Brevet FR2946878A1 — publié le 20101224

UTILISATION COSMÉTIQUE DU FLORIDOSIDE COMME INHIBITEUR DE LA MÉLANOGENÈSE L'invention concerne essentiellement l'utilisation cosmétique du 5 floridoside ou d'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside comme principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse. Le floridoside est un hétéroside soluble de faible poids moléculaire présent dans de nombreuses algues rouges et qui a été à l'origine isolé à partir des Rhodophycées Palmaria palmata et Mastocarpus stellatus. 10 La structure moléculaire du floridoside a été établie pour la première fois en 1954 par Putman et Hassid (Putman EW. Biochem J. 1954;79:7û12) qui l'ont caractérisé comme un 2-O-glycerol-a-D-galactopyranoside (a-D- galactopyranoside-(1ù2)-glycerol) représenté par la formule suivante : OH OH OH O 15 Le floridoside est un produit majeur de la photosynthèse chez de nombreuses algues rouges, obtenu par condensation de l'UDP-galactose et du glycerol phosphate par l'intermédiaire de la floridoside phosphate synthase. Ainsi, les teneurs en floridoside dans les algues rouges, sont généralement 20 comprises entre 1,5 % et 8% en poids de la matière sèche et peuvent atteindre 22 % chez Catenella nipae (Kirst, 1980 ; Simon-Collin et al., 2002). Chez les algues rouges à l'exception des Cérémiales, le floridoside est considéré comme étant la principale réserve de carbone soluble directement disponible pour les besoins cellulaires (Kirst, Phytochemistry, 19 : 1107- ou 1110 ;1980 ; Simon-Colin C. Carbohydr Res. 2002;337(3):279û80 ; Simon-Colin C.. Carbohydr Res. 2003;338(22):2413û6). En plus du floridoside, certaines algues rouges comme les Bangiales comprennent des formes isomériques du floridoside, à savoir le D-isofloride et le L-isofloride (a-D-galactopyranoside-(1-1)-glycerol) (Meng et al., Carbohydr. Res 161 : 171-180). Actuellement, la fonction principale reconnue du floridoside est celle d'osmorégulateur afin de permettre aux cellules des algues rouges de résister au changement extérieur de salinité. En effet, il a été montré que lors d'un stress hyperosmotique, la teneur intracellulaire en floridoside augmente considérablement afin de rétablir une pression intracellulaire cytoplasmique acceptable. Des compositions cosmétiques basées sur cette fonction du floridoside ont alors été développées. Ainsi, la demande de Brevet Européen EP 1 743 628 décrit des compositions cosmétiques anti-déshydratante comprenant une association de floridoside et d'acide iséthionique. La couleur de la peau provient de plusieurs substances dont notamment les mélanines. Les mélanines permettent de protéger l'épiderme et les couches profondes de la peau des agressions externes, en particulier de l'action des rayons ultraviolets. Les mélanines sont produites par des cellules situées dans la couche la plus profonde de l'épiderme, les mélanocytes. En particulier, la synthèse des mélanines se produit dans les mélanocytes au niveau de vésicules spécialisées, les mélanosomes. Après synthèse des mélanines, les mélanosomes sont transportées le long des dendrites mélanocytaires puis transférées aux kératinocytes environnants permettant ainsi une pigmentation uniforme de l'épiderme. Il existe deux types de mélanines, les phaeomélanines rouges ou jaunes et les eumélanines qui sont brunes ou noires. Leur biosynthèse est commune jusqu'à la dopaquinone. Les ultraviolets de type A et B (UVA et surtout UVB) atteignent les 5 mélanocytes situés dans la couche basale de l'épiderme et provoquent des altérations cellulaires qui seraient des activateurs de la production de mélanines. Les kératinocytes, cellules de l'épiderme participent aussi à cette mélanogénèse en fabriquant des substances régulant cette production de mélanines, telles que l'a-MSH, l'endothéline, la prostaglandine E2 (PGE2). 10 Ainsi, une diminution de l'endothéline par les kératinocytes ou une diminution de la fixation de l'endothéline sur son récepteur mélanocytaire provoque une inhibition de la production de mélanine (G Imokawa et al., Biochem J. 1996 February 15; 314: 305-312). En outre, la pigmentation cutanée dépend du nombre de mélanocytes 15 matures qui est régulée par des facteurs de croissance tels que les endothélines ainsi que par le MITF (� Microphtalmia-Associated Transcription Factor �) qui contrôle la différenciation, la croissance et la survie des mélanocytes. Le MITF contrôle la différenciation mélanocytaire en régulant l'expression d'enzymes impliquées dans la synthèse de mélanines, à savoir la Tyrosinase et les protéines 20 TRP-1 et TRP-2 (� Tyrosinase related protein 1 et 2 �) (Corine Bertolotto et al,. Mol Cell Biol, February 1998, 18, 2: 694-702). La synthèse de mélanines est également contrôlée par d'autres protéines telles que les protéines P, MATP et Silver (PMEL 17). Ainsi, la protéine Silver permet l'organisation de la mélanine en stries longitudinales dans les 25 mélanosomes (Jinyan Du et al. American Journal of Pathology. 2003;163:333-343). Dans la partie périphérique des mélanocytes, les mélanosomes, après synthèse de mélanines sont transportés via le réseau d'actine par l'intermédiaire d'un complexe composé de Rab 27, la mélanophiline (MLPH) et la myosine VA. Ce complexe permet l'accumulation des mélanosomes au bout des dendrites, facilitant ainsi le transfert aux kératinocytes (Molly Strom et al., J. Biol. Chem., 2002, July 12, 277, 28 : 25423-25430). Depuis plusieurs années, on constate un intérêt croissant pour les produits présentant une activité inhibitrice sur la mélanogénèse aussi bien dans le domaine de la cosmétique que de la médecine. En effet, la mélanine peut former des taches de pigmentation qui peuvent notamment être des taches de vieillesse, des taches solaires, des taches liées à une phototoxicité, des taches liées à des chloasmas ou encore des taches liées à certaines pathologies. Ainsi, l'utilisation d'inhibiteurs de la synthèse de mélanines est particulièrement intéressante en cosmétologie, non seulement pour des applications où une véritable dépigmentation est recherchée comme dans le cas du blanchiment de peau fortement pigmentée ou l'inhibition de l'hyperpigmentation dans certains aspects inesthétiques par exemple, mais également pour des applications visant à éclaircir le teint, à donner de la luminosité, de l'éclat à la peau. Cette inhibition de la synthèse de mélanine peut être aussi particulièrement 20 intéressante dans le cadre de la prévention ou du traitement de pathologies ou de troubles liés à la mélanogenèse. En effet, toutes les mélanines ne sont pas protectrices et il existe une forme particulière de mélanine, appelée phaeomélanine qui est extrêmement phototoxique. En effet, la phaeomélanine provoque sous l'action des ultraviolets 25 de type B (UVB), la formation de radicaux libres, susceptibles d'induire des mutations dans l'ADN des kératinocytes. Un certain nombre de substances ont montré une activité inhibitrice sur la mélanogenèse, en particulier via une action inhibitrice de la tyrosinase, mais certaines d'entre elles ne peuvent être utilisées ni en cosmétique ni au niveau médical en raison de leur toxicité, de leurs effets secondaires indésirables, tant cutanés que systémiques ou du fait de la lenteur excessive de leur action. À titre d'exemples de telles substances, on peut citer les sels de mercure, le monobenzyléther d'hydroquinone (MBEH), l' isopropylcatéchol, le monométhyléther d'hydroquinone (MMEH), l'hydroquinone et les dermocorticoïdes. Il existe donc encore aujourd'hui un besoin de disposer de produit permettant d'inhiber efficacement la mélanogenèse tout en étant dépourvu d'effets 10 secondaires indésirables. À la suite d'importantes recherches, les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante qu'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside, et en particulier le floridoside permettent d'inhiber efficacement la mélanogenèse. Les inventeurs ont notamment montré qu'un extrait d'algue rouge 15 contenant du floridoside permet d'inhiber efficacement l'expression de plusieurs protéines impliquées dans différents niveaux de régulation de la mélanogenèse, à savoir l'endothéline, le récepteur de l'endothéline de type B, la protéine TRP-2, mais également la myosine VA qui intervient dans le transport des mélanosomes contenant les mélanines vers les kératinocytes. 20 Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet l'utilisation cosmétique du floridoside ou d'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside, en tant que principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse dans une composition cosmétique. L'invention a également pour objet une composition cosmétique ou 25 pharmaceutique, notamment dermatologique, inhibitrice de la mélanogenèse comprenant un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable et à titre de principe actif inhibant la mélanogenèse, du floridoside et/ou un extrait d'algue rouge contenant du floridoside. On entend par �floridoside � au sens de la présente invention, le composé 2-O-glycerol-a-D-galactopyranoside (a-D-galactopyranoside-(1ù 2)-glycerol), ainsi que ses dérivés et analogues ayant la capacité d'inhiber la mélanogenèse. Le floridoside peut être naturel, notamment issu d'algue rouge, ou encore synthétique. Le floridoside peut être obtenu à partir d'algue rouge selon des techniques classiques bien connues de l'Homme du métier telles que décrites dans les publications de Meng J. and Srivastava L. M. (Journal of phycology, 1990, vol. 26, n°4, pp. 683-688) et de Courtois A., et al. (Mar Drugs. 2008 September; 6(3): 407-417), par exemple par extraction suivie d'une purification. Les algues rouges contenant du floridoside peuvent être identifiées par l'Homme du métier par des techniques classiques telles que par chromatographie sur couche mince. Avantageusement, l'algue rouge peut appartenir à la famille des 15 Dumontiacées, en particulier au genre Dilsea, et tout particulièrement à l'espèce Dilsea carnosa. L'extrait de Dilsea carnosa présente l'avantage non seulement d'avoir une activité inhibitrice de la mélanogenèse mais également d'avoir une forte activité anti-oxydante permettant de lutter notamment contre les espèces réactives de 20 l'oxygène tout en étant dépourvu de toxicité vis-à-vis notamment des kératinocytes et des fibroblastes humains. Les espèces réactives à l'oxygène sont produites d'une manière accrue lorsque la régulation du métabolisme de l'oxygène est perturbée (stress oxydants). Ces espèces sont responsables, d'une manière directe ou indirecte, de nombreux 25 dommages oxydatifs au niveau moléculaire (acides nucléiques, protéines, lipides ...) pouvant affecter considérablement les mécanismes cellulaires et ainsi favoriser le développement de nombreuses pathologies telles que l'athérosclérose, le diabète, les maladies neurodégénératives mais également les processus de vieillissement. Les extraits d'algue rouge contenant du floridoside peuvent être obtenues par toute techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que par au moins une étape d'extraction choisie dans le groupe comprenant l'extraction aux solvants, l'extraction phase-solide, l'extraction au CO2 supercritique et une combinaison de celles-ci, de préférence l'extraction aux solvants et tout préférentiellement l'extraction aqueuse. Parmi les solvants utilisables dans l'étape d'extraction selon l'invention, 10 on peut citer l'eau, le méthanol, l'acétonitrite, l'acétone, l'acétate d'éthyle, de préférence l'eau. L'extraction aqueuse présente l'avantage d'être peu coûteuse et peu polluante. À titre d'exemples de phases-solides utilisables dans l'étape d'extraction 15 selon l'invention, on peut citer l'amberlite, la polyvinylpyrrolidone, la polyvinylpolypyrrolidone. Il est possible de procéder à plusieurs extractions successives jusqu'à épuisement de la matière à extraire par le solvant considéré. La durée d'extraction varie en fonction du solvant considéré, la 20 température et éventuellement de la pression utilisée, pour aboutir à l'épuisement total d'extraction de la matière. En pratique, cette durée sera limitée à moins de deux heures pour une exploitation industrielle rentable. Préalablement à l'étape d'extraction, ladite algue peut être broyée, coupée ou écrasée. 25 Avantageusement l'extrait d'algue rouge contenant du floridoside peut être concentré, par exemple par osmose inverse. La teneur en matière sèche dans l'extrait d'algue rouge selon l'invention peut être en particulier de 0,5 % à 20 % en poids, et tout particulièrement de 1 à 10 % en poids, par rapport au poids total de l'extrait. On entend par � matière sèche � au sens de la présente invention, la matière qui subsiste après dessiccation totale de l'extrait, mise en oeuvre par exemple dans une étuve. L'extrait d'algue rouge contenant du floridoside selon l'invention peut comprendre de 0,1 à 50%, en particulier de 0,5 à 20 % et tout particulièrement de 1 à 15 % en poids de floridoside par rapport au poids total de la matière sèche de l'extrait. Selon un mode de réalisation particulier, la teneur en extrait d'algue rouge contenant du floridoside dans la composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention est comprise entre 0,01 à 20 % en poids et plus particulièrement entre 0,1 à 10 % en poids et encore plus particulièrement entre 0,5 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. Selon un mode de réalisation particulier, la teneur en floridoside dans la composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention est comprise entre 0,0001 à 10 % en poids et plus particulièrement entre 0,0001 à 1 % en poids et encore plus particulièrement entre 0,001 à 0,01 % en poids par rapport au poids total de la composition. En particulier, le floridoside et l'extrait d'algue rouge contenant du floridoside sont utilisés en tant que principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse notamment induite par les rayons ultraviolets. En particulier, la composition cosmétique selon l'invention est destinée à : (i) améliorer l'uniformité et la clarté de la peau ; et/ou (ii) blanchir la peau ; et/ou (iii) dépigmenter la peau et/ou les poils et/ou les cheveux ; et/ou (iv) prévenir et/ou réduire et/ou supprimer les taches de pigmentation. Les taches de pigmentation peuvent être des taches de vieillesse (lentigo sénile) ou des taches solaires (apparues après une exposition prolongée au soleil) ou des taches liées à une phototoxicité ou des taches liées à des chloasmas (mélasma). Avantageusement, la composition cosmétique ou pharmaceutique selon l'invention peut comprendre en outre au moins un autre principe actif inhibant la mélanogenèse, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps. Ledit autre principe actif inhibant la mélanogenèse peut être un inhibiteur de la tyrosinase de type suppressif ou non suppressif. Les inhibiteurs de la tyrosinase de type suppressif comprennent : û les inhibiteurs de synthèse ou exogènes, tels que l'acide kojique et l'acide ascorbique ; û les inhibiteurs dits naturels ou endogènes, provenant du métabolisme cellulaire lui-même et ayant une action de rétrocontrôle sur la pigmentation, comme les facteurs indoliques bloquant la mélanogenèse. Les inhibiteurs de la tyrosinase de type non suppressif se divisent eux-mêmes en trois catégories : û les inhibiteurs ribosomiaux, tels que les extraits placentaires ou la bioméine ; û les inhibiteurs du transfert de la tyrosinase sur les prémélanosomes par interruption de la glycosylation tels que la tunicamycine et glucosamine ; û les inhibiteurs cytotoxiques, dont l'hydroquinone et ses dérivés et 25 l'acide azélaïque. En particulier, ledit autre principe actif inhibant la mélanogenèse peut être choisi dans le groupe comprenant l'acide rétinoïque, l'acide azélaïque, l'acide kojique, le N-acétyl-4S-cystéaminyl phénol (N acétyl 4S-CAP), la glabridine, le trioxopimélate de diéthyle, l'acide thioctique, la vitamine C, la vitamine E, les alpha-hydroxyacides, un extrait de Morus alba, un extrait de Théa sinensis, un extrait de Chamomilla recutica et un extrait de Ascophylum nodosum. Le thé vert (Théa sinensis) est connu pour ses propriétés d'inhibition du transport des mélanocytes matures vers les kératinocytes. Il s'agit également d'un inhibiteur de la tyrosinase. La matricia (Chamomilla recutica) tout comme l'Ascophylum nodosum sont des antagonistes de l'endothéline qui inhibe la mélanogenèse induite par les rayons ultraviolets. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre le floridoside et/ou ledit extrait d'algue rouge selon l'invention et ledit au moins un autre principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse dans un rapport molaire � floridoside et/ou ledit extrait d'algue rouge selon l'invention � / � ledit au moins un autre principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse � allant de 10/1 à 1/10. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un filtre solaire organique ou minéral. À titre d'exemples de filtre solaire organique, on peut citer l'éthylhexyl methoxycinnamate, l'octocrylène, les salicylates, la benzophenone, le butyl 20 methoxybenzoylmethane. À titre d'exemples de filtre solaire minéral, on peut citer l'oxyde de zinc et l'oxyde de titane. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous différentes formes, notamment sous une forme choisie dans le groupe comprenant les 25 solutions, les émulsions, les crèmes, les pommades, les laits, les lotions et les gels. Ces différentes formes peuvent être obtenues par des techniques bien connues de l'Homme du Métier. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être administrées par différentes voies compatibles avec le traitement recherché, de préférence de manière topique. On entend par � véhicule cosmétiquement acceptable � au sens de la 5 présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans une composition cosmétique. À titre d'exemples de véhicule cosmétiquement acceptable, on peut citer la glycérine, la gomme xanthane, les polymères issus d'algues (agar, carraghénane, alginate), les silicones, le caprylic / capric triglyceride et les huiles de plantes telle 10 que des plantes du genre Macadamia. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre une teneur en support cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable allant de 5 à 99 %, notamment de 10 à 90 %, et tout particulièrement de 20 à 75 % en poids par rapport au poids total de la composition. 15 On entend par � support pharmaceutiquement acceptable � au sens de la présente invention, toute matière qui est appropriée à une utilisation dans une composition pharmaceutique. À titre d'exemples de support pharmaceutiquement acceptable, on peut citer le lactose, l'amidon éventuellement modifié, la cellulose, l'hydroxypropyl 20 cellulose, l'hydroxypropylmethyl cellulose, le sorbitol, le xylitol, le dextrose, le sulfate de calcium, le phosphate de calcium, le lactate de calcium, les dextrases, l'inositol, le carbonate de calcium, la glycine, la bentonite, la polyvinylpyrrolidone et leurs mélanges. De façon connue, les compositions cosmétiques et pharmaceutiques, 25 notamment dermatologiques selon l'invention peuvent contenir également les adjuvants habituels dans les domaines cométiques et pharmaceutiques, tels que des gélifiants hydrophiles ou lipophiles, des actifs hydrophiles ou lipophiles, des conservateurs, des solvants, des parfums, des fibres, des charges, des pigments, des absorbeurs d'odeur et des matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 à 50 % du poids total de la composition. La présente invention a également pour objet le floridoside ou un extrait d'algue rouge contenant du floridoside pour son utilisation comme médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies et/ou de troubles liés à la mélanogenèse, notamment la mélanogenèse induite pas les rayons ultraviolets. En particulier, lesdites pathologies sont choisies dans le groupe comprenant les hypermélanocytoses, les hypermélaninoses. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet une méthode de traitement cosmétique pour : (i) améliorer l'uniformité et la clarté de la peau ; et/ou (ii) blanchir la peau ; et/ou (iii) dépigmenter la peau et/ou les poils et/ou les cheveux ; et/ou (iv) prévenir et/ou réduire et/ou supprimer les taches de pigmentation ; comprenant une étape d'application sur les zones concernées par voie topique du floridoside ou d'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside ou d'une composition cosmétique selon l'invention. L'invention concerne également un agent inhibiteur de la mélanogenèse comprenant du floridoside et/ou un extrait d'algue rouge contenant du floridoside. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et non limitatif. La figure 1 illustre l'effet du floridoside sur la synthèse de mélanine intracellulaire et sécrétée par des mélanocytes en présence d'a-MSH. La figure 2 illustre l'effet du floridoside sur la synthèse de mélanine totale par des mélanocytes en présence d'a-MSH. La figure 3 illustre l'effet d'un extrait concentré de Dilsea carnosa à 5 % sur la synthèse de mélanine par des mélanocytes. La figure 4 illustre l'effet d'un extrait concentré de Dilsea carnosa à 5 % sur la synthèse de mélanine par des mélanocytes en présence de NDP-MSH. La figure 5 illustre l'effet d'un extrait concentré de Dilsea carnosa à 1 % et à 2 % sur la synthèse de mélanine intracellulaire et sécrétée par des mélanocytes en présence d'a-MSH. La figure 6 illustre l'effet d'un extrait concentré de Dilsea carnosa à 1 % et à 2 % sur la synthèse de mélanine totale par des mélanocytes en présence d'a-MSH. La figure 7 illustre l'inhibition de la synthèse de mélanine par l'effet d'un extrait concentré de Dilsea carnosa à 1 %, à 2 % et à 5 %par des mélanocytes en 15 présence d'a-MSH La figure 8 montre l'expression des gènes de la tyrosinase TRP2 (figure 8A), du récepteur à l'endothéline de type B (figure 8B) et de la myosine (figure 8C) dans des mélanocytes humains non traités ou traités avec un extrait concentré de Dilsea carnosa à 1%. 20 La figure 9 montre l'expression de l'endothéline dans des kératinocytes humains non irradiés, irradiés aux ultraviolets et non traités ou encore irradiés aux ultraviolets et traités avec un extrait concentré de Dilsea carnosa à 1%. 1. Exemple I: Mise en évidence de l'activité inhibitrice de la 25 mélanogenèse du floridoside Cette étude a consisté à tester l'effet du floridoside purifié à partir d'une algue rouge sur la synthèse de mélanine intracellulaire et sur la synthèse de mélanine sécrétée, sur une lignée de mélanocytes murins, en présence ou en absence d'une molécule naturelle stimulatrice de la mélanogenèse : l'alpha-MSH. I.1 Matériels et méthodes Une solution de floridoside purifié à partir d'une algue rouge et dont la pureté mesurée par RMN est de 99%, a été testée à une concentration finale de 0,0004% et de 0,0008% (soit 4 et 8 �g/ml) sur une lignée de mélanocytes murin (B16-F1, ECACC, Lot 08A006), utilisée au 23ème passage. L'acide kojique (Sigma K3125), inhibiteur reconnu de la mélanogenèse a également été testé à 200 �g/ml. Les mélanocytes de la lignée B16-F1 ont été ensemencés en plaques 96 puits. Des plaques additionnelles ont été ensemencées afin d'évaluer la viabilité cellulaire en fin d'expérience (Test standard au MTT). 24 heures après ensemencement, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture supplémenté (ou non) avec 100 nM d'a-MSH (mélanocortine, molécule naturelle connue pour stimuler la mélanogenèse) et contenant ou non (témoin, colonne � non traité �) le composé à tester. Chaque condition a été réalisée 5 fois. Les cellules ont été incubées pendant 72 heures à 37°C, 5 % CO2. À la fin de l'incubation de 72 heures, la quantité de mélanine totale (sécrétée + intracellulaire) a été évaluée par mesure de l'absorbance à 405 nm de chaque échantillon contre une gamme de mélanine standard (gamme de concentration de 0,78 à 100 �g/ml de mélanine, Sigma M8631). La mesure de la viabilité cellulaire a été effectuée à l'aide du sel de tétrazolium. En effet, la transformation du sel de tétrazolium (MTT : 3-(4,5- diméthyl thiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) en cristaux bleus de formazan, solubles dans l'isopropanol acide, est proportionnelle à l'activité de la succinate déshydrogénase (une enzyme mitochondriale), elle-même proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Les cellules ont été incubées en présence de MTT puis ont été dissociées et les cristaux de formazan ont été solubilisés. La densité optique (DO) à 540 nm, représentative du nombre de cellules vivantes, a été mesurée sur un lecteur de plaques (SoftMax, Molecular Devices). Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel� et les calculs des CI50 ont été traités sous le logiciel PRISM�. Les comparaisons intergroupes ont été réalisés à l'aide du test de Student. Le pourcentage d'inhibition de la synthèse de mélanine est calculé grâce à la formule ci-dessous : Inhibition (%)=100 X (Moyenne Témoin Stimulé ù Valeur)/ (Moyenne Témoin Stimulé ù Moyenne Témoin Basal) I.2 Résultats Les résultats de cette étude en présence d'alpha-MSH sont illustrés sur les figures 1 et 2. Comme le montre, la figure 1, en présence d'alpha-MSH, le floridoside a un effet inhibiteur aussi bien sur la synthèse de la mélanine intracellulaire que sur 20 la synthèse de la mélanine sécrétée. En outre, comme le montre les figures 1 et 2, le floridoside est un puissant inhibiteur de la mélanogenèse. En effet, l'effet inhibiteur de la mélanogenèse est manifeste pour une concentration de floridoside de seulement 4 �g/ml. En outre, une concentration faible de floridoside (8 .ig/ml) permet 25 d'obtenir une inhibition de la synthèse de la mélanine sécrétée de 29 % tandis que d'autres inhibiteurs nécessitent des concentrations beaucoup plus élevées pour obtenir un effet similaire, à savoir par exemple de 200 �g/ml pour l'acide kojique. II. Exemple II: Mise en évidence de l'activité inhibitrice de la mélanogenèse d'un extrait de Dilsea carnosa à 5 % Cette étude a consisté à tester l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa à 5 % sur la synthèse de mélanine sur une lignée de mélanocytes murins, en présence ou 5 en absence d'une molécule stimulatrice de la mélanogenèse : le NDP-MSH. II.1 Matériels et méthodes Le NDP-MSH est un dérivé stable de l'alpha-MSH (hormone naturelle de stimulation de la mélanogénèse). La stimulation par le NDP-MSH permet de 10 déconnecter la synthèse de mélanine du métabolisme basal du mélanocyte, si bien qu'on peut avoir des inhibitions nettes de synthèse de mélanine à des concentrations éloignées de la cytotoxicité. L'extrait de Dilsea carnosa (échantillon lyophilisé reconstitué, Item d'essai : I07-181, Référence : E07058, Lot : 300307DN, CODIF International) 15 testé avait une teneur en floridoside de 0,41% (soit 4,1 g/L). L'extrait de Dilsea carnosa a été obtenu par lixiviation de 3,7% d'algue séchée dans l'eau pendant 1h30. Après plusieurs clarifications successives, l'extrait est filtré à l'aide d'un filtre de porosité 0,22�m puis concentré par osmose inverse. L'extrait est filtré stérilement. 20 Il a été testé sur des mélanocytes murins (lignée B16-F10, utilisée au 4ème passage). Les mélanocytes de la lignée B16-F10 ont été ensemencés jusqu'à subconfluence, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture supplémenté (ou non) avec le NDP-MSH et contenant ou non (témoin) le composé à tester ou la référence. Chaque condition a été réalisée 3 fois (excepté 25 pour le témoin, 6 fois). Les cellules ont été incubées pendant 72 heures à 37°C, 5%CO2. À la fin de l'incubation de 72 heures, la quantité de mélanine totale (sécrétée + intracellulaire) a été évaluée par mesure de l'absorbance à 405 nm de chaque échantillon contre une gamme de mélanine standard, tel que décrit au point I.1 ci-dessus. La mesure de la viabilité cellulaire a été effectuée telle que décrit au point I.1 ci-dessus. II.2 Résultats Les résultats de cette étude sont illustrés sur la figure 3 (en absence de NDP-MSH) et la figure 4 (en présence de NDP-MSH). Dans les conditions expérimentales de cet essai et en absence de 10 NDP-MSH (condition non stimulée), le concentré de Dilsea carnosa, testé à 5% (soit environ 200�g/ml de floridoside), a inhibé de 16% la synthèse de mélanine par les mélanocytes B16-F10 (figure 3). En parallèle, en absence de NDP-MSH, l'acide kojique testé entre 1,56 et 200 �g/ml a inhibé la synthèse de mélanine (environ 30% d'inhibition) sans effet 15 cytotoxique. Après stimulation par le NDP-MSH, l'effet de l'extrait de Dilsea carnosa est beaucoup plus marqué avec une inhibition nette de 70% de la synthèse de mélanine par les mélanocytes (Figure 4). Les effets ont été observés sans toxicité du composé. 20 Parallèlement, en présence de NDP-MSH, l'acide kojique, testé entre 12,5 et 200 .ig/ml, a inhibé de manière concentration dépendante la synthèse de mélanine par les mélanocytes B16-F10. A plus faible concentration, l'effet n'était plus visible. L'effet a été observé sans effet cytotoxique de l'acide kojique. 25 III. Exemple III : Mise en évidence de l'activité inhibitrice de la mélanogenèse d'un extrait de Dilsea carnosa à 1 % et à 2 %5 Cette étude a consisté à tester l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa à 1 % et à 2 % sur la synthèse de mélanine sur une lignée de mélanocytes murins, en présence ou en absence d'une molécule stimulatrice de la mélanogenèse : l'alpha-MSH III.1 Matériels et méthodes L'extrait de Dilsea carnosa (version sans conservateur, I07-147, Référence : E07050, Lot : 230307DN, CODIF International) testé avait une teneur en floridoside de 0,41%. L'extrait a été obtenu selon le procédé décrit au point II.1, 10 ci-dessus. Il a été testé sur les mélanocytes de lignée B 16-F 1 ; ceux-ci sont plus pigmentés que les B16-F10 (Shioda T et al, 1996) mais une étude comparative, menée par Hill SE. et son équipe, a démontré que les deux lignées augmentaient l'activation de la tyrosinase et la synthèse de mélanine (Hill SE. et al, 1989). 15 Les mélanocytes de la lignée B16-F1 (ECACC, Lot 08A006, utilisée au 35eme passage) ont été ensemencés. 24 heures après ensemencement, le milieu de culture a été remplacé par du milieu de culture supplémenté (ou non) avec 100 nM d'a-MSH et contenant ou non (témoin, colonne �non traité �) le composé à tester. Chaque condition a été réalisée 6 fois. 20 Les cellules ont été incubées pendant 72 heures à 37°C, 5 % CO2. À la fin de l'incubation de 72 heures, la quantité de mélanine totale (sécrétée + intracellulaire) a été évaluée par mesure de l'absorbance à 405 nm de chaque échantillon contre une gamme de mélanine standard, tel que décrit au point I.1 ci-dessus. 25 La mesure de la viabilité cellulaire a été effectuée telle que décrit au point I.1 ci-dessus.5 III.2 Résultats Les résultats de cette étude en présence d'alpha-MSH sont illustrés sur les figures 5 et 6. En présence d'a-MSH, l'extrait de Dilsea carnosa, testé à 1% et 2% (soit environ 40 et 80 .ig/ml de floridoside), a significativement inhibé la synthèse de mélanine intracellulaire et la synthèse de mélanine sécrétée par les mélanocytes B16-F1 (Figure 5). La synthèse totale de mélanine (intracellulaire et sécrétée) diminue également significativement (jusqu'à û 49%) (Figure 6). Dans ces mêmes conditions, l'acide kojique, testé à 200 .ig/ml, a inhibé la 10 synthèse de mélanine par les mélanocytes B16-Fl (environ 55% d'inhibition). L'effet a été observé sans effet cytotoxique de l'acide kojique. Les résultats des expériences décrites dans les exemples II et III sont résumés sur la figure 7. 15 IV. Exemple IV : Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa sur l'inhibition de l'expression de protéines impliquées dans la mélanogenèse et d'une protéine impliquée dans le transport des mélanosomes vers les kératinocvtes Cette étude a consisté à tester l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa sur 20 l'expression de protéines impliquées dans la mélanogenèse, à savoir la protéine TRP-2 et le récepteur à l'endothéline de type B, ainsi que sur l'expression d'une protéine impliquée dans le transport des mélanosomes vers les kératinocytes, à savoir la myosine VA. 25 IV.l Matériels et méthodes Un extrait de Dilsea carnosa (échantillon lyo, I07-114, Référence : MP06176, Lot : 301006DN) a été testé sur des mélanocytes épidermiques 19 humains normaux (NHEM-2 utilisés au hème passage), maintenus en culture à 37°C, 5% CO2 dans les milieux de culture fournis par le fournisseur. Cet extrait de Dilsea carnosa a été obtenu par macération de 3% d'algue dans l'eau pendant 1h30. L'extrait est ensuite clarifié et filtré stérilement avant d'être lyophilisé pour sa conservation. L'extrait lyophilisé a été resolubilisé à 1% dans de l'eau déminéralisée juste avant d'être utilisé pour le test, dans lequel il a été redilué à 1% dans le milieu de culture des cellules. La teneur en floridoside dans cet extrait devrait être de l'ordre de 0,1 % de l'extrait liquide (10% de la matière sèche, soit l g/L). Les mélanocytes épidermiques humains normaux (NHEM) ont été cultivés à confluence, et ont été traitées ou non (témoin) par le produit à l'essai puis cultivées à 37°C et 5% de CO2 pendant 24 heures. L'analyse de l'expression des gènes a été réalisée en utilisant des DNA arrays simplifiés standards, dédiés à la recherche et adaptés au screening. IV.2 Résultats Les résultats de cette étude sont illustrés sur la figure 8. Dans les mélanocytes humains normaux en culture, l'extrait de Dilsea carnosa, testé à 1 % (soit environ 10.ig/ml de floridoside), diminue significativement l'expression : - de la tyrosinase-related protein (TRP 2 ou Dct) : -39% (figure 8A) ; - du récepteur à l'endothéline de type B : -58% (figure 8B) ; et - de la myosine VA : -52% (figure 8C). V. Exemple V : Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa sur l'inhibition de l'expression d'une protéine impliquée dans la mélanogenèse, l'endothéline, dans des kératinocytes humains normaux en culture exposés aux UV-B et UV-A Cette étude a consisté à tester l'effet d'un extrait de Dilsea carnosa sur l'expression d'une protéine impliquée dans la mélanogenèse, l'endothéline, dans des kératinocytes humains normaux en culture exposés aux ultraviolets UV-B et UV-A V.l Matériels et méthodes Un extrait de Dilsea carnosa (échantillon lyo, I07-114, Référence : MP06176, Lot : 301006DN) a été testé sur des kératinocytes épidermiques humains normaux (NCTC 225/40 utilisés au 14ème passage), maintenus en culture à 37°C, 5% CO2 dans les milieux de culture fournis par le fournisseur. Cet extrait a été obtenu selon le protocole décrit au point IV.1. Les kératinocytes humains NCTC225/40 ont été cultivés à confluence, les 15 cellules ont été traitées ou non (témoins) par le produit à l'essai. Après 24 heures de pré-incubation, une série a été irradiée par des UVB (250 mJ/cm2) et des UVA (5,3 J/cm2) et l'autre série a été conservée à l'abri de la lumière (témoins sans UV). À la fin de l'irradiation, le milieu d'irradiation a été remplacé par du milieu d'essai en présence ou non du produit à l'essai. Les 20 cellules ont alors été cultivées à 37°C et 5% de CO2 pendant 24 heures. L'analyse de l'expression des gènes a été réalisée en utilisant des DNA arrays simplifiés standards, dédiés à la recherche et adaptés au screening. IV.2 Résultats 25 Les résultats de cette étude sont illustrés sur la figure 9. Comme le montre la figure 9, l'extrait de Dilsea carnosa diminue significativement l'expression de l'endothéline de -46% dans des kératinocytes humains normaux en culture exposés aux UVB (250 mJ/cm2) et aux UVA (5,3 J/cm2). REVENDICATIONS1. Utilisation cosmétique du floridoside ou d'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside, pour la fabrication d'un principe actif cosmétique 5 inhibant la mélanogenèse dans une composition cosmétique. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'algue rouge appartient au genre Dilsea. 10 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que la composition cosmétique est destinée à : ( ) améliorer l'uniformité et la clarté de la peau ; et/ou (ii) blanchir la peau ; et/ou (iii) dépigmenter la peau et/ou les poils et/ou les cheveux ; et/ou 15 (iv) prévenir et/ou réduire et/ou supprimer les taches de pigmentation. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la composition cosmétique comprend en outre au moins un autre principe actif cosmétique inhibant la mélanogenèse, comme produit de combinaison, pour 20 une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps. 5. Agent inhibiteur de la mélanogenèse comprenant du floridoside et/ou un extrait d'algue rouge contenant du floridoside. 25 6. Composition cosmétique ou pharmaceutique inhibitrice de la mélanogenèse comprenant un véhicule cosmétiquement ou pharmaceutiquementacceptable et à titre de principe actif inhibant la mélanogenèse, du floridoside et/ou un extrait d'algue rouge contenant du floridoside. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce l'algue rouge appartient au genre Dilsea. 8. Composition selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un autre principe actif inhibant la mélanogenèse, comme produit de combinaison, pour une utilisation simultanée, séparée et/ou étalée dans le temps. 9. Floridoside ou extrait d'algue rouge contenant du floridoside pour son utilisation comme médicament pour la prévention et/ou le traitement de pathologies et/ou de troubles liés à la mélanogenèse. 10. Floridoside ou extrait d'algue rouge contenant du floridoside pour son utilisation comme médicament selon la revendication 9, caractérisé en ce que les pathologies sont choisies dans le groupe comprenant les hypermélanocytoses, les hyperrnélaninoses. 11. Méthode de traitement cosmétique pour : (i) améliorer l'uniformité et la clarté de la peau ; et/ou (ii) blanchir la peau ; et/ou (iii) dépigmenter la peau et/ou les poils et/ou les cheveux ; et/ou (iv) prévenir et/ou réduire et/ou supprimer les taches de pigmentation ;comprenant une étape d'application sur les zones concernées par voie topique du floridoside ou d'un extrait d'algue rouge contenant du floridoside ou d'une composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 6 à 8.5