Brevet FR2947840A1 — publié le 20110114

La présente invention a pour objet de nouvelles séquences d'ADN présentant une activité de promoteur, des vecteurs d'expression contenant de telles séquences, ainsi que des cellules hôtes transformées avec ces vecteurs, notamment les bactéries lactiques telles que Lactococcus lactis. L'invention comprend également l'utilisation de ces promoteurs pour la production de protéines hétérologues, en particulier des protéines thérapeutiques ou vaccinales. Les récents progrès accomplis dans le domaine de la biologie moléculaire ont permis de modifier des microorganismes pour leur faire produire des protéines hétérologues d'intérêt. En particulier, de nombreuses études génétiques ont porté sur les cellules de mammifères, d'oiseaux ou de cellules procaryotes comme les bactéries, notamment E. coli. Toutefois, compte tenu de la particularité de ces cellules (possibilité d'obtenir des protéines glycosylées ou non, présence de virus oncogène, rendement limité, ...), l'application industrielle de ces nouveaux modes de production est encore limitée, en particulier par les problèmes d'efficacité ou d'innocuité de l'expression des gènes dans ces microorganismes recombinés. Pour augmenter les performances de ces procédés de production, des études sont régulièrement menées afin en particulier d'isoler de nouveaux promoteurs constitutifs forts ou d'améliorer les conditions de culture de ces microorganismes ou les systèmes de sécrétion et/ou d'extraction de ces protéines. Les bactéries lactiques sont couramment utilisées dans l'industrie agro-alimentaire. En marge de cette application historique ces bactéries présentent un intérêt croissant comme hôte de production de protéines hétérologues et sont de plus en plus utilisées dans ce cadre. Les protéines hétérologues exprimée chez les bactéries lactiques peuvent être de nature et d'application très diverses. Toutefois l'innocuité de ces souches bactériennes leur confère un intérêt particulier dans le cadre de production de protéines recombinantes à visée thérapeutique ou vaccinale. La capacité de souches bactériennes à sécréter directement les protéines d'intérêt dans le surnageant de culture leur confère un atout supplémentaire en permettant une purification aisée de la protéine d'intérêt dans le cadre d'application en bioproduction ou en permettant d'utiliser la souche bactérienne comme vecteur de délivrance de la protéine d'intérêt in situ chez le patient. L'expression de protéines recombinantes dans des bactéries lactiques nécessite de disposer d'outils d'expression permettant d'optimiser la production de la protéine d'intérêt. Parmi ces outils d'expression, le promoteur est un élément clef qui joue un rôle crucial dans le niveau d'expression de la protéine d'intérêt. D'une manière générale on considère souvent que plus le promoteur est fort plus l'expression potentielle de la protéine d'intérêt sera optimale. Mais bien qu'un niveau de transcription élevé soit nécessaire pour obtenir une expression optimale de la protéine, un niveau transcriptionnel trop fort peut avoir des effets délétères sur le niveau d'expression de la protéine d'intérêt dans des conditions de production. Plusieurs causes différentes peuvent être la source de ces niveaux d'expression sub-optimaux. La charge � énergétique � induite par un très fort niveau d'expression de la protéine confère un désavantage sélectif aux souches exprimant la protéine d'intérêt en réduisant sa vitesse de croissance. Il peut résulter de ce désavantage sélectif une instabilité de la souche avec le risque de sélection de mutants spontanés ayant perdu la capacité à exprimer la protéine d'intérêt. Dans le cas de protéines sécrétées le contrôle du niveau d'expression intracellulaire est encore plus crucial. En effet, la surexpression de la protéine d'intérêt nécessite son export à travers la membrane plasmique de la bactérie. Cette étape, postérieure à la transcription, peut devenir limitante et aboutir à l'accumulation intracellulaire de la forme non mature de la protéine d'intérêt et l'induction potentielle de mécanismes de réponses de résistance au stress (Hyyrylàinen et al., 2005). Le contrôle du bon niveau transcriptionnel est par conséquent le choix du promoteur optimal constitue donc un élément essentiel dans le cadre d'expression de protéines recombinantes. Bien que les bactéries lactiques soient étudiées depuis de nombreuses années et que la séquence du génome de certaines d'entre elles soit connue, on ne dispose à l'heure actuelle que d'un nombre restreint de promoteurs utilisés dans l'expression de protéines hétérologues. Ces promoteurs se divisent en deux types : les promoteurs inductibles et les promoteurs constitutifs. Les promoteurs inductibles permettant de déclencher ou d'arrêter l'expression de la protéine d'intérêt présentent l'intérêt dans le cadre de protéines toxiques ou interférant avec le métabolisme de la bactérie hôte. Plusieurs types de promoteurs inductibles ont été décrits chez L. lactis : le promoteur nisine (PnisA) (de Vos et al., 1995 ; Kuipers et al., 1995), un promoteur thermo-inductible (Nauta, 1997), un promoteur inductible pat le phage (p31 (Walker, 1998), le promoteur p170 (Madsen et al., 1999), le promoteur xylose(Pxyl) (Miyoshi et al., 2004) et le promoteur Zinc (Pzä) (Lull et al., 2004). Les promoteurs constitutifs permettant une expression continue de la protéine présentent quant à eux l'avantage de permettre une expression de la protéine tout au long de la culture et ne nécessitent pas de phase d'induction. Par contre, le niveau transcriptionnel de ces promoteurs n'étant pas modulable, le choix du promoteur possédant le niveau transcriptionnel optimal est essentiel. Plusieurs promoteurs constitutifs de forces variables ont été décrits chez L. lactis (Koivula et al., 1991 ; van der Vossen et al., 1987 et van Asseldonk et al., 1990). Plusieurs de ces promoteurs ont été utilisés dans le cadre d'expression de protéines hétérologues (pour revue Morello 2008, de Vos 1999). Les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible d'améliorer très nettement le niveau d'expression de protéines recombinantes, notamment de protéines sécrétées, chez Lactococcus Lactis, lorsque ces protéines sont exprimées sous le contrôle de nouvelles séquences promotrices constitutives issues du promoteur constitutif P44 de séquence SEQ ID NO : 1, issu de Lactococcus Lactis. Ainsi, la présente invention a pour objet un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-217 (PL3A de séquence SEQ ID NO : 21), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1, ce fragment comportant au moins la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence comportant au moins la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4), au moins la séquence nt 27-149 (SEQ ID NO : 5) ou au moins la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1; ou de manière préférée b) un fragment compris dans la séquence ntl-215, ntl-214, ntl-213, ntl-212, ntl-211, ntl-210, ntl-209, ntl-208, ntl-207, ntl-206, ntl-205, ntl-204, ntl-203, ntl-202, ntl-201, ntl-200, ntl-199, ntl-198, ntl-197, ntl-196 ou ntl-195 de la séquence SEQ ID NO : 1, ce fragment comportant au moins la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1, de préférence comportant au moins la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4), au moins la séquence nt 27-149 (SEQ ID NO : 5) ou au moins la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1; ou c) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 5 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a) ou b). De préférence, la présente invention a pour objet un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce 10 qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence SEQ ID NO : 2, bornes comprises, et correspondant à la séquence ntl-195 de la séquence SEQ ID NO : 1, ce fragment comportant au moins la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) d'un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, 95 %, 97 %, 98 % et 15 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). La séquence SEQ ID NO : 1 correspond ici au promoteur P44 (ou p44) de séquence suivante: AACAATTGTAACCCATACAGGAGAAGGGACGATAGCAATTTTTTCAATAAGTAGACAAAGTAGA 20 GAATAATTTAATAAAAAACTGAAAAAATCACAGCTAAACTCTTGTTTTACTTGATTTTATGTTAAA ATAATTAATGAGTGTAATTGTATATAAAATTATCTGTACACTTACCTAATTTATTAAAAAAAAATA TGAATCGTGATGTGTGAGGGAAAGGAGTCGCTTTTATGGCCAAA. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique, on entend désigner ici le degré d'identité entre les deux séquences d'acides nucléiques le long des 25 séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille différente, le % d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la plus courte séquence. Pour calculer le % d'identité, les deux séquences sont superposées de façon à maximiser le nombre de bases identiques en autorisant des intervalles, puis le nombre de bases identiques est divisé par le nombre total de bases de la plus courte séquence. 30 Le pourcentage d'identité entre deux séquences peut également être défini en utilisant le programme 'BLAST 2 Séquences'. Ce programme utilise l'algorithme BLAST pour des comparaisons de séquences ADN-ADN deux à deux. Une version de ce programme est disponible sur le site web http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/b12.html. De préférence encore, l'invention a pour objet un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1, ce fragment comportant au moins la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). De préférence encore, la présente invention a pour objet un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 27-149 (SEQ ID NO : 5) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). De préférence encore, la présente invention a pour objet un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, 20 de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). L'invention comprend également un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il 25 est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence nt15-195 (SEQ ID NO : 7) bornes comprises, ce fragment comportant au moins une séquence choisie parmi le groupe de séquences suivantes : 30 - la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1, - la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4) de la séquence SEQ ID NO : 1, et - la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). L'invention comprend également un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence nt27-195 (SEQ ID NO : 8), bornes comprises, ce fragment comportant au moins une séquence choisie parmi le groupe de séquences suivantes : - la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1, - la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4) de la séquence SEQ ID NO : 1, et - la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). L'invention comprend également un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence nt15-159 (SEQ ID NO : 9), bornes comprises, ce fragment comportant au moins une séquence choisie parmi le groupe de séquences suivantes : - la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1, - la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4) de la séquence SEQ ID NO : 1, et - la séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment tel que défini en a). De manière encore plus préférée, la présente invention a pour objet un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1 choisi parmi les fragments de séquences SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 9 ou les fragments dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % à l'une des séquences SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 9. De manière encore plus préférée également, la présente invention a pour objet un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué du fragment de séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) ou d'un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, 97 %, 98 % et 99 % de la séquence du fragment de séquence SEQ ID NO : 6. Selon l'invention, lesdits acides nucléiques de l'invention ont une activité de 5 promoteur. L'activité de promoteur de la transcription des acides nucléiques de l'invention peut être vérifiée par exemple en introduisant dans la cellule hôte considérée un ADN recombinant comprenant, sous le contrôle de la séquence promotrice étudiée, un gène reporteur, comme la luciférase, dont l'expression peut être mise en évidence dans l'hôte 10 cellulaire considéré. Ainsi, l'invention a pour objet un promoteur constitué d'un acide nucléique selon la présente invention ou comprenant à titre de séquence promotrice un acide nucléique selon la présente invention. 15 Sous un aspect particulier, l'invention a pour objet un acide nucléique dénommé PL3 de séquence SEQ ID NO : 10, comprenant à titre de promoteur la séquence SEQ ID NO : 6, une séquence 5'UTR et le début de la séquence codant pour la séquence signal EXP4, de séquence suivante : PL3:ACTGACTGACTGACTGGACGATAGCAATTTTTTCAATAAGTAGACAAA 20 GTAGAGAATAATTTAATAAAAAACTGAAAAAATCACAGCTAAACTCTTGTT TTACTTGATTTTATGTTAAAATAATTAATGAGTGTAATTGTATATAAAACGG TCCGATATATATAT. Sous un autre aspect, l'invention comprend un vecteur d'expression comprenant 25 à titre de promoteur un promoteur constitué d'un acide nucléique selon la présente invention ou comprenant à titre de séquence promotrice un acide nucléique selon la présente invention. De préférence, ce vecteur d'expression porte un gène d'intérêt ou comprend un acide nucléique d'intérêt codant pour une protéine d'intérêt, de préférence hétérologue à 30 l'hôte cellulaire transformée par ce vecteur d'expression, caractérisé en ce que ce gène d'intérêt ou ledit acide nucléique est sous le contrôle d'un promoteur ou d'un acide nucléique selon l'invention. Parmi ces vecteurs d'expression, on préfère ceux comprenant également les moyens nécessaires à l'expression dudit gène d'intérêt, à sa réplication et, le cas échéant, à la sélection des cellules transformées. Parmi ces vecteurs d'expression, on préfère particulièrement le vecteur 5 PGTPFZ301 ou PGTPFZR301 tel que décrit dans les exemples suivants ou tout vecteur d'expression adapté pour Lactococcus lactis. De préférence, ledit gène d'intérêt code pour une protéine thérapeutique, vaccinale, diagnostique, cosmétique ou agro-alimentaire. Parmi ces protéines, on peut citer mais sans s'y limiter : 10 - les anticorps thérapeutiques ou leurs fragments, en particulier des anticorps anticancéreux ; les protéines dérivées de produits sanguins tels que la sérum-albumine, l'alpha- ou la béta-globine, le facteur VIII, le facteur IX, le facteur de von Willebrand, la fibronectine, l'alpha-1 antitrypsine, etc.), les hormones telles que l'insuline et ses variants, le glucagon, les lymphokines telles que les interleukines, les interférons, les 15 facteurs de stimulation des colonies (G-CSF, GM-CSF, M- CSF, ... ), le TNF, le TRF etc.), les facteurs de croissance tels que l'hormone de croissance, l'érythropoïétine, le FGF, PEGF, le PDGF, le TGF etc. ; - les antigènes capables d'induire des réactions immunogènes efficaces et protectives chez les mammifères, notamment chez l'homme. En particulier pour la préparation de 20 vaccins anti-infectieux (HIV, HCV, HBS, Mycobacterium tuberculosis, VRS, HSV, Influenza virus, vaccinia virus, Chlamydia pneumoniae ou trachomatis, etc.) ; - les enzymes tels que les amylases, les lipases, protéases, la chymosine, la superoxide dismutase, la catalase, etc.) ; ou encore - des protéines de fusion. 25 L'invention comprend également sous un autre aspect les cellules hôtes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par un vecteur d'expression selon l'invention, de préférence choisies parmi les bactéries, de préférence encore du genre Lactococcus, plus particulièrement Lactococcus Lactis. Les cellules transformées de l'invention peuvent être obtenues par toute méthode 30 permettant d'introduire un ADN étranger dans une cellule. Il peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, fusion, ou toute autre méthode connue de l'homme de l'art. S'agissant de la transformation, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier elle peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence de polyéthylène glycol ou d'éthylène glycol ou encore de diméthyl sulfoxyde (DMSO). La méthode dite d'électroporation est bien connue de l'homme de l'art d'électroporation. Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire sont bien connues de l'homme de métier et sont abondamment décrites dans la littérature (voit notamment les ouvrages de références tels que Maniatis T. et al., � Molecular Cloning, a Laboratory Manual �, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., dernière édition). Sous un dernier aspect, l'invention a pour objet un procédé pour la production d'une protéine hétérologue comprenant la culture d'une cellule hôte selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé pour la production d'une protéine hétérologue dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la culture d'une cellule hôte selon l'invention transformée par un vecteur ou acide nucléique comprenant un gène d'intérêt codant pour ladite protéine hétérologue, ceci dans les conditions permettant l'expression stable de ladite protéine ; et b) l'extraction de la protéine hétérologue des cellules ou du surnageant de culture. De manière préférée, la protéine hétérologue est une protéine sécrétée. Dans le cas où la protéine codée par le gène exogène est sécrétée naturellement, la séquence codant pour cette protéine est de préférence précédée d'une séquence signal. Cette séquence signal, choisie en fonction de la cellule hôte, a pour fonction de permettre l'exportation de la protéine recombinante en dehors du cytoplasme, ce qui permet à la protéine recombinante de prendre une conformation proche de celle de la protéine naturelle et facilite considérablement sa purification. Cette séquence signal peut être clivée, soit en une seule étape par une signal-peptidase qui libère la protéine mature, la séquence éliminée étant habituellement appelée séquence pré ou peptide-signal, soit en plusieurs étapes lorsque cette séquence signal comprend, en plus de la séquence éliminée par la signal-peptidase, appelée séquence pré, une séquence éliminée plus tardivement au cours d'un ou plusieurs événements protéolytiques, appelée séquence pro. D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES Légendes des figures Figure 1 : Carte du vecteur PLB145. repA et repC sont des gènes de réplication du plasmide. ssi et ori désignent respectivement la région contenant les signaux d'initiation de la réplication simple brin � single strand initiation signals � et l'origine de réplication. Cm désigne le gène de résistance au chloramphénicol. pZn désigne le promoteur zinc, zitR le gène codant la protéine répresseur du promoteur zinc et SPEXP4 : NucB la protéine de fusion entre le peptide signal EXP4 et la nucléase B. ter désigne le terminateur de transcription. Figure 2A : Carte du vecteur pGTP FZ 301. repA et repC sont des gènes de réplication du plasmide. ssi et ori désignent respectivement la région contenant les signaux d'initiation de la réplication simple brin � single strand initiation signals � et l'origine de réplication. Cm désigne le gène de résistance au chloramphénicol. pZn désigne le promoteur zinc, zitR le gène codant la protéine répresseur du promoteur zinc et PSexp4 le peptide signal EXP4. ter désigne les terminateurs de transcription. Figure 2B : Séquence nucléotidique du fragment d'ADN Z301 obtenu par synthèse de 20 gène. Figure 3A : Carte du vecteur pGTP FZR 303. repA et repC sont des gènes de réplication du plasmide. ssi et ori désignent respectivement la région contenant les signaux d'initiation de la réplication simple brin � single strand initiation signals � et l'origine de réplication. Cm désigne le gène de résistance au chloramphénicol. pZn désigne le 25 promoteur zinc, zitR le gène codant la protéine répresseur du promoteur zinc et PSExp4 le peptide signal EXP4. ter désigne les terminateurs de transcription. Figure 3B : Séquence nucléotidique modifiée par mutagenèse dirigée (région 729 à 822) les sites de restrictions BamHI et EcoRI sont indiqués en gras. Figure 4 : Séquence nucléotidique optimisée codant la protéine Apo-AI (Obtenue par 30 synthèse de gène). Figure 5A : Tableau décrivant les séquences d'origine à partir desquelles ont été conçues les 4 séquences promotrices PLI, PL2, PL3 et PL4. Figure 5B : Séquences nucléotidiques des 4 fragments d'ADN synthétiques générés pour le clonage des séquences promotrices PLI, PL2, PL3 et PL4. La région correspondant au site de restriction RsrII est indiquée en gras. Figure 6A : Séquence nucléotidique des fragments ADN synthétisés et correspondant aux régions promotrices p44 et PL3. Les sites de restrictions BglII et NheI sont indiquées en gras. La région correspondant à la séquence codant le peptide signal EXP4 est indiquée en lettres minuscules. Figure 6B : Alignement de séquence des fragments d'ADN synthétique PL3A, PL3B, PL3C, PL3D, PL3E, PL3F, PL3G et PL3H illustrant différentes délétions du promoteur 10 p44, ces séquences comportant en 5' le site de restriction � AGATCT �. Figure 7 : Niveau d'expression de la protéine Apo-AI dans le surnageant de culture obtenu après 8 heures de culture en fonction des différentes séquences promotrices utilisées PLI, PL2, PL3 ou PL4. Figure 8A : Niveau d'expression de la protéine Apo-AI dans le surnageant de culture 15 obtenu après 8 heures de culture en fonction de la séquence promotrice utilisée : PL3 ou p44. Figure 8B : Niveau d'expression de la protéine NucB dans le surnageant de culture obtenu après 8 heures de culture en fonction de la séquence promotrice utilisée : PL3 ou p44. 20 Figures 9A : Niveau d'expression de la protéine NucB dans le surnageant de culture obtenu après 8 heures de culture en fonction de la séquence promotrice utilisée : P44, PL3, PL3A, PL3B, PL3C, PL3D PL3E, PL3F, PL3G, PL3H. Le niveau d'expression de NucB est exprimé en valeurs relatives par rapport à celle obtenue avec le promoteur P44 25 (dénommé aussi p44). Figure 9B : Représentation schématique des différentes délétions réalisées dans les promoteurs PL3A à PL3H la partie correspondant à la région promotrice est présentée par un trait rouge les régions correspondant aux sites de restrictions utilisés pour le clonage et au 5'UTR propre au peptide signal EXP4 sont présenté par un trait bleu. Le 30 rectangle bleu annoté EXP4 schématise les codons codant les premiers acides aminés du peptide signal EXP4. Les sites enzymatiques de restriction Bg1II et NheI ainsi que la position du codon d'initiation ATG sont indiqués. Les régions correspondant à des délétions sont schématisées en pointillés. EXEMPLE 1 : Matériel et Méthodes 5 A) Vecteurs d'expression PGTP_FZ301 Le pGTPFZ301 (Figure 2A) est un vecteur d'expression pour L. lactis dérivé du pLB145 (Morello et al., 2008) (Figure 1). Ce vecteur permet l'expression du gène 10 d'intérêt en fusion traductionnelle avec le peptide signal Exp4 (PSexp4) sous la dépendance du promoteur Pzä zitR (Pocquet et al., demande internationale PCT de brevet publiée sous le N° WO 2004/020640). Ce vecteur a été obtenu par remplacement de la cassette d'expression du PLB145 compris entre les sites de restrictions BglII et EcoRV par une séquence ADN synthétique Z301 (Figure 2B) incluant un site multiple 15 de clonage entre la séquence codant le peptide signal Exp4 et le site de terminaison de la transcription. PGTP FZR303 pGTP FZR303 (Figure 3A) est un vecteur d'expression dérivant du 20 pGTPFZ301. Il a été obtenu par mutagenèse dirigée de manière à insérer un site Bsal en aval de la séquence codant peptide signal EXP4 et de rapprocher le site BamHI de cette même séquence. La séquence résultante de cette mutagenèse dirigée est indiquée sur la figure 3B. 25 Vecteur APO et vecteur nuc B La séquence nucléotidique codant la protéine APO-Al humaine, modifiée pour optimiser l'usage des codons chez L. lactis, a été synthétisée avec ajout des sites de restrictions Bsal et Xbal (Figure 4). Cette séquence nucléotidique (SEQ ID NO : 15) a été sous clonée chez L. lactis dans le vecteur pGTP FZR303 préalablement digéré par 30 Bsal et XbaI pour donner la construction pGTP _FZR303_0600088. La séquence nucléotidique codant la forme mature protéine NucB de Staphylococcus aureus (Davis et al., 1977) a été amplifiée par PCR à partir du vecteur pLB145 (Morello et al., 2008) à l'aide des amorces suivantes : 5'-TTTAAATTTAGGATCCGCATCACAAACAGATAACGG-3' (SEQ ID NO : 11) et 5'-TATATATATAGGTACCTTATTGACCTGAATCAGCGT-3' (SEQ ID NO : 12). Le produit PCR obtenu a ensuite été digéré par les enzymes de restriction BamHI et KpnI et sous-cloné dans le vecteur pGTPFZ301 préalablement digéré. La construction résultante est appelée pGTPFZ301 NucB. Promoteurs PLI, PL2, PL3 et PL4 Les séquences nucléotidiques (PLI, PL2, PL3 et PL4) correspondent à des versions tronquées de régions promotrices constitutives de L. lactis déjà décrites dans la littérature (Koivula et al., 1991 ; van der Vossen et al., 1987 et van Asseldonk et al., 1990, et Figure 5A). Les différentes séquences nucléotidiques correspondant aux différents promoteurs (PLI, PL2, PL3, PL4, PL5) (Figure 5B) ont été synthétisées et sous clonées dans le vecteur pGTP FZR3030600088 préalablement digéré par les enzymes PvuII et RsrII chez L. lactis pour donner les vecteurs suivants : pGTP FPL1 0600088, pGTP FPL2 0600088, pGTP FPL2 0600088 et pGTP FPL4 0600088. P44 et PL3 Les séquences nucléotidiques correspondant au p44 (van der Vossen et al., 1987) et à la séquence PL3 suivie de la région 5'UTR et des nucléotides codant les premiers acides aminés de la séquence signal EXP4 ont été synthétisées (Figure 6A). La séquence promotrice synthétique correspondant au p44 a été digérée par les enzymes de restriction BglII et NheI puis sous-clonée en place de la séquence promotrice PL3 dans le vecteur d'expression pGTP FLP30600088 préalablement digéré par BclI et NheI pour donner le vecteur pGTP Fp440600088. Les séquences promotrices synthétiques correspondant au p44 et à la séquence PL3 ont été digérées par les enzymes de restriction BglII et NheI sous clonées dans le vecteur pGTP F301 NucB préalablement digéré par BglII et Nhel pour donner les vecteurs pGTP_Fp44_NucB et pGTP FPL3 NucB. PL3 tronqués Les séquences promotrices PL3A, PL3B, PL3C, PL3D, PL3E, PL3F, PL3G, PL3H (Figure 6B) ont été synthétisées. Elles ont ensuite été digérées par les enzymes de restriction BglII et Nhel et sous-clonées dans le vecteur pGTP F301 NucB préalablement digéré par BglII et Nhel pour donner respectivement les vecteurs suivants : pGTP FPL3A NucB, pGTP FPL3B NucB, pGTP_FPL3C_NucB, pGTP_FPL3D NucB, pGTP_FPL3E NucB, pGTP_FPL3F NucB, pGTP_FPL3G NucB, pGTP_FPL3H NucB. Vecteurs d'expression Nom Séquence Protéine Plasmide parent Promotrice exprimée pGTPFZ301 Pzn zitR Aucune pLB145 pGTP_FZR303 Pzn zitR Aucune pGTP FZ301 pGTPFZ301 NucB Pzn zitR NucB pGTP FZ301 pGTP _FZR303_0600088 Pzn zitR ApoAl pGTP FZR303 pGTP _FPL1_0600088 PLI ApoAl pGTP FZR303 0600088 pGTP_FPL2_0600088 PL2 ApoAI pGTP _FZR303_0600088 pGTP_FPL3_0600088 PL3 ApoAI pGTP _FZR303_0600088 pGTP_FPL4_0600088 PL4 ApoAI pGTP _FZR303_0600088 pGTP_Fp44_0600088 p44 ApoAl pGTP_FPL3_0600088 pGTP_Fp44_NucB P44 NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3_NucB PL3 NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3A_NucB PL3A NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3B_NucB PL3B NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3C_NucB PL3C NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3D_NucB PL3D NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3E_NucB PL3E NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3F_NucB PL3F NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3G_NucB PL3G NucB pGTP FZ301 NucB pGTP_FPL3H NucB PL3H NucB pGTP_FZ301 NucB Souches bactériennes et conditions de culture Les opérations de sous clonage intermédiaires ont été réalisées chez Escherichia coli NEB 5-a (New England Biolabs, Ipswich, MA) dans des vecteurs de sous clonage de type PUC. Escherichia coli a été cultivé en milieu Luria Bertani (LB) : 1 % tryptone (Sigma, St Louis, MO), 5 % d'extrait de levure (Fluka, St Louis MO), 1 % NaCl (Fluka) supplémenté en ampicilline à 100 �g/mL (Sigma Aldrich) à 37°C sur un plateau agitant avec agitation de 200-250. Le milieu solide a été préparé par ajout d'agar (Invitrogen, Paisley, UK) à une concentration de 1,5 % poids/volume. Les phases de sous clonage dans les vecteurs d'expression ont été réalisées dans la souche de MG1363 de Lactococcus lactis MG1363 (Gasson et al., 1983) cultivée à 30°C sans agitation dans un milieu riche M17 (Fluka) supplémenté avec 1 % glucose et 5 �g/mL de chloramphénicol (Sigma Aldrich) pour la sélection du plasmide. Pour les phases d'expression des protéines hétérologues, les souches recombinantes de Lactoccocus lactis MG1363 ou LA17 (MG1363 htrA- GTP Technology) issues d'une pré-culture de 14 Heures en milieu GM17v ont été inoculées à une densité optique à 600 nm (DO600) de 0.2 dans des mini bioréacteurs de 200 mL et cultivées sous agitation lente (100 à 150 rpm) à 30°C en milieu GM17v en absence d'aération et à un ph régulé à 6.5 par ajout de NH4OH 30 % (Fluka). Le milieu GM17v contient : 1 % d'extraits végétaux (Fluka), 0,25 % d'extrait de levure, 0,05 % L-acide ascorbique (Sigma), 1,9 % Sodium glycérophosphate (Sigma), 0,05 % MgSO4 (Fluka) et 5 % glucose. La croissance bactérienne de ces cultures a été suivie toutes les heures par mesure de la densité optique à 600nm. Analyse de l'expression Afin d'évaluer l'expression de chacun des construits, des aliquotes des surnageants de culture ont été prélevés et déposés sur Gel SDS PAGE coloré au bleu de Coommasie. L'intensité de chaque bande correspondant aux protéines d'intérêt a été analysée par densitométrie (BIORAD GS800 et ImageQuantTL Amersham Bioscience). La quantité de chaque protéine présente dans le surnageant a été déterminée par rapport à une gamme de protéine de référence (BSA) déposée sur le même gel. Dans le cas de la protéine Apo-Al le niveau d'expression initial ne permettant pas une quantification directement en gel SDS PAGE la quantification relative de l'expression a été effectuée par analyse densitométrique de l'intensité de la bande révélée en Western-blot avec un anticorps anti Apo-Al (AutogenBioclear #RP-063). EXEMPLE 2 : Comparaison de l'efficacité des séquences promotrices PLI, PL2, PL3 et PL4 pour l'expression de APO-AI Quatre séquences d'ADN correspondant à des séquences promotrices de L. lactis ont été comparées pour leur capacité à permettre l'expression de la protéine Apo-Al dans le surnageant de culture. L'analyse comparative de l'expression de la protéine APO-AI recombinante avec ces 4 séquences promotrices PLI, PL2, PL3 et PL4 a été réalisée comme suit. Les vecteurs d'expression pGTP_FPL1_0600088, pGTP_FPL2_0600088, pGTPFPL30600088 et pGTPFPL40600088 ont été transformés dans la souche de LA17 (L. lactis). Un clone transformant a été sélectionné pour chacune des constructions et cultivé en milieu GM17v à 30°C en absence d'aération et à un pH régulé à 6.5 par ajout de NH4OH 30%. Des prélèvements cinétiques ont été effectués toutes les heures à partir de 3 heures de culture et analysés en Western-Blot afin de déterminer la quantité relative d'APO-AI présente dans chaque échantillon. Aucune différence significative de croissance bactérienne n'a été remarquée pour les 4 souches évaluées. L'analyse de comparative de l'expression de la protéine d'intérêt dans le surnageant de culture montre que quelle que soit la séquence promotrice évaluée la quantité de protéine Apo-Al augmente en fonction du temps de culture pour atteindre un maximum après 8 Heures de culture. L'analyse de la quantité relative de Apo-Al présente dans le surnageant de culture après 8 Heures est présentée en Figure 7. Elle montre que l'utilisation de la séquence promotrice PL3 permet d'obtenir une expression 4 à 5 fois supérieure à celle obtenue avec les autres séquences promotrices, PLI, PL2 et PL4. Les séquences PL3 et PL2 correspondent à des formes tronquées des promoteurs p44 et p2l décrits dans van der Vossen et al., 1987. Dans cette publication, les auteurs montrent par une analyse comparative de l'activité transcriptionnelle de ces promoteurs que le niveau d'expression obtenue avec la séquence p44 est 6 fois mois élevé que celui obtenu avec la séquence p21. Or les résultats obtenus dans les essais d'expression présentés en Figure 7 montrent un résultat inverse. En effet, le promoteur dérivé du p44 (PL3) permet une expression significativement plus importante que celle obtenue avec le promoteur dérivé du p2l (PL2). Ces résultats suggèrent que les délétions effectuées dans ces séquences promotrices modifient l'activité transcriptionnelle de ces promoteurs et conduisent à une amélioration de l'expression obtenue à partir du p44 et/ou à une diminution de l'expression obtenue à partir du P21. EXEMPLE 3 : Comparaison de l'efficacité des séquences promotrices PL3 et P44 5 pour l'expression de APO-AI Afin d'évaluer l'importance de l'amélioration du promoteur obtenue par délétion de séquences en amont et en aval de la séquence du p44, une analyse comparative de l'expression de deux protéines sous la dépendance des promoteurs p44 et PL3 a été effectuée. 10 Les vecteurs d'expression pGTPFPL30600088 et pGTPFP440600088 ont été transformés dans la souche de LA17 (L. lactis). Les vecteurs d'expression pGTP_FP44 NucB et pGTP_FPL3 NucB ont été transformés dans la souche de MG1363 (L. lactis). Un clone transformant a été sélectionné pour chacune des constructions et cultivé en milieu GM17v à 30°C en absence d'aération et à un pH 15 régulé à 6.5 par ajout de NH4OH 30%. Des prélèvements cinétiques ont été effectués toutes les heures à partir de 3 heures de culture et analysés en Western-Blot dans le cas de l'expression de la protéine Apo-Al et par analyse densitométrique sur gel SDSPAGE coloré au bleu de Coomassie dans le cas de la protéine NucB. Conformément à ce qui avait été observé lors de la comparaison des promoteurs 20 PLI, PL2, PL3 et PL4, on observe une accumulation maximale de chacune des protéines d'intérêt dans le surnageant de culture après 8 heures de culture. L'analyse comparée de l'expression des deux protéines NucB et Apo-Al après 8 heures de culture est présentée en Figure 8. On observe que l'expression de la protéine Apo-Al est significativement supérieure avec le promoteur PL3. En effet, aucune expression de 25 cette protéine n'a pu être détectée avec le promoteur p44 alors que cette protéine est bien exprimée sous la dépendance du promoteur PL3 (Figure 8A). De plus, il est à noter, qu'en accord avec les résultats précédemment publiés (van der Vossen et al., 1987), on observe que l'expression provoquée par le promoteur p44 est bien inférieure à celle obtenue avec la séquence promotrice PL2 dérivée du p21. En ce qui concerne la 30 protéine NucB (Figure 8B), on constate que l'expression de NucB avec le promoteur PL3 est 5 fois supérieure à celle obtenue avec le promoteur p44. Ces analyses sur 2 protéines différentes démontrent donc clairement l'effet positif des délétions effectuées dans la séquence p44. De façon surprenante, ces délétions permettent d'augmenter significativement le niveau d'expression dans le surnageant de L. lactis. Ainsi, l'utilisation du promoteur tronquée PL3 permet d'augmenter le niveau d'expression de protéines recombinantes dans le surnageant de culture d'au moins un facteur 5. EXEMPLE 4 : Définition de la séquence promotrice optimale Afin de caractériser plus précisément les bornes de la séquence promotrice optimale, plusieurs autres délétions de la séquence p44 ont été réalisées (Figures 6A-6B). Une analyse comparative de l'expression de la protéine NucB sous la dépendance de ces différents promoteurs a été réalisée. Les vecteurs d'expression pGTP_FP44 NucB, pGTP_FPL3 NucB, pGTP_FPL3A NucB, pGTP_FPL3B NucB, pGTP_FPL3C NucB, pGTP_FPL3D NucB, pGTP_FPL3E NucB, pGTP_FPL3F NucB, pGTP_FPL3G NucB, pGTP_FPL3H NucB, ont été transformés dans la souche de MG1363 (L. lactis). Un clone transformant a été sélectionné pour chacune des constructions et cultivé en milieu GM17v à 30°C en absence d'aération et à un pH régulé à 6.5 par ajout de NH4OH 30 %. Des prélèvements cinétiques ont été effectués toutes les heures à partir de 3 heures de culture et analysés par analyse densitométrique sur gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. Résultats Voir Figures 9A et 9B Références Koivula, T., Sibakov, M. and Palva, I.: Isolation and characterization of Lactococcus lactis subsp. Lactis promoters. Appl. Environ. Microbiol. 57 (2), 333-340 (1991). van der Vossen, J.M., van der Lelie, D. and Venema, G : Isolation and characterization of Streptococcus cremoris Wg2-specific promoters. Appl. Environ. Microbiol. 53 (10), 2452-2457 (1987). van Asseldonk, M., Rutten, G., Oteman, M., Siezen, R.J., de Vos, W., Mand Simons, G.: Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363. Gene 95 (1), 155-160 (1990). Gasson, M.J.: Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci alter protoplast-induced curing. J Bacteriol. 1983, 154(1):1-9. Morello, E., Bermudez-Humaran, L.G., Llull, D., Sole, V., Miraglio, N., Langella, P., Poquet, I.: Lactococcus lactis, an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion. J. Mol. Microbiol Biotechnol. 2008, 14(1-3):48-58. Davis; A., Moore IB, Parker DS, Taniuchi H: Nuclease B. A possible precursor of nuclease A, an extracellular nuclease of Staphylococcus aureus. J Biol Chem 1977, 252(18):6544-6553. Hyyrylinen HL, Sarvas M, Kontinen VP: Transcriptome analysis of the secretion stress response of Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. 2005 May; 67(3):389-96. 20 Epub 2005 Jan 27. De Vos WM, Beerthuyzen MM, Luesink EL, Kuipers OP.: Genetics of the nisin operon and the sucrose-nisin conjugative transposon Tn5276. Dev Biol Stand. 1995; 85:617-25. Kuipers OP, Rollema HS, Siezen RJ, De Vos WM: Lactococcal expression systems for protein engineering of nisin. Dev Biol Stand. 1995; 85:605-13. 25 Miyoshi A, Jamet E, Commissaire J, Renault P, Langella P, Azevedo V.: A xyloseinducible expression system for Lactococcus lactis. FEMS Microbiol Lett. 2004 Oct 15; 239(2):205-12. Madsen SM, Arnau J, Vrang A, Givskov M, Israelsen H : Molecular characterization of the pH-inducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis. 30 Mol Microbiol. 1999 Apr; 32(1):75-87. Llull D, Poquet I.: New expression system tightly controlled by zinc availability in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 2004 Sep;70(9):5398-406. Nauta A, van den Burg B, Karsens H, Venema G, Kok J.: Design of thermolabile bacteriophage repressor mutants by comparative molecular modeling. Nat Biotechnol. 1997 Oct; 15(10):980-3. Walker, S.A., Klaenhammer, T.R.: Molecular characterization of a phage-inducible 5 middle promoter and its transcriptional activator from the lactococcal bacteriophage phi3l. J Bacteriol. 1998 Feb; 180(4):921-31. de Vos, W.M.: Gene expression systems for lactic acid bacteria. Curr Opin Microbiol. 1999 Jun; 2(3):289-95. Revendications1. Acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence ntl-217, bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) d'un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du fragment tel que défini en a). 2. Acide nucléique isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué : a) d'un fragment de la séquence SEQ ID NO : 1, ledit fragment étant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 88-149 (SEQ ID NO : 3) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) d'un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du fragment tel que défini en a). 3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 88-159 (SEQ ID NO : 4) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du fragment tel que défini en a). 4. Acide nucléique l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 27-149 (SEQ ID NO : 5) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du fragment tel que défini en a). . Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) un fragment compris dans la séquence ntl-195 (SEQ ID NO : 2), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1 et comportant au moins la séquence nt 27-159 (SEQ ID 5 NO : 6) de la séquence SEQ ID NO : 1 ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du fragment tel que défini en a). 6. Acide nucléique isolé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'en a), ledit fragment est compris dans la séquence nt15-195 (SEQ ID NO : 7), bornes 10 comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1. 7. Acide nucléique isolé l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'en a), ledit fragment est compris dans la séquence nt27-195 (SEQ ID NO : 8), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1. 8. Acide nucléique isolé l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'en 15 a), ledit fragment est compris dans la séquence nt15-159 (SEQ ID NO : 9), bornes comprises, de la séquence SEQ ID NO : 1. 9. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi les fragments de séquences SEQ ID NO : 2 à SEQ ID NO : 9 ou un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de l'une des séquences SEQ 20 ID NO : 2 à SEQ ID NO : 9. 10. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit fragment est choisi parmi : a) le fragment de séquence nt 27-159 (SEQ ID NO : 6) ; ou b) un fragment dont la séquence est identique à au moins 90 % de la séquence du 25 fragment tel que défini en a). 11. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10 à activité de promoteur. 12. Promoteur constitué d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11 ou comprenant à titre de séquence promotrice un acide nucléique selon l'une des 30 revendications 1 à 11. 13. Vecteur d'expression, caractérisé en ce que ce qu'il comprend comme promoteur un promoteur selon la revendication 12 ou un acide nucléique selon la revendication 11. 14. Vecteur d'expression portant un gène d'intérêt, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est sous le contrôle d'un promoteur selon la revendication 12 ou d'un acide nucléique selon la revendication 11. 15. Vecteur d'expression selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend également les moyens nécessaires à l'expression dudit gène d'intérêt, à sa réplication et, le cas échéant, à la sélection des cellules transformées. 16. Vecteur d'expression selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que le vecteur portant le promoteur selon la revendication 12 ou l'acide nucléique selon la revendication 11 est un vecteur choisi parmi le vecteur pGTPFZ301, le vecteur pGTPFZR303, ou tout vecteur d'expression adapté à l'expression de protéine hétérologue dans Lactococcus lactis. 17. Vecteur d'expression selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que le gène d'intérêt est un gène recombinant codant pour une protéine thérapeutique, vaccinale ou immunogénique, diagnostique, cosmétique ou agro-alimentaire. 18. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 13 à 17. 19. Cellule hôte transformée selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie, de préférence du genre Lactococcus, notamment Lactococcus Lactis. 20. Procédé pour la production d'une protéine hétérologue comprenant la culture d'une cellule hôte selon l'une des revendications 18 et 19. 21. Procédé pour la production d'une protéine hétérologue dans une cellule, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la culture d'une cellule hôte selon l'une des revendications 18 et 19 transformée par un vecteur ou acide nucléique comprenant un gène d'intérêt codant pour ladite protéine hétérologue, ceci dans des conditions permettant l'expression stable de ladite protéine ; et b) l'extraction de la protéine hétérologue des cellules ou du surnageant de culture. 22. Procédé pour la production d'une protéine hétérologue dans une cellule selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que la protéine hétérologue est une protéine sécrétée.