Brevet FR2947340A1 — publié le 20101231

La présente invention est relative à l'identification d'un marqueur qui apparaît dans des cellules tumorales d'origines tissulaires diverses et qui présente des propriétés mitogènes et de stimulation de l'invasivité tumorale sur des cellules en culture et sur des tumeurs implantées chez le rongeur. L'invention comprend aussi la détection qualitative de ce marqueur et son dosage dans des matériaux biologiques en utilisant une combinaison de procédures chimiques et/ou immunologiques. L'invention permet, en outre, de qualifier des molécules comme agents ayant des propriétés anticancéreuses et/ou chimio-préventives des cancers. On entend ici par � matériau biologique � un tissu biologique, une préparation ou un extrait issu de tissu biologique, liquide ou solide ; le matériau peut aussi être un mélange d'au moins deux matériaux tels que ci-dessus définis. Un tel matériau biologique peut donc être, notamment, soit préparé à partir de tissus, d'organes, de selles ou de liquides biologiques d'un homme ou d'un mammifère, soit obtenu à partir de cultures cellulaires � in vitro � ; un tel matériau biologique peut aussi être un sérum, du plasma, de l'urine, du liquide céphalorachidien, du liquide synovial, du liquide péritonéal, du liquide pleural, du liquide séminal ou du liquide ascitique. Le cholestérol et les produits d'oxydation du cholestérol sont soupçonnés depuis longtemps de présenter des propriétés carcinogènes chez l'homme (Fritz Bishof, Advance in Lipid Research, vol 7, p. 165-244, 1969). Ces effets ont été initialement observés sur un nombre limité d'espèces de rongeurs et ont conduit à des observations contradictoires qui ont entraîné un désintéressement de la communauté scientifique sur ce sujet (Leland L Smith et al., Free Radical Biology and Medecine, Vol , p. 285-332, 1989). Certains produits d'oxydation du cholestérol sont connus pour apparaître lors du catabolisme du cholestérol et de la production des hormones stéroïdes. Un certain nombre d'oxystérols jouent un rôle physiologique clé dans le système immunitaire, le système nerveux et le système cardiovasculaire. Les cibles connues des oxystérols sont des facteurs de transcription ligands-dépendant, dont les plus connus sont les récepteurs LXR(liver-X-receptor). Les oxysterols modulent le transport intracellulaire du cholestérol, la formation de micro-domaines lipidiques, l'activation des voies de HedgeHog impliquées dans la morphogenèse lors du développement embryonnaire ; ils ont aussi des propriétés antagonistes sur les récepteurs des hydrocarbures aromatiques. On a indiqué que certains oxystérols modulent l'activité d'enzymes impliqués dans le métabolisme du cholestérol et, notamment, dans la biosynthèse de mévalonate (HMG-CoA-réductase), l'esterification du cholestérol, l'hydrolyse des époxydes de cholestérol (voir Schroefper G. Jr. : Physiological Reviews, Vol 80, N°1, p. 362-521, 2000). On a noté aussi que, selon la nature du groupement oxygéné (alcool, carbonyle, hydroperoxyde, peroxyde ou époxyde), sa position sur le squelette hydrocarboné du cholestérol, son orientation dans l'espace et le nombre de groupements oxygénés sur ledit squelette hydrocarboné, un produit d'oxydation du cholestérol peut présenter des propriétés de reconnaissance spécifiques de différentes cibles biologiques (membranes, enzymes, récepteurs). Selon l'invention, on a constaté que le cholestane-3B,5a-diol-6-one (OCDO) était présent dans des lignées tumorales d'origine tissulaire variées. On a caractérisé les propriétés de cette molécule dans la mitogenèse tumorale et, in vitro, dans l'invasivité sur des cellules et sur des tumeurs implantées chez le rongeur. On a, de plus, montré que cette molécule entraîne, dans les cellules tumorales, une stimulation de l'expression de cytokines immunosuppressives alors qu'elle diminue l'expression de cytokines immunostimulantes, ce qui est en accord avec une immuno-suppression au voisinage de la tumeur favorisant son développement et son invasivité. On sait que la cholestérol-époxyde hydrolase (ChEH) est une enzyme responsable de l'hydrolyse de l'époxyde de cholestérol (CE) en 10 cholestane triol (CT) selon la réaction suivante : ChEH 15 (voir de Médina et al, Faseb J. 19(4) : A285 û A285, Part I Suppl. S, 04 Mars 2005) Dans un premier temps, les demanderesses ont comparé l'activité de la ChEH pour des extraits cellulaires obtenus à partir de cellules de tissus normaux et à partir de cellules tumorales : l'activité de la ChEH peut être 20 observée en séparant par chromatographie sur couche mince, le substrat CE par rapport au produit CT de la ChEH. La visualisation des taches correspondant aux composés CE et CT a été réalisée par radiomarquage à 14C. Le détail de l'expérimentation est fourni à l'essai 1 détaillé plus loin et le résultat est représenté sur la figure 1. Les demanderesses ont constaté, que les cellules normales permettaient de visualiser deux taches correspondant aux composés CE et CT, mais qu'en revanche, de façon surprenante, les cellules tumorales faisaient apparaître trois taches, à savoir l'une correspondant au cholestane triol (CT), la deuxième correspondant à l'époxyde de cholestérol (CE) (faible par rapport à la tache correspondante relative aux cellules normales), et une troisième tache proche de celle du composé CE mais néanmoins parfaitement distincte. On sait que le tamoxyfène (tam), utilisé de façon connue comme agent anticancéreux réducteur de tumeurs pour le traitement et la prévention des cancers du sein, est un inhibiteur de la ChEH et qu'il en est de même pour le PBPE (N,N-pyrrolidino-[(4-benzyl-phenoxy]-éthanamine) qui est un agent anti-prolifératif connu (voir à cet égard la référence de publication donnée dans l'essai 2 de la présente demande). Ni cette � troisième tache �, que les demanderesses ont attribuée à un métabolite M, ni la tache CT n'existent, si les cellules tumorales sont traitées au tamoxyfène. Sachant que le tamoxyfène inhibe la ChEH, on a recherché, dans un deuxième temps, si l'inhibition de la ChEH pouvait être à l'origine de l'apparition de la � troisième tache � sur la plaque de chromatographie des cellules tumorales traitées. Les détails de cette expérience sont fournis à l'essai 2 décrit plus loin et les résultats sont représentés sur les figures 3A et 3B. Pour ce faire, on a effectué, sur des extraits de cellules tumorales traitées respectivement au tamoxyfène ou au PBPE, une inhibition de l'activité ChEH, l'incubation des cellules par l'inhibiteur étant maintenue pendant trois jours, avec des doses croissantes d'inhibiteur pour les essais successifs. Et on a constaté, sur les chromatographies en couche mince que, lorsque la dose d'inhibiteur augmente, le composé CT disparaît en même temps que la � troisième tache � voisine de celle du composé CE. Selon l'invention, la demanderesse en a déduit que le métabolite M relatif à la � troisième tache � était probablement un dérivé du composé CT Dans un troisième temps, les demanderesses ont complété cette expérimentation en établissant que la formation du métabolite M correspondant à la � troisième tache � s'effectuait progressivement, après une incubation de plus de 24 heures avec l'inhibiteur tamoxifène de la ChEH, au détriment de la formation du composé CE ; et ce phénomène se produit avec les deux isomères a et B du composé CE. Ce complément de démonstration est détaillé à l'essai 3 et représenté sur les figures 2A et 2B. Les demanderesses en ont donc conclu, selon l'invention, que le produit relatif à la � troisième tache �, est un produit de transformation du composé CT, qui a un comportement chromatographique proche de celui du composé CE mais est retenu de façon plus importante par le support de chromatographie, ce qui indique que le métabolite M associé à la � troisième tache � est un composé ayant une polarité intermédiaire entre celles des composés CT et CE et ayant une structure voisine de celle des deux molécules CE et CT. L'essai 4 détaillé plus loin, fournit toutes les précisions de l'étude menée pour confirmer que le métabolite M de la � troisième tache � provient d'une transformation du composé CT ; le résultat de cet essai est représenté sur la figure 4. Enfin, l'essai 5 décrit la méthode, qui a permis l'identification chimique du produit correspondant à cette � troisième tache �. Les demanderesses ont donc établi, selon l'invention, que cette � troisième tache �, qui apparaît uniquement avec les cellules tumorales testées, est due au 6-oxo-cholestan-3B,5a-diol (OCDO) correspondant à la formule ci-dessous : Le produit OCDO n'est pas un produit nouveau : il a été décrit comme un produit d'oxydation du Cholestane-313,5a,613-triol (CT) par la N-bromosuccinimide (Fieser L. F. et ; Rajagopalan S.: Selective oxydation with N-bromosuccinimide. II. Cholestane-3B,5a,6B-triol, The Journal of the American Chemical Society, 71, p. 3938-41, 1949). La synthèse chimique de l'OCDO avait, d'ailleurs déjà été décrite en 1908 (Robert Howson Pickardet al., J. Chem. Soc. Trans. vol 93, p. 1678-1687, 1908). L'existence de cette molécule comme métabolite issu de la transformation du cholestane-3B,5a,6B-triol a été rapportée en 1971 : on a indiqué que l'OCDO pouvait être retrouvé dans les féces de rat gavé avec du cholestane-3B,5a,6B-triol (Roscoe HG, Fahrenbach MJ, J Lipid Research, vol 12, P. 17-23, 1971). On a aussi indiqué que l'OCDO pouvait être trouvé dans le sérum de bovin et le sang humain à une concentration comprise entre 10 et 100 nM (Yamaguchi M. et al, Biol. Pharm. 20(9), p. 1044-46, 1997). On va donner ci-après la procédure expérimentale détaillée mise en oeuvre pour les essais 1 à 5, qui ont permis d'aboutir à l'identification du marqueur OCDO. Pour les essais 1 à 5 et dans certains des exemples donnés plus loin dans cette demande de brevet, on a utilisé des cellules tumorales MCF7, qui proviennent de l'American Tissue Culture Collection (ATCC). Ces cellules sont cultivées dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 2g/litre de carbonate de sodium aqueux, 1,2mM de glutamine (pH 7,4 à 23°C) et 5% de sérum bovin foetal (Gibco), à 37°C sous 5% CO2, et 2,5 ml d'antibiotiques (pénicilline/streptomycine) par litre de milieu. On désire étudier l'activité de la ChEH dans des cellules de souris par chromatographie sur couche mince de silice. Les composés que l'on désire visualiser sont les composés CE et CT précédemment définis. Afin de visualiser les taches correspondant à CE et CT sur une plaque de chromatographie, on a synthétisé les composés CE et CT marqués au 14C a) Synthèse du 5-6Bépoxycholestan-313-ol[14C] et du 5-6a époxycholestan-3B-ol [14c]. On dissout 0,35 �mol de cholestérol [14C] (58 mCi/mmol) dans 200 �l de dichlorométhane en présence de 0,56 Ilmol d'acide métachloroperbenzoïque. La solution est agitée à température ambiante pendant 5 heures. Le mélange réactionnel est dissout dans 1 ml de dichlorométhane, lavé avec du sulfite de sodium aqueux (10 % en poids), de l'hydrogénocarbonate de sodium (solution acqueuse à 5% en poids) et d'une solution saturée en chlorure de sodium. La phase organique est évaporée et le résidu est purifié par RP-HPLC (colonne hydrophobe Ultrasep ES C18 61.rm) en condition isocratique CH3OH/H2O (95/5 en volume) à 0.7 ml/mn. Les isomères a et B sont facilement séparés dans ces conditions et détectés par un détecteur de radioactivité (Berthold). Le rendement total de la réaction est de 80 % ; le produit obtenu contient 75 % d'isomère a (CEa) et 25 % d'isomère B (CEB). b) Synthèse du cholestan 3B,5a,6B triol[14C] Ce composé a été synthétisé à partir 5-613époxycholestan-313-ol[14C] comme décrit dans la littérature (Pulfer MK and Murphy RC, Formation of biologically active oxysterols during ozonolysis of cholesterol present in lung surfactant, J. Biol Chem, vol 279(25) p. 26331-26338, 2004). Le CEB[14C] préparé sous a) ci-dessus (58 mCi/mmol) est dissout dans 1 ml d'un mélange tétrahydrofurane/H2O/acétone (v/v/v, 4:1 : 0.5). 125�l d'acide perchlorique sont ajoutés au mélange réactionnel, qui est agité pendant 4 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est dilué dans 1 ml de dichlorométhane puis lavé à l'hydrogénocarbonate de sodium (solution aqueuse à 5 % en poids) et à l'eau. Le résidu est purifié par HPLC sur colonne hydrophobe (Ultrasep ES C18 6 �m) en condition isocratique CH3OH/H20 (95/5 en volume) à un débit de 0.7 ml/mn. On obtient le CT[14C] avec un rendement de 62%. Pour être utilisées dans les essais 1 à 5 qui suivent, les cellules sont ensemencées dans des plaques 6 puits à une densité de 80000 cellules dans un volume de 2 ml. Trente six heures après ensemencement, les cellules sont traitées pendant 15 minutes soit par du solvant véhicule (éthanol à 1%o dans un tampon PBS), soit par les composés que l'on désire tester ; cette incubation est donc, selon les besoins de l'essai, effectuée avec les composés CE a[14C] (0.6�M, 15 �Ci/�mol) et CE B[14C] (0,6 �M, 15iCi/�mol) ou CT [14C] (1 �M, 15 �Ci/�mol), la proportion de solvant ne dépasse pas 2 %o par rapport au volume du milieu de culture. Après le temps d'incubation que l'on désire pour l'essai, le milieu est collecté, les cellules sont lavées par du PBS (tampon phosphate) froid (2 ml par puit) poolé avec le milieu. Les cellules sont alors grattées dans du PBS froid (1 ml pour 3 puits) ; les puits sont à nouveau rincés par du PBS froid (1 ml pour 3 puits). La suspension cellulaire obtenue est centrifugée à 1000 t/rnn pendant 5 mn à 4°C. Le culot cellulaire et le milieu sont extraits par la méthode de Folch modifiée (telle que publiée par Ways P. et al., Journal of lipid Research, 5(3) : 318 (1964)). Dans toute la suite de cette description, le solvant véhicule utilisé est le même que celui-ci-dessus défini. Les radioactivités aqueuse et organique sont comptées. Les phases organiques sont ramenées à sec sous argon. Le résidu est resuspendu dans 60 gl d'éthanol puis déposé, à raison de 20 pl par piste, sur les plaques de silice sur verre (LK-6-DFWhatman 20x20), que l'on utilise dans les différents essais (ces plaques ayant été préalablement chauffées à 100°C pendant 1 heure). Le solvant de migration utilisé est l'acétate d'éthyle. Les plaques de chromatographie sont placées en contact avec une plaque � Phosphor-screen � dans une cassette pendant une nuit. Le � Phosphor-screen � est révélé avec un � Phosphor Imager � de type Storm. Pour évaluer le caractère plus ou moins dense des taches obtenues sur les plaques, on quantifie la radioactivité par densitométrie avec le programme informatique � Imagequant �(TM). Essai 1 Dans cet essai 1, on a mis en évidence l'activité de la ChEH dans des cellules de souris saines et dans des cellules de souris tumorales MCF7. On procède par chromatographie en couche mince selon les techniques qui viennent d'être exposées. Les résultats sont présentés sur la figure 1. Sur cette figure, on voit que tous les dépôts ont été faits au même niveau repéré par un trait mixte en bas des pistes. Sur la piste de gauche, on a déposé le composé CE[14C] préalablement préparé comme indiqué ci-dessus (0,6�M, 15tCi/�mol). Les pistes médiane et de droite correspondent à des extraits de cellules préalablement incubées dans CE[14C] selon la technique précédemment exposée. L'extrait cellulaire déposé en bas de la piste de droite, est un extrait correspondant à des hépatocytes normaux prélevés sur des souris adultes C57/B6 de 20-25 g (fournies par Charles Rivers). Les hépatocytes ont été isolés par perfusion de collagénase selon le protocole de Davis (Davis RA et al, J. Biol Chem, 1979, Vol. 254, N° 6, p. 2010-2016) et mis en culture dans des boites de Pétri de 6 cm de diamètre recouverte de collagène, à une densité de 2 millions de cellules par boite, dans du milieu nutritif � Dulbecco modified eagle medium � (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal, de l'insuline (0.5 U/ml) et des antibiotiques (50 unités/ml) (un mélange pénicilline et streptomycine). Les boites sont maintenues à 37°C dans une étuve humide avec 5% de CO2. Après adhérence des cellules, le milieu nutritif est remplacé par du milieu neuf après avoir effectué un lavage des cellules avec du tampon PBS de façon à éliminer les débris cellulaires. Les cellules sont utilisées dès le lendemain pour le test. On voit, sur la piste de droite de la figure 1, que le composé CT apparaît en premier et que le composé CE se trouve sensiblement au niveau de celui qui a été déposé directement sur la piste de gauche. Le composé CT formé provient nécessairement du composé CE transformé par l'hydrolase ChEH, puisque l'un et l'autre apparaissent sur la chromatographie, alors qu'initialement, seul le composé marqué CE était déposé et susceptible d'apparaître. En revanche, sur la piste médiane, on a déposé des extraits de cellules de souris tumorales MCF7 ; cet extrait cellulaire est préparé à partir de cellules MCF7 cultivées de la même façon que l'extrait d'hépatocytes à partir des cellules de souris C57/B16. On constate une tache correspondant au composé CT puis deux taches, proches l'une de l'autre, correspondant l'une au composé CE de la piste de droite et l'autre à un métabolite M non identifié ; de plus, cette � troisième tache � est plus intense que celle correspondant au composé CE. On en a donc déduit que, dans les cellules tumorales, une partie du composé CE avait été transformé en un métabolite M ayant un comportement chromatographique proche de celui du composé CE et ayant une polarité intermédiaire entre celles des composés CE et CT. Essai 2 On a recherché si l'apparition de la � troisième tache � sur la plaque de chromatographie de l'essai 1, était ou non affectée par une inhibition de la ChEH, qui, dans la cellule, donne naissance au composé CT à partir du composé CE. On sait que la ChEH est inhibée par le tamoxifène (Tam) et par la PBPE (FASEB Journal, Vol. 19, Issue 4, p. A285-A285, Part 1 Suppl. S). Pour cet essai, on a donc utilisé ces deux inhibiteurs. Pour ce faire, on a déposé sur une plaque de chromatographie, du même type que celle utilisée pour l'essai 1, des extraits cellulaires de cellules tumorales MCF7 incubées dans une solution de CE (-a ou-B) [14C] comme indiqué à l'essai 1, puis, ensuite, incubées dans une solution aqueuse d'inhibiteur de ChEH, tamoxifène ou PBPE, pendant 3 jours. Quand on utilise une incubation avec CE-a[14C], on met en oeuvre des solutions de tamoxifène à des concentrations de 1.10-2, 1.10-1, 5.10-1, 1, 2,5 et 5�M (figure 3A) ; quand on utilise une incubation avec le CEB[14C], on met en oeuvre des solutions de PBPE à des concentrations de 1.102, 1.10-1, 1, 5 et 10 gM (figure 3B) ; les figures 3A et 3B représentent les plaques chromatographiques obtenues dans les deux cas. On constate que, pour les fortes quantités de l'inhibiteur d'incubation, on a disparition du composé CT et, simultanément, disparition de la � troisième tache � due au métabolite M ; au contraire, pour de faibles quantités d'inhibiteur, la tache du composé CT est importante de même que la tache due au métabolite M alors que les taches dues au CE sont faibles ce qui montre que le CE a été transformé en (CT+ métabolite) ; on en conclut que l'hydrolase ChEH, quand elle est peu inhibée, laisse apparaître le CT et que, dès lors, la tache du métabolite M apparaît également. Essai 3 On a étudié la cinétique de l'activité de la ChEH dans des cellules MCF7 en utilisant le composé CE (-a ou -B) marqué au [14C]. Comme dans l'essai 2, les cellules sont incubées au CE (-a ou -B)[14C]. Les extraits sont déposés sur les plaques de chromatographie après des temps d'incubation de 4, 8, 16, 24, 48 et 72 heures : les plaques obtenues sont représentées sur les figures 2A (pour CE-a) et 2B (pour CE-(3) Les dépôts, comme pour les figures 1 et 3A, 3B ont été faits au même niveau repéré par un trait mixte en bas des pistes. Pour un délai d'incubation court, on voit que le composé CE n'a pas le temps d'être beaucoup transformé en composé CT ; mais si le temps d'incubation augmente, la ChEH transforme de plus en plus le composé CE en composé CT, de sorte que les taches CT sont plus denses alors que les taches CE deviennent plus claires ; et simultanément, lorsque le composé CT apparaît, on voit apparaître les � troisièmes taches � correspondant à un métabolite M. La demanderesse a donc considéré comme vraisemblable que le métabolite M de la � troisième tache � était un dérivé du composé CT. Essai 4 Pour vérifier les conclusions tirées des exemples 1 à 3, on a incubé des cellules MCF7 avec le composé CT [14C] pendant des temps de 24, 48 et 72 heures en utilisant les procédures ci-dessus définies. Les extraits cellulaires ont ensuite été obtenus comme indiqué à l'essai 1 et déposés sur une plaque de chromatographie (voir figure 4). La piste de gauche de la plaque reçoit un dépôt de CE[14C] et la piste voisine reçoit un dépôt de CT[14C], comme témoins de migration ; les trois autres pistes correspondent aux extraits cellulaires testés après incubation. On constate que, pour une incubation d'une durée de 24 heures, on voit sur la piste de l'extrait cellulaire une tache correspondant à celle du métabolite voisin de la tache du composé CE [14C]. Cette tache est d'autant plus dense que le temps d'incubation est plus grand et plus la tache du métabolite M est sombre, plus celle du composé CT s'éclaircit. Ceci confirme que le métabolite est bien un produit de transformation du composé CT Essai 5 Pour identifier la structure chimique du métabolite apparu dans les essais 1 à 4, on a utilisé une technique en plusieurs étapes. Des cellules MCF7 ont été ensemencées à 0,4 106 cellules par boîte de Pétri (diamètre 100 mm) dans 10 ml du milieu défini à l'essai 1. Trente six heures après l'ensemencement, les cellules ont été incubées, à une concentration de 10 �M, pour les unes dans du CEa ou pour les autres dans du CEa[14C] obtenu comme indiqué précédemment. Après soixante douze heures, les cellules sont lavées par du PBS (tampon phosphate) froid, puis sont grattées dans du PBS froid et centrifugées à 1000 tours/mn pendant 5 minutes à 4°C. Le culot cellulaire et le milieu sont extraits par la méthode de Folch modifiée (voir la référence déjà fournie en page 9 du présent texte). La phase organique est évaporée, resuspendue dans du méthanol puis passée sur une cartouche RP C18 (Sep-Pack de la société Waters). La cartouche est ensuite lavée au méthanol. Après évaporation, le résidu est dissout dans 20�l d'éthanol puis purifié par HPLC en phase inverse (colonne hydrophobe � Ultrasep �) en utilisant des conditions isocratiques : CH3OH/H2O (95/5 en volume) à 0,7 ml/mn. Des fractions de 1 mn sont collectées à la sortie de la colonne et la radioactivité est décomptée afin de déterminer les temps de rétention des composés marqués et notamment du métabolite issu du CEa[14C]. Les fractions radioactives sont analysées par chromatographie sur couche mince en utilisant l'acétate d'éthyle comme solvant de migration. Les fractions HPLC d'intérêt issues des cellules MCF7 traitées par le CEa froid sont analysées par spectrographie de masse en impact électronique (70 ev) et ionisation chimique (voir le spectre sur la figure 5). On a ainsi déterminé que le CT produit par les cellules MCF7 a une masse de 420 et un comportement chromatographique similaire à celui du CT commercial. La spectrométrie de masse du métabolite existant dans les extraits de cellules MCF7 et purifié comme indiqué ci-dessus, donne une masse de 418 soit une perte de 2 unités de masse par rapport au composé CT. Comme on l'a vu à partir des essais 1 à 4, le métabolite provient de la biotransformation du composé CT : la différence de masse correspond donc à une perte de 2 atomes d'hydrogène. Ceci suggère l'apparition d'une fonction cétone ou l'apparition d'une double liaison sur le composé CT. L'analyse en infrarouge montre l'apparition d'une bande caractéristique d'une fonction cétone, ce qui démontre la formation du 6-oxo-cholestan-313,5a-diol (OCDO). La structure du composé OCDO correspond à un produit de déshydrogénation du composé CT sur le groupement hydroxyl porté sur le carbone 6 du noyau. Les propriétés chromatographiques et le profil de fragmentation en spectrométrie de masse du métabolite sont identiques à ceux du standard commercial fourni par la société � Steraloîds � pour le composé OCDO, ce qui démontre l'identité entre ces deux molécules. L'invention a, en conséquence, pour objet une méthode de diagnostic pour détecter l'état oncogénique et/ou mitogénique de cellules prélevées à partir d'un matériau biologique provenant d'un sujet humain ou d'un animal mammifère, caractérisée en ce que l'on détermine par un moyen révélateur si les cellules prélevées contiennent, en quantité significative, le composé OCDO de formule HO (6-oxo-cholestan-313,5a-diol) et que, si cette détermination est positive, on en déduit que lesdites cellules sont dans un état oncogénique et/ou mitogénique. Dans un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode selon l'invention, on obtient un extrait liquide des cellules prélevées et l'on détermine si ledit extrait liquide contient, en quantité significative, le composé OCDO. Pour obtenir ledit extrait liquide, on peut lyser les cellules prélevées et séparer les fractions solide et liquide, avantageusement, par centrifugation. On peut repérer la présence d'OCDO dans l'extrait liquide par chromatographie sur couche mince, la présence d'OCDO étant alors détectée sur la plaque de chromatographie par un moyen révélateur approprié. On peut prévoir que le moyen révélateur consiste en une modification chimique de l'OCDO lui permettant de s'immobiliser sur une protéine de transport, que l'on détecte ultérieurement par des anticorps monoclonaux. Selon une variante, le moyen révélateur est un marquage radioactif des cellules prélevées effectué avant la chromatographie, la révélation se faisant sur la plaque par quantification de la radioactivité. On a constaté que les cellules ont un état oncogénique et/ou mitogénique, dès lors qu'un extrait liquide desdites cellules présente une concentration d'OCDO supérieure à 1�M. On peut doser la concentration d'OCDO dans l'extrait par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC). On peut aussi doser cette concentration par une chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrographie de masse. L'invention a aussi pour objet une utilisation du composé OCDO de formule : (6-oxo-cholestan-3 (3,5a-diol)(OCDO) Comme marqueur de l'état oncologique et/ou mitogénique d'un matériau biologique provenant d'un sujet humain ou d'un animal mammifère. L'invention a également pour objet un procédé pour évaluer l'activité d'un médicament anticancéreux utilisé pour le traitement thérapeutique de la pathologie d'un sujet, homme ou animal mammifère, caractérisé par le fait que : -on effectue sur le sujet traité un premier prélèvement de matériau 20 biologique comportant des cellules concernées par ladite pathologie et on dose la concentration Dl d'OCDO dans un extrait liquide desdites cellules ; - après un temps de traitement thérapeutique approprié, on effectue, de la même manière, un deuxième prélèvement de cellules de même nature et origine que pour le premier prélèvement, pour obtenir le dosage de la concentration D2 d'OCDO dans les cellules du deuxième prélèvement ; - on compare Dl et D2 ; et - si D2 L'invention a enfin pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de l'OCDO pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter une pathologie cancéreuse ou mitogène chez l'homme ou l'animal mammifère. Un mode de mise en oeuvre consiste à administrer l'inhibiteur d'OCDO en le dissolvant dans l'éthanol et en diluant cette solution (notamment au 1/1000) dans un tampon, notamment un tampon phosphate, la solution ainsi obtenue étant injectée en intra tumorale ; on peut, selon l'inhibiteur utilisé, injecter des doses journalières comprises entre 1 gg/kg et 500 gg/kg pendant un temps compris entre 1 et 10 semaines. L'inhibiteur d'OCDO peut avantageusement être choisi parmi les 20 produits suivants : - les inhibiteurs d'enzyme(s) impliqués dans la biosynthèse du cholestérol ; - les inhibiteurs des cytochromes P 450, les lipoxygènases et les antioxydants actifs sur l'époxydation du cholestérol ; 25 -les inhibiteurs de l'activité cholestérol-époxy hydrolase (ChEH) -les inhibiteurs choisis dans le groupe formé par : -les modulateurs des récepteurs des oestrogènes ; - les ligands des sites de liaison membranaires des anti-oestrogènes (AEBS) ; - les ligands des récepteurs a 1 et 2 et certains amino-alkyl stérols - les inhibiteurs du transport intra-cellulaire du cholestérol ; et 5 -les inhibiteurs d'enzyme choisis dans le groupe formé par la progestérone et les antagonistes des récepteurs Ahr Exemple 1 : L'OCDO est un marqueur de l'état tumoral d'une cellule. On a testé, par la méthode décrite à l'exemple 4 ci-après, la présence d'OCDO sur de nombreuses lignées cellulaires tumorales afin de 10 d'établir que ce marqueur est observable dans différents types cellulaires chez l'homme, le rat ou la souris. La production de LOCDO a été détectée dans chacune des lignées cellulaires tumorales testées comme indiqué dans le tableau suivant : Lignée cellulaire Type Production d'OCDO MCF7 Carcinome mammaire humain + MCF7/TamR Carcinome mammaire + humain résistant au tamoxifène MDA-MB-231 + TS/A Carcinome mammaire humain + A-549 Carcinome mammaire murin + B16-F10 Carcinome pulmonaire humain + SK-MEL-28 Mélanome murin + U-937 Mélanome humain + J 774 Leucémie myéloïde humain + THP. 1 Leucémie myéloïde murine + HT-29 Leucémie monocytaire aigüe humaine + HeLa Carcinome du colon humain + C6 Carcinome utérin humain + SK-N-SH Gliome de rat + Saos-2 Neuroblastome humain + P19 Ostéosarcome humain + TT Carcinome embryonnaire murin + Carcinome médulaire de la thyroïde humain + Les demanderesses, ayant constaté que l'OCDO se retrouve dans toutes les cellules tumorales testées, ont conclu que l'OCDO constituait un marqueur de l'état tumoral des cellules. Cependant, à titre préalable, et de façon analogue à ce qui a été fait dans les essais 1 à 5 précédents, on a évalué la transformation du composé CE dans des cellules de différents tissus sains de souris dans des conditions qui permettaient de détecter l'OCDO (voir le résultat sur la figure 6). On a incubé lesdites cellules avec le composé CEa[14C] et on a observé en chromatographie sur couche mince de silice les taches radioactives qui apparaissent avec (+) ou sans (-) incubation au tamoxifène. On constate que si le tamoxifène est présent, le composé CT n'apparaît plus, ce qui correspond bien à l'inhibition de la ChEH ; en l'absence d'incubation au tamoxifène, le composé CT apparaît mais on ne note aucune présence, au voisinage du composé CE, de tache correspondant à la présence d'OCDO. Il est donc clair que l'OCDO n'est pas produit dans un tissu normal ; sa détection constitue donc bien un élément prédictif de l'état tumoral des cellules ; l'OCDO est un marqueur de l'état oncogénique et/ou mitogénique d'une cellule. Exemple 2 : l'OCDO est carcinogène A partir des essais précédemment décrits et de l'exemple 1, les demanderesses ont pensé, selon l'invention, que la présence de l'OCDO dans les cellules en situation tumorale, pouvait être liée au fait que cette molécule pourrait avoir, par elle-même, un potentiel carcinogène. Un tel potentiel n'a jamais été rapporté antérieurement dans la littérature. Le cholestérol n'a pas de propriétés mutagènes. Les précurseurs de l'OCDO et les épimères de Cholestérol époxydes ont été cités comme de faibles mutagènes dans des cellules de mammifères (Peterson AR, Peterson H, Spears CP, Trosko JE and Sevanian , Mutation Research, vol 203 p. 355-366, 1988). Les sterol-epoxides n'ont pas montré de propriétés mutagènes dans le test d'Ames réalisé sur des bactéries (Smith LL et al., Mutation Research, vol 68 p. 23-30, 1979 ; Ansari GAS et al., Vol 20, p. 35-41, 1982). Ces observations ont été confirmées récemment (Cheng YW et al., Food and Chemical Toxicology, vol 43, p. 617-622, 2005). Certes, on a trouvé des homologies structurales de l' OCDO avec des promoteurs de tumeur tel que le TPA (12- tetradecanoylphorbol 13-acetate) (Endo Y. et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), vol 42 (3) p. 462-469, 1994). Mais personne n'a décrit ni même suggéré que l'OCDO pourrait avoir des propriétés d'activation des PKC, ni de promotion de tumeurs chez l'animal de laboratoire ; on a uniquement montré que cette molécule se fixait sur une protéine de fixation des esters de phorbol (Endo Y., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol 194, p. 1529-1535, 1993). Sur le plan cellulaire, on a seulement indiqué que l' OCDO paraît : - 1) inhiber la formation de rosette lymphocyte T provenant de sérum humain (Streuli R.A. et al., J. Immunol., Vol. 123 (6)n, p.2897-2902) ; -2) inhiber la mobilité des leucocytes (Gordon L, Natl. Acad. Sci. USA, vol 77(7), p.4313-4316, 1980 ; - 3) induire la toxicité des cellules NK chez la souris (Kucuk O. et al., Cell. Immunol., 139, p. 541-549, 1992) ; - 4) inhiber l'activité cytolytique produit par les lymphocytes T chez la 25 souris (Kucuk O et al., Lipids, Vol 29(9), p. 657-660, 1994), ces effets étant observés à des concentrations comprises entre 1 et 20 pM. Par le présent exemple 2, les demanderesses ont établi, dans le cadre la présente invention, que l'OCDO a des effets sur le développement tumoral, qui n'étaient aucunement suggérés à l'homme de métier par l'état de la technique. a) Dans cet exemple 2, on a utilisé la lignée cellulaire humaine TT de carcinome médullaire de la thyroïde (American Tissues and Cells Collection). Cette lignée est cultivée dans un milieu F12K modifié par Kaighn (vendu par la société � Invitrogen �), contenant 10 % en poids de sérum de veau foetal et 2,5 ml d'une solution d'antibiotiques (pénicilline/streptomycine) à 50 UI/g. L' OCDO testé provient de la société � Steraloids �. Pour étudier in vitro l'effet de l'OCDO sur la croissance cellulaire, les cellules TT sont ensemencées sur des plaques six puits (200 000 cellules par puit) dans un milieu F12K tel que défini ci-dessus. Les cellules TT sont traitées tous les deux jours soit par un solvant (éthanol à cm % dans du tampon phosphate PBS) soit par des quantités d'OCDO dans le solvant conduisant à des concentrations de 0,1 ; 1 ; 2,5 ; ou 5 �M. Les cellules sont comptées 4 jours après l'ensemencement. Comme on le voit sur la figure 7, la prolifération des cellules TT est augmentée de façon concentration-dépendante par le traitement avec l'OCDO, quand on compare, comme référence, à la prolifération des cellules traitées par le solvant. A la concentration de 5�M en OCDO, un facteur d'induction de prolifération de 1,5 est mesuré après 4 jours de traitement ; l'induction de la prolifération est donc établie in vitro pour des concentrations d'OCDO comprises entre 100 nM et 5 �M. Le facteur de stimulation de la prolifération est comparable à celui des oestrogènes, qui sont des molécules ayant des propriétés mitogènes sur des cellules tumorales mammaires (voir : Philippe de Medina et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol 319, 2006 : p. 139-149). b) Les demanderesses ont également étudié in vivo l'effet de l'OCDO sur le développement tumoral. Pour l'injection à l'animal, les cellules TT précédemment définies dans cet exemple sous a), sont récupérées avec de la trypsine, lavées deux fois et suspendues dans un tampon phosphate PBS. Les cellules TT (environ 4.106 cellules/0,1 ml) sont ensuite injectées en sous-cutané dans le flanc de souris femelles � nude nu/nu Swiss � de 6 semaines (fournies par Charles River). Les animaux sont traités par voie sous-cutanée une fois par jour, 5 jours sur 7, soit avec l'OCDO à la dose de 50 gg/kg (groupe traité) soit avec le solvant (groupe contrôle) sur une période de 110 jours (le solvant utilisé est de l'éthanol à 0,1 % dans du tampon phosphate (PBS)). Les animaux (5 ou 10 souris par groupe) sont suivis régulièrement pour mesurer le développement des tumeurs. Le volume des tumeurs est calculé selon la formule L x 12 x 0,5 où L est la longueur et 1 est la largeur de la tumeur. La figure 8 représente le volume V des tumeurs en fonction du temps de traitement t. Le traitement par l'OCDO accélère significativement la croissance de la tumeur ; le volume de la tumeur chez les animaux traités avec l'OCDO est presque trois fois plus important que pour les animaux témoins traités avec le solvant. On a euthanasié les animaux après 75 jours de traitement et on a prélevé la tumeur ainsi que les différents organes pour être analysés en histologie. On a observé un envahissement des ganglions lymphatiques (GL) chez les animaux traités par l'OCDO deux fois supérieur à celui des animaux traités par le solvant (voir figure 9). On a pratiqué une analyse histomorphologique. Pour ce faire, les tumeurs des souris traitées par l'OCDO ou par le solvant ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, poumon et foie) sont prélevés, fixés dans 10 % de formaline neutre tamponnée et inclus dans des blocs de paraffine. Pour ces analyses, les coupes sont marquées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'immunomarquage est réalisé avec des anticorps dirigés contre différents antigènes humains associés aux carcinomes médullaires de la thyroïde. Les anticorps utilisés sont l'anticorps polyclonal anti-calcitonine (Dako SAS, Trappes, France, 1:1000), l'anticorps monoclonal anti-cytokératine (Dako clone AE1/AE3, 1:50) et l'anticorps monoclonal anti-antigène de membranes épithéliales (EMA) (Dako clone E29, 1:50). L'immunomarquage des coupes de paraffine est précédé par une technique de récupération d'antigènes par chauffage dans un tampon citrate (10 mM, pH 6) soit deux fois pendant 10 minutes dans un four à micro-ondes (750 W) pour l'anticorps anti-CEA, soit dans un bain d'eau à 95°C pendant 40 minutes pour les anticorps anti-calcitonine et anti-EMA. Après incubation avec les anticorps ci-dessus définis, les coupes sont immunomarquées avec le complexe streptavidine-biotine-peroxidase (StreptABComplex/HRP,Dako) suivi par une solution chromogène de diaminobenzidine (DAB), puis sont colorées avec de l'hématoxyline. Les contrôles négatifs sont réalisés par incubation dans une solution tampon ne contenant pas l'anticorps primaire. Les résultats obtenus par cette analyse histologique sont représentés sur la figure 10 pour chacun des trois anticorps utilisés. On constate que les tumeurs issues des animaux traités par l'OCDO sont bien des carcinomes médullaires de la thyroïde humains, ce qui confirme l'envahissement des ganglions lymphatiques par des cellules issues de la tumeur. Les demanderesses ont donc établi que l'OCDO a une activité mitogène in vivo en stimulant la pousse tumorale implantée chez l'animal de 5 laboratoire Exemple 3 : l'OCDO stimule IL10 et réduit IL12, ce qui explique son action carcinogène. Les demanderesses, ayant établi, selon l'invention, que l'OCDO stimule la capacité d'invasion des cellules cancéreuses in vivo, ont confirmé cet 10 effet de l'OCDO en étudiant in vitro l'expression des cytokines sur des cellules THP1 traitées in vitro par l'OCDO. Les cellules THP1 (lignée cellulaire myéloïde humaine fournie par l'ATCC) sont cultivées avec un milieu de culture de type DMEM (Dubelco modified eagle medium) complété par 10 % de sérum de veau 15 foetal et un mélange d'antibiotiques. Les cellules THP1 sont traitées par 10 �M d'OCDO pendant 4 heures. Les ARN sont extraits selon une procédure classique. Les ADN complémentaires sont produits, puis utilisés pour mesurer l'expression des gènes d'intérêt. On a étudié l'expression des gènes codant l'interleukine 12(IL12) et 20 l'interleukine 10(IL10), qui représentent un couple de cytokines aux propriétés antagonistes. L'IL12 est une cytokine immunostimulante alors que l'IL10 est une cytokine immunosuppressiue. Le rapport d'expression de ces deux cytokines permet d'évaluer le potentiel immunosuppresseur ou immunostimulant de la cellule et sa capacité à favoriser la progression 25 tumorale ou au contraire à la ralentir. Les amorces utilisées correspondent aux séquences humaines de l'IL10 et de l'IL12 et sont les suivantes : IL10 sens : AAA-CCA-AAC-CAC-AAG-ACA-GAC, IL10 Anti Sens : GCT-GAA-GGC-ATC-TCG-GAG, IL12 Sens : CTA-TGG-TGA-GCC-GTG-ATT-GTG, IL12 Anti Sens : TCT-GTG-TCA-TCC-TCC-TGT-GTC. Les résultats sont représentés sur la figure 11 : l'OCDO stimule l'expression de la cytokine immunosuppressive IL10 et réduit l'expression de la cytokine IL12. Ce mécanisme permet d'expliquer la stimulation par l'OCDO de la capacité d'invasion des cellules tumorales constatée par l'exemple 2. Exemple 4 : Dosage de l'OCDO A) Dosage par HPLC On a séparé et dosé l'OCDO par une méthode de chromatographie liquide à haute pression HPLC(95 McOH/5 H2O ; 0,7 ml/mn ; colonne Ultrasep ES 6�M de 250 x 4, C18 (Bishoff, Leonberg, Allemagne)). Le chromatographe est un appareil de la société Perkin Elmer ; il comporte une pompe série 200 et un détecteur à barrettes de diodes de type 200. L'appareil est équipé d'un ordinateur � PC �, qui met en oeuvre le programme Turbochrome (Tm) permettant le pilotage des appareils et le traitement des données. On réalise un extrait cellulaire de cellules tumorales MCF7 cultivées comme indiqué à l'essai 1 : on lyse environ 60 millions de cellules pour obtenir 25 gL d'extrait liquide après une centrifugation de 10 mn à 1200 t/mn. On passe 20 �L de cet extrait dans la colonne du chromatographe. Le chromatogramme résultant est fourni sur la figure 12 : on voit que l'OCDO est séparé du CT, du CE et du céto-cholestérol (7-Ceto-Ch). Le temps de rétention de l'OCDO est de 19 mn. On effectue un étalonnage pour relier la mesure de la surface du pic OCDO ainsi obtenu et le poids de l'OCDO contenu dans l'échantillon. Cet étalonnage est réalisé à l'aide de solutions éthanoliques d'OCDO vendu par la société � Steraloids �, de concentrations croissantes. On utilise un volume fixe de 20 �L d'échantillon. Les quantités suivantes d'OCDO ont été injectées : 80 ng, 0,4 �g, 0,8 �g, 4�g et 8 �g. L'aire des pics correspondant à l'OCDO a été mesurée par intégration à l'aide du logiciel Turbochrome (Tm); ces valeurs (y) ont été reportées sur le graphe de la figure 13 en fonction des masses d'OCDO (x) correspondantes. On obtient une droite de corrélation convenable (y=69430x+1381 ; r2=0.999 ; n=6x3 ; p B) Dosage par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrographie de masse (GC/MS) Un mélange de 5a-cholestane et d'OCDO est triméthylsilylé selon la méthode décrite par Kedjouar (voir Kedjouar et al, Journal of Biological Chemistry, 2004, vol 279 n° 32, p. 34048-61). L'échantillon est traité par un mélange de N,O-bis(triméthysilyl)trifluoroacétamide/pyridine (50:50, v/v) pendant 30 mn à une température de 60°C. Les réactifs sont évaporés sous un flux d'azote et les dérivés triméthylsilylés (TMS) sont dissous dans l'hexane. Ces analyses GC/MS sont réalisées sur un appareil de type 4890 � Hewlett Packard system � équipé d'une colonne capîllaire de silice RTX-50 (30rnx0.32mm diamètre interne, film d'épaisseur 0.1 �m ; Restek). La température du four a été programmée à 230°C pendant 1 minute, ensuite de 230 à 240°C à une vitesse d'augmentation de 1° par minute pendant 10 minutes, de 240°C à 250°C à une vitesse d'augmentation de 3° par minute, ensuite jusqu'à 290°C à une vitesse d'augmentation de 45C/mn puis à 330°C en 1 minute. L'injecteur et le détecteur étaient à 310°C et 340°C respectivement. Le profile GC obtenu est représenté sur la figure 14. On obtient trois pics. Le premier correspond au 5a-cholestane, qui a un temps de rétention de 10,62 minutes. Le deuxième a un temps de rétention de 32,43 minutes et donne, en analyse par spectrométrie de masse avec fragmentation par impact électronique, un résultat qui correspond à un produit de déshydratation de l'OCDO (M+(472.3), M+ moins un groupement CH3 et M+ moins 2 groupements de CH3 (voir figure 15). Enfin, le dernier pic (temps de rétention de 36,68 minutes) correspond à l'OCDO et son profil de fragmentation en masse est donné sur la figure 16. Ce profil détermine les masses de 546.2 (M+moins un CH3), 531.2 (M+moins deux CH3), 472,2 (M+moins H2O et moins un groupement OTMS). L'étalonnage de la méthode est réalisé à l'aide de solutions éthanoliques d'OCDO de concentrations croissantes. Les quantités suivantes d'OCDO ont été injectées 6.25 ng, 12.5 ng, 50 ng et 100 ng. L'intégration de l'aire des pics correspondant à l'OCDO pour ces différentes quantités d'OCDO ont permis d'établir une courbe de calibration permettant de quantifier l'OCDO . Cette méthode permet de doser des quantités d'OCDO comprises entre 5 et 200 ng (voir figure 17). Exemple 5 : Inhibition de la production d'OCDO par le tamoxifène in 25 vivo. On a déjà montré à l'essai 2 (figure 3A) que l'addition de tamoxifène sur les cultures de cellules tumorales MCF7 bloque la production d' OCDO dans ces cellules. On va montrer ci-après que le tamoxifène administré in vivo entraîne aussi une inhibition de la production d' OCDO. On a utilisé les techniques de dosage détaillées à l'exemple 4 pour 5 mesurer la modulation de l'OCDO sur des tumeurs implantées chez la souris. On effectue d'abord une culture cellulaire de cellules TS/A. Ces cellules TS/A sont des adénocarcinomes mammaires de souris (voir Nanni P et al., Clin. Exp. Metastasis, 1983 Oct-Dec ; 1(4):373-80). Les cellules sont 10 cultivées, à 37°C sous 5% CO2, dans un milieu DMEM supplémenté par 2g/litre de carbonate de sodium, 1,2 mM de glutamine (pH 7,4 à 23°C), 5% de sérum bovin foetal (Gibco) et 2,5 ml d'antibiotiques par litre de milieu (pénicilline/streptomycine). Les cellules TS/A sont récupérées avec de la trypsine, lavées deux fois et 15 suspendues dans du tampon PBS. Les cellules TS/A ((environ 4 106 cellules /0.1 ml) sont ensuite injectées en sous-cutané dans le flanc de souris femelles BALB/c de 6 semaines (fournies par Charles River). Les animaux sont traités 27 jours après l'implantation des tumeurs, par voie intratumorale une fois par jour sur une durée de 37 jours, soit avec du 20 tamoxyfène à une concentration de 10 �M pour des volumes d'injection de 100 �l (groupe traité par le tamoxifène) soit avec le solvant véhicule (éthanol à 0,1 % dans du tampon phosphate PBS (groupe contrôle). Les animaux (10 souris par groupe) sont suivis régulièrement pour le développement des tumeurs. Le volume des tumeurs est calculé selon la 25 formule suivante Lx 12x0.5 (L est la longueur et 1 est la largeur de la tumeur). L'expérience a été reproduite deux fois. Les résultats sont fournis sur la figure 18 (la flèche indique le début du traitement). On observe donc qualitativement, sur la figure 18, une inhibition de la pousse tumorale chez les souris traitées au tamoxifène. Pour obtenir une information quantitative sur l'inhibition de 1' OCDO, l'expérience a été reproduite dans les mêmes conditions et les tumeurs ont été prélevées au jour 28. On ajoute 5 volumes (par rapport à la masse prélevée) de tampon (Tris-HC1 50 mM,KC1 150 mM, pH=7,4). Les tumeurs sont broyées et les homogénats sont centrifugés pendant 5 minutes à 2500 tours/mn à 4°C. On récupère les surnageants puis on ajoute 1 volume de méthanol (par rapport au volume de surnageant) et 2 volumes de chloroforme. Après centrifugation (pour séparer les phases), on récupère la phase organique. La phase organique est évaporée à sec puis le résidu est repris par 0.5 ml de chloroforme. Les extraits organiques sont filtrés sur des cartouches de silice de 0.5 ml. Les stérols polaires sont élués de façon séquentielle par : 1) 0.5 ml d'un mélange hexane/chloroforme (1/1) 2) 0.5 ml de chloroforme, 3) 0.5 ml d'acétate d'éthyle et du méthanol. L'addition d'un standard externe OCDO marqué au 14C durant les phases d'extraction et de purification permet d'établir un rendement de récupération de 86�6%. Les fractions acétate d'éthyle sont évaporées, sillylées (50 �l acétonitrile 1BSTFA 1) puis analysées par GC/MS (4l) selon les conditions décrites précédemment. La figure 19 présente deux chromatogrammes faits en phase gazeuse comme indiqué à l'exemple 4, correspondant : A) à un extrait de tumeur provenant d'un animal témoin : la tumeur avait une masse de 2 g ; B) à un extrait de tumeur provenant d'un animal traité au tamoxifène : la tumeur avait une masse de 1,45 g. On observe sur la figure 19 une diminution significative des pics provenant de l'OCDO dans la tumeur des souris traitées (B) par comparaison à celle des souris non traitées (A). L'analyse en spectrométrie de masse confirme la structure des molécules dans les pics d'intérêt (voir figure 20). On a donné ci-dessous les résultats chiffrés ainsi obtenus, le groupe témoin ayant été précédemment défini, et on a valorisé à 100 les valeurs associées au témoin par des coefficients qui ont été également appliqués aux résultats relatifs au tamoxifène. Jour 28 Jour 37 molécule taille de la OCDO taille de la OCDO tumeur (% contrôle) tumeur (% contrôle) (% du contrôle) (% du contrôle) Témoin 100 100 100 100 non traité Tamoxifène 73,5�8 19,2�4 46,2�7 8,4�4 On voit que, in vivo, le tamoxifène inhibe significativement l'OCDO. Le fait que le tamoxifène exerce une activité anti tumorale tout en inhibant in vivo la production d'un oxystérol promoteur de tumeur montre que l'OCDO joue un rôle dans les effets du tamoxifène. Exemple 6 : Inhibition de la production d'OCDO par le PBPE in vivo. Le PBPE est un composé dont l'effet antiprolifératif a été établi par des expériences in vitro (voir la référence citée à l'essai 2 et aussi la publication Payre B. et al, Mol. Cancer Ther., 7(12), 3707-3717). On a déterminé, pour le PBPE, des résultats in vivo analogues à ceux présentés dans l'exemple 5 pour le tamoxifène. Le protocole utilisé est strictement identique à celui qui a été détaillé à l'exemple 5 pour le traitement au tamoxifène à cette différence près que les injections intratumorales journalières sont effectuées à une concentration de 40 �M pour le PBPE pour des volumes d'injection de 100 �L. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous : Jour 28 Jour 37 molécule taille de la OCDO taille de la OCDO tumeur (% contrôle) tumeur (% contrôle) (% du contrôle) (% du contrôle) Témoin 100 100 100 100 non traité PBPE 71,6�7 22,5�5 54,5�8 9,6�5 On a donc déterminé in vivo que le PBPE d'une part inhibe l'OCDO et d'autre part, fait régresser les tumeurs. Exemple 7 : Inhibition de la production d' OCDO par PBPE sur diverses 10 cellules tumorales L'essai 2 précédemment fourni a montré que des extraits cellulaires de cellules tumorales MCF7 incubées pendant 3 jours dans des solutions de PBPE conduisent à constater une inhibition du métabolite que l'on a identifié comme étant l'OCDO. 15 On a repris une expérience analogue avec des lignées différentes en incubant les cellules testées pendant 48 heures dans une solution à 40 �M de PBPE. On a constaté que l'OCDO était inhibé à 100% pour toutes les lignées testées du tableau suivant : Lignée Type Inhibition de la cellulaire production d'OCDO MCF-7 Carcinome mammaire 100 % Humain MDA-MB-231 Carcinome mammaire 100 % Humain A-549 Carcinome pulmonaire 100 % Humain B-16-F10 Mélanome murin 100 % U-937 Leucémie Humaine 100 % HT-29 Carcinome colique 100 % Humain HeLa Carcinome utérin Humain 100 % C6 Gliome de rat 100 % SH-N-SH Neuroblastome Humain 100 % Saos-2 Osteosarcome Humain 100 % P19 Lignée carcino- 100 % embryonaire murine TT Carcinome médulaire de la 100 % thyroïde Humain De façon générale, pour établir les pourcentages d'inhibition de l'OCDO à partir des plaques de chromatographie en couche mince (CCM) obtenues comme à l'essai 2, les métabolites radioactifs sont identifiés et quantifiés à partir desdites plaques en utilisant une plaque sensible à l'europium de type � GP Phosphorescreen � (GE Healthcare) et un � Phosphor Imagor Storm 840 � (GE Healthscare). La proportion des oxystérols radio-marqués est déterminée sur l'autoradiogramme obtenu par densitométrie en utilisant le logiciel � Image Quant 5.2 �. Le pourcentage est calculé à partir du rapport entre la quantité d'oxystérols quantifiés divisée par la somme des quantités d'oxystérols (CEE + CE + CT + OCDO). Le CEE (ester de CE) provenant exclusivement du CE, le pourcentage du CE est calculé à partir du rapport (CE + CEE)/(CE + CEE + CT + OCDO). Exemple 8 : L'OCDO est inhibé quand la ChEH est inactive. Comme il a été établi précédemment dans cette demande de brevet, on sait que les cellules tumorales produisent de l'OCDO, ce qui implique que l'hydrolase ChEH est active puisqu'elle permet la transformation de CE en CT qui est le passage obligé pour la production d'OCDO. Comme il sera établi dans le tableau 1 donné plus loin dans cet exemple, le tamoxyfène, le PBPE, le raloxifène et le DPPE sont des inhibiteurs de la ChEH. On a donc complété l'essai 2 précédemment fourni en mesurant les quantités des produits en présence lorsque les cellules tumorales MCF7 sont incubées comme indiqué en détail dans l'essai 2. Le calcul des pourcentages de CE, CT et OCDO a été effectué comme indiqué à l'exemple 7. Les résultats sont fournis à la figure 21, qui montre une plaque de chromatographie en couche mince sur laquelle les pistes correspondant à des incubations des cellules avec le solvant véhicule T (0,1% éthanol dans du tampon PBS), avec CE-a et avec quatre inhibiteurs de ChEH dont les identifiants sont donnés en bas des pistes. Les valeurs numériques obtenues sont rassemblées dans le tableau ci-dessous : Composés % CE % OCDO % CT EtOH (T) 0 73,1 26,9 CE a 10�M 31,5 27 41,5 Tam 2,5 �M 90,3 6,9 2,8 PBPE 10 �M 89,2 6,2 4,6 Rai 10 �M 96,5 0,5 3 DPPE 1,5 �M 80,7 8,8 10,5 T = témoin DPPE = N,N-Diethyl-2-(4-benzylphénoxy)éthanamine Rai = Raloxifène On constate qu'une inhibition de ChEH entraine bien une inhibition de 5 l'OCDO, le produit CT etant alors en quantité très réduite. En fait, la formation de l'OCDO dans une cellule dépend de plusieurs paramètres : 1. la présence de cholestérol 2. la présence de CE 10 3. la présence de cholestérol époxyde hydrolase (ChEH) 4. la présence de CT 5. le transport du CT vers la zone d'oxydation du CT en OCDO 6. la présence et l'activité de l'enzyme responsable de l'oxydation de CT en OCDO 15 Pour établir le bien fondé du lien existant entre la capacité de divers composés d'inhiber l'OCDO dans une cellule tumorale MCF7, d'une part, et leur qualité d'inhibiteur de la ChEH, d'autre part, on a calculé les coefficients d'inhibition Ki pour ChEH relatifs à un certain nombre de produits et on a mesuré la production d'OCDO par les MCF7 après 20 incubation des cellules par les mêmes produits selon le protocole défini dans l'essai 2 de la présente demande de brevet. L'ensemble des résultats est présenté dans les tableaux 1 et 2. A partir de ces deux tableaux, il apparaît que tout inhibiteur d'enzyme impliqué dans la biosynthèse de cholestérol entraine une diminution du cholestérol utilisable pour la production de l'OCDO. On notera, en particulier, des inhibiteurs des enzymes à partir de l'hydroxyméthylglutaryle Coenzyme A synthétase (HMG_CoA_synthétase) jusqu'à la 7-déhydrocholestérol réductase et la 24-déshydrocholestérol réductase. Une expérience a été effectuée dans cette catégorie d'inhibiteurs, à savoir, avec un inhibiteur d'HMG-coA réductase, tel que la � Lovastatine �, utilisé à une concentration de 10�M : on a constaté qu'après une incubation de cellules MCF7 selon le protocole donné dans l'essai 2 et en amenant le témoin à la valeur 100, on obtient une production d'OCDO par les MCF7 de moins de 1.15 TABLEAU 1 Molécule KiChEH (nM) ligands d'AEBS PBPE 26,8 � 6 PCPE 34,7 � 8 Tesmilifene 62,4 � 3 DDA 1250,4 � 6 modulateurs des récepteurs des oestrogènes Tamoxifène 33,6 � 8 4OH-Tamoxifène 145,3 � 4 Raloxifene 35,6 � 4 Nitromiphene 17,7 � 6 Clomiphene 9,0 � 2 RU 39,411 155,2 � 8 ligands des récepteur� sigma BD-1008 98,7 � 9 Haloperidol 18067 � 14 SR-31747A 6,2 � 2 Ibogaine 2150 � 11 AC-915 3527 � 9 Rimcazole 2325 � 8 Amiodarone 733,1 � 9 Trifluoroperazine 135,4 � 7 inhibiteurs de la biosynthèse du Cholestérol Ro 48-8071 88,9 � 5 U-18666A 90,3 � 5 AY-9944 649 � 6 Triparanol 39,5 � 3 Terbinafine 9105 � 33 SKF-525A 1904 � 11 10 15 20 TABLEAU 2 Molécule Production d'OCDO par les MCF-7 (concentration en �M) (%contrôle) Témoin - 100 Ligands d'AEBS PBPE (1) tamoxifene: 2-[4-[(Z)-1,2-di(phenyl)but- l-enyl]phenoxy]-N,N-dimethylethanamine; 4OH-tamoxifene: 4- [ (Z) - 1- [4 - (2- dimethylaminoethyloxy)phenyl] -2-phenylbut-1-enyl]phenol; raloxifene: [6-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)- 1 -benzothiophen-3-yl] - [4-(2-piperidin-1-ylethoxy) phenyl] methanone; nitromiphene: 1- [2- [4- [ (Z) - 1 - (4-methoxyphenyl) - 2-nitro-2-phenylethenyl]phenoxy] ethyl]pyrrolidine; clomiphene: 2- [4- [ (Z)-2-chloro-1,2-di (phenyl)ethenyl]phenoxy] -N,N- diethylethanamine; RU 39411: 11-[4-N,N-[diethylaminoethoxy]phenyl]-estra-1,3,5(10) triene-3,17-diol. BD-1008: N-(3,4-dichlorophenethyl)-N-methyl-2-(pyrrolidin-l-yl)ethanamine; Haloperidol : 4-(4- (4-chlorophenyl)-4-hydroxypiperidin- l -yl)-1-(4- fluorophenyl)butan-l-one; SR-31747A: (E)-N-(4-(3-chloro-4-cyclohexylphenyl)but-3-enyl)-N-ethylcyclohexanamine; AC915: N-(3,4-dichlorophenethyl)-N-methyl-2-(pyrrolidin-1-yl)ethanamine Rimcazole: 9-[3-[(3 S,5R)-3,5-dimethylpiperazin- l -yl] propyl] carbazole Amiodarone: (2-butyl-1-benzofuran-3-yl)-[4-(2-diethylaminoethyloxy)-3, 5-diiodophenyl]methanone Trifluoroperazine: 10-[3-(4-methylpiperazin- l -yl)propyl]-2- (trifluoromethyl)phenothiazine RO 48-8071: (4-(6-(allyl(methyl)amino)hexyloxy)phenyl)(4-30 bromophenyl)methanone; U-18666A: 3-beta-(2-(diethylamino)ethoxy)androst-5-en-17-one; AY-9944: trans-1,4-Bis(2-chlorobenzaminomethyl)cyclohexane; Triparanol : 2-(4-chlorophenyl)-1-(4-(2-(diethylamino)ethoxy)phenyl)-1-ptolylethanol; terbinafine: (E)-N,3,6,6-tetramethyl-N-(naphthalene-l-ylmethyl)hept-2-en-4-yn-1-amine; SKF-525A: 2-diethylaminoethy12,2-diphenylpen tanoate. Les inhibiteurs, qui ont fait l'objet des expériences ayant abouties aux tableaux 1 et 2 incluent des modulateurs des récepteurs des oestrogènes, des ligants des sites de liaison membranaires des anti-oestrogènes (AEBS), des ligants des récepteurs sigma 1 et 2, des inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol à partir de la squalène synthétase et jusqu'à la 7- et 24-déshydrocholestérol réductase. Tous ces inhibiteurs ont un point commun, à savoir, celui d'être des ligants des sites AEBS. On a détaillé ci-après les protocoles utilisés pour la mesure des coefficients d'inhibition Ki du Tableau 1 : a) Ki pour les AEBS Le Ki est la constante d'inhibition correspondant à la molécule d'intérêt et est mesuré de la façon suivante : des microsomes de foie de rat sont incubés avec une concentration de 2,5nM de tamoxifène tritié (fourni par la société GE healthcare) et des concentrations croissantes en inhibiteur comprises entre 0,01 et 100011M dans les conditions décrites dans la publication suivante : Poirot M. et al, Bioorganic and Medicinal Chemistry 2000, vol 8(8), p. 2007-2016. Les IC50 correspondent à la concentration en inhibiteur requise pour inhiber 50% de l'activité de la ChEH ; E elles sont déterminées par utilisation d'un programme de traitement de données � GraphPad Prizm (version 4) �. Les Ki sont calculés par utilisation de l'équation de Cheng et Prussof (Cheng et Prussolf, Biochemical Pharmacology, 1973, vol 22(23), pages 3099- 3108). Le Ki est exprimé selon l'équation : Ki = [IC50](1+([tamoxifène tritié])/Kd). La concentration en tamoxifène tritié est de 2,5 nM et la constante de dissociation a l'équilibre du tamoxifène tritié pour AEBS est de 2 nM. b) Détermination du Ki pour ChEH : 150 �g de protéines de microsomes de foie de rat sont incubés en présence de 2 concentrations de CE-a[14C] avec des concentrations croissantes d'inhibiteurs comprises entre 0,01 et 1000 �M dans les conditions décrites précédemment pour la mesure de l'activité ChEH. Le Ki est mesuré comme la projection sur l'axe des abscisses de l'intersection des lignes obtenues en reportant sur un graphe les valeurs de 1/V en fonction de 1/S pour la ChEH, tel que déterminé par la méthode de Dixon (Dixon M, Biochemical Journal, 1953, vol 55(1), p 170-171). Exemple 9 : Inhibition de l'OCDO par un inhibiteur des cytochromes 15 P450 L'époxydation du cholestérol peut être produite par auto-oxydation du cholestérol avec de l'oxygène de l'air, sous l'action d'enzymes comme des cytochromes P450 ou des lipoxygénases (voir Schroepfer G.Jr, Physiological Reviews, Vol. 80, n° 1, p. 362-521, 2000). 20 On a constaté une inhibition de la production de l'époxystérol CE et de ses dérivés, le CT et l'OCDO, par utilisation d'un inhibiteur général des cytochromes P450, à savoir, le kétoconazole (voir figure 22). Le protocole pour cette expérience est le même que celui décrit dans l'exemple 7. 25 Exemple 10 : Inhibition de la ChEH par un aminoalkylstérol. Pour cette expérience, on a choisi un aminoalkylstérol inclus dans le brevet français 2 838 741, ayant comme formule : Cholestan-3(3,5a-diol- 613-N-[2-(3H-imidazole-4-yl)-éthylamino] (DDA). On a incubé des cellules tumorales MCF7 par du CE[14C](l0mCurie/mmol, 0,6�M) pendant 48 heures en présence ou en l'absence de l'aminoalkylstérol susmentionné (aux concentrations de 0,1 et 1 MM). On a effectué une chromatographie en couche mince, dont la plaque a été reproduite sur la figure 23. Sur cette plaque, l'incubation est faite pour la piste 1 avec CE[14C] ; pour la piste 2, avec CT[14C] ; pour la piste 3, avec le solvant véhicule, qui est le même que celui utilisé pour les essais 1 à 5 ; pour la piste 4, avec CE[14C]et 0,1 �M de l'aminoalkylstérol ; et pour la piste 5, avec CE[14C] et une concentration de 1 pM de 1' aminoalkylstérol. On observe que la présence de l'aminoalkylstérol entraine une inhibition de la ChEH ; cette inhibition est dépendante de la concentration en aminoalkylstérol. Par ailleurs, on a également effectué une étude de cette inhibition sur homogénat. Le protocole est le suivant : les cellules MCF7 sont décrochées à la trypsine et reprises par du milieu RPMI 5%FBS. La suspension cellulaire obtenue (60 millions de cellules) est centrifugée, lavée au PBS froid et resuspendue dans un 1ml de tampon Tris-HCL (pH=7,4 ; 150 mM KCL). Les cellules sont lysées par cinq cycles de congélation/décongélation (azote liquide/37°C). La solution est centrifugée à 1200 tours/mn à 4°C pendant 10 minutes. Le surnageant est récupéré et la quantité de protéines est déterminée par la méthode de Bradford. La mesure de l'activité ChEH sur lysat cellulaire MCF7 est effectuée comme suit : l'activité enzymatique est mesurée sur 150 .tg de protéines dans un volume final de 150 gl comportant 125 �l de tampon ChEH (trisHCL, pH 7,4, 150mM KCL) et 15 gl de protéines MCF7. On a comparé les valeurs des IC 50 et on a constaté que (IC 50)cellules = 0,6�M alors que (IC50)homogénat=11,2 �M. Cette différence entre les IC50 montre que l' aminoalkylstérol testé présente des propriétés de prévention de la survenue des cancers. On a, en outre, déterminé, que pour le composé DDA, des résultats analogues à ceux présentés dans l'exemple 6 pour le PBPE. Le protocole utilisé est strictement identique à celui qui a été détaillé à l'exmple 5 pour le traitement au tamoxifène à cette différence près que les injections intro-tumorales journalières sont effectuée à une concentration de 10 �M pour des volumes d'injection de 100 �L. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous : Jour 28 Jour 37 molécule taille de la OCDO taille de la OCDO tumeur (% contrôle) tumeur (% contrôle) (% du contrôle) (% du contrôle) Témoin 100 100 100 100 non traité DDA 65,4�7 14,5�3 28,3�8 4,5�3 On a donc établi, dans cet exemple, que d'une part, le produit DDA inhibe l'OCDO et que, d'autre part, in vivo, il réduit la taille tumorale. Exemple 11 : Inhibition de l'OCDO par des modulateurs du transport intracellulaire du cholestérol et des modulateurs des récepteurs arylhydrocarbure (récepteur Ahr) On a testé deux modulateurs du transport intracellulaire du cholestérol, à savoir, la progestérone et le � U18666A � (343-(2- (diéthylamino)ethoxy)androst-5-en-17-one) (voir LISCUM L et al,. Biol. Chem., vol 270 (26) p 15443-15446, 1995) (pistes 2 et 3 respectivement). On a testé également (voir pistes 4 et 5 respectivement) deux modulateurs des récepteurs Ahr (Aryl hydrocarbon receptor), à savoir, la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) et le Benzo(A)pyrène. On a enfin testé deux antagonistes des récepteurs Ahr, à savoir, le resvératrol et le 1,3-dichloro-5-[(1E)-2-(4-chlorophényl)ethényl]-benzène (PDM2) (voir : � Casper R.F. et al, Mol. Pharmacol., 1999 oct. ; 56(4) ; 784-90 � et � de Medina et al, J.Med.. Chem., 2005 Janv. 13 ;48(1) : 287-91) �). On a réalisé les expériences suivantes : des cellules tumorales MCF7 ont été mises en présence de 0,5 gM de CT [14C] et ont été ensuite incubées pendant 24 heures en présence de l'un des produits suivants : 1. solvant véhicule (0 ,1% d'éthanol dans un tampon PBS) servant de témoin (piste 1) 2. 10 �M de progestérone 3. 10�M de U18666A 4.100nMdeTCDD 5. 10 �M de benzo(A)pyrène 6. 10 �M de resvératrol 7. 10�M de PDM2 On a réalisé des chromatographies sur couche mince et la figure 24 représente la plaque obtenue. A partir des taches des différentes pistes, on a quantifié, en appliquant le protocole détaillé dans l'exemple 7, la production de l'OCDO dans les cellules traitées. Les résultats de cette quantification sont représentés par l'histogramme de la figure 24. On a, en outre, mesuré les quantités d'OCDO produites par des cellules MCF7, quand on les incube selon le même protocole que ci-dessus défini avec d'autres antagonistes des récepteurs Ahr, le test témoin étant amené à 100 et la production d'OCDO étant exprimée en % du témoin (même témoin que ci-dessus). Les résultats sont donnés dans le tableau suivant : Molécule Production d'OCDO par les MCF-7 (concentration 10 �M) (%contrôle) Témoin - 100 Antagoniste des Resveratrol Il apparaît donc que les modulateurs du transport intro-cellulaire du cholestérol et les antagonistes des récepteurs Ahr peuvent inhiber la formation de l' OCDO et être utilisés en conséquence pour leur effet anticancéreux. REVENDICATIONS1. Méthode de diagnostic pour détecter l'état oncogénique et/ou mitogénique de cellules prélevées à partir d'un matériau biologique provenant d'un sujet humain ou d'un animal mammifère, caractérisée en ce que l'on détermine par un moyen révélateur si les cellules prélevées contiennent, en quantité significative, le composé OCDO de formule (6-oxo-cholestan-3 (3, 5 a-diol) et que, si cette détermination est positive, on en déduit que lesdites 10 cellules sont dans un état oncogénique et/ou mitogénique 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on obtient un extrait liquide des cellules prélevées et l'on détermine si ledit extrait liquide contient, en quantité significative, le composé OCDO. 15 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que, pour obtenir ledit extrait liquide, on lyse les cellules prélevées et on sépare les fractions solide et liquide. 4. Méthode selon les revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que l'on repère la présence d'OCDO dans l'extrait liquide parchromotographie sur couche mince, la présence d'OCDO étant détectée sur la plaque de chromatographie par un moyen révélateur approprié. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 4, caractérisée en ce que le moyen révélateur consiste en une modification chimique de dOCDO lui permettant de s'immobiliser sur une protéine de transport, que l'on détecte ultérieurement par des anticorps monoclonaux 6. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que le moyen révélateur est un marquage radioactif des cellules prélevées effectué avant la chromatographie, la révélation se faisant sur la plaque par quantification de la radioactivité. 7. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'on détecte que les cellules prélevées ont un état oncogénique et/ou mitogénique, dès lors qu'un extrait liquide desdites cellules présente une concentration d'OCDO supérieure à 1 �M 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on dose la concentration d'OCDO dans l'extrait cellulaire liquide par chromatographie en phase liquide à haute pression (HPLC) 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on dose la concentration d'OCDO dans l'extrait cellulaire liquide par une chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrographie de masse. 10. Utilisation du composé OCDO de formule HO (6-oxo-cholestan-3 13,5 a-diol)(OCDO) comme marqueur de l'état oncologique et/ou mitogénique d'un matériau biologique provenant d'un sujet humain ou d'un animal mammifère. 1 L Procédé pour évaluer l'activité d'un médicament anticancéreux utilisé pour le traitement thérapeutique de la pathologie d'un sujet homme ou animal mammifère, caractérisé en ce que -sur un premier prélèvement déjà effectué de matériau biologique comportant des cellules concernées par ladite pathologie, on dose la concentration Dl d'OCDO dans un extrait liquide desdites cellules ; - après un temps de traitement thérapeutique, de la même manière, sur un deuxième prélèvement déjà effectué de cellules de même nature et origine que pour le premier prélèvement, on dose la concentration D2 d'OCDO dans les cellules du deuxième prélèvement ; - on compare Dl et D2 ; et - si D2