Brevet FR2945537A1 — publié le 20101119

Composés augmentant la sécrétion d'au moins une mucine gastro-intestinale La présente invention a pour objet des composés permettant d'induire une augmentation de la synthèse d'au moins une mucine gastro-intestinale. Le mucus gastro-intestinal est connu pour son rôle dans la protection de la surface de l'épithélium du tractus gastro-intestinal. Cette protection permet de lutter contre les agressions telles que l'acide, les enzymes digestives, les toxines, ou l'alcool, et constitue également une barrière naturelle contre certains types de pathogènes (Deplancke et al. (2001) Am J Clin Nutr 73(6) :1131S-1141S). Des défauts dans l'établissement de ce mucus sont donc à l'origine de nombreuses pathologies dues en particulier à une inflammation des muqueuses gastriques et intestinales (Gibson et al. (2005) Gut 54:900-903, Einerhand et al. (2002) Eur J Gastroenterol Hepatol 14(7):757-65). Les principaux composants du mucus sont des glycoprotéines de la famille des mucines. Il s'agit de polymères de grandes tailles, composés de monomères de glycoprotéines hautement glycosylées. Quatre membres de cette famille sont connus pour être impliqués dans la formation du gel de mucus : MUC2, MUC5AC, MUC5B et MUC6 (Desseyn et al. (2000) Mol Biol Evol 17(8) :1175-84). Un second groupe de mucines associées à la membrane, auquel appartiennent MUC1, MUC3 et MUC4, joue également un rôle dans la protection de l'épithélium. MUC2 est la principale mucine présente dans le mucus intestinal. Il a été montré récemment que l'invalidation du gène muc2 chez la souris se traduit par l'apparition de colites et de tumeurs intestinales (Velcich et al. (2002) Science 295(5560)1 726-9). Des modifications de l'expression de cette mucine ont également été observées lors de maladies inflammatoires intestinales. La mucine MUC2 est produite et secrétée par des cellules épithéliales spécialisées : les cellules à mucus ou cellules caliciformes. Peu d'éléments sont connus à l'heure actuelle sur la régulation de la sécrétion et de l'expression des mucines gastro-intestinales par les facteurs nutritionnels. Certains travaux ont permis de caractériser l'effet sécrétagogue de fibres alimentaires et d'acides gras à chaîne courte (Lundin et al. (1993) Scand J Gastroenterol 28(1) :15-22, Sharma et al. (1995) Dig Dis Sci 40(12) :2532-9, Sharma et al. (1995) Lab Invest 73(4) :558-64, Barcelo et al. (2000) Gut 46(2) :218-24, Satchithanandam et al. (1990) J Nutr 120(10) :1179-84, Burger-van Paasen et al. (2009) Biochem J. Feb 2009 DOI BJ20082222, Hedemann et al. (2009) Brit J Nutr, 13:1-9). Plus récemment, des travaux ont porté sur l'effet des [3-casomorphines sur la sécrétion des mucines. Les [3-casomorphines sont une famille de peptides opioïdes exogènes (exorphines) issus de l'hydrolyse d'une protéine de lait, la caséine [3 (ou (3-caséine). Ces peptides sont libérés durant les différentes étapes de la digestion des protéines du lait dans l'estomac et l'intestin grêle et seraient capables de traverser les monocouches de cellules intestinales (Meisel et al. (2000) BR J Nutr 84(Suppl 1) :S27-31, Sienkiewicz-Szlapka et al. (2009) Int Dairy J 19 :252-257). Ils sont également libérés lors de la fermentation des produits laitiers. Des précurseurs des [3-casomorphines ont ainsi été identifiés dans les produits fermentés et notamment dans le yaourt et le fromage (Schieber et al. (2000) Eur Food Res Technol 210 :310-13, Sienkiewicz-Szlapka et al. (2009) !nt Dairy J 19 :258-263). Le principal représentant de cette famille, la [3-casomorphine-7 correspond au fragment [60-66] de la [3-caséine bovine. Il a été montré que la [3-casomorphine 7 est un puissant sécrétagogue du mucus ex vivo dans le jéjunum de rat (Trompette et al. (2003) J Nutr 133(11) :3499-503, Claustre et al. (2002) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 283(3) :G521-8) et qu'elle induit in vitro l'augmentation de l'expression de la principale mucine sécrétée MUC2 dans la lignée colique mucipare de rat (DHE) (Zoghbi et al. (2006) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290(6) :G1105-13). En 1999, un nouveau peptide opiacé a été identifié dans la séquence de la caséine [3 bovine, la séquence [114-119], appelé néocasomorphine-6 (Jinsmaa et al. (1999) Peptides 20 :957-962). Toutefois, ce composé est dépourvu d'effet inducteur de la sécrétion des mucines gastro-intestinales. Description de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, de ce qu'un nouveau peptide issu de la caséine [3 bovine, correspondant aux résidus 94-123 (SEQ ID NO : 1) de cette protéine, est un stimulant de l'expression des mucines gastro-intestinales. Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide comprenant ou constitué de : - SEQ ID NO : 1, ou - une séquence homologue présentant au moins 80%, de préférence au moins 90%, plus préférablement au moins 95%, d'identité avec SEQ ID NO : 1, ou - une séquence d'au moins quatre acides aminés consécutifs comprise dans SEQ ID NO :1, qui présente un effet d'induction de l'expression d'au moins une mucine gastro-intestinale, et sous réserve que le polypeptide ne comprenne pas la séquence SEQ ID NO : 2. De préférence le polypeptide tel que défini ci-dessus est constitué de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO : 2 correspond à la séquence constituée des acides aminés 60 à 66 de la caséine bovine. On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polypeptidiques le pourcentage d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer. Les comparaisons entre deux séquences polypeptidiques sont généralement réalisées après avoir aligné ces deux séquences de manière optimale. Cet alignement peut être réalisé manuellement ou à l'aide d'un programme informatique. A titre d'exemple de programme informatique, on peut citer le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) avec l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Kruskal (1983) An overview of sequence comparison ln D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed)). Comme on l'entend ici, le nombre de positions pour lesquelles les acides aminés sont identiques est ensuite divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus grande des deux séquences comparées et le pourcentage d'identité est obtenu en multipliant le résultat obtenu par 100. Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 90% avec le polypeptide de SEQ ID NO : 1 est un polypeptide comportant, au plus, 3 acides aminés modifiés sur 30 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 10% des acides aminés dans la séquence SEQ ID NO : 1 peuvent être supprimés ou substitués par un autre acide aminé ou la séquence peut comporter jusqu'à 10% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, la séquence d'au moins quatre acides aminés comprend au moins 4, 5, 10, 20 ou 25 acides aminés consécutifs compris dans SEQ ID NO :1. Comme on l'entend ici la séquence homologue peut comprendre à la fois les variants naturels de la séquence SEQ ID NO : 1 ainsi que des mutants artificiels. Par ailleurs, le polypeptide défini ci-dessus peut être modifié, par exemple par le remplacement d'au moins un acide aminé L par un acide aminé D ou par une modification de la nature chimique d'au moins un acide aminé. Ces modifications, ainsi que les mutations artificielles, sont notamment utiles pour augmenter la stabilité du peptide dans l'environnement gastrique et intestinal, en particulier pour augmenter la stabilité des peptides vis-à-vis des protéases et peptidases digestives telles que la trypsine, la chymotrypsine et la pepsine. L'expression de mucines gastro-intestinales peut être déterminée de manière aisée par des méthodes bien connues de l'homme du métier comme cela est notamment décrit par El Homsi et al. ((2007) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 293(1):G365-73), Radhakrishnan et al. ((2007) Biochim Biophys Acta 1770(6):884-9) et Lu et al. ((2005) Am J Physiol Lung Cet/ Mol Physiol 288(1):L52- 60)) et en particulier comme cela est décrit dans I' Exemple 2 suivant. A titre d'exemple, l'expression d'au moins une mucine gastro-intestinale peut être notamment déterminée in vitro en quantifiant l'ARNm d'au moins une mucine ou la quantité d'au moins une protéine de mucine produite par des cellules mucosécrétantes. Les cellules mucosécrétantes utilisées sont de préférence des cellules mucosécrétantes intestinales telles que des cellules de la lignée cellulaire humaine HT29-MTX ou HT29-CI16E. L'expression déterminer � l'expression d'au moins une � mucine indique que l'expression d'une, de deux, de trois mucines ou plus peut être déterminée. De préférence, la ou les mucines dont l'expression est déterminée sont sélectionnées parmi les mucines intestinales MUC2, MUC3 et MUC4 ou gastro-intestinales MUC5AC et MUC6. De préférence, l'effet d'induction de l'expression d'au moins une mucine gastro-intestinale correspond à une augmentation de l'expression d'au moins une de ces mucines d'au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% par rapport à l'expression obtenue en absence de peptide. De préférence également, l'effet d'induction de l'expression d'au moins une mucine gastro-intestinale correspond à une augmentation de l'expression d'au moins une de ces mucines d'au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% par rapport à l'expression obtenue avec un polypeptide constitué de SEQ ID NO : 1 mesurée dans les mêmes conditions. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne le polypeptide tel que défini ci-dessus pour son utilisation comme médicament, de préférence pour le traitement de patients présentant un défaut de production de mucines gastro-intestinales. Les pathologies liées à un défaut d'expression ou de sécrétion de mucines gastro-intestinales comprennent toutes les pathologies directement ou indirectement liées à une absence ou à une insuffisance de l'expression de mucines. De telles pathologies sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans Turner et al. (2003) Cancer Chemother Biol Response Modif 21:259-74), Utsunomiya et al. (1998) Clin Cancer Res 4:2605-14 et Nakamori et al. (1994) Gastroenterol 106:353-361. De préférence, les pathologies liées à un défaut d'expression ou de sécrétion de mucines gastro-intestinales sont sélectionnées dans le groupe constitué d'inflammations intestinales notamment chroniques, d'infections intestinales, d' ulcères gastriques et duodénaux, notamment dus à une infection à Helicobacter pylori, des cancers intestinaux et coliques et des mucites induites par la radiothérapie ou la chimiothérapie. Le traitement selon l'invention peut être administré à la suite de l'apparition de ces désordres ou de façon préventive. Le traitement selon l'invention peut être administré aux animaux, en particulier aux mammifères, et notamment l'Homme. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide tel que défini ci-dessus à titre de substance active, en association avec des excipients ou véhicules pharmaceutiquement acceptables et, éventuellement, à des matrices à libération soutenue comme, par exemple, des polymères biodégradables pour former des compositions thérapeutiques. Le terme "pharmaceutiquement acceptable" se rapporte à des molécules et compositions qui n'induisent pas une réaction adverse, allergique ou non désirée lorsqu'elles sont administrées à un mammifère, en particulier à un humain. Un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou excipient peut être un solide ou un semi-solide, un liquide, un diluant, un matériel encapsulé ou n'importe quelle autre formulation accessoire. La forme de la composition pharmaceutique, le mode d'administration, le dosage et la posologie dépendent bien sûr, entre autres, de la maladie à traiter, de sa sévérité, de l'âge, du poids et du sexe du patient. La composition pharmaceutique selon l'invention est préférentiellement formulée de façon à pouvoir être administrée par voie orale ou entérale. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être une composition alimentaire. La présente invention concerne donc également l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'une composition alimentaire, de préférence une composition alimentaire lactée. Ce type de composition alimentaire peut notamment être qualifié d'alicament ou de nutraceutique. La présente invention concerne également une composition alimentaire lactée ou non lactée, préférentiellement lactée, comprenant un polypeptide tel que défini ci-dessus préférentiellement à la concentration d'au moins 7 pM, encore préférentiellement supérieure à 10 pM et de préférence inférieure à 15 pM, encore de préférence inférieure à 20 pM. Les polypeptides selon l'invention peuvent êtres obtenus par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. Ainsi, les polypeptides peuvent être synthétisés au préalable, par exemple par voie chimique ou par production par une bactérie recombinante capable de synthétiser un tel polypeptide. De façon préférentielle, de telles bactéries sont capables de synthétiser et de secréter les peptides d'intérêt. Les peptides obtenus sont alors extraits du surnageant de la culture bactérienne. Alternativement ou de manière complémentaire, la présence du polypeptide, tel que défini ci-dessus dans les compositions alimentaires de l'invention, peut être due à la dégradation de la caséine f3 bovine par l'action de bactéries fermentatives. La présente invention concerne donc également un procédé de préparation d'un produit lacté fermenté par au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et/ou au moins une souche de Streptococcus salivarus spp. thermophilus comprenant une étape de détermination de la concentration d'un polypeptide tel que défini ci-dessus. De préférence, le procédé est tel qu'on laisse agir la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et/ou la souche de Streptococcus salivarus spp. thermophilus jusqu'à ce qu'une valeur prédéterminée de la concentration du polypeptide soit atteinte. Les méthodes de fermentation des produits lactés, tels que yaourts et fromages, sont bien connues de l'homme du métier. Les ferments lactiques pouvant être couramment utilisés reposent notamment sur l'association d'une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et/ou d'une souche de Streptococcus salivarus spp. thermophilus. Description des figures FIG. 1 : Profils obtenus en RP-HPLC pour le pool peptidique total issus du yaourt du commerce (noté pool peptidique C) et les différentes fractions obtenues à partir de ce pool peptidique (notées C2 à C5). La fraction Cl était retrouvée en trop faible quantité pour être analysée. FIG. 2 : Profils obtenus en RP-HPLC pour le pool peptidique total issus du yaourt préparé au laboratoire (noté pool peptidique F) et les différentes fractions obtenues à partir de ce pool peptidique (notées F2 à F5). La fraction F1 était retrouvée en trop faible quantité pour être analysée. FIG. 3 : Effet du pool peptidique total du yaourt du commerce testé aux concentrations Y/5, Y/2 et Y (horizontalement) sur la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation: CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p FIG. 4 : Effet du pool peptidique total du yaourt du commerce testé aux concentrations Y, Y12 et Y/5 (horizontalement), sur l'expression des gènes muc2, muc4 et muc5AC par la lignée HT29-MTX après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation: CT (verticalement). FIG. 5 : Effet des différentes fractions C2 à C5, à la concentration Y, issues du yaourt du commerce (horizontalement) sur la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation: CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p FIG. 6 : Effet de différentes concentrations (Y/5, Y/2, Y) de la fraction C2 issue de yaourt du commerce (horizontalement) sur la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX, après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation: CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p FIG. 7 : Effet de différentes concentrations (Y/5, Y/2, Y) de la fraction C2 issue du yaourt du commerce (horizontalement) sur l'expression du gène muc4 par la lignée HT29-MTX après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation : CT (verticalement). FIG. 8 : Effet de différentes concentrations (Y/5, Y/2, Y) de la fraction C2 issue du yaourt du commerce (horizontalement) sur l'expression du gène muc2 par la lignée HT29-MTX après 4 h de stimulation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence de stimulation : CT (verticalement). FIG. 9 : Effet sur la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX après incubation de 10 minutes avec du cyprodime, après incubation pendant 10 minutes avec du cyprodime suivi de 4 h de stimulation avec de la fraction C2 (à la concentration Y) ou après une stimulation de 4 h avec de la fraction C2 (à la concentration Y) (horizontalement) exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX en absence de cyprodime et de fraction C2. * correspond à une probabilité p FIG. 10: Effet de différentes concentrations (10"6M, 10-5M, 10-4M) du peptide [94-123] (horizontalement) sur la sécrétion de mucines par la lignée HT29-MTX, après 4 h d'incubation, exprimé en pourcentage de la sécrétion de mucines en absence d'incubation : CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p FIG. 11 : Effet de différentes concentrations (10"6M, 10-5M, 10-4M) du peptide [94-123] (horizontalement) sur l'expression du gène muc2 par la lignée HT29-MTX après 4 h d'incubation, exprimé en pourcentage de l'expression du gène muc2 en absence d'incubation : CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p FIG. 12: Effet de différentes concentrations (10"6M, 10-5M, 10-4M) du peptide [94-123] (horizontalement) sur l'expression du gène muc4 par la lignée HT29-MTX après 4 h d'incubation, exprimé en pourcentage de l'expression du gène muc4 en absence d'incubation : CT (verticalement). Le symbole étoile (*) correspond à une probabilité p EXEMPLES, EXEMPLE 1 : La protéolyse des caséines par les bactéries lactiques du yaourt entraîne la formation de précurseurs de peptides bioactifs à activité opiacée. MATERIEL ET METHODE Culture de ferments lactiques Les ferments lactiques utilisés industriellement pour la production de yaourt reposent toujours sur l'association en culture mixte d'une souche de Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus avec une souche de Streptococcus salivarius spp. thermophilus, issues de collections à la disposition des fabricants. Les souches de ferments lactiques (Syndifrais) conservées à -18`C étaient revivifiées et repiquées à plusieurs reprises. La souche de Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus était cultivée à 43CC en anaérobie sur milieu MRS (De Man , Rogosa, Sharpe) liquide pH 5,4 tandis que la souche de Streptococcus salivarius spp. thermophilus était cultivée à 43CC en anaérobie sur milieu M17 liquide . La pureté des souches était contrôlée par la réalisation d'isolements (méthode des quadrants, Norme FIL 146 :1991). Le suivi de la population bactérienne était effectué via des dénombrements (Norme FIL 117B :1997) sur gélose MRS pH 5,4 pour L. bulgaricus et sur gélose M17 lactose pour S. thermophilus. La veille de la préparation de yaourt, des dilutions (en eau peptonée) de chacune des souches étaient ensemencées dans 10 ml de lait autoclavé. Après incubation 1 nuit à 43'C, la dilution n'ayant pas provoqué la coagulation du lait était choisie comme pré-culture. Fermentation du lait par culture mixte Yaourt préparé au laboratoire : 100 ml de lait UHT écrémé du commerce additionnés de 2 % (plp) de poudre de lait écrémé Ultra Low Heat (INRA Rennes) étaient incubés 45 min à 37`C sous agitation, puis subissaient un traitement thermique de 10 min à 90cC. Après une redescente en température à 43CC, le lait était ensemencé par 2 g de préculture de chacun des ferments. Le milieu était ensuite incubé à 43`C jusqu'à atteindre un pH de 4, 9 û 4,5 au bout de 2 à 5 h. L'acidification du milieu était suivie au pH-mètre (poste multiple, CINAC) et un dénombrement bactérien était effectué à t0 (inoculation) et à tf. Le yaourt obtenu était stocké à 4`C et l'évolution de la protéolyse était suivie par dosage de la MAT (Matière Azotée Totale) et par RP-HPLC analytique (Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography) jusqu'à 3 semaines de stockage (prélèvements à 24 h, au 10ème jour et au 20ème jour). Yaourt du commerce : le yaourt du commerce utilisé était un yaourt nature dont les valeurs nutritionnelles moyennes pour 100 g de produit étaient les suivantes (indications fabricant) : 4,1 % de protéines, 5,5 % de glucides, 1 % de lipides. En conditions standard, ce type de yaourt est issu de la fermentation par les bactéries lactiques d'un lait supplémenté en protéines et traité thermiquement dont la teneur en matière grasse a été ajustée. Obtention du pool peptidique total du yaourt Le yaourt était homogénéisé manuellement puis centrifugé 30 min à 5000 g à température ambiante. Le surnageant obtenu était ensuite filtré sur papier Whatman n° 41. A ce stade, une précipitation sélect ive des protéines du surnageant était obtenue par l'ajout de TCA (acide trichloroacétique) à 2 % final, ceci afin d'éliminer les protéines du lactosérum (majoritairement [3-lactoglobuline et a-lactalbumine). Après 30 minutes, une centrifugation de 10 min à 5000 g permettait d'obtenir le surnageant correspondant au pool peptidique total du yaourt. Une étape finale de dialyse extensive contre de l'eau désionisée (tubes SpectraPor, membrane en ester de cellulose, seuil de coupure 500 Da) permettait d'éliminer le lactose, le TCA et de diminuer la force ionique des échantillons en vue de la culture cellulaire. Obtention des fractions peptidiques du yaourt Les fractions peptidiques du yaourt ont été obtenues par RP-HPLC préparative. Préalablement à l'injection, les pools peptidiques totaux étaient filtrés sur 1,2 pm et la colonne était équilibrée pendant 30 min avec du tampon A. La colonne utilisée était une colonne préparative (250 x 50 mm) contenant un support greffé en C18 (C18, LiChrospher RP18, 12 pm, Merck). Le tampon A était constitué de TFA 1,06 %o (acide trifluoroacétique) dans de l'eau milliQ et le tampon B de TFA 1 %o dans de l'acétonitrile à 80 %. Après 18 min d'élution en isocratique sous tampon A, l'élution était réalisée à 45 ml/min en 4 plateaux d'élution successifs de 8 min à 15 %, 30 %, 45 % puis 60 % de tampon B. Un plateau final de 20 min à 100 % de tampon B terminait le gradient. La détection était réalisée à 214 nm, avec une collecte manuelle des fractions. Après 2 injections de 60 ml d'échantillon, les fractions correspondantes étaient poolées puis évaporées sous vide (Rotavapor, Buchi) afin d'éliminer l'acétonitrile et la majorité de l'eau. Les échantillons étaient ainsi concentrés jusqu'à l'obtention d'environ 10 ml de produit, ajustés à pH 7 avec de l'ammoniaque (25 %) puis lyophilisés. Caractérisation des peptides du yaourt - Dosage de la matière azotée totale (MAT) par micro-Kjeldhal Le dosage de la MAT était réalisé par la méthode de Kjeldhal (Ogg (1960) J. Assoc. Off. Anal. Chem. 43:689-694) appliquée à l'analyse des petits volumes soit 500 pI. Une gamme étalon de sulfate d'ammonium était réalisée pour chaque analyse. Les résultats étaient exprimés en mg d'azote/ml. Les échantillons sont analysés en dupliquas. Le taux optimal de récupération de l'azote se situait entre 97 et 99 %, caractérisé par une très bonne reproductibilité. - Chromatographie liquide haute performance en phase inversée (RP-HPLC analytique) La chromatographie était réalisée sur une chaîne Waters (Waters alliance). L'absorbance était suivie à 214 et 280 nm. Les colonnes utilisées étaient une Symmetry C18 (150 X 2,1 mm) pour l'analyse des peptides et une Vydac C4 (150 x 4,6 mm) pour l'analyse des protéines. Pour l'analyse sur Vydac C4, les échantillons étaient préalablement traités au DTT (Dithiotreitol, Sigma). L'élution était réalisée à 40t après injection de 100 pI d'échantillon. Le tampon A était constitué de TFA 1,06 %o dans de l'eau milliQ et le tampon B de TFA 1 %o dans de l'acétonitrile à 80 %. - Nano-chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (Nano-LC-MS/MS) Pour l'analyse en spectrométrie de masse (QSTAR XLR, Applied Biosystems), les échantillons préalablement préparés pour la RP-HPLC étaient dilués 20 fois dans du TFA 1 %o puis 5 pl étaient injectés à 200 nl/min pour l'analyse. La colonne utilisée (diamètre interne 75 pm, longueur 15 cm) était remplie avec une phase inverse C18. Les séquences en acides aminés des peptides étaient déterminées grâce aux bases de données accessibles via Internet (Mascot).30 RESULTATS Protéolyse dans le yaourt - Evolution du pH L'association des deux ferments Streptococcus salivarius spp. Thermophilus et Lactobacillus delbrueckii spp. Bulgaricus provoque une acidification rapide du milieu qui atteignait des pHs autour de 4,9 et 4,5 après respectivement 3 et 4 h d'incubation. - Evolution de la MAT Un lait UHT écrémé du commerce supplémenté par 2 % de poudre de lait écrémé Ultra Low Heat (INRA Rennes) était utilisé pour la préparation de yaourt. Les yaourts obtenus étaient stockés à 4'C et l'évol ution de la protéolyse était suivie pendant 3 semaines grâce à des dosages à 24 h, 10 jours et 20 jours de stockage. Une augmentation moyenne de 0,5 % des valeurs de MAT était observée au cours des 3 semaines de stockage. Cependant le suivi des échantillons par HPLC analytique effectué en parallèle montre qu'aucun changement n'intervient sur le plan qualitatif. Identification du pool peptidique du yaourt - Préparation et caractérisation par RP-HPLC La combinaison des techniques de précipitation sélective au TCA 2 %, de dialyse sur membrane de 500 Da et de chromatographie a permis d'isoler et de purifier le pool peptidique à partir du milieu complexe qu'est le yaourt. Ce pool peptidique résultait de la protéolyse réalisée dans le yaourt par les ferments lactiques. Il était caractérisé par RP-HPLC, avec une élution selon une échelle d'hydrophobicité croissante obtenue grâce à un gradient linéaire d'acétonitrile. Yaourt du commerce : Le profil d'élution du pool peptidique issu du yaourt du commerce était déterminé par RP-HPLC (indiqué par Pool peptidique C dans la FIG. 1). La première moitié du chromatogramme ainsi que les massifs retrouvés entre 40 et 53 min d'élution sont de nature peptidique. Le pic élué à 62 min est le résidu de R-lactoglobuline présent initialement dans le milieu avant l'étape de précipitation au TCA 2 %. Yaourt préparé au laboratoire : Le profil d'élution du pool peptidique issu du yaourt préparé au laboratoire était déterminé par RP-HPLC (indiqué par Pool peptidique F dans la FIG. 2). L'intensité des pics obtenus reflétait un plus faible contenu en peptides dans ce yaourt lorsqu'on le compare au yaourt du commerce. Ce résultat concorde avec la protéolyse plus faible mesurée par la MAT dans le yaourt préparé au laboratoire. Le yaourt préparé au laboratoire possédait en outre une texture plus visqueuse que celle du yaourt du commerce. Cette caractéristique peut être due au fait que la souche de Lb. bulgaricus employée se soit révélée productrice d'exopolysaccharides. Identification des peptides par nano-LC-MS/MS Yaourt du commerce : Une bonne centaine de peptides ont pu être identifiés dans le yaourt du commerce. La majorité, soit environ une soixantaine, provient de la caséine [3, environ 20 peptides sont issus de la caséine x, 15 peptides proviennent de la caséine as, et 5 peptides sont issus de la caséine as2 Plusieurs peptides potentiellement porteurs d'activité opiacée ont été identifiés parmi lesquels un certain nombre de peptides de la caséine p : 8 peptides contiennent la séquence Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile de la [3-casomorphine-7 (fragment [60-66] de la caséine [3) considérés comme des pro-[3- casomorphines en raison de la présence du motif Tyr-X(n)-Phe ; 6 peptides contiennent la séquence Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr correspondant au fragment [114-120] de la caséine [i. Cette séquence opioïde [114-120] issue de la caséine (3, a été identifiée en 1999 (Jinsmaa et al. (op. cit.)). II faut aussi souligner que parmi les peptides identifiés issus de la caséine [3, plusieurs autres sont des précurseurs de peptides bioactifs notamment des séquences contenant la séquence Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg dotée d'activité d'inhibition de l'enzyme de conversion de l'angiotensine I (ACE), et donc potentiellement d'activité antihypertensive. Région de la caséine [3 Peptides identifiés Pro-(3-casomorphine 54-65 (60-66) 57-68 57-72 57-77 57-91 57-93 59-72 Opioïde 94-123 (114-120) 100-123 102-123 106-119 106-123 108-123 Tableau 1 : Peptides identifiés par nano-LC-MSIMS dans le pool peptidique du yaourt du commerce. Yaourt préparé au laboratoire : A l'instar du yaourt du commerce, la majorité des peptides retrouvés dans le yaourt préparé au laboratoire est issue de la caséine [3 soit 55 peptides, tandis qu'une trentaine sont issus de la caséine asi, une dizaine de la caséine as2 et 2 de la caséine K. Plusieurs précurseurs de peptides opiacés sont également identifiés dans le yaourt préparé au laboratoire (Tableau 2) dont 7 peptides considérés comme des pro-[3-casomorphines couvrant la région 60-66 de la caséine [3 et 15 peptides contenant le fragment potentiellement opioïde [114-120] de la caséine [3. De nombreuses séquences pro-hypertensives sont aussi retrouvées dans le yaourt du laboratoire. Région de la caséine R Peptides identifiés Pro-[3-casomorphine 53-72 (60-66) 57-68 57-72 57-77 57-87 57-91 59-91 Opioïde 92-123 (114-120) 94-119 94-123 98-119 97-123 100-119 100-123 101-119 101-123 102-119 102-123 103-119 103-123 106-123 108-123 Tableau 2: Peptides identifiés par nano-LC-MS/MS dans le pool peptidique du yaourt préparé au laboratoire. Pour ces deux types de yaourt, on constate une coupure spécifique après la glutamine en position 123 dans la séquence de la caséine P. Cette coupure est liée à la protéase de paroi de type PIII qui hydrolyse la caséine f3 de manière spécifique après la glutamine en position 123 et qui est retrouvée notamment chez Lactococcus lactis subsp. Cremoris (Visser et al. (1991) Appt Microbiol Biotechnol. 35(4):477-83. Les systèmes protéolytiques des lactocoques (modèle Lactococcus lactis subsp. cremoris) et des lactobacilles (modèle Lb. delbrueckii) sont très proches et expliquent donc l'hydrolyse de la liaison 123-124. Dans le yaourt, on peut donc supposer que Lb. bulgaricus, doté d'une activité protéasique supérieure à celle de S. thermophilus, est responsable de cette spécificité de coupure. Isolement de fractions peptidiques - Préparation et caractérisation par RP-HPLC préparative Les fractions peptidiques du yaourt ont été obtenues par RP-HPLC préparative à partir des pools peptidiques totaux comme décrits dans la partie Matériel et Méthodes. Fractions issues du yaourt du commerce : 5 fractions ont été obtenues à partir du pool peptidique (FIG. 1). Ces fractions ont dénommées Cl à C5. La fraction Cl, éluée pendant le premier plateau à 15 % de tampon B, n'a pu être testée sur le plan biologique car recueillie en trop faible quantité. Les fractions C2, C3, C4 et C5 étaient éluées respectivement à 30, 45, 60 et 100 % de tampon B. Fractions issues du yaourt préparé au laboratoire : 5 fractions ont été obtenues à partir du pool peptidique (FIG. 2). De la même manière que pour Cl dans le yaourt du commerce, la fraction FI éluée pendant le plateau à 15 % de tampon B n'a pas pu être testée car récupérée en trop faible quantité. Les fractions F2, F3, F4 et F5 sont respectivement éluées au cours des plateaux à 30, 45, 60 et 100 % de tampon B. - Identification des peptides par nano-LC-MS/MS Fractions issues du yaourt du commerce : Les peptides d'intérêt identifiés dans les fractions C2, C3 et C4 sont présentés en tableau 3. Trois peptides contenant la séquence [114-120] de la caséine [3 sont identifiés dans la fraction C2 dont le peptide [94-123]. La fraction C3 contient 6 précurseurs de la séquence [114-120] de la caséine R ainsi que 3 pro-[i-casomorphines, de séquences [57-68], [57-72] et [59-72]. La fraction C4, quand à elle, contient 3 pro-[3-casomorphines et la fraction C5 contient 5 peptides issus de la caséine [3, pour lesquels aucune séquence d'intérêt n'a été identifiée. Peptides Fraction C3 C4 identifiés C2 54-65 57-68 + 57-72 + 57-77 + 57-91 + 57-93 + 59-72 + 61-72 94-123 + 100-123 + 102-123 + + 106-119 + 106-123 + + 108-123 + Tableau 3 : Peptides identifiés par nano-LC-MS/MS dans les différentes 15 fractions issues du yaourt du commerce. Fractions issues du yaourt préparé au laboratoire : Les fractions F3 et F4 contiennent des peptides d'intérêt. Aucun peptide issu de la caséine R n'est identifié dans la fraction F2, tandis que la fraction F5 ne contient pas de peptides d'intérêt. La fraction F3 contient 2 pro-[i-casomorphines de séquences [57-68], 20 [57-72], et 6 précurseurs de la séquence opioïde [114-120] ayant tous la 10 glutamine123 en position Cterminale• La fraction F4 contient 5 pro-fi-casomorphines et 6 précurseurs de la séquence opioïde [114-120] ayant tous la phenylalanine119 en position Cterminale• Peptides Fraction identifiés F3 F4 53-72 57-68 + 57-72 + + 57-77 + 57-87 + 57-91 + 59-91 + 92-123 94-119 + 94-123 + 97-123 98-119 + 100-119 + 100-123 + 101-119 + 101-123 102-119 + 102-123 + 103-119 + 103-123 + 106-123 + 108-123 + Tableau 4 : Peptides identifiés par nano-LC-MS/MS dans les différentes fractions issues du yaourt préparé au laboratoire. EXEMPLE 2 : Les précurseurs de peptides bioactifs à activité opiacée modulent in vitro la sécrétion et l'expression de mucines gastro-intestinales MATERIEL ET METHODE Culture cellulaire Les cellules HT29-MTX et HT29-CI16E étaient cultivées en flasques de 25 cm2 avec du milieu minimum essentiel DMEM supplémenté avec 10 % de SVF et 1 % d'antibiotiques (pénicilline 10 000 Ullml et streptomycine 10 pglml). Les cellules étaient incubées à 37t dans une atmosphère humide (5 % de CO2 et 95 % d'02). A confluence, les cellules soumises au préalable à l'action de la trypsine (trypsine-EDTA) étaient cultivées dans des plaques 12 puits à raison de 1 ml de milieu de culture complet par puits. Afin de maintenir les cellules dans des conditions optimales de croissance, le milieu de culture était changé tous les 2 jours. Protocoles expérimentaux Les expériences ont été réalisées sur les plaques 12 puits 21 jours après confluence des cellules. La veille de la stimulation, les plaques étaient lavées afin d'éliminer le SVF. Le pool peptidique total de yaourt ainsi que les différentes fractions lyophilisées étaient d'abord repris dans de l'eau stérile en solution 10 fois concentrée (10[Y]), [Y] correspondant à la concentration des peptides dans le yaourt initial). L'osmolarité et le pH des échantillons (ajusté à la neutralité par NaOH 1M) étaient contrôlés à ce stade. Des dilutions successives ([Y], [Y]/2 et [Y]/5) étaient ensuite réalisées dans du milieu de culture dépourvu de SVF. Le jour de l'expérience, le milieu était aspiré puis les cellules étaient lavées avec du PBS à 37C. Du milieu sans SVF contenant ou non (contrô les) les fractions peptidiques du yaourt à la concentration souhaitée était déposé à raison de 1 ml par puits (triplicata). Les cellules étaient alors incubées 4 h à 37C en atmosphère humide. Les surnageants de culture étaient ensuite collectés et congelés à -20t en vue du dosage des mucines par ELLA (Enzyme Linked Lectin Assay). Les cellules étaient enfin lysées par l'ajout de Tri-Reagent et leur contenu en acides nucléiques était prélevé en vue de l'extraction des ARN totaux. Chaque stimulation était réalisée à 4 reprises. RESULTATS Effets des pools peptidiques totaux sur la sécrétion des mucines L'activité biologique des deux pools peptidiques a été recherchée dans la lignée mucosécrétante intestinale humaine HT29-MTX. Pour cela, les cellules étaient exposées à différentes concentrations de pool peptidique pendant 4 h, C désignant le yaourt du commerce et F le yaourt fait au laboratoire. La concentration Y correspond à la MAT des peptides dans le yaourt initial. L'osmolarité était ajustée à 330 mmosml/L et le pH à 7. Au cours de ces expériences, il a été montré que la sécrétion de mucines était augmentée de manière dose dépendante par les pools peptidiques totaux issus des deux yaourts. Cet effet était maximum à la concentration Y (FIG. 3). Effets des pools peptidiques totaux sur l'expression des mucines L'étude a porté sur les deux principales mucines gastro-intestinales secrétées produites par les cellules HT29-MTX, les mucines MUC2 et MUC5AC, ainsi que sur la mucine membranaire MUC4. Dans le tractus intestinal, cette mucine est en effet décrite comme pouvant être produite sous une forme secrétée (Rong et al. (2005) J Ce/1 Physiol 202(1):275-84). Elle pourrait donc participer aux propriétés du gel de mucus. La stimulation de la lignée HT29-MTX pendant 4 h par le pool peptidique C (concentration Y, Y/2 et Y/5) s'est traduite par une augmentation du niveau des transcrits codant MUC2 et MUC4 par rapport aux cellules non traitées alors que les transcrits de MUC5AC n'étaient pas modifiés de façon significative (FIG. 4). Le pool peptidique F a augmenté l'expression de MUC5AC et MUC4, avec une réponse maximale observée à la concentration Y. Dans nos expériences, les pools peptidiques totaux C et F n'ont pas modifié l'expression de la cyclophiline (gène de ménage). Effets des différentes fractions C du yaourt du commerce sur la sécrétion et l'expression de mucines in vitro (HT29-MTX) - Effets des fractions C sur la sécrétion des mucines Suite à ce résultat, les fractions C2, C3, C4 et C5 (à la concentration Y), obtenues par chromatographie préparative (RP-HPLC), ont été testées sur la sécrétion et l'expression des mucines gastro-intestinales. Le dosage des surnageants de culture par ELLA a permis de montrer que seule la fraction C2 induit une augmentation significative de la sécrétion de mucines par rapport aux cellules non traitées (203+/-11 % des contrôles, p Effets des différentes fractions F du yaourt du laboratoire sur la sécrétion et l'expression de mucines in vitro (HT29-MTX) - Effets des fractions F sur la sécrétion des mucines Les fractions F3, F4 et F5 (à la concentration Y) obtenues par chromatographie préparative (RP-HPLC) ont été testées sur la sécrétion et l'expression des mucines gastrointestinales. Aucun peptide issu de la caséine [3 n'ayant été identifié dans la fraction F2, cette dernière n'a pas été testée. La fraction F3 a induit une augmentation significative de la sécrétion de mucines par rapport aux cellules non traitées (160 +/-8 % des contrôles, p - Effet dose de la fraction F3 sur la sécrétion de mucines Une étude dose réponse a été réalisée pour la fraction F3. Les résultats obtenus ont montré que cette fraction a un effet dose dépendant sur la sécrétion 25 de mucines. - Effets de la fraction F3 sur l'expression des mucines Contrairement aux résultats obtenus avec la fraction C2, la stimulation des cellules HT29- MTX par la fraction F3 pendant 4 h n'a pas modifié le niveau des 30 transcrits codant MUC2 par rapport aux cellules non traitées. En revanche, une augmentation significative du niveau des transcrits codant MUC5AC et MUC4 était observée après incubation des cellules en présence de cette fraction. En conclusion, l'effet de chaque pool peptidique (C et F) a été reproduit par une seule de ses fractions (respectivement C2 et F3). Les deux fractions actives contiennent des précurseurs de peptides opioïdes. La fraction C2 a augmenté l'expression des mucines gastro-intestinales MUC2 et MUC4 alors que la fraction F3 augmentait celle de MUC5AC et MUC4. Mise en jeu de la voie p-opioïdergique par les fractions C2 et F3 Des récepteurs p opioïdergiques ont été mis en évidence à la surface des cellules HT29-MTX (Zoghbi et al. (op. cit.)). La présente étude montre que la pré- incubation des cellules HT29-MTX en présence de cyprodime (10-5 M), un antagoniste spécifique du récepteur p-opioïdergique (Marki et al. (1999) Eur J Pharmacol 383(2) :209-14), inhibe la sécrétion de mucines induite par les fractions C2 (FIG. 9) ou F3 (concentration Y). L'effet de la fraction C2 sur l'expression des mucines MUC2 et MUC4 était également aboli par l'utilisation de cet antagoniste. Par RT-PCR quantitative, il a également été montré que le cyprodime abolit l'augmentation du niveau des transcrits codant MUC5AC induite par la fraction F3. Un résultat identique a été observé avec la mucine MUC4. Ces résultats permettent de penser que les fractions C2 et F3 exercent leur effet sur la sécrétion et sur l'expression des mucines via l'activation des récepteurs p-opioïdes. Les deux fractions d'intérêt C2 et F3 ont également été testées à la concentration Y dans une autre lignée mucosécrétante, la lignée HT29-CI16E. Les résultats obtenus sur l'expression de MUC2, MUC5AC et MUC4 étaient similaires à ceux observés sur les cellules HT29-MTX avec une augmentation de l'expression des mucines MUC2 et MUC4 sous stimulation par la fraction C2 (4 h, concentration Y) et une augmentation de l'expression des mucines MUC5AC et de MUC4 sous stimulation par la fraction F3 (4 h, concentration Y). Le dosage des surnageants de culture par ELLA a montré également que les fractions C2 et F3 augmentent de façon significative la quantité de mucines libérées dans le milieu de culture après 4 h de stimulation (172+1- 3% et 157+/-8% pour les fractions CE et F3, respectivement, p D'autres résultats ont permis de montrer qu'à la concentration de 10-8 M, ce peptide provoque également une forte augmentation de l'expression des mucines MUC2 et MUC4 (environ 300%). Dans toutes nos expériences, le peptide [94-123] (10"8-10-4M) était sans effet sur l'expression de MUC5AC. REVENDICATIONS1. Polypeptide comprenant ou constitué de : - SEQ ID NO : 1, ou - une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 1, ou - une séquence d'au moins quatre acides aminés consécutifs comprise dans SEQ ID NO :1, qui présente un effet d'induction de l'expression d'au moins une mucine gastro-intestinale, et sous réserve que le polypeptide ne comprenne pas la séquence SEQ ID NO : 2. 2. Polypeptide selon la revendication 1, constitué de SEQ ID NO : 1. 3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, pour son utilisation comme médicament. 4. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3, pour son utilisation comme médicament dans le traitement de patients présentant un défaut de sécrétion ou d'expression des mucines gastro-intestinales. 5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, pour son utilisation comme médicament dans la prévention ou le traitement d'une pathologie sélectionnée dans le groupe constitué d'une inflammation intestinale notamment chronique, d'une infection intestinale, d'ulcères gastrique et duodénal notamment dus à une infection à Helicobacter pylori, de cancers intestinaux et coliques et de mucites induites par la radiothérapie ou la chimiothérapie 6. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2 à titre de substance active, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 7. Utilisation d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'une composition alimentaire. 8. Utilisation selon la revendication 7, pour la préparation d'une composition alimentaire lactée. 9. Composition alimentaire non lactée comprenant un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2. 10. Composition alimentaire lactée comprenant un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2. 11. Composition alimentaire selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle le polypeptide est à la concentration d'au moins 7 �M. 12. Procédé de préparation d'un produit lacté fermenté par au moins une souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et/ou au moins une souche de Streptococcus salivarus spp. thermophilus comprenant une étape de détermination de la concentration d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2. 13. Procédé selon la revendication 12, dans lequel on laisse agir la souche de Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus et/ou la souche de Streptococcus salivarus spp. thermophilus jusqu'à ce qu'une valeur prédéterminée de la concentration du polypeptide soit atteinte.