariate proteomic analysis of murine embryonic stem cell self-renewal versus differentiation signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:2900ù2905. 55. Zenzmaier C, Gesslbauer B, Grobuschek N et al. Proteomic profiling of human stem tells derived from umbilical cord blood. Biochem Biophys Res Commun 2005;328:968-972. 56. Zhong JF, Zhao Y, Sutton S, Su A, Zhan Y, Zhu L, Yan C, Gallaher T, Johnston PB, Anderson WF, Cooke 680 MP. Gene expression profile of murine long-term reconstituting vs. short-term reconstituting hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 15;102(7):2448-53. 57. Unwin RD, Smith DL, Blinco D, Wilson CL, Miller CJ, Evans CA, Jaworska E, Baldwin SA, Barnes K, Pierce A, Spooncer E, Whetton AD; Blood. Quantitative proteomics reveals posttranslational control as a regulatory factor in primary hematopoietic stem tells. 2006 Jun 15;107(12):4687-94. 685 58. Baharvand H, Fathi A, van Hoof D, Salekdeh GH. Concise review: trends in stem tell proteomics. Stem Cells. 2007 Aug; 25(8):1888-903. 59. Pan JG, Mak TW. Metabolic targeting as an anticancer strategy: dawn of a new era? Sci STKE. 2007 Apr I0;2007(381):pe14. 60. Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C, Thompson R, Lee CT, Lopaschuk GD, 690 Puttagunta L, Bonnet S, Harry G, Hashimoto K, Porter CJ, Andrade MA, Thebaud B, Michelakis ED. A mitochondria-K+ channe] axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell. 2007 Jan;1 1(1):37- 51.. 61. Archer SL, Gomberg-Maitland M, Maitland ML, Rich S, Garcia JG, Weir EK. Mitochondrial metabolism, redox signaling, and fusion: a mitochondria-ROS-HIF-1 {alpha}-Kvl.5 02-sensing pathway at the intersection of 695 pulmonary hypertension and cancer. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008 Feb;294(2): 62. Champagne E, Martinez LO, Collet X, Barbaras R. Ecto-FIFo ATP synthase/Fl ATPase: metabolic and immunological functions. Curr Opin Lipidol. 2006 Jun;17(3):279-84 63. Das B, Mondragon MO, Sadeghian M, et al. A novel ligand in lymphocyte-mediated cytotoxicity: expression 700 of the beta subunit of H+ transporting ATP synthase on the surface of tumor cell lines. J Exp Med 1994; 180:273ù281 64. Kim BW, Choo HJ, Lee JW, Kim JH, Ko YG. Extracellular ATP is generated by ATP synthase complex in adipocyte lipid rafts. Exp Mol Med. 2004 Oct 31;36(5):476-85. 65. Moser TL, Stack MS, Asplin I, et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial 705 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:2811ù2816. 66. Gupta S, Knowlton AA. Cytosolic heat shock protein 60, hypoxia, and apoptosis. Circulation. 2002 Nov 19;106(21):2727-33 67. Seung NR, Park EJ, Kim CW, Kim KH, Kim KJ, Cho HJ, Park HR. Comparison of expression of heat-shock protein 60, Toll-like receptors 2 and 4, and T-cell receptor gammadelta in plaque and guttate psoriasis. J Cutan 710 Pathol. 2007 Dec;34(12):903-11. 68. Vabulas RM, Wagner H, Schild H. Heat shock proteins as ligands of toll-like receptors. Curr Top Microbiol Immunol. 2002;270:169-84. Review. 69. Ghosh JC, Dohi T, Kang BH, Altieri DC. Hsp6O regulation of tumor cell apoptosis. J Biol Chem. 2008 Feb 22;283(8):5188-94. 715 70. Piselli P, Vendetti S, Vismara D, Cicconi R, Poccia F, Colizzi V, Delpino A. Different expression of CD44, ICAM-1, and HSP60 on primary tumor and metastases of a human pancreatic carcinoma growing in scid mice.Anticancer Res. 2000 Mar-Apr ; 20(2A):825-31 71. Parmar K, Mauch P, Vergilio JA, Sackstein R, Down JD. Distribution of hematopoietic stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia. Proc Nad Acad Sci U S A. 2007 Mar 27;104(13):5431-6. 720 72. Loeffler DA, Juneau PL, Heppner GH. Natural killer-cell activity under conditions reflective of tumor microenvironment Int J Cancer. 1991 Jul 30;48(6):895-9. 73. Cairns, R., Papandreou, 1., & Denko, N. (2006). Overcoming physiologic barriers to cancer treatment by molecularly targeting the tumor microenvironment. Molecular Cancer Research, 4, 61-70. 74. Wykoff, C. C., Beasley, N. J., Watson, P. H., Turner, K. J., Pastorek, J., Sibtain, A., et al. (2000). Hypoxia- 725 inducible expression of tumor-associated carbonic anhydrases. Cancer Research, 60, 7075ù7083. 75. Svastova, E., Hulikova, A., Rafajova, M., Zat'ovicova, M., Gibadulinova, A., Casini, A., et al. (2004). Hypoxia activates the capacity of tumor-associated carbonic anhydrase IX to acidify extracellular pH. FEBS letters, 577, 439-445. 76. Robertson, N., Potier, C., & Harris, A. L. (2004). Rote of carbonic anhydrase IX in human tumor cell growth, 730 survival, and invasion. Cancer Research, 64, 6160ù6165. 77. D.G. Hardie, J.W. Scott, D.A. Pan and E.R. Hudson, Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system, FERS Lett. 546 (2003), pp. 113-120. 78. D. Carling, The AMP-activated protein kinase cascade-a unifying system for energy control, Trends Biochem. Sci. 29 (2004), pp. 18ù24. 735 79. B.B. Kahn, T. Alquier, D. Carling and D.G. Hardie, AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides Glues to modern understanding of metabolism, Cell Metab. 1 (2005), pp. 15ù25. y, 80. J. Boudeau, J.L. Reid, K.J. Mustard, L. Udd, T.P. Makela, D.R. Alessi and D.G. Hardie, Complexes between the LKB1 tumor suppressor, STRADalpha/beta and MO25alpha/beta are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade, J. Biol. 2 (2003), p. 28. 740 81. A. Woods, S.R. Johnstone, K. Dickerson, F.C. Leiper, L.G. Fryer, D. Neumann, U. Schlattner, T. Wallimann, M. Carlson and D. Carling, LKBI is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade, Curr. Biol. 13 (2003), pp. 2004ù2008. 82. R.J. Shaw, M. Kosmatka, N. Bardeesy, R.L. Hurley, L.A. Witters, R.A. DePinho and L.C. Cantley, The tumor suppressor LKB 1 kinase directly activates AMP-activated kinase and regulates apoptosis in response to energy 745 stress, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004), pp. 3329ù3335 . 83. Clevers H. Stem cells, asymmetric division and cancer. Nat Genet. 2005 Oct;37(10):1027-8. 84. Caussinus E, Gonzalez C. Induction of tumor growth by altered stem-cell asymmetric division in Drosophila melanogaster. Nat Genet. 2005 Oct;37(10):1125-9. 85. Narala SR, Allsopp RC, Wells TB, Zhang G, Prasad P, Coussens MJ, Rossi DJ, Weissman IL, Vaziri H. 750 SIRTI Acts as a Nutrient-sensitive Growth Suppressor and Its Loss Is Associated with Increased AMPK and Telomerase Activity. Mol Biol Cell. 2008 Mar;19(3):1210-9. 86. Pedersen PL. Warburg, me and Hexokinase 2: Multiple discoveries of key molecular events underlying one of cancers' most common phenotypes, the "Warburg Effect", i.e., elevated glycolysis in the presence of oxygen. J Bioenerg Biomembr. 2007 Jun ;39(3):21 1-22. 755 87. Stem Cells. 2008 Dec;26(12):3037-46. Quantitative mass spectrometry identifies drug targets in cancer stem cell-containing side population. Steiniger SC, Coppinger JA, Krüger JA, Yates J 3rd, Janda KD. 88. Trends Biochem Sci. 2008 Aug;33(8):359-62. New roles for pyruvate kinase M2: working out the Warburg effect. Ferguson EC, Rathmell JC. 89. Nature. 2008 Mar 13;452(7184):230-3. The M2 splice isoform of pyruvate kinase is important for cancer 760 metabolism and tumour growth. Christofk HR, Vander Heiden MG, Harris MH, Ramanathan A, Gerszten RE, Wei R, Fleming MD, Schreiber SL, Cantley LC. 90. FantinVR, St-Pierre J, Leder P . Attenuation of LDH-A expression uncovers a link between between glycolysis, mitochondrial physiology, and tumor maintenance. Cancer Cell. 2006 Jun;9(6):425-34; 91.L6pez A, Garcia JA, Escames G, Venegas C, Ortiz F, L6pez LC, Acufia-Castroviejo D. Melatonin protects the 765 mitochondria from oxidative damage reducing oxygen consumption, membrane potential, and superoxide anion production. J Pineal Res. 2008 Nov 19. 92. McFate T, Verma A et al. Pyruvate dehydrogenase complex activity controls metabolic and malignant phenotype in cancer cells. McFate T, Verma A et al. J Biol Chem. 2008 Aug 15;283(33):22700-8. 770 775 780 785 790 795 800 805 REVENDICATIONS: 1) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et 810 de cellules souches cancéreuses mettant à profit l'effet Warburg, caractérisée en ce qu'elle est basée sur une expression différentielle protéomique ou glycoprotéomique comparant d'une part l'expression protéomique ou glyco-protéomique (1) des extraits totaux ou partiels de protéines ou de glycoprotéines de membranes plasmiques des cellules d'une tumeur ou d'une lignée de cellules 815 cancéreuses à pH légèrement acide et en normoxie ou en hypoxie, dont on sait que, comme toute tumeur ou toute lignée de cellules cancéreuses, elle n'a pas accès à la respiration mitochondriale, mais seulement à la glycolyse dite � glycolyse aérobie � et ce quelles que soit les conditions de pressions d'oxygène, et d'autre part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire (2) des extraits totaux ou partiels de 820 protéines ou de glycoprotéines de membranes plasmiques des cellules de la même tumeur ou de la même lignée de cellules cancéreuses à pH légèrement acide, en normoxie, et soumise à une action chimique ou biochimique ou biologique leur ouvrant l'accès à la respiration mitochondriale, les marqueurs de surface exprimés différentiellement par les cellules de la tumeur ou de la lignée de 825 cellules cancéreuses non soumises à une action chimique ou biochimique ou biologique leur ouvrant l'accès à la respiration mitochondriale représentant un ensemble (3) de marqueurs de surface des cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses en glycolyse � aérobie �, avec interférence possible avec des marqueurs de surfaces de cellules normales, 830 ledit ensemble (3) pouvant être restreint par un deuxième ensemble (6) détecté par une deuxième expression différentielle comparant d'une part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire (4) des extraits totaux ou partiels de protéines ou de glycoprotéines de membranes plasmiques des cellules d'un tissu normal à pH neutre en 835 hypoxie, dont on sait qu'elles sont en glycolyse anaérobie et d'autre part l'expression protéomique ou glyco-protéomique membranaire (5) des extraits totaux ou partiels de protéines ou de glycoprotéines de membranes plasmiques des cellules du même tissu normal à pH neutre en normoxie, dont on qu'elle sont en respiration mitochondriale, 840 les marqueurs de surface exprimés différentiellement par les cellules normales en hypoxie à pH neutre représentant l'ensemble (6) de marqueurs de surface de cellules normales à pH neutre en glycolyse anaérobie dont peuvent faire éventuellement partie tout ou partie des marqueurs de surface de cellules souches normales (en glycolyse anaérobie), la restriction de l'ensemble (3) par l'ensemble (6) représentant l'ensemble (7) des marqueurs de surface spécifiques de celules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses en � glycolyse aérobie � sans interférence avec des marqueurs de cellules normales en glycolyse anaérobie dont peuvent faire éventuellement partie les marqueurs de surface de cellules souches normales 850 2) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce que lun moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peuvent être l'action d'une molécule 855 chimique comme l'acide dichloroa-acétique (DCA) assistée par l'action de la mélatonine 3) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut être l'action d'un 860 LDH-A sh RNA (petit ARN en épingle à cheveux inhibiteur de la lactate dehydrogénase A) 845 4) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un moyen employé pour ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut être la surexpression de la 865 PK1 (isoforme 1 de la pyruvate kinase), ou l'action d'un PK2 sh RNA (petit ARN en épingle à cheveux inhibiteur de la pyruvate kinase 2) 5) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'un moyen employé pour 870 ouvrir aux cellules cancéreuses l'accès à la respiration mitochondriale peut être 1 l'action d'un PDK1 sh RNA (petit ARN en épingle à cheveux inhibiteur de la pyruvate dehydrogenase kinase 1) 6) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est basée des 875 expressions différentielles protéomiques membranaires de surface réduites aux extraits de la composante � radeaux lipidiques � de membranes plasmiques, ou au contraire réduites aux extraits de la composante � non radeaux lipidiques � de membranes plasmiques. 7) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et 880 de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ensemble (3) est déterminé par une expression protéomique différentielle sur une tumeur maligne telle qu'un carcinome, un adénocarcinome ou un sarcome (liposarcome, myosarcome, neurofibrosarcome, etc...) soumise ou non à une molécule chimique ou biochimique ou biologique qui les bascule vers la respiration mitochondriale, tandique ledit ensemble (6) est déterminé par une expression protéomique différentielle sur une tumeur 885 bénigne (adénome, lipome, fibrome, neurinome, etc...) soumise ou non soumise à l'hypoxie. 8) Méthode de détection et d'identification � de novo � de marqueurs de surface de cellules cancéreuses et de cellules souches cancéreuses selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit ensemble (3) est déterminé par une expression protéomique différentielle quantitative avec séparation en deux dimensions 890 des digestions trysiques des extraits totaux ou partiels de protéines ou de glycoprotéines de membranes plasmiques des cellules de l'échantillon puis identification et quantification par la spectrométrie de masse, et en ce que ledit ensemble (6) est déterminé par une expression protéomique ou glycoprotéomique différentielle quantitative similaire. 895