Brevet FR2935393A1 — publié le 20100305

L'invention se rapporte à l'enrichissement de microorganismes non photosynthétiques en sélénium organique, notamment à l'aide de composés de type séléno-hydroxyacides, et plus particulièrement à l'aide d'acide 2- hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, sous forme (D, L), ou d'un énantiomère, sel, dérivé ester ou amide de ce composé, ainsi que l'utilisation des microorganismes ainsi enrichis en nutrition animale ou humaine, cosmétique ou pharmacie. Le sélénium est un micro-nutriment essentiel pour l'Homme et les mammifères notamment (Wendel, A. ; Phosphorus, Sulfur Silicon Pelat Elem. ; 1992; 67, 1-4, 405-415). En particulier, il participe, sous la forme de L(+)-sélénocystéine ou de L(+)-sélénométhionine (Muller, S. et al. ; Arch. Microbiol., 1997 ; 168 ; 421) à la biosynthèse des sélénoprotéines telles que la Glutathion peroxydase, la Thiorédoxine réductase et la Sélénoprotéine P. Chez l'Homme, des déficiences en sélénium ont été reportées, notamment dans le cas de patients soumis à une alimentation par voie parentérale durant de longues périodes (Von Stockhausen, H.B. ; Biol. Trace Elem. Res. ; 1988; 15; 147-155). Une complémentation journalière de 200pg en sélénium est considérée comme sûre et adéquate pour un homme adulte de poids moyen (Schrauzer, G.N., J. Am. Col. Nutr. ; 2001; 20 ; 1- 14). Le sélenium se trouve dans la nature, sous deux formes : organique et inorganique. Les composés inorganiques sont le plus souvent des sels tels que le sélénite ou le sélénate de sodium. Ces composés sont très toxiques pour l'homme et la plupart des animaux. Les composés organiques (composés organoséléniés) sont représentés dans les organismes vivants notamment par les acides aminés L(+)-sélénométhionine, L(+)-méthylsélénocystéine et L(+)-sélénocystéine. La L(+)-sélénométhionine est la principale source de sélénium organique chez l'Homme et les animaux. Cependant, L'Homme et les animaux sont autoxotrophes pour cet acide aminé, qui ne peut être obtenu qu'au travers de l'alimentation. C'est donc sous cette forme organique qu'idéalement le sélénium devrait être incorporé dans les compléments alimentaires visant à traiter ou prévenir une carence en sélenium. Il a pu être ainsi démontré qu'une supplémentation de l'alimentation en L(+)-sélénométhionine était beaucoup moins toxique et présentait une meilleure biodisponibilité qu'un apport sous forme de sélénite de sodium (Mony, MC et al.; J. of Trace Elem. Exp. Med. ; 2000 ; 13 ; 367-380). Actuellement, on ne connaît pas d'autres voies métaboliques de captation du sélénium par les organismes vivants que celles utilisant comme substrats le sélénium inorganique, principalement sous la forme de sélénite de sodium, et la sélénométhionine. On peut trouver un apport convenable en sélénium organique chez les végétaux supérieurs (blé, maïs, soja notamment), chez lesquels plus de 80% du sélénium est constitué par de la L(+)-sélénométhionine (Schrauzer, G.N. ; J.Am.Coll. Nutrit. ; 2001 ; 20; 1 ; 1-4). Cependant la concentration en sélénium de ces végétaux n'est pas suffisante pour pouvoir réaliser facilement, et à moindre coût, des additifs alimentaires. Une des voies explorées pour obtenir des compositions riches en sélénométhionine, consiste à enrichir certains microorganismes en sélénium organique à partir de sélénium inorganique. Ces microorganismes, une fois enrichis, peuvent servir de matière première à la préparation de produits alimentaires ou cosmétiques. De nombreuses publications décrivent, par exemple, la préparation de levures enrichies en sélénium, et plus particulièrement la levure Saccharomyces cerevisiae (Oh Tae-Kwang et al., brevet KR950006950 du 26.06.1995) en vue de les utiliser en tant que tels ou de les incorporer dans des compositions alimentaires (Moesgaard S. et al., brevet DK200200408 du 16.09.2003) ; ou encore d'obtenir des produits dérivés enrichis en sélénium tels que du pain (Wang Boaquan, brevet CN 1817143 du 16.08.2006), du lait (Jeng Chang-Yi, brevet TW565432 du 11.12.2003), des oeufs (Cui Li et al., brevet CN1302723C du 07.03.2007), du chocolat (In Gyeong Suk et al., brevet KR200401 01 1 45 du 08.11.2004) ou de la bière (Jakovleva L.G. et al., brevet RU2209237 du 27.07.2003) enrichis en sélénium par exemple. Dans le domaine des aliments de santé, des préparations contenant des levures enrichies en sélénium ont aussi été proposées pour des femmes enceintes (Wang Weiyi, brevet CN1778199 du 31.05.2006), ou encore pour améliorer le micro-environnement intestinal de patients hypoglycémiques (Li Tao Zhao, brevet CN1810161 du 02.08.2006). Dans le domaine dermocosmétique, des compositions contenant des levures enrichies en sélénium ont été développées en vue de réduire la perte capillaire (Kasik Heinz, brevet DE19858670 du 21.06.2000) ou en prévention du photo-vieillissement (Kawai Norihisa et al., brevet JP07300409 du 14.11.1995). Des préparations pharmaceutiques contenant des levures enrichies en sélénium ont été utilisées dans la prévention et le traitement de pathologies inflammatoires telle que les rétinopathies liées au diabète (Crary Ely J., brevet US5639482 du 17.06.1997), ou cardiovasculaires (Nagy P.L. et al.; brevet HUT060436 du 28.09.1992). Les bactéries et plus particulièrement les bactéries pro-biotiques ont, elles aussi, fait l'objet d'enrichissement en sélénium (Calomme M. et al., Biol. Trace Elem. Res.;1995; 47; 379-383). Lactobacillus acidophilus, mais aussi Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus buchnerilparabuchneri (Andreoni V. et al., brevet US0258964) ont été décrits en tant que compléments alimentaires enrichis en sélénium. Des mélanges de pro-biotiques constitués de levures et de lactobacilles, en vue de renforcer système immunitaire et la résistance aux maladies (Huang Kehe Qin, brevet CN1283171C du 08.11.2006) ont été préparés. Cependant, dans toutes ces préparations, les microorganismes enrichis en sélénium sont préparés à partir de sélénium inorganique uniquement. Ainsi, la source de sélénium la plus souvent utilisée consiste en du sélénite ou du sélénate de sodium solubilisé dans les milieux de cultures des microorganismes. Les microorganismes ainsi enrichis, bien qu'ayant synthétisé des quantités satisfaisantes de sélénium organique assimilable par l'organisme humain, présentent souvent un taux résiduel élevé en sélénium inorganique non transformé, ce qui peut s'avérer dangereux pour le consommateur. Dans une précédente demande publiée sous WO 2006/008190, le demandeur a décrit de nouveaux composés organiques de type sélénohydroxyacide pouvant servir de précurseurs à la synthèse de L(+)-sélénométhionine chez l'homme et l'animal. De manière surprenante, le demandeur a constaté que les composés organiques de type séléno-hydroxyacide décrits dans la demande WO 2006/008190 pouvaient être incorporés dans des milieux de culture et utilisés par différents microorganismes tels que des bactéries et des levures en vue de leur enrichissement en sélénium organique. Les résultats obtenus ont révélé que ces composés permettent d'enrichir très efficacement les microorganismes non photosynthétiques en sélénium organique, notamment en L(+)-sélénométhionine, avec un rendement équivalent, voire supérieur, à celui obtenu à l'aide des composés inorganiques habituellement utilisés Il est ainsi apparu que l'enrichissement de microorganismes en sélénium organique à partir de composés organiques de type sélénohydroxyacide permettait de produire du sélénium organique exempt de sélénium inorganique, et ainsi de résoudre les problèmes de toxicité liés aux procédés de l'art antérieur. Les microorganismes non photosynthétiques ainsi enrichis peuvent être directement utilisés dans l'alimentation dans le cadre de la prévention ou du traitement des carences en sélénium, notamment en vue de produire des produits et compositions pharmaceutiques, nutritionnelles ou cosmétiques. Les figures 1 à 6 ci-après représentent des graphiques représentent l'évolution de la croissance des microorganismes au cours du temps, en milieu YPG (Saccharomyces cerevisiae) ou MRS (Lactobacillus casei) supplémentés avec différents composés séléniés inorganiques (sélenite de sodium) et organiques (sélénométhionine ou acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (THD-177). L'axe des abscisses correspond au nombre d'heures de culture, l'axe des ordonnée à la densité cellulaire (absorbance mesurée à 550 nm). Figure 1: la levure Saccharomyces cerevisiae est cultivée en milieu YPG, supplémentée en sélénite de sodium (composé inorganique) Figure 2: la levure Saccharomyces cerevisiae est cultivée en milieu YPG, supplémentée en sélénométhionine (composé organique) Figure 3: la levure Saccharomyces cerevisiae est cultivée en milieu YPG, supplémentée en acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (composé organique selon l'invention) Figure 4: la bactérie Lactobacillus casei est cultivée en milieu MRS, supplémentée en sélénite de sodium (composé inorganique) Figure 5: la bactérie Lactobacillus casei est cultivée en milieu MRS, supplémentée en sélénométhionine (composé organique) Figure 6: la bactérie Lactobacillus casei est cultivée en milieu MRS, supplémentée en acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (composé organique selon l'invention) Description détaillée de l'invention La présente demande se limite à l'obtention de microorganismes non-photosynthétiques, c'est-à-dire aux microorganismes dont la croissance ne dépend pas directement d'une source de lumière. Les résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de la présente invention visent plus particulièrement des bactéries non photosynthétiques et des levures, lesquels ont un métabolisme très différent des microorganismes photosynthétiques. Par microorganisme, on entend tout organisme vivant unicellulaire appartenant à l'un des Règnes suivants : monères, protistes, mycètes ou protozoaires, présentant une structure cellulaire eucaryote ou procaryote, de taille microscopique ou ultramicroscopique, ayant un potentiel métabolique et de reproduction. Lesdits organismes unicellulaires peuvent être impliqués dans la formation de filaments ou de biofilms. Par sélénium organique, on entend un ensemble de molécules contenant au moins un composé possédant au moins un atome de sélénium dans sa structure chimique susceptible d'être produit par un organisme vivant, tels que notamment les acides aminés sélénométhionine, méthylsélénocystéine et sélénocystéine, des peptides ou des protéines les contenant. De préférence, les microorganismes non-photosynthétiques selon l'invention sont des levures ou des bactéries, plus préférentiellement une levure du genre Saccharomyces ou une bactérie du genre Lactobacillus. Les microorganismes ainsi enrichis en sélénium peuvent être utilisés en tant que tels ou bien en tant qu'additif alimentaire. Ils peuvent, par exemple, être déshydratés pour former une poudre stable pouvant être incorporées dans des compositions servant de base à la préparation de produits transformés mais peuvent être aussi utilisés vivants en tant que pro-biotiques dans les processus de transformation de produits alimentaires. La présente invention a donc pour objet un nouveau procédé d'enrichissement de microorganisme non photosynthétique en sélénium organique, caractérisé en ce que ledit microorganisme non photosynthétique est cultivé dans un milieu de culture comprenant un composé de type sélénohydroxyacide. De préférence, le composé de type séléno-hydroxyacide est un composé de formule générale (I), un sel, ou bien un dérivé ester ou amide de celui-ci, On 0 II Se R Rl (1) formule dans laquelle : n = 0, 1 ou 2; R~ = OH, OCOR3, OPO3H2, OPO3R4R5 ou OR6; R2 = OH, R3, NHR7, S-cystéinyle ou S-glutathionyle; étant entendu que lorsque n = 1 et R2 = OH, alors RI ne peut être OH ; R3 = alkoxyle, céramide 1, céramide 2, céramide 3, céramide 4, céramide 5, céramide 6a et 6b, S-cystéinyle, S-glutathionyle, ou un groupe choisi parmi les suivants :30 OH H OR4 = alkoxyle (C1-C26), céramide 1, céramide 2, céramide 3, céramide 4, céramide 5, céramide 6a et 6b, ou un groupe choisi parmi les suivants : 7 H H OH MEO H ~~ \ \ \ \ ou Mao5 OR5 = alkoxyle (C1-C26), céramide 1, céramide 2, céramide 3, céramide 4, céramide 5, céramide 6a et 6b ou un groupe choisi parmi les suivants : OH CH HO ou OR6 = pyruvate, lactate, citrate, fumarate, maléate, myristate, palmitate, stéarate, palmitoléate, oléate, linoléate, acides gras naturels ou 13-cis rétinoate ; R, = H, alkyle (C1-C26), un amino-acide naturel ou une amine 10 naturelle. Dans la formule (I) ci-dessus : - par alkyle, il est entendu un groupement comportant 1 à 26 atomes de carbone linéaire ou cyclique, éventuellement ramifié, éventuellement fluoré ou polyfluoré, et comportant éventuellement une ou plusieurs doubles 15 liaisons carbone-carbone, tel que par exemple méthyle, éthyle, isopropyle, trifluorométhyle, linoléyle, linolényle, palmitoyle. - par alkoxyle, il est entendu un groupement dérivé d'un alcool primaire, secondaire ou tertiaire comportant 1 à 26 atomes de carbone linéaire ou cyclique, éventuellement ramifié, éventuellement fluoré ou polyfluoré, et comportant éventuellement une ou plusieurs double liaisons carbone-carbone, tel que par exemple méthoxyle, éthoxyle, isopropoxyle, trifluorométhoxyle, linoléoxyle, linolénoxyle, palmitoxyle. - des structures de radicaux de type céramide sont décrites notamment dans � Cosmetic Lipids and the Skin Barrier �, Thomas Fôrster Ed. 2002, Marcel Dekker, Inc., page 2, figure 2. - par naturel, il est entendu tout composé correspondant retrouvé dans le métabolisme des organismes du monde végétal, animal, ainsi que dans celui de l'homme (Steglich W., Rômpp Encyclopedia Naturel Products, G. Thieme ed.) - par oligomère, il est entendu tout composé constitué par l'enchaînement de 2 à 15 monomères reliés entre eux par l'intermédiaire d'une liaison de type ester. - par polymère, il est entendu tout composé constitué par l'enchaînement de plus de 15 monomères reliés entre eux par l'intermédiaire d'une liaison de type ester. Selon l'invention, lesdits composés de formule (I) sont préférentiellement utilisés sous forme de sels de calcium, de magnésium, ou de zinc, ce qui permet une meilleure solubilité dans les milieux de culture, ainsi qu'une meilleure assimilation par les microorganismes. L'invention vise plus particulièrement l'utilisation d'un composé de formule (I) choisi parmi : - l'acide L-2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, - l'acide D-2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, - l'acide DL-2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, ou un sel de ces composés. Ces composés sont décrits dans la demande WO 2006/008190. L'invention a également pour objet un microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium organique, susceptible d'être obtenu selon le procédé de l'invention. Un tel microorganisme présente généralement un contenu en sélénium organique supérieur à 1000 ppm, de préférence supérieur à 1200 ppm, plus préférentiellement supérieur à 1400 ppm, en équivalent sélénium, et un contenu en sélénium inorganique inférieur à 0,5 %, de préférence inférieur à 0,2 % et plus préférentiellement inférieur à 0,1 % en poids sec dudit microorganisme. L'invention vise plus particulièrement une levure du genre Saccharomyces enrichie en sélénium, caractérisée en ce qu'elle comprend une teneur en sélénométhionine supérieure à 130 microgrammes équivalent sélénium par gramme (pgSe/g), de préférence supérieure à 150 pgSe/g et plus préférentiellement supérieure à 170 pgSe/g en poids sec de ladite levure. La teneur en sélénium total et en sélénométhionine des microorganismes peut être déterminée respectivement par minéralisation et digestion enzymatique après centrifugation et lyophilisation des microorganismes, par exemple en suivant la méthode selon Lobinsky et al. décrite dans Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385 :168-180. Une levure selon l'invention peut s'avérer utile, par exemple, dans la fabrication de produits de boulangerie enrichis en sélénium mais aussi dans l'obtention de lait d'origine animale enrichi en sélénium organique, ou encore d'oeufs enrichis en sélénium organique. L'invention vise également une bactérie du genre Lactobacillus, caractérisée en ce qu'elle comprend une teneur en sélénométhionine supérieure à 50 pgSe/g, de préférence supérieure à 100 pgSe/g et plus préférentiellement supérieure à 500 pgSe/g en poids sec de ladite bactérie non-photosynthétique. Une telle bactérie peut s'avérer utile, par exemple, dans la fabrication de laits fermentés comme des fromages ou des yahourts, enrichis en sélénium. Les microorganismes non photosynthétiques selon l'invention peuvent également utiles en nutrition animale, notamment en vue de l'obtention à partir d'animaux, de dérivés secondaires enrichis en sélénium organique, comme par exemple du poisson, du lait ou des oeufs. L'invention vise également la fabrication de produits alimentaires, cosmétiques ou pharmaceutiques directement à partir des microorganismes enrichis en sélénium selon le procédé de la présente invention. Cette fabrication fait appel aux techniques connues de l'homme du métier. Selon un mode particulier de l'invention, on incorpore les microorganismes initialement enrichis en sélénium, vivants ou morts, en tant qu'additif dans une composition donnée. Les microorganismes ne participent pas dans ce cas nécessairement à la transformation biologique des ingrédients présents dans la composition. Selon un autre mode de l'invention, les microorganismes vivants ne sont pas préalablement enrichis en sélénium, mais enrichis au fur et à mesure du procédé de fabrication de la composition à partir d'un ou plusieurs composés de formule (I) tels que définis plus haut, selon le procédé de l'invention. Lesdits composés de formule (I) sont alors incorporés dans ladite composition avec les autres ingrédients et microorganismes non photosynthétiques. Les microorganismes non photosynthétiques peuvent alors opérer une bioconversion des composés de sélénium organique à l'intérieur même de la composition pour obtenir, par exemple, une pâte à pain dont les levures sont enrichies en sélénium ou encore un lait fermenté dans lequel les bactéries lactiques sont enrichies en sélénium. Le sélénium organique et produits dérivés ainsi obtenus sont utiles dans différentes applications, dont celles rappelées en préambule, notamment en tant qu'agent cosmétique, pharmaceutique ou nutritionnel. L'invention vise également les compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou nutritionnelles comprenant un ou plusieurs microorganismes enrichis en sélénium organique selon l'invention. L'invention vise encore un milieu de culture pour microorganisme non photosynthétique caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs des composés de formule (I) définis plus haut. Un tel milieu de culture est utile pour la mise en oeuvre du procédé d'enrichissement des microorganismes en sélénium organique selon l'invention. En particulier, l'invention vise un milieu de culture comprenant au moins un composé de formule (I), de préférence l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque ou l'un de ses sels, à une concentration comprise entre 0,5 et 2000 mg/L, de préférence entre 1 et 1000 mg/L, plus préférentiellement entre 2 et 500 mg/L, soit respectivement environ entre 0,2 et 800 mg/L dudit composé en équivalent sélenium, préférentiellement entre 0,4 et 400 mg/L dudit composé en équivalent sélenium, plus préférentiellement entre 0,8 et 200 mg/L dudit composé en équivalent sélenium. Un procédé de préparation de microorganisme non photosynthétique selon l'invention peut notamment comprendre une ou plusieurs des étapes suivantes : - préparer un milieu de culture, de préférence un milieu minimum, comportant les éléments chimiques nécessaires à la croissance dudit microorganisme non photosynthétique; - introduire dans le milieu de culture un composé de formule (I), préférentiellement de l'acide 2-hydroxy-4méthylséléno-butanoïque en tant que source organique de sélénium; - ajuster le pH du mélange à une valeur comprise entre 3 et 8; - mettre en culture un inoculum de pré-culture dudit microorganisme non photosynthétique dans le mélange ainsi constitué, à une température comprise entre 25 et 80°C, sous une agitation orbitale comprise entre 100 et 500 rpm, et une atmosphère pouvant contenir de 0 à 20% en oxygène et de 0,5 à 99 % en gaz carbonique, de préférence pendant 24 à 96 heures; - centrifuger le mélange entre 4000 et 10 000 rpm pendant quelques minutes; - reprendre le culot cellulaire dans de l'eau physiologique; - centrifuger à nouveau entre 4000 et 10 000 rpm pendant quelques minutes; - stériliser le culot cellulaire humide dans lequel se trouve le microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium ; Le culot cellulaire humide peut être lyophilisé ou séché à l'air. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Les exemples ci-après sont fournis uniquement à titre d'illustration et ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. EXEMPLES Exemple 1 : Production de la levure Saccharomyces cerevisiae dans un milieu YPG contenant de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque et dans un milieu YPG contenant du sélénite de sodium : Isolement de la souche de Saccharomvces cerevisiae 3053-E000 La souche a été isolée à partir d'un carré de 42g de levure de panification de la marque FALA BACKHEFE, d'un lot identifié avec une DLC 22/07/2007. Cette levure a été conservée au réfrigérateur à +4°C avant utilisation, puis elle a été reprise en milieu liquide YPG (Yeast Peptone Glucose). La souche de Saccharomyces cerevisiae: 3053-E000 a été obtenue par étalement sur milieu YPG en colonies isolées et mise en collection à -80°C avec ajout de 10% vol/vol de Glycérol comme agent cryoprotecteur. Composition du milieu YPG Yeast Extract 10g Peptone 20 g Glucose 20 g pH 7.0 Eau osmosée, qsp 1 L Dans les expérimentations décrites les caractéristiques de croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae 3053 E000 ont été mesurées en présence de différentes concentrations de sélénium sous la forme de sélénite de Sodium, de sélénométhionine, ou d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque et comparées aux caractéristiques de croissance en l'absence d'additifs (contrôle). La pré-culture de la souche Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 est 35 réalisée en milieu liquide YPG, à 37°C, sous agitation orbitale (250 rpm) pour une durée de 24h. 13 Conditions de culture de la souche Saccharomvces cerevisiae 3053-E000 La culture est réalisée à partir d'un inoculum (1.106 UFC/ml) de la pré-culture précédemment décrite dans 100 mL de milieu YPG, à pH = 4 à une température de 37°C sous agitation (250 rpm) et selon les conditions suivantes : Les cultures de Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 ont été suivies par des mesures d'absorbance à 550 nm et par des comptages CFU sur boites gélosés YPG. Addition de sélénium sous la forme de sélénite de sodium Les concentrations testées pour l'ajout de sélénite de sélénium sont de 0,5 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement : 1,1 mg/L, 22,22 mg/L et 44,44 mg/L de sélénite de sodium. Le graphique de la figure 1 permet de visualiser la croissance de la souche de S. cerevisiae 3053-E000 en présence des différentes concentrations de sélénite de sodium. Comme on peut l'observer, le sélénite de sodium commence à manifester un effet toxique à partir de 10 mg/L (en équivalent sélénium), affectant négativement la vitesse de croissance et le rendement obtenu en biomasse (- 50% en 48h). A une concentration de 20 mg/L (en équivalent sélénium), le sélénite de sodium se révèle très toxique pour Saccharomyces cerevisiae. Addition de sélénium sous la forme de sélénométhionine Les concentrations testées pour l'ajout de sélénométhionine sont respectivement de 0,5 mg/L, 2 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement 1,25 mg/L, 5 mg/L, 25 mg/L et 50 mg/L de sélénométhionine Le graphique de la figure 2 permet de visualiser la croissance de la souche de S. cerevisiae 3053-E000 en présence des différentes concentrations de sélénométhionine. Comme on peut l'observer, la sélénométhionine commence à manifester un effet à partir de 2 mg/L (en équivalent sélénium) affectant négativement le rendement obtenu en biomasse (- 29% en 48h). L'augmentation de la dose à 10 mg/L (en équivalent sélénium) produit des effets inhibiteurs plus importants sur la vitesse de croissance et le rendement biomasse (- 50%) sans affecter pour autant la viabilité (- 30%). Pour 20 mg/L de sélénométhionine (en équivalent sélénium), les effets sont similaires à ceux obtenus pour 10mg/L en ce qui concerne la vitesse et le rendement final en biomasse, l'effet toxique sur la viabilité se manifestant plus fortement (- 50%). Addition de sélénium sous la forme d'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque Les concentrations testées pour l'ajout selon l'invention d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque sont respectivement de 0,5 mg/L, 2 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement 1,25 mg/L, 5 mg/L, 25 mg/L et 50 mg/L d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (THD-177, Tetrahedron SAS, France, CAS :873660-49-2). Le graphique de la figure 3 permet de visualiser la croissance de la souche de S. cerevisiae 3053-E000 en présence des différentes concentrations d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque. Comme on peut l'observer, l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque commence à manifester un effet à partir de 10 mg/L (en équivalent sélénium) affectant négativement le rendement final en biomasse (-15%) et en réduisant la viabilité de 36%. Pour une concentration de 20 mg/L d'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque (en équivalent sélénium), le rendement en biomasse est réduit de 36% et la viabilité est réduite de 50%. Enrichissement en sélénium de S. cerevisiae Au vu des résultats obtenus précédemment pour la production de biomasse de la souche de S. cerevisiae 3053-E000, il a été procédé au choix d'un taux d'incorporation de 20 mg/L d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (en équivalent sélénium) et d'un taux d'incorporation de 10 mg/L de sélénite de sodium (en équivalent sélénium) dans les cultures décrites ci-après : Pré-cultures: à partir d'une culture saturée en YPG, il a été effectué deux étapes de pré-culture. Pré-culture 1: 10 mL de culture (taux inoculation 10% v/v à partir de la culture saturée, incubation 24h à 37°C) Pré-culture 2: 100 mL de culture (taux inoculation 10% v/v à partir de la pré-culture 1, incubation 24h à 37°C) Culture: à partir de la pré-culture 2, 1 L de milieu YPG est inoculé à un taux de 10% v/v. La culture est incubée à une température fixée et régulée à 37°C. Le pH est ajusté à 4 et la culture est mélangée par agitation orbitale (150 rpm). Préparation des échantillons pour analyses: Après 48 heures de culture, le milieu est centrifugé à 6500 rpm pendant 5 minutes, le culot cellulaire est repris dans de l'eau physiologique puis centrifugé à nouveau à 6500 rpm pendant 5 minutes. Le culot cellulaire humide est lyophilisé pour l'analyse des constituants séléniés (sélénium total, sélénométhionine et sélénite de sodium). Analyse des constituants séléniés de la levure Saccharomvces cerevisiae produite dans un milieu contenant de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque ou du sélénite de sodium Le sélénium total est dosé par ICP couplée à une détection par masse, après minéralisation de l'échantillon. La spéciation du sélénium est effectuée par chromatographie liquide haute performance couplée à une détection masse-masse, après digestion enzymatique de l'échantillon comme décrit par Lobinsky et al. (Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385 :168-180). Résultats Tableau 1 : Milieu de culture YPG initial Sélénium total Sélénométhionine (pg/mL) (pgSe/mL) 17,1 �0,2 0,95 �0,0825 Tableau 2 : Analyse des composants séléniés de la levure S.cerevisiae 3053-E000 produite sur milieu YPG avec additifs : Poids seca Sélénium Sélénométhionineb Sélénite b (g) totalb totale Témoin 4,8 0,17 � 0,053 � 0,006 Les résultats obtenus reportés dans les tableaux 1 et 2 ci-dessus montrent que l'incorporation d'acide 2-hydroxy-4-méthylséléno-butanoique 10 dans le milieu de culture permet d'enrichir par un facteur d'environ 3500 la teneur totale en sélénium de Saccharomyces cerevisiae, la sélénométhionine constituant 31% de ce sélénium total. Le sélénite de sodium permet d'avoir un facteur d'enrichissement supérieur, de l'ordre de 5000, mais la sélénométhionine ne représente que 14% de la teneur totale en sélénium. 15 Par ailleurs, la teneur résiduelle en sélénite, dans la levure Saccharomyces cerevisiae, liée à l'utilisation d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutyrique comme source de sélénium, est plus de 4 fois inférieure à celle correspondant à l'utilisation du sélénite de sodium comme source de sélénium. 20 L'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoique (THD-177) constitue donc bien une meilleure source de sélénium que le sélénite de sodium pour enrichir en sélénométhionine un microorganisme eucaryote tel que Saccharomyces cerevisiae, tout en diminuant de 400% le risque de toxicité liée à la teneur résiduelle en sélénite dans le microorganisme. 25 Exemple 2 : Production de la bactérie Lactobacillus paracasei dans un milieu MRS contenant de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (THD-177) et dans un milieu MRS contenant du sélénite de sodium 30 Isolement de la souche de Lactobacillus paracasei 3052 E000 La souche a été isolée à partir d'un tube d'ACTIMEL� commercialisé par la société Danone. Ce tube a été conservé au réfrigérateur à +4°C avant utilisation, puis 5 son contenu a été dilué dans 50 mL de milieu liquide MRS. La souche de Lactobacillus paracasei 3052-E000 a été obtenue par étalement sur milieu MRS en colonies isolées. Elle a été caractérisée sur Galerie API 50 CHL et mise en collection à -80°C avec ajout de 0% vol/vol de glycérol comme agent cryoprotecteur. 10 Polypeptone 10g Extrait de levure 5g Extrait de viande 10g Glucose 20g Phosphate dipotassique 2g Acétate de sodium 5g Citrate d'ammonium 2g Sulfate de magnésium 0,20g Sulfate de manganèse 0,05g Tween 80 1 ml pH 6,4 Dans cette expérimentation, les caractéristiques de croissance de la 25 bactérie Lactobacillus paracasei ont été mesurées en présence de différentes concentrations de sélénium sous la forme de sélénite de sodium, de sélénométhionine, de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque et comparées aux caractéristiques de croissance en l'absence d'additifs. 30 Pré-culture de la souche de Lactobacillus paracasei 3052 E000 La pré-culture de la souche Lactobacillus paracasei 3052-E000 est réalisée en milieu liquide MRS, à 42°C, sans agitation pour une durée de 24h. La culture de la souche Lactobacillus paracasei 3052-E000 a été 35 réalisée à partir d'un inoculum (1.10' UFC/ml) de la préculture ci-dessus Composition et préparation pour 1 L de milieu MRS : 15 20 dans 100 mL de milieu MRS, à pH = 6,4 et à une température de 42°C (sans agitation). Les cultures ont été suivies par des mesures en absorbance à 550 nm et sur comptage CFU réalisé sur boite MRS. Addition de sélénium sous la forme de sélénite de sodium Les concentrations testées pour l'ajout de sélénite sélénium sont respectivement de 0,5 mg/L, 2 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement 1,11 mg/L, 4,44 mg/L, 22,22 mg/L et 44,44 mg/L de sélénite de sodium Le graphique de la figure 4 permet de visualiser la croissance de la souche de L. paracasei 3052-E000 en présence de sélénite de sodium. Comme on peut l'observer, le sélénite de sodium commence à manifester un effet inhibiteur sur la croissance de Lactobacillus paracasei dès l'addition de 0,5 mg IL de sélénite de sodium (en équivalent sélénium), ainsi qu'une réduction de rendement de production de biomasse de 25% à 48h. Ces effets sont accentués avec l'addition de 2 mg/L de sélénite de sodium (en équivalent sélénium), pour atteindre une réduction de rendement atteignant 90% à 48h pour des concentrations de 10 et 20 mg/L de sélénite de sélénium (en équivalent sélénium). A ces niveaux, le sélénite de sodium manifeste une toxicité sur Lactobacillus paracasei. Addition de sélénium sous la forme de sélénométhionine Les concentrations testées pour l'ajout de sélénométhionine sont respectivement de 0,5 mg/L, 2 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement 1,25 mg/L, 5 mg/L, 25 mg/L et 50 mg/L de sélénométhionine Le graphique de la figure 5 permet de visualiser la croissance de la souche de L. paracasei 3052-E000 en présence des différentes 30 concentrations de sélénométhionine. L'addition de sélénium sous la forme de sélénométhionine ne montre pas d'effet inhibiteur sur la croissance, ni d'effet sensible de réduction du rendement de production de la biomasse jusqu'à 20 mg/L (en équivalent sélénium) sur Lactobacillus paracasei. 35 Addition de sélénium sous la forme d'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque Les concentrations testées pour l'ajout d'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque sont respectivement de 0,5 mg/L, 2 mg/L, 10 mg/L et 20 mg/L en équivalent sélénium, soit respectivement 1,25 mg/L, 5 mg/L, 25 mg/L et 50 mg/L d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (THD-177�, Tetrahedron SAS, France, CAS :873660-49-2). Le graphique de la figure 6 permet de visualiser la croissance de la souche de L. paracasei 3052-E000 en présence des différentes concentrations d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque. De manière similaire à l'addition de sélénométhionine, l'addition de sélénium sous la forme d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque ne montre pas d'effet inhibiteur sur la croissance ni d'effet sensible de réduction du rendement de production de la biomasse jusqu'à 20 mg/L d'acide 2- hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque (en équivalent sélénium). Afin de compléter l'étude d'impact de l'ajout de l'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, à des valeurs plus importantes, des concentrations de 40 et de 60 mg/L ont été testées dans les mêmes conditions que précédemment. De même que pour l'addition de 20 mg/L de sélénium sous forme d'acide 2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, aucun effet inhibiteur n'a été constaté sur la croissance et le rendement biomasse de la souche. Enrichissement en sélénium de Lactobacillus paracasei Au vu des résultats obtenus précédemment, il a été procédé au choix d'un taux d'incorporation de 60 mg/L d'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque (en équivalent sélénium) et d'un taux d'incorporation de 1 mg/L de sélénite de sélénium (en équivalent sélénium) pour la production de biomasse de la souche de Lactobacillus paracasei 3052-E000, Préparation des échantillons pour analyses : Après 48 heures de culture, le milieu est centrifugé à 6500 rpm pendant 5 minutes, le culot cellulaire est repris dans de l'eau physiologique puis centrifugé à nouveau à 6500 rpm pendant 5 minutes. Analyse des constituants séléniés de la levure Saccharomvces cerevisiae produite dans un milieu contenant de l'acide 2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque ou du sélénite de sodium Le sélénium total est dosé par ICP couplée à une détection par masse, après minéralisation de l'échantillon. La spéciation du sélénium est effectuée par chromatographie liquide haute performance couplée à une détection masse-masse, après digestion enzymatique de l'échantillon. Résultats Tableau 3 : Milieu de culture MRS initial Sélénium total Sélénométhionine (pg/mL) (pgSe/mL) 57 �1 11 �2 Tableau 4: Analyse des composants séléniés de la bactérie L.paracasei 3052-E000 produite sur milieu MRS avec additifs. Poids sec Sélénium Sélénométhionineb Sélénite b (g) totalb totale Témoin 1,1 0,18 � 0,02 0,108 � 0,006 Exemple 3: Préparation de levures enrichies sous forme de comprimés : Composition d'un comprimé non sécable: Levures enrichies en sélénium organique 75 pg' (préparées selon l'invention) Cellulose microcristalline qsp Silicium qsp Linoléate de magnésium qsp Phosphate dicalcique qsp Hydroxpropylmethylcellulose qsp Talc qsp Dioxyde de titane qsp 1 : équivalent sélénium Les ingrédients sont mélangés de façon à obtenir une pâte homogène, puis les comprimés sont obtenus selon la technique conventionnelle. Chaque comprimé non sécable contient 75 pg d'équivalent sélénium. Composition d'un comprimé sécable: Levures enrichies en sélénium organique 150 pg' (préparées selon l'invention) Cellulose microcristalline qsp Silicium qsp Linoléate de magnésium qsp Phosphate dicalcique qsp Hydroxpropylmethylcellulose qsp Talc qsp Dioxyde de titane qsp 1 : équivalent sélénium Les ingrédients sont mélangés de façon à obtenir une pâte homogène, puis les comprimés sont obtenus selon la technique conventionnelle. Chaque comprimé sécable contient 150 pg d'équivalent sélénium. REVENDICATIONS1. Procédé d'enrichissement d'un microorganisme non photosynthétique en sélénium organique caractérisé en ce que ledit microorganisme non photosynthétique est cultivé dans un milieu comprenant un composé de type séléno-hydroxyacide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de type séléno-hydroxyacide est de formule générale (I) telle que définie ci-après, un sel, ou un dérivé ester ou amide dudit composé On 0 (l Se R2 R1 (I) formule dans laquelle : n = 0, 1 ou 2; R~ = OH, OCOR3, OPO3H2, OPO3R4R5 ou OR6; R2 = OH, R3, NHR7, S-cystéinyle ou S-glutathionyle; étant entendu que lorsque n = 1 et R2 = OH, alors RI ne peut être OH ; R3 = alkoxyle, S-cystéinyle, S-glutathionyle, ou un groupe choisi parmi les suivants :OH \1, COGH h, OH o OH HeO HeO OR4 = aikoxyle (C1-C26), ou un groupe choisi parmi les suivants : on OH COOH Ho on Ne. ou NeoOR5 = alkoxyle (C1-C26), ou un groupe choisi parmi les suivants : OH OH t,H, H. OH,)12 on, OH HO 0 L HC Me(os . OR6 = pyruvate, lactate, citrate, fumarate, maléate, myristate, palmitate, stéarate, palmitoléate, oléate, linoléate, acides gras naturels ou 13-cis rétinoate ; R7 = H, alkyle (C1-C26), un amino-acide naturel ou une amine naturelle. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit composé de formule (I) est pris parmi : - l'acide L-2-hydroxy-4-méthylsélénobutanoïque, - l'acide D-2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque, - l'acide DL-2-hydroxy-4- méthylsélénobutanoïque, ou l'un de ses sels. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que lesdits composés de formule (I) sont sous forme de sels de calcium, de zinc ou de magnésium. . Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le microorganisme non photosynthétique est sélectionné parmi une levure ou une bactérie non photosynthétique. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme non photosynthétique est une levure du genre Saccharomyces. 7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le microorganisme non photosynthétique est une bactérie du genre Lactobacillus. 8. Un microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium organique susceptible d'être obtenu selon le procédé des revendications 1 à 7. 9. Levure enrichie en sélénium organique susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une teneur en sélénométhionine supérieure à 130 pgSe/g, de préférence supérieure à 150 pgSe/g et plus préférentiellement supérieure à 170 pgSe/g en poids sec de ladite levure. 10. Levure enrichie en sélénium organique selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est du genre Saccharomyces. 11. Bactérie non-photosynthétique enrichie en sélénium organique susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend une teneur en sélénométhionine supérieure à 50 pgSe/g, de préférence supérieure à 100 pgSe/g et plus préférentiellement supérieure à 500 pgSe/g en poids sec de ladite bactérie non-photosynthétique. 12. Bactérie non-photosynthétique enrichie en sélenium organique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est du genre Lactobacillus. 13. Bactérie non photosynthétique ou Levure enrichie en sélénium organique selon des revendications 9 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, moins de 0,5 %, préférentiellement moins de 0,2 % et plus préférentiellement moins de 0,1 % en poids sec de sélénium inorganique.14. Utilisation d'un microorganisme non photosynthétique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, en tant que produit cosmétique ou nutritionnel. 15. Composition comprenant un microorganisme non photosynthétique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 16. Composition pharmaceutique comprenant au moins un microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium organique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 17. Composition nutritionnelle comprenant au moins un microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium organique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 18. Composition cosmétique comprenant au moins un microorganisme non photosynthétique enrichi en sélénium organique selon l'une quelconque des revendications 8 à 13. 19. Un milieu de culture pour microorganisme non photosynthétique caractérisé en ce qu'il comprend un composé de type séléno-hydroxyacide de formule (I) tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 4.