Brevet FR2936253A1 — publié le 20100326

La présente invention se rapporte à un procédé de détection par amplification par PCR en temps réel pour le diagnostic rapide de Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli et Brachyspira intermedia présent dans l'environnement ou sur des mammifères dans le cadre d'une application en diagnostic de routine. La présente invention se rapporte également à un kit de détection mis en oeuvre par le procédé susmentionné. Ces bactéries du genre Brachyspira sont à l'origine de diverses affections digestives chez le porc. De plus la réglementation des facteurs de croissance dans l'alimentation porcine a comme principale conséquence la recrudescence des pathologies digestives liées aux Brachyspira. Différents groupes correspondant aux cinq principales espèces chez le porc ont été décrits: B. hyodysenteriae, B. intermedia, B. murdochii, B. innocens, B. pilosicoli. Les affections liées à ces différentes espèces n'ont pas la même incidence économique. B. hyodysenteriae est responsable de la dysenterie porcine caractérisée par une diarrhée muccohémorragique. Cette pathologie entraîne des pertes économiques importantes du fait d'un retard de croissance des animaux infectés. C'est une des pathologies digestives les plus coûteuses pour l'industrie porcine. B.pilosicoli est l'agent responsable de la spirochétose intestinale porcine, les animaux infectés présentent une diarrhée non hémorragique, et une réduction des indices de croissance. L'incidence de pathologie des autres espèces de Brachyspira isolées chez le porc est mal élucidée. B.intermedia est fréquemment isolée de fèces de porc en engraissement présentant des symptômes diarrhéiques. Brachyspira hyodysenteriae est l'agent de la dysenterie porcine appelée entérite hémorragique, maladie identifiée dans tous les pays ou l'élevage porcin est développé et affectant principalement les porcs en engraissement. La dysenterie porcine est une maladie dont les répercussions économiques sont importantes du fait de la mortalité et, surtout du coût des traitements et des retards de croissance engendrés.35 Le principal mode de contamination des élevages résulte de l'introduction d'animaux infectés. Les animaux guéris représentent un danger important car ils peuvent excréter le micro-organisme après les symptômes au-delà de 70 jours. D'autres modes de contamination peuvent être rencontrés (contamination par des effluents, contamination par des animaux porteurs, nourriture contaminée, objet souillé...). La période d'incubation varie de 5 à 37 jours avec une moyenne de 11 jours. Durant cette période d'incubation, les animaux peuvent déjà être excréteurs car ils éliminent la bactérie entre 3 et 18 jours après un contact infectant. Dans les cas typiques, l'état général des animaux est d'abord peu modifié, mais ils se nourrissent sans enthousiasme. Progressivement, les porcs maigrissent et peuvent devenir cachectiques. La majorité des animaux guérit en une ou deux semaines, mais l'indice de consommation augmente et le GMQ (Gain Moyen Quotidien) peut diminuer au-delà de 6 semaines. Dans les formes les plus graves, les animaux sont très affaiblis, ils se déshydratent et meurent en environ 5 jours. Brachyspira pilosicoli est responsable d'une infection expérimentalement reproductible et connue sous les noms de spirochétose intestinale du porc. Des infections ont été décrites dans la plupart des pays où l'élevage porcin est développé. Les facteurs prédisposants sont mal connus et invoquent la composition de l'aliment, le procédé de granulation, l'utilisation des facteurs de croissance. Le mode de contamination semble voisin de celui observé pour les infections Brachyspira hyodysenteriae. Les animaux les plus sensibles sont les porcs en engraissement. Expérimentalement, la période d'incubation a une durée de 5 à 16 jours, parfois plus et, dans les conditions naturelles, elle est de l'ordre de 7 jours. Les premiers signes cliniques sont une légère détérioration de l'état général et l'émission de fèces ramollies. L'état général des animaux est altéré, l'infection s'accompagne de fièvre, d'un faible indice de consommation et d'un retard de croissance important. Des cas de mortalité sont éventuellement observés (2% des animaux), mais l'importance de la maladie est avant tout liée aux pertes économiques résultants de la diminution de la croissance et du coût des traitements. Brachyspira intermedia est isolée de porcs, souffrant éventuellement de diarrhées mais, à l'exception d'une étude, la maladie n'a pas été reproduite. Le pouvoir pathogène pour le porc est encore controversé, même si, après le sevrage, quelques cas de diarrhée sont associés à la présence de cette espèce dans l'intestin. Le diagnostic des infections liées à Brachyspira chez le porc est principalement basé sur l'isolement du germe en culture et sa caractérisation biochimique. Ils sont isolés à partir de fèces ou de contenu intestinal. L'isolement nécessite, après un pré-enrichissement sur bouillon, l'utilisation de milieu sélectif tel que le milieu Blood Agar Media contenant des antibiotiques (spectinomycine, rifampicine). Cette technique permet d'obtenir des résultats en 72 heures. De plus il est nécessaire de réaliser des analyses microbiologiques complémentaires pour le diagnostic de l'espèce (hémolysine, pouvoir indologène, productions de diverses enzymes...). Cette identification reste longue et fastidieuse. Les techniques de diagnostic indirect par mise en évidence d'anticorps (ELISA, hémagglutination indirecte, micro-agglutination...) sont parfois utilisées pour détecter des élevages infectés, mais elles ne permettent ni un diagnostic individuel ni la détection des animaux porteurs. Des tests PCR classiques, en point final, permettant l'identification des Brachyspira ont été décrits dans la littérature et comparés aux méthodes traditionnelles. Pronost et al. (Revue de Médecine Vétérinaire, Vol. 150, p. 803 à 808, 1999 û "Apports de la PCR pour l'identification des souches de Brachyspira pathogènes chez le porc") ont montré l'intérêt de la PCR en tant qu'outil de caractérisation d'un isolat de Brachyspira obtenu en culture pure. Il s'agit d'une amplification des gènes codant pour l'ARNr 16S, l'ARNr 23S, la NADH oxydase ou l'hémolysine. Ces tests sont généralement effectués sur des cultures car il est difficile d'extraire l'ADN directement à partir de fèces. Des diagnostics définitifs par PCR couplé à la méthode culture ne peuvent alors être établis que dans un délai de 5 à 7 jours. Toutefois, La et al. (J. of Chimical Microbiology, Vol. 41, p. 3372-3375, 2003- Development of a duplex PCR assay for detection of Brachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in pig feces) ont décrit un test de PCR en point final, utilisable sur l'ADN extrait des fèces. Ce test amplifie une portion du gène codant pour l'ARNr 16S pour Brachyspira pilosicoli et la NADH oxydase de Brachyspira hyodysenteriae. Il permet d'identifier plus rapidement les animaux infectés mais manque de sensibilité et de reproductibilité. En conclusion, il reste encore un besoin dans le développement de procédé permettant un diagnostic rapide, efficace, très sensible et reproductible de Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli et Brachyspira intermedia dans le cadre d'une application en diagnostic de routine. Un but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé de détection et de quantification de Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli et Brachyspira intermedia à partir d'un échantillon biologique prélevé dans l'environnement ou chez un mammifère et en particulier à partir de fèces, telles que des fèces de porc. Un autre but de la présente invention est de fournir des kits (ou trousses) pour la mise en oeuvre du procédé susmentionné. A cet effet, l'invention concerne un procédé de détection et de quantification du gène nox (gène NADH oxidase) de l'espèce Brachyspira issu d'un échantillon environnemental ou animal tel que des fèces de mammifères et en particulier de porc, par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), caractérisé en ce que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) étant en temps réel, le procédé comprend les étapes consistant à : (i) analyser ledit échantillon susceptible de contenir des Brachyspira par PCR avec un milieu réactionnel comprenant une amorce sens apte à se lier spécifiquement à la région non codante 5' du gène nox, une amorce anti-sens apte à se lier spécifiquement à la région codante 3' du gène nox, et une sonde marquée fluorescente détectable qui se lie spécifiquement à l'amplicon résultant de la réaction PCR, (ii) mesurer et quantifier, par l'intermédiaire d'un système optique d'un thermocycler ou d'un système équivalent, la présence d'émission de fluorescence indiquant, de façon proportionnelle, la quantité d'amplicon à chaque cycle PCR, de manière à pouvoir détecter la présence de Brachyspira à partir dudit échantillon environnemental ou animal. Le genre Brachyspira appartient à l'ordre des Spirochaetales et à la famille des � Brachyspiraceae �. Ce sont des bactéries hélicoïdales, Gram négatif, mobiles et anaérobiques. Les espèces d'intérêt vétérinaire se cultivent à des températures comprises entre 37°C et 42°C dans des bouillons trypticase soja ou coeur-cervelle contenant 10 p. cent de sérum (sérum foetal de veau, de boeuf ou mouton). Les souches de Brachyspira hyodysenteriae sont fortement hémolytiques alors que celles de Brachyspira pilosicoli et intermedia sont faiblement hémolytiques. Les inventeurs ont découvert l'intérêt du gène NADH oxidase (nox) dans la différenciation des espèces de Brachyspira, par PCR en 25 temps réel. En effet, la NADH oxydase (nox) réduit l'oxygène moléculaire en eau. Cette réduction permet à la bactérie de vivre à proximité d'un tissu qui utilise de l'oxygène, comme l'intestin. Le gène nox est une cible 30 intéressante en PCR, en effet celui-ci est conservé au sein des espèces de Brachyspira, il est au minimum identique à 86,3% au sein des espèces de Brachyspira. À partir de l'alignement de toutes les espèces, les inventeurs ont 35 pu observer des régions conservées spécifiques des trois bactéries cibles permettant de trouver le couple amorces/sonde approprié pour chacune d'elles. Pour Brachyspira pilosicoli, la région intéressante se situe entre 421 paires de bases et 521 paires de bases (figure 1). Il y a une région de 100 nucléotides spécifiques pour cette espèce. Pour Brachyspira hyodysenteriae, la région intéressante se situe entre 1128 paires de bases et 1216 paires de bases (figure 3). Il y a une région de 88 nucléotides spécifiques pour cette espèce. Pour Brachyspira intermedia, la région intéressante se situe entre 48 paires de bases et 150 paires de bases (figure 2). Il y a une région de 102 nucléotides spécifiques pour cette espèce. Dans ces régions spécifiques des couples d'amorces/sonde ont été déterminés pour chacune des espèces pour une analyse par PCR en temps réel. La PCR en temps réel se distingue de la PCR classique par le fait que l'analyse de la réaction se fait dans la phase exponentielle, plus reproductible, et non en point final. A la différence d'une PCR classique, la PCR en temps réel utilise une sonde fluorescente, spécifique de la cible, qui permet la quantification et la caractérisation en temps réel de l'amplicon synthétisé. C'est le couple amorces/sonde qui induit la grande spécificité de la PCR en temps réel. La technologie de PCR en temps réel est en effet basée sur la détection et la quantification d'un � rapporteur � fluorescent. L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés durant la réaction de PCR. En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où l'augmentation significative de la quantité d'amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de matrice cible. Le processus pour être automatisé du début à la fin rendant cette technologie très performante pour des applications d'analyse à grande échelle. Pour visualiser la réaction de PCR en temps réel, deux possibilités 35 se présentent : 7 - l'utilisation d'un agent intercalant comme le � Sybr Green� � qui se fixe sur l'ADN double brin; - ou l'utilisation d'une sonde permettant d'accroître la spécificité de l'amplification (sondes TagMan�, sondes TagMan� MGBTM ) Ainsi, dans un premier mode de réalisation, la sonde marquée détectable du procédé de détection et de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira est un agent intercalant apte à se lier à l'ADN double brin de l'amplicon résultant de la réaction PCR, tel que Sybr Greene. Dans un second mode de réalisation, la sonde marquée détectable est une sonde moléculaire apte à accroître la spécificité de l'amplification 15 comme les sondes TaqMan, TaqMan' MGBTM Parmi les différentes sondes existantes, les sondes TaqMan sont utilisées de préférence. C'est un oligonucléotide d'une longueur de 20-30 bases marqué avec un fluorophore (rapporteur) à l'extrémité 5' et un 20 inhibiteur de fluorescence (désactiveur) à l'extrémité 3'. Durant la PCR, en présence d'une cible, la sonde s'hybride spécifiquement sur l'ADN cible. Le �désactiveur � inhibe alors l'émission de fluorescence du � rapporteur �. Pendant la réaction, la Taq polymérase possédant une activité exonucléase 5'-3', dégrade la sonde et libère le rapporteur 25 permettant l'émission de fluorescence. Un accroissement de la fluorescence est donc observé au fur et à mesure de l'amplification lorsque la région recherchée est présente. Les sondes peuvent être composées de � rapporteur � et 30 � désactiveur � différents qui se distinguent chacun par une absorbance spécifique. Ainsi le Fam est détecté à 530 nm, le Tamra à 582 nm. Au milieu réactionnel du procédé de détection et de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira, une molécule fluorescente (ROX) 35 est ajoutée de préférence, elle correspond à la référence passive car elle ne participe pas à la réaction d'amplification PCR. Elle permet de 8 normaliser le signal complexe obtenu lors de la mesure de fluorescence. L'intensité du signal de fluorescence est proportionnelle au nombre de copies d'ADN synthétisées à chaque cycle de PCR. L'évolution de l'amplification est représentée par une courbe sigmoïdale où l'abscisse correspond au nombre de cycles et l'ordonnée à l'amplitude du signal généré appelée ARn. Le Rn (pour Normalized Rapporteur) est le rapport de l'intensité de fluorescence émise par le rapporteur sur celle émise par la référence passive. La référence passive permet d'éliminer le bruit de fond de fluorescence. Dans les exemples ci-dessous de la présente invention, des sondes Applied Biosystems TagMan� MGBTM qui comprennent un rapporteur coloré en 5' et un � désactiveur � non-fluorescent (NFQ) en extrémité 3' ont été utilisées. Le NFQ possède l'avantage de réduire le bruit de fond, ce qui permet d'obtenir une meilleure précision de la quantification. La partie MGB (Minor Groove Binding) stabilise la sonde hybridée et augmente la température de fusion (Tf). En se fixant à l'extrémité 3' d'une sonde, le MGB se replie dans le petit sillon formé par l'ADN double brin pour stabiliser l'hybridation. L'effet de cette stabilisation est une augmentation de la température de fusion et la partie MGB produit un effet de � régulation de la Tf � quand le pourcentage d'Adénosine-Thymine augmente. Cette technologie permet d'obtenir des sondes plus courtes et spécifiques pour une Tf donnée (68 ù 70°C). Des sondes TagMan� MGBTM ont donc été définies pour respecter les paramètres principaux et obtenir la meilleure sensibilité. Plus particulièrement, les amorces de Brachyspira hyodysenteriae comprennent les séquences suivantes ATGTCCCATATAAACATCGATGCC (amorce sens) et TAGGATCTTTAACTACGCCACCAAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. La sonde de Brachyspira hyodysenteriae comprend la séquence suivante : CACCTCTCAAACTTTCAGGAC. Les amorces de Brachyspira pilosicoli comprennent les séquences suivantes : CACTAGAACAGTCTCCTATAGCATAAACAT T (amorce sens) et ACCATTAGGTAAAGTCTCTAAATAA TCT (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. La sonde de Brachyspira pilosicoli comprend la séquence suivante : CTCATCTTTAGAAGATTTCA. Les amorces de Brachyspira intermedia comprennent les séquences suivantes : GTATAGCAATAGAGAATGCATGTATAGCT TC (amorce sens) et CGTCCAGTATCTTCTTCATAAACTATTTTTA C (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. La sonde de Brachyspira intermedia comprend la séquence suivante : CATGGTTGTTTTTAGAAGCA. L'invention a également pour objet un kit (ou trousse) de détection ou de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et de quantification tel que décrit ci-dessus, comprenant des réactifs appropriés pour l'amplification du gène nox de l'espèce Brachyspira issu d'un échantillon environnemental ou animal tel que des fèces de mammifères et en particulier de porc. En particulier, le kit (ou trousse) de détection ou de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira pour la mise en oeuvre du procédé d'identification et de quantification tel que décrit ci-dessus, comprend un milieu réactionnel comportant : (i) une amorce sens apte à se lier spécifiquement à la région non codante 5' du gène nox, (ii) une amorce anti-sens apte à se lier spécifiquement à la région codante 3' du gène nox, (iii) une sonde marquée fluorescente détectable qui se lie 35 spécifiquement à l'amplicon (gène nox) résultant de la réaction PCR, (iv) éventuellement, une molécule fluorescente ROX est ajoutée au mélange réactionnel, de manière à normaliser le signal complexe obtenu lors de la mesure de fluorescence, (v) des dNTPs et des polymérases présents en large excès 5 dans le milieu réactionnel. Pour valider le résultat et s'affranchir de faux positifs ou de faux négatifs qui peuvent être dus, par exemple, à un artefact lié aux réactifs utilisés ou à une mauvaise purification des acides nucléiques, le kit peut 10 comprendre également : (vi) un témoin interne positif (IPC), (vii) un témoin positif (viii) un témoin négatif. 15 De préférence, les amorces de Brachyspira hyodysenteriae comprennent les séquences suivantes ATGTCCCATATAAACATCGATGCC (amorce sens) et TAGGATCTTTAACTACGCCACCAAC (amorce anti-sens) ou leurs 20 séquences complémentaires. Avantageusement, la sonde de Brachyspira hyodysenteriae comprend la séquence suivante : CACCTCTCAAACTTTCAGGAC. 25 De manière avantageuse, les amorces de Brachyspira pilosicoli comprennent les séquences suivantes CACTAGAACAGTCTCCTATAGCATAAACATT (amorce sens) et ACCATTAGGTAAAGTCTCTAAATAATCT (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 30 Préférentiellement, la sonde de Brachyspira pilosicoli comprend la séquence suivante : CTCATCTTTAGAAGATTTCA. De manière préférentielle, les amorces de Brachyspira intermedia 35 comprennent les séquences suivantes GTATAGCAATAGAGAATGCATGTATAGCTTC (amorce sens) et 11 CGTCCAGTATCTTCTTCATAAACTATTTTTAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. De préférence, la sonde de Brachyspira intermedia comprend la 5 séquence suivante : CATGGTTGTTTTTAGAAGCA. Selon un mode de réalisation, la sonde marquée détectable est un agent intercalant apte à se lier à l'ADN double brin de l'amplicon résultant de la réaction PCR, tel que Sybr Green' Selon un second mode de réalisation, la sonde marquée détectable est une sonde moléculaire apte à accroître la spécificité de l'amplification comme les sondes TagManR, TagManR MGBTM 15 L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, détails, caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux figures suivantes : 20 - la figure 1 présente la région d'intérêt du gène nox pour Brachyspira pilosicoli ; - la figure 2 présente la région d'intérêt du gène nox pour Brachyspira intermedia ; - la figure 3 présente la région d'intérêt du gène nox pour 25 Brachyspira hyodysenteriae ; - la figure 4 présente les valeurs de Ct correspondant à l'amplification résultant d'une PCR temps réel sur ADN extrait d'une souche de référence, dilution 10-5 à 10-8 pour B. pilosicoli, 10-4 à 10' pour B. hyodysenteriae et 10.2 à 10-5 pour B. intermedia ; 30 - la figure 5 présente les valeurs de Ct correspondant à l'amplification résultant d'une PCR temps réel FAST sur ADN extrait de souche de référence, dilution 10-4 à 10' pour B. pilosicoli ; - la figure 6 montre les résultats obtenus avec des échantillons suspectés de spirochétose de selles de porc avec les souches de 35 références B. pilosicoli et B.hyodysenteriae pour des valeurs Ct ("Threshold cycle"- cycle seuil) obtenues avec des acides nucléiques, pur 10 12 ou dilué au 1/10, ainsi que des valeurs de Ct de l'IPC (contrôle interne d 'amplification) ; - et la figure 7 présente les valeurs de Ct correspondant à l'amplification des témoins positifs à Brachyspira pilosicoli, 5 Brachyspira hyodysenteriae et Brachyspira intermedia. Exemple 1 : Sensibilité, spécificité, robustesse et optimisation de la PCR Bachyspira A - Echantillons 1 - Les cultures bactériennes 15 Les souches types des différentes espèces de Brachyspira proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC) et de la collection de l'institut Pasteur (CIP). Les autres souches de Brachyspira ou leur ADN ainsi que les différentes espèces bactériennes utilisées pour la mise en oeuvre du test de PCR en temps réel ont été fournies par 20 différents laboratoires partenaires. Tableau 1 : Souches de référence des Brachyspira spp. 10 Espèces bactériennes Origine 25 B. hyodysenteriae B. pilosicoli B. intermedia B. alvinipulli B. murdochii ATCC 27164 ATCC 51339 CIP 105833 CIP 105681 CIP 105832 30 2 - Les prélèvements terrain Sur la base de prélèvements terrain réalisés en élevage sur des 35 animaux qui ont présenté des signes cliniques de spirochétose, la recherche de Brachyspira a été également réalisée. 3 û Milieux et conditions de culture Les souches de références de Brachyspira ont été mises en culture sur bouillon Brain Heart Infusion (BHI) contenant 10 % de sang défibriné de cheval. Les cultures ont été incubées à 37°C en anaérobiose pendant 2 à 5 jours en fonction des souches. B - Extraction des acides nucléiques 1 û Les cultures bactériennes L'ADN a été extrait par lyse thermique par la méthode PrepMan� Ultra d'Applied Biosystem. Pour chaque souche 1 mL de culture a été centrifugé 3 minutes à 16 000 g ; le culot bactérien a été repris dans 200 �L de tampon PrepMan� Ultra et placé 10 minutes à 100°C dans un bain-marie sec. L'échantillon a été ensuite centrifugé 3 minutes à 16 000 g puis le surnageant a été transféré dans un nouveau micro tube. Les lysats bactériens ainsi obtenus ont été conservés à ù 20°C jusqu'à amplification. 2 ù Les fèces de porc Cette extraction a été réalisée sur 2 g d'échantillon de fèces. La concentration bactérienne a été réalisée par ajout de 10 mL de PBS stérile. La contamination artificielle a été faite par ajout de 1 mL de la culture bactérienne de référence. Le tube a été brièvement agité puis centrifugé 10 minutes à 5 000g. Le culot a été conservé. Echantillons à analyser suite à des prélèvements par des vétérinaires L'extraction a été réalisée sur 100 �L de contenu intestinal. La concentration bactérienne a été obtenue par ajout de 900 �L d'eau stérile puis le tube a été brièvement agité et centrifugé 10 min à 5 000g. Le culot a été conservé. Ensuite, l'extraction des acides nucléiques a été réalisée en utilisant la plateforme NucliSens� miniMAG TM avec les réactifs NucliSens� Magnetic Extraction Reagents de Biomérieux selon les recommandations du fournisseur. C û PCR en Temps réel Brachyspira 1 - Alignements des séquences 10 Pour réaliser un alignement des différents génomes de Brachyspira (intermedia, pilosicoli et hyodysenteriae), il a été nécessaire de trouver les séquences nucléotidiques correspondantes dans la banque de données Genbank. Un alignement a été ensuite réalisé à l'aide du logiciel CLC Free Workbench. Ainsi, il a été possible de localiser les 15 régions les plus conservées intéressantes pour définir les amorces et les sondes des différentes espèces de Brachyspira. 2 û Définition des amorces et des sondes 20 Après avoir déterminé une région intéressante, la séquence consensus résultant de l'alignement a été analysée dans le logiciel Primer express 3.0 d'Applied Biosystems ou le logiciel Primer 3 plus. Ces logiciels permettent de rechercher le couple amorces/sonde le plus approprié pour la PCR en temps réel permettant d'obtenir une PCR 25 efficace. Des couples d'amorces/sonde ont été déterminés pour chacune des espèces pour les régions spécifiques codant le gène nox (tableau 2). Tableau 2 : couples amorces/sondes Couple B.hyodysenteriae Séquences Amorce F ATGTCCCATATAAACATCGATGCC Amorce R TAGGATCTTTAACTACGCCACCAAC Sonde CACCTCTCAAACTTTCAGGAC5 Couple B.pilosicoli Séquences Amorce F CACTAGAACAGTCTCCTATAGCATAAACATT Amorce R ACCATTAGGTAAAGTCTCTAAATAATCT Sonde CTCATCTTTAGAAGATTTCA Couple B.intermedia Séquences Amorce F GTATAGCAATAGAGAATGCATGTATAGCTTC Amorce R CGTCCAGTATCTTCTTCATAAACTATTTTTAC Sonde CATGGTTGTTTTTAGAAGCA L'amplicon obtenu pour Brachyspira pilosicoli avec le couple B. pilosicoli a une taille de 153 pb. Pour Brachyspira hyodysenteriae avec le couple B.hyodysenteriae on obtient un amplicon de 89 pb et celui de 5 Brachyspira intermedia avec le couple inter une taille de 103 pb. 3 ù Kit PCR en temps réel Pour cette étude, le TagMan� Master Mix d'Applied l3iosytems a 10 été utilisé (Tableau 3). Des travaux précédents ont montré son efficacité en PCR en temps réel. Tableau 3 : Kit, Mélange réactionnel et Programme utilisé pour les PCR TaqMan Temps réel. Kit Mélange Réactionnel pour 1 Tube Programme TaqMan � Universal 6, 25 �L H20 2 minutes 50 °C PCR Master Mix 12,5 �L Master Mix 10 minutes 95°C d'Applied Biosystems 0,5 �L amorce Sens 10 �M 15 secondes 95°C 0,5 �L amorce Antisens 10 �M 1 minute 60°C X 45 0,25 �L Sonde 10 �M �L d'échantillon 15 L'ensemble des PCR en temps réel ont été réalisées sur des appareils Step One ou 7300 SDS d'Applied Biosystems. 16 4 ù Validation de la spécificité La spécificité des amorces et sondes définies doit être testée sur d'autres organismes (bactéries, virus) que les Brachyspira spp. ciblés (Tableau 4). Les organismes testés sont responsables d'infections intestinales et possèdent le même habitat. Tableau 4: Liste des organismes testés pour valider la spécificité de la PCR en Temps réel. Bactéries Virus - Rotavirus - Astrovirus - Adénovirus - Norovirus GI - Norovirus GII - Virus de l'Hépatite A - Virus de l'Hépatite E - Escherichia coli - Campylobacter coli - Campylobacter jejuni. - Listeria spp. - Vibrio spp. - Salmonella spp. - Brachyspira suanatina - Brachyspira murdochii - Brachyspira alvinipulli 5 û Robustesse Pour valider l'essai de PCR en temps réel développé, des tests de répétabilité intra-essai et de reproductibilité interùessai et inter- manipulateur sont indispensables. Cinq réplicats par dilution ont ainsi été testé par PCR en temps réel pour chaque essai. Les dilutions limites ont été aussi intéressantes à observer car elles définissent la sensibilité du test, c'est-à-dire le nombre de copie minimum d'ADN bactérien détecté. 6 ù Optimisation de la PCR en temps réel • Fast Universal PCR Master Kit 17 Afin d'assurer un gain de temps optimal dans l'obtention des résultats, le kit TagMan� Fast Universal PCR Master Mix d'Applied Biosystems (Tableau 5) a également été testé. Tableau 5 : Kit, Mélange réactionnel et Programme utilisé pour les PCR TaqMan Temps réel Fast. Kit Mélange Réactionnel pour 1 Programme Tube 6, 25 �L H20 TaqMan � Fast 12,5 tL Fast Master Mix 20 secondes 95°C Universal 0,5 �L amorce Sens 10 tM 1 seconde 95°C PCR Master Mix 0,5 tL amorce Antisens 10 20 secondes 60°C d'Applied tM Biosystems 0,25 tL Sonde 10 �M X 45 5�L d'échantillon • Contrôle interne d'amplification Afin de contrôler chaque réaction, un contrôle interne d'amplification (ou IPC : Internai Positive Control) est rajouté dans le Master Mix de PCR en temps réel avec les amorces/sondes de chaque espèce de Brachyspira (tableau 6). L'IPC est marqué par un fluorophore VIC. L'utilisation de ce dernier permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs et de vérifier que l'amplification PCR a fonctionné correctement. Tableau 6 : Kit, Mélange réactionnel et Programme utilisé pour les PCR TaqMan Temps réel avec contrôle interne. Kit Mélange Réactionnel pour 1 Programme Tube TaqMan � Universal 3, 25 �L H20 2 minutes 50 °C X 45 ' PCR Master Mix 12,5 �L Fast Master Mix 10 minutes 95°C d'Applied 2,5 �l IPC Mix 15 secondes 95°C Biosystems 0,5 �l IPC DNA 1 minute 60°C 0,5 �L amorce Sens 10 �M 0,5 �L amorce Antisens 10 �M 0,25 �L Sonde 10 �M 5 �L d'échantillon 20 18 Exemple 2 : Validation de la sensibilité et de la spécificité Chaque couple d'amorce et sonde a été testé sur les 3 souches 5 bactériennes (tableau 7) afin d'observer leur spécificité et leur sensibilité. Tableau 7 . Souches de référence des Brachyspira spp. Espèces bactériennes Origine B. hyodysenteriae ATCC 27164 B. pilosicoli ATCC 51339 B. intermedia CIP 105833 15 Des études antérieures ont démontré l'efficacité du kit TagMan� Master Mix d'Applied Biosytems, par conséquent les essais en temps réel sont réalisés avec celui-ci. Les trois couples ont été testés avec les 20 souches de référence extraite par lyse thermique à l'aide de la solution PrepMan� Ultra d'Applied Biosystem (figure 4). Le tableau 8 met en évidence la sensibilité obtenue pour les trois couples. Une bonne efficacité d'amplification a été observée pour 25 chacun des couples, ceci a son importance lorsqu'on cherche à détecter des bactéries en très faible quantité dans un échantillon. De plus, l'essai de PCR temps réel développé est sensible pour chaque souche de Brachyspira cible compte tenu des valeurs de Ct limites obtenus correspondant aux limites de détection de la méthode et estimés entre 1 30 et 5 copies de génome. 10 Tableau 8: % amplification et Ct obtenus pour les dilutions 1 0-' à 10-8 0/0 Ct Ct Ct Ct Ct Ct Ct amplification 10"2 10-3 10-4 10-5 10-6 10"7 10-8 Couple pilo 100,3 % 18,75 21,93 24,98 28,14 31,83 35,6 37,22 Couple 99,4% 25,97 29,13 32,1 36,1 38,14 hyody Couple 100,7% 30,95 33,86 37,33 39,92 inter La spécificité de chaque couple a ensuite été testée sur divers organismes (bactéries et virus) pouvant se retrouver dans diverses infections digestives chez le porc (tableau 4). Aucune amplification n'a été observée que ce soit avec les autres espèces de Brachyspira ou avec l0 les 7 espèces bactériennes et les 5 virus testés. L'essai temps réel développé est également spécifique aux Brachyspira. De plus, aucune réaction croisée n'a été observée entre les 3 espèces ciblées. Les 3 tests de PCR en temps réel définis sont donc sensibles et spécifiques. 15 Dans le tableau 9 sont donnés les résultats de la répétabilité et de la reproductibilité. La répétabilité a été faite avec 5 réplicats par dilution et la reproductivité a été mesurée à partir de 2 essais réalisés dans les mêmes conditions avec les mêmes dilutions mais par des manipulateurs différents. L'efficacité de l'amplification est supérieure à 95% pour tous 20 les essais et les variations de Ct ne sont pas significatives donc nous pouvons conclure que les 3 essais sont répétables et reproductibles. Tableau 9: Test de répétahilité intra manipulateur (infra essai et inter essai) et reproductibilité inter manipulateur par PCR temps réel sur dilution limites d 'ADN extrait des souches de référence. Couple Répétabilité Répétabilité Reproductibilité Reproductribilité pilo intra-essai inter-essai manipulateur manipulateur Dilution 10-6 10-' 10-6 10-7 10-6 10' 10"6 10-' Variation 0,93 0,93 0,35 1,32 1,26 1,04 1,43 0,56 Ct Couple Répétabilité Répétabilité Reproductibilité Reproductribilité hyody intra-essai inter-essai manipulateur manipulateur Dilution 105 106 105 106 105 106 105 106 Variation 1,59 0,14 1,35 0,44 1,44 0,4 1,66 0,56 Ct Couple Répétabilité Répétabilité Reproductibilité Reproductribilité inter intra-essai inter-essai manipulateur manipulateur Dilution 104 105 104 105 104 105 104 105 Variation 0,84 0,51 0,82 1,40 0,76 0,33 1,09 1,9 Ct 10 De plus des essais ont été réalisés sur un autre type d'appareil en Temps réel (Stratagène MX3000). Les résultats obtenus sont similaires, par conséquent, le test de détection est applicable sur différents types 15 d'appareil Temps réel sans perte de sensibilité. Une des exigences des laboratoires vétérinaires est la rapidité du diagnostic. Dans cette optique, le kit TagMan� Fast Universal PCR Master Mix d'Applied Biosystems a été testé sur les échantillons 20 terrains. Celui-ci permet de réaliser une PCR en temps réel en 50 min, soit une réduction de moitié du temps de manipulation. Le kit a été5 21 validé au niveau de la sensibilité (figure 5), la reproductibilité et testé sur des échantillons de fèces. Aucune différence significative n'a été observée par rapport à l'utilisation du kit TagMan� Master Mix d'Applied Biosytems en terme de sensibilité, de spécificité et d'efficacité sur des échantillons de féces. Par conséquent, le présent demandeur a réussi à développer un test répondant à l'une des attentes des laboratoires vétérinaires afin de pouvoir intervenir dans les élevages de porcs dans des délais très courts. Le développement de cet outil de détection repose sur le fait de réaliser la PCR en temps réel directement à partir des fèces afin de gagner du temps dans le diagnostic. Or les fèces de porc sont des matrices difficiles à extraire et pouvant contenir de nombreux inhibiteurs. Pour vérifier que l'amplification se déroule parfaitement, l'ajout d'un contrôle interne d'amplification permet de vérifier les éventuelles inhibitions lors de la réaction. Tous les échantillons analysés (artificiellement ou non) ont donné des valeurs d'IPC identique (figure 6), ce qui confirme l'absence d'inhibiteur lors des réactions de PCR. Par conséquent, la méthode d'extraction développée est pertinente. Les tests de détection Brachyspira ont été testés sur différents échantillons fournis par des laboratoires vétérinaires, présentant une suspicion d'infection de type spirochétose. Les échantillons sont traités dès leur arrivée, l'extraction des acides nucléiques est réalisée sur la plateforme NucliSens� miniMAG TM. Chaque échantillon est testé pur et dilué au 10e'ne avec les trois couples d'amorce/sonde. Cependant aucune amplification pour les échantillons analysés n'a été observée. Pour confirmer l'absence d'amplification, un IPC a été rajouté au mix de PCR pour vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR. Les trois espèces bactériennes ont été recherchées dans des échantillons de selles de porc contaminées artificiellement, afin de valider la méthode d'extraction et de détection. Les contaminations artificielles ont été réalisées avec des concentrations différentes. Pour chaque essai, une amplification a été observée sur les ADN extraits, permettant de conclure que la méthode d'extraction et de détection est fiable sur des échantillons de types fèces. De plus, la technique d'extraction utilisée semble limiter la présence d'inhibiteurs de PCR puisque qu'un delta de valeurs de Ct d'environ 3,3 a été observé entre les échantillons purs et dilués au 1/10. Exemple 3 : Différentes matrices à analyser ont été envoyées par des vétérinaires, telles que des matières fécales, des écouvillons en pot stérile, des prélèvements intestinaux en pot stérile, des chiffonnettes en sachet stérile et de l'eau en bidon stérile. A - Prétraitement des échantillons Écouvillons Les écouvillons (pool de 3 maximum) ont été mélangés sur vortex dans 2 ml de tampon de lyse, puis agités manuellement tout en prenant soin de ne pas faire mousser le mélange. Après incubation 10 min à Température Ambiante (TA) puis élimination des écouvillons, le mélange est centrifugé à Xg Xmin puis le surnageant conservé Matières Fécales et Prélèvements intestinaux Une suspension de selles de 10 à 50 % dans 1 ml de PBS stérile a été effectuée, puis centrifugée 30 min à 3 000 rpm. Le surnageant obtenu est ensuite centrifugé 15 min à 10 000 t/min et l'opération répétée jusqu'à obtention d'un surnageant clair. Puis 300 uL de ce sont ajoutés à 2 ml de tampon de lyse Nuclisens Biomérieux, puis agité en évitant de faire mousser et incubé 10 min à température ambiante. Chiffonnettes Les chiffonnettes ont été découpées de manière à obtenir un échantillon de 10 cm` au centre de chaque chiffonnette. L'échantillon a ensuite été placé dans un sachet filtre stérile contenant 30 mL d'eau physiologique puis le mélange malaxé (si absorption totale, ajout 10 mL d'eau physiologique, et malaxer à nouveau). Enfin, 300 uL du surnageant filtré a été transféré dans 2 ml de tampon de lyse nuclisens biomérieux, puis le tout a été agité en évitant de faire mousser et incubé 10min à température ambiante. Eaux Une filtration d' 1 L d'eau est effectuée à l'aide de cassette de filtration tangentielle Sartorius Vivaflow 50. Un filtrat de 20 mL est récupéré. Afin de rincer la cassette, on fait passer 20 mL d'eau physiologique et on récupère 40 mL de filtrat dans un Falcon de 50 ml. A ce filtrat 10 ml de solution de PEG 6000 à 50% sont ajoutés puis le mélange est agité pendant 1 h à 4°C (Table d'agitation rotatif). Après centrifugation à 11 000g pendant 30 min à 4°C, le culot est remis en suspension dans lmL d'eau stérile chauffée à 56°C. Deux mL, de tampon de lyse sont ajoutés et le mélange incubé 10 min à température ambiante. B - Extraction des acides nucléiques Pour l'ensemble des matrices préparées ci-dessus, le procédé d'extraction des acides nucléiques est le même. La technique utilisée est la méthode d'extraction des acides nucléiques NucliSens de Biomérieux, mais le prétraitement sur le Kit d'extraction Qiagen et Invitrogen (selon les recommandations fournisseurs) a été également validé. C - PCR en temps réel La réaction de PCR temps réel est réalisée avec des consommables, réactifs et appareil de chez Applied, ces analyses ont également été réalisées sur d'autres types d'appareils (Stratagène MX3000...) et avec des réactifs de PCR en temps réel de fournisseurs différents (Invitrogen). Les résultats sont identiques.35 D ù Programme PCR Temps réel Un plan de plaque ou de barrette a été défini. Le programme présenté dans le tableau 10 pour le mélange réactionnel PCR temps réel avec IPC présenté dans le tableau 11 a été mis en oeuvre : Tableau 10 : Programme PCR Temps réel Cycles Temps Température 1 2 minutes 50 °C 1 10 minutes 95 °C 45 15 secondes 95 °C 1 minute 60 °C Tableau 11: Mélange réactionnel PCR temps Réel avec IPC Réactifs Volume/Réaction en �l H2O 3,25 Master Mix 12,5 Master Mix IPC 2,5 DNA IPC 0,5 Amorce F (10�M) 0,5 Amorce R (10�M) 0,5 Amorce S (10�M) 0,25 Les réactifs sont mis à décongeler sous une hotte dédiée à la 15 préparation des Mix. Sous la hotte, on agite sur vortex et on centrifuge chaque réactif puis on les place sur la glace. On prépare ensuite le mélange réactionnel d'après le tableau 11. On répartit 20 �L de Mix dans chaque puits, on dépose la plaque 20 ou la barrette de tube sur un support. Sous la hotte dédiée à la distribution des acides nucléiques, on ajoute 5�l d'échantillons par puits en respectant le plan de plaque ou de 24 lo barrette de tube. On recouvre la plaque d'un film plastique ou de capuchon pour la barrette de tube. On centrifuge la plaque ou la barrette 10 secondes. Enfin, on met la plaque ou la barrette dans l'appareil pour démarrer la mesure. E - Résultats/conclusions Une amplification sur les ADN extraits a également été observée pour un 1 o certain nombre d'échantillons (figure 7) permettant de conclure que le présent procédé est fiable sur les différentes matrices testées. Ces essais ont ainsi permis de détecter sur 96 prélèvements terrains, les résultats positifs suivants : 15 7 Brachyspira hyodysenteriae (soit 7,30 % des échantillons) 15 Brachyspira pilosicoli (soit 15,60 % des échantillons) 10 Brachyspira intermedia (soit 10,40 % des échantillons) L'efficacité et la sensibilité du test développé constituent une aide au 20 diagnostic en permettant au vétérinaire de connaître et reconnaître les premiers signes cliniques des infections aux Brachyspira spp., qui sont le plus souvent discrets. Un des avantages intéressants de cette invention réside dans le gain de 25 temps réalisé en utilisant la PCR en temps réel. En effet, les résultats peuvent être obtenus en 4 heures après réception des échantillons. Le temps d'analyse est un facteur très important pour les laboratoires vétérinaires et les vétérinaires conseils qui souhaitent intervenir le plus tôt possible sur les élevages. 30 Les méthodes de l'art antérieur, par PCR en point final couplée à la méthode culture ne permettent d'établir un diagnostic définitif que 5 à 7 jours après réception des échantillons. En outre, avec la présente invention, l'élimination des milieux spécifiques généralement onéreux, 35 entraîne de fait une réduction des coûts liés au diagnostic.5 Les échantillons soumis à l'essai sont des matrices contenant de nombreux inhibiteurs de PCR (matières organiques, sang, tissus...). Il était donc nécessaire de disposer d'une méthode d'extraction permettant de purifier efficacement les acides nucléiques extraits. La présente méthode d'extraction des acides nucléiques utilisés est simple, rapide et permet d'éliminer les inhibiteurs de PCR, l'ajout d'un contrôle d'amplification interne (IPC) permet de contrôler l'amplification. Le test de détection de "Brachyspira" par PCR en temps réel développé présente toutes les caractéristiques exigées pour les analyses clients : rapidité, sensibilité, spécificité, pertinence et robustesse. La sensibilité du test est une caractéristique importante, celui-ci permet de détecter des échantillons ayant un niveau de contamination faible sachant qu'un très faible nombre de copies peuvent à elles seules représenter un risque pathogène. En conclusion, le procédé selon la présente invention met en avant la possibilité d'utiliser une méthode de PCR en temps réel directement sur des prélèvements issus d'élevages. Bien que l'invention ait été décrite en relation avec un mode de réalisation particulier, il est bien évident qu'elle n'y est nullement limitée et qu'elle comprend tous les équivalents techniques des moyens décrits ainsi que leurs combinaisons si celles-ci entrent dans le cadre de l'invention. REVENDICATIONS1. Procédé de détection et de quantification du gène nox (gène NADH oxidase) de l'espèce Brachyspira issu d'un échantillon environnemental ou animal tel que des fèces de mammifères et en particulier de porc, par réaction de polymérisation en chaîne (PCR), caractérisé en ce que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) étant en temps réel, le procédé comprend les étapes consistant à : (i) analyser ledit échantillon susceptible de contenir des Brachyspira par PCR avec un milieu réactionnel comprenant une amorce sens apte à se lier spécifiquement à la région non codante 5' du gène nox, une amorce anti-sens apte à se lier spécifiquement à la région codante 3' du gène nox, et une sonde marquée fluorescente détectable qui se lie spécifiquement à l'amplicon résultant de la réaction PCR, (ii) mesurer et quantifier, par l'intermédiaire d'un système optique d'un thermocycler ou d'un système équivalent, la présence d'émission de fluorescence indiquant, de façon proportionnelle, la quantité d'amplicon à chaque cycle PCR, de manière à pouvoir détecter la présence de Brachyspira à partir dudit échantillon environnemental ou animal. 2. Procédé de détection et de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira selon la revendication 1, dans lequel le type de Brachyspira détecté est choisi parmi : Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli et Brachyspira intermedia. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les amorces de Brachyspira hyodysenteriae comprennent les séquences suivantes : ATGTCCCATATAAACATCGATGCC (amorce sens) et TAGGATCTTTAACTACGCCACCAAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 à 3, dans lequel la sonde de Brachyspira hyodysenteriae comprend la séquence suivante : 35 CACCTCTCAAACTTTCAGGAC. 27 5. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les amorces de Brachyspira pilosicoli comprennent les séquences suivantes CACTAGAACAGTCTCCTATAGCATAAACATT (amorce sens) et ACCATTAGGTAAAGTCTCTAAATAATCT (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 6. Procédé selon l'une des revendications 2 et 5, dans lequel la sonde de Brachyspira pilosicoli comprend la séquence suivante CTCATCTTTAGAAGATTTCA. 7. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les amorces de Brachyspira intermedia comprennent les séquences suivantes GTATAGCAATAGAGAATGCATGTATAGCTTC (amorce sens) et CGTCCAGTATCTTCTTCATAAACTATTTTTAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 8. Procédé selon l'une des revendications 2 et 7, dans lequel la sonde de Brachyspira intermedia comprend la séquence suivante CATGGTTGTTTTTAGAAGCA. 9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la sonde marquée détectable est un agent intercalant apte à se lier à l'ADN double brin de l'amplicon résultant de la réaction PCR, tel que Sybr Green' . 25 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la sonde marquée détectable est une sonde moléculaire apte à accroître la spécificité de l'amplification comme les sondes TagMan', TagManR MGBTM 11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel une molécule fluorescente ROX est ajoutée au mélange réactionnel, de manière à normaliser le signal complexe obtenu lors de la mesure de fluorescence. 30 35 29 12. Kit de détection et de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira mis en oeuvre par le procédé de détection et de quantification selon l'une des revendications 1 à 11, comprenant les réactifs appropriés pour l'amplification du gène nox de l'espèce Brachyspira issu d'un échantillon environnemental ou animal, en particulier issu de fèces de porcs. 13. Kit de détection et de quantification du gène nox de l'espèce Brachyspira selon la revendication 12, comprenant un milieu réactionnel 10 comportant: (i) une amorce sens apte à se lier spécifiquement à la région non codante 5' du gène nox, (ii) une amorce anti-sens apte à se lier spécifiquement à la région codante 3' du gène nox, 15 (iii) une sonde marquée fluorescente détectable qui se lie spécifiquement à l'amplicon (gène nox) résultant de la réaction PCR, (iv) éventuellement, une molécule fluorescente ROX est ajoutée au mélange réactionnel, de manière à normaliser le signal complexe obtenu lors de la mesure de fluorescence, 20 (v) des dNTPs et des polymérases présents en large excès dans le milieu réactionnel. 14. Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend également : 25 (vi) un témoin interne positif (IPC), (vii) un témoin positif (viii) un témoin négatif 15. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel les 30 amorces de Brachyspira hyodysenteriae comprennent les séquences suivantes : ATGTCCCATATAAACATCGATGCC (amorce sens) et TAGGATCTTTAACTACGCCACCAAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 16. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel la sonde de Brachyspira hyodysenteriae comprend la séquence suivante CACCTCTCAAACTTTCAGGAC. 17. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel les amorces de Brachyspira pilosicoli comprennent les séquences suivantes CACTAGAACAGTCTCCTATAGCATAAACATT (amorce sens) et ACCATTAGGTAAAGTCTCTAAATAATCT (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 18. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel la sonde de Brachyspira pilosicoli comprend la séquence suivante CTCATCTTTAGAAGATTTCA. 19. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel les amorces de Brachyspira intermedia comprennent les séquences suivantes : GTATAGCAATAGAGAATGCATGTATAGCTTC (amorce sens) et CGTCCAGTATCTTCTTCATAAACTATTTTTAC (amorce anti-sens) ou leurs séquences complémentaires. 20. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel la sonde de Brachyspira intermedia comprend la séquence suivante : CATGGTTGTTTTTAGAAGCA. 21. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel la sonde marquée détectable est un agent intercalant apte à se lier à l'ADN double brin de l'amplicon résultant de la réaction PCR, tel que Sybr Green'. 22. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, dans lequel la sonde 30 marquée détectable est une sonde moléculaire apte à accroître la spécificité de l'amplification comme les sondes TagManR, TagManR MGBTM 35