Brevet FR2944806A1 — publié le 20101029

ADRESSAGE D'ACIDES NUCLEIQUES DANS LES MITOCHONDRIES La présente invention concerne un système navette permettant d'importer des acides nucléiques d'intérêt dans une mitochondrie. Ce système est basé sur l'utilisation d'une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt. Ce système navette est utile, par exemple, dans le domaine agronomique, dans le domaine de la thérapie génique, et dans le cadre de projets de recherche visant à caractériser la fonction de gènes mitochondriaux. Les mitochondries sont des organites présents dans la quasi totalité des cellules eucaryotes. Elles sont impliquées dans de nombreux processus fondamentaux tels que la production d'ATP par phosphorylation oxydative, la synthèse d'acides aminés et la mort cellulaire programmée. Il est aujourd'hui admis que la mitochondrie provient de l'endosymbiose d'une a-protéobactérie à l'intérieur d'une cellule proto-eucaryotique. De fait, les mitochondries possèdent leur propre matériel génétique mais ce dernier n'est plus que le vestige de celui de l'a-protéobactérie ancestrale. Il ne code plus que pour un nombre limité de gènes et la grande majorité des macromolécules (e.g. environ 1500 protéines et quelques ARN) nécessaires à la biogenèse mitochondriale dépendent aujourd'hui de l'expression de gènes nucléaires. Ces macromolécules sont alors transportées du cytosol dans l'organelle. En conséquence, très tôt dans l'évolution, cet organite a dû développer des systèmes de transport qui permettent à ces macromolécules de traverser la double membrane mitochondriale. Ceci est tout particulièrement vrai pour les protéines et les composants majeurs des machineries d'importation de ces macromolécules ont été identifiés chez tous les eucaryotes. En particulier, le complexe TOM (pour � Translocase of the Outer Mitochondrial membrane �) représente la porte d'entrée principale des protéines matricielles au niveau de la membrane externe mitochondriale et le complexe TIM (pour � Translocase of the Inner Mitochondrial membrane �) est nécessaire pour la translocation à travers la membrane interne (Dolezal et al., Science, 313, 314-318, 2006 ; Bolender et al., EMBO Rep, 9, 42-49, 2008). De plus, le mécanisme de transport des protéines requiert une séquence particulière, la séquence d'adressage mitochondriale, généralement située à l'extrémité N-terminale de la protéine et reconnue par le complexe TOM (Habib SJ, Methods Cell Biol, 80, 761-781, 2007). Une fois la protéine transloquée dans l'espace matriciel, cette séquence d'adressage est alors clivée par une peptidase. Stan et al., (Mol Cell Biol, 23, 2239-2250, 2003) décrit ainsi que la protéine DHFR fusionnée à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est importée dans les mitochondries de levure. Comparativement aux protéines, un nombre plus restreint d'ARN est importé dans les mitochondries. Néanmoins ce transport d'ARN est également essentiel à la viabilité cellulaire. Il s'agit d'ARN non codant et plus particulièrement d'ARN de transfert (ARNt). Contrairement aux protéines, les mécanismes de transport des ARN dans les mitochondries sont mal connus et semblent faire appel à des composants protéiques différents selon les organismes (Salinas et al., Trends in Biochem, 33, 320-329, 2008). Le génome mitochondrial subit de nombreuses mutations ponctuelles (en particulier chez les mammifères), insertions, délétions ou recombinaisons (par exemple chez les plantes supérieures). Ces modifications plus ou moins importantes de l'ADN mitochondrial aboutissent à des dysfonctionnements qui engendrent de graves répercussions sur le fonctionnement de la cellule. De tels dysfonctionnements sont au centre de différentes maladies humaines neurodégénératives et neuromusculaires, du diabète, du vieillissement, et même de certains cancers (Bonnet et al., Biochem Biophys Acta, 1783, 1707-1717, 2008 ; Florentz et al., Cell Mol Life Sci, 60, 1356-1375, 2003 ; Trifunovic et al., Nature, 429, 417-423, 2004). Chez les végétaux, le dysfonctionnement des mitochondries, souvent lié à la présence de séquences codantes inhabituelles dans le génome de l'organelle, est à l'origine du phénomène de stérilité mâle cytoplasmique (SMC). Ce phénomène se traduit par l'incapacité des plantes à produire du pollen fonctionnel et constitue un outil très utilisé dans la production de semences hybrides qui sont plus vigoureuses en culture comme le maïs, le coton ou le riz (Budar et Pelletier, C R Acad Sci, 324, 543-550, 2001). Cet organite se retrouve donc au coeur de nombreux programmes de recherche mais les défis majeurs qui restent à relever se heurtent à plusieurs verrous scientifiques et techniques. L'un des verrous les plus importants est l'absence d'une technique fiable et aisée à mettre en oeuvre permettant de transformer l'ADN mitochondrial végétal ou humain de manière stable. Seule la transformation du génome mitochondrial de la levure Saccharomyces cerevisiae (Fox et al., Proc Natl Acad Sci, 85, 7288-7292, 1988) et de l'algue verte Chlamydomonas reinhardtii (Remacle et al., Proc Natl Acad Sci, 103, 4771-4776, 2006) a pu être obtenue à ce jour. L'une des approches possibles pour complémenter un gène mitochondrial muté est d'introduire un gène dans le génome nucléaire de la cellule, et d'importer la protéine codée par le gène dans la mitochondrie en utilisant la voie d'importation mitochondriale des protéines. Cependant cette technique ne permet de complémenter que les dysfonctionnements mitochondriaux dont l'origine est protéique. En effet, cette approche ne permet pas de complémenter des maladies mitochondriales dues par exemple à des mutations d'ARNt mitochondriaux, ni d'influencer directement la réplication, le maintien ou l'expression du génome de la mitochondrie. De plus, la principale limite que présente cette méthode est de faire face à un trafic intracellulaire difficile des protéines fortement hydrophobes codées par le génome mitochondrial. Aussi, il a été envisagé d'adresser de l'ARN messager (ARNm) à la périphérie des mitochondries, pour adresser ensuite la protéine correspondante dans la mitochondrie. En effet, il a été démontré, tant chez S. cerevisiae que dans les cellules humaines, que des ARNm codant des protéines mitochondriales sont enrichis à la surface des organelles. Ainsi, les protéines traduites à partir de ces ARNm sur des polysomes cytosoliques situés à la surface des organelles sont aussitôt entraînées à travers la double membrane mitochondriale. L'importance des régions 3' UTR (pour � 3' untranslated region �) dans la localisation mitochondriale des ARNm a conduit des chercheurs à utiliser ces séquences pour adresser des protéines fortement hydrophobes et compenser ainsi des déficiences mitochondriales entraînant des neuropathies optiques (Bonnet et al., Biochem Biophys Acta, 1783, 1707-1717, 2008 ). Le transport d'acides nucléiques étrangers dans des mitochondries isolées, de façon transitoire ou stable, et ce afin d'étudier ou de manipuler l'expression du génome mitochondrial, n'a été couronné de succès que dans un nombre limité de cas en utilisant les techniques suivantes. L'acide nucléique d'intérêt peut être importé dans des mitochondries végétales isolées par électroporation (Farre et Araya, Nucleic Acid Res, 29, 2484-2491, 2001) ou par voie directe (Koulintchenko et al., EMBO J, 22, 1245-1254, 2003). Les gènes introduits ont été ensuite exprimés sous la dépendance d'un promoteur mitochondrial. Cependant, le transport in vitro d'ADN dans des mitochondries isolées par électroporation souffre de deux problèmes majeurs. D'une part, la technique d'électroporation entraîne la perte d'intégrité d'une partie non négligeable des organelles. D'autre part, cette technique ne peut être appliquée pour l'instant à des cellules entières. Le transport d'ADN par voie directe n'est pas aussi délétère que l'électroporation. En revanche, l'expression du transgène inséré reste aléatoire, faible et difficile à obtenir. Une autre technique repose sur l'utilisation de molécules de PNA (� Peptide Nucleic Acid �), c'est-à-dire des macromolécules qui miment l'ADN. Les molécules de PNA sont fusionnées avec une séquence d'adressage mitochondrial, et peuvent être importées dans des mitochondries de cellules humaines (Muratovska et al., Nucleic Acids Res, 29, 1852-1863, 2001). Cependant la liaison PNA-peptide est difficile à réaliser et le conjugué est vulnérable aux protéases. Une autre technique repose sur l'utilisation du transport naturel d'ARN dans les mitochondries. Dans la grande majorité des cas, ce sont des ARNt codés par le génome nucléaire qui sont transportés dans l'organite. Ce transport a été expérimentalement démontré dans plusieurs organismes, dont l'homme (Salinas et al., Trends Biochem Sci, 33, 320-329, 2008 ; Rubio et al., Proc Natl Acad Sci, 105, 9186-9191, 2008). Récemment, des articles ont décrit la possibilité d'importer un ARNtLys dans des mitochondries humaines. En effet, l'absence d'un ARNtLys mitochondrial fonctionnel conduit au syndrome MERRF (pour � Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers �), lequel aboutit à une maladie dégénérative grave. Kolesnikova et al. (Human Mol Genet, 13, 2519-2534, 2004) décrit le transport de l'ARNtLys de levure, ou de formes mutantes, par utilisation d'un système de transport d'ARN présent dans les mitochondries humaines. Mahata et al. (Science, 314, 471-474, 2006) décrit le transport de l'ARNtLys cytosolique humain dans des mitochondries de cellules humaines par apport d'un complexe protéique d'importation d'ARNt (appelé RIC pour � RNA Import Complex �) du protozoaire Leishmania. Enfin, le transport dans des mitochondries de cellules humaines de petits ARN antisens sous la dépendance d'une séquence signal d'importation d'ARNt de Leishmania et en présence du complexe RIC, a permis la dégradation spécifique d'ARN ciblés (Mukherjee et al., Human Mol Genet, 17, 1292-1298, 2008). Cependant, le transport in vivo de l'ARNtLys ou de ses dérivés, soit par l'utilisation d'un système de transport encore inconnu dans les mitochondries humaines, soit par l'utilisation du complexe RIC, ne peut être généralisable à n'importe quel ARNt. De plus, l'utilisation du complexe RIC qui comporte une douzaine de sous-unités et son insertion dans des membranes mitochondriales est difficile à mettre en oeuvre. Enfin, aucun ARN de grande taille, comme par exemple un ARNm, n'a été transporté à ce jour avec ces systèmes. Ces diverses approches possèdent donc chacune plusieurs inconvénients qui vont de l'instabilité des molécules à la difficulté d'internalisation ou d'expression. De plus, elles limitent les champs d'application du fait de l'absence de système généralisable. En effet, chacune des approches ci-dessus mentionnées n'est possible que pour une classe précise d'acide nucléique. Il serait donc souhaitable d'obtenir un outil permettant l'importation d'acides nucléiques dans les mitochondries qui (i) lèverait la restriction actuelle quant à la très faible diversité des acides nucléiques qui ont pu être adressés aux mitochondries ; (ii) lèverait la restriction actuelle quant à la faible taille des acides nucléiques qui ont pu être adressés aux mitochondries ; (iii) éviterait la lourdeur des techniques actuellement disponibles ; et (iv) permettrait d'assurer la fonctionnalité et la stabilité des acides nucléiques transportés. DESCRIPTION DE L'INVENTION Les inventeurs ont établi une stratégie pour développer un système de navette protéique permettant l'introduction efficace et � à souhait � de n'importe quel acide nucléique dans les mitochondries. Ce système de navette protéique est basé sur l'utilisation d'une protéine capable de fixer des acides nucléiques. Cette protéine, surexprimée en fusion à une séquence d'adressage mitochondriale, est internalisée dans la mitochondrie en entraînant avec elle l'acide nucléique allogène. Plus particulièrement, les inventeurs ont identifié une protéine soluble capable de lier des acides nucléiques de façon aspécifique, la DiHydroFolate Reductase cytosolique de souris (DHFR). Ils ont fusionné cette protéine à une séquence d'adressage mitochondriale, en l'occurrence celle de la sous-unité 9 de l'ATP synthase (atp9) de Neurospora crassa. Cette protéine de fusion est appelée pSu9-DHFR. Les inventeurs ont démontré que la protéine de fusion pSu9-DHFR permet l'importation de plusieurs acides nucléiques différents, à savoir l'ARNtAIa cytosolique de plante, le précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze, et l'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre, dans des mitochondries isolées de pomme de terre. Certains de ces ARN sont de taille importante. Ainsi, le système navette selon l'invention a permis l'importation d'un transcrit d'environ 250 nucléotides correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze, et celle d'un ARNm complet d'environ 650 nucléotides, à savoir l'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre. Il a par ailleurs été montré que la protéine de fusion pSu9-DHFR permet l'importation d'ARN non seulement dans des mitochondries de pomme de terre, mais aussi dans des mitochondries de levure. Le système navette selon l'invention est donc généralisable aux mitochondries de n'importe quel organisme. Ce système permet également l'importation d'acides nucléiques autres que des ARN, puisqu'il a été montré qu'un ADN de 75 nucléotides pouvait être importé dans des mitochondries de pomme de terre et de levure. Le système navette selon l'invention permet donc l'importation de n'importe quel type d'acide nucléique, même de grande taille, au sein de mitochondries issue de n'importe quel organisme. De plus, le protocole de mise en oeuvre de l'invention est simple et efficace. Enfin, ce système navette peut être utilisé pour importer des acides nucléiques de manière ciblée et spécifique, en le mettant en oeuvre avec une protéine de fusion capable de fixer des acides nucléiques de manière séquence-spécifique. 1. Protéines de fusion selon l'invention L'invention concerne des protéines de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt. De telles protéines de fusion sont appelées ici � protéines de fusion selon l'invention �. N'importe quelle séquence d'adressage mitochondriale peut être utilisée dans le cadre de l'invention. De telles séquences sont bien connues de l'homme du métier et incluent, par exemple, pSu9. D'autres séquences d'adressage mitochondriale sont par exemple celle de la sous-unité IV de la cytochrome oxydase (coxlX) de la levure Saccharomyces cerevisiae (Menand et al., Proc Natl Acad Sci, 95, 11014-11019, 1998), celle de la sous-unité VIII de la cytochrome oxydase de Schizosaccharomyces pombe (Ozawa et al., Nature Methods, 4, 413-419, 2007) ou encore celle de la sous-unité F1 R de l'atp synthase de Nicotiana plumbaginifolia (Moberg et al., J Mol Biol, 336, 1129-1140, 2004) Cette liste n'est pas exhaustive et la séquence d'adressage mitochondriale peut être n'importe quelle séquence d'adressage mitochondriale correctement prédite et dont la fonction a été expérimentalement démontrée, selon des critères bien connus de l'homme du métier (Habib et al., Methods in Cell Biology, 80, 761-781, 2007). Dans un mode de réalisation préféré, la séquence d'adressage mitochondriale selon l'invention comprend ou consiste en la séquence pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa. Par � séquence d'adressage mitochondriale pSu9 �, on entend ici le polypeptide codé soit par la séquence SEQ ID NO : 2, soit par des séquences nucléotidiques dérivées de SEQ ID NO : 2. De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à : un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 2 ; une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à SEQ ID NO : 2 ; un variant allèlique de la séquence SEQ ID NO : 2; une séquence homologue à pSu9 provenant d'une autre espèce que Neurospora crassa; à condition que les séquences d'adressage codées par de telles séquences dérivées conservent leur capacité d'adresser la protéine de fusion à la mitochondrie. Cette capacité peut facilement être vérifiée par l'homme du métier, par exemple en utilisant les protocoles décrits dans l'exemple 1.1.7 ou par Pujol et al. (Proc Natl Acad Sci, 105, 6481-6485, 2008). Les séquences nucléotidiques dérivées peuvent différer de la séquence de référence par substitution, délétion et/ou insertion d'un ou de plusieurs nucléotides, et ceci à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité de la protéine codée par l'acide nucléique. Par � séquence au moins 95% (par exemple) identique à une séquence de référence �, on entend une séquence identique à la séquence de référence si ce n'est que cette séquence peut comporter jusqu'à cinq mutations (substitutions, délétions et/ou insertions) pour chaque partie de cent nucléotides de la séquence de référence. Ainsi, pour une séquence de référence faisant 100 nucléotides, un fragment de 95 nucléotides et une séquence de 100 nucléotides comportant 5 substitutions par rapport à la séquence de référence sont deux exemples de séquences 95% identiques à la séquence de référence. Le pourcentage d'identité est généralement déterminé en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, le Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). De préférence, les substitutions, délétions et/ou insertions au niveau de la séquence nucléotidique ne conduisent pas à un changement de phase de lecture, ni à l'introduction d'un codon-stop. Les substitutions peuvent soit être silencieuses, soit conduire à des mutations au niveau de la protéine codée par l'acide nucléiques. La protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut correspondre à n'importe quelle protéine capable de lier un acide nucléique. L'homme du métier peut facilement déterminer si une protéine est capable de lier un acide nucléique par la technique du gel retard (voir les exemples 1.1.13. et 1.2.1.). La protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut lier l'acide nucléique d'intérêt soit de manière aspécifique (i.e. elle est capable de lier les acides nucléiques indépendamment de leur séquence), soit de manière séquence-spécifique (i.e. elle n'est capable de se lier qu'à des acides nucléiques contenant une séquence particulière). La séquence d'adressage mitochondriale est fusionnée à la protéine liant un acide nucléique d'intérêt de sorte à ce qu'une seule protéine soit traduite. En d'autres termes, l'acides nucléique codant la séquence d'adressage mitochondriale est fusionnée à l'acide codant la protéine liant un acide nucléique d'intérêt de sorte à ce qu'il y ait une seule et même phase ouverte de lecture. La protéine de fusion selon l'invention comporte la séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à l'extrémité N-terminale de la protéine liant un acide nucléique d'intérêt. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt est la protéine DHFR murine, qui lie des acides nucléiques de manière aspécifique. Par � DHFR �, on entend ici la protéine codée soit par la séquence SEQ ID NO : 1, soit par des séquences nucléotidiques dérivées de SEQ ID NO : 1. De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à : un fragment d'au moins 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou 550 nucléotides de la séquence SEQ ID NO : 1 ; une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à SEQ ID NO : 1 ; un variant allèlique de la séquence SEQ ID NO : 1; une séquence homologue à DHFR provenant d'une autre espèce que la souris; à condition que les protéines codées par de telles séquences nucléotidiques dérivées conservent leur capacité à lier des acides nucléiques. Lorsque l'invention est mise en oeuvre avec la protéine DHFR, l'acide nucléique d'intérêt peut avoir n'importe quelle séquence. Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt est la protéine de coque du phage MS2, qui lie des acides nucléiques de manière séquence-spécifique. Par � protéine de coque du phage MS2 � ou � CP �, on entend ici la protéine codée soit par les nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18, soit par des séquences nucléotidiques dérivées des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18. De telles séquences nucléotidiques dérivées peuvent par exemple correspondre à : un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, ou 350 nucléotides des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ IDNO:18; une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO:18; un variant allèlique des nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18; une séquence homologue à CP provenant d'une autre espèce que le phage MS2; à condition que les protéines codées par de tels séquences dérivées conservent leur capacité à lier des acides nucléiques de manière séquence-spécifique. La protéine de coque du phage MS2 reconnaît la région en tige-boucle de l'ARN MS2. Le terme � région en tige-boucle de l'ARN MS2 � désigne les nucléotides 154 à 172 et/ou les nucléotides 193 à 211 de la séquence SEQ ID NO : 17. De ce fait, lorsque l'invention est mise en oeuvre avec la protéine de coque du phage MS2, l'acide nucléique d'intérêt doit contenir ou être fusionné à au moins une région en tige-boucle de l'ARN MS2. L'acide nucléique d'intérêt peut par exemple contenir ou être fusionné à au moins une copie des nucléotides 154 à 172 de la séquence SEQ ID NO : 17, des nucléotides 193 à 211 de la séquence SEQ ID NO : 17, ou des nucléotides 125 à 239 de la séquence SEQ ID NO : 17. Cependant, l'homme du métier peut construire une protéine de fusion selon l'invention contenant une protéine liant un acide nucléique d'intérêt de manière séquence-spécifique qui est différente de la protéine de coque du phage MS2. Par exemple, la protéine liant un acide nucléique d'intérêt peut correspondre à PUMILIO1 ou l'un de ses fragments liant des acides nucléiques (Ozawa et al., Nature Methods, 4, 413-419, 2007). Il peut aussi s'agir de protéines comme les facteurs de transcription qui lient de façon spécifique des motifs connus par l'homme du métier, motifs que l'on peut retrouver facilement dans les banques de données Interpro, Pfam ou encore SCOP. Citons par exemple les protéines bZip d'Antirrhinum majus qui lient préférentiellement les motifs CACGTG ou TGACGT/C (Martinez-Garcia et al., The Plant J, 13, 489-505). Un mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la protéine de coque du phage MS2. La séquence d'adressage mitochondriale correspond préférentiellement à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9. De ce fait, l'invention a pour objet une protéine de fusion pSu9-CP comprenant ou consistant en un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150 ou 175 acides aminés de SEQ ID NO : 19, ou comprenant ou consistant en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 19. Un autre mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la protéine DHFR. La séquence d'adressage mitochondriale correspond préférentiellement à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9. De ce fait, l'invention a pour objet une protéine de fusion pSu9-DHFR comprenant ou consistant en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 3, ou comprenant ou consistant en un fragment d'au moins 50, 75, 100, 125, 150, 200 ou 250 acides aminés de SEQ ID NO : 3. Les protéines de fusion selon l'invention qui comprennent ou consistent en une séquence au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% identique à la séquence SEQ ID NO : 3 ou 19 peuvent contenir des mutations telles que des délétions, insertions et/ou substitutions d'acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré, ces protéines diffèrent des protéines de séquence SEQ ID NO : 3 ou 19 par des substitutions conservatives. L'invention concerne également un acide nucléique codant une protéine de fusion selon l'invention, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant un tel acide nucléiques. Dans les vecteurs recombinants selon l'invention, l'acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux d'expression (e.g. promoteur, � enhancer �, terminateur, signaux de traduction, incluant par exemple les régions UTR 5' et 3'), de manière à former une cassette d'expression. Un mode de réalisation préféré selon l'invention porte sur des vecteurs recombinants pour thérapie génique. Par � vecteur recombinant pour thérapie génique � on entend ici tout vecteur convenant à la thérapie génique. De tels vecteurs sont généralement sous la forme d'un virus recombinant, et correspondent donc à des vecteurs viraux. Le vecteur viral peut être choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès, un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. Le terme � virus défectif � désigne un virus incapable de se répliquer dans une cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs est dénué d'au moins les séquences nécessaires pour la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées, soit rendues non fonctionnelles ou encore substituées par d'autres séquences et en particulier par l'acide nucléique qui code pour le peptide d'intérêt. Néanmoins, de préférence, le virus défectif conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsulation des particules virales. Dans un mode de réalisation préféré des vecteurs recombinants pour thérapie génique, le vecteur contient un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale (par exemple pSu9) et une protéine qui lie un acide nucléique de manière séquence-spécifique (par exemple la protéine de coque du phage MS2). 2. Utilisation des protéines de fusion selon l'invention et kits pour l'importation d'acides nucléiques d'intérêt dans des mitochondries La présente invention concerne l'utilisation, in vivo ou in vitro, d'une protéine de fusion selon l'invention (i.e. une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt), ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie. Par � in vitro �, on entend ici toute méthode qui n'est pas réalisée sur un organisme pluricellulaire tel qu'un organisme animal et/ou humain. En revanche, les méthodes in vitro incluent des méthodes réalisées sur des cellules, tissus ou organes préalablement isolés d'un organisme pluricellulaire animal et/ou humain. Les méthodes in vitro incluent également des méthodes réalisées sur des cellules ou tissus de plantes. Dans des modes de réalisation préférés de l'invention ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine DHFR, ou en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine de coque du phage MS2. Les mitochondries peuvent soit être isolées, soit être présentes au sein d'une cellule. L'homme du métier peut facilement obtenir des mitochondries isolées, par exemple en utilisant les protocoles décrits dans les exemples 1.1.4. et 1.1.6. Les mitochondries peuvent être issues de n'importe quel organisme eucaryote, tel que des levures, des champignons, des plantes ou des animaux (y compris des humains). Lorsque les mitochondries sont isolées, la protéine de fusion peut lier l'acide nucléique de manière aspécifique ou de manière séquence-spécifique. Dans le cas d'une importation dans une mitochondrie d'une cellule, une protéine de fusion liant l'acide nucléique de manière séquence-spécifique est préférentiellement utilisé. L'homme du métier peut aisément vérifier si l'acide nucléique d'intérêt a été importé dans la mitochondrie, par exemple en utilisant le protocole décrit dans l'exemple 1.1.7. L'invention concerne également un kit pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie comprenant : i. une protéine de fusion selon l'invention, ou un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ; et, optionnellement, ii. au moins un réactif pour l'importation de l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie ; et/ou iii. des instructions pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie. Les réactifs du kit peuvent correspondre à n'importe lequel des réactifs décrits dans les exemples de la présente demande. Ils peuvent par exemple correspondre à au moins un réactif choisi parmi un tampon import (e.g. Mannitol 600 mM, phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, Hepes-KOH pH 7,2 20 mM, KCI 40 mM, DTT 2 mM, malate 2 mM, NADH 2 mM), un tampon de lavage (e.g. saccharose 300 mM, phosphate de potassium pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,1%(p/v), glycine 5 mM) et un tampon STOP (e.g. le tampon de lavage contenant de l'EGTA 5 mM et de l'EDTA 5 mM). 3. Procédé d'importation d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée La présente demande concerne également un procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée, comprenant l'étape de mettre en contact une protéine de fusion selon l'invention avec un acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée. La mise en contact peut par exemple être réalisée en mélangeant environ 1 �g de la protéine de fusion avec environ 50 à 100 fmoles de l'acide nucléique d'intérêt et environ 200 �g de mitochondries isolées. A ce mélange est additionné les réactifs appropriés, tels qu'un tampon import (par exemple contenant du Mannitol 600 mM, du phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, de l'Hepes-KOH pH 7,2 20 mM, du KCI 40 mM, du DTT 2 mM, du malate 2 mM et du NADH 2 mM), de l'ADP, et de l'ATP. Après la mise en contact, on laisse en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée. Pour ce faire, on incube à une température et pendant une durée appropriée. Par exemple, l'incubation peut être réalisée entre 4°C et 30°C, entre 20°C et 30°C, ou préférentiellement aux alentours de 25°C. L'incubation peut par exemple avoir une durée de 5 min à 16 h (� overnight �), 15 min à 2 heures, ou environ 30 min. Le procédé peut comporter une étape supplémentaire consistant à ajouter un mélange contenant de la RNAse ou de la DNAse afin de dégrader les acides nucléiques d'intérêt se trouvant à l'extérieur des mitochondries. Le procédé peut contenir une autre étape supplémentaire qui consiste en l'arrêt de la réaction, la centrifugation du mélange, l'élimination du surnageant, et le lavage du culot de mitochondries. Les acides nucléiques du culot de mitochondries peuvent ensuite être extraits pour analyse. Lorsque le procédé d'importation selon l'invention est mis en oeuvre avec un acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention, le procédé d'importation contient en outre les étapes suivantes, avant l'étape (a) : ù produire une protéine de fusion selon l'invention ; et optionnellement, ù purifier ladite protéine de fusion. La protéine de fusion selon l'invention peut par exemple être produite par des techniques recombinantes, par exemple par expression de l'acide nucléique codant une protéine de fusion selon l'invention dans une cellule hôte convenant à la production de protéines recombinantes. De telles cellules hôtes incluent notamment les bactéries (E.coli), les levures, les champignons, ainsi que les cellules animales et/ou humaines. 4. Procédé d'importation d'un acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie d'une cellule Un aspect de l'invention concerne l'importation d'acides nucléiques d'intérêt de manière séquence-spécifique. Dans ce cas, la cellule est transformée par deux acides nucléiques, l'un étant l'acide nucléique d'intérêt, et l'autre codant une protéine de fusion selon l'invention liant un acide nucléique de manière séquence- spécifique. Une fois intégrés dans le génome nucléaire de la cellule, les deux acides nucléiques sont transcrits en ARN. L'ARN codant la protéine de fusion selon l'invention est traduit en protéine. Une fois exprimée dans le cytoplasme de la cellule, la protéine de fusion permet alors l'importation de l'acide nucléique d'intérêt, lui aussi présent dans le cytoplasme, dans la mitochondrie. Ainsi, l'invention concerne une combinaison d'acides nucléiques comprenant : a) un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à l'acide nucléique lié par ladite protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique. Dans un mode de réalisation préféré, la combinaison d'acides nucléiques comprend : a) un acide nucléique codant la séquence d'adressage mitochondriale (par exemple pSu9) fusionnée à la protéine de coque du phage MS2; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à au moins une région en tige-boucle de l'ARN MS2. Dans un premier mode de réalisation, un seul et même vecteur recombinant comprend les acides nucléiques (a) et (b). En d'autres termes, la combinaison correspond à un vecteur recombinant comprenant les acides nucléiques (a) et (b). Un tel vecteur fait partie des vecteurs recombinants selon l'invention. Alternativement, les deux acides nucléiques sont positionnés sur deux vecteurs différents. Dans ce cas, la combinaison correspond à une combinaison de vecteurs recombinants, l'un comprenant l'acide nucléique (a), l'autre comprenant l'acide nucléique (b). L'invention concerne également un procédé d'importation in vitro ou in vivo d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule, comprenant les étapes de : a) obtenir ou préparer une combinaison d'acides nucléiques tels que définis ci-dessus; et b) introduire ladite combinaison d'acides nucléiques dans une cellule. L'acide nucléique codant la protéine de fusion selon l'invention est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux d'expression (e.g. promoteur, � enhancer �, terminateur, signaux de traduction, 5' ou 3'UTR), de manière à former une cassette d'expression. Quant à l'acide nucléique d'intérêt fusionné à l'acide nucléique reconnu par ladite protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique, il est préférentiellement placé sous le contrôle de signaux permettant sa transcription (e.g. promoteur, � enhancer �, terminateur). La cellule peut correspondre à n'importe quelle cellule eucaryote contenant des mitochondries, par exemple des cellules de levure, de champignons, de plantes ou d'animaux (y compris des cellules humaines). Les vecteurs peuvent être introduits dans la cellule par n'importe quelle méthode appropriée, telle que l'électroporation, la transformation biolistique, la transformation via agrobacterium ou tout agent bactérien adapté à l'organisme hôte, la micro-injection, les méthodes chimiques, etc. La méthode sera généralement choisie en fonction du type de cellule utilisé. 5. Domaines d'application de l'invention Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus sont notamment utiles dans le domaine de la thérapie génique, dans le domaine agronomique, pour produire des protéines dans des mitochondries, pour analyser des processus fondamentaux pour la biogenèse mitochondriale, et pour manipuler l'expression du génome mitochondrial. Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus peuvent par exemple être utilisés pour l'analyse de processus fondamentaux pour la biogenèse mitochondriale. La facilité à introduire à volonté des acides nucléiques dans des mitochondries, quelque soit leur séquence et/ou leur taille, permet d'envisager de nombreuses études visant à comparer des acides nucléiques sauvages à des formes mutées, à étudier leur stabilité, et/ou leur fonctionnalité dans l'organelle. Les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus permettent également la manipulation de l'expression du génome mitochondrial. Ainsi, le système navette selon l'invention permet l'introduction aisée et efficace d'ARN antisens, d'oligonuléotides sens ou antisens, de ribozymes complémentaires à des régions impliquées dans la réplication, la transcription ou la traduction afin de tester directement et rapidement l'effet sur l'expression du génome mitochondrial, par exemple chez les plantes. D'autre part, les protéines de fusion, acides nucléiques, vecteurs, utilisations et procédés décrits ci-dessus permettent la production de protéines allogènes. La présente invention permet, pour la première fois, l'introduction d'ARNm complets avec leurs régions 5' et 3' UTR dans une mitochondrie. La production de la protéine correspondante est alors envisageable. En absence des séquences indispensables à la traduction eucaryotique, ces ARNm seront exclusivement traduits en protéine dans la mitochondrie où ils sont adressés. Si le code génétique diverge, ce qui est le cas pour les mitochondries animales par exemple, l'ARNm ne pourra être produit que dans la mitochondrie de part les codons utilisés. La présente invention concerne également l'utilisation des protéines de fusion selon l'invention dans le domaine de la thérapie génique. L'acide nucléique d'intérêt est importé dans une mitochondrie d'une cellule humaine ou animale grâce à une protéine de fusion selon l'invention. Ainsi, un aspect de l'invention porte sur : ù un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour utilisation en tant que médicament et/ou pour utilisation en thérapie génique ; l'utilisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour la préparation d'un médicament, préférentiellement destiné à la thérapie génique ; une composition pharmaceutique comprenant une protéine de fusion selon l'invention, un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention. Les vecteurs recombinants peuvent correspondre à n'importe quel vecteur recombinant contenant une protéine de fusion selon l'invention. Ils correspondent préférentiellement à des vecteurs pour thérapie génique. Les vecteurs et combinaisons de vecteurs ou d'acides nucléiques correspondent préférentiellement à ceux décrits dans le paragraphe 4 ci-dessus, intitulé � Procédé d'importation ciblé et spécifique d'un acide nucléique d'intérêt �. Le ou les vecteurs peuvent être introduits in vivo par toute technique connue de l'homme du métier. En particulier, il est possible d'introduire le vecteur d'ADN in vivo sous une forme nue, c'est-à-dire sans l'aide d'un quelconque véhicule ou système qui faciliterait la transfection du vecteur dans les cellules. Un canon à gènes peut être également employé, par exemple en déposant l'ADN à la surface de particules � en or � et en projetant celles-ci de manière à ce que l'ADN pénètre à travers la peau d'un patient. Des injections au moyen d'un gel liquide sont également possibles pour transfecter à la fois peau, muscle, tissu gras et tissu mammaire. Des techniques de microinjection, électroporation, précipitation au phosphate de calcium, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Des nanoparticules en polyalkyl cyanoacrylate biodégradables sont particulièrement avantageuses. Dans le cas de liposomes, l'utilisation de lipides cationiques favorise l'encapsulation des acides nucléiques qui sont chargés négativement, et facilite la fusion avec les membranes cellulaires chargées négativement. Une administration ciblée de gènes est par exemple décrite dans la demande WO 95/28 494. Les vecteurs et combinaisons selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter n'importe quelle maladie humaine liée à une déficience mitochondriale. Les vecteurs et combinaisons permettent de complémenter le gène déficient en introduisant par transgenèse le gène non muté dans le génome nucléaire, alors que la transgenèse génétique directe des mitochondries humaines est actuellement impossible. Le produit de ce gène est ensuite adressé à la mitochondrie. La présente invention permet d'élargir considérablement la panoplie d'acides nucléiques transportables dans la mitochondrie. De plus, elle permet de tester très rapidement, in vitro, dans les mitochondries isolées, les acides nucléiques les plus adaptés pour complémenter une fonction mitochondriale déficiente, et/ou pour inhiber la réplication des molécules d'acides nucléiques � malades � afin de refaire basculer le seuil critique vers les molécules d'acides nucléiques � saines �. Un exemple de maladie qui peut être traité par les vecteurs recombinants et combinaisons selon l'invention est le syndrome MERRF (� Myoclonic Epilepsy and Red Ragged Fibers �). L'invention porte donc sur un vecteur recombinant selon l'invention, ou une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour traiter et/ou prévenir le syndrome MERRF. Dans ce cas, l'acide nucléique d'intérêt qui est présent dans le vecteur ou la combinaison selon l'invention est l'ARNtLys mitochondrial humain. La présente invention concerne enfin l'utilisation des protéines de fusion selon l'invention dans le domaine agronomique. L'acide nucléique d'intérêt est importé dans une mitochondrie d'une cellule de plante grâce à une protéine de fusion selon l'invention qui, de préférence, lie ledit acide nucléique d'intérêt de manière séquence-spécifique. Ainsi, un aspect de l'invention porte sur l'utilisation in vitro du vecteur selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule de plante. La cellule de plante peut par exemple correspondre à un protoplaste. Les vecteurs recombinants peuvent correspondre à n'importe quel vecteur recombinant contenant une protéine de fusion selon l'invention. Les vecteurs et combinaisons de vecteurs ou d'acides nucléiques correspondent préférentiellement à ceux décrits dans le paragraphe 4 ci-dessus, intitulé � Procédé d'importation ciblé et spécifique d'un acide nucléique d'intérêt �. L'invention concerne plus particulièrement un procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) obtenir ou préparer une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention; b) introduire ladite combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques dans une cellule de plante, par exemple en transformant un protoplaste ; c) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (b) ; et d) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome lesdits vecteurs ou acides nucléiques. Par ailleurs, il est possible d'injecter des mitochondries isolées dans des protoplastes de plante (Verhoeven et al., Plant Cell Reports, 14 : 781-785, 1995). De ce fait, l'invention concerne également un procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact une protéine de fusion selon l'invention avec l'acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée ; et b) laisser en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée ; c) introduire ladite mitochondrie isolée dans une cellule de plante, par exemple un protoplaste ; d) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (c) ; et e) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome ledit acide nucléique d'intérêt. La méthode ci-dessus peut aussi bien être mise en oeuvre avec des protéines de fusion selon l'invention liant l'acide nucléique d'intérêt de manière séquence-spécifique qu'avec des protéines de fusion selon l'invention liant l'acide nucléique d'intérêt de manière aspécifique. Les plantes obtenues à l'étape (d) ou (e) des méthodes ci-dessus peuvent ensuite être croisées entre elles, et des plantes homozygotes pour l'acide nucléique d'intérêt peuvent être sélectionnées. Alternativement, les plantes obtenues à l'étape (d) ou (e) peuvent être croisées avec une plante de la même espèce, et les plantes issues du croisement et ayant conservé l'acide nucléique d'intérêt peuvent être sélectionnées. Les plantes recombinantes obtenues par de tels procédés font également partie de l'invention, ainsi que les semences et fruits de telles plantes. Ces procédés sont utiles pour améliorer les caractéristiques des plantes d'intérêt agronomique, par exemple leur résistance aux stress biotiques et/ou abiotiques, et pour maîtriser la stérilité mâle cytoplasmique. Dans ce dernier cas, les procédés selon l'invention sont utilisés pour introduire un ARNm produisant une protéine capable de générer une stérilité mâle cytoplasmique. Ainsi, un mode de réalisation préféré de l'invention concerne l'utilisation in vitro d'un vecteur selon l'invention, ou d'une combinaison de vecteurs ou d'acides nucléiques selon l'invention, pour générer une stérilité mâle cytoplasmique chez une plante. Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande. Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes � comprenant �, � contenant �, � comportant � et � consistant en � ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : A. Interaction de la protéine pSu9-DHFR avec le transcrit radioactif correspondant à l'ARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana. L'analyse a été effectuée par la technique de gel retard. La figure présente une autoradiographie du gel en condition native. La première colonne (-) montre l'ARNtAIa radiomarqué servant de sonde. Les autres colonnes (DHFR) montrent qu'une migration retardée de la sonde est observée en présence de quantité croissante de DHFR. B. Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAIa marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. �In � représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAIa présente dans le milieu d'importation. � + � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en présence de 1 �g de pSu9-DHFR. � - � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en l'absence de pSu9-DHFR. Deux expositions du même gel (4h et la nuit) sont présentées. Figure 2 : A. Effet de l'addition de pSu9-DHFR et de DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAIa marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. � In � représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAIa présente dans le milieu d'importation. � - � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en l'absence de DHFR ou de pSu9-DHFR. � 2 � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en présence de 2�g de DHFR ou de pSu9-DHFR. � 4 � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en présence de 4�g de DHFR ou de pSu9-DHFR. B. Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro du transcrit d'ARNtAIa marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre en présence de méthotrexate. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. � In � représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAIa présente dans le milieu d'importation. � - � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en l'absence de pSu9-DHFR. � + � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en présence de 1�g de pSu9-DHFR. � Mtrx � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa: en présence de 1�g de pSu9-DHFR et de méthotrexate (50 �M). Figure 3 : Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro de transcrit correspondant au précurseur d'ARNtHis édité ou non édité de mélèze dans des mitochondries isolées de pomme de terre. A. Schéma du précurseur d'ARNtHis de mélèze. P1 et P2 indiquent la localisation schématique des sites d'hybridation des amorces utilisées pour la cRT-PCR. B. Importation du transcrit marqué radioactivement. La figure représente l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. � In � représente la quantité initiale de transcrit précurseur d'ARNtHis présente dans le milieu d'importation. � - � représente la quantité de transcrit précurseur d'ARNtHis en l'absence de pSu9-DHFR. � + � représente la quantité de transcrit précurseur d'ARNtHis en présence de 1�g de pSu9-GFP. � pretrnH-ed � désigne le précurseur d'ARNtHis édité. � pretrnH-uned � désigne le précurseur d'ARNtHis non édité. � tr � désigne le transcrit d'ARNtHis mature. C. Séquence de 15 clones de l'ARNtHis obtenus après importation in vitro. Seules les extrémités 5' et 3' des séquences sont représentées. La séquence CCA ajoutée post-transcriptionnellement, observée pour 5 de ces clones, est représentée en texte italique souligné. Les séquences du précurseur non complètement maturé sont représentées en gras. Figure 4 : Effet de l'addition de pSu9-DHFR sur l'importation in vitro d'un oligonucléotide correspondant à l'ARNtAIa marqué radioactivement dans des mitochondries isolées de pomme de terre. La figure montre l'autoradiographie d'un gel de polyacrylamide dénaturant 15%. � T � représente la quantité initiale de transcrit d'ARNtAIa présente dans le milieu d'importation. � + � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en présence de 1 �g de pSu9-DHFR. � - � représente la quantité de transcrit d'ARNtAIa en l'absence de pSu9-DHFR. � Mi � désigne le traitement RNase réalisé sur mitochondries intègres. � Mtp � désigne le traitement RNase réalisé sur mitoplastes. A. Mitochondries isolées de pomme de terre. B. Mitochondries isolées de levure. DESCRIPTION DES SEQUENCES DU LISTAGE DE SEQUENCES SEQ ID NO : 1 représente la séquence codant la DHFR de souris. SEQ ID NO : 2 représente la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa. SEQ ID NO : 3 représente la séquence protéique de la protéine de fusion 20 pSu9-DHFR SEQ ID NO : 4 représente la séquence codant l'ARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana. SEQ ID NO : 5 représente la séquence codant la GFP. SEQ ID NO : 6 représente la séquence codant la forme précurseur de 25 l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze. Les nucléotides en position 81, 87 et 117 sont des sites d'édition. SEQ ID Nos. 7 et 8 représentent des amorces pour analyse par la technique de cRT-PCR. SEQ ID NO : 9 représente la séquence codant l'atp9 mitochondrial de 30 pomme de terre. Les nucléotides en position 353, 383, 414, 415, 423, 425, 515, 524, 545 et 556 correspondent à des sites d'édition. La version non éditée du gène codant l'atp9 mitochondrial contient une cytidine aux positions notées � y �. Au niveau de l'ARNm correspondant obtenu après transcription, ces positions sont éditées en uridine par des enzymes matricielles mitochondriales (générant des thymidines au niveau des séquences d'ADN correspondantes). SEQ ID NO : 10 représente la séquence codant l'atp9 mitochondrial de pomme de terre seule. Cette séquence contient les mêmes sites d'édition que la 5 séquence SEQ ID NO : 9. SEQ ID Nos. 11 à 14 représentent des oligonucléotides pour mutagenèse par PCR. SEQ ID Nos. 15 et 16 représentent des amorces utilisées pour analyse par RT-PCR. 10 SEQ ID NO : 17 représente la séquence codant la forme précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze fusionnée, du côté 3', à la séquence codant la partie en tige-boucle de l'ARN MS2. SEQ ID NO : 18 représente la séquence nucléotidique correspondant à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine CP. 15 SEQ ID NO : 19 représente la séquence polypeptidique de la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine CP. SEQ ID Nos. 20 à 27 représentent des oligonucléotides pour mutagenèse par PCR. SEQ ID Nos. 28 à 34 représentent les séquences d'au moins dix acides 20 aminés montrées sur la Figure 3C. EXEMPLE 1 : ADRESSAGE IN VITRO d'ARN ALLOGENE DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE PLANTES VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9-DHFR 25 1.1. Matériel et Méthodes 1.1.1. Surexpression et purification de la protéine recombinante pSu9-DHFR dans Escherichia coli Le vecteur pQE40 (Quiagen) contenant un gène chimère codant la DHFR de souris (SEQ ID NO : 1) fusionnée à la séquence d'adressage mitochondriale 30 pSu9 du gène atp9 de Neurospora crassa (SEQ ID NO : 2 ; Pfanner et al., Eur J Biochem, 169, 289-293, 1987) a été utilisé pour la surexpression de la protéine de fusion pSu9-DHFR (SEQ ID NO : 3). Ce vecteur pSu9-DHFRpQE40 est utilisé pour transformer des bactéries E. coli, souche M15. pSu9-DHFR peut facilement être purifiée en condition native à l'aide d'un tag histidine présent à l'extrémité C terminale de la protéine. Le protocole suivant a été utilisé. 5 mL de milieu LB additionnés d'ampicilline (100 �g/mL) sont ensemencés avec la souche recombinante d'E. coli M15 contenant le plasmide pSu9-DHFRpQE40 et sont incubés une nuit à 37°C sous agitation. Cette préculture est utilisée pour ensemencer 45 mL de LB (Extrait de levure 5 g/I, bactotryptone 10 g/I, NaCl 10 g/I, pH 7,0) additionnés d'ampicilline (100 �g/mL) et d'IPTG (isopropyl-b-D-galactothiopyranoside) (1 mM). L'IPTG induit l'expression de la protéine. La surexpression est réalisée pendant 4 heures à 37°C sous agitation. Les bactéries sont récupérées par centrifugation pendant 5 minutes à 11000 g à température ambiante. Toutes les étapes sont réalisées à 4°C. Après obtention des bactéries induites celles-ci sont soumises à 10 sonications d'une durée de 8 secondes chacune dans 1,8 mL de tampon de lyse (Tris-malate pH8,2 50 mM, NaCl 0,6 M, MgCl2 5 mM, glycérol 1% (v/v), Triton X-100 1% (v/v), Imidazole 70 mM, 20 gl de PMSF (paramehtyl sulfonyl fluoride) 100 mM ajoutés extemporanément). Le lysat cellulaire est centrifugé 30 minutes à 4000 g. 200 �L de résine Ni-NTA Superflow (Qiagen) sont lavés 3 fois dans 500 �L de tampon de lavage (Tris-malate pH8,2 50 mM, NaCl 0,6 M, MgCl2 5 mM, glycérol 1% (v/v), imidazole 70 mM). La résine est récupérée entre chaque lavage par centrifugation 5 minutes à 9000 g. Le surnageant du lysat cellulaire est ajouté à la résine. L'ensemble est incubé 1 heure sous agitation douce. Après centrifugation 5 minutes à 9000 g, le surnageant est éliminé. La résine est lavée 3 fois dans 300 �L de tampon de lavage comme précédemment. Les protéines fixées sur la résine sont alors éluées en présence de 100 �L de tampon d'élution (Hepes pH 7,5 25 mM, NaCl 0,6 M, MgCl2 5 mM, imidazole 250 mM) pendant 15 minutes. L'éluat est récupéré par centrifugation 5 minutes à 9000 g. Cette étape d'élution est répétée 2 fois et les éluats sont congelés dans de l'azote liquide puis conservés à -80°C. 1.1.2. Transcription d'ADN in vitro Le kit Riboprobe� (Promega) permet la production de transcrits in vitro à partir du vecteur pGEM�-T Easy contenant les gènes d'intérêt et linéarisé par une enzyme de restriction. Suivant l'orientation de l'insert dans le vecteur, les ARN polymérase T7 ou Sp6 sont utilisées. La réaction se déroule 3 heures à 37°C dans 20 �L du milieu réactionnel suivant : 5 à 10�g d'ADN plasmidique digéré, 4 �L de tampon de transcription 5x (Hepes-KOH pH 7,5 400 mM, MgCl2 120 mM, DTT 200 mM, spermidine 10 mM), mélange de NTP**, 1 �L d'un mélange enzymatique (15-20 U d'ARN polymérase T7 ou Sp6, 0,3 U de pyrophosphatase) et 40 U d'inhibiteur de RNases (RNaseOUTTM - Invitrogen). Après la réaction de synthèse des transcrits, 2 unités de DNase RQ1 (Promega) ainsi que 5�L de tampon DNase 10x (Tris-HCI pH 8,0 200 mM, MgCl2 100 mM) sont ajoutés et le volume est complété à 50 L. Une incubation à 37°C pendant 15 minutes est nécessaire pour digérer l'ADN. Afin d'éliminer les nucléotides non incorporés durant la transcription in vitro et les produits de dégradation de l'ADN, le milieu réactionnel est déposé sur une colonne de Sephadex G-50 d'1 mL préalablement séchée par centrifugation à 200 g. L'élution se fait par une nouvelle centrifugation dans les mêmes conditions. Les ARN sont ensuite précipités à -20°C pendant une heure dans 2,5 volumes d'éthanol en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10 �L d'eau. Trois types d'ARN peuvent être produits suivant le mélange de NTP utilisé. Des transcrits d'ARN non marqués sont réalisés dans un milieu réactionnel contenant 2,5 mM de chaque NTP. Des ARN marqués radioactivement sont produits dans un milieu réactionnel contenant 2,5 mM de GTP, CTP et ATP, 0,5 mM d'UTP et 4 �L d'[a32P]UTP (10 activité spécifique : 3 �Ci/pmol). Des ARN marqués avec un fluorophore sont produits dans un milieu réactionnel contenant 0,5 mM de GTP, CTP et ATP, 0,375 mM d'UTP et 100 �M d'UTP Chromatide� Alexa Fluor� 488 (Molecular Probe). 1.1.3. Mutagenèse par PCR û construction de gènes chimériques Les gènes chimériques sont construits par la technique d'extension de fragments chevauchants par PCR. Cette méthode nécessite deux étapes. Lors de la première étape, deux PCR sont réalisées en parallèle à partir de deux matrices différentes : la matrice n° 1 en présence du premier couple d'amorces (amorces a et b) et la matrice n ° 2 en présence du deuxième couple d'amorces (amorces c et d). Un dixième des deux produits PCR obtenus sont alors mis en présence des amorces a et d pour réaliser une dernière étape de PCR. Au final, le produit PCR correspond à la fusion d'une partie des deux matrices de départ. 1.1.4. Purification de mitochondries de pommes de terre Le protocole utilisé est celui décrit par Pujol et al. (froc Natl Acad Sci, 105, 6481-6485, 2008). Le rendement est d'environ 15 mg d'équivalent de protéines mitochondriales par kg de tubercules de pommes de terre (variété Bintje). Lorsqu'elles sont utilisées pour des expériences d'importation, les mitochondries sont remises dans un volume minimal de tampon de lavage PdT. 1.1.5. Dosage des mitochondries en équivalent protéines par la méthode de 10 Bradford Cette méthode est basée sur la modification de la longueur d'onde d'absorption du bleu de Coomassie G-250 en milieu acide après sa fixation sur les protéines (595 nm). En pratique, 800 �L de réactif de Bradford (BioRad) et 200 �L d'extrait protéique à quantifier sont mélangés et l'absorbance est mesurée à 595 15 nm. Cette mesure de DO permet de déterminer la quantité de protéines présentes en se référant à une gamme étalon de BSA établie avec des quantités connues. La quantité de mitochondries utilisée lors des différentes expériences a été évaluée par cette technique. Dans la présente demande, � mg de mitochondries � fait référence à des mg d'équivalent en protéines mitochondriales. 20 1.1.6. Obtention de mitoplastes Les mitoplastes sont des mitochondries chez lesquelles il y a eu rupture de la membrane externe. Pour préparer les mitoplastes, une méthode basée sur le principe de gonflement hypotonique est utilisée. Le changement d'osmolarité entraîne la rupture de la membrane externe, mais pas celle de la membrane 25 interne. Le protocole suivi pour obtenir des mitoplastes de pomme de terre est celui décrit par Delage et al. (Mol Cell Biol, 23, 4000-4012, 2003). 1.1.7. Importation in vitro de protéines radiomarquées dans des mitochondries isolées de pomme de terre • Transcription et traduction in vitro 30 Le précurseur de la protéine dont on souhaite étudier l'importation dans les mitochondries est synthétisé par une transcription et une traduction couplées dans un lysat de réticulocytes de lapin en présence de méthionine marquée au [35S]. Nous utilisons le système � TNT� Coupled Retyculocytes Lysate System � (Promega). Le milieu réactionnel de 50 �L contient 25 �L de TNT� Rabbit Retyculocytes Lysate (Promega), 2 �L du tampon de transcription TNT� (Promega), 1�L de T7 ou de Sp6 ARN polymérase TNT� (Promega) suivant l'orientation du gène dans le plasmide, 1�L d'un mélange d'acides aminés sans méthionine 1 mM, 2�L de [35S] méthionine 10 �Ci/�L (activité spécifique de 1000 Ci/mmol), 1 à 2 pg d'un plasmide contenant le promoteur T7 ou Sp6 ARN polymérase et l'ADNc complet de la protéine d'intérêt. Après 1 heure 30 d'incubation à 30°C, l'ensemble est congelé à -80°C. • Test d'importation in vitro de protéines dans les mitochondries L'importation in vitro de protéines dans les mitochondries est réalisée selon le protocole décrit par Pujol et al. (froc Natl Acad Sci, 105, 6481-6485, 2008). Cinquante pg de mitochondries de pomme de terre sont repris dans un volume final de 50 �L contenant 25 �L de tampon d'importation (Mannitol 300 mM, Hepes-KOH pH 7,5 20 mM, KCI 80 mM, K2HPO4 1 mM, malate 1 mM, DTT 1 mM, NADH 1 mM) en présence de 40 �M d'ADP et 2 mM d'ATP. Les protéines radiomarquées (5 �L) sont ajoutées et la solution est incubée 30 minutes à 25°C sous agitation. Le milieu réactionnel est ensuite déposé sur un coussin de saccharose à 27% (Tris-HCI pH 7,5 20 mM, saccharose 27% p/v, EDTA pH 8,0 1 mM, K2HPO4 100 mM, BSA 1 mg/mL) et les mitochondries sont récupérées après centrifugation 10 minutes à 9000 g. Le surnageant est éliminé et le culot de mitochondries est analysé sur gel de polyacrylamide dénaturant. Le gel est ensuite séché puis exposé contre une plaque phospholmager (Fuji) ou mis en autoradiographie. Dans la pratique, une expérience d'importation nécessite un certain nombre de contrôles. Quatre essais différents sont donc généralement réalisés : -le premier échantillon ne subit aucun traitement particulier ; -le second échantillon subit un traitement à la protéinase K (100 �g/mL pendant 10 minutes à température ambiante inhibée ensuite avec 1 mM de PMSF). Avec ce traitement, seules les protéines incorporées dans les mitochondries sont alors protégées de l'action de la protéinase K ; -dans le troisième essai, les mitochondries sont pré-traitées à la valinomycine (2 �M) pendant 10 minutes à 4°C avant l'ajout des protéines marquées. Ce traitement a pour effet de dissiper le potentiel de membrane bloquant ainsi le transport du précurseur à travers le canal d'importation des protéines. -le quatrième échantillon est traité à la valinomycine et à la protéinase K. Dans ces conditions, ni la protéine précurseur ni la protéine mature sont protégées de la dégradation par la protéinase K. Ce contrôle montre que la bande considérée comme la protéine mature n'est pas un produit de dégradation résistant à la protéinase K. • Analyse de protéines sur gel de polyacrylamide dénaturant La séparation des protéines est effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12% en conditions dénaturantes en présence de SDS. Le gel comporte un gel de concentration (5% acrylamide/bisacrylamide 37,5/1 (p/v), Tris-HCI pH 6,8 125 mM, SDS 0,1% (p/v)) et un gel de séparation (12% acrylamide/bisacrylamide 35,5/1 (p/v), Tris-HCI pH 8,8 380 mM, SDS 0,1% (p/v)). La polymérisation du gel est obtenue par addition de persulfate d'ammonium 0,1% (p/v) et de TEMED 0,01% (v/v). Un volume de tampon Laemmli (Tris-HCI pH6,8 100 mM, SDS 4% (p/v), R-mercaptoéthanol 4% (v/v), glycérol 15%, bleu de bromophénol 0,05% (p/v)) est ajouté aux échantillons protéiques avant dépôt. La migration se fait dans du tampon SDS-PAGE (Tris 25 mM, glycine 250 mM, SDS 0,1% (p/v)) sous ampérage constant de 30 mA. Les protéines sont révélées par incubation dans une solution de coloration (Bleu de Coomassie 0,25% (p/v), acide acétique 10% (v/v), méthanol 40% (v/v)) pendant 30 minutes puis par plusieurs passages successifs dans une solution de décoloration (Acide acétique 10% (v/v), éthanol 20% (v/v)). Le gel est ensuite séché 1 heure dans un sécheur de gel, avant d'être exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mis en autoradiographie pour visualiser les protéines radioactives. • Importation d'acides nucléiques dans des mitochondries Une expérience d'importation d'un transcrit radiomarqué dans des mitochondries de pomme de terre est réalisée dans un milieu réactionnel de 100 �L contenant 50 �L de tampon import 2x PdT (Mannitol 600 mM, phosphate de potassium pH 7,5 2 mM, Hepes-KOH pH 7,2 20 mM, KCI 40 mM, DTT 2 mM, malate 2 mM, NADH 2 mM), 40 �M d'ADP, 5 mM d'ATP, 5 mM de MgCl2, 200 �g de mitochondries (équivalent protéines), 50 à 100 fmoles de transcrit marqué au [a32P]UTP (50 000 à 100 000 cpm) et 1 gg de pSu9-DHFR. Après incubation 30 minutes à 25°C, 100 �L d'un mélange RNase (100 �g/mL de RNase A, 750 U/mL de RNase Ti dans du tampon de lavage : saccharose 300 mM, phosphate de potassium pH 7,5 10 mM, EDTA 1 mM, BSA 0,1 %(p/v), glycine 5 mM) sont ajoutés afin de dégrader les molécules de transcrits se trouvant à l'extérieur des mitochondries. Après une incubation de 10 minutes à 4°C, 1 mL de tampon STOP (EGTA 5 mM, EDTA 5 mM dans du tampon de lavage) est ajouté et l'ensemble est centrifugé 5 minutes à 9000 g. Le surnageant est éliminé et le culot de mitochondries subit deux autres étapes identiques de lavage. Les ARN sont ensuite extraits et l'analyse des transcrits radioactifs est réalisée sur un gel de polyacrylamide dénaturant pour de petits ARN (75 nucléotides) ou sur gel d'agarose formaldéhyde pour des ARN de plus grande taille (500 à 1000 nucléotides). Le gel est ensuite séché puis exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) ou mis en autoradiographie. Dans tous les cas, une expérience contrôle réalisée en absence de pSu9- DHFR est réalisée. Elle permet de vérifier que la présence de pSu9-DHFR a un effet positif sur le transport d'ARN. Pour valider l'internalisation des ARN dans l'espace matriciel, 100 de mélange RNase peuvent également être ajoutés après obtention de mitoplastes. Dans ce cas, les ARNs protégés de l'action des RNases ont traversé la membrane interne et sont présents dans la matrice mitochondriale. Lors des expériences en présence d'ARN non radiomarqués, l'internalisation des ARN a été évaluée par RT-PCR ou par RT-PCR sur ARN circularisé (cRT-PCR). Lors des expériences en présence d'un ARN marqué par un fluorophore, les mitochondries sont visualisées en microscopie confocale directement après l'étape d'incubation dans le milieu d'importation. 1.1.8. Extraction d'ARN mitochondriaux Un culot de mitochondries de pomme de terre (200 �g équivalent protéines) repris dans 10 �L de tampon de lavage est ajouté à 100 �L de tampon d'extraction d'ARN (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, MgCl2 10 mM, SDS 1% (p/v)) et 100 �L de phénol saturé en eau. Après 15 minutes d'agitation forte au vortex puis centrifugation 10 minutes à 12 000 g, la phase aqueuse est prélevée et mise à précipiter à -20°C pendant une heure dans 2,5 volumes d'éthanol en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10 �L d'eau. 1.1.9. Fractionnement d'ARN sur gel de polyacrylamide Le fractionnement de transcrits d'ARNt radioactifs et/ou d'ARNt mitochondriaux est réalisé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15% en conditions dénaturantes. Le gel (8x12x0,03 cm) a la composition suivante : 15% d'acrylamide/bisacrylamide (19/1), 7M urée, tampon TBE 1 x (Tris 90 mM, EDTA 2,5 mM, acide borique 90 mM). La polymérisation est obtenue par addition de 0,07% (p/v) de persulfate d'ammonium (APS) et de 0,035% (v/v) de TEMED. Avant dépôt, les transcrits d'ARNt sont additionnés d'un volume de tampon de charge (Formamide 95% (v/v), EDTA 20 mM, bleu de bromophénol 0,05% (p/v), xylène cyanol 0,05% (p/v)). Le tampon d'électrophorèse est le TBE 1 x et la migration s'effectue sous un ampérage maximal de 25 mA. Après migration, les acides nucléiques sont visualisés sous UV après incubation 5 minutes dans un bain de bromure d'éthidium à 0,5 Le gel est ensuite incubé 30 minutes dans une solution 10% (v/v) acide acétique, 20% (v/v) éthanol puis séché 1 heure dans un sécheur de gel, avant d'être exposé contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mis en autoradiographie pour visualiser les transcrits radioactifs. 1.1.10. Fractionnement d'ARN sur gel d'agarose formaldéhyde Les ARN de haut poids moléculaires (> 500 nucléotides) sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (p/v), formaldéhyde 18% (v/v), MOPS 1 x (MOPS 20mM, acétate de sodium 2mM, EDTA 1 mM ) dans un tampon de migration MOPS 1x. Les ARN sont d'abord dénaturés 10 minutes à 70°C dans 4 volumes de tampon de charge (MOPS 15 mM, formamide 60% (v/v), formaldéhyde 15% (v/v), glycérol 4% (v/v), xylène de cyanol 0,025% (p/v), bleu de bromophénol 0,025% (p/v)) et 1�L de BET (10 pg/�L) puis refroidis rapidement 5 minutes sur la glace. Après 5 minutes de pré-migration du gel à 70V, les échantillons sont déposés et l'électrophorèse se déroule pendant 3 heures à 50V. Le gel est lavé 3 fois 10 minutes dans de l'eau et 2 fois 30 minutes dans du tampon SSC 20x (NaCl 3M, citrate trisodique 0,3 M, pH 7). Les ARN sont ensuite transférés par capillarité durant la nuit dans du SSC 20x sur une membrane de nylon HybondTM-N+ (Amersham). La membrane est rincée dans du SSC 2x, mise sur du papier Whatmann imbibé de SSC 2x et fixée 5 minutes sous UV. La membrane est rincée dans de l'eau, incubée brièvement dans du bleu de méthylène 0,2% (p/v) û acétate de sodium 0,2 M pH 4,8 puis décolorée dans de l'eau. Cette étape permet de visualiser les ARN et les marqueurs de poids moléculaires non marqués radioactivement. La membrane est ensuite mise à exposer contre une plaque de Phosphorlmager (Fuji) et/ou mise en autoradiographie pour visualiser les transcrits radioactifs. 1.1.11. Réaction de cRT-PCR ("circularised Reverse Transcription coupled 10 with a Polymerisation Chain Reaction') Dans un premier temps 1�g d'ARN mitochondriaux sont circularisés par incubation 3 heures à 37°C en présence de 100 unités de T4 RNA ligase (Fermentas) et de 3,4 �M d'ATP dans du tampon de ligation (50 mM Hepes-NaOH pH 8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT). L'enzyme est inactivée 15 minutes à 65°C puis 15 les ARN sont précipités dans 2,5 volumes d'éthanol 100% en présence de 0,1 volume d'acétate de sodium pH 4,8 1 M. Après centrifugation 20 minutes à 16000 g, le culot est séché à l'air libre et repris dans 10�L d'eau. Une réaction de transcription inverse (RT) est ensuite réalisée afin de synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc) correspondant à la ligation entre les 20 extrémités 5' et 3' de l'ARN analysé. 400 ng d'ARN sont dénaturés pendant 5 minutes à 65°C en présence de 20 pmol d'amorce spécifique de l'ARN recherché. La réaction de transcription inverse a lieu pendant 1 heure à 52°C dans 20 �L d'un milieu réactionnel contenant : 100 nmol de chaque dNTP, 100 nmol de DTT, 4�L de tampon RT 5x (Tris-HCI pH 8,3 250 mM, KCI 375 mM, MgCl2 15 mM), 100 25 unités de SuperScript III RTTM (Invitrogen) et 40 unités d'inhibiteur de RNases (RNaseOUTTM - Invitrogen). L'enzyme est inactivée pendant 15 minutes à 70°C. Un dixième des produits de cette réaction est utilisé comme matrice pour une réaction de PCR. 1.1.12. Observations microscopiques 30 Les observations microscopiques sont réalisées sur un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM 510. Le fluorochrome MitoTrackerTM Orange CM-H2TMRos (Molecular Probes) est utilisé pour contrôler l'intégrité des mitochondries. Il s'agit du 4-chlorométhyltétraméthylrosamine qui est un colorant vital pénétrant spécifiquement dans les mitochondries présentant un potentiel membranaire. Il fluoresce dans le rouge (Xm : 574 nm) lorsqu'il est excité à 551 nm. Ce colorant est ajouté aux mitochondries isolées à une concentration finale de 0,5 pM. L'UTP fluorescent Chromatide� Alexa Fluor� 488 (Molecular Probes) utilisé pour le marquage d'ARN fluoresce dans le vert ( Xm : 561 nm) lorsqu'il est excité à 488 nm. Le traitement des images se fait sur le logiciel LSM 510 version 2.8 (Zeiss). 1.1.13. Technique de gel retard L'interaction ARN-protéine a été étudiée à l'aide de la technique de gel retard. Le protocole utilisé est le protocole n° TB110 de Promega, intitulé � gel shift assay system �. La réaction est faite dans un volume réactionnel de 9 �L comprenant : 0 à 20 pmole de la protéine, 2 �L de tampon gel retard 5x (glycérol 20% (v/v), MgCl2 5 mM, EDTA 2,5 mM, DTT 2,5 mM, NaCl 250 mM, Tris-HCI pH 7,5 50 mM). Le milieu est incubé 10 minutes à température ambiante. Un �L d'ARNt radiomarqué (environ 10 fmoles correspondant à 20 000 cpm) est ensuite ajouté puis l'ensemble est incubé sous une légère agitation à 25°C. Avant migration, le milieu est additionné d'un �L de tampon de charge (Tris-HCI pH 7,5 250 mM, glycérol 40% (v/v)). Le gel est préparé à partir d'une solution d'acrylamide/N,N' méthymène bisacrylamide (19/1) de 4% dans du tampon TBE 0,5x (Tris 45 mM, EDTA pH 8,3 1,25 mM, acide borique 45 mM). La polymérisation du gel est catalysée par l'addition d'APS 0,04% (p/v) et de TEMED 0,04% (v/v). Avant de charger les échantillons, le gel est mis sous tension de 350 V pendant 10 min. La migration s'effectue ensuite pendant 20 min à 350 V dans le tampon TBE 0,5x. Le gel est séché puis exposé contre une plaque de phosphorimager (Fuji) ou mis en autoradiographie. 1.2. Résultats 1.2.1. Interaction entre la protéine DHFR et l'ARN La technique de gel retard a été utilisée pour démontrer que la protéine DHFR recombinante purifiée à l'aide du tag histidine est capable de fixer des acides nucléiques. Le substrat acide nucléique choisi dans ce cas correspond à l'ARNtAIa cytosolique d'Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4). Cet ARN a été obtenu par transcription radioactive in vitro à partir d'un plasmide recombinant (Carneiro et al., Plant Mol Biol, 26, 1843-1853, 1994). Un retard du transcrit d'ARNtAIa en présence de DHFR a été observé (Figure 1A). Les inventeurs ont donc démontré qu'il existe une interaction entre DHFR et des acides nucléiques. Il est à noter qu'il a déjà été démontré que la DHFR cytosolique humaine est capable d'interagir spécifiquement avec un court fragment d'ARN de son propre ARNm (Tai et al., Biochem Biophys Res Comm, 2008). Cependant, il n'était pas connu que la DHFR de souris possède un spectre d'interaction beaucoup plus large, et qu'elle peut interagir avec un quelconque acide nucléique. 1.2.2. La protéine pSu9-DHFR est importée dans des mitochondries isolées de pomme de terre L'importation de la protéine de fusion pSu9-DHFR de 28,6 kDa dans des mitochondries isolées de pomme de terre a été vérifiée. Il a été montré que la protéine pSu9-DHFR est bien importée dans les mitochondries, et que la protéine est protégée de l'action des protéases après importation, et clivée au niveau de la séquence d'adressage pour générer une protéine de taille mature de 22 kDa. 1.2.3. Importation in vitro du transcrit correspondant à l'ARNtAIa dans des mitochondries isolées de pomme de terre Il a été montré que l'importation de I'ARNtAIa dans des mitochondries est fortement augmentée en présence de la protéine de fusion pSu9-DHFR (Figure 1 B). De plus, il a été également démontré que cette méthode permet à I'ARNtAIa d'atteindre l'espace matriciel des mitochondries, comme le démontre le fait que I'ARNtAIa est, après importation et obtention de mitoplastes, protégé contre l'action de ribonucléases. La protéine de fusion pSu9-DHFR peut donc être utilisée pour l'importation d'acides nucléiques dans des mitochondries. La très forte augmentation de l'internalisation de I'ARNtAIa en présence de la protéine pSu9-DHFR dans des mitochondries végétales isolées a été corroborée par les résultats suivants : 1. Des expériences d'importation en présence de quantités croissantes de pSu9-DHFR ont montré que l'efficacité d'importation du transcrit d'ARNtAIa était corrélée à la quantité de pSu9-DHFR présente dans le milieu d'incubation (Figure 2A). 2. Il a été trouvé que la protéine recombinante DHFR seule (c'est à dire sans séquence d'adressage mitochondriale) est incapable d'entraîner I'ARNtAIa à l'intérieur des mitochondries isolées (Figure 2A). 3. Aucun effet n'a été observé sur l'importation du transcrit d'ARNtAIa en présence de la protéine de fusion pSu9-GFP (pour � pSu9-� Green Fluorescent Protein �). La protéine pSu9-GFP a été obtenue de façon identique à la protéine pSu9-DHFR à partir d'un clone recombinant comportant la séquence d'adressage mitochondrial pSu9 en fusion avec la séquence codant la GFP (SEQ ID NO : 5), ceci dans le vecteur pQE40. La protéine pSu9-GFP a alors été surexprimée et purifiée comme ci-dessus mentionnée pour la protéine pSu9-DHFR. Bien que la protéine pSu9-GFP soit correctement internalisée in vitro dans les mitochondries isolées de pomme de terre, cette protéine est incapable d'interagir avec l'ARNtAIa contrairement à la protéine pSu9-DHFR. 4. Il a été montré qu'un analogue de substrat du folate, le méthotrexate, qui est capable de se fixer sur la DHFR (Eilers et Schatz, Nature, 322, 228-232, 1986), inhibe l'importation de l'ARNtAIa dans les mitochondries isolées (Figure 3B). 5. L'importation d'un transcrit d'ARNtAIa marqué avec un fluorophore, l'UTP Chromatide� Alexa Fluor� 488, dans des mitochondries isolées en présence de pSu9-DHFR a été visualisée directement par microscopie confocale. Les résultats obtenus montrent qu'en absence de pSu9-DHFR, pratiquement aucune mitochondrie ne fluoresce alors qu'en présence de la protéine recombinante, la quasi totalité des mitochondries sont fluorescentes, attestant de la présence d'ARNtAIa au niveau des organelles. A ce jour, l'importation in vitro de l'ARNtAIa dans des mitochondries isolées 25 de pommes de terre avait été observée en l'absence de tout facteur cytosolique additionnel, mais ce avec une efficacité très faible (Delage et al., Mol Oeil Biol, 23, 4000-4012, 2003). En présence de la protéine recombinante pSu9-DHFR, cet ARNt est internalisé de manière beaucoup plus efficace dans ces mêmes mitochondries (de 50 à 100 fois, soit de 10 à 20% de l'ARN mis en présence des 30 mitochondries au temps T=0 de l'incubation). 1.2.4. Importation in vitro du transcrit correspondant au précurseur d'ARNtHis mitochondrial de mélèze dans des mitochondries isolées de pomme de terre L'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre d'un transcrit de 250 nt correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze (SEQ ID NO : 6) a été testée. Dans un premier temps, deux transcrits radiomarqués obtenus par transcription in vitro à partir d'un plasmide recombinant ont été utilisé. Ces transcrits correspondent respectivement aux formes éditée et non éditée de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze. En effet, dans les mitochondries végétales, les transcrits mitochondriaux subissent un processus d'édition : un certain nombre de cytidine sont convertis post-transcriptionnellement en uridine (Gagliardi et Binder, Annual Plant Reviews, 31, 51-96, 2007). Il a été montré précédemment par les Inventeurs que l'ARNtHis mitochondrial de mélèze possède trois sites d'édition (Maréchal-Drouard et al., Nucleic Acids Res, 24, 3229-3234, 1996). L'internalisation d'un précurseur d'ARNt dans la mitochondrie doit conduire à sa prise en charge par la machinerie moléculaire mitochondriale et à son clivage en 5' et en 3' par les RNases P et Z respectivement. Les inventeurs ont précédemment montré que seule la forme éditée de l'ARNtHis était maturée in vitro. De plus, in vivo, la forme non éditée et non maturable est rapidement dégradée dans les mitochondries (Placido et al., J Biol Chem, 280, 33573-33579, 2005). Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 3B. Après incubation, un ARN migrant à la taille de l'ARN correspondant à la forme mature de l'ARNtHis est retrouvé dans les mitochondries incubées en présence de pSu9-DHFR, et ce uniquement lorsque la forme éditée du précurseur est utilisée. Dans un second temps, le transcrit non radiomarqué correspondant à la forme précurseur éditée de l'ARNtHis a été utilisé pour une expérience d'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre et en présence de pSu9-DHFR. Après incubation, les ARN totaux ont été extraits des mitochondries et la maturation de l'ARNtHis a été analysée par la technique de cRT-PCR. Pour se faire, l'amorce complémentaire, appelée P1 (SEQ ID NO : 7) a été utilisée pour l'étape de réverse transcription et l'étape de PCR a été réalisée avec cette même amorce complémentaire et l'amorce directe, appelée P2 (SEQ ID NO : 8). La localisation schématique de ces amorces est présentée sur la Figure 3A. Le produit d'amplification a été cloné dans le vecteur pGem-T Easy vector (Promega) et la séquence ADN des clones en résultant a été réalisée à l'aide d'un appareil Applied Biosystems 3100 (Perkin Elmer). Quinze clones différents ont été analysés. La séquence des extrémités 5' et 3' de 15 clones est présentée sur la Figure 3C. Ces séquences montrent que toutes les molécules analysées, sauf une, sont maturées à leur extrémité 5'. Pour cinq d'entre elles, l'extrémité 3' est également maturée : l'extrémité CCA terminale a été ajoutée post-transcritionnellement par la tRNA-nucleotidyl transferase localisée dans la matrice mitochondriale. Ceci démontre que l'ARNtHis a bien été adressé à la mitochondrie, puisque l'ARNtHis a subi un processus de maturation présent uniquement au sein des mitochondries. A ce jour, seuls des ARNt ou l'ARN 5S avaient été importés dans des mitochondries isolées de divers organismes (Salinas et al., Trends Biochem Sci, 33, 320-329, 2008). Les présents résultats démontrent que des acides nucléiques de plus grande taille peuvent être importés dans des mitochondries grâce à la présente invention. Au vu de ces résultats, la protéine de fusion pSu9-DHFR peut être utilisée pour internaliser dans l'espace matricielle mitochondrial, de façon aspécifique et à souhait, des ARN de grande taille. 1.2.5. Importation in vitro dans des mitochondries isolées de pomme de terre du transcrit correspondant à la forme mitochondriale non éditée de l'ARNm atp9 de pomme de terre L'importation dans des mitochondries isolées de pomme de terre a ensuite été réalisée pour les deux transcrits suivants : un transcrit de 775 nt (trnH-atp9) correspondant à la forme précurseur de l'ARNt(His) mitochondrial de mélèze fusionné à la version non éditée d'atp9 mitochondrial de pomme de terre (SEQ ID NO : 9) et un transcrit de 651 nt (atp9) correspondant à la version non éditée d'atp9 mitochondrial de pomme de terre seule (SEQ ID NO : 10). La construction chimérique permettant l'obtention du transcrit trnH-atp9 a été obtenue par mutagenèse par PCR à partir du plasmide contenant la séquence codant le transcrit précurseur édité de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze et celui contenant la séquence codant la version non éditée du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre. Les oligonucléotides nécessaires à la mutagenèse par PCR sont présentés en tant que SEQ I D Nos. 11, 12, 13 et 14. Les transcrits ARN correspondant à ces deux constructions ont été synthétisées in vitro en présence ou non d'UTP radioactif. Ces transcrits ont alors été utilisés dans des essais d'importation in vitro dans des mitochondries isolées de pomme de terre. Il a été montré que lorsque la protéine pSu9-DHFR est ajoutée au milieu d'importation, un signal radioactif beaucoup plus intense est visible après incubation, tant lorsque les ARN ont été extraits de mitochondries que de mitoplastes. L'estimation de chacun des signaux radioactifs par rapport à la quantification des ARN colorés au bromure d'éthidium et à l'activité spécifique du transcrit a permis d'estimer à environ 3% la quantité de transcrits importés dans les mitochondries. Aucune différence significative entre l'échantillon � mitochondries � et l'échantillon � mitoplastes � n'a été observée, suggérant que ces ARNs ont atteint l'espace matriciel. Afin de conforter les données obtenues ci-dessus, des expériences similaires ont été réalisées avec des transcrits non radioactifs. Des expériences de RT-PCR ont ensuite permis d'analyser leur internalisation dans les mitochondries isolées. Les deux amorces utilisées pour l'analyse en RT-PCR ont les séquences SEQ ID Nos. 15 et 16. Celles-ci permettent la discrimination des ARN exogènes des ARN endogènes d'atp9. Des produits d'amplification de la taille attendue ont été obtenus uniquement lors des expériences de RT-PCR menées en présence de réverse transcriptase et à partir des ARN extraits des mitochondries incubés avec chacun des transcrits en présence de pSu9-DHFR. Le clonage de ces fragments dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega) suivi de leur séquençage ont permis de vérifier que les produits de RT-PCR obtenus correspondaient effectivement aux séquences des transcrits exogènes. Enfin, l'analyse de la séquence de ces clones a permis de démontrer que certains des sites � éditables � étaient effectivement édités après internalisation de l'ARN dans les mitochondries isolées. L'ARNm du gène atp9 mitochondrial de pomme de terre possède neuf sites d'édition (Dell'Orto et al., Plant Science, 88, 45-53, 1993). Parmi les séquences analysées, 6,6 % des clones possèdent deux des neuf sites édités : CTATCGGTATTGGAAACGT CTATCGGTATTGGAAACGT TTAGTTCCTCGATTCATT (séquence des clones après import) ; TTAGTTCCTCGATTCATT (séquence non éditée). Les séquences ci-dessus représentent les nucléotides 271 à 309 de la séquence SEQ ID NO : 10. Les boites indiquent les sites d'édition édités, et les nucléotides soulignés indiquent les sites d'édition non édités. De plus, parmi les séquences analysées, 23,3% des clones possèdent deux autres des neuf sites édités : GTTTGCCC~TAATGATGGCCTTTTTGATCTCAT (séquence des clones après import) ; GTTTGCCC~CAATGATGGCCTTTTTGATCTCAT (séquence non éditée). Les séquences ci-dessus représentent les nucléotides 388 à 423 de la séquence SEQ ID NO : 10. Les boites indiquent les sites d'édition édités, et les nucléotides soulignés indiquent les sites d'édition non édités. Ceci démontre l'ARN exogène introduit peut atteindre les enzymes impliquées dans le processus d'édition au niveau matriciel des mitochondries. Par ailleurs, ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus in vitro démontrant que les sites d'édition ne sont pas tous édités avec la même efficacité (Takenaka et aL, Mitochondrion, 8, 35-46, 2008). L'ensemble des résultats ci-dessus montre que le système de navette protéique pSu9-DHFR : permet l'internalisation dans des mitochondries non pas uniquement d'ARNt (75 nt) mais aussi de molécules d'ARN de taille très largement supérieure (775 nt) ; permet l'internalisation d'ARN de façon indépendante d'une structure ARNt ; permet l'internalisation de ces ARN au niveau de la matrice des mitochondries ; et permet l'adressage dans les mitochondries d'ARNm, lesquels sont ensuite reconnus par les machineries mitochondriales intervenant dans l'expression génique. EXEMPLE 2: ADRESSAGE IN VITRO DE L'ARNtAIa DE PLANTES 30 DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE LEVURE VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9-DHFR Comme il va être montré dans l'exemple 2, le système navette basé sur l'utilisation de la protéine de fusion pSu9-DHFR en modèle végétal est CAT 0 CAT généralisable à toute mitochondrie issue de n'importe quel organisme. En effet, la présente invention est pour partie basée sur la reconnaissance de la protéine pSu9-DHFR par le complexe d'importation TOM/TIM mitochondrial des protéines. Ce complexe existant dans tous les systèmes mitochondriaux étudiés à ce jour, le système navette selon l'invention est généralisable à tout organisme. 2.1. Matériel et Méthodes 2.1.1. Purification de mitochondries de levure Saccharomyces cerevisae Le protocole utilisé est celui décrit par Daum et al. (J Biol Chem, 257, 13075-13080, 1982). 2.1.2. Importation d'ARN dans des mitochondries isolées de levure Concernant les expériences d'importation d'ARN dans des mitochondries de levure, le protocole est le même que celui ci-dessus décrit pour les mitochondries de pomme de terre à la différence du tampon d'importation qui est inspiré du protocole d'importation spécifique de l'ARNtLys (Tarassov et al., J Mol Biol, 245, 315-323, 1995). Le milieu réactionnel de 100 �L contient 50 �L de tampon import 2x levure (Sorbitol 1,2 mM, Hepes-KOH 40 mM pH 7,4, DTT 2 mM), 4 U Créatine phosphokinase, 0,5 pmol de phosphocréatine, 2 mM MgCl2, 1 mM d'ATP, 200 �g de mitochondries (équivalent protéines), 50 fmoles de transcrit marqué au [a32P]UTP (100 000 cpm) et 1 gg de pSu9-DHFR. Le mélange RNase et le tampon STOP sont réalisés avec du tampon 1 xBB. Dans tous les cas, une expérience contrôle réalisée en absence de pSu9-DHFR est réalisée. Elle permet de vérifier que la présence de pSu9-DHFR a un effet positif sur le transport d'ARN. Pour valider l'internalisation des ARN dans l'espace matriciel, 100 �L de mélange RNase peuvent également être ajoutés après obtention de mitoplastes. Dans ce cas, les ARNs protégés de l'action des RNases ont traversé la membrane interne et sont présents dans la matrice mitochondriale. 2.1.3. Obtention de mitoplastes Pour la levure, les mitochondries sont maintenues 15 minutes dans du 30 tampon K1 K2 (KH2PO4 0,2M, K2HPO4 0,8M, pH 7,5) avant d'ajouter un volume de tampon 2x levure (Sorbitol 1,2 M, Hepes-KOH 40 mM pH 7,4). 2.2. Résultats Le transcrit correspondant à l'ARNtAIa cytosolique de plantes (SEQ ID NO : 4) a été testé pour son internalisation dans des mitochondries de levure en présence ou non de la protéine recombinante pSu9-DHFR. Il a été démontré qu'en présence de la protéine pSu9-DHFR, l'ARNtAIa cytosolique de plante, qui n'est pas normalement adressé aux mitochondries de levure, est très efficacement internalisé dans les mitochondries isolées de la levure S. cerevisiae. Cette internalisation se fait au niveau matriciel puisque le transcrit a été retrouvé en proportion équivalente dans les mitoplastes. EXEMPLE 3 : ADRESSAGE IN VITRO D'UN OLIGONUCLEOTIDE DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES DE POMME DE TERRE OU DE LEVURE VIA LA NAVETTE PROTEIQUE PSU9-DHFR Les exemples ci-dessus démontrent que le système navette selon l'invention permet d'internaliser des ARN allogènes. Il va être démontré ci-dessous que ce système navette peut être utilisé pour internaliser efficacement tout type d'acide nucléique, notamment de l'ADN. En premier lieu, l'interaction entre un fragment d'ADN simple brin correspondant à un oligonucléotide de 75 nt de long et la protéine recombinante pSu9-DHFR a été validée. En second, l'internalisation de cet oligonucléotide dans des mitochondries isolées de pomme de terre ou de levure a été testée. 3.1. Matériel et Méthodes 3.1.1. Technique de Southwestern Cette technique permet l'identification de protéines interagissant avec un oligonucléotide radiomarqué. Les protéines fixées sur la membrane Immobilon-P (Millipore) sont renaturées la nuit à 4°C dans du tampon de renaturation (Tris-HCI pH 7,5 100mM, NP 40 0,1% (v/v)). Le NP-40, détergent ionique, permet une meilleure élimination du SDS. Après 4 lavages, de 15 min de la membrane dans le même tampon à 4°C sous agitation douce, la membrane est saturée 5 min à température ambiante dans du tampon de blocage (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM, BSA 5% (p/v), Triton X-100 0,01% (v/v). Le filtre est alors mis en présence 106 cpm de l'oligonucléotide radiomarqué (en présence de polynucléotide kinase et de [y-32P]ATP) dans 5 mL de tampon d'hybridation (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM, Triton X-100 0,01% (v/v) et incubé une nuit à 4°C. Après 4 lavages de 5 min à 4°C avec le tampon de lavage (Tris-HCI pH 7,5 10 mM, acétate de magnésium 5mM, DTT 2 mM), la membrane est séchée puis mise en autoradiographie et/ou exposée contre une plaque de phosphorimager pour visualiser l'interaction. 3.1.2. Importation d'oligonucléotide radiomarqué dans des mitochondries isolées Le marquage en 5' d'oligonucléotide en présence de [y32P]ATP et de polynucléotide kinase se fait classiquement selon les recommandations du fournisseur (Fermentas). Les expériences d'importation d'oligonucléotide radiomarqué dans des mitochondries isolées ont été menées selon les mêmes protocoles que pour l'importation d'ARN dans des mitochondries de pomme de terre ou de levure (voir pages ci-dessus) à une exception près : l'internalisation d'ADN dans l'organelle a été validée par l'ajout de 100 �L de mélange DNase (25 pg de DNase I, MgCl2 10 mM dans du tampon de lavage pour les mitochondries de pomme de terre et dans du tampon 1xBB pour les mitochondries de levure) après obtention de mitochondries ou de mitoplastes. 3.2. Résultats 3.2.1. Interaction entre la protéine DHFR et l'ADN La technique de Southwestern a été utilisée pour démontrer que la protéine DHFR recombinante purifiée à l'aide du tag histidine est capable de fixer non pas uniquement de l'ARN mais également de l'ADN. Le substrat ADN choisi dans ce cas correspond à un oligonucléotide (ADN simple brin) correspondant à la séquence de l'ARNtAIa cytosolique d'A. thaliana (SEQ ID NO : 4). Cet oligonucléotide synthétisé chimiquement (Sigma Aldrich) et marqué en 5' a été incubé avec une membrane sur laquelle les protéines recombinantes DHFR et GFP ont été transférées. Aucune interaction entre la GFP et l'olligonucléotide n'a été observée, alors qu'un signal reflétant une interaction entre la DHFR et l'oligonucléotide a été obtenu. 3.2.2. Internalisation in vitro d'oligonucléotides dans des mitochondries isolées de pomme de terre ou de levure L'interaction entre DHFR et oligonucléotide étant possible, ce dernier a été utilisé dans des expériences d'importation in vitro. Les résultats obtenus pour les essais réalisés avec des mitochondries isolées de pomme de terre et de levure sont illustrés sur les Figures 4A et 4B respectivement. Si l'oligonucléotide est incubé avec les mitochondries en absence de pSu9-DHFR, aucun signal n'est visible après autoradiographie. En revanche, l'ajout de la protéine pSu9-DHFR dans le milieu d'importation facilite le passage de l'oligonucléotide à travers la double membrane mitochondriale, et un signal est révélé tant à partir des fractions d'acides nucléiques extraites tant des mitochondries que des mitoplastes repurifiés. Dans ce système, la fraction d'oligonucléotide ayant atteint l'espace matriciel a été estimée à environ 1%. Ceci démontre que ce nouvel outil de navette protéique est pleinement utilisable pour transporter de l'ADN dans des mitochondries isolées. EXEMPLE 4 : ADRESSAGE SPECIFIQUE D'UN ARN EN FUSION AVEC LA SEQUENCE TIGE BOUCLE DU PHAGE MS2 DANS DES MITOCHONDRIES ISOLEES VIA LA NAVETTE PROTEIQUE CONSTITUEE PAR LA PROTEINE DE COQUE DU PHAGE MS2 FUSIONNEE A LA SEQUENCE D'ADRESSAGE MITOCHONDRIALE PSU9 Le système navette selon l'invention peut être étendu à des systèmes génétiques stables pour l'introduction spécifique et contrôlable d'un acide nucléique donné dans les mitochondries. Le développement d'un système d'adressage à souhait d'un ARN spécifique est basé sur l'utilisation d'une protéine capable de reconnaître et de s'associer à une séquence ARN spécifique. Dans le présent exemple, cette protéine correspond à la protéine de coque du phage MS2 (également appelée CP), laquelle est connue pour reconnaître et s'associer à une séquence-spécifique d'ARN adoptant une structure secondaire en tige-boucle particulière (Beach et al., Curr Biol, 9, 569-578, 1999 ; Querido et al., Methods in Cell Biol, 85, 273-292, 2008). Alors que le système de navette pSu9-DHFR permet l'importation de n'importe quel ARN, le système de navette pSu9-CP permet l'importation ciblée et spécifique d'un ARN uniquement associé à l'ARN en tige boucle du phage MS2. 4.1. Construction de la protéine pSu9-CP Plusieurs constructions ont été réalisées par mutagenèse par PCR. La séquence codant la forme précurseur de l'ARNtHis mitochondrial de mélèze a été fusionnée du côté 3' à la séquence codant la partie en tige-boucle de l'ARN MS2 (SEQ ID NO : 17). Cette séquence en tige boucle est présente 2 fois. Les amorces utilisées pour générer cette construction par mutagenèse par PCR correspondent aux séquences SEQ ID Nos. 20, 21, 22 et 23. La séquence correspondant à la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 a été fusionnée à la protéine CP (SEQ ID NO : 18). Cette construction a été clonée dans le vecteur d'expression bactérien pQE40 et permet l'obtention de la protéine pSu9-CP. Les amorces utilisées pour générer cette construction par mutagenèse par PCR correspondent aux séquences SEQ ID Nos. 24, 25, 26 et 27. 4.2. Obtention des deux partenaires et validation de l'interaction Les ARN substrats sont obtenus par transcription in vitro. La protéine pSu9-CP est purifiée à l'aide du tag histidine présent à l'extrémité C-terminale de la protéine de fusion, selon un modèle analogue à celui développé pour la protéine recombinante pSu9-DHFR. L'interaction entre les deux partenaires est validée par les approches de gel retard ou de northwestern. L'ARN précurseur de l'ARNtHis non fusionnée à la partie ARN en tige boucle de MS2 servira de contrôle négatif. 4.3. Essai d'importation in vitro dans des mitochondries isolées La démarche suivie est la même que celle décrite dans les exemples 1 à 3. Dans le cas du système navette basé sur l'utilisation de la protéine pSu9-CP, la spécificité est évaluée par la non-importation d'ARN ne présentant la structure en tige-boucle du phage MS2. Tout ARN fusionné à la séquence en tige-boucle peut être reconnu par la protéine de fusion pSu9-CP et donc être importé dans l'organelle. REVENDICATIONS1. Utilisation in vitro d'une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt, ou d'un acide nucléique codant ladite protéine de fusion, pour l'importation dudit acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie. 2. Utilisation selon la revendication 1, où : ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine DHFR ; ladite séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 2 ; et ladite protéine DHFR est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 1. 3. Utilisation selon la revendication 1, où : ladite protéine de fusion comprend ou consiste en la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 fusionnée à la protéine de coque du phage MS2 ; ladite séquence d'adressage mitochondriale pSu9 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 2 ; et ladite protéine de coque du phage MS2 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18. 4. Kit pour importer un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie comprenant : a) une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique d'intérêt, ou un acide nucléique codant ladite protéine de fusion ;b) au moins un réactif pour l'importation de l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie ; et, optionnellement, c) des instructions pour importer l'acide nucléique d'intérêt dans la mitochondrie. 5. Protéine de fusion comprenant ou consistant en une séquence d'adressage mitochondriale fusionnée à la protéine de coque du phage MS2, où ladite protéine de coque du phage MS2 est codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique aux nucléotides 208 à 564 de la séquence SEQ ID NO : 18. 6. Protéine de fusion selon la revendication 5, où ladite séquence d'adressage mitochondriale est la séquence d'adressage mitochondriale pSu9 codée par une séquence nucléotidique au moins 80% identique à la séquence SEQ ID NO : 2. 7. Acide nucléique codant la protéine de fusion selon la revendication 5 ou 6. 8. Vecteur recombinant contenant une protéine de fusion telle que définie à la revendication 5 ou 6. 9. Vecteur recombinant comprenant : a) un acide nucléique codant une protéine de fusion entre une séquence d'adressage mitochondriale et une protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à l'acide nucléique lié par ladite protéine liant un acide nucléique de manière séquence-spécifique. 10. Vecteur recombinant selon la revendication 9 comprenant : a) un acide nucléique selon la revendication 7; et b) un acide nucléique d'intérêt fusionné à au moins une copie de la région en tige-boucle de l'ARN MS2. 11. Composition pharmaceutique comprenant une protéine de fusion telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 3, et/ou un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 12. Procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie isolée, comprenant les étapes de : a) mettre en contact une protéine de fusion telle que définie dans l'une des revendications 1 à 3 avec l'acide nucléique d'intérêt et une mitochondrie isolée ; et b) laisser en contact de sorte à ce que l'acide nucléique d'intérêt soit importé dans la mitochondrie isolée. 13. Procédé d'importation in vitro d'un acide nucléique d'intérêt dans une mitochondrie d'une cellule, comprenant les étapes de : a) obtenir ou préparer un vecteur recombinant selon la revendication 9 ou 10; et b) introduire ladite combinaison d'acides nucléiques dans une cellule. 14. Procédé d'obtention d'une plante recombinante caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) obtenir ou préparer un vecteur recombinant selon la revendication 9 ou 10; b) introduire ledit vecteur recombinant dans une cellule de plante ; c) régénérer une plante entière à partir de la cellule de plante recombinante obtenue à l'étape (b) ; et d) sélectionner les plantes ayant intégré dans leur génome lesdits acides nucléiques. 15. Plante recombinante susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 14. 16. Semence ou fruit d'une plante recombinante selon la revendication 15.