Brevet FR2938332A1 — publié le 20100514

Test prédictif de la neutralisation de l'activité asparaginase L'invention est relative à un test permettant de diagnostiquer la capacité d'un patient à répondre à un traitement par l'enzyme thérapeutique asparaginase. Elle 5 est notamment relative à un test permettant de prédire l'efficacité d'un traitement à l'aide d'une asparaginase chez un patient donné. La L-asparaginase est un composant essentiel des protocoles de chimiothérapies utilisés depuis plus de 30 ans pour le traitement des leucémies aigües 10 lymphoblastiques. Son mécanisme d'action repose sur l'hydrolyse de l'acide aminé plasmatique asparagine, élément essentiel à la croissance tumorale des lymphoblastes. Contrairement aux cellules normales, les cellules lymphoblastiques cancéreuses n'ont pas la capacité de fabriquer elles-mêmes leur asparagine et sont dépendantes de sources extra-cellulaires. Le traitement par 15 l'asparaginase les prive de ce constituant essentiel et aboutit ainsi à leur mort. L'enzyme produite à partir de microorganismes est actuellement commercialisée sous trois formes : les deux premières sont dérivées des sources bactériennes Escherichia coli et Erwinia Chrysantemi, la troisième est obtenue par le couplage 20 par liaison covalente de polyethylene glycol à l'asparaginase native d'Escherichia coli (PEG-asparaginase). Malgré sa grande efficacité anti-leucémique, le traitement à l'asparaginase connaît un certain nombre de complications liés à l'immunogénicité de l'enzyme. Ces 25 complications peuvent se traduire par des manifestations cliniques ou par une inactivation silencieuse. Des réactions d'hypersensibilités dont la sévérité varie de la réaction allergique modérée au choc anaphylactique ont été rapportées par de nombreux auteurs 30 (Wang et al, Journal of Immunological Methods 239 (200) 75-83). Le développement de ce type de réactions, observé avec les 3 formes d'asparaginase, conduit généralement à l'arrêt du traitement par crainte d'une réaction plus sévère. L'asparaginase provoque par ailleurs l'apparition d'anticorps circulants qui possèdent des propriétés neutralisantes se traduisant par une augmentation de la clairance de l'enzyme par le système réticulo-endothélial et une réduction de son efficacité thérapeutique (Müller HJ, Boos J. Crit Rev Oncol/hematol 1998 ; (28):97-113). Ces anticorps ont été observés avec les trois formes de l'enzyme (E. Coli, Erwinia et PEG-asparaginase), l'objectif thérapeutique de l'asparaginase qui est d'atteindre une déplétion rapide et complète en asparagine plasmatique sur une durée prolongée est, dans ce cas de figure, non atteint. Cette inactivation de l'enzyme par des facteurs neutralisants, anticorps principalement, présents dans le sérum des patients ne s'accompagne pas de signes cliniques, elle est silencieuse pour le clinicien. Les inventeurs ont identifié qu'il existe de ce fait un besoin important pour les cliniciens de disposer d'un test rapide et facile à mettre en oeuvre permettant de prédire sa présence de facteurs de neutralisation de l'asparaginase, anticorps principalement, présents dans le sérum des patients. Ce test permettrait de modifier la dose d'enzyme administrée ou de substituer l'asparaginase utilisée à une autre forme d'asparaginase non ou moins sensible à ces facteurs neutralisants. Plusieurs possibilités ont été envisagées pour réaliser un suivi de l'activité asparaginase chez un patient : � Dosage de la L-asparagine plasmatique � Dosage de l'activité L-asparaginase plasmatique • Dosage des anticorps anti-asparaginase Le niveau d'asparagine plasmatique est le principal paramètre biochimique 30 représentatif de l'effet thérapeutique voulu avec l'asparaginase : une déplétion rapide, complète et durable en asparagine. Plusieurs méthodes ont par conséquent été décrites pour effectuer son dosage. Elles reposent pour la plupart sur l'association d'une étape de séparations des constituants de l'échantillon à doser par chromatographie liquide à haute performance et d'une détection fluorimétrique ou d'une quantification par spectrométrie de masse. Ces méthodes son fastidieuses, elles nécessitent un personnel qualifié, un coût et une durée de mise en oeuvre incompatibles avec un usage courant en clinique. Plus récemment, Verma et coll ont décrit une méthode de dosage rapide de l'asparagine reposant sur la co-immobilisation de la L-asparaginase et d'un indicateur coloré sur différents supports (membrane de nitrocellulose, gel silicone ou billes d'alginate de calcium). Lorsque l'un de ces supports est mis en présence d'un échantillon de sérum de patient, la L-asparaginase immobilisée va dégrader l'asparagine présente. La production d'ammonium consécutive à cette réaction d'hydrolyse va entrainer un changement de coloration de l'indicateur rouge de phénol. Si cette méthode semble répondre aux impératifs de simplicité et rapidité de mise en oeuvre, les auteurs ne fournissent pas de données permettant de la valider et des doutes subsistent quant à sa précision. Outre l'absence de méthodes validées, simples et rapides à mettre en oeuvre, le dosage de la L-asparagine plasmatique est limité par les considérations suivantes. In vivo, la dégradation de l'asparagine par l'action de l'asparaginase est contrebalancée par la production physiologique d'asparagine tandis qu'in vitro, l'effet catalytique de l'enzyme sur l'asparagine va perdurer. Conséquence directe, lors du prélèvement d'un échantillon de sérum d'un patient traité à l'asparaginase, la présence d'une quantité résiduelle d'enzyme va entrainer un biais dans la mesure du niveau d'asparagine qui sera � faussement � inférieur au niveau physiologique (Boos et al., European journal of cancer (1996) 32, 1544-1550). Cette interférence dans la procédure analytique entraîne une absence de corrélation avec l'activité asparaginase physiologique chez le patient testé. Plusieurs méthodes de dosage de la L-asparaginase plasmatique ont été décrites, la plus fréquemment utilisée repose sur l'incubation du sérum contenant la L-asparaginase dans un tampon contenant de la L-asparagine, puis après arrêt de la réaction, dosage de l'ammonium produit avec le réactif de Nessler. Orsonneau et Coll. ont proposé une variante automatisée, plus rapide et plus précise permettant le suivi des patients traités à la L-asparaginase (JL Orsonneau et coll. Ann Biol Clin 2004, 62 : 568-72). Cette méthode est basée sur l'action de la glutamate déshydrogénase qui utilise l'ammonium produit lors de l'hydrolyse de la L-asparagine par la L-asparaginase pour convertir l'a-cétoglutarate an acide glutamique. Glutamate déshydrogénase a-cétoglutarate + NH4+ + NADPH � L-glutamate + NADP + H20 Lors de cette réaction, la quantité de NADPH oxydé au cours de la réaction est équivalente à la quantité d'ammoniac contenue dans l'échantillon et peut être déterminée par mesure de la diminution de la densité optique. La cinétique d'apparition de l'ammonium peut ainsi être suivie et l'activité de la L-asparaginase calculée. Cette méthode, si elle permet un suivi de l'activité L-asparaginase chez un patient, ne donne aucune information prédictive quant à la neutralisation de cette enzyme par des facteurs présents dans le sérum. Wang et coll. ont mis au point un test ELISA standardisé permettant la quantification des IgG anti-asparaginase dans des échantillons de plasma de patients (B Wang et al., Journal of Immunological Methods 239 (2000) 75-83). Ce test a été utilisé dans le cadre d'une étude clinique pour mesurer la concentration d'anticorps anti-asparaginase présents dans le sérum de patients atteints de leucémie algue lymphoblastique, traités par la L-asparaginase et ayant ou n'ayant pas développé de réaction allergique (MH Woo et al., Leukemia (1998) 12, 1527- 1533). Les auteurs ont pu montrer que la concentration médiane en anticorps antiasparaginase était plus importante chez les patients développant une réaction allergique et ce que la mesure soit effectuée avant ou après que cette réaction n'est lieu. Ils concluent sur l'intérêt en pratique clinique d'utiliser un tel test pour prédire le développement futur d'une réaction allergique. On peut néanmoins relativiser la valeur prédictive d'un tel test, en effet les intervalles dans lesquels varient la concentration en anticorps anti-asparaginase mesurée avant le développement d'une réaction allergique se recouvrent, ils sont respectivement de : e 0,001 à 0,375 unité de DO pour les patients ayant développés une réaction allergique ultérieurement ; � 0,004 à 0,064 unité de DO pour les patients n'ayant pas développé de réaction allergique ultérieure De plus, la mesure de la concentration en anticorps ne donne aucune information quant à l'activité pharmacologique de l'asparaginase chez le patient et son éventuelle neutralisation par des facteurs présents dans le sérum. La présente invention a donc pour objectif de proposer une nouvelle approche permettant de remédier aux inconvénients de l'art antérieur et de connaître à un moment donné, chez un patient, la présence de facteurs susceptibles de neutraliser l'activité asparaginase. La méthode doit avoir l'avantage d'être totalement prédictive, c'est-à-dire qu'elle ne doit pas nécessiter une étape d'administration de l'enzyme au patient à diagnostiquer. Elle doit refléter la capacité du patient à répondre à toute forme d'asparaginase. Ainsi, le patient peut être un patient devant être traité pour la première fois à l'aide de l'enzyme, ou un patient ayant été traité ou sous traitement à l'asparaginase. Il est possible de tester la présence des facteurs susceptibles de neutraliser l'activité de l'enzyme utilisée pour le traitement précédent ou en cours, ce qui permet de savoir si le traitement avec cette enzyme peut être repris ou poursuivi, éventuellement aménagé. Il est également possible de détecter la présence des facteurs susceptibles de neutraliser l'activité de l'enzyme envisagée pour le traitement de ce patient, ce qui permet de valider ou d'écarter l'emploi de telle ou telle enzyme. Cette connaissance permettra d'orienter le praticien d'une manière beaucoup plus pertinente que les méthodes de l'art antérieur sur la conduite du traitement (posologie, régime de dose) ou sur le choix de l'enzyme ou de sa forme d'administration. Soit les facteurs neutralisants sont inexistants ou présents en quantité suffisamment faible pour qu'un traitement à l'aide de l'enzyme testée soit possible, éventuellement avec un renforcement de la posologie ou du régime de dose. Soit les facteurs neutralisants sont présents à un niveau trop élevé pour qu'un tel traitement soit poursuivi ou engagé, et alors l'invention permet de tester et/ou préconiser une solution alternative à l'aide d'une autre forme de l'enzyme ou d'une forme moins ou pas sensible aux facteurs de neutralisation, telle que de l'enzyme incluse dans un biovecteur. L'invention a ainsi pour objectif de proposer un procédé in vitro de détermination de la présence de facteurs neutralisant l'activité asparaginase dans un échantillon sanguin provenant d'un patient. Elle a aussi pour objectif de proposer une méthode de détermination in vitro de la capacité d'un patient à répondre (i) positivement à un traitement par une asparaginase ou (ii) à n'y pas répondre ou (iii) seulement de manière incomplète. 15 Elle a aussi pour objectif de proposer une méthode de pronostic de l'efficacité d'un traitement à l'aide d'une asparaginase ou du fait que cette enzyme ne fera pas l'objet d'emblée d'une inactivation substantielle de son activité par des facteurs neutralisants. 20 L'invention a donc pour objet un procédé de mesure in vitro de la présence de facteurs neutralisants de l'activité asparaginase dans un échantillon de sang, plasma, sérum ou milieu dérivé susceptible de contenir de tels facteurs neutralisants, issu d'un patient, comprenant le mélange de cet échantillon avec une asparaginase, l'incubation de ce mélange, puis la mesure de l'activité 25 résiduelle de cette asparaginase dans le mélange, ce qui traduit et permet de déterminer et de quantifier la présence de facteurs de neutralisation dans l'échantillon et donc in vivo chez le patient. Le procédé permet de diagnostiquer qualitativement et quantitativement la présence de facteurs de neutralisation de l'asparaginase chez un patient. 30 L'invention a encore pour objet une méthode permettant de prédire si une asparaginase donnée peut être active chez un patient donné. Cette méthode comprend la détermination in vitro de la capacité d'un patient à répondre à un10 traitement par une asparaginase, dans laquelle on applique à un échantillon de sang, plasma, sérum ou milieu dérivé susceptible de contenir des facteurs de neutralisation de l'activité asparaginase, issu dudit patient, le procédé comprenant le mélange de cet échantillon avec de cette asparaginase, l'incubation de ce mélange, puis la mesure de l'activité enzymatique résiduelle de cette asparaginase dans le mélange, qui traduit et permet de déterminer et de quantifier la présence de facteurs de neutralisation dans l'échantillon et donc in vivo chez le patient, susceptibles de neutraliser l'activité asparaginase, et donc la capacité du patient à répondre à un traitement par cette enzyme. L'invention donne donc accès à une méthode permettant de tester l'efficacité d'une asparaginase par patient. En fonction de l'existence ou de l'absence de facteurs neutralisants, et éventuellement de leur niveau, le procédé et la méthode permettent de déterminer si le patient est susceptible de (i) répondre positivement à un traitement par l'asparaginase ou (ii) à n'y pas répondre ou (iii) seulement de manière incomplète. L'échantillon peut provenir d'un patient sous traitement par une asparaginase ou d'un patient ayant été traité par une asparaginase. L'échantillon peut aussi provenir d'un patient jamais traité par une asparaginase ou par cette asparaginase. L'asparaginase employée dans le test peut être celle qui est ou a été utilisée dans 25 le traitement subi par le patient. Elle peut aussi être une enzyme d'origine différente que l'on souhaite tester chez le patient pour prédire son efficacité. Il est aussi possible de tester différentes enzymes simultanément ou successivement pour déterminer le traitement le plus 30 adapté au patient.20 L'invention fournit donc une méthode de pronostic de l'efficacité d'un traitement à l'asparaginase ou du fait que cette enzyme ne fera pas l'objet d'emblée d'une inactivation substantielle par des facteurs neutralisants. L'invention s'applique à toutes les formes d'asparaginase, par exemple la L-asparaginase. Sans y être limité, on peut citer les enzymes natives provenant de toute source bactérienne, par exemple la L-asparaginase produite par E. Coli, l'enzyme produite par En,vinia, les enzymes mutées ou encore les enzymes modifiées, par exemple les enzymes péguilées (PEG-asparaginase). L'enzyme peut aussi être d'origine naturelle, synthétique ou recombinante. Elle peut être libre ou comprise dans un biovecteur, par exemple dans des érythrocytes. La mesure de l'activité résiduelle de l'asparaginase dans le mélange peut être réalisée par addition audit mélange d'asparagine, de préférence de L-asparagine et d'un système réactif apte à mettre en évidence la dégradation enzymatique de l'asparagine par l'asparaginase active. Suivant une configuration avantageuse, le procédé comprend les étapes suivantes : (a) incubation de l'échantillon avec une quantité connue d'asparaginase ; (b) incubation du mélange précédent avec une quantité connue d'asparagine, de préférence en quantité saturante par rapport à la quantité d'asparaginase ; (c) incubation du mélange précédent avec le système réactif apte à permettre de doser l'activité enzymatique résiduelle; (d) évaluation qualitative ou quantitative de la perte ou non de l'activité enzymatique, laquelle est en corrélation avec la présence ou la teneur de l'échantillon en facteurs de neutralisation de l'activité asparaginase. L'incubation à l'étape (a) dure notamment de 1 à 60 min. La teneur en enzyme est 30 notamment de 0,1 à 5 Ul/ml. Il peut être utile et avantageux d'inactiver ou d'éliminer toute trace d'enzyme active dans l'échantillon à tester. Ainsi, selon une caractéristique, avant l'étape (a), une étape (ao) d'élimination ou d'inactivation de l'asparaginase éventuellement présente dans l'échantillon est réalisée. En variante, on peut, avant l'étape (a), réaliser une étape (ao) de mesure de la teneur basale de l'échantillon en asparaginase, ce qui permet soit de vérifier que cette activité est nulle ou négligeable, soit de soustraire cette activité de celle mesurée par le procédé. En variante, connaissant la demi-vie de l'enzyme administrée au patient avant le test, on peut attendre le temps nécessaire entre la dernière administration et le prélèvement sanguin. Suivant une modalité particulière, l'étape (a) est suivie d'une étape (al) d'élimination des complexes immuns anticorps-asparaginase. Cette élimination peut se faire facilement par centrifugation, de sorte que le mélange impliqué à l'étape (b) est le surnageant. De préférence, on centrifuge à 3000-25000g pendant de 1 à 30 min à la vitesse de consigne. Suivant une caractéristique, le système réactif est sensible à l'apparition de l'ion ammonium issu de la dégradation enzymatique de l'asparagine par l'asparaginase. Ainsi, la détermination ou la mesure de la présence de facteurs neutralisants peut être obtenue en faisant intervenir une réaction consommant l'ion ammonium de manière quantitative. Cette consommation de l'ion ammonium peut être suivie, avantageusement de manière quantitative, par la mesure de la diminution de la densité optique (absorbance) du mélange. On fait notamment intervenir les réactions suivantes : (1) asparaginase + asparagine û* acide aspartique + NH4+ (2) a-cétoglutarate + NH4+ + NADPH + glutamate-déshydrogénase (catalyseur) û> glutamate + NADP+ + H2O. L'incubation avec l'asparagine est de préférence réalisée pendant de 2 à 60 min avec une quantité saturante d'asparagine (par rapport à la quantité d'enzyme introduite), notamment de 10 à 50 mg/ml. L'incubation avec le système réactif dure notamment de 3 à 20 min. L'invention procure donc une méthode permettant de déterminer si le patient est susceptible de (i) répondre positivement à un traitement par une asparaginase ou (ii) à n'y pas répondre ou (iii) seulement de manière incomplète. Elle permet donc de confirmer ou infirmer la possibilité de traiter avec l'enzyme testée, ou de conduire à la décision de modifier le régime de dose ou de traiter le patient à l'aide d'une asparaginase différente, notamment d'une forme encapsulée dans un biovecteur. L'invention a donc aussi pour objet une méthode de traitement d'une pathologie sensible à l'asparaginase chez un patient, comprenant : (A) mise en oeuvre de la méthode de détermination in vitro de la capacité d'un patient à répondre à un traitement par une forme donnée d'asparaginase (notamment forme libre ou modifiée), dans laquelle on applique à un échantillon de sang, plasma, sérum ou milieu dérivé susceptible de contenir des facteurs de neutralisation de l'asparaginase, issu dudit patient, le procédé comprenant le mélange de cet échantillon avec ladite forme d'asparaginase, l'incubation de ce mélange, puis la mesure de l'activité résiduelle de l'asparaginase dans le mélange et la détermination de ladite activité neutralisante et de la capacité du patient à répondre (i) positivement au traitement par cette forme d'asparaginase ou (ii) à n'y pas répondre ou (iii) seulement de manière incomplète, et (B) traitement de la pathologie à l'aide de cette asparaginase dans le cas (i) ou à 25 l'aide d'une autre forme d'asparaginase dans les autres cas. Suivant un mode de réalisation préféré, l'autre forme d'asparaginase est de l'asparaginase encapsulée ou incluse dans un biovecteur, notamment encapsulée dans des érythrocytes. Il s'agit notamment d'érythrocytes produits par lyse- 30 rescellement, par exemple selon l'enseignement de la demande de brevet français n°0408667. Parmi les pathologies susceptibles de bénéficier de cette méthode figurent avant tout les leucémies, par exemple les leucémies aigües lymphoblastiques. On peut également citer, sans que cela soit limitatif, les tumeurs solides (WO2007/103290), notamment cancer du pancréas et cancer de l'ovaire. L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples illustrant l'invention de manière non limitative. 10 Exemples, Exemple 1: Immunisation d'un lapin avec de la L-Asparaginase Quelques millilitres de sérum sont prélevés au lapin avant la première 15 immunisation de façon à avoir un sérum pré immun. Puis 500 pg de LAsparaginase (Kidrolase�, OPI-EUSA Limonest France). sont injectés 4 fois au lapin. Des sera sont prélevés entre la première et la deuxième immunisation et entre la deuxième et la troisième immunisation. Enfin, après la dernière immunisation, le sérum total est récupéré et stocké à -20°C. Le sérum final est 20 caractérisé pour sa concentration en protéines totales (méthode du Biuret) et sa concentration en immunoglobulines totales. Exemple 2: Purification des IqG totales de lapin 25 La purification des IgG totales de lapin à partir du sérum final, contenant des IgG anti-Asparaginase, est réalisée avec le Kit pure 1A de chez Sigma (# PUREIA). Brièvement, 2 ml de sérum sont clarifiés par centrifugation ou filtration sur un filtre 0,45 pm avant la purification des IgG. Puis 4 ml de � binding buffer � sont ajoutés aux 2 ml de sérum clarifié. Le mélange est passé, puis élué de la colonne en 30 suivant le protocole préconisé par Sigma. Afin de pouvoir les injecter chez l'animal, les IgG totales sont centrifugées dans une colonne de filtration dont le seuil est 10 000 Dalton afin de remplacer le tampon d'élution par du PBS.5 Exemple 3a: Mesure de l'inhibition d'un sérum intermédiaire sur l'activité enzymatique de la L-Asparaginase (dosage du mélange) Le dosage de la L-Asparaginase a été réalisé selon le protocole publié dans : Orsonneau et al, "Dosage automatique en cinétique de l'activité L-Asparaginase plasmatique en suivi thérapeutique des leucémies aiguës lymphoblastiques", Ann Biot Clin, 62 : 568-572. Un sérum intermédiaire (obtenu entre la première et la deuxième immunisation) a été utilisé en premier lieu pour mettre au point la mesure de l'inhibition de l'activité enzymatique. Une concentration de 2 Ul/ml de L-Asparaginase est utilisée. L'enzyme est pré incubée 15 minutes à 37°C avec plusieurs dilutions de sérum, puis l'activité enzymatique est mesurée dans le mélange. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 : Tableau 1 N° tube L-Asparaginase dilution L-Asparaginase /° activité ajoutée sérum dans mélange % (UI / ml) (UI / ml) résiduelle 1 2 - 1,96 100 2 2 1,11 0, 72 36,43 3 2 1/2 0,78 39,63 4 2 1 /4 0, 85 43, 04 5 2 1/16 1,18 60,16 6 2 1/32 1,29 65,91 7 2 1/128 1, 64 83, 74 Le tableau 1 compile les mesures d'activités enzymatiques résiduelles de la L- Asparaginase des mélanges (tubes 2 à 7). Le sérum de lapin inhibe l'activité enzymatique de la L-Asparaginase. Plus la dilution du sérum est élevée, plus l'inhibition est faible. Le tube 1 constitue un contrôle montrant que l'incubation de l'enzyme seule à 37°C pendant 15 minutes n'affecte pas son activité enzymatique. Exemple 3b: Mesure de l'inhibition d'un sérum intermédiaire sur l'activité 5 enzymatique de la L-Asparaginase (dosage d'un surnageant2 Un sérum intermédiaire (obtenu entre la première et la deuxième immunisation) a été utilisé. 10 Afin de mimer la phagocytose des complexes antigène-anticorps par le système réticuloendothélial, le mélange L-Asparaginase / sérum est incubé 15 min à 37°C, puis centrifugé 10 minutes à 17500g à 4°C afin d'éliminer les complexes immuns. L'activité enzymatique est dosée dans le surnageant. Le dosage est présenté dans le tableau 2 : 15 Tableau 2 N° Tube L-Asparaginase dilution L-Asparaginase Activité ajoutée sérum dans résiduelle dans (UI/ml) surnageant surnageant (%) (UI/mI) 1 2 - 1,91 95,63 2 2 1,11 0,21 10,39 3 2 1 /2 0,14 6, 77 4 2 1/4 0,05 2,72 2 1/16 0,03 1,53 6 2 1/32 0,02 0,98 7 2 1/128 0,02 1,00 contrôle 2 préimmun 1,82 90,81 Un contrôle, remplaçant le sérum par le sérum pré immun, a été ajouté de façon à 20 contrôler la spécificité de l'interaction entre la L-Asparaginase et les anticorps anti-Asparaginase présents dans le sérum. Ce dernier permet de montrer que plus de 90% de l'enzyme n'est pas impliquée dans une interaction avec des anticorps non spécifiques. 20 Les anticorps présents dans le sérum ont interagit avec la totalité de l'enzyme pour les dilutions 1/4, 1/16, 1/32 et 1/1281ème Exemple 4: Mesure de l'inhibition des IqG totales de lapin sur l'activité enzymatique de la L-Asparaginase La même expérience que celle présentée en exemple 3b a été réalisée avec les IgG totales de lapin et une concentration de 1,25 Ul/ml de L-Asparaginase. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 : Tableau 3 N° tube L-Asparaginase Dilution L-Asparaginase Activité ajoutée des IgG dans surnageant résiduelle dans (UI/ml) (Ul/ml) surnageant (%) contrôle 1,25 - 1,19 94,99 1 1,25 - 1,26 100,00 2 - 1 /8 0,02 1,38 3 1,25 1/8 0,02 1,52 4 1,25 1/16 0,01 0,40 5 1,25 1/32 0,01 0,62 6 1,25 1/64 0,01 0,98 Les IgG totales de lapin, contenant des IgG anti-Asparaginase, interagissent avec 15 la L-Asparaginase dès la dilution 1/64'è' et provoquent une inhibition totale de l'activité enzymatique (99,02% d'enzyme précipitée). Exemple 5 : Inactivation par les IqG totales de lapin de la L-Asparaginase libre injectée à la souris Une expérience a été mise en place chez la souris (16 souris) pour étudier l'inhibition de la L-Asparaginase par les IgG anti-Asparaginase in vivo. Les conditions expérimentales ont été les suivantes : dose de 100 Ul/kg de L-Asparaginase ce qui correspond à 1,25 Ul/ml en circulation chez une souris de 25 g Injection de 7,5 pg des IgG totales de lapin. L'injection des IgG ou de PBS est réalisée 20 minutes avant l'injection de LAsparaginase libre ou encapsulée en globules rouges (Asp-GR) de souris. Puis 6 heures après cette dernière injection, les souris sont sacrifiées et le sang est collecté. L'activité L-Asparaginase est alors dosée dans le plasma et dans les GR. Le tableau 4 résume les valeurs obtenues : Tableau 4 Activité L-Asparaginase (UI/ml) IgG PBS Asp-GR Globules rouges 0,798 � 0,126 0,879 � 0,146 Plasma 0,013 � 0,002 0,126 � 0,029 L-Asparaginase Globules rouges 0,132 � 0,019 0,098 � 0,013 libre Plasma 0,002 � 0,002 0,417 � 0,103 Le dosage de la L-Asparaginase dans les GR de souris ayant reçu les Asp-GR détecte 0,798 et 0,879 UI/ml en présence d'IgG ou de PBS respectivement. Donc les IgG, présentes dans le plasma, n'ont pas eu d'effet inhibiteur sur l'enzyme encapsulée. Dans le plasma de ces mêmes souris, la L-Asparaginase libre injectée avec les Asp-GR (il reste en effet un peu d'enzyme libre en dehors des GR, de l'ordre de 10% de la dose) est inhibée en présence des IgG (0,013 UI / ml) et reste active en présence de PBS (0,126 UI/ml). Lorsque la L-Asparaginase libre a été injectée, les IgG ont inhibé son activité (0,002 UI/ml) alors que l'injection du PBS est restée sans effet sur l'activité de l'enzyme (0,417 UI/ml). Etant donnée la demi-vie de la L-Asparaginase libre (10 heures), la mesure de 0,417 UI/ml de L-Asparaginase plasmatique correspond à l'activité résiduelle de l'enzyme libre 6 heures après son injection. La concentration plasmatique de la L-asparagine a été mesurée dans 14 des plasmas des souris de l'étude (2 non exploitable car volume trop faible). Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 L-asparagine plasmatique (pmol/litre) IgG PBS Asp-GR 15 Exemple 6: Mesure de l'inhibition des IqG totales de lapin sur l'activité enzymatique de la PEG-Asparaginase Les IgG totales de lapin, contenant des IgG anti-Asparaginase, ont été testés sur la PEG-Asparaginase (Sigma # A5336). La même expérience que celle présentée 20 en exemple 4 a été réalisée avec la PEG-Asparaginase. Les résultats sont présentés dans le tableau 6. Tableau 6 25 N° Tube PEG-Aspa Dilution PEG-Aspa Activité ajoutée des IgG Dosée résiduelle (UI/mI) (Ul/ml) dans surnageant (0/0) 1 0,40 - 0,360 90,00 2 0,79 1/8 0,023 2,97 3 0,79 1/16 0,026 3,32 4 0,79 1/32 0,023 2,90 0,79 1/64 0,029 3,67 Les IgG de lapin contenant des IgG anti-Asparaginase ont interagit avec la PEGAsparaginase. L'activité décelée dans le surnageant est inférieure à 4% de 5 l'activité initiale mélangée avec les IgG. Exemple 7 : Protocole de test Ce protocole s'applique à un patient que l'on envisage de traiter avec une certaine asparaginase. On prélève chez ce patient un peu de sang que l'on traite de manière classique pour obtenir un échantillon de sérum. On procède ensuite de la manière suivante : (ao) éventuellement inactivation ou élimination de l'asparaginase éventuellement présente dans l'échantillon de sérum, ou mesure de l'activité enzymatique résiduelle (a) incubation pendant de 1 à 60 min de l'échantillon avec 0,1 à 5 Ul/ml d'asparaginase ; (al) éventuellement élimination, de préférence par centrifugation à 3000- 25000g pendant de 1 à 30 min à la vitesse de consigne, des complexes immuns ; (b) incubation pendant de 2 à 60 min du mélange de (a) ou du surnageant de (al) avec une quantité saturante en asparagine, notamment de 10 à 50 mg/ml ; (c) incubation, notamment pendant de 3 à 20 min du mélange précédent avec le système réactif (a-cétoglutarate, NADPH, glutamate déshydrogénase) apte à mettre en évidence l'activité enzymatique résiduelle ; (d) évaluation qualitative ou quantitative de la perte ou non de l'activité enzymatique, laquelle est en corrélation avec la présence ou la teneur de l'échantillon en facteurs de neutralisation de l'asparaginase. Il est possible de déterminer des niveaux ou seuils de niveaux d'activité enzymatique résiduelle en fonction de l'inclusion ou non de l'étape (al). 10 Chez un patient déjà traité, le procédé montrant une présence forte de facteurs de neutralisation, on préconise et on applique un traitement de substitution à l'aide d'une autre forme d'asparaginase. Notamment, lorsque la forme libre ou modifiée est susceptible d'être inhibée, on préconise l'enzyme encapsulée dans des 15 érythrocytes. Le même protocole est applicable pour tout simplement tester l'efficacité potentielle d'une asparaginase chez le patient. REVENDICATIONS1. Procédé de mesure in vitro de la présence de facteurs neutralisants de l'activité asparaginase dans un échantillon de sang, plasma, sérum ou milieu dérivé susceptible de contenir de tels facteurs neutralisants, issu d'un patient, comprenant le mélange de cet échantillon avec une asparaginase, l'incubation de ce mélange, puis la mesure de l'activité résiduelle de cette asparaginase dans le mélange, et la détermination ou la quantification de la présence de ces facteurs de neutralisation. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon provient d'un patient sous traitement par une asparaginase ou d'un patient ayant été traité par une asparaginase. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la mesure de l'activité résiduelle de l'asparaginase dans le mélange est réalisée par addition audit mélange d'asparagine et d'un système réactif apte à doser l'activité enzymatique résiduelle. 4. Procédé selon la revendication 3, comprenant les étapes suivantes : (a) incubation de l'échantillon avec une quantité connue d'asparaginase ; (b) incubation du mélange précédent avec une quantité connue d'asparagine ; (c) incubation du mélange précédent avec le système réactif apte à doser l'activité enzymatique résiduelle ; (d) évaluation qualitative ou quantitative de la perte ou non de l'activité enzymatique, laquelle est corrélée à la présence ou à la teneur de l'échantillon en facteurs de neutralisation de cette asparaginase. 5. Procédé selon la revendication 4, comprenant, avant l'étape (a), une étape (ao) d'élimination ou d'inactivation de l'asparaginase éventuellement présente dans l'échantillon. 6. Procédé selon la revendication 4, comprenant, avant l'étape (a), une étape (ao) de mesure de la teneur basale de l'échantillon en asparaginase. 7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, dans lequel le système réactif est sensible à l'apparition de l'ion ammonium issu de la dégradation enzymatique de l'asparagine par l'asparaginase. 8. Procédé selon la revendication 7, qui fait intervenir une réaction consommant l'ion ammonium de manière quantitative. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la consommation quantitative de l'ion ammonium est mesurée par la mesure de la diminution de la densité optique du mélange. 15 10. Procédé selon l'une des revendications 3 à 9, qui fait intervenir les réactions suivantes : (1) asparaginase + asparagine ù> acide aspartique + NH4+ (2) a-cétoglutarate + NH4+ + NADPH + glutamate-déshydrogénase (catalyseur) ù+ glutamate + NADP+ + H2O. 20 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, employé pour prédire si l'asparaginase peut être active chez le patient. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 comprenant la détermination de la capacité du patient à répondre (i) positivement au traitement par cette forme d'asparaginase ou (ii) à n'y pas répondre ou (iii) seulement de manière incomplète.10