Brevet FR2944529A1 — publié le 20101022

METHODE DE DOSAGE D'ENZYMES PLASMATIQUES DANS LE SANG TOTAL La présente invention concerne une méthode de dosage in vitro d'enzymes plasmatiques. telles que les transaminases ou les enzymes NADH dépendantes, dans un échantillon de liquide biologique, par la mesure de la fluorescence du NADH. Les transaminases sont des enzymes qui catalysent le transfert d'un groupe amine d'un acide aminé à un autre. Chez l'homme, on distingue deux types de transaminases : • 1'ASAT (ASpartate Amino Transférase), AST ou GOT (Glutamate Oxaloacétique Transaminase). Cette enzyme catalyse la réaction (i) suivante : L-aspartate 10 + a-cétoglutarate 4 oxaloacétate + L-glutamate ; l'ALAT (ALanine Amino Transférase), ALT ou GPT (Glutamate Pyruvate Transaminase). Cette enzyme catalyse la réaction (ii) suivante : L-alanine + acétoglutarate 4 pyruvate + L-glutamate. Les transaminases sont présentes dans tous les tissus, principalement 15 dans le foie et le muscle cardiaque, ainsi que dans les globules rouges. En cas de dommage hépatique (nécrose ou hépatite) ou d'infarctus du myocarde par exemple, les transaminases sont libérées respectivement du foie ou du myocarde vers la circulation sanguine, ce qui entraîne une augmentation de leurs niveaux dans le sang. Le dosage des transaminases dans le sérum ou le plasma des patients constitue un outil de diagnostic des pathologies 20 hépatiques ou cardiaques. Les principales méthodes de dosage des transaminases plasmatiques sont basées sur des méthodes optiques, électrochimiques, chromatographiques ou radiochimiques (voir pour revue Huang et al., Sensors, 2006, 6:756-782). Les méthodes optiques sont utilisées en routine ; parmi ces méthodes, on distingue : 25 - la colorimétrie : Cette méthode de dosage est réalisée à partir de sérum ou de plasma. Après arrêt des réactions enzymatiques catalysées par l'AST ou l'ALT, on utilise un sel de diazonium qui réagit non seulement avec l'oxaloacétate (un des produits de la réaction catalysée par l'AST) pour donner un composé de couleur rouge, mais aussi avec le L- 30 glutamate (un des produits des réactions catalysées par l'ALT et l'ALT) pour donner, en présence de glutamate déshydrogénase, un composé de couleur verte ; il suffit ensuite de mesurer la densité optique (DO) du sérum ou du plasma coloré en rouge ou en vert. La loi de Beer-Lambert permet alors de relier la densité optique d'une solution à sa concentration molaire (c) : DO = dlc, � c � étant le coefficient d'absorption spécifique du composé coloré 35 et � 1 � l'épaisseur de la cuve contenant la solution (sérum ou plasma). Les inconvénients de cette méthode sont principalement le calibrage des cuves qui doit être effectué pour chaque dosage et la nécessité d'arrêter les réactions enzymatiques pour effectuer le dosage. Il est également possible de mettre en oeuvre cette méthode après immobilisation des réactifs sur phase solide, par exemple sur membrane. Différents dispositifs de dosage des transaminases, basés sur une méthode colorimétrique après immobilisation des réactifs sur phase solide, ont été proposés. Parmi ces dispositifs, on peut citer le dispositif de biologie délocalisée (� point-of-cure �) dénommé CholestechLDX� (Cholestech). Le dosage des transaminases AST et ALT à l'aide de ce dispositif s'effectue à partir d'un échantillon de 35 p.L de sang total capillaire, et comprend les étapes suivantes : le sang est déposé dans le puits d'une cassette (consommable du dispositif) et migre par capillarité dans la cassette qui comporte un filtre retenant spécifiquement les globules rouges ; le plasma résultant est ensuite mis au contact de réactifs séchés sur une membrane, conduisant à une réaction colorimétrique : le système optique du dispositif mesure alors l'intensité de la couleur finale de la réaction par photométrie de réflectance, la coloration bleue mesurée étant d'une intensité proportionnelle à la concentration en transaminases présentes dans l'échantillon (Demandes Internationales \VO 2004/90555 et WO 2005/044429) ; - la spectrophotométrie d'absorption UV à 340 nm : Selon cette méthode, c'est l'activité d'enzymes qui dégradent l'oxaloacétate et le pyruvate, produits respectivement par l'AST et l'ALT, qui est mesurée lors de réactions enzymatiques secondaires. Ces réactions enzymatiques sont catalysées respectivement par les enzymes MDH (Malate DésHydrogénase ; EC 1.1.1.37) et LDH (Lactate DésHydrogénase EC 1.1.1.27), en présence de NADH ((3-nicotinamide adénine dinucléotide) : • la MDH catalyse la réaction (iii) suivante : oxaloacétate + NADH + H+ 4 malate + NAD+ ; • la LDH catalyse la réaction (iv) suivante : pyruvate + NADH + H+ 4 L-lactate + NAD+. Le NADH (forme réduite) absorbe dans l'ultraviolet (UV) à 340 nm. alors que le NAD+ (forme oxydée) n'absorbe pas à cette longueur d'onde. On peut donc mesurer l'activité enzymatique des réactions secondaires catalysées par la LDH ou la MDH en suivant la décroissance de l'absorbance UV à 340 nm (correspondant à la consommation de NADH au cours des réactions enzymatiques secondaires en fonction du temps), et ainsi en déduire les activités enzymatiques de l'ALT et de l'ALT. Le dosage des transaminases AST et ALT par cette méthode s'effectue, non pas directement sur du sang total, mais à partir de sérum ou de plasma (Karmen et al., J. Clin. Invest., 1955, 34:131-133 ; Brevet américain US 3.925,162 et Demande de Brevet européen EP 415 188). En effet, le sang total, qui comprend les globules rouges, est un milieu très absorbant, notamment à la longueur d'onde de 340 nm, et des taux variables d'hématocrite (défini comme le rapport, exprimé en pourcentage, entre le volume de globules rouges obtenu en centrifugeant un échantillon de sang total et le volume de cet échantillon) de patients différents présentant par ailleurs un taux de transaminases identique pourrait donner lieu à des résultats de dosage de transaminases différents car la variation d'absorption UV serait fonction de la quantité de globules rouges et non fonction du taux de transaminases. Conformément aux recommandations de l'IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratorv Medicine), le dosage de l'AST selon cette méthode comprend les étapes suivantes : mélanger le plasma ou le sérum avec du L-aspartate, du NADH, du phosphate de pyridoxal (P Pal ou PLP pour pyridoxal-phosphate), une MDH et une LDH dans un tampon approprié : laisser incuber pendant 5 minutes ; ajouter ensuite l'acétoglutarate (de manière à initier la réaction enzymatique (i) ci-dessus ; laisser incuber pendant 90 secondes ; et mesurer la décroissance de l'absorbance UV du NADH pendant 180 secondes (Schumann et al.. Clin. Chem. Lab. Med., 2002, 40:725û733 ). Une phase de latence (ou d'incubation) de 90 secondes est recommandée afin d'obtenir une décroissance linéaire du signal (absorbance UV) mesuré en fonction du temps. Conformément aux recommandations de l'IFCC, le dosage de l'ALT selon cette méthode comprend les mêmes étapes que celles décrites pour le dosage de l'AST, mais il n'est pas utilisé de MDH et le L-aspartate est remplacé par la L-alanine ; l'ajout d'a-cétoglutarate permet d'initier la réaction enzymatique (ii) ci-dessus (Schumann et al., Clin. Chem. Lab. Med., 2002, 40:718û724). - la fluorescence : Cette méthode fait intervenir les mêmes réactions enzymatiques secondaires que celles décrites pour la spectrophotométrie d'absorption UV ci-dessus. Le NADH, excité à une longueur d'onde de 340 nm, fluoresce à une longueur d'onde de 460 nm, ce qui n'est pas le cas de sa forme oxydée, le NAD+. L'intensité d'émission est alors dépendante de la concentration en NADH dans le milieu étudié. L'activité enzymatique des transaminases AST et ALT peut donc être suivie par la diminution de la fluorescence émise par le NADH à 460 nm. soit en phase homogène, soit après immobilisation sur un support solide. Pour les même raisons qu'exposées ci-dessus, le dosage des transaminases AST et ALT par cette méthode ne peut s'effectuer que sur du sérum ou du plasma (Brevets américains US 3.925,162 et US 5.612,178 ; Demande Internationale WO 91/013169). Le dosage des enzymes plasmatiques ayant comme cofacteur le NADH (enzymes NADH-dépendantes), telles que les LDH et les MDH, s'effectue, sur sérum ou plasma, par mesure de leur activité enzymatique par spectrophotométrie d'absorption UV du NADH à 340 nm ou par suivi de la décroissance de la fluorescence à 460 nm du NADH consommé au cours de la réaction enzymatique catalysée par ces enzymes (dans le cas du dosage de la MDH, c'est le NADH consommé au cours de la réaction enzymatique (iii) décrite ci-dessus qui est mesuré et dans le cas du dosage de la LDH, c'est le NADH consommé au cours de la réaction enzymatique (iv) décrite ci-dessus qui est mesuré). Le dosage de ces enzymes est réalisé en mélangeant à l'échantillon de sérum ou plasma, leurs substrats (dont le NADH). Le dosage des LDH, par exemple, est utilisé pour le diagnostic et le suivi d'affections hépatiques et cardiaques, et de certains cancers (poumon et reins). Les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à une méthode de dosage d'enzymes plasmatiques, notamment les enzymes NADH-dépendantes et les transaminases, à partir d'un faible volume (quelques microlitres) de sang total humain et sans séparation préalable des globules rouges, le dosage étant réalisé rapidement après le prélèvement de sang (10 à 30 minutes). De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que le dosage des enzymes catalytiques plasmatiques NADH-dépendantes, telles que les LDH et MDH, par mesure de leur activité enzymatique (ou concentration catalytique), pouvait être effectué directement dans un échantillon de sang total, c'est-à-dire en présence notamment des globules rouges, en mesurant, dans une chambre microfluidique, la décroissance de la fluorescence du NADH consommé au cours de la réaction enzymatique catalysée par ces enzymes. Cette méthode s'est avérée fiable, rapide et robuste. En outre, elle peut être mise en oeuvre à l'aide d'un dispositif de biologie délocalisée. Cette méthode peut aussi s'appliquer au dosage d'une enzyme catalytique plasmatique Ec ayant comme substrats Si et S2, telle que les transaminases, par mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH consommé au cours de réactions enzymatiques secondaires qui sont catalysées par une ou plusieurs enzymes catalytiques NADH-dépendantes ayant pour substrat l'un des produits de la réaction enzymatique catalysée par ladite enzyme catalytique plasmatique Ec. En conséquence, la présente invention a pour objet une méthode de dosage, dans un échantillon de liquide biologique, d'une enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante, par mesure de son activité enzymatique, comprenant une étape de mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH, laquelle méthode est caractérisée en ce que ledit liquide biologique est du sang total et en ce que l'activité enzymatique de ladite enzyme catalytique est mesurée en suivant la décroissance de la fluorescence du NADH dans une chambre microfluidique de 20 �m à 2 mm d'épaisseur. On entend par enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante (EN), une enzyme catalytique présente dans le sang qui utilise le NADH comme cofacteur. A titre d'exemples non limitatifs d'enzymes catalytiques plasmatiques NADH-dépendantes (EN), on peut citer la lactate déshydrogénase (LDH), la malate déshydrogénase (MDH) et l'isocitrate déshydrogénase (IDH). On entend par chambre microfluidique, un dispositif présentant une veine fluidique susceptible de recevoir de très faibles quantités d'échantillon liquide, de l'ordre de la dizaine de microlitres. Les dimensions réduites de ladite chambre, de 20 tm à 2 mm d'épaisseur, de préférence de 20 �m à 100 �m, plus préférentiellement de 30 �m à 50 �m, et particulièrement de 30 �m, permettent de minimiser les mouvements dans l'échantillon liquide et aux globules rouges de sédimenter en quelques minutes selon l'épaisseur de la chambre microfluidique. En effet, une particularité du sang total est le phénomène de sédimentation du fait de la gravité agissant sur les particules les plus denses, la vitesse de sédimentation des globules rouges étant comprise entre 0,3 et 3 �m/s. Il est donc avantageux de choisir une chambre microfluidique de quelques dizaines de �m d'épaisseur de manière à avoir un temps de sédimentation (ou temps de latence) le plus court possible. N'importe quel matériau transparent aux longueurs d'ondes d'environ 300 à 550 nm, tel que le plastique et le quartz peut être utilisé pour fabriquer la chambre microfluidique. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, ladite chambre microfluidique comprend deux parois, de préférence de faible épaisseur (d'une centaine de �m à quelques mm), sensiblement parallèles et séparées par un ou plusieurs moyens d'espacement, tel(s) que la distance entre lesdites deux parois soit comprise entre 20 pm à 2 mm, de préférence entre 20 �m et 100 �m, plus préférentiellement entre 30 �m et 50 pm, et particulièrement de 30 �m. Les moyens d'espacement peuvent être, de manière non limitative, des plots ou des barres continues ou discontinues. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite chambre microfluidique comprend au moins une paroi constituée d'un matériau réfléchissant la lumière de fluorescence. L'utilisation d'un matériau réfléchissant la lumière de fluorescence permet, en dépit de l'accumulation des globules rouges au fond de la dite chambre microfluidique, d'augmenter le signal de fluorescence mesuré. Ledit matériau réfléchissant peut être constitué d'oxydes ou de nitrures de silicium, tels que SiO3 et Si3N4, ou de silicium (SiO2), de préférence de silicium. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, ladite chambre microfluidique comprend une paroi sensiblement plane, en verre ou en silicium, telle que par exemple une lame de microscope, et une paroi également sensiblement plane, en quartz ou en plastique, telle que par exemple une lamelle de microscope ; lesdites parois étant espacées de 20 �m à 2 mm, de préférence de 20 �m à 100 �m, plus préférentiellement de 30 �m à 50 �m, et particulièrement de 30 �m, à l'aide de plots (ou espaceurs) par exemple. L'échantillon de sang total, de préférence de sang humain, peut être prélevé sur anticoagulant, tel que l'EDTA (acide éthylène diamine tétra acétique), le citrate de sodium ou l'héparine, de préférence le citrate de sodium. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, le 35 volume de l'échantillon de sang total est compris entre 0,1 �L et 50 �L, de préférence il est de 3 �L. Ledit échantillon de sang total peut, en outre, être mélangé aux substrats de ladite enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante (dont le NADH) ainsi qu'à un tampon approprié. De tels tampons sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemples de tampons, on peut citer le Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) et un mélange constitué de Tris et d'azide de sodium (NaN3). L'introduction de l'échantillon de sang total dans ladite chambre microfluidique peut être réalisée à l'aide d'une pompe ou d'un piston, ou par migration capillaire, en évitant la lyse des globules rouges (hémolyse). En effet, les globules rouges peuvent renfermer des enzymes identiques auxdites enzymes catalytiques et qui ne doivent pas être dosées (étant donné que l'on souhaite déterminer l'activité catalytique des enzymes plasmatiques). Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, 20 p.M à 250 �M de NADH est ajouté audit échantillon de sang total. La fluorescence du NADH est mesurée à l'aide d'un fluorimètre ou d'une caméra appropriée, sensible à la fluorescence, à une longueur d'onde comprise entre 420 nm et 550 nm, de préférence à 460 nm, après excitation du NADH à une longueur comprise entre 300 nm et 400 nm. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, la mesure de la décroissance de la fluorescence s'effectue après l'écoulement d'un temps de latence défini par le temps de sédimentation des globules rouges dans ladite chambre microfluidique ; ce temps de latence varie donc en fonction de l'épaisseur de ladite chambre microfluidique. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, la mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH s'effectue à température ambiante ou à une température d'environ 37°C, de préférence à 37°C. La décroissance de la fluorescence du NADH peut être mesurée pendant 180 secondes après l'écoulement du temps de latence. La présente invention a également pour objet une méthode de dosage, dans un échantillon de liquide biologique, d'une enzyme catalytique plasmatique (Ec) ayant comme substrats SI et S2, par mesure de l'activité enzymatique de ladite enzyme Ec, comprenant au moins les étapes suivantes : a) incubation dudit liquide biologique avec ledit substrat SI, du NADH, une ou plusieurs enzyme(s) catalytique(s) NADH-dépendante(s) (EN) différentes ayant chacune pour substrat l'un des produits de la réaction enzymatique catalysée par Ec, et optionnellement du phosphate de pyridoxal ; b) ajout dudit substrat S2 de manière à initier les réactions enzymatiques catalysées par les enzymes catalytiques Ec et EN ; laquelle méthode est caractérisée : - en ce que ledit liquide biologique est du sang total, tel que défini ci-dessus, en ce qu'après l'ajout du substrat Sz à l'étape b), le mélange obtenu est immédiatement introduit dans une chambre microfluidique de 20 �m à 2 mm d'épaisseur telle que définie ci-dessus, et - en ce que l'activité enzymatique de ladite enzyme catalytique Ec est mesurée en suivant la décroissance de la fluorescence du NADH dans ladite chambre microfluidique, dans les conditions définies ci-dessus. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de cet aspect de l'invention, ladite chambre microfluidique est de quelques dizaines de �m d'épaisseur. En effet, dans le cas de l'utilisation d'une chambre microfluidique de 30 �m d'épaisseur pour le dosage des transaminases, la distance parcourue par les globules rouges pour une sédimentation complète dans ladite chambre microfluidique atteint environ 27 �m pendant les 90 secondes de la phase de latence. ce qui correspond à la phase de latence recommandée. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de cet aspect de l'invention, la concentration du NADH dans le mélange obtenu à l'étape a) est de 20 �M à 250 �M. Le temps d'incubation à l'étape a) définie ci-dessus est compris entre 2 et 30 minutes, de préférence il est de 5 minutes. Ladite enzyme catalytique (Ec) définie ci-dessus peut être toute enzyme catalytique plasmatique dont l'un des produits obtenus au cours de la réaction enzymatique catalysée par celle-ci est lui-même un substrat d'au moins une enzyme catalytique (EN) ayant comme cofacteur le NADH. A titre d'exemple d'enzymes catalytiques (Ec), on peut citer l'aspartate amino transférase (AST), l'alanine amino transférase (ALT), la pyruvate kinase, la créatine kinase et la glycérol kinase. L'activité enzymatique de ces enzymes peut être mesurée en utilisant une lactate déshydrogénase (LDH) et/ou une malate déshydrogénase (MDH) en tant qu'enzyme catalytique EN. Les LDH (EC 1.1.1.27) et les MDH (EC 1.1.1.37) sont bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent être isolées de n'importe quel mammifère, de préférence le porc. ou bien peuvent être recombinantes ou synthétiques. Selon un mode de mise en oeuvre particulier de cet aspect de l'invention. 30 ladite enzyme catalytique Ec est l'aspartate amino transférase. Selon ce mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, ledit substrat Si est le L-aspartate, ledit substrat S2 est l'u-cétoglutarate, et lesdites enzymes catalytiques EN sont, soit une MDH, soit une MDH et une LDH ; la concentration du NADH dans le mélange obtenu à l'étape a) est de préférence de 20 à 200 �M, plus préférentiellement 90 35 �M ; et la fluorescence du NADH est de préférence mesurée à 460 nm après excitation du NADH à une longueur d'onde de 318 nm de préférence. Selon un autre mode de mise en oeuvre particulier de cet aspect de l'invention, ladite enzyme catalytique Ec est l'alanine amino transférase. Selon ce mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, ledit substrat SI est la L-alanine, ledit substrat S2 est l'a-cétoglutarate, et ladite enzyme catalytique EN est une LDH la concentration du NADH dans le mélange obtenu à l'étape a) est de préférence de 20 à 250 �M, plus préférentiellement 180 �M ; et la fluorescence du NADH 5 est de préférence mesurée à 460 nm après excitation du NADH à une longueur d'onde de 367 nm de préférence. La concentration en AST ou en ALT dans l'échantillon de sang exprimée en U/L est obtenue en multipliant la valeur de l'activité enzymatique (concentration catalytique) de l'AST ou de l'ALT exprimée en �kat/1 par un facteur f égal à 60 (voir les 10 articles de Schumann et al., 2002, cités ci-dessus). La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une chambre microfluidique telle que définie ci-dessus pour doser une enzyme catalytique plasmatique (EN ou Ec) telle que définie ci-dessus dans un échantillon de sang total. La présente invention a en outre pour objet un kit ou coffret pour doser 15 une enzyme catalytique plasmatique Ec, telle que définie ci-dessus dans un échantillon de sang total caractérisé en ce qu'il comprend une chambre microfluidique telle que définie ci-dessus, et les réactifs suivants : les substrats SI et S2, le NADH, au moins une enzyme catalytique NADH-dépendante (EN), et optionnellement du PLP. Selon un mode de réalisation du kit ou coffret selon l'invention, il 20 comprend une chambre microfluidique telle que décrite ci-dessus, du L-Asp, une MDH, du NADH, de l'a-cétoglutarate et optionnellement une LDH et du PLP, le kit ou coffret étant utile pour mesurer l'activité enzymatique ou doser l'AST dans un échantillon de sang total humain. Selon un autre mode de réalisation du kit ou coffret selon l'invention, il 25 comprend une chambre microfluidique telle que décrite ci-dessus, de la L-Ala, une LDH, du NADH, de l'a-cétoglutarate et du PLP, le kit ou coffret étant utile pour mesurer l'activité enzymatique ou doser l'ALT dans un échantillon de sang total humain. La présente invention a également pour objet un kit ou coffret pour doser une enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante, caractérisé en ce qu'il comprend 30 une chambre microfluidique telle que définie ci-dessus. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, et qui se réfèrent à des exemples de mise en oeuvre de la méthode objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : 35 - la Figure 1 represente l'effet de la température sur la mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH pour le dosage de l'ALT. A- Corrélation entre la méthode de référence et la méthode selon la présente invention à température ambiante (a) ou à 37°C (b). B- Corrélation entre les mesures selon la méthode de la présente invention à température ambiante et à 37°C ; - la Figure 2 représente l'effet du matériau constituant la base de la chambre microfluidique sur la mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH pour le dosage de l'ALT. A- Corrélation entre la méthode de référence et la méthode selon la présente invention avec les bases de chambres microfluidiques constituées de verre (a) ou de silicium (b). B- Corrélation entre les mesures effectuées avec des bases de chambres microfluidiques constituées de verre ou de silicium ; - la Figure 3 représente l'effet de la concentration en NADH sur la mesure de la décroissance de la fluorescence pour le dosage de l'ALT. A- Corrélation entre la méthode de référence et la méthode selon la présente invention en utilisant 18011M de NADH (a) ou 90�M de NADH (b). B- Corrélation entre les mesures effectuées avec des chambres microfluidiques dont la base était constituée de verre ou de silicium et avec respectivement 180 �M (a) ou 90 �M (b) de NADH ; - la Figure 4 représente les résultats détaillés des dosages des transaminases ALT (Figure A) et AST (Figure B) chez des patients hospitalisés. Figures A et B- La valeur � Slope � correspond à la pente de la régression linéaire entre la pente de décroissance de la fluorescence et l'activité transaminase mesurée selon la méthode de référence. La valeur � Intercept � correspond à l'ordonnée à l'origine de cette même régression linéaire. Le � R2 � est le coefficient de détermination de la régression linéaire. La valeur � Min � représente la valeur minimale du CV (coefficient de variation), alors que la valeur � Max � représente la valeur maximale du CV. Le � CVp �correspond au CV �poolé �, calculé selon la formule suivante : CVp = Ni((CV12 + CV22 + ... + CVä2)/n). Ht = hématocrite. ALT ou AST par HCL = activité enzymatique mesurée à l'aide de l'automate de la gamme COBAS (Roche) fonctionnant par mesure de l'absorbance UV du NADH à 339 nm. Rep = répétition. ABS moyen = valeur absolue de la moyenne des 3 expériences. Figure B- Les valeurs marquées * correspondent aux résultats obtenus avec 90 pM de NADH et une phase de latence de 90 secondes. Les valeurs marquées ** correspondent aux résultats obtenus avec 45 �M de NADH et une phase de latence de 90 secondes, et les valeurs marquées *** correspondent aux résultats obtenus avec 90 �M de NADH et une phase de latence de 30 secondes - la Figure 5 représente les valeurs du photo-blanchiment observées pour le dosage des transaminases ALT (figure A) et AST (figure B) par suivi de la décroissance de la fluorescence du NADH - la Figure 6 est un graphique représentant la corrélation entre la décroissance de la fluorescence du NADH mesurée par la méthode de l'invention et l'activité ALT mesurée par la méthode de référence (automate Cobas). Droite � noire � d'équation y=ax+b ; droite � grise � d'équation y=ax ; - la Figure 7 est un graphique représentant la corrélation entre la décroissance de la fluorescence du NADH mesurée par la méthode de l'invention et l'activité AST mesurée par la méthode de référence (automate Cobas). Droite � noire � d'équation y=ax+b ; droite � grise � d'équation y=ax ; - La Figure 8 est un graphique représentant la corrélation entre la décroissance de la fluorescence du NADH mesurée par la méthode de l'invention et l'activité AST mesurée par la méthode de référence (automate Cobas). La corrélation prend en compte uniquement les valeurs obtenues dans les conditions optimales (90 de NADH et une phase de latence de 90 secondes). Les valeurs obtenues avec 45 �M de NADH et les valeurs obtenues avec la phase de latence de 30 s sont cependant reportées sur le graphique afin d'estimer leur adéquation à la droite obtenue. Droite � noire � d'équation y=ax+b ; droite � grise � d'équation y=ax ; - La Figure 9 est un graphique représentant la corrélation entre la mesure de la décroissance de fluorescence mesurée par la méthode de l'invention et l'activité AST mesurée par la méthode de référence (automate Cobas, Roche) en fonction des différentes classes d'hématocrite (hématocrite 45°/o). EXEMPLE 1: DOSAGE DES TRANSAMINASES PAR LA MESURE DE LA DECROISSANCE DE LA FLUORESCENCE DU NADH DANS UN ECHANTILLON DE SANG TOTAL HUMAIN : ETUDE DE DIFFERENTS PARAMETRES POUVANT INFLUER SUR LA FIABILITE ET LA REPETABILITE DES MESURES 1.1 Matériels et Méthodes a) Réactifs utilisés : - L-alanine (L-Ala) : exempte d'acide, BioUltra, > 99,5% (NT), Fluka, Réf : 05129 ; - L-aspartate (L-Asp) : exempt d'acide, BioUltra, > 99,5% (T), Fluka, Réf : 11189 ; - pyridoxal 5' phosphate monohydrate (PLP) : BioChemika, > 97,0% 30 (NT), Fluka, Réf : 82870 ; - a-cétoglutarate : sel disodique dihydraté de l'acide a-cétoglutarique, pureté > 98,5% (matière sèche, NT), Fluka, Réf : 75892 ; - lactate déshydrogénase (LDH) : EC 1.1.1.27, obtenue à partir de muscle squelettique de porc, dans du glycérol, homotétramère, Roche, Réf : 10 127 221 001 ; 35 - malate déshydrogénase (MDH) : EC 1.1.1.37, obtenue à partir de coeur de porc, dans du glycérol, homodimère, Roche, Réf : 10 127 892 001 ; - alanine amino transférase (ALT) : Glutamate-Pyruvate Transaminase (GPT), obtenue à partir de coeur de porc, poudre lyophilisée, > 75 unités/mg de protéine. Sigma, Réf : G8255 ; - aspartate amino transférase (AST) : Glutamate Oxaloacétate 5 Transaminase (GOT), obtenue à partir de coeur de porc, Type II-A, poudre lyophilisée, 100-400 unités/mg de protéine. Sigma, Réf : G7005 ; - BSA : � Bovine Serum Albumine �, Fraction V, > 98% (électrophorèse sur gel d'agarose), essentiellement exempte de protéase, poudre lyophilisée, Sigma, Réf : A3294 ; 10 - Chlorure de Sodium (NaCl) : Sigma, Réf : 59625 ; - NADH : sel disodique de (3-nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite, Sigma, Réf : N8129 ; - Tris : Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, Sigma, Réf : T1503 ; - NaN3 : azide de sodium, ReagentPlus�, > 99%, Sigma-Aldrich, Réf : 15 52002. b) Préparation des solutions pour les réactions enzymatiques : solutions pour le dosage de l'AST (conservées à 4°C) : - Solution 1 (5 mL) : Tris 96,92 mM pH 7,65, L-Asp 302,4 mM, NaN3 8 mM - Solution 2 (50 .iL) : Tris 96,92 mM pH 7,65, NaN3 8 mM 20 - Solution 3 (100 ML) : PLP 6.3 mM - Solution 4 (50 �L) : NADH 11,34 mM - Solution 5 (50 .iL) : LDH 113,4 U/mL, MDH 75,6 U/mL - Solution de réaction : Solution 1 + Solution 2 + Solution 3 + Solution 4 + Solution 5 solutions pour le dosage de l'ALT (conservées à 4°C) : 25 - Solution 1 (5 mL) : Tris 121.2 mM pH 7,15, L-Ala 630 mM, NaN3 8 mM - Solution 2 (50 ML) ; Tris 121,2 mM pH 7,15, NaN3 8 mM - Solution 3 (100 �L) : PLP 6,3 mM - Solution 4 (50 ML) : NADH 11,34 mM - Solution 5 (50 �L) : LDH 214 U/mL 30 - Solution de réaction : Solution 1 + Solution 2 + Solution 3 + Solution 4 + Solution 5 c) Fabrication des chambres microfluidiques : Les chambres fluidiques ont été fabriquées avec une épaisseur de 30 �m (cette épaisseur permet de sédimenter l'ensemble des globules rouges dans la chambre en 90 secondes avant d'effectuer la mesure de la fluorescence). La base des chambres 35 fluidiques était constituée soit d'une lame de verre au format standard de lame de microscope, soit d'une lame de silicium au même format. Du ruban adhésif double face de 30 �m d'épaisseur a ensuite été collé sous forme de plot (pastille) sur la lame de base. Puis une lamelle de microscope en quartz a été collée sur le ruban adhésif, de manière à former la chambre microfluidique. L'utilisation du quartz permet la détection de la fluorescence du NADH tout en étant transparent au rayonnement ultra-violet (Xex du NADH = 320nm-370nm). Les chambres microfluidiques ont été placées sur la platine d'un microscope (Olympus BX60 associé à un filtre optique Oméga XF06), qui se trouvait soit à température ambiante, soit thermostatée à 37°C d) Protocole de mesure de la fluorescence 3 tL de sang total humain ont été mélangés à 30 �L de solution de réaction contenant l'ensemble des réactifs nécessaires au dosage (hormis l'a-cétoglutarate). Le mélange ainsi obtenu a été incubé pendant 5 min à 37°C ou à température ambiante. 3�L d'une solution d'a-cétoglutarate (144 mM pour le dosage de l'ALT ou 180 mM pour le dosage de l'ALT) ont ensuite été ajoutés au mélange réactionnel afin d'initier la réaction enzymatique. Après une agitation rapide, 20 �L du mélange ont été immédiatement déposés à l'entrée de la chambre microfluidique, qui se remplit par capillarité. Après introduction du mélange réactionnel dans la chambre microfluidique, débute la phase de latence de 90 secondes à 37°C ou à température ambiante. Une fois la phase de latence écoulée, le mélange réactionnel a été excité à une longueur d'onde de 318 (pour le dosage de l'ALT) ou 367 nm (pour le dosage de l'ALT), à l'aide d'une lampe UV 100 mW filtrée (bande passante du filtre 320 mn f) Calcul du photo-blanchiment Le photo-blanchiment (%) a été calculé sur l'échantillon � blanc � comme suit : [(Intensité de fluorescence de la 1ere mesure - Intensité de fluorescence de la 13e'"e mesure) / (Intensité de fluorescence de la 1 eue mesure)] x 100. 1.2 Résultats 1.2.1. Effet de la température L'effet de la température sur les résultats obtenus a été vérifié. Pour cela. un échantillon de sang total provenant d'un donneur sain de l'Etablissement Français du Sang (EFS) a été supplémenté avec des transaminases porcines pour obtenir une gamme de concentration en transaminases, à savoir entre 10 et 100 U/L pour l'AST et entre 20 et 200 U/L pour l'ALT. Le dosage selon le système Cholestech LDX� des 8 échantillons de la gamme préparée montrait des activités enzymatiques comprises entre 34 et 110 U/L pour l'ALT, et entre 20 et 177 U/L pour l'ALT. Ces mêmes échantillons ont ensuite été analysés par la méthode selon la présente invention permettant de suivre la décroissance de la fluorescence du NADH, soit à température ambiante (22°C), soit à 37°C, et en utilisant des chambres microfluidiques dont la base était constituée de verre. Les blancs effectués pour cette expérience ont été réalisés avec un culot de globules rouges lavés de manière à éliminer toute trace d'activité catalytique résiduelle des transaminases plasmatiques. Les résultats pour le dosage de l'ALT sont présentés à la Figure 1. La Figure 1A montre les corrélations obtenues entre la méthode de référence (système Cholestech LDX�) et la décroissance de la fluorescence après normalisation des données et soustraction de l'échantillon � blanc �. Les deux corrélations montrent des coefficients R2=0,978 à 22°C (température ambiante) et R2=0,951 à 37°C. Il ressort de cette Figure que les décroissances de la fluorescence observées à 37°C sont plus importantes que celles observées à température ambiante, ce qui est tout à fait cohérent car les réactions enzymatiques sont optimales à 37°C. La corrélation entre les mesures effectuées à 37°C, et celles effectuées à température ambiante, illustrée à la Figure 1B, montre cette amélioration de résultats : les valeurs sont augmentées d'un facteur 1,66 à 37°C par rapport à la température ambiante. Pour cette série d'expériences à différentes températures, le photo-blanchiment ne semble pas être affecté par la température. Ceci est cohérent dans la mesure où le photo-blanchiment du fluorophore est dû essentiellement au temps d'exposition du faisceau lumineux et non à la température. La mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH permettant le 35 suivi de l'activité enzymatique des transaminases peut donc être effectuée à 37°C ou à température ambiante, même si la température de 37°C est optimale. 1.2.2. Effet du matériau de la base de la chambre microfluidique (verre ou silicium) Les diminutions de signal de fluorescence observées dans des chambres microfluidiques en verre se sont avérées être de 10% au maximum pour les taux de transaminases les plus élevés (soit 200 U/L pour l'ALT). Aux longueurs d'onde d'excitation utilisées (comprises entre 300 et 400 nm), le verre est absorbant. Une partie du signal d'excitation peut donc être perdue par absorption par le verre. L'utilisation d'un matériau réfléchissant permettrait de pallier à cette perte. Il a donc été étudié s'il était possible d'augmenter ces décroissances de signal au delà de cette limite de 10%. de manière à améliorer la précision des mesures. Des chambres microfluidiques comprenant une base en silicium ont donc été fabriquées tel que décrit au paragraphe 1.1.c) ci-dessus. Un échantillon de sang provenant d'un donneur sain de l'EFS a été supplémenté avec des transaminases porcines (voir paragraphe 1.2.1). Le dosage selon le système Cholestech LDX� des 8 échantillons de la gamme préparée montraient des activités enzymatiques comprises entre 35 et 108 U/L pour l'ALT, et entre 27 et 223 U/L pour l'ALT. Ces mêmes échantillons ont ensuite été dosés selon la méthode de la présente invention à 37°C, dans des chambres microfluidiques en verre ou en silicium. Les blancs effectués pour cette expérience ont été réalisés avec un culot de globules rouges lavés. Les résultats pour le dosage de l'ALT sont présentés à la Figure 2. La Figure 2A montre les corrélations obtenues entre la méthode de référence et la mesure de la décroissance de la fluorescence (selon la méthode de la présente invention) après normalisation des données et soustraction du blanc. Les CV observés pour les expériences réalisées avec les bases des chambres microfluidiques en verre sont compris entre 1,8% et 29,6%, alors que ceux obtenus avec les bases des chambres microfluidiques en silicium sont compris entre 1,8 et 14.5% : la répétabilité est donc améliorée avec le silicium. Par ailleurs, il ressort de cette figure que les décroissances de la fluorescence observées avec les bases des chambres microfluidiques en silicium sont plus importantes que celles observées sur verre. La corrélation entre les mesures effectuées avec les bases des chambres microfluidiques en verre, et celles effectuées avec les bases des chambres microfluidiques en silicium, illustrée à la Figure 2B, montre cette amélioration de résultats : les valeurs sont augmentées d'un facteur 1,6 avec le silicium par rapport au verre. Le photo-blanchiment est inférieur à 4% avec le verre, alors qu'il est inférieur à 7% avec silicium. Ceci s'explique par le fait que le faisceau traverse deux fois l'épaisseur de la chambre microfluidique, puisqu'il est réfléchi : le photo-blanchiment s'en trouve ainsi augmenté. Le verre et le silicium peuvent donc être utilisés pour la fabrication de la base des chambres microfluidiques. Cependant, l'utilisation du silicium permet d'obtenir des diminutions de signal plus importantes par rapport à l'utilisation du verre, et la répétabilité des mesures en est améliorée. 1.2.3. Effet de la concentration en NADH Un échantillon de sang provenant d'un donneur sain de l'EFS a été supplémenté avec des transaminases porcines à 8 taux différents de manière à établir une gamme d'activité enzymatique. Le dosage des transaminases a été effectué avec des concentrations de NADH de 90 �M ou 180 �M. Le dosage selon le système Cholestech LDX� des 8 échantillons de la gamme préparée montrait des activités enzymatiques comprises entre 32 et 125 U/L pour l'AST, et entre 19 et 228 U/L pour l'ALT. Ces mêmes échantillons ont ensuite été analysés par la méthode selon la présente invention à 37°C, avec des chambres microfluidiques dont la base était constituée de silicium. Les blancs effectués pour cette expérience ont été réalisés avec un culot de globules rouges lavés. Les résultats du dosage de l'AST sont présentés à la Figure 3. La Figure 3A montre les corrélations obtenues entre la méthode de référence et celle selon la présente invention après normalisation des données. Les CV observés aux deux concentrations de NADH sont comparables, systématiquement inférieurs à 30%. Les deux corrélations montrent des coefficients R2 similaires, R2=0,903 avec 180�M de NADH et R2=0,885 avec 90 tM de NADH. Il ressort de cette figure que la décroissance de la fluorescence observée avec 90 �M de NADH est plus importante que celle observée avec 180�M de NADH. Les pentes des régressions linéaires varient d'un facteur 2,75. La Figure 3B illustre l'amélioration entre la configuration initiale. chambre en verre et 180 �M de NADH, et la configuration optimale, chambre en silicium et 90 pM de NADH. Les variations de décroissance de la fluorescence ont été améliorées quasiment d'un facteur 5 entre les deux configurations. Pour le dosage de l'AST, l'utilisation de 90 �M de NADH s'avère plus fiable, car permettant d'obtenir des variations de signal de décroissance de la fluorescence plus importantes. EXEMPLE 2: VALIDATION EXPERIMENTALE DE LA METHODE DE DOSAGE DES TRANSAMINASES PAR LA MESURE DE LA FLUORESCENCE DU NADH Les résultats présentés à l'Exemple I concernaient des dosages effectués sur des échantillons de sang provenant de donneurs sains, qui ont été supplémentés en transaminases porcines afin de mimer des échantillons de patients malades, dont les taux de transaminases seraient élevés. La méthode de dosage des transaminases selon la présente invention a ensuite été validée sur des échantillons de sang total de patients malades prélevés sur citrate. Des échantillons de sang citraté provenant de patients hospitalisés aux Hospices Civils de Lyon (HCL, France) ont été analysés selon la méthode de la présente invention. Les mesures de la fluorescence du NADH ont été effectuées selon la méthode décrite à l'Exemple I, avec les paramètres suivants : - une température de 37°C ; - des chambres microfluidiques avec une base en silicium ; - une concentration de NADH de 180 �M pour le dosage de l'ALT et de 90 �M pour le dosage de l'AST ; - des mesures réalisées en triplicatat ; - les � blancs � ont été réalisés en remplaçant l'a-cétoglutarate (qui initie la réaction enzymatique) par un volume équivalent de NaCl 154 mM. Les résultats obtenus par la mesure de décroissance de la fluorescence selon la méthode de la présente invention ont été comparés à ceux obtenus par la méthode de référence mise en oeuvre au sein du laboratoire de Biochimie de l'hôpital Edouard Herriot de Lyon (France). Le Tableau 1 ci-dessous décrit les principales caractéristiques des deux méthodes : Tableau 1 : comparaison de la méthode de dosage des transaminases AST/ALT mise en oeuvre par le laboratoire de Biochimie de l'hôpital Edouard Herriot de Lyon à l'aide d'un automate de la gamme Cobas (Roche) et la méthode selon la présente invention. Méthode de référence Méthode de l'invention Système de mesure Automate de la gamme Cobas de la société Roche fonctionnant par mesure de l'absorbance UV à 339 nm (décroissance du NADH en présence de PLP) Volume de 10�L de plasma hépariné 3�L de sang total citraté l'échantillon prélevé dans un tube de 5mL de sang centrifugé (3�L de plasma si taux fort, 401uL de plasma si taux faible) Banc expérimental permettant la mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH à 460nm (voir Exemple 1.1) Température 37°C Nombre réplicats 1 Gamme 4-600U/L pour ALT 4-800U/L pour AST Durée de l'analyse 20 min de centrifugation + 10 min de passage dans l'automate 30 min pour une seule mesure Reproductibilité CV 25 échantillons de sang provenant de patients différents ont été analysés pour le dosage de l'ALT, et 21 échantillons de sang provenant de patients différents ont été analysés pour le dosage de l'ALT. Les résultats bruts sont représentés à la Figure 4. 2.1. Estimation du photo-blanchiment Durant la cinétique des réactions enzymatiques (180 secondes), des photos ont été prises toutes les 15 secondes, avec ouverture puis fermeture de l'obturateur à chaque prise. Un objectif 1OX a été utilisé et les temps d'exposition étaient de 50 millisecondes pour un facteur d'amplification électronique du signal optique de 250 (qui est détecté au niveau de la caméra). Le photo-blanchiment (calculé selon la méthode décrite à l'Exemple 1.1S) ci-dessus) a été estimé sur les mesures réalisées sur les échantillons � blancs �. Les résultats, présentés à la Figure 5 montrent que le photo-blanchiment est systématiquement inférieur à 2% pour cette série d'expérience où les échantillons � blancs � sont réalisés en remplaçant l'a-cétoglutarate par du NaCl 154 mM. 2.2. Corrélation entre la méthode de dosage de référence et la méthode de dosage selon la présente invention 2.2.1. pour l'ALT : Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 6. La corrélation est linéaire. Elle est correcte sur l'ensemble de la gamme étudiée, avec des coefficients de 20 régression linéaire supérieurs à 0.959. 2.2.2 pour l'AST : Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 7. La corrélation est linéaire avec des R2 de 0,812 et 0,783 pour respectivement une régression linéaire de type y=ax+b et une régression linéaire de type y=ax. On note également que les variations de 25 signal observées pour le dosage de l'AST sont 2 fois plus faibles que celles déterminées pour l'ALT. Par exemple, pour une activité transaminase de 100 U/L, la décroissance de la fluorescence pour ALT est de 5%, alors qu'elle n'est que de 2,5% pour l'ALT. Il a donc été vérifié s'il était possible d'améliorer cette décroissance de signal en testant deux paramètres susceptibles d'influencer ces résultats : la quantité de 30 NADH (45 �M au lieu de 90 �M) et la phase de latence (30 s au lieu de 90 s). Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 8. Il ressort du graphique de la Figure 8 que la diminution de la concentration de NADH de 90 �M à 45 �M ne permet pas d'augmenter la décroissance de la fluorescence : les valeurs obtenues sont du même ordre de grandeur que celles observées 35 avec 90 �M de NADH. Il est cependant intéressant de noter que les CV sont meilleurs avec 45 �M de NADH : en effet, dans ces conditions, les valeurs des 5 CV varient entre 0,6% et 10,5%. Ainsi, même si la diminution de la concentration ne permet pas d'obtenir des décroissances de la fluorescence plus importantes, elle permet une meilleure répétabilité. Par ailleurs. une phase de latence de 30 s au lieu de 90 s, n'a pas permis d'améliorer les résultats. Au contraire, les décroissances de la fluorescence étaient plus faibles dans ces conditions. 2.3. Effet de l'hématocrite L'hématocrite pourrait constituer un paramètre impactant les mesures de la fluorescence. En effet, la mesure de la fluorescence du NADH est effectuée en sang total, donc en présence des globules rouges. Des taux variables d'hématocrites chez divers patients présentant par ailleurs un taux de transaminases identique pourrait donc donner des résultats de dosage de transaminases différents à cause de la variation de l'absorption due aux quantités variables de globules rouges. Afin de vérifier cette hypothèse, il a été testé l'effet de l'hématocrite sur les mesures de la décroissance de fluorescence. Les différents patients qui ont été analysés présentaient des taux d'hématocrite compris entre 21,6 % et 51 % (moyenne = 34,3%, écart-type = 7,3%). Compte-tenu de la gamme d'hématocrite disponible, différentes classes ont été définies : - hématocrite 45% Les résultats obtenus sont présentés à la Figure 9. Ces résultats ne mettent pas en évidence de tendance entre les différentes valeurs de décroissance de fluorescence mesurées et la valeur de l'hématocrite. On peut seulement noter que le patient présentant le taux d'hématocrite le plus faible semble être en dehors de la corrélation. On n'observe donc pas d'effet de l'hématocrite sur les mesures de décroissance de la fluorescence du NADH. REVENDICATIONS1) Méthode de dosage, dans un échantillon de liquide biologique, d'une enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante (EN), par mesure de son activité enzymatique, comprenant une étape de mesure de la décroissance de la fluorescence du NADH, laquelle méthode est caractérisée en ce que ledit liquide biologique est du sang total et en ce que l'activité enzymatique de ladite enzyme catalytique est mesurée en suivant la décroissance de la fluorescence du NADH dans une chambre microfluidique de 20 �m à 2 mm d'épaisseur. 2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite enzyme catalytique est choisie dans le groupe constitué par la lactate déshydrogénase (LDH), la malate déshydrogénase (MDH) et l'isocitrate déshydrogénase (IDH). 3) Méthode de dosage, dans un échantillon de liquide biologique, d'une enzyme catalytique plasmatique (Ec) ayant comme substrats S, et S2, par mesure de l'activité enzymatique de ladite enzyme Ec, comprenant au moins les étapes suivantes : a) incubation dudit liquide biologique avec ledit substrat S,, du NADH, une ou plusieurs enzyme(s) catalytique(s) NADH-dépendante(s) (EN) différentes ayant chacune pour substrat l'un des produits de la réaction enzymatique catalysée par Ec, et optionnellement du phosphate de pyridoxal (PLP) ; b) ajout dudit substrat S2 de manière à initier les réactions enzymatiques catalysées par les enzymes catalytiques Ec et EN, laquelle méthode est caractérisée : - en ce que ledit liquide biologique est du sang total, - en ce qu'après l'ajout du substrat S2 à l'étape b), le mélange obtenu est immédiatement introduit dans une chambre microfluidique de 20 �m à 2 mm d'épaisseur, et - en ce que l'activité enzymatique de ladite enzyme catalytique Ec est mesurée en suivant la décroissance de la fluorescence du NADH dans ladite chambre microfluidique. 7) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'épaisseur de ladite chambre microfluidique est comprise entre 30 �m et 50 �m, de préférence de 30 �m. 8) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite chambre microfluidique comprend deux parois sensiblement parallèles et séparées par un ou plusieurs moyens d'espacement tel(s) que la distance entre lesdites deux parois soit comprise entre 20 �m à 2 mm, de préférence entre 30 à 50 �m. 9) Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'au moins une des deux parois est constituée d'un matériau réfléchissant la lumière de fluorescence. 10) Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce ledit matériau réfléchissant est du silicium ou un oxyde ou un nitrure de silicium. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la mesure de la décroissance de la fluorescence s'effectue après l'écoulement d'untemps de latence défini par le temps de sédimentation des globules rouges dans ladite chambre microfluidique. 9) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la fluorescence du NADH est mesurée à une longueur d'onde comprise entre 420 nm et 550 nm, après excitation du NADH à une longueur comprise entre 300 et 400 nm. 10) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le volume de l'échantillon de sang total est compris entre 0,1 �L et 50 �L. 11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que le temps d'incubation à l'étape a) est compris entre 2 et 30 minutes, de préférence de 5 minutes. 12) Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 11, caractérisée en ce que la concentration du NADH dans le mélange obtenu à l'étape a) est de 20 �M à 250 �M. 13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 12, caractérisée en ce que ladite enzyme catalytique Ec est choisie dans le groupe constitué par l'aspartate amino transférase (AST), l'alanine amino transférase (ALT), la pyruvate kinase, la créatine kinase et la glycérol kinase, de préférence l'AST et l'ALT. 14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 13, caractérisée en ce que ladite enzyme catalytique Ec est l'aspartate amino transférase, ledit substrat SI est le L-aspartate, ledit substrat S2 est l'a-cétoglutarate, et lesdites enzymes catalytiques EN sont choisies parmi soit une malate déshydrogénase (MDH), soit une MDH et une lactate déshydrogénase (LDH). 15) Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 13, caractérisée en ce que ladite enzyme catalytique Ec est l'alanine amino transférase, ledit substrat SI est la L-alanine, ledit substrat S2 est l'a-cétoglutarate, et ladite enzyme catalytique EN est une lactate déshydrogénase. 16) Utilisation d'une chambre microfluidique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 7, pour doser une enzyme catalytique plasmatique dans un échantillon de sang total. 17) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ladite enzyme catalytique est choisie dans le groupe constitué par l'AST, l'ALT, la pyruvate kinase, la créatine kinase, la glycérol kinase, la LDH, la MDH et l'IDH. 18) Kit ou coffret pour doser une enzyme catalytique plasmatique (Ec) dans un échantillon de sang total, ladite enzyme catalytique plasmatique ayant comme substrats S I et S2, caractérisé en qu'il comprend une chambre microfluidique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 7, et les réactifs suivants : les substrats SI et S2. le NADH, au moins une enzyme catalytique NADH-dépendante (EN), et optionnellement du PLP.19) Kit ou coffret selon la revendication 18, caractérisé en que ledit substrat S I est le L-aspartate et ledit substrat S2 est l'a-cétoglutarate, ou en ce que ledit substrat S I est la L-alanine et ledit substrat S2 est l'a-cétoglutarate. 20) Kit ou coffret pour doser une enzyme catalytique plasmatique NADH-dépendante (EN) dans un échantillon de sang total, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre microfluidique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 et 4 à 7.