Brevet FR2945820A1 — publié le 20101126

PANEL DE GENES POUR LE PRONOSTIC DU CANCER DE LA PROSTATE La présente invention concerne une plaque microfluidique permettant le diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate, ainsi qu'une méthode de diagnostic et/ou pronostic du cancer de la prostate basée sur l'utilisation d'une telle plaque. Plus particulièrement, la plaque microfluidique selon l'invention permet d'analyser le niveau d'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 par RT-qPCR. Le cancer de la prostate est le plus fréquent des cancers de l'homme de plus de 50 ans, et représente la deuxième cause de décès par cancer chez l'homme dans le monde développé. La méthode de diagnostic du cancer de la prostate la plus utilisée actuellement est le dosage du PSA (� prostate specific antigen �) sanguin. Cependant, le taux de PSA, dans le sang peut s'élever au cours de pathologies de la prostate autres que les cancers (infections ou inflammations prostatiques, traumatismes de la prostate, hyperplasie bénigne de la prostate, etc.). De plus, le PSA n'étant pas un marqueur spécifique des adénocarcinomes prostatiques, il a une faible valeur prédictive dans le diagnostic précoce des cancers de la prostate. Par conséquent, il existe un besoin en méthodes pour diagnostiquer et/ou établir un pronostic du cancer de la prostate. Plus particulièrement, il serait souhaitable de disposer d'une technique permettant d'établir rapidement un diagnostic fiable, tout en évaluant l'agressivité du cancer de la prostate. DESCRIPTION DE L'INVENTION Une plaque microfluidique TaqMan� à basse densité comportant des amorces permettant de déterminer l'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGFI, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 a été construite. Les inventeurs ont trouvé que cette plaque microfluidique permettait un pronostic fiable, reproductible et simple de l'agressivité d'un cancer de la prostate. 1. Plaques microfluidiques selon l'invention Un premier aspect de l'invention concerne une plaque microfluidique caractérisée en ce qu'elle contient des moyens pour détecter le niveau d'expression, dans un échantillon biologique, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Par � BRCA1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � Breast cancer type 1 susceptibility protein � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque de séquences du National Center for Biotechnology Information (dénommé ci après banque NCBI) est : NM 007294 (PRI 26-APR-2009). Par � BRCA2 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � Breast cancer type 2 susceptibility protein � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 000059.3 (PRI 26-APR-2009). Par � AR �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � androgen receptor � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001011645.1 (PRI 26-APR-2009). Par � IGF1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � insulin-like growth factor 1 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001111283.1 (PRI 26-APR-2009). Par � EPHB2 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � EPH receptor B2 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_017449.3 (PRI 10-APR-2009). Par � AMACR �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � alpha-methylacyl-CoA racemase � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence clans la banque NCBI est : NM_203382.1 (PRI 22-FEB-2009). Par � ESR1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � estrogen receptor 1 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001122742.1 (PRI 26-APR-2009). Par � ESR2 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � estrogen receptor 2 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001040275.1 (PRI 26-APR-2009). Par � BCL2 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée Bcl2 ou � oncogene B-cell leukemia 2 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000633.2 (PRI 26- APR-2009). Par � RNASEL �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � 2',5'-oligoisoadenylate synthetase-dependent ribonuclease L � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 021133.2 (PRI 29-MAR-2009). Par � MUC1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � cell surface associated Mucin 1 � en anglais. Ce gène est également connu sous le nom hCG1996357. Par � IL18 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � interleukin 18 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_001562.2 (PRI 26-APR-2009). Par � COL4A3 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � alpha 3 type IV collagen � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_031362.2 (PRI 14-MAR-2009). Par � GSTP1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � glutathione S-transferase pi � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM_000852.2 (PRI 13-JUL-2008). Par � RASSF1 �, on entend ici le gène codant pour la protéine dénommée � Ras association (RaIGDS/AF-6) domain family member 1 � en anglais. Ce gène code notamment pour l'ARNm dont la référence dans la banque NCBI est : NM 170713.2 (PRI 26-APR-2009). Les moyens pour détecter le niveau d'expression de ces gènes permettent de détecter le transcrit présenté dans les références dans la banque NCBI mentionnés ci-dessus, et/ou des variants d'épissage de tels transcrits, et/ou les protéines codées par ces transcrits. La référence de ces gènes dans différentes bases de données est présentée dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Gène Référence Applied Biosystems Référence NCBI Locus BRCA1 Hs00173233_ml NM 007294.2 hCG16943 BRCA2 Hs00609060_m1 NM 000059.3 hCG33126 AR Hs00907244_m1 NM 001011645.1 hCG15093 IGF1 Hs01547656m1 NM 001111283.1 hCG21873 EPHB2 Hs01031827_ml I NM 017449.3 hCG1812037 AMACR Hs02786742s1 NM 203382.1 hCG37068 ESR1 Hs01046817_ml NM 001122742.1 hCG1811630 ESR2 Hs00230957 ml NM 001040275.1 hCG21449 Hsuu1u;3~bu mi RNASEL Hs00221692__ml NM 021133.2 hCG24392 MUC1 Hs00410317 ml hCG1996357 IL18 Hs01038788_m1 NM 001562.2 hCG39294 COL4A3 Hs01022527_ml NM 031362.2 hCG2013333 GSTP1 Hs00943351_gl NM 000852.2 hCG21055 RASSF1 Hs00200394 ml NM 170713.2 hCG17462 Dans un mode de réalisation préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la plaque microfluidique selon l'invention contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des quinze gènes suivants : BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Préférentiellement, la plaque microfluidique selon l'invention contient en outre des moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène de calibration. Par � gène de calibration �, on entend un gène qui est ni surexprimé, ni sous exprimé, dans un cancer de la prostate. Des gènes de calibration couramment utilisés par l'homme du métier incluent, par exemple, le gène codant pour l'ARN ribosomique 18s (référence dans la banque NCBI: X03205.1, PRI 16-DEC-1994), actine (référence dans la banque NCBI: NM_001101, PRI 03-AUG-2008) et la glyceraldehyde-3-phosphate déhydrogénase (référence dans la banque NCBI: NM 002046, PRI 22-MAR-2009). Un mode de réalisation particulièrement préféré porte sur une plaque microfluidique qui contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes consistant en BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1, RASSF1 et un gène de calibration (par exemple l'ARNr 18s). Des moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont bien connus de l'homme de l'art. L'expression d'un gène peut soit être détectée au niveau de la protéine codée par le gène, soit au niveau des ARN transcrits à partir du gène. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes incluent donc, par exemple, des anticorps et des oligonucléotides tels que des sondes et/ou des amorces. Dans le cadre de la présente invention, les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation (ACP ou PCR), et plus particulièrement des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). Une telle amplification par RT-gPCR peut être réalisée par plusieurs techniques différentes, incluant la technique SYBR Green et les techniques utilisant des sondes fluorescentes (techniques dites � TaqMan �, � FRET �, � Beacon �, etc.). Dans le cas d'une détection basée sur l'utilisation de sondes fluorescentes, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente (� sonde TaqMan �, � sonde FRET �, � sonde Beacon �, etc.). Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes sont préférentiellement des oligonucléotides pour la réalisation d'une RT-gPCR par la technique Taqman. Dans ce cas, chacun des puits de la plaque microfluidique selon l'invention contient une amorce sens, une amorce antisens, et une sonde fluorescente dite � sonde Taqman �. Les oligonucléotides appropriés peuvent aisément être choisis et construits par l'homme du métier en fonction de la technique choisie pour réaliser la RT-gPCR. Alternativement, des oligonucléotides appropriés et/ou des plaques microfluidiques contenant des oligonucléotides appropriés peuvent être commandés auprès de fournisseurs tels que Applied Biosystem (Carlsbad, Californie, USA). Par � plaque microfluidique �, on entend ici toute plaque convenant à être utilisée dans une plateforme à haut débit pour réaliser des réactions chimiques et/ou biologiques telles que des RT-qPCR. Ladite plaque microfluidique est préférentiellement une carte TagMan� à basse densité (� TLDA �). Une telle plaque contient 384 puits. La carte TDLA commercialisée par Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA) sous la référence n° 4346798 convient tout particulièrement à la présente invention puisque cette plaque permet l'analyse de l'expression de 15 gènes ainsi que celle d'un gène de calibration, et ce pour huit échantillons analysés en parallèle. Les moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes peuvent par exemple être positionnés comme montré sur la Figure 1. 2. Méthodes de pronostic et/ou diagnostic selon l'invention Un autre aspect de l'invention porte sur l'utilisation d'une plaque microfluidique selon l'invention pour le pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate. Par � pronostic �, on entend l'évaluation de l'agressivité du cancer et/ou de la durée de survie du patient. Par � diagnostic �, on entend la détermination qu'un individu souffre d'un cancer. L'invention porte également sur l'utilisation de moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes tels que définis dans le paragraphe ci-dessus pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate. La plaque microfluidique selon l'invention est particulièrement utile pour évaluer si un cancer de la prostate est agressif ou non. Les cancers agressifs, pour lesquels la durée de survie est faible, sont définis comme des cancers dont le score de Gleason est supérieur ou égal à 7. Alternativement, l'agressivité du cancer peut être définie par son grade, lequel indique le degré de dédifférenciation des cellules cancéreuses, ou par la classification TNM, laquelle indique l'extension anatomique d'un cancer. La présente invention permet de déterminer l'agressivité des cancers de la prostate de manière simple et rapide grâce à une approche transcriptomique. Le cancer de la prostate peut par exemple être un adénocarcinome prostatique, un sarcome prostatique, un carcinome squameux prostatique, un carcinome ductal de la prostate ou une néoplasie intra-épithéliale de prostate. Le cancer de la prostate est préférentiellement un adénocarcinome prostatique, lequel est le cancer de la prostate le plus courant. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) mettre une plaque microfluidique selon l'invention en contact avec : (i) au moins un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate ; et (ii) au moins un échantillon de référence ; (b) réaliser une amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). Dans cette méthode, le niveau d'expression d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation préféré, le niveau d'expression des quinze gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est analysé. L'échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate correspond ou contient des cellules prostatiques. Celles-ci peuvent être prélevées lors d'une biopsie ou être obtenues à partir d'un fluide biologique (par exemple du sang) ayant subi un traitement visant à l'enrichir en cellules prostatiques. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique correspond à une préparation d'ARNc préparé à partir des cellules prostatiques. L'échantillon de référence est un contrôle négatif indicatif du niveau d'expression de ces gènes chez un individu sain. Il peut par exemple correspondre à un pool d'ARN de prostates saines, tel que celui commercialisé par Ozyme (Saint-Quentin-en-Yvelines, France) sous la référence n° 636550. Cette méthode est préférentiellement mise en oeuvre en utilisant une plateforme de haut débit, telle que celle représentée sur la Figure 2. Cette méthode peut en outre comporter une étape (c) qui consiste à déterminer si, chez le patient, les gènes dont le niveau d'expression est détecté grâce à la plaque microfluidique selon l'invention sont surexprimés ou sous exprimés par rapport à l'échantillon de référence. Cette méthode peut également comporter les étapes de : (d) pour chacun des gènes, attribuer un score de 1 si : (i) chez le patient, les gènes BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSFI sont surexprimés par rapport à l'échantillon de référence ; et (ii) chez le patient, le gène AR est sous exprimé par rapport à l'échantillon de référence ; (e) faire la somme des scores obtenus pour chacun des gènes afin d'obtenir un score global. Dans la méthode ci-dessus, le score global est calculé avec un score binaire de 0 ou de 1 pour chacun des gènes. Cependant, le poids des scores attribués peut être modifié en pondérant les scores afin de d'accorder plus d'importance à certains des gènes. Par ailleurs, il est envisageable n'attribuer un score de 1 que si la différence de niveau d'expression entre l'échantillon du patient et l'échantillon de référence est statistiquement significative. Lorsque la méthode est mise en oeuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1), le score global va de 0 à 15. Afin de pouvoir le comparer au score de Gleason (allant de 0 à 10), il peut être recalculé sur une échelle de 0 à 10. De ce fait, la méthode selon l'invention peut en outre comporter une étape (f) de calcul d'un score global pondéré (i.e. un score sur une échelle de 0 à 10). Ce score global pondéré peut par exemple être obtenu en utilisant la formule suivante : (score global -Xmin) X XmaxG-XminG) (Xmax-Xmin) où Xmin indique le score global minimun, Xmax indique le score global maximum, XmaxG indique le score de Gleason maximum (en l'occurrence 10) et XminG indique le score de Gleason mnimum (en l'occurrence 0).Par exemple, pour un score global de 9 obtenu lorsque la méthode est mise en oeuvre avec quinze gènes et que les scores attribués aux gènes sont binaires (0 ou 1), le score global pondéré sera de 6 : (9-0) x(10-0)=6. (15-0) Le score global et le score global pondéré indiquent si le patient souffre d'un cancer de la prostate, et/ou le degré d'agressivité du cancer de la prostate. Si ces scores sont élevés, le cancer est agressif. A l'inverse, s'ils sont faibles le cancer est peu agressif. Ainsi, un score global pondéré supérieur ou égal à 2 indique que ledit patient souffre probablement d'un cancer de la prostate. Un score global pondéré supérieur ou égal à 7 indique que le patient souffre probablement d'un cancer de la prostate agressif. Plus généralement, l'invention concerne toute méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant l'étape (a) de déterminer le niveau d'expression, dans un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate, d'au moins onze, douze, treize, quatorze ou quinze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. De préférence, ces gènes incluent les onze gènes suivants : AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le niveau d'expression de l'ensemble des quinze gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 est déterminé. Cette méthode peut en outre comprendre une étape (b) de comparer le niveau d'expression de chacun de ces gènes avec le niveau d'expression déterminé dans un échantillon de référence. Le niveau d'expression des gènes est de préférence déterminé par quantification des ARNm transcrits à partir de ces gènes, par exemple par RT-qPCR ou par hybridation à des sondes nucléiques. Alternativement, le niveau d'expression est déterminé par quantification de la protéine traduite à partir du gène grâce à des anticorps. Les méthodes selon l'invention peuvent être utilisées non seulement pour déterminer si un individu souffre d'un cancer de la prostate et/ou pour estimer l'agressivité du cancer de la prostate, mais aussi pour établir le schéma de traitement (� treatment regimen �) d'un patient, pour ajuster le schéma de traitement d'un patient, pour suivre la progression d'un cancer de la prostate, et/ou pour suivre la réponse d'un patient à un traitement donné (� drug monitoring �). Les méthodes selon l'invention peuvent donc comporter une étape supplémentaire d'établir et/ou ajuster le schéma de traitement d'un patient. En effet, si le cancer est agressif, le médecin va opter pour un traitement agressif, par exemple une chimiothérapie associant plusieurs principes médicamenteux. En revanche, si le cancer n'est pas agressif, il pourra opter pour un traitement moins lourd produisant moins d'effets secondaires chez le patient. Le schéma de traitement d'un patient peut donc être établi et/ou ajusté en fonction du score global obtenu à l'étape (e). Lors de l'ajustement d'un schéma de traitement, du suivi de la progression d'un cancer et/ou du suivi de la réponse d'un patient, la méthode selon l'invention est répétée à au moins deux reprises sur des échantillons prélevés d'un même patient à différents moments. Des échantillons peuvent par exemple être prélevés et analysés tous les mois, ou tous les six mois environ. Lors du suivi de la réponse d'un patient, un échantillon est d'abord prélevé avant le début du traitement, et un ou plusieurs échantillons sont prélevés après le début de traitement. Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande. Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes � comprenant �, � contenant �, � comportant � et � consistant en � ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. LEGENDES DES FIGURES La Figure 1 représente une plaque microfluidique selon l'invention, en l'occurrence une carte TaqMan� à basse densité (� TLDA �), laquelle comporte 384 puits. Chaque numéro désigne un gène dont l'expression est détectée grâce aux oligonucléotides présents dans le puits. 1 : BRCA1; 2 : BRCA2; 3 : AR; ctl : gène de calibration (ARNr 18s); 4 : IGFI ; 5 : EPHB2; 6 : ESR1; 7 : ESR2; 8 : AMACR; 9: BCL2; 10: RNASEL; 11 : MUC1; 12: IL18; 13: COL4A3; 14: GSTP1; 15: RASSF1. Les emplacements destinés au chargement des échantillons sont représentés par des accolades. La Figure 2 représente une plateforme à haut débit convenant à la méthode de diagnostic et/ou pronostic selon l'invention. 1 : Ordinateur avec logiciels d'acquisition et d'analyse. 2 : Douchette à code barres pour identification des plaques. 3: Appareil d'analyse par RT-qPCR. 4: Bras de chargement des plaques. 5. Lecteur de code barres. 6: Robot pour plateforme à haut débit. EXEMPLES Exemple 1 : Protocole de diagnostic et de pronostic du cancer de la prostate en utilisant une plaque microfluidique selon l'invention Les plaques microfluidiques TaqMan� à basse densité, dénommées � TLDA � pour � TagMan� Low Density Array �, sont des cartes comportant 384 puits et permettant 384 réactions simultanées de PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR), sans utilisation de robots de remplissage ou de pipettes multicanaux pour les remplir. Une telle plaque permet l'analyse simultanée de huit échantillons. Une plaque microfluidique TDLA selon l'invention a été fabriquée par Applied Biosystem (Carlsbad, California, USA). La Figure 1 montre un schéma de cette plaque microfluidique, dénommée � plaque Oncodiag �. Cette plaque comporte des oligonucléotides permettant l'analyse de seize gènes (quinze gènes de diagnostic/pronostic et un gène de calibration) par RT-qPCR. Les quinze gènes de diagnostic/pronostic dont l'expression est détectée par la plaque microfluidique selon l'invention sont connus comme étant des gènes soit surexprimés, soit sous exprimés, dans les cancers. Ainsi, BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 sont connus comme étant surexprimés dans les cancers, et le gène AR est connu comme étant sous exprimé dans les cancers. Huit échantillons peuvent être chargés et analysés simultanément grâce à cette plaque. Une fois les échantillons chargés sur la plaque, une RT-qPCR est mise en oeuvre en utilisant une plateforme de haut débit telle que celle représentée sur la Figure 2. La plaque Oncodiag permet ainsi d'estimer la sous expression ou la surexpression des gènes par rapport à un échantillon de référence (en l'occurrence, un pool d'ARN de 32 prostates saines, référence n° 636550, Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France). Plus précisément, 100 ng d'ADNc issu d'ARN de prostate, à 2 ng/pL, et 50 pL de � Mix TagMan� Universel � sont chargés dans chaque cupule de la plaque. Un échantillon de référence est étudié en parallèle des échantillons à tester. Un ensemble de cycles de PCR est ensuite lancé afin d'étudier et d'évaluer la sous expression ou surexpression des gènes de diagnostic/pronostic grâce au logiciel d'analyse RQmanager. Les résultats de la RT-qPCR sont obtenus à partir des logiciels de la plateforme de haut débit. Pour chaque échantillon à tester, la sous expression ou la surexpression des gènes de diagnostic/pronostic, par rapport à l'échantillon de référence, est calculée et fournie par le logiciel RQManager. Les données sont exportables sous Excel. Ainsi en passant les données en LOG, la référence étant évaluée à zéro, si la valeur est positive, il y a surexpression du gène et inversement si la valeur est négative, le gène est sous exprimé par rapport à la référence. Pour chacun des gènes, on attribue un score de 1 si la différence d'expression observée pour l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence est celle qui est retrouvée lors de cancers. Par exemple, si IGF1 est surexprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 1 pour IGF1. Inversement, si IGF1 est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, on attribue une valeur de 0 pour IGF1. Dans le cas de RA, on attribue un score de 1 si ce gène est sous exprimé dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence, et sinon on attribue un score de 1. En additionnant les scores obtenus pour chacun des quinze gènes, un score global est obtenu. Ce score est compris entre 0 et 15 et est corrélé avec le degré d'agressivité du cancer de la prostate. Exemple 2: Résultats Le protocole ci-dessus a été mis en oeuvre pour des échantillons d'ADNc provenant de vingt-deux patients différents. Afin de valider la méthode selon l'invention, le score Oncodiag a été comparé au score de Gleason. Le score de Gleason, qui est déterminé par anatomo-pathologie, est un score arbitraire établi durant l'examen des tissus sur lames. Il correspond à la somme de l'évaluation du degré de malignité (allant de 0 à 5) sur deux prélèvements. Les résultats obtenus pour le patient 1 sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous. Les scores Oncodiag et de Gleason déterminés pour chacun des vingt-deux patients sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 2 Gène RQ LOG RQ Score BRCA1 1,083 0,035 1 BRCA2 2,432 0,386 1 AR 0,785 -0,105 1 IGF1 1,366 0,135 1 EphB2 1,006 0,003 1 ESR1 2,279 0,358 1 ESR2 1,023 0,01 1 AMACR 8,637 0,936 1 BCL2 0,292 -0,535 0 RNASEL 0,598 -0,223 0 MUC1 0,911 -0,04 0 _ -0,262 0 IL18 0,547 /. F I A A /l A ff /l /7, '.. !l A A r .1 GSTP1 0,4 -0,398 0 RASSF1 0,961 -0,017 0 Score général Score ONCODIAG 6 Score de Gleason 6 Tableau 3 Patient Score Oncodiag Score de Gleason 1 6 6 2 2 6 3 6 6 4 9 9 9 6 6 4 6 7 5 6 8 3 6 9 5 6 6 6 11 5 6 12 1 0 13 1 0 14 9 8 9 9 16 9 0 17 9 0 18 3 0 19 9 7 9 7 21 1 0 22 9 7 Une bonne corrélation entre le score Oncodiag et le score de Gleason est observée. Plus particulièrement, tous les cancers dont le score de Gleason est 5 supérieur ou égal à 7 présentent également un score Oncodiag supérieur ou égal à 7. De ce fait, la plaque microfluidique selon l'invention permet un diagnostic et un pronostic efficace des cancers de la prostate agressifs. Exemple 3 : Les avantages des plaques microfluidiques et méthodes 10 selon l'invention L'utilisation de plaque microfluidique en RT-qPCR est une technique récente et novatrice. Les avantages techniques sont nombreux car cette technique est fiable, reproductible, simple d'utilisation et facilement réalisable. Elle est également moins coûteuse que l'utilisation de biopuces. De plus, la possibilité 15 d'utiliser une plateforme haut débit (appareil robotisé) offre la possibilité d'une analyse de routine. La fiabilité est assurée dans la continuité du système d'information grâce à un système de lecteur de code barres. Les avantages des plaques TLDA sont nombreux. La technologie TDLA est sensible et reproductible pour l'étude de l'expression des gènes. De plus, il a été démontré que cette nouvelle technique permet de produire des résultats comparables à ceux obtenus par la méthode conventionnelle de RT-qPCR. L'avantage essentiel de ce type de plaque provient de la possibilité d'étudier simultanément l'expression de plusieurs gènes issus d'un même échantillon, ce qui permet qui plus est de réaliser des économies en termes de coûts et de matériaux. Cette technique constitue une nouvelle approche de la sensibilité et de l'étude des profils transcriptomiques. Ainsi, en moins de trois jours, il est possible d'obtenir un score Oncodiag illustrant le degré d'agressivité du cancer de la prostate du patient après étude transcriptomique du panel de gènes grâce à la plaque Oncodiag. REVENDICATIONS1. Plaque microfluidique caractérisée en ce qu'elle contient des moyens pour détecter le niveau d'expression, dans un échantillon biologique, d'au moins onze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. 2. Plaque microfluidique selon la revendication 1, où ladite plaque microfluidique contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes AR, IGF1, EPHB2, AMACR, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. 3. Plaque microfluidique selon la revendication 2, où ladite plaque microfluidique contient des moyens pour détecter le niveau d'expression des gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1. 4. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où ladite plaque microfluidique contient en outre des moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène de calibration. 5. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où lesdits moyens pour détecter le niveau d'expression d'un gène sont des oligonucléotides pour amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR). 6. Plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où ladite plaque microfluidique est une carte TaqMan à basse densité (TLDA). 7. Utilisation de moyens pour détecter le niveau d'expression de gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate. 8. Utilisation d'une plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour le pronostic et/ou diagnostic in vitro du cancer de la prostate. 9. Méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) mettre une plaque microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en contact avec : (i) au moins un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate ; et (ii) au moins un échantillon de référence ; (b) réaliser une amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (RT-qPCR) ; et, de manière optionnelle, (c) déterminer si, chez le patient, les gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3 sont surexprimés ou sous exprimés par rapport à l'échantillon de référence. 10. Méthode selon la revendication 9, comprenant en outre les étapes de: (d) pour chacun des gènes tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 3, attribuer un score de 1 si : (i) chez le patient, les gènes BRCA1, BRCA2, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 sont surexprimés par rapport à l'échantillon de référence ; (ii) chez le patient, le gène AR est sous exprimé par rapport à l'échantillon de référence ; et (e) faire la somme des scores obtenus pour chacun des gènes afin d'obtenir un score global. 11. Méthode selon la revendication 10, où ledit score global est converti en un score global pondéré calculé sur une échelle de 0 à 10. 12. Méthode selon la revendication 11, où un score global pondéré supérieur ou égal à 2 indique que ledit patient souffre probablement d'un cancer de la prostate. 13. Méthode selon la revendication 11, où un score global pondéré supérieur ou égal à 7 indique que le patient souffre probablement d'un cancer de la prostate agressif. 14. Méthode in vitro de pronostic et/ou diagnostic du cancer de la prostate comprenant les étapes suivantes : (a) déterminer le niveau d'expression, dans un échantillon biologique d'un patient souffrant, ou susceptible de souffrir, d'un cancer de la prostate, d'au moins onze gènes choisis parmi les gènes BRCA1, BRCA2, AR, IGF1, EPHB2, AMACR, ESR1, ESR2, BCL2, RNASEL, MUC1, IL18, COL4A3, GSTP1 et RASSF1 ; et, de manière optionnelle, (b) comparer le niveau d'expression mesuré à l'étape (a) avec le niveau d'expression mesuré dans un échantillon de référence. 15. Méthode selon la revendication 14, où le niveau d'expression des gènes est déterminé par quantification des ARNm par RT-qPCR.20