Brevet FR2938269A1 — publié le 20100514

L'invention se rapporte au diagnostic du cancer de la vessie et plus particulièrement à la détection du carcinome de type transitionnel de la vessie (TCC : translational cell carcinoma). Les carcinomes de type transitionnel se rencontrent dans les tumeurs à épithélium de transition qui constituent environ 70 à 90% des tumeurs épithéliales de la vessie. Elles se caractérisent par leur grande variabilité morphologique, ce qui en rend le pronostique parfois difficile. Sur le plan histologique, les tumeurs urothéliales peuvent être papillaires ou non papillaires, de haut degré ou de bas degré de malignité (grade histologique), infiltrantes ou non infiltrantes; chaque lésion étant la résultante d'une combinaison de ces trois critères morphologiques. Il existe plusieurs classifications des tumeurs urothéliales de la vessie. La classification qui était jusqu'à présent la plus utilisée était celle de l'OMS qui date de 1974. Elle classait les tumeurs à épithélium de transition en tumeurs bénignes (papillome exophytique, papillome inversé) et malignes (carcinomes à épithélium de transition de grade 1, 2 et 3). En 1998, au terme de plusieurs réunions rassemblant des anatomo-pathologistes, urologues, oncologues, et biologistes, une classification de consensus des tumeurs urothéliales de vessie a été édifiée et validée. C'est cette nouvelle classification (Epstein JI, Am J Surg Pathol. (1998), 22: 1435-1448) qui est actuellement utilisée. Bien que ne différant que trés peu de la classification OMS antérieure, elle a le mérite d'être plus en harmonie avec la biologie et le potentiel évolutifs des tumeurs urothéliales. Selon cette classification, les tumeurs de la vessie sont classées selon leur � grade � de G1 à G3 en fonction de différents critères cytomorphologiques. Plus le grade est élevé, moins les cellules présentent un aspect différencié et plus elles sont agressives. Les tumeurs sont par ailleurs classées en fonction de leur caractère superficiel (pTa et Ti) ou invasive dans le muscle (T2 à T4). Les tumeurs de bas grade sont généralement non invasive ou infiltrant les couches superficielles (stade Ta et Ti), tandis que les tumeurs de haut grade, plus agressives, sont le plus souvent détectées déjà en stade Ti ou à un stade plus avancé. La détermination du grade des cellules tumorales revêt une importance critique pour le clinicien, car elle détermine les moyens thérapeutiques devant être mis en oeuvre. Ainsi la présence de tumeurs de grade 3 invasive, nécessite l'ablation totale de la vessie et des glandes annexe. Par contre, la plupart des tumeurs de bas stades / grades (Ta et Ti) peuvent généralement être traitées localement avec maintient de l'organe intact selon différentes voies thérapeutique, comme la chimiothérapie, l'immunothérapie ou la BCG thérapie. Les patients atteints de tumeurs de bas grade, non invasive, sont en général de bon pronostic mais nécessitent un suivi car le risque de récidive du cancer est de l'ordre de 70%. De ce fait, les patients doivent être suivis régulièrement après traitement, tous les 3 mois pendant les 2 premières années, et tous les 6 mois ensuite, et en cas de récidive, il est très important de pouvoir suivre l'évolution des tumeurs. D'ailleurs, les tumeurs Ta de bas grade n'envahissent le muscle que dans 10-15% des cas, tandis que les Ti progressent vers le stade T2 dans 30-50% des cas. Les tumeurs de haut grade progressent plus vite, les patients atteignant le stade T2 rapidement, et des métastases distantes se forment souvent dans les 2 années suivantes. Actuellement, seuls les examens cliniques invasifs, c'est-à-dire par prélèvement ou visualisation directe des tumeurs par endoscopie ou chirurgie permettent de poser un diagnostic certain concernant le grade des cellules tumorales, et mettre en oeuvre une thérapie adaptée. Il reste que l'endoscopie est parfois douteuse et difficile à interpréter. Quant à la cytologie après prélèvement, les études montrent que leur fiabilité est moyenne, entrainant la non-détection de 50% des tumeurs (Boman, H., et al., 2002, J.Urol., 167(1) :80-83). Devant la prévalence élevée du cancer de la vessie dans la population, notamment chez les personnes de plus de 50 ans, et dans le but d'améliorer à la fois le diagnostic et le confort des patients, des efforts de recherche importants ont été fait pour mettre au point des méthodes de détection indirecte, non invasives, du cancer de la vessie. A cet égard, plusieurs équipes de chercheurs ont tenté de dépister les tumeurs urologiques dans les urines des patients à l'aide de marqueurs tumoraux classiques de nature protéiques. Néanmoins, jusqu'à présent, la détection de ces protéines ne s'est pas avérée suffisamment spécifique pour être certain à la fois de la provenance des protéines et du stade de développement des tumeurs. En 1999, une équipe américaine a décrit la possibilité de suivre l'évolution du cancer de la vessie en analysant les séquences d'ADN microsatellites contenus dans les urines (Steiner et al. (1997) Nature Medecine 3:621-624). Cette méthode de détection, qui consiste à amplifier et mesurer la variabilité de certaines séquences répétées non codantes d'ADN mitochondrial, est basée sur l'observation que ces séquences sont généralement altérées dans les cellules carcinomiques. Pour autant, cette technique ne donne pas entièrement satisfaction 15 dans la mesure où elle ne permet pas de déterminer réellement le grade des tumeurs. D'autres méthodes moléculaires se fondent sur des méthodes de PCR visant à amplifier ou détecter des marqueurs génétiques, tels que des mutations ponctuelles dans des gènes suppresseurs de tumeurs, appliquées 20 aux ADN présents dans les urines des patients. Ces méthodes nécessitent cependant des amorces spécifiques de 20 à 40 nucléotides, qui ne sont pas faciles à mettre en point, contenu de la taille du génome humain et de sa variabilité. En outre, dès lors que l'ADN des cellules tumorales est mêlé dans les urines aux ADN des cellules saines, l'amplification recherchée est 25 masquée par celle résultant de ces derniers. Devant la difficulté de mettre en oeuvre les différents marqueurs génétiques connus des carcinomes de type transitionnel de la vessie, les inventeurs ont privilégié une approche originale fondée sur la détection simultanée de plusieurs anomalies génétiques rencontrées fréquemment 30 dans les cellules TCC. Dans ce but, ils ont répertorié les principales anomalies génétiques rencontrées dans les carcinomes de type transitionnel de la vessie, puis sélectionné celles les plus représentatives du grade des cellules tumorales. Ils ont privilégié, dans cette approche, les anomalies génétiques consistant en des altérations physiques des chromosomes, telles que des ploïdies ou des délétions, résultant typiquement d'analyse du caryotype des cellules tumorales. Ils ont ensuite mis au point un procédé original permettant de détecter simultanément la présence ou l'absence des anomalies génétiques sélectionnées dans l'ADN contenu dans les urines des patients. Ce procédé permet de manière étonnante de poser un diagnostic sur la présence de cellules carcinomes de type transitionnel de la vessie, sans avoir à procéder à un examen chirurgical de la vessie, tout en ayant une bonne indication du grade de ces cellules tumorales. Figure 1 : classement des tumeurs analysées dans les exemples selon les critères cliniques usuels. Figure 2 : classement des patients dont les urines ont été analysées dans les exemples, en fonction des résultats d'endoscopie et de cytoscopie. Description détaillée de l'invention La présente demande a pour objet un procédé de détection urinaire du cancer de la vessie. Cette détection est obtenue grâce au marquage de l'ADN total contenu dans les urines d'un patient, et la détection dans cet ADN, de séquences chromosomiques comprises dans des loci susceptibles d'être atteints par des anomalies génétiques. Ces séquences chromosomiques, qui constituent les ADN de référence selon la présente invention, sont susceptibles d'être absentes, en cas de délétion du locus chromosomique auquel elles appartiennent, ou bien d'être dupliquées, comme par exemple, dans le cas d'une trisomie. Les cellules tumorales du cancer de la vessie sont fréquemment le siège de remaniements chromosomiques, lesquels sont indicatifs dans une certaine mesure du caractère tumoral des cellules. Les régions atteintes par ces remaniements chromosomiques sont cependant potentiellement nombreuses et leur étendue variable. En effet, bien que certains loci soient plus systématiquement altérés, notamment ceux codant pour des gènes suppresseurs de tumeurs, ou bien impliqué dans la régulation du cycle cellulaire, les anomalies chromosomiques se forment à la faveur de recombinaison intra ou inter-chromosomiques entre régions homologues, qui ne sont pas toujours les mêmes. Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détection in-vitro du cancer de la vessie chez un patient, caractérisé en ce qu'il comprend une ou plusieurs des étapes décrites ci-après: Dans une première étape (i), on extrait l'ADN contenu dans un échantillon d'urine provenant dudit patient par une des nombreuses méthodes connues de l'homme de l'art. Comme indiqué précédemment l'intérêt de la présente invention est de pouvoir établir l'état cancéreux de la vessie à partir de l'urine des patients. Cette méthode doit donc permettre de concentrer l'ADN contenu dans l'échantillon d'urine, lequel ADN est à l'état résiduel puisqu'il provient, en partie, des cellules présentes dans la vessie. L'ADN n'étant pas un matériel très fragile, il n'est donc pas nécessaire de prendre des mesures drastiques pour la conservation des urines à analyser. Les prélèvements peuvent donc avoir lieu au domicile des patients. L'ADN extrait est total, dans le sens où c'est tout l'ADN présent dans l'urine, provenant ou ne provenant pas de cellules tumorales, qui est susceptible d'être récupéré. Dans une étape suivante (ii) on fragmente l'ADN extrait à l'étape (i), de préférence par sonication, pour des fragments d'ADN dont la taille est majoritairement supérieure à 500 pb, de préférence supérieure à 800 pb, et plus préférentiellement entre 1000 et 5000 paires de bases. De manière alternative, l'ADN peut être digéré au moyen d'enzymes telles que des enzymes de restriction. Dans une étape suivante (iii), on marque de manière uniforme les fragments d'ADN obtenus, au moyen d'un premier agent de marquage de sorte à former un pool d'ADN marqué. C'est ainsi l'ADN total extrait de l'urine du patient qui se retrouve marqué. L'expression � de manière uniforme � signifie que le marquage s'effectue de manière non spécifique de sorte que deux fragments d'ADN différents de taille identique sont marqués avec la même intensité. Pour obtenir ce marquage, on utilise de préférence des nucléotides couplés à un fluorophore, lesquels sont introduits dans l'ADN au cours d'une étape de réplication. Cette étape de réplication enzymatique in- vitro peut présenter l'avantage d'augmenter le nombre de copies de fragments d'ADN marqués disponibles dans le pool d'ADN. Le pool d'ADN marqué est constitué préférentiellement de fragments dont les coupures sont aléatoires. Dans une étape suivante (iv), on forme au moins une aliquote à partir du pool d'ADN marqué, laquelle aliquote peut former, le cas échéant, la totalité du pool d'ADN marqué. Chaque aliquote est alors mise en contact avec un ADN de référence, de préférence plusieurs, chacun de ces ADN de référence correspondant à une séquence d'ADN différente comprise dans un locus d'un chromosome susceptible d'être atteint par une anomalie génétique. Ladite anomalie génétique est de préférence corrélée avec un stade de développement du cancer de la vessie et plus particulièrement avec un grade, tel que cela a été évoqué plus haut. L'ADN de référence peut avoir été choisi, par exemple, en fonction des données de la littérature scientifique ou de résultats d'analyse sur biopsies. Selon l'invention, les ADN de références consistent en des séquences d'ADN de chromosomes humains d'une longueur comprise entre 1000 et 200 000 paires de bases, de préférence entre 2000 et 180 000 pb, et plus préférentiellement entre 5000 et 160 000 paires de bases, telles que celles clonées dans des clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou YAC (Yeast Artificial Chromosome) construits à partir de séquences génomiques humaines. De tels clones BAC sont décrits dans les bases de données accessibles au public concernant le génome humain telles que celles du CNBI ou de l'UCSC. Ainsi, alors qu'il s'est avéré difficile de pouvoir établir un diagnostic du cancer de la vessie sur la base de marqueurs isolés, en particulier des marqueurs correspondant à des séquences génétiques courtes permettant la mise en oeuvre de tests pas amplification génétique (PCR, TMA ..etc...), le procédé de détection selon l'invention s'appuie sur une méthode de détection utilisant des séquences d'ADN de taille généralement supérieure à 600 pb. Les inventeurs ont déterminé qu'il était préférable de mettre en oeuvre préférentiellement au moins un ADN de référence dont la séquence est comprise dans un des locus des chromosomes humains sélectionné parmi les suivants : 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11g13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11 p, 14q22-qter, 17p, 19 et 22. Selon l'invention, la mise en contact des fragments d'ADN marqués avec les ADN de référence est pratiquée dans des conditions permettant une hybridation spécifique, de préférence en conditions stringentes telles qu'indiquées dans la partie expérimentale de la présente demande. Parallèlement à l'étape (iv), une étape (v) prévoit la préparation d'un pool d'ADN témoin provenant d'un ou plusieurs individus n'ayant pas de cancer de la vessie. Idéalement, cet ADN est obtenu à partir d'échantillons urinaires provenant de plusieurs individus non atteints de cancer, pris au hasard dans l'espèce humaine. Il est aussi possible d'utiliser un ADN humain de référence de préparation commerciale. Comme pour l'ADN extrait de l'urine du patient, l'ADN témoin est marqué de manière uniforme au moyen d'un second marqueur, de préférence fluorescent. Ce marqueur est de préférence différent du premier utilisé pour marquer l'ADN du patient. Comme dans l'étape (iv), une aliquote de l'ADN témoin marqué est mis en contact avec les ADN de référence sélectionnés, lesquels sont identiques à ceux utilisés à l'étape (iv). Cette mise en contact peut s'effectuer parallèlement ou conjointement, dans les mêmes conditions d'hybridation que celles mises en oeuvre à l'étape (iv). Lorsque la mise en contact est conjointement, cela signifie que l'ADN du patient et l'ADN témoin sont tous deux mis en contact avec le même ADN de référence, de préférence simultanément. Dans une étape suivante (vi), on élimine les fragments d'ADN marqués qui ne se sont pas hybridés de manière spécifique aux ADN de référence aux étapes (iv) et (v). Cette étape de lavage des ADN non hybridés, sans difficulté particulière, s'effectue selon les règles de l'art. Dans une étape suivante (vii) on détermine l'intensité du signal émis par les fragments marqués qui se sont hybridés à chacun des ADN de référence sélectionnés. Le type et l'intensité du signal est fonction du type de marqueur utilisé. Lorsque le premier et le second marqueur utilisés sont des marqueurs d'intensité équivalente, comme par exemple, les cyanines 3 et 5, les variations observées entre l'ADN du patient et l'ADN témoin sont directement liées à la quantité de fragments d'ADN hybridés au niveau de chaque ADN de référence. Dans une étape suivante (viii) on détermine pour chaque ADN de référence l'écart entre le signal obtenu avec l'ADN du patient et l'ADN témoin. Selon un aspect préféré de l'invention, les fragments d'ADN provenant du patient à l'étape (iii) sont divisés en deux pools, l'un marqué au moyen du premier marqueur et le second au moyen du deuxième marqueur. Les fragments d'ADN témoin à l'étape (iv) sont également divisés en deux pools, l'un marqué au moyen du premier marqueur et le second au moyen du deuxième marqueur. En procédant de cette manière, l'écart de signal peut être déterminé avec le premier marqueur puis le deuxième marqueur de manière croisée. Si les écarts constaté entre le l'ADN du témoin et l'ADN du patient sont du même ordre quelque soit le marqueur utilisé, cela signifie que l'écart est significatif. Dans une étape suivante (ix) on déduit des écarts constatés à l'étape précédente l'état cancéreux du patient. Ainsi, selon l'invention, plus les écarts obtenus sont nombreux, plus la détection du cancer de la vessie est précise. En outre, les écarts donnent qualitativement une idée du grade des tumeurs impliquées, notamment si plusieurs loci indicatifs du grade tumoral, sont mis en oeuvre simultanément. Alternativement, si un locus est considéré comme un marqueur très représentatif de la malignité des cellules tumorales, plusieurs ADN de référence peuvent être sélectionnés au sein du même locus afin d'être certain du résultat obtenu sur ce locus. Le procédé selon l'invention permet ainsi, dans l'étape (ix), de comparer plusieurs ADN de référence et d'obtenir un tableau élargi des anomalies génétiques rencontrées. Il peut alors s'avérer utile à cette étape de pondérer les résultats obtenus pour chaque ADN de référence, de manière à prendre en considération, par exemple, la probabilité de trouver une anomalie génétique au locus sélectionné pour une tumeur de grade donné. Il est également possible de pondérer l'écart obtenu pour un ADN de référence lorsque plusieurs ADN de référence sont utilisés pour détecter une anomalie présente sur le même locus, et ainsi rendre compte de son poids relatif par rapport aux autres loci représentés. Cette pondération, ou bien l'emploi de constantes visant à établir des corrélations entre différents loci, peut servir à l'élaboration d'un algorithme permettant de déterminer un � grade théorique � à partir des données collectées à l'étape (viii). Les loci préférentiellement couverts par les ADN de référence selon l'invention sont récapitulés dans le tableau 1. Les ADN de référence correspondent à une ou plusieurs séquences comprises dans les séquences correspondantes telles que référencées par le NCBI (positions de début et de fin sur la séquence génomique de chacun des chromosomes). Tableau 1 Localisation des ADN de référence Localisation Début Fin chromosomique de la séquence de la séquence génomique génomique 1p 20365560 113105490 3q 123351123 182149547 8q22-qter 95030146 143909236 151454 57934415 5p12-p13 1771703 9682916 9p 14010384 37091069 9q 70785194 137897571 18q12 33436616 40743026 1q22-q24 154902972 158452461 5p 1771703 9682916 20 5 10 Tableau 1 (suite) Localisation des ADN de référence Localisation Début Fin chromosomique de la séquence de la séquence génomique génomique 6q22 109464089 111511071 7 3863510 158689815 11q13 65805698 73155080 12q15 55617597 78745914 13q 25467720 99788952 15 25650963 97412048 16 267091 88643457 17q 26415272 77690512 6q25-q27 160256061 170536116 7q 62015315 158689815 8p 345303 38886999 10q 42335633 135251915 11p 399850 44925329 14q22-qter 72026416 106339461 17p 7436433 21191536 19 9998870 54262315 22 20487250 48028036 Les caractéristiques des loci concernés sont les suivantes : 3p : Région possédant plusieurs gènes candidats impliqués dans de nombreux cancers. 4 : Région impliquée davantage dans la progression tumorale que dans l'initiation. Des gènes suppresseurs de tumeur, ciblés pour d'autres pathologies cancéreuses ont été décrits dans cette région. 5p12-p13: Région impliquée dans l'agressivité tumorale, notamment dans la dissémination métastatique. 6q : Région liée aux tumeurs de haut grade, envahissant le muscle. On notera le gène M6P/IGF2R comme repère génétique dans le locus 6q26-q27. 8p : Région fréquemment délétée dans les tumeurs invasive de haut grade (surtout 8p21-pter) comprenant les gènes suppresseur de tumeur : EXTL3, WRN et PRLTS. 9p ou 9 complet : Région atteinte souvent précocement. Les gènes p16/MTS1/CDKN2A/INK4A et p15/MTS2/CDKN2B sont des inhibiteurs de kinases importants dans la progression du cycle cellulaire. Souvent atteinte dans les pTa, p16 est un anti oncogène dépendante de Rb que nous verrons plus loin. INK4A pourrait agir sur les points de contrôle de p53 notamment. 10q ou 10 complet : Région minimale 10g11-q21 et 10g24-q25 : Impliqués dans de nombreux autres cancers (lymphome, prostate, colon). Cette zone comporte de nombreux gènes suppresseurs de tumeur. La délétion 10q serait un facteur de mauvais pronostic. 11 p : Région correspondante à l'agressivité tumorale, premier seuil vers un éventuel passage à la tétraploïdie. La délétion pourrait agir sur l'expression du gène KAI1 (11 p11.2) qui est un gène suppresseur de métastases. Les gènes EXT2, WT1, TSG101 et TSSC5 sont aussi impliqués dans d'autres cancers. 13g14: Région correspondante à RB1 dans les grades et stades avancés de cancer, RB entre en coopération avec P53. L'inactivation de RB facilite la progression tumorale par régulation de l'entrée en phase S. D'autres gènes pourraient être impliqués, en dehors du locus q14, qui expliquerait les délétions plus larges généralement détectées. 14g22-qter : Région qui semble être associée à la progression tumorale La délétion pourrait être causée par une translocation déséquilibrée. Au moins un gène suppresseur de tumeurs est présent à ce locus. 16q : Région associée à la progression tumorale. CDH1 code pour la E cadhérine, la délétion abouti à l'agressivité clinique et biologique des cellules tumorale. Un autre gène code pour la H cadhérine, qui inhibe normalement la croissance cellulaire. 17: Région délétée ou mutée, qui survient tardivement, davantage associée à la progression tumorale qu'à l'initiation. La délétion de p53 en 17p13.1 conduit à l'augmentation du nombre d'altérations génétiques par défaut de contrôle de la protéine P53. Le gène HIC1 en 17p13.3 est aussi possiblement impliqué. 18q12 ou 18 complet : Région altérée typiquement dans les tumeurs qui envahissent le muscle (T2 ou plus). Smad4IDPC4 et Smad2/MADR2/hMAD2/JU18-1 agit sur RB et p15 les inactivant. 1q22-q25 : Région amplifiée qui correspond à la transition entre Ta et Ti. P73 est aussi souvent surexprimée donc potentiellement altérée par une duplication dans cette zone. 3g23-q24-q25-q26-qter : Région déjà détectée comme pouvant être altérée même si son implication n'a pas encore été prouvée. isochromosome 5p (gain 5p at perte 5q associée) : Région altérée dans les tumeurs envahissant le muscle, par activation de protooncogènes. 6p22 : Région amplifiée qui peut être associée à une invasion tumorale à cause de possible proto-oncogène présents. 7 : Région qui comprend en 7p14-p21 le gène ERBB1/EGFR qui code pour un récepteur EGF (epidermial growth factor), facteur de croissance cellulaire. En 7g31 le gène cmet code pour un autre recepteur de croissance HGF/SF (hepatocyte growth factor scatter factor). Ces zones semblent être impliquées dans la croissance cellulaire anarchique des tumeurs. 8q : Région souvent impliquée dans la transition Ta-T1 et la progression vers une tumeur invasive et surtout métastatique par la présence 25 d'oncogènes dans la région 8q22-q23. 10g22-q23 : Région qui est rarement amplifié mais surtout délétée (voir ci dessus) 11 : Amplification de la bande 11q13 au minimum avec le gène CCND1 qui contrôle l'entrée dans le cycle cellulaire. CCND1 est activé dans 30 de nombreux cancers mais apparaît peu lié à l'évolution du cancer. Cette amplification signifierait une association aux étapes précoces de la cancérisation. 12g15 : Région contenant le gène MDM2 qui interagit avec p53 dans quelques tumeurs pour inactiver son rôle par masquage de son site activateur. 13g33-q34 : La possible trisomie 13, occasionnelle dans les tumeurs de la vessie, pourrait avoir pour but la duplication de cette région contenant un possible proto-oncogène. 17q : Région communément dupliquée comprenant le gène ERBB2 en 17g21. Cette anomalie est plus fréquente dans les grades et stade élevés, ou associée aux rechutes. 18g11 : Région retenue pour quelques rares amplifications significatives. 20 : Région commune, plus souvent limitée au locus 20q. Des proto-oncogène de carcinome de forme familiale sont présents au locus 20g11-q12. En 20q13, STKIS/BTAK code pour une protéine qui induit une instabilité chromosomique. Selon un aspect préféré de l'invention, le procédé de détection in-vitro de la vessie, consiste à tester la ploïdie de l'ADN des cellules urinaire du patient à partir d'un, plusieurs, ou l'intégralité des loci suivants : 1 q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11g13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p,9p, 9q, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p,18q12, 19 et 22. Dans une variante de mise en oeuvre de l'invention, la méthode consiste à tester la ploïdie de l'ADN des cellules urinaire du patient pour une ou plusieurs des combinaisons de loci suivantes : - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12 et 17p ; -1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p et 11 p ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18812, 17p, 11 p et 7q ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18812, 17p, 11p, 7q et 1q22-24 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18812, 17p, 11 p, 7q, 1q22- 24 et 11q13 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18812, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13et8p; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11q13, 8p et 14g22 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11813, 8p, 14822 et 22 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22 et 5p ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p et 6g22 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22- 24, 11813, 8p, 14822, 22, 5p, 6g22 et 7 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7 et 12g15 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15 et 15 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15 et 6g25-q27 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27 et 19 ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22- 24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19 et 13q ; - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22-24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19, 13q et 16 ; et - 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 17p, 11 p, 7q, 1q22- 24, 11g13, 8p, 14q22, 22, 5p, 6q22, 7, 12q15, 15, 6q25-q27, 19, 13q, 16 et 17q. Un autre aspect de l'invention est l'utilisation d'un ou plusieurs ADN de référence issus des 25 loci visés plus haut pour déterminer le grade tumoral et l'agressivité d'une tumeur. De préférence, le nombre des ADN de référence différents utiles pour la mise en oeuvre du procédé, est compris entre 2 et 500, de préférence entre 10 et 400, plus préférentiellement entre 50 et 400. A cet égard, la présente invention a également pour objet une microplaque ou puce à ADN pour la détection urinaire du cancer de la vessie, caractérisée en ce qu'elle comprend à sa surface plusieurs dépôts d'ADN de référence, distincts les uns des autres, chacun de ces dépôts correspondant à une séquence comprise dans un ou plusieurs des loci décrits plus haut. Cette microplaque ou puce à ADN, qui est de préférence une plaque de verre, permet la mise en oeuvre du procédé selon l'invention sur une surface réduite permettant de comparer simultanément l'état aploïde ou polyploïde de l'ADN du patient à l'état diploïde normal d'un ADN sain pour un, plusieurs ou l'intégralité les locus précités. Par puce à ADN, on entend un support plat en verre, en silicium ou en plastique, sur lequel sont déposées des séquences nucléiques connues d'ADN, tels que les ADN de référence selon l'invention. De préférence, selon l'invention, l'ADN de référence déposé sur la puce à ADN consiste en des séquences d'ADN compris exclusivement dans des loci dans lesquels des anomalies chromosomiques liées au cancer de la vessie ont été décrites, et de préférence dans un, plusieurs ou l'intégralité des loci décrits dans la présente demande. L'invention a également pour objet un kit comprenant un ou plusieurs des éléments suivants : - un ou plusieurs des ADN de référence selon l'invention tels que décrits précédemment fixés sur un support de verre, de préférence sous la forme d'une puce à ADN ; - un échantillon d'ADN témoin provenant d'un patient sain ; - un réactif de marquage de l'ADN total tel que décrit précédemment ; et - un logiciel permettant l'analyse de la comparaison de l'état diploïde de l'ADN du patient avec l'état diploïde normal d'un ADN témoin. Un tel kit est préférentiellement conditionné dans une boite pouvant accueillir tout les tubes, flacons et réactifs nécessaire à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, sans limiter l'invention à ces seuls aspects. EXEMPLES I ù Préparation de la lame de verre. Grâce aux banques de données publiques (UCSC et NCBI), une série de clones BAC (portions d'ADN du génome humain) ont été sélectionnés 10 pour couvrir les marqueurs choisi référencés dans le Tableau 1. La position de ces clones a été validée par séquençage des 2 extrémités des ADN cloné pour vérifier la position exacte de la séquence d'ADN dans le génome. Chacun de ces clones forment un ADN de référence au sens de la présente invention. 15 L'ensemble des clones retenus couvrent tous les loci chromosomiques choisis comme marqueurs pour un total de 341 clones de BAC. L'ADN est extrait des BAC par mini'prep et amplifié par la technologie repliG (Qiagen, Germany). Chaque ADN est déposé pour former 341 puits en plaque PCR contenant tous 10 pg d'ADN purifié. Par l'intermédiaire d'un 20 robot Biorobotic, et 4 aiguilles, l'ADN est déposé en très faible quantité sur une lame de verre. Le design, crée par ArrayGenomics, comporte deux zones d'hybridations pour pouvoir effectuer une double expérience par sécurité. Chaque ADN est déposé 5 fois dans chaque zone d'hybridation de manière randomisée afin de pouvoir obtenir à terme 5 mesures 25 indépendantes. L'ADN est alors fixé chimiquement sur la lame de verre pour une conservation de 3 à 6 mois. II ù Profil génétique des tumeurs de la vessie 30 Des tumeurs congelées ont été collectées. L'ADN chromosomique de ces tumeurs est extrait à l'aide d'un kit commercial. Les tumeurs considérées de � bas grades � sont à un stade pTa/G2. Les tumeurs considérées de � haut grade � sont à un stade au moins pTa/G3, pTl et pT2. Les tumeurs ont été classées selon les critères cliniques usuels (Figure 2).5 L'ADN extrait des tumeurs congelées est quantifié par fluorimétrie (système QuBit, Invitrogen). L'ADN génomique humain servant de témoin pour la mise en oeuvre de la méthode de diagnostic est un ADN commercial (promega, human 5 genomics DNA). IIIù Marquaqe des ADN et hybridation avec les ADN de référence Marquaqe des ADN totaux 10 1. 2,3 pg d'ADN témoin sont fragmentés par sonication dans un tube eppendorf de 55 pl au moyen d'un sonicateur (Elmasonic sonicator) pendant 12 à13 secondes. 2. 200-300 ng d'ADN ainsi preparés sont verifies en électrophorèse sur un gel d'agarose à 0.8% agarose, afin d'examiner que l'ADN est bien 15 fragmenté et que la majorité des fragments ont une taille de plus de 600 pb. 3. Les fragments sont purifiés sur microcolonnes (NucleospinExtract II) 4. Des aliquotes de 25 pI (-1 ug) d'ADN purifié et d'ADN témoin sont placés dans des tubes de centrifugation pour être marqués au moyen 20 des fluorophores Cy5 and Cy3. 5. 20 pI d'amorces de séquences aléatoires (tube 1, Enzo Kit) est ajouté dans chaque tube, puis vortéxé et centrifugé. 6. Les tubes sont chauffés dans un bain-marie à 99° C pendant 10 minutes. 25 7. Les tubes sont mis dans la glace pendant 5 minutes puis brièvement centrifugés et replacé dans la glace. 8. 5 pI d'un mélange de nucleotides marques à la cyanine sont ajoutés dans chaque tube (tube 2 or 3, Enzo Kit). 9. 1 pI de fragment d'enzymes de Klenow (Tube 4, Enzo Kit). 30 10. Le mélange est incubé à 37°C dans un heat-block pendant 3 heures et 30 minutes. 11. 5 pI de Stop Buffer (tube 5, Enzo Kit) est ajouté puis les tubes sont placés sur la glace. Lavaqe de l'ADN marqué 12.200 pl de NT buffer pour 100 pl d'ADN sont ajoutés dans les tubes. 13. Le contenu de chaque tube est transféré dans une colonne, puis centrifugés pendant 1 minute à 11000g. 14.600 pl d'un tampon de lavage NT3 est passé dans chaque colonne, puis centrifugé 1 minute à 11000g. 15. Les colonnes sont centrifugées pendant 2 minutes à 11000g. 16.51 pl d'eau sterile est placé au sommet de la colonne pendant 1 minute. 17. La colonne est centrifuge pendant 1 minute à 11000g et l'ADN marqué dissout est récupéré dans un tube. Préparation de l'ADN avant hybridation 18. 50 pl de Cot-1 DNA (Roche) est ajouté dans chaque tube. 19. Le volume est ajusté à 200 pl à l'aide de 0,3M d'acétate de sodium (pH 5-8). 20. 300 pl d'ethanol glacé est ajouté. 21. Le mélange est passé au vortex puis incubé à -70°C pendant 15 minutes dans l'obscurité. 22. Les tubes sont centrifuges pendant 15 minutes à 11000g entre 4 et 8 °C. 23. Le surnageant est retiré à l'aide d'une pompe à vide. Préparation des BAC sur lame de verre Les ADN sous forme de clones BAC sont placés sous forme déshydratée sur une lame en verre puis fixés à l'aide d'un agent de réticulation sensible au rayonnement UV (350 mJ). Hybridation ADN marqué / ADN de référence (BAC) 24. Le culot récupéré au point 23 est repris dans 5 pl de ddH2O. 25.10 pl pour 50 pg/pl de yeast tRNA (Invitrogen, Cat #15401-011) est le mélange est agité et chauffé à 95°C pendant 5 minutes. 26.15 pI de tampon d'hybridation (Ambion Slide Hyb Buffer #3) préchauffé à 70°C est ajouté. 27. Le mélange est agité vigoureusement pendant 30 secondes et centrifuge à 13K rpm pendant 30 secondes. 28. Le mélange est chauffé à 37°C pendant 30 minutes. 29. La lame de verre est complétement recouverte à l'aide du mélange. 30. Une feuille propre Lifterslip (24x32 inches) (Erie Scientific, Cat #25X601-2-4789) est placée par dessus la plaque de verre afin de recouvrir la microplaque. 31.20 pI d'eau est ajoutée pour humidifier les joints. 32. La chambre d'hybridation fermée (Hybridization chamber, Corning, Cat #2551) est submergée dans une bain marie à 55°C pendant 16 heures. Lavaqe post-hybridation 33. La lame de verre est incubée dans une première solution 0.1X SSC, 0.1% SDS à 50°C La microplaque est ensuite successivement placée dans les solutions de lavages suivantes (pendant 45s sous agitation et 45s sans agitation pour chacune) : a) 0.1X SSC, 0.10/0 SDS ; b) 0.1X SSC, 0.1% SDS ; c) 0.1X SSC; d) 0.1X SSC; 34. La lame de verre est plongée à temperature ambiante dans une boite de marquage remplie d'une solution 0.1X SSC puis dans une autre boite remplie d'éthanol à 100 % (CML, Cat# BVITRI-PPL25L). 35. Les lames de verres sont ensuite placées dans des tubes coniques de 50 ml puis centrifugées quelques secondes afin de les sécher. 36. Les lames de verres sont conservées dans l'obscurité. Les lames de verre sont analysées avec un scanner de fluorescence (GENEPIX 4000B) dont la sensibilité est ajustée selon l'intensité du signal de marquage. Les résultats sont analysés à l'aide du logiciel d'analyse d'image BacMagic+ (développé par ARRAYGENOMICS) pour visualiser les profils graphiquement en dye swap. Pour chaque ADN, un fichier texte est exporté par BacMagic+ et est mis en forme pour être utilisé avec le logiciel seeGH. Les délétions et les gains sont annotés grâce à la visualisation de la symétrie du dye swap dans BacMagic+. Grâce à seeGH, pour chaque groupe, les annotations sont compilées pour former une image globale des anomalies détectées et de leur fréquence. Sur ces figures, ressemblants à une table de caryotype, ou les traits représentent les anomalies (rouge = perte, vert = gain) et leur emplacement. La taille des traits représente leur fréquence de détection dans le pool de patients. L'analyse de la Figure 2 permet de réaliser un profil type de chaque groupe de tumeur selon son grade et stade à rapprocher des profils types de groupes tumoraux. Tableau 2 Gains visualisés après analyse des anomalies détectées BANDES TOTAL MINIMUM pTa G2 pTa G3 T1 T2 CLONES POUR POSITIF 1 q22-24 4 3 2 2 3q 6 5 2 1 5p 7 6 2 8q22-ter 3 2 1 2 2 1 11q13 7 6 2 12q21-24 5 4 1 15 8 6 1 16 12 10 1 2 17q 11 9 1 18q 10 8 2 20g11-ter 10 8 1 20 14 11 1 2 1 Tableau 3 Délétions visualisés après analyse des anomalies détectées BANDES TOTAL MINIMUM pTa G2 pTa G3 T1 T2 CLONES POUR POSITIF 2q35-ter 2 2 1 4q26-ter 7 6 1 6q25-27 5 4 1 4 3 8p 14 11 2 2 2 9p 6 5 1 1 9q 12 10 3 2 2 1 10q 14 11 1 11p 4 3 1 3 11 q23-25 5 4 1 1 1 13q13 3 2 2 1 13 7 6 1 1 2 14q23-31 3 2 2 17p 5 4 1 17 16 13 1 1 18q12 3 2 1 1 18q12-23 11 9 4 19 4 3 1 1 Avec ce bilan, il est à noter que les pTaG2 sont bien moins altérés que les haut grades. Certaines anomalies apparaissent être caractéristiques de tumeurs de bas grade. Comme décrit dans la littérature, nous retrouvons la délétion du 9 qui semble plus liée à l'initiation et associé souvent aux pTa. Ici, le gain du 3q et du 5p semble aussi être caractéristique des bas grades (il ne s'agit pas ici d'un iso5p décrit dans les hauts grades car nous n'avons pas de gain du 5q) Les anomalies en gain des hauts grades apparaissent au fur et à mesure : 8q, l q, llq mais aussi le 16 et le 18 qui semble être plus souvent dans les T2 ou plus. Les anomalies en perte des hauts grades sont le 6q, 11 p, 13 mais aussi le 18q, évènement qui semble donc plus tardif dans la progression de la tumeur. IV - CALCUL ET DÉFINITION DE SENSIBILITÉ, SPÉCIFICITÉ 10 Sensibilité : capacité à détecter les sujets malades. vrai positif vrai positif + faux négatif Spécificité : capacité du test à définir les sujets sains. vrai négatif vrai négatif + faux positif Grâce aux tumeurs connues que nous avons faites, il est possible de 25 calculer la sensibilité du test. Elle évaluera la faculté de la technique à détecter les tumeurs de bas grade et de haut grade. Les deux groupes seront dissociés dans les calculs, car les tumeurs de bas grade sont les plus difficiles à détecter. Les tests de routine, comme la cytologie urinaire, ne détectent que 50 % de ces cancers en initiation. 30 Les tests actuels sont caractérisés par leur sensibilité est spécificité calculées dans les publications scientifiques (ils sont exprimés par un minimum et maximum car les valeurs varient selon les études - Sources : Biomarkers for detection and surveillance of bladder cancer, Lorne I. Budman, MSc, Wassim Kassouf, MD, and Jordan R Steinberg, MD from the 35 Division of Urology, McGill University Health Centre, Montréal, Quebec) comme indiqué dans le tableau 4 ci-dessous. 15 20 Tableau 4 Sensibilité et Spécificité pour les tests actuels: Test Sensibilité Spécificité BTA Stat (Polymedco) 52.5%û78.0% 69.0%û87.1% BTA Trak (Polymedco) 51%û100% 73%û92.5% Cytology 12.1 %û84.6% 78.0%û100% Hematuria dipstick 47.0%û92.6% 51.0%û84.0% NMP22 Bladder Cancer Test (Matritech) 34.6%û100% 60.0%û95.0% NMP22 BladderChek (Matritech) 49.5%û65.0% 40.0%û89.8% ImmunoCyt/uCyt+ (DiagnoCure) 63.3%û84.9% 62.0%û78.1% ImmunoCyt/uCyt+ and cytology 81.0%û89.3% 61.0%û77.7% UroVysion (Abbott Molecular) 68.6%û100% 65.0%û96.0% La sensibilité est déterminée pour un nombre de marqueurs déterminé. Pour chacun d'entre eux, il est possible de calculer une sensibilité. Il est évident qu'un seul marqueur génétique n'apporte pas à lui seul une solution fiable. Mais l'association des 25 marqueurs semble beaucoup plus judicieuse comme l'indiquent les bilans des tableaux 5 et 5. Tableau 5 Bilan réalisé à l'aide des 25 marqueurs Gains Bas Grade Pertes Locus Nombre de % Locus Nombre de % tumeurs tumeurs anormales anormales 1 p 1 10% 5p12p13 1 10% 3q 2 20% 9p 3 30% 8q22-qter 4 20% Sensibilité totale 80% 9q 1 10% 11q13 4 29% 18q12 2 20% 19 2 14% 20 2 20% Tableau 6 Bilan réalisé à l'aide des 25 marqueurs Gains Haut Grade Pertes Locus Nombre de % Locus Nombre de % tumeurs tumeurs anormales anormales 1q22-24 4 29% 6q25-27 2 14% 3q 3 21% 7q 4 29% 5p 2 14% Sensibilité totale 86% 8p 3 21% 6q22 1 14% 9p 1 7% 7 2 14% 9q 3 21% 8q22qter 3 21% 10q 1 7% 112q15 1 14% 11p 5 36% 13q 2 7% 13q 4 29% 15 2 14% 14g22gter 3 21% 16 1 7% 16 1 7% 17q 1 7% 17p 5 36% 20 1 7% 18q12 4 29% 22 3 21% Spécificité: 6 ADN négatifs (ADN sans anomalies) : 6/(6+0))*100 = 100% 5 Les 10 anomalies que nous avons groupées dans les bas grades peuvent être prises comme modèles pour des tumeurs en initiation, qui ne sont encore pas invasive. 10 Globalement, quand la tumeur n'est pas invasive mais de haut grade, ou qu'elle est déjà en Ti, T2 ou plus, le nombre d'anomalies détectées sur nos marqueurs augmente. Pour les hauts grades, la méthode vérifie bien l'importance du chromosome 1, 7, 8, 11, 13, 14, 17, 18. 15 Cependant il est important de noter que la sensibilité de chacun des marqueurs pris séparément ne dépasse pas les 36 % (comme la cytologie ou le NMP22 dans certaines études). Par contre, la mise en commun de tout les marqueurs génétiques que nous avons sélectionnés pour l'invention, donne un très bonne sensibilité, même pour les bas grades stricts (le résultat de notre invention SEULE est aussi bon que la combinaison ImmunoCyt/uCyt+ and cytology dans certaines études) De même, la spécificité, (calculée sur des échantillons normaux, ou sur des ADN extraits d'urine de patients avec une endoscopie négative et un suivi négatif,) atteint les 100%. V ù Validation sur de l'urine Des échantillons d'urine sont prélevés sur des patients en diagnostic ou en suivi. Une endoscopie, de routine, est effectuée. Les patients seront 15 groupés comme dans la figure 2. La méthode est mise en place de la même manière que pour les tumeurs congelée. (cf partie II) Les résultats sont analysés le logiciel BacMagic+ pour visualiser les profils graphiquement en dye swap. Pour chaque ADN, un fichier texte est 20 exporté par BacMagic+ et est mis en forme pour être utilisé avec le logiciel seeGH. Les délétions et les gains sont annotés grâce à la visualisation de la symétrie du dye swap dans BacMagic+. Grâce à seeGH, pour chaque groupe, les annotations sont compilées pour former une image globale des anomalies détectées et de leur 25 fréquence. Sur ces figures, ressemblante à une table de caryotype, ou les traits représentent les anomalies (rouge = perte, vert = gain) et leur emplacement. La taille des traits représente leur fréquence de détection dans le pool de patients. 30 Pour les tumeurs du haut appareil urinaire, il est possible d'établir un bilan des anomalies détectées (tableau 7 et 8). Tableau 7 Bilan des anomalies détectées (gains) BANDES TOTAL MINIMUM Positive Suspect CLONES POUR endo endo POSITIF lq 10 8 1 1q22-24 3 2 1 3 19 1 3q 6 5 1 3q26-ter 3 2 1 5p 7 6 1 1 7p 7 6 1 8q21-23 11 9 2 1 11q13 7 6 1 12 15 12 1 1 12q 7 6 1 13q 7 5,6 1 1 15 8 6,4 1 16q 5 4 1 1 17p 5 4 1 17q 10 8 4 1 19 4 3 4 1 20 17 14 1 15 Tableau 8 Bilan des anomalies détectées (délétions) BANDES TOTAL MINIMUM Positive Suspect CLONES POUR endo endo POSITIF lp2l-22 4 3 1 4q12-13 6 5 1 6q25-27 3 2 2 1 8p 14 11 2 1 9p 6 5 5 1 9q 12 10 4 1 10g22 3 2 1 11p 10 8 1 1 14q23-31 4 3 1 17p 5 4 1 1 17q 10 8 1 18q12 3 2 1 18q12-23 11 9 5 20q 10 8 1 22q 8 6 1 Pour les patients dont l'endoscopie est positive, nous retrouvons les anomalies caractéristiques des cancers de la vessie, avec quelques variantes que nous avons reportés ici. De plus, nous utiliserons le tableau de répartition des anomalies pour 10 tenter de déterminer le grade de ces tumeurs détectées. Pour les tumeurs de la vessie, il est fait de même en établissant un bilan des altérations détectées. Tableau 9 Bilan des anomalies détectées (gains) BANDES TOTAL MINIMUM Positive Suspect CLONES POUR endo endo POSITIF positive (suivi) 1q22-24 4 2 1 3p24-ter 4 3 1 3q 6 5 5p 7 6 2 8q22-ter 3 2 3 1 10p 4 3 1 11q13 7 6 4 2 12q21-24 5 4 15 8 6 16 12 10 1 17p 5 4 1 17q 11 9 2 1 18q 10 8 2 20g11-ter 10 8 3 1 20 14 11 1 15 Tableau 10 Bilan des anomalies détectées (délétions) BANDES TOTAL MINIMUM Positive Suspect CLONES POUR endo endo POSITIF positive (suivi) 2q35-ter 2 2 4p 3 2 1 4q26-ter 7 6 6q15-24 5 4 1 6q25-27 5 4 1 1 8p 14 11 2 2 9p 6 5 3 1 9q 12 10 1 1 10q 14 11 1 11p 4 3 1 1 11 q23-25 5 4 1 13q13 3 2 13 7 6 14q23-31 3 2 17p 5 4 17 16 13 18q12 3 2 2 1 18q12-23 11 9 1 19 4 3 Les résultats des tableaux 9 et 10 montrent que de nombreuses anomalies caractéristiques sont détectées chez les patients pour lesquels l'endoscopie est positive. Par contre, les endoscopies suspectes révèlent moins d'altérations. Chez les patients dont le diagnostic par endoscopie n'était pas complètement déterminé, le suivi a montré que ces patients ont évolué défavorablement. Notre test aurait donc permis de clarifier l'endoscopie suspecte avant d'attendre le suivi à 6 mois. Remarquons aussi que les patients pour lesquels l'endoscopie est négative ainsi que ceux pour lesquels le suivi à 12 mois n'a toujours rien révélé, ne présente pas de positivité pour les zones testées. (seuls quelques clones varient mais ne sont pas dans les zones à tester et correspondent à des variations polymorphes des clones spottés sur la lame. Ces clones devront être supprimés dans les prochaines versions de notre lame, à cause de leurs caractères variants et de leur position proche centromèrique) Si l'on effectue l'analyse au cas par cas de chacun des ADN extrait d'urine de patient avec endoscopie positive, on peut appliquer notre tableau récapitulatif qui associe au bas grade ou haut grade. Exemples particuliers : ADN 34016 TVES avec endoscopie positive : nous détectons la délétion 9p et 9q significative des bas grades. Notre urologue partenaire a effectué une biopsie à la suite du test. Il a été déterminé un grade 1 ou 2. ADN 33276: TVES avec endoscopie positive. Nous détectons de nombreuses anomalies (8 en tout) dont le 9q, 11p, 8p et 1 q22-q24 caractéristique des hauts grades. Après examen de la biopsie, un grade G3 est confirmé. ADN 32479: Tumeur de la vessie avec endoscopie suspecte mais suivi positif à 6 mois : Nous ne détectons qu'un gain du 19, ce faible nombre d'anomalie ainsi que l'implication non déterminé de ce gain du 19 nous permet d'associer cette tumeur à un bas grade. La biopsie indique un G1/G2. La plupart des patients dont nous avons testé l'urine dans cette étude, ont été orienté pour une biopsie, à partir du moment où l'endoscopie était positive. Au moment du test sur BOA, nous n'avions pas les résultats de la biopsie. Le test a donc été effectué en aveugle. Nous pouvons en résumer les résultats pour le cancer de la vessie dans le tableau 11 suivant : Tableau 11 Tumeur de la vessie : endoscopie positive : 8 échantillons d'urines N° ADN MARQUEURS POSITIFS CONCLUSION CONCLUSION BCA BIOPSIE Fb48 Aucun Bas grade G1 Non analysable 30869 8q22-qter, 11g13, 17q Bas Grade G2 Non analysable 32479 19 Bas Grade G1 G1/G2 32759 9p Bas Grade G1 G1/G2 Fb43 19 Bas Grade G1 G1/G2 30656 6q25-q27 Bas grade Non analysable 32671 9p, 6q25-q27 Bas Grade G3 progression 31138 Aucun Bas Grade Non analysable 33442 6q27, 8p, 17q Haut Grade G3 32924 5p, 8q, 11g13, 17q, 20, 8p, 9p, 9q, Très haut G3 10q, 11p, 16, 18g12, 22 grade Fb13 6q25-q27, 9p, 14q22-qter, 11g13, Haut grade G3 20, 22 39373 5p, 8q22-qter, 18q12, 20 Haut grade G3 Il est à noter que pour tous les patients pour lesquels le résultat de la biopsie est clair, nous aurions pu prédire le grade de la tumeur. De plus dans certains cas, l'analyse plus précise des marqueurs altérés nous donne des précisions sur l'aspect agressif de la tumeur, son potentiel métastatique et son éventuelle progression. De plus, certaines biopsies trop exigues ne sont pas analysables, alors que nous pouvons rendre un résultat clair sur le grade de ces tumeurs. REVENDICATIONS1. Procédé de détection in-vitro du cancer de la vessie chez un patient, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: (i) on extrait l'ADN contenu dans un échantillon d'urine provenant dudit patient; (ii) on fragmente l'ADN extrait à l'étape (i), (iii) on marque de manière uniforme les fragments d'ADN obtenus au moyen d'un premier agent de marquage de sorte à former un pool d'ADN marqué ; (iv) on forme au moins une aliquote à partir du pool d'ADN marqué et on met chaque aliquote en contact avec un ADN de référence différent, chaque ADN de référence correspondant à une séquence comprise dans un locus d'un chromosome susceptible d'être atteint par une anomalie génétique corrélée avec le développement du cancer de la vessie, cette mise en contact étant pratiquée dans des conditions permettant l'hybridation spécifique des fragments d'ADN marqués avec lesdits ADN de référence ; (v) parallèlement, on fragmente et on marque un ADN humain témoin, extrait provenant d'un ou plusieurs individus n'ayant pas de cancer de la vessie, lequel ADN témoin est marqué de manière uniforme au moyen d'un second marqueur, une aliquote de cet ADN témoin marqué étant ensuite mis en contact avec des ADN de référence identiques à ceux de l'étape (iv) et dans les mêmes conditions d'hybridation que celles mises en oeuvre à l'étape (iv); (vi) on élimine les fragments d'ADN marqués qui ne se sont pas hybridés de manière spécifique aux ADN de référence aux étapes (iv) et (v); (vii) on détermine l'intensité du signal émis par les fragments marqués hybridés à chacun des ADN de référence sélectionnés; (viii) on détermine pour chaque ADN de référence l'écart entre le signal obtenu avec l'ADN du patient et l'ADN témoin ; (ix) on déduit des écarts constatés l'état cancéreux du patient. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on met en oeuvre au moins un ADN de référence dont la séquence est comprise dans un des locus des chromosomes humains sélectionné parmi les suivants : 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13, 9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11g13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p, 19 et 22. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les ADN de références consistent en des séquences d'ADN de chromosomes humains d'une longueur comprise entre 1000 et 200 000 paires de bases, de préférence entre 2000 et 180 000 pb, et plus préférentiellement entre 5000 et 160 000 paires de bases. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les ADN de référence consistent en des clones BAC du génome humain. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le premier et le second marqueur sont des marqueurs fluorescents. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le premier et le second marqueur sont des marqueurs fluorescents émettant à des longueurs d'onde différentes, tels que Cy3 et Cy5. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on détermine le grade des cellules tumorales à l'étape (ix) en fonction des écarts constatés pour plusieurs ADN de référence. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les ADN de référence sont séparément déposés sur une microplaque, préalablement à l'hybridation avec les fragments d'ADN marqués. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les fragments d'ADN provenant du patient à l'étape (iii) sont divisés en deux groupes, l'un marqué au moyen du premier marqueur et le second au moyen du deuxième marqueur, les fragments d'ADN témoin étant également divisés en deux groupes à l'étape (iv), l'un marqué au moyen du premier marqueur et le second au moyen du deuxième marqueur, l'écart de signal étant déterminé à l'étape (viii) de manière croisée entre chacun des groupes ainsi marqués. 10. Puce à ADN pour la détection urinaire du cancer de la vessie, caractérisée en ce qu'elle comprend à sa surface plusieurs dépôts d'ADN de référence, distincts les uns des autres, consistant en une ou plusieurs séquences comprises dans un ou plusieurs loci des chromosomes humains suivants : 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11g13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11p, 14q22-qter, 17p,, 19 et 22. 11. Puce à ADN pour la détection urinaire du cancer de la vessie, caractérisée en ce qu'elle comprend à sa surface plusieurs dépôts d'ADN de référence, distincts les uns des autres, consistant en plusieurs séquences comprises dans les loci des chromosomes humains suivants : 1p, 3q, 8q22qter, 20, 5p12-p13,9p, 9q, 18q12, 1q22-q24, 5p, 6q22, 7, 11g13, 12q15, 13q, 15, 16, 17q, 6q25-q27, 7q, 8p, 10q, 11 p, 14q22-qter, 17p, 19 et 22.