Brevet FR2942806A1 — publié le 20100910

Procédé d'identification de germes en milieu liquide L'invention a pour objet un procédé d'identification de germes en milieu liquide. Pour l'identification de germes en culture dans un liquide biologique, 24 à 48 heures de délai sont nécessaires. En effet, une culture de germes en milieu liquide requiert de passer par une subculture sur milieu solide. Ce délai est préjudiciable au besoin d'une instauration rapide d'une antibiothérapie empirique adéquate avant de disposer des résultats de l'antibiogramme. Les techniques de biologies moléculaires (PCR) appliquées directement aux bouillons 15 d'hémocultures sont plus rapides, mais demandent néanmoins un minimum d'environ 3h, une structure adaptée et une certaine expertise technique. Les travaux des inventeurs ont porté sur la recherche de moyens permettant de résoudre les inconvénients des techniques antérieures. Mettant à profit leur expertise à la fois dans le 20 domaine bactériologique et dans l'analyse de microorganismes par spectrométrie de masse, les inventeurs Dnt cherché à adapter la technique MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) à l'identification de germes en milieu liquide. 25 On sait que la spectrométrie de masse MALDI-TOF-MS permet actuellement d'identifier rapidement des bactéries qui ont été cultivées sur milieu solide, grâce aux profils spécifiques d'espèces obtenus directement à partir de colonies. Les inventeurs ont constaté que cette technologie était utilisable en traitant de manière 30 appropriée les germes présents dans un échantillon liquide ou un prélèvement biologique ayant ou non bénéficié d'un enrichissement en milieu liquide. L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle méthode d'identification de germes en milieu liquide.10 La méthode de l'invention est caractérisée par l'addition d'un détergent membranaire au milieu liquide renfermant des éléments d'un hôte infecté par des germes, à savoir des composants cellulaires et protéines du milieu extracellulaire, de manière à libérer les germes de ces éléments, sans les altérer, et par l'analyse des germes ayant poussé dans ce milieu liquide par spectrométrie de masse type MALDI-TOF-MS. Plus particulièrement, la méthode de l'invention comprend les étapes d'addition au milieu liquide de détergent membranaire doux, respectant la paroi des procaryotes, afin de séparer les germes des composants de l'hôte infecté, notamment en libérant les germes intracellulaires et d'obtenir des spectres avec des bruits de fonds réduits, permettant d'identifier aisément les germes ; de récupération des germes du milieu liquide par centrifugation différentielle, et - d'analyse par spectrométrie MALDI-TOF-MS sur le culot de germes, suivie d'une 15 comparaison avec des bases de données de germes. Cette technique présente l'avantage d'être rapide: elle procure en effet un gain d'au minimum 24h dans l'identification en évitant la subculture sur milieu solide, permettant ainsi la mise en route sans perte de temps d'une antibiothérapie adaptée. De plus, la technique est facile à 20 mettre en oeuvre. Le détergent membranaire doux est ajouté au milieu liquide à raison de 5% final au plus, notamment de 1 à 5% final, de préférence 2% final. 25 Des composés appropriés comprennent la saponine, le n-octyl-glucoside, le n-dodécylglucoside, l'octanoyl-N-méthylglucamide, le décanoyl -N-méthylglucamide, le n-dodécyl-(3 - D-maltoside. Un détergent préféré est la saponine. Le temps de contact avec le liquide renfermant les germes à analyser et le détergent est avantageusement de 8 min au plus, de préférence de 3 à 8 min, plus spécialement de 5 min.environ. 30 Le mélange est soumis à une centrifugation, avantageusement après avoir rajouté de l'eau distillée. I)es conditions de centrifugation appropriées correspondent à 8000 t/min au plus, particulièrement de 3000 -5000 t/min, durant 15 min.au plus, de préférence durant environ 5 à 15 min. et plus particulièrement durant 5 min environ. Le surnageant est alors éliminé et le culot, repris dans de l'eau distillée et soumis à une centrifugation en opérant avantageusement selon les conditions définies ci-dessus. Le culot est récupéré e: utilisé pour l'analyse MALDI-TOF-MS. Les résultats obtenus sont comparés aux bases de données. Les liquides utilisés dans la méthode de l'invention comprennent, par exemple, des hémocultures positives de malades à un germe donné, des liquides articulaires ensemencés ou non au bloc opératoire dans des flacons d'hémoculture et donnant une culture positive à un germe donné, ou tout autre fluide biologique par exemple urine, liquide céphalorachidien, liquide proverant de la production de drains ou obtenu par ponctions (abcès), dans la mesure où l'infection est suspectée monomicrobienne. Cette détection peut être effectuée soit directement à partir du fluide biologique, soit après un enrichissement en milieu liquide lorsque l'inoculum est peu abondant. L'analyse du spectre est avantageusement réalisée en opérant selon la technique de la demande internationale PCT/IB08/001058 déposée le 8 janvier 2008 pour � Means for identifying a germ isolated from a clinical sample �. Différents types de germes sont identifiables comme les bactéries, levures, champignons le cas échéant champignons filamenteux. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui 30 suivent clans lesquels il est fait référence aux figures 1A à 1E représentant les graphes MALDI-TOF-MS obtenus sur des germes isolés d'hémocultures.25 Matériel et méthodes Matériel : Souches bactériennes Les essais dont les résultats sont rapportés ci-après ont porté sur les bactéries les plus fréquemment retrouvées : - dans les hémocultures : staphylocoques, entérobactéries (Escherichia. coli, Klebsiella pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis. - dans les liquides articulaires : Staphylococcus aureus et Kingella kingae. - dans les urines : Escherichia coli et autres entérobactéries, Staphylococcus saprophyticus Les espèces rnentionées ci-dessus ne sont pas limitatives. D'autres germes peuvent être identifiés. Outre les agents bactériens, il peut s'agir de levures (Candida), champignons, et de filamenteux (À spergillus) Hémocultures Les expérimentations ont porté sur des hémocultures de patients retrouvées positives en 24-48H. Liquides articulaires : Certains prélèvements biologiques précieux nécessitent une phase d'enrichissement en bouillon pour augmenter les chances de faire le diagnostic étiologique d'une infection. A l'hôpital Necker-Enfants Malades, le service d'Orthopédie Pédiatrique accueille de nombreux enfants dont le diagnostic d'arthrite septique est suspecté. Les liquides articulaires prélevés au bloc opératoire sont systématiquement mis en bouillon d'hémoculture et envoyés au laboratoire de Microbiologie. Les liquides articulaires sont pris ici comme exemple, mais une stratégie similaire est applicable à tout autre prélèvement biologique liquide. Identification directement à partir des liquides biologiques sans enrichissement préalable par une phase de croissance en milieu liquide : Les urines de patients présentant une infection urinaire seront prises pour exemple.30 Méthode Hémocultures La première étape de l'analyse a consisté à éliminer les protéines du sang et cellulaires . A 1 ml du bouillon d'hémoculture sont rajoutés 200 tl de saponine à 5%. Après contact de 5 min, de l'eau disti [fée est rajoutée QSP 10 ml. Après centrifugation de 10 min à 5000t/min, le surnageant est éliminé. Le culot est alors repris avec 1 ml d'eau distillée. Le mélange est transféré dans un tube à jupe de 2 ml et de l'eau distillée est rajoutée qsp 2 ml. Après centrifugation 10min à 5000t/min, le surnageant est éliminé et le culot repris avec 20 �l de TFA à 10% (acide trifluoro-acétique). Bouillon d'enrichissement des liquides articulaires : A 1ml de bouillon d'hémoculture sont ajoutés 200 pl de saponine à 5%. Après contact de 5 min, de l'eau distillée est rajoutée QSP 2 ml. Après centrifugation de 10 min à 5000t/min, le surnageant est éliminé. Le culot est alors repris avec 2 ml d'eau distillée. Après centrifugation 10 min à 5000t/min, le surnageant est éliminé et le culot repris avec 20 tl de TFA à 10%. Identification des germes à partir des urines. Les urines ont été traitées comme les liquides articulaires, mais sans ensemencement préalable. Technique MALDI-TOF-MS On opère avantageusement selon la méthode décrite dans la demande internationale PCT.précitée. A titre d'exemple, les conditions opératoires utilisées sont les suivantes : 111l du rnélar..ge précédemment préparé est déposé sur la cible MALDI-TOF-MS. Après séchage de 5 min à température ambiante, 1 �l d'éthanol absolu est déposé. Après séchage, 1 �l d'une solut:.on de matrice DHB (acide 2,5 dihydroxybenzoïque 50 mg/ml, acétonitrile 30%, acide trifluoro-acétique 0.1%) est rajoutée. La cristallisation du mélange est obtenue en 5 quelques minutes à température ambiante. La plaque de dépôt est ensuite placée dans le spectromètre MALDI-TOF Microflex (Bruker Daltonics). Dix séries de 50 tirs laser (laser à N2) sont effectués sur chaque puits. Les ions obtenus sont ensuite soumis à une accélération de 20 kV après application d'un champ électrique (accélération en mode linéaire) et acheminés à travers un tube de vol vers un détecteur (détection des ions positifs). Les acquisitions sont obtenues dans un intervalle de m/z compris entre 3500 et 20000. Pour chaque souche, le spectre obtenu correspond à la sommation des acquisitions obtenues pour chaque puits, soit 500 tirs au total. Le traitement des acquisitions est réalisé avec le logiciel flex analysis. La gamme de calibration est effectuée avec un kit de calibration (Standard I. Bruker Daltonics). Les profils sont analysés et comparés en utilisant le logiciel BGP-database. Etablissement des bases de données MALDI-TOF-MS Les bases de données sont avantageusement établies comme décrit dans la demande internationale PCT évoquée ci-dessus. Résultats et commentaires Les figures 1A à IE montrent des spectres obtenus avec, respectivement, P. aeruginosa. S. aureus, E.coli, E.faecalis, K pneumoniae, ayant poussé en milieu liquide, ici en flacon d'hémoculture. Au moment de l'analyse des spectres, le logiciel BGP bases de données choisit le meilleur match entre le spectre du prélèvement à tester et ceux des bases de données créées. Résultats sur hémocultures positives Les tests ont porté sur 25 hémocultures positives de malades: 5 S. aureus, 11 SCN, 1 Klebsiella pneumoniae, 1 P. aeruginosa , 4 E. coli et 3 E. faecalis. Un Gram a été réalisé sur chaque bouillon d'hémoculture. L'analyse par MALDI-TOF-MS a été conduite en confrontant le spectre de la bactérie à la base de donnée correspondant au groupe bactérien défini par le Gram et a permis l'identification des germes. Résultats sur bouillons d'enrichissement des liquides articulaires :Trois bouillons d'enrichissement retrouvés positifs après 24-48 heures d'incubation ont été testés par la 10 technique MALDI-TOF-MS: 2 à S. aureus, 1 à K. kingae. L'analyse des 3 résultats a montré une identification correcte. Ces premiers résultats montrent la faisabilité et l'intérêt médical de cette technique pour 5 l'identification précoce des germes isolés dans les hémocultures et les liquides articulaires. Résultats sur urines : 10 urines ont été testées. Dans 9 cas, une bactérie E.coli a été identifiée et dans 1 cas une souche de S.saprophyticus. Les identifiacations étaient correctes. Cette technique est donc applicable directement à partir des prélèvements biologiques si la concentration en germes est suffisante et l'infection monomicrobienne. REVENDICATIONS1 - Méthode d'identification de germes dans un milieu liquide caractérisée par l'addition d'un détergent membranaire au milieu liquide renfermant des éléments d'un hôte infecté par des germes, à savoir des composants cellulaires et des protéines du milieu extracellulaire, de manière à libérer les germes des éléments de l'hôte infecté, sans les altérer, et par l'analyse des germes ayant poussé dans le milieu liquide par spectrométrie de masse type MALDITOF-MS 2 û Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes - d'addition au milieu liquide de détergent membranaire, respectant la paroi des germes ; - de récupération des germes du milieu liquide par centrifugation différentielle ; et d'analyse par spectrométrie MALDI-TOF-MS sur le culot de germes, suivie d'une comparaison avec des bases de données appropriées. 3 û Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le détergent membranaire est ajouté à ra son de 5% final au plus, de préférence de 1 à 5% final, en particulier de 2% final. 4 û Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le détergent est choisi dans le groupe comprenant la saponine, le n-octyl-glucoside, le ndodécyl-glucoside, l'octanoyl-N-méthylglucamide, le décanoyl -N-méthylglucamide, le ndodécyl-(3 -D-rialtoside. 5 û Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le temps de contact avec le liquide renfermant le germe à analyser et le détergent est de 8 min au plus, de préférence de 3 à 8 min., plus spécialement de 5 min.environ. 30 6 û Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le mélange est soumis à une centrifugation à 8000 t/minau plus, en particulier à 3000 -5000 t/min, durant 15 min. au plus, de préférence durant environ 5 à 15 min. et plus particulièrement durant 5 min environ. 25 7 û Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le surnageant est éliminé et le culot, repris clans de l'eau distillée, est soumis à une centrifugation en opérant selon les conditions définies dans la revendication 6. 8 - Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que les liquides utilises sont des hémocultures de malades positives à un germe donné, des liquides articulaires ensemencés ou non dans un milieu liquide, des urines ou tout autre fluide biologique ensemencé ou non dans un milieu liquide, par exemple liquide céphalorachidien, liquide provenant de la production de drains ou obtenus par ponctions (abcès), dans la mesure où l'infection est suspectée monomicrobienne.