Brevet FR2945821A1 — publié le 20101126

PROCEDE PERMETTANT LA TRAÇABILITE DE BACTERIES CORROSIVES La présente invention a pour objet un procédé permettant la traçabilité de bactéries corrosives posant problème dans les transports commerciaux et les prospectionsexploitations-distributions terrestres, sub-terrestres ou maritimes, notamment pétrolières. Dans de nombreux domaines, notamment le domaine pétrolier, l'étude des populations bactériennes est devenue une obligation. En effet, la contamination microbienne des installations est retrouvée à de multiples endroits au niveau des différents sites de prélèvement, dans les circuits de transports et jusque dans les cuves de stockage, notamment celles des stations services. Certains microorganismes utilisent les hydrocarbures présents comme source de carbone pour leur croissance ce qui diminue la qualité du pétrole brut ou du produit raffiné. En raison de la poussée écologique des dernières années notamment face aux catastrophes écologiques imputables aux compagnies pétrolières (marées noires, sols contaminés par les hydrocarbures), des études sur les microorganismes dégradant les hydrocarbures ont été lancées et devraient permettre d'isoler des souches bactériennes utilisables dans le processus de bioremédiation des environnements marins ou terrestres contaminés par les hydrocarbures. Outre l'intérêt écologique qu'ils présentent, l'étude de ces microorganismes a de nombreuses implications aussi bien fondamentales (stabilisation des macromolécules et des membranes) qu'appliquées (utilisation industrielle d'enzymes thermostables). Le pétrole résulte de la lente dégradation chimique et bactériologique d'organismes aquatiques végétaux et animaux qui, il y a des dizaines, voire des centaines de millions d'années, ont proliféré dans les mers et se sont accumulés en couches sédimentaires. Les gisements se localisent toujours en un point singulier ou dans une anomalie naturelle de ces roches, que l'on appelle roches-réservoirs ou roches-magasins. Le pétrole se présente le plus souvent surmonté d'une couche d'hydrocarbures gazeux et se situe généralement au-dessus d'une couche d'eau salée. Typiquement, dans la partie huileuse du réservoir, 80 % du volume poreux sont occupés par le pétrole alors que les 20 % restants le sont par de l'eau de salinité variable constituant le milieu de croissance des organismes. Les réservoirs de pétrole sont généralement caractérisés aussi par des températures élevées puisque la température est généralement estimée subir une augmentation de 2 à 3° C par 100 mètres de profondeur. Les pétroles bruts sont constitués de différentes familles des composés (Figure 1) dont la composition chimique varie énormément selon leur origine géographique et géologique. Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut pétrolier et représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Les composés pétroliers peuvent être classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon l'origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %). Les microorganismes extrêmophiles peuvent se développer dans des milieux où les conditions physico-chimiques sont inappropriées pour la croissance de la plupart des organismes. Dans ce type de milieux, la diversité biologique est souvent plus réduite et l'on peut parfois observer un seul type de microorganisme. Au total cependant, la diversité des extrêmophiles est notable (Stetter K.O., FEMS Microbiol., (1996), 19, 149-158). Des habitats extrêmes de type hypersalés, très acides ou alcalins, des habitats à hautes pressions, très chauds ou très froids ont ainsi été colonisés. Les puits de pétrole, avec leur forte salinité, leur forte chaleur et parfois leur forte pression font partie des environnements extrêmes. A ce jour, peu d'études ont été menées sur la biodiversité des puits eux-mêmes. La plupart des bactéries isolées appartiennent aux bactéries sulfato-réductrices (BSR), aux bactéries méthanogènes, aux bactéries fermentaires et aux bactéries aérobies. Les bactéries fermentaires ne sont pas capables de dégrader, en condition anaérobie et en culture pure, les hydrocarbures vrais. Mais certaines bactéries fermentaires le sont pour des composés de type hydrocarbures oxydés. De plus, ce type de bactéries peut intervenir dans certains réseaux trophiques en dégradant les composés plus polaires car oxydés lors de l'attaque initiale de l'hydrocarbure par d'autres types bactériens (BSR, bactéries méthanogènes). En effet des composés de type phénols ou benzoates présentent une polarité et un taux d'oxydation suffisant pour permettre une récupération d'énergie significative en condition anaérobies par certaines bactéries fermentaires. De plus le pétrole brut n'étant pas constitué uniquement de composés hydrocarbonés, des bactéries fermentaires peuvent croitre au dépend de ces autres composés en condition anaérobie. Par exemple des bactéries des genres Petrotoga et Thermotoga ont ainsi été isolées de puits de pétrole. Les BTEX (ou Benzène, Toluène, Ethyl-benzène et Xylènes) représentent les composés hydrocarbonés volatiles les plus abondants d'un brut pétrolier. Ces BTEX, y compris le benzène, sont dégradés par des consortia méthanogéniques qui sont restés longtemps non caractérisés. Parmi les habitats de ces consortia, les stockages souterrains d'hydrocarbures, qui sont susceptibles de subir une dégradation méthanogénique, ont fait l'objet d'étude de caractérisation de leur microflore méthanogénique par analyses des séquences d'ARN 16S (Watanabe K. et al. Appl. Environ. Microbiol., (2002), 68, 3899-3907). Les techniques moléculaires ont ainsi permis à Ficker M. et al. (Appl. Environ. Microbiol., (1999), 65, 5576-5585) de décrire de façon détaillée un consortium méthanogénique utilisant le toluène pour sa croissance. Ce consortium avait été obtenu par enrichissement sur toluène pendant plusieurs années. La composition de la communauté ressemblait à celle d'une culture syntrophique dégradant le benzoate décrite par d'autres auteurs. Elle comportait deux espèces eubactériennes et deux espèces archéennes méthanogènes. L'une de ces deux dernières était apparentée à celles du genre Methanosaeta, une archée acétoclastique, et l'autre à celles du genre Methanospirillum. L'une des espèces eubactériennes était voisine du genre Desulfatomaculum, un genre de BSR qui est aussi capable de conversions acétogéniques en l'absence de sulfate. L'autre espèce eubactérienne, sans affiliation avec un groupe connu, était vraisemblablement celle effectuant l'attaque initiale du toluène. D'autres types de dégradation syntrophique du toluène ont été décrits par la suite. De nombreux groupes de micro-organismes utilisent une assez large variété de composés inorganiques voire organiques comme accepteurs terminaux d'électrons lors de leur respiration anaérobie. Parmi ces composés inorganiques, ceux du soufre jouent un rôle particulièrement important ; on peut citer le soufre élémentaire et les polysulfures, le sulfate et le sulfite, le thiosulfate et les polythionates. Les bactéries sulfato-réductrices (BSR) constituent un groupe physiologique unique de micro-organismes partageant la capacité d'utiliser le sulfate pour leur croissance en produisant d'importantes quantités d'hydrogène sulfuré. Il existe deux groupes de BSR : le premier comprend les bactéries capables d'oxyder complètement les composés organiques en dioxyde de carbone alors que le second n'oxyde que partiellement ces composés organiques, menant à la synthèse d'acétate. La physiologie et la taxonomie des BSR ont subi de considérables changements durant ces vingt dernières années et environ 40 genres et 150 espèces de sulfato-réducteurs sont actuellement caractérisés et divisés en trois groupes phylogénétiques d'après l'analyse de leurs séquences d'ARNr 16S : • Eubactéries BSR Gram-positive sporulées • Eubactéries BSR Gram-négative mésophiles et thermophiles • Archaebactéries thermophiles sulfato-réductrices. La majorité des BSR décrites à ce jour appartient au domaine des Bacteria (firmicutes pour les BSR sporulées et delta protéobactéries pour les BSR non-sporulées). Le domaine des Archaea n'est actuellement représenté que par deux genres thermophiles : Archaeoglobus et Caldivirga. Diverses BSR ont été isolées d'environnement pétrolier et certaines d'entres elles sont capables de croitre sur certains hydrocarbures monoaromatiques. Les BTEX sont ainsi tous dégradables en conditions sulfato-réductrices. Ces BSR sont capables de dégrader et de minéraliser la plupart d'entre eux en culture pure. C'est le cas par exemple des souches oXyS1 et mXyS1, isolées respectivement sur o-xylène et m-xylène à partir d'une culture d'enrichissement sur pétrole brut. Les alkylbenzènes dégradés par ces souches sont utilisés comme substrat de croissance et minéralisés, et non pas dégradés par co-métabolisme. D'autres souches bactériennes ont également été isolées de champs pétroliers dont Desulfovibrio alaskensis, Desulfovibrio capillatus ou encore Desulfonatronovibrio hydrogenovorans. Les bactéries aérobies habitant les réservoirs pétroliers chauds sont encore très peu étudiées. Parmi ces bactéries aérobies et thermophiles, certaines ont été isolées à partir de divers puits pétroliers (Kazakhstan, Sibérie, Russie et Chine). Par exemple, deux bactéries sporulantes et oxydant le pétrole ont été identifiées, comme appartenant au genre Geobacillus : G. subterraneus et G. uzenensis. Récemment, une nouvelle espèce bactérienne thermophile du même genre Geobacillus, (G. jurassicus) a été isolée d'un réservoir pétrolier géothermique localisé à Dagang en Chine. De même a pu être décrit à partir d'un puits de pétrole situé dans le Queensland, à l'Est de l'Australie, un nouveau genre bactérien consommateur de nitrate, Petrobacter succinatimandens, qui se distingue par ses activités métaboliques. Elle s'est révélée capable d'oxyder les acides organiques et se caractérise par un métabolisme aérobie-anaérobie facultatif. L'introduction accidentelle d'oxygène, via un apport d'eau extérieur au gisement (infiltrations d'eau de pluie ou pratique courante d'injections d'eau lors de l'extraction du pétrole) pourrait expliquer la présence de telles bactéries aérobies et de leur maintien dans un environnement anaérobie. La microbiologie moléculaire permet, entre autre, d'identifier différentes souches bactériennes présentes dans un échantillon même lorsque l'on n'est pas capable de les cultiver. Une des branches de cette discipline est impliquée dans le développement de méthodes moléculaires pour l'identification et le suivi de microorganismes dans leur environnement. Depuis une vingtaine d'années, l'identification des microorganismes basée sur des méthodes moléculaires, spécialement celles incluant le séquençage des gènes codant pour l'ADN ribosomal 16S, est devenue un outil très important dans l'étude des communautés bactériennes. L'orientation vers l'utilisation des techniques culture-indépendantes vient, d'une part, du manque de connaissances des conditions réelles sous lesquelles se développent les microorganismes dans leurs environnements et, d'autre part, de la difficulté rencontrée pour développer des milieux de culture réunissant toutes les conditions nécessaires à la croissance bactérienne. Les techniques de biologie moléculaire peuvent également être désignées sous le terme de � fingerprint génétique �, que l'on peut traduire par � empreinte génétique �. Elles ont d'abord été utilisées en génétique humaine, pour permettre la détection de mutations, responsables de maladies génétiques. Ces techniques ont ensuite été appliquées à l'identification de populations de procaryotes et d'eucaryotes unicellulaires. Parmi les techniques qui ont été développées, on peut citer la technique appelée Terminal-Restriction Fragment Lenght Polymorphism (T-RFLP). Il s'agit d'un outil moléculaire basé sur la présence de sites de restriction à l'intérieur de fragment d'ADN, ces sites étant coupés par des enzymes spécifiques, appelés enzymes de restriction et a été introduite plus tard (Liu W.T. et al., Appl. Environ. Microbiol., (1997) 63, 4516-4522). Cette technique, bien que permettant d'identifier des polymorphismes au sein des espèces, ne permet pas la caractérisation de toutes les sous espèces, et en particulier ne permet pas de différencier deux espèces différentes qui ne possèdent pas de polymorphisme de restriction. La gestion de la biocorrosion en milieu pétrolier génère un coût annuel énorme pour les exploitants pétroliers de toute la chaine, du gisement à la pompe en passant par le raffinage et le stockage. Ce problème de corrosion est aussi important dans le transport maritime (militaire ou commercial), et estimé à 250 Millions de dollars aux USA pour prévenir, réparer, changer les infrastructures métalliques du pays (ponts, barrage, bâtiments...). Aussi la traçabilité de procaryotes (bactéries ou leurs produits de métabolisme) posant problème dans un champ pétrolier comme lors de son exploitation-distribution, permettrait de mettre en évidence la présence du problème et de traiter/éliminer/gérer le potentiel contamination � oil spoilage �/toxique/biocorrosif d'un brut pétrolier, quel qu'il soit, et par extension tout problème de biocorrosion lié à des tankers métalliques de transport ou de stockage pour produits aqueux ou solides, y compris aliments, boissons, ainsi que tout type de biotope concerné, y compris boues, sources, etc.... Actuellement, seul l'isolement de bactéries permet d'identifier la présence de bactéries corrosives de type BSR ou assimilé. Hors pratique culturale, il n'existe aucun moyen d'identification et donc aucune traçabilité et en cas de problème de corrosion la seule solution est le traitement par des biocides. Le Brevet français N°2 791 362 décrit un procédé de dénombrement de BSR mais ne mentionne pas la possibilité d'une traçabilité de ces bactéries. Il existe donc un besoin de disposer de techniques simples, fiables et économiques permettant l'évaluation, l'identification et la caractérisation d'une microflore bactérienne. Aussi la présente invention a-t-elle pour objet un procédé de détection et/ou de discrimination de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, lesdits matériaux étant en contact avec un échantillon susceptible de contenir au moins un desdits microorganismes, ledit procédé comprenant : a. l'extraction du matériel génétique des microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon en contact avec un matériau 20 susceptible d'être corrodé, b. la détermination de l'éventuelle présence d'au moins un microorganisme responsable de la corrosion de matériaux dans ledit échantillon au moyen de l'amplification d'au moins un fragment du gène dsrB par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), 25 c. la discrimination des microorganismes présents dans l'échantillon, révélés à l'étape précédente, par la mise en oeuvre d'une technique de séparation des produits de réactions de PCR précédents en fonction de leur séquence nucléotidique utilisant le polymorphisme de conformation des simples brins SSCP, notamment par système capillaire (CE-SSCP). 30 Par � procédé de détection et/ou de discrimination �, l'invention définit un � procédé de détection �, ou un � procédé de discrimination �, ou un � procédé de détection et de discrimination �. Le � procédé de détection � selon l'invention permet d'identifier la présence d'un microorganisme dans un échantillon. Le � procédé de discrimination � selon l'invention permet de définir qu'un échantillon possédant des microorganismes en possède plusieurs différents. Enfin, le � � procédé de détection et de discrimination � décrit dans l'invention permet à partir d'un échantillon déterminé de définir s'il présente ou non des microorganismes, et si tel est le cas de définir s'il contient un ou plusieurs microorganismes �. Le procédé décrit dans l'invention repose sur une méthode comprenant trois étapes : une étape de purification et d'extraction du matériel génétique des microorganismes susceptibles d'être contenus dans un échantillon, - une étape d'amplification dudit matériel génétique, notamment au moyen de la technique de PCR connue de l'homme de métier, et - si l'échantillon est positif, c'est-à-dire s'il contient au moins un microorganisme à l'issue de l'étape précédente, la discrimination de l'éventuelle présence de plusieurs microorganismes au moyen de la technique de SSCP. Le polymorphisme de conformation des simples brins (Single-Strand Conformation polymorphism ou SSCP), a été introduit avant la T-RFLP, il y a une dizaine d'années (Lee DH, Zo YG, Kim SJ, Appl. Environ. Microbiol., (1998), 62 , 3112-3120). Cet outil moléculaire utilise les différentes conformations que peut acquérir un ADN simple-brin pour différencier des séquences entre elles. La technique SSCP sur séquenceur capillaire (CE-SSCP) est utilisée en routine par l'homme de métier. La séparation des fragments d'ADN de même taille est basée sur la migration différentielle de l'ADN simple brin en condition non dénaturante, en fonction de leur conformation tridimensionnelle. Comparativement à la SSCP sur gel classiquement utilisée par l'homme de métier, la SSCP capillaire (CE-SSCP) est une technique haut-débit séparant, sans action humaine, les produits d'amplification, cette automatisation en améliore la reproductibilité. Il s'agit d'une méthode privilégiée pour la description de flores complexes de microorganismes. Ainsi, le procédé de l'invention, à partir des profils obtenus par CE-SSCP, permet d'établir un profil moléculaire du ou des microorganismes susceptibles d'êtres présents dans l'échantillon. Dans l'invention, la � corrosion � désigne l'altération d'un objet par réaction avec un oxydant. Les exemples les plus connus sont les altérations chimiques des métaux. Cependant, la corrosion est un domaine bien plus vaste qui touche toutes sortes de matériaux (métaux, céramiques, polymères) dans des environnements variables (milieu aqueux, pétrolifères, atmosphère, hautes températures...). Dans l'invention, le procédé permet de détecter et de discriminer des 5 microorganismes capables, ou susceptibles d'être capable, d'altérer un matériau en provoquant une corrosion. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, lesdits microorganismes sont des procaryotes, préférentiellement des procaryotes exprimant l'enzyme sulfite réductase, notamment des bactéries sulfato-réductrices. 10 Dans un autre mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, ledit échantillon est en contact avec un contenant susceptible d'être corrodé. Par contenant on entend dans l'invention tout objet capable de contenir. Par exemple, un pipeline est un contenant pour le pétrole, et une boite de conserve est un contenant pour un aliment... Par extension, un contenant est défini dans l'invention comme tout matériau en 15 contact avec l'échantillon, et notamment les outils de forage. Conformément à l'invention, ledit échantillon est choisi parmi tout échantillon susceptible d'être acheminé, transporté, stocké, conservé, commercialisé en contenant métallique ou équivalent, et donc pouvant être sujet à la corrosion, et notamment le pétrole brut, le pétrole lourd, le pétrole léger et les eaux de pétrole, ainsi que les aliments, les 20 boissons, et autres produits assimilés tels que les boues et autres milieux. Par produits assimilés, on entend dans l'invention des produits tels que les compléments alimentaires correspondant à des produits ingérés, les eaux potables, les eaux de source contenus, ou transportés dans des contenants susceptibles de corrosion. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, si l'échantillon contient une 25 faible quantité de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, le procédé selon l'invention comprend une étape complémentaire permettant d'augmenter la quantité de matériel génétique issu desdits microorganismes afin de disposer d'une quantité plus importante. Conformément à l'invention cette étape complémentaire peut être réalisée par 30 n'importe quelle technique connue de l'homme du métier, notamment elle peut consister en une étape de stimulation de la prolifération desdits microorganismes afin d'augmenter la quantité desdits microorganismes. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la stimulation de la prolifération consiste en la levée de phase stationnaire desdits microorganismes, notamment par la mise en culture desdits microorganismes, dans un milieu contenant des nutriments et dans des conditions nécessaires à leur prolifération. La �phase stationnaire � d'un microorganisme est définie dans l'invention comme la phase ou un microorganisme est métaboliquement actif (il est capable de se nourrir) mais pendant laquelle ledit microorganisme ne se multiplie pas, c'est-à-dire qu'il ne procède pas à la division cellulaire. La � levée de la phase stationnaire � correspond donc dans l'invention aux conditions environnementales (nutriments, air...) qui font que le microorganisme se met à entrer dans une phase de division cellulaire, notamment par Mitose. Un moyen de lever la phase stationnaire est de mettre ledit microorganisme dans un milieu de culture riche en nutriments et en éléments essentiels pour sa division cellulaire, c'est-à-dire sa prolifération. Avantageusement cette mise en culture est réalisée dans les conditions suivantes : la température est généralement celle de l'échantillon + ou ù 5°C, (sans excéder 75°C) ; toutefois pour les échantillons de très basse et très haute température, ladite mise en culture est également effectuée à la température standard de 37°C, la salinité correspond généralement à celle de l'échantillon + ou ù 1% en NaCl (sans excéder 300 g/1) ; pour les microorganismes aptes à supporter des salinités élevés, la mise en culture est également effectuée à une salinité standard de 1% en NaCl , - le pH correspond généralement à celui de l'échantillon + ou ù 0,5 unité de pH ; pour les échantillons fortement acides ou basiques, la mise en culture est également effectuée à un pH compris entre 7,2 et 7,5. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les nutriments utiles à la stimulation de la prolifération sont fournis par le lactate et/ou l'acétate dans une gamme de concentration d'environ 0,3 à environ 30 g/1, ainsi que par la peptone et/ou l'extrait de levure, dans une gamme de concentration d'environ 0,1 à environ 20 g/l. Lorsque l'échantillon est du pétrole ou de l'eau de pétrole, ledit milieu contenant des nutriments est éventuellement complémenté avec d'environ 0,1 % à environ 1 % de pétrole brut. 15 20 25 L'étape complémentaire permettant d'augmenter la quantité de matériel génétique issu desdits microorganismes afin de disposer d'une quantité plus importante peut également être réalisée par une étape de concentration du matériel génétique des microorganismes, notamment une étape de concentration par filtration au moyen d'un filtre spécifique, notamment avec une taille de pores dans une gamme d'environ 0,05 à environ 0,25 �m, notamment de type polyéthersulfone ou tout filtre de caractéristiques équivalentes. Les filtres de caractéristiques équivalentes qui peuvent être utilisés dans l'invention possèdent une porosité telle qu'elle permet la rétention d'une biomasse bactérienne, c'est-à-dire que la taille des pores est comprise entre 0,05 et 0,25 �m. Les filtres préférés de l'invention sont de type polyéthersulfone qui sont plus inertes et plus broyables que les autres filtres utilisables par l'homme de métier. Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention, la PCR est réalisée en utilisant : a. une amorce sens comprenant ou consistant en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 19 nucléotides consécutifs, au moins 21 nucléotides consécutifs, de la séquence SEQ ID NO 1 suivante : 5'- GGN1 N2T N3 N4 N5CAACATCGT N6CAN7ACCCAGGG-3' où N1 représente un C ou un T, N2 représente un A ou un G, N3 représente un A, un C ou un T, N4 représente un A ou un T, et N5 représente un C ou un G, N6 et N7 représentent n'importe quel nucléotide (A, T, G ou C) b. une amorce anti-sens comprenant ou consistant en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 16 nucléotides consécutifs, préférentiellement les 17 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO 2 suivante : 30 5 '-GTGTAGCAGTTACCGCA-3'. L'amorce sens peut donc correspondre, lorsqu'elle comprend au moins 15 nucléotides, aux séquences suivantes : '- GGN1N2TN3N4N5CAACATC-3', 5'- GNIN2TN3N4N5CAACATCG -3', 5'- NIN2TN3N4N5CAACATCGT-3', etc... Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé selon 5 l'invention, l'amorce sens comprend ou consiste en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 19 nucléotides consécutifs, au moins 21 nucléotides consécutifs de l'une quelconque des séquences suivantes : 5'- GGCATAACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 3, 5'- GGTATAACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 4, 5'- GGCGTAACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 5, 5'- GGTGTAACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence 15 SEQ ID NO 6, 5'- GGCATCACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 7, 5'- GGTATCACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 8, 20 5'- GGCGTCACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 9, 5'- GGTGTCACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 10, 5'- GGCATTACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence 25 SEQ ID NO 11, 5'- GGTATTACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 12, 5'- GGCGTTACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 13, 30 5'- GGTGTTACCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 14, 5'- GGCATATCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 15, 10 15 20 25 30 12 5'- GGTATATCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 16, 5'- GGCGTATCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 17, 5'- GGTGTATCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 18, 5'- GGCATCTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 19, 5'- GGTATCTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 20, 5'- GGCGTCTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 21, 5'- GGTGTCTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 22, 5'- GGCATTTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 23, 5'- GGTATTTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 24, 5'- GGCGTTTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 25, 5'- GGTGTTTCCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 26, 5'- GGCATAAG CAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 27, 5'- GGTATAAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 28, 5'- GGCGTAAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 29, 5'- GGTGTAAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 30, 5'- GGCATCAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 31, correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence 10 15 20 25 30 13 5'- GGTATCAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 32, 5'- GGCGTCAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 33, 5'- GGTGTCAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 34, 5'- GGCATTAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 35, 5'- GGTATTAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 36, 5'- GGCGTTAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 37, 5'- GGTGTTAGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 38, 5'- GGCATATGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 39, 5'- GGTATATGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 40, 5'- GGCGTATGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 41, 5'- GGTGTATGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 42, 5'- GGCATCTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 43, 5'- GGTATCTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 44, 5'- GGCGTCTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 45, 5'- GGTGTCTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 46, 5'- GGCATTTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' SEQ ID NO 47, correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence correspondant à la séquence 25 30 5'- GGTATTTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 48, 5'- GGCGTTTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 49, 5'- GGTGTTTGCAACATCGTCCACACCCAGGG-3' correspondant à la séquence SEQ ID NO 50). Dans un mode de réalisation encore plus avantageux du procédé selon l'invention, l'amorce sens consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 50, ou consiste en la séquence SEQ ID NO 51 suivante : 5'- CAACATCGTCCACACCCAGGG-3', et l'amorce anti-sens consiste en la séquence SEQ ID NO 2. Dans un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de référencement des profils SSCP afin de disposer d'une banque de données référençant les polymorphismes, c'est-à-dire leur profil moléculaire, des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon. L'invention a également pour objet un procédé de discrimination de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, lesdits matériaux étant corrodés et étant en contact avec un échantillon contenant au moins un desdits microorganismes, ledit procédé comprenant : a. l'extraction du matériel génétique des microorganismes contenus dans ledit échantillon en contact avec un matériau corrodé, b. l'amplification d'au moins un fragment du gène dsrB par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), c. la discrimination des microorganismes présents dans l'échantillon, révélés à l'étape précédente, par la mise en oeuvre d'une technique de séparation des produits de réactions de PCR précédents en fonction de leur séquence nucléotidique utilisant le polymorphisme de conformation des simples brins, notamment par système capillaire (CE-SSCP). L'invention a également pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention, pour la détermination de la signature moléculaire d'un échantillon en contact avec un matériau susceptible d'être corrodé, - ladite signature moléculaire correspondant à la somme des profils moléculaires de chacun des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, - lesdits profils moléculaires étant obtenus à partir du profil SSCP des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, et - ledit profil SSCP de chacun des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon étant référencé dans une banque de données. Le procédé selon l'invention permet donc, d'établir une signature moléculaire, c'est-à-dire une sorte de carte d'identité moléculaire d'un échantillon donné, qui correspond à la somme des profils moléculaires des différents organismes contenus dans l'échantillon. A partir de la banque de donnée établie dans l'invention, il est donc possible de déterminer avec exactitude quels sont les microorganismes contenus dans un échantillon déterminé. Plus généralement, la signature moléculaire d'un échantillon obtenue selon l'invention permet la traçabilité d'un échantillon. Cela signifie, que la signature moleculaire permet d'identifier un échantillon et de remonter jusqu'à sa source, et d'identifier tous les contenants susceptibles d'être corrodés qui ont été en contact avec les microorganismes définissant ladite signature moléculaire. L'exemple et les figures 1 à 6 qui suivent illustrent l'invention. La figure 1 illustre les principaux composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans le brut pétrolier. La figure 2 présente les caractéristiques principales des trois puits (P1, P2 et P3) tunisiens étudiés. ne : non communiquée. La figure 3 illustre la biodiversité sur la base de la région V3 de l'ADNr 16S retrouvée dans les échantillons natifs des puits Pl et P2. La figure 4 illustre la biodiversité sur la base de la région V3 de l'ADNr 16S retrouvée après levée de phase stationnaire (profil LPS pauvre) provenant de P2 (haut) et P3 (bas). La figure 5 illustre la reconnaissance des clones grâce à la co-migration (superposition) des pics. Les flèches indiquent les trois pics du profil ayant été identifiés. Les clones 1 et 8 sont affiliés à la souche Marinobacter sp YJ0216, les clones 3 et 10 à Marinobacter sp BR-13 et les clones 12 et 13 à Leuconostoc citreum KM20. La figure 5 illustre la possibilité d'effectuer la traçabilité d'un profil bactérien unique. La figure 6 illustre la biodiversité en sulfato-réducteurs révélée dans les échantillons natifs, avec l'exemple des puits P2 (haut) et P1 (bas). Les flèches représentent les comigrations entre les deux échantillons, les couleurs identiques représentant les identifications bactériennes superposables pour ces deux puits P2 et P1. Exemple 1.1. Matériels et méthodes 1.1.1. Echantillons Les échantillons utilisés ont été collectés de trois puits pétroliers tunisiens notés respectivement P1, P2 et P3. Les échantillons ont été récupérés à la sortie des tuyaux ramenant le pétrole du puits à la surface, en prenant soin de rester dans les conditions les plus stériles possibles, pour éviter toute contamination liée aux prélèvements effectués. Les échantillons ont été stockés à 4°C dès leurs prélèvements et durant tout le temps précédant les manipulations. Les caractéristiques des différents sites de prélèvements (puits) sont synthétisées dans la figure 2. 1.1.2. Milieux utilisés pour les techniques culture-dépendantes Pour pouvoir comparer les résultats obtenus entre les outils moléculaires et les techniques culture-dépendantes, une mise en culture des différents échantillons natifs a été réalisée. 1.1.1.1. Milieu de base Le milieu de base est composé de (par litre de solution) : extrait de levure : 1g, NaCI: 50g, KC1: 0,1g, NH4C1: 0,5g, KH2PO4: 0,6g, K2HPO4: 0,6g, solution d'oligoélément de Widdel & Pfennig (Arch. Microbiol., (1981), 129, 395-400), modifiée par Imhoff-Stuckle & Pfennig (Arch. Microbiol., (1983 ), 136, 194-198) : 1 ml, cystéine-HC1 : 1g, résazurine : lml (solution aqueuse à 0,1 %), MgC12 x 7H2O: 0,3g, CaC12 x 2H2O: 0,05g, solution de vitamines de Balch et al. (Microbiol. Rev., (1979), 43, 260-296) : 10ml. Lors de l'utilisation d'un milieu pauvre, le même milieu est utilisé, mais avec une concentration en extrait de levure réduite à 0,1 g par litre de solution. Ce milieu de base a été distribué dans des tubes de Hungate puis stérilisé (autoclavé à 110°C pendant 30 min). Les autres éléments ont été ajoutés dans ces tubes, en conditions anaérobies et stériles, dont une solution de tampon carbonaté (NaHCO3 10%) et un réducteur de milieu (Na2S). Le volume final est de 5m1. Pour garantir les conditions d'anaérobiose stricte, les ajouts sont effectués sous flux d'azote et de manière stérile. 1.1.1.2. Milieu spécifique pour bactéries sulfato-réductrices Pour cibler les conditions sulfato-réductrices, il n'y a pas eu d'ajout de réducteur de milieu (Na2S) pour ne pas interférer avec les sulfures produits lors de la réduction des sulfates. Les substrats carbonés ajoutés sont les d'hydrocarbure (1% v/v de brut pétrolier) et l'acétate (5mM) ou le lactate (5mM). Enfin, les tubes ont été inoculés avec 0,1 ml d'échantillon natif par tube de Hungate. Les tubes ont été placés sous étuves à 45°C et sans agitation. Il n'y a pas eu de gazage H2/CO2 (tube à pression atmosphérique). 1.1.1.3. Milieu spécifique pour bactéries fermentaires Pour privilégier des conditions fermentaires, des solutions de peptone (5g/1) et de glucose (20mM) ont complété la source d'hydrocarbures (1% v/v). Les tubes ont été inoculés avec 0,1 ml d'échantillon natif. Les tubes, comme précédemment, ont été placés à incuber à 45°C, sans agitation et sans gazage H2/CO2. Pour l'ensemble de ces milieux, les croissances positives sont repiquées dans les 20 mêmes conditions jusqu'à l'obtention d'un enrichissement bactérien dense permettant les isolements bactériens correspondants. 1.1.1.4. Milieu spécifique pour bactéries aérobies Le milieu utilisé est identique à celui des bactéries fermentaires, mais les tubes et boites de Pétri sont placés sous atmosphère aérobie. Ces tubes, comme précédemment, ont été 25 placés à incuber à 45°C, sans agitation. 1.1.3. Techniques de culture bactérienne 1.1.3.1. Levée de phase stationnaire (LPS) Une partie des bactéries présentes dans un échantillon natif, du fait de son stockage à 4°C, risque d'être en phase stationnaire ou en phase de dormance. Cette première culture mise 30 en culture en milieu spécifique a pour but d'initier cette levée de dormance. Tous les milieux ont été réalisés avec 50g/1 de NaCl et ajustés à un pH compris entre 7,2 et 7,5 unités pH. Les trois échantillons natifs ont été mis en culture dans deux types de milieux. Le premier milieu dit � riche � en substrat carboné est supplémenté avec : 1 g/1 de peptone, 1 g/l d'extrait de levure, 1% de brut. Le deuxième milieu dit � pauvre � se différencie du premier par une réduction au dixième de l'extrait de levure et de la peptone. Toutes les cultures ont été réalisées sous agitation et à 45°C. Avant toute mise en croissance, une partie de chaque échantillon natif a également été conservée pour une utilisation directe de l'ADN bactérien présent avec l'outil moléculaire (SSCP). 1.1.3.2. Enrichissement et isolement bactérien Les enrichissements ont été réalisés à partir des croissances positives observées lors de la LPS (levée de phase stationnaire) des échantillons natifs et sous les conditions décrites ci-dessus. L'isolement bactérien a été recherché par des séries de dix dilutions successives au 1/10ème dans des tubes de Hungate pour les conditions anaérobies et en boite de pétri pour les conditions aérobies. Les colonies obtenues à partir de la dilution ultime sont observées sous loupe binoculaire et les colonies bien isolées sont prélevées et remises en suspension-dilution dans les mêmes conditions. Le protocole est ainsi répété jusqu'à l'obtention de clones qui sont alors considérés comme des souches pures. Ces souches pures sont ainsi prêtes pour une analyse phylogénétique du gène de la sous-unité 16S de l'ARN ribosomal. 1.1.4. Techniques moléculaires 1.1.4.1.Extraction d'ADN pour la SSCP Les extractions d'ADN ont été réalisées de deux manières, suivant la quantité d'ADN bactérien disponible. Soit directement sur culots bactériens après centrifugation (13000rpm, 15 min, 4°C) soit sur des filtres, stockés à -80°C avant extraction. Les Kits � QlAamp DNA Stool � et � QlAamp Mini Kit � ont permis l'extraction sur culot et filtrat respectivement. Les extractions ont été vérifiées sur gel d'agarose 0,7% et 1% de BET puis stockées à -20°C. 1.1.4.2.Technique d'amplification par PCR 1.1.4.2.1. Amplification de la partie V3 de l'ADNr 16S Toutes les amplifications ont été réalisées avec la technique de polymérisation en chaine (PCR). La PCR utilisée pour la SSCP est une PCR qui cible la région V3 de l'ADNr 16S. L'intérêt d'utiliser ce gène vient du fait de sa très grande conservation mais également du fait que le gène produit un ARN fonctionnel, non traduit en protéine et possédant des structures secondaires remarquables et indispensable à la fonction de cet ARN. Cette PCR utilise les primers sens w49 (5'-ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3') et anti-sens w104 (5'-6FAM-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'), ce dernier étant couplé à un fluorochrome (6 FAM, 6 carboxyfluorescein) permettant la détection du fragment couplé par l'outil SSCP. Le mix PCR utilisé est le suivant (pour un tube PCR 0,2m1) : H2O : 36.98�l, Tampon 10x Pfu Turbo : 5�l, dNTP : 4�l, primer w36 : 1,3�l, primer w104 : 1,3g1 et Pfu Turbo (0,5�l). Les cycles PCR utilisés sont présentés dans le tableau ci-dessous. Température Durée Nombre de cycles Dénaturation 94°C 2 min 1 Dénaturation 94°C 30 sec 20 Hybridation 55°C 30 sec Elongation 72°C 30 sec Elongation 72°C 10 min 1 La vérification de la PCR se fait sur gel d'agarose 2% et 1% BET puis les produits de PCR sont stockés à -20°C. 1.1.4.2.2. Amplification du gène dsrB Le principe est le même que pour la partie V3 mais avec l'utilisation d'amorces sens inspirées de l'amorce DSRp2060F décrite par Geets J. et al. (J. Microbiol. Meth., (2005), 66, 194-205), dont l'amorce 5'-CAACATCGTCCACACCCAGGG-3' et d'amorces anti-sens dont l'amorce DSR4R 5'-6FAM-GTGTAGCAGTTACCGCA-3' décrite par Wagner M et al. (J. Bacteriol., (1998) 180, 2975ù 2982). Le produit de PCR obtenu est de plus grande taille, environ 320 paires de bases. Les cycles PCR utilisés sont présentés dans le tableau ci-dessous : Température Durée Nombre de cycles Dénaturation 94°C 2 min 1 Dénaturation 94°C 30 sec 25 Hybridation 55°C 30 sec Elongation 72°C 45 sec Elongation 72°C 10 min 1 1.1.5. Analyse des échantillons en SSCP L'outil SSCP utilisée est à 4 capillaires, permettant d'analyser des plaques 96 puits. Au fond de chaque puits est déposé lml de produits de PCR recouvert par 18,925�1 de formamide et 0,075111 de RoxGS 400. La plaque est ensuite mise à 95°C pour dénaturer les doubles brins d'ADN puis placée immédiatement dans la glace pour favoriser les repliements du simple brin sur lui-même. L'analyse se fait sur la nuit : 30 min sont nécessaires pour l'analyse d'un �run �, c'est-à-dire 4 échantillons. 1.1.6. Clonage et séquençage Pour le clonage de la région V3 du gène de l'ADNr 16S, les amorces utilisées sont w49 (5'-ACGGTCCAGACTCCTACGGG-3') et w31 (5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3') avec un mélange (en �L): H20 pure : 35, Tampon Red Taq : 5, dNTP 2,5mM : 4, amorce 100ng4 L : 2, Rad Taq : 1. Le programme PCR utilisé est le suivant : 2 mn à 94°C, 25 cycles comprenant 1 mn à 94°C, 1 mn à 61°C et 1 mn à 72°C puis après les cycles, 10 mn à 72°C.L La purification du produit de PCR obtenu se fait suivant les indications du kit de purification sur colonnes QIAQUICK (kit QIAQUICK). Pour le clonage proprement dit, le kit � Topo Ta Cloning Kit � est utilisé et les instructions de ce kit permettent la ligation du gène dans un plasmide chez E. coli, la transformation de ces bactéries, la vérification des transformants. La sélection des plasmides est réalisée par SSCP, par l'intermédiaire de co-migration entre le pic de référence et le pic formé par la séquence de la région V3 de l'ADNr 16S, introduite dans le plasmide. Avant d'envoyer les transformants au séquençage, deux plaques sont réalisées : une plaque avec un milieu LB kanamycine liquide qui est envoyée au séquençage et une plaque LB kanamycine solide qui est conservée à -80°C, en cas de problème lors du séquençage. 1.2. Résultats 1.2.1. Identification de la microflore, notamment sulfato-réductrice, par les techniques cultures ùdépendantes Les enrichissements aérobies et anaérobies ont été effectués pour les trois puits P1, P2 et P3. Ils ont montré des résultats positifs pour les conditions sulfato-réductrices en présence de lactate ainsi que pour les conditions fermentaires pour le puits Pl. Pour ces conditions fermentaires, plusieurs bactéries ont pu être isolées, et notamment une souche bactérienne appartenant au genre Thermoanaerobacter. Pour les enrichissements en présence de lactate plusieurs isolements bactériens ont été obtenus, et identifiés comme trois espèces de BSR appartenant au genre Desulfovibrio. 1.2.2. Estimation de la microflore présente par SSCP Les résultats sont donnés dans les figures 3 et 4 Les deux puits P1 et P2 analysés par SSCP ont montré un profil complexe. Le nombre de genre et d'espèce présents a pu être estimé grâce à ces profils à plusieurs milliers (Figure 3). Ces résultats originaux remettent en cause l'estimation généralement considérés faible des environnements pétroliers. Les résultats comparés pour les profils obtenus après LPS en milieux � pauvres � (figure 4) comme ceux obtenus après LPS en milieux � riches � (résultats non présentés) confirment en revanche que seule une faible biodiversité s'est révélée cultivable et ceci pour les trois puits étudiés. L'ensemble de ces résultats montrent : (i) d'une part, la découverte d'une forte biodiversité bactérienne en milieu pétrolier, à savoir un grand nombre de profils bactériens différents, identifiée à partir de la SSCP 16S selon l'invention ; les puits P1 et P2 (Figure 3) montrant une très grande diversité de pics, et (ii) d'autre part, l'existence d'une énorme différence de détection des microorganismes entre les échantillons natifs et après LPS, c'est-à-dire que la LPS permet, de manière complémentaire aux résultats obtenus sur échantillons natifs, l'amplification d'une population minoritaire correspondant à certains profils mineurs détectés dans l'échantillon natif, et ce quelque soit le puits (P1, P2 ou P3 testé, Figure 4). Ces résultats montrent également que certains pics ont été amplifiés par prolifération bactérienne, donc rendus visibles grâce au passage par la LPS, pics qui n'étaient pas ou très peu visibles avant LPS. 1.2.3. Identification des pics d'un profil SSCP Elle a été réalisée sur profil LPS �pauvre �. L'exemple du puits P3 est illustré dans la figure 5. Sur les 4 pics présents révélés par SSCP, trois ont pu être clonés. Après séquençage et identification, les positionnements phylogénétiques des trois clones ont été les suivants : Marinobacter sp YJ0216, Marinobacter BR-13 et Leuconostoc citreum KM20. 1.2.4. Identification de la microflore bactérienne sulfo-réductrice par SSCP Elle a été réalisée sur des échantillons d'eau de pétrole issus des puits P1 et P2. Les résultats sont donnés dans la figure 6. Chaque profil (P 1 et P2) est représenté par 5 pics dont trois sont identiques (3 comigrations) entre les deux puits. (Figure 6). Pour chacun des profils, 60% des bactéries détectées présentée ont donc un profil identique (flèches pleines de la figure 6). Ces résultats ont permis de confirmer la présence de ce type de bactéries sulfato- réductrices dans cet environnement pétrolier, ces résultats ayant par ailleurs été également obtenus par les techniques culturales. Ces résultats ont ainsi permis pour la première fois de détecter des BSR grâce à l'outil SSCP couplé au gène dsrB. De plus ces résultats ont été obtenus malgré une concentration très faible d'ADN initialement disponible, ce qui permet d'envisager l'utilisation de ce couplage dsrB-SSCP pour d'autres biotopes où la présence d'une fonction sulfito-reductase dissimilatrice est suspectée. REVENDICATIONS1. Procédé de détection et/ou de discrimination de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, lesdits matériaux étant en contact avec un échantillon 5 susceptible de contenir au moins un desdits microorganismes, ledit procédé comprenant : i. l'extraction du matériel génétique des microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon en contact avec un matériau susceptible d'être corrodé, ii. la détermination de l'éventuelle présence d'au moins un microorganisme responsable de la corrosion de matériaux dans ledit échantillon au moyen de l'amplification d'au moins un fragment du gène dsrB par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), iii. la discrimination des microorganismes présents dans l'échantillon, révélés à l'étape précédente, par la mise en oeuvre d'une technique de séparation des produits de réactions de PCR précédents en fonction de leur séquence nucléotidique utilisant le polymorphisme de conformation des simples brins SSCP, notamment par système capillaire (CE-SSCP). 20 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits microorganismes sont des procaryotes, préférentiellement des procaryotes exprimant l'enzyme sulfite réductase, notamment des bactéries sulfato-réductrices. 25 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit échantillon est en contact avec un contenant susceptible d'être corrodé. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que si l'échantillon contient une faible quantité de microorganismes responsables de la 30 corrosion de matériaux, ledit procédé comprend une étape complémentaire permettant d'augmenter la quantité de matériel génétique issu desdits microorganismes. 10 15 15 . Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que si l'échantillon contient une faible quantité de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, ledit procédé comprend une étape de stimulation de la prolifération desdits microorganismes afin d'augmenter la quantité desdits microorganismes. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite stimulation de la prolifération consiste en la levée de phase stationnaire desdits microorganismes, notamment par la mise en culture desdits microorganismes, dans un milieu contenant des nutriments nécessaires à la prolifération desdits microorganismes. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits nutriments sont fournis par le lactate et/ou l'acétate dans une gamme de concentration d'environ 0,3 à environ 30 g/l, ainsi que par la peptone et/ou l'extrait de levure, dans une gamme de concentration d'environ 0,1 à environ 20 g/l. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel, si l'échantillon est du pétrole ou de l'eau de pétrole, ledit milieu contenant des nutriments est éventuellement complémenté avec d'environ 0,1 % à environ 1 % de pétrole brut. 20 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que si l'échantillon contient une faible quantité de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux, ledit procédé comprend une étape de concentration du matériel génétique des microorganismes, notamment une étape de concentration 25 par filtration au moyen d'un filtre spécifique, notamment avec une taille de pores dans une gamme d'environ 0,05 à environ 0,25 �m, notamment de type polyéthersulfone. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que la 30 PCR est réalisée en utilisant : i. une amorce sens comprenant ou consistant en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 19 nucléotides consécutifs, aumoins 21 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO 1 suivante : 5'- GGN1 N2T N3 N4 NSCAACATCGT N6CAN7ACCCAGGG-3' où N1 représente un C ou un T, N2 représente un A ou un G, N3 représente un A, un C ou un T, N4 représente un A ou un T, et N5 représente un C ou un G, N6 et N7 représentent n'importe quel nucléotide (A, T, G ou C) ii. une amorce anti-sens comprenant ou consistant en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 16 nucléotides consécutifs, préférentiellement les 17 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID NO 2 suivante : iii. 5'-GTGTAGCAGTTACCGCA-3'. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'amorce sens comprend ou consiste en au moins 15 nucléotides consécutifs, préférentiellement au moins 19 nucléotides consécutifs, au moins 21 nucléotides consécutifs de l'une 20 quelconque des séquences suivantes : SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 50. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que a. l'amorce sens consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 3 à 25 SEQ ID NO 50, ou consiste en la séquence SEQ ID NO 51 suivante : 5'- CAACATCGTCCACACCCAGGG-3', et b. l'amorce anti-sens consiste en la séquence SEQ ID NO 2. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce 30 que ledit procédé comprend en outre une étape de référencement des profils SSCP afin de disposer d'une banque de données référençant les polymorphismes des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon. 10 15 14. Procédé de discrimination de microorganismes responsables de la corrosion de matériaux selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, lesdits matériaux étant corrodés et étant en contact avec un échantillon contenant au moins un desdits microorganismes, ledit procédé comprenant : i. l'extraction du matériel génétique des microorganismes contenus dans ledit échantillon en contact avec un matériau corrodé, ii. l'amplification d'au moins un fragment du gène dsrB par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), iii. la discrimination des microorganismes présents dans l'échantillon, révélés à l'étape précédente, par la mise en oeuvre d'une technique de séparation des produits de réactions de PCR précédents en fonction de leur séquence nucléotidique utilisant le polymorphisme de conformation des simples brins, notamment par système capillaire (CESSCP). 15 15. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détermination de la signature moléculaire d'un échantillon en contact avec un matériau susceptible d'être corrodé, ladite signature moléculaire correspondant à la somme des profils moléculaires 20 de chacun des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, lesdites profils moléculaires étant obtenus à partir du profil SSCP des différents microorganismes susceptibles d'être contenus dans ledit échantillon, ledit profil SSCP de chacun des différents microorganismes susceptibles d'être 25 contenus dans ledit échantillon étant référencé dans une banque de données. 10