Brevet FR2936256A1 — publié le 20100326

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du récepteur LGR5, pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie. Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs aimées. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col., 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagène pour les étapes IV à v et anagène tardive pour les étapes VI et VII. La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller-Rover et col., 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974). Chez la souris et les autres mammifères à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent � synchronisés �, c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région anatomique (Muller-Rover et col., 2001). La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie. II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont : 2 2936256 • l'alopécie androgénétique héréditaire est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ; • l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une 5 irradiation aiguë ; • l'alopécie Areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus 10 aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps. Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n'étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter 15 contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène. On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux. 20 La demanderesse a maintenant trouvé que le gène codant pour LGR5 était exprimé spécifiquement dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour 25 prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie. Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata. LGR5 30 Le gène LGR5 code pour un récepteur orphelin couplé à une protéine G. LGR5 aussi appelé GPR49, HG38, ou FEX, est une protéine ayant une partie extra-cellulaire constituée de 18 unités dites LRR (Leucine-rich repeat) et d'une partie transmembranaire. Dans le contexte de l'invention, le terme � gène LGR5 � ou � acide nucléique LGR5 � signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la protéine LGR5. Si la cible visée est 35 de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant le récepteur LGR5, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour le récepteur. La séquence nucléique humaine (SEQ ID No.1) et la séquence protéique humaine (SEQ ID No.2) du récepteur LGR5 sont reproduites en annexe. 3 2936256 LGR5 est un gène cible de la voie de signalisation Wnt. La cascade de signalisation Wnt est une voie impliquée dans la prolifération et la détermination cellulaire. En absence de signal Wnt, la protéine cytoplasmique f3- 5 caténine s'associe avec un complexe de destruction contenant diverses protéines, l'axine, la kinase GSK-3(3 (Glycogen Synthase Kinase-3(3) et l'APC (Adeomatosis Polyposis Coli). Par fixation sur ce complexe, la (3-caténine est phosphorylée et ubiquitinée, ce qui entraîne sa dégradation. La voie Wnt est impliquée dans le développement des annexes tégumentaires (plumes poils glandes) mais joue également 10 un rôle au court du cycle pilaire. L'expression spécifique de LGR5 dans les kératinocytes du poil et son induction au cours de l'entrée en anagène suggère qu'il joue un rôle important dans l'homéostasie du follicule pileux. Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution 15 de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine LGR5 par un test immunohistochimique ou immunoessai (est-ce la même chose ?), par exemple par dosage 20 ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du récepteur LGR5 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet � contrôle � est un sujet � sain �. Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le � sujet contrôle � fait référence au 25 même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To) Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du récepteur LGR5, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie. Un tel suivi peut 30 conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5 de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un 35 de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine LGR5, par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm 4 2936256 correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du récepteur LGR5 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet � contrôle �, dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de 5 référence � saine �. La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence 10 l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie. Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour 15 le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur LGR5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité du récepteur LGR5, 20 ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant les étapes suivantes : 25 a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression 30 de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le 35 mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par �modulation �, on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité du récepteur LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. 5 2936256 Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine LGR5, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par � expression 5 d'une protéine �, on entend la quantité de cette protéine ; Par � activité d'une protéine �, on entend son activité biologique ; Par � activité d'un promoteur �, on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). 10 Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les 15 composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur LGR5. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène LGR5, 20 et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la 25 protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur LGR5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à 30 mesurer l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène LGR5 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fibroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, 35 comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le récepteur LGR5, de préférence humaine ou de mammifère. 6 2936256 Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. 5 Dans ces méthodes, l'expression du gène LGR5 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. 10 L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RTPCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, 15 avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou 20 enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de 25 l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence. 30 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûLGR5 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi 35 connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression 7 2936256 sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps 5 ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. 10 Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse 15 (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides 20 ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). 25 Le récepteur LGR5 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. 30 Modulateurs du récepteur LGR5 L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur LGR5 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode 35 comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur LGR5, à un patient nécessitant un tel traitement. De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du récepteur LGR5. 8 2936256 L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du récepteur LGR5, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. 5 Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, 10 de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au 15 traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition 20 pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur du récepteur LGR5 allant de 0,001 25 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : 30 - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; 35 - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B ; 9 2936256 - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. 5 Légende des figures : La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région 10 du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure lA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure 1B représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure 1C représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que 15 l'ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure 1B). La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression du récepteur LGR5/GPR49, exprimés par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris 20 contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés 25 et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix. La Figure 3 montre l'expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris en télogène et début d'anagène par hybridation in situ. La Figure 3A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en télogène soumise à une hybridation in 30 situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline. La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en 35 anagène précoce (III) soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre-colorée à l'hématoxyline. io 2936256 La Figure 4 montre l'expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris en anagène tardive et catagène par hybridation in situ. La Figure 4A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène tardive soumise à une hybridation in 5 situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 4B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline. La Figure 4C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en 10 catagène soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens du récepteur LGR5/GPR49, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre-colorée à l'hématoxyline. 15 Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression du récepteur LGR5/GPR49 au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix. 20 Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène (Chase, 1954) ont été ovariectomisées ou non au jour 1 de l'étude. L'ovariectomie pratiquée pendant la phase télogène provoque sous une semaine une entrée massive des 25 follicules pileux de la région dorsale en phase anagène (Chanda, 2000.) alors que les follicules pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en télogène. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude. Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du 30 transcriptome par la technologie des puces Affymetrix. L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. A partir d'ADNc double brin, les ARNc marqués à la biotine sont synthétisés en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP 35 conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système � Lab on a chip � d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les Il 2936256 résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide 5 hybridant parfaitement (� perfect match �) versus un oligonucléotide qui contient une mutation,(� single mismatch �) dans la région centrale de l'oligonucléotide. Résultats: Figure 1 : 10 En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (1A). Chez les souris soumises à une ovariectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagène (1B). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l'ovariectomie à induit la transition de la 15 phase télogène à la phase anagène. La phase anagène est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude. Figure 2 : Le récepteur LGR5/GPR49 est exprimés en phase télogène et en phase anagène du cycle 20 pilaire. L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (JO) et anagène (J8 ovariectomisé) montre que l'expression des transcrits du récepteur LGR5/GPR49 est induite en anagène précoce par rapport au stade télogène, alors que chez les souris contrôles, l'expression du récepteur LGR5/GPR49 n'est pas induite par rapport au début d'étude. 25 Exemple 2 : Expression du récepteur LGR5/GPR49 dans la peau de souris par � hybridation in situ � Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription Sox4 par 30 incubation du gène linéarisé (2�g) avec 63 �Ci de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4�m de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de 35 préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/�135S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au 12 2936256 moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense 5 (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) utilisé comme contrôle négatif. Résultats: Figure 3 10 Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en télogène. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en début d'anagène (stade III). La Figure 3A montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé spécifiquement au niveau des follicules pileux dans la peau de souris en télogène. Plus particulièrement, le récepteur LGR5/GPR49 est présent dans les kératinocytes au contact de la papille dermique. 15 La Figure 3C montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé de façon spécifique dans les follicules pileux en début d'anagène au niveau des kératinocytes qui formeront le nouveau follicule pileux Figure 4 20 Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en anagène tardive. Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en catagène. La Figure 3A montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé spécifiquement dans la gaine épithéliale externe des follicules pileux dans la peau de souris en anagène tardive. La Figure 3C montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé de façon spécifique dans les follicules 25 pileux en début catagène. Conclusion: L'exemple 1 montre que le récepteur LGR5/GPR49 est exprimé dans la peau et induit au cours de l'entrée en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène LGR5 est exprimé de façon 30 spécifique dans les kératinocytes des follicules pileux aux différents stades du cycle pilaires. L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression du récepteur LGR5/GPR49 chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de 35 l'utilisation du récepteur LGR5/GPR49 pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie. 13 REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de LGR5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine LGR5, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la protéine LGR5, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour le récepteur LGR5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur LGR5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme. i4 2936256 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour le récepteur LGR5. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est 5 déterminée en mesurant le taux de tran:>cription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10