Brevet FR2936528A1 — publié le 20100402

Nouvelle méthode de mesure non-radioactive de la synthèse protéique et marquage des protéines dans les cellules vivantes La présente invention concerne un procédé de mesure non radioactif du niveau de synthèse protéique dans une cellule vivante. La plupart des activités biologiques sont effectuées par les protéines, dont la synthèse est donc un élément clé des fonctions cellulaires. De plus, l'activité de traduction de l'ARN messager (ARNm) en protéines est directement liée à l'état physiopathologique des cellules et des tissus (Sonenberg et Hinnebusch (2007) Mol. Gel/. 28:721). La synthèse protéique est contrôlée par de multiples récepteurs de surface et cascades de transduction du signal qui permettent de coordonner la prolifération et la survie cellulaire (Sabatini (2006) Nat. Rev. Cancer 6:729). Le contrôle de la traduction est donc devenu un axe important dans la recherche biologique et de nouvelles stratégies de suivi de la synthèse protéique ont été développées au cours des dernières années. En particulier, les techniques d'incorporation d'acides aminés radioactifs sont à la base des connaissances actuelles sur la traduction (Borsook et al. (1949) Fed. Proc. 8:589; Borsook et al. (1949) J. Biol. Chem 179:689). Néanmoins, ces techniques présentent un certain nombre d'inconvénients importants, liés notamment aux problèmes de radioprotection. C'est pourquoi d'autres techniques qui pourraient se substituer à l'utilisation de radioéléments ont été recherchées. Il a ainsi été proposé de transformer les cellules avec des rapporteurs fluorescents ou de charger enzymatiquement des acides aminés non naturels sur l'ARNt (Noren et al. (1989) Science 244:182). Cependant, ces méthodes ne se sont jamais révélées aussi efficaces que les techniques de radiomarquage. En conséquence, il existe toujours une demande importante de nouvelles méthodes de mesure du niveau de synthèse protéique qui ne font pas intervenir la radioactivité. La puromycine est un antibiotique amnionucléosidique naturel produit par Streptomyces alboniger. Il s'agit d'un analogue structural des ARNt aminoacylés, qui est attaché à la chaîne peptidique en croissance pendant la traduction, empêchant ainsi la poursuite de l'élongation (Nathans (1964) Fed Proc. 23:984). La liaison ester normale de l'ARNt est remplacée dans la puromycine par une liaison amide, qui rend le composé plus résistant à l'hydrolyse, favorisant ainsi le décrochage du ribosome et une libération prématurée de la chaîne protéique en croissance (Nathans (1964) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 51:585). De manière intéressante, si la puromycine est utilisée dans de faibles quantités, son incorporation dans les protéines néo synthétisées reflète directement le taux de traduction de l'ARNm dans les cellules vivantes. L'incorporation et la détection de puromycine ont été utilisées initialement pour suivre les cinétiques de repliement des chaînes peptidiques en croissance in vitro (Hansen et al. (1994) J. Bio/. Chem. 269:26610). Il a également été démontré que différents dérivés de la puromycine de la forme X-dC-puromycine étaient fonctionnels dans des expériences de traduction in vitro (Starck et Roberts (2002) RNA 8:890; Doi et al. (2002) Genome Res. 12:487; Kawahashi et al. (2003) Proteomics 3:1236). Ainsi plusieurs essais de fabrication d'une version de puromycine conjugué à un fluorophore ont permis de marquer des protéines synthétisées in vitro (Nemoto et al. (1999) FEBS Lett. 462:43; Starck et al. (2004) Chem. Biol. 11:999). Néanmoins, aucune de ces études n'a démontré que ces techniques pouvaient être appliquées in vivo et ainsi être utilisée pour suivre la synthèse protéique d'une cellule. Ainsi, il a été proposé dans la demande de brevet américain US 2006/0057069 d'utiliser des conjugués de puromycine marquée pour détecter la synthèse protéique in vivo. Cependant, l'utilisation de tels composés de puromycine modifiée est généralement associée à des problèmes de perméabilité membranaire qui affectent l'efficacité de ces techniques dans le suivi de la synthèse protéique dans les cellules vivantes (Starck et al. (2004) Chem. Bio/. 11:999). Description de l'invention Les inventeurs ont maintenant démontré que des anticorps monoclonaux dirigés contre la puromycine pouvaient faciliter sa détection et permettaient de suivre directement l'incorporation de la puromycine dans les protéines nouvellement synthétisées sans aucune modification chimique de la puromycine. Ainsi, la puromycine non modifiée franchit efficacement la membrane cellulaire et des stratégies de pulse-chasse, qui tirent partie de la clairance rapide de la puromycine libre résiduelle peuvent être mises en oeuvre pour marquer des protéines nouvellement synthétisées. La présente invention concerne donc un procédé de mesure du niveau ou de détection de la synthèse protéique dans une cellule comprenant les étapes consistant à : a1) mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci, b1) détecter ou mesurer la quantité d'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé incorporé dans des fragments protéiques de la cellule, dans lequel le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé dans les fragments protéiques est indicatif du niveau ou de la présence de synthèse protéique dans la cellule. Par "synthèse protéique" ou "synthèse de protéines", on entend ici le processus par lequel une cellule assemble une chaîne protéique par liaison d'acides aminés, la séquence de la chaîne protéique étant fonction de la séquence d'ADN du gène codant ladite protéine. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la synthèse protéique comprend au moins deux étapes : d'une part la transcription de l'ADN en ARNm et d'autre part la traduction de l'ARNm en protéine. De manière préférée, la détection de la synthèse protéique selon l'invention correspond plus particulièrement à la détection de l'étape de traduction. Par "fragment protéique", on entend ici une chaîne d'acides aminés issue de la traduction complète ou partielle d'un ARNm. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la synthèse protéique détectée dans une cellule reflète le métabolisme de cette cellule. En particulier, la détection de synthèse protéique dans une cellule signifie que ladite cellule est vivante. Par conséquent, le procédé de détection de la synthèse protéique tel que défini ci-dessus permet de détecter la présence d'une cellule vivante dans un milieu donné. Les cellules selon l'invention peuvent être des cellules procaryotes, en particulier des bactéries Gram positives ou Gram négatives, ou des cellules eucaryotes. Des exemples de cellules eucaryotes selon l'invention comprennent les champignons unicellulaires, les levures, les protozoaires, les cellules issues de métazoaires et de plantes. Les cellules selon l'invention peuvent être des cellules cultivées in vitro ou des cellules présentes dans un tissu, un organe ou un organisme. Par "milieu", on entend ici un support, de préférence un fluide, dans lequel des cellules peuvent vivre. Le milieu selon l'invention peut être un milieu biologique tel que par exemple le sang, l'urine, la lymphe, un milieu de culture synthétique ou naturel permettant la survie d'organismes vivants. Des exemples de milieu comprennent également l'eau de ville, l'eau minérale ou de source, les eaux usées. Par "antibiotique aminonucléosidique", on entend ici un antibiotique affectant la synthèse protéique et qui agit en entrant en compétition avec les aminoacyl-ARNt lors de leur liaison au site A de la grande sous-unité ribosomique. Des exemples d'antibiotiques aminonucléosidiques appropriés comprennent la puromycine et ses analogues synthétiques, tels que le 6-DMAP, la puromycine N6-bis-déméthylée, et la puromycine Nord methanocarba. De manière préférée, l'antibiotique aminonucléosidique utilisé selon l'invention est la puromycine. Par "dérivé d'antibiotique aminonucléosidique", on entend un antibiotique aminonucléosidique tel que défini ci-dessus modifié par voie chimique ou enzymatique, comprenant éventuellement des groupements marqueurs, mais qui conserve les propriétés de l'antibiotique aminonucléosidique naturel sur la synthèse protéique. De manière préférée, le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique utilisé selon l'invention n'est pas un antibiotique aminonucléosidique conjugué à un fluorophore. Comme il est bien connu de l'homme du métier, on entend ici par "mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique", le fait d'incuber la cellule dans un milieu approprié avec un antibiotique aminonucléosidique tel que défini ci-dessus à une concentration suffisante et pendant une période suffisante pour que l'anticorps aminonucléosidique puisse être incorporé dans les fragments protéiques en cours de synthèse dans la cellule. De manière préférée, l'antibiotique aminonucléosidique est utilisé à une concentration comprise entre environ 0,1 pg/ml et environ 50 pg/ml, mieux encore à une concentration comprise entre environ 0,5 pg/ml et environ 25 pg/ml, mieux encore à une concentration comprise entre environ 1 pg/ml et environ 15 pg/ml, de manière préférée entre toutes à une concentration d'environ 10 pg/ml. De manière préférée, la cellule est mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique pendant une période adaptée permettant l'obtention d'un signal dont le niveau est significativement plus élevé que celui du bruit de fond. De manière particulièrement préférée, la cellule est mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique pendant une période comprise entre 15 secondes et 3 h, mieux encore pendant une période comprise entre 1 min et 1 h, mieux encore pendant une période comprise entre 5 min et 30 min, de manière préférée entre toutes pendant une période d'environ 10 min. Dans un mode de réalisation préféré, l'étape b1) de détection du niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, du procédé défini ci-dessus est réalisée à l'aide d'un composé ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé. Des composés appropriés ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé incluent en particulier les anticorps et les aptamères. Les "aptamères" sont des séquences d'oligonucléotides ou peptidiques ayant la capacité de reconnaître virtuellement n'importe quelle classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. Les modes d'obtention, modifications, applications et avantages de ces molécules sont décrits par exemple dans Jayasena (1999) Clin. Chem. 45:1628-1650. Préférablement, le composé ayant une affinité spécifique pour l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, utilisé selon l'invention est un anticorps. Comme on l'entend ici le terme � anticorps � se réfère à des molécules d'immunoglobuline et des portions immunologiquement actives des molécules d'immunoglobuline, c'est-à-dire des molécules qui contiennent un site de liaison de l'antigène qui se lie spécifiquement à un antigène. Le terme "anticorps" ne comprend donc pas seulement les molécules d'anticorps entières mais aussi les fragments d'anticorps ainsi que les variants (y compris les dérivés) d'anticorps et de fragments d'anticorps. Un anticorps selon l'invention peut être un anticorps de mammifère, en particulier un anticorps de camélidé. Un anticorps selon l'invention peut être un anticorps polyclonal ou monoclonal. Les "fragments d'anticorps" comprennent une portion d'un anticorps intact, de préférence la région variable ou de liaison à l'antigène de l'anticorps intact. Des exemples de fragment d'anticorps approprié comprennent les fragments Fv, Fab, Fab', (Fab')2, Fd, dAb, scFV, dsFV, sc(Fv)2, et les diabodies. De manière préférée, l'anticorps selon l'invention est un anticorps monoclonal. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps modifié. En particulier, l'anticorps selon l'invention peut être conjugué à un groupement marqueur. Le groupement marqueur peut être par exemple une substance marqueur non radioactive telle qu'un fluorophore, une enzyme telle que la phosphatase alcaline, la peroxidase de raifort ou la luciferase, une coenzyme telle que la biotine, des protéines, des peptides, des sucres, des lipides, des colorants, du polyethylène glycol, et analogues. De manière préférée, l'anticorps utilisé dans la présente invention est un anticorps conjugué à un fluorophore. Le terme � spécifique �, quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison d'un ligand à une cible, signifie que le ligand interagit avec la cible sans interaction substantielle avec une autre cible ne présentant pas de ressemblance structurale avec la cible. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, est spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, libre non incorporé dans les fragments protéiques. L'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus peut être mise en oeuvre par toute technique appropriée d'immunodétection permettant de révéler la liaison d'un anticorps. Ces techniques de détection sont bien connues de l'homme du métier incluant les techniques d'immunofluorescence, de chimioluminescence, colorimétriques, de radiomarquage, d'immunochimie, d'immunopurification et d'immunoprécipitation. L'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus peut être en particulier mise en oeuvre sur des cellules vivantes, des lysats cellulaires ou un milieu conditionné par les cellules étudiées (par exemple, un surnageant de culture). Selon un mode de réalisation particulier, le procédé défini ci-dessus comprend en outre une étape a2) de lyse des cellules après l'étape a1) de mise en contact et avant l'étape de détection b1). Cette étape a2) de lyse des cellules comprend typiquement la mise en contact des cellules étudiées avec du tampon de lyse (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, inhibiteurs de protéases) pendant 10 min sur glace. Les cellules peuvent également être reprises directement en tampon Laemmli (65 mM Tris-HCI pH 6,8, 3% SDS, 10% glycérol, 100 mM DTT, 0,004% bleu de bromophénol). De manière préférée, l'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus est alors mise en oeuvre par immunoempreinte. Les procédés d'immunoempreinte ou Western Blot sont bien connus de l'homme du métier et comprennent typiquement les étapes consistant à faire migrer les extraits cellulaires sur un gel de polyacrylamide dénaturant, transférer les protéines ainsi séparées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, saturer la membrane avec une solution de TBS 0,1% Tween 20 contenant du lait en poudre écrémé, incuber la membrane avec un anticorps primaire puis avec un anticorps secondaire, révéler la membrane avec un système de révélation approprié dépendant du type d'anticorps secondaire utilisé, tel que la chimioluminescence ou la colorimétrie. Selon un autre mode de réalisation préféré, l'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus est effectuée sur une cellule vivante. De manière préférée, l'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus est alors mise en oeuvre par cytométrie de flux ou par microscopie, en particulier par microscopie confocale à fluorescence. De manière encore préférée, l'étape de détection b1) du procédé défini ci-dessus consiste à détecter, par cytométrie en flux, l'antibiotique aminonucléosidique ou le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique à la surface des cellules. Cette technique est appelée ici technique SUnSET. Typiquement, la technique SUnSET est mise en oeuvre de la manière suivante. L'antibiotique aminonucléosidique ou le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique est mis en contact à une concentration appropriée pendant une période appropriée, de préférence environ 10 min, avec les cellules ou tissus vivants. Après un lavage et une période de chasse appropriée, de préférence de 50 min, les cellules traitées sont incubées avec un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique ou du dérivé d'antibiotique aminonucléosidique, marqué directement ou non avec un fluorophore idoine. La détection de cet anticorps est ensuite effectuée sur les cellules, vivantes ou fixées, par cytométrie en flux selon des protocoles standards bien connus de l'homme du métier. De manière préférée entre toutes, le procédé selon l'invention défini ci-dessus n'est pas radioactif. La présente invention concerne également un procédé de criblage de nouveaux composés pharmacologiques susceptibles d'affecter le métabolisme ou de tuer des cellules comprenant les étapes consistant à: a) mettre en contact les cellules avec le composé pharmacologique à tester, b) mettre en contact les cellules, préalablement traitées ou non avec le composé pharmacologique à tester, avec un antibiotique aminonucléosidique, ou un dérivé de celui-ci, tel que défini ci-dessus, c) détecter le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans des fragments protéiques dans les cellules traitées ou non avec le composé pharmacologique à tester, à l'aide d'un anticorps spécifiquement dirigé contre l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, d) comparer le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans les cellules traitées avec le composé pharmacologique à tester et les cellules non traitées; dans lequel un niveau plus élevé de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, dans les fragments protéiques dans les cellules non traitées avec le composé pharmacologique à tester par rapport aux cellules traitées avec le composé pharmacologique à tester, indique que le composé pharmacologique à tester est susceptible d'affecter le métabolisme ou de tuer des cellules. La présente invention concerne également un kit destiné à mesurer le niveau ou à détecter la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant : - un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci tel que défini ci-dessus, - un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, tel que défini ci-dessus, et - un système d'électrophorèse. Par "système d'électrophorèse", on entend ici tout système permettant de séparer et caractériser des protéines et/ou des acides nucléiques en fonction de leur taille et/ou de leur point isoélectrique. Les systèmes d'électrophorèse appropriés sont bien connus de l'homme du métier et comprennent notamment les électrophorèses de focalisation isoélectrique (électrophorèse dans un gradient de pH), les électrophorèses sur gel de polyacrylamide, les électrophorèses en gel d'agarose, les électrophorèses bi-dimensionnelles, les électrophorèses en champ pulsé, les électrophorèses en conditions dénaturantes. De manière préférée, un système d'électrophorèse approprié comprend un gel de polyacrylamide SDSPAGE ou Tris-Tricine, éventuellement accompagné d'une cuve d'électrophorèse, un tampon de migration, un générateur. La présente invention concerne également un kit destiné à mesurer ou détecter par FACS le niveau ou la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant : - un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci tel que défini ci-dessus, et - un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, tel que défini ci-dessus, l'anticorps étant de préférence un anticorps conjugué à un groupement marqueur tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé ayant une affinité spécifique pour un antibiotique aminonucléosidique, ou d'un dérivé de celui-ci, tel que défini ci-dessus pour détecter la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, tels que définis ci-dessus, à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique, ou son dérivé, tel que défini ci-dessus. Par "fragments protéiques à la surface d'une cellule", on entend ici les fragments protéiques ou protéines de la cellule tels que définis ci-dessus qui sont enchâssés dans la membrane plasmique de la cellule ou liés à la membrane plasmique de la cellule. Comme il est bien connu de l'homme du métier, ces fragments protéiques et protéines sont produits dans la cellule et sont ensuite transportés au niveau de la membrane plasmique de la cellule par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Différents aspects de la présente invention ressortiront encore plus nettement au vu des exemples illustratifs ci-après. Description des figures La Figure 1 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (puro, panel de gauche) et d'une autoradiographie (35S, panel de droite) réalisés sur des cellules B3Z non traitées (sans puro/35S), traitées pendant 1 h avec 10 pg/ml de puromycine (puro), traitées pendant 10 min avec 25 �M de cycloheximide puis traitées pendant 1 h avec 10 pg/ml de puromycine (puro + CHX), traitées pendant 10 min avec du promix 35S (35S) ou traitées pendant 10 min avec 25 �M de cycloheximide puis traitées pendant 10 min avec du promix 35S (35S + CHX). Une détection anti-actine mettant en évidence l'égalité des quantités chargées dans les puits est également présentée (actine). La Figure 2 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (puro, panel de gauche) et d'une autoradiographie (35S, panel de droite) réalisés sur des splénocytes primaires OT-1 CD8a+ stimulés ou non avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SIINFEKL (SEQ ID NO:1) (mDC-SL8) et incubées pendant 1 h avec de la puromycine (puro) ou avec du promix 35S (35S) Une détection anti-actine mettant en évidence l'égalité des quantités chargées dans les puits est également présentée (actine). Le graphique au-dessus du blot représente l'intensité de marquage déterminée pour chacun des puits. La Figure 3 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 10 min avec 10 pg/ml de puromycine et marquées avec un anti-puromycine (puro, panel de gauche) et un anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a, panel du millieu). Le panel de droite représente la superposition des deux marquages. La barre d'échelle correspond à 10 �m. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'antipuromycine (puro) et l'anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a) au niveau de la section représentée sur l'image de droite. La Figure 4 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 5 min avec 25 �M de cycloheximide (CHX) puis pendant 10 min avec 10 pg/ml de puromycine et 10 marquées avec un anti-puromycine (puro, panel de gauche) et un anti-phosphoeIF2a (P-eIF2a, panel du millieu). Le panel de droite représente la superposition des deux marquages. La barre d'échelle correspond à 10 �m. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a) au niveau de la section représentée sur l'image de droite. La Figure 5 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 10 min avec 10 pg/ml de puromycine et marquées avec un anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a, panel en haut à gauche), un anti-puromycine (puro, panel du milieu en haut) et un oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel en bas à gauche). Le panel en haut à droite représente la superposition des marquages anti-puromycine et anti-phospho-eIF2a. Le panel en bas au milieu représente la superposition des trois marquages. La barre d'échelle correspond à 10 �m. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a) au niveau de la section représentée sur l'image en haut à droite. La Figure 6 représente des images prises en microscopie confocale à fluorescence de cellules NIH3T3 traitées pendant 30 min avec 500 �M d'arsénite (AS) puis traitées pendant 10 min avec 10 pg/ml de puromycine et marquées avec un anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a, panel en haut à gauche), un anti-puromycine (puro, panel du milieu en haut) et un oligo dT-Alexa 555 (oligo dT, panel en bas à gauche). Le panel en haut à droite représente la superposition des marquages anti-puromycine et anti-phospho-eIF2a. Le panel en bas au milieu représente la superposition des trois marquages. Les flèches indiquent des granules de stress. La barre d'échelle correspond à 10 �m. Le graphique représente les intensités de fluorescence mesurées avec l'anti-puromycine (puro) et l'anti-phospho-eIF2a (P-eIF2a) au niveau de la section représentée sur l'image en haut à droite. La Figure 7 représente le résultat d'une analyse en FACS de surface sur des cellules non traitées (sans puro) ou traitées pendant 1 h avec 10 pg/ml de puromycine (1 h puro), représentant l'intensité de fluorescence du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 en abscisse et le nombre de cellules en ordonnée. La Figure 8 montre un graphique représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z traitées pendant 1 h aux concentrations de puromycine indiquées en abscisse. Le Western Blot représenté au dessus du graphique correspond à un marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine réalisé sur les cellules correrspondantes. La Figure 9 montre un graphique représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z pulsées avec 10 pg/ml de puromycine pendant 30 min (courbe noire) ou 10 min (courbe grise) et chassées pendant les temps indiqués en abscisse (chasse). La Figure 10 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z pulsées avec 10 pg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant les temps indiqués en abscisse (chasse). La Figure 11 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z pré-traitées pendant 10 min avec de la cycloheximide aux concentrations indiquées en abscisse (CHX) avant d'être pulsées avec 10 pg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant 1 h. La Figure 12 montre des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence médiane du marquage avec l'anticorps 12D10 anti-puromycine conjugué à l'Alexa 647 (puro-A647) mesurée par FACS de surface sur des cellules B3Z pulsées avec 10 pg/ml de puromycine pendant 10 min et chassées pendant 1 h puis trypsinées pendant 0, 5 ou 10 min avant l'analyse. La Figure 13 représente le résultat d'une analyse en FACS de surface sur des cellules non traitées (sans puro), pulsées pendant 10 min avec 10 pg/ml de puromycine puis chassées pendant 1 h (10' 10 pg/ml puro +1 h), ou traitées avec 5 pg/ml de brefeldine A avant d'être marquées à la puromycine (puro + 5 pg/ml BFA) représentant l'intensité de fluorescence du marquage avec l'anticorps 12D10 antipuromycine conjugué à l'Alexa 647 en abscisse et le nombre de cellules en ordonnée. La Figure 14 représente le résultat d'un blot anti-puromycine (WB:puro) réalisé sur des lysats totaux (panel de gauche) ou sur des protéines de surface biotinylées immunoprécipitées (PD:biotine de surface, panel de droite) de cellules B3Z non traitées (sans puro), traitées à la puromycine (puro) ou traitées à la brefeldine A avant d'être traitées à la puromycine (puro +BFA). La Figure 15 représente le résultat d'une analyse par SUnSET d'une population de cellules hétérogène. Le panel de gauche représente la répartition par FACS des cellules selon l'intensité du marquage CD45.1 (ordonnée) et la taille (FCS, abscisse). Les cellules comprises dans la zone en haut à gauche correspondent aux splénocytes CD45.1 /CD8a+, les cellules situées dans la zone en bas à gauche correspondent aux splénocytes OT-1 CD45.2/CD8a+ et les cellules situées dans la zone en bas à droite correspondent aux lymphocytes T d'hybridome B3Z. Le panel de droite représente la répartition par FACS, pour chacune des catégories de cellules identifiées dans le panel de gauche (première rangée : splénocytes CD45.1 /CD8a+, deuxième rangée : lymphocytes T d'hybridome B3Z, troisième rangée : splénocytes OT-1 CD45.2/CD8a+), de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SL8 mais non traitées à la puromycine (première colonne), de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures chargées avec le peptide SL8 et traitées à la puromycine (deuxième colonne) ou de cellules incubées avec des cellules dendritiques matures et traitées à la puromycine (troisième colonne) selon l'intensité du marquage anti-puromycine (ordonnée) et la taille (abscisse). Exemple Matériels et méthodes SUnSET Les expériences ont été réalisées dans des plaques 96 puits à fond rond (Greiner Bio-One) avec un nombre maximal de cellules de 200 000 cellules / 150 pl de milieu RPMI complet (RC) comprenant 10% de sérum de veau foetal (SVF, HyClone Perbio) et 100 unités/mL de pénicilline/streptomycine (Gibco). Toutes les centrifugations ont été faites pendant 3 min à 340 g. 15 �I d'une solution de puromycine à 10 pg/ml (Sigma, min. 98% TLC, testé en culture cellulaire, P8833, dilué en PBS) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 10 min à 37°C et 5% CO2 (=pulse). Les cellules ont été centrifugées à température ambiante, lavées deux fois avec 150 pl de milieu RC préchauffé et incubées pendant 1 h à 37°C et 5% CO2 (=chasse). Les cellules ont été récupérées par centrifugation à 4°C et lavées deux fois dans du PBS froid comprenant 0,1% de sérum albumine bovine (PBS/BSA). Les cellules ont été resuspendues dans 30 �I de PBS/BSA froid comprenant 1 pg d'anticorps monoclonal anti-puromycine 12D10 IgG2a de souris marqué avec l'Alexa 647 et incubées 30 min sur glace. Les cellules ont été lavées deux fois avec 150 pl de PBS/BSA, fixées par resuspension dans 40 pl de solution de paraformaldéhyde (PFA) à 2% (diluée en PBS/BSA) et conservées à 4°C jusqu'à l'analyse par FACS. immunoempreinte et marquage radioactif 50 pg de matériel soluble en Triton X-100 ou 200 000 cellules, lysées directement en tampon Laemmli, ont été chargés en SDS-PAGE (gel d'électrophorèse à gradient de 2 à 12% d'acrylamide ou sans gradient à 10% d'acrylamide) avant immunoempreinte et détection par chimioluminescence (Pierce, USA). L'anticorps monoclonal de souris anti-actine (clone AC-15) a été obtenu chez Sigma et l'anticorps polyclonal de lapin anti-phospho-S6 (Ser235/236) a été obtenu chez Cell Signaling Technologies. 2x107 cellules ont été marquées par pulse avec 10 mCi/ml de [35S]-methionine Pro-mix (APB, UK) 15 pendant 10 min à 37°C en milieu RPMI contenant 10% SVF avant séparation par SDS-PAGE et quantification avec un phosphoimager FUJI. Analyse par cytométrie en flux Les cellules ont été marquées avec des anticorps spécifiques des marqueurs de la surface cellulaire CD8î (RM2201, Caltag), CD69 (H1.2F3, BD Pharmingen), CD45.2 (104, BD Pharmingen), CD45.1 (A20, eBioscience), CD11 c (N418, eBioscience) ou la puromycine (12D10) pendant 30 min à 4°C. Les cellules ont ensuite été lavées et fixées en PBS 2% PFA. Les événements ont été comptés sur un appareil FACSCalibur et les données acquises en utilisant le logiciel CellQuest (BD Biosciences) et analysées avec le logiciel FlowJo. Activation des cellules T 5 pg/ml de peptide SL8 (SIINFEKL (SEQ ID NO:1); Schafer-N, Danemark) ont été ajoutés aux cellules dendritiques pendant 4 h. Après récupération, les cellules dendritiques ont été fixées en PBS 0,25% PFA pendant 5 min à température ambiante. Après lavage, le PFA a été désactivé avec 10 mM de glycine pendant 5 min à température ambiante. 20 000 cellules dendritiques ont été mélangées avec 200 000 cellules T et incubées en milieu de cellules T complet à 37°C et 5% CO2. Immunofluorescence Les cellules incubées avec la puromycine ont été fixées en PBS 3% PFA avant perméabilisation à la saponine (0,05%) ou au Triton X-100 (0,5%). Un double marquage a été effectué avec l'anticorps monoclonal de souris antipuromycine 12D10 et un anticorps secondaire anti-anticorps de souris fluorescent. L'observation finale est faite sur un microscope confocal ZEISS LSM 510. Résultats 1-Suivi de la traduction par incorporation de puromycine Les inventeurs ont d'abord déterminé la manière dont l'incorporation de puromycine permettait de suivre la traduction par rapport à l'incorporation de méthionine/cystéine radioactive. Des hybridomes de cellules T B3Z (Shastri et Gonzalez (1993) J. Immunol. 150:2724) ont été marqués pendant 1 h avec 10 pg/ml de puromycine ou pendant 10 min avec de la méthionine/cystéine 35S (promix) (Figure 1). L'incorporation de puromycine a été détectée de manière efficace par Western Blot en utilisant l'anticorps monoclonal de souris anti- puromycine 12D10 avec une sensibilité comparable à celle de l'incorporation du promix 35S révélée par autoradiographie. Un pré-traitement avec la cycloheximide (CHX), un inhibiteur de la traduction, a complètement bloqué l'incorporation, indiquant que la puromycine marque exclusivement les protéines néosynthétisées. De manière intéressante, la détection de puromycine a seulement nécessité 20 à 30 s d'exposition du film, tandis que la détection du 35S a nécessité au moins 12 h d'exposition. Comme attendu, les protéines marquées avec la puromycine présentaient un poids moléculaire relativement plus faible que celles marquées au 35S du fait de l'arrêt de l'élongation induite par la puromycine. La traduction a également été suivie dans des cellules T primaires OT-1 CD8a+ spécifiques du MHC I Kb lié au peptide SIINEFKL (SEQ ID NO:1) (SL8), un peptide de l'ovalbumine majeur. Les cellules OT-1 ont été stimulées par des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles activées (cellules dendritiques matures, mDC) chargées avec le peptide SL8. Le récepteur des cellules T (TCR) activé par les complexes MHC-peptide induit plusieurs voies de transduction du signal menant à l'activation et la prolifération des cellules T. Cette activation est probablement accompagnée d'une augmentation coordonnée de la traduction comme suggéré par les résultats précédemment obtenus dans des cellules T humaines stimulées avec des anticorps anti-CD3 (Mao et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20444). Les inventeurs ont observé une intensité de la traduction des protéines relativement modeste dans les cellules OT-1 non-stimulées que ce soit en utilisant le marquage à la puromycine ou le promix 35S (Figure 2). Cependant, les deux techniques ont révélé une augmentation de la traduction dans les cellules T stimulées par les cellules dendritiques matures chargées avec le peptide (mDC-SL8). Dans les deux conditions expérimentales, les mêmes profils protéiques ont pu être détectés avec une sensibilité égale, démontrant que l'incorporation de puromycine et la détection par immunoempreinte étaient une bonne alternative au marquage métabolique au 35S. 2-Suivi de la traduction dans des cellules individuelles Les inventeurs ont ensuite recherché si la versatilité de l'anticorps monoclonal 12D10 pouvait être utilisée pour quantifier la traduction dans une cellule individuelle. Des cellules NIH3T3, traitées ou non avec différents réactifs pharmacologiques influençant la traduction de l'ARNm, ont été incubées pendant une période courte avec de la puromycine avant visualisation en microscopie confocale à immunofluorescence (Figures 3 à 6). L'intensité de traduction a pu être directement visualisée et quantifiée dans chacune des cellules présentes dans le champ optique. Comme attendu, les cellules traitées avec CHX ont présenté une intensité de fluorescence fortement réduite, qui a pu être relevée et directement comparée aux fibroblastes contrôles (Figures 3 et 4). En plus du CHX, les cellules ont été exposées à de l'arsénite de sodium (AS), qui arrête la traduction par phosphorylation de eIF2a et induit la formation de granules de stress (SG) (Anderson et Kedersha (2002) J. Cell. Sci. 115:3227) (Figures 5 et 6). Dans ce cas, la phosphorylation de eIF2a et la formation de SG (marquage oligodT) ont été utilisées comme indicateurs pour évaluer l'efficacité du traitement des cellules, qui présentaient toutes une intensité d'incorporation de puromycine particulièrement faible (Figure 6). Ainsi, l'anticorps 12D10 et l'incorporation de puromycine peuvent être utilisés pour visualiser et quantifier l'intensité de traduction par microscopie dans des cellules individuelles exposées à différents traitements et conditions de croissance. 3-Détection de la puromycine à la surface de la cellule Le repliement des protéines dans le réticulum endoplasmique a lieu de manière concomitante avec la synthèse des polypeptides par le ribosome (Fedorov et Baldwin (1997) J. Biol. Chem. 272:32715). Les inventeurs ont recherché si les protéines marquées avec la puromycine pouvaient être détectées à la surface de la cellule. La puromycine à faible concentration peut en effet être insérée dans les protéines membranaires de type Il presque complètement traduites et repliées et la taille relativement petite du composé ne devrait pas interférer avec la translocation de la protéine (Hurtley et Helenius (1989) Annual Review of Cell Biology 5:277; Skach (2007) J. Cell. Biol. 179:1333). Les inventeurs ont donc utilisés l'anticorps 12D10 conjugué à l'Alexa 647 pour mettre en oeuvre un marquage à la surface et un FACS sur des cellules B3Z marquées à la puromycine. Ils ont clairement détecté un déplacement important de l'intensité de marquage de surface indiquant que les protéines marquées à la puromycine néo synthétisées pouvaient atteindre la surface de la cellule de manière efficace (Figure 7). Ils ont démontré que la détection de surface de la puromycine était directement proportionnelle à l'incorporation globale du composé telle que détectée par immunoempreinte et qu'une concentration de 10 pg/ml de puromycine était optimale (Figure 8). Les concentrations supérieures à 50 pg/ml tendant à avoir un effet inhibiteur sur la traduction n'ont pas été évaluées plus en détail. Afin de minimiser le risque d'interférence de la puromycine avec les fonctions cellulaires, les inventeurs ont cherché à diminuer le temps d'exposition des cellules à la drogue et ont réduit les effets indésirables en réalisant un pulse de marquage court suivi par une chasse. Ils ont démontré qu'un temps de pulse de 10 min suivi d'une chasse de 50 min était optimal pour permettre aux protéines marquées à la puromycine d'atteindre la surface de la cellule (Figure 9). Ils ont ensuite évalué la stabilité de ces protéines, qui ont continué à être détectées à leurs niveaux maximaux jusqu'à 3 h après le pulse (Figure 10). Après cette période, une perte de marquage, reflétant probablement le turnover endocytique, a été observée. Pour démontrer que la détection de la puromycine à la surface ne reflétait pas simplement une liaison non spécifique, les cellules ont été pré-traitées avec différentes concentrations de CHX avant l'incorporation de puromycine (Figure 11). Aucun marquage au-dessus du bruit de fond n'a pu être détecté aux hautes concentrations de CHX, ce qui indique qu'une traduction active est nécessaire pour observer l'apparition de puromycine à la surface de la cellule. L'intensité de marquage était directement proportionnelle à la concentration de CHX, indiquant que le SUnSET reflète avec précision les variations d'activité traductionnelle ayant lieu dans les cellules. La trypsination des cellules marquées à la puromycine a également abattu efficacement la détection de surface démontrant encore que la puromycine de surface est liée aux protéines néo-synthétisées (Figure 12). Le traitement des cellules avec le métabolite fongique brefeldine A (BFA), un bloqueur puissant du transport du réticulum endoplasmique vers le Golgi, a inhibé l'apparition à la surface des protéines marquées à la puromycine indiquant que ces molécules étaient exportées via la voie de sécrétion habituelle (Figure 13). Les inventeurs ont ensuite cherché à définir la diversité de la population de protéines marquées à la puromycine atteignant la surface. Les cellules ont été soumises à un marquage à la puromycine en présence ou absence de BFA et l'incorporation de puromycine a été visualisée par immunoempreinte (Figure 14, panel de gauche). Les cellules marquées ont également été biotinylées à la surface et les protéines biotinylées ont été immunoprécipitées avant Western Blot avec l'anticorps 12D10 (Figure 14, panel de droite). En présence de BFA, seule une fraction limitée de protéines biotinylées était marquée avec la puromycine, tandis que dans les cellules contrôle, les protéines immunoprécipitées contenaient un ensemble varié et abondant de protéines nouvellement synthétisées portant de la puromycine, qui avaient clairement toutes besoin du transport du réticulum endoplasmique vers le Golgi pour atteindre la surface cellulaire. La technique SUnSET permet donc de suivre de manière non-invasive la traduction dans des cellules individuelles ou dans différentes populations cellulaires exposées à des conditions physiologiques variables. 4-Utilisation du SUnSET avec des populations hétérogènes de cellules vivantes Pour démontrer le potentiel de la technique SunSET pour suivre la traduction dans des populations cellulaires hétérogènes, les inventeurs ont évalué l'activation de la traduction dans un ensemble comprenant 3 types différents de cellules T CD8a+. Ils ont mélangé des cellules OT-1 CD45.2+/CD8a+ primaires (cellules T spécifiques de SL8), des cellules T CD45.1 +/CD8a+ (spécificité variable) provenant de souris C57/BL6 et des hybridomes B3Z (spécifiques de SL8). Ces trois populations ont été incubées avec des cellules dendritiques chargées avec SL8 et le SunSET a été mis en oeuvre (Figure 15). Les différentes populations de cellules T ont été identifiées sur la base de leur positivité pour CD45 et leur taille (FCS). Après l'absorption de puromycine, les splénocytes T primaires présentaient une activité traductionnelle limitée par rapport aux hybridomes B3Z plus grands, qui avaient une plus forte activité traductionnelle basale sans doute due à leur état transformé. Après stimulation avec les cellules dendritiques chargées avec SL8, aucun changement dans l'intensité de traduction n'a pu être observé dans les cellules CD45.1 et dans les B3Z. En revanche, les cellules OT-1 CD45.2+ ont réagi à la présence de cellules dendritiques chargées avec SL8 et les inventeurs ont observé une augmentation considérable du marquage de surface de la puromycine dans ces cellules par rapport à la population exposée aux cellules dendritiques sans peptide. Ainsi, le SUnSET permet de discriminer des cellules sur la base de leur activité métabolique. REVENDICATIONS1.- Procédé de mesure du niveau ou de détection de la synthèse protéique dans une cellule comprenant les étapes consistant à : a1) mettre en contact la cellule avec un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci, b1) détecter la présence ou mesurer la quantité d'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans des fragments protéiques de la cellule, dans lequel le niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé dans les fragments protéiques est indicatif du niveau ou de la présence de synthèse protéique dans la cellule. 2.-Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape b1) de détection du niveau de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé est réalisée à l'aide d'un anticorps spécifiquement dirigé contre l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé. 3.- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine. 4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 3, dans lequel l'anticorps est spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique, ou de son dérivé, incorporé dans les fragments protéiques par rapport à l'antibiotique aminonucléosidique libre ou son dérivé. 5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape de détection b1) est effectuée sur une cellule vivante. 6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant en outre une étape a2) de lyse des cellules après l'étape de mise en contact a1) et avant l'étape de détection b1). 7.- Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape de détection b1) est mise en oeuvre par immunoempreinte. 8.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'anticorps est fluorescent. 9.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, dans lequel l'étape de détection b1) est mise en oeuvre par cytométrie de flux. 10.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8, dans lequel l'étape de détection b1) est mise en oeuvre par microscopie à fluorescence. 11.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 8 à 9, dans lequel l'étape de détection b1) consiste à détecter l'antibiotique aminonucléosidique à la surface des cellules. 12.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, le procédé étant non radioactif. 13.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le dérivé d'antibiotique aminonucléosidique n'est pas un antibiotique aminonucléosidique conjugué à un fluorophore. 14.- Kit destiné à mesurer le niveau ou à détecter la présence de synthèse protéique dans des cellules, le kit comprenant : - un antibiotique aminonucléosidique ou un dérivé de celui-ci, - un anticorps spécifique de l'antibiotique aminonucléosidique ou de son dérivé, et - un système d'électrophorèse. 15.- Kit selon la revendication 14, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine. 16.- Anticorps spécifique d'un antibiotique aminonucléosidique ou d'un dérivé de celui-ci pour son utilisation dans la détection de la présence de fragments protéiques marqués par l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé à la surface d'une cellule ayant été mise en contact avec l'antibiotique aminonucléosidique ou son dérivé. 17.- Anticorps selon la revendication 16, dans lequel l'antibiotique aminonucléosidique est la puromycine.10