Brevet FR2942798A1 — publié le 20100910

PEPTIDES UTILISABLES POUR LE TRAITEMENT DE LA LEUCEMIE LYMPHOÏDE CHRONIQUE La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est une hémopathie définie par l'accumulation d'un clone de petits lymphocytes B dans le sang (lymphocytes supérieurs à 4.109/Litre) et la moelle osseuse. La LLC est la plus fréquente des hémopathies chez les adultes en occident (O'Brien et al., 1995). Elle représente le tiers de l'ensemble des leucémies. Son incidence atteint 2,7 pour 105 individus aux États-Unis et en Europe. Cette incidence atteint 20 pour 105 pour les personnes âgées de plus de 70 ans. La découverte de la maladie est fortuite dans la majorité des cas, à l'occasion d'un hémogramme chez un adulte en bonne santé apparente, conduisant à la découverte d'une hyper lymphocytose variable, habituellement comprise entre 5 et 50 000/mm3 et atteignant parfois des centaines de milliers de lymphocytes B. Ces lymphocytes B présentent des caractéristiques particulières qui permettent de les distinguer des lymphocytes B normaux. Les Lymphocytes B de la LLC expriment des immunoglobulines à leur surface avec une monotypie des chaînes légères (Preud'homme and Seligmann, 1972) et des déterminants idiotypiques des chaînes lourdes (Fu et al., 1975), témoignant de la nature monoclonale de la cellule. La mono clonalité est confirmée par l'étude du réarrangement des gènes des immunoglobulines (Fialkow et al., 1978). Les LLC sont caractérisées par une expression quasiment constante du marqueur CD5 (Boumsell et al., 1978). Le marqueur CD5 est habituellement présent sur les cellules T mûres et est exprimé dans une sous-population des cellules B normales. Ces caractéristiques phénotypiques constituent aujourd'hui un des critères diagnostic de la maladie (Moreau et al., 1997). Le diagnostic repose sur la présence d'une lymphocytose excessive constatée sur plusieurs hémogrammes d'aspect morphologique particulier ; l'étude immunologique confirme l'augmentation d'une population de lymphocytes B monoclonaux CD19+ CD5+ CD23+ (Caligaris-Cappio and Hamblin, 1999). L'activité proliférative des lymphocytes B de la LLC est faible. En effet, comme le montre l'observation de l'expression des régulateurs du cycle cellulaire, les cellules sont bloquées en phase GO/Gl du cycle cellulaire (Delmer et al., 1995). L'accumulation clonale de ces cellules est liée à un défaut d'un mécanisme de mort cellulaire programmée (programm ed cal death, PCD) appelé apoptose. La protéine p27 est un inhibiteur de prolifération, dont la faible expression est souvent associée à un mauvais pronostic dans le cas de tumeur proliférative. Par contre, pour la LLC qui n'est pas une tumeur proliférative, c'est la surexpression de p27 qui est un facteur pronostique défavorable, et pourrait influencer les processus d'apoptose (Vrhovac et al., 1998). eIF4E (eukaryotic Initiation Factor 4E) est un facteur déterminant dans le contrôle de l'initiation de la traduction dépendante de la coiffe. eIF4E se lie aux ARNm possédant une coiffe (appelée "cap") à l'extrémité 5', et s'associe à eIF4G pour stimuler la synthèse protéique. L'inhibition compétitive de cette interaction par l'association de eIF4E avec 4EBP (eIF4E Binding Protein) est un mécanisme de régulation de l'initiation de la traduction essentiel, en particulier dans l'ovule d'oursin. Il a été démontré chez l'oursin que l'augmentation de l'activité traductionnelle à la fécondation passe par une dissociation du complexe eIF4E-4EBP et la dégradation de 4E-BP (Cormier et al., 2003). La traduction d'ARNm spécifiques peut également être régulée par des protéines interagissant à la fois avec eIF4E et avec dARNm (pour revue voir (Richter and Sonenberg, 2005)). Le rôle d'eIF4E dans la régulation de l'expression des ARNm ne se limite pas à l'initiation de la traduction. La liaison d'eIF4E à la coiffe des ARNm les protège d'une dégradation exonucléolytique. L'interaction d'eIF4E avec ses partenaires induit des modifications conformationnelles, ce qui change son affinité pour la coiffe et peut conduire à la dégradation de dARNm. L'interaction d'eIF4E à 4E-T est impliquée dans le routage cellulaire des ARNm vers des lieux de stockage et de dégradation. Les protéines eIF4E et 4EBP sont impliquées dans les mécanismes de survie et d'apoptose : eIF4E est caractérisé comme étant anti-apoptotique et inversement, 4EBP est identifié comme pro-apoptotique (Holcik and Sonenberg, 2005; Morley et al., 2005)). Récemment, une nouvelle fonction a été décrite : eIF4E régule l'export nucléo-cytoplasmique d'ARNm comportant une séquence 4E-SE (4E sensitivity element). Certains ARNm comportant cette séquence codent pour des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, ce qui donne un éclairage nouveau sur les propriétés prolifératives et oncogéniques d'eIF4E. Cette fonction d'eIF4E requiert son interaction avec différents partenaires dont des protéines à homéodomaines comme HoxA9 (Culjkovic et al., 2005; Topisirovic et al., 2005). La traduction de la majorité des ARNm codant pour des protéines impliquées dans la croissance et la prolifération cellulaire est fortement dépendante de la disponibilité d'eIF4E pour former un complexe fonctionnel avec eIF4G dans la cellule (Koromilas et al., 1992). 4EBP régule négativement cette interaction en s'associant à eIF4E. Dans le but de mimer la fonction de 4EBP, des peptides ou des molécule synthétiques capable de se lier à eIF4E ont été recherchées (Herbert et al., 2000; Moerke et al., 2007). Une librairie de composés chimiques a été criblée sur la propriété de ces composés à se lier à eIF4E (Moerke et al., 2007). Un composé sélectionné, 4EGI-1, est capable d'inhiber la traduction de protéines impliquées dans la croissance et la prolifération cellulaire, cet effet étant plus important dans les cellules qui surexpriment l'oncogène bcr-abl. De plus, 4EGI-1 provoque une augmentation de la proportion d'ADN en sub-GO/Gi, et l'apparition d'une morphologie nucléaire de type apoptotique. 4EGI-1 n'est plus actif en présence de ZVAD.fmk, un inhibiteur de l'apoptose. 4EGI-1 entraîne donc une PCD de type apoptotique. Ces expériences ayant été réalisées sur des cellules en présence de sérum, l'effet de 4EGI-1 s'exerce donc sur des cellules en prolifération, et passe par la voie d'apoptose "classique". L'introduction de peptides basés sur le motif de liaison de 4EBP et eIF4G dans les cellules MRC5, cultivées sans sérum pendant 72 heures, conduit à une mort cellulaire rapide (Herbert et al., 2000). Cette mort cellulaire s'apparente à une PCD, d'une part par les caractéristiques de l'ADN des cellules traitées (fragmentation observée en immunofluorescence, profil sub-GO/Gien FACS) et d'autre part par une modification de la perméabilité mitochondriale. Cette PCD n'est pas l'apoptose "classique" puisqu'elle est indépendante de l'activation de caspases et n'est pas inhibée par l'inhibiteur de l'apoptose ZVAD.fmk. De plus, cette mort cellulaire est indépendante de la traduction puisque l'effet des peptides perdure après traitement des cellules par des inhibiteurs de la traduction. Contrairement à l'étude de Moerke (supra), l'effet des peptides s'exerce sur des cellules cultivées sans sérum, donc sur des cellules arrêtées en GO/Gl, et par un mécanisme de PCD différent de l'apoptose "classique". Dans ce contexte, les inventeurs ont évalué la capacité de peptides pouvant interagir avec eIF4E, connus ou identifiés par une approche de génomique fonctionnelle originale, à induire la mort cellulaire de ces lymphocytes LLC. Ils ont ainsi mis en évidence que contrairement aux peptides décrits dans l'art antérieur pour leur capacité à se lier à eIF4E, le peptide Al WT IRS, de séquence RRKYGRDFLLRFRYIRS (SEQ ID No : 2), lorsqu'il est incubé avec des lymphocytes B issus de patients atteints de LLC et mis en culture, provoque une forte mortalité de ces lymphocytes. Cet effet est essentiellement précoce au cours de l'incubation avec les cellules en culture, et présente une spécificité intéressante vis-à-vis des lignées cellulaires myéloïdes et lymphoïdes. Le peptide Al WT IRS correspond à une séquence issue de la protéine Angel 1 humaine (peptide Al WT, de séquence RRKYGRDFLLRF (SEQ ID No : 3)), fusionné à son extrémité C-terminale à une séquence favorisant son entrée dans les cellules. Les inventeurs ont émis l'hypothèse que ce peptide pouvait conserver son activité malgré plusieurs substitutions dans sa séquence, déterminant ainsi une séquence générique de peptides actifs dans ce contexte. L'invention porte donc en premier lieu sur un peptide comprenant la séquence XIX2X3YX4X5X6X7LX8X9XIp (SEQ ID No : 1), dans laquelle : - X1 et X2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un acide aminé choisi parmi R, K et H, avec de préférence X1 = X2 =R ; - X3 représente un acide aminé choisi parmi R, K et H, de préférence R ou K; - X4, X5 et X6 représentent n'importe quel acide aminé, avec de préférence : - X4 = G, A ou S, plus préférentiellement A ou S, et/ou - X5 = R ou H, plus préférentiellement R, et/ou - X6 = D, E, A, V, L, P, M, F, I ou X, plus préférentiellement D ouA; - X7 représente un acide aminé choisi parmi F, A, V, L, I, M, de préférence F; - Xg représente un acide aminé choisi parmi L, M et F, de préférence L ; - X9 représente n'importe quel acide aminé, de préférence R ; - Xlo représente un acide aminé choisi parmi F, Y, W et H, de préférence F ou W, pour le traitement d'une maladie hématopoïétique maligne. Le peptide selon l'invention sera particulièrement efficace pour traiter la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie prolymphocytaire B (LPLB), la leucémie aigüe lymphoblastique T (LALT), le lymphome de la zone marginale (LZM), le lymphome du manteau et la leucémie aigüe myéloïde (LAM). Dans le présent texte, le terme "peptide" désigne n'importe quelle molécule dont le coeur est constitué d'acides aminés, en configuration L ou D, qui peuvent éventuellement être remplacés par des acides aminés modifiés pour avoir de meilleures propriétés pharmacocinétiques, tels que des acides a-aminés N-méthylés ou des acides aminés (éventuellement non protéinogéniques) contraints (Cowell et al., 2004). Dans un peptide au sens de la présente invention, les acides aminés ou leurs analogues peuvent être reliés entre eux par des liaisons peptidiques (-CO-NH-), mais le terme "peptide" désigne également tout enchaînement d'acides aminés (ou analogues) dans lequel une ou plusieurs liaisons peptidiques ont été modifiées, notamment pour augmenter la résistance de la molécule à la protéolyse. Le cas échéant, d'autres groupes chimiques peuvent être liés de façon covalente à ce peptide, pour lui procurer une meilleure stabilité, le protéger in vivo et/ou pour lui apporter des propriétés supplémentaires, par exemple pour favoriser son entrée dans les cellules, et/ou favoriser son adressage vers les cellules à traiter (dans le cas de la LLC, les lymphocytes B). A titre d'exemples de groupes susceptibles d'être liés au peptide de l'invention pour améliorer sa stabilité et/ou ralentir sa destruction ou son élimination in vivo, on peut citer les groupes cystéamide, cystéine, thiol, amide, carboxyles, alkyles en C1-C6 linéaires ou ramifiés, alkyles substitués, amines primaires ou secondaires, dérivés osidiques, lipides, phospholipides, acides gras, cholestérol, poly-éthylène glycol, acétyle, etc. L'homme du métier pourra choisir de greffer, aux extrémités N et/ou C-terminales du peptide, un ou plusieurs de ces groupes. Si nécessaire, par exemple dans le cas d'une addition N-terminale de cholestérol, un pont peptidique sera utilisé pour lier une molécule non peptidique au peptide de l'invention. Un exemple de pont utilisable pour cela est le pont ûCApû. Un autre moyen, largement illustré par la littérature scientifique, d'obtenir une protection et une stabilisation des peptides in vivo est de les cycliser. Le cas échéant, un pont, peptidique ou autre (par exemple S-S ou C-C), est ajouté entre les extrémités N- et C-terminales du peptide linéaire, afin d'assurer sa cyclisation. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le peptide comprenant la séquence SEQ ID No : 1 est cyclisé. A titre d'exemples de groupes favorisant l'entrée du peptide de l'invention dans les cellules, on peut citer certaines séquences peptidiques, par exemple les séquences dites "pénétratines" telles que la séquence IRS composée de la séquence d'acides aminés RYIRS (SEQ ID No : 4) (utilisée dans la partie expérimentale présentée ci-dessous), ou la séquence KKWKMRRNQFWVKVQRG (Kanovsky et al., 2001). Une telle séquence sera de préférence liée à l'extrémité C-terminale du peptide de l'invention, par une liaison peptidique ou autre. D'autres éléments susceptibles de favoriser l'entrée du peptide dans la cellule peuvent être utilisés, comme par exemple des nanoparticules. A titre d'exemples de groupes favorisant l'adressage du peptide vers certains types cellulaires, on peut citer, bien entendu, des composés peptidiques tels que des épitopes ou des fragments d'anticorps (Fab) ciblant spécifiquement des éléments de la surface cellulaire (antigènes, récepteurs) du type cellulaire ciblé, etc., mais également des sucres, tels que des monosaccharides (ex : glucose, galactose, glucosamine ou galactosamine), des oligosaccharides, polysaccharides, ou leurs analogues, ainsi que certains oligonucléotides, ou certaines molécules organiques telles que le folate. La fonction d'adressage de telles molécules est liée au fait qu'elles constituent des ligands de certains récepteurs sur-exprimés à la surface cellulaire des cellules d'intérêt. En particulier, l'adressage du peptide vers les lumphocytes B de LLC peut être assuré (i) par liaison à un peptide d'adressage tel que la séquence IRS mentionnée plus haut ; (ii) par liaison du peptide à une structure carbohydrate telle que le Sia-a2-6 Gal-(31-4G1cNAc (Hanasaki et al., 1995) qui cible la molécule CD22 des lymphocytes B ; et/ou (iii) par l'incorporation du peptide dans des immuno-nanoparticules recouvertes d'anticorps spécifique reconnaissant un ou des antigène(s) des lymphocytes B (ex :CDS et HLA-DR ou CD5 -Fc y RO). Il est à noter que la séquence IRS peut : - soit être conservée, - soit remplacée par un autre peptide d'adressage reconnaissant un récepteur d'endocytose sur le lymphocyte B de LLC (exp : HLA-DR), - soit être supprimée si le peptide est lié à une structure carbohydrate ou si le peptide est incorporé dans une immuno-nanoparticule. Les stratégies d'adressage peuvent également favoriser l'entrée du peptide dans les cellules. Il est important de noter que bien que certains des éléments qui peuvent être liés au peptide de SEQ ID No : 1 comportent des acides aminés, l'invention ne concerne pas n'importe quel peptide ou protéine comprenant cette séquence, indépendamment des acides aminés situés autour de la séquence SEQ ID No : 1. En effet, les seules séquences peptidiques qui peuvent être liées au peptide de l'invention sont, comme décrit ci-dessus, des ponts peptidiques (dont la longueur n'excèdera pas 5 acides aminés), des peptides favorisant l'entrée dans les cellules (dont la longueur n'excèdera pas 20 à 25 acides aminés, de préférence 5 à 17 acides aminés), ainsi que des peptides de ciblage (dont la taille n'excèdera pas 50 acides aminés, de préférence 5 à 20 acides aminés). Un peptide selon l'invention possède donc des caractéristiques structurales (présence de la SEQ ID No : 1 ; taille n'excédant pas 75 acides aminés environ, de préférence moins de 20 acides aminés), mais également fonctionnelles, puisqu'il doit conserver l'activité du peptide Al IRS de SEQ ID No : 2, telle que décrite à l'exemple 4 ci-dessous, le cas échéant combinée avec des fonctionnalités additionnelles telles que le ciblage de certains types cellulaires, notamment les lymphocytes B. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, le peptide utilisé pour le traitement d'une maladie telle que la leucémie lymphoïde chronique est le peptide Al WT 15 IRS de séquence RRKYGRDFLLRFRYIRS (Seq ID No : 2). L'invention porte également sur une composition pharmaceutique, destinée notamment au traitement de la leucémie lymphoïde chronique, et comprenant un peptide tel que décrit ci-dessus, associé à un vecteur. Il existe une très abondante littérature sur les vecteurs utilisables pour délivrer des composés peptidiques dans des cellules, et l'homme du 20 métier est libre, pour mettre en oeuvre l'invention, d'utiliser un peptide de séquence SEQ ID No :1 en combinaison avec n'importe quel élément susceptible de favoriser sa stabilité, son entrée dans les cellules et/ou son adressage. A titre d'exemples non limitatifs de vecteurs qui peuvent être utilisés pour délivrer le peptide de l'invention, on peut citer ceux décrits dans les articles de (Deshayes et al., 2008; Foged and Nielsen, 2008; Malik et al., 2007) et (Soares et 25 al., 2007). Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, et des figures annexées. Légendes des figures : Figure 1 : Test d'interaction des séquences peptidiques à eIF4E 30 La protéine eIF4E fusionnée à la glutathione-S-transférase (GST-eIF4E) ou la GST seule (GST) utilisée comme contrôle, sont produites en bactérie, purifiées et immobilisées sur des billes glutathione. Les protéines YFP, YFP-A1 WT et YFP-A1 YALA ont été produites en lysat de réticulocytes de lapin en présence de méthionine 35S et chromatographiées sur les billes GST-eIF4E ou GST. Les protéines retenues sur les billes sont 35 éluées et analysées par SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie. Un dixième des protéines YFP, YFP-Al WT et YFP-A1 YALA utilisées par essai ont été chargées sur le gel (input 1/10, piste 1, 4, 7). Figure 2 : Effet des peptides sur la traduction Les peptides possédant le motif IRS et les séquences de type 4EBP (Al WT, SgWT, et BP2WT) ou les séquences de type 4EBP mutantes (Al YALA, SgYALA, BP2YALA), sont incubés en lysat de réticulocyte de lapin contenant des ARNm coiffés codant pour la luciférase, enzyme dont l'activité est facilement dosable. L'activité traductionnelle est directement proportionnelle à l'activité de la luciférase produite. L'activité traductionnelle en présence de peptide est comparée à celle obtenue lors de l'ajout d'un volume équivalent de DMSO, considérée égale à 100%. Figure 3 : Effet des peptides sur la survie cellulaire Des lymphocytes B de sang périphérique prélevé sur des patients atteints de la LLC puis purifiés sur coussin de Ficoll et mis en culture sont incubés en présence de 4011M des peptides décrits figure 2. Le pourcentage de survie cellulaire après 4 heures (colonne grise) ou 24 heures (colonne blanche) de culture correspond au pourcentage de cellules non marquées ni par l'annexine ni par l'iodure de propidium évalué par cytométrie de flux. Figure 4 : Effet des peptides sur la survie des cellules après différents temps d'incubation : Les cellules sont traitées comme indiqué figure 3, sauf que le pourcentage de survie cellulaire est évalué après différent temps d'incubation :1H, 2H, 4H et 24H. Figure 5 : Effet dose-dépendant du peptide Al WT sur la survie des cellules Les cellules sont traitées comme indiqué figure 3, avec une concentration de peptides de 0, 5, 10, 20, 30, ou 40 �M. La survie cellulaire est déterminée après 24H de culture en présence de peptide. Figure 6 : Activité du peptide Al WT en présence d'émétine Les cellules sont préparées et mises en culture comme indiqué figure 3. Les cellules sont préincubées pendant une heure avec 100�M d'émétine avant ajout de 40�M des peptides Al WT ou Al YALA. Le pourcentage de survie cellulaire est évalué après 1H ,21-I et 4H d'incubation. Figure 7 : Activité du peptide Al WT sur des cellules d'origine lymphocytaire, lymphoïde, gastrique, colique ou rénale. Les cellules sont préparées et mises en culture (voir Matériel et Méthodes) puis incubées pendant 4H avec le peptide Al WT ou Al YALA. Le pourcentage de survie cellulaire correspond au pourcentage de cellules non marquées ni par l'annexine ni par l'iodure de propidium évalué par cytométrie de flux. Les noms des pathologies dont sont atteints les patients prélevés sont indiquées sous la figure. Les lymphocytes T (L.T) et B (L.B.) contrôle sont prélevés chez des patients souffrant d'une maladie non liée à une pathologie lymphocytaire (hémochromatose). Figure 8 : Effet dose-dépendant du peptide Al WT sur des cellules d'origine lymphocytaire, lymphoïde, gastrique, colique ou rénale. Panel A et B, les cellules sont préparées et traitées comme indiqué figure 3, sauf que les cellules ont été incubées avec 0, 5, 10, 20, 30 ou 40 mM de peptide Al WT ou 40 mM de peptide Al YALA. Les abréviations des noms des pathologies dont sont atteints les patients prélevés sont indiquées figure 7. Figure 9 : Activité du peptide Al WT IRS et de ses dérivés sur la survie des cellules LLC, lymphocytes T contrôles et Jok. Les cellules sont traitées comme indiqué figure 7, avec les cellules LLC, lymphocytes T contrôle et Jok, qui sont incubées avec le peptide Al WT IRS et ses dérivés décrits dans le tableau 1. Par soucis de simplification de la légende le peptide Al WT IRS est nommé � WT �. De même ses dérivés sont nommés par le nom des mutations (Al K3I IRS est nommé � K3I � par exemple). Exemples Les exemples expérimentaux décrits ci-après ont été obtenus en utilisant les matériels et méthodes suivants : Test d'interaction des peptides fusionnés à YFP Les plasmides codant pour les protéines YFP û peptides ont été obtenus par amplification du cadre de lecture de la protéine YFP (enhanced yellow-green variant of the Aequorea victoria green fluorescent protein) à partir du plasmide pEYFP-C 1 (Clontech). L'amorce 5' utilisée (séquence décrite ci dessous) a permis d'insérer un promoteur T7 (séquence soulignée) en amont du cadre de lecture de YFP. L'amorce 3' YFP a assuré l'amplification de YFP alors que l'amorce 3' Al WT a permis de fusionner l'extrémité C terminale de YFP à la séquence du peptide Al WT. Les amplimères ont été clonés dans le plasmide pCR 2.1-TOPO (TOPO TA clonig kit, Invitrogen). La mutation de YFP-Al WT pour obtenir YFP Al YALA a été réalisée à l'aide de l'amorce de mutagénène Al YALA. Les protéines YFP, YFP Al WT et YFP Al YALA ont été produites en lysat de réticulocyte de lapin (RRL) en présence Met 35S suivant les indications du fournisseur (TNT T7 coupled rabbit réticulocyte lysate system, Promega). Le plasmide pGEX 4E a été obtenu en insérant le cadre de lecture de la protéine eIF4E de souris au niveau des sites BamHI/EcoRI du vecteur PGEX-4T-1 (Amersham pharmacia biotech).La protéine recombinante eIF4E de souris fusionnée en N terminale à la GST a été produite en bactéries BL21 DE3 (Novagen) à partir du plasmide pGEX4T-eIF4E et fixée sur des billes glutathion suivant les indications du fournisseur (Glutathione sepharose 4B bead column, Amersham Pharmacia Biotech). 5 ml de RRL programmé ont été incubés en présence de 20 ml de billes GST-eIF4E dans un volume de 400 ml de PBS. Après lavage, les protéines ont été éluées par du tampon de charge SDS, et analysées après gel SDS-PAGE par autoradiographie (Typhoon Phospholmager, Amersham Pharmacia Biotech). Amorce 5' : TAATTGCTAGCTTAATACGACTCACTATAGGGACCGGTCGCCACC ATGGTGAGC (SEQ ID No : 26) Amorce 3' YFP : TTATTGAATTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG (SEQ ID No : 27) Amorce 3' Al WT : TTATTGAATTCAAGCGATGCTGCAGAAGCGGAAACGTAGCAGGA AGTCTCGGCCATACTTGCGTCTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG (SEQ ID No : 28) Amorce de mutagénèse Al YALA : GCTGTACAAGAGACGCAAGGCTGGCCGAGACTTCCTGCTACG (SEQ ID No : 29) Analyse de l'effet des peptides sur la traduction en lysat de réticulocyte de lapin Les peptides ont été produits, purifiés par HPLC (pureté >95%), et 15 lyophylisés par Thermofisher Scientific. Les peptides ont ensuite été dissous à 10 mm dans du DMSO. Les ARNm coiffés codant pour la luciférase Renillia (Luc R) ont été produits par le système T7 Message Machine Kit (Ambion) à partir du plasmide pGb-Eg2-410A2-hxG-A65 linearisé avec EcoRV (Legagneux V, Omilli F, Osborne HB (1995) 20 Substrate-specific regulation of RNA deadenylation in Xenopus embryo and activated egg extracts. RNA 1: 1001-1008). Les ARNm Luc R ont été traduits une heure à 30°C en lysat de réticulocyte de lapin (Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System, Promega) en présence de 50 �M de peptide. L'activité luciférase a été déterminée en utilisant le Renillia luciférase assay 25 (Promega) sur le luminomètre Tristar LB941 (Berthold). Isolement des lymphocytes Les lymphocytes B LLC ont été obtenus à partir de sang périphérique de 18 patients différents atteints d'une leucémie lymphoïde chronique. Les patients n'avaient pas reçu de traitement à la date du prélèvement, et présentaient différents stades d'évolution 30 (stade A, 12 patients; stade B, 3; stade C, 3) selon la classification de Binet. Les prélèvements ont été réalisés dans le centre hospitalier de Brest, au service d'hématologie. Les prélèvements sanguins ont été effectués après information et obtention du consentement avisé des patients. Les lymphocytes B et les lymphocytes T contrôles proviennent de prélèvement de sang périphérique de patients atteints d'hémochromatose, fournies par le 35 centre de transfusion CTS à BREST. Les lymphocytes B et T ont été isolés à l'aide du kit Rosett-Sep (StemCell Technologies) selon les recommandations du fournisseur. Les lymphocytes, cellules mononuclées, ont été isolées à partir des prélèvement de sang périphérique héparinés par centrifugation Ficoll-Hypaque (LSM 1077 10 lymphocyte, euro-bio). Les globules rouges ont été lysés par 10 mn d'incubation dans du VersaLyse Lysing Solution (Beckman Coulter). Les cellules mononuclées sont obtenues après 2 lavages dans du milieu de culture (RPMI1640, Gibco BRL). Après isolement, la pureté des lymphocytes B a été analysée par détection 5 des antigènes CD5,et CD 19 en cytométrie de flux (paragraphe 5) Culture cellulaire Les lymphocytes B ont été cultivés dans un milieu de culture composé de RPMI 1640 contenant 10% de FBS (sérum de veau foetal, 1% de penicilline-streptomycine et 1% de glutamine, Gibco BRL). Les cellules sont distribuées en plaque 24 puits et cultivés à 10 37°C en atmosphère humide sous 5% de CO2. 4001.11 de suspension cellulaire (1x106 cellules/ml) par puit ont été traitées pendant 4h ou 24h avec différentes concentrations de peptides. Le test d'activité des peptides en présence d'émétine (Figure 6) a été réalisé en préincubant les cellules avec 100 �M d'émétine pendant une heure avant ajout de peptide. 15 Analyse en cytométrie de flux. Les analyses ont été réalisées à l'aide du cytomètre Coulter epics XL (Beckman Coulter). Evaluation de la pureté des lymphocytes B de LLC et des lymphocytes B sains 20 Pour chaque analyse en cytométrie de flux, 2 tubes distincts ont été préparés contenant chacun 2.105 cellules reprises dans 100111 de tampon PBS. Dans un des deux tubes, 10 �l d'anticorps anti-CD 19 couplés au fluorochrome Phycoerythine (PE)(CD 19 PE, Beckman Coulter) et d'anticorps anti-CD5 couplés au fluorochrome Phycocyanine (PC)(CD5 PC, Beckman Coulter) sont ajoutés. Dans le second tube utilisé comme contrôle, sont ajoutés 25 10111 d'anticorps d'isotypes aspécifiques couplés aux fluorochromes PE (IgG1PE, Beckman Coulter) et PC (IgG1 PCy5, Beckman Coulter). Ces anticorps fixent les marqueurs de surface autres que CD5+ et CD19+. Par conséquent, le second tube sert de contrôle négatif dans l'analyse des données en cytométrie de flux. Les deux tubes sont incubés 10 minutes à l'obscurité à température ambiante. A la fin de l'incubation est ajouté lml de PBS additionné 30 de BSA à 5%, puis les cellules sont lavées comme précédemment (centrifugation 1200 rpm, 10 minutes, 20°C). A la suite de ce lavage, le surnageant est enlevé puis 500�l de PBS BSA 5% sont rajoutées sur le culot cellulaire.2.105 cellules dans l00111 de PBS ont été exposées aux anticorps antiCD5PC5 et anti CD19PE couplés à des fluorochromes pendant 10 minutes à l'obscurité. La fluorescence des cellules est analysée après lavage au PBS. 35 Mesure du pourcentage de la survie cellulaire Après lavage des cellules au PBS, les cellules ont été analysées à l'aide du système Annexin V-FITC IP selon les recommendations du fournisseur (Beckman Coulter). Exemple 1 : Identification de peptides de fortes affinités avec eIF4E Afin d'identifier et de caractériser des peptides à très forte affinité pour eIF4E, les inventeurs ont développé une approche de génomique fonctionnelle originale appelée 3D-S, qui combine biologie structurale et bio-informatique. Différentes études de l'interaction entre eIF4E et ses partenaires ont montré qu'une stratégie de liaison commune était utilisée. Le motif de reconnaissance d'eIF4E est défini par Tyr-X-X-X-X-Leu-D (SEQ ID No : 25) (où X est variable et 1 est un résidu hydrophobe, à savoir Leu, Met ou Phe). Pour trouver de nouveaux partenaires d'eIF4E, il a été recherché des protéines possédant ce motif dans une base de données contenant des protéines de nombreuses espèces : Trembl (http://www.ebi.ac.uk/trembl). Un nombre très important de protéines contiennent ce motif, ce qui est incompatible avec le nombre attendu de partenaires pour eIF4E considérant ses rôles spécifiques. Ce motif commun aux partenaires d'eIF4E connus est donc minimal mais n'est pas suffisant pour définir un site de liaison à eIF4E. Les inventeurs ont alors tiré profit des structures cristallographiques disponibles pour comprendre le mode d'interaction d'eIF4E et de ses partenaires, afin de construire une matrice de substitution d'acides aminés pour le site de liaison à eIF4E. En d'autres termes, il s'agit de définir une matrice d'acides aminés englobant l'ensemble des séquences dont la structure 3D est compatible avec une interaction avec eIF4E. Sur la base de l'observation en 3D des structures d'eIF4E en interaction avec un peptide issu de 4E-BP ou d'un peptide issu de eIF4G, l'effet de changement d'acide aminé a été testé pour chaque position du site de liaison à eIF4E, sur une longueur de 10 acides aminés. Ceci a permis de générer une matrice d'analyse, dénommée matrice 3D-S/4EBS (matrice d'analyse 3D-S pour eIF4E binding site). A l'aide de cette matrice d'acides aminés, de nouveaux partenaires d'eIF4E ont été recherchés par bio-informatique. Comme attendu, eIF4G et 4EBP ont été trouvés. Ceci a permis d'identifier également 582 protéines possédant cette séquence (sur un total de 2914826 protéines). Parmi les protéines identifiées, des faux négatifs peuvent correspondre à des protéines qui ne présentent par le site d'interaction à leur surface, ou qui sont localisées dans des compartiments cellulaires sans eIF4E. Afin d'augmenter la spécificité de cette recherche, les inventeurs ont posé l'hypothèse que si l'interaction d'eIF4E avec un partenaire était importante fonctionnellement, le motif devait être conservé dans l'évolution. La base de données comportant des protéines de nombreuses espèces, une recherche de protéines homologues parmi les 582 protéines issues de la première sélection a été réalisée. Cette analyse d'homologie a consisté en l'alignement des protéines 2 à 2 et à la constitution de groupes de protéines en prenant les paramètres suivants : la taille de l'alignement entre 2 séquences A et B doit correspondre à au moins 75% de longueur de A, et le pourcentage d'identité doit être supérieur à 50%. Parmi les 582 protéines issues de la première sélection, 315 ont été classée en 66 groupes. Quatorze groupes ont été jugés pies plus intéressants. Ces groupes, rassemblant 152 protéines au total, sont constitués de protéines dont plus de 2 homologues possèdent le site de liaison à eIF4E. L'un des groupes comporte même des homologues issus de 10 espèces différentes. Parmi ces 14 groupes, 6 correspondent à des protéines annotées, représentées dans des banques d'ADNc, mais pour lesquelles aucune fonction n'a été décrite. En conclusion, le criblage 3D-S de la base de données de protéines Trembl (http://www.ebi.ac.uk/trembl) a permis de sélectionner 582 protéines (possédant une séquence 4EBP like) classées en 14 groupes. La validation biochimique des peptides identifiés a ensuite été effectuée par des approches de chromatographie d'affinité. La séquence 4EBPlike de l'homologue humain de chacun des 14 groupes a été utilisée pour produire des protéines de fusion entre YFP (yellow fluorescent protein) et chaque peptide en lysat de réticulocytes de lapin (milieu réactionnel permettant la traduction d'ARNm in vitro). La capacité de ces peptides à interagir avec eIF4E a été ensuite analysée par chromatographie d'affinité. Parmi les 14 protéines testées, 6 interagissent avec eIF4E. De manière intéressante, un peptide appelé YFP-A1 WT (protéine YFP, yellow fluorescent protein, fusionnée à un peptide issu de la protéine Angel 1 humaine, de séquence RRKYGRDFLLRF (SEQ ID No : 3)), s'associe plus fortement à eIF4E que les autres peptides testés. Exemple 2 : le peptide Al WT interagit avec eIF4E, la mutation YALA abolit cette interaction. La séquence 4E-BP like de la protéine Al sauvage (wild type, WT) fusionnée à la protéine YFP et la protéine YFP seule utilisée comme contrôle ont été produites en lysat de réticulocyte de lapin et marquées à la méthionine radioactive (Met 35S). Les protéines YFP-A1 WT et YFP ont ainsi été obtenues sous forme soluble. Trois acides aminés connus pour être essentiels à l'interaction avec eIF4E dans la séquence de 4E-BP2 humaine sont retrouvés dans la séquence 4E-BP like de la protéine Al sauvage. Afin d'obtenir une protéine mutante incapable d'interagir avec eIF4E utilisable comme contrôle, ces trois acides aminés ont été mutés pour obtenir la protéine YFP-A1 YALA (mutation des acides aminés tyrosine (Y) et leucine (L) en alanine (A)), dans lequel le peptide Al YALA présente la séquence suivante : RRKAGRDFAARF (SEQ ID No : 5). Les protéines produites ont été analysées sur un gel SDS-PAGE suivi d'une autoradiographie (Figure 1, "input 1/10", pistes 1, 4, 7). YFP- Al WT est retenue sur des billes GST-eIF4E (piste 5) alors que YFP non fusionnée n'est pas retenue (piste 2). Les billes GST ne retiennent aucune protéine, démontrant la spécificité de l'interaction (piste 6). Lorsque les trois acides aminés sont mutés l'interaction est très faible (piste 8). Cette expérience montre l'interaction entre eIF4E et la séquence 4E-BP like de la protéine Angel 1, et que cette interaction est perdue après mutation YALA. Exemple 3 : le peptide Al WT, possédant un site d'interaction avec eIF4E, inhibe la traduction Le peptide correspondant à la séquences 4E-BP like de la protéine Angel 1 (Al WT), a été synthétisé chimiquement en fusion avec la séquence IRS composée des acides aminés RYIRS (SEQ ID No: 4) ; pour une utilisation in vivo, cette séquence peut soit être conservée, soit être remplacée par une autre séquence pénétratine, par un autre polypeptide tel qu'une molécule du CMH, par exemple HLA-DR, ou par un autre élément, tel qu'un carbohydrate ou une nano-particule, etc.. Des peptides déjà connus pour interagir avec eIF4E issus des protéines 4E-BP2 humaine (BP2WT) et 4E-BP d'oursin Sphaerichinus granularis (SgWT) ont également été synthétisés, également fusionnés à la séquence IRS. De plus, les acides aminés tyrosine (Y) et leucine (L), connus comme étant essentiels à l'interaction avec eIF4E pour la protéine 4E-BP2 humaine, ont été remplacés par des alanines (A) pour obtenir les peptides Al YALA IRS, BP2 YALA IRS et Sg YALA IRS qui ont été utilisés comme contrôles. La pureté des peptides analysée par spectrométrie de masse est supérieure à 95%. Al YALA IRS RRKAGRDFAARFRYIRS (SEQ ID No : 6) BP2 WT IRS RIIYDRKFLLDRRYIRS (SEQ ID No : 7) BP2 YALA IRS RIIADRKFAADRRYIRS (SEQ ID No : 8) Sg WT IRS RIIYDRHFLLNMRYIRS (SEQ ID No : 9) Sg YALA IRS RIIADRHFAANMRYIRS (SEQ ID No : 10) 20 Un ARNm coiffé (possédant une coiffe appelée "cap" à l'extrémité 5') codant pour la luciférase, protéine facilement dosable par la mesure de son activité, a été traduit en présence de ces différents peptides en lysat de reticulocytes de lapin (Figure 2). L'activité luciférase mesurée est directement proportionnelle à la quantité de protéine luciférase produite et donc à l'activité traductionnelle dépendante de la coiffe ("cap- 25 dependent"). Les peptides étant dissous dans du DMSO, il était important de tester l'effet du DMSO sur la traduction. Il a été observé que l'ajout de DMSO n'affectait pas la traduction (comparer l'ajout d'eau (H2O) et de DMSO, figure 2). L'activité traductionnelle en présence de peptide a été comparée à celle obtenue lors de l'ajout d'un volume égal de DMSO, considérée égale à 100%. En présence du peptide BP2 WT IRS à une concentration finale de 30 50 �M, une forte inhibition de la traduction a été observée par rapport au contrôle. Par contre le peptide BP2 YALA IRS utilisé comme contrôle négatif (il n'interagit pas avec eIF4E), ne provoque pas d'inhibition de la traduction de la luciférase. Il en est de même pour les peptides issus de la séquence de 4E-BP de l'oursin (Sg WT IRS et Sg YALA IRS). De manière intéressante, le peptide issu de la protéine Angel 1 (Al WT IRS) inhibe la traduction de façon 35 plus importante, comparé aux autres peptides. Comme attendu, le peptide Al YALA IRS n'inhibe pas la traduction démontrant la spécificité d'action du peptide Al WT IRS sur la traduction dépendante d'eIF4E.15 Exemple 4 : effet des peptides sur des lymphocytes LLC prélevés chez des patients puis mis en culture Les cellules prélevées sur des patients atteints de leucémie lymphoïde chronique ont été purifiées sur coussin de Ficoll. La pureté des lymphocytes B analysée par détection des antigènes CD5 et CD19 par FACS est supérieure à 95% dans toutes les expériences réalisées. Les cellules ont été mises en culture dans du milieu RPMI en présence de 10% FBS (sérum de veau foetal). Les peptides ont été ajoutés directement dans le milieu de culture. Ces peptides comportent la séquence IRS (dont la séquence en acides aminés est RYIRS) qui est connue pour pelmettre la pénétration de peptides dans les lymphocytes B en culture (Dong et al., 2005). Les cellules ont été analysées avec le kit de détection annexin/Iodure de Propidium (Beckman Coulter), permettant de mettre en évidence l'exposition extracellulaire de phosphatidylsérine et l'apparition d'une perméabilté membranaire, événements caractéristiques de la PCD. Les cellules qui survivent au traitement sont celles qui ne sont marquées ni par l'annexine ni par l'Iodure de Propidium. Les conditions de culture permettent la survie des lymphocytes purifiés puisque le pourcentage de survie ne passe que de 96 à 84% après 4H et 24H de culture respectivement (Figure 3). Lorsque les peptides 4EBP2WT et SgBPWT (connus pour interagir avec eIF4E) ont été incubés avec les cellules, le pourcentage de survie n'a pas diminué. Par contre le peptide Al WT (peptide découvert au cours de cette étude) a provoqué une forte mortalité puisque seulement 25% des cellules survivaient après 4H d'incubation. Ce pourcentage est passé à 19% après 24H, indiquant que l'effet du peptide est essentiellement précoce. Le peptide Al YALA IRS, incapable d'interagir avec eIF4E, n'a pas d'effet, ce qui indique que l'activité du peptide Al WT IRS est spécifique. Cette expérience permettant de comparer les effets des peptides 4EBPWT, SgBPWT et Al WT a été vérifiée sur 3 lots de cellules purifiées (obtenues à partir de 3 patients différents atteints de LLC), et sur 2 lots de peptides Al (pureté supérieure à 95 et 99% respectivement pour chaque lot). Afin de suivre l'évolution de l'effet du peptide Al WT au cours des 24H de l'expérience, le pourcentage de survie lors de l'incubation avec les peptides Al WT IRS et Al YALA IRS a été analysé à différents temps après incubation. Les résultats sont présentés figure 4. Alors que l'effet du peptide Al WT IRS est observé au cours des 4 premières heures d'incubation, la différence de survie par rapport aux cellules non traitées n'augmente plus ensuite, ce qui indique que le peptide n'est plus actif après 4H d'incubation. Ceci peut s'expliquer par une dégradation du peptide au cours de l'incubation dans le milieu de culture. En conclusion, le peptide Al WT provoque une forte mortalité des lymphocytes B LLC, et cet effet est essentiellement précoce au cours de l'incubation avec les cellules en culture. Lorsque le peptide Al WT IRS a été incubé à différentes concentrations avec les cellules LLC pendant 24H, la mortalité cellulaire a augmenté avec la concentration de peptide (figure 5). L'IC50, définie comme la concentration de peptide capable d'entraîner la mort de 50% des cellules après 24H est d'environ 28 �M. Cette expérience a été reproduite sur un lot de cellules provenant d'un deuxième patient, pour lequel l'IC50 s'est élevée à 24 �M. eIF4E, cible du peptide A1WT, intervient dans la régulation de l'initiation de la traduction, mais également dans la stabilité et le transport des ARNm. Les inventeurs ont voulu déterminer si la traduction était nécessaire à l'effet du peptide (figure 6). L'ajout d'émétine, inhibiteur de la traduction, n'a provoqué qu'un faible effet sur la survie des cellules, qui est passée de 97 à 82% après 4H d'incubation. L'efficacité de l'inhibition de la traduction a été vérifiée par incorporation de Methionine 35S (résultat non présenté). Lors de l'ajout du peptide A1WT en présence d'émétine, la survie des cellules est passée de 97% à 27% en 4H, ce qui montre que le peptide est toujours efficace en absence de traduction. Cette expérience reproduite sur un deuxième lot de cellules purifiées a conduit à un résultat similaire. L'effet du peptide Al WT sur eIF4E ne concerne donc pas directement ses fonctions de régulation de la traduction. Ainsi, parmi les différents peptides 4EBP-like testés qui interagissent avec eIF4E, et inhibent la fonction d'eIF4E dans la traduction, seul le peptide Al WT identifié au cours de cette étude provoque, par son interaction avec eIF4E, la mort cellulaire de lymphocytes B de patients atteints de LLC. Cet effet est indépendant de la traduction et touche donc une fonction d'eIF4E indépendante de la traduction. Le peptide A1WT est donc un peptide original potentiellement exploitable en thérapie contre la LLC. Exemple 5 : Effet du peptide Al sur différentes lignées cellulaires d'origine myéloïde, lymphoïde, gastrique, colique ou rénale. Afin de déterminer si le peptide Al pouvait être potentiellement exploitable pour la thérapie d'autres pathologies que la LLC, les inventeurs ont testé l'effet du peptide Al WT IRS sur d'autres cellules d'origine lymphoïde ou myéloïde. Le peptide Al YALA IRS est utilisé comme contrôle. Les cellules d'origine lymphoïde provenaient toutes de prélèvements chez des patients souffrant de différentes pathologies classées en fonction du siège de la prolifération tumorale. Cette prolifération a lieu soit dans la moelle osseuse, pour la LLC, la Leucemie pro-lymphocytaire B et la leucémie aigüe lymphoblastique T (LAL T); soit dans les ganglions pour le lymphome de manteau et le lymphome de la zone marginale. Un classement peut également être fait en fonction du type cellulaire touché : lymphocytes B (LLC, Leucémie pro-lymphocytaireB, lymphome de manteau et lymphome de la zone marginale) ou lymphocytes T (LAL T). Les cellules d'origine myéloïde ont soit été prélevées sur des patients atteints de leucémie aiguë myéloïde (2 patients). Les inventeurs ont d'abord testé une autre lignée leucémique que la LLC : la leucémie pro-lymphocytaire B (pro-ly, fig.7). Comme indiqué figure 7, ces cellules sont sensibles au peptide Al WT puisque la survie cellulaire n'est que de 20% après 24H de traitement, proche du taux de survie observé pour les cellules LLC. Le peptide A1WT peut donc toucher des cellules issues de différentes lignées leucémiques dont la LLC et la leucémie pro-lymphocytaire B. Des cellules cancéreuses de type B mais non leucémiques et provenant de lymphomes malins dont l'origine prédominante est ganglionnaire ont ensuite été testées. Il s'agit du lymphome du manteau (MAN, fig.7, 1 patient) et du lymphome de la zone marginale (LZM, 1 patient). Le taux de survie en présence du peptide Al WT est d'environ 30% (Fig. 7), proche de celui observé pour les cellules LLC. L'activité du peptide Al WT n'est donc pas spécifique de cellules issues de pathologies leucémiques. L'effet du peptide Al WT a ensuite été testé sur des lymphocytes T obtenus par prélèvement d'un patient atteint d'une leucémie aiguë lymphoblastique T (LALT, Fig. 7). Les résultats montrent que l'effet du peptide est aussi important que pour les cellules LLC. Le peptide agit donc sur des cellules cancéreuses de type T comme de type B. Une lignée myéloïde a ensuite été utilisée. Le peptide A1WT est actif sur des cellules prélevées chez deux patients atteints de leucémie aiguë myeloide (LAM, Fig. 7) puisque qu'un taux de survie de 38% est observé. Ces résultats montrent que le peptide n'est pas spécifique des pathologies lymphoïdes mais est également actif sur les lignées myéloïdes testées. L'effet du peptide a également été testé sur des lymphocytes B et T (L.T et L.B, Fig. 7) obtenus à partir de sang périphérique prélevés chez 6 patients souffrant d'une maladie non liée à une pathologie lymphocytaire, l'hémochromatose. Les résultats ont montré que le peptide agit également sur ces lymphocytes B et T, bien que l'effet était plus important sur les lymphocytes B que sur les lymphocytes T avec un taux de survie respectivement de 12% et 38% après 4H d'incubation avec 40 �M de peptide Al WT (Figure 7). Il est intéressant de noter que le peptide agit sur des cellules bloquées en GO-G1 (lymphocytes B provenant de patient atteint de LLC) et également sur les cellules qui sont en prolifération (toutes les lignées utilisées sauf lymphocytes B provenant de patient atteint de LLC). Le peptide étant efficace sur de nombreuses pathologies cancéreuses hématopoïétiques, les inventeurs ont ensuite testé des cellules issues d'un cancer solide, la lignée cellulaire HGT1 issue d'un cancer gastrique. L'effet du peptide était faible, puisque plus de 88% des cellules survivent après 4H de traitement avec le peptide Al WT (HGT1, fig.7). De même, la survie de cellules issues d'un cancer colique humain ou d'un cancer du rein simien est peu affectée par le peptide (respectivement 94 et 90% de survie cellulaire). Afin de classer les cellules en fonction de leur sensibilité au peptide, les cellules ont été exposées à différentes concentrations de peptide Al WT IRS (Fig. 8). Pour toutes les cellules analysées, le taux de survie cellulaire diminue lorsque la concentration en peptides augmente. En terme de taux de réponse au peptide, on peut définir 3 groupes de populations cellulaires, en fonction du taux de survie cellulaire par rapport aux cellules incubées sans peptide, après 4h d'incubation avec 24LM de peptide : - Cellules répondant faiblement, survie cellulaire supérieure à 90% : Leucémie Aigüe Myéloïde (LAM) et cellules issues de cancers gastrique, colique ou rénal. - Cellules présentant une réponse partielle, survie cellulaire comprise entre 75 et 90% : lymphome de la zone marginale (LZM), lymphome du manteau, lymphocytes T contrôles. - Cellules présentant une réponse importante, survie cellulaire inférieure à 65% : LLC, Leucémie pro-lymphocytaire B, lymphocytes B contrôles, leucémie aigüe 15 lymphoblastique T (LALT). En conclusion, le peptide Al WT pourrait ouvrir des perspectives de thérapie de différentes pathologies cancéreuseshématopoïétiques. Ce potentiel est renforcé par la sélectivité d'action de ce peptide, puisqu'il a peu d'effet sur les cellules issues de cancers gastrique, colique ou rénal. 20 Exemple 6 : analyse de l'effet de différents mutants obtenus à partir du peptide Al sur des lymphocytes LLC prélevés chez des patients Les inventeurs ont ensuite réalisé une série de peptides variants, obtenus par substitution (conservative ou non) d'un ou deux acides aminés du peptide Al, ou par délétion des deux premiers acides aminés. La liste des peptides testés dans cette nouvelle série 25 d'expériences est indiquée ci-après : 10 Tableau 1 : Présentation de la séquence des peptides et de leur effet cellulaire. l ère colonne : Effet cellulaire Peptide Séquence SEQ ID LLC LT Jok Jok No 40 40 20 40 Al WT IRS RRKYGRDFLLRFRYIRS 2 + + + + Al YALA IRS RRKAGRDFAARFRYIRS 6 - - - - Al K3I IRS RRIYGRDFLLRFRYIRS 11 - nd +/- + Al del2 IRS KYGRDFLLRFRYIRS 12 - - +/- + Al R1,2K IRS KKKYGRDFLLRFRYIRS 13 + +/- +/- + Al R1,2G IRS GGKYGRDFLLRFRYIRS 14 - - - +/- Al K3R IRS RRRYGRDFLLRFRYIRS 15 + + + + Al G5A-IRS RRKYARDFLLRFRYIRS 16 + + + + Al G5S IRS RRKYSRDFLLRFRYIRS 17 + + + + Al R6K IRS RRKYGKDFLLRFRYIRS 18 + +/- +/- + Al R6H IRS RRKYGHDFLLRFRYIRS 19 +/- +/- + + Al D7E IRS RRKYGREFLLRFRYIRS 20 + + + + Al D7A IRS RRKYGRAFLLRFRYIRS 21 + + + + Al F12K IRS RRKYGRDFLLRKRYIRS 22 - - - - Al F12W IRS RRKYGRDFLLRWRYIRS 23 + + + +/- BP2 WT IRS RIIYDRKFLLDRRYIRS 7 - nd - - BP2 I3K IRS RIKYDRKFLLDRRYIRS 24 - - - - nom des peptides. 2eme colonne : séquence des peptides, les acides aminés mutés par rapport à la séquence de Al WT IRS sont indiqués en gras. Le peptide Al YALA IRS correspond aux mutations Y4AL9,10A dans la séquence Al WT IRS. 3ème colonne : numéro des séquences. Colonnes suivantes : niveau d'effet des peptides pour induire la mortalité de lymphocytes B de patients LLC à 40 .iM (colonne LLC 40), de lymphocytes T contrôles à 40 �M (colonne LT40), de cellules Jok à 20 (colonne Jok 20) ou à 40 �M (colonne Jok 40). + : survie 50%, n.d : non déterminé ; ce pourcentage de survie cellulaire correspond au pourcentage de cellules non marquées (ni par l'annexine ni par l'iodure de propidium), évalué par cytométrie de flux, après 4 heures de culture en présence de peptide. L'échantillon contrôle correspond aux cellules incubées sans peptide. Les peptides ont été testés sur des lymphocytes B de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique, des lymphocytes T contrôles, ou des cellules Jok (lignée cellulaire dérivée de lymphocytes B). L'expérience a été répétée 3 fois pour chaque type de cellule testé. Les cellules incubées sans peptide ont présenté un pourcentage de survie supérieur à 96% (contrôle, figure 9). Le peptide Al WT IRS (SEQ ID No : 2) induit à 40 �M une forte mortalité cellulaire dans les cellules LLC et les cellules Jok (figure 9 et tableau 1) ; le taux de survie est plus élevé dans les cellules T contrôles comme déjà décrit dans les expériences précédentes (figures 7 et 8). Le peptide Al YALA IRS (SEQ ID No : 6, correspondant à Y4AL9AL10A Al IRS), utilisé comme contrôle négatif puisqu'il ne se lie pas à eIF4E, comme attendu n'a 15 pas d'effet. Le peptide Al de12 IRS (SEQ ID No : 12) : la délétion des deux premiers acides aminés de la séquence de Al WT IRS provoque la perte d'effet du peptide à 40 �M sur les cellules LLC, les lymphocytes T contrôles, ainsi que sur les cellules Jok à 20 M. A 40 �M, il provoque tout de même une mortalité importante sur les cellules Jok. 20 Le peptide Al R1,2K IRS (SEQ ID No : 13): le remplacement des deux arginines (RR) par 2 acides aminés lysine (KK) diminue l'effet à 40 �M dans les cellules LLC et les lymphocytes T contrôle, ainsi que sur les cellules Jok à 20 �M. A 40 �M, il a le même effet que le peptide Al WT IRS sur les cellules Jok. Le peptide Al R1,2G IRS (SEQ ID No : 14): La substitution des deux 25 premiers acides aminés par 2 acides aminés neutres glycine (GG) abolit l'effet du peptide, sauf dans les cellules Jok lorsqu'il est utilisé à 401.1M où son effet n'est que partiellement diminué. Les peptides Al K3R IRS (SEQ ID No : 15) et Al K3I IRS (SEQ ID No : 1 l) : la substitution de l'acide aminé lysine en position 3 par une arginine (R) ne modifie pas 30 l'effet du peptide dans les trois types cellulaires, alors que la substitution du même acide aminé par une isoleucine (I) provoque la perte d'effet du peptide à 40 �M sur les cellules LLC, ainsi que partiellement sur les cellules Jok à 20 �M. Les peptides Al G5A IRS (SEQ ID No : 16) et Al G5S IRS (SEQ ID No : 17) : la substitution de l'acide aminé glycine (G) en position 5 par un acides aminés alanine 35 (A) ou par une serine (S) augmente légèrement l'effet du peptide dans les trois types cellulaires. Les peptides Al R6K IRS (SEQ ID No : 18) et Al R61I IRS (SEQ ID No : 19) : la substitution de l'acide aminé R (Arginine) en position 6 par l'acide aminé lysine (K) diminue partiellement l'action de peptides dans les trois types cellulaire alors que sa substitution par une histidine (H) annule l'effet sur les cellules LLC et les lymphocytes T contrôles, contrairement aux cellules Jok où l'effet est potentialisé. Les peptides Al D7E IRS (SEQ ID No : 20) et Al D7A IRS (SEQ ID No : 21) : la substitution de l'acide aminé acide aspartique en position 7 par des acides aminés acide glutamique (E) ou alanine(A) ne modifie pas l'action de peptides dans les cellules LLC et les lymphocytes T saines, sauf pour le peptide D7E dans les cellules de Jok où sont effet est potentialisé. Le peptide Al F12K IRS (SEQ ID No : 22) et Al F12W IRS (SEQ ID No : 23) : la substitution de l'acide aminé phenylalanine (F) en position 12 par l'acide aminé lysine (K) abolit complètement l'action du peptide dans les trois types cellulaires, alors que son remplacement par un tryptophane (W) ne modifie pas l'action de peptides dans les trois types cellulaires. Le peptide BP2 WT IRS (SEQ ID No : 7) correspond à la séquence de liaison à eIF4E de la protéine 4E-BP2 humaine. 4E-BP2 est une protéine connue pour interagir avec eIF4E (choisie pour son affinité pour eIF4E qui est supérieure à 4E-BP1 (Ptushkina, EMBO J, 1999)). Ce peptide n'a pas d'effet ni sur les cellules LLC ni sur les cellules Jok. Le peptide BP2 I3K IRS (SEQ ID No : 24) : il s'agit de la séquence BP2 mutée en position 3. Une isoleucine est présente en position 3 de BP2 et SBP, alors qu'une lysine est présente à cette position dans la séquence de Al WT. Les inventeurs ont testé si cette différence pouvait être à l'origine de la différence d'effet cellulaire entre Al WT et BP2 WT. Les résultats montrent que le substitution de l'acide aminé isoleucine (I) en position 3 de BP2WT par l'acide aminé lysine (K) ne confère pas à ce dernier une meilleure efficacité. Alors que le peptide BP2 inhibe efficacement la traduction dépendante de eIF4E (fig. 2), il n'a pas d'effet sur la survie cellulaire. La capacité d'un peptide de se lier à eIF4E et d'inhiber la traduction n'est donc pas suffisante pour entraîner la mortalité cellulaire observée avec Al WT. En conclusion, les mutations du peptide peuvent diminuer ou augmenter 30 l'efficacité du peptide à induire la mort cellulaire, et ceci de façon dépendante du type cellulaire analysé. En particulier : a) Les 2 premiers acides aminés sont nécessaires à l'activité du peptide, et doivent être de préférence des acides aminés basiques, par exemple des arginines. b) L'acide aminé en position 3 doit également être choisi parmi les acides 35 aminés basiques (R, K, H). c) Une sérine ou une alanine sera choisie de préférence en position 5. d) En position 6 sera choisi de préférence une arginine (R). Une histidine sera préférée pour un moindre effet LLC et lymphocytes T contrôles par rapport aux cellules Jok. e) La mutation testée en position 7 n'a pas d'effet. Si un moindre effet sur les Jok est recherché par rapport à l'effet sur les cellules LLC et lymphocytes T contrôles, l'acide glutamique (E) sera évité. f) L'acide aminé en position 12 sera soit la phénylalanine (F) soit le tryptophane (W). REFERENCES Boumsell, L., Bernard, A., Lepage, V., Degos, L., Lemerle, J. and Dausset, J. (1978) Some chronic lymphocytic leukemia cells bearing surface immunoglobulins share determinants with T cells. Eur Jlmmunol, 8, 900-904. Caligaris-Cappio, F. and Hamblin, T.J. (1999) B-cell chronic lymphocytic leukemia: a bird of a different feather. J Clin Oncol, 17, 399-408. Cormier, P., Pyronnet, S., Salaun, P., Mulner-Lorillon, O. and Sonenberg, N. (2003) Cap- dependent translation and control of the cell cycle. Prog Cell Cycle Res, 5, 469-475. Cowell, S.M., Lee, Y.S., Cain, J.P. and Hruby, V.J. (2004) Exploring Ramachandran and chi space: conformationally constrained amino acids and peptides in the design of bioactive polypeptide ligands. Curr Med Chem, 11, 2785-2798. Culjkovic, B., Topisirovic, I., Skrabanek, L., Ruiz-Gutierrez, M. and Borden, K.L. (2005) eIF4E promotes nuclear export of cyclin Dl mRNAs via an element in the 3'UTR. J Cell Biol, 169, 245-256. Delmer, A., Aj chenbaum-Cymbalista, F., Tang, R., Ramond, S., Faussat, A.M., Marie, J.P. and Zittoun, R. (1995) Overexpression of cyclin D2 in chronic B-cell malignancies. Blood, 85, 2870-2876. Deshayes, S., Morris, M., Heitz, F. and Divita, G. (2008) Delivery of proteins and nucleic acids using a non-covalent peptide-based strategy. Adv Drug Deliv Rev, 60, 537-547. Dong, C., Li, Q., Lyu, S.C., Krensky, A.M. and Clayberger, C. (2005) A novel apoptosis pathway activated by the carboxyl terminus of p2l. Blood, 105, 1187-1194. Fialkow, P.J., Najfeld, V., Reddy, A.L., Singer, J. and Steinmann, L. (1978) Chronic lymphocytic leukaemia: Clonai origin in a committed B-lymphocyte progenitor. Lancet, 2, 444-446. Foged, C. and Nielsen, H.M. (2008) Cell-penetrating peptides for drug delivery across membrane barriers. Expert Opin Drug Deliv, 5, 105-117. Fu, S.M., Winchester, R.J. and Kunkel, H.G. (1975) Similar idiotypic specificity for the membrane IgD and IgM of human B lymphocytes. J Immunol, 114, 250-252. Hanasaki, K., Powell, L.D. and Varki, A. (1995) Binding of human plasma sialoglycoproteins by the B cell-specific lectin CD22. Selective recognition of immunoglobulin M and haptoglobin. JBiol Chem, 270, 7543-7550. Herbert, T.P., Fahraeus, R., Prescott, A., Lane, D.P. and Proud, C.G. (2000) Rapid induction of apoptosis mediated by peptides that bind initiation factor eIF4E. Curr Biol, 10, 793-796. Holcik, M. and Sonenberg, N. (2005) Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol, 6, 318-327. Kanovsky, M., Raffo, A., Drew, L., Rosai, R., Do, T., Friedman, F.K., Rubinstein, P., Visser, J., Robinson, R., Brandt-Rauf, P.W., Michl, J., Fine, R.L. and Pincus, M.R. (2001) Peptides from the amino terminal mdm-2-binding domain of p53, designed from conformational analysis, are selectively cytotoxic to transformed cells. Proc Nad Acad Sci USA, 98, 12438-12443. Koromilas, A.E., Lazaris-Karatzas, A. and Sonenberg, N. (1992) mRNAs containing extensive secondary structure in their 5' non-coding region translate efficiently in cells overexpressing initiation factor eIF-4E. Embo J, 11, 4153-4158. Malik, D.K., Baboota, S., Ahuja, A., Hasan, S. and Ali, J. (2007) Recent advances in protein and peptide drug delivery systems. Curr Drug Deliv, 4, 141-151. Moerke, N.J., Aktas, H., Chen, H., Cantel, S., Reibarkh, M.Y., Fahmy, A., Gross, J.D., Degterev, A., Yuan, J., Chorev, M., Halperin, J.A. and Wagner, G. (2007) Smallmolecule inhibition of the interaction between the translation initiation factors eIF4E and eIF4G. Cell, 128, 257-267. Moreau, E.J., Matutes, E., A'Hern, R.P., Morilla, A.M., Morilla, R.M., Owusu-Ankomah, K.A., Seon, B.K. and Catovsky, D. (1997) Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). Am J Clin Pathol, 108, 378-382. Morley, S.J., Coldwell, M.J. and Clemens, M.J. (2005) Initiation factor modifications in the preapoptotic phase. Cell Death Differ, 12, 571-584. O'Brien, S., del Giglio, A. and Keating, M. (1995) Advances in the biology and treatment of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood, 85, 307-318. Preud'homme, J.L. and Seligmann, M. (1972) Immunoglobulins on the surface of lymphoid cells in Waldenstrom's macroglobulinemia. J Clin Invest, 51, 701-705. Richter, J.D. and Sonenberg, N. (2005) Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature, 433, 477-480. Soares, A.F., Carvalho Rde, A. and Veiga, F. (2007) Oral administration of peptides and proteins: nanoparticles and cyclodextrins as biocompatible delivery systems. Nanomed, 2, 183-202. Topisirovic, I., Kentsis, A., Perez, J.M., Guzman, M.L., Jordan, C.T. and Borden, K.L. (2005) Eukaryotic translation initiation factor 4E activity is modulated by HOXA9 at multiple levels. Mol Cell Biol, 25, 1100-1112. Vrhovac, R., Delmer, A., Tang, R., Marie, J.P., Zittoun, R. and Ajchenbaum-Cymbalista, F. (1998) Prognostic significance of the cell cycle inhibitor p27Kipl in chronic B-cell lymphocytic leukemia. Blood, 91, 4694-4700. REVENDICATIONS1. Peptide comprenant la séquence X1X2X3YX4X5X6X7LX8X9X10 (SEQ ID No : 1), dans laquelle : - X1 et X2 représentent, indépendamment l'un de l'autre, un acide aminé 5 choisi parmi R, K et H, - X3 représente un acide aminé choisi parmi R, K et H, - X4, X5 et X6 représentent n'importe quel acide aminé, - X7 représente un acide aminé choisi parmi F, A, V, L, I et M, - X8 représente un acide aminé choisi parmi L, M et F, 10 - X9 représente n'importe quel acide aminé, - X10 représente un acide aminé choisi parmi F, Y, W et H, pour le traitement d'une maladie hématopoïétique maligne. 2. Peptide selon la revendication 1, pour le traitement d'une maladie choisie parmi la leucémie lymphoïde chronique, la leucémie pro-lymphocytaire B, la leucémie aigüe 15 lymphoblastique T, le lymphome de la zone marginale, le lymphome du manteau et la leucémie aigüe myéloïde. 3. Peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel : - X1= X2 = R, et/ou - X3 = K ou R, et/ou 20 - X4 = G, A ou S, et/ou - X5 = R ou H, et/ou - X6 = D, E, A, V, L, P, M, F, I ou X, et/ou - X7 = F, et/ou - X8 = L, et/ou 25 - X9 = R, et/ou - X10=Fould. 4. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel : - X4 = A ou S, et/ou - X5 = R, et/ou 30 -X6=DouA. 5. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, comprenant en outre une séquence peptidique favorisant l'entrée dudit peptide dans les cellules eucaryotes, liée à l'extrémité C-terminale de la séquence SEQ ID No : 1. 6. Peptide selon la revendication 5, dans lequel la séquence peptidique 35 favorisant l'entrée dudit peptide dans les cellules eucaryotes est la séquence RYIRS (SEQ ID No : 4). 7. Peptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il s'agit du peptide Al-IRS de séquence RRKYGRDFLLRFRYIRS (Seq ID No : 2). 8. Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un ou plusieurs groupement(s) protecteur(s) aux extrémités N et/ou C-terminales. 9. Peptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est cyclisé. 10. Composition pharmaceutique comprenant un peptide tel que décrit dans l'une quelconque des revendications précédentes, associé à un vecteur.