Brevet FR2937259A1 — publié le 20100423

Il n'est donc pas possible avec de telles vésicules de créer un gradient de pH entre le milieu externe et la cavité interne des vésicules, car les deux milieux s'équilibrent très rapidement. Or, il existe des principes actifs organiques dont la solubilisation dans un milieu aqueux ne peut se faire qu'à un pH acide ou à un pH basique. Mais l'administration de ces principes actifs à l'organisme humain ou animal requiert de les placer dans une composition sensiblement neutre. Et il subsiste donc le besoin de vésicules permettant d'encapsuler de tels actifs, ces vésicules étant elles-mêmes solubilisées en milieu sensiblement neutre. Par ailleurs, diverses structures permettant de délivrer des principes actifs, incluant des formes à libération prolongée, ont déjà été proposées et sont basées sur l'encapsulation d'ingrédients actifs à l'intérieur de vésicules. C'est ainsi que dans ce but, un grand nombre de documents de l'art antérieur a décrit l'utilisation de vésicules sphériques constituées d'une ou de plusieurs bicouches lipidiques et communément désignées sous le nom de liposomes. Cependant l'utilisation de liposomes ne donne pas toujours entière satisfaction en termes de stabilité et dans la mesure où leur préparation met en oeuvre des procédés nécessitant l'emploi de solvants organiques dont l'utilisation n'est pas toujours compatible avec les milieux physiologiques. En outre, l'industrie cherche à éviter l'emploi de solvants organiques en grande quantité. Pour résoudre l'ensemble de ces problèmes la demanderesse a mis au point de nouvelles vésicules catanioniques dispersées dans un milieu aqueux sensiblement neutre, et dont la cavité interne contient une solution qui est soit acide, soit basique. Ces vésicules ont notamment l'avantage d'être stables, d'être facilement préparées par un procédé qui fait l'objet de la présente invention et qui ne fait pas appel à l'emploi de solvants organiques. L'invention a pour premier objet des vésicules non poreuses en dispersion dans une composition aqueuse (phase externe) dont les parois, qui définissent une phase interne, sont constituées d'un mélange d'au moins un tensioactif anionique (TA) à contre-ion A+ et d'au moins un tensioactif cationique (TC) à contre-ion B-, (A+, W) étant distinct de (H+, OH-) mais avec au moins A+ = H+ ou B- = OH". Ces vésicules présentent l'avantage d'être faiblement perméables et, en l'absence d'actifs dissous dans leur cavité interne, de renfermer dans leur cavité interne une solution aqueuse de pH différent de celui de la phase externe d'au moins une unité de pH. Les parois des vésicules de l'invention sont constituées des tensioactifs anioniques et cationiques auto-assemblés en une structure sensiblement sphérique faiblement perméable. Par vésicules non poreuses ou faiblement perméables on entend des vésicules dont les parois sont capables de prévenir le passage de solutés contenus dans leur cavité interne vers la phase externe ou inversement pendant des temps suffisamment longs. La faible perméabilité des vésicules peut être contrôlée expérimentalement par la mesure à différents intervalles de temps de la concentration en protons (via le pH) ou en ions Cl-, Br dans les vésicules en contact avec un bain de dialyse, ou par la mesure de la concentration d'un soluté encapsulé dans les vésicules ajouté pendant la préparation (comme par exemple les molécules citées plus bas). L'évolution de la concentration csoluté(t) du soluté testé (H+, Br , Cl-, autre composé) est généralement donnée par une loi exponentielle du type : 3 Psolnré - C C soluté (t) R ù CO.soluté e où R est le rayon moyen des vésicules, t le temps écoulé entre l'encapsulation du soluté et la mesure, Psol,é la perméabilité des vésicules pour le soluté considéré. La faible perméabilité des vésicules de l'invention pour un soluté est constatée par la mesure d'une perméabilité inférieure à 1010 cm/s. Par exemple, pour des vésicules d'un diamètre typique de 5 �m, cela correspond à la perte de la moitié du soluté en un temps supérieur à 160 heures. En général, la perméabilité d'une vésicule donnée pour un soluté donné peut différer selon le sens de passage du soluté. Notamment, pour un soluté chargé 20 traversant la paroi d'une vésicule présentant un potentiel transmembranaire A0= 4exteme - (1)1t71eme, la perméabilité qui caractérise la sortie du soluté et la perméabilité P,,, qui caractérise la rentrée du soluté sont reliées par : P- expr- qA0 P kT ~ Où q est la charge du soluté, k la constante de Boltzmann et T la 25 température en kelvins. Ainsi, on peut observer plusieurs ordres de grandeur de différence entre la perméabilité d'un soluté chargé dans un sens et dans l'autre. Une vésicule sera considérée comme peu perméable à un soluté si au moins l'une des deux perméabilités, dans un sens ou dans l'autre, est inférieure à 5 10-11 cm/s. Les vésicules de l'invention ont une perméabilité à H+ ou à 0W qui est inférieure à 5 10-n cm/s. Les vésicules de l'invention se caractérisent également par : Le fait qu'une différence de pH d'au moins 1 unité et avantageusement 2 unités entre la phase interne et la phase externe des vésicules est conservée sur une durée d'au moins 1 mois, et préférentiellement 2 mois 30 .a Leur résistance à la dialyse : les vésicules sont résistantes à la dialyse, c'est-à-dire : elles ne sont pas détruites par la dialyse (observations par microscopie), leur composition en tensioactifs ne change pas (observé par HPLC), même si on les laisse à dialyser pendant 2100 heures. C'est un phénomène très étonnant, parce que l'homme du métier s'attendait à ce que la dialyse élimine le tensioactif soluble, et donc entraîne la destruction totale des vésicules. En outre, on a constaté que le plus souvent, la bicouche des vésicules est cristallisée. C'est observable par diffraction des rayons x. Cela implique que les tensioactifs sont � gelés � dans la bicouche, ne s'échangent pas avec la solution extérieure, et donc les vésicules sont solides. L'invention a également pour objet un procédé pour la préparation d'une dispersion de vésicules en milieu aqueux, ce procédé comprenant les étapes suivantes : i) Mélange dans de l'eau d'au moins un tensioactif anionique à contre-15 ion A+ et d'au moins un tensioactif cationique à contre-ion W, (A+, W) étant distinct de (H+. OH-) mais avec au moins A+ = H+ ou 13- = OW ; ii) Chauffage de ce mélange, pendant une durée tchauf . à une température T inférieure à la température de fusion du mélange catanionique et qui est supérieure ou égale à 40°C mais inférieure à 90°C, T et tchauff étant suffisantes pour 20 obtenir la solubilisation des tensioactifs ; iii) Dialyse de la suspension obtenue en ii) de façon à éliminer les sels de la phase externe. De façon plus détaillée : Le procédé de l'invention est mis en oeuvre en milieu aqueux. c'est-à- 25 dire dans de l'eau ou dans un mélange d'eau et d'un autre solvant miscible à l'eau. On peut par exemple utiliser des mélanges d'eau avec du glycérol (jusqu'à 30% en volume par rapport au volume d'eau) ou du DMSO (jusqu'à 3% en volume par rapport au volume d'eau). Les vésicules supportent également après leur préparation l'addition d'éthanol, de DMSO ou de glycérol en quantités modérées (moins de 1% en volume par 30 rapport au volume d'eau) De préférence le procédé de l'invention est mis en oeuvre dans de l'eau. Les tensioactifs sont choisis de la façon suivante : Selon une première variante, qui concerne les vésicules à phase interne acide, le tensio-actif anionique est à contre-ion H+ et le tensio-actif cationique est à contre-ion W, W étant différent de 0W. Selon une seconde variante, qui concerne les vésicules à phase interne 5 basique. le tensio-actif anionique est à contre-ion A+, A+ étant différent de H+ et le tensio-actif cationique est à contre-ion 0W. Les tensioactifs anioniques pouvant être utilisés conformément à l'invention pour la formation des vésicules comportent un groupement polaire anionique et au moins une chaîne alkyle en C8-C30 éventuellement substituée par un ou plusieurs 10 groupements hydroxyle et un ou plusieurs atomes d'halogène. Le groupement polaire anionique est choisi parmi les fonctions acide ou sel d'acide. Préférentiellement ces tensioactifs anioniques sont des dérivés de chaîne alkyle en C8-C24, ou hydroxyalkyle en C8-C24, ou fluoroalkyle en C3-C24. De préférence ils sont choisis parmi les acides carboxyliques à chaîne alkyle ou hydroxyalkyle en C8-C24, ou fluoroalkyle en C8-C24, 15 les acides di-carboxyliques à chaîne hydrophobe carbonée en C8-C24, les phosphates, les sulfates et les sulfonates comportant une ou deux chaînes alkyle en C8-C24. Le tensioactif anionique mis en oeuvre dans l'invention peut être un acide neutre qui libère un proton dans l'eau. Ainsi, l'expression � tensioactif anionique � inclut les tensioactifs ionisables en tensioactif anionique. 20 Parmi ces tensioactifs anioniques, on peut en particulier citer les acides gras tels que l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide dodécanedioïque, l'acide tétradécanedioïque, l'acide hexadécanedioïque, l'acide 12-dodécanoïque, l'acide 14-tétradecanoïque, l'acide 16-hydroxyhexadécanoïque. Le tensioactif anionique peut éventuellement être en mélange avec un 25 tensioactif non-ionique, préférentiellement choisi parmi des dérivés de chaîne alkyle en C8-C24, ou hydroxyalkyle en C8-C24, ou fluoroalkyle en C8-C24, comme par exemple un alcool gras ou un dérivé d'alcool gras : un hydroxyalkyle en C8-C24, un éther d'un hydrate de carbone en C4-C24 et d'un hydroxyalkyle en C8-C24. Le tensioactif non-ionique peut être introduit sans endommager les vésicules. L'utilisation de tensioactif 30 non-ionique en mélange avec le tensioactif ionique permet de diminuer le gradient de pH entre le compartiment interne et le milieu externe. Le tensio-actif anionique est soit à contre-ion H+ (première variante), soit à contre-ion différent de H+, et dans ce cas le contre-ion peut être choisi parmi les sels des métaux alcalins et alcalino-terreux, comme par exemple Na+, K+. Li+, ainsi que les cations organiques comme NH4, NH3+0H, NH3+CH2OH (seconde variante). Lors de la mise en oeuvre de la première variante, lorsque l'on souhaite faire varier le pH interne des vésicules, on choisit d'utiliser un tensioactif avec un contre-ion H+ et au moins un autre contre-ion. Par exemple on peut utiliser un mélange de contre-ions, comme H+ et Na+. Les tensioactifs cationiques pouvant être utilisés pour la formation des vésicules de l'invention sont des molécules comportant un groupement polaire cationique et au moins une chaîne alkyle ou aryle ou aralkyle, saturée ou insaturée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone et éventuellement interrompue par une fonction ester ou éther. Ces tensioactifs sont de préférence choisis parmi les ammoniums mono- et bicaténaires répondant aux formules (I) et (1') suivantes et les bases correspondantes : B 1 B R4ùNùR2 R4ùNùR2 1 (1) 1 , (1') R3 R3 dans lesquelles : - RI, R2 et R3, R', et R'2, identiques ou différents, représentent un 15 groupement choisi parmi : H, un alkyle en C1-C4, un hydroxyalkyle en C1-C4 et un alkyl(C i-C4)éther, - R4, R'3 et R'4, identiques ou différents, représentent un groupement choisi parmi : une chaîne hydrocarbonée saturée ou insaturée en C8-C24, un benzyle, un aralkyle en C8-C24 ou un groupement alkyl(C4-C20)ester d'alkyle(C4-C20), - B- représente un ion choisi parmi : 0W (seconde variante). F. Cl-. Br-, F. BF4_, 5042- (première variante). Le tensioactif cationique mis en oeuvre dans l'invention peut être une base neutre qui se protone dans l'eau. Ainsi, l'expression � tensioactif cationique � inclut les tensioactifs ionisables en tensioactif cationique. Lors de la mise en oeuvre de la seconde variante, pour faire varier le pH interne des vésicules, on peut utiliser un tensioactif cationique avec un mélange de contre-ions, par exemple 0W et Br-. Dans les formules (I) et (I') ci-dessus, RI, R2. R3_ R', et R'2, représentent de préférence le radical méthyle. Dans les formules (1) et (I') ci-dessus, R'3, R'4 et R4, sont notamment choisis parmi : 20 25 30 - les chaînes alkyle en C8-C24 telles que par exemple les chaînes stéaryle, cétyle, dodécyle et tétradécyle ou myristyle ; - les groupements alkyl(C4-C20)ester d'alkyle(C4-C20) tels que par exemple les alkyl(C16)esters d'alkyle(C4-C20) et les alkyl(C12)esters d'alkyle(C4-C20). - B est avantageusement choisi parmi : 0W (seconde variante), et Cl-, Br (première variante). Il est possible, conformément à l'Invention, d'associer n'importe quel type de tensioactif anionique avec n'importe quel type de tensioactif cationique dès lors que les contre-ions sont distincts du couple (H+, OH-). Les quantités de chaque catégorie de tensioactifs dans le milieu aqueux de départ sont données en nombre de moles nA et nc, désignant respectivement le nombre de moles de tensioactif anionique et le nombre de moles de tensioactif cationique. Dans le cas de la première variante, on calcule la fraction molaire de 15 tensioactif anionique suivant la formule : nA rA = nA+nc La fraction rA est optionnellement choisie pour chaque couple de tensioactifs, ou de mélanges de tensioactifs en suivant le protocole suivant : a) Les tensioactifs anionique et cationique sont mélangés dans l'eau, 20 en choisissant une fraction rAl au hasard, de préférence avec un excès de tensioactif cationique ; b) Le mélange est chauffé à une température proche, mais inférieure à la température de fusion du tensioactif anionique pendant une durée supérieure ou égale à une heure ; c) La suspension obtenue est dialysée ; d) Au cours de la dialyse on mesure l'évolution de rAl dans la composition, par exemple en suivant la concentration des tensioactifs par HPLC ; e) On observe que rAl atteint une valeur limite qui ne change plus et qui est indépendante de la valeur de rAl choisie au départ ; f) On nomme cette valeur r1(A) ; g) Les vésicules sont préparées en utilisant une valeur de rA supérieure à r1(A). Dans le cas de la seconde variante, on calcule la fraction molaire de tensioactif cationique suivant la formule : 10 25 30 ne rc = nA + ne La fraction rc est choisie pour chaque couple de tensioactifs, ou de mélanges de tensioactifs en suivant le protocole suivant : a) Les tensioactifs anionique et cationique sont mélangés dans l'eau, 5 en choisissant une fraction rci au hasard, de préférence avec un excès de tensioactif anionique ; b) Le mélange est chauffé à une température proche mais inférieure à la température de fusion du tensioactif cationique Tc, pendant une durée supérieure ou égale à une heure ; c) La suspension obtenue est dialysée ; d) Au cours de la dialyse on mesure l'évolution de rci dans la composition, par exemple en suivant la concentration des tensioactifs par HPLC ; e) On observe que rci atteint une valeur limite qui ne change plus et qui est indépendante de la valeur de rci choisie au départ ; f) On nomme cette valeur rl(c) ; g) Les vésicules sont préparées en utilisant une valeur de rc supérieure à ri(c). La concentration de tensioactifs dans le mélange est notée c et calculée de la façon suivante : mA + mC c= 20 mA + mC +mH 2O mA désignant la masse de tensioactif anionique, mc la masse de tensioactif cationique et mH2o la masse d'eau. Le choix de la concentration massique c permet de contrôler la taille finale des vésicules : plus c est faible, plus la taille des vésicules est élevée. De 25 préférence c est comprise entre 0,01 et 3%, et encore plus préférentiellement entre 0,33 et 1%. La taille des vésicules est un paramètre important qu'il est utile de pouvoir contrôler en vue de leur application notamment dans le domaine pharmaceutique. Des vésicules de petite taille sont en effet plus facilement assimilées par l'organisme humain ou animal. 30 La suspension préparée à l'étape i) est mise à chauffer à une température T pendant un temps tchauff. T est inférieure à la température de fusion du mélange catanionique, c'est-à-dire la température de fusion du mélange des deux tensioactifs anionique et 8 10 15 cationique. Elle est proche mais inférieure à la température de fusion du tensioactif le moins soluble parmi le tensioactif anionique et le tensioactif cationique. T est choisi de la manière suivante : elle être suffisamment élevée pour permettre la dissolution des cristaux de tensioactifs insolubles (les tensioactifs anioniques et éventuellement non- ioniques dans le cas de la première variante). Si T est trop basse, la solubilisation ne se fait pas, ou se fait trop lentement ce qui conduit à la formation de cristaux, d'un précipité ou d'un surnageant. Si T est trop élevée, la solution devient presque transparente, ce qui veut dire qu'on forme des micelles mixtes ou de très petites vésicules qui seront éliminées par la dialyse. En pratique T est comprise entre les températures de fusion de chacun des tensioactifs de la suspension, et généralement elle est supérieure ou égale à 40°C. T est donc inférieure à la température de fusion du tensioactif le moins soluble. De façon habituelle, on chauffe la suspension jusqu'à une température T qui reste inférieure ou égale à 80°C. En pratique T est inférieure de 2 à 5 °C de la température de fusion du tensioactif le moins soluble. La durée du chauffage tchauff doit être suffisamment longue pour assurer la dissolution des cristaux de tensioactifs insolubles (anioniques et éventuellement non-ioniques). Si tchauff est trop long, on observe la formation de cristaux, d'un précipité ou d'un surnageant. Un contrôle visuel permet d'observer le temps nécessaire à la dissolution des tensioactifs. La durée nécessaire pour obtenir une dissolution complète dépend des tensioactifs choisis. Par exemple une durée de une heure à une semaine peut être choisie, et de façon courante une durée de un à deux jours se révèle satisfaisante pour une grande partie des mélanges de tensioactifs. Avec une température T bien choisie, on obtient généralement au bout du temps tchauff une solution blanche sans agrégats ni cristaux visibles à l'ceil nu. Le choix de T et du temps tchauff peut être affiné en contrôlant par microscopie, après la dialyse, la formation des vésicules et l'absence de cristaux résiduels. Après cette étape, la dispersion peut être éventuellement diluée en ajoutant un solvant, de préférence de l'eau, à la température T. Cette étape est optionnelle, elle permet par exemple de contrôler la viscosité finale de la solution de vésicules. Dans le cas où l'on souhaite encapsuler un actif dans les vésicules, on peut ajouter pendant l'étape ii) une solution contenant l'actif à encapsuler. Cette solution est alors introduite à la température T. On peut aussi ajouter à la composition issue de l'étape ii) une solution contenant un actif à encapsuler. A l'issue de cette étape la dispersion est refroidie à la température ambiante (environ 18-25°C). Les vésicules qui se sont formées au cours de l'étape ii) ont une forme sensiblement ovoïdale, allongée et plate. La dispersion est mise à dialyser pendant un temps td;al. La dialyse permet d'éliminer de la phase externe de la dispersion les sels A+B-, et en particulier les sels H+B. (première variante) ou A+OH- (seconde variante). Ces sels se sont formés dans le milieu aqueux extérieur aux vésicules et dans la cavité interne des vésicules. Le procédé de l'invention permet d'obtenir à la fin de l'étape ii) des vésicules non poreuses et faiblement perméables de forme sensiblement sphérique et l'étape de dialyse permet d'éliminer les sels de la solution aqueuse dans laquelle les vésicules sont en suspension, ou sont dispersés. Mais les sels qui se sont formés à l'intérieur de la cavité des vésicules ne sont pas éliminés par la dialyse, ce qui crée à l'issue de la dialyse une différence de pH entre la phase aqueuse dans laquelle sont dispersées les vésicules et la cavité interne des vésicules. En l'absence d'actif à encapsuler, cette différence de pH est supérieure à une unité de pH, et préférentiellement supérieure à deux unités de pH, avantageusement supérieure à trois unités. La durée tdiai est généralement choisie pour que l'élimination des ions à l'extérieur des vésicules soit complète. Habituellement 2 à 3 jours suffisent. Si tdial est trop courte, la dispersion est instable et peut former un précipité ou un surnageant d'agrégats, ou former des cristaux. Un choix de td;ai trop long n'altère pas la qualité des vésicules obtenues. Toutefois, après plusieurs mois de dialyse, les vésicules finissent par se vider de leur contenu. La solution est ensuite extraite de la cassette de dialyse et stockée. La composition finale est extrêmement stable, les vésicules restent intègres pendant plusieurs années de stockage après leur extraction de la cassette de dialyse. Elles peuvent même rester sous dialyse sans être détruites. La solution peut être diluée. Des essais de dilution par un facteur 50 ont été réalisés sans destruction notable des vésicules. Si l'on applique ce procédé aux couples de tensioactifs catanioniques qui ont été décrits dans l'art antérieur et notamment dans WO2005/089927 et EP-1 846 152, on observe la formation de vésicules poreuses à l'issue de l'étape ii). Ces tensioactifs catanioniques étant à contre-ions (H+, OW) conduisent en outre à la formation de vésicules dont la cavité interne présente un pH neutre comme la phase externe. Le document WO2006/070095 indique que l'on peut utiliser des cations à contre-ion différent de OH-. Toutefois, les vésicules obtenues par ce procédé sont différentes de celles de l'invention. En effet, le procédé de l'invention se distingue de celui de l'art antérieur par la dialyse, la température de chauffage et la durée du chauffage. Dans les conditions de l'art antérieur, même si des vésicules se formaient, elles seraient poreuses, et en particulier, en l'absence de dialyse, la préparation est instable, i.e. des cristaux, un précipité ou un surnageant se forment. Selon la première variante, si l'on n'a pas ajouté d'actif à encapsuler, on constate que l'intérieur des vésicules est à un pH inférieur au pH à l'extérieur des vésicules (typiquement, pH 3, soit 1 mM en HBr ou HC1 par exemple). Et selon la seconde variante, si l'on n'a pas ajouté d'actif à encapsuler, on constate que l'intérieur des vésicules est à un pH supérieur au pH à l'extérieur des vésicules. Le pH interne peut être mesuré par spectroscopie de fluorescence résolue en temps ou statique après ajout d'une sonde fluorescente adéquate. Un gradient de pH est maintenu sur des durées de l'ordre de plusieurs mois. Ce pH peut être ajusté dans une certaine mesure en jouant sur la taille des vésicules, comme cela a été décrit ci-dessus, des vésicules plus petites étant dotées de cavités internes de pH plus faibles. On peut aussi jouer sur le pH en utilisant un mélange acide gras/sel d'acide gras comme décrit ci-dessus pour la première variante. L'utilisation de sel d'acide gras tend à remplacer HC1 ou HBr par NaCl ou NaBr dans les mêmes proportions, et à augmenter le pH interne. Dans le cas de la seconde variante, on peut utiliser un mélange d'halogénure d'ammonium et d'hydroxyde d'ammonium, ou d'halogénure d'ammonium et d'ammonium protonable. Les vésicules catanioniques de l'invention ont une taille de 0,1-100�m, ajustable en jouant sur la concentration massique c de la composition de tensioactifs de départ. A l'issue du procédé de l'invention, le pH à l'intérieur des vésicules est différent du pH à l'extérieur des vésicules. Cette caractéristique est obtenue directement, sans ajout de solution tampon par exemple. Habituellement, la formation de vésicules avec un gradient de pH nécessite l'ajout d'une solution tampon qui diffuse dans la vésicule (liposome), et l'excès est ensuite nettoyé (C. Grabielle-Madelmont, et al., Journal Of Biochemical And Biophysical Methods, 56(1-3):189-217, June 2003, ou K. Holmberg, D. Shah, and M. Schwuger, editors. Handbook of Applied Surface and Colloid Chemistry, volume 2, Wiley-VCH, New York, 2002). Dans le procédé de l'invention, la solution est acidifiée ou rendue basique naturellement lorsque les vésicules se forment. Les temps de rétention de la solution acide ou basique dans la cavité interne des vésicules sont comparables, voire supérieurs, aux préparations de l'art antérieur. Selon une variante, les vésicules de l'invention peuvent être stabilisées par au moins un polymère adsorbé sur leur surface. Parmi les polymères utilisables, on peut citer ceux choisis parmi : - les polysaccharides tels que par exemple les dextranes et les dérivés de cellulose tels que les hydroxyméthylcelluloses, les hydroxyéthylcelluloses et les hydroxypropylcelluloses, - les polymères de synthèse tels que les polyéthylèneglycols (PEG), la polyvinylpyrrolidone (PVP), les polystyrènes, les polyacrylates, les polyvinylalcools tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales PVA, Ethenol�, Poval�, Acroflex�, Airvol�, Alcotex� ou Aquafilm�. Parmi ces polymères, on préfère tout particulièrement utiliser des polymères faiblement adsorbants tels que le polyoxyéthylène, le dextrane, la polyvinylpyrrolidone (PVP), les polymères di-blocs oxyéthylénés tels que les polymères vendus sous la dénomination commerciale Varonic� par la société Degussa-Goldschmidt, les copolymères blocs à base d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les polymères vendus par les société BASF sous les dénominations commerciales Pluronic� et Lutrol� et leurs équivalents hydrosolubles, les copolymères tri-blocs hydrosolubles c'est-à-dire les copolymères composés de blocs hydrophilehydrophobe-hydrophile tels que les produits vendus sous les dénominations Méthyl-Oxyrane, copolymère EOPO, Pluronic�, Antarox�, Arcol�, Daltocel� Dowfax� et leurs analogues comportant du polystyrène comme groupement hydrophobe Lorsqu'ils sont utilisés, ces polymères représentent de préférence de 50 à 400 % et encore plus particulièrement de 100 à 200 % en poids par rapport au poids total de la bicouche. L'enrobage des vésicules de l'invention n'est pas nécessaire mais peut être utile lorsque l'on souhaite les introduire dans un milieu fortement chargé en sels, afin d'assurer leur stabilité. Il est possible d'encapsuler des principes actifs hydrosolubles dans les vésicules avec d'excellents rendements : jusqu'à 66% pour les principes actifs de charge opposée à celle de la cavité interne des vésicules, 30% pour les principes actifs de charge identique à celle de la cavité interne des vésicules, 10% pour les principes actifs neutres. Dans les liposomes de l'art antérieur, des rendements bien inférieurs sont habituellement donnés. En particulier, dans les autres systèmes catanioniques, sans gradient de pH entre la phase interne et la phase externe, la littérature rapporte des rendements jusqu'à 70% pour les solutés de charge opposée aux vésicules, et inférieurs à 8% pour des solutés de même charge que les vésicules. Les temps de rétention des vésicules de l'invention sont comparables ou supérieurs aux temps habituellement rapportés pour les vésicules de l'art antérieur. Les vésicules sans soluté encapsulé mais qui présentent un intérieur acide ou basique à l'issue du procédé de l'invention ont la faculté d'absorber spontanément certains composés cationiques ou anioniques, respectivement, qui se trouvent alors encapsulés à l'intérieur des vésicules. De plus, les parois des vésicules sont chargées positivement dans le cas de la première variante, donc elles ont la faculté d'attirer des composés de charge opposée qui se trouvent alors concentrés à proximité des parois des vésicules. Selon une variante, le procédé de l'invention comporte une étape au cours de laquelle on ajoute un actif à encapsuler à la composition issue de l'étape iii). Ces propriétés permettent d'utiliser les vésicules de l'invention pour encapsuler des principes actifs du type molécule organique hydrosoluble à faible pH (première variante) ou à pH élevé (seconde variante), notamment dans le domaine médical ou pharmaceutique et dans le domaine cosmétique. Ces vésicules sont stables sur des périodes de plusieurs mois et permettent notamment de retenir, par adsorption et/ou encapsulation, et de contrôler la diffusion lente de molécules actives pharmaceutiques. cosmétiques ou bien encore de cellules telles que des bactéries par exemple. Ces propriétés permettent également d'envisager l'utilisation des vésicules de l'invention pour capturer des ions dans un milieu aqueux, et cette utilisation trouve des applications notamment dans le secteur de la dépollution des milieux aqueux. Le procédé de l'invention permet de réaliser des vésicules attirant à la fois les espèces chargées positivement et négativement, ce qui est particulièrement intéressant pour des utilisations en dépollution de l'eau. Ces propriétés permettent également d'envisager l'utilisation des vésicules de l'invention pour capturer des ions métalliques dans le compartiment interne de la vésicule, qui peuvent réagir avec les ions B- pour former des particules de petite taille, par exemple nanométrique. Par exemple, avec B- = CF ou Br on peut faire réagir des ions Ag+, ou avec B- = OH- (seconde variante) on peut faire réagir des métaux de transition (Cu2+, Mn2+, Zn2+ etc.). Toute réaction d'hydrolyse-condensation catalysée en milieu aqueux acide ou basique, par exemple l'hydrolyse-condensation du tetraéthoxysilane en SiO2 peut être envisagée. Enfin, l'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins une 5 vésicule telle que décrite ci-dessus, pour la formulation d'espèces actives dans une composition cosmétique ou dans une composition pharmaceutique. Une composition cosmétique comprenant au moins une vésicule telle que décrite ci-dessus constitue un autre objet de l'invention. Une composition pharmaceutique comprenant au moins une vésicule 10 telle que décrite ci-dessus constitue un autre objet de l'invention. De façon plus détaillée, et afin d'illustrer l'invention, des exemples sont donnés ci-dessous de tensioactifs ayant effectivement conduit à la formation de vésicules selon l'invention à l'aide du procédé décrit ci-dessus. Mise en oeuvre de la première variante : 15 - Les solvants testés ont été : H2O, D2O, un mélange eau-glycérol (70:30) - Tensioactifs anioniques : Ils peuvent être choisis parmi les acides gras et les sels des acides gras suivants :5 Acide laurique Acide myristique Acide myristique Acide palmitique deutéré ô ô ô 0 o 0- 0 N N N N O? N U M N N N U ~? U U ~. M M M U U Û U Myristate de sodium CH3(CH2)11CH2 ONa Acides gras complexes : Acide dodécanedioïque Acide hexadecanedioïque Acide 16- hydroxydécanoïque I o U 0-U 0 ( 0ù( I = cm o N U U N r _I N f ti O U O V O o C Tensioactifs cationiques : Bromure de cétyl triméthylammonium Chlorure de cétyl triméthylammonium Bromure de myristyl trimethylammonium M In _ + 2 OùzùO N Autres tensioactifs : Tétradécanol (en mélange avec l'acide myristique) CH3(CH2).12CH20H Solutés cationiques : Chlorure de Rhodamine 6G Lucigénine10 Solutés neutres ou amphotères : Glucose Chlorure de Rhodamine B H ,,.OH H3C.y N . ..~ O._ , - ,cH, HO,. H H 1-1 C .. 2- N CHI H OH OH O Ci // \O H Solutés anioniques : Sulforhodamine Oregon Green O so, /{1f SO3H CH Etape i) on prépare une suspension d'eau, de tensioactif cationique et de tensioactif anionique, en de manière optionnelle du soluté à encapsuler en prenant les 10 valeurs adéquates de r et c. avec n(anionique) r = (fraction molaire de tensioactif n(anionique) + n(cationique) anionique) = m(anionique) + m(cationique) c m(anionique) + m(cationique) + m(eau) (concentration massique de tensioactif) 15 Le choix de r est fait en sorte qu'à l'issue de la dialyse, on obtient effectivement des vésicules. La méthode pour déterminer rationnellement les valeurs de r possibles a été décrite ci-dessus. r peut être déterminé par différents tests, mais nous avons choisi la méthode suivante : On effectue une préparation comme expliqué ci- 17 dessus, en choisissant un r au hasard (de préférence tel qu'il y ait un excès significatif de tensioactif soluble dans l'eau, ici cationique). On mesure l'évolution de r au cours de la dialyse, par exemple en mesurant séparément les concentrations des deux tensioactifs par HPLC. On constate que r finit par atteindre une valeur limite qui ne change plus, et qui est indépendante du r choisi initialement. Les vésicules sont alors préparées à ce rapport molaire, ou à des compositions plus riches en tensioactif insoluble (ici anionique ou non ionique). Par exemple, dans le cas du mélange acide myristique/ cétyltriméthylammonium chloré ou bromé (CTAC1 ou CTABr), la composition des échantillons préparés à des valeurs de r quelconques se stabilisent à r ... 0,60 en plusieurs centaines d'heures de dialyse. On choisit alors de préparer les vésicules à un rapport molaire plus riche en acide myristique, soit r = 0,66. On note que des préparations effectuées à des r supérieurs restent intactes et forment également des vésicules. On obtient le même type de comportement avec d'autres mélanges de tensioactifs. Le choix de c permet de contrôler dans une certaine mesure la taille finale des vésicules : plus c est faible, plus la taille des vésicules est élevée. Il n'y a pas de limites particulières relatives à la quantité de soluté à ajouter, si ce n'est qu'on a constaté que de très fortes concentrations de certains solutés peuvent empêcher les vésicules de se former. On choisit généralement c = 1%. Si on choisit d'encapsuler un soluté, il est ajouté à cette étape de sorte que la concentration finale soit préférentiellement dans la gamme 30 �M ù 50 mM. On peut envisager des concentrations plus faibles, et plus élevées. Toutefois, dans certains 25 cas de concentration trop élevée, on constate que l'ajout de soluté empêche la formation de vésicules. On obtient alors une suspension aqueuse qui présente habituellement des cristaux de tensioactif insoluble (par exemple l'acide myristique), et éventuellement le soluté à encapsuler. 30 Etape ii) cette suspension est mise à chauffer à la température T pendant un temps tcfäutf. T est choisie de la manière suivante : elle doit être suffisamment élevée pour permettre la dissolution des cristaux de tensioactifs insolubles. Si T est trop basse, la solubilisation ne se fait pas, ou se fait trop lentement ce qui conduit à la 35 formation de cristaux, d'un précipité ou d'un surnageant. Si T est trop élevée, la solution devient presque transparente, ce qui veut dire qu'on forme des micelles mixtes ou de très petites vésicules qui seront éliminées par la dialyse. tchauff doit être suffisamment long pour assurer la dissolution des cristaux de tensioactif insoluble. Si T est bien choisie, on obtient généralement au bout du temps tchauff une solution blanche sans agrégats ni cristaux visibles à l'oeil nu. Le choix de T et tchauff peut être affiné en contrôlant par microscopie que les vésicules sont bien formées après la dialyse et qu'il n'y a pas de cristaux résiduels. Par exemple, dans le cas du mélange acide myristique/CTABr ou CTAC1. on peut chauffer à 50°C pendant 2 jours quel que soit le choix de r. La suspension est éventuellement diluée en ajoutant de préférence de l'eau à la température T, ou une solution contenant le soluté à encapsuler. Cette étape est optionnelle, elle permet par exemple de contrôler la viscosité finale de la solution de vésicules. Par exemple, avec le mélange acide myristique/CTAC1 ou acide myristique/CTABr, avec r = 0,66 et c = 1%, on obtient après la dialyse une solution très visqueuse (gel) de vésicules de diamètre autour de 5 �m. Si on dilue par 3 la solution avant de la dialyser, on obtient une solution fluide qui contient des vésicules de diamètre autour de 5 �m. Après refroidissement, la suspension est mise à dialyser pendant un temps tdial. On utilise par exemple des cassettes de dialyse avec un seuil de coupure moléculaire de 10 kDa, mais des seuils plus bas conviennent également. Le bain de dialyse peut être changé par de l'eau fraîche à intervalles réguliers, notamment pour éliminer le soluté qui n'est pas encapsulé dans les vésicules, mais c'est optionnel. I1 est préférable d'agiter le bain de dialyse pour permettre une élimination rapide du sel entre les vésicules, et éviter ainsi leur déstabilisation. tdiai est généralement choisi pour que l'élimination des ions entre les vésicules (pas à l'intérieur) soit complète. Habituellement 2 à 3 jours suffisent. Au cours de la dialyse, il est fréquent d'observer dans un premier temps une séparation de phase (typiquement au bout de 12 heures). Il suffit alors d'agiter un peu la cassette pour que la solution s'homogénéise, et on obtient finalement une suspension qui ne se sépare plus jamais en deux phases. La solution est extraite de la cassette de dialyse et stockée. La solution finale est extrêmement stable, les vésicules restent intègres après plusieurs années de stockage après extraction de la cassette, elles peuvent même rester sous dialyse sans être détruites. La solution peut être diluée par un facteur 50 sans destruction notable des vésicules. Si on n'a pas ajouté de soluté à encapsuler, on constate que l'intérieur des vésicules est à un pH inférieur à l'extérieur des vésicules (typiquement, pH 3, soit 5 1 mM en HBr ou HCl). Un gradient de pH est maintenu sur des durées de l'ordre de plusieurs mois (temps de demi-vie de HC1 = 100 jours). Ce pH peut être modulé en jouant sur la taille des vésicules, comme décrit ci-dessus, des vésicules plus petites produisant des pH plus faibles. On peut aussi jouer sur le pH en utilisant un mélange acide gras/sel 10 d'acide gras comme décrit ci-dessus. L'utilisation de sel d'acide gras tend à remplacer HC1 ou HBr par NaCl ou NaBr dans les mêmes proportions. Le pH interne peut être mesuré par spectroscopie de fluorescence résolue en temps ou statique après ajout d'une sonde fluorescente adéquate. De manière optionnelle, du soluté à encapsuler peut être ajouté. Si les 15 vésicules ont été préparées sans ajout de soluté dans les étapes précédentes, alors elles ont la faculté de pouvoir absorber certains composés présents en solution, par exemple la Rhodamine B ou la Rhodamine 6G. Il suffit d'ajouter le soluté et d'attendre une dizaine de minutes avant que les vésicules n'absorbent spontanément le soluté. Si on a ajouté un soluté pendant la préparation des vésicules, on 20 constate qu'une fraction importante reste à l'intérieur des vésicules : jusqu'à 66% s'il est anionique, de l'ordre de 30% s'il est cationique ou neutre. Les vésicules se vident très lentement du soluté, avec des temps de demi-vie de l'ordre d'une centaine de jours, avec des variations selon la nature du soluté. On peut vérifier la présence du soluté par les techniques spectroscopiques usuelles. On peut éventuellement faire appel à des 25 techniques plus élaborées qui montrent que le soluté présent dans la solution finale est effectivement à l'intérieur des vésicules, pas à l'extérieur (microscopie confocale, spectroscopie de fluorescence résolue en temps). Les solutés cationiques sont uniformément répartis à l'intérieur des vésicules, les solutés anioniques sont concentrés près des parois des vésicules, uniquement du côté interne de la paroi. 30 Mise en oeuvre de la seconde variante : On a testé les tensioactifs suivants : - Tensioactifs anioniques : Myristate de sodium, tétradécane sulfonate de sodium, hexadécane sulfonate de sodium. 35 - Tensioactifs cationiques : ils sont choisis parmi les amines et les sels des amines suivantes : Tridécylamine, tétradécylamine, hexadecylamine, N,N diméthyltridécylanime, N,N diméthyltétradécylamine. PARTIE EXPERIMENTALE FIGURES Figure 1 : vésicules acide myristique/CTAC1 r = 0.65 c = 1.0% dialysées 5 jours, observation au microscope confocal après marquage à l'Oregon Green 488. La barre est de 10 �m. Figure 2 : vésicules acide myristique/CTAC1 r = 0.65 c = 1.01% diluées par trois puis dialysées 5 jours, observation au microscope confocal après marquage à l'Oregon Green 488. La barre est de 10 �m. Figure 3 : vésicules myristate de sodium/N,N dimethyltetradécylamine r = 0.35 c = 1.0% dialysées 95h, observation au microscope confocal après marquage à la Rhodamine 6G. Figure 4 : vésicules acide tetradecane dicarboxylique/chlorure de cétyl triméthylammonium r = 0.49 c = 1.0% dialysées 4 jours, observation au microscope confocal après marquage à l'Oregon Green. Figure 5 : vésicules acide 16-hydroxy hexadécanoïque/chlorure de cétyl triméthylammonium r = 0.50 c = 1.0% dialysées 4 jours, observation au microscope confocal après marquage à l'Oregon Green. Figure 6 : vésicules acide myristique/CTAC1 r = 0.66 c = 1.00% diluées par trois avec Rhodamine 6G encapsulée dialysées 5 jours. La barre est de 10 �m. Figure 7 : vésicules acide myristique/CTAC1 r = 0.65 c = 1.01% diluées par trois avec Rhodamine encapsulée dialysées 5 jours, observation au microscope confocal après marquage à l'Oregon Green 488. Figure 8 : courbe de calibration de la réponse de la Rhodamine B : F(576nm)/F(600nm) en fonction du pH, imposé par ajout de HC1 à une solution de Rhodamine B. Figure 9 : pH dans des vésicules acide myrsitique/chlorure de 30 cétyltriméthyl ammonium mesuré par le ratio de fluorescence de la Rhodamine B à 546nm et 600nm, pour différentes dilutions de la solution de vésicules. Figure 10 : Evolution de la concentration de Rhodamine 6G dans les vésicules acide myristique/chlorure de cétyltriméthylammonium en fonction du temps, évaluée par l'absorbance à 526 nm. Figure 11 : Evolution de la concentration de l'Oregon Green dans les vésicules acide myristique/chlorure de cétyltriméthylammonium en fonction du temps, évaluée par fluorescence à 522 nm sous excitation à 502 nm. Figure 12 : Evolution de la fraction molaire d'acide myristique c(myristique) r = pour des mélanges de fraction molaire initiale ro = 0.32, c(myristique) + c(CTA) 0,47, 0,55, 0,66 et 0,70 au cours du temps de dialyse. Figure 13 : vésicules myristate de sodium/N,N dimethyltetradécylamine r = 0.35 c = 1.0% dialysées 95h, observation au microscope confocal une minute après ajout d'Oregon Green. Figure 14 : vésicules acide myristique / chlorure de cétyl triméthylammonium, r = 0.66 c = 1.0% diluées à 0.33% et dialysées 4 jours. Observation au microscope confocal 20 minutes après addition de Rhodamine 6G. Exemple 1 : préparation de vésicules à faible pH interne, gel On mélange 33,7 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,7603 g d'eau ultrapure (r = 0,65, c = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution blanche homogène sans résidus solide. Environ 3 mL de cette solution sont prélevés et mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de lh, 4h, 24h, 48h et 5 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Avant le changement d'eau à 1h et 4h de dialyse, on observe une démixtion, avec une solution très visqueuse blanche qui surnage au-dessus d'une solution limpide. Après le changement d'eau à 24h de dialyse, il n'y a plus de démixtion observable, mais la solution forme un gel très visqueux. Après 5 jours de dialyse, la membrane de la cassette de dialyse est découpée, et le gel blanc est collecté à l'aide d'une spatule et stocké à température ambiante. La présence de vésicules dans le gel est contrôlée par microscopie confocale après marquage à l'Oregon Green 488 : environ 100 mg du gel sont prélevés, on ajoute 20 �L d'une solution aqueuse saturée d'Oregon Green 488 diluée 10 fois. L'observation par microscopie confocale est effectuée selon les techniques usuelles. On obtient une image des vésicules dont les murs positifs sont marqués par le colorant négatif (figure 1). Ces vésicules forment un empilement presque compact. Exemple 2 : préparation de vésicules à faible pH interne, solution fluide On mélange 33,7 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,7603 g d'eau ultrapure (r = 0,65, c;n;t;al = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution blanche homogène sans résidus solide. 1,0122g de cette solution sont prélevés. On y ajoute 2,0513 g d'eau à 50°C et on laisse agiter 30 secondes (cfinal = 0,33%). Le mélange est mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) l0 de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 1h, 4h, 24h, 48h et 5 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste blanche, homogène et fluide. 15 Après 5 jours de dialyse, la solution est prélevée de la cassette à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. La présence de vésicules dans la solution est contrôlée par microscopie confocale après marquage à l'Oregon Green 488: environ 100 mg de la solution sont prélevés, on ajoute 20 �L d'une solution aqueuse saturée d'Oregon Green 20 488 diluée 10 fois. L'observation par microscopie confocale est effectuée selon les techniques usuelles. On obtient une image des vésicules dont les murs positifs sont marqués par le colorant négatif (figure 2). Les vésicules sont bien séparées. L'excès de colorant négatif reste dans la solution mais ne pénètre pas dans les vésicules. Exemple 3 : préparation de vésicules à fort pH interne, solution 25 fluide On mélange 29,2 mg de myristate de sodium, 53,4 mg de N,N diméthyltetradécylamine et 8,1749 g d'eau ultrapure (r = 0,35, c = 1,00%). On laisse agiter à 50°C pendant 41 heures. Les cristaux de myristate de sodium se dissolvent progressivement et les gouttelettes huileuses du N,N diméthyltetradécylamine 30 disparaissent progressivement pour donner une solution blanche homogène. Environ 3 mL de cette solution sont prélevés et mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 500 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau 35 ultrapure au bout de 30 minutes, 1h, 3h, 7h, 22h, 95h. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Avant le changement d'eau à 30 minutes, 1h, 3h, 7h et 22h de dialyse, on observe une démixtion entre une solution blanche qui surnage au-dessus d'une solution limpide. Après le changement d'eau à 22h de dialyse, il n'y a plus de démixtion observable. Après 95h de dialyse, la solution blanche fluide est prélevée de la cassette de dialyse à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. La présence de vésicules dans la solution est contrôlée par microscopie confocale après ajout de Rhodamine 6G : environ 100 �L de solution sont prélevées, on ajoute 10 �L d'une solution aqueuse de Rhodamine 6G à 10 �M. L'observation par microscopie confocale est effectuée selon les techniques usuelles. On obtient une image des vésicules imperméables qui apparaissent en noir sur le fond continu de Rhodamine 6G dans la solution extérieure (figure 3). Exemple 4 : préparation de vésicules avec un diacide gras On mélange 20 mg d'acide tetradecane dicarboxylique, 25,8 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 4,5728 g d'eau ultrapure (r = 0,49, c = 1,00%). On laisse agiter à 50°C pendant 75 heures. Les cristaux de l'acide dicarboxylique se dissolvent progressivement pour donner une solution blanche homogène sans résidus solide. Environ 3 mL de cette solution sont prélevés et mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 18h, 27h, 42h, 66h et 4 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Après le changement d'eau à 27h de dialyse, la solution forme un gel très visqueux. Après 4 jours de dialyse, la membrane de la cassette de dialyse est découpée, et le gel blanc est collecté à l'aide d'une spatule et stocké à température ambiante. La présence de vésicules dans le gel est contrôlée par microscopie confocale après marquage à l'Oregon Green 488 : environ 100 mg du gel sont prélevés, on ajoute 20 �L d'une solution aqueuse saturée d'Oregon Green 488 diluée 10 fois. L'observation par microscopie confocale est effectuée selon les techniques usuelles. On obtient une image des vésicules dont les murs positifs sont marqués par le colorant négatif (figure 4). Ces vésicules forment un empilement presque compact. Exemple 5 : préparation de vésicules avec un acide gras hydroxylé On mélange 22,0 mg d'acide 16-hydroxy hexadécanoïque, 26,3 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 4,8263 g d'eau ultrapure (r = 0,50, c = 1,00%). On laisse agiter à 50°C pendant 75 heures. Les cristaux de l'acide dicarboxylique se dissolvent progressivement pour donner une solution blanche homogène sans résidus solide. Environ 3 mL de cette solution sont prélevés et mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 18h, 27h, 42h, 66h et 4 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Après le changement d'eau à 27h de dialyse, la solution forme un gel très visqueux. Après 4 jours de dialyse, la membrane de la cassette de dialyse est découpée, et le gel blanc est collecté à l'aide d'une spatule et stocké à température ambiante. La présence de vésicules dans le gel est contrôlée par microscopie confocale après marquage à l'Oregon Green 488: environ 100 mg du gel sont prélevés, on ajoute 20 �L d'une solution aqueuse saturée d'Oregon Green 488 diluée 10 fois. L'observation par microscopie confocale est effectuée selon les techniques usuelles. On obtient une image des vésicules dont les murs positifs sont marqués par le colorant négatif (figure 5). Ces vésicules forment un empilement presque compact. Exemple 6 : Encapsulation de solutés organiques dans des vésicules On mélange 33,8 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,76 de solution de Rhodamine 6G à 4.5 mM dans l'eau (r = 0,66, C;,,;t;ai = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution homogène sans résidus solide qui présente la couleur rose caractéristique de la Rhodamine 6G. 1,67 g de cette solution sont prélevés, sont complétés à 5,OOg par ajout d'eau ultrapure et agités pendant 30 secondes (cfnai = 0,33%, [Rhodamine 6G]finai = 1.5 mM). Environ 3 mL de ce mélange sont mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 2 heures, 5 heures, 1 jour, 2 jours, 4 jours et 7 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste homogène et fluide et présente la coloration rose caractéristique de la Rhodamine 6G. Avant le changement d'eau de dialyse, le bain présente également la coloration rose caractéristique de la Rhodamine 6G, mais elle s'atténue progressivement au fur et à mesure des changements, jusqu'à devenir imperceptible au changement à 2 jours de dialyse. Après 7 jours de dialyse, la solution est prélevée de la cassette à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. La présence de vésicules dans la solution et l'encapsulation de la Rhodamine 6G est contrôlée par microscopie confocale selon les techniques usuelles. La Rhodamine 6G est bien présente à l'intérieur des vésicules, et exclusivement à l'intérieur (figure 7). On peut procéder à la même observation après marquage à l'Oregon Green 488: à 20gL de la solution, on ajoute 10 �L d'une solution aqueuse saturée d'Oregon Green 488 diluée 10 fois. L'utilisation de filtres sélectifs à l'Oregon Green et la Rhodamine 6G permet de localiser sélectivement chaque colorant : l'Oregon Green (figure 7) s'accumule près des parois chargées positivement des vésicules, la Rhodamine 6G (figures 6 et 7) est bien présente à l'intérieur des vésicules, et exclusivement à l'intérieur. Exemple 7 : Mesure du pH interne pour des vésicules à faible pH On mélange 33,8 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,76 g de solution de Rhodamine B à 10 �M dans l'eau (r = 0,66, c;n;t;al = 1,00%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution blanche homogène sans résidus solide. 1,67 g de cette solution sont prélevés, complétés à 5,00 g par ajout d'eau ultrapure, agités pendant 30 secondes (ct nai = 0,33%, [Rhodamine B]t;nai = 3.33 MM). Le mélange est mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer. ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 2 heures, 5 heures, 1 jours, 2 jours, 4 jours et 7 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste homogène et fluide et présente la coloration rose caractéristique de la Rhodamine B. Avant le changement d'eau de dialyse, le bain présente également la coloration rose caractéristique de la Rhodamine B, mais elle s'atténue progressivement au fur et à mesure des changements, jusqu'à devenir imperceptible au changement à 1 jour de dialyse. Après 7 jours de dialyse, la solution est prélevée de la cassette à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. L'observation de la solution par microscopie confocale selon les techniques usuelles sans ajout supplémentaire d'autres colorants montre que les vésicules sont bien formées et que la Rhodamine B est exclusivement encapsulée à l'intérieur des vésicules, pas à l'extérieur. A l'aide d'un spectromètre de fluorescence (Varian Cary Eclipse), la solution est excitée à 555 nm et on mesure que le rapport des intensités de fluorescence à 576 nm et 600 nm vaut F(565nm)/F(600nm) = 1.65. Cette valeur est comparée à la courbe d'étalonnage réalisée en mesurant le rapport des intensités de fluorescence mesurées dans les mêmes conditions dans des mélanges Rhodamine B/HC1 de pH connu (figures 8 et 9). On détermine que le pH interne des vésicules vaut environ pH = 2,5, alors que le pH de la solution mesuré à l'aide d'une électrode à pH plongée directement dans la solution de vésicules donne un pH égal à 6. La dilution de la solution jusqu'à un facteur 80 ne détruit pas les vésicules, et permet de garder un pH interne aux vésicules inférieur à 3,5. la surconcentration de protons à l'intérieur des vésicules est conservé sur des périodes de plusieurs mois même lorsque les vésicules sont laissées sous dialyse (tableau 1). Durée de dialyse pH intravésiculaire c(H+) correspondant 7 jours 3,15 0,71mM 18 jours 3,31 0,48mM 2 mois 3,48 0,34mM Tableau 1 : pH intravésiculaire et concentration associée en fonction du 20 temps de dialyse, mesuré par le ratio de fluorescence de la Rhodamine B à 546nm et 600nm. Exemple 8: mesure de la perméabilité aux cations et du taux d'encapsulation. On mélange 33,8 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de 25 cetyltriméthylammonium et 5,76 de solution de Rhodamine 6G à 4.5 mM dans l'eau (r = 0,66, = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution homogène sans résidus solide qui présente la couleur rose caractéristique de la Rhodamine 6G. 1,67 g de cette solution sont prélevés, sont complétés à 5,OOg par ajout 30 d'eau ultrapure et agités pendant 30 secondes (effilai = 0,33%, [Rhodamine 6G]final = 1.5 mM). Environ 3 mL de ce mélange sont mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 2 heures, 5 heures, 1 jour, 2 jours, 4 jours et 7 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste homogène et fluide et présente la coloration rose caractéristique de la Rhodamine 6G. Avant le changement d'eau de dialyse, le bain présente également la coloration rose caractéristique de la Rhodamine 6G, mais elle s'atténue progressivement au fur et à mesure des changements, jusqu'à devenir imperceptible au changement à 2 jours de dialyse. Sans interrompre la dialyse, environ 200 �L de solution sont prélevés après 7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 45 jours et 57 jours de dialyse. Après le dernier prélèvement, la quantité résiduelle de Rhodamine 6G dans chaque échantillon est mesuré comme suit : les vésicules sont détruites par 40 �L d'une solution de Triton X-100 à 5% en masse dans l'eau est ajoutée aux 200 pL d'échantillon et chauffage à 50°C pendant quelques minutes. La destruction complète des vésicules est vérifiée par microscopie confocale. La solution est complétée à 3.5 mL par addition d'eau ultrapure, et l'absorbance à 526 nm de la solution est mesurée à l'aide d'un spectromètre UV-visible (Varian Cary 1). La concentration de Rhodamine 6G dans chaque échantillon est proportionnelle à l'absorbance. On reporte donc la concentration en Rhodamine 6G dans les vésicules en fonction du temps de dialyse et l'ajustement de la courbe par une _ 3 P olmc ~ loi exponentielle donne la perméabilité selon l'équation : c01 é (t) _ coso11,1ee R (figure 10). Le rayon R des vésicules est estimé par microscopie confocale à 2,5 �m, ce qui permet finalement de déduire que la perméabilité des vésicules à la Rhodamine 6G est de 8.1 10"12 cm/s. Le rapport de la concentration initiale de Rhodamine 6G dans la solution (1.5 mM) et la concentration dans les vésicules extrapolée à t = 0 (0.50 mM) permet de mesurer le taux d'encapsulation. 30% de la Rhodamine 6G initiale est donc encapsulée. Exemple 9: mesure de la perméabilité aux anions et du taux 30 d'encapsulation. On mélange 33,8 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,76 de solution saturée d'Oregon Green dans l'eau (r = 0,66, c;mtial = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution homogène sans 35 résidus solide qui présente la vert-jaune caractéristique de l'Oregon Green. 1,67 g de cette solution sont prélevés, sont complétés à 5,OOg par ajout d'eau ultrapure et agités pendant 30 secondes (cfnal = 0,33%). Environ 3 mL de ce mélange sont mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slidea-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 2 heures, 5 heures, 1 jour, 2 jours, 4 jours et 7 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste homogène et fluide et présente la coloration jaune-vert caractéristique de l'Oregon Green. Avant le changement d'eau de dialyse, le bain présente également la coloration jaune-vert caractéristique de l'Oregon Green, mais elle s'atténue progressivement au fur et à mesure des changements, jusqu'à devenir imperceptible au changement à 1 jour de dialyse. Sans interrompre la dialyse, environ 200 �L de solution sont prélevés après 7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 45 jours et 57 jours de dialyse. Après le dernier prélèvement, la quantité résiduelle de l'Oregon Green dans chaque échantillon est mesuré comme suit : les vésicules sont détruites par 40 �L d'une solution de Triton X-100 à 5% en masse dans l'eau est ajoutée aux 200 �L d'échantillon et chauffage à 50°C pendant quelques minutes. La destruction complète des vésicules est vérifiée par microscopie confocale. La solution est complétée à 3 mL par addition d'une solution de CTACI à 1,5 mM dans une solution-tampon de borate à pH = 9. L'émission de fluorescence à 522 nm sous excitation à 502 nm est mesurée à l'aide d'un spectromètre de fluorescence Varian Cary Eclipse pour toutes les solutions préparées à partir de chacun des échantillons prélevés. La concentration d'Oregon Green dans chaque échantillon est proportionnelle à l'émission de fluorescence à un facteur arbitraire près sans importance pour la mesure. On reporte donc la fluorecence fonction du temps de dialyse et l'ajustement de la courbe par une loi exponentielle donne la perméabilité 3 P,,trä• t selon l'équation : F(t) = Foe R (figure 11). Le rayon R des vésicules est estimé par microscopie confocale à 2,5 �m, ce qui permet finalement de déduire que la perméabilité des vésicules à l'Oregon Green est de 8.9 10-11 cm/s. Le rapport de la fluorescence mesurée à partir de la solution initiale et de la fluorescence extrapolée à t = 0 permet de mesurer le taux d'encapsulation. 60% de l'Oregon Green initial est donc encapsulé. Exemple 10 : mesure par HPLC de la fraction molaire de tensioactif pendant la dialyse. Le mélange acide myristique/chlorure de cétyl triméthylammonium à analyser est dilué dans 4 fois sa masse en éthanol absolu. Les concentrations d'acide myristique et de cétyl triméthylammonium dans cette solution sont mesurés par HPLC à l'aide d'une colonne C18 HyPurity couplée à un réfractomètre Sedex 75 thermalisé à 40°C sous une pression d'azote de 2.9 bars. La phase continue pour la mesure est un mélange 70/15/15 en volume d'acétone/méthanol/eau acidifiée à 0.06% en volume d'acide trifluoroacétique. Le mélange est injecté à 0,5 mL/min. Dans ces conditions, le cétyl triméthylammonium et l'acide myristique produisent des pics bien séparés après des temps de migration de 3,5 et 6 minutes respectivement. L'aire sous ces pics est comparée à des courbes de calibration réalisées à partir de solutions de chlorure de cétyl triméthylammonium et d'acide myristique préparées dans le même rapport eau/éthanol, et de concentrations connues. Cette technique permet de suivre l'évolution de la fraction molaire r = c(myristic) d'acide myristique dans un mélange quelconque d'acide c(myristic) + c(CTA) myristique et chlorure de cétyl triméthyl ammonium de fraction molaire initiale quelconque et de temps de dialyse quelconque (figure 12) Exemple 11 : Encapsulation spontanée d'un acide faible dans une vésicule à haut pH. On mélange 29,2 mg de myristate de sodium, 53,4 mg de N,N diméthyltetradécylamine et 8,1749 g d'eau ultrapure (r = 0,35, c = 1,00%). On laisse agiter à 50°C pendant 41 heures. Les cristaux de myristate de sodium se dissolvent progressivement et les gouttelettes huileuses du N,N diméthyltetradécylamine disparaissent progressivement pour donner une solution blanche homogène. Environ 3 mL de cette solution sont prélevés et mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slide-a-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 500 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 30 minutes, 1h, 3h, 7h, 22h, 95h. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Avant le changement d'eau à 30 minutes, 1h, 3h, 7h et 22h de dialyse, on observe une démixtion entre une solution blanche qui surnage au-dessus d'une solution limpide. Après le changement d'eau à 22h de dialyse, il n'y a plus de démixtion observable. Après 95h de dialyse, la solution blanche fluide est prélevée de la cassette de dialyse à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. La présence de vésicules dans la solution est contrôlée par microscopie confocale par ajout de Rhodamine 6G comme décrit plus haut. L'encapsulation spontanée d'Oregon Green est réalisée comme suit : 10 �L de solution saturée d'Oregon Green dans l'eau diluée par 10 sont ajoutés à 100 �L de la solution de vésicules. Après un temps d'attente de une minute, la microscopie confocale permet de mettre en évidence des zones très concentrées en Oregon Green (figurel3) qui correspond à l'encapsulation spontanée du colorant faiblement acide dans l'intérieur à fort pH des vésicules. Exemple 12 : Encapsulation spontanée de solutés cationiques dans des 10 vésicules On mélange 33,8 mg d'acide myristique, 25,1 mg de chlorure de cetyltriméthylammonium et 5,76 d'eau ultrapure (r = 0,66, cinitiai = 1,01%). On laisse agiter à 50°C pendant 72 heures. Les cristaux d'acide myristique se dissolvent progressivement pour donner une solution homogène blanche sans résidus solides. 15 1.67 g de cette solution sont prélevés, sont complétés à 5,OOg par ajout d'eau ultrapure et agités pendant 30 secondes (cfnai = 0,33). Environ 3 mL de ce mélange sont mis dans une cassette de dialyse de 3 mL à membrane de cellulose (Slidea-lyzer, ThermoScientific) de seuil de coupure 3500 Da. La cassette est plongée dans un bain de dialyse d'environ 300 mL sous agitation à température ambiante. L'eau de 20 dialyse est changée pour de l'eau ultrapure au bout de 2 heures, 5 heures, 1 jour, 2 jours et 4 jours. La cassette est vigoureusement agitée avant chaque changement d'eau de dialyse. Au cours de la dialyse, la solution reste homogène et fluide. Après 4 jours de dialyse, la solution est prélevée de la cassette à l'aide d'une seringue et stockée à température ambiante. 25 L'encapsulation spontanée de la Rhodamine 6G est réalisée comme suit : environ 10 �L de Rhodamine 6G à 10�M sont ajoutés à 20�L de la solution de vésicules. Après 20 minutes, des zones très concentrées en Rhodamine 6G sont observées par microscopie confocale (Figure 14). Elles correspondent à l'intérieur des vésicules dans lequel la Rhodamine 6G s'est accumulée préférentiellement. 30 REVENDICATIONS1. Vésicules non poreuses en dispersion dans une composition aqueuse désignée phase externe, dont les parois, qui définissent une phase interne, sont constituées d'un mélange d'au moins un tensioactif anionique (TA) à contre-ion A+ et d'au moins un tensioactif cationique (TC) à contre-ion B- co-cristallisés, (A+, W) étant distinct de (H+, OH-) et avec au moins A+ = H+ ou B- = OH-. 2. Vésicules selon la revendication 1 qui ont une perméabilité à H+ ou à 0W qui est inférieure à 5.10-1' cm/s. 3. Vésicules selon la revendication 1 ou la revendication 2, qui ont une 10 différence de pH d'au moins 2 unités entre leur phase interne et leur phase externe, cette différence étant conservée sur une durée d'au moins 1 mois. 4. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lesquelles le tensio-actif cationique est choisi parmi ceux qui comportent un groupement polaire cationique et au moins une chaîne alkyle ou aryle ou aralkyle, saturée ou 15 insaturée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone et éventuellement interrompue par une fonction ester ou éther, et le tensioactif anionique est choisi parmi ceux qui comportent un groupement polaire anionique et au moins une chaîne alkyle en C8-C30 éventuellement substituée par un ou plusieurs groupements hydroxyle et un ou plusieurs atomes d'halogène. 20 5. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lesquelles le tensio-actif cationique est choisi parmi : les ammoniums mono- et bicaténaires répondant aux formules (I) et (I') suivantes et les bases correspondantes : B 1 B R4ùNùR2 R4ùN~R2 (1) 1 , (l') R3 R3 dans lesquelles : 25 - RI. R2 et R3_ R'1 et R'2, identiques ou différents, représentent un groupement choisi parmi : H, un alkyle en Ci-C4, un hydroxyalkyle en C1-C4 et un alkyl(CI-C4)éther, - R4. R'3 et R'4, identiques ou différents, représentent un groupement choisi parmi : une chaîne hydrocarbonée saturée ou insaturée en C8-C24, un benzyle, un 30 aralkyle en C8-C24 ou un groupement alkyl(C4-C20)ester d'alkyle(C4-C20), - B- représente un ion choisi parmi : OH-, F, Cl-, Br , F, BF4-, SO42-, et le tensio-actif anionique est choisi parmi les acides carboxyliques à chaîne alkyle ou hydroxyalkyle en C8-C24, ou fluoroalkyle en C8-C24, les acides di-carboxyliques à chaîne hydrophobe carbonée en C8-C24, les phosphates, les sulfates et les sulfonates comportant une ou deux chaînes alkyle en C8-C24. 6. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à phase interne acide, dans lesquelles le tensio-actif anionique est à contre-ion H+ et le tensio-5 actif cationique est à contre-ion W, W étant différent de 0W. 7. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, à phase interne basique, dans lesquelles le tensio-actif anionique est à contre-ion A+, A+ étant différent de H+ et le tensio-actif cationique est à contre-ion 0W. 8. Vésicules selon la revendication 6, dans lesquelles : 10 le tensioactifs anionique est choisi parmi les acides et les sels des acides suivants : Acide laurique Acide myristique Acide myristique deutéré Acide palmitique o N o M o U o Myristate de sodium o CH3(CH2)11CH2 ONa5Acide dodécanedioïque Acide hexadecanedioïque Acide 16- hydroxydécanoïque o z I O O o I 0 ( r=, I N V o o C"i U N cv = .- • U o N S I N U o=~ O K o I o 0 Le tensioactif cationique est choisi parmi : Bromure de cétyl Chlorure de cétyl Bromure de myristyl triméthylammonium triméthylammonium trimethylammonium M m = MI M U ' +I = I M+z U U-z-U U M = _ N _ +I I I N U-z-U U = Lf) U N) (-A U = ~ -~ M I 9. Vésicules selon la revendication 7, dans lesquelles ie tensioactif anionique est choisi parmi : 10 Myristate de sodium, tétradécane sulfonate de sodium, hexadécane sulfonate de sodium, Le tensioactif cationique est choisi parmi les amines et les sels des amines suivantes :Tridécylamine, tétradécylamine, hexadecylamine, N,N diméthyltridécylanime, N,N diméthyltétradécylamine. 10. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, qui ont une taille de 0,1-1001_tm. 11. Vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, qui comportent un principe actif encapsulé dans leur cavité interne. 12. Procédé pour la préparation d'une dispersion de vésicules en milieu aqueux selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, ce procédé comprenant les étapes suivantes : i) Mélange dans de l'eau d'au moins un tensioactif anionique à contre-ion A+ et d'au moins un tensioactif cationique à contre-ion W, (A+, W) étant distinct de (H+, OH-) et avec au moins A+ = H+ ou W = 0W ; ii) Chauffage de ce mélange, pendant une durée tchauff à une température T inférieure à la température de fusion du mélange catanionique et qui est supérieure ou égale à 40°C mais inférieure à 90°C, T et tcha,,ff étant suffisantes pour obtenir la solubilisation des tensioactifs ; iii) Dialyse de la suspension obtenue en ii) de façon à éliminer les sels de la phase externe. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel le milieu aqueux est de l'eau. 14. Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, dans lequel on calcule la fraction molaire de tensioactif anionique suivant la formule : nA rA = nA + ne nA et nc, désignant respectivement le nombre de moles de tensioactif anionique et le nombre de moles de tensioactif cationique, la fraction rA étant choisie pour chaque couple de tensioactifs, ou de mélanges de tensioactifs en suivant le protocole suivant : a) Les tensioactifs anionique et cationique sont mélangés dans l'eau, en choisissant une fraction rAI au hasard, de préférence avec un excès de tensioactif cationique ; b) Le mélange est chauffé à une température inférieure à la température de fusion du tensioactif anionique, pendant une durée supérieure ou égale à une heure ; c) La suspension obtenue est dialysée ;d) Au cours de la dialyse on mesure l'évolution de rAl dans la composition, par exemple en suivant la concentration des tensioactifs par HPLC ; e) On observe que rAl atteint une valeur limite qui ne change plus et qui est indépendante de la valeur de rAl choisie au départ ; f) On nomme cette valeur ri(A) ; g) Les vésicules sont préparées en utilisant une valeur de rA supérieure à ri(A). 15. Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, dans lequel on calcule la fraction molaire de tensioactif cationique suivant la formule : ne rc = nA + ne la fraction rc est choisie pour chaque couple de tensioactifs, ou de mélanges de tensioactifs en suivant le protocole suivant : a) Les tensioactifs anionique et cationique sont mélangés dans l'eau, en choisissant une fraction rci au hasard, de préférence avec un excès de tensioactif 15 anionique ; b) Le mélange est chauffé à une température inférieure à la température de fusion du tensioactif cationique Tc, pendant une durée supérieure ou égale à une heure ; c) La suspension obtenue est dialysée ; d) Au cours de la dialyse on mesure l'évolution de rci dans la composition, par exemple en suivant la concentration des tensioactifs par HPLC ; e) On observe que rci atteint une valeur limite qui ne change plus et qui est indépendante de la valeur de rci choisie au départ ; f) On nomme cette valeur ri(c) ; g) Les vésicules sont préparées en utilisant une valeur de rc supérieure à n(c). 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 dans lequel la concentration de tensioactifs dans le mélange est comprise entre 0,01 et 3%, et encore plus préférentiellement entre 0,33% et 1%. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 16 dans lequel T est supérieure ou égale à 40°C et inférieure ou égale à 80°C. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 17 dans lequel tchauff est compris entre une heure et une semaine, et de préférence entre un et deux jours. 20 25 30 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 18 dans lequel on ajoute à la composition issue de l'étape ii) une solution contenant un actif à encapsuler. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 19 dans lequel on ajoute un actif à encapsuler à la composition issue de l'étape iii). 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 20 dans lequel on stabilise les vésicules par au moins un polymère adsorbé sur leur surface. 22. Utilisation de vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour encapsuler des principes actifs du type molécule organique hydrosoluble. 23. Utilisation de vésicules selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la dépollution des milieux aqueux. 24. Une composition cosmétique comprenant au moins une vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11. 25. Une composition pharmaceutique comprenant au moins une 15 vésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.