Brevet FR2937550A1 — publié le 20100430

UTILISATION DE LA CITRULLINE POUR LE TRAITEMENT ET LA PREVENTION DU SYNDROME D'ISCHEMIE-REPERFUSION La présente invention a pour objet une nouvelle utilisation de la citrulline. La citrulline (ou acide 2-amino-5-(carbamoyl amino)pentanoïque) est un acide a-aminé et a été isolée pour la première fois à partir du melon d'eau. La citrulline est un acide aminé non essentiel que l'organisme produit à partir d'autres nutriments. Par exemple, la citrulline joue un rôle particulièrement important, avec l'ornithine et l'arginine, dans le cycle de l'urée. Enfin, la citrulline joue un rôle majeur dans l'homéostasie de l'arginine et du monoxyde d'azote. Certaines applications pharmaceutiques de la citrulline ont déjà été décrites. Ainsi, la demande de brevet européen EP 1495755 concerne l'utilisation de la citrulline pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies liées à une insuffisance intestinale. Plus particulièrement, les pathologies mentionnées dans cette demande sont les suivantes : le syndrome du grêle court faisant suite à une résection intestinale, la maladie coeliaque, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, l'insuffisance intestinale liée au vieillissement et l'insuffisance intestinale liée à une irradiation. La demande de brevet européen EP 1755582 décrit notamment l'utilisation de l'association d'au moins une statine, avec la citrulline pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de l'athérosclérose, notamment de l'athérosclérose primaire ou secondaire, de l'hypertension, du diabète, ou des maladies neurodégénératives, notamment la maladie d'Alzheimer. Les lésions hépatiques d'ischémie-reperfusion (I/R) sont un problème de premier plan lors de résections hépatiques, de transplantation ou en situation de choc. Ces lésions résultent de l'activation de processus protéolytiques et pro-inflammatoires initiés pendant l'ischémie et majorés par la reperfusion et conduisent à terme à une altération de la fonction du foie. Actuellement on ne dispose que de peu de moyens thérapeutiques pour prévenir ces lésions tissulaires induites par l'hypoperfusion ou l'interruption de la vascularisation. Deux approches commencent à être utilisées. La première est le préconditionnement ischémique qui fait appel à une ou plusieurs ischémies courtes induisant une protection partielle face à une ischémie longue. Dans le domaine de la chirurgie hépatique, Gurusamy K.S. et al. (Cochrane Database Syst. Rev. (2007), 4, CD006409) suggèrent que cette technique apporte un bénéfice en termes de durée d'hospitalisation mais sans amélioration significative de la fonction hépatique. La seconde approche est le préconditionnement anesthésique où un effet protecteur similaire à celui du préconditionnement ischémique est obtenu par administration préalable d'un anesthésique volatile halogéné tel que le sévoflurane. Il n'y pas à l'heure actuelle de données cliniques concernant cette approche en chirurgie hépatique. Aussi existe-t-il toujours un besoin de trouver des moyens thérapeutiques pour prévenir ces lésions tissulaires induites par l'hypoperfusion ou l'interruption de la vascularisation. La glycine est un acide aminé qui est connu pour exercer des effets protecteurs en situation d'ischémie-reperfusion. Toutefois il s'agit essentiellement d'effets protecteurs pendant la reperfusion après une ischémie froide mis à profit en transplantation (Luntz S. P. et al. (2005) BMC Surg.. 5, 18-25). Par ailleurs plusieurs études expérimentales ont mis en évidence une réduction des altérations hépatiques par l'administration de précurseurs du glutathion tels que la cystéine et ses dérivés, la glycine et la glutamine, d'antioxydants tels que la vitamine E, du monoxyde d `azote (Zhang W. et al. (2007), Transplant Proc., 39, 1332-1337) ou de ses précurseurs comme l'arginine (Cottart C.H. et al. (1999), Hepatology. 29, 809-813). Toutefois ces diverses méthodes sont limitées dans leur utilisation, soit parce que 20 la protection obtenue est insuffisante, soit parce que les produits utilisés sont toxiques. Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir un moyen de prévenir ou de traiter le syndrome d'ischémie-reperfusion. La présente invention concerne l'utilisation de la L-citrulline de formule (I) suivante : NH, O 25 OH (I) ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable pour la prévention et le 30 traitement du syndrome d'ischémie-reperfusion dans un tissu choisi dans le groupe comprenant le foie, le cerveau, l'intestin, le rein et le poumon. Au titre de la présente invention, on désigne notamment par "sel pharmaceutiquement acceptable" des sels de citrulline tels que le malate de citrulline, l'a-cétoglutarate de citrulline, le citrate de citrulline ou l'a-cétoisocaproate de citrulline. Au sens de la présente invention on entend par syndrome d'ischémie-reperfusion, toute altération du fonctionnement d'un organe résultant d'un arrêt ou d'un ralentissement de la circulation sanguine, à l'origine d'une anoxie locale, suivi d'un rétablissement de cette celle-ci. Au sens de la présente invention on entend par L-citrulline le produit disponible dans le commerce, notamment fourni par Sigma ou le produit naturel issu de végétaux, notamment de la pastèque ou melon d'eau (Citrullus lanatus) sous forme notamment de jus, de pulpe ou d'extrait. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le tissu est issu d'un mammifère humain ou non humain. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le syndrome d'ischémie-reperfusion est lié à une ischémie chaude. On entend par ischémie chaude, la période pendant laquelle un tissu ou un organe demeure à la température physiologique pendant la diminution de la perfusion sanguine ou en l'absence d'apport sanguin. Pendant les transplantations d'organes, cette période commence quand l'organe atteint la température physiologique avant la fin de l'anastomose chirurgicale et se termine au moment du rétablissement de la circulation sanguine à travers le tissu. On l'observe en chirurgie, en cas d'accidents vasculaires, d'hypoperfusion et de défaillances circulatoires. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le syndrome d'ischémie-reperfusion est lié à une ischémie froide. On entend par ischémie froide ou ischémie en hypothermie la période qui s'étend de la prise en charge du greffon jusqu'au traitement du receveur d'organe. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la L-citrulline est administrée entre 0,5 heures et 24 heures avant l'apparition de l'ischémie, de préférence entre 10 minutes et 24 heures avant l'apparition de l'ischémie, de préférence entre 30 minutes et 5 heures. Dans un autre mode avantageux de réalisation de l'invention, la L-citrulline est administrée au moment de l'apparition de l'ischémie, pendant l'ischémie, au moment de la reperfusion ou dans les 3 heures suivant le début de la reperfusion. Dans un mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, la L-citrulline est administrée à une dose unitaire en L-citrulline comprise entre 0,1 g et 10 g ; si nécessaire elle peut être administrée plusieurs fois par jour à raison d'une dose unitaire comprise entre 0,1 g et 5g pour une posologie comprise entre 1,5 mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour. Dans le cas de transplantation. la citrulline peut être administrée chez le donneur d'organe avant le prélèvement, chez le receveur avant, pendant ou immédiatement après la transplantation. Elle peut être également introduite dans le milieu de conservation pendant la conservation de l'organe. Dans le cadre de l'invention. la L-citrulline peut se présenter sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse et plus généralement sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. Elle peut être administrée seule ou associée à un véhicule approprié, c'est-à-dire tout excipient, véhicule ou support pharmacologiquement acceptable. De tels supports sont bien connus de l'homme du métier. Selon l'invention, la L-citrulline peut être associée avec d'autres composés à activité anti-ischémique, comme par exemple l'allopurinol (inhibiteur de la xanthine oxydase), la pentoxyfilline (anti TNF et inhibiteur de l'activation des cellules immunitaires) et les polvphénols tels le resvératrol ou la curcumine pour donner un produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. L'invention a également pour objet l'utilisation de la L-citrulline pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du syndrome d' ischémie-reperfusion. L'invention a également pour objet une méthode pour protéger un tissu contre un syndrome d'ischémie-reperfusion chez un mammifère comprenant l'administration audit mammifère d'une quantité thérapeutiquement efficace de L-citrulline. L'invention est illustrée à l'aide de l'exemple et des figures 1 et 2 qui suivent. La figure 1 représente les activités plasmatiques de l'aspartate amino-transferase (ASAT), de l'alanine amino-transférase (ALAT) et de la lactate déshydrogénase (LDH) chez des rats non ischémiés ayant reçu de la citrulline (CIT/IR-) ou un placebo isoazoté (NEAA/IR-) et chez des rats ischémiés ayant reçu de la citrulline (CIT/IR+) ou un placebo isoazoté (NEAA/IR ;-). Les colonnes avec des lettres différentes sont significativement différentes (p La figure 2 représente l'activité myéloperoxydase mesurée dans les foies de rats non ischémiés ayant reçu de la citrulline (CIT/IR-) ou un placebo isoazoté (NEAA/IR-) et de rats ischémiés ayant reçu de la citrulline (CIT/IR+) ou un placebo isoazoté (NEAA/IR+). Les colonnes avec des lettres différentes sont significativement différentes (p 1.2. Entretien des animaux Des rats mâles Sprague Dawley (-,-, 200 g; Charles River, L'Arbresles, France) sont utilisés. Ils sont acclimatés à notre animalerie pendant au moins 5 jours en cages standard, à 20 21°C, en cycle jour/nuit normal et avec un accès libre à l'eau désionisée et à une alimentation standard (UAR A04 ; Usine d'Alimentation Rationnelle, Villemoisson-sur-Orge, France). Le responsable du programme est autorisé (n°75.522) par le Ministère de l'Agriculture et de la Forêt à pratiquer ce type d'expériences. De plus, l'utilisation ainsi que l'entretien des animaux de laboratoire sont respectueux de la législation (D2001-486) et sont en accord avec 25 la législation européenne (Journal Officiel de la Communauté Européenne L358 12/18/1986). Le protocole expérimental a reçu l'accord du comité d'éthique pour l'expérimentation animale (P2.CM.037.07). 1.3. Protocole expérimental Les animaux sont répartis en quatre groupes : un groupe reçoit par gavage de la 30 citrulline (1 g/kg) 30 minutes avant une ischémie de 60 minutes, un groupe d'animaux témoins (sham) subit l'ensemble des traitements. sauf l'étape d'ischémie, un groupe d'animaux subit l'ensemble des traitements mais le gavage est réalisé avec un placebo isoazoté 30 minutes avant l'ischémie et non par la citrulline et un groupe d'animaux ne subit pas l'étape d'ischémie et reçoit par gavage le placebo isoazoté. Les expériences sont réalisées sur des animaux à l'état nourri. Toutes les expériences sont réalisées sur la même période de la journée pour s'assurer de la constance de l'état nutritionnel des animaux. Après anesthésie par inhalation d'isoflurane (3%), analgésie au Temgesic� (Shering-Plough, Paris, France ; 0,05 mg/kg par voie sous-cutané) et laparotomie, une ischémie hépatique partielle (70%) est induite par clampage pendant 60 minutes des branches de la veine porte et de l'artère hépatique au niveau des lobes médian et latéral gauche. A la fin de l'ischémie, les clamps sont retirés et la reperfusion peut alors se faire. Les muscles et la peau sont recousus et un anesthésique local (Emla�, AstraZeneca France, Rueil-Malmaison, France) est appliqué sur la plaie chirurgicale. L'apparition de douleurs postopératoires est prévenue par une 2C11e administration sous-cutanée de Temgesic� avant l'arrêt de l'anesthésie. Après 6 heures de reperfusion, les animaux sont euthanasiés par exsanguination après anesthésie afin de déterminer l'effet de la citrulline et les mécanismes mis en jeu. Les rats non soumis à l'ischémie sont euthanasies 7130 après le gavage. L'intégrité des cellules hépatiques est évaluée par la mesure des activités plasmatiques des enzymes utilisées comme marqueurs des lésions hépatiques : l'aspartate amino-transferase (ASAT), l'alanine amino-transférase (ALAT) et la lactate déshydrogénase (LDH). L'activité myéloperoxydase, marqueur de l'infiltration par les neutrophiles est également mesurée. Toutes ces activités sont mesurées par des techniques classiques connues de l'homme du métier. 1.4. Résultats Ils sont représentés clans les figures 1 et 2. Les animaux ischémiés ayant reçu le placebo izoazoté développent des lésions hépatiques majeures illustrées par une augmentation très forte et statistiquement très significative (p Chez les animaux ischémiés ayant subi un prétraitement à la citrulline, on observe une quasi normalisation de ces activités enzymatiques (ASAT x 3, ALAT x 4 et LDH x 3,5 ; NS vs sham), significativement plus faibles que dans le groupe des animaux ischémiés ayant reçu le placebo izoazoté, ce qui témoigne d'une préservation de l'intégrité des cellules hépatiques. On observe également chez les animaux ischémiés ayant reçu le placebo isoazoté une forte activité myéloperoxydase (x 4, p REVENDICATIONS1. L-citrulline de formule (I) suivante : NH2 (1) OH NH2 o ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable pour la prévention et le traitement du syndrome d'ischémie-reperfusion dans un tissu choisi dans le groupe comprenant le foie, le cerveau, l'intestin, le rein et le poumon. 2. L-citrulline selon la revendication 1 caractérisée en ce que le syndrome d'ischémie-reperfusion est lié à une ischémie chaude. 3. L-citrulline selon la revendication 1 caractérisée en ce que le syndrome d'ischémie-reperfusion est lié à une ischémie froide. 4. L-citrulline selon la revendication 2 ou 3 administrable entre 10 minutes et 24 heures avant l'apparition de l'ischémie. 5. L-citrulline selon la revendication 2 ou 3 administrable entre 10 minutes et 1 heure après l'apparition de l'ischémie. 6. L-citrulline selon la revendication 2 ou 3 administrable au moment de l'apparition de l'ischémie. 7. L-citrulline selon la revendication 1 caractérisée administrable à une dose unitaire en L-citrulline comprise entre 0,1 g et 10 g pour une posologie comprise entre 1,5 mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour. 8. L-citrulline selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse. 2937550 9 SANS MODIFICATIONS APPARENTES 9. L-citrulliné selon l'ûne quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. 10. L-citrulline selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisée en ce qu'elle est associée avec d'autres composés à activité anti-ischémique.