Brevet FR2935385A1 — publié le 20100305

INDUCTION DE L'EXPRESSION DE P53 PAR NEUTRALISATION DE LA NEUROPILINE-2 POUR LE TRAITEMENT DES CANCERS La présente invention est relative au traitement du cancer par surexpression du gène suppresseur des tumeurs p53. Le cancer est caractérisé par une prolifération cellulaire incontrôlée généralement due à des mutations au niveau des gènes contrôlant positivement (les oncogènes) ou négativement (les gènes suppresseurs des tumeurs) la prolifération cellulaire. De par leur prolifération anarchique, les cellules tumorales envahissent localement le tissu sain, et après avoir subi de nouvelles mutations, peuvent acquérir la faculté de migrer dans la circulation sanguine et de se propager à distance de la tumeur initiale pour former des métastases. Cependant, la néovascularisation de la tumeur via le mécanisme d'angiogénèse est essentielle à la croissance tumorale, puisque toute cellule, et en particulier les cellules tumorales très exigeantes en oxygène et en énergie, ne peuvent survivre à plus de quelques dizaines de millimètres d'un vaisseau sanguin. Les traitements anticancéreux actuels ont donc pour cibles principales, d'une part les cellules tumorales elles-mêmes, et d'autre part l'angiogénèse tumorale. En ce qui concerne les stratégies anti-angiogénèse, l'implication des facteurs de croissance, notamment l'EGF ou le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), dans la progression des cancers et dans l'angiogenèse a été mise en évidence. Plusieurs molécules ciblant l'action des VEGFs ont été développées comme médicament anti-angiogénèse : le bevacizumab (Avastin�), anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le VEGF, a été utilisé dès 2004 pour le traitement du cancer colorectal métastatique ; le sunitinib et le sorafenib, molécules inhibant la transduction du signal de la voie VEGF/VEGF-Receptor, ont été utilisés dans des stratégies anti-angiogénèse pour le traitement du carcinome rénal métastatique. Concernant les stratégies ciblant la tumeur et les cellules tumorales, l'ablation des tissus tumoraux par voie chirurgicale (lorsque cela est possible), la radiothérapie des tumeurs solides, des immunothérapies visant à renforcer la réponse immunitaire contre les cellules cancéreuses, et les chimiothérapies représentent les traitements thérapeutiques standards. Les avancées majeures dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la cancérogénèse ont permis le développement de nouvelles chimiothérapies, dont l'efficacité dépend cependant du type de cancer à traiter et de l'organe atteint. En outre, de nombreux cancers posent encore des problèmes de santé publique majeurs et s'avèrent résistants aux thérapeutiques classiques. Par exemple, les cancers digestifs (pancréas, cholangiocarcinomes, cancers colorectaux) deviennent au cours de leur histoire naturelle, rapidement résistants à la chimiothérapie. La perte du gène suppresseur des tumeurs codant pour la protéine p53 est un des mécanismes majeurs expliquant la résistance des cellules tumorales à l'apoptose et aux traitements anti-néoplasiques conventionnels comme la chimiothérapie ou la radiothérapie. En effet, la protéine p53 a pour fonction d'arrêter le cycle cellulaire ou d'induire l'apoptose d'une cellule en réponse aux dommages de l'ADN cellulaire ou à l'activation des oncogènes. La protéine p53 joue donc un rôle central dans le contrôle du cycle cellulaire et dans le maintien de l'intégrité du génome, en permettant à la cellule dont le cycle cellulaire est interrompu de réparer l'anomalie génétique, ou bien en entrainant sa destruction par apoptose. p53 étant essentielle pour protéger l'organisme des effets d'une division cellulaire aberrante ou incontrôlée, l'absence de p53, sa sous-expression ou l'expression d'une protéine p53 non-fonctionnelle, a pour conséquence la survie des cellules tumorales. Dans un modèle d'étude in vitro et dans des modèles murins, il a été montré que la restauration de l'expression de p53 par transfert de gène favorise la régression des cancers et améliore l'efficacité des traitements cytotoxiques. Des études in vitro ont également montré que dans des cellules exprimant une protéine sauvage et une protéine p53 mutante ayant un effet dominant négatif envers la protéine sauvage, l'interférence par un siARN ciblant spécifiquement l'ARNm codant pour la protéine p53 mutante rétablit la fonction de p53 (MARTINEZ et al. P.N.A.S., 99(23):14849-54, 2002). Il a par ailleurs été montré qu'il est possible de "réactiver" des protéines p53 mutantes en stabilisant une conformation fonctionnelle de ces protéines. Les molécules CP-31398, PRIMA-1 et MIRA-1, premières molécules développées présentant cette capacité, ont été utilisées avec succès dans un modèle de xénogreffe humaine pour inhiber la croissance tumorale (pour revue, cf par exemple LEVESQUE & EASTMAN, Carcenogenesis., 28(1) :13-20, 2007). La restauration de l'expression d'une protéine p53 fonctionnelle, ainsi que l'induction de la surexpression de cette protéine, représentent donc des objectifs essentiels dans le développement de thérapies antitumorales. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence l'existence d'une corrélation inverse entre la neuropiline-2 (NRP-2) et l'expression de la protéine p53, et ont montré que de façon surprenante l'expression de p53 pouvait être induite ou augmentée en inhibant l'expression de la neuropiline-2, ou en la neutralisant par des anticorps anti-NRP-2. La neuropiline-2, glycoprotéine transmembranaire d'environ 130 kDa, est un récepteur des facteurs de croissance de la famille du VEGF exprimé chez l'homme par les neurones, les cellules endothéliales, les ostéoblastes et par une large variété de néoplasmes. Dans de nombreux cas, les neuropilines sont les seuls récepteurs des VEGF exprimés par les cellules cancéreuses (BIELENBERG et al. Exp. Cell. Res., 312(5) :584-593, 2006), et plusieurs études ont montré que l'expression, voire la surexpression des neuropilines, est généralement corrélée à une augmentation de la croissance tumorale et du caractère invasif et métastatique des cancers, ainsi qu'à un pronostic défavorable. En outre, de nombreuses observations indiquent que ces récepteurs jouent un rôle crucial dans la progression tumorale en activant l'angiogénèse : notamment, la liaison du VEGF à la NRP2 est responsable d'une activité pro-angiogénique, médiée par une coopération entre le court domaine intracytoplasmique de la NRP2 et celui du récepteur au VEGF VEGFR1. Début 2008, il a été rapporté que la NRP-2 a la capacité d'induire la phosphorylation du récepteur VEGFRI et de la protéine AKT, favorisant ainsi la progression des cancers. Dans ce modèle, la suppression de la neuropiline-2 par siRNA s'oppose à l'apparition de métastases dans des xénogreffes et réduit la taille des tumeurs (GRAY et al. J. Natl. Cancer Inst., 100 :109-120, 2008). Les inventeurs ont maintenant observé qu'indépendamment de l'effet que NRP-2 exerce par l'intermédiaire de VEGF, l'inhibition de l'expression de NRP-2, ou la neutralisation de la neuropiline-2 par des anticorps anti-NPR-2 restaurent l'expression de p53 dans des cellules possédant un gène p53 fonctionnel. En outre, ils ont constaté in vitro et in vivo dans un modèle murin que le traitement par des composés inhibant l'expression de la neuropiline-2, ou neutralisant cette dernière, potentialise l'efficacité de traitements anticancéreux. Ces données ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques, en particulier concernant la possibilité de développer des stratégies innovantes de sensibilisation à la chimiothérapie ou à la radiothérapie. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de la neuropiline-2 pour l'obtention d'un médicament destiné à augmenter l'expression de p53 dans le cadre d'un traitement anticancéreux, permettant ainsi de promouvoir l'apoptose de cellules cancéreuses. L'invention est applicable à tous les types de tumeurs exprimant la neuropiline-2, et notamment aux cancers colorectaux, aux cancers du sein et aux mélanomes. L'expression de la neuropiline-2 dans une tumeur peut aisément être détectée à l'aide d'anticorps anti-neuropiline-2, par exemple les anticorps décrits ci-après. Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, on utilise comme inhibiteur de l'expression de la neuropiline-2 humaine un ARN interférent ciblant le gène de la neuropiline-2 humaine. Un ARN interférent est une molécule d'ARN double-brin capable d'inhiber de manière séquence spécifique l'expression d'un gène cible en provoquant la dégradation de son 25 ARNm. Pour être utilisé en cellule de mammifère, les ARN interférents doivent posséder une partie double-brin de moins de 30 pb afin d'éviter une réponse interféron non-spécifique induite par des ARN double-brin plus long. Ces ARN interférents incluent en particulier les petits ARN interférents (� small interfering RNAs � ou siRNAs) (ELBASHIR et 30 al., Nature, 411(6836): 494-8, 2001 ; TUSCHL, Nat. Biotechnol., 20(5): 446-8, 2002), les ARN courts en forme d'épingle à cheveux (� short hairpin RNAs � ou shRNAs) qui sont ensuite transformés par la machinerie cellulaire en siRNAs (PADDISON et al., Genes Dev., 16(8): 948-58, 2002; YU et al., P.N.A.S., 99(9): 6047-52, 2002; SIOLAS et al., Nat. Biotechnol., 23(2): 227-31, 2005). En général, les siARNs ont une longueur de 19 à 25 nucléotides, incluant une 35 région double-brin de 19 à 23 nucléotides, au moins l'un des deux brins a une extrémité 3' sortante de 1 à 3 nucléotides. Un précurseur d'ARN interférent est une molécule d'ADN qui une fois transcrite peut être préparée par une cellule de mammifère pour former un siRNA (par exemple une molécule d'ADN transcrite en shRNA). Un exemple de siARN ciblant le gène de la neuropiline-2 humaine, et permettant une inhibition efficace de l'expression de ce gène est représenté par le siARN défini par les séquences 5'- GGC UGG AAG UCA GCA CUA AUU U -3' (SEQ ID NO : 1) et 5'-AUU AGU GCU GAC UUC CAG CCU U û 3' (SEQ ID NO : 2). Ces séquences sont bien entendu non limitatives, d'autres siRNA appropriés peuvent être conçus à partir de la séquence du gène NRP-2 disponible dans les bases de données, en utilisant par exemple la stratégie proposée par JAGLA et al. (Rna 11(6): 864-72, 2005) ou IZQUIERDO, M. (Cancer Gene Ther., 12(3): 217-27, 2005). Une fois la séquence appropriée définie, des siRNAs, des shRNAs, ainsi que leurs ADNs précurseurs peuvent être obtenus par des méthodes bien connues en elles-mêmes, incluant en particulier la synthèse chimique et le génie génétique. De nombreuses méthodes d'administration dans les cellules ou dans les tissus des ARN interférents et des ADN précurseurs sont également bien connues de l'homme du métier (par exemple pour revue AMARZGUIOUI et al., FEBS Letter, 579(26): 5974-81, 2005 ; SANDY et al., Biotechniques, 39(2): 215-24, 2005). Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, on utilise comme inhibiteur de l'activité de la neuropiline-2 humaine, un anticorps anti-neuropiline 2 humaine, ou un ligand de la neuropiline 2 humaine dérivé dudit anticorps. On entend ici par : � anticorps anti-neuropiline 2 humaine �, une molécule d'immunoglobuline dirigée contre la partie extra-cellulaire de la neuropiline 2. On entend par � anticorps chimérique � un anticorps possédant les domaines variables de 1"anticorps monoclonal dont il est issu, couplés aux domaines constants d'un autre anticorps, de préférence un anticorps humain. Le terme � anticorps humanisé � se réfère à un anticorps produit chez un animal non humain, de préférence la souris, ayant conservé sa spécificité de liaison à la neuropiline 2, mais dans lequel, afin de réduire son immunogénicité chez l'homme. le plus de séquences murines possible ont été remplacées par les séquences humaines correspondantes. En ce qui concerne les domaines variables, les séquences remplacées sont en général les régions FR (framework), c'est-à-dire les séquences situées entre les boucles hypervariables CDRs. Des anticorps chimériques ou humanisés utilisables conformément à l'invention sont de préférence des immunoglobulines de classe IgG, et notamment d'isotypes IgG 1, 2, 3 ou 4. On entend par � ligand de la neuropiline 2 humaine dérivé d'un anticorps antineuropiline 2 �, tout ligand de la neuropiline 2 comprenant au moins les CDR3 de la chaine lourde et ceux de la chaîne légère dudit anticorps, et de préférence comprenant également les CDR2 et/ou les CDRI de la chaine lourde et de la chaîne légère dudit anticorps. On rappellera que les CDRs (� complementarity determining regions �) d'un anticorps sont les portions des domaines variables qui sont impliquées dans la reconnaissance spécifique de l'antigène. Chaque chaîne lourde et légère d'un anticorps possède trois CDRs, dénommées VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3 dans le cas de la chaine lourde, et VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 dans le cas de la chaîne légère. Des dérivés d'anticorps anti-neuropiline-2 peuvent être en particulier : - tout fragment d'un anticorps anti-neuropiline-2 comprenant au moins les CDR3, et de préférence comprenant en outre les CDR2 et/ou les CDR1 des chaînes lourde et légère dudit anticorps ; - toute protéine recombinante comprenant un fragment d'anticorps antineuropiline-2 tel que défini ci-dessus. Des fragments d'anticorps anti-neuropiline 2 utilisables conformément à l'invention sont notamment des fragments Fv, dsFv, Fab, Fab'2 ou scFv. Les fragments Fv sont constitués des domaines variables des chaînes lourde et légère VH et VL d'un anticorps, associés l'un à l'autre par des interactions hydrophobes. Le fragment dsFv est constitué d'un dimère VH :: VL relié par un pont disulfure. Les fragments scFv sont constitués des portions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps, reliées entre elles par l'intermédiaire d'un lieur flexible (CLACKSON et al., Nature, 352: 624-628, 1991), formant ainsi une protéine simple-chaîne. Les fragments Fab résultent de l'action de la papaïne sur une molécule d'immunoglobuline, et contiennent chacun une chaîne légère et la première moitié d'une chaîne lourde reliées entre elles par un pont disulfure. Le fragment F(ab')2 peut être obtenu par traitement d'un anticorps par la pepsine : ce fragment comprend deux fragments Fab et une partie de la région charnière. Les fragments Fab' peuvent être obtenus à partir des fragments F(ab')2 par coupure du pont disulfure dans la région charnière. Ces fragments se liant à l'antigène peuvent également être combinés afin d'obtenir des dérivés plurivalents, tels que les � diabodies � ou � triabodies �, résultant de l'association de 2 ou 3 de ces fragments se liant à l'antigène. Des protéines recombinantes comprenant un fragment d'anticorps anti- neuropiline-2 peuvent être notamment : - des protéines associant au moins un fragment d'anticorps anti-neuropiline-2 avec au moins un fragment d'un autre anticorps ; on citera à titre d'exemples, des immunoglobulines bi-spécifiques. des conjugués d'un fragment Fv ou Fab d'un anticorps anti- neuropiline-2 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente, des � diabodies bi-spécifiques � résultant de l'association d'un fragment scFv d'un anticorps antineuropiline-2 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente ; - des protéines associant au moins un fragment d'anticorps anti-neuropiline-2 avec une molécule permettant de prolonger sa demi-vie plasmatique lors de son administration in vivo, notamment avec un polypeptide hydrosoluble de masse moléculaire suffisante pour que la masse moléculaire du polypeptide de fusion ainsi obtenu soit supérieure au seuil de filtration rénale. Des anticorps chimériques ou recombinants, des fragments scFv et leurs dérivés, etc. peuvent être obtenus par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al. (MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Des polynucléotides codant les régions variables d'un anticorps antineuropiline 2 peuvent être obtenus par clonage desdites régions à partir d'une banque d'ADNc d'un hybridome produisant ledit anticorps. Ils peuvent également être préparés totalement ou partiellement, par synthèse d'acides nucléiques, à partir des séquences nucléotidiques desdites régions variables. Diverses méthodes pour obtenir des anticorps humanisés sont également bien connues en elles-mêmes (pour revue cf. par exemple ALMAGRO & FRANSSON, Frontiers in Bioscience, 13, 1619-1633, 2008). On peut citer les méthodes basées sur la greffe de CDRs qui consiste à transférer les CDRs d'un anticorps non-humain dans les régions de charpente (FR pour � framework regions �) d'un anticorps d'origine humaine (cf. par exemple ROUTLEDGE et al., "Reshaping antibodies for therapy", in Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylatic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England, 1993, ou ROGUSKA et al., Protein Engineering, 9(10): 895-904.. 1996). La greffe de CDRs est généralement complétée par l'optimisation des régions de charpente, qui consiste à modifier quelques résidus des régions de charpente afin d'augmenter l'affinité de liaison à l'antigène de l'anticorps humanisé. L'utilisation de librairies combinatoires permet de simplifier cette étape d'optimisation (ROSOK. et al. J. Biol. Chem. 271: 22611-22618, 1996; BACA et al. J. Biol. Chem. 272: 10678-10684, 1997). Une autre stratégie d'humanisation d'anticorps consiste à conserver uniquement les CDR3 des chaines lourdes et légères de l'anticorps d'origine, et à sélectionner le reste de la séquence à partir de banques naïves de gènes V humains (RADER et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 95: 8910-8915, 1998). Les Inventeurs ont obtenu des anticorps monoclonaux anti-neuropiline-2 humaine. et ont sélectionné ceux qui étaient capables d'induire l'apoptose de cellules tumorales exprimant la neuropiline 2. Les séquences nucléotidiques des domaines variables de deux de ces anticorps, dénommés ci-après ITAC-Bl et ITAC-B2, ont été déterminées. Ces séquences, ainsi que les séquences polypeptidiques déduites, sont représentées dans le Tableau 1 ci-après (pour la chaîne légère et la chaîne lourde d'ITAC-B 1) et dans le Tableau 2 ci-après (pour la chaine légère et la chaîne lourde d'ITAC-B2). Les séquences nucléotidiques sont également représentées dans la liste de séquences en annexe respectivement sous les numéros SEQ ID NO:3, 5, 7 et 9, et les séquences polypeptidiques sont également représentées respectivement sous les numéros SEQ ID NO:4, 6, 8 et 10. L'hybridome CNCM I-4054, produisant l'anticorps ITAC-B1 a d'autre part été déposé, selon le Traité de Budapest, le 30 juillet 2008 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, sous le numéro CNCM I-4054. TABLEAU 1 ITAC-B1 Chaîne lourde (Région V-D-J) Séquence gaagttaagctgcaggagtcaggggCagagottgtgaagccaggggCctcagt nucléotidique caagttgtcctgcacagtttctggcttcaaoattaaagacacctatatacact gggtgatacagaggcctgaacagggcctggagtggcttggaaggattgatcct gcgaatggtaatactaaatatgacccgaagttccagggcaaggccactataac agcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacctctg aggacactgocgtctattactgtgctagatgggcggttgtaggtgactaotgg ggccaaggcaccactctcacagtctCctcag (SEQ ID NO: 3) Séquence peptidique EVKLQESGAELVKPGASVKLSCTVSGFNIKDTYIHWVIQRPEQGLEWLGRIDP ANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARWAVVGDYW GQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 4) Chaîne légère (Région V-J) Séquence gatattgtgatcacccactctacaaattcctgcatgtatcagcaggagacagg gttaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtgatgatgtggcttggta ccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactctgcatccaatc tccctc ça ac nucléotidique ctacact q qgag gatgcttcactgg gtqgatatggg ggatttc actttcaccatcagcactgtgcagcctgaagacctggcagtttatttctgtca gcaggattatagctctcccacgttcggttatgggaccaagctggagctgaaac (SEQ ID NO: 5) Séquence peptidique YCDHPLYKFLHVSAGDRVTITCKASQSVSDDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNR YTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQPEDLAVYFCQQDYSSPTFGSGTKLELK (SEQ ID NO: 6) TABLEAU 2 ITAC-B2 Chaîne lourde (Région V-D-J) Séquence gaggtgcagctggaggagtcagggggagg:ttagtgaagcctggagggtccct nucléotidique gaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtgactattacatgtatt gggttcgccagactccggaaaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtgat ggtggtagttacacctactatccagacagtattaagggccgattcaccatctc cagggacaatgccaggaacaacctgtaccttcaaatgagcagtctgaagtctg aggacacagccatgtattactgtgcaagaggtgggccctataggtcctggttt gctttctggggccaagggactctggtcactgtctctgcag (SEQ ID ND:7) Séquence peptidique EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISD GGSYTYYPDSIKGRFTISRDNARNNLYLQ4SSLKSEDTAMYYCARGGPYRSWF AFWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: S) Chaîne légère (Région V-J) Séquence gatattgtgatcacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatca agcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgtgtatagtaatggaaaca cctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatc tacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaqgtcagtgqçagtgg nucléotidique atcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgg gagtttattactgctttcaaggttcacatgttcctccgacgttcggtggaggc accaagctggaaatcaaac (SEQ ID NO: 9) Séquence peptidique DIVITQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGG I TKLEIK (SEQ ID NO: 10) Les anticorps comprenant les domaines variables d'ITAC-B1 (c'est-à-dire comprenant une chaîne lourde dont le domaine variable est défini par la séquence SEQ ID NO: 4 et une chaîne légère dont le domaine variable est défini par la séquence SEQ ID NO: 6) ou les domaines variables d'ITAC-B2 (c'est-à-dire comprenant une chaîne lourde dont le domaine variable est défini par la séquence SEQ ID NO: 8 et une chaîne légère dont le domaine variable est défini par la séquence SEQ ID NO: 10), ainsi que les anticorps ou dérivés d'anticorps, tels que définis ci-dessus, comprenant au moins les CDR3 d'ITAC-B1 ou d'ITAC-B2 font également partie de l'objet de la présente invention, et peuvent être utilisés, de manière avantageuse, comme inhibiteurs de l'activité de la neuropiline-2 humaine. Les séquences codant les CDRs d'ITAC-Bl et ITAC-B2 peuvent être déterminées, de manière classique, à l'aide du logiciel IMGT/V-QUEST (GIUDICELLI et al., Nucleic Acids Research 32, W435-W440, 2004). Les séquences polypeptidiques déduites sont représentées ci après dans le Tableau 3 pour l'anticorps ITAC-Bl, et le tableau 4 pour l'anticorps ITAC-B2. Elles sont également représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 11 à 22. TABLEAU 3 ITAC-B1 Séquence Chaîne lourde VH-CDR1 GFNIKDTY (SEQ ID NO:11) VH-CDR2 IDPANGNT (SEQ ID NO:12) VH-CDR3 ARWAWGDY (SEQ ID NO:13) Chaîne légère VL-CDR1 QSVSDD (SEQ ID NO:14) VL-CDR2 SAS (SEQ ID NO:15) VL-CDR3 QQDYSSPT (SEQ ID NO:16) TABLEAU 4 ITAC-B2 Séquence Chaîne lourde VH-CDR1 GFTFSDYY (SEQ ID NO:17) VH-CDR2 ISDGGSYT (SEQ ID NO:18) VH-CDR3 ARGGPYRSWFAF (SEQ ID NO:19) Chaîne légère VL-CDR1 QSIVYSNGNTY (SEQ ID NO:20) VL-CDR2 KVS (SEQ ID NO:21) VL-CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO:22) La présente invention a également pour objet tout polynucléotide codant pour un anticorps conforme à l'invention ou pour un ligand de la neuropiline 2 humaine dérivé dudit anticorps, ainsi qu'un vecteur recombinant, notamment un vecteur d'expression contenant ledit nucléotide. La présente invention a également pour objet des cellules produisant des anticorps ou 15 des dérivés d'anticorps conformes à l'invention. Il peut s'agir notamment d'hybridomes, par exemple l'hybridome CNCM I-4054, et de cellules-hôtes transformées par un vecteur d'expression conforme à l'invention. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. Parmi les cellules eucaryotes utilisables, on citera en particulier des cellules végétales, des cellules de levure, telles que Saccharomyces, des cellules d'insecte, telles que les cellules de 20 Drosophila, ou de Spodoptera et des cellules de mammifères telles que les cellules HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc... La construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention, et la transformation des cellules-hôtes peut être effectuée par les techniques classiques de biologie moléculaire. 25 Pour la mise en oeuvre de la présente invention, un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de la neuropiline 2 peut être administré par voie intraveineuse, intra-artérielle ou intra-péritonéale.10 De manière avantageuse, ledit inhibiteur peut être administré en combinaison avec un autre agent anti-tumoral. Des agents antitumoraux utilisables dans ce cadre sont en particulier les agents de chimiothérapies (de type alkylants, analogues nucléotidiques ou inhibiteurs de 5 topoisomérases), les radiations ionisantes ou les biothérapies (combinaison avec des molécules de thérapeutiques ciblées neutralisant par exemple le VEGF ou le récepteur à l'EGF. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation d'anticorps et d'ARN interférents conformes à l'invention et à leur utilisation pour augmenter l'expression 10 de p53. EXEMPLE 1: GENERATION DE LIGNEES CELLULAIRES PRESENTANT LA NEUROPILINE-2 HUMAINE A LEUR SURFACE MEMBRANAIRE Deux lignées cellulaires ont été transfectées afin d'exprimer NRP2 à leur surface. Une lignée murine, le mastocytome P815 (Diaclone), tumeur expérimentale largement 15 utilisée comme modèle en immunologie tumorale, et qui n'exprime pas naturellement la NRP2 humaine, ainsi qu'une lignée tumorale humaine, élaborée à partir de cellules cancéreuses colorectales HT29 n'exprimant pas naturellement la NRP2 à sa surface membranaire, ont été transfectées par un vecteur d'expression de la NRP2 humaine. Le vecteur d'expression utilisé, basé sur un plasmide pcDNA3.1 (Invitrogen) a été décrit par Rossignol M et al, (Genomics. 20 2000 Dec 1;70(2):211-22). La lignée murine p815 transfectée a été utilisée pour la production d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre la glycoprotéine NRP2 humaine, la lignée humaine transfectée a ensuite été utilisée lors d'expériences fonctionnelles évaluant l'intérêt des anticorps anti-NRP-2. 25 La transfection des lignées a été réalisée à l'aide d'un kit Effecten� (Qiagen). Les cellules mastocytaires P815 et tumorales HT29 ont été cultivées dans 20mL de milieu DMEM jusqu'à une concentration de 200000 cellules/mL. Les cellules ont alors été lavées une fois avec 20mL de PBS et mises à une concentration de 2x105 cellules/mL dans 4mL de milieu DMEM en flasque. Les cellules ont alors été transfectées avec 1 �g de vecteur (vecteur 30 plasmidique à 1 �g/�L dans du tampon TBE). Les cellules P815 et HT29 transfectées ont été laissées en petites flasques et mises à l'incubateur à 37°C sous 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée, pendant 48h. A J3, les milieux de cultures ont été changés par un nouveau milieu comprenant 0,8 mg/mL de geneticine (G418, Invitrogen, France), pour la sélection des cellules transfectées. 35 Les cellules efficacement transfectées et exprimant NRP-2 à leur surface sont nommées P815-NRP2 et HT29-NRP2. L'efficacité de la transfection est évaluée à J7 par marquage membranaire avec un anticorps IgG murin anti-NRP2 humaine (Clone C9, Santa Cruz Biotechnology) puis lecture en cytométrie en flux. Le résultat de l'étude en cytométrie de flux est représenté à la Figure 1. Les panneaux A et C (P815 et HT29ctr) de la Figure 1 représentent les résultats obtenus par cytométrie en flux avec les cellules contrôles alors que les panneaux B et D (P815-NRP2 et HT29-NRP2) représentent les résultats obtenus avec des cellules exprimant NRP-2 à leur surface membranaire. Les courbes de distribution en traits noirs représentent les résultats du marquage avec un anticorps contrôle, les courbes de distribution en traits gris représentent les résultats du marquage avec l'anticorps IgG murin anti-NRP2 humaine. Pour chacun des panneaux de la Figure 1, le nombre d'évènements (nombre de cellules) est indiqué en ordonnée, l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'anticorps IgG murin anti-NRP2 humaine) est représentée en abscisse. Les panneaux A et C (P815 et HT29ctrl) de la Figure 1 montrent que les pics de distribution représentant la population cellulaire P815 et HT29ctrl (témoins non transfectées) en contact avec l'anticorps anti-NRP2 humaine (trait gris) ou avec un anticorps IgG contrôle (trait noir) se superposent : ceci signifie que les cellules P815 et HT29ctrl (témoins non transfectées) ne sont pas davantage marquées par l'anticorps anti-NRP2 humaine que par un anticorps IgG contrôle et qu'elles n'expriment donc pas NRP-2. En revanche, lorsque les cellules P815 et HT29 transfectées par un vecteur d'expression de la NRP2 humaine (panneaux B et D, P815-NRP-2 et HT29-NRP2 respectivement) sont mises en présence de l'anticorps anti-NRP2 humaine, il y a un net déplacement du pic de distribution de la population cellulaire vers la droite (pic trait gris) par rapport au marquage avec l'anticorps IgG contrôle (pic trait noir). Ces résultats attestent que les cellules transfectées expriment bien NRP-2 à leur surface membranaire. EXEMPLE 2: PRODUCTION ET CARACTÉRISATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-NRP-2 HUMAINE Un protocole d'immunisation dérivé de celui décrit par MATTHEW et SANDROCK (J. Immunol. Methods, 100: 73-82, 1987) a été utilisé. Cinq souris Balb/C femelles (Charles River Laboratories) ont été immunisées avec des cellules transfectées P815-NRP2 une fois par semaine pendant 5 semaines. Chaque immunisation consiste en l'administration en � foot-pad � de 1x106 cellules P815-NRP2 dans chaque patte postérieure de la souris (soit 2x106 P815-NRP2 par souris). Les cellules servant à l'immunisation d'une souris ont été diluées dans 25�L de PBS 1X et dans 25�L d'adjuvant Ribi (Immunochem Research, USA). 50�L de mélange cellulaire ont alors été injectés à chaque souris (25�L par patte postérieure) à plusieurs reprises durant le protocole d'immunisation. Cinq jours après la dernière injection, les ganglions des souris ont été prélevés et les lymphocytes ont été fusionnés avec une lignée de myélome. La fusion a été effectuée de la façon suivante : les lymphocytes prélevés ont été fusionnés avec des cellules de myélome murin X63/AG 8653 (le rapport lymphocytes/cellules de myélome est de 5 :1), en présence de polyéthylène glycol (KEARNEY et al, J. of Immunol., 123: 1548, 1978). Le myélome murin P3X63/AG8.653 provient de l'ATCC (ref CRL-1580). La suspension de cellules fusionnées a été lavée une fois, et cultivée sur un milieu sélectif composé de 500 mL de milieu RPMI 1640 (Sigma, France), additionné de 10% de SVF inactivé par la chaleur (Abcys, France), de 4 mM de L-glutamine (Sigma, France), 100 itg/mL de streptomycine, de 100 UI/ml de pénicilline (Sigma, France), de 13,6 �g/mL d'hypoxanthine, 0,19 tg/mL d'aminoptérine et 3.88 UI /mL de thymidine (solution 50X, Sigma, France). Ce milieu ne permet ni la survie des cellules myélomateuses n'ayant pas fusionné, puisque celles-ci sont incapables de synthétiser l'inositol monophosphate, ni la survie des lymphocytes qui n'ont pas la capacité de se multiplier indéfiniment in vitro. En revanche les hybridomes survivent car ils présentent d'une part la capacité de métaboliser l'hypoxanthine exogène (propriété des lymphocytes), et d'autre part ont la capacité de se multiplier indéfiniment (� immortalité �) des cellules X63/AG 8653. Dix jours après la fusion, les surnageants des cultures dans lesquelles une croissance d'hybridomes a été observée ont été testés pour détecter la production d'anticorps monoclonaux anti-NRP2. Dans ce but, les surnageants de chaque puits de culture d'hybridomes ont été testés par cytométrie en flux sur les lignées cellulaires exprimant ou non la neuropiline 2. Les hybridomes produisant des anticorps reconnaissant la lignée P815-NRP2 ont été clonés en utilisant la méthode de la dilution limite (densité d'ensemencement de 1 cellule par puits de culture). Plusieurs candidats reconnaissant spécifiquement NRP2 ont été générés et sélectionnés pour leur capacité à induire une apoptose des cellules tumorales exprimant la neuropiline 2, dont les clones ITAC-B1 et ITAC-B2. Le clone ITAC-B1 a été déposé selon le Traité de Budapest, auprès de la CNCM (Collection Nationale des Microorganisme, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) le 30 juillet 2008 sous le numéro de dépôt CNCM I-4054. Afin de caractériser les anticorps monoclonaux ITAC-BI et ITAC-B2, un marquage membranaire a été réalisé par cytométrie en flux en mettant en présence 200000 cellules HT29, HT29-NRP2, P815 ou P815-NRP2 avec 51.1g/mL d'ITAC-B1 ou d'ITAC- B2, 15 minutes, à 4°C. Un anticorps secondaire de chèvre anti-souris couplé à du FITC a été incubé ensuite 15 minutes dans le noir, à 4°C, avant lecture par cytométrie en flux. Les résultats de l'analyse par cytométrie de flux obtenus pour ITAC-BI sont représentés à la figure 2. Pour chacun des panneaux de la Figure 2, le nombre d'évènements (nombre de cellules) est indiqué en ordonnée. l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'anticorps ITAC-B 1) est représentée en abscisse. Les panneaux A et C (P815 + ITAC-B 1 et HT29ctr + ITAC-BI ) de la Figure 2 représentent les résultats obtenus par cytométrie en flux avec les cellules contrôle alors que les panneaux B et D (P815-NRP2 + ITAC-BI et HT29-NRP2 + ITAC-Bl) représentent les résultats obtenus avec des cellules exprimant NRP-2 à leur surface membranaire. Les courbes de distribution en traits noirs représentent les résultats du marquage avec un anticorps contrôle, les courbes de distribution en traits gris représentent les résultats du marquage avec les anticorps ITAC-B 1. On constate, pour les lignées cellulaires exprimant NRP-2, un net déplacement vers la droite du pic de distribution des populations cellulaire lors du marquage par ITAC-B 1 (trait gris) en comparaison du marquage avec l'anticorps IgG contrôle (trait noir). Pour les lignées cellulaires n'exprimant par NRP-2 ce déplacement du pic de distribution est très faible. Ces résultats montrent que les anticorps ITACBl reconnaissent spécifiquement la neuropiline-2 présentent à la surface membranaire. Des résultats similaires ont été obtenus pour l'anticorps ITAC-B2. Les séquences génomiques de la région variable des chaînes lourdes des hybridomes produisant les anticorps ITAC-B 1 et ITAC-B2 ont été analysées par séquençage respectivement avec les amorces : - 5'-GARGTTAAGCTGSAGGAGTCAGG- 3' (amorce sens dégénérée) (SEQ ID NO : 23) - 5'-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC- 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 24) ; et - 5'-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCAGG- 3' (amorce sens) (SEQ ID NO : 25) - 5'-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC- 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 26). Les séquences génomiques de la région variable des chaînes lourdes des hybridomes produisant les anticorps ITAC-BI et ITAC-B2 ont été analysées par séquençage respectivement avec les amorces : - 5'-GATATTGTGATSACMCARDCTACA- 3' (amorce sens dégénérée) (SEQ ID NO : 27) - 5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATTA- 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 28); et - 5'-GATATTGTGMTSACCCAGACTCCA- 3' (amorce sens dégénéré) (SEQ ID NO : 29) - 5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATTA- 3' (amorce anti-sens) (SEQ ID NO : 30). Les séquences d'acides aminés des boucles hypervariables CDRI, CDR2 et CDR3 des régions variables des anticorps ITAC-BI et ITAC-B2 ont été déterminées à l'aide du logiciel IMGT/V-QUEST version 3.0.0 sur la base de données d'immunoglobulines de � the international ImMunoGeneTics information system� � (IMGT/GENE-DB). EXEMPLE 3: ROLE DE LA NEUROPILINE-2 DANS LA PROLIFERATION 25 CELLULAIRE Production d'un vecteur exprimant des siRNA double brin ciblant le gène de la NRP2 humaine Un oligonucléotide sens 5'-AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA AT-3' (SEQ ID NO : 31), et un oligonucléotide anti-sens : 5'-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA 30 GC-3' (SEQ ID NO : 32) correspondant à une partie de la séquence génique de la NRP2 humaine ont été hybridés, et le duplex résultant a été inséré dans un vecteur d'expression double promoteur (pFiv H1/U6puro SiRNA Expression vector, System Biosciences) préalablement digéré par l'enzyme Bbsl. Après avoir vérifié que l'insert avait bien la taille attendue (21 paires de bases), 35 100�L de bactéries compétentes E. Coli HB101 (Gibco) ont été transformées par 11_tg du vecteur contenant cet insert. Une colonie a été amplifiée dans 200mL cle milieu LB avec ampicilline en utilisant un Hi-speed midi prep kit (Qiagen), puis une maxiprep (Qiagen) a été réalisée et a conduit à la purification du plasmide pFiv HI/U6puro SiRNA-NRP2. Puisque le plasmide pFiv H1/U6puro SiRNA-NRP2 contient les promoteurs Hl et U6 de l'ARN polymérase III bordant l'insert, chacun des brins de l'insert est transcrit dans les cellules transfectées par ce plasmide, aboutissant à la génération de siARN double brin dirigé contre les transcrits NRP-2, constitué de: Brin sens : 5'- GGC UGG AAG UCA GCA CUA AUU U -3' (SEQ ID NO : 1); Brin anti-sens : 5'- AUU AGU GCU GAC UUC CAG CCU U û 3' (SEQ ID NO : 2); Production d'une lignée cellulaire exprimant un siRNA ciblant le gène de la NRP2 humaine La lignée Colo320 exprimant naturellement la Neuropiline 2 à sa surface membranaire a été transfectée par le plasmide pFiv H1/U6puro siRNA-NRP2 en utilisant le kit Effectene�, Qiagen). Parallèlement, des cellules Co1o320 ont été transfectées par un siRNA contrôle (siRNA-ctrl) fourni avec le kit pFiv H1/U6puro SiRNA Expression vector (System Biosciences). Les cellules transfectées Colo320siRNA-NRP2 et Colo320siRNA-ctrl ont ensuite été sélectionnées à J2 par 21ag/mL de puromycine. L'efficacité de la transfection a été évaluée dès J7 par marquage avec un anticorps IgG murin anti-NRP2 humaine (Clone C9, Santa Cruz Biotechnology) en cytométrie en flux : les résultats obtenus sont représentés à la Figure 3. Pour chacun des panneaux de la Figure 3, le nombre d'évènement (le nombre de cellules) est indiqué en ordonnée, l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'anticorps anti-NRP2 C9) est représentée en abscisse. Les courbes de distribution en traits noirs représentent les résultats obtenus après marquage avec un anticorps contrôle, les courbes de distribution en traits gris représentent les résultats obtenus après marquage avec l'anticorps C9. Le panneau B de la Figure 3, qui représente l'analyse réalisée avec les cellules Colo320s'RNA-NRP2 exprimant naturellement NRP-2, montre un déplacement vers la gauche du pic de distribution des cellules marquées par l'anticorps C9, par rapport à l'analyse réalisée avec les cellules Colo320siRNA-ctrl qui est représentée sur le panneau A. Ces résultats montrent que l'expression de la protéine NRP-2 est efficacement inhibée dans les cellules exprimant le siARN-NRP-2. Test de prolifération en présence du siRNA-NRP-2 : test MTT Le test de prolifération MTT se base sur la réduction du bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium), par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives, en formazan. L'intensité de la coloration (DO) induite par cette réaction est proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test, et à leur activité métabolique. 4000 cellules HT29ctrl, HT29-NRP2, COl0320siRNA-ctrl ou Colo320siRNA-NRP2 ont été ensemencées dans une plaque Maxisorp 96 puits, dans 10011L de milieu DMEM contenant 10% de SVF inactivé. Le test a été effectué en triplicate. A 24, 48 et 72 heures respectivement, 10 �L de MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés dans chaque puits. Après 2 heures d'incubation à 37°C, 5% CO2, 200�L de DMSO ont été ajoutés à chaque puits après agitation, et la DO a été lue à 570nm par un spectrophotomètre. Les résultats de ces expériences sont représentés à la Figure 4 Les Figures 4.A et 4.B sont des histogrammes représentant les résultats obtenus lors du test de prolifération réalisé respectivement avec les cellules HT29ctrl et HT29-NRP2, et avec les cellules CoIo320s'RNA-ct`i et COlo32Os1RNA-NRP2 L'intensité de coloration (la densité optique � DO �) correspondant à la production de formazan par les cellules est indiquée en ordonnée, et les temps auxquels ont été réalisés les tests de viabilité sont indiqués en abscisse. Pour le panneau A, les barres gris claires représentent les mesures réalisées sur les cellules HT29-NRP2, les barres gris foncées représentent les mesures réalisées sur les cellules témoins HT29ctrl. Pour le panneau B, les barres gris claires représentent les mesures réalisées sur les Colo32OsiRNA-NRP2 cellules dont l'expression de NRP2 est réprimée, les barres gris foncées représentent les mesures réalisées sur les cellules témoins CoIo320s'RNA-ctri exprimant NRP2. La Figure 4.A montre que la DO augmente lorsque les cellules expriment NRP-2, ce qui signifie que l'expression de NRP-2 par les cellules HT29-NRP2 induit une prolifération et une survie cellulaire supérieure à celle des cellules n'exprimant pas NRP-2. La Figure 4.B montre que la DO diminue lorsque l'expression de NRP-2 dans les cellules Co1o320 est supprimée (cf. barres représentant CoIo320s'RNA-NRP2 ne comparaison de Colo320siRNA-`t`I) Ce résultat confirme le résultat obtenu avec les cellules HT29 : NRP-2 induit une prolifération et une survie cellulaire supérieure chez les cellules. L'influence de la neuropiline 2 sur le cycle cellulaire a été étudiée. 50000 cellules HT29 ou HT29-NRP2 ont été ensemencées dans 1mL de DMEM-10%SVF en plaque 24 puits. 24heures après ensemencement, les cellules ont été trypsinées, lavées 2fois avec 3mL de PBS et reprises dans 1mL d'éthanol 70%. Elles ont été laissées une nuit à 4°C dans l'éthanol 70%. Le lendemain, les cellules sont lavées 2 fois avec 3mL de PBS, digérées avec de la Dnase et marquées avec de l'IP. 30min après, les cellules sont analysées grâce à un cytomètre EPIC'C Altra (Beckman Coulter) et au logiciel d'analyse de cycle Wincycles. Les résultats de cette analyse sont présentés à la Figure 4bis La Figure 4 bis montre que lorsque les cellules expriment NRP2, le nombre de cellules en phase G2M et S augmente, alors que le nombre de cellules en phase G 1 diminue. Ainsi, l'expression de la neuropiline 2 est associée à une augmentation de la fraction de cellules en phase S et G2M. L'influence oncogénique de la neuropiline-2 a également été évaluée en comparant chez des souris le développement de xénogreffes de diverses lignées tumorales en fonction de l'expression de la neuropiline-2 dans ces lignées. Les Figures 5.A, 5.B, 5.0 et 5.D sont des photographies de souris ayant été inoculées par voie sous-cutanée respectivement par les cellules HT29ctrl, HT29-NRP2, Colo32Os1RNA-ctn et Colo320s1RNA-NRP2 Alors que chez les souris inoculées avec des cellules n'exprimant pas NRP-2 (Fig. 5.A et Fig. 5.D), il n'y a pas de progression anormale de la xénogreffe, une augmentation anormale de la prolifération de la xénogreffe est observée chez les souris inoculées avec des cellules exprimant NRP-2 (Fig. 5.B et Fig. 5.C). Ces expériences montrent que l'expression de la neuropiline-2 après transfection, ou la répression de cette protéine par ARN interférence, influencent l'oncogenèse des lignées Modulation de l'expression de p53 par un siRNA ciblant le gène de la NRP2 humaine. L'expression de p53, des E-Cadhérines et de la cytokératine 20 dans les xénogreffes de cellules tumorales exprimant ou non la neuropiline-2 (lignée HT29ctrl ou HT29-NRP2) a été étudiée par immunohistochimie à l'aide d'anticorps spécifiques de chacune des ces trois protéines. Les Figures 6.A, 6.0 et 6.E sont des photographies de coupes de xénogreffes prélevées chez des souris inoculées par la lignée contrôle HT29ctrl, les Figures 6.B, 6.D et 6.F sont des photographies de coupes de xénogreffes prélevées chez des souris inoculées par la lignée exprimant NRP-2 (HT29-NRP2). Les coupes de xénogreffes des Figures 6.A et 6.B ont été marquées par un anticorps anti-cytokératine, les coupes de xénogreffes des Figures 6.0 et 6.D ont été marquées par un anticorps anti-E-Cadhérine, et les coupes de xénogreffes des Figures 6.E et 6.F ont été marquées par un anticorps anti-p53. Les Figures 6.A, 6.0 et 6.E montrent que les xénogreffes issues de la lignée contrôle HT29ctrl sont fortement marquées par les anticorps anti-cytokératine, anti- E-Cadhérine et anti-p53, alors que les xénogreffes issues de la lignée contrôle HT29-NRP2 ne sont marquées par aucun des ces anticorps. Cette étude a montré que la transfection de la neuropiline-2, qui favorise la progression des xénogreffes (Figures 5.A à 5.D), est associée à une perte de l'expression de l'anti-oncogène p53 au niveau des noyaux des cellules tumorales (Figure 6). En outre, l'étude immunohistochimique objective une perte de l'expression des E-Cadhérines et de la cytokératine 20 dans les xénogreffes exprimant la neuropiline-2 (Figure 6), suggérant que l'acquisition de la neuropiline-2 favoriserait la transition épithélio-mésenchymateuse. L'influence de la neuropiline-2 sur l'expression de p53 a également été étudiée. Pour cela, les lignées HT29-NP2 ou Co1o320 ont été traitées soit avec des siRNA inhibant la traduction de la neuropiline-2, soit avec des anticorps monoclonaux provenant de l'hybridome ITAC-B 1. La Figure 7 représente les résultats obtenus par cytométrie en flux pour les cellules HT29-ctrl (panneau A), HT29-NRP2 (panneau B), Colo320s1RNA-c'ri (panneau C) et Colo320s'RNA-NRPZ (panneau D) marquées à l'aide d'un anticorps anti-p53. Les courbes en traits noirs représentent les résultats du marquage avec un anticorps contrôle, les courbes en traits gris représentent les résultats du marquage avec l'anticorps anti-p53. Le nombre d'évènements (le nombre de cellules) est indiqué en ordonnée, l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'anticorps anti-p53) est représentée en abscisse. Les panneaux B et C présentant les résultats obtenus pour les lignées exprimant NRP-2, à savoir les panneaux HT29-NRP2 et Colo320SiRNA-ctrl montrent que la protéine p53 n'est pas, ou très peu exprimée (les courbes des populations marquées avec l'anticorps contrôle ou l'anticorps anti-p53 se superposent). En revanche, concernant les panneaux A et D qui présentent les résultats obtenus pour les lignées n'exprimant pas la protéine NRP-2, à savoir les panneaux HT29ctr et COlo320siRNA-NRP2 lors du marquage par l'anticorps anti-p53 (trait gris), il y a un déplacement du pic de distribution des populations cellulaires vers la droite, en comparaison du marquage avec anticorps IgG contrôle (trait noir). Ces expériences montrent qu'il existe une corrélation négative entre la présence de la neuropiline-2 et celle de p53. En particulier, lorsque colo320, lignée tumorale exprimant constitutivement la neuropiline-2, est traitée par ARN interférence pour inhiber la traduction de cette protéine (lignées Colo320s'RNA-NRP2), une restauration de l'expression de p53 dans les lignées tumorales est clairement observée. Les extraits protéiques des lignées cellulaires HT29-ctrl, HT29-NRP2, Colo320s'RNA-c"i et CO1o320s'RNA-NRP2 ont également été analysés par transfert de Western à l'aide d'anticorps anti-p53. Après lyse des lignées cellulaires, migration des culots protéiques obtenus sur gel de polyacrylamide 10% (10 p.g de protéine par puits, normalisée par rapport à l'immunoblotting de l'actine), puis transfert sur membrane PVDF, la membrane PVDF a été incubée durant une nuit avec l'anticorps primaire p53 (BD Biosciences, mouse anti-human p53) dilué au 1/500. Les membranes, après lavage dans du TBS 0,1% Tween20, ont été incubées pendant 1 heure avec un anticorps secondaire anti-mouse HRP dilué au 1/12500. Les résultats sont représentés sur la Figure 8. La Figure 8 montre que la protéine p53 est fortement exprimée dans la lignée HT29-ctrl n'exprimant pas NRP-2 alors qu'elle est indétectable dans la lignée HT29-NP2. De la même manière, p53 ne peut être mis en évidence dans la lignée Colo320s'RNA " I qui exprime NRP-2, alors qu'elle est fortement exprimée dans la lignée Colo320s'RN'A-NRP2 dans laquelle l'expression de NRP-2 est réprimée. Cette expérience confirme qu'il existe une corrélation négative entre la présence de la neuropiline-2 et l'expression de p53. Ces données indiquent que l'inhibition de l'expression de la neuropiline-2 permet l'augmentation de l'expression de p53. EXEMPLE 4: EFFET DE L'ANTICORPS ITAC-B1 SUR LA CROISSANCE DE CELLULES TUMORALES Test de formation de colonies tumorales en milieu gélosé semi-solide Afin de déterminer si l'anticorps ITAC-B 1 possède une activité de neutralisation de la formation de colonies tumorales in vitro, des tests de formation de colonies tumorales in vitro en milieu gélosé semi-solide contenant de l'agar ont été effectués. Le principe de ce test repose sur la mise en contact de cellules tumorales humaines exprimant la NRP2 à leur surface membranaire (Colo320) et de l'anticorps ITAC-B1. 4000 cellules tumorales humaines (Colo320) exprimant à leur surface membranaire la NRP2 sont ensemencées dans chaque puits d'une plaque 24 puits, en milieu semi-solide contenant de l'agar, et en présence de 10 pg/mL d'anticorps anti-NRP2 ITAC-B1. A titre de comparaison, le même test est effectué en présence de cytotoxiques d'action prouvée, à savoir du 5-fluoro-uracile (5-FU) utilisé à raison de 50�g/mL ou de l'Avastin� (bevacizumab : anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le VEGF) utilisé à raison de 50 lag/mL, ou en présence d'un anticorps contrôle isotypique (anticorps monoclonal IgGI de souris (BZI)), utilisé à raison de 10 �g/mL A 10 jours post ensemencement, le comptage des colonies a été effectué au microscope optique. La Figure 9 représente les résultats obtenus. Le nombre de colonies formées est indiqué en ordonnée, et les différentes molécules testées sont indiquées en abscisse. Ces résultats montrent qu'en présence de l'anticorps ITAC-BI comme en présence de 5 FU, le nombre de colonies est d'environ 40, contre plus de 140 pour le témoin cellules seules ou le contrôle négatif, et environ 120 colonies lorsque les cellules sont cultivées en présence d'Avastin� (bevacizumab). Il ressort de cette étude in vitro que les anticorps anti-NRP2 ITAC-B 1 inhibent 15 presque totalement la formation de colonies tumorales de cellules exprimant la NRP2 à leur surface, et ceci d'une façon plus efficace que l'Avastin� (bevacizumab). La neuropiline-2 étant un co-récepteur du VEGF, il a été vérifié si l'activité d'ITAC-B1 était dépendante d'une interaction entre NRP-2 et VEGF. Dans ce but, les tests de formation de colonies de cellules Colo 320 ont été effectués dans les conditions décrites ci- 20 dessus, et en présence d'anticorps ITAC-BI (10 �g/mL), cle bevacizumab (50�g/mL) ou d'anticorps contrôle (10 �g/mL), utilisés isolément ou en association. Les résultats sont présentés sur la Figure 10: l'ordonnée représente le nombre de colonies formées ; en abscisse les anticorps présents clans le milieu de culture sont indiqués par un � + �. 25 La Figure 10 montre que la présence de bevacizumab dans le milieu de culture affecte très peu la prolifération des cellules Colo 320 : le nombre de colonies observées en présence de l'anticorps contrôle, du bevacizumab, ou de l'association de ces 2 anticorps est similaire, et ne diffère que peu de celui observé avec le témoin cellules seules. En revanche, le nombre de colonies observé en présence de l'anticorps ITAC-B1 est fortement diminué par 30 rapport au témoin cellules seules ; en outre lorsque le milieu de culture contient l'anticorps ITAC-B1 et le bevacizumab (qui neutralise VEGF-A), le nombre de colonies est identique à celui observé lorsque le milieu contient l'anticorps ITAC-B 1 seul. Ce résultat indique qu'ITACB1 inhibe aussi efficacement la prolifération cellulaire en présence de VEGF qu'en l'absence de VEGF, et donc que l'effet thérapeutique de ITAC-BI est indépendant de l'interaction NRP- 35 2/VEGF. Test MTT de prolifération de cellules tumorales : L'effet de l'anticorps ITAC-BI sur la prolifération de cellules tumorales humaines présentant la NRP2 à leur surface membranaire, a également été étudié en utilisant le test MTT, comme décrit à l'Exemple 3 ci-dessus. 4000 cellules par puits de cellules Colo32QsiRNA-ctrl (cellules contrôle transfectées par un vecteur vide) ou de cellules Colo320s'RNA-NRP2 (transfectées par un siRNA ciblant la NRP2) , dans 1001.1L de milieu DMEM contenant 10% de SVF inactivé, ont été ensemencées en plaque Maxisorp 96 puits. Après adhérence des cellules, 5�g/mL d'anticorps anti-NRP2 ITAC-B ou 5�g/mL �g/mL d'anticorps contrôle ont été ajoutés. Après 24, 48, ou 72 heures de culture, 10 �L de MTT reconstitué à 5 mg/mL dans du PBS ont été ajoutés à chaque puits de culture. Les plaques ont ensuite été incubées 3 heures dans le noir, à 37°C, et 5% de CO2, centrifugées, puis le surnageant a été éliminé. 200�L de DMSO ont alors été ajoutés dans chaque puits. La densité optique a été lue dans l'heure, à 570 nm, après agitation de la plaque. Le test a été effectué en triplicate. Les résultats sont présentés sur la Figure 11. Les panneaux A et B de la Figure 1 1 représentent respectivement les résultats obtenus lors du test de prolifération réalisé avec les cellules Colo320siRNA-`tri ou Colo320siRNANRP2 La densité optique � DO �) traduisant la production de formazan par les cellules est indiquée en ordonnée, et la durée de culture est indiquée en abscisse. Le témoin cellules seules est représenté par 0, les cellules cultivées en présence de l'anticorps contrôle sont représentées par ^, et les cellules cultivées en présence de l'anticorps ITAC-B1 sont représentées par A. Ces résultats montrent que dans le cas des cellules Colo320s1RNA-ctrl qui expriment NRP-2, la prolifération en présence de l'anticorps ITAC-BI est inférieure à celle des cellules seules et celle observée en présence de l'anticorps contrôle. En revanche, dans le cas des cellules Co]o320siRNA-NRP2 la prolifération en présence de l'anticorps ITAC-BI est identique à celle des cellules témoin et à celle observée en présence de l'anticorps contrôle. Les anticorps ITAC-B 1 ralentissent donc spécifiquement la prolifération des cellules présentant NRP2 à la surface (cellules Colo320siRNA-ctri) et non celle des cellules n'exprimant pas NRP2 (cellules Colo32Qs1RNA NRP2 EXEMPLE 5: L'ANTICORPS ITAC-B1 POSSEDE LA CAPACITE D'INDUIRE L'APOPTOSE DE CELLULES TUMORALES EXPRIMANT LA NEUROPILINE-2 Afin de déterminer la capacité de l'anticorps ITAC-Bl à induire l'apoptose de cellules tumorales exprimant la NRP2, un test in vitro d'apoptose Annexine V-APC a été réalisé (BD Pharmingen, San Diego, CA). Ce test repose sur l'externalisation de la phosphatidylsérine par les cellules apoptotiques, et sur la fixation de l'Annexine V-APC sur cette molécule. l mL de milieu DMEM contenant 10% de SVF inactivé et 100000 cellules HT29-NRP2 ou 100000 cellules IIT29ctrl ont été ensemencées par puits dans une plaque Nunc 24 puits. Après adhérence des cellules (3heures), trois concentrations d'anticorps anti-NRP2 ITAC-B (0,5�g/mL, 1�g/mL et 5�g/mL) ont été testées dans différents puits. En parallèle, des témoins cellules seules ont été réalisés, ainsi que des contrôles négatifs (anticorps de souris IgGI anti-human (BZ1) aux mêmes concentrations que l'anticorps ITAC-B 1). Après 16 heures d'incubation, le surnageant de culture a été aspiré et 50011L de trypsine-EDTA ont été ajoutés dans chaque puits, et laissés en contact pendant 10 minutes. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher, 500�L de milieu DMEM-10% SVF ont été ajoutés par puits. Les cellules ont alors été centrifugées, lavées 2 fois dans du PBS puis reprises dans 300�L de Tampon Binding Buffer IX (fourni dans le kit), puis 5�L d'Annexine V-APC ont ensuite été ajoutés à 100�L de cette solution. L'analyse par cytométrie en flux des populations de cellules marquées par l'Annexine V-APC en fonction des concentrations en anticorps ITAC- B1, et en anticorps contrôle, est présenté à la Figure 12. Pour chacun des panneaux de la Figure 12, le nombre d'évènements (nombre de cellules) est indiqué en ordonnée et l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'annexine V-APC) est représentée en abscisse. Les panneaux A, C et E représentent les expériences réalisées avec les cellules HT29-NRP2, les panneaux B, D et F représentent les expériences réalisées avec les cellules HT29ctrl. Les expériences pour lesquelles la concentration en anticorps ITAC-B1 est de 0,5�g/mL sont représentées aux panneaux A et B de la Figure 12. Les expériences pour lesquelles la concentration en anticorps ITAC-BI est de I �g/mL sont représentées aux panneaux C et D de la Figure 12, et les expériences pour lesquelles la concentration en anticorps ITAC-B1 est de 5�g/mL sont représentées aux panneaux E et F de la Figure 12. Pour chaque panneau, la courbe de distribution (1) représente les cellules seules, la courbe de distribution (2) représente les cellules cultivées en présence d'un anticorps isotypique murin contrôle et la courbe de distribution (3) représente les cellules cultivées en présence de l'anticorps ITAC-Bl. On constate, pour les panneaux C et E représentant les expériences réalisées avec les cellules HT29-NRP2 exprimant NRP-2 un déplacement vers la droite du pic de distribution correspondant respectivement aux concentrations 1 et 5 �g/mL d'anticorps ITACBI. Ce déplacement du pic de distribution n'est pas observé pour les témoins cellules seules et anticorps contrôle. Ce résultat indique que l'apoptose est spécifiquement induite chez les cellules exprimant NRP-2 à partir de 1 �g/mL d'anticorps ITAC-BI dans le milieu de culture. En ce qui concerne les expériences correspondantes réalisées avec les cellules HT29ctrl qui n'expriment pas NRP-2, les courbes représentant les conditions cellules seules, témoins anticorps contrôle et anticorps ITAC-B1 se superposent, indiquant que l'anticorps ITAC-BI n'entraine par l'apoptose de cellules n'exprimant pas NRP-2. On constate que l'anticorps ITAC-Bl induit l'apoptose de cellules exprimant la NRP2 à leur surface cellulaire, à une dose égale ou supérieure à I�g/mL. L'apoptose induite par ITAC-B1 est dose-dépendante puisqu'une concentration plus importante d'ITAC-B1 entraîne une apoptose plus importante. Ces expériences montrent donc que les anticorps ITAC-BI induit spécifiquement l'apoptose de cellules tumorales présentant la NRP2 (HT29-NRP2) à leur surface membranaire, sans induire l'apoptose de cellules ne présentant pas la NRP2 (HT29). Des expériences similaires d'évaluation de la capacité d'ITAC-B1 à induire l'apoptose de cellules exprimant NRP2 ont été réalisées avec des cellules cultivées en présence soit de 5FU (5 fluoro-uracile), soit d'irinotecan, deux anticancéreux couramment utilisés en chimiothérapie. Dans cette série d'expériences, les concentrations en anticorps ITAC-BI de 2,51.1g/mL et 5�g/mL ont été testées. En parallèles, des témoins cellules seules ont été réalisés, ainsi que des contrôles avec l'anticorps BZ1 aux concentrations 2,5�g/mL et 5�g/mL. Le 5FU et l'irinotecan sont utilisés à 10�g/mL. Les résultats de ces expériences sont représentés à la Figure 13. Les panneaux de la Figure 13 sont des représentations en nuage de points de l'analyse par cytométrie en flux. Pour chacun des panneaux, l'intensité de fluorescence (correspondant au marquage des cellules par l'annexine V-APC) est représentée en abscisse. L'ordonnée indique la granulosité des cellules (Side Scatter ou SSC). Les conditions de traitement par les anticorps sont indiquées au dessus des panneaux, et le traitement par le 5FU ou l'irinotecan est indiqué à droite des panneaux. Le pourcentage de cellules marquées par l'annexine V-APC, (correspondant au pourcentage de cellules entrées en apoptose), est indiqué en bas à droite de chaque panneau. Les cellules seules présentent environ 12% d'apoptose, et les cellules cultivées en présence de 5FU ou d'irinotecan seuls, ou associés à l'anticorps contrôle BZ1 présentent entre 15 34 et 43% environ d'apoptose dans le cas du 5FU, et entre 21 et 35% d'apoptose dans celui de l'irinotecan. L'apoptose chez les cellules cultivées conjointement en présence de 5FU et de l'anticorps ITAC-BI est de l'ordre de 78,5% pour une concentration d'ITAC-Bl dans le milieu de 2,5�g/mL, et de l'ordre de 80% pour une concentration d'ITAC-Bide 5�g/mL. 20 Pour les cellules cultivées en présence d'irinotecan et d'ITAC-Bl, l'apoptose est de l'ordre de 51% pour une concentration d'anticorps ITAC-B1 de 2,5�g/mL, et de l'ordre de 58% pour une concentration de 5�g/mL. Ces résultats mettent donc en évidence une synergie d'action entre les anticorps ITAC-Bl et les molécules anticancéreuses, la combinaison 5FU/ITAC-Bl étant la plus 25 efficace dans les conditions testées. Afin de corréler l'induction d'apoptose à l'expression de p53. les cellules Colo320siRNA-ctrl ont été prétraitées 18h avec un inhibiteur chimique de p53, la pifithrin-a, à une dose de 27�M (PFTa, Sigma). Après prétraitement, les cellules sont lavées 2 fois avec 3mL de PBS et mises en plaque 24 puits, à raison de 100000 cellules/puits dans lmL de RPMI-10% 30 SVF. Des cellules non prétraitées sont mises dans les mêmes conditions. Les cellules sont incubées pendant 5h avec un anticorps isotypique murin contrôle (BZI) ou ITAC-BI à 20�g/mL et l'apoptose est mesurée comme décrit ci-dessus. La Figure 14 représente les résultats des expériences d'induction de l'apoptose réalisées avec les cellules Colo320siRNA-ctrl prétraitées ou non par la PFTa. Le pourcentage de 35 cellules marquées par l'annexine V-APC est indiqué en ordonnée, les conditions de cultures des cellules sont indiquées en abscisse (témoin milieu, témoin milieu additionné d'un anticorps contrôle isotypique -BZ1-, essai milieu additionné de l'anticorps ITAC-B 1). Les résultats des essais réalisés avec des cellules prétraitées par la PFTa sont représentés en gris clair, ceux des essais réalisés avec des cellules non prétraitées sont représentés en gris foncé. Alors que dans les témoins milieu et milieu additionné d'anticorps contrôle le marquage à l'annexine V-APC est similaire que les cellules soient traitées ou non par la PFTa, on constate que les cellules cultivées en présence d'anticorps ITAC-B 1 sont plus faiblement marquées lorsqu'elles sont prétraitées avec la PFTa (environ 28% de marquages contre 41% pour les cellules non prétraitées). Ces résultats montrent que le prétraitement par la PFTa prévient l'apoptose dépendante d'ITAC-Bl. L'apoptose induite par ITAC-BI semble donc dépendre de l'expression de p53. EXEMPLE 6: LES ANTICORPS ITAC-B1 ET ITAC-B2 ONT LA CAPACITE 10 D'INDUIRE L'EXPRESSION DE LA PROTEINE P53 Après avoir montré que la neuropiline-2 a la capacité d'altérer l'expression de p53 dans la lignée HT29 et de la restaurer dans la lignée Colo320siRNA-NRP2 l'influence de l'anticorps ITAC-B1 sur l'expression de p53 dans des lignées exprimant la neuropiline-2, comme HT29-NP2+ et Colo320siRNA-ctrl, a été étudiée. 15 Les cellules tumorales HT29, HT29-NP2, Colo320siRNA-ctrl et Colo320siRNA-NRP2 ont été exposées à 20�g/ml d'anticorps ITAC-B1 ou d'anticorps contrôle, et cultivées pendant 48 heures. Après lyse des lignées cellulaires, migration des culots protéiques obtenus sur gel de polyacrylamide 10% (10 �g de protéine par puits). puis transfert sur membrane PVDF, la membrane a été incubée durant une nuit avec l'anticorps primaire anti-p53 20 (BD Biosciences, mouse anti-human p53) dilué au 1/500. Les membranes, après lavage dans du TBS 0,1% Tween20, ont été incubées pendant 1 heure avec un anticorps secondaire anti IgGHRP de souris dilué au 1/6000. Les résultats sont représentés à la Figure 15. Ces résultats montrent que la protéine p53 est fortement exprimée dans les lignées HT29-ctrl et Colo320siRNA-NRP2 n'exprimant pas NRP-2, que l'anticorps ITAC-Bl 25 soit présent ou non dans le milieu. Lorsque les lignées HT29-NRP2 et Colo320siRNA-ctrl exprimant NRP2 sont cultivées seules ou en présence de l'anticorps contrôle, p53 n'est pas détectée, alors que la présence de l'anticorps ITAC-BI dans le milieu de culture restaure en partie l'expression de p53. Ces résultats montrent donc que le traitement de cellules exprimant NRP2 à leur surface membranaire (HT29-NP2 et Colo320siRNA-etrl) par ITAC-B1 aboutit à la 30 restauration de l'expression de p53 dans les lignées tumorales. Cette expérience confirme qu'il existe une corrélation négative entre la présence de la neuropiline-2 et p53, et que ITAC-B1 possède la capacité originale de pouvoir moduler le niveau d'expression de p53. EXEMPLE 7: UTILISATION DE L'ANTICORPS ITAC-BI POUR POTENTIALISER 35 L'EFFET DE TRAITEMENTS ANTI-NEOPLASIQUES IN VIVO Des cellules tumorales HT29-NRP2 ont été injectées en sous-cutané à 20 souris immunodéficientes, à raison de 1.106 cellules par souris, au niveau du flanc droit. 10 jours après l'injection, les tumeurs mesurent environ 5mm x 5mm. Quatre groupes de 3 souris possédant des tumeurs comparables ont été formés : chaque groupe a reçu par voie intrapéritonéale soit du PBS (Groupe contrôle A), soit l'anticorps ITAC-BI (Groupe B), soit du 5FU (Groupe C), soit du 5FU et l'anticorps ITAC-B1 (Groupe D). Le protocole de traitement de chimiothérapie est schématisé sur la figure 16. Conformément au protocole décrit ci-dessus. le Groupe B a été inoculé avec ITAC-BI à JO (12mg/kg), J3 (6mg/kg), J7 (12mg/kg) et J10 (6mg/kg). Le Groupe C a été inoculé avec 20mg/kg de 5FU de JO à J4 puis avec 100mg/kg à J9. Le Groupe D a été inoculé avec ITAC-BI à JO (12mg/kg), J3 (6mg/kg), J7 (12mg/kg) et J10 (6mg/kg) et avec 20mg/kg de 5FU de JO à J4 et 100mg/kg de 5FU à J9. Les tumeurs ont été mesurées 2 fois par semaine, et le calcul du volume des 10 tumeurs a été effectué avec la formule : V (mm3) = d2 x D / 2. Les résultats de ces mesures sont présentés dans la Figure 17. La Figure 17 représente le volume des tumeurs en fonction du temps. Le Groupe A (témoin PBS) est représenté par (0), le Groupe B (souris inoculées avec l'anticorps ITAC-B1) est représenté par (.), le Groupe C (souris inoculées avec le 5FU) est représenté par 15 (A), et le Groupe D (souris inoculées à la fois avec l'anticorps ITAC-B1 et avec le 5FU) est représenté par (x). On observe une réduction du volume des tumeurs à partir de J14 chez les souris inoculées avec l'anticorps ITAC-B1 ou avec du 5FU. Cette réduction est plus marquée lors du traitement combiné 5FU/ITAC-B1. 20 Ces résultats montrent que l'anticorps ITAC-B1 est capable de ralentir in vivo la croissance tumorale. En outre, puisque les souris traitées par du 5FU associé à ITAC-BI connaissent le ralentissement de croissance tumorale le plus important, par rapport aux souris traitées par 5FU seul ou ITAC-B1 seul, ces résultats montrent clairement que l'utilisation de l'anticorps ITAC-Bl potentialise l'efficacité du 5-fluorouracile. :ABINET REVENDICATIONS1) Utilisation d'un anticorps anti-neuropiline 2 humaine, ou d'un ligand de la neuropiline 2 humaine dérivé dudit anticorps, pour l'obtention d'un médicament destiné à augmenter l'expression de p53 dans le cadre d'un traitement anticancéreux. 2) Anticorps anti-neuropiline-2 humaine choisi parmi : i) un anticorps comprenant le domaine variable de la chaîne lourde et le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps ITAC-B1, lesdits domaines étant respectivement définis par les séquences SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 6; ii) un anticorps comprenant le domaine variable de la chaîne lourde et le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps ITAC-B2, lesdits domaines étant respectivement définis par les séquences SEQ ID NO: 8 et SEQ ID NO: 10. 3) Ligand de la neuropiline 2 humaine dérivé d'un anticorps selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les CDR3 de la chaîne lourde et les CDR3 de la chaîne légère de l'anticorps ITAC-B 1 ou ITAC-B2. 4) Ligand de la neuropiline-2 humaine selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les CDR2 et/ou les CDR1 de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps ITAC-B1 ou ITAC-B2. 5) Ligand de la neuropiline-2 humaine selon une quelconque des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps humanisé dérivé d'un anticorps selon la revendication 2. 6) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on utilise comme inhibiteur de l'activité de la neuropiline-2 humaine, un anticorps selon la revendication 2, ou un ligand selon une quelconque des revendications 3 à 5.25