Brevet FR2937050A1 — publié le 20100416

La présente invention concerne les dispositifs et procédés de culture cellulaire. notamment de cellules neuronales. Le cerveau est une structure extrêmement complexe composée de plusieurs aires neuronales connectées entre elles. Les études expérimentales in vivo préservent cette structure globale, mais ne sont pas adaptées à l'étude aux échelles cellulaires. Les cultures de cellules dissociées permettent de décrire bien plus en détail le système étudié. C'est pourquoi de nombreux laboratoires procèdent à des cultures neuronales. Traditionnellement, ces cultures de neurones sont réalisées dans des boîtes de petri ou des puits de culture. Ces cultures cellulaires trouvent des applications comme modèle réductionniste dans l'étude des maladies neuro-dégénératives (Alzheimer. Huntington, Creutzfeldt-Jakob, etc.) mais aussi en biologie du développement pour la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires de la différenciation neuronale. Cependant. dans ces systèmes les connexions neuronales se font aléatoirement et il est impossible d'y reconstituer une architecture semblable à celles que l'on trouve in vivo. La structure en réseau du système nerveux central (CNS) est complètement absente, et ne permet pas d'étudier comment les différentes couches neuronales interagissent. Une autre méthode consiste à utiliser des tranches de différentes parties du cerveau cultivées ex vivo. Même si l'intégrité des couches neuronales est préservée par cette méthode, la complexité des tissus prélevés pose vite problème. Afin de mieux comprendre la propagation de la mort neuronale et les mécanismes de développement dans les différentes couches du cerveau, il convient de développer de nouveaux dispositifs expérimentaux permettant de contrôler l'architecture des réseaux des neurones cultivés in vitro. La microfluidique est un outil de choix pour la biologie cellulaire et en particulier pour les neurosciences. Dans WO200434016, Jeon et al., inspirés des travaux de Campenot [Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977, 74(10), 4516-4519], proposent une configuration de circuit microfluidique permettant d'isoler le soma des neurones de leur axone. Cette configuration est adaptée aux neurones du système nerveux central (CNS). Le compartiment dit somatique est le canal dans lequel sont introduits les neurones fraîchement disséqués. Le compartiment distal est celui vers lequel se dirigent les axones en traversant des microcanaux. Le soma des neurones ne peut pas traverser les microcanaux. En effet, les microcanaux sont trop fins pour permettre au soma de traverser. Ce dispositif est un premier pas vers le contrôle des cultures neuronales du CNS in vitro. Les temps de diffusion dans les microcanaux sont longs, ce qui permet de traiter de façon séparée les compartiments distal et somatique. La diffusion de ce qui est contenu dans l'un des compartiments vers l'autre est compensée en imposant un différentiel de pression. Il suffit pour cela de mettre dans l'un des réservoirs d'un des compartiments un volume de liquide plus grand, pour imposer un différentiel de pression hydrostatique entre différents compartiments. Cependant, ce dispositif présente encore de nombreuses limitations. D'une part, s'il permet de. séparer les compartiments cellulaires, il ne permet pas d'induire de connexion axonale dirigée entre deux populations de neurones, puisque les axones peuvent parcourir les microcanaux dans les deux sens. Les publications WO 2006/037033 et US 7 419822, se rapportent également à 20 des dispositifs de culture cellulaire adaptés à la culture de neurones. La présente invention vise entre autres à remédier à ces différentes limitations, et de permettre ainsi des études, des procédés et des criblages impossibles avec les dispositifs de l'art actuel. Résumé 25 L'invention a pour objet, selon l'un de ses aspects, un dispositif de culture cellulaire, notamment de cellules neuronales, comportant : - un support définissant une première chambre microfluidique destinée à être ensemencée par une première culture cellulaire, et au moins une deuxième chambre microfluidique, 30 - un système d'interconnexion fluidique reliant les première et deuxième chambres microfluidiques et permettant à des extensions cellulaires, notamment des axones, de s'étendre d'une chambre vers l'autre chambre, dispositif dans lequel le système d'interconnexion est réalisé de manière à privilégier la progression d'au moins un premier type d'extensions cellulaires par rapport à au moins un second type d'extensions cellulaires. Lesdits premier et second types d'extensions cellulaires peuvent différer par la chambre microfluidique dont ils proviennent et/ou par le type cellulaire dont ils sont l'extension. La deuxième chambre microfluidique peut être ensemencée avec au moins un deuxième type cellulaire. Le système d'interconnexion peut comporter une pluralité de canaux et/ou une pluralité de microstructures. Le système d'interconnexion peut comporter au moins un canal ou un réseau de microstructures présentant une asymétrie entre le côté dudit canal ou dudit réseau connecté à la première chambre microfluidique, et le côté dudit canal ou dudit réseau connecté à la deuxième chambre microfluidique. Le système d'interconnexion peut comporter au moins un canal dont au moins une dimension se réduit en progressant d'une chambre vers l'autre, ladite au moins une dimension comportant par exemple la largeur du canal. Ladite dimension peut être à l'endroit du débouché dudit canal dans la première chambre microfluidique ou dans la deuxième chambre microfluidique, inférieure ou égale à 5�m. Le système d'interconnexion peut comporter un canal dont au moins une portion présente une forme trapézoïdale lorsqu'observé de dessus. Le système d'interconnexion peut comporter un canal non rectiligne. Le système d'interconnexion peut comporter un canal comprenant une succession de rétrécissements et d'élargissements lorsque l'on progresse de l'une des chambres vers l'autre. Lesdits canaux peuvent présenter des interconnexions ou des ramifications. Le réseau de microstructures peut comporter des obstacles empêchant la propagation d'axones en ligne droite. Les obstacles peuvent être disposés de façon à imposer à tout chemin continu entre la première chambre microfluidique et la deuxième chambre microfluidique au moins une portion dans laquelle le rayon de courbure dudit chemin est inférieur à 20 �m. de préférence inférieur à 10 �m, plus préférentiellement encore inférieur à 7 �m, 5 �m. voire 3 �m. Le système d'interconnexion peut comporter au moins une portion dont la surface a été traitée chimiquement ou biochimiquement de façon à avoir une affinité pour au moins un type de cellule ou un type de comportement cellulaire. Le traitement chimique peut comporter l'exposition à moins un type de molécule sélectionné parmi la fibronectine, les cadhérines, le collagène, la laminine. les molécules comportant des groupement succinimides, le (N-Sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido- 2'-nitrophenylamino] hexanoate), les molécules chimiques réactives photo-activables. Le système d'interconnexion peut comporter des microcanaux ou des microstructures d'épaisseur inférieure à celles des première et seconde chambres microfluidiques, et de préférence comprise entre 1 et 5�m, plus préférentiellement encore entre 2 et 4 �m. Le dispositif peut comporter au moins une chambre microfluidique monocellulaire, dimensionnée pour ne contenir que le soma d'une seule cellule. cette chambre microfluidique monocellulaire communiquant avec le système d'interconnexion et avec l'une des première et deuxième chambres microfluidiques. La chambre microfluidique monocellulaire peut avoir une épaisseur plus faible que celle des première et deuxième chambres microfluidiques, et plus élevée que celle dudit système d'interconnexion. Le dispositif peut comporter au moins une chambre microfluidique dont le volume est compris entre 100 et 10 000 �m3, et de préférence entre 500 et 5000 �m3. et communiquant de façon fluidique avec le système d'interconnexion et avec l'une des première et deuxième chambres microfluidiques. Le système d'interconnexion peut être délimité sur au moins une partie de sa surface par une paroi poreuse permettant l'échange avec un compartiment annexe de molécules et d'ions, mais ne permettant pas l'échange, avec ledit compartiment annexe, de cellules. Le dispositif de culture cellulaire peut comporter en outre au moins une microélectrode, et de préférence un réseau de microélectrodes, reliée à un appareil de mesure permettant d'étudier des processus électrophysiologiques au sein d'au moins une cellule présente dans ledit dispositif. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects. un dispositif de culture cellulaire, comportant : des premier et second macrocanaux. - un microcanal relié à une première extrémité au premier macrocanal. - une chambre microfluidique monocellulaire communiquant avec le deuxième macrocanal et avec une deuxième extrémité du microcanal, les premir et deuxième macrocanaux communiquant entre eux par l'intermédiaire du microcanal et de la chambre microfluidique monocellulaire, la chambre microfluidique monocellulaire étant dimensionnée de façon de ne pouvoir recevoir que le soma d'une seule cellule. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un dispositif de culture cellulaire, comportant au moins deux systèmes d'interconnexion dont l'un au moins. et de préférence deux au moins, sont réalisés comme défini plus haut. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspect, un dispositif de culture cellulaire comportant au moins trois chambres microfluidiques reliées en série par au moins deux systèmes d'interconnexion, dans lequel l'épaisseur desdits systèmes d'interconnexion est inférieure à l'épaisseur desdites trois chambres microfluidiques, et au moins l'une desdites chambres microfluidiques présente une épaisseur comprise entre l'épaisseur d'au moins une des autres chambres microfluidiques et celle desdits systèmes d'interconnexion. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé de culture cellulaire, notamment de cellules neuronales, dans lequel on ensemence avec des cellules neuronales au moins une chambre microfluidique d'un dispositif tel que défini plus haut. On peut ensemencer au moins deux chambres microfluidiques avec des cellules neuronales et les axones des cellules de l'une des chambres éprouvent moins de difficultés à se développer vers l'autre chambre que ceux des cellules de l'autre chambre en raison de la forme du système d'interconnexion. On peut ensemencer au moins une chambre microfluidique avec une culture cellulaire présentant au moins deux types cellulaires, et les axones des cellules d'au moins l'un desdits types cellulaires éprouvent moins de difficultés à se développer au sein du système d'interconnection que les axones des cellules d'au moins un second type cellulaire. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé pour étudier des biomarqueurs présents dans un compartiment cellulaire, comportant au moins les étapes de : cultiver des cellules selon l'un des procédés définis plus haut, mettre au moins l'un desdits compartiments cellulaires d'au moins l'une desdites cellules en présence de sondes pour ledit biomarqueur, révéler et/ou quantifier à l'aide desdites sondes la présence dudit biomarqueur. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé pour étudier les biomarqueurs présents dans un compartiment cellulaire, comportant au moins les étapes de : - cultiver des cellules selon l'un des procédés définis plus haut, collecter le surnageant présent dans au moins l'une des chambres microfluidiques, et rechercher ou quantifier dans son contenu un ou plusieurs biomarqueurs. La recherche ou la quantification du ou desdits biomarqueurs peut impliquer au moins la détermination du contenu en une séquence nucléotidique, ou la détermination du contenu en un polypeptide, ou la détermination du contenu en un métabolite. dudit compartiment cellulaire ou dudit surnageant. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé pour déterminer la réaction de certaines cellules à une espèce, comportant les étapes consistant à: a) cultiver des cellules en utilisant l'un des dispositifs définis plus haut, ou l'un des procédés définis plus haut, puis b) mettre au moins l'un des compartiments cellulaires desdites cellules en présence de la dite espèce dans au moins l'une des chambres microfluidiques dudit dispositif Ce procédé peut comporter en outre une étape c) consistant à étudier l'effet de la stimulation effectuée à l'étape b) sur un autre compartiment cellulaire ou dans une autre chambre microfluidique du dispositif. Le procédé peut être appliqué en parallèle sur plusieurs dispositifs présents sur le même support microfluidique, en mettant en jeu entre au moins deux dispositifs différents des différences entre au moins un type cellulaire, un type de tampon. un type d'espèce, ou un type de système d'interconnexion, afin d'effectuer un criblage différentiel. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé de criblage d'agents neurotoxiques, ou de criblage de médicaments neuroprotecteurs, mettant en jeu au moins un dispositif tel que défini plus haut ou l'un des procédés ci-dessus. L'invention a encore pour objet, selon un autre de ses aspects, un procédé de fabrication d'un dispositif microfluidique dans lequel on réalise ledit système microfluidique par une technique de photogravure à partir d'un premier masque comportant une pluralité de motifs micrométriques, et en superposant pendant la photogravure audit masque un second surmasque présentant une transparence optique correspondant à un sous-ensemble de ladite pluralité de motifs, afin de transférer uniquement ledit sous-ensemble sur le substrat pendant la photogravure. L'invention permet, selon des modes de mise en oeuvre, une compartimentalisation neuronale efficace, l'imposition d'une directionalilté à la croissance axonale, la sélection entre différents types d'axones, et/ou la création de réseaux de cellules impliquant différents types de cellules contenus dans des chambres différentes, et présentant des connexions dirigées par l'intermédiaire des extensions cellulaires. L'invention peut permettre d'imposer de façon dynamique certains stimuli physiques ou chimiques à un ou plusieurs sous-compartiments cellulaires sélectionnés. le biomarquage spécifique de certains de ces sous-compartiments et l'analyse du contenu biologique de certains de ces sous-compartiments. Selon un aspect, le dispositif microfluidique de l'invention comprend au moins deux chambres microfluidiques de culture cellulaire, dont la dimension est compatible avec le développement de soma cellulaires, séparées par une zone d'interconnexion microfabriquée dont la géométrie peut affecter la direction, la cinétique. le nombre, le type. les interconnexions, de fibres axonales ou plus généralement d'extensions cellulaires. Différents types de microstructures peuvent être utilisées à cet effet, et divers exemples sont proposés ci-dessous. Différents types de microstructures du système d'interconnexion fludique peuvent avoir différents types d'effets ou exercer différents types de sélection sur la croissance des extensions cellulaires, et peuvent être sélectionnés et éventuellement combinés en fonction des effets souhaités. Des structures comportant des canaux présentant un rétrécissement asymétrique vont favoriser la croissance d'extensions cellulaires dans un sens, en général celui qui va du plus large au plus étroit. Des structures comportant des microcanaux présentant une tortuosité permettront de retarder, accélérer ou sélectionner certains types particuliers d'axones appartenant à des sous-types neuronaux. Des structures à base d'obstacles, par exemple de micro-piliers, peuvent permettre une compartimentalisation axonale ou dentritique, tout en permettant de réguler la formation de connexions inter-axonales. Un autre objet de l'invention est de proposer des dispositifs de culture microfluidiques, comportant en sus des systèmes d'interconnexion ci-dessus, des sous-chambres de culture de cellules individuelles permettant de contrôler précisément le positionnement des somas cellulaires. Optionnellement, ces sous-chambres présentent une surface traitée de façon à favoriser l'adhésion d'au moins un certain type de soma cellulaire. L'invention concerne tout type de cellules pouvant, lors de leur multiplication et/ou de leur différenciation, donner lieu à des extensions cellulaires. Elle concerne en particulier des cellules souches, des cellules neuronales, des cellules souches neuronales. ainsi que toutes les cellules pouvant donner naissance, lors de leur différenciation. à des cellules neuronales et à des sous-types neuronaux spécialisés. L'invention peut permettre la reconstruction orientée de réseaux neuronaux du plus simple au plus complexe, impliquant éventuellement différents sous-types neuronaux, et/ou une combinaison de neurones et de cellules non-neuronales, et/ou différents types d'interactions axonales et/ou dendritiques entre neurones. L'invention peut permettre de reconstruire et d'étudier les interactions entre cellules neuronales et cellules non-neuronales. L'invention peut permettre d'adresser des compartiments neuronaux spécifiques avec des réactifs et/ou des médicaments, de collecter pour analyse des biomarqueurs provenant de certains de ces compartiments. Le caractère transparent des chambres et des systèmes d'interconnexion peut faciliter l'analyse in situ, optionnellement en temps réel, desdits compartiments cellulaires tels que axones, dendrites, synapses, soma, avec des outils de biologie moléculaire ou cellulaire tels que, à titre d'exemples non-limitatifs, l'immunohistochimie. l'hybridation d'acides nucléiques, l'amplification d'acides nucléiques, l'électrochimie. l'électrophysiologie. Entre dans le cadre de l'invention la réalisation de telles études pendant le développement neuronal, dans des états neuronaux ou patholologiques. L'invention est particulièrement bien adaptée aux études comparatives, le criblage à haut contenu (high content screening), le criblage à haut débit (high throughput screening), la recherche de médicaments ou les études toxicologiques. Elle est également particulièrement bien adaptée à l'étude de l'effet de neurotoxiques naturels ou artificiels, de signaux apoptotiques, de neuroprotecteurs naturels ou artificiels. D'une manière générale, elle se prête bien à l'étude détaillée de la présence, dans des compartiments cellulaires spécifiques, de biomarqueurs. Par "biomarqueur" on entend tout type d'information relative à l'état biologique d'une cellule. Des exemples typiques de biomarqueurs couramment utilisés en biologie, en biologie cellulaire et en médecine, sont la présence d'une protéine, sa concentration, son taux d'expression, la présence ou la concentration d'un métabolite. d'un neurotransmetteur, d'une séquence nucléotidique, d'une enzyme où encore la localisation d'une protéine, sa distribution spatiale dans le compartiment cellulaire, ou toute combinaison de ces critères. Selon l'invention, ces biomarqueurs peuvent être détectés par diverses méthodes, optiques, en particulier l'imagerie de fluorescence, ou électrique, en particulier l'électrophysiologie. De nombreuses méthodes sont connues de l'homme de l'art, et en particulier des biologistes cellulaires et des neurologues. pour identifier des biomarqueurs dans des cellules, En fait. un des avantages majeurs de l'invention, est de permettre l'utilisation in vivo de la plus large panoplie de méthodes de détection et d'analyse de biomarqueurs connue en biologie cellulaire et de pouvoir pour la première fois le faire sur des neurones disposés dans des architectures précédemment inaccessibles. L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, d'exemples de mise en oeuvre non limitatifs de celle-ci, et à l'examen du dessin annexé. On a représenté à la figure 1, de manière schématique, un exemple de dispositif 5 microfluidique 1 réalisé conformément à l'invention, encore appelé "puce". Ce système microfluidique 1 comporte dans l'exemple considéré des chambres microfluidiques 2, en espèce au nombre de deux et référencées 2a et 2b, destinées à être ensemencées par des première et deuxième cultures cellulaires respectivement. Le système microfluidique 1 comporte également un système d'interconnexion 10 fluidique 3 reliant les première et deuxième chambres 2a et 2b et permettant à des extensions cellulaires de s'étendre d'une chambre vers l'autre chambre. Les chambres microfluidiques 2 sont par exemple réalisées avec deux portions parallèles respectives 4a et 4b entre lesquelles s'étend le système d'interconnexion fluidique .3. 15 Les portions 4a et 4b, encore appelées macrocanaux, sont par exemple, comme illustré, reliées à leurs extrémités à des portions 5 plus larges, par exemple de forme cylindrique. Le dispositif 1 peut être réalisé sur tout support adapté, monomatière ou multimatériau. Ce support peut comporter, comme illustré à la figure lA, plusieurs 20 dispositifs de culture cellulaire 1 selon l'invention. Dans l'exemple de la figure 1A, les dispositifs 1 sont réalisés sur un substrat basal qui est par exemple transparent, étant par exemple une lamelle de microscope circulaire, par exemple de 42 mm de diamètre. L'invention n'est pas limitée à un matériau et à une forme particulière. 25 Sur la figure 1 B. les dispositifs 1 comportent trois chambres 2a, 2b et 2c par dispositif 1 microfluidique. La troisième chambre 2c comporte une portion 4c rectiligne qui s'étend entre les portions 4a et 4b des chambres 2a et 2b. Cette portion 4c relie deux portions plus larges 5 de la chambre 2c. 30 Les portions 4a, 4b, 4c ont par exemple une largeur d'au moins 551,1m. Sur les figures 1A et 1B, on n'a pas représenté dans un souci de clarté du dessin le système d'interconnexion fluidique 3. Le système d'interconnexion fluidique 3 peut être réalisé de diverses façons. dans le but de privilégier la progression d'au moins un premier type d'extension cellulaire par rapport à au moins un deuxième type d'extension cellulaire, les premier et second types d'extension cellulaire différant par exemple par la chambre microfluidique dont ils proviennent ou par le type cellulaire dont ils sont l'extension. D'une manière générale, le système d'interconnexion fluidique peut comporter une pluralité de microcanaux juxtaposés, qui sont reliés à leurs extrémités aux chambres cellulaires, soit directement, soit par l'intermédiaire de chambres monocellulaires comme cela sera précisé plus loin. Le système d'interconnexion fluidique peut comporter par exemple entre 1 et 1000 microcanaux, lesquels peuvent avoir diverses formes. Tous les microcanaux d'un même système d'interconnexion fluidique peuvent avoir la même forme, chacun étant par exemple la réplique d'un autre par exemple par une translation ou une rotation ou une transformation géométrique plus complexe. Dans un exemple de mise en oeuvre de l'invention, le système d'interconnexion fluidique comporte une pluralité de microcanaux dont les axes longitudinaux sont parallèles et par exemple perpendiculaires aux macrocanaux 4a et 4b, voire 4c. des chambres cellulaires 2 qu'ils relient. Le système d'interconnexion fluidique peut comporter des microcanaux ayant 20 une forme asymétrique, notamment lorsqu'observé en vue de dessus. Sur la figure 2A, on a représenté un premier exemple de microcanal 10 du système d'interconnexion fluidique 3, présentant une forme asymétrique, avec une portion plus large l0a de largeur a et une portion plus étroite 10b de largeur b, reliées par une portion intermédiaire 10c, ayant par exemple une largeur qui décroît linéairement. 25 On a remarqué de façon étonnante qu'en utilisant des dispositifs présentant des canaux asymétriques de longueurs différentes, on était capable de sélectionner les axones non seulement en fonction de la chambre de laquelle ils proviennent, mais également en fonction de leur sous-type cellulaire. Par exemple, en utilisant des canaux d'au moins 1200 !am de long, les neurones 30 de granules cérébraux ne peuvent envoyer d'axones dans la chambre distale, tandis que les neurones de projection le peuvent. Egalement, on a observé que des axones ne pénètrent pas ou pénètrent difficilement dans un canal dont la largeur est inférieure ou égale à 2 �m. ce qui permet d" effectuer des interconnexions fluidiques imperméables aux axones. Les figures 2B à 2D représentent également d'autres formes possibles pour les microcanaux 10, par exemple une forme trapézoïdale en vue de dessus comme illustré sur la figure 2B, une forme en ogive comme illustré à la figure 2C ou une forme en pavillon comme illustré à la figure 2D. La largeur du microcanal 10 peut varier de façon linéaire ou non, lorsque l'on se déplace le long de l'axe longitudinal de celui-ci. Les microcanaux 10 peuvent être formés par des rainures en partie basse du dispositif, comme illustré à la figure 2E, ou par des rainures formées en partie haute, comme illustré sur la figure 2F. Les microcanaux 10 ont par exemple une longueur comprise entre 10 �m et 10 000 �m. de préférence entre 50 �m et 2000 �m, par exemple de l'ordre de 500 �m. Les microcanaux 10 ont par exemple une épaisseur comprise entre 1 et 5 �m, par exemple de l'ordre de 3 �m. La largeur des microcanaux 10, dans leur partie la plus large, est par exemple comprise entre 5 et 100 �m et dans la partie la moins large est comprise entre 1 et 10 �m. La largeur des microcanaux, dans la partie la moins large, est par exemple au plus égale à la moitié de leur largeur dans la partie la plus large. Dans des exemples de réalisation, la largeur dans la partie la plus large vaut 10 et celle dans la partie la moins large 3�m. Avec de telles valeurs, on peut observer de façon surprenante et spectaculaire une sélectivité avoisinant 1000, c'est-à-dire que les cellules contenues dans la chambre cellulaire en contact avec la partie la plus large du microcanal envoient au moins 1000 fois plus d'axones que celles contenues dans la chambre cellulaire en contact avec la partie étroite du microcanal. Les microcanaux du système d'interconnexion fluidique peuvent avoir chacun une forme rectiligne ou en variante une forme non rectiligne. Sur la figure 3A, on a représenté un microcanal 10 ayant une forme en zigzag, avec par exemple des portions consécutives disposées à angle droit les unes par rapport aux autres. La période L du motif en zigzag est par exemple comprise entre 5 �m et 100 �m, et de préférence entre 10 et 50 �m Sur la figure 3B. on a représenté un microcanal 10 ayant une forme ondulée. composée par exemple d'une succession de portions hémicirculaires. Suivant le type neuronal à sélectionner. la période L du motif ondulé est par exemple comprise entre 3 et 5 �m, ou entre 5 et 10 �m, ou encore entre 10 et 30 �m. Ce type de canaux peut être utile pour sélectionner des sous-types d'axones. Par exemple, en utilisant des canaux avec de faibles rayons de courbure, on a observé que les axones corticaux sont arrêtés, alors que les axones de l'hippocampe ou les axones striataux sont capables de traverser ces canaux. On a représenté à la figure 3C un exemple de microcanal 10 qui comporte une succession de portions élargies l0a et de portions rétrécies 10b. Les portions rétrécies 10a et 10b sont par exemple de largeur constante tandis que les portions élargies présentent des entrées et sorties respectivement divergentes et convergentes et une portion médiane 10c de largeur constante a, par exemple comprise entre 5 �m et 50 �m. La largeur b des portions rétrécies 10b est par exemple comprise entre 2�m et 10 �m La longueur d des portions rétrécies 10b est par exemple comprise entre 10 et 500 �m. La longueur c des entrées et sorties est par exemple comprise entre 10 et 500 �m. La longueur f de la portion 10c est par exemple comprise entre 10 et 500 �m. Les figures 4A à 4C donnent des exemples de système d'interconnexion 3 du type constitué de réseaux d'obstacles. Sur ces figures, on voit que l'on peut réaliser des obstacles 70, par exemple sous la forme d'îlots circulaires (encore appelés micro-piliers) comme illustré sur la figure 4A ou de pavés de forme polygonale, par exemple rectangulaire comme illustré sur la figure 4B. Les obstacles 70 peuvent avoir différentes dispositions, par exemple être agencés sous forme de réseau avec positionnements réguliers dans les deux dimensions du plan comme sur la figure 4A ou 4B. Les obstacles 70 peuvent encore être sous la forme d'agencements où les centres des îlots sont disposés comme les sommets de polygones. comme illustré à la figure 4C. La disposition de la figure 4A correspond à un mode de réalisation privilégié. dans lequel il n'est pas possible de faire circuler entre les obstacles 70 une ligne ne présentant pas de rayon de courbure inférieur au rayon des obstacles. Une telle disposition peut être utilisée pour séparer des axones corticaux et striataux. Les valeurs a.. b et c valent par exemple entre 2 et 10 �m. entre 2 et 10 �m, et entre 5 et 100 �m, respectivement, et préférentiellement entre 2 et 5�m, entre 2 et 5�m, et entre 5 et 50 �m. La figure 5 donne des exemples, non-exhaustifs, de dispositions utilisables pour former à l'aide de l'invention des architectures neuronales complexes et orientées. Les petits rectangles représentent, de façon shématique, des chambres de culture cellulaire 2. Les flèches représentent, également de façon shématique, les systèmes d'interconnexion et leur directionalité. Ces systèmes dirigés peuvent être utiles par exemple pour étudier la croissance axonale, la synaptogénèse, le transport rétrograde et antérétrograde, ou la signalisation cellulaire, pour étudier les processus neurodégénératifs, comme les maladies d'Alzheimer, de Huntington, de Parkinson, en particulier celles dans lesquelles des sous-types spécifiques de neurones montrent des signes de dysfonctionnement synaptiques précoce. En particulier, si l'on souhaite pouvoir infuser des réactifs auprès de certains compartiments neuronaux, ou collecter des produits, sans perturber l'organisation neuronale, selon l'une des variantes de l'invention, le système d'interconnexion est délimité sur au moins une partie de sa surface par une paroi poreuse permettant l'échange avec un compartiment annexe de molécules et d'ions, mais ne permettant pas l'échange avec ledit compartiment annexe de cellules. Cette paroi peut être constituée par exemple en intercalant une membrane entre deux couches de matériau constituant, respectivement, la partie basse et la partie haute du canal, et en réservant dans la partie haute un canal annexe, en contact avec ladite membrane, et capable d'amener ou de collecter des produits. Selon d'autres modes de mise en oeuvre, cette membrane peut être constituée in situ, par exemple par photopolymérisation. Enfin, elle peut aussi être constituée par un réseau d'obstacles très rapprochés, par exemple présentant une distance inférieure à 2 �m, qui ne laisse pas passer les axones. A la figure 6A, on a représenté un exemple de microcanal 10 avec bifurcation qui comporte une première portion 50 qui se raccorde à deux branches 51. La portion 50 peut présenter une largeur a de même que les branches 51. Les motifs avec bifurcations permettent par exemple la connexion ou la division axonale. Les axes longitudinaux des branches 51 sont par exemple écartés, à l'extrémité opposée à l'extrémité d'entrée de la portion 50, d'une distance L. L'axe longitudinal de la portion 50 est par exemple contenu dans un plan médian pour les branches 51. Ces dernières peuvent comporter deux portions 52 qui divergent, par exemple sur une longueur de 100 �m. A la figure 6B, on a représenté un tableau de valeurs pour les paramètres a et L pour différents exemples de configurations A à E. A la figure 6C. le microcanal 10 est réalisé avec une portion 50 dont la largeur 2a est par exemple double de celle des branches 51. Le tableau de la figure 6D donne quelques exemples de valeurs pour la largeur a, dans différentes configurations A à C. La figure 6E représente un microcanal 10 comportant une portion 50 qui se rétrécit avant de se scinder en deux branches 51. La portion 50 passe par exemple d'une largeur a à une largeur b et les branches 51 ont par exemple la même largeur que celle de la portion rétrécie 54. La longueur de la portion convergente 55, par laquelle la portion 50 se raccorde à la portion rétrécie 54, vaut par exemple 100 �m. Le tableau de la figure 6F donne différents exemples du ratio a/b pour différentes configuration A à C. La présence de la portion rétrécie 54 permet de focaliser le faisceau. La configuration de la figure 6C permet de conserver le débit. La contrainte sur le filopode est à priori plus grande que dans l'exemple de la figure 6A, ce qui permet d'espérer sa fission. La figure 6G présente une configuration ayant des propriétés similaires à celles de la figure 6C en ce qui concerne les contraintes mécaniques sur la zone en Y. La configuration de la figure 6G permet aussi de tester le comportement de faisceaux d'axones qui se croisent. Dans la configuration de la figure 6G, les microcanaux 10 comportent des portions rectilignes parallèles 60 qui se raccordent à des branches 61 qui divergent puis convergent pour se raccorder à une nouvelle portion rectiligne 60. Deux branches 61 de deux canaux adjacents se rejoignent en 63, les branches ménageant entre elles un îlot 64. L'écartement entre les axes longitudinaux des portions rectilignes 60 est par exemple de 30 �m et le pas dans la direction longitudinale est par exemple de 100 �m. La largeur d'une portion 60 est par exemple double, égale à 2a de celle d'une branche 61. Le tableau de la figure 6H donne différents exemples de valeurs de la largeur a dans des configurations A à C. Sur la figure 7, on a illustré la possibilité de réaliser des chambres monocellulaires 80 entre les chambres 2. Les chambres monocellulaires 80 communiquent par exemple avec une extrémité 90 d'un microcanal associé 10 et du côté opposé avec un canal de liaison 92 dont la section est plus grande que celle du microcanal 10 qui se raccorde directement à la chambre 2. La chambre 2 fait par exemple 55 !am de hauteur, les chambres monocellulaires 12 �m et les microcanaux 10, 30 �m. Les chambres monocellulaires 80 peuvent piéger les somas des neurones devant l'entrée des micro-canaux. Pour réaliser ces structures, une troisième couche de résine peut s'avérer nécessaire. Leur taille caractéristique pourrait varier de 10 à 100 .xm pour accueillir un ou plusieurs somas. En ce qui concerne la fabrication des dispositifs selon l'invention, de nombreuses méthodes de microlithographie peuvent être utilisées, par exemple celles 15 décrites par Patrick Tabeling. Introduction à la microfluidique Belin. Selon un mode de réalisation privilégié, le dispositif est fabriqué grâce aux méthodes de lithographie douce, comme décrit dans Whitesides, G. M. Ostuni. E. Takayama, S. ; Jiang, X. ; Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry., Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001, 3, 335-373. On peut utiliser un élastomère. le PDMS (poly- 20 diméthylsiloxane) qui, une fois réticulé, possède des propriétés bien adaptées à la biologie cellulaire et moléculaire : transparent, peu réactif, biocompatible. Le PDMS nest pas une surface sur laquelle les neurones adhèrent naturellement. Quel que soit l'environnement de culture (boîte de petri ou puce microfluidique), il peut s'avérer utile de traiter chimiquement la surface. Le moyen le plus 25 couramment utilisé consiste à utiliser de la poly-lysine, qui s'adsorbe aux parois et permet l'adhésion cellulaire. Il est aussi possible d'utiliser d'autres protéines d'adhésion comme la fibronectine ou le collagène, mais ces substances ne s'adsorbent pas suffisamment au PDMS de façon naturelle pour permettre l'adhésion cellulaire, contrairement à la polylysine. Il peut être nécessaire de les lier chimiquement au PDMS. On peut donc utiliser un 30 cross-linker 2 photo-activable : lorsque celui-ci reçoit un rayonnement UV, l'énergie reçue lui permet de créer une liaison avec le PDMS. De nombreux réticulants ou crosslinkers, peuvent être utilisés dans l'invention, tels que, à titre d'exemples non limitatifs : - Sulfo-sanpah : Le sulfo-sanpah (N-Sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'- nitrophenylamino] hexanoate) est une molécule qui possède à l'une de ses extremités un groupement nitrophenyle azide photo-activable, et à l'autre extremité un groupement ester N-sulfosuccinimidyle qui a pour particularité d'être très réactif avec les fonctions amines (arnidation), très courantes dans les protéines. - Benzophénone et BBTA : La benzophénone est un initiateur radicalaire qui s'adsorbe fortement sur le PDMS. Lorsqu'il est photo-activé, il peut créer une liaison avec une molécule contenant des hydrogènes et ainsi la greffer sur la surface. La BBTA ((4-benzoylbenzyl)triméthylammonium) est une version hydrophile de la benzophénone, mais son fonctionnement est a priori le même, à ceci près qu'il peut être mis dans la même solution que les protéines puisqu'il est hydrophile. La réaction a lieu alors que les deux molécules sont dans l'eau, contrairement à la benzophénone qui doit d'abord être adsorbée sur le PDMS. Selon un mode de réalisation privilégié, utile en particulier en conjonction avec les applications dans lesquelles on souhaite favoriser l'adhésion de cellules ou de compartiments cellulaires spécifiques à des endroits spéciriques, on peut utiliser une photo-activation localisée. On peut par exemple utiliser un masque pour n'éclairer aux UV qu'aux endroits désirés, afin de créer des motifs de protéines d'adhésion comme décrit dans Jenny Fink. Manuel Théry, Ammar Azioune, Raphael Dupont, François Chatelain. Michel Bornensa and Matthieu Piel. Comparative study and improvement of current cell micropatterning techniques. Lab on a Chip, 2007, 7,672-680. Selon un autre mode préféré, on peut également utiliser une photo-activation par microscope (PPM) : On peut en envoyant des UV à travers un microscope, les projeter sur la surface PDMS de la puce microfluidique, tel que décrit par exemple dans Jun Nakanishi, Yukiko Kikuchi, Tohru Takarada, Hidekazu Nakayama, Kazuo Yamaguchi, and Mizuo Maeda. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 16314-16315 . En plaçant un photo-masque avec les motifs désirés dans le plan focal objet du microscope, on obtient les motifs souhaités sur la surface des canaux micro-fluidiques. De plus, l'objectif permet de rétrécir considérablement la taille des motifs du photo-masque, ce qui permet de gagner en précision. Certaines structures d'interconnexion nécessitent une résolution de l'ordre du �m. C'est pourquoi il est souhaitable d'utiliser un masque en quartz haute résolution. Afin de rentabiliser au maximum ce support, il entre également dans les objectifs de l'invention de proposer une nouvelle méthode de lithographie facilitant sa mise en oeuvre. Selon cette méthode, la surface entière d'un masque 120 en quartz, par exemple tel que représenté à la figure 8, est gravée d'une multiplicité de motifs de microcanaux et de chambres cellulaires. Cet outil permet en un seul masque d'explorer des motifs qui pourraient avoir un intérêt dans l'élaboration d'un réseau contrôlé de neurones, ou permettre de tester certaines propriétés des projections axonales comme leur propriété de fasciculation/défasciculation ou leur comportement dans des canaux arrondis. Le but de ce masque 120 est double : - Permettre de lithographier à la fois 4 microstructures différentes de manière standardisée. Il a été conçu pour avoir un maximum de compatibilité avec les différentes géométries de macrocanaux, et peut donc être utilisé pour toutes les géométries, ce qui offre une grande souplesse d'utilisation. - Placer le plus de motifs différents sur un même masque en quartz (qui est assez onéreux). Une multiplicité de motifs (96 dans l'exemple donné en figure 8) peuvent être juxtaposés les uns à côté des autres (les pas ont été standardisés). Des motifs d'alignement ont été disposés en son centre. On peut donc l'utiliser pour faire les motifs de puce possédant beaucoup de compartiments, tant que la résine utilisée pour les microstructures est une résine négative. 13 formes de micro-canaux et 6 formes de compartiments cellulaires ont été gravés sur le masque 120. Chaque forme a été reproduite avec différentes tailles, portant le nombre de motifs à 96. Des motifs multi-échelles ont par ailleurs été gravés. Ces motifs regroupent en un seul différentes tailles et formes, le but étant d'explorer un maximum de formes en un minimum d'expériences. Par exemple, pour les canaux rétrécissant, un motif multi-échelle a été conçu. qui permet de savoir en une expérience quelle taille est favorable pour un type de neurone donné. A titre d'exemple, un total de 96 motifs différents représentés dans la figure 8. peuvent être produits à partir d'un seul masque haute résolution. La sélection entre les différents motifs peut être effectuée par un surmasque 130 à plus basse résolution présentant des fenêtres 110, comme représenté à la figure 10. La figure 9 représente deux exemples de motifs pouvant apparaître à travers une fenêtre 110. Le surmasque 130 peut également comporter des motifs d'alignement 135. L'invention peut être utilisée avantageusement pour cultiver et étudier différents types de cellules, étant particulièrement intéressante pour travailler sur des neurones. Les neurones sont des cellules qui une fois différenciées, ne se multiplient plus. Il est donc impossible de propager des cultures cellulaires de neurones. Il est par ailleurs important d'obtenir ces neurones pendant leur pic de neurogénèse : c'est le moment ou la prolifération des neurones se termine et où la différenciation est faite. Par ailleurs ils ne sont pas encore matures. c'est à dire que leurs axones et leurs dendrites n'ont pas encore poussé, et il est donc possible de les ensemencer dans les boîtes de cultures ou les puces. Avantageusement, on utilisera dans les dispositifs selon l'invention, du matériel neuronal prélevé sur des animaux, et notamment des souris, selon des protocoles de dissection bien connus de l'homme de l'art. L'invention permet également de visualiser des cellules, et de localiser des substances au sein de compartements cellulaires spécifiques. L'invention se prête particulièrement bien à toutes les techniques d'immunomarquage, d'immunohistochimie, de marquage d'ADN. de marquage fluorescent, luminescent ou chemiluminescent. Ci-dessous est donnée à titre d'exemple une liste de molécules intéressantes pour la biologie cellulaire, qui peuvent être détectées par immunomarquage fluorescent dans des dispositifs selon l'invention. û a-tubuline : Cette sous-unité de la tubuline est présente dans toutes les microtubules des cellules. Ce marquage permet donc de voir la totalité des cytosquelettes des cellules présentent dans le compartiment. û 133-tubuline : Sous-unité spécifique des microtubules des axones, sauf exception. û Map2 : Map2 est associée aux microtubules. Elle est surtout présente dans les dendrites. ù Synaptophysine : Lorsqu'un axone n'a pas de synapse, la synaptophysine est présente de façon homogène dans l'axone. Elle s'accumule dans les synapses lorsque celles-ci maturent et se connectent à un neurone. ù p-erk : erk (extra cellular regulated kynase) est une protéine kynase qui, lorsqu'elle est activée, est phosphorylée puis transloquée dans le noyau. Son activation intervient dans la cascade de transduction du signal glutamatergique des neurones striataux. On peut vérifier à l'aide de ce marquage que les neurones striataux ont bien été activés par le glutamate. On peut également utiliser un Marquage non-immunologique. Par exemple, on peut utiliser dans les dispositifs selon l'invention le DAPI ou tout autre intercalant de l'ADN, qui permet de visualiser les noyaux des cellules. La figure 11 est une photographie d'un exemple de réalisation d'un système d'interconnexion comportant des microcanaux dont la largeur décroît d'une chambre microfluidique à l'autre. Sur la figure 11, on voit à gauche le compartiment somatique où ont été ensemencés les neurones corticaux. Les axones traversent les microcanaux 10 dont la largeur passe par exemple de 15 �m en entrée à 3�m en sortie. On voit sur la photographie qu'à gauche, les neurones corticaux projettent des faisceaux d'axones dans la partie large des microcanaux tandis qu'à droite les faisceaux d'axones corticaux, indiqués par des flèches en pointillés ressortent du côté rétréci et se connectent aux somas et aux axones striataux repérés par des flèches en trait continu. Sur la figure 12, on voit sur la photographie de gauche la sortie des microcanaux les plus étroits, en contraste de phase 40x, avec une culture corticale seule et sur la photographie de gauche dans le cas d'une cocultutre. Dans ce dernier cas, le réseau d'axones corticaux est beaucoup plus diffus et enchevêtré. Exemples Exemple 1 : Masters en résine pour la fabrication de dispositifs selon l'invention. Deux couches de résines sont utilisées afin que le master possède des structures de deux épaisseurs différentes, à savoir 3 �m et 55 �m. Les microcanaux sont réalisés avec de la résine SU8 2002 (Microchemicals) et les macrocanaux (épaisseur 55 �m) avec une résine négative laminable SY355 (Microchem). Les deux masques de photolithographie pour la réalisation du master en résine du canal microfluidique sont dessinés à partir du logiciel QCad. Des lames de verres (lmm d'épaisseur, 52 mm de diamètre, Ediver, France) sont lavées à l'isopropanol, trempées dans un mélange piranha (50 % H2O2, VWR International, 50 % H2SO4. VWR International) pendant 30 minutes, puis séchées à 150°C pendant 2 heures. Les lames sont traitées au plasma 30s. La résine SU8 est étalée sur la lame à une vitesse déterminant son épaisseur (http ://www.microchem.com/products/pdf/SU8_2-25.pdf). Une pré-cuisson sur plaque chauffante suit l'étalement pour éliminer le solvant restant dans la résine. La résine est ensuite insolée 8 secondes aux UV (aligneur Karl Suss MJB3) à travers un support en quartz de 3mm. Une post-cuisson permet la réticulation de la résine. Le développement est conduit dans le développeur approprié à la résine jusqu'à l'apparition des motifs. Le substrat est rincé en fin de protocole. Un recuit final permet de renforcer l'adhérence de la résine au substrat et de durcir les structures en achevant la réticulation. Il faut ensuite déposer la deuxième résine. Les lames sont préchauffées à 80 °C. Le film de résine est laminé à 65°C sur les lames, insolé aux UV pendant 10 sec avec le masque pour les macro- canaux, puis développé. Un rinçage à l'isopropanol achève le procédé. Exemple 2 : Procédé de fabrication des dispositifs. La fabrication des dispositifs se fait en 2 étapes. 1) Moulage du PDMS : Le moulage du dispositif se fait en versant du PDMS avec 1 :10 w/w d'agent réticulant (Sylgard 184, Dow Corning), dans un moule en PTFE contenant le master. L'ensemble est ensuite laissé à réticuler 4 heures au four à 65°C. Les trous des réservoirs sont ensuite réalisés à l'aide d'un poinçon de diamètre 4-5 mm. 2) Collage de la puce : Pour sceller le dispositif, une lame de verre est collée sur la puce en PDMS. Pour cela les 2 surfaces sont soigneusement nettoyées à l'isopropanol, puis sont traitées au plasma air (PDC-32G, Harrick) pendant 45 secondes, puis la puce et la lame de verre sont mises en contact. Exemple 3 : Traitement de surface On décrit ici différents exemples de traitement de surface du substrat de dispositifs selon l'invention. (par exemple des lames de verre, afin de faciliter l'adhésion des neurones ou la progression des axones. Dans le protocole décrit ci-dessous, la protéine utilisée est de la fibronectine rendue fluorescente par un greffage de FITC. Cependant, ces protocoles peuvent être utilisés tels quels pour fonctionnaliser les lames avec d'autres molécules intéressantes pour telle ou telle application particulière. Préparation des lames de PDMS : Dans un premier temps des lames de verre 4 cm de diamètre (Edriver) sont nettoyées à l'isopropanol. Puis du PDMS à 10 % en réticulant est déposé sur la lame et étalé par rotation à 1000 rpm. Les lames sont ensuite mises au four à 65°C au moins 2 heures. Les lames sont ensuite traitées avec l'un des 3 protocoles suivants : û Les lames sont traitées au plasma 45 secondes et sont tout de suite utilisées. Elles conservent alors un caractère à la fois radicalaire et hydrophile. û Les lames sont traitées au plasma et sont conservées au minimum 4h en contact avec de l'eau. Elles perdent ainsi leur caractère radicalaire mais conserve leur hydrophilie. û Les lames ne sont pas traitées au plasma et ont donc une surface hydrophobe. Traitement sulfo-sanpah : Du sulfo-sanpah (Pierce) solide est dilué à 250 �g=mL dans une solution d'HEPES (50 mM à pH 8.5). Il possède une couleur rouge vif. 200 �L de sulfo-sanpah est déposé sur la lame et insolé sous une lampe à UV jusqu'au noircissement de la solution (5 min). La lame est lavée 2 fois à dHEPES sous agitation au shaker pendant 15 min. Une goutte de la solution de fibronectine-FITC diluée à 0.2 mg/mL dans du PBS est déposée sur la lame qui est placée dans une boîte de petri conservée humide à l'aide d'une lingette imbibée d'eau. La lame est laissée une nuit à 4°C avant d'être rincée au PBS 1X pour être utilisée. Traitement benzophénone : Une lame est placée dans une solution de benzophénone à 10 % d'eau /acétone pendant 1 min puis rincée à l'acétone. Une goutte de solution de fibronectine-FITC diluée à 0.2 mg/mL est déposée sur la lame que l'on illumine aux UVs de la même manière que pour le sulfo-sanpah pendant 20 min. La lame est ensuite rincée au PBS. Traitement BBTA : La solution de BBTA à 62mM est complétée avec 0.25 30 mg/mL de solution de fi-bronectine FITC et 0,25 mg/mL de fibronectine naturelle. La lame est exposée aux UV, puis rincée au tampon PBS Exemple 4 : Culture primaire et ensemencement des neurones Neurones en grains de cervelet (CGN) Les cervelets sont prélevés sur des souriceaux de lignée Swiss âgés de 5 à 7 jours. Après avoir procédé à la décapitation de toute la portée, 3 incisions sont réalisées en arrière de la tête afin de dégager les hémisphères cérébelleux. Ils sont ensuite prélevés chirurgicalement, et déposés dans une boîte de pétri contenant du PBS (Gibco). Une fois les méninges retirés, les cervelets sont découpés finement, rincés 3 fois au PBS et dissociés en trypsine-EDTA (Gibco) 10 minutes à 37°C. La trypsine est ensuite inhibée par l'ajout de 10 % de SVF. Les cellules sont remises en suspension dans une solution de DMEM Glutamax I en présence de 5 U/ml de DNAse 1 (sigma), puis dissociées mécaniquement à l'aide d'une pipette de l0ml. Après 3 centrifugations de 6 minutes à 80g, le culot est resuspendu à une densité de 50 millions de cellules par ml, dans du DMEM Glutamax (Invitrogen), contenant 10% de sérum de veau foetal (Biochrom) Streptomycine/ Penicilline (Gibco), 25 mM de KC1 et complémentés avec les suppléments neuronaux N2 et B27 (Gibco). Les cellules sont ensuite ensemencées dans le compartiment somatique du dispositif. 10 �L de la suspension cellulaire sont introduits dans le réservoir haut dU compartiment somatique. Les cellules s'écoulent alors rapidement dans le compartiment et après une dizaine de secondes du milieu complet sans cellules est ajouté dans l'autre réservoir de manière à stabiliser le flux créé par la différence de pression hydrostatique. et ainsi permettre aux cellules d'adhérer au support. La vitesse du flux et la qualité de l'ensemencement sont contrôlés à l'aide d'un microscope. Une dizaine de minutes après ensemencement, les 4 réservoirs (somatiques et distaux) son remplis de milieux complets (environ 50 �L / réservoir). Entre 20 et 30000 cellules sont ainsi ensemencées dans le compartiment distal. Les puces sont placées dans une boîte de pétri contenant 2 à 3 ml d'eau de façon à éviter l'évaporation du milieu. Le milieu de culture est entièrement renouvelé tous les 2-3 jours, sur une durée qui s'étend sur 12 jours in vitro (JIV). Après deux jours de culture les neurones commencent à se différencier en émettant des neurites dans le compartiment distal. Environ 2 % des neurones ensemencés projettent leurs axones dans les micro-canaux. Apres 4 à 6 jours de culture, les axones engagés dans les microcanaux rejoignent le compartiment distal, pour atteindre une longueur totale de 750 à 1200 �m après 10 jours et ne varient plus avec le temps. Culture primaire de neurones du cortex et du striatum. Les cortex et les striata d'embryons de souris âgés de 14 jours, sont prélevés à partir de lignée swiss. Les outils sont les mêmes que pour les CGN. Les deux hemisphères sont prélevés après avoir entaillé le tour de la boîte crânienne. Le cortex et le striatum peuvent être prélevés simultanément. Les cellules sont ensuite dissociées enzymatiquement puis mécaniquement dans du milieu L15, avant d'être ensemencées dans les dispositifs de culture selon le même protocole que celui utilisé pour les CGN. Le milieu de culture est composé de Neurobasal contenant 2mM de Glutamax-I, de la streptomycine et de la pénicilline, et enfin des suppléments de culture N2 et B27. Après 2 jours de culture les neurones corticaux commencent à se différencier en projetant des neurites dont certains commencent à entrer dans les micro-canaux. Environ 2 % des neurones corticaux ensemencés se projettent dans les microcanaux. Exemple 5 : protocoles d'étude par Immunofluorescence des cultures Toutes les incubations sont effectuées à température ambiante et un flux est généré afin de pouvoir traiter l'ensemble du circuit (micro-canaux). Au temps d'analyse désiré, les cellules sont fixées au paraformaldéhide 4 % en PBS 20 min. Après rinçage au PBS, elles sont perméabilisées en triton X-100, 0,1 % pendant 10 min et saturées pendant 40 min avec une solution de PBS contenant 1%de BSA. Après rinçage, les cellules sont incubées à l'obscurité en présence de dilution d'anticorps primaires d'intérêts pendant 40 min à température ambiante. Après rinçage avec du PBS, les anticorps secondaires dirigés contre les immunoglobulines (IgG) de l'espèce ayant servi à générer le premier anticorps dilués dans une solution de DAPI, sont ajoutés pendant 25 min à l'obscurité. Après rinçage au PBS, les puces sont ensuite scellées avec du milieu de montage �fluoromount �. Les anticorps primaires dirigés contre les protéines d'intérêt suivantes ont été utilisés : _13-tubuline (monoclonal 1 /300eme, Sigma), _a-tubuline (monoclonal 1/300eme, Sigma). Map 2 (polyclonal lapin, 1/300eme, Chemicon), synaptophysine (monoclonal 1/400eme, Sigma). Les anticorps secondaires anti-espèce couplés aux Alexa 350, 488 ou 555 ont été dilué au 1/500eme. Les sondes suivantes ont été utilisées : phalloïdine couplée au cy3 (1/700eme, sigma). Mitotracker red (Molecular probes). Les acquisitions d'images sont réalisées à l'aide d'un microscope Axioberver Z1 (Zeiss) équipé d'une caméra CCD refroidie 12 bits (CoolsnapHQ2, Ropert Scientific) l'ensemble étant piloté par le logiciel open source Micro-Manager. Les Images sont traitées à l' aide du logiciel Image J. Exemple 6 : Culture de neurones en grains de cervelet dans un dispositif selon l'invention. Les NGCs fraîchement dissociés sont ensemencés dans le compartiment somatique. Contrairement aux dispositifs de culture cellulaire conventionnels où toutes les cellules introduites dans un puits de culture adhèrent, le nombre de cellules ensemencées dans les circuits microfluidiques ne peut être estimé qu'après comptage au microscope du nombre de cellules ayant adhéré. Il apparaît ainsi que la densité cellulaire dans le compartiment somatique est approximativement de 20 000 à 30 000 cellules selon les expériences. Après 2 jours in vitro (JIV), les neurones commencent à établir un réseau complexe de neurites dans le compartiment somatique dont certains commencent à pénétrer dans le premier tiers des micro-canaux. A 4 JIV, l'ensemble des 150 micro- canaux est entièrement occupé par des axones en extension dans les canaux. Le compartiment distal est peu à peu envahi par les neurites. A partir de 7 JIV. la pousse neuritique se termine et les axones atteignent leur taille qui est de 750 à 1200 �m depuis le soma, et ne varient plus avec le temps. Dans les systèmes de l'art antérieur, la pousse neuritique s'effectue de façon égale, selon qu'on ensemence le compartiment de droite ou le compartiment de gauche. Un des avantages de l'invention est d'arriver à obtenir des co-cultures pour lesquelles les projections neuronales sont contrôlées (où des neurones corticaux se projettent sur des striataux par exemple). On ensemence donc un type neuronal dans la chambre de gauche. et un autre type neuronal dans le compartiment dans la chambre de droite. Pour que la projection soit contrôlée il est important que les axones puissent traverser les micro-canaux dans un sens et non dans l'autre. Dans cet exemple, on a utilisé des micro-canaux selon l'invention de forme similaire à celle représentée à la figure 28. faisant 15�m de large du côté somatique et 3 �m du côté distal pour une longueur de 5001am. Ainsi les axones du côté rétréci n'entrent pas dans les canaux, alors que les axones du côté large peuvent tout de même traverser car ils sont focalisés. Les axones ne traversent le microcanal que dans un seul sens. Axones corticaux : Lorsque l'on ensemence des neurones corticaux du côté large (15�m), 8 à 10 axones corticaux traversent par microcanal (1000 - 1500 sur tout le système). Lorsqu'ils sont ensemencés de l'autre côté, seulement 5 à 10 axones traversent la puce dans son ensemble. Axones striataux : Les axones corticaux entrent du grand côté (15�m) des canaux rétrécissants mais ils n'arrivent pas à franchir la partie faisant 3 .im de large. Ces dimensions de microcanal sont donc particulièrement bien adaptées à une co-culture dans laquelle on contrôle la projection des axones corticaux sur les neurones striataux, et montre que l'invention peut également être utilisée pour sélectionner la pousse d'axones en fonction du type cellulaire. Exemple 7 : Application à la co-culture cortico-striatale et à la constitution de réseaux neuronaux orientés. Principe : En ensemençant la chambre de gauche avec des neurones corticaux primaires de souris et la chambre de droite avec des neurones striataux (3 jours après). et en utilisant un milieu de culture adapté aux deux types neuronaux, une projection neuronale unidirectionnelle des neurones corticaux sur les neurones striataux a pu être observée au 6ème jour. On a vu qu'avec un dispositif selon l'invention présentant une dissymétrie de largeur entre les deux côtés du système d'interconnexion, on facilitait la co-culture corticaux-striatale. Il peut être utile dans cette expérience de co-culture de vérifier que la projection des synapses des neurones corticaux sur les neurones striataux est bien fonctionnelle. Orientation du faisceau d'axones corticaux : La croissance des faisceaux 25 d'axones corticaux est très sensible à la présence des neurones striataux : ils s'orientent très nettement vers eux. Maturation des synapses : En utilisant un marquage synaptophysine. on vérifie que la proximité des neurones striataux entraîne bien le bourgeonnement des synapses des axones corticaux ayant traversé le micro-canal. On peut voir la maturation des synapses 30 des neurones corticaux dans un cas mais pas dans l'autre. L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits. L'expression "comportant un" doit se comprendre comme étant synonyme de "comportant au moins un". REVENDICATIONS1. Dispositif de culture cellulaire, notamment de cellules neuronales, comportant : un support définissant une première chambre microfluidique destinée à être ensemencée par une première culture cellulaire, et au moins une deuxième chambre microfluidique, - un système d'interconnexion fluidique reliant Ies première et deuxième chambres et permettant à des extensions cellulaires, notamment des axones, de s'étendre d'une chambre vers l'autre chambre, dispositif dans lequel le système d'interconnexion est réalisé de manière à privilégier la progression d'au moins un premier type d'extensions cellulaires par rapport à au moins un second type d'extensions cellulaires, lesdits premier et second types d'extensions cellulaires différant soit par la chambre microfluidique dont ils proviennent, soit par le type cellulaire dont ils sont l'extension. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la deuxième chambre microfluidique est ensemencée avec au moins un deuxième type cellulaire 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, le système d'interconnexion comportant une pluralité de microcanaux (10) ou une pluralité de microstructures. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'interconnexion comportant au moins un canal ou un réseau de microstructures présentant une asymétrie entre le côté dudit canal ou dudit réseau connecté à la première chambre microfluidique, et le côté dudit canal ou dudit réseau connecté à la deuxième chambre microfluidique. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, le système d'interconnexion comportant au moins un canal dont au moins une dimension se réduit en progressant d'une chambre vers l'autre. 6. Dispositif selon la revendication précédente, ladite au moins une dimension comportant la largeur du canal. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, le système d'interconnexion comportant un canal dont au moins une portion présente une forme trapézoïdale lorsqu'observé de dessus. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel ladite dimension est, à l'endroit du débouché dudit canal dans la première chambre microfluidique ou dans la deuxième chambre microfluidique, inférieure à 5 �m. 9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'interconnexion comportant un canal non rectiligne. 10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'interconnexion comportant un canal comprenant une succession de rétrécissements et d'élargissements lorsque l'on progresse de l'une des chambres vers l'autre. 11. Dispositif selon l'une des revendications 5 à 10, ledit canal présentant des interconnexions ou des ramifications. 12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le réseau de microstructures comporte des obstacles (70) empêchant la propagation d'axones en ligne droite. 13. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel les obstacles sont disposés de façon à imposer à tout chemin continu entre la première chambre microfluidique et la deuxième chambre microfluidique au moins une portion dans laquelle le rayon de courbure dudit chemin est inférieur à 20 �m, de préférence inférieur à 10 �m, plus préférentiellement encore inférieur à 7�m, 5�m, voire 3�m. 14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'interconnexion comportant au moins une portion dont la surface a été traitée chimiquement ou biochimiquement de façon à avoir une affinité pour au moins un type de cellule ou un type de comportement cellulaire. 15. Dispositif selon la revendication 14, le traitement chimique comportant au moins un type de molécule sélectionné parmi la fibronectine, les cadhérines, le collagène, la laminine, les molécules comportant des groupements succinimides, le (NSulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamino] hexanoate), les molécules chimiques réactives photo-activables. 16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, le système d'interconnexion comportant des microcanaux ou des microsctructures d'épaisseur inférieure à celles des première et seconde chambres microfluidiques, et de préférence comprise entre 1 et 5�m, plus préférentiellement encore entre 2 et 4 �m. 17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant au moins une chambre microfluidique monocellulaire (80), dimensionnée pour ne contenir que le soma d'une seule cellule, cette chambre microfluidique monocellulaire communiquant avec le système d'interconnexion et avec l'une des première et deuxième chambres microfluidiques. 18. Dispositif selon la revendication 17, dans lequel ladite chambre microfluidique monocellulaire a une épaisseur plus faible que celle des première et deuxième chambres microfluidiques et plus élevée que celle dudit système d'interconnexion. 19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, comportant au moins une chambre microfluidique dont le volume est compris entre 100 et 10 000 1.tm3, et de préférence entre 500 et 5000 �m3, et communiquant de façon fluidique avec le système d'interconnexion et avec l'une des première et deuxième chambres microfluidiques. 20. Dispositif selon d'une des revendications 1 à 19, dans lequel le système d'interconnexion est délimité sur au moins une partie de sa surface par une paroi poreuse permettant l'échange avec un compartiment annexe de molécules et d'ions, mais ne permettant pas l'échange avec le dit compartiment annexe de cellules. 21. Dispositif de culture cellulaire, selon la revendication 1 comportant : - des premier et second macrocanaux, un microcanal (10) relié à une première extrémité au premier macrocanal, une chambre microfluidique monocellulaire (80) communiquant avec le deuxième macrocanal et avec une deuxième extrémité du microcanal, les première et deuxième chambres communiquant entre elles par l'intermédiaire du microcanal et de la chambre microfluidique monocellulaire, la chambre microfluidique monocellulaire étant dimensionnée de façon de ne pouvoir recevoir que le soma d'une seule cellule. 22. Dispositif de culture cellulaire, comportant au moins deux systèmes d'interconnexion dont l'un au moins, et de préférence deux au moins, sont réalisés selon l'une des revendications 1 à 20. 23. Dispositif de culture cellulaire selon la revendication 1 comportant au moins trois chambres microfluidiques reliées en série par au moins deux systèmes d'interconnexion, dans lequel l'épaisseur desdits systèmes d'interconnexion est inférieure à l'épaisseur desdites trois chambres microfluidiques, et au moins l'une desdites chambresmicrofluidiques présente une épaisseur comprise entre l'épaisseur d'au moins l'une des autres chambres microfluidiques et celle desdits systèmes d'interconnexion. 24. Procédé de culture cellulaire, notamment de cellules neuronales, dans lequel on ensemence avec des cellules neuronales au moins une chambre microfluidique d'un dispositif tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes. 25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel on ensemence au moins deux chambres microfluidiques avec des cellules neuronales et dans lequel les axones des cellules de l'une des chambres éprouvent moins de difficultés à se développer vers l'autre chambre que ceux des cellules de l'autre chambre en raison de la forme du système d'interconnexion. 26. Procédé selon la revendication 24, dans lequel on ensemence au moins une chambre microfluidique avec une culture cellulaire présentant au moins deux types cellulaires, et dans lequel Ies axones des cellules d'au moins l'un desdits types cellulaires éprouvent moins de difficultés à se développer au sein du système d'interconnexion que les axones des cellules d'au moins un second type cellulaire. 27. Procédé pour étudier un biomarqueur présent dans un compartiment cellulaire, comportant au moins les étapes de : - cultiver des cellules selon l'un des procédés des revendications 24 à 26 - mettre au moins l'un desdits compartiments cellulaires d'au moins l'une 20 desdites cellules en présence de sondes pour ledit biomarqueur, révéler et/ou quantifier à l'aide desdites sondes la présence dudit biomarqueur 30. Procédé pour étudier au moins un biomarqueur présent dans un compartiment cellulaire, comportant au moins les étapes de : 25 - cultiver des cellules selon l'un des procédés des revendications 24 à 26 collecter le surnageant présent dans au moins l'une des chambres microfluidiques, et rechercher ou quantifier dans son contenu un ou plusieurs biomarqueurs 31. Procédé selon la revendication 27 ou 28, dans lequel la recherche ou la 30 quantification du ou desdits biomarqueurs implique au moins la détermination du contenu en une séquence nucléotidique, ou la détermination du contenu en un polypeptide, ou ladétermination du contenu en un métabolite, dudit compartiment cellulaire ou dudit surnageant. 30. Procédé pour déterminer la réaction de certaines cellules à une espèce, comportant les étapes consistant à a/ cultiver des cellules en utilisant l'un des dispositifs des revendications 1 à 23, ou un procédé selon l'une des revendications 24 à 26, puis b/ mettre au moins l'un des compartiments cellulaires desdites cellules en présence de la dite espèce dans au moins l'une des chambres microfluidiques du dispositif 31. Procédé selon la revendication 30, comportant en outre une étape c/ consistant à étudier l'effet d'une stimulation effectuée à l'étape b) sur un autre compartiment cellulaire ou dans une autre chambre microfluidique du dispositif. 32. Procédé selon l'une des revendications 24 à 31, lequel est appliqué en parallèle sur plusieurs dispositifs selon l'une des revendications 1 à 23, présents sur le même support microfluidique, en mettant en jeu entre au moins deux dispositifs différents des différences entre au moins un type cellulaire, un type de tampon, un type d'espèce, ou un type de système d'interconnexion, afin d'effectuer un criblage différentiel. 33. Procédé de criblage d'agents neurotoxiques, ou de criblage de médicaments neuroprotecteurs, mettant en jeu au moins un dispositif selon l'une des revendications I à 23, ou l'un des procédés selon l'une des revendications 24 à 32. 34. Dispositif de culture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 23, comportant en outre au moins une microélectrode, et de préférence un réseau de microélectrodes, reliée à un appareil de mesure permettant d'étudier des processus électrophysiologiques au sein d'au moins une cellule présente dans ledit dispositif.