Brevet FR2936813A1 — publié le 20100409

MILIEU DEFINI POUR L'ENUMERATION DE CAMPYLOBACTER La présente invention concerne des milieux et une méthode utilisés pour le développement des bactéries. Contexte Les espèces de Campylobacter, en particulier les C. jejuni, C. coli, et C. tari sont une des principales causes de gastroentérite d'origine alimentaire. Les espèces de Campylobacter sont des bactéries micro aérobies Gram-négatif sensibles à l'oxygène. Une concentration en O' supérieure à environ 5 % est considérée comme toxique. En règle générale, des substances inhibant l'oxygène ont été intégrées aux milieux de développement pour protéger les Campylobacters de la toxicité de l'oxygène. Un des inhibiteurs les plus communs de l'oxygène dans ce but est le sang total. Outre sa propension à être cher, potentiellement dangereux et périssable, le sang est mal défini dans la mesure où il varie d'un sang prélevé à l'autre sur un même animal ou une même personne. Le charbon de bois est également utilisé comme un inhibiteur d'oxygène. Cependant, le charbon de bois est réputé pour absorber les antibiotiques compris dans le milieu pour empêcher de développer des agents contaminants, amenant ainsi une récupération variable des bactéries cibles. En outre, ni le sang ni le charbon de bois n'est clair. Par conséquent, leur utilisation résulte en un milieu opaque. Le milieu opaque obscurcit la lecture des informations sur la paroi inférieure du récipient de culture et peut entraver l'identification de colonies, rendant l'énumération difficile. Le brevet USA N° 5,891,709 accordé à Stern et al., inclus dans son intégralité ci-après, enseigne l'utilisation d'agents réducteurs tels que le bisulfite de sodium, le métabisulfite de sodium, le pyruvate de sodium et le sulfate ferreux pour réduire les risques de toxicité de l'oxygène. Cependant, les nombreuses formulations révélées par Stern et al. contiennent du sang et par conséquent, comportent les inconvénients mentionnés ci-dessus. Le brevet USA N° 6,368,847 attribué à Line et al, inclus dans son intégralité ci-après enseigne l'utilisation d'agents réducteurs et de certaines représentations contenant des compositions ne mettant pas de sang en scène. Cependant, les compositions sans sang contiennent un extrait de levure qui, tout comme le sang, n'est pas clairement défini et varie de lot en lot. En outre, l'extrait de levure n'est pas clair, ce qui rend le milieu trouble en apparence. Les conditions micro aérobies requises pour le développement des Campylobacters peuvent engendrer une acidification du milieu de la culture lorsque, dans l'idéal, le Campylobacter se développe bien dans une gamme pH comprise entre 7,3 et 7,7 et peut se développer jusqu'un pH de 9. Un mélange de peptone qui dérive généralement de viande hydrolysée est introduit dans le milieu en raison de la faculté de tamponnage doux des peptones. Cependant, avec des extraits de levure et du sang ou des produits en rapport avec le sang, les mélanges de peptone ne sont pas clairement définis et varient de lot en lot. Une telle variabilité constitue un obstacle lorsqu'il s'agit de développer une formulation pour une production commerciale, en particulier pour les applications industrielles ou cliniques. Un milieu agar sans charbon de bois contenant un indicateur de couleur qui colore les colonies de Campylobacter dans le but de faciliter la visualisation est disponible sur le marché (CampyFood ID, bioMerieux, France). La formulation du milieu est brevetée mais contient du sérum équin et par conséquent ne constitue pas un milieu défini. Un milieu clair et défini est requis pour le développement, l'identification et l'énumération sélectifs de Campylobacters adaptés pour l'utilisation d'échantillons y compris ceux susceptibles de contenir un mélange et/ ou des populations chargées en microorganismes. Résumé de l'invention L'un des buts de la présente invention est de fournir un milieu défini permettant la récupération, le développement, l'identification et l'énumération des colonies 30 d'espèces de Campylobacter. Un des autres buts de la présente invention est de fournir un milieu défini permettant la récupération, le développement, l'identification et l'énumération des colonies d'espèces de Campylobacter contenant un indicateur qui colore les 35 colonies de Campylobacter de manière à en faciliter l'identification et/ ou l'énumération.25 Conformément au premier aspect de l'invention, un milieu de culture défini chimiquement est fourni pour la culture des espèces de Campylobacter. Ce milieu procure un environnement adapté au développement des bactéries Campylobacter sensibles à l'oxygène sans les difficultés associées aux milieux traditionnels dotés de composants non-définis tels que le sang, les produits en rapport avec le sang, l'extrait de levure ou encore les mélanges de peptone. Le milieu de culture défini chimiquement contient de préférence les éléments suivants : (a) Un milieu de nutriments avec une source d'énergie efficace permettant la croissance de Campylobacter ; (b) Un agent de réduction sélectionné dans le groupe comprenant un sel métabisulfite, un sel bisulfite, un acide pyruvique, un sel pyruvate et un mélange de ces éléments. Sans vouloir être limité à une théorie quelconque, le métabisulfite est susceptible de s'associer à la L-cystéine dans le milieu pour créer une atmosphère restreinte. Cet environnement restreint est important dans la mesure où il annule les effets des radicaux d'oxygène toxiques, particulièrement nocifs au développement du Campylobacter. Un autre milieu pour le Campylobacter utilise le sang et le charbon de bois pour produire une atmosphère restreinte. Idéalement le milieu comprend en sus un tampon avec une capacité de tamponnage de pH 7,61 � 0,2. L'introduction d'un tampon est utile dans la mesure où il permet de maintenir le PH du milieu à un PH favorisant le développement du Campylobacter. De préférence, le milieu comprend un tampon choisi parmi le groupe comprenant des tampons HEPES, MOPS et TES. Il s'agit d'alternatives au tampon standard à base de bicarbonate qui est utilisé dans 35 les milieux existant.30 Idéalement, le milieu comprend du tétrazolium. Cela peut colorer les colonies de bactéries, facilitant encore plus la détection et l'énumération de la bactérie. Mieux vaut ne pas introduire de rouge de phénol dans le milieu en raison de sa possible toxicité pour le Campylobacter. Dans l'idéal, le milieu est essentiellement transparent Comme nous l'avons mentionné précédemment, mieux vaut utiliser un milieu essentiellement transparent dans la mesure où cela facilite l'identification et 10 l'énumération des colonies de bactéries. L'utilité se vérifie lorsqu'une bactérie se développe dans un milieu solide ou semi-solide et que des colonies individuelles sont identifiées dans le milieu, par exemple sur un plateau d'agar. Dans l'idéal, le milieu est essentiellement transparent à l'oeil nu de manière à 15 pouvoir clairement distinguer les colonies de bactérie comme toile de fond du milieu. Un certain niveau de transparence est requis pour permettre de compter des petites colonies sur un équipement de lecture de plateau standard. Idéalement, le milieu comprend entre 8 à 20 g/ I d'agar environ. Un milieu solide doté d'agar permet le développement des Campylobacters dans des boîtes pétri ou des plateaux, rendant ainsi la détection et l'énumération plus facile. 25 Il est recommandé que le milieu soit essentiellement dépourvu d'extrait de levure. Il est recommandé que le milieu soit essentiellement dépourvu de sang. II est recommandé que le milieu soit essentiellement dépourvu de peptone. 30 L'extrait de levure, le sang et les mélanges de peptone sont tous variables d'un point de vue chimique et ne disposent pas d'une définition claire. La composition des milieux comprenant ces composants varie par conséquent d'un lot à l'autre, rendant ainsi plus difficile l'obtention de résultats reproductibles. 20 35 II est recommandé que le milieu soit essentiellement dépourvu de charbon de bois. Comme nous l'avons mentionné précédemment, le charbon de bois peut absorber les antibiotiques dans les milieux de développement et peut également engendrer un milieu opaque. Aucune des propriétés susmentionnées n'est souhaitable. Idéalement, le milieu contient moins de 0,01 g/1 de glucose. Le glucose dans le milieu peut disparaître lors de l'autoclavage ; le retrait de ce composant résout ce problème. Le Campylobacter n'a pas besoin de sucres pour se 10 développer et la présence de sucres peut faciliter le développement de microorganismes rivaux non-souhaitables. Idéalement, le milieu contient moins de 0,03 g/ I de chlorure de calcium. Le chlorure de calcium peut précipiter l'autoclavage ; le retrait de ce composant résout ce problème. Idéalement, le milieu contient moins de 0,0002 g /1 d'acide lipoïque. Idéalement, le milieu contient moins de 0,0002 g /1 de vitamine B12. L'acide lipoïque et la vitamine B12 peuvent interférer avec un mélange efficace du milieu. Ces composants peuvent floculer lors du broyage par conséquent, mieux 25 vaut ne pas les inclure. Conformément au second aspect de l'invention, un milieu de culture défini chimiquement est fourni pour la culture des espèces de Campylobacter, comprenant : 30 MgSO4 (anhyd) Environ 0,005 û environ 0,500 g/1, CaCl2. 2 H2O Environ 0,0 û environ 0,03 g/ I, KCI Environ 0,1 û environ 2,0 g/1, NaCI Environ 2 û environ 10 g/ I, 35 Na2S2O5 Environ 0,1 û environ 1,0 g/1, KH2PO4 Environ 0,1 û environ 0,7 g/1, 15 20 L-alanine L-arginine HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique L-cystéine HCI • monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine • HCI • monohydrate L-isoleucine L-leucine L-lysine • HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine - 2Na . déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Acide lipoïque Nicotinamide D-acide pantothénique . '/ Ca Pyridoxal • HCI Riboflavine Thiamine • HCI Vitamine B12 Glucose Acide pyruvique L-glutamine 35 Agar HEPES6 Environ 0,0 ù environ 0,025 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,01 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 8 ù environ 20 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/ I, HEPES Na sel Environ 5 û environ 15 g/ I, 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 û environ 0,3 g/ I. Conformément à un autre aspect de l'invention, un milieu de culture défini chimiquement est fourni pour la culture des espèces de Campylobacter, comprenant : MgSO4 (anhyd) Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, KCI Environ 0,1 û environ 2,0 g/1, NaCl Environ 2 û environ 10 g/ I, Environ 0,1 û environ 1,0 g/1, Environ 0,1 û environ 0,7 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/1, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/1, Environ 0,005 û environ 0,500 g/1, Environ 0,005 environ 0,500 g/1, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 environ 0,500 g/ I, Environ 0,00005 û environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 û environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 û environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 û environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 û environ 0,0005 g/ I, Na2S2O5 KH2PO4 L-arginine HCI L-asparagine monohydrate 15 L-acide aspartique L-cystéine HCI . monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine . HCI - monohydrate 20 L-isoleucine L-leucine L-lysine • HCI DL-méthionine L-phénylalanine 25 L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine . 2Na - déshydrate 30 L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique 35 Myo-inositol Nicotinamide D-acide pantothénique • '/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI 5 Acide pyruvique L-glutamine Agar HEPES HEPES Na sel8 Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 8 ù environ 20 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/ I, Environ 5 ù environ 15 g/ I, 10 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. Conformément à un autre aspect de l'invention, un milieu de culture défini chimiquement est fourni pour la culture des espèces de Campylobacter, comprenant : 15 MgSO4 (anhyd) CaCl2. 2 H2O KCI NaCl 20 Na2S2O5 KH2PO4 L-alanine L-arginine HCI L-asparagine monohydrate 25 L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate 30 L-isoleucine L-leucine L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine 35 L-proline L-sérineEnviron 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,03 g/ I, Environ 0,1 ù environ 2,0 g/ I, Environ 2 ù environ 10 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,1 ù environ 0,7 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,025 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine - 2Na - déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Acide lipoïque Niacotinamide D-acide pantothénique 1/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine - HCI Vitamine B12 Glucose Acide pyruvique L-glutamine HEPES HEPES Na sel9 Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,01 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 1 ù environ 10 g/ I, Environ 5 ù environ 15 g/ I, 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. Conformément à un autre aspect de l'invention, un milieu de culture défini 25 chimiquement est fourni pour la culture des espèces de Campylobacter, comprenant : MgSO4 (anhyd) KCI 30 NaCl Na2S2O5 KH2PO4 L-arginine • HCI L-asparagine monohydrate 35 L-acide aspartique L-cystéine • HCI monohydrateEnviron 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,1 ù environ 2,0 g/ I, Environ 2 ù environ 10 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,1 ù environ 0,7 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate L-isoleucine L-leucine L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine • 2Na • déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Nicotinamide D-acide pantothénique • 1/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI Acide pyruvique L-glutamine HEPES HEPES Na sel10 Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/ I, Environ 5 ù environ 15 g/ I, 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. Le milieu peut également inclure de la L-alanine. De préférence, le milieu comprend un antibiotique. L'utilisation d'un ou plusieurs antibiotiques permet au milieu d'être plus sélectif dans le développement des organismes d'intérêt. Les antibiotiques peuvent comprendre, sans constituer une limitation, les substances suivantes : triméthoprime (2 û 10 mg/ L), polymyxine b (0,25 û 0,75 mg/ L), cycloheximide (5 û 20 mg/ L), anisomycind (5 û 20 mg/ L), amphotéricine (10 û 50 mg/ L), vancomycine (5 û 30 mg/ L), rifampicine (5 û 20 mg/ L), nystatine (20 û 80 mg/ L), aztréonam (10 û 40 mg/ L), céfopérazone (15 û 50 mg/ L) ou un mélange de ces composés. Conformément à un autre aspect de l'invention, une méthode de culture est fournie 10 concernant la culture et l'énumération des espèces de Campylobacter, comprenant les étapes suivantes : apporter un milieu conforme à l'invention ; 15 inoculer le Campylobacter dans le milieu ; Incuber le milieu en micro-aérobie et déterminer le développement de Campylobacter. Incuber le milieu en micro-aérobie constitue une étape importante dans la mesure 20 où cela favorise le développement de Campylobacter. Les niveaux d'oxygène d'environ 5 % sont considérés comme des environnements micro-aérobies. Idéalement, le milieu est incubé en micro-aérobie à environ 41,5°C pour une durée 25 de 24 à 72 heures. II s'agit des conditions idéales pour le développement des Campylobacters. Conformément à un autre aspect de l'invention, une utilisation du milieu est fournie 30 concernant la culture et l'énumération des espèces de Campylobacter. D'autres buts et avantages de l'inventionapparaîtront dans la révélation suivante. Description des fiqures 35 FIG. 1 La photographie présente la comparaison de colonies de C. jejuni développées dans le milieu de la présente découverte (milieu BrillianceTM) et dans un milieu mCCDA (modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar, en français milieu gélosé modifié au charbon, à la céfoperazone et au désoxycholate). Description en détails de l'invention Le nutriment de base du milieu de la présente découverte provient d'une formulation alpha du Milieu minimum essentiel de Eagle (MEMa; Tableau 1), dont l'utilisation est connue dans le développement du Campylobacter dans des cultures en milieu liquide mais qui n'a pas été utilisée en lien avec un milieu solide pour le développement de Campylobacter. Tableau 1. Formulation standard de MEMa Composant Grammes/ litre CaCl2. 2 H2O 0,265 MgSO4 (anhyd) 0,09767 KCI 0,4 NaHCO3 2,2 NaCl 6,8 NaH2PO4 0,122 L-alanine 0,025 L-arginine . HCI 0,126 L-asparagine monohydrate 0,05 L-acide aspartique 0,03 L-cystéine HCI . monohydrate 0,1 L-cystéine 2HCI 0,0313 L-acide glutamique 0,075 Glycine 0.05 L-histidine . HCI . monohydrate 0,042 L-isoleucine 0,052 L-leucine 0,052 L-lysine HCI 0,0725 L-méthionine 0,015 L-phénylalanine 0,032 L-proline 0,04 L-sérine 0,025 L-thréonine 0,048 L-tryptophane 0,01 L-tyrosine . 2Na • déshydrate 0,0519 L-valine 0,046 L-acide ascorbique • Na 0,05 D-biotine 0,0001 Chlorure de choline 0,001 Acide folique 0,001 Myo-inositol 0,002 Acide lipoïque 0,0002 Niacinamide 0,001 D-acide pantothénique - 1/2 Ca 0,001 Pyridoxal Hcl 0,001 Riboflavine 0,0001 Thiamine - HCI 0,001 Vitamine B12 0,00136 Glucose 1 Rouge de phénol 0,011 Acide pyruvique 0,11 L-glutamine 0,292 En raison de la différence entre le Campylobacter développé dans la culture en milieu liquide et celui développé dans le milieu solide, des modifications s'avèrent nécessaires pour adapter un milieu approprié aux cultures en milieu liquide pour une utilisation efficace en milieu solide. Le chlorure de calcium peut être supprimé de la formule dans la mesure où il se précipite lors de l'autoclavage (stérilisation par la chaleur). Le rouge de phénol peut également être supprimé car il ne constitue pas un élément essentiel, en particulier depuis qu'un milieu clair a été préféré. En outre, le phénol peut être toxique pour le Campylobacter. Le glucose peut être supprimé puisque les espèces de Campylobacter n'ont pas besoin de sucres pour se développer, au contraire, d'autres microorganismes utilisent facilement les sucres. En outre, la présence de sucre peut faciliter la croissance de micro-organismes rivaux indésirables. De nombreux nucléotides, acides lipoïques (thioctique) et la vitamine B12 peuvent également être supprimés dans la mesure où ce ne sont pas des éléments essentiels à la croissance des espèces de Campylobacter. Ces composants peuvent également occasionner des problèmes lors du processus comme par exemple la floculation sur le broyage. Autrement, tous les éléments susmentionnés peuvent être introduits. Le tampon standard à base de bicarbonate utilisé avec MEMa peut être remplacé si vous le souhaitez avec un autre tampon disposant d'une meilleure capacité de tamponnage dont la gamme pH est de 7,61 � 0,2. Par exemple les tampons HEPES, MOPS, TES ou tout autre tampon présenté dans l'illustration peut être utilisé. L'acide pyruvique, le pyruvate de sodium, le métabisulfite de sodium, le bisulfite de sodium ou un mélange de ces éléments peuvent être ajoutés en tant qu'agents réducteurs. Tout sel (par exemple le sodium ou le potassium) de ces composants peut être utilisé dans le milieu. Sans être limité à une théorie en particulier, il est préférable que le milieu ne contienne pas de métabisulfite dans la mesure où ce composant produit une atmosphère restreinte. Cette atmosphère réduite serait probablement due à l'association du métabisulfite avec la L-cystéine dans le milieu. Produire une atmosphère restreinte est une étape importante dans la mesure où cela annule les effets des radicaux d'oxygène qui sont toxiques, en particulier pour le développement du Campylobacter. D'autres milieux de Campylobacter utilisent du sang et du charbon pour produire une atmosphère restreinte, favorisant le développement du Campylobacter. Du tétrazolium peut être ajouté pour colorer les colonies de Campylobacter dans le but d'en faciliter la détection et/ ou l'énumération. Il est recommandé de ne pas utiliser de rouge de phénol en raison de sa toxicité pour le Campylobacter, comme nous l'avons déjà mentionné. Des antibiotiques ayant pour effet l'inhibition des microorganismes rivaux peuvent être introduits. Les antibiotiques peuvent comprendre, sans constituer une limitation, les substances suivantes : triméthoprime (2 û 10 mg/L), polymyxine b (0,25 û 0,75 mg/L), cycloheximide (5 û 20 mg/L), anisomycine (5 û 20 mg/L), amphotéricine (10 û 50 mg/L), vancomycine (5 û 30 mg/L), rifampicine (5 û 20 mg/L), nystatine (20 û 80 mg/L), aztréonam (10 û 40 mg/L), céfopérazone (15 û 50 mg/L) ou un mélange de ces composés. L'Agar sert à solidifier le milieu. De l'agar peut être ajouté au milieu avant le processus de stérilisation comme précisé dans le dessin. Si vous le souhaitez, le milieu stérilisé pourra être versé dans les plateaux avant de paramétrer les résultats (dès le refroidissement) avec une surface solide de milieu d'agar sur lequel l'échantillon concerné pourra être stratifié. Une fois le milieu inoculé avec un échantillon de bactérie, il pourra incuber dans des conditions favorables au développement des Campylobacters. Les conditions favorables, sans toutefois être limitées, sont atteintes avec une température 5 comprise entre 35 et 44 degrés centigrade, en particulier entre 41 et 43 degrés Centigrade et avec une faible teneur en oxygène. Il est recommandé de maintenir un taux d'oxygène entre 3 et 6%, dans l'idéal à 5 %. De telles conditions micro-aérobies favorisent la croissance du Campylobacter. Une formulation à titre d'exemple pour la présente découverte vous est donnée dans le tableau 2. Tableau 2. Milieu défini pour le développement du Campylobacter Composant Gamme en grammes/ litre MgSO4 (anhyd) 0,005 - 0,500 KCI 0,1 - 2,0 NaCl 2- 10 Na2S2O5 0,1 - 1,0 KH2PO4 0,1 - 0,7 L-arginine • HCI 0,005 - 0,500 L-asparagine monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide aspartique 0,005 - 0,500 L-cystéine • HCI • monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide glutamique 0,005 - 0,500 Glycine 0,005 - 0,500 L-histidine • HCI • monohydrate 0,005 - 0,500 L-isoleucine 0,005 - 0,500 L-leucine 0,005 - 0,500 L-lysine • HCI 0,005 - 0,500 DL-méthionine 0,005 - 0,500 L-phénylalanine 0,005 - 0,500 L-proline 0,005 - 0,500 L-sérine 0,005 - 0,500 L-thréonine 0,005 - 0,500 L-tryptophane 0,005 - 0,500 L-tyrosine • 2Na • déshydrate 0,005 - 0,500 L-valine 0,005 - 0,500 L-acide ascorbique • Na 0,005 - 0,500 D-biotine 0,00005 - 0,0005 Chlorure de choline 0,00005 - 0,0005 Acide folique 0,00005 - 0,0005 Myo-inositol 0,00005 - 0,0005 Acide lipoïque 0,00005 - 0,0005 Nicotinamide 0,00005 - 0,0005 D-acide pantothénique • '/2 Ca 0,00005 - 0,0005 Pyridoxal • Hcl 0,00005 - 0,0005 Riboflavine 0,00005 - 0,0005 Thiamine • HCI 0,00005 û 0,0005 Acide pyruvique 0,1 û 1,0 L-glutamine 0,005 û 0,500 Agar 8 û 20 HEPES 1 - 10 HEPES Na sel 5 û 15 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium 0,01 û 0,3 Les composants du milieu Campylobacter de la présente découverte tels que répertoriés dans le Tableau 2, sauf pour le 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium, sont mélangés avec une quantité adéquate d'eau distillée, chauffés et autoclavés pour stériliser (cf. illustration). Par exemple, le mélange peut être chauffé jusqu'à ébullition puis autoclavé à environ 121°C à une pression d'environ 21 psi pendant 15 à 20 minutes. Le pH du milieu post stérilisation doit être réglé si besoin est à un pH de 7,6 � 0,2. Le milieu est ensuite refroidi à environ 35 -50°C et les autres ingrédients sont introduits dans des conditions stériles. Par exemple 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium peut être préparé comme une solution mère d'environ 20 grammes dans 100 ml d'eau déminéralisée, que l'on met à chauffer pour permettre sa dissolution, que l'on filtre dans des conditions stériles via un filtre pore de 0,2pm et que l'on stocke à 4°C environ. Si la cristallisation se produit, la solution mère devra être chauffée pour permettre la dissolution du tétrazolium. Des solutions antibiotiques sont mélangées et stockées conformément à la méthode décrite dans le croquis. Une fois les solutions antibiotiques et le tétrazolium incorporés dans le milieu refroidi, le milieu est immédiatement versé ou ajouté à des récipients de culture tels que les boîtes Pétri. La dose recommandée est d'environ 20 ml par boîte s'il s'agit de boîtes de 100 x 15 mm. Le milieu est stocké à température ambiante dans le noir durant 1 à 2 jours puis à 4 - 6°C jusque 15 jours. Il est possible d'inoculer le milieu avec des échantillons d'un grand choix de source, y compris carcasses de volailles, en particulier poulets, ou des carcasses d'animaux comme les ovins et les bovins, l'alimentaire, le lait et l'eau entre autres. D'autres sources possibles peuvent provenir de sources cliniques comme par exemple les matières fécales ou le sanq. Exemple 1 87 souches de Campylobacter comprenant 11 souches de C. lari, 32 souches de C. coli et 44 de C. jejuni ont été développées à Bolton en milieu liquide sans compléments pendant environ 48 heures à 41,5°C dans une atmosphère micro-aérobie puis diluées à une densité d'environ 0,5 unité McFarland. Les cultures ont été stratifiées dans un milieu de Campylobacter de la présente découverte et sur des plateaux contenant des milieux solidifiés mCCDA (Oxoid Ltd., Basingstoke, Royaume-Uni) et ont incubé en micro-aérobie à 41,5°C pendant environ 48 heures. Au bout de 48 heures, la sensibilité de mCCDA et du milieu Campylobacter de la présente découverte (milieu BrillianceTM) s'est révélée être à 100 %. Les colonies de Campylobacter développées dans le milieu BrillianceTM apparaissent comme des colonies rouges sur un fond clair. L'illustration 1 compare une culture pure de C. jejuni développée à la fois dans un milieu mCCDA et dans un milieu Campylobacter de la de présente découverte (BrillianceTM) après 48 heures à 41,5°C dans des conditions micro-aérobies. Exemple 2 Pour effectuer des tests plus spécifiques, 139 souches de micro-organismes non-Camp ylobacter, y compris des souches d'espèces de Enterobacteriaceae, Staphylococci, Enterococci, Lactobacilli, Candida, Pseudomonas, Proteus, Atchobacter, Aeromonas et Bacterioides ont été développées de manière adéquate dans divers supports et ont ensuite été diluées dans une densité d'environ 0,5 unités McFarland. Les cultures ont été stratifiées dans des plateaux mCCDA et un milieu Campylobacter de la présente découverte (Brilliance) et ont incubé en micro-aérobie pendant 48 heures à 41,5°C. Après 48 heures, le développement a été déterminé comme suit : 30 mCCDA Milieu Brilliance Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii Aeromonas hydrophilia Candida albicans Candida glabarata x 2 35 Candida krusei Enterococcus faecium x 4 19 Enterococcus hirae Klebsiella oxytoca La spécificité du milieu Brilliance s'est révélée être de 99 % en comparaison des 92 5 % du milieu mCCDA. Exemple 3 De plus amples exemples de milieu (concentrations en grammes/ litre) 20 10 MgSO4 (anhyd) CaCl2. 2 H2O KCI NaCl Na2S2O5 15 KH2PO4 L-alanine L-arginine . HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique 20 L-cystéine . HCI . monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine . HCI . monohydrate L-isoleucine 25 L-leucine L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline 30 L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine • 2Na . dehydrate L-valine 35 L-acide ascorbique • Na D-biotine 0,005 ù 0,500 0.0 ù 0,03 0,1 ù 2.0 2- 10 0,1 ù 1,0 0,1 ù 0,7 0,0 ù 0,025 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,00005 ù 0,0005 Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Acide lipoïque Nicotinamide D-acide pantothénique • '/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI Vitamine B12 Glucose Acide pyruvique L-glutamine Agar HEPES HEPES Na sel0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,0 ù 0,0002 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,0 ù 0,0002 0,0 ù 0,01 0,1 ù 1,0 0,005 ù 0,500 8 - 20 1-10 5-15 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium 0,01 ù 0,3 Exemple 4 De plus amples exemples de milieu (concentrations en grammes/ litre) 0,005 - 0,500 MgSO4 (anhyd) KCI 0,1 -2,0 NaCl 2-10 Na2S2O5 0,1 - 1,0 KH2PO4 0,1 - 0,7 L-arginine • HCI 0,005 - 0,500 L-asparagine monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide aspartique 0,005 - 0,500 L-cystéine • HCI • monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide glutamique 0,005 - 0,500 Glycine 0,005 - 0,500 L-histidine HCI • monohydrate 0,005 - 0,500 L-isoleucine 0,005 - 0,500 L-leucine 0,005 - 0,500 L-lysine • HCI 0,005 - 0,500 DL-méthionine 0,005 - 0,500 L-phénylalanine 0,005 - 0,500 L-proline 0,005 - 0,500 L-sérine 0,005 - 0,500 L-thréonine 0,005 - 0,500 L-tryptophane 0,005 - 0,500 L-tyrosine • 2Na • déshydrate 0,005 - 0,500 L-valine 0,005 - 0,500 L-acide ascorbique • Na 0,005 - 0,500 D-biotine 0,00005 - 0,0005 Chlorure de choline 0,00005 - 0,0005 Acide folique 0,00005 - 0,0005 Myo-inositol 0,00005 - 0,0005 Nicotinamide 0,00005 - 0,0005 D-acide pantothénique • '/2 Ca 0,00005 - 0,0005 Pyridoxal • HCI 0,00005 - 0,0005 Riboflavine 0,00005 - 0,0005 Thiamine • HCI 0,00005 - 0,0005 Acide pyruvique 0,1 - 1,0 23 L-glutamine 0,005 ù 0,500 Agar 8 - 20 HEPES 1 - 10 HEPES Na sel 5 - 15 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium 0.01 ù 0.3 Exemple 5 De plus amples exemples de milieu MgSO4 (anhyd) 0,005 - 0,500 CaCl2. 2 H2O 0,0 - 0,03 KCI 0,1 - 2,0 NaCl 2 - 10 Na2S2O5 0,1 - 1,0 KH2PO4 0,1 - 0,7 L-alanine 0,0 - 0,025 L-arginine HCI 0,005 - 0,500 L-asparagine monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide aspartique 0,005 - 0,500 L-cystéine HCI monohydrate 0,005 - 0,500 L-acide glutamique 0,005 - 0,500 Glycine 0,005 - 0,500 L-histidine HCI monohydrate 0,005 - 0,500 L-isoleucine 0,005 - 0,500 L-leucine 0,005 - 0,500 L-lysine HCI 0,005 - 0,500 DL-méthionine 0,005 - 0,500 L-phénylalanine 0,005 - 0,500 L-proline 0,005 - 0,500 L-sérine 0,005 - 0,500 L-thréonine 0,005 - 0,500 L-tryptophane 0,005 - 0,500 L-tyrosine • 2Na • déshydrate 0,005 - 0,500 L-valine 0,005 - 0,500 L-acide ascorbique • Na 0,005 - 0,500 D-biotine 0,00005 - 0,0005 Chlorure de choline 0,00005 - 0,0005 Acide folique 0,00005 - 0,0005 Myo-inositol 0,00005 - 0,0005 Acide lipoïque 0,0 - 0,0002 Nicotinamide 0,00005 - 0,0005 D-acide pantothénique • '/2 Ca 0,00005 - 0,0005 Pyridoxal HCI 0,00005 - 0,0005 Riboflavine 0,00005 - 0,0005 Thiamine - HCI Vitamine B12 Glucose Acide pyruvique 5 L-glutamine HEPES HEPES Na sel25 0,00005 ù 0,0005 0,0 ù 0,0002 0,0 ù 0,01 0,1 ù 1,0 0,005 ù 0,500 1-10 5-15 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium 0.01 ù 0.3 10 Exemple 6 De plus amples exemples de milieu MgSO4 (anhyd) KCI NaCl Na2S2O5 KH2PO4 L-arginine HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate L-isoleucine L-leucine L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine • 2Na déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Nicotinamide D-acide pantothénique • '/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI 35 Acide pyruvique L-glutamine 0,005 ù 0,500 0,1 ù 2,0 2-10 0,1 ù 1,0 0,1 ù 0,7 0.005 ù 0.500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,005 ù 0,500 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,00005 ù 0,0005 0,1 ù 1,0 0,005 ù 0,500 HEPES HEPES Na sel 27 1 - 10 5-15 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium 0.01 û 0.35 Revendications: 1. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter. 2. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à la revendication 1 comprenant : (a) un milieu de nutriments avec une source d'énergie efficace permettant la croissance de Campylobacter ; (b) un agent de réduction sélectionné dans le groupe comprenant un sel métabisulfite, un sel bisulfite, un acide pyruvique, un sel pyruvate et un mélange de ces éléments. 3. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à la revendication 1 ou 2 15 comprenant en plus un tampon avec une capacité de tamponnage de pH 7,61 � 0,2. 4. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant un tampon choisi parmi le groupe de tampons HEPES, MOPS et TES. 5. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant en plus du tétrazolium. 6. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication 25 précédente et transparent en substance. 7. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant entre 8 et 20 g/ I d'agar environ. 30 8. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente essentiellement dépourvu d'extrait de levure. 9. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente essentiellement dépourvu de sang. 20 35 10. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente essentiellement dépourvu de peptone. 11. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente essentiellement dépourvu de charbon de bois. 12. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant moins de 0,01 g/ I de glucose environ. 13. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant moins de 0,03 g/ I de chlorure de calcium environ. 14. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant moins de 0,0002 g/ I d'acide lipoïque environ. 15. Un milieu de culture défini chimiquement conforme à toute revendication précédente comprenant moins de 0,0002 g/ I de vitamine B12 environ. 16. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter comprenant : MgSO4 (anhyd) Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, CaCl2. 2 H2O Environ 0,0 û environ 0,03 g/ I, KCI Environ 0,1 û environ 2,0 g/ I, NaCI Environ 2 û environ 10 g/ I, Environ 0,1 û environ 1,0 g/ I, Environ 0,1 û environ 0,7 g/ I, Environ 0,0 û environ 0,025 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/1, Environ 0,005 û environ 0,500 g/1, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 û environ 0,500 g/ I, 20 25 Na2S2O5 KH2PO4 L-alanine L-arginine HCI L-asparagine monohydrate 30 L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate 35 L-isoleucine L-leucineL-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine . 2Na . déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Acide lipoïque Nicotinamide D-acide pantothénique . '/2 Ca Pyridoxal . HCI Riboflavine Thiamine - HCI Vitamine B12 Glucose Acide pyruvique L-glutamine Agar HEPES HEPES Na sel30 Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ 0,005 ù environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ Environ 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/ I, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,500 g/1, 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,0 ù environ 0,0002 g/1, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, 0,0 ù environ 0,01 g/1, 0,1 ù environ 1,0 g/1, 0,005 ù environ 0,500 g/1, 8 ù environ 20 g/ I, 1 ù environ 10 g/ I, 5 ù environ 15 g/ I, 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. 17. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter comprenant : MgSO4 (anhyd) KCI NaCl Na2S2O5Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,1 ù environ 2,0 g/ I, Environ 2 ù environ 10 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I,KH2PO4 L-arginine HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate L-isoleucine L-leucine L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine • 2Na • déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Nicotinamide D-acide pantothénique '/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI 30 Acide pyruvique L-glutamine Agar HEPES HEPES Na sel31 Environ 0,1 ù environ 0,7 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 8 ù environ 20 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/1, Environ 5 ù environ 15 g/ I, 35 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. 18. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter comprenant : MgSO4 (anhyd) CaCl2. 2 H2O KCI NaCI Na2S2O5 KH2PO4 L-alanine L-arginine HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate 15 L-acide glutamique Glycine L-histidine HCI monohydrate L-isoleucine L-leucine 20 L-lysine HCI DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine 25 L-thréonine L-tryptophane L-tyrosine • 2Na • déshydrate L-valine L-acide ascorbique • Na 30 D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Acide lipoïque 35 Niacotinamide D-acide pantothénique • '/2 CaEnviron 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,03 g/1, Environ 0,1 ù environ 2,0 g/1, Environ 2 ù environ 10 g/1, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/1, Environ 0,1 ù environ 0,7 g/1, Environ 0,0 ù environ 0,025 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1,Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,0002 g/ I, Environ 0,0 ù environ 0,01 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/ I, Environ 5 ù environ 15 g/ I, 10 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. 19. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter comprenant : Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI Vitamine B12 5 Glucose Acide pyruvique L-glutamine HEPES HEPES Na sel 15 MgSO4 (anhyd) KCI NaCl Na2S2O5 KH2PO4 20 L-arginine HCI L-asparagine monohydrate L-acide aspartique L-cystéine HCI monohydrate L-acide glutamique 25 Glycine L-histidine HCI monohydrate L-isoleucine L-leucine L-lysine HCI 30 DL-méthionine L-phénylalanine L-proline L-sérine L-thréonine 35 L-tryptophane L-tyrosine • 2Na • déshydrateEnviron 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,1 ù environ 2,0 g/ I, Environ 2 ù environ 10 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/ I, Environ 0,1 ù environ 0,7 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1,L-valine L-acide ascorbique • Na D-biotine Chlorure de choline Acide folique Myo-inositol Nicotinamide D-acide pantothénique • '/2 Ca Pyridoxal HCI Riboflavine Thiamine • HCI Acide pyruvique L-glutamine HEPES HEPES Na sel 34 Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/1, Environ 0,00005 ù environ 0,0005 g/ I, Environ 0,1 ù environ 1,0 g/1, Environ 0,005 ù environ 0,500 g/ I, Environ 1 ù environ 10 g/1, Environ 5 ù environ 15 g/1, 2,3,5 - chlorure de triphényltétrazolium Environ 0,01 ù environ 0,3 g/ I. 20. Un milieu de culture défini chimiquement pour le développement des espèces de Campylobacter conforme à toutes les requêtes précédentes et doté 20 d'un antibiotique en sus. 21. Une méthode de développement et d'énumération de Campylobacter comprenant les étapes suivantes : 25 Fourniture d'un milieu conforme à l'une des revendications 1 à 20, inoculation du Campylobacter dans le milieu ; Incubation du milieu en micro-aérobie et détermination du développement 30 des Campylobacters. 22. Une méthode conforme à la revendication 17 dans laquelle le milieu est incubé en micro-aérobie à environ 41,5°C pour une durée de 24 à 72 heures. 35 23. Utilisation d'un milieu conforme à l'ensemble des requêtes de 1 à 20 pour le développement et l'énumération de Campylobacter.