Brevet FR2936529A1 — publié le 20100402

PROCEDE DE CARACTERISATION D'UN ECHANTILLON D'ADN La présente invention concerne un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue. L'invention se rapporte également à l'utilisation de ce procédé ainsi qu'à un kit pour sa mise en oeuvre. Beaucoup d'échantillons biologiques, tels que ceux rencontrés en médecine légale, dans les tissus archivés, l'ADN ancien, l'ADN extracellulaire ou encore dans le domaine alimentaire, conduisent à l'obtention d'ADN fortement dégradés et/ou en faibles quantités. La faible quantité et surtout l'état de dégradation de ces échantillons les rendent difficiles à analyser par les techniques actuelles. Or une estimation de la taille et de la quantité d'ADN contenu dans l'échantillon est nécessaire en particulier pour les analyses de STR (Short Tandem Repeat - Courtes séquences répétées en chaîne) en médecine légale ou pour la quantification d'organismes génétiquement modifiés (O6M) . Actuellement, la quantification de faibles quantités d'ADN peut être réalisée par fluorimétrie (avec des colorants dont la fluorescence augmente par fixation sur l'ADN) par hybridation avec des sondes contenant des séquences répétées, ou plus généralement par PCR (�Polymerase Chain Reaction� - Réaction en Chaîne par Polymérase) quantitative en temps réel. Toutefois, si l'ADN contenu dans l'échantillon est dégradé, ces techniques conduisent à une sous-estimation systématique de la quantité d'ADN puisque la fixation de colorants sur l'ADN, son taux de rétention sur membrane d'un fragment d'ADN et sa capacité à s'hybrider chutent avec sa taille, et enfin, pour la PCR il est impossible d'amplifier des fragments comportant des coupures dans la séquence cible. Par ailleurs, pour de faibles masses, avec les techniques actuelles, la détermination de la taille des fragments d'ADN contenus dans un échantillon est encore plus difficile. L'électrophorèse avec révélation directe de la position d'ADN par coloration n'est pas assez sensible. Cette sensibilité peut être accrue par l'utilisation de la technique de Southern, plus compliquée et nécessitant, même ainsi, des quantités d'échantillons excessives pour certaines applications. Ainsi avec les méthodes d'analyse actuelles il est impossible de caractériser de façon simple et rapide un échantillon d'ADN. Il n'existe aucune technique validée et rigoureuse permettant simultanément de mesurer la masse d'ADN, d'estimer la taille moyenne et/ou établir le profil de distribution de la taille des fragments d'ADN à analyser. Il existe donc un besoin pour une méthode simple et fiable permettant de 15 caractériser des populations de fragments d'ADN, en particulier de fragments issus de la dégradation aléatoire d'un ADN intact. C'est pourquoi l'objectif de la présente invention est de répondre à ce besoin et de pallier les inconvénients des techniques de l'art antérieur en proposant un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, efficace et 20 facile à mettre en oeuvre. A cet effet, la présente invention vise un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, contenant, avant dégradation, N copies d'un fragment d'ADN intact de taille B, comprenant les étapes suivantes a) mesure par PCR quantitative du nombre NI de copies intactes 25 d'une séquence nucléotidique cible Cl de taille L1, Ll étant inférieure ou égale à (B-1), b) si la masse N n'est pas connue, mesure par PCR quantitative du nombre N2 de copies intactes d'une séquence nucléotidique cible C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1, c) calcul de la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en utilisant la formule : - Pcut = 1-(N1/N2)1112, si N n'est pas connu, ou - Pcut = 1-( N1 /N) 1/ Ll, si N est connu, d) à partir de Pcut, détermination d'une ou plusieurs données caractérisant l'échantillon d'ADN, choisies parmi : la masse N de l'ADN contenu dans l'échantillon, la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon, le profil de distribution de la taille des fragments contenus dans l'échantillon, le profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon, la probabilité qu'une séquence nucléotidique C de taille L soit intacte, la probabilité d'avoir une PCR positive, la quantité minimum d'échantillon à utiliser pour avoir une PCR positive, la taille de fragment maximum qui peut être amplifiée avec une quantité d'échantillon d'ADN donnée, la vitesse de dégradation ou de modification de l'ADN. Par � échantillon d'ADN d'origine connue �, on entend une population d'ADN dont les éléments ont une taille unique B avant dégradation et pour lesquels on peut définir au moins deux couples d'amorces permettant l'amplification d'au moins deux fragments cibles de tailles différentes et connues. La � masse N � correspond au nombre initial N de copies du fragment d'ADN intact de taille B. La � taille B � correspond au nombre de nucléotides formant un fragment d'ADN cible d'origine connue, intact. La � séquence nucléotidique cible Cl� correspond à une séquence d'ADN située sur le fragment de taille B, de taille L1, L1 étant inférieure ou égale à (B-1) et exprimée en nombre de nucléotides. La �séquence nucléotidique cible C2� correspond à une séquence d'ADN placée sur le fragment de taille B, de taille L2, L2 étant inférieure à Ll et exprimée en nombre de nucléotides. La � probabilité de coupure par nucléotide� Pcut correspond à la probabilité que chaque (B-1) liaison nucléotide-nucléotide a de se rompre. Cette expression est une simplification car le site de rupture peut ne pas être situé entre deux nucléotides, mais au niveau d'un nucléotide lui-même. De même on entend par coupure tout évènement conduisant au blocage de la polymérase lors d'une expérience PCR. Par � taille moyenne des fragments d'ADN � on entend la taille des fragments majoritaires en masse dans l'échantillon au moment de l'analyse, quand les coupures sont les seules altérations subies par l'ADN. C'est la taille correspondant au maximum de fluorescence de la population d'ADN lors de l'analyse par électrophorèse sur gel. Par extension, la � taille d'un fragment � correspond au nombre de nucléotides présents entre deux sites de blocage de la polymérase. Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être utilisé dans différents domaines, tels que par exemple la médecine légale, la détection et le dosage d'organismes génétiquement modifiés (OGM), l'étude d'ADN ancien, la recherche dans le domaine médical ou dans tout domaine de recherche où l'on étudie la dégradation ou la modification de l'ADN. La présente invention a également pour objet l'utilisation de ce procédé pour diverses applications. Enfin, l'invention vise également un kit comprenant des éléments permettant la 25 mise en oeuvre du procédé. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement, en regard des dessins annexés sur lesquels - la figure 1 représente la schématisation d'un fragment d'ADN intact de taille B, - la figure 2 représente un échantillon d'ADN contenant initialement N fragments d'ADN intacts, avant dégradation, après dégradation, et les valeurs 5 NI et N2 obtenues par PCR quantitative, - la figure 3 représente le profil de distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans un échantillon avec B = 200 nucléotides et Pcut = 0,03, avec en abscisse L la longueur des fragments en nucléotides et en ordonnée QL la proportion de fragments de longueur L, 10 - la figure 4 représente le profil de distribution de la masse des fragments d'ADN contenus dans un échantillon avec B = 200 nucléotides et Pcut = 0,03, avec en abscisse L la longueur des fragments en nucléotides et en ordonnée ML la masse des fragments de longueur L, - la figure 5 représente une schématisation de la mise en oeuvre du 15 procédé selon l'invention, - la figure 6 représente un gel électrophorèse en conditions dénaturantes d'échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I, - la figure 7 est un diagramme représentant la quantification d'ADN dégradé pour 10 échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I, l'ordonnée 20 correspondant au nombre de copies d'une séquence nucléotidique à l'échelle logarithmique, et - la figure 8 est un diagramme comparant la taille moyenne calculée à partir de Pcut et mesurée sur gel, à l'échelle logarithmique, des fragments d'ADN dans 10 échantillons d'ADN génomique digérés à la DNase I. 25 L'invention concerne donc un procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, contenant à l'origine N copies d'un fragment d'ADN initial intact 10 tel que représenté sur la figure 1, de taille B constitué de nucléotides 12. A chaque nucléotide, un évènement de coupure peut se produire soit sur le nucléotide lui-même soit entre ce nucléotide et un nucléotide voisin. On peut considérer qu'il s'agit de deux évènements équivalents. Dans le cas présent on considère que la coupure se fait entre deux nucléotides. Chaque liaison 14 nucléotide-nucléotide a une même probabilité Pcut de se rompre, pour donner deux fragments 16 et 18 de tailles inférieures à B. Le procédé consiste dans un premier temps à réaliser une PCR quantitative pour mesurer le nombre NI de copies intactes d'une séquence cible Cl de taille L1, Ll étant inférieure ou égale à (B-1). Pour qu'une séquence d'ADN soit amplifiable par PCR, il faut qu'elle soit intacte sur la totalité de sa longueur, c'est-à-dire non coupée et ne présentant pas de modification chimique ou enzymatique capable de bloquer la progression de la polymérase dans l'étape d'extension de la PCR. La mesure par PCR quantitative du nombre de copies d'un fragment donné dans un échantillon donné d'origine connue donne donc directement le nombre de copies intactes de ce fragment cible. Si la masse N d'ADN, c'est-à-dire le nombre de copies du fragment d'ADN initial intact de taille B contenu dans l'échantillon, est connue, on détermine ensuite la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en appliquant la formule Pcut = 1-( Nl /N) ~~ Ll Si la masse N d'ADN n'est pas connue, le procédé selon l'invention consiste ensuite à réaliser une seconde PCR quantitative pour mesurer le nombre N2 de copies intactes d'une séquence cible C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1. Les étapes a) et b) peuvent consister à réaliser deux PCR quantitatives en monoplex ou une seule PCR quantitative en duplex. Sur la figure 2 est représenté un échantillon d'ADN issu de la dégradation d'une population initiale de N copies d'un fragment intact de taille B nucléotides. Chaque fragment de longueur B porte deux séquences nucléotidiques spécifiques Cl et C2 de tailles Ll et L2 avec L2 La masse N d'ADN peut être déterminée à partir de Pcut sachant que N = Ni / (1- Pcut)LI-1= N2 / (1- Pcut)-2-1. Ainsi, si N n'est pas connu, on peut déterminer cette caractéristique en utilisant la formule : N = N1 / (1- P)'1 ou N = N2 / (1- Pcut)L2-1. Une fois que N est déterminé ou si N est connu, on peut déterminer des intervalles de confiance à 95% selon la formule suivante : Interval le.conf(Pcut) =1ù (1ù Pcut) 1+/ 1,96 1 + 1 ù Z (1- Pculi-1 (1- Pcut)`2-1 Selon un autre aspect de l'invention, il est possible de déterminer à l'étape d) à partir de Pcut la distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon. Pour cela, pour chaque fragment de longueur L nucléotides, il est nécessaire de considérer QL la probabilité qu'un fragment soit de longueur L après dégradation c'est-à-dire la proportion de fragments de longueur L nucléotides dans l'échantillon. Pour déterminer QL deux situations sont à distinguer. Si L est égal à B, alors QL correspond à la probabilité qu'aucune liaison nucléotide-nucléotide 14 ne se soit rompue, c'est-à-dire la probabilité que le fragment 10 d'origine reste intact. La probabilité pour qu'une liaison nucléotide- nucléotide reste intacte correspond à (1-Pcut). Etant donné qu'il s'agit d'évènements indépendants pour chaque liaison 14, la probabilité permettant aux (B-1) liaisons de rester intactes est (1- Pcut)B-1 Ainsi, si L =B, alors QL _ (1- Pcut)B-1. Si L est inférieur à B, alors le calcul de QL est plus complexe. Un fragment de longueur L ne peut être formé qu'après un certain nombre s de coupures, et s coupures donnent (s+1) fragments. Le nombre de liaisons nucléotide-nucléotide rompues ne peut excéder (B-L) car dans ce cas au moins une des (L-1) liaisons formant le fragment de longueur L est rompue. La détermination de QL nécessite l'énumération de tous les chemins possibles pour générer un fragment de longueur L après avoir cassé s liaisons, s allant de 1 B-L à (B-1). Ainsi : QL s-~PS.PLis avec PS la probabilité de générer s coupures et PLIS la probabilité que le fragment soit de longueur L sachant qu'il y a eu s coupures. La probabilité de générer s coupures PS peut être déterminée à l'aide d'une loi binomiale de paramètre B-1 et Pcut, (Bin(B-1, Pcut)), c'est-à-dire qu'on considère que l'on renouvelle (B-1) fois de manière indépendante une épreuve de Bernoulli de paramètre Pcut. L'épreuve de Bernoulli de paramètre Pcut correspond à une expérience aléatoire à deux issues possibles : � succès � et � échec �, Putt étant la probabilité de succès et (1- Pcut) la probabilité d'échec. Les évènements sont indépendants et (Pcut)5 est la probabilité que s coupures se produisent. Pour qu'il y ait exactement s coupures, il est nécessaire que les ((B-1)-s) liaisons restantes du fragment restent intactes. Cela se produit avec une probabilité correspondant à (1- Pcut)(B-1)-s. Etant donné que les coupures peuvent se situer n'importe où sur le fragment, il faut prendre en compte le nombre de possibilités de placer s coupures sur un fragment de longueur B. Ainsi, PS = P(Bin(B-1, Pcut)) = CB 1 * s )(B-1}s *(1- Put où CB_1 est le nombre de combinaisons de s éléments parmi B-1. Par ailleurs, la probabilité Pais d'avoir un fragment de longueur L sachant qu'il y a sù1 eu s coupures est : Pais = ` BS1-L , où CB2,_L est le nombre de combinaisons de (s-1) CB-1 éléments parmi (B-1-L) et où CB_1 est le nombre de combinaisons de s éléments parmi (B-1). Donc la proportion de fragments de longueur L nucléotides dans l'échantillon peut être déterminée en appliquant la formule : B L Cs Ps (1û P ce 1 s Cs 1 BûL QL Bû1. cut cut B 1ûL ù s=1 Cs 1 Ps /1 ù PB 1-s Ps B Cs Bû1ûL cut• cut) s=1 -1 BûL QL = P (1ùP )L-1 L Cs-1 Ps-1 (1ùP )BûLûs cut cut BûLû1 cut cut s=1 Or, en utilisant la formule du binôme de Newton, on arrive à la simplification suivante : BûL sû1 sû1 BûLûs B 1 CB-Lû1' cut •(1û' cut) = 1 = 1. s=1 Ainsi, si L est inférieur à B, la proportion de fragments de longueur L se définit par : QL = Pcut(1- Pcut)L 1 Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une étape basée sur QL la proportion de fragments de longueur L, en utilisant la formule : QL = (1- Pcut)B-1 si L = B, QL = Pcut(1- Pcut)L-1 si 1 L. Selon un autre aspect de l'invention, pour caractériser l'échantillon d'ADN après avoir déterminé Pcut on peut calculer le profil de distribution de la masse des fragments, et faire une simulation approximative de la distribution électrophorétique de la population de l'échantillon. Ce profil est déterminé par le calcul pour chaque fragment de longueur L de ML la masse des fragments de taille L. Selon l'invention, la masse de chaque fragment ML, correspond au produit de la taille L du fragment par sa proportion QL : ML = L.QL, car la masse d'un fragment peut être considérée comme proportionnelle à sa taille du fait que les nucléotides ont des masses voisines. Ainsi, pour déterminer ML, il faut appliquer la formule : - ML = LxPcutx(1-Pcut)L-1 , si 1 L P.t = 1- exp(-k.t) Ainsi, dans un échantillon isolé dont on connaît le temps de stockage t, après avoir effectué les étapes a) à c), il est possible de déterminer la valeur de la constante de vitesse de dégradation k. Cela permet notamment d'évaluer la durée de la conservation de l'ADN. Le procédé selon l'invention peut être en partie mis en oeuvre sur un ordinateur, en particulier les étapes c) et d). Sur la figure 5, les données de la colonne 30 sont les données fournies par l'utilisateur du procédé, celles de la colonne 40 les données déterminées expérimentalement et celles de la colonne 50 les données susceptibles d'être déterminées par un ordinateur. Dans la colonne 30, les données pouvant être fournies par l'utilisateur sont les suivantes - 31 la taille Ll d'une séquence nucléotidique Cl, - 32 la taille L2 d'une séquence nucléotidique C2, - 33 la masse N d'ADN de l'échantillon d'origine (nombre de copies du fragment de taille B intact à l'origine avant toute dégradation) - 34 la taille L d'une séquence nucléotidique C pour laquelle on souhaite réaliser une PCR, - 35 le volume V d'échantillon qui sera placé dans la réaction pour laquelle 25 on souhaite réaliser une PCR, et - 36 le temps t de dégradation. Dans la colonne 40, on a représenté en 43 un thermocycleur comprenant éventuellement un logiciel intégré, permettant de réaliser des PCR quantitatives sur l'échantillon étudié pour les cibles Cl et C2 et obtenir N1 et N2 respectivement représentés par les références 41 et 42. Les données 41 et 42 sont exportées dans un logiciel permettant la mise en oeuvre des étapes c) et/ou d) sur un ordinateur. Enfin, dans la colonne 50, les données pouvant être calculées à l'aide d'un logiciel mis en oeuvre sur un ordinateur sont : - 51 Pcut, - 52 la distribution des fragments (profil de distribution de la taille des fragments et/ou profil électrophorétique), - 53 N, - 54 la probabilité PPC, d'amplifier un fragment cible de taille Lx, - 55 le volume à utiliser pour avoir une PCR positive sur un fragment cible de taille Lx, et - 56 la vitesse de dégradation. Avantageusement, le procédé selon l'invention, qu'il soit ou non mis en oeuvre en partie sur un ordinateur, peut permettre de caractériser de faibles quantités d'ADN dégradés. Il peut être utilisé dans différents domaines. Il peut bien entendu être appliqué à la détermination de la taille des fragments et de la quantité d'ADN dans un échantillon. Il peut aussi être utile par exemple pour caractériser un échantillon avant de réaliser d'autres analyses et pour déterminer la quantité d'un échantillon minimum à utiliser pour avoir une PCR positive avec un fragment de taille donnée, ou la taille maximum qui peut être amplifiée avec une quantité donnée d'échantillon. Parmi les nombreuses applications du procédé selon l'invention on peut citer notamment la médecine légale, les études portant sur l'ADN ancien, la médecine par exemple pour la caractérisation d'ADN dans le sérum pour le diagnostic du cancer, la zoologie pour la caractérisation d'ADN à partir de plumes, poils ou déjections, la détection des fraudes pour la quantification de la contamination en OGM dans un produit alimentaire, l'UV � dosimetry� (Hegedus et al., 2003), l'étude de la dégradation de l'ADN en général ou encore pour la quantification des lésions induites par des produits chimiques, l'oxydation ou les radiations. Le procédé selon l'invention est particulièrement intéressant pour caractériser une contamination d'un produit par les OGM, c'est-à-dire pour la détection et le dosage d'un organisme génétiquement modifié dans un échantillon de produit donné, en particulier pour les produits alimentaires où l'ADN est souvent très dégradé à cause des traitements subis par le produit. En effet, actuellement le taux de contamination par les OGM peut être évalué par PCR quantitative en utilisant des cibles spécifiques respectivement de l'OGM et du produit. Généralement les deux PCR quantitatives sont conduites sur deux cibles de taille similaire dans le but d'avoir des efficacités d'amplification équivalentes. Cependant cette méthode repose sur l'hypothèse que les ADN des deux organismes (modifié et non modifié) se dégradent à la même vitesse, en particulier qu'ils ont subi le même traitement et donc les mêmes processus de dégradation ce qui n'est pas forcément le cas. Ceci est particulièrement vrai pour les produits alimentaires où l'ADN est souvent très dégradé à cause des traitements subis par le produit. Avantageusement le procédé selon l'invention pallie les inconvénients de l'art antérieur. Il peut être utilisé dans un échantillon d'un produit X contenant potentiellement des produits génétiquement modifiés XM. Il consiste alors à appliquer le procédé pour le produit génétiquement modifié XM et pour le produit non génétiquement modifié X, afin de déterminer la masse d'ADN du produit XM, la masse d'ADN du produit X, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit XM, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit X et le pourcentage de contamination de l'échantillon en produits XM. Il est possible de réaliser les étapes a) et b) du procédé pour X et pour XM en effectuant une PCR quantitative en quadruplex ou en effectuant deux PCR quantitatives en duplex ou encore quatre PCR quantitatives en monoplex, avec des amorces adéquates c'est-à-dire deux couples spécifiques de l'OGM XM et deux couples spécifiques du produit contaminé X. Le procédé selon l'invention est également particulièrement utile pour des analyses effectuées par la police scientifique ou encore pour un praticien de l'ADN ancien. En particulier, le procédé selon l'invention peut être utilisé pour déterminer la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage ou pour donner une indication sur les risques de contamination d'un ADN ancien par de l'ADN moderne. Le procédé selon l'invention est également utile pour des chercheurs dans le domaine médical par exemple pour des analyses d'ADN extracellulaires ou en bactériologie ou encore dans tout domaine de recherche où l'on étudie la dégradation et/ou la modification de l'ADN. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un kit pour la mise en 15 oeuvre du procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN. Ce kit comprend au moins : - des amorces pour amplifier respectivement des séquences Cl de taille Ll et C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1, et Ll inférieure ou égale à (B-1), - des réactifs pour effectuer la ou les PCR quantitative(s), à savoir au 20 moins des tampons, des enzymes et un système de détection par fluorescence, et - une notice explicative expliquant la mise en oeuvre du procédé. Le kit peut également comprendre un programme d'ordinateur permettant la mise en oeuvre sur un ordinateur des étapes c) et d) du procédé. Ainsi, un technicien de la police scientifique qui souhaite analyser un échantillon 25 d'ADN d'origine connue, peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la médecine légale, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, et déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données. Un praticien de l'ADN ancien qui souhaite analyser un échantillon d'ADN ancien d'origine connue, peut à partir d'un kit selon l'invention - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à l'ADN ancien, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données et donner une indication sur les risques de contamination. Pour la détection et le dosage d'un OGM dans un produit alimentaire, un praticien peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en quadruplex, ou deux PCR quantitatives en duplex ou quatre PCR quantitatives en monoplex, avec deux couples d'amorces spécifiques de l'OGM C1 et C2, et deux couples d'amorces spécifiques du produit alimentaire Cl' et C2', - exporter les données obtenues (N1, N2, Ni' et N2') et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'OGM et du produit alimentaire, leurs tailles moyennes, et le pourcentage de contamination du produit alimentaire. Pour un chercheur qui souhaite analyser un échantillon d'ADN très dégradé, il peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour Cl et C2, ou deux PCR quantitatives en monoplex, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa taille moyenne, la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage, déterminer la taille maximum de cible que l'on peut amplifier à partir d'un échantillon donné, déterminer la probabilité d'une PCR positive pour une masse et une taille de cible données, et déterminer une vitesse de modification ou de dégradation. Pour un chercheur qui souhaite analyser un échantillon d'ADN peu dégradé, par exemple, il peut à partir d'un kit selon l'invention : - effectuer une pré-amplification d'un grand fragment d'ADN, - effectuer une PCR quantitative en duplex avec des amorces pour C1 et C2, 20 ou deux PCR quantitatives en monoplex, la séquence Cl étant prise dans le fragment préamplifié, - exporter les données obtenues (N1 et N2) et d'autres données dans un programme d'ordinateur spécifique adapté à la recherche, et - utiliser ce logiciel pour déterminer la masse d'ADN de l'échantillon, sa 25 taille moyenne, et une vitesse de dégradation et/ou de modification. L'invention est à présent illustrée par un exemple réalisé sur des échantillons d'ADN génomique. Dans l'exemple les échantillons génomiques sont digérés à la DNase I pour générer des populations de fragments de tailles décroissantes et de masse connue. Ces populations sont ensuite analysées par PCR quantitative en temps réel sur deux tailles de fragments et en parallèle analysées par électrophorèse dénaturante pour évaluer la taille moyenne majoritaire en masse, c'est-à-dire où il y a le maximum d'intensité. Les résultats de la PCR quantitative permettent de calculer Pcut et donc de déterminer le nombre de copies introduites dans la PCR et la taille moyenne des échantillons. Ces données sont comparées à la quantité d'ADN connue introduite et à la taille déterminée sur gel. I. Matériel et méthode Les échantillons d'ADN génomique utilisés sont extraits de prélèvements sanguins par la méthode au phénol chloroforme. I.1 Dégradation de l'ADN génomique en solution à la DNaseI Pour obtenir une collection d'échantillons contenant chacun une même masse d'ADN et des fragments d'ADN de tailles décroissantes, la réaction enzymatique est réalisée à 37°C dans un tube unique et des aliquotes de volumes identiques sont prélevées à divers temps de dégradation. La DNase I est utilisée en présence de MgCl2 et catalyse la formation aléatoire de coupures simple brin. La solution de DNase I est préparée comme suit : une dilution d'une solution de DNase I (Sigma D5025 650 pg.mL-1) est réalisée au 1/2166ème par dilutions successives dans de l'eau ultra-pure (5 pL de DNase I + 45 pL d'eau puis 10 pL + 90 pL d'eau puis 20 pL + 180 pL d'eau puis 115,4 pL + 134,6 pL d'eau). On utilise un pré-mix d'ADN contenant dans un volume de 900 pL, 200 pg d'ADN génomique dans un tampon Tris HCI 55 mM, en présence de 4mM de MgCl2. Un volume réactionnel de 75 pL contenant 15 pg d'ADN est prélevé en cours de digestion à des temps donnés. La réaction est bloquée par ajout de 37,5 pL d'EDTA 0,1 M suivi d'un chauffage de 10 minutes à 70°C et d'un refroidissement dans la glace. Une fraction de 50 pL de chaque échantillon est prélevée et stockée à -20°C pour les analyses par PCR quantitatives. Le reste des échantillons est précipité pour être concentré, par ajout de 2 volumes d'éthanol absolu en présence de 0,1 volume de NaCl 5 M et de 1 pL de glycogène à 20 mg.mL-1. Après incubation d'une nuit à -20°C et centrifugation 20 min à 13 000 rpm à 4°C, les surnageants sont éliminés et les culots d'ADN sont lavés avec 500 pL d'éthanol à 70%. Le lavage est répété et les culots sont remis en solution dans 10 pL de Tris HCI 0,01 M à pH 7,5. I.2. Analyses par PCR Les amorces utilisées sont dessinées à l'aide du logiciel Primer 3. Les amorces sont choisies de manière à avoir une taille de 20 nucléotides, une "température de fusion" leur permettant de s'hybrider à 55°C et un pourcentage de G + C (Guanine + Cytosine) de 45%. Séquences des amorces (5'->3') p-2-micro-globuline sur ADN génomique de cheval B2M-328-s CCT TAG CTG CTG ACG GTT GT 328 pb 20 B2M-328-as GCA GGG CTT ACA GAC AA GG B2M-161-s CAC CCC CAA TGT TTC TCA CT B2M-161-as CCT GCC AGA GGT TAC TGG AG 25 Pour chaque PCR, le mélange suivant est réalisé, les concentrations données étant les concentrations finales : 2,5 pL de tampon 10x Platinum Taq Polymerase (Invitrogen) lx 0,75 pL de MgCl2 (Invitrogen) 1,5mM 161 pb 0,5 pL de dNTPs à 10mM de chaque (Promega) 0,2mM 0,5 pL de chacune des amorces à 10 pM 0,2 pM 0,1 pL de Platinum Taq polymerase (Invitrogen) 1 IL de Sybr Green I au 1/1 000ème (Molecular probes) q.s.p. 25 pL avec de l'eau ultra-pure selon le volume d'ADN utilisé. Concernant les dispositifs utilisés, le Rotor Gene 3000 de Corbett Research est utilisé. Les cycles de PCR sont programmés comme suit : Dénaturation / activation de l'enzyme 2 minutes à 94°C Dénaturation 30 secondes à 94°C Hybridation 30 secondes à 55°C 45 cycles Elongation 1 minute à 72°C Elongation finale 1 minute à 72°C Une courbe de fusion (melt) est programmée en fin de réaction. Elle permet pour chaque réaction de mesurer la température de fusion (Jennerwein & Eastman) des produits amplifiés afin de vérifier la spécificité de la PCR et l'unicité des produits obtenus (absence de dimères d'amorces notamment). Au cours des cycles, l'acquisition du signal de fluorescence du SybrGreen est réalisée à la fin de chaque étape d'élongation (lorsque les produits de la PCR sont sous forme double brin). I.3. Electrophorèses Les échantillons sont additionnés de tampon de charge dénaturant (NaOH 0,3M, EDTA 6mM, glycérol 30%, bleu de bromophénol 0,25%, xylène cyanol 0,25%). Le gel d'agarose est additionné de 50mM de NaOH. Les échantillons et des standards de taille sont déposés et mis à migrer à 20V pendant 16 heures en chambre froide. Après migration, le gel est placé dans un bain de neutralisation (Tris HCI 1M pH 7,5, NaCl 1,5 M) pendant 40 min. Il est ensuite coloré dans un bain de SybrGreen II dilué au 10 000ème dans du TAE 0,5x pendant 7 h sous agitation. Le gel est ensuite placé sur un transilluminateur UV et photographiés par un appareil de photographie numérique équipé du filtre approprié grâce au système � Visio-mic � (Genomic SA). Une fois le gel photographié, le logiciel permet de repérer chaque piste (le lieu de passage des molécules à partir de chaque puits) et trace le profil d'intensité en fonction de la distance de migration. D'autre part, les profils d'intensités des marqueurs sont enregistrés avec les tailles qui leur correspond, celles-ci servant d'étalon pour la détermination des tailles des fragments d'ADN selon leur distance de migration. Ces profils sont exportés dans le logiciel Microsoft Excel et pour chaque échantillon analysé, la taille du maximum d'intensité (Lmoy) est déterminée. II. Exemple Des échantillons d'ADN génomique de concentration connue sont digérés à la DNase I. Ils sont analysés par gel dénaturant et par qPCR (SybrGreen) en triple afin de déterminer les nombres N1 et N2 de copies amplifiables des fragments C1 et C2 de taille L1 = 328 et L2 = 161 dans les échantillons digérés. Les résultats de la digestion à la DNase I sont présentés sur la figure 6. Sur cette figure t1 à t10 correspondent respectivement à 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 40, 50 et 60 minutes et M1 au marqueur A/Hind III(Promega), M2 au marqueur 100bp DNA ladder (Invitrogen) et M3 au marqueur 1kb DNA ladder (NEB). On constate que la digestion à la DNase I permet d'obtenir des fragments de tailles moyennes décroissantes. La détermination directe des tailles moyennes étant difficile à partir du gel, elle est réalisée avec le tracé des profils dans Excel. La taille correspondant au maximum d'intensité est déterminée pour chaque temps de dégradation. Les résultats de la PCR quantitative ainsi que le calcul du nombre de copies du fragment introduit à l'origine N par N = N1 / (1- P.-F)' 14 ou N = N2 / (1- P.-F)-24 sont présentés sur la figure 7 pour 10 échantillons. On constate que le nombre de copies est constant au cours de la digestion et que le procédé selon l'invention permet d'obtenir une bonne estimation de N. La quantification donne bien la valeur de nombre de copies N attendu. En outre, la figure 8 permet de comparer pour chaque échantillon la taille 5 moyenne des fragments, mesurée sur gel et calculée par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention avec Lmoy = min (B, 1/Prut). On constate qu'il y a une très bonne corrélation entre les tailles calculées et mesurées. Le procédé selon l'invention permet donc une bonne détermination de la taille moyenne des fragments dégradés Lmoy• REVENDICATIONS1. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, contenant, avant dégradation, N copies d'un fragment d'ADN intact de taille B, comprenant les étapes suivantes : a) mesure par PCR quantitative du nombre N1 de copies intactes d'une séquence nucléotidique cible Cl de taille L1, L1 étant inférieure ou égale à (B-1), b) mesure par PCR quantitative du nombre N2 de copies intactes d'une séquence nucléotidique cible C2 de taille L2, L2 étant inférieure à L1, c) calcul de la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en utilisant la formule : Pcut = 1-(NI/N2)1/('I-'2), d) à partir de Pcut, détermination d'une ou plusieurs donnée(s) caractérisant l'échantillon d'ADN, choisie(s) parmi : - la masse N de l'ADN contenu dans l'échantillon correspondant au nombre initial de copies du fragment d'ADN intact de taille B, - la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon, - le profil de distribution de la taille des fragments contenus dans l'échantillon, - le profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon d'ADN, - la probabilité qu'une séquence nucléotidique soit intacte, - la probabilité d'avoir une PCR positive, - la quantité minimum d'échantillon à utiliser pour avoir une PCR positive,- la taille maximum d'une cible qui peut être amplifiée avec une quantité d'échantillon d'ADN donnée, - la vitesse de dégradation ou de modification de l'ADN. 2. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue, 5 contenant, avant dégradation, N copies d'un fragment d'ADN intact de taille B, N étant connu, comprenant les étapes suivantes : a) mesure par PCR quantitative du nombre N1 de copies intactes d'une séquence nucléotidique cible Cl de taille L1, L1 étant inférieure ou égale à (B-1), 10 c) calcul de la probabilité de coupure par nucléotide Pcut, en utilisant la formule : Pcut = 1-( N1 /N) 1/ L1 d) à partir de Pcut, détermination d'une ou plusieurs donnée(s) caractérisant l'échantillon d'ADN, choisie(s) parmi : - la taille moyenne des fragments d'ADN contenus dans 15 l'échantillon, - le profil de distribution de la taille des fragments contenus dans l'échantillon, - le profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon d'ADN, 20 - la probabilité qu'une séquence nucléotidique soit intacte, - la probabilité d'avoir une PCR positive, - la quantité minimum d'échantillon à utiliser pour avoir une PCR positive, - la taille maximum d'une cible qui peut être amplifiée avec 25 une quantité d'échantillon d'ADN donnée, - la vitesse de dégradation ou de modification de l'ADN. 3. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape d) comprend ladétermination à partir de Pcut de la masse N de l'ADN contenu dans l'échantillon, correspondant au nombre initial de copies du fragment d'ADN intact de taille B, en utilisant la formule : N = N1 / (1- Pcut)' 14 ou N = N2 / (1- P)'24. 4. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape d) comprend la détermination à partir de Pcut de la taille moyenne Lmoy des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon en utilisant la formule : Lmoy = min(B , 1/Prut). 5. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape d) comprend la détermination à partir de Pcut du profil de distribution de la taille des fragments d'ADN contenus dans l'échantillon en calculant pour chaque cible C de longueur L, QL la proportion de fragments de longueur L, en utilisant la formule : - QL = (1- P.t)B-1 si L = B, - QL = P.t(1- P.t)L-1 si 1 L 6. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape d) comprend la détermination à partir de Pcut du profil de distribution de la masse des fragments contenus dans l'échantillon en calculant pour chaque cible C de longueur L, ML la masse des fragments de taille L, en utilisant la formule : - ML = LxP.tx(1-Pcut)L-1 , si 1 L 7. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'une 25 partie dudit procédé est mise en oeuvre sur un ordinateur. 8. Procédé de caractérisation d'un échantillon d'ADN d'origine connue selon la revendication 7, caractérisé en ce que les étapes c) et d) sont mises en oeuvre sur un ordinateur. 9. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des précédentes revendications pour la détection et le dosage d'un organisme génétiquement modifié dans un échantillon de produit donné. 10. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans un échantillon d'un produit X, contenant potentiellement des produits génétiquement modifiés XM, caractérisée en ce qu'elle consiste à appliquer le procédé pour le produit génétiquement modifié XM et pour le produit non génétiquement modifié X, afin de déterminer la masse d'ADN du produit XM, la masse d'ADN du produit X, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit XM, la taille moyenne des fragments d'ADN du produit X et le pourcentage de contamination de l'échantillon en produits XM. 11. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour déterminer la quantité optimale d'échantillon à utiliser pour une analyse de génotypage. 12. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour donner une indication sur les risques de contamination d'un ADN ancien par de l'ADN moderne. 13. Utilisation du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, pour étudier la vitesse de dégradation et/ou la modification de l'ADN. 14. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins - des amorces permettant d'amplifier une séquence Cl de taille Ll et C2 de taille L2, Ll étant inférieure à L2, et L2 inférieure ou égale à (B-1), - des réactifs pour effectuer la ou les PCR quantitative(s), à savoir au moins des tampons, des enzymes et un système de détection par fluorescence, et - une notice explicative expliquant la mise en oeuvre du procédé. 15. Kit selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend également un programme d'ordinateur permettant la mise en oeuvre sur un ordinateur des étapes c) et d) du procédé selon l'une des revendications 1 à 8.