Brevet FR2942805A1 — publié le 20100910

i La présente invention concerne un procédé pour caractériser le niveau d'exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures, comprenant la conservation avec lesdits échantillons d'un échantillon de cellules témoins, éventuellement calibrées. L'invention concerne aussi un procédé de calibration des cellules témoins et les cellules témoins ainsi calibrées. La conservation d'échantillons biologiques, notamment d'origine humaine, est un enjeu majeur aussi bien de santé publique que pour la recherche et le io développement de nouvelles thérapies. Partant de ce constat, de nombreuses structures publiques ou privées se sont développées afin de garantir une traçabilité et une conservation optimale de ces échantillons. De nombreux travaux ont montré l'importance de la conservation en azote liquide pour le maintien de la qualité des échantillons, et des procédures strictes 15 concernant la phase de congélation et l'utilisation de cryoprotecteurs ont été définies, notamment pour la thérapie cellulaire. Cependant peu de travaux ont été consacrés à l'effet de variations de température, notamment liées à la remontée en température induite lors de l'ajout ou du retrait de nouveaux échantillons. Or ce phénomène peut induire des variations de température, qui peuvent être 20 importantes et itératives, plus ou moins délétères pour l'échantillon. A ce jour il n'existe aucun test validé permettant de certifier la qualité d'un échantillon avant et lors de sa décongélation. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé pour 25 caractériser le niveau d'exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures, comprenant la conservation avec lesdits échantillons d'un échantillon de cellules témoins, lesdites cellules témoins étant calibrées pour définir un ou plusieurs marqueurs permettant de distinguer un seuil dont le franchissement est significatif d'une exposition à un stress. 30 Les cellules témoins peuvent avantageusement être des cellules d'Ovaires de Hamster Chinois (� Chinese Hamster Ovary �), dites cellules de � CHO �, et plus particulièrement des cellules de CHO cultivées en suspension. 2 Le seuil est préférentiellement identifié par référence à un protocole standard d'exposition à un stress, en particulier thermique, notamment à un protocole standard d'exposition à un cycle de congélation/décongélation prédéterminé. Ce protocole standard peut notamment être défini par un cycle de remonté puis de descente en température prédéterminé, par exemple l'exposition de l'échantillon congelé à très basses températures pendant deux périodes de 5 minutes à 20°C suivies à chaque fois du retour à la température de congélation. La congélation et/ou le retour à la température de congélation peut comprendre une première étape dans laquelle l'échantillon est baigné dans de l'azote liquide, par exemple pendant 10 minutes, avant d'être placé à température de congélation. La température de congélation peut être inférieure ou égale à -80°C, en particulier inférieure ou égale à -100°C, notamment inférieure ou égale à -120°C, voire inférieure ou égale à -140°C, ou encore être de -196°C. Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de calibration d'un échantillon de cellules témoins pour définir un marqueur permettant de distinguer un seuil dont le franchissement est significatif d'une exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures, ledit procédé de calibration comprenant les étapes suivantes : - mise en culture des cellules, - incubation des cellules, - détermination du marqueur avant congélation, par exemple la proportion d'une population de cellules témoins définie par un certain rapport taille/structure, le rapport entre deux populations de cellules témoins définie par un certain rapport taille/structure et/ou le niveau d'expression d'au moins une espèce moléculaire. Ce procédé de calibration peut ainsi permettre d'obtenir des échantillons de cellules permettant de disposer d'au moins un marqueur utilisable de manière reproductible. Selon encore un autre de ses aspects, l'invention a pour objet l'utilisation d'une lignée de cellules de CHO, en particulier de cellules de CHO cultivées en 30 3 suspension, dites CHO-S, comme échantillon de cellules témoin pour caractériser le niveau d'exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures. Par � très basses températures �, on entend au sens de la présente invention des températures inférieures ou égales à -80°C, en particulier inférieures ou égales à -100°C, notamment inférieures ou égales à -120°C, voire inférieures ou égales à -140°C, ou encore une température de -196°C. Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet une io lignée de cellules de CHO, notamment de CHO cultivées en suspension, calibrées pour leur emploi comme échantillon de cellules témoin. La figure 1 représente la distribution de populations de cellules de CHO-S calibrées selon leur rapport taille/structure, 15 La figure 2 représente la distribution de deux populations de cellules calibrées CHO-S avant (Jcong) et après congélation-décongélation selon qu'elles subissent un stress thermique (S) ou non (NS). La figure 3 présente le niveau d'expression de différents marqueurs de type peptides selon que les cellules calibrées CHO-S ont été stressées (R2_5) ou non 20 (Ctrl). Les cellules témoins peuvent notamment être des cellules de CHO, et en particulier de cellules de CHO cultivées en suspension, dites CHO-S, SFM Adapted, par exemple celles commercialisées par Gibco sous la référence 11619- 25 012. Ces cellules présentent notamment l'avantage de pouvoir être mises en culture dans un milieu dépourvu de sérum. Parmi les milieux utilisables on peut citer l'Ex-Cell 302 de BASF SE, le SFC CHO Express Media de PromoCell, le CHO-S SFM II d'Invitrogen ou le Power CHO de Lonza. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le marqueur est un rapport entre deux populations P1 et P3 de cellules de CHO calibrées pour leur emploi comme échantillon de cellules témoin. 4 Chaque population P1 et P3 peut notamment être déterminée par un rapport taille/structure des cellules témoin mesuré par cytométrie en flux. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, avec des cellules de CHO-S comme témoin, la population P1 peut être définie comme étant celle dont le rapport taille/structure est compris entre 0 > P1 SSC > 250 et 50 > P1 FSC > 250 et la population P3 celle dont le rapport taille/structure est compris entre 50 > P3 SSC > 250 et 0 > P3 FSC > 50. En particulier les populations P1 et/ou P3 sont des cellules. Schématiquement, la taille correspond à la dispersion captée en phase du io passage de l'évènement, notamment de la cellule, devant le faisceau laser, et la structure correspond à la dispersion captée à 90° lors du passage de l'évènement, notamment de la cellule, devant le laser. Dans le cas de cellules de CHO calibrées et employées comme cellules témoins selon la présente invention, le seuil caractéristique d'un cycle de remonté 15 puis de descente en température prédéterminé, par exemple l'exposition de l'échantillon congelé à très basses températures pendant deux périodes de 5 minutes à 20°C suivie à chaque fois du retour à la température de congélation, peut être un rapport P1/P3 allant de 0,1 à 0,9, notamment de 0,2 à 0,8 et en particulier de 0,3 à 0,7. 20 Bien entendu, l'homme du métier saura déterminer ce seuil caractéristique selon les lignées cellulaires et selon les cycles prédéterminés choisis, notamment en suivant la méthode employée dans les exemples de réalisation ci-après. Selon un autre mode de réalisation, le marqueur est la différence entre une 25 population, notamment P1, de cellules de CHO calibrées pour leur emploi comme échantillon de cellules témoins avant congélation et après décongélation. Les populations peuvent être mesurées par cytométrie en flux et exprimé en % d'événements par rapport aux évènements totaux. Cette différence peut être calculée par soustraction du % d'une population, 30 notamment de cellules, en particulier P1, par rapport au nombre total d'événements avant congélation et après décongélation. En particulier, cette différence de population, notamment P1, est mesurée sur des cellules témoins ayant subi une ou plusieurs périodes de stress, notamment thermique, et en particulier comprenant au moins une période où les échantillons de cellules congelées à très basses températures sont placés à 20°C, en particulier la procédure est telle que celle définie ci-dessus. 5 Pour les cellules de CHO employées comme cellules témoins selon la présente invention, la différence de population P1 avant congélation et après décongélation et sans période de stress peut aller de 10 à 22 %, notamment de 15 à 19 %, et en particulier être de 17 %. Dans le cas de cellules de CHO calibrées et employées comme cellules témoins selon la présente invention, le seuil caractéristique d'une exposition de deux périodes de 5 minutes à 20°C d'échantillons congelés à très basses températures est une différence de population P1 avant congélation et après décongélation d'au moins 22 %, notamment d'au moins 27 %, voire d'au moins 30 0/0. Il est entendu que l'homme du métier saura déterminer ce seuil caractéristique selon les lignées cellulaires et selon les cycles prédéterminés choisis. Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, le marqueur est au moins une espèce moléculaire, notamment détectable en spectrométrie de masse. Le terme "espèce moléculaire" peut désigner tout type de molécule, notamment choisie parmi les protéines, les polypeptides et les peptides, éventuellement glycosylées et/ou phosphorylées, les produits du métabolisme, ou encore les fragments d'une ou plusieurs de ces entités. Tout particulièrement le marqueur est au moins un polypeptide et/ou au moins un peptide. Un polypeptide est défini comme une chaine comprenant de 50 à 140 acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. Un peptide est défini comme une chaine comprenant moins de 50 acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. Le marqueur peut être au moins un polypeptide et/ou au moins un peptide, en particulier obtenu après purification de polypeptides et/ou de peptides à l'aide d'une chimie de surface de type hydrophobe, comme Dynabeads RPC18, de Invitrogen, présentant un poids moléculaire de 4960, 5295, 9927, 7308, 7062, 2836, 12059, 6023, 10600, 10684, 3907, 10970, 5270, 6942, 2501, 4935, 4806, 11732, 11732, 5861, 7208, 14565, 7532, 4506, 5088, 2669, 6158, 7078, 5481 ou 3894 Da. Ces marqueurs peuvent notamment permettre de différencier les cellules dites � contrôles � vis-à-vis des cellules dites � stressées �. Le marqueur peut également être au moins un polypeptide et/ou au moins io un peptide, en particulier obtenu après purification de polypeptides et/ou peptides à l'aide d'une chimie de surface de type hydrophobe, choisi parmi les polypeptides et peptides de poids moléculaire 4960, 5295, 10970, 7308, 7062, 6023, 9927, 10600, 12059, 2836, 2501, 10684, 4506, 5088, 5270, 7208, 4935, 3907, 14565, 5481, 4806, 4098, 6942, 6708, 2669, 3686, 7270, 8652, 9962 et 3557 Da, en 15 particulier afin de prédire le caractère stressé (dans la limite de la définition du stress prédéterminé ci-dessus) ou non des cellules CHO-S. Les poids moléculaires indiqués ici ont été obtenus dans des conditions expérimentales spécifiées ci-après. Cependant, d'autres technologies, différentes de celles citées dans cette description, sont utilisables. On peut en particulier citer 20 les spectromètres de masse incluant une source d'ionisation de type MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) ou ESI (ElectroSpray Ionization) et possédant des analyseurs et/ou détecteurs différents, en particulier des analyseurs basse résolution, comme le quadripôle ou quadrupôle (Q), le piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), et des analyseurs haute résolution, permettant de 25 mesurer la masse exacte des analytes, comme le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), la résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FTICR) et l'Orbitrap. Une certaine variation est susceptible d'apparaître lors de l'utilisation de technologies et/ou d'appareillages différents de ceux décrits dans la présente 30 description. Néanmoins, l'homme du métier est capable de transposer les résultats décrits dans cette description à d'autres technologies, et d'identifier les signaux, comme par exemple les pics de masse obtenus par spectrométrie de masse, correspondants aux marqueurs mis en évidence par les inventeurs ou 7 susceptibles d'être utilisés comme marqueurs. Du fait de la variation liée aux technologies, et en particulier aux spécifications des fabricants d'appareils de spectrométrie qui utilisent notamment des logiciels de traitement de l'information susceptibles d'entraîner des décalages de pics, les poids moléculaires indiqués ci-dessus doivent être entendus avec une précision de � 2%, en particulier de � 0,5%, voire de � 0,1%. Au sens de la présente invention, le terme "dosage" désigne une mesure semi-quantitative au sens large, par exemple une quantification relative d'un composé, par rapport au même composé dans un autre échantillon ou par rapport io à un autre composé dans le même échantillon. Ainsi, dans le présent texte, une comparaison de profils, par exemple obtenus par spectrométrie de masse, est assimilé à un "dosage". L'homme du métier peut déterminer le nombre de marqueurs à doser en vue d'obtenir un test le plus sensible et sélectif possible. 15 Parmi les marqueurs caractérisés par les inventeurs et cités ci-dessus, neuf ont été identifiés comme étant particulièrement pertinents, il s'agit des polypeptides et/ou peptides ayant les poids moléculaires suivants 4960, 5295, 9927, 7308, 7062, 2836, 12059, 6023 et 10600 Da. Ces marqueurs sont surexprimés ou sous exprimés chez les contrôles par rapport aux cellules témoins 20 stressées (fig. 3). Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que pour des cellules de CHO-S employées comme cellules témoins, une combinaison de polypeptides et peptides de masse située avantageusement entre 1000 et 16000 Da est caractéristique d'un stress thermique prédéterminé, défini ci-dessus comme étant un ou plusieurs 25 cycles de remonté puis de descente en température prédéterminé, par exemple un cycle comprenant l'exposition de l'échantillon congelé à très basses températures pendant deux périodes de 5 minutes à 20°C suivie à chaque fois du retour à la température de congélation. Le suivi de la variation de la quantité de ces peptides dans les cellules 30 témoins permet d'identifier l'exposition à un stress, notamment correspondant à deux cycles de remonté en température de 5 minutes chacune. Selon les cellules employées pour la mise en oeuvre du procédé selon 8 l'invention, il peut être nécessaire de les calibrer. C'est le cas notamment pour les cellules de CHO-S, commercialisée par la société Gibco. En particulier le procédé de calibration permet l'obtention de cellules présentant un rapport entre les deux populations P1/P3, définies précédemment, supérieur à 1, notamment va 1 à 1,5, et en particulier de 1,1 à 1,4, un pourcentage de la population P1, par exemple mesuré par cytométrie en flux, qui va de 50 à 60 %, par rapport au nombre total d'évènement, et/ou une certaine teneur en peptide(s) spécifique(s). Lors de la calibration, les cellules témoins peuvent être incubées à une io température allant de 25 à 40°C, et notamment de 37°C. L'atmosphère peut comprendre 95 % v/v d'humidité et 5 % v/v de CO2. L'incubation peut aller de 1 à 10 jours, notamment de 2 à 6 jours, et en particulier être de 4 jours. Le rapport taille/structure peut être mesuré après l'incubation par cytométrie de flux. Les paramètres de cytométrie de flux peuvent être FSC 255 et SSC 301. 15 La congélation peut être effectuée selon une procédure particulière, en particulier suivre les protocoles de congélation définis par les normes en vigueur selon les territoires concernés. En particulier, les cellules sont placées dans un milieu de culture, par exemple contenant 10 % de DMSO froid, sous forme d'un inoculum de 500 pL de 20 4.106 cellules dans un cryotube. La congélation peut être réalisée à -80°C dans un dispositif contenant de l'isopropanol. La conservation peut être avoir lieu en azote à une température inférieure à -140°C. La décongélation des cellules peut être réalisée par incubation pendant 30 secondes du cryotube à 37°C. La décongélation peut être terminée par ajout de 25 milieu de culture froid puis transfert des cellules dans un tube pour une centrifugation à 1000 tours/min pendant 5 minutes. Dans le cas de l'analyse protéique, la mise en évidence des marqueurs de masses cités ci-dessus peut être effectuée selon la procédure suivante : 30 Des cellules (0,5.106) congelées à -196°C dans 30 pl de tampon de sucrose sont repris à 20°C par 180 pl de tampon d'extraction puis l'ensemble est centrifugé. Après avoir écarté les surnageants, les culots sont repris par un volume de 160 pl d'H2O milliQ. 9 Un volume de 50 pl est utilisé pour la purification d'un sous polypeptidome et peptidome à l'aide de billes magnétiques de type C18. Après capture et élution des polypeptides et peptides ayant une forte affinité pour la phase utilisée, les Dynabeads RPC18 de Invitrogen, ces polypeptides et peptides sont analysés par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (unitraflex TOF/TOF, Bruker Daltonik, Bremen, Allemagne) en mode linéaire après mélange avec la matrice acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) et après calibration de l'instrumentation. Dans le cadre de cette invention l'analyse statistique différentielle a été io réalisée, après traitement des signaux de spectrométrie de masse (normalisation, soustraction de la ligne de base, détection des pics), en utilisant la méthode proposée dans la librairie limma de R laquelle est particulièrement adaptée aux données de grande dimension qui concernent peu d'individus. L'analyse prédictive a été réalisée en utilisant la méthode des forêts aléatoires. Dans l'objectif de faire 15 de la sélection de variables le modèle LARS a été appliqué. Il est entendu que l'homme du métier saura adapter le procédé général de calibration selon l'invention aux cellules qu'il entend employer comme cellules témoins dans le procédé selon l'invention. 20 Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet une lignée de cellules de CHO calibrées obtenues par le procédé de calibration selon l'invention pour leur emploi comme échantillon de cellules témoin. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules calibrées 25 sont des cellules de CHO, en particulier de CHO-S, dont le rapport entre les deux populations P1/P3 défini précédemment est supérieur à 1, notamment va 1 à 1,5, et en particulier de 1,1 à 1,4, et/ou présente un pourcentage de la population P1, par exemple mesuré par cytométrie en flux, qui va de 50 à 60 %, par rapport au nombre total d'évènement, et/ou une certaine teneur en peptide(s) spécifique(s). 30 L'utilisation de modèles mathématiques adaptés peut permettre alors de classifier les échantillons en fonction de leur stress. D'autres caractéristiques de l'invention sont illustrées dans les exemples de réalisation ci-après. Exemples Exemple 1 Les cellules de CHO-S (CHO-S cells, SFM Adapted, Gibco, Réf : 11619- 012) sont calibrées de la manière suivante. Les cellules (200.103 cellules/mL) de CHO-S sont placées en flasque de 150 cm2 et mises en culture dans de l'Ex-Cell 302 (BASF SE), du SFC CHO Express Media (PromoCell), du CHO-S SFM II (Invitrogen) ou du Power CHO io (Lonza), contenant 4 mM de L-Glutamine et un mélange d'hypoxantine à 19,27 mg/L et de thymidine à 1 mg/L. Ces milieux ayant été spécialement développé pour ces cellules et ne contenant pas de sérum. Puis l'incubation de ces cellules est effectuée dans un incubateur à 37°C sous une atmosphère de 95 % d'humidité et 5 % CO2. 15 L'observation du rapport taille/structure des cellules est faite par cytométrie en flux après 4 jours de culture. Les cellules (1.106 cellules) sont suspendues dans 500 pL de PBS, puis 1 pL de Hoechst (1 mg/mL) est ajoutée pendant 10 minutes à 37°C. La solution est ensuite placée à 4°C pendant 5 minutes avant l'ajout de 1 pL de Iodure de Propidium (1 mg/mL). Les paramètres retenus en cytométrie sont : 20 FSC 255 et SSC 301. La congélation des cellules en cryotubes est effectuée dans un milieu de culture contenant 10% de DMSO froid sous forme d'un inoculum de 500 pL de 4. 106 cellules. Cette congélation est réalisée à -80°C dans un dispositif contenant de 25 l'isopropanol. La décongélation des cellules est réalisée par incubation pendant 30 secondes du cryotube à 37°C. La décongélation est terminée par ajout de milieu de culture froid, puis transfert des cellules dans un tube pour une centrifugation à 1000 tours/min pendant 5 minutes. 30 La figure 1 présente la répartition des populations des cellules calibrées selon l'exemple 1. Cette figure présente la répartition des cellules selon leur taille en fonction de leur structure. Les valeurs sont exprimées en unité arbitraire. i0 Il Exemple 2 Deux échantillons de cellules calibrées obtenues selon l'exemple 1 sont congelés à une température de -140°C. Un échantillon A ne subit pas de stress thermique alors qu'un échantillon B est exposé pendant deux périodes de 5 minutes à une température de 20°C puis à un retour à la température de congélation. Les deux échantillons sont ensuite décongelés. La figure 2 présente les répartitions des populations P1 et P3 des différents io échantillons. Elle représente les répartitions de population P1 et P3 de cellules avant congélation (JO) et après décongélation (selon le protocole défini précédemment). La répartition de population P1 et P3 a été déterminée pour des cellules n'ayant pas subies de stress (NS) ou ayant été stressées par l'exposition de deux périodes de 5 minutes à 20°C (S). 15 Les échantillons A et B avant congélation présentent une population P1 de 56 % par rapport au nombre total d'évènements et une population P3 de 25 % par rapport au nombre total d'évènements. L'échantillon A après décongélation présente une population P1 de 38 0/0 par rapport au nombre total d'évènements et une population P3 de 33 % par 20 rapport au nombre total d'évènements. Ainsi, l'échantillon A présente un rapport P1/P3 après décongélation de 1,151. L'échantillon B après décongélation présente une population P1 de 25 0/0 par rapport au nombre total d'évènements et une population P3 de 57 % par 25 rapport au nombre total d'évènements. L'échantillon B pour sa part présente un rapport P1/P3 après décongélation de 0,439. Cet exemple montre donc bien que l'échantillon A n'a pas été soumis à un stress thermique et que l'échantillon B a été soumis a un stress thermique. 30 D'autre part, la différence de population P1 avant congélation et après décongélation de l'échantillon A est de 17 %, soit 56 % - 39 %, alors que cette différence est de 31 %, soit 56 % -25 %, pour le groupe stressé. 12 Cette méthode de mesure permet également de montrer que la l'échantillon A n'a pas subit de stress thermique alors que l'échantillon B a subi un stress thermique. Exemple 3 Des cellules témoins (0,5.106 cellules) de CHO-S calibrées selon l'exemple 1 et congelées à une température de -140°C dans 30 pl de tampon de sucrose sont reprises à 20°C par 180 pl de tampon d'extraction puis l'ensemble est centrifugé. Après avoir écarté les surnageants, les culots sont repris par un volume de 160 pl d'H2O milliQ. Deux volumes de 50 pl sont utilisés pour la purification du sous peptidome à l'aide de billes magnétiques de type C18. Après capture et élution des polypeptides et peptides ayant une forte affinité pour la phase utilisée (C18), ces polypeptides et peptides sont analysés par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (unitraflex TOF/TOF, Bruker Daltonik, Bremen, Allemagne) en mode linéaire après mélange avec la matrice acide a-cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA). Dans le cadre de cette invention l'analyse statistique différentielle a été réalisée, après traitement des signaux de spectrométrie de masse (normalisation, soustraction de la ligne de base, détection des pics), en utilisant la méthode proposée dans la librairie limma de R laquelle est particulièrement adaptée aux données de grande dimension qui concernent peu d'individus. L'analyse prédictive a été réalisée en utilisant la méthode des forêts aléatoires. Dans l'objectif de faire de la sélection de variables le modèle LARS a été appliqué. La figure 3 présente les résultats de ces analyses sur des cellules témoins n'ayant pas subi de stress thermique et sur des cellules témoins ayant subi un stress selon la procédure définie dans l'exemple 2. Les 9 marqueurs présentés sont effectivement surexprimés ou sous exprimés chez les contrôles par rapport aux cellules témoins stressées. Ainsi, la mesure de ces marqueurs permet de savoir si les cellules ont été exposées à un stress tel que défini à l'exemple 2. REVENDICATIONS1. Procédé pour caractériser le niveau d'exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures, caractérisé en ce qu'il comprend la conservation avec lesdits échantillons d'un échantillon de cellules témoins, lesdites cellules témoins étant calibrées pour définir un marqueur permettant de distinguer un seuil dont le franchissement est significatif d'une exposition à un stress. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules lo témoins sont des cellules d'Ovaires de Hamster Chinois, dites cellules de CHO, en particulier cultivées en suspension. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le seuil est identifié par référence à un protocole standard d'exposition à un cycle de congélation/décongélation prédéterminé. 15 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le protocole standard d'exposition à un cycle de congélation/décongélation prédéterminé est un cycle comprenant deux périodes de 5 minutes chacune à 20°C. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le marqueur est un rapport entre deux populations P1 et P3 20 de cellules de CHO, chaque population étant déterminée par la caractérisation par cytométrie en flux du rapport taille/structure des cellules témoin. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la population P1 présente un rapport taille/structure compris entre 0 > P1 SSC > 250 et 50 > P1 FSC > 250, la population P3 un rapport taille/structure compris entre 50 > P3 SSC 25 > 250 et 0 > P3 FSC > 50, et le rapport P1/P3 va de 0,1 à 0,9, notamment de 0,2 à 0,8 et en particulier de 0,3 à 0,7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'une population P1 de cellules témoins, notamment de CHO, présente un rapport taille/structure compris entre 0 > P1 SSC > 250 et 50 > P1 30 FSC > 250 et en ce que la différence de population P1 avant congélation et après décongélation est d'au moins 20 %, notamment d'au moins 27 %, voire d'au moins 30%. 14 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le marqueur est au moins une espèce moléculaire, notamment détectable en spectrométrie de masse, en particulier au moins un peptide et/ou au moins un polypeptide. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le peptide ou le polypeptide présente un poids moléculaire de 2501, 2669, 2836, 3557 3686, 3894, 3907, 4098, 4506, 4806, 4935, 4960, 5088, 5270, 5295, 5481, 5861, 6023, 6158, 6708, 6942, 7062, 7078, 7208, 7270, 7308, 7532, 8652, 9927, 9962 10600, 10684, 10970, 11732, 12059, ou 14565 Da, en particulier 2836, 4960, 5295, 6023 7062, 7308, 9927, 10600 ou 12059 Da. 10. Procédé de calibration d'un échantillon de cellules témoins pour définir un marqueur permettant de distinguer un seuil dont le franchissement est significatif d'une exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : mise en culture des cellules témoins, incubation des cellules témoins, détermination du marqueur avant congélation, par exemple la proportion d'une population de cellules témoins définie par un certain rapport taille/structure, le rapport entre deux populations de cellules témoins définie par un certain rapport taille/structure et/ou le niveau d'expression d'au moins une espèce moléculaire. 11. Utilisation d'une lignée de cellules de CHO comme échantillon de cellules témoin pour caractériser le niveau d'exposition à un stress d'échantillons de cultures cellulaires conservées à très basses températures. 12. Utilisation selon la revendication 11, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 9. 13. Lignée de cellules de CHO calibrées pour leur emploi comme échantillon de cellules témoin, caractérisé en ce que le rapport entre les deux populations P1 /P3 de cellules de CHO déterminées par la caractérisation par cytométrie en flux du rapport taille/structure des dites cellules calibrées est supérieur à 1, notamment va 1 à 1,5, et en particulier de 1,1 à 1,4, présente un pourcentage de la population P1, notamment mesuré par cytométrie en flux, qui15 va de 50 à 60 %, par rapport au nombre total d'évènement, et/ou une certaine teneur en peptide(s) spécifique(s).