Brevet FR2936255A1 — publié le 20100326

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs du récepteur transmembranaire Frizzled 2 (FZD2), pour le traitement de l'alopécie. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de cette pathologie. Chez l'être humain, la croissance des cheveux est cyclique et comporte trois phases successives : la phase anagène, la phase catagène et la phase télogène. Chaque follicule de la chevelure se renouvelle donc en permanence, de façon cyclique et indépendante aux follicules adjacents (Kligman 1959, Montagna et Parakkal, 1974). La phase anagène ou phase de croissance, au cours de laquelle les cheveux s'allongent, dure plusieurs aimées. Cette phase récapitule la morphogenèse du cheveux et est divisée en 7 différentes stades (anagène I à anagène VII) (Muller-Rover et col., 2001). Pour simplifier, la phase anagène est généralement réduite à trois étapes qui regroupent chacune plusieurs stades : précoce pour les étapes I-III, milieu d'anagène pour les étapes IV à v et anagène tardive pour les étapes VI et VII. La phase catagène qui succède à la phase anagène est très courte et ne dure que quelques semaines. Cette phase est divisée en 8 différentes stades (catagène I à catagène VIII) (Muller-Rover et col., 2001) Au cours de cette phase, le cheveu subit une involution, le follicule s'atrophie et son implantation dermique apparaît de plus en plus haute. La phase télogène, qui dure quelques mois, correspond à une période de repos du follicule où le cheveu finit par tomber. Après cette phase de repos un nouveau follicule est régénéré, sur place, et un nouveau cycle recommence. (Montagna et Parakkal, 1974). A chaque instant, tous les cheveux ne sont pas dans la même phase au même moment. Ainsi, sur les 150 000 cheveux environ que comporte une chevelure, seuls 10% d'entre eux environ sont au repos et seront donc remplacés en quelques mois selon une horloge biologique propre à chaque cheveu (Montagna, 1974). Chez la souris et les autres mammifères à fourrures, les follicules pileux possèdent également un cycle de renouvellement comportant les trois phases anagène, catagène et télogène, découpées en différents stades. Par contre, les cycles pilaires des jeunes animaux sont souvent � synchronisés �, c'est-à-dire dans la même phase du cycle au même moment au sein d'une même région anatomique (Muller-Rover et col., 2001). La chute ou perte naturelle des cheveux est un phénomène physiologique qui se produit en permanence et peut être estimée, en moyenne, à quelques cent cheveux par jour pour un état physiologique normal. Cependant, il arrive que le cycle pilaire puisse se dérégler et que la chute des cheveux s'accélère et conduise à une perte temporaire ou définitive des cheveux appelée alopécie. Différentes causes peuvent être à l'origine d'une alopécie. II existe différentes types d'alopécie, les formes principales sont : 2 2936255 • l'alopécie androgénétique héréditaire est la plus fréquente : elle se manifeste par une diminution du volume des cheveux, voire une calvitie, et touche 70% des hommes ; • l'alopécie aiguë : elle peut être liée à un traitement par chimiothérapie, un stress, des carences alimentaires importantes, une carence en fer, des troubles hormonaux, au sida, une 5 irradiation aiguë ; • l'alopécie Areata qui semble être d'origine auto-immune (mécanisme de médiation cellulaire) qui se caractérise par une atteinte en "patch" plus ou moins gros et à un ou plusieurs endroits. Cette forme de pelade peut atteindre toute la tête et on parle d'alopécie Totalis et parfois l'ensemble du corps c'est l'alopécie Universalis et dans ce cas il n'y a plus 10 aucun poil ni cheveu sur l'ensemble du corps. Dans tous ces trois cas, la chute des cheveux est en relation directe avec le cycle pilaire, le follicule n'entrant plus dans la phase anagène, ou la phase anagène n'étant pas maintenue, ce qui implique que le follicule ne produit plus de tige pilaire donc plus de cheveux. Pour lutter 15 contre l'alopécie, il est donc nécessaire de relancer le cycle pilaire en activant la phase anagène. On recherche ainsi depuis de nombreuses années, dans l'industrie cosmétique ou pharmaceutique, des compositions permettant de supprimer ou de réduire l'alopécie, et notamment d'induire ou de stimuler l'entrée en phase anagène ou la croissance des cheveux. 20 La demanderesse a maintenant trouvé que le gène codant pour Frizzled 2 était exprimé spécifiquement dans les kératinocytes du follicule pileux, et que son expression était induite au moment de l'entrée en anagène, in vivo, dans un modèle d'induction de l'entrée en anagène par gonadectomie. Elle propose dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression, pour 25 prévenir ou améliorer les phénomènes d'alopécie. Par alopécie, on entend toutes les formes d'alopécie, à savoir notamment les alopécies androgénétiques, aiguë ou areata. FZD2 30 Le gène Frizzled 2 (ou "FZD2") code pour une protéine transmembranaire servant de récepteur dans la voie de signalisation Wnt. Dans le contexte de l'invention, le terme � gène FZD2 � ou � acide nucléique FZD2 � signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la protéine FZD2. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire 35 appel à des cellules exprimant le récepteur transmembranaire Frizzled 2, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour le récepteur transmembranaire. La séquence nucléique humaine (SEQ ID No.1) et la séquence protéique humaine (SEQ ID No.2) du récepteur transmembranaire FZD2 sont reproduites en annexe. 3 2936255 FZD2 est connu pour jouer un rôle important dans la cascade de signalisation Wnt. La cascade de signalisation Wnt est une voie impliquée dans la prolifération et la détermination cellulaire. En absence de signal Wnt, la protéine cytoplasmique f3- 5 caténine s'associe avec un complexe de destruction contenant diverses protéines, l'axine, la kinase GSK-3(3 (Glycogen Synthase Kinase-3(3) et l'APC (Adeomatosis Polyposis Coli). Par fixation sur ce complexe, la (3-caténine est phosphorylée et ubiquitinée, ce qui entraîne sa dégradation. La fixation de Wnt à la surface de son récepteur Frz (Frizzled) entraîne l'activation de la protéine Dsh (Dishevelled) qui 10 inhibe le complexe de destruction (Barker et Clevers, 2000; Reya et Clevers, 2005). Les protéines de (3-caténine s'accumulent dans le cytoplasme et sont transloquées dans le noyau, où elles agissent comme des co-activateurs transcriptionnels du facteur TCF (aussi connu comme le Lymphoid Enhancer Factor, LEF) (Bien et Clevers, 2003). La voie Wnt est impliquée dans le développement des annexes tégumentaires (plumes 15 poils glandes) mais joue également un rôle au court du cycle pilaire. L'expression spécifique de FZD2 dans les kératinocytes du poil et son induction au cours de l'entrée en anagène suggère qu'il joue un rôle important dans l'homéostasie du follicule pileux. Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution 20 de l'alopécie chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2 (FZD2), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle. L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine FZD2 par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre 25 méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du récepteur transmembranaire FZD2 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet � contrôle � est un sujet � sain �. Dans le cadre d'un suivi de l'évolution de l'alopécie, le � sujet contrôle � fait référence au 30 même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'alopécie. 35 Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. 4 2936255 Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer une alopécie, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2 (FZD2), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un 5 sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine FZD2, par un test immunohistochimique ou immunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du récepteur 10 transmembranaire FZD2 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble capillaire lié à une alopécie. Le sujet � contrôle �, dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence � saine �. La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'alopécie. 15 Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par épilation de cheveux ou biopsie. 20 Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité du récepteur transmembranaire Frizzled 2 25 (FZD2) ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'alopécie. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité du récepteur transmembranaire FZD2, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 30 Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges 35 réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; 5 2936255 c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de 5 l'activité de la protéine FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par �modulation �, on entend tout effet sur le niveau d'expression ou d'activité du récepteur transmembranaire FZD2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses 10 promoteurs, à savoir éventuellement une inhibition, mais de préférence une stimulation, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus induisent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine FZD2, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 15 Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par �expression d'une protéine �, on entend la quantité de cette protéine ; Par � activité d'une protéine �, on entend son activité biologique ; Par � activité d'un promoteur �, on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la 20 synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. 25 Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité du récepteur transmembranaire FZD2. Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées 30 avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène FZD2, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également 35 s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. 6 2936255 Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur transmembranaire FZD2, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. 5 La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène FZD2 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule de prostate, ou encore mieux une cellule de la peau, des kératinocytes du follicule pileux ou des fibroblastes de papille dermique. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple des cheveux, ou des follicules pileux de vibrisses. 10 Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour le récepteur transmembranaire FZD2, de préférence humaine ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par 15 phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. Dans ces méthodes, l'expression du gène FZD2 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par 20 taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. L'homme du métier est familier avec les techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RTPCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels 25 que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde 30 marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (par exemple radioactif ou enzymatique) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde 35 antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéïnisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par exemple par autoradiographie ou chimioluminescence. 7 2936255 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûFrizzled 2 5 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de la protéine entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues par l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par 10 exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). 15 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes 20 solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des immunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par 25 analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur 30 leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). 35 Le récepteur transmembranaire FZD2 peut être produit selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Il peut également être produit à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. 8 2936255 Modulateurs du récepteur transmembranaire L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur du récepteur transmembranaire FZD2, à un patient nécessitant un tel traitement. 10 De préférence, de tels modulateurs sont des activateurs (ou inducteurs) du récepteur transmembranaire FZD2. L'invention comprend l'utilisation de composés inducteurs du récepteur transmembranaire FZD2, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus haut, pour le traitement 15 préventif et/ou curatif de l'alopécie. Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la 20 composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous 25 forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau, des muqueuses et du cuir chevelu et peut se présenter sous forme d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de 30 suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. 35 La composition peut comprendre une teneur en modulateur du récepteur transmembranaire Frizzled 2 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. 9 2936255 La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; 5 - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; 10 - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B ; - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains chélatants de métaux. 15 Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures : La Figure 1 illustre l'induction du passage en anagène par ovariectomie. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à 20 une ovariotomie ou non (contrôle) au jour 1 de l'étude. Un prélèvement de la peau de la région du dos des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. La Figure lA représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris au jour 0 de l'étude. La Figure 1B représente une coupe histologique de peau de la région dorsale d'une souris ovariectomisée au jour 8 de l'étude. La Figure 1C représente une coupe histologique de peau de la région dorsale 25 d'une souris contrôle au jour 8 de l'étude. L'analyse histologique montre clairement que l'ovariectomie a induit le passage en anagène (Figure 1B). La Figure 2 est un tableau qui présente la modulation du niveau d'expression des récepteurs Fzdl et Fzd2, exprimés par rapport au Jour 0 de l'étude, dans la peau de la région dorsale de 30 souris ovariectomisées au jour 8 de l'étude et dans la peau de la région dorsale de souris contrôle (peau en phase télogène) au jour 8 de l'étude par utilisation de la technologie des puces Affymetrix. Des souris femelles, dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène au Jour 0, ont été soumises à une ovariotomie au jour 1 de l'étude. Des souris non ovariectomisées ont été conservées pour servir de groupe contrôle. Un prélèvement de la peau 35 de la région dorsale des souris a été effectué aux jours 0 et 8 de l'étude. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie des puces Affymetrix. La Figure 3 montre l'expression du récepteur Fzd2 dans la peau de souris en début d'anagène et anagène tardive par hybridation in situ. La Figure 3A est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène précoce soumise à une hybridation in situ io 2936255 utilisant une sonde anti-sens de Fzd2, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3B est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène précoce contre-colorée à l'hématoxyline. 5 La Figure 3C est la photographie de l'image en fond noir d'une coupe de peau de souris en anagène tardive soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde anti-sens de Fzd2, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées par l'accumulation de points lumineux (grains argentés). La Figure 3D est la photographie de la même coupe histologie de peau de souris en anagène tardive contre-colorée à l'hématoxyline. 10 La Figure 4 est un graphique qui présente la modulation du niveau d'expression des récepteurs Fzdl, Fzd2 et Fzd6 dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par minoxidil ,exprimés par rapport au niveau d'expression dans de la région dorsale de souris en télogène traitées par le véhicule éthanol. Des souris mâles, dont les follicules pileux de la région dorsale 15 étaient en télogène, ont été traitées par de l'éthanol absolu ou minoxidil à 2.5% dans de l'éthanol absolu. Un prélèvement de la peau de la région dorsale des souris a été effectué 6 heures, 24 heures et 48 heures après le traitement. Les ARN ont été isolés et l'expression des gènes a été analysée par la technologie de kRT-PCR. 20 Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de Fzdl et Fzd2 au cours de l'entrée en anagène induite par l'ovariectomie par la technologie des puces Affymetrix. 25 Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène (Chase, 1954) ont été ovariectomisées ou non au jour 1 de l'étude. L'ovariectomie pratiquée pendant la phase télogène provoque sous une semaine une entrée massive des follicules pileux de la région dorsale en phase anagène (Chanda, 2000.) alors que les follicules 30 pileux de la région dorsale des animaux contrôles sont toujours en télogène. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux jours 0, 6 et 8 de l'étude. Une partie du prélèvement a été utilisé pour confirmer le passage en anagène par analyse histologique. L'autre partie du prélèvement a été utilisé pour réaliser une analyse du transcriptome par la technologie des puces Affymetrix. 35 L'expression des gènes a été analysée sur une station Affymetrix (module microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les recommandations du fournisseur. En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en ADNc. A partir d'ADNc double brin, les ARNc marqués à la biotine sont synthétisés en utilisant la polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le système � Lab on a chip � d'Agilent pour confirmer la bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après différents lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la présence ou l'absence de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (� perfect match �) versus un oligonucléotide qui contient une mutation,(� single mismatch �) dans la région centrale de l'oligonucléotide. Résultats: Figure 1 : En début d'étude au jour 0, l'analyse histologique montre que les follicules pileux de la région dorsale de la peau des souris sont en phase télogène (1A). Chez les souris soumises à une ovariectomie, les follicules pileux de la région dorsale de peau sont en début de phase anagène (1B). A l'inverse, les follicules pileux de la région dorsale de peau des souris contrôles (non ovariectomisées) sont restés en phase télogène. Ainsi, l'ovariectomie à induit la transition de la phase télogène à la phase anagène. La phase anagène est avérée par l'analyse histologique au jour 8 de l'étude. Figure 2 : Les récepteurs Fzdl et Fzd2 sont exprimés en phase télogène et en phase anagène du cycle pilaire. L'analyse différentielle entre l'expression au stade télogène à (JO) et anagène (J8 ovariectomisé) montre que l'expression des transcrits des gènes Fzdl et Fzd2 est induite en anagène précoce par rapport au stade télogène, alors que chez les souris contrôles, l'expression de ces récepteurs n'est pas induite par rapport au début d'étude. Exemple 2 : Expression de Fzd2 dans la peau de souris par � hybridation in situ � Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du facteur de transcription Sox4 par incubation du gène linéarisé (2�g) avec 63 �Ci de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections (4�m de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de 12 2936255 préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/�135S marqué) à 53°C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion photographique LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4°C pendant au 5 moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre-colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 4B et Figure 5B) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 3A et Figure 4A) 10 utilisé comme contrôle négatif. Résultats: Figure 3 Les images (A à B) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en début d'anagène. 15 Les images (C à D) montrent des follicules pileux de peau de dos de souris en milieux d'anagène. La Figure 3A montre que le récepteur Fzd2 est exprimé dans la peau de souris. Les transcrits sont spécifiquement présent au niveau des follicules pileux en début d'anagène. Plus particulièrement, Fzd2 est présent dans les kératinocytes au contact de la papille dermique. La Figure 3C montre que le récepteur Fzd2 est exprimé de façon spécifique dans les follicules 20 pileux en milieux d'anagène. Plus particulièrement, Fzd2 est présent dans la gaine épithéliale interne des follicules pileux. Exemple 3 : Mise en évidence de l'activité de minoxidil sur l'expression de Fzdl, Fzd2 et Fzd6 dans la peau de souris par la technologie des kRT-PCR (Applied 25 Biosystem). Méthodes : Des souris C57BL/6 femelles de 42 jours dont les follicules pileux de la région dorsale étaient en télogène ont été traitées avec 50 �l d'éthanol minoxidil 2.5%. Le traitement par minoxidil 2.5% pendant la phase télogène provoque une entrée rapide des follicules pileux de la région 30 dorsale en phase anagène par rapport aux animaux contrôles. Des prélèvements de peau ont été réalisés dans la région dorsale aux temps 6 h, 24 h et 48 h de l'étude. L'expression des gènes a été analysée par kRT-PCR en suivant les recommandations du fournisseur (Applied Biosystem). En résumé, les ARN totaux isolés des tissus sont transcrits en 35 ADNc. Les ADNc sont incubés avec des primers spécifiques pour les gènes de Fzdl, Fzd2 et Fzd6 qui ont été obtenus auprès d'Applied Biosystem. La kRT-PCR se déroule selon les conditions recommandées par le fournisseur. Chaque point a été fait en duplicate et chaque valeur de Ct a été normalisée par rapport au Ct du gène 18S. Pour chaque temps le niveau d'expression est calculé par rapport au niveau d'expression chez les individus contrôles. 13 2936255 Résultats: Figure 4 Le graphique 1 montre que le récepteur Fzdl et, plus particulièrement, le récepteur Fzd2 sont 5 induit 24 h après le traitement minoxidil. A partir de 48 h, le niveau d'expression des récepteurs Fzdl et Fzd2 revient au niveau d'expression dans la peau des individus contrôles. Le récepteur Fzd6 est induit 6h après le traitement minoxidil. Conclusion: 10 L'exemple 1 montre que les gènes Fzdl et Fzd2 sont exprimés dans la peau et induits au cours de l'entrées en anagène. L'exemple 2 souligne que le gène Fzd2 est exprimé de façon spécifique dans les kératinocytes des follicules pileux en anagène. L'exemple 3 indique que le traitement par minoxidil induit l'expression des Fzdl, Fzd6 et plus particulièrement Fzd2. 15 L'ensemble de ces travaux permet de soutenir l'utilisation de modulateurs de l'expression des récepteurs Fzd, et plus particulièrement Fzd2, chez l'Homme pour obtenir une stimulation de la croissance des follicules pileux en induisant l'entrée en phase anagène. Egalement, ils soutiennent l'intérêt de l'utilisation des récepteurs Fzd, et plus particulièrement du récepteur Fzd2, pour diagnostiquer ou prognostiquer cette pathologie. 20 14 REVENDICATIONS1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de Frizzled 2 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'alopécie selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine Frizzled 2, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) activent l'expression ou l'activité de la protéine Frizzled 2, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour le récepteur transmembranaire Frizzled 2, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour le récepteur transmembranaire Frizzled 2, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 10 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont choisies parmi les kératinocytes et les fibroblastes de la papille dermique ou du derme. 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans Iaquelle les cellules sont des cellules 5 transformées par un acide nucléi lue hétérologue codant pour le récepteur transmembranaire Frizzled 2. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de tran,;cription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de tradIction dudit gène. 15