Brevet FR2947271A1 — publié le 20101231

NOUVEAUX COMPOSES ANTICANCEREUX La présente invention se rapporte à des conjugués de cryptophycines, les compositions les contenant et leur application thérapeutique, notamment comme anticancéreux. L'invention se rapporte aussi au procédé de préparation de ces composés ainsi qu'aux dérivés de cryptophycines eux-mêmes. [Domaine technique] Les cryptophycines sont des métabolites secondaires appartenant à la classe des macrocycles depsipeptidiques produits par les cyanobactéries du genre Nostoc. Leur nom se réfère au fait qu'elles sont hautement cytotoxiques vis-à-vis des levures du genre cryptococcus. Le premier représentant de cette classe de molécules, la cryptophycine-1 (C-1), a été isolé en 1990 de cyanobacterium Nostoc sp (ATCC 53789) (voir EiI ler S., et al., Synthesis 2006, 22, 3747-3789). La structure, la formule générale ainsi que la numérotation des atomes de carbone de ces composés, telle que décrite dans WO 98/08505, sont rappelées ci-dessous : Les cryptophycines Cl et C-52, qui se caractérisent par une fonction époxyde représentée ci-dessous, ont des propriétés anticancéreuses. Des essais cliniques de phase II dans le cancer du poumon ont été conduits avec C-52 (LY 355073) : voir Edelman M.J., et al., Lung Cancer 2003, 39, 197-199 ; Sessa C., et al., Eur.J.Cancer 2002, 38, 2388-96. La cryptophycine C-55, prodrogue de C-52, se caractérise quant à elle par une fonction chlorhydrine en lieu et place de la fonction époxyde (Bionpally R.R., et al., Cancer Chemother Pharmaco12003, 52, 25-33). C-55 s'est avérée très active mais n'est pas stable en solution. Des dérivés de type glycinate de chlorhydrine tel que le composé C-55 Gly ont également été décrits pour gagner en stabilité (Liang J., et al., Investigational New Drugs 2005, 23, 213-224). ci ci ci Cl OMe O" 7 N" ~O OMe H H C55 C55-gly [Problème technique] La chimie des conjugués est connue depuis de nombreuses années et a été appliquée à plusieurs familles de cytotoxiques comme par exemple les maytansinoïdes (WO 04103272), les taxanes (WO 06061258), les tomaymycines (WO 09016516), les leptomycines (WO 07144709), le CC-1065 et ses analogues (WO 2007102069); voir aussi à propos des conjugués, Monneret C., et al., Bulletin du Cancer. 2000, 87(11), 829-38 ; Ricart A.D., et al., Nature Clinicat Practice Oncology 2007, 4, 245-255. Cependant, elle n'a pas été appliquée aux dérivés de cryptophycine. Le problème technique qu'entend résoudre la présente invention est de proposer de nouveaux conjugués à base de dérivés de cryptophycine, ainsi que de nouveaux dérivés de cryptophycine aptes à être conjugués. [Art antérieur] EP 0830136 et WO 98/08505 décrivent des dérivés de cryptophycines mais ne décrivent pas de conjugués de cryptophycines. WO 98/08505 décrit des dérivés de cryptophycines de formule o R14 a~ X N. R6 3 R11 I R30 R R I° R R8 H (A) : (A) dans laquelle Ar peut représenter un groupe Ar' de R56 y~J R55 formule : R54 dans laquelle R54 représente H, un groupe (C1-C6)alkyle, (Ç1_ 20 C6)alkvIe(R57 R57 R57"j, aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, S03H, S02R58, NR59R60, NHOR61, NHOR61', CN, NO2, OR62, CH2OR6z, CH2NR96R961, / \ / ùR"' C6)alkyleORloo, , SR63 ; R55 et R56 représentent H, un groupe (C1-C6)alkyle, C(R57.357'•1357j, aryle, phényle, hétérocycloalkyle, un atome d'halogène, COOR57, PO3H, SO3H, S02R58, NR59R66, NHOR61i NHCHR61', CN, NO2, OR82, CH2OR62', CH,000R95, CH,NR96R96', 25 Li-C6 (Ç1-C6)alkyleNR591t6o, WO 98/08505 décrit notamment les composés suivants : Ar (ex.34) NHBoc (composé 24, schéma 4) o (composé 33, schéma 5) ,,ojL o 10 (ex.42) (ex.43) (ex.47) (ex.48) (ex.74) qui se caractérisent pas le groupe terminal ûNHC(=O)Ot-Bu. US 2007/0213511 décrit des immunoconjugués de calichéamicine. Parmi ceux-ci, mention est faite du MYLOTARG� (ou CMA-676) qui est un immunoconjugué de calichéamicine utilisé dans le traitement de l'AML (anti-CD33-calichéamicine). Voir aussi à propos des conjugués : WO 2006/042240. Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46(14), 2985-3007 et Al-awar R.S., et al., Mol. Cancer Ther. 2004, 3(9), 1061-1067 décrivent des dérivés de cryptophycine, ainsi que leurs évaluations in vivo. WO 08010101 décrit un anticorps monoclonal anti-EphA2 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. WO 08047242 décrit un anticorps monoclonal anti-CD38 ainsi que les conjugués correspondants comprenant une ou plusieurs molécules d'un composé cytotoxique attachée(s) à l'anticorps monoclonal. Le composé cytotoxique peut être choisi parmi les maytansinoïdes, les taxanes, les tomaymycines, les leptomycines, le CC-1065 et ses analogues. WO 2009/126934 décrit des anticorps anti-CD70 et leurs conjugués avec des composés cytotoxiques ; la cryptophycine est citée parmi les cytotoxiques. [Définitions] On entend par : • conjugué un agent de ciblage cellulaire auquel est attaché de façon covalente au moins une molécule d'un composé cytotoxique ; • agent de ciblage cellulaire (ou � cell binding agent � en anglais) : une molécule ayant une affinité pour une cible biologique : il peut s'agir par exemple d'un ligand, d'une protéine, d'un anticorps, plus particulièrement monoclonal, d'un fragment de protéine ou d'anticorps, d'un peptide, d'un oligonucléotide, d'un oligosaccharide. L'agent de ciblage a pour fonction de diriger le composé biologiquement actif comme un cytotoxique vers la cible biologique ; • cible biologique : un antigène (ou groupe d'antigènes) localisé préférentiellement à la surface des cellules cancéreuses ou cellules stromales associées à cette tumeur; ces antigènes pouvant être par exemple, un récepteur de facteur de croissance, un produit (ex.77) d'oncogène ou de gène � suppresseur de tumeur � muté, une molécule liée à l'angiogénèse, une molécule d'adhésion ; • linker : un ensemble d'atomes permettant d'attacher de façon covalente un composé cytotoxique à l'agent de ciblage ; • groupe alkyle : un groupe hydrocarboné aliphatique saturé obtenu en enlevant un atome d'hydrogène d'un alcane. Le groupe alkyle peut être linéaire ou ramifié. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, iso-butyle, tertio-butyle, pentyle, 2,2-diméthylpropyle, hexyle ; • groupe cycloalkyle : un groupe alkyle cyclique comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone engagés dans la structure cyclique. A titre d'exemples, on peut citer les groupes cyclopropyle, cyclobutyle, cyclopentyle, cyclohexyle ; • groupe hétérocycloalkyle : un groupe cycloalkyle comprenant au moins un hétéroatome (O, S, N) engagé dans le cycle et relié aux atomes de carbone formant le cycle ; • groupe alcoxy : un groupe -0-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ; • groupe alcanoyloxy : un groupe -0-CO-alkyle, où le groupe alkyle est tel que défini ci-dessus ; • groupe alkylène : un groupe divalent saturé de formule brute -CnH2n , obtenu en enlevant deux atomes d'hydrogène d'un alcane. A titre d'exemples, on peut citer les groupes méthylène (-CH2-), éthylène (-CH2CH2-), propylène (-CH2CH2CH2-), butylène (-CH2CH2CH2CH2-), x hexylène (-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-) ou les groupes ramifiés suivants , )k ; • De préférence, le groupe alkylène est de formule -(CH2)n-, n représente un nombre entier ; • dans les plages de valeurs, les bornes sont incluses (par ex. une plage du type � n allant de 1 à 6 � ou bien � compris entre 1 et 6 � inclut les bornes 1 et 6). Abréviations utilisées AcOEt : acétate d'éthyle ; ALK : groupe (C1-C12)alkylène, plus particulièrement (C1-C6)alkylène, plus particulièrement de la forme ù(CH2)n- n étant un entier de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; CCM : chromatographie sur couche mince (TLC en Anglais) ; Rf : facteur de rétention ; DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ène ; DCC : N,N'-dicyclohexylcarbodiimide ; DCM : dichlorométhane ; DEAD : diéthylazodicarboxylate ; DIC: N,N'-diisopropylcarbodiimide ; DIPEA : N,N-diisopropyléthylamine ; DMA : diméthylacétamide ; DMAP : 4-diméthylaminopyridine ; DME : diméthoxyéthane ; DMF : diméthylformamide ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; EEDQ : 2-éthoxy-1-éthoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline ; EDCI : N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide ; EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique ; Fmoc : fluorénylméthoxycarbonyl ; HOBt : 1- hydroxybenzotriazole ; HEPES : acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique ; mCPBA : acide m-chloroperbenzoïque ; NHS : N-hydroxysuccinimide ; NMP : N-méthylpyrrolidinone ; PR : pression réduite ; SEC : chromatographie d'exclusion stérique ; TA : température ambiante ; TBDMS : tert-butyldiméthylsilyl ; TEA : triéthylamine ; TIPS : triisopropylsilyl ; THF : tétrahydrofurane ; tR : temps de rétention. [Brève description de l'invention] L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) : H/` O R7 Re Ris R8 (I) dans laquelle : ^ RI représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ûOH, un groupe acyle dérivé 10 d'un acide aminé AA ou un groupe (CI-C4)alcanoyloxy ; ou bien RI et R2 forment ensemble un motif époxyde ; ^ AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ; ^ R3 représente un groupe (C,-C6)alkyle ; ^ R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre 15 C13etC14; ^ R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R6 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (CI-C6)alkyle ; ^ R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ; 20 ^ R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C,-C4)alkyle ; l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRI, de préférence en para. 25 Le dérivé de cryptophycine peut être l'un des suivants : CI OMe cl OMe ci OMe cl et OMe OMe cl et OMe OMe L'agent de ciblage peut être un ligand, une protéine, un anticorps, plus particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide. L'invention est aussi relative à un dérivé de cryptophycine de formule (Il) : Ri _ R3 R5 L HO R, R5 (II) dans laquelle L représente un linker en position ortho (o), méta (m) ou para (p), de préférence para, du noyau phényle porteur du motif GCR1 choisi parmi : -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t(CR17=CR16)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR16)(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rfuryl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 -G' X (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; Ris 10 R5 -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16), Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl--(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)U Q GCR1; -G' X (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; ou -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR16)(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rfuryl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t--triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q CCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 formules dans lesquelles : ^ G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ; ^ G" représente un groupe -(CH2)n- ; ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ; ^ Y représente un groupe -0-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -NR12COO-, ou -S(0)e, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés àG"; ^ q représente un entier pouvant valoir 0, 1 ou 2 ; ^ Y' représente un groupe -0-, -OCO, -OCOO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -NR12COO-, -S(0)q-, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ; ^ R12, R'1 Y, R13, R14, R15, R16, R17 et R78 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ t, u et y représentent des entiers pouvant aller chacun de 0 à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ; ^ dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1, si y vaut 0 et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir 0 ; ^ Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C10)alkylène ou un groupe (OCH2CH2)i, i représentant un entier allant de 1 à 10 ; ^ GCR1 représente -SZa ou -C(=O)-ZbRb ; ou bien L est choisi parmi : V^ ZaS-ALK,N^ N,(C1_12)r, N.(CH2)ä 512 N. RbZb-CO-ALK-SS-ALrNy0�CH2),,+ (~ ~ 0 ZaS-ALK 512 ZaS-ALK'N 512 ZaS-ALK-N�CH2) RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'0y (CH2), O O RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i.0)(CH2)ä R12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'0y N�CH2),/ o 512 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'N"(CH2)ä- 10 10 512 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i' ( O�C Il H2)n O RbZbCO-ALK-(OCH2CH2)i.N (''N, (CH2)n L,/N�CH2)n RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'SùC)'(CH2)n/ R12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i N. Ô (CH2)" N=N 512 RbZb-CO-ALK-N" N�CH2)n+ R bZb-CO-ALK-(OCH2C H2)i OCH2CH 512 5'12 ZaS-ALK-CHZ N~~ON~(CH2)" 512 ZaS-(CH2CH20)i-CH2CH(N�CH2)n RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)kNl(CH2)n ? T R12 RbZb-CO-ALK,N^ L,,,N.(CH2)n RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i^N 512 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'S�CH2)n+ RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i O. (CH2)n+ O N=N ~N RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'OCH2CH2 (CH2)n RbZb-00-ALK-(OCH2CH2)i'Ov RbZb-CO-ALK" 512 5'12 Zas-ALK NON. (CH2)n o S (CH2)n (N= RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'Ov vN (CH2)n+ j~=N 512 N=N RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)iù N, (CH2)n RbZb-CO-ALK" N�CH2)n formules dans lesquelles : s ^ ùC-)(cH2)" représente l'un des 7 groupes suivants : S-ALK R12 l i 2 L.N-(CH2)n_ ùS-ALK'N`(CH2)n 0 S-ALK �CH2)n R112 *S-ALK'N 512 S-ALK-CHZ N--O 5'12 N, (CH2)n N. 15 20 R S-ALK N7~~ i T N,2 O i (CH2)n O ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ ALK représente un groupe (C1-C12)alkylène ; ^ R72 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; ^ 1 représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ; 512 S-(CH2CH2O)i-CH2CHN�CH2)n J /Dù(CH2)n ou bien L est un linker de formule (IV) : RbZb-CO-ALK (AA)w (IV) dans laquelle : ^ (AA)W représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ; ^ w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ D représente l'un des motifs suivants : (D1) (D2) 15 20 25 R20 R21 O (D3) pour lesquels : R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ; T rattaché à (CH2)n représente NR12 ou O ; V1 représente O, S, NR12 ; ^ V2 représente CR22 ou N ; ^ V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N ; ^ Za représente H ou le groupe -SRa, Ra représentant un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; ^ Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle. Plus particulièrement, n vaut 1. D2 peut être L peut être choisi parmi : V2 V4 -NR1\ /V5 V2 H -N 12 N O Y0 512 ZaS RbZb\ . /O.(^O^äOUO4 0 l IIO RbZb0~~0]~ O 0RbZb O.k--^ 0 O 512 RbZb O f i~NU04- i O O C II RbZb R12 RbZb j 512 b N RbZb 0 N RbZb 0RbZb 0 I tt RbZb 0 0i~0~0 vt 0 O ZbRb" N=N O~N RbZb O O N=N O' .~ N j RbZb Où~ N=Ni R12 N N_ S N N~R1 RbZb RbZb N i N RbZb\ ^ /O0 HZNyNH 0 5'12 512 N- 512 N~ 512 ZaS.. 0 ù N~ RbZb 1 ZaS 5'12 512 ZaS Za représente plus particulièrement H ou -S(C1-C6)alkyle, notamment ûSMe. ZbRb représente 0 ùOùN plus particulièrement -O(C1-C6)alkyle, -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2, ou SO3M _G_ M=H ou cation GI ou le groupe dans lequel GI représente au moins un ùOùN . GI peut être û groupe électroinductif, ou encore dans lequel ûC(=O)ZbRb représente NO2 ou ûHal, notamment ûF. Plus particulièrement, L est choisi parmi : MISS N` S u 512 S' vN~F HS" vN 0 l 1 HS MeSS H Nô ~O~O,Z O ô N~- 5112 00 512 NUO 3 III O 1 2 00 ~O N_N 2\ùN N N=N O O où gO~~N H S 3 N ù. HS H O O HS~_0 R12 3 H2NUNH 0 R12 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. Plus particulièrement, le dérivé de cryptophycine est l'un des suivants : L et et OMe OMe CI OMe L O HO .--[5,.---,.. L L L'invention est aussi relative à un procédé de préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine, dénoté conjugué, consistant à : (i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution d'un dérivé de cryptophycine ; (ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés. La température peut être comprise entre 20 et 40 °C et/ou la durée de la réaction varie entre 1 et 15 24 h. Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. L'invention est aussi relative au conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé décrit plus haut. PPPIus particulièrement, le DAR déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre UV est 20 supérieur à 2, plus particulièrement compris entre 2 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7, le DAR étant calculé par l'équation DAR = col ca. Plus particulièrement, X1= 280 nm et 12= 246 nm. L'invention est aussi relative à une solution de conjugué susceptible d'être obtenue par le 25 procédé décrit plus haut. L'invention est aussi relative à l'utilisation d'un dérivé de cryptophycine de formule (Il) ou (III) pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine. Le dérivé de cryptophycine de formule (III) : R, Re OO O HN K R11 R9T ~.~ io O N R6 R7 RB H (III) est tel que G représente un groupe -CH=CH2 ou -(CH2),Y, se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1, de préférence en para, n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant ûOH ; -Cl ; -N3; -NH2; -COOH ; -NR12-CH2-C:-=CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant ; -OC(=O)-O-(4-nitrophényle). Plus particulièrement, l'utilisation concerne un dérivé de cryptophycine choisi parmi l'un des suivants : G HO HS HS , ^N^ ,A\ l 1N 'S.Sy'N^ HS15 H O HS H ONO I H O O H HS 10 L'invention est aussi relative à un dérivé de cryptophycine de formule (III) R+ R3 Rs G I I o~o Rn RaTO~ N~ K~o x n R8 R~ RB H dans laquelle G représente un groupe -(CH2),Y, se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1, de préférence en para, n étant un entier allant de 1 à 6 et Y désignant -N3; -NR12-CH2-CECH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C,-C6)alkyle ; -OMs ou -OC(=O)-O-(4-nitrophényle). Enfin, l'agent de ciblage, le dérivé de cryptophycine, le conjugué ou la solution de conjugué peuvent être utilisés en tant qu'anticancéreux. [Description détaillée de l'invention] L'invention est relative à un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) : 0 (I) ° O"')( N- -' O R8 H R7 RB R� dans laquelle : ^ RI représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ùOH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ; ou bien RI et R2 forment ensemble un motif époxyde ; ^ AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ; ^ R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13etC14; ^ R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C,-C4)alcoxy, un atome d'halogène ; 5 ^ R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (CIC4)alkyle l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRI. positions ortho (o), méta (m) ou para( p) : R~ R3 R5 Rz Ris R5 o RI représente un atome d'halogène, plus particulièrement Cl. R3 représente un groupe (C,-C6)alkyle, plus particulièrement Me. R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou 10 un groupe (C,-C6)alkyle ; plus particulièrement ils représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe Me. R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (CIC6)alkyle ; plus particulièrement R8 représente H et R9 représente isobutyle. R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène, plus particulièrement, il y a deux substituants : 3-Cl et 4-méthoxy. R11 représente au 15 moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1-C4)alkyle ; plus particulièrement H. Plus particulièrement, on pourra choisir l'un des substituants RI à R11 parmi ceux décrits dans les exemples. Chaque substituant RI à R11 pourra aussi adopter une des configurations spatiale (par 20 ex. Rou S ou bien Z ou E) telle que décrite dans les exemples. AA représente un acide aminé naturel ou non naturel. Il peut s'agir d'un acide aminé a, R ou y. On peut citer notamment les acides aminés suivants : alanine (Ala), 8-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), 25 cystéïne (Cys), glutamine (GIn), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), sérine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide y-aminobutyrique, acide a,a-diméthyl y-aminobutyrique, acide 8,8-diméthyl y-aminobutyrique, ornithine (Orn), citrulline (Cit) ainsi que les formes protégées desdits acides aminés (par ex. par acetyl, formyl, 30 tosyl, nitro). De préférence, il s'agit d'un acide aminé naturel. Plus particulièrement, il s'agit de la glycine. RI et R2 peuvent aussi former ensemble un motif époxyde. L'attachement entre le dérivé de cryptophycine et l'agent de ciblage est réalisé par l'intermédiaire d'un linker L positionné en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1; ainsi, le dérivé de cryptophycine apte à la conjugaison a pour formule (II) : R$ ù R5 RRz L R� 0 L'attachement au niveau de l'agent de ciblage se situe à l'autre extrémité du linker L au niveau d'un groupe réactif présent sur l'agent de ciblage. Ainsi, L comprend au moins un groupe chimique réactif (GCR1) vis-à-vis d'un groupe chimique réactif (GCR2) présent sur l'agent de ciblage. La réaction entre GCR1 et GCR2 assure l'attachement du composé de formule (II) sur l'agent de ciblage par formation d'une liaison covalente. Ainsi, le dérivé de cryptophycine de formule (II) est apte à être conjugué à un agent de ciblage. Les dérivés de cryptophycine de la présente invention, y compris ceux exemplifiés, peuvent exister à l'état de bases ou de sels d'addition à des acides, notamment des acides pharmaceutiquement acceptables. A titre d'exemples de GCR1, on peut citer le groupe réactif : (i) ûSZa pour lequel Za représente H ou le groupe -SRa ou bien (ii) le groupe réactif -C(=O)-ZbRb pour lequel Zb représente une liaison simple, -0- ou -NH-, Ra représentant un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C,)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle et Rb représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle. Plus particulièrement, -SZa peut représenter ûSH ou ûSS(C1-C6)alkyle, notamment -SSMe. Plus particulièrement, -ZbRb peut représenter -OH, -OCH3, -OCH2CH=CH2, 0 ou SO3M ù° M=H ou cation 0 ùOùN I ùOùN ou le GI groupe `z dans lequel GI représente au moins un groupe électroinductif tel que ûNO2 ou û Hal, notamment ûF. II peut s'agir par exemple des groupes suivants : ûV N°, ou Un autre type de groupe ûC(=O)ZbRb est le suivant : " . Les groupes réactifs ûSH et 0 présentent une bonne réactivité. Plus particulièrement, GCR1 pourra être choisi parmi l'un de ceux décrits dans les exemples. A titre d'exemple de GCR2, on peut citer les groupes s-amino des lysines portés par les chaînes latérales des résidus lysine qui sont présents à la surface d'un anticorps, les groupes saccharides de la région charnière ou les thiols de cystéines par réduction de liaisons disulfures intra-chaine (Garnett M.C., et al., Advanced Drug Delivery Reviews 2001, 53, 171-216). Plus récemment d'autres approches ont été considérées comme l'introduction de cystéines par mutation (Junutula J.R., et al., Nature Biotechno/ogy 2008, 26, 925-932; WO 09026274) ou l'introduction d'acides aminés non-naturels permettant d'autres types de chimie (de Graaf A.J., et al., Bioconjugate Chem. 2009, Publication Date (Web): February 3, 2009 (Review); DOI: 10.1021/bc800294a ; WO 2006/069246 et selon Chin J.W., et al., JACS 2002, 124, 9026-9027 (technologie ReCode�)). Ces modes d'attachements utilisés avec les anticorps sont applicables à l'ensemble des agents de ciblage connus en fonction de leur structure. II est également possible de modifier chimiquement l'agent de ciblage de façon à introduire de nouveaux groupes chimiques réactifs GCR2. Ainsi, il est bien connu de l'homme du métier comment modifier un anticorps à l'aide d'un agent de modification (voir notamment WO 2005/077090 page 14). La modification permet d'améliorer la réaction de conjugaison et de permettre de pouvoir utiliser une plus grande variété de groupes GCR1. L'agent de modification o RS.,ALK peut être un ester activé NHS de formule o dans laquelle R représente un groupe (CI-C6)alkyle, aryle, hétéroaryle, (C3-C7)cycloalkyle, (C3-C7)hétérocycloalkyle et ALK représente un groupe (C1-C6)alkylène ; par exemple, on peut utiliser le N-succinimidyl pyridyldithiopropionate (SPDP) ou le N-succinimidyl pyridyldithiobutyrate (SPDB) de façon à introduire des groupes réactifs GCR2 dithiopyridyl (voir Bourdon M.A., et al., Biochem. J. 1978, 173, 723-737 ; US 5208020) lesquels peuvent ensuite réagir avec un groupe chimique réactif GCR1 de type ûSH présent sur le linker du dérivé de cryptophycine afin de former une nouvelle liaison ûS-S-. Le groupe N-hydroxysuccinimide réagit préférentiellement sur les groupes amino présents sur l'anticorps de façon à former des liaisons amides. Un autre exemple d'agent de modification est décrit dans WO 2004/016801 de R3 R R2 R1 formule : ou un analogue pegylé de formule : dans lesquelles R, RI, R2, R3 représentent H ou un groupe (C1-C6)alkyle, X et Y représentent -H, -CONR4R5, -NO2, R4 et R5 représentant H ou un groupe (C,-C6)alkyle, Z représente -SO3 M+ ou H ou bien un groupe ammonium quaternaire et m désigne un entier allant de 0 à 2000. Un autre exemple d'agent de modification est le succinimidyl-4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), un composé similaire décrit dans EP 0306943 ou un sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate). Le dérivé de cryptophycine pourra être, en série C-52 et C-1, l'un des suivants : 0,0 O HN~ ,,•• `~ Cl O H~O OMe cl OMe CI OMe CI OMe CI OHIO OMe Gly=glycinate HN~;,•• � Cl OMe Gly=glycinate H Cl OMe CI ou un motif équivalent décrit dans l'un des exemples. Plus particulièrement, L est en position para du motif CRI. Procédé de préparation des dérivés de crvptophvcine Les composés de formule (II) sont préparés selon le Schéma 1 à partir d'un dérivé de 20 cryptophycine de formule (III) et d'un précurseur de linker (PL) :15 G représente le groupe -CH=CH2 ou -(CH2)äY avec n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant ùOH, -CI, -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant tel que par exemple le groupe mésylate (OMs), ou Y représente un groupe réactif tel que -N3, -NH2, -COOH, -NR12-CH2-C=CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. Le précurseur de linker PL a pour fonction d'introduire le linker L au niveau du dérivé de cryptophycine après réaction entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL. HsùO'G peut aussi représenter le groupe (cHZ)" (c'est-à-dire que Y représente le groupe HSùQ choisi parmi l'un des 7 groupes suivants (R12 et R'12 représentent H ou un groupe (C1-C6)alkyle) : 512 HS-ALKHS-ALK.N 512 HS-ALK•N (CH2)n+ N-(CH2)n HS-ALK'N�CH2)n N�CH2)n* 512 5'12 512 5'12 512 N,HS-ALKu _ N N HS-ALK-CH2 ~ (CH2)n IO (CH2)n HS-(CH2CH2O)i-CH2CH2 �CH2)n Sur le Schéma 1, plusieurs étapes et/ou réactions peuvent être nécessaires pour aboutir au dérivé de cryptophycine (II) à partir du dérivé de cryptophycine (III). Ainsi, par exemple, dans le cas où Za=H, on préfère introduire un linker L pour lequel Za=-S(C1-C6)alkyle utilisant le 20 précurseur de linker correspondant, puis à réduire la fonction disulfure ùSS(C1-C6)alkyle en fonction thiol ùSH. On peut utiliser pour cela par exemple la tris(2-carboxyéthyl)phosphine : voir à ce propos Burns J.A., et al., J.Org.Chem. 1991, 56(8), 2648-2650. Cette transformation ùSS(C1-C6)alkyle + -SH peut s'appliquer par exemple aux linkers L1.4 et L21.23 du Tableau I. 25 De même, dans le cas où ZbRb= , on peut introduire un linker L pour lequel ZbRb=-O- allyle utilisant le précurseur de linker correspondant, puis déprotéger la fonction ùCOOH et 0 -0ùNJ introduire 0 . La déprotection peut être réalisée par un traitement avec un catalyseur au palladium, par exemple Pd(PPh3)4 en présence d'une amine � scavenger �, par exemple la morpholine ; l'activation peut être réalisée avec le carbonate de N-N'-disuccinimidyle en présence (II) R11 R9T ONO R8 R7 R6 H (III) Schéma 1 o PL + G15 d'une base, par exemple la DIPEA ou avec le NHS en présence d'un agent de couplage, par exemple le DCC. Cette transformation d'un groupe ZbRb à un autre groupe ZbRb (par ex. -0-allyle Q. O-N + ° ) peut s'appliquer pour obtenir d'autres groupes ZbRb, notamment ceux décrits plus haut. Dans le cas où RI représente un atome d'halogène et R2 un groupe acyle, on préfère préparer d'abord un composé de formule (II) pour lequel R2 représente un groupe ûOH (une fois le linker introduit), et introduire ensuite le groupe acyle à l'aide du composé acylant correspondant. 10 Exemples de réactions entre le groupe G et une fonction chimique présente sur PL • substitution nucléophile entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction amine ûNH-(un sel d'amine peut également convenir) et G=-(CH2)nCl ou -(CH2)nOMs (voir par ex. Tableau I, PL14, Pt-7a, PL8..10 PL21_23) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base, comme par exemple la TEA ou la DIPEA. Voir ex.1, 15 composé 7 ou ex.5, composé 16 ; • acylation entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction halogénure de carbamoyle et G=-(CH2)nOH (voir par ex. Tableau I, PL5) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'une base amine comme, par exemple la TEA. 20 Selon une variante, on peut également faire réagir un précurseur de linker PL porteur d'une fonction amine ûNH- et G=-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) obtenu à partir de G=-(CH2)nOH et de p-nitrophénylchloroformate (activation de l'alcool sous forme de carbonate) selon le schéma ci-dessous (R12= H ou (C1-C6)alkyle) : -NHR12 + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) - crypto-(CH2)nO-C(=O)-NR12-25 • l'activation d'un alcool sous forme de carbonate peut aussi être utilisée pour faire réagir un précurseur de linker porteur d'une fonction ûOH et G=-(CH2)nNH2 ou û(CH2)nOH pour obtenir respectivement une fonction carbamate (-O-C(=O)-NH-) ou carbonate (-O-C(=O)-O-) selon les schémas respectifs suivants : 30 -O-C(=O)-O-(4-nitrophényle) + crypto-(CH2)nNH2 -~ crypto-(CH2)nNH-C(=O)-O--OH + crypto-(CH2)nO-C(=O)-O-(4-nitrophényle) -~ crypto-(CH2)nO-C(=O)-0-. (voir par ex. Tableau I, PL6a_6b, PL24-25) • estérification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide ûCOOH et G=-(CH2)nOH (voir par ex. Tableau I, PL14b) : cette réaction peut être conduite dans un solvant 35 polaire aprotique en présence d'une base amine comme, par exemple la DMAP et d'un agent de couplage, par exemple le DCC ;5 • amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction acide ûCOOH et G=-(CH2),NH2 (voir par ex. Tableau I, PL14a) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; • amidification entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction ûNH2 et G=- (CH2),000H (voir par ex. Tableau I, PL7C) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence d'un agent de couplage, par exemple l'EDCI ou le HOBt ; • cycloaddition 1,3-dipolaire (appelée aussi chimie � click �) entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction alcyne terminale et G=-(CH2),N3 ou bien entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction azide et G=-(CH2),NR12-CH2C=CH (voir par ex. Tableau I, PL15.18) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire en présence de Cu(l) comme catalyseur (voir à ce propos, sur la cycloaddition de Huisgen : Rostovtsev V.V., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599 ; Tornoe C.W., et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057-3064) ; • métathèse entre un précurseur de linker PL porteur d'une fonction éthylénique terminale et G=-CH=CH2 (voir Tableau I, PL19, PL20) : cette réaction peut être conduite dans un solvant polaire aprotique en présence du catalyseur de Grubbs de 2ème génération (CAS N°246047-72-3, voir à ce propos, Poeylaut-Palena A.A., et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 2024-2027. A propos du Iinker L Le linker L pourra être choisi parmi l'un des suivants : -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t(CR17=CR16)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR1s)(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinylméthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1;-G' X (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1; G' X (CR13R14)rtriazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rfuryl--(CR15R16)u Q GCR1, -G' X (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)rtriazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; ou =G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; - G" Y (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridrnyl-(CR15R18)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)r-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-furyl--(CR15R16)u Q GCR1, -G" Y (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipérazinyl-(CR15R16)u Q CCR1 ; G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rtriazolyl-(CR15R16)u Q GCR1;; G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ; G" représente un groupe -(CH2)n- ; n représente un entier allant de 1 à 6 ; X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ; Y représente un groupe -0-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, - NR12C00- ou -S(0)q, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés à G" ; Y' représente un groupe -0-, -OCO-, -OCOO-, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, NR12COO-, -S(0)e, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ; R12, R'12, R13, R14, R15 et R76, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; t, u et y représentent des nombres entiers pouvant aller de 0 (cas du groupe absent) à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ; q représente un entier pouvant valoir 0, 1 ou 2 ; Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C10)alkylène ou un groupe (OCH2CH2);, i étant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. i peut prendre chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y-Y'-(CR15R16)u Q GCR1, si y vaut 0 (pas de groupe PEG) et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir 0. Plus particulièrement, on exclut les linkers comprenant le motif terminal ùNR12-C(=O)-O- (Y'=NR12 ; u=0 ; Q=liaison simple et GCRI=-C(=O)ZbRD). Certains de ces linkers ont été décrits dans les demandes WO 07085930 et WO 09016516. y représente un entier allant de 0 à 20, plus particulièrement de 1 à 20, plus particulièrement encore de 1 à 10, de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5. y peut prendre 10 chacune des valeurs de ces plages, notamment valoir 2, 3, 4 ou 5. Le linker L pourra être choisi parmi l'un de ceux de formule (IV) : O RbZb CO-ALK /Dù(CH2)n AA)w dans laquelle : 15 • (AA), représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ; • w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; • n représente un entier allant de 1 à 6 ; • D représente l'un des motifs suivants : V2 Rio ùNR1 1 V pour lesquels : R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; R19, R20, R21, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome 25 d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ; T rattaché à (CH2)n représente NR12 ou O ; V7 représente O, S, NR12 ; V2 représente CR22 ou N ; V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N. 30 Un exemple de D2 est le suivant : VZ V4 ùNR12 C\ ' V2 20 (Dl) (D2) (D3) AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel, plus particulièrement choisi parmi : alanine (Ala), 6-alanine, acide 2-amino-2-cyclohexylacétique, acide 2-amino-2-phénylacétique, arginine (Arg), acide aspartique (Asp), cystéïne (Cys), glutamine (GIn), acide glutamique (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), méthionine (Met), phénylalanine (Phe), proline (Pro), sérine (Ser), thréonine (Thr), tryptophane (Trp), tyrosine (Tyr), valine (Val), acide y-aminobutyrique, acide a,a-diméthyl y-aminobutyrique, acide 3, f3-diméthyl yaminobutyrique, ornithine (Orn), citrulline (Cit). dans laquelle R23 représente un résidu d'un des acides aminés décrits ci-dessus. Des exemples d'enchaînements sont les suivants : Gly-Gly, Phe-Lys, Val-Lys, Val-Cit, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lsy, Ala-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Ala-Phe, Gly-Gly-Gly, Gly-Ala-Phe, Gly-Val-Cit, Gly-Phe-Leu-Cit, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala- 15 Leu-Ala-Leu. Les précurseurs de linkers sont ceux comprenant les motifs ûOH correspondants : WO 2005/082023 (voir notamment pages 61-64) décrit comment obtenir certains précurseurs de 20 linkers. Les préparations des précurseurs de linkers PL25 et PL26 décrites ci-après peuvent également être utilisées pour obtenir d'autres précurseurs de linkers similaires comprenant un autre enchaînement (AA)W. Le linker L pourra être choisi également parmi l'un de ceux décrits dans le Tableau I ou dans les 25 exemples Dans toutes les formules de linkers, NR12 ou NR'12 représente plus particulièrement NH ou NMe. Préparation des composés de formule (111) 30 cas où G=- C( !j OH ou ûCH=CH2 V2 V4 VZ V4 ùN� V2 ùNR1jV2 V; OH V OH R20 R21 R20 R21 27 L'enchaînement (AA), a pour formule : H O NALK 1 R23 R3 RRRRRR OO NaI09 0 0 HN~ä,• ,o H2OITHF R (II) PPh3+, Br-Rä (iii) \ Bull, THF TIPSO TBDMSO Pä TBAF THF TBAF THF mCPBA, DCM P3 = composé de fomule (III) avec G=-CH2CH2OH HO R3i~ K10 R,0 R7 RoH 0 P]= composé de fomule (III) avec G=-CH2OH HO 0 0 HN Ro R,o ,o R Rio R] R8 r ii P3= composé de fomule (III) avec G=-CH=CH2 Schéma 1 P, est préparé selon l'enseignement des demandes WO 98/08505, WO 00/23429 ou WO 00/34252 ainsi que des publications suivantes Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 ; Salamonczyk G.M., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6893-6900 (incorporées ici par référence). Dans les pages 158-159 de � The isolation, characterization and development of a novel class of potent antimitotic macrocyclic depsipeptides : the cryptophycins �, Chap.9, in � Anticancer agents from natural products �, Taylor&Francis, CRC press book, isbn=0-8493-1863-7 sont donnés les schémas de synthèse permettant de préparer les différents fragments (A, B, C et D) de cryptophycine et d'aboutir à Pi. Rej R., et al., J. Org. Chem. 1996, 61, 6289-6295 décrit sur les schémas 1-6 la voie d'accès à l'un des dérivés de cryptophycine de la Figure 1 mais ces schémas peuvent s'appliquer à la préparation de PI en utilisant les réactifs de départ idoines. PI permet de préparer d'autres dérivés de cryptophycine à l'aide des étapes détaillées ci-après : 15 Etape (i) : ouverture du cycle époxyde de PI en milieu acide permettant d'obtenir la fonction diol. On peut utiliser par exemple l'acide perchlorique concentré ; Etape (ii) : coupure oxydante du diol à l'aide par exemple du periodate de sodium ; Etape (iii) : réaction de Wittig utilisant un halogénure de phosphonium adéquat, par exemple un bromure, et une base forte telle que par exemple BuLi. 20 Le bromure de 4-(triisopropylsiloxyméthyl)benzyltriphénylphosphonium est obtenu partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N° 934667-38-6) dont la préparation à partir de 1,4-benzènediméthanol (CAS N° 589-29-7, produit commercial) est décrite par Potter R.G., et al., Organic Letters 2007, 9(7), 1187-1190. Les composés pour lesquels R11 représente 25 un groupe (C1-C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir du diol correspondant qui est soit un produit commercial soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir du 1,4-benzènediméthanol. A partir du 1-(bromométhyl)-4-(triisopropylsiloxyméthyl)-benzène (CAS N°135408-73-0), dont la préparation est décrite sur le schéma 4a de EP 0496548 ou en page 83 de l'article de Nevill C.R. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 1(1), 83-86, on peut obtenir le bromure de phosphonium correspondant. Les composés pour lesquels R11 représente un groupe (C,-C4)alkyle sont obtenus de façon semblable à partir d'un composé équivalent au composé 1 décrit en page 83 de l'article de Nevill C.R. Jr., et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1991, 1(1), 83-86 qui est soit un produit commercial, soit est obtenu par C-alkylation Friedel-Crafts à partir de l'acide p-tolylacétique. Le bromure de triphényl(p-vinylbenzyl)phosphonium (CAS N°118766-51-1) est obtenu à partir du dérivé bromé correspondant (voir Drefahl G., et al., Chem.Ber. 1961, 94(8), 2002-2010) dont la préparation à partir de l'alcool 4-vinylbenzylique (CAS N°1074-61-9, produit commercial) est décrite dans l'article de Shimomura O., et al.,Tetrahedron 2005, 61, 12160-12167. A partir de P7 ou de P8 qui sont des composés de formule (III) pour lesquels G=-(CH2),OH, on peut obtenir d'autres composés de formule (III) ayant d'autres groupes G. cas où G=-(CH21äCI ou û(CH2)äN3 MsCI, TEA CI ° DCM O P. Pä mCPBA, DCM (PhO)2P(=O)N, HO DBU, THF Schéma 2 MsCI, TEA C 1U DCM A partir du groupe G=-CH2OH, on peut obtenir les groupes G = ûCH2CI ou ûCH2N3 : - l'introduction de ûCl peut être réalisée en présence de chlorure de méthanesulfonyle : voir ex.1 composé 2 ; - l'azidation peut être réalisée en présence du diphénylphosphorazide (PhO)2P(=O)N3 et d'une base, par exemple le DBU. Le Schéma 2 décrit ces réactions pour le cas n=1 mais il peut 30 s'appliquer également pour n>1. cas où G=-(CH21 ÇQQH HO -' HO R,0 2Me-2-butene THF/H20 NaCIO2, NaH2PO4 , ,. O Dess-Martin n. n MN _ NaCiO2, NaH2POe H ,o Pyr, DCM HO HO Dess-Martin Pyr, DCM A partir du groupe G=-(CH2)20H, on peut obtenir le groupe G =ûCH2OOOH par une oxydation. Le Schéma 3 décrit une double oxydation : lère oxydation à l'aide du réactif de Dess-Martin (voir "Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis"; Paquette L. A., Ed.; Wiley: Chichester, UK, 1995, Vol. 7, 4982-4987 ou Boeckman R.K. Jr., et al., J.J. "The Dess-Martin Periodinane" Org. Synth. 2004, 10, 696-702) suivie d'une 2ème oxydation de type Pinnick en présence de 2-méthyl-2-butène (Pinnick H.W., Tetrahedron 1981, 37, 2091-2096). Le Schéma 3 décrit ces réactions pour le cas d'un composé de départ pour lequel n=2 mais il peut s'appliquer également pour n>2. Schéma 4 A partir du groupe G=-CH2OH, on peut obtenir le groupe G =ûCH2NH2 à l'aide d'une réaction de Mitsonobu utilisant la triphénylphosphine et le DEAD. A ce propos, voir : Mitsunobu O., Synthesis 1981, 1-28 ; Hughes D.L., Org. Reactions 1992, 42, 335-656 ; Hughes D.L., Org. Prep. 1996, 28, 127-164. Le Schéma 4 décrit ces réactions pour le cas n=1 mais il peut s'appliquer également pour n>1. Cas où G=-(CHIä-NR 2-CH2C==ûCH A partir du groupe G=-(CH2),Cl, on peut obtenir le groupe G=-(CH2) NR12-CH2-C=CH à l'aide d'une substitution nucléophile utilisant le composé de formule NHR12-CH2-CECH (R12=H : propargylamine ; R12=(C1-C6)alkyle : préparé selon Mock W.L., et al., J.Org. Chem. 1989, 54 (22), 5302-8). Plus particulièrement, dans le cas de la C-52, on pourra utiliser les composés suivants dont les préparations sont décrites dans Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007 ou dans WO 9808505 : Cas où G=- C( H3 R, K x ^ N O R10 DEAD, PPh2 RR+o O N O R10 EtOH RIO X NO R, ;H THF R, R,H R. R, R,H P, P. P,, HO o G=-CH2OH : composé 31b du schéma 5 û ~ o~o o v/ HN4,, c) G=-CH2CH2OH : composé 49 du schéma 9 o OMe G=-CH2OOOH : composé 51 du schéma 9 ou ex.81 de WO 9808505 G=-C(=O)H : ex.80 de WO 9808505 D'autre part, à partir du composé 31b pour lequel G=-CH2OH, il est possible d'obtenir les composés pour lesquels G=-CH2CI ou ùCH2N3 : • G=-CH2CI : voir exemple 1, composé 2 ; • G=-CH2N3: la conversion de -CH2OH en -CH2N3 peut être réalisée dans un solvant polaire aprotique en présence de diphénylphosphorazide et d'une base comme le DBU. L'enseignement de J.Med.Chem. pourrait s'appliquer à d'autres dérivés de cryptophycine comprenant d'autres substituants R6-R9. Préparation des précurseurs de linker PL 10 PL pourra être l'un des suivants : CIO Za-S-ALK" 'N'--''I PLI ''"préparé selon le schéma ci-dessous : H IN"'` N'boc ALK-SZa ( III ALKSZa (i') ZaS-ALK"N~ L,,NH Cl HO (iii) ~N~boc ZaS-ALK Etape (i) : activation de l'acide à l'aide de NHS ; l'activation est réalisée à température ambiante en présence d'un agent de couplage comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3- 15 diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide en solution dans un solvant aprotique anhydre comme le DCM. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1, composé 4. Etape (ii) : amidification avec la pipéridine N-Boc ; le couplage peptidique est réalisé dans un solvant polaire aprotique à température ambiante en présence d'une base, qui peut être une amine tertiaire comme la TEA ou la DIPEA. Le solvant peut être le DMF. On pourra s'inspirer des 20 conditions de l'exemple 1, composé 5. Etape (iii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 1, composé 6. L'acide de départ, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être 25 commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogéné par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. Voir aussi US 2719170. ZaS-ALK.,N-. PL2 L.,,NH préparé selon le schéma ci-dessous : ZaS-ALK-N ~ ZaS-ALK-N ] ~N\ LNH Cl Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme par exemple le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11. Etape (ii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 12. L'aldéhyde de départ, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, peut être commercial ou préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogéné convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. PL3 ZaS-ALKùNHR,Z préparé selon les schémas ci-dessous : cas où R1,=H N'O~ NHZ co JI (ii) ZaS ALK H + IiZN' CIH ZaS ALK ZaS-ALK Etape (i) : formation d'une oxime ; l'aldéhyde précédemment décrit est mis en solution dans un solvant polaire protique comme l'éthanol puis traité par le chlorhydrate de O- méthylhydroxylamine au reflux en présence d'une base comme l'hydroxyde de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 2, composé 8. Etape (ii) : réduction de l'oxime ; l'oxime est réduite par un traitement au reflux avec une solution de borane diméthylsulfure dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 2, composé 9. cas où RäeI N'o NHZ NHBoc Rt2'NBoc NHR12 (j) Ji (ii) (Il') J (iv) J (v) ZaS-ALK H + HZN'CIH ZaS-ALK ZaS-ALK ZaS-ALK --~ ZaS-ALK ZaS-ALK Dans ce cas, les deux étapes (i) et (ii) précédentes sont suivies des étapes suivantes : Etape (iii) : monoprotection de l'amine par un groupement Boc ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'amine avec le dicarbonate de di-tert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. Etape (iv) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. Etape (v) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). R12 ZaS-ALK PL4 préparé selon le schéma ci-dessous : 0 R\u H 'ALK-SZa ZaS-ALK'N Y 1 (ii) boc R12 ZaS-ALK'N" (i) NH CIH R12 HN. `boc Ce linker est préparé de façon semblable à ce qui est présenté pour PL2. Etape (i) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en deux étapes : formation d'un complexe intermédiaire en présence d'isopropoxyde de titane puis réduction in situ avec un agent réducteur comme le cyanoborohydrure de sodium. On pourra s'inspirer des conditions de l'exemple 3, composé 11. Etape (ii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). MsO-ALK-N(Boc)R12 (vi) HS-ALK-N(Boc)R12 RbZbOC-ALK-SS-ALK-NR12 COCI Etape (i) : protection de l'amine ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'amine avec le dicarbonate de di-tert-butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. 20 Etape (ii) : transformation de l'alcool en bromure ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le THF par traitement de la fonction alcool avec le tétrabromure de carbone en présence d'une phosphine par exemple la triphénylphosphine ; voir à ce propos Appel R. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 801-811 ou Desmaris N., et al., Tetrahedron Letters 2003, 44(41), 7589-7591. 25 Etape (iii) : substitution du bromure par le thioacétate ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DMF en utilisant comme nucléophile le thioacétate de potassium. Etape (iv) : formation de la liaison disulfure ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire protique anhydre comme le méthanol en présence d'une base comme par exemple le 30 méthanolate de sodium et d'un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure. PL5 RbZb-CO-ALKSS-ALKùNR1z Ci préparé selon le schéma ci-dessous : (III) Me-COS-ALK-N(Boc)R12 QSSALK5ZbRb (iv) HO-ALK-NHR72 O HO-ALK-N(Boc)R72 RbZbOC-ALK-SS-ALK-N(Boc)Rt2 (viii) RbZbOC-ALK-SS-ALK-NHR12 (v)1 HCI ÇSSALKYZbRb (vii) 1(ix) Br-ALK-N(Boc)R12 (ii) Selon une variante : Etape (v) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. Etape (vi) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium. Etape (vii) : activation du thiol sous forme de pyridyl-disulfure ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire protique comme l'éthanol par traitement avec un réactif comportant un motif pyridyl-disulfure en présence d'un acide comme l'acide acétique. Etape (viii) : déprotection de l'amine à l'aide d'une solution d'acide, par exemple acide chlorhydrique (par ex. en solution dans le dioxane). Etape (ix) : activation de l'amine sous forme de chlorure de carbamoyle ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le diphosgène en présence d'une base comme la TEA. PL6 RbZb-OC-ALK-(OCH2CH2);ùoHpréparé selon le schéma ci-dessous : cas où ALK=CH2CH2 Voie A: O_ ^ OH (ii) HO O O HO Voie B: (i) HO 11 + H L O" 1OH (iii) ' L _ ~f' OH (i) O O O OH O HO" L ùo O Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le 25 dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. Etape (iii) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire 30 aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. cas où ALK≠CH2ÇH2 ALKùHal+ H f O~\OTHP (iv) c) ALK}r0 0THP~~ HO ALK}rO I (ii) rr OH ALK} LLO OH Etape (iv) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire 35 aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PL7 RbZbOC-ALK-(OCH2CH2);--NHR12 préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CH2CH2 cas où RI,=H o- -0 T'es _boc _a H 0-{----°i--"N-b" O HCI HO cas où R12≠H HO OO T'' `NHBoc(~ -">---O v OO li'' -NHBoc }Q~ ^ (i) ~~O v O- -° 7N `NHR,Z cas où ALK≠CH2CH2 cas où R12=H ALK-O_ ` v 0 7^~ 'JJ (v) 0 ALK-Hal + HO Hal= Brou 1 (ii) ALK-OBI v0 NH2 ALK-O~~O ]~ '(J HOALK-O~i°/~ (i) cas où Rä≠H H0~~0 0 ALK-Hal + Hal= Brou 1 0~ù^N (v) / ALK-0 O (i) ALK-O-N-° N HO~ALK-O l ~ 0 0 ALK-O 0 T NHZ (n) 0 l (v) ALK ONO OxALK-Ot0 (ii) O NRt2Boc ALK-O o r 'NHBoc NHR12 Etape (i) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme I'EDCI et d'une base comme la DMAP. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (iii) : alkylation de l'atome d'azote ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium comme décrit dans WO 2007/127440 ; Etape (v) : saponification de l'ester ; la réaction est réalisée par réaction de l'ester avec de la lithine en présence d'eau. Etape (vi) : protection de l'amine ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement de l'amine avec le dicarbonate de di-tert-15 butyle en présence d'une base comme par exemple la TEA. Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3,5,6,10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant. Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon 20 la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction amine par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3. RbZbOC-ALK-(OCH2CH2LN PL8 NH préparé selon les schémas ci-dessous : 25 cas où ALK=CH2CH2 y HO-f OIr-rO l' ~D HO~I ~O OH ~~ HO-L f CIH ~N~O li 0 Etape (i) : déprotection du composé de départ à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (ii) : protection de la fonction acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction 30 est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DMF en présence de bromure allylique et d'une base comme le carbonate de potassium. Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA. 35 Etape (iv) : réaction entre la fonction mésylate et la fonction amine du composé Omo/\ Ç,,) Ms0+ . 0 O (iv) O NNL~ O 37 Boc-N'\ "H (alkylation) ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. cas où ALK CHZ H2 }IO (v) 4O" ALKùHal + H~OOTHP Ô (I) ALK~O^ ].,OTHP O HO Hal=Br,1 _ALKi..O~ l~N\,l CIH (I) Etape (v) : élongation de la chaine PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate d'un diol PEG monoprotégé sous forme d'éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et 10 al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont 15 commercialement disponibles pour i= 3 à 12. ZbRb-CO-ALK,N^l PL9 L"H préparé selon le schéma ci-dessous : yoc H CIH N N C D N CNR ALI O (ii) ALK_f O~ .T 7_OH ~\O ALICL _O OH r O (Hi) N O ov) OALK-f O~ NJ O ~ Ô ALKf /1_0 Ms boc CD N H ZbRb-CO-ALK PL10 préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CHH2 0 Oyo (i) + CN ~NQ , (ii) N~Q (iii) O HO rNH NJ CIH cas où ALK CH2CH2 oYO ALK\ JIO + Jl ~N` (iv) OH Etape (i) : ouverture de l'anhydride cyclique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydride comme le DCM en présence d'une base comme la TEA. Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme l'EDCI et d'une base comme la DMAP. Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane). Etape (iv) : couplage peptique ; la réaction entre l'acide carboxylique et l'amine est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'un agent 15 de couplage comme le système DIC / HOBt. Etape (v) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine. Les diacides monoprotégés sous forme d'ester méthylique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)1_6- (comme l'ester monométhylique de l'acide 1,6-hexanedioïque). 20 Riz Z= Brou 1 RbZbOC-ALK (OCHZCHZ); Nz PLI 1 préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CH,CH, cas où R1,=H ~AL NJ () H ùALK~NJ (°) =-\. ~NJ 0 0 (iii) 0 ('NH ùALIÇNJ HCI 0 O HO" LO ~JiO~~NHZ c) Z= Brou 1 25 Etape (i) : formation de l'amide et activation de l'acide ; les deux étapes sont réalisées successivement dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : réaction entre la fonction amine et l'halogénoacétate de N-hydroxysuccinimidyle puis addition in situ d'un agent de couplage comme le DIC. cas où Ris HO LO `JiO~~NHR,Z Z=Brout O "L [O"ùiOR, z (ü) O~~NH2 HO Etape (ii) : protections de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique et de l'amine sous forme de trifluoroacétamide ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique comme le DCM : protection de l'acide par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane en présence de méthanol puis protection de l'amine par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA. Etape (iii) : alkylation de l'amine et saponification de l'ester ; la réaction est réalisée en deux étapes successives dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF : alkylation de l'amine par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle R12Hal puis addition de lithine et d'eau. Etape (i) : suite à l'étape (iii), on reprend les réactions de l'étape (i) pour le cas R12=H. cas où ALK≠CH2 H2 cas où R12=H (v) ALK-Hal * HO~L ~O T'es IN O~ALKùOONHZ Hal= Brou I 1(i) ALKùOO H Z=Br ou I cas où Riz .≠I-1 OALKùHal + HOO P"N Hal= Brou I ALKùO'L (v) ALKùO~ L O Ir NHZ (vi) ALKùOO P'~ N R12 Z=BrouI HOALKùO O 7~ NHR,2 ALKùOO~ N,000F3 H (I) Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire 20 aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate d'un benzophénone-imine-PEG-alcool généré par l'action de NaH ou du naphtalénure de potassium (cf. WO 2007/127440) ; Etape (v) : clivage sélectif de l'imine par hydrogénation en présence de palladium sur charbon (cf. Wessjohann, L. et al., Synthesis 1989, 5, 359-63) ; 25 Etape (vi) : protection de l'amine par addition d'anhydride trifluoroacétique et d'une base comme la TEA. Les amino-PEG-acides sont commercialement disponibles pour i=3, 5, 6, 10 ou peuvent être préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et de l'amino-PEG-alcool correspondant. Les amino-PEG-alcools sont commercialement disponibles pour par exemple i=3, 4, 7, 8 ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. La protection de la fonction amine par la benzophénone peut être réalisée par déshydratation azéotropique en présence d'un acide de Lewis comme l'éthérate de BF3. RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)rZ PLI 2 z= Brou 'préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CH2 H2 Voie A : HO+(O~ ) MsO+O O (ii) z 0 0 , / (iii) i) z~ vO OH O 1(iv) z t OO. Z= Brou 1 O Voie B : O f8' HO O-tH 40L'O- tH 4OLy,OOMs (I) o% o^ rz ( v) HO cas où ALK CH2ÇH2 OTHP (vi) 5, OH O ALKùHal O ALK O _ Hal= Br,1 ALK40^-liOMs O N,O" ALK-[O~ `~;z O(ii) 2= Br oou]II O ALK4O- z 1(iii) O r ~ ], (y HOALK{-O" `~~z Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA. Etape (ii) : échange mésylate / halogène ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire aprotique comme l'acétone avec un halogénure de sodium comme l'iodure de sodium. Etape (iii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (iv) : activation de l'acide ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant 25 polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. L'intermédiare formé est hydrolysé sélectivement à pH 5 en hydroxy ester. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PLI 3 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)iùSH préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CH,CH2 Voie A : HO+ v (iii) Mso (iv) O (i) OH HO HO O O HS.-v°lv-yOH 0 Voie B : 40' + HO~I ~O JiH (y) HO 0' ~f SH (iv) H (I) HO (ii) (iii) O 0 OMs O o cas où ALK≠CH2CH O OTHP (vi) x ( %OH C) 4O ALKùHal+HiO- O ALK O Hal = Br, I Etape (i) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction hydroxy peut se former. Il est clivé lors de l'étape suivante (ii). Etape (ii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par 25 traitement avec le triméthylsilyldiazométhane. Etape (iii) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA. Etape (iv) : formation du thiol libre et saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée 30 au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel HOAALK~O_ ] O -O" ALK4O- OH HO ALK4O' JISH loi) ALK-O" qOMs d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde de sodium. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Le linker avec n = 8 (l'acide 3-[2-mercaptoéthoxy-hepta-(éthylèneoxy)]propionique) est disponible commercialement. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tett-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PL14 RbZbOC-ALK-(OCH2CH2)11 OH préparé selon le schéma ci-dessous : cas où ALK=CH,CH, + HO 0 O cas où ALK≠CH,CH2 O^~O\ ^/OH O OTHP ALK-Hal lL` 0 Hal = Br, I HOxALK~O~~O~f O Uv) OALK[-O O IT 1(v) HOALK--O I' L , O 1(iii) ALK-rI-0 OH OTHP ~~OxALKt0~~0\ ^ /O 0 ~~O~ALK~O~~O~OH O Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Dans ce dernier cas, du trifluoroacétate de la fonction alcool éventuellement présente sur la structure peut se former. Ce trifluoroacétate est clivé lors de l'étape suivante (iii). Etape (iii) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester méthylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le méthanol par traitement avec le triméthylsilyldiazométhane. Etape (iv) : saponification de l'ester méthylique la réaction est réalisée à température ambiante dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine. Etape (v) : protection de l'acide carboxylique sous forme d'ester allylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM en présence d'alcool allylique, d'un agent de couplage comme I'EDCI et d'une base comme la DMAP. Etape (vi) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PLI 5 Rbzb-co-Al K-(ocH2cH2)io préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CHÇH2 Voie A : 0) 4 (ii) 4o l o L IC ~~yy HOJL~~IL M.% 1,2 Voie B : O O 1,2 + HO(iv) ° O-i-H -- °° 12 I(ii) 1,2 O HO v O 12 cas où ALK≠CH,CH2 '1'O'ALKûHal Hal = Br, I O OTHP (!) OALK-[-O ALK--O HO + HtO OH ,,2 ALK~O~! .2 O Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme l'hydrure de sodium et d'un halogénure d'alkynyle comme le bromure de propargyle ou le 4-bromo-1-butyne. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. O IxI (iii) HO" l O' ~7~ 3 N•O L O' ~1~ Ns cas où ALK≠CH,CH, PL16 RbZbOC-ALK-(OCH2CH2); "3 préparé selon les schémas ci-dessous cas où A~ LK=CH,CH, /1`~ H O N _/1\~O O 3 + H{Oit/N3 (~ -~) IOII OxALK~O^~ HOALKi-O ' ALKi-O^~N3 fi) ALKûHal Hal= Br,l Etape (i) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Etape (iv) : élongation de la chaîne hydroxy azido PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate de l'hydroxy azido PEG. Les alcools azido PEG sont commercialement disponibles ou peuvent être préparés à partir des diols PEG correspondants commercialement disponibles pour i=3 à 12.35 PLI7 RbZb-CO-ALK/ préparé selon le schéma ci-dessous : HO ALKù ci) Etape (i) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le 5 NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Les acides porteurs d'un groupement acétylénique sont commercialement disponibles pour ALK=-(CH2)m avec m=1 à 10 (comme l'acide 3-butynoïque). PLI8 RbZb-CO-ALK'"3 préparé selon le schéma ci-dessous : ALI~ IOO (i) 0 'ALKùHal Hal = Cl, Br, I (i) ALKùN3 HO ALKùN3 10 Etape (i) : substitution nucléophile de l'halogénure par l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétone en présence d'azoture de sodium. Etape (ii) : saponification de l'ester méthylique ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un mélange de solvants polaires comme un mélange THF/eau en présence de lithine. 15 Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Les esters méthyliques porteurs d'un motif halogénoalkyle sont commercialement disponibles pour ALK = -(CH2)n,- avec m=1 à 6 (comme le bromoacétate de méthyle). 20 PLI 9 Rbzb co ALK-(OCH2CH2)io 1.2 ' préparé selon les schémas ci-dessous : cas où ALK=CHÇH2 Voie A : 40L-fo'" (i) 000 \ (ii) HO (iii) 25 Voie B : f0 OH (iv) I 011 OH (I) 0 (ii) H /~ O O 0 HO cas où ALK≠CH2CH2 ALK-Hal + HtO_-. OTHP (!) O Hal=Br,I 1 ALK-1-O 7;0'K> !fi) HO ALK4O^ O zu OH (i) ALKf0 ALK- Our°'11 (iii) Etape (i) : substitution nucléophile ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF en présence d'une base comme l'hydrure de sodium et d'un halogénure d'alkènyle comme le bromure d'allyle ou le 4-bromo-1-butène. Etape (ii) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (iii) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Etape (iv) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement d'un acide insaturé protégé sous forme d'ester avec l'alcoolate généré par l'action de sodium en quantité catalytique. Etape (v) : élongation de la chaîne PEG ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF ou la DMF par traitement d'un ester halogéné avec l'alcoolate du diol PEG monoprotégé en éther de tétrahydropyrane (THP). La préparation de ce type de diol PEG monoprotégé est bien décrite dans la littérature, voir par exemple Richard A. et al. Chem. Eur. J. 2005, 11, 7315-7321 ou Sakellariou E.G., et al. Tetrahedron 2003, 59, 9083-9090. Les alcools PEG comportant une fonction acide protégée sous forme d'ester tert-butylique sont commercialement disponibles (comme le 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodécanoate de tert-butyle) ou préparés à partir de l'acrylate de tert-butyle et d'un diol PEG. Les diols PEG de départ sont commercialement disponibles pour i=3 à 12. PL20 Rbzb-OC-ALK ' préparé selon le schéma ci-dessous : HOALI PL21 ZaS-ALK-CH2-NRt2-(CH2CH20),-CH2CH2-NHR'12 préparé selon les schémas ci-dessous : cas où R12 et R'12=H H f 0- -NHBoc !i) SO yNHBoc O f!) yNHBoc HZN\ ,I0^ yNHBoc ALK-SZa ZaS-ALKN NH I (v) ZaS-ALK~N\ NHBoc L O ~1 I-t 2 v l O 'J i-t cas où R12≠H et R'l,=H H O--Ji LNHBoc (~) HfO^ _i NBPh (I) L 7_ Ha ZaS-ALKNR~y~.~ ~~ yNH LO 'Jii-tZ cas où R1?=H et R'12 H CH2Ph ÇHZ Ph Il (ii) N3 ^ ],NBoc (moi) H2N yNHBoc ~ ~ lO ~ ~~~lü-1 O O H" ALK-SZa (v) ZaS-ALK yNHBoc ~NR12~O^ yNHBoc (~ viii) H L ~Jt ZaS-ALK N\~ - t0 Jin-t (iv) H f0-NHB(oc () S O yNHBoc (i!) Na'--Boc (viii) N3\ ~O^ yNR'12Boc ` ~On ~O~jy i-tNH V l 1 ~t 0 0 ZaS-ALK,,,N HCI N R'12 (v) v L0 ù) 1_1 cas où R1, et R'19 Hf O^ , (i) (ii) N3 yNHBoc (viii) N NR' Boc `1-NHBoc SAO v LO NHBoc U~O~'li-t --- 3U~O~.ri-t ,z O O 1(ai) ZaS-ALK NRI3,1O ~lNRt'12Boc (viii) ZaS-ALK N ~~ yNR'726oc .H~ALK-SZa H2N\ ~~ yNR'12Boc l ~~ yi- i(v) HCI ZaS-ALK~,NR NHR'tz t 0 -1 i-t Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde 10 d'argent et d'iodure de potassium. Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. 15 Etape (iv) : amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le 20 dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure 00 ZaS-ALK,N NR'tzBo, H" ALK-SZa HZN\v `O J i t ~~ NR'12Boc (iv) (iii) de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle. Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium. Etape (viii) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction amine sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino- 3,6,9-trioxaundecanyl-1l-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'aldéhyde ZaSS-ALKCHO, par exemple le 2-méthyl-2-(méthyldithio)-propanal, est commercial ou peut être préparé par oxydation d'un alcool porteur d'un motif disulfure obtenu à partir d'un alcool halogéné convenablement protégé (par exemple sous forme d'éther silylé) par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. o ZaS-ALK N HCI y LO ~J;NH2 o(v) ZaS-ALK H N 0 `J ~, yNHi-t Boc PL22 ZaS-ALK NRt2-(CH2CH2o); CH2CH2-NHR'12 préparé selon les schémas ci-dessous : cas où Rä et R'1H H.LO 1i HBoc yNHBoc (i) N'~/~o~ riNHBoc (iii) HzN\ ~O~ LNHBoc t f.N S' v LO ~JI-t v l '1 d "b (iv) HO ALK-SZa cas où R12≠H et R'ä=H GH2Ph GHZPh ÇHZPh Hfo HlNHBoc (v) HL LO~~NBoc 0) � O` ylNBoc (ù°) N3~/~0 ] Boc (hi HzN~~OyiNHBoc ,S~ v L O 'J i-t J 0 0 ZaS-ALK 1,1R HCI (v) ZaS-ALK\ NRt ~o~.riNH2 IÎ~I O irBoc o HO" ALK-SZa cas où R1?=H et (viii) R12HN\1~ NHBoc `0 l i-t NR'tz 0 NHBoc (ù°) Na `0 `J i-t NHBoc (iX) Na v L0 Hi-t oc S' v l0 ~1 i-t NB 0 0 (v) ZaS-ALK Hfo-"...}-NHBoc !i) H HCI ZaS-ALK` 'N\ ~ ~~ yNHR'1z IKI v l 0 ~J i-t oH NR'1z N\ yNBoc v L 0 ~l i-t(iii) NB', HzN~~oi~,NBoc HO ALK-SZa . cas où R� et R't,H H~ NHBoc (-! ~) O^~ R12 NR'72 ZaS-ALK N\ ,~ yNBoc v L 0 ûJ it49 R,ZHN . ~O ^ ,-NBoc (iii) NRI,2 (viii) HZN/~O~~,NBoc NR',2 NR',2 O\ ^ yNHBoc (i~) N3 \v L O^v, yNHi-t Boc (iX) Na\ ^ ,NBoc S' v L 0 v, i-t v L O ùJ i.t d "b O (v) HO ALK-SZa R12 HCI ZaS-ALK N, vL0 ~lirR'72 O Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le chlorure de tosyle en présence d'oxyde d'argent et d'iodure de potassium. Etape (ii) : substitution nucléophile du tosylate ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme l'acétonitrile par traitement avec l'azoture de sodium. Etape (iii) : réduction de l'azoture ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange THF/eau en présence de triphénylphosphine. Etape (iv) : couplage peptidique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique 10 comme le diméthylformamide en présence d'agents de couplage comme le système N,N'-diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole et d'une base comme la TEA. Etape (v) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (vi) : protection de la fonction NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire 15 aprotique comme le THF ou la DMF par traitement avec 1 équivalent de base comme l'hydrure de sodium suivi d'un halogénure de benzyle comme le chlorure de benzyle. Etape (vii) : clivage du groupement benzyle et réduction de la fonction azido ; la réaction est réalisée dans un solvant protique comme le méthanol par l'hydrogène en présence d'un catalyseur comme l'hydroxyde de palladium. 20 Etape (viii) : alkylation de l'amine par amination réductrice avec un aldéhyde ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le DCM en présence d'un agent réducteur comme le triacétoxyborohydrure de sodium et si nécessaire d'acide acétique comme catalyseur. Etape (ix) : alkylation du groupe NHBoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire 25 aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction amine sont commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-1 l-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement 30 disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. L'acide carboxylique ZaS-ALK-CO2H, par exemple l'acide 4-méthyl-4-(méthyldithio)-pentanoïque, peut être commercial ou préparé à partir d'un acide carboxylique halogéné par traitements successifs avec le thioacétate de potassium et un dérivé de type méthanethiosulfonate. PL23 ZaS-(CH2CH2O); CH2CH2-NHR12 préparé selon les schémas ci-dessous 5 cas où RI .2.1-1 NHBoc (10) NHBoc I (iv) ZaS~/~O~.NH2 HCI HO O NHBoc (1) MsO 4. o NHBoc (ii) HS-:.. - 0 cas où 0-.NHBoc (11) HS0 - NHBoc (10) ZaS~[/ o~ /NHBoc L Jl (v) ZaS~[/~O~~NHR72 (lv) ZaS~/~ ~~NR12Boc `` HCI O Etape (i) : activation de l'alcool sous forme de mésylate ; la réaction est réalisée dans un solvant 10 polaire aprotique anhydre comme le DCM par traitement avec le chlorure de mésyle en présence d'une base comme la TEA. Etape (ii) : formation du thiol libre ; la réaction est réalisée au reflux d'un solvant polaire protique comme un mélange éthanol/eau en deux étapes successives : déplacement du mésylate par la thiourée puis hydrolyse in situ du sel d'isothiouronium par ajout d'une base comme l'hydroxyde 15 de sodium. Etape (iii) : protection du thiol ; la réaction est réalisée dans un mélange de solvants polaires comme un mélange éthanol/eau avec un réactif comportant une fonction méthanethiosulfonate comme le méthyl-méthanethiosulfonate en présence d'une base comme le carbonate de sodium. Etape (iv) : déprotection à l'aide d'une solution d'acide chlorhydrique (par ex. solution dans le 20 dioxane) ou d'acide trifluoroacétique. Etape (v) : alkylation de l'amine ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec une base comme l'hydrure de sodium en présence d'un réactif porteur d'un groupement nucléofuge comme un halogénure d'alkyle. Les amino-PEG-alcools protégés ou non par un groupement Boc sur la fonction amine sont 25 commercialement disponibles (comme le N-Boc-aminoéthoxy-éthoxy-éthanol ou le 1-amino-3,6,9-trioxaundecanyl-1l-ol) ou peuvent être préparés à partir des diols PEG, commercialement disponibles pour i=3 à 12, selon la procédure décrite dans US 7230101. HO O NHBoc (1) MsO RbZbOC-ALK OH H2NyNH O préparé selon le schéma ci-dessous : PL24 FmocHN ci) OH O (Lcitrulline) HzNUNH O (ii) I H fi (iii) FmocHN 1f Y OH FmocHN O H2NÏNH O OH H2N,r,NH O (v) t ~~OJ ALK*OH Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange diméthoxyéthane/THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium. Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme l'EEDQ. Etape (iv) : déprotection de l'amine Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine. Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le chlorhydrate d'EDCI. Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile. Les diacides monoprotégés sous forme d'ester allylique sont commercialement disponibles pour n=2 (succinate de monoallyle) ou peuvent être préparés par transestérification des monoesters méthyliques ou tert-butyliques qui sont commercialement disponibles pour n = 2 à 6. o RbZbOC-ALK-(OCH2CH2)i PL25 H2N\ NH o préparé selon le schéma ci-dessous : (il) o FmocHN~ OH FmocHN H,N.&OH O H H2N` /NH 0 0 ALK O n OH ~~O1ALKO (V) ~~OxALKOH HZNyNH O Etape (i) : activation de la Fmoc-L-valine sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire aprotique anhydre comme le THF par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC. Etape (ii) : couplage peptidique entre la Fmoc-L-valine-NHS et la L-citrulline ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DME(THF/eau en présence d'une base comme le bicarbonate de sodium. Etape (iii) : couplage peptidique avec l'alcool 4-aminobenzylique ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'un agent de couplage comme I'EEDQ. Etape (iv) : déprotection de l'amine Fmoc ; la réaction est réalisée dans un solvant polaire comme un mélange DCM/méthanol en présence d'une base comme la diéthylamine. Etape (v) : activation de l'acide carboxylique sous forme d'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme le DCM par traitement avec le NHS en présence d'un agent de couplage comme le DCC supporté. Etape (vi) : couplage peptidique entre le dipeptide et l'ester NHS ; la réaction est réalisée à température ambiante dans un solvant polaire aprotique comme un mélange DCM/acétonitrile. Les diacides PEG monoprotégés sous forme allyle sont préparés selon la description de préparation du linker L14. 53 Tableau I Précurseurs de linkers Dérivés de cryptophycine de formule (11)2'5 PL exemples de PL G Réaction(s)' L Famille de linker dérivée du o o HN Cl précurseur PL L o H o � OMe avec L = PLI NH -(CH2)nCl substitution L~ ZaS-ALK" N~ HSN^ nucléophile ~(CH2)n-- ~l [pour Ze H, étape ex..) supplément. de réduction] L2 ZaS-ALK.N . HS L 1N, ex.3 (cH2)n ~N N PL2 ~tJ -(CH2)nCI L3 R12 R 72 ZaS-ALK'NS(CH2)n HS N Rte=H : ex.2 ou R12=Me PL3 is`S NHR12 -(CH2)nCl R12=H ou R12=Me L4 R 12 HS' vN~N ZaS ALK"N\ ^ l (CHZ)n PL4 R ,2 -(CH2)nCl iS`SN NH R12=H ou R12=Me PL6 0~\/~iS`Si~NUci -(CH2)nOH acylation L5 R12 O 0 O RbZb-CO-ALK-SS-ALK'NyO~(CH2) N O S.S~NUO o O lol PL6 ~/~OOOH -(CH2)nOH activation, couplage, L6a RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i_oy (CH2)n N.o~~o ~.o o o [évent. transformation O 0 o o d'un ZbRb en un autre ZbRb, par ex. pour 0 ù ZbRb= déprotection, activation par NHS] Lsb R1z o RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'O Ô N~(CH2)n/0 O~0 0 N 01012 o (CH2)nNH2 (CH2)n estérification, L Sc gg o CO2H [évent. transformation RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i o (mil 002 0 d'un ZbRb en un autre ZbRb, par ex. pour 54 ZbRb= ° déprotection, activation par NHS] -(CH2)ä Cl substitution L7a ,N\2 )n 3 Procédé de préparation du conjugué Le conjugué est obtenu par le procédé consistant à : (i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse de l'agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine de formule (II) ; (ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés. On entend par � agrégats � les associations qui peuvent se former entre deux agents de ciblage ou plus, les agents de ciblage ayant été modifiés ou non par conjugaison. Les agrégats sont susceptibles de se former sous l'influence d'un grand nombre de paramètres tels qu'une concentration élevée en agent de ciblage dans la solution, le pH de la solution, des forces de cisaillement élevées, le nombre de dimères greffés et leur caractère hydrophobe, la température (voir les références citées dans l'introduction de J.Membrane Sci. 2008, 318, 311-316), l'influence de certains d'entre eux n'étant parfois pas éclaircie avec précision. Dans le cas des protéines ou des anticorps, on pourra se reporter à AAPS Journal, � Protein Aggregation and Bioprocessing � 2006, 8(3), E572-E579. La teneur en agrégats peut être déterminée à l'aide de techniques connues telles que la SEC (voir à ce propos, Analytical Biochemistry 1993, 212(2), 469-480). La solution aqueuse de l'agent de ciblage peut être tamponnée à l'aide par exemple de tampons tels que par exemple le phosphate de potassium ou l'acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (tampon HEPES) ou un mélange de tampons tel que le tampon A divulgué plus loin. Le tampon dépend de la nature de l'agent de ciblage. Le dérivé de cryptophycine est mis en solution dans un solvant organique polaire, par exemple le DMSO ou la DMA. La réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40 °C. La durée de la réaction peut varier entre 1 à 24 h. La réaction entre l'anticorps et le dérivé de cryptophycine peut être suivie par SEC avec un détecteur réfractométrique et/ou ultraviolet afin d'en déterminer l'état d'avancement. Si le taux de substitution est insuffisant, on peut laisser réagir plus longtemps et/ou ajouter du dérivé de cryptophycine. On pourra se reporter à la méthode générale donnée dans la partie exemples pour plus de détails sur des conditions particulières. L'homme du métier dispose de différentes techniques chromatographiques pour la séparation de l'étape (ii) : le conjugué peut être purifié par exemple par chromatographie d'exclusion stérique (SEC), par chromatographie d'adsorption (comme l'échangeuse d'ions, IEC), par chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), par chromatographie d'affinité, par chromatographie sur des supports mixtes comme l'hydroxyapatite céramique ou par HPLC. La purification par dialyse ou diafiltration peut également être utilisée. Après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué peut subir une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. On obtient donc à l'issue de ces étapes le conjugué en solution aqueuse. Un mode particulier de procédé applicable est celui décrit dans les exemples 9 ou 10. anticorps L'anticorps (voir à ce propos, Janeway et al. � Immunobiology �, 5ème édition, 2001, Garland Publishing, New York) pourra être choisi parmi ceux décrits notamment dans WO 04043344, WO 08010101, WO 08047242, WO 05009369 (anti CA6). L'anticorps peut être éventuellement modifié à l'aide d'un agent de modification afin de favoriser l'attachement du dérivé de cryptophycine (voir ci-dessus). L'anticorps peut être notamment monoclonal, polyclonal ou multispécifique. Il peut s'agir aussi d'un fragment d'anticorps. II peut s'agir aussi d'un anticorps murin, humain, humanisé ou chimérique. coniuqué Un conjugué comprend généralement de l'ordre de l'ordre de 1 à 10 dérivés de cryptophycine attachés de façon covalente à l'agent de ciblage (il s'agit du taux de greffage ou "drug-toantibody ratio" ou "DAR" en Anglais). Ce nombre varie en fonction de la nature de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine ainsi que des conditions opératoires utilisées dans le procédé de conjugaison (par exemple nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine par rapport à l'agent de ciblage, temps de réaction, nature du solvant et de l'éventuel cosolvant). La mise en contact de l'agent de ciblage et du dérivé de cryptophycine conduit à un mélange comprenant plusieurs conjugués se distinguant individuellement les uns des autres par des DAR différents ; éventuellement l'agent de ciblage n'ayant pas réagi ; éventuellement des agrégats. Le DAR qui est déterminé sur la solution finale correspond donc à un DAR moyen. Dans le cas où l'agent de ciblage est un anticorps, la spectroscopie UV peut être une méthode utilisée pour déterminer le DAR. Cette méthode s'inspire de celle présentée dans Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, � Therapeutic Antibodies and Protocols �, vol. 525, 445, Springer Science. Elle consiste à mesurer l'absorbance d'une solution de conjugué après l'étape de séparation (ii) à deux longueurs d'onde notées I1 et 2^,2. On utilise les coefficients d'extinction molaires suivants de l'anticorps nu et du dérivé de cryptophycine mesurés préalablement à la conjugaison. Les absorbances de la solution de conjugué à x1 et X2 (Am) et (Au) sont mesurées soit sur le pic correspondant du spectre SEC (ceci permet de calculer un "DAR(SEC)") ou en utilisant un spectrophotomètre UV classique (ceci permet de calculer un "DAR(UV)"). Les absorbances peuvent être exprimées sous la forme : Am =(CDXEDM)+(CAXEAM) Au = (CD X ED ?2) + (CA X 4 12) équations pour lesquelles : • CD et cA désignent respectivement les concentrations dans la solution de la partie du conjugué relative au dérivé de cryptophycine et la partie du conjugué relative à l'anticorps ; • ED X1 et EDX2 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison aux deux longueurs d'onde X1 et X2 ; • EA x1 et EA 12 désignent respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu aux deux longueurs d'onde Xl et X2. On entend par anticorps nu, l'anticorps auquel n'est attaché aucun dérivé de cryptophycine, c'est-à-dire l'anticorps avant l'étape de conjugaison. La résolution de ces deux équations conduit à : 7 CD = [(CA X Au) - (EAJ2 X Am)] / [(CD 12 X CA 11) - (CA 12 X CD x1)] CA=[Aa,1-(CDXEDI1)]/EA~1 20 Le DAR moyen correspond alors à cD / cA. Dans le cas des dérivés de cryptophycine, on considére les deux longueurs d'onde : X1= 280 nm et X2= 246 nm. Le DAR(UV) est de préférence supérieur à 2, plus particulièrement compris entre 2 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7. 25 Le conjugué peut être utilisé en tant qu'anticancéreux. De par la présence de l'agent de ciblage, le conjugué est rendu très sélectif vis-à-vis des cellules tumorales plutôt que les cellules saines. Ceci permet de diriger le dérivé de cryptophycine dans un environnement proche de celles-ci ou directement à l'intérieur de celles-ci (à ce propos, voir les publications suivantes qui décrivent l'utilisation de conjugués d'anticorps monoclonaux dans le traitement de cancers : � Antibody- 30 drug conjugates for cancer therapy � Carter P.J., et al., Cancer J. 2008, 14, 154û169 ; � Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs � Chari R., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 98û107). II est possible de traiter des cancers solides ou liquides. Le conjugué est formulé sous forme d'une solution aqueuse tamponnée à une concentration 35 généralement comprise entre 1 et 10 mg/ml. Cette solution peut être injectée sous forme de perfusion telle qu'elle ou bien être rediluée pour former une solution de perfusion. [Exemples] 6015 Méthodes analytiques utilisées Chromatographie liquide haute pression û Spectrométrie de masse (LCMS) Méthode Al L'analyse est réalisée sur un appareil Waters ZQ et une colonne XBridge C18 2,5 pm (3X50 mm) à 70°C avec un débit de 0,9 ml/min, un gradient d'élution (7 min) de (A) eau/0,1% acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique (gradient : de 5% à 100% B en 5,3 min ; 5,5 min : 100% B ; 6,3 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Méthode A2 L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH C18 1,7 pm (2,1X50 mm) à 50°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau/0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile/0,1% acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 0,8 min ; 1,2 min : 100% B ; 1,85 min : 100% B ; 1,95 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Méthode A3 L'analyse est réalisée sur un appareil Waters UPLC-SQD et une colonne Acquity BEH C18 1,7 pm (2,1X50 mm) à 70°C avec un débit de 1 ml/min, un gradient d'élution (2 min) de (A) eau / 0,1 % acide formique et de (B) acétonitrile / 0,1% acide formique (gradient : de 5% à 50% B en 1 min ; 1,3 min : 100% B ; 1,45 min : 100% B ; 1,75 min : 5% B) et une ionisation électrospray en mode positif et/ou négatif. Spectrométrie de masse (MS) Les spectres ont été réalisés par introduction directe sur un appareil WATERS GCTof (introduction directe sans LC). Résonance magnétique nucléaire 1H (RMN) Les spectres RMN 1H ont été réalisés sur un spectromètre Bruker Avance soit DRX-300, DRX-400, DRX-500 ou DMX-600. Méthode générale utilisée pour préparer les coniuqués dans le cas des dérivés de crvptophvcine comprenant un linker L terminé par -SZa 1è,e étape L'anticorps est tout d'abord modifié par un ester activé NHS, afin d'introduire à sa surface des groupements pyridyldisulfures. Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,05 M de phosphate de potassium et 0,05 M de NaCl est traitée par 5 à 10 éq. de l'ester activé NHS en solution dans la DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit comprise entre 5 et 10 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 5%. La réaction est poursuivie pendant 2 h à TA. Le mélange est déposé sur une colonne de filtration sur gel (matrice SephadexTM G25, GE Healthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA. L'anticorps modifié est élué avec le tampon HEPES pH=8, collecté puis dosé par spectrométrie UV afin de déterminer la concentration en anticorps de l'échantillon ainsi que le nombre de groupements pyridyldisulfures. Un prélèvement de l'anticorps modifié est traité avec le dithiothréitol afin de réduire la liaison disulfure, la pyridine-2-thione libérée est dosée par spectrométrie (coefficients d'extinction : 8343 nm : 8080 M-'cm"', 8280 nm : 5100 M"'cm"' pour la pyridine-2-thione, et 8280 nm : 208380 M"'cm" ' pour l'anticorps). En moyenne, de 3 à 6 groupements pyridyldisulfures sont greffés par molécule d'anticorps. 2"e étape La solution d'anticorps modifié de la 1" étape est diluée dans le tampon aqueux pH=8 décrit ci-dessus puis traitée par une solution du dérivé de cryptophycine (5 éq.) de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20% ; le nombre d'équivalents de dérivé de cryptophycine est exprimé par rapport au nombre de molécules de pyridyldisulfures introduites lors de la première étape. La réaction est poursuivie pendant la nuit à 30°C. Le mélange est analysé par SEC HPLC (colonne TSKgel (G3000SWXL, 07,8 mmx30,0 cm, 5 pm, Tosho Bioscience), débit 0,5 ml/min, isocratique à 100% de tampon SEC pH=7 contenant 200 ml de KCI 1M, 52 ml de KH2PO4 1M, 107 ml de K2HPO4 1M, 441 ml d'eau et 200 ml d'iPrOH) afin de déterminer le taux de greffage du dérivé de cryptophycine sur l'anticorps. Le mélange est filtré sur filtre Millex�-SV 5 pm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl, 2 mM d'EDTA et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice SephadexTM G25 (colonne Hiprep 26/10 desalting, GE Healthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le nombre moyen de cytotoxique par anticorps. Méthode générale utilisée pour préparer les coniugués dans le cas de dérivés de cryptophycine comprenant un linker terminé parûC=O IZbRb Une solution d'anticorps hu2H11 dans un tampon aqueux pH=8 contenant 0,05 M de HEPES, 0,05 M de NaCl et 2 mM d'EDTA est traitée avec un excès d'une solution dans le DMA du dérivé de cryptophycine de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml et le pourcentage de DMA dans le tampon aqueux de 20%. La réaction est poursuivie pendant 3 h à 30°C. Le mélange est analysé par SEC HPLC (colonne TSKgel (G3000SWXL, 0 7,8 mmx30,0 cm, 5 pm, Tosho Bioscience), débit 0,5 ml/min, isocratique à 100% de tampon SEC pH=7 contenant 200 ml de KCI 1M, 52 ml de KH2PO4 1M, 107 ml de K2HPO4 1M, 441 ml d'eau et 200 ml d'iPrOH) afin de déterminer le taux de greffage de cytotoxique sur la population d'anticorps monomériques. Si le taux de substitution est insuffisant, le mélange est traité avec la solution de dérivé de cryptophycine dans la DMA pendant 3 h supplémentaires à 30°C. Le mélange est filtré sur filtre Millex�-SV 5 pm (membrane PVDF, Durapore, Millipore) puis purifié par filtration sur gel en utilisant une matrice Superdex 200 pg (colonne HiLoad 16/60 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl, 2 mM d'EDTA et 10% à 20% de NMP. Les fractions contenant l'anticorps conjugué sous forme monomérique sont collectées, rassemblées et concentrées sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 10k ou 50k, Millipore) jusqu'à une concentration comprise entre 2 et 5 mg/ml. Un changement de tampon est finalement réalisé afin d'éliminer le solvant organique du tampon de conservation du conjugué. Le conjugué est déposé sur une colonne de filtration sur gel composée d'une matrice SephadexTM G25 (colonnes Nap-5, -10, PD-10 ou colonne Hiprep 26/10 desalting, GEHealthcare) au préalable équilibrée avec un tampon aqueux de composition et pH adaptés à chaque conjugué. Le conjugué final est dosé par spectrométrie UV en utilisant les coefficients d'extinction déterminés pour l'anticorps et le dérivé de cryptophycine correspondant afin de mesurer la concentration en anticorps et le taux de greffage. Les deux méthodes décrites pour le cas de l'anticorps hu2H11 pourraient s'appliquer aussi de façon semblable à d'autres anticorps. Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-30 diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone o Composé 2 : (E)-(3S,10R, 16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-16-{(S)-1-[(R)-3- (4-chloro-méthylphényl)-oxiranyl]-éthyl}-3-isobutyl-6,6-diméthyl-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene2,5,9,12-tétraone ci HO 2 Le composé 1 (30 mg ; 42,9 pmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DMF anhydre (2 ml) et le mélange est refroidi à 0°C avant ajout de la TEA (107 pmol) puis du chlorure de méthanesulfonyle (64,6 pmol). Après 15 min, le bain est retiré et l'agitation est poursuivie 12 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt (2 ml) et la phase organique est lavée par de l'eau (2x1 ml), par une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (1 ml) et par une solution aqueuse saturée de NaCl (1 ml). La phase organique est séchée sur MgSO4 et, après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 2 est obtenu sous forme d'une huile incolore qui cristallise (25 mg ; 81%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) (ppm) : 0,77 - 0,83 (m, 6 H); 1,02 (s, 3 H); 1,04 - 1,07 (m, 3 H); 1,14 (s, 3 H); 1,29 - 1,36 (m, 1 H); 1,54 - 1,63 (m, 2 H); 1,80 - 1,87 (m, 1 H); 2,24 - 2,33 (m, 1 H); 2,63 - 2,73 (m, 2 H); 2,96 - 3,06 (m, 3 H); 3,28 - 3,32 (m, 1 H); 3,83 (s, 3 H); 3,93 (d, J=1,6 Hz, 1 H); 4,27 (ddd, J=11,3, 8,0, 3,6 Hz, 1 H); 4,78 (s, 2 H); 4,93 (dd, J=9,6, 3,6 Hz, 1 H); 5,13 (dd, J=10,8, 5,1 Hz, 1 H); 5,81 (d, J=14,8 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=15,0, 11,2, 3,7 Hz, 1 H); 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J=8.5, 1,9 Hz, 1 H); 7.23 (d, J=9,6 Hz, 1 H); 7,29 (d, J=1,9 Hz, 1 H); 7,34 (d, J=8,2 Hz, 2 H); 7,47 (d, J=8,2 Hz, 2 H); 8,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H). LCMS (Al) : ES m/z=71 [M + H]+ ; m/z =715 [M - H]- ; tR = 5,17 min. Composé 4 : 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle O HO 3 4 A une solution, purgée à l'argon, du composé 3 (3,05 g, 15,7 mmol, préparé selon WO 2007085930) dans le DCM (30 ml) sont successivement ajoutés le NHS (17,3 mmol) et le chlorure d'EDCI (17,3 mmol). Le mélange est agité pendant 3 h à TA avant d'être lavé avec un tampon phosphate pH=6 (2X30 ml) puis avec une solution saturée de NaCl (30 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. L'huile ambrée obtenue qui cristallise est lavée par un mélange heptane/AcOEt 75/25 et filtrée sur un verre fritté pour donner le composé 4 sous la forme d'un solide blanc (2,08 g, 45%). Le filtrat est concentré à sec et le brut obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 50/50 à 0/100. Les fractions contenant le produit attendu sont concentrée à sec et reprises dans de l'éther isopropylique (5 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritté pour donner le composé 4 attendu (1 g, 22%). RMN 'H (400 MHz, DMSO-d6) (ppm) : 1,29 (s, 6 H) ; 1,92 à 1,98 (m, 2 H) ; 2,41 (s, 3 H) ; 2,72 à 2,78 (m, 2 H) ; 2,81 (s, 4 H). LCMS (A4) : El, m/z = 291 [M + Hr 65 Composé 5 : 4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-piperazine-1-carboxylate de tert-butyle o s-s 4 Dans un tube Wheatton sont chargés le composé 4 (200 mg, 686 pmol), la 1-Boc-pipérazine (686 pmol), la TEA (755 pmol) et le DMF (1,6 ml). Le mélange est agité à TA pendant la nuit puis dilué avec de l'AcOEt (5 ml), lavé avec de l'eau (2x5 ml), séché sur MgSO4 et concentré à sec. Le brut est repris dans de l'éther isopropylique (3 ml) ; le précipité est filtré sur verre fritté pour donner le composé 5 (213 g, 86%). RMN 'H (400 MHz, DMSO-d6) (ppm) 1,27 (s, 6 H) ; 1,41 (s, 9 H) ; 1,73 à 1,87 (m, 2 H) ; 2,34 à 2,41 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3 H) ; 3,23 à 3,36 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,39 à 3,45 (m, 4 H). LCMS (A2) : ES m/z = 363 [M + H]+; m/z = 307 [M + H - C4H8]- ; tR = 1,08 min. Composé 6 : chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one N LNH CI s-s 6 6 A une solution du composé 5 (213 mg, 588 pmol) dans le dioxane (4,4 ml) est ajoutée une solution HCI 4M dans le dioxane (4,4 ml). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h. Le mélange est filtré sur verre fritté, le solide obtenu est rincé avec du dioxane (2 ml) puis de l'éther isopropylique (2 ml) pour donner le composé 6 (132 mg, 75%) sous la forme d'un solide crème. RMN 'H (500 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) : 1,27 (s, 6 H) ; 1,73 à 1,85 (m, 2 H) ; 2,37 à 2,45 (m, 2 H) ; 2,40 (s, 3H) ; 2,98 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,62 à 3,73 (m, 4H) ; 9,39 (m étalé, 2 H). LCMS (Al) : ES m/z = 263 [M + H]+ ; tR = 2,40 min. Composé 7 : (E)-(3S,1OR,165)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6, 6-diméthyl-16-[(S)-l-((R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl) -pipérazin-l-ylméthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-1 3-ene-2,5,9,12-tétraone HO Le composé 1 (20,3 mg ; 29,0 pmol) est placé en solution dans le DMF anhydre (0,77 ml) et la TEA (72,6 pmol) puis le chlorure de méthanesulfonyle (43,6 pmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé et la TEA (58,0 pmol) puis le chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (34,8 pmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant d'être dilué par de l'AcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aqueuse saturée de NaCl (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 98/2. Un solide blanc, 7, est obtenu (5,7 mg ; 21%). CCM (DCM 90/MeOH 10) : Rf=0,6 ; RMN I H (400 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) 0,75 - 0,81 (m, 6 H); 1,01 (s, 3 H); 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H); 1,12 (s, 3 H); 1,26 (s, 6 H); 1,28 - 1,33 (m, 1 H); 1,52 - 1,61 (m, 2 H); 1,76 - 1,83 (m, 2 H); 2,27 - 2,38 (m, 4 H); 2,39 (s, 3 H); 2,64 - 2,74 (m, 2 H); 2,95 - 3,05 (m, 2 H); 3,24 - 3,34 (m, 6 H); 3,44 (br. s., 4 H); 3,49 (s, 2 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J=1,7 Hz, 1 H); 4,22 - 4,29 (m, 1 H); 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H); 5,08 - 5,15 (m, 1 H); 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H); 6,48 (ddd, J=15,2, 11,3, 3,5 Hz, 1 H); 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H); 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H); 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H); 7,25 - 7,34 (m, 5 H); 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) ; LCMS (Al) : ES m/z = 943 [M + H]+ ; m/z = 941 [M - H]- ; tR=4,03 min Exemple 1 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3-15 {4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-I ,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9,12-tétraone s Le produit 7 (9,6 mg ; 10,2 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1,2 ml) / eau (1 ml) et le mélange se trouble. Le chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (25,4 pmol) est 20 ensuite additionné et le mélange est agité 5 h à TA. Le mélange est dilué par ajout d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aqueuse saturée de NH4CI (1 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit final, Ex1, est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,5 mg ; 71%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) 0,76 - 0,81 (m, 6 H); 25 1,01 (s, 3 H); 1,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H); 1,13 (s, 3 H); 1,24 (s, 6 H); 1,27 - 1,31 (m, 1 H); 1,56 - 1,64 (m, 2 H); 1,73 - 1,85 (m, 3 H); 2,26 - 2,33 (m, 3 H); 2,36 - 2,45 (m, 4 H); 2,63 - 2,75 (m, 2 H); 2,95 - 3,06 (m, 3 H); 3,34 - 3,36 (m, 1 H); 3,42 - 3,51 (m, 6 H); 3,82 (s, 3 H); 3,89 (s, 1 H); 4,22 - 4,29 (m, 1 H); 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H); 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H); 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,48 (ddd, J=15,0, 11,4, 3,4 Hz, 1 H); 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J=8,3, 1,5 Hz, 1 30 H); 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H); 7,26 - 7,36 (m, 5 H); 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H) ; LCMS (A2) : ES mlz = 897[M+H]+;m/z= 895 [M - H]-;tR=0,97min Exemple 2 : (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3-{4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylam ino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-35 dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone HS Composé 8 : 2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propionaldéhyde 0-méthyl-oxime N'o + H2N'O~ CIH g (33,3 mmol) de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde sont mis en solution dans 50 ml d'éthanol, 5 sous atmosphère inerte. Sont successivement ajoutés une suspension de 5,56 g (66,54 mmol) de chlorure de O-méthylhydroxylamine dans 50 ml d'éthanol puis 6,65 ml (66,54 mmol) de NaOH. Le mélange, blanc trouble, est chauffé au reflux pendant la nuit. Après retour à TA, le mélange est versé dans 500 ml d'eau. La phase aqueuse est extraite avec l'AcOEt (3x175 ml), les phases organiques rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl (200 ml) et séchées sur MgSO4. Après filtration et concentration sous PR, le composé 8 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (5,89 g, 32,9 mmol). Composé 9 : 2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamine N,o, 8 BH3 S THF Dans un ballon purgé à l'argon, sont successivement introduits, à TA, 1,78 g (9,9 mmol) d'éther d'oxime 8, 19 ml de THF anhydre et 99,5 ml d'une solution 2M de borane méthylsulfure dans le THF. Le mélange est ensuite chauffé au reflux pendant 16h. La réaction est ensuite arrêtée, le mélange laissé revenir à TA avant que 100 ml de MeOH soient ajoutés goutte à goutte prudemment, à 0°C tant que la mousse se forme puis à TA. Le mélange est évaporé sous PR pour donner environ 2,8 g d'une huile jaune qui est reprise dans 30 ml d'une solution HCI 5 à 6N dans l'isopropanol. Le mélange est porté au reflux pendant 1 h puis laissé à TA pendant la nuit. Après évaporation sous PR, le résidu obtenu est repris avec 80 ml de HCI 1 N puis extrait avec le diéthyle éther (3X20 ml). La phase aqueuse est traitée avec de l'ammoniaque aqueux à 30% jusqu'à obtention d'un pH de 12,5-13, ie 12 ml (phase aqueuse violet pâle) puis à nouveau extraite avec 3X20 ml d'éther. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées à sec sous PR pour donner 760 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 90/10. Le composé 9 est obtenu sous la forme d'une huile jaune pâle (301 mg, 20%). LCMS (A2) : ES m/z= 152 [M+H]+;tR=0,27 min30 Composé 10: (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3-{4-[(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propylamino)-méthyl]-phenyl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-l3-ène-2, 5,9,12-tétraone c A une solution, purgée à l'argon, de 25 mg (35 pmol) du composé 2 dans 3,1 ml de DMF anhydre sont successivement ajoutés, à TA, 9,8 pl (70 pmol) de TEA et 6,3 mg (42 pmol) du composé 9. L'agitation est poursuivie sous agitation à 40°C. Après 72h de réaction, il reste du composé 2 de départ, sont alors ajoutés 9,8 pl (70 pmol) de TEA et 6,3 mg (42 pmol) de l'amine 9. Après 72h supplémentaires à 40°C, il reste encore du composé 2 : 6,3 mg (42 pmol) de l'amine 9 et l'agitation poursuivie à 40°C. Un jour plus tard, la réaction est complète. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 2X10 ml d'eau, 10 ml d'une solution saturée de NaHCO3 et 10 ml d'une solution saturée de NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 30 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 93/7. Le composé 10 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (23,3 mg, 81%). CCM (DCM 90/ MeOH 10) : Rf=0,55 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) b (ppm) 0,76 à 0,81 (m, 6 H); 1,02 (s, 3 H); 1,07 (d, J=6,9 Hz, 3 H); 1,13 (s, 3 H); 1,27 à 1,33 (m, 7 H); 1,52 à 1,63 (m, 2 H); 1,82 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H); 2,06 (s large, 1 H); 2,25 à 2,34 (m, 1 H); 2,37 (s, 3 H); 2,57 (s, 2 H); 2,66 à 2,76 (m, 2 H); 2,97 à 3,06 (m, 3 H); 3,33 à 3,38 (m, 1 H); 3,75 (s, 2 H); 3,83 (s, 3 H); 3,88 (d, J=1,6 Hz, 1 H); 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,4 Hz, 1 H); 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H); 5,12 (dd, J=5,8 et 11,3 Hz, 1 H); 5,82 (dd, J=1,5 et 15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,2 Hz, 1 H); 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J=1,9 et 8,5 Hz, 1 H); 7,23 (dd, J=2,6 et 9,5 Hz, 1 H); 7,26 (d, J=8,2 Hz, 2 H); 7,30 (d, J=1,9 Hz, 1 H); 7,35 (d, J=8,2 Hz, 2 H); 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 832 [M + H]+ ; m/z = 830 [M - H]- ; tR = 0,96 min. Exemple 2: (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-Chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3 {4-[(2-mercapto-2-méthyl-propylamino)-méthyl]-phényl}-oxiranyl)-éthyl]-6, 6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone S-S Le produit 10 (10,6 mg ; 12,8 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (1,5 ml) / eau (1,26 ml). Le chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (9,1 mg, 31,9 pmol) est ensuite additionné et le mélange est agité pendant 2h30 à TA. Le mélange est dilué dans 15 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aqueuse saturée de NH4CI (5 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2 à 92/8. Le composé Ex2 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,4 mg ; 63%). CCM (DCM 90/MeOH 10) : Rf=0,47 ; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) 0,80 à 0,86 (m, 6 H); 1,06 (s, 3 H); 1,11 (d, J=6,9 Hz, 3 H); 1,18 (s, 3 H); 1,31 à 1,38 (m, 7 H); 1,57 à 1,67 (m, 2 H); 1,87 (sxt, J=6,8 Hz, 1 H); 2,29 à 2,38 (m, 1 H); 2,56 (s, 2 H); 2,70 à 2,80 (m, 2 H); 3,00 à 3,11 (m, 3 H); 3,39 à 3,43 (m, 1 H); 3,82 (s, 2 H); 3,87 (s, 3 H); 3,92 (d, J=1,9 Hz, 1 H); 4,31 (ddd, J=3,6 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H); 4,97 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H); 5,17 (dd, J=5,8 et 11,3 Hz, 1 H); 5,86 (dd, J=1,4 et 15,1 Hz, 1 H); 6,54 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,1 Hz, 1 H); 7,11 (d, J=8,7 Hz, 1 H); 7,23 (dd, J=1,9 et 8,7 Hz, 1 H); 7,27 (dd, J=2,7 et 9,6 Hz, 1 H); 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2 H); 7,34 (d, J=1,9 Hz, 1 H); 7,42 (d, J=8,0 Hz, 2 H); 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 786 [M + H]+ ; m/z = 784 [M - H]- ; tr = 0,92 min. Exemple 3 : (E)-(3S,1 OR,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R,3R)- 3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-d iméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tetraone HS Composé 11 : 4-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle H Ny O A une solution, purgée à l'argon, de 1-Boc-pipérazine (1,0 g, 5,37 mmol) dans le THF anhydre (20 ml) sont ajoutés le 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol). Le mélange est agité pendant 20 min à TA puis un nouvel ajout de 2-(méthyldithio)-isobutyraldéhyde (5,37 mmol) et l'isopropoxyde de titane (IV) (6,71 mmol) est réalisé. L'agitation est poursuivie pendant 2 h puis 12 ml d'éthanol sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 5 min. Sont ajoutés du cyanoborohydrure de sodium (5,37 mmol), le mélange est agité pendant 1 h avant que soient ajoutées 5,37 mmoles supplémentaires de cyanoborohydrure de sodium. L'agitation est poursuivie pendant 1 h. Le mélange est concentré à sec puis repris dans l'AcOEt. De l'eau est ajoutée entraînant la formation d'un précipité qui est filtré sur verre fritté, rincé avec de l'AcOEt et de l'eau. Le solide obtenu est solubilisé dans une solution aqueuse HCI 1 N (50 ml), le milieu est neutralisé avec une solution aqueuse NaOH 5N puis extrait au DCM. Les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées et concentrées sous PR. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 97/3. Le composé 11 est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (650 mg ; 40%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) (ppm) : 1,26 (s, 6 H) ; 1,39 (s, 9 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,42 (s, 2H) ; 2,44 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,27 (m partiellement masqué, 4 H). LCMS (Al) : ES m/z = 321 [M + H]+ ; m/z = 265 pic de base ; tR = 3,02 min. Composé 12 : chlorhydrate de 1-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazine N\ /O ~/NH CIH o 11 12 A une solution du composé 11 (322 mg, 1,01 mmol) dans le dioxane (13 ml) est ajoutée une solution HCI 4M dans le.dioxane (5 ml). L'agitation est poursuivie à TA pendant 16 h. Le mélange est filtré sur verre fritté, le solide obtenu est rincé avec du dioxane pour donner le composé 12 (231 mg, 90%) sous la forme d'une poudre blanche. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) b (ppm) : 1,31 (s large, 6 H) ; 2,42 (s, 3 H) ; 2,59 à 3,38 (m très étalé, 10 H) ; 8,78 (m étalé, 2 H). LCMS (A2) : ES m/z = 221 [M + H]+ ; tR = 0,46 min. Composé 13 : (E)-(3S,10R, 165)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1-( (2R,3R)-3-{4-[4-(2-méthyl-2-méthyldisulfanyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl] -phényl}-oxiranyl)-éthyl]-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-1 3-ène-2,5,9,12-tetraone CI A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (15,02 mg, 20,93 pmol) dans le DMF anhydre (0,9 ml) est ajoutée une solution du composé 12 (25,12 pmol) et de TEA (52,3 pmol) dans le DMF (1 ml). Le mélange est agité à 40°C sous argon. Après 24 h de réaction, 25,12 pmol du composé 12 et 31,4 pmol de TEA sont ajoutés. Après 24 h supplémentaires à 40°C, la réaction est terminée. Le mélange est dilué avec de l'AcOEt (6 ml) et lavée avec de l'eau (2x6 ml), une solution saturée de NaHCO3 (6 ml) et une solution saturée de NaCI (6 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4i celle-ci est filtrée puis évaporée sous PR pour donner 46 mg de brut. Ce résidu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 9515. Le composé 13 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (5,2 mg, 28%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) : 0,76 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,4 Hz, 3 H) ; 1,01 (s, 3 H) ; 1,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,25 (s, 6 H) ; 1,27 à 1,33 (m, 1 H) ; 1,51 à 1,63 (m, 2 H) ; 1,76 à 1,85 (m, 1 H) ; 2,23 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,37 (m, 4 H) ; 2,39 (s, 3 H) ; 2,41 (s, 2 H) ; 2,53 à 2,56 (m, 4 H) ; 2,63 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,82 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,26 (ddd, J=3,8 et 7,8 et 11,3 Hz, 1 H) ; 4,92 (dd, J=3,8 et 9,8 Hz, 1 H) ; 5,07 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,06 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H). LCMS (Al) : ES m/z = 901 [M + H]+ ; m/z = 451 pic de base ; tR = 4,33 min. Exemple 3: (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)-3-{4-[4-(2-mercapto-2-méthyl-propyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2, 5,9,12-tetraone \S,S~N I (,,N Le produit 13 (5,7 mg ; 6,3 pmol) est placé en solution dans un mélange éthanol (0,8 ml) / eau (0,5 ml). Le chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (4,54 mg, 15,83 pmol) est ensuite additionné et le mélange est agité 1 h à TA. Le mélange est dilué dans 7 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aqueuse saturée de NH4CI (7 ml). Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut obtenu est finalement purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 95/5. Le composé Ex3 est obtenu sous forme d'un solide blanc (2,95 mg ; 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) : 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1,02 (s, 3 H) ; 1,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,27 (s, 6 H) ; 1,29 à 1,34 (m, 1 H) ; 1,52 à 1,63 (m, 2 H) ; 1,82 (m, 1 H) ; 2,29 (m, 1 H) ; 2,37 (s, 2 H) ; 2,39 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,57 à 2,62 (m, 4 H) ; 2,65 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,96 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,34 (m, partiellement masqué, 1 H) ; 3,46 (s, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,88 (d, J=2,2 Hz, 1 H) ; 4,27 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,5 Hz, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,12 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,49 (ddd, J=3,7 et 11,5 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,18 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,21 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,36 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (Al) : ES m/z = 855 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + 2H]2+ pic de base ; tR = 4,13 min. Exemple 4 : hu2H11-SPDB-Ex1 Selon la méthode générale, 10,4 mg (0,071 pmol, 1,174 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration initiale de 8,86 mg/mi sont traités par 7 équivalents de l'ester N-hydroxysuccinimidyle de l'acide 4-(2-pyridyldithio)butanoïque (0,16 mg, 0,496 pmol) en solution dans 34,2 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 8 mg/ml dans le mélange. Après purification, on obtient 2,2 ml d'anticorps hu2H11 modifiés à une concentration de 4,28 mg/mi (9,42 mg, 91%) avec en moyenne 4,68 molécules de pyridyldisulfures par anticorps. Selon la méthode C, 1,68 ml (7,2 mg, 0,049 pmol) d'anticorps hu2H11 modifié est traité avec 1,03 mg de (E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1- ((2R,3R)-3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl] -phényl}-oxiranyl)-éthyl]- 6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ène-2,5,9,12-tétraone (composé Ex1, 1,148 pmol) en solution dans 101,2 pl de DMA. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl. On obtient alors 1,5 ml de conjugué à une concentration de 1,1 mg/ml avec en moyenne 3,2 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 99,9%. Exemple 5 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl] -3-iso buty l-6, 6-d i m éthyl-2, 5, 9,12-tétraoxo-1,4-d ioxa-8,11-d Taza-cyc lo hexadec-13-en-16-y l}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Composé 14 : 4-méthoxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle 0 0 r'N~O O rNOk HN) O). NJ 14 200 mg (1,07 mmol) de pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle sont placés en solution dans l'acétonitrile anhydre (10 ml). La TEA (1,07 mmol) puis le bromoacétate de méthyle (1,61 mmol) 15 sont ensuite ajoutés. La suspension blanche est agitée 48 h à TA avant ajout d'une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (10 ml). La phase aqueuse est extraite par du DCM (3X10 ml), les phases organiques sont réunies, lavées par une solution aqueuse saturée de NaCI et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit brut est obtenu. Ce brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 20 98/2. Le produit attendu 14, une huile incolore est alors obtenu (174,8 mg ; 63%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,66 ; RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) : 1,39 (s, 9 H) ; 2,40 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,28 à 3,33 (m partiellement masqué, 4 H) ; 3,61 (s, 3 H). Composé 15 : chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle 10 25 CIH O (NH ~~NJ 15 O Le composé 14 (174 mg ; 0,67 mmol) est placé en solution dans le dioxane anhydre (5 ml) et une solution HCI 4 M dans le dioxane (0,02 mmol) est ajoutée. Le mélange est agité 5 h à TA puis la suspension est filtrée sur verre fritté. Le solide ainsi obtenu est lavé par du dioxane (2 ml) puis par de l'éther isopropylique (2 ml) avant d'être séché sous vide. Un solide beige, 15, est obtenu 30 (131 mg ; 100%). RMN1H (300 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) : 2,88 à 2,97 (m, 4 H) ; 3,09 à 3,19 (m, 4 H) ; 3,53 à 3,59 (m, 2 H) ; 3,65 (s, 3 H) ; 8,65 à 9,22 (m étalé, 2 H). Composé 16 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl} -pipérazin-1-yl)-acétate de méthyle HO 7 16 Le dérivé 1 (20 mg ; 28,6 pmol) est placé en solution dans le DCM anhydre (1 ml) et la TEA (71,5 pmol) puis le chlorure de méthanesulfonyle (45,8 pmol) sont ajoutés. Après 12 h à TA, le produit 2 formé n'est pas isolé. La TEA (85,7 pmol) puis le chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate de méthyle 15 (42.8 pmol) sont ajoutés. Le mélange est agité 72 h supplémentaires à TA avant que du DMF anhydre (1 ml) et Nal (30 pmol) ne soient ajoutés. Le mélange est agité 48 h à 45°C avant d'être dilué par de l'AcOEt (5 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x2 ml), par une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (2 ml) et par une solution aqueuse saturée de NaCI (2 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 98/2. Le composé 16 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (8,2 mg ; 34%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,45 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) : 0,77 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,1 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=7,1 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,27 à 1,32 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,60 (m, 2 H) ; 1,74 à 1,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,30 (m, 1 H) ; 2,37 (s large, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,06 (m, 3 H) ; 3,18 à 3,52 (m, partiellement masqué, 9 H) ; 3,60 (s, 3 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=2,0 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,31 (m, 1 H) ; 4,91 (dd, J=3,8 et 9,9 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,3 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,3 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,33 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (Al) : ES m/z = 839 [M + H]+ ; m/z = 420 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 837 [M - Hr ; m/z = 883 [M + HCO2H - H] - (pic de base) ; tR = 3,57 min. Composé 17 : bromoacétate d'allyle Io 17 B J~ 'Br Br~O~ 288 mg (4,95 mmol) d'alcool allylique sont mis en solution dans 25 ml de DCM. La solution est refroidie à 0°C puis 760 pl (5,45 mmol) de TEA et 3,03 mg (24,8 pmol) de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité à 0°C puis 1,0 g (4,95 mmol) de bromure de bromoacétyle sont ajoutés. La réaction est poursuivie pendant la nuit à TA. On ajoute de l'eau au mélange ; la phase aqueuse est lavée avec du DCM. Les fractions organiques sont rassemblées, lavées avec de l'eau et une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit 17 est obtenu (747 mg, 84%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) : 4,18 (s, 2 H) ; 4,64 (td, J=1,5 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,25 (qd, J=1,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,35 (qd, J=1,5 et 17,2 Hz, 1 H) ; 5,92 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,2 Hz, 1 H). Composé 18 : 4-allyloxycarbonylméthyl-pipérazine-1-carboxylate de tert-butyle oyo,y CN J N H no .,N)L O O A une solution de 200 mg (1,07 mmol) de 1-Boc-pipérazine dans 8 ml d'acétonitrile sont ajoutés 150 pl (1,07 mmol) de TEA et 250 mg (1,40 mmol) de bromoacétate d'allyle 17. Le mélange est agité à TA pendant la nuit. La réaction est arrêtée par ajout d'une solution saturée de NaHCO3. Le mélange est extrait avec l'AcOEt (3 fois) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec une solution saturée de NaCl et séchées sur MgSO4. Après filtration et évaporation du solvant sous PR, le produit brut est obtenu. Ce brut est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le produit attendu 18 est obtenu sous la forme d'une huile jaune (314 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 3 (ppm) : 1,39 (s, 9 H) ; 2,45 à 2,48 (m, 4 H) ; 3,25 à 3,34 (m partiellement masqué, 6 H) ; 4,57 (td, J=1,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,22 (qd, J=1,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1,5 et 17,1 Hz, 1 H) ; 5,83 à 5,98 (m, 1 H). LCMS (A2):ES m/z = 285 [M + H]+ ; m/z = 229 pic de base ; tR = 0,51 min. Composé 19 : chlorhydrate du pipérazin-1-yl-acétate d'allyle INI~O/ foi ( INH HCI 0)N./ /\ 18 19 314 mg (1,10 mmol) du composé 18 sont dissous dans 12,6 ml de dioxane puis 5,5 ml (22.0 mmol) d'une solution HCI 4M dans le dioxane sont ajoutés. L'agitation est poursuivie pendant la nuit à TA. Le mélange est concentré à sec pour donner le composé attendu 19 sous la forme d'une huile jaune (260 mg ; 100%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 3 (ppm) : 2,79 à 2,88 (m, 4 H) ; 3,07 à 3,15 (m, 4 H) ; 3,48 à 3,51 (m, 2 H) ; 4,60 (td, J=1,5 et 5,6 Hz, 2 H) ; 5,23 (qd, J=1,5 et 10,3 Hz, 1 H) ; 5,32 (qd, J=1,5 et 7,4 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,98 (m, 1 H) ; 8,74 (s large, 2 H). LCMS (A2): ES m/z = 185 [M + H]+ ; tR=0,19 min. Composé 20 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,1 OR,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9, 12-tétraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzyl}-pipérazin-1-yl)-acétate d'allyle cl A une solution, purgée à l'argon, du composé 2 (28,3 mg, 39,5 pmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) est ajoutée une solution du composé 19 (118,5 pmol) et de TEA (198 pmol) dans l'acétonitrile anydre (1 ml). L'agitation est poursuivie pendant 24 h à 40°C. Le mélange est dilué dans de l'AcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (10 ml), par une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aqueuse saturée de NaCI (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 98/2. Le composé 20 est obtenu sous la forme d'un solide blanc (19,2 mg ; 56%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) S (ppm) : 0,75 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 0,77 (d, J=6,3 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,25 à 1,33 (m, 1 H) ; 1,50 à 1,61 (m, 2 H) ; 1,74 à 1,84 (m, 1 H) ; 2,27 (dt, J=11,3 et 14,2 Hz, 1 H) ; 2,32 à 2,42 (m, 4 H) ; 2,52 (m partiellement masqué, 4 H) ; 2,64 à 2,74 (m, 2 H) ; 2,94 à 3,05 (m, 3 H) ; 3,25 (s, 2 H) ; 3,32 à 3,35 (m partiellement masqué, 1 H) ; 3,40 à 3,48 (m, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,6 Hz, 1 H) ; 4,25 (ddd, J=3,7 et 8,0 et 11,6 Hz, 1 H) ; 4,56 (td, J=1,5 et 5,5 Hz, 2 H) ; 4,91 (dd, J=3,7 et 9,7 Hz, 1 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,21 (qd, J=1,5 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,80 (d, J=16,2 Hz, 1 H) ; 5,86 à 5,95 (m, 1 H) ; 6,47 (ddd, J=3,8 et 11,2 et 15,2 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,19 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 865 [M + H]+ ; m/z = 433,5 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 863 [M - H] ; m/z = 909 [M + HCO2H - H]- ; tR = 0,92 min. Composé 21 : acide (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl} -pipérazin-1-yl)-acétique A une solution sous argon du composé 20 (12,8 mg, 14,8 pmol) dans le THF anhydre est ajoutée le tétrakis(triphénylphospine)palladium (1,48 pmol) et la morpholine (148 pmol). Après 3 h de réaction, le mélange est concentré à sec et repris dans 5 ml de DCM. La phase organique est lavée par une solution de 1 ml HCI O,IN dans 3 ml d'eau (pH~5), séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour donner le composé 21 (6,7 mg, 55%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) S (ppm) : 0,76 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 0,78 (d, J=6,0 Hz, 3 H) ; 1,00 (s, 3 H) ; 1,05 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,12 (s, 3 H) ; 1,28 (m, 1 H) ; 1,52 à 1,59 (m, 2 H) ; 1,76 à 1,84 (m, 1 H) ; 2,21 à 2,32 (m, 1 H) ; 2,42 (d, J=6,6 Hz, 4 H) ; 2,58 à 2,76 (m, 6 H) ; 2,97 à 3,09 (m, 3 H) ; 3,14 (s large, 2 H) ; 3,33 (m masqué, 75 1 H) ; 3,46 (s large, 2 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 3,87 (d, J=1,8 Hz, 1 H) ; 4,20 à 4,29 (m, 1 H) ; 4,89 à 4,93 (m, 1 H) ; 5,06 à 5,14 (m, 1 H) ; 5,80 (d, J=15,2 Hz, 1 H) ; 6,43 à 6,50 (m, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,5 Hz, 1 H) ; 7,17 (dd, J=2,2 et 8,5 Hz, 1 H) ; 7,20 à 7,32 (m, 6 H) ; 8,34 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 825 [M + H]+ ; m/z = 413 [M + 2H]2+ (pic de base) ; m/z = 823 [M - H]- ; tR = 0,86 min. Exemple 5 : (4-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl] -3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tétraoxo-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-en-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl} -pipérazin-1-yl)-acétate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle 0 O LN I~ O~yO HN~,,,,• CI O O LN O~O O HNCl Exemple 6 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxybenzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzylamino} -éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5- dioxo-pyrrolidin-//1--yle oNfio H ' O~O O HN CI o Composé 22 : 3-(2-{2-[2-(2-tert-butoxycarbonylamino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy) -propanoate d'allyle H H O 22 o A une solution d'acide Boc-15-amino-4,7,10,13-tétraoxapentadecanoïque (50 mg, 137 pmol) dans 1,25 ml de DCM sont successivement ajoutés le chlorhydrate d'EDCI (164,2 pmol), la DMAP (13,7 pmol) et l'alcool allylique (164,2 pmol). Le mélange est agité à TA pendant 16h puis évaporé à sec. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 100/0 à 95/5. Le composé 22 est obtenu sous la forme d'une huile incolore (37,5 mg ; 67%). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 6 (ppm) : 1,37 (s, 9 H) ; 2,57 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,06 (q, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,37 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 3,44 à 3,53 (m, 12 H) ; 3,64 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,55 (td, J=1,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,20 (qd, J=1,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,90 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 6,70 (t large, J=6,1 Hz, 1 H). LCMS (A2) ES m/z = 406 [M + H]+ ; m/z = 428 [M + Na]+ ; m/z = 306 pic de base ; tR = 0,91 min.30 Composé 23 : chlorhydrate du 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle H C 1 /~/ C .,/, ~\/ C 0,"..,ä/ N o 22 00CNH, Il II HCI o 23 A une solution du composé 22 (37,5 mg, 92,5 pmol) dans 2 ml de dioxane sont ajoutés 460 pl (1,85 mmol) d'une solution d'acide chlorhydrique 4M dans le dioxane. L'agitation est poursuivie à température ambiante pendant la nuit puis le milieu réactionnel est évaporé à sec pour donner le composé 23 sous la forme d'une huile incolore (31 mg, quantitatif). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) (ppm) : 2,58 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 2,96 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,53 (m, 8 H) ; 3,55 à 3,58 (m, 4 H) ; 3,60 (t, J=5,4 Hz, 2 H) ; 3,65 (t, J=6,1 Hz, 2 H) ; 4,56 (td, J=1,6 et 5,4 Hz, 2 H) ; 5,21 (qd, J=1,6 et 10,5 Hz, 1 H) ; 5,30 (qd, J=1,6 et 17,3 Hz, 1 H) ; 5,91 (tdd, J=5,4 et 10,5 et 17,3 Hz, 1 H) ; 7,91 (m étalé, 3 H). LCMS (A2) : ES m/z = 306 [M + H]+ ; tR = 0,42 min. Composé 24 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)- oxiranyl]-benzylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate d'allyle H 0~~0^iN O CI 2 24 Composé 25: acide (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,IOR,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxybenzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn-16yl}-éthyl)-oxi ranyl]-benzylami no}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïque H O H O 24 Exemple 6 : (2-{2-[2-(2-{4-[(2R,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S, I OR,16S)-10-[3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9, 12-tetraoxo-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl) -oxiranyl]-benzyl amino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-d i oxo- pyrrolid in- 1 -yle ONO HO Omo^ ^i0~~ ^/N O O R HN Cl O Omo^ ^i0~~ i~N O O MN Cl O O 25 O• H O� I 8 O O ,.~... Exemple 7 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2S,3R)-3-((S)-1-{(E)-(1 OR,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxybenzyl)-3-isobutyl-6,6-d iméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-d ioxa-8,11-d iaza-cyclohexadec-13-èn-16-yi}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl}-p1péraz1n-1-yl)-1, 1-diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]-acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy} -éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle o S H Composé 26 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-bromo-acétylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy) -propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle o 0 26 H A une solution d'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propionique (671 mg, 2,53 mmol) dans le DCM (10 ml) est ajoutée une solution du bromoacétate de 2,5-dioxopyrrolidin-1-yle (2,53 mmol) dans 4,7 ml de DCM. L'agitation est poursuivie pendant 15 min à température ambiante puis le DCC est ajouté au mélange. Après 4 h de réaction, le mélange est filtré sur verre fritté puis le filtrat est évaporé et purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 9416. L'huile obtenue (800 mg) est à nouveau purifiée par chromatographie sur gel de silice greffée cyano, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1. On obtient le composé 26 sous la forme d'une huile incolore (611 mg, 50%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) S (ppm) : 2,81 (s, 4 H) ; 2,92 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,23 (q, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,43 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,48 à 3,55 (m, 12 H) ; 3,72 (t, J=5,9 Hz, 2 H) ; 3,85 (s, 2 H) ; 8,30 (t large, J=5,9 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 483 [M + H]+ ; m/z = 481 [M - H]- ; tR = 0,51 min. Composé 7 : (E)-(3S,1 OR,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-16-[(S)-1-( (R)-3-{4-[4-(4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl] -phényl}-oxiranyl)-éthyl]-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-13-ene-2,5,9, 12-tétraone A une solution purgée à l'argon du composé 2 (19,8 mg, 27,6 pmol) dans l'acétonitrile anhydre (2,5 ml) sont successivement ajoutés la TEA (138 pmol) et le chlorhydrate de la 4-méthyl-4-méthyldisulfanyl-1-pipérazin-1-yl-pentan-1-one 6 (83 pmol). L'agitation est poursuivie à 40°C pendant 24 h puis le mélange est dilué dans de l'AcOEt (10 ml). La phase organique est lavée par de l'eau (2x 10 ml), par une solution aqueuse saturée de NaHCO3 (10 ml) et par une solution aqueuse saturée de NaCI (10 ml). Après séchage sur MgSO4 et filtration, les solvants sont évaporés sous PR. Le brut de la réaction est purifié par chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Une poudre blanche, 7, est obtenue (19,4 mg ; 75%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,6 ; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) i5 (ppm) 0,75 - 0,81 (m, 6 H); 1,01 (s, 3 H); 1,05 (d, J=6,8 Hz, 3 H); 1,12 (s, 3 H); 1,26 (s, 6 H); 1,28 - 1,33 (m, 1 H); 1,52 - 1,61 (m, 2 H); 1,76 - 1,83 (m, 2 H); 2,27 - 2,38 (m, 4 H); 2,39 (s, 3 H); 2,64 - 2,74 (m, 2 H); 2,95 - 3,05 (m, 2 H); 3,24 - 3,34 (m, 6 H); 3,44 (br. s., 4 H); 3,49 (s, 2 H); 3,81 (s, 3 H); 3,88 (d, J=1,7 Hz, 1 H); 4,22 - 4,29 (m, 1 H); 4,92 (dd, J=9,9, 3,5 Hz, 1 H); 5,08 - 5,15 (m, 1 H); 5,81 (d, J=14,2 Hz, 1 H); 6,48 (ddd, J=15,2, 11,3, 3,5 Hz, 1 H); 7,05 (d, J=8,6 Hz, 1 H); 7,17 (dd, J=8,4, 2,3 Hz, 1 H); 7,22 (d, J=9,3 Hz, 1 H); 7,25 - 7,34 (m, 5 H); 8,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H). LCMS (AI): ES m/z = 943 [M+H]+; m/z = 941 [M-H]-;tR=4,03 min. Nota : le composé 7 peut être préparé également à partir de G=OMs (voir exemple 1) Composé Ex1 : (E)-(3S,1OR,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy-benzyl)-3-isobutyl-16-[(S)-1-((2R, 3R)- 3-{4-[4-(4-mercapto-4-méthyl-pentanoyl)-pipérazin-1-ylméthyl]-phényl} -oxiranyl)-éthyl]-6,6-diméthyl-1,4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexadec-l3-ene-2, 5,9,12-tétraone ci Le composé 7 (17,9 mg ; 18,97 'mol) est placé en solution dans un mélange éthanol (2,2 ml) / eau (1,8 ml) et le mélange se trouble. Le chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (47,4 'mol) est ensuite additionné et le mélange est agité 3 h à TA, puis dilué par ajout d'AcOEt (20 ml) et la phase organique est lavée par un mélange 1/1 d'eau et d'une solution aqueuse saturée de NH4CI (20 ml) puis par 20 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le produit Ex1 est obtenu sous forme d'un solide blanc (15,6 mg ; 92%). CCM (DCM 90 / MeOH 10) : Rf = 0,56 ; RMN'H (500 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) 0,76 - 0,81 (m, 6 H); 1,01 (s, 3 H); 1,06 (d, J=6,8 Hz, 3 H); 1,13 (s, 3 H); 1,24 (s, 6 H); 1,27 - 1,31 (m, 1 H); 1,56 - 1,64 (m, 2 H); 1,73 - 1,85 (m, 3 H); 2,26 - 2,33 (m, 3 H); 2,36 - 2,45 (m, 4 H); 2,63 - 2,75 (m, 2 H); 2,95 - 3,06 (m, 3 H); 3,34 - 3,36 (m, 1 H); 3,42 - 3,51 (m, 6 H); 3,82 (s, 3 H); 3,89 (s, 1 H); 4,22 - 4,29 (m, 1 H); 4,92 (dd, J=9,8, 3,4 Hz, 1 H); 5,12 (dd, J=10,8, 4,9 Hz, 1 H); 5,81 (d, J=15,2 Hz, 1 H); 6,48 (ddd, J=15,0, 11,4, 3,4 Hz, 1 H); 7,06 (d, J=8,3 Hz, 1 H); 7,18 (dd, J=8,3, 1,5 Hz, 1 H); 7,24 (d, J=9,8 Hz, 1 H); 7,26 --7,36 (m, 5 H); 8,37 (d, J=7,8 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 897 [M + H]+ ; m/z = 895 [M - H]- ; tR = 0,97 min. Exemple 7 : 3-(2-{2-[2-(2-{2-[4-(4-{4-[(2S,3R)-3-((S)-1-{(E)-(10R, 16S)-10-(3-chloro-4-méthoxy- benzyl)-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-dioxa-8, 11-diaza-cyclohexadec-13-èn-16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyl} -pipérazin-l-yl)-1,1-diméthyl-4-oxo-butylsulfanyl]-acétylamino}-éthoxy) -éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle Ex7 A une solution, purgée à l'argon, du composé Ex1 (15,6 mg, 17,8 pmol) dans l'acétonitrile anhydre (1,0 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (19.12 pmol) et le composé 26 (19,12 pmol). L'agitation est poursuivie à TA pendant 4 h puis 29,5 pmol supplémentaires de DIPEA sont ajoutés et l'agitation poursuivie pendant 16h. Le lendemain, sont ajoutés 29,5 pmol supplémentaires de composé 26 et de DIPEA et le mélange est chauffé à 50°C. Après 24h supplémentaires de réaction, 22,6 pmol de composé 26 et 29,5 pmol de DIPEA sont ajoutés et le mélange chauffé à 60°C pendant 24h supplémentaires. Le chauffage est alors arrêté et l'agitation poursuivie à TA pendant 64 h. Le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt et la phase organique est lavée par 2X10 ml d'eau puis par 10 ml d'une solution saturée en NaCl. Après séchage de la phase organique sur MgSO4, filtration et évaporation des solvants sous PR, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange DCM/méthanol 99/1 à 90/10. Le produit Ex7 est obtenu sous forme d'un solide incolore (9,2 mg ; 41%). RMN 'H (500 MHz, DMSO-d6) 5 (ppm) : 0,77 à 0,82 (m, 6 H) ; 1,02 (s, 3 H) ; 1,06 (d, J=6,9 Hz, 3 H) ; 1,13 (s, 3 H) ; 1,23 (s, 6 H) ; 1,26 à 1,35 (m, 1 H) ; 1,52 à 1,64 (m, 2 H) ; 1,68 à 1,77 (m, 2 H) ; 1,78 à 1,86 (m, 1 H) ; 2,26 à 2,33 (m, 3 H) ; 2,35 à 2,41 (m, 4 H) ; 2,68 à 2,76 (m, 2 H) ; 2,82 (s, 4 H) ; 2,93 (t, J=6.0 Hz, 2 H) ; 2,96 à 3,07 (m, 4 H) ; 3,13 (s, 2 H) ; 3,20 (q, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,33 (m, 1 H) ; 3,38 à 3,57 (m, 18 H) ; 3,73 (t, J=5,8 Hz, 2 H) ; 3,83 (s, 3 H) ; 3,89 (s, 2 H) ; 4,27 (m, 1 H) ; 4,93 (dd, J=3,8 et 10,0 Hz, 1 H) ; 5,13 (m, 1 H) ; 5,82 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,49 (ddd, J=3,8 et 11,1 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,07 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,15 à 7,37 (m, 7 H) ; 8,01 (t, J=5,8 Hz, 1 H) ; 8,35 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1299 [M + H]+ ; m/z = 650 [M + 2H]2+ ; m/z = 1297 [M - H]- ; tR = 0,92 min. Exemple 8 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxybenzyl]-3-isobutyl-6,6-d iméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1,4-d ioxa-8,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn- 16-yl}-éthyl)-oxiranyl]-benzyloxycarbonylami no}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoate de 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yle oNo o Composé 28 : carbonate de 4-((2S,3R)-3-{(S)-1-[(E)-(3S,10R,16S)-10-(3-chloro-4-méthoxybenzyl) -3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1 ,4-dioxa-8,1 1-d iaza-cycl ohexadec- 1 3-èn- 1 6-30 yl]-éthyl}-oxiranyl)-benzyle et de 4-nitrophényle O N..O 27 Le dérivé 27 (20 mg ; 28,6 pmol, préparé selon Al-awar R.S., et al., J.Med.Chem. 2003, 46, 2985-3007) est placé en solution dans le DCM anhydre (0,3 ml), la solution est purgée à l'argon avant que soient ajoutés la TEA (40 pmol) puis le chloroformate de 4-nitrophényle (32,32 pmol). Après 3h30 d'agitation à TA, le mélange est hydrolysé et dilué dans 7 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée à l'eau puis avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 28 sous la forme d'un solide blanc (23 mg, 93%). LCMS (A3):ESm/z=864[M+H]+;m/z= 908 [M+HCO2H-HF;tR=1,43min. Composé 29 : acide 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxybenzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn-16yl}-éthyl)-oxi ranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propanoïq ue 81 Hu CI I A une solution, purgée à l'argon, du composé 28 (23 mg, 26,6 pmol) dans l'acétonitrile anhydre (1,6 ml) sont successivement ajoutés l'acide 3-(2-{2-[2-(2-amino-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy)-propionique (39,9 pmol) et la TEA (53,2 pmol). Après 24 h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt. La phase organique est lavée avec 10 ml d'eau contenant 250 pl d'HCI 0,IN (pH4). La phase aqueuse est extraite avec 10 ml d'AcOEt (2 fois) ; les phases organiques sont rassemblées, lavées avec 10 ml d'eau puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée à sec pour donner le composé 29 sous la forme d'un solide jaune très pâle (18,5 mg, 70%). LCMS (A3) : ES m/z = 990 [M + H]+ ; m/z = 988 [M - H]- ; tR = 1,32 min. Exemple 8 : 3-(2-{2-[2-(2-{4-[(2S,3R)-3-((S)-1-{(E)-(3S,10R,16S)-10- [3-chloro-4-méthoxy-benzyl]-3-isobutyl-6,6-diméthyl-2,5,9,12-tetraoxo-1, 4-dioxa-8,11-diaza-cyclohexa-dec-13-èn-16-y1}-éthyl)- oxiranyl]-benzyloxycarbonylamino}-éthoxy)-éthoxy]-éthoxy}-éthoxy) -propanoate de 2,5-dioxo- pyrrolidin-1-yle 0 O O O HN CI O O~^O^iO~~Oi~N O O O HN CI o o 0 O No � _~ 11 Ex8 O' `H O � q A une solution, purgée à l'argon, du composé 29 (18,5 mg, 18,6 pmol) dans le THF (1,5 ml) sont successivement ajoutés la DIPEA (55,8 pmol) et le carbonate de N,N'-disuccinimidyle (37,2 pmol). Après 19h d'agitation à TA, le mélange est dilué dans 10 ml d'AcOEt, lavé avec 10 ml d'eau (2 fois) puis 10 ml d'une solution saturée de NaCl, séché sur MgSO4 et évaporé à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice en éluant avec un mélange heptane/AcOEt 100/0 à 0/100 contenant 10% d'isopropanol. Le produit Ex4 est obtenu sous forme d'un solide blanc (6,08 mg ; 30%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) 8 (ppm) : 0,83 à 0,88 (m, 6 H) ; 0,97 (d, J=7,1 Hz,3H); 1,02 (s,3H); 1,15 (s,3H); 1,47 à 1,56 (m, 1 H); 1,58 à 1,68 (m,2H); 1,82 à 1,90 (m, 1 H) ; 2,39 à 2,47 (m, 1 H) ; 2,60 à 2,66 (m, 1 H) ; 2,71 (dd, J=11,5 et 14,4 Hz, 1 H) ; 2,80 (s, 4 H) ; 2,91 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 2,94 à 3,07 (m, 3 H) ; 3,14 (q, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,37 à 3,56 (m partiellement masqué, 15 H) ; 3,71 (t, J=6,0 Hz, 2 H) ; 3,79 (m, 1 H) ; 3,81 (s, 3 H) ; 4,27 (ddd, J=3,8 et 8,0 et 11,3 Hz, 1 H) ; 4,96 à 5,05 (m, 3 H) ; 5,11 (m, 1 H) ; 5,88 (d, J=15,4 Hz, 1 H) ; 6,48 (ddd, J=3,8 et 11,3 et 15,4 Hz, 1 H) ; 7,05 (d, J=8,8 Hz, 1 H) ; 7,14 à 7,39 (m, 8 H) ; 8,40 (d, J=8,0 Hz, 1 H). LCMS (A2) : ES m/z = 1087 [M + H]+ ; m/z = 1085 [M - H]- ; tR=1,09 min. Exemple 9 : hu2H11-Ex7 Selon la méthode générale, 8,31 mg (0,057 pmol, 1,468 ml) d'anticorps nu hu2H11 à une concentration de 5,66 mg/mi sont traités par 5 éq. du composé Ex7 (0,442 mg, 0,340 pmol) en solution dans 37,3 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le mélange. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,15 ml de conjugués à une concentration de 2,48 mg/ml avec en moyenne 2,2 cytotoxiques par anticorps et une pureté monomérique de 99,7% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de NaCl sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1,5 ml d'une solution de conjugué à une concentration de 1,06 mg/ml avec en moyenne 2,8 dérivés de cryptophycine (déterminée par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,7%. Exemple 10 : hu2H11-Ex8 Selon la méthode générale, 7,8 mg (0,053 pmol, 1,458 ml) d'anticorps nus hu2H11 à une concentration de 5,35 mg/ml sont traités par 6 équivalents du composé Ex8 (0,578 mg, 0,531 pmol, pureté 60%) en solution dans 272 pl de DMA de telle sorte que la concentration finale en anticorps soit de 3 mg/ml dans le milieu réactionnel. Après purification sur Superdex 200 pg et concentration sur Amicon Ultra-15 (membrane Ultracel 50k, Millipore), on obtient 2,35 ml de conjugués à une concentration de 2,49 mg/ml avec en moyenne 2,5 dérivés de cryptophycine par anticorps et une pureté monomérique de 100% dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate, 0,14 M de NaCl et 20% en volume de NMP. Le changement de tampon final est réalisé dans un tampon aqueux pH=6,5 contenant 0,01 M de phosphate et 0,14 M de chlorure de sodium sur 1 ml de conjugué. On obtient alors 1,5 ml de d'une solution de conjugué à une concentration de 0,84 mg/ml avec en moyenne 2,22 dérivés de cryptophycine (déterminée par UV) par anticorps et une pureté monomérique de 99,9%. REVENDICATIONS1. Agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine de formule (I) : R, R R3 Re 2 o R8 (I) dans laquelle : ^ RI représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ùOH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ou bien RI et R2 forment ensemble un motif époxyde ; ^ AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ; ^ R3 représente un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13etC14; ^ R6 et R, représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ Rio représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C,-C4)alcoxy, un atome d'halogène ; ^ R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (CIC4)alkyle , l'agent de ciblage et le dérivé de cryptophycine étant attachés de façon covalente, l'attachement se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CRI, de préférence en para. 2. Agent de ciblage selon la revendication 1 dans lequel le dérivé de cryptophycine est choisi parmi l'un des suivants : Cl OMe OO O-HN~,,., `~ CI O N,---:,--0 OMe ci OMecl cl OMe OMe 3. Agent de ciblage selon la revendication 1 dans lequel le dérivé de cryptophycine est : Cl OMe 4. Agent de ciblage selon la revendication 1 à 3 dans lequel l'agent de ciblage auquel est attaché le dérivé de cryptophycine est un ligand, une protéine, un anticorps, plus 10 particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide. 5. Dérivé de cryptophycine de formule (Il) : R, _ R3 Rg L R,1, R8 0 15 dans laquelle : ^ RI représente un atome d'halogène et R2 représente un groupe ùOH, un groupe acyle dérivé d'un acide aminé AA ou un groupe (C1-C4)alcanoyloxy ; ou bien RI et R2 forment ensemble un motif époxyde ; ^ AA désigne un acide aminé naturel ou non-naturel ; 20 ^ R3 représente un groupe (C,-C6)alkyle ; ^ R4 et R5 représentent tous deux H ou forment ensemble une double liaison CH=CH entre C13 et C14 ; ^ R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R6 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R10 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi : H, un groupe OH, (C1-C4)alcoxy, un atome d'halogène ; ^ R11 représente au moins un substituant du noyau phényle choisi parmi H ou un groupe (C1-C4)alkyle ; ^ L représente un linker en position ortho (o), méta (m) ou para (p), de préférence para, du noyau phényle porteur du motif GCR1 choisi parmi : -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t(CR17=CR16)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G' X (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR16)(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)rphényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-furyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; - G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1; - G' X (CR13R14)rtriazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rfuryl--(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-oxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-thiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-imidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G' X (CR13R14)t-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1; -G' X (CR13R14)t-triazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; ou -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2) -Y'-(CR15R16)u Q GCR1 -G" Y (CR13R14)t(CR17=CR18)(CR15R16)u(OCH2CH2)y Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)y(CR17=CR18)(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)t-phényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rfuryl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 -G" Y (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 -G" Y (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipérazinyl-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t-pipéridinyl-méthyl-NR12-CO(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Y' Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)t--triazolyl-(CR15R16)u Y' Q GCR1; -G" Y (CR13R14)-phényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)-furyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)roxazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rthiazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rthiényl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rimidazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipérazinyl-(CR15R16)u Q GCR1; -G" Y (CR13R14)rpipérazinyl-(CR15R16)u Q CCR1 -G" Y (CR13R14)-pipéridinyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rpipéridinyl-méthyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)-pipéridinyl-NR12-(CR15R16)u Q GCR1 ; -G" Y (CR13R14)rtriazolyl-(CR15R16)u Q GCR1 ; formules dans lesquelles : ^ G' représente un groupe -CH=CH- ou -(CH2)n- ; ^ G" représente un groupe -(CH2)n- ; ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ X représente une liaison simple ou un groupe -CO-, -COO-, ou -CONR12-, le groupe CO étant attaché à G' ; ^ Y représente un groupe -0-, -OCO, -000O, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -NR12OOO-, ou -S(0)e, l'atome O ou le groupe NR12 étant attachés àG"; ^ q représente un entier pouvant valoir 0, 1 ou 2 ; ^ Y' représente un groupe -0-, -OCO, -00OO, -OCONR12-, -NR12-, -NR12CO-, -NR12CONR'12-, -NR12OOO-, -S(0)q, -CO-, -COO-, ou -CONR12- ; 10^ R12, R'12, R13, R14, R15, R15, R17 et R18 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ t, u et y représentent des entiers pouvant aller chacun de 0 à 20 et tels que t+u+y soit supérieur ou égal à 1 ; ^ dans le cas du linker de formule -G" Y (CR13R14)t(OCH2CH2)ÿ Y'-(CR15R16)u Q GCR1, si y vaut 0 et que Q représente une liaison simple, alors u ne peut valoir 0 ; ^ Q représente une liaison simple, un groupe (C1-C10)alkylène ou un groupe (OCH2CH2)i, i représentant un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à5; ^ GCR1 représente ûSZa ou -C(=O)-ZbRb ; ZaS-ALK-N 88 ou bien L est choisi parmi : R12 ZaS-ALK'N'(CH2)n ZaS-ALK,N^ L/ i 1 N''(CH2)n+ ~N.(CH2)n R12 N\(CH2)ä R12 RbZb-CO-ALK-SS-ALK' Nu 0`(CH2)n o 15 20 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'OU O`(CH2n+ IOI O RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i.0)(CH2)n R12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i Ir(CH2), O RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i. N^ (CH2)n+ O RbZb-CO-ALK~N' N�CH2)n+ RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)r- (CH2)n+ R12 RbZ b-CO-ALK-(OC H2CH2)i' 0yN�C H2)n- o 1,12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i' N`(CH2)n--O RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i- N (CHz)n R,2 RbZb-CO-ALK, N 1 (CH2)n RbZb-CO-ALK-(O C H2CH2)i^N R12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)rS�C H2)n 112 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i N. (CH2)n RbZb-CO-ALK-(OC H2CH2)i1 O, o (CH2)n N=N RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'0" N�CH2)n • ,NN 12 RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)iùN iq ?? (CH2)n N=N . RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i OCH2CH2 (CH2)n NN=N RbZb-CO-ALK" N�CH2)n+ 25 N=N Ru RbZb-CO-ALK-N" N�CH2)n RbZb-CO-ALK-(OCH2CH2)i'0 `~ RbZb-CO-ALK-(O CH2C H2)i OCH2CHRbZb-CO-ALK"R12 512 5'12 Zas-ALKUN ZaS-ALK-CH(NON�CHZ),/ Il O R'12 N�CH2)n O 512 ZaS-(CH2CH2O)i-CH2CH(N�CH2)n formules dans lesquelles : s ^ ùO.(cHZ)" représente l'un des 7 groupes suivants : S-ALK, tS-ALK N`~/ 512 v N,(CHZ)n v N (CHZ)n *S-ALKA`(CH2)n R12 S-ALK'N R12 S-ALKUN,,--.O O ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ ALK représente un groupe (C1-C12)alkylène ; 10 ^ R12 et R'12 représentent indépendamment l'un de l'autre H ou un groupe (C1-Cs)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; ^ i représente un entier allant de 1 à 20, plus particulièrement de 1 à 10, plus particulièrement encore de 1 à 8, ou de 1 à 6, encore plus particulièrement de 2 à 5 ; O /Dù(CH2)n+ 15 ou bien L est un linker de formule (IV) . RbZb-CO-ALK (AA)w (IV) dans laquelle : ^ (AA)w, représente un enchaînement de w acides aminés AA reliées entre eux par des liaisons peptidiques ; ^ w représente un entier allant de 1 à 12, de préférence de 1 à 6 ; 20 ^ n représente un entier allant de 1 à 6 ; ^ D représente l'un des motifs suivants : 12 VZ i R19 ùNR VO~/T~ pour lesquels : VZ V4 / Vs V2 o (CH2)n+ 5'12 N�CH2)n 512 S-ALK-CHZ N~\O 512 S-(CH2CH2O)i-CH2CH2 N�CH2)" 5'12 i (CH2)n R20 R21 O (D2) (D3) 15^ R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; ^ R19, R20, R2,, R22 représentent indépendamment l'un de l'autre H, un atome d'halogène, -OH, -CN ou un groupe (C1-C4)alkyle ; ^ T rattaché à (CH2)ä représente NR12 ou O ; V1 représente O, S, NR12 ; ^ V2 représente CR22 ou N ; ^ V3, V4, V5 sont choisis indépendamment l'un de l'autre parmi CR22 ou N ; ^ Za représente H ou le groupe -SRa, Ra représentant un groupe (C1-C6)alkyle, (C3- C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle ; ^ Zb représente une liaison simple, -O- ou -NH-, Rb représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, (C3-C7)cycloalkyle, aryle, hétéroaryle ou (C3-C7)hétérocycloalkyle. 6. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 5 dans lequel n vaut 1. 7. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 5 ou 6 dans lequel D2 est : H ùN 8. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 5 dans lequel L est choisi parmi : 0 R12 RbZb" v vS S N ~O 0 ZaS • ZaS RbZbO O Oi~,0-0 0 RbZbO Oi~~OR RbZbO r( -^,O 0 I Il 20 0 0 i 0 R112 NYO O RbZb Riz Riz RbZb(O O RbZb bRb 0 0 RbZb R12 O ~N=N O'• v ~N RbZb RbZb RbZbO~~O.--^,,S O RbZb O RbZb\ . /O 0 ZbRb O NN\=N RbZb" v v v N ~=N R,z RbZb N " N4 25 RbZb 0 V~ ~ ,N 'N RizRbZb\ ^ /0 0~ 0 iii 9. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 5 à 8 dans lequel Za représente H ou ûS(C1-C6)alkyle, notamment ûSMe, ou ZbRb représente ûO(C1-C6)alkyle, -OH, -OCH3, - RbZb 0 ùOùN I ùOùN OCH2CH=CH2, O ou ou le M=H ou cation SO3M ù o %N--N GI groupe '' dans lequel GI représente au moins un groupe électroinductif, ou encore dans lequel ûC(=O)ZbRb représente 10. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 9 dans lequel GI représente ûNO2 ou û Hal, notamment ûF. 20 11. Dérivé de cryptophycine selon la revendication 5 dans lequel L est choisi parmi : MISS N 512S' HS" v Nit 1 > 0 O O0, 0 O 0 5112 N 01~~0 ~•ON ~2 o HS~N^ L Nui 0 -.o s-sY.,,NYO~F O HS MeSS 153 0 N_N - 0 3 N O o o3 HS N,,--. O 3 2-R12 HS,/^.Oä,' _3 H2NyNH O O O^ j°~~IV H HS 10 R12 représentant H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle. 12. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 5 à 11 défini selon l'une des formules suivantes, L étant de préférence en position para Cl OMe L L CI OMe CI OMeL L L 13. Procédé de préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine, dénoté conjugué, consistant à : (i) mettre en contact et laisser réagir une solution aqueuse d'un agent de ciblage éventuellement tamponnée et une solution du dérivé de cryptophycine tel que défini à l'une des revendications 5 à 12 ; (ii) puis à éventuellement séparer le conjugué formé à l'étape (i) du dérivé de cryptophycine et/ou de l'agent de ciblage n'ayant pas réagi et/ou des agrégats qui se seraient formés. 14. Procédé selon la revendication 13 dans lequel l'agent de ciblage est un ligand, une protéine, un anticorps, plus particulièrement monoclonal, un fragment de protéine ou d'anticorps, un peptide, un oligonucléotide ou un oligosaccharide. 15. Procédé selon la revendication 13 ou 14 dans lequel la réaction a lieu à une température comprise généralement entre 20 et 40 °C et/ou la durée de la réaction varie entre 1 et 24 h. 16. Procédé selon l'une des revendications 13 à 15 dans lequel après l'étape (i) ou (ii), la solution du conjugué subit une étape (iii) d'ultrafiltration et/ou de diafiltration. 17. Conjugué susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 13 à 25 16. 18. Conjugué selon la revendication 17 caractérisé par un DAR déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre UV supérieur à *2, plus particulièrement compris entre 2 et 10, encore plus particulièrement entre 2 et 7, le DAR étant calculé par l'équation : 30 DAR = CD / cA dans laquelle :20 CD = [(EA 1 X A~2) ù (EA ),2 X Am)l / [(CD 7,2 X EA 11) ù (EA 7,2 X ED 1)1 CA = [Am ù (CD X CD I1)] I EA 21 et Am et A 2 désignant respectivement les absorbances de la solution de conjugué respectivement aux longueurs d'onde 1 et a,2 ; CD I1 et CD 2 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires du dérivé de cryptophycine avant conjugaison à deux longueurs d'onde X,1 et a,2 ; EA m et EA 12 désignant respectivement les coefficients d'absorption molaires de l'anticorps nu avant conjugaison aux deux longueurs d'onde X,1 et X2. 19. Conjugué selon la revendication 18 dans lequel I1= 280 nm et X,2= 246 nm. 20. Solution de conjugué susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 13 à 16 ou comprenant le conjugué tel que défini à l'une des revendications 17 à 19. 21. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 5 à 12 pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine. 22. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine de formule (III) : R, R5 G R� RaTOx^ ,o N Ra R~ Re H (III) dans laquelle les groupes R1 à R1, ont les mêmes significations qu'à la revendication 1, 2 , 5 ou 12 et G représente un groupe -CH=CH2 ou -(CH2),Y, se situant en position ortho 25 (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1, de préférence en para, n étant un entier allant de 1 à 6 et Y représentant ùOH ; -Cl ; -N3 ; -NH2 ; -COOH ; -NR12-CH2-C=CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle, plus particulièrement le groupe méthyle ; -OGP dans lequel GP désigne un groupe partant ; - OC(=O)-O-(4-nitrophényle) ; 30 pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dudit dérivé de cryptophycine. 23. Utilisation d'un dérivé de cryptophycine choisi parmi l'un des suivants :20HS S-S HS O^N~O i H 0 07^,7N O H O H H^,N O O--.,iS H HS 10HS N Hu CI pour la préparation d'un agent de ciblage auquel est attaché au moins un dérivé de cryptophycine. 24. Dérivé de cryptophycine de formule (III) : R, R3 R5 7 dans laquelle les groupes R1 à R11 ont les mêmes significations qu'à la revendication 1, 2, 5 ou 12 et G représente un groupe -(CH2),Y, se situant en position ortho (o), méta (m) ou para (p) du noyau phényle porteur du motif CR1, de préférence en para, n étant un entier allant de 1 à 6 et Y désignant -N3 ; -NR12-CH2-C=CH dans lequel R12 représente H ou un groupe (C1-C6)alkyle ; -OMs ou -OC(=O)-O-(4-nitrophényle). 25. Agent de ciblage selon l'une des revendications 1 à 4 en tant qu'anticancéreux. 26. Dérivé de cryptophycine selon l'une des revendications 5 à 13 en tant qu'anticancéreux. 27. Conjugué selon la revendication 18 à 20 en tant qu'anticancéreux. 28. Solution de conjugué selon la revendication 21 en tant qu'anticancéreux.