Brevet FR2947636A1 — publié le 20110107

METHODE RAPIDE, SENSIBLE ET SPECIFIQUE POUR DETECTER DES SPORES DE B. ANTHRACIS OU TOUTE PRESENCE D'ANTIGENE PROTECTEUR PA DANS UN ECHANTILLON DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé simple et rapide pour détecter la présence de spores de B. anthracis ou toute présence d'antigène protecteur PA dans un échantillon ainsi qu'un dispositif et un kit pour mettre en oeuvre ce procédé. ART ANTERIEUR DE L'INVENTION Le charbon est une maladie causée par un bacille Gram-positif, Bacillus anthracis (B. anthracis). Cette bactérie est non mobile et forme des spores lorsqu'elle est placée dans un environnement défavorable à sa survie. Les spores peuvent survivre 24 heures dans l'air et plusieurs dizaines années dans le sol, et possèdent des propriétés de résistance à la chaleur ou aux agents désinfectants. Une infection par le charbon peut prendre trois formes : cutanée, digestive ou pulmonaire. La forme pulmonaire est plus particulièrement d'intérêt militaire et constitue la forme la plus dangereuse. En cas d'inhalation, les spores de B. anthracis passent dans les alvéoles où elles sont phagocytées par les macrophages et les cellules dendritiques, notamment. Les spores germent dans ces cellules et les formes végétatives se multiplient dans les ganglions. Les bactéries passent alors dans le sang, se reproduisent en continu et produisent des toxines, responsables en partie de la létalité de la maladie. Les toxines du charbon sont composées de trois protéines distinctes : l'antigène protecteur (PA, 83 kDa avant clivage enzymatique intracellulaire et 63 kDa après clivage), le facteur létal (LF, 90 kDa) et le facteur oedémateux (EF, 89 kDa). La toxine létale est formée de PA et LF ; et la toxine oedémateuse, dont le rôle dans la physiologie de la maladie est moindre, de PA et EF. Ces protéines sont sécrétées par la bactérie en tant que monomères non toxiques, et s'assemblent à la surface des cellules cibles pour former des complexes toxiques.30 La détection de B. anthracis ou du moins d'un des composants de la toxine létale est un réel enjeu au vu des récents événements bioterroristes (USA 2001 ; puis envoi en nombre de lettres suspectes en Europe, et particulièrement en France). Il est donc essentiel d'avoir à disposition un test de détection des spores de B. anthracis qui 5 soit d'une part spécifique et sélectif, et d'autre part qui soit simple et rapide à mettre en oeuvre. Les moyens de détection des spores de B. anthracis dans un échantillon utilisent généralement une première étape de culture dans un milieu solide favorisant la croissance de ces bactéries. Lorsque des colonies bactériennes sont formées, les bactéries B. anthracis 10 peuvent être ensuite identifiées par des techniques microscopiques et/ou biochimiques. Dans les années 60, un milieu de culture, appelé PLET, a été mis au point pour permettre une croissance sélective de B. anthracis (Knisely, J Bacteriol, 1966, 92 :784). Cependant, un certain nombre de bactéries sont devenues résistantes aux inhibiteurs contenus dans ce milieu PLET, résultant en une perte de spécificité pour B. anthracis. En effet, le milieu de 15 culture PLET permet la croissance de bactéries gram positive et gram négative telles que B. subtilis, Streptococcus faecalis, Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus et Escherichia coli. La demande de brevet US2004/0058428 décrit un autre milieu de culture permettant la croissance sélective de B. anthracis. Ce milieu de culture comprend une source de 20 nutriments telle que de l'infusion de coeur de boeuf, au moins un inhibiteur de bactérie gram négative tel que la cefotaxime et au moins un inhibiteur de bactérie gram positive tel que le lysosyme. De plus, de l'acétate de thallium et de 1'EDTA peuvent être ajoutés pour inhiber des bactéries gram positives autres que B. anthracis et un agent antifongique tel que la cycloheximide peut être ajouté pour supprimer la formation de colonies de 25 moisissures. La culture de l'échantillon bactérien dans ce type de milieu permet d'amplifier la croissance de colonies B. anthracis, qui sont alors visibles en microscopie (couleur gris-blanche / 0,2 à 2 mm de diamètre). Il est cependant nécessaire de valider cette identification microscopique. Pour cela, des méthodes de bactériologie classiques sont utilisées, comme par exemple l'utilisation du 30 procédé de type galerie API. D'autres techniques de biologie moléculaire peuvent également être utilisées comme des tests basés sur l'amplification de séquences spécifiques de B. anthracis (à l'aide de la PCR �polymerase chain reaction �) ou sur la détection immunologique des spores, de leurs composants ou de leur produit de germination à l'aide d'anticorps (par exemple tests ELISA � enzyme-linked immunosorbent assay �). Cependant, cette étape de validation de l'identification de B. anthracis nécessite que la colonie soit isolée puis amplifiée en culture liquide pour disposer du matériel nécessaire aux tests, dont la réalisation est relativement longue, complexe et nécessite du personnel particulièrement formé à cet effet. Ces tests d'identification et de validation de la présence de B. anthracis dans un échantillon sont donc longs, coûteux, et nécessitent la présence d'un personnel hautement qualifié. Un objectif de la présente invention est donc de fournir une méthode plus simple et plus rapide pour détecter la présence de spores de B. anthracis que les méthodes pré-existantes. Un objectif de la présente invention est également de fournir une méthode permettant de détecter dans un échantillon la présence de spores de B. anthracis, indirectement par germination de ces spores puis induction de la sécrétion de l'antigène protecteur (PA, responsable de la pathogénicité de la maladie), qui est détecté par des moyens immunologiques préférentiellement rapides. La méthode de l'invention a l'avantage de ne pas utiliser de matériel couteux et encombrant, de ne pas nécessiter la présence d'un personnel hautement qualifié et peut être facilement et rapidement réalisée en laboratoire de terrain, et/ou en situation d'afflux en grand nombre d'échantillons suspects de contenir des spores du charbon. RESUME DE L'INVENTION L'invention a pour objet une méthode de détection dans un échantillon de spores de B. anthracis, par culture, induction de sécrétion puis détection de la présence d'antigène protecteur PA dans le milieu de culture, ladite méthode comprenant : - mettre en culture un échantillon en présence de sérum pendant au minimum 6 heures, et - réaliser sur un échantillon ou la totalité de la culture obtenue précédemment, un test immunologique comprenant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit échantillon est un échantillon environnemental ou un échantillon biologique. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit sérum est du sérum de veau fétal. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit test immunologique est un test immunochromatographique, un test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, un test électrochimiolumiscent ou un test ELISA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit test immunologique est un test immunochrommatographique. Un autre objet de l'invention est un dispositif de test immunochromatographique pour détecter dans un échantillon la présence d'antigène protecteur PA, ledit dispositif comprenant une membrane poreuse pourvue : - d'une zone de conjugué dans laquelle est immobilisé un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA complexé avec un marqueur, - d'une zone de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA, et - d'une zone de contrôle dans laquelle est immobilisé un agent de capture du premier 15 anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA et complexé avec un marqueur, ou un agent de capture du marqueur. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit marqueur est constitué de particules colloïdales d'or. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit agent de capture est de l'argent. 20 Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit dispositif est tel que décrit précédemment dans lequel - la zone de conjugué de la membrane poreuse comprend également un premier anticorps dirigé contre le facteur létal LF complexé avec un marqueur, et/ou un premier anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF complexé avec un marqueur, et 25 - la membrane poreuse comprend également une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur létal LF, et/ou une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF, ledit dispositif permettant de détecter simultanément la présence de l'antigène protecteur 30 PA, et de l'un ou des deux des facteurs LF et/ou EF. Un autre objet de l'invention est un kit permettant de détecter dans un échantillon suspect des spores de B. anthracis ou l'antigène protecteur PA, ledit kit comprenant : - au moins un container contenant du sérum animal, et - au moins un moyen permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit kit comprend également au moins un écouvillon. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit kit comprend également un témoin positif sous la forme de spores d'une souche non pathogène de B. anthracis secrétant PA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit moyen de détecter l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique, un dispositif de test immunoenzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, ou un anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA permettant sa détection par un test électrochimiolumiscent ou encore un test ELISA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit moyen de détecter l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique tel que décrit ci-dessus. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Les inventeurs ont mis en évidence que la culture, dans un milieu composé de sérum pur, d'un échantillon potentiellement contaminé uniquement induit de façon très rapide la production par B. anthracis de l'antigène protecteur PA dans la culture. En effet, l'expression de l'antigène protecteur PA est effective au bout de 6 heures de cette culture en sérum pur. Cet effet n'est pas observé quand un milieu de culture permettant la croissance sélective de B. anthracis est utilisé. De plus, les inventeurs ont mis en évidence que le milieu RM décrit dans Leppla et al. (Leppla 1988 Methods in enzymology, 165 : 103), qui est un milieu conçu pour induire préférentiellement la production de d'antigène protecteur PA, ne conduit pas à la production de l'antigène protecteur PA dans la culture de façon aussi rapide que le sérum. Les inventeurs ont donc mis au point une méthode de détection dans un échantillon de spores de B. anthracis, par culture, induction de sécrétion puis détection de la présence d'antigène protecteur PA dans le milieu de culture, ladite méthode comprenant : - mettre en culture un échantillon en présence de sérum pendant au minimum 6 heures, et - réaliser un test immunologique rapide sur un échantillon ou la totalité de la culture comprenant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. La spécificité du test de détection est basée sur le fait que l'on cherche à détecter la 5 présence de l'antigène protecteur PA, qui est spécifique de B. anthracis. Ce test est un test de première intention, facile et relativement rapide à mettre en oeuvre, qui peut être complété par les techniques microbiologiques classiques, en particulier en cas de positivité. 10 L'échantillon à tester pour la présence de spores de B. anthracis peut être un échantillon environnemental ou un échantillon biologique. Les échantillons peuvent être obtenus directement de la source ou peuvent être pré-traités par différentes techniques comme le chauffage préalable pour éliminer les bactéries autres que sporulées, la filtration, précipitation, dilution, distillation, concentration... 15 Des exemples d'échantillons environnementaux incluent, mais ne sont pas limités à, des échantillons prélevés sur des surfaces dures ou souples telles que des bureaux, des paillasses de laboratoire, des enveloppes postales ou encore des échantillons de poudre, de liquide ou d'aliments suspects ou encore des échantillons de sols. Des exemples d'échantillons biologiques incluent, mais ne sont pas limités à, des fluides 20 biologiques comme des échantillons sanguins (sang, serum, plama), du fluide interstitial, de la salive, de la sueur, de l'urine ou des échantillons provenant de surfaces épithéliales humaines comme par exemple un écouvillonage nasal ou un lavage broncho-pulmonaire. Des écouvillons à usage unique sont utilisés pour récolter l'échantillon environnemental ou 25 biologique. Les inventeurs ont montré que la culture d'échantillon susceptible de contenir des spores de B. anthracis dans du sérum animal seul augmente fortement la production d'antigène protecteur PA. 30 Dans un mode de réalisation de l'invention, le sérum animal est un sérum de mammifère. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le sérum animal inclut le sérum de veau fétal, le sérum de chèvre, le sérum de singe, le sérum de lapin, le sérum de cheval, le sérum humain. De préférence, le sérum utilisé est le sérum de veau fétal. Selon l'invention, l'échantillon à tester est mis en culture pendant au moins 6 heures, au moins 7 heures, au moins 8 heures, au moins 9 heures, au moins 10 heures, au moins 11 heures, au moins 12 heures. L'homme du métier sera à même de déterminer le temps de culture nécessaire pour obtenir une concentration suffisante d'antigène protecteur PA qui soit détectable par la méthode de détection immunologique qu'il aura choisi d'utiliser. Ainsi, lorsque la détection de l'antigène protecteur PA est réalisée à l'aide d'un test immunochromatographique, le temps de culture est de préférence d'au moins 10 heures. Dans un autre mode de réalisation, lorsque la détection de l'antigène protecteur PA est réalisée à l'aide d'un test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immun-capture sur colonne, le temps de culture peut être réduit du fait d'une meilleure sensibilité du test. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon à tester est mis en culture sur la nuit. Selon l'invention, l'échantillon à tester est mis en culture à une température d'environ 35°C, de préférence entre 30 et 40°C, plus préférentiellement de 37°C. Selon l'invention, l'échantillon à tester est mis en culture dans une atmosphère comprenant 5 à 15% de CO2, de préférence 10%. Selon l'invention, l'échantillon à tester est mis en culture dans un volume déterminé par l'homme de l'art sachant que la concentration d'antigène protecteur PA produite sera inversement proportionnel au volume de la culture. Dans un mode de réalisation de l'invention, le volume de culture est d'environ 500 gl a environ 2 ml. Le terme � environ � utilisé dans la présente invention correspond à plus ou moins 10% de la valeur. Dans un mode de réalisation de l'invention, à la suite de l'étape de culture, la présence de 30 l'antigène protecteur PA est testée sur un échantillon de la culture. Par exemple, 100 �l de la culture sont prélevés et utilisés pour déterminer la présence de l'antigène protecteur PA. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, à la suite de l'étape de culture, la présence de l'antigène protecteur PA est testée sur la culture en entier. Par exemple, un dispositif de test immunochromatographique est placé directement dans le tube contenant la culture. Dans un autre exemple, la totalité de la culture est passée sur le dispositif du test d'immunoaffinité à l'aide de colonnes. Selon l'invention, la détection de la présence de l'antigène protecteur PA peut être réalisée par l'un des moyens suivants : test immunochromatographique ; test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, dont l'antigène n'est pas élué mais détecté par un anticorps conjugué à un système de marquage ; test électrochimiolumiscent (ECL) ou encore test ELISA (� enzyme-linked immunosorbant assay �). L'homme de l'art pourra utiliser tout anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA, monoclonal ou polyclonal, ledit anticorps étant adapté pour la mise en oeuvre d'un des tests cité précédemment. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la détection de la présence de l'antigène protecteur PA est réalisée à l'aide d'un test immunochromatographique ou d'un test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, dont l'antigène n'est pas élué mais détecté par un anticorps conjugué à un système de marquage. Ces deux types de tests ont l'avantage d'être très rapides, de ne pas nécessiter de main d'oeuvre qualifiée et d'être facilement utilisables sur le terrain. Le résultat du test immunochromatographique peut être obtenu après 20 min et le résultat du test immunoenzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne peut être obtenu après 2 heures ou moins. Un exemple de test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur 25 colonne permettant la détection de l'antigène protecteur PA est commercialisé par la société Senova (Allemagne). Un objet de l'invention est un dispositif de test immunochromatographique pour détecter dans un échantillon la présence d'antigène protecteur PA, ledit dispositif comprenant une 30 membrane poreuse pourvue : - d'une zone de conjugué dans laquelle est immobilisé un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA complexé avec un marqueur, - d'une zone de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA, et - d'une zone de contrôle dans laquelle est immobilisé un agent de capture du premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA ou un agent de capture du marqueur. 5 Selon l'invention, la membrane poreuse peut être supportée par un matériel rigide. En général, la membrane poreuse est réalisée dans tout matériel permettant à l'échantillon de circuler. Des exemples de matériels utilisés pour la réalisation de la membrane poreuse incluent, mais ne sont pas limités à, des matériaux naturels ou synthétiques tels que des 10 polysaccharides (par exemple des matériaux cellulosiques comme le papier ou des dérivés cellulosiques comme l'acétate de cellulose ou la nitrocellulose), le polyéther sulfone, le polyéthylène, le nylon, le fluorure de polyvinylidene (PVDF), le polyester, le polypropylène, la silice, des matériaux inorganiques tels que de l'alumine désactivée, du MgSO4, ou d'autres matériels inorganiques dispersés dans une matrice polymérique 15 poreuse, avec des polymères tels que le chlorure de vinyle, le copolymère chlorure de vinyle û propylène, et copolymère chlorure de vinyle û acétate de vinyle ; du tissu naturel (coton) ou synthétique (nylon ou rayon), des gels poreux tels que des gels de silice, agarose, dextran, et gélatine ; des films polymériques tels que le polyacrylamide. Dans un mode de réalisation préféré, la membrane poreuse est réalisée à partir de nitrocellulose. Tel 20 qu'utilisé dans la présente invention, le terme � nitrocellulose � correspond à des esters nitriques de cellulose, qui peuvent être de la nitrocellulose seule ou un mélange d'esters d'acide nitrique et d'autres acides tels que des acides carboxyliques aliphatiques ayant 1 à 7 atomes de carbones. 25 Dans un mode de réalisation de l'invention, la membrane poreuse comprenant la zone de conjugué, la zone de détection et la zone de contrôle est réalisée dans le même matériel. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la membrane poreuse comprenant la zone de conjugué n'est pas réalisée dans le même matériel que la membrane poreuse comprenant la zone de détection et la zone de contrôle. Par exemple, la membrane utilisée 30 pour la zone de conjugué est réalisée à partir de polyester tandis que la membrane utilisée pour la zone de détection et la zone de contrôle est réalisée à partir de nitrocellulose. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de test immunochromatographique peut également comprendre une membrane absorbante qui est couplée à la membrane poreuse du côté de la zone de contrôle. Cette membrane absorbante récupère le fluide ayant migré le long de la (ou des) membrane poreuse comprenant la zone de conjugué, la zone de détection et la zone de contrôle et permet donc de promouvoir l'action de la migration capillaire et le flux de fluide à travers la membrane poreuse. Pour initier la détection de spores de B. anthracis dans un échantillon, l'échantillon peut être directement appliqué à la portion terminale libre de la membrane poreuse, de sorte que l'échantillon peut circuler dans la membrane poreuse selon le chemin suivant : zone de conjugué, zone de détection puis zone de contrôle et enfin zone absorbante si une membrane absorbante est présente. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'échantillon peut être déposé dans une zone de dépôt d'échantillon qui est en communication fluidique avec la membrane poreuse. Des matériaux susceptibles d'être utilisés pour la réalisation de cette zone de dépôt d'échantillon incluent, mais ne sont pas limités à, la nitrocellulose, la cellulose, du polyéthylène poreux, ou du papier filtre en fibre de verre. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'échantillon peut être dilué avant migration dans un tampon de neutralisation, destiné notamment à solubiliser ou fluidifier 20 l'échantillon, à normaliser son pH, ou à bloquer les interactions non spécifiques. Selon l'invention, la membrane poreuse comprend une zone de conjugué dans laquelle est immobilisé un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA complexé avec un marqueur. 25 Toute substance qui permet de générer un signal détectable visuellement ou par un dispositif peuvent être utilisée comme marqueur. Des exemples de telles substances incluent, mais ne sont pas limités à, des chromogènes ; des catalyseurs ; des composés luminescents (i.e. fluorescents, phosphorescents...) ; des composés radioactifs ; des 30 marqueurs visuels incluant des particules colloïdales métalliques (e.g. or) ou non métalliques, des particules colorantes (fluorescentes ou conjuguées à l'avidine ou la streptavidine), des enzymes ou substrats, des particules de polymère organique (e.g. latex) ou des particules de type dextran couplées à des fluorophores. Un exemple préféré de marqueur est constitué par des microparticules d'or, ou de latex pouvant être marquées avec un composé fluorescent ou un colorant. Les microparticules peuvent être de n'importe quelle forme et de préférence sphériques. La taille moyenne (diamètre) des microparticules peut également varier et peut être de 0,1 nm à 1000 �m, dans certains modes de réalisation de 0,1 nm à 100 �m et dans d'autres modes de réalisation de 1 nm à 10 �m. Un exemple de système enzyme/substrat est l'enzyme phosphatase alcaline et le substrat 5-bromo-4-chloro-3 indolyl phosphate/nitro-bleu tétrazolium (BCIP) ou le substrat 4-méthylumbelliferyl phosphate (4-MUP). Des exemples de composés fluorescents incluent, mais ne sont pas limités à, la fluorescéine, les chélates d'europium, la phycobiliprotéine, la rhodamine... Selon l'invention, les marqueurs sont complexés à un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA de façon à reconnaitre spécifiquement l'antigène protecteur. Le terme � anticorps � se réfère à une molécule d'immunoglobuline ou un fragment d'une molécule d'immunoglobuline ayant la capacité de se lier spécifiquement à un antigène particulier. Un anticorps selon la présente invention peut être un anticorps entier monoclonal (anticorps murin, de rat, chimérique ou humanisé, notamment) ou polyclonal (anticorps de lapins, de chèvres, de lapins notamment) purifié ou non par affinité, ou un fragment d'anticorps F(ab')2, Fab, scFv, Fv, anticorps simple chaîne notamment. Il peut aussi s'agir de toute molécule autre qu'un anticorps, se liant spécifiquement à PA et avec une affinité meilleure que 1 micromolaire. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur 25 PA est un anticorps monoclonal. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA est un anticorps polyclonal, éventuellement purifié par affinité. Des exemples d'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur sont les anticorps sc-52123, sc-52124, sc-52125, sc-52126, sc-52127, sc-52128, sc-52129, sc-17423, sc-17424, sc- 30 57952 (Santa Cruz Technologies), NB100-62352 (Acris antibodies). Dans un mode de réalisation préféré, le premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA est un anticorps monoclonal tel que l'anticorps BAP0105 commercialisé par AbCys. L'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA est complexé au marqueur par des 5 techniques conventionnelles bien connues de l'homme de l'art, par exemple par liaison covalent directe ou indirecte à l'aide de lieur fonctionnel. On appellera par la suite � conjugué � les complexes formés du �premier anticorps � et du � marqueur �. 10 Selon l'invention, la membrane poreuse comprend une zone de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA est un anticorps monoclonal. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre l'antigène 15 protecteur PA est un anticorps polyclonal. Des exemples d'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur sont les anticorps sc-52123, sc-52124, sc-52125, sc-52126, sc-52127, sc-52128, sc-52129, sc-17423, sc-17424, sc-57952 (Santa Cruz Technologies), NB100-62352 (Acris antibodies). Dans un mode de réalisation préféré, le second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur 20 PA est un anticorps polyclonal. Selon l'invention, le second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA n'entre pas en compétition avec le premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA et complexé au marqueur. Par �n'entre pas en compétition �, on entend que ces deux anticorps ne se lient pas au même épitope de l'antigène protecteur PA. Il est nécessaire que le premier 25 anticorps ne se lie pas à un épitope qui empêcherait la liaison du second anticorps à son antigène. Ainsi, lorsque l'échantillon circule dans la membrane poreuse à l'aide des forces capillaires, l'antigène protecteur PA présent dans l'échantillon est fixé dans la zone de conjugué par le conjugué ; puis les complexes PA / conjugué ainsi formés migrent puis 30 sont fixés au niveau de la zone de détection par les second anticorps dirigés contre l'antigène protecteur PA. De façon préférentielle, les seconds anticorps dirigés contre l'antigène protecteur PA sont disposés sous la forme d'une ligne dans une direction substantiellement perpendiculaire au flux de l'échantillon à travers la membrane poreuse. Cependant, les seconds anticorps dirigés contre l'antigène protecteur PA pourraient également être disposés d'une autre façon, comme par exemple sous la forme d'un point dont le diamètre serait substantiellement égal à la largeur de la membrane poreuse. Selon l'invention, la membrane poreuse comprend une zone de contrôle dans laquelle est immobilisé un agent de capture du premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA 10 ou un agent de capture du marqueur. Cet agent de capture sert de site de liaison fixe pour tous les conjugués. Optionnellement, cette agent de capture sert également de site de liaison fixe pour tous les conjugués complexés avec l'antigène protecteur PA qui ne se sont pas fixés dans la zone de détection. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'agent de capture est l'antigène protecteur PA, 15 ce qui permet de fixer les conjugués. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'agent de capture est un agent non biologique. Ce mode de réalisation a l'avantage de s'assurer que tout conjugué qui serait resté libre ou tout conjugué complexé avec l'antigène protecteur PA est immobilisé dans la zone de contrôle. 20 Par exemple, dans ce mode de réalisation, l'agent de capture comprend un polyélectrolyte. Les polyélectrolytes peuvent avoir une charge nette positive, négative ou neutre. Des exemples de polyélectrolytes ayant une charge nette positive incluent, mais ne sont pas limités à, la polylysine, le polyéthylène-imine, les polyamines fonctionnalisées par l'épichlorohydrine et/ou les polyamidoamines tel que le poly(diméthylamine-co- 25 épichlorohydrine), le poly(chlorure de diallyldiméthylammonium) ; les dérivés de cellulose cationique tels que les copolymères de cellulose ou les dérivés de cellulose liés à un monomère hydrosoluble d'ammonium quaternaire. Des exemple de polyélectrolytes ayant une charge nette négative incluent, mais ne sont pas limités à, des acides polyacryliques tels que le poly(éthylène-co-acide méthacrylique). Des polyélectrolytes amphiphiles 30 peuvent également être utilisés comme le poly(styryl-b- iodure de N-méthyl-2-vinylpyridinium) et le poly(styryl-b-acide acrylique). De manière préférentielle, les polyélectrolytes sont fixés à la membrane poreuse à l'aide de liaison ionique et/ou covalente, de façon à pouvoir être facilement détectable par l'utilisateur. Dans un mode de réalisation, les polyélectrolytes sont déposés sur la membrane poreuse et sont ensuite séchés. Pendant le séchage, le polyélectrolyte peut former une liaison ionique avec certains groupes fonctionnels présents à la surface de la membrane poreuse qui ont une charge opposée à celle de l'électrolyte. Dans un autre mode de réalisation, les polyélectrolytes peuvent être réticulés à la membrane poreuse par des techniques conventionnelles. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur utilisé est des particules colloïdales d'or et l'agent de capture est de l'argent ou de la polylysine. Les particules d'or servent d'indicateur coloré ou �marqueur �. Lorsque l'échantillon à tester est mis en contact avec le dispositif de test immunochromatographique, l'antigène protecteur PA contenus dans l'échantillon à tester se lie à l'anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA conjugué aux particules d'or. Ce complexe conjugué / antigène protecteur PA migre dans la membrane poreuse et les second anticorps dirigés contre l'antigène protecteur PA, immobilisés dans la zone de détection, fixent le complexe conjugué / PA. La formation d'un complexe sandwich induit la précipitation de l'indicateur coloré, ce qui conduit à la formation d'une ligne colorée indiquant que le test est positif. Le conjugué seul et/ou le conjugué complexé à PA et ne s'étant pas fixé dans la zone de détection migrent ensuite vers la zone de contrôle où ils sont fixés par la polylysine, ce qui induit la précipitation de l'indicateur coloré et la formation d'une ligne colorée indiquant que le test a bien fonctionné (contrôle positif). Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de test immunochromatographique a les dimensions suivantes : 1 à 20 cm de longueur, de préférence 2 à 15 cm et plus préférentiellement de 5 à 10 cm de longueur, 5 à 20 mm de largeur, de préférence 5 à 10 mm de largeur et 0.1 à 2 mm d'épaisseur. La zone de détection est espacée de la zone de contrôle de 0,5 à 5 cm. La zone de conjugué est espacée de la zone de détection de 0,5 à 5 cm. Dans un mode de réalisation de l'invention, le dispositif de test immunochromatographique selon l'invention est intégré dans un support de préhension. Ce support de préhension peut envelopper partiellement ou totalement la membrane poreuse. Généralement, ce support a une forme de boitier qui facilite la manipulation du dispositif et protège celui-ci de l'humidité notamment. Le support de préhension peut être réalisé à partir de matériaux divers tels que du carton, du carton plastifié ou des matières plastiques, de préférence, le matériau utilisé est rigide et imperméable. Le support de préhension sera pourvu d'au moins une fenêtre d'observation correspondant à la zone de détection et la zone de contrôle. Dans un mode de réalisation, le dispositif de test immunochromatographique comprend une partie saillante par rapport au support de préhension qui permet de mettre en contact le dispositif avec l'échantillon à tester. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le support de préhension comprend une ouverture pour le dépôt de l'échantillon sur le dispositif au niveau de la zone de dépôt. De préférence, les dispositifs ne sont pas intégrés dans un support de préhension, de façon à pouvoir être placés directement dans le tube ayant servi à faire la culture ; plusieurs de ces dispositifs non intégrés sont emballés dans un tube avec dessicant, pour assurer leur conservation. Il est aussi possible que chaque dispositif soit emballé de façon individuelle. Le dispositif de test immunochromatographique selon l'invention présente également l'avantage de pouvoir être conservé pendant plus d'un an à température ambiante ou à +4°C. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif de test immunochromatographique tel que décrit précédemment est un dispositif multiplex permettant de détecter simultanément la présence de l'antigène protecteur PA, et d'un ou de deux des facteurs suivants : facteur létal LF, facteur oedémateux EF. Selon un premier mode de réalisation, la membrane poreuse du dispositif comprend: - une zone de conjugué dans laquelle est immobilisé - un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA complexé avec un marqueur et/ou, - un premier anticorps dirigé contre le facteur létal LF complexé avec un marqueur, et/ou - un premier anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF complexé avec un marqueur, - d'une première zone de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA et, - d'une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur létal LF, et/ou - d'une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF, et - d'une zone de contrôle dans laquelle est immobilisé un agent de capture du premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA et/ou du premier anticorps dirigé contre le facteur métal LF et/ou du premier anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF, ou un agent de capture du marqueur. Dans ce mode de réalisation, la première zone de détection est distincte de la ou des zones additionnelles de détection. Par exemple, lorsque le marqueur utilisé est des particules colloïdales d'or et l'agent de capture est de l'argent ou de la polylysine, la présence d'antigène protecteur PA, de facteur létal LF et/ou de facteur oedémateux EF est révélée par la présence de deux ou trois lignes colorées. Selon un autre mode de réalisation, une seule zone de détection est réalisée par dépôt de 20 plusieurs anticorps simultanément mais les marqueurs peuvent être distingués lors de la lecture du test. Selon un troisième mode de réalisation de test multiplex, le dispositif consiste en deux dispositifs adossés l'un à l'autre, permettant de détecter sur une face l'antigène protecteur 25 et sur l'autre face le facteur létal LF ou le facteur oedémateux EF. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre le facteur létal LF ou contre le facteur oedémateux EF est un anticorps monoclonal. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'anticorps dirigé contre le facteur létal 30 LF ou contre le facteur oedémateux EF est un anticorps polyclonal. Des exemples d'anticorps dirigé contre LF sont les anticorps sc-17420, sc-52055, sc-52054 (Santa Cruz Technologies). Des exemples d'anticorps dirigé contre EF sont les anticorps sc-17416, sc-28578, sc-68481, sc-130371, sc-68483, sc-68484, sc-68485, sc-68324, sc-68325, sc-101035, sc-133538 (Santa Cruz Technologies). Selon l'invention, le second anticorps dirigé contre le facteur létal LF ou contre le facteur oedémateux EF n'entre pas en compétition avec le premier anticorps dirigé contre le facteur létal LF ou contre le facteur oedémateux EF complexé au marqueur. Par �n'entre pas en compétition�, on entend que ces deux anticorps ne se lient pas au même épitope du facteur létal LF ou du facteur oedémateux EF. Il est nécessaire que le premier anticorps ne se lie pas à un épitope qui empêcherait la liaison du second anticorps à son antigène. Un autre objet de l'invention est un kit permettant de détecter, dans un échantillon suspect, des spores de B. anthracis, indirectement par induction de la sécrétion puis détection de l'antigène protecteur PA, ledit kit comprenant : - optionnellement au moins un écouvillon - au moins un container contenant du sérum animal tel que décrit précédemment, ledit container devant être conservé à une température négative, inhibant la croissance bactérienne et préservant les qualités du sérum pour la culture, et - au moins un moyen permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. Selon l'invention, ledit dispositif permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique, un dispositif de test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, dont l'antigène n'est pas élué mais détecté par un anticorps conjugué à un système de marquage, ou un anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA permettant sa détection par un test électrochimiolumiscent (ECL) ou encore un test ELISA. Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit dispositif permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne. Un exemple de ce type de dispositif est celui commercialisé par la société Senova (Allemagne). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, ledit dispositif permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique tel que décrit précédemment. Selon ce mode de réalisation, ledit kit peut comprendre deux parties : - dans une première partie: au moins un écouvillon et au moins un dispositif de test immunochromatographique tel que décrit précédemment, ledit dispositif de test immunochromatographique pouvant être conservé à température ambiante ou à +4°C, et - dans une seconde partie, au moins un container contenant du sérum animal tel que décrit précédemment, ledit container devant être conservé à une température négative, inhibant la croissance bactérienne et préservant les qualités du sérum pour la culture Dans un mode de réalisation de l'invention, la seconde partie du kit comprend plusieurs containers à usage unique contenant du sérum. Chaque container sert ainsi à la culture d'un seul échantillon. Ce mode de réalisation a 15 l'avantage d'éviter toute contamination entre les différentes réalisations du test. Le kit selon l'invention pourra également comprendre un manuel d'instructions. Dans un autre mode de réalisation, le kit pourra également comprendre un container 20 contenant un témoin positif sous la forme de spores d'une souche non pathogène de B. anthracis secrétant PA, et le cas échéant EF ou LF. Un exemple de cette souche est la souche acapsulée, vaccinale, Sterne ou STI. Dans un autre mode de réalisation du test, un témoin d'inhibition pourra également être 25 réalisé en ajoutant au témoin positif une quantité d'échantillon à analyser égale ou supérieure à la quantité utilisée dans le test principal. Ce témoin d'inhibition permet de vérifier que l'échantillon à analyser ne contient pas d'élément susceptible d'inhiber la sécrétion ou la détection de l'antigène protecteur PA et/ou de EF et/ou de LF. 30 D'autres aspects, objets, avantages et caractéristiques de l'invention, seront présentés à la lecture des exemples non restrictifs qui suivent et qui décrivent des modes de réalisation préférés de l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES Figurel : Photographie des tests immunochromatographiques obtenus pour 9, 10, 11 et 12 heures de cultures pour différentes concentrations de bactéries. ZD correspond à la zone de détection et ZC correspond à zone de contrôle. EXAMPLES Matériels et méthodes Dispositif de test immunochromatographique Un anticorps polyclonal de lapin (n°CRSSA/704776) dirigé contre PA a été obtenu selon les techniques habituelles d'immunisation développées à cet effet. L'antigène protecteur PA83 recombinant provient de la société List Biological 15 laboratories (Cambell, USA). Des lapins de souche � New Zealand � ont été immunisés par des injections de PA en présence d'adjuvant de Freund. Cet anticorps polyclonal a été purifié sur des colonnes Hi-Trap Protéine A HP (Amersham Pharmacia, Orsay, France), puis dilué à 1 mg/ml et déposé par 20 pulvérisation sur la nitrocellulose d'une Membrane Test Platform (MTP, Whatman, Maidstone, G.B.), à un centimètre de sa partie basse et à la dose de 1 �l/cm. Le réactif du témoin de migration (Goldline, British Biocell International, Cardiff, G.B.) a été déposé de même, mais à 1,9 cm de la partie basse de la nitrocellulose de la MTP. 25 La membrane a ensuite été séchée 2 heures à 37°C. 5 �l de nanobilles d'or (anti-mouse IgG, 40nm, OD10, British Biocell International) ont été préalablement coatées (1h, 37°C) par 10 ng de l'anticorps BAP0105 (AbCys, Paris, France), puis elles ont été adsorbés sur une membrane pour conjugué (� conjugate pad � n°7, Alchemy Laboratories Ltd, Dundee, G.B.), placée en bas de la 30 MTP.10 A la partie supérieure de la MTP a été fixée une membrane absorbante (Absorbent pad, Whatman). Les membranes assemblées sont coupées (Guillotine cutter, Alchemy) pour former une bandelette de 5 mm de large. Méthode Le prélèvement (contenant éventuellement une ou plusieurs spores de B. anthracis) est cultivé en présence de 500 �l de sérum animal (sérum de veau fétal) à 35°C, en présence de 10% de CO2, pendant 10 heures au moins. Il est souhaitable de réaliser en plus une culture qui serve de témoin positif et une autre, servant de témoin d'inhibition (culture d'une ou plusieurs spores de la souche Sterne ajoutées à un prélèvement identique au prélèvement à tester, pour s'assurer que le prélèvement n'inhibe pas le procédé). 100 �l de la culture préalablement obtenue sont prélevés et placés dans un tube de verre dans lequel le test est ensuite introduit, provoquant la migration de la culture dans 15 le test par capillarité. La lecture du test se fait lorsque la membrane de nitrocellulose est sèche, soit environ 30 minutes après le début de la migration. Résultats 20 Le procédé a été utilisé en triplicate, après inoculation d'une quantité moyenne de 1,2 spore de la souche 9602 de B. anthracis, suivi d'une étape de culture pendant des durées de 9, 10, 11 et 12 heures. Des photographies des tests immunochromatographiques ont été réalisées (Figure 1). Les cultures ont été numérées au moment de la réalisation du test. 25 Aucun signal n'est visible sur le témoin négatif ni après la 9 et la 10ème heure de culture. Un signal est identifiable dès la 1 l ème heure sur la bandelette n°3 (correspondant à une culture contenant à 4x106 bactéries). Il existe par ailleurs un signal faible (difficilement visible sur la photographie) sur la bandelette n°2, et aucun sur la bandelette n°1. A la 12ème heure, il s'avère que la culture n°l ne contenait pas de bactéries : elle n'avait donc pas reçu de spore lors de l'inoculation, comme statistiquement il était possible compte tenu du faible inoculum choisi pour cet essai. Cette culture n° 1 constitue donc un second témoin négatif de l'expérience et la bandelette n°l correspondante ne montre effectivement pas de signal. Les bandelettes n°2 et 3 obtenues après la 12ème heure de culture effective (correspondant respectivement à des cultures contenant 5x106 et 3x106 bactéries) montrent un signal bien identifiable, comme il était attendu. Des résultats équivalents ont été obtenus en utilisant la souche vaccinale Sterne et à l'United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (Frederick, USA), en utilisant la souche vaccinale STI et la souche létale de référence Ames Il a été mis en évidence que ce test immunochromatographique a une sensibilité de 10 ng d'antigène protecteur PA/ml.15 REVENDICATIONS1. Méthode de détection dans un échantillon de spores de B. anthracis, par culture, induction de sécrétion puis détection de la présence d'antigène protecteur PA dans le 5 milieu de culture, ladite méthode comprenant : - mettre en culture un échantillon en présence de sérum pendant au minimum 6 heures, et - réaliser sur un échantillon ou la totalité de la culture obtenue précédemment, un test immunologique comprenant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. 10 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle ledit échantillon est un échantillon environnemental ou un échantillon biologique. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le sérum est du sérum de veau fétal. 4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le test immunologique est un test immunochromatographique, un test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, un test électrochimiolumiscent ou un test ELISA. 20 5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle le test immunologique est un test immunochrommatographique. 6. Dispositif de test immunochromatographique pour détecter dans un échantillon la 25 présence d'antigène protecteur PA, ledit dispositif comprenant une membrane poreuse pourvue : - d'une zone de conjugué dans laquelle est immobilisé un premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA complexé avec un marqueur, - d'une zone de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre 30 l'antigène protecteur PA, et 15- d'une zone de contrôle dans laquelle est immobilisé un agent de capture du premier anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA ou un agent de capture du marqueur. 7. Dispositif selon la revendication 6, dans lequel le marqueur est des particules colloïdales d'or. 8. Dispositif selon la revendication 6 ou 7, dans lequel l'agent de capture est de l'argent. 9. Dispositif selon l'une des revendications 6 à 8, dans lequel - la zone de conjugué de la membrane poreuse comprend également un premier anticorps dirigé contre le facteur létal LF complexé avec un marqueur, et/ou un premier anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF complexé avec un marqueur, et - la membrane poreuse comprend également une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur létal LF, et/ou une zone additionnelle de détection dans laquelle est immobilisé un second anticorps dirigé contre le facteur oedémateux EF, ledit dispositif permettant de détecter simultanément la présence de l'antigène protecteur PA, et de l'un ou des deux des facteurs LF et/ou EF. 10. Kit permettant de détecter dans un échantillon suspect des spores de B. anthracis ou l'antigène protecteur PA, ledit kit comprenant : - au moins un container contenant du sérum animal, et - au moins un moyen permettant la détection immunologique de l'antigène protecteur PA. 11. Kit selon la revendication 10, comprenant également au moins un écouvillon. 12. Kit selon la revendication 10 ou 11, comprenant également un témoin positif sous la forme de spores d'une souche non pathogène de B. anthracis secrétant PA, et comprenant optionnellement un témoin d'inhibition sous la forme de spores d'une souche non pathogène de B. anthracis secrétant PA auquel est ajouté l'échantillon à tester pour s'assurer qu'il n'inhibe pas le procédé. 13. Kit selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel ledit moyen de détecter l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique, un dispositif de test immuno-enzymatique comprenant une étape d'immuno-capture sur colonne, ou un anticorps dirigé contre l'antigène protecteur PA permettant sa détection par un test électrochimiolumiscent ou encore un test ELISA. 14. Kit selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, dans lequel ledit moyen de détecter l'antigène protecteur PA est un dispositif de test immunochromatographique selon l'une des revendications 6 à 9.