Brevet FR2943542A1 — publié le 20101001

La présente invention concerne une méthode de soin 5 cosmétique anti-âge par stimulation de l'activité de l'aconitase mitochondriale. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des molécules ou extraits, en particulier d'origine végétale stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané, leur utilisation en tant qu'agents actifs 10 dans des compositions cosmétiques, et les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites compositions. Arrière plan technologique Le vieillissement est un phénomène multifactoriel. existe 15 plusieurs théories du vieillissement parmi lesquelles la théorie des radicaux libres basée sur la nature chimique et la présence ubiquitaire de ces radicaux (Harman D., J. Gerontol., 1956 ; 11, 298-300). Ces radicaux libres, également dénommés espèces réactives de l'oxygène (ERO) peuvent être d'origine exogène ou produits par 20 différentes processus cellulaires, notamment lors de la respiration mitochondriale (Cadenas E. et al., Free Radic. Biot. Med., 2000 ; 29, 222-230). Au cours de la respiration, une faible mais significative quantité de l'oxygène total consommé par la chaîne respiratoire est converti en 25 radical superoxycle 022- qui peut conduire à la formation d'autres espèces encore plus réactives de l'oxygène comme le peroxyde d'hydrogène H202, les radicaux hydroxyle et le péroxynitrite (cf Cadenas et al., supra). Dans les conditions d'un stress oxydant, la formation de ces espèces réactives, aboutit à l'endommagement oxydatif des protéines, de 30 l'ADN et des lipides, ainsi qu'à des changements dans l'expression des protéines mitochondriales et contribue au processus de vieillissement cutané (Bulteau et al., Exp Gerontol, 2006, 41 653-657). Au cours du vieillissement, on observe une moindre efficacité du système de maintenance des macromolécules cellulaires et une augmentation constante de la production d'EROs au sein des mitochondries (Humphries et al., Free Radie Res, 2006 ; 40, 1239-1243). Or la mitochondrie joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires, parmi lesquelles la production du gradient de proton établi par la chaîne respiratoire et la production d'ATP par l'intermédiaire du cycle de Krebs (Liu et al., J. Neurochem., 2002 ; 80, 780-787). L'accumulation des dommages oxydatifs et d'anomalies de structure entraîne pour la mitochondrie, la perte progressive de sa capacité à produire I'ATP nécessaire au fonctionnement et à l'intégrité de la cellule (FRENZEL et al., 1984). L'aconitase est une enzyme mitochondriale essentielle du cycle de Krebs, qui convertit le citrate en isocitrate. Elle joue également un rôle dans la préservation de l'ADN mitochondrial. Par le biais de l'acotinase, la stabilité et la transmission héréditaire de cet ADN sont ainsi étroitement liées à l'état métabolique de la cellule (Chen et al., Proc Natl Acad Sei U S A, 2007 ; 104, 13738-13743). L'activité de l'aconitase dépend de l'intégrité de son centre fer-soufre [4Fe-4S]2+ (Beiner, et al., Faseb 3, 1993 ; 7, 1442-1449). L'attaque par des oxydants de son centre fer-soufre [4Fe-4S]2+ entraîne la formation d'un centre fer-soufre [3Fe-4S]+ qui inactive l'aconitase. La perte d'activité de l'aconitase mitochondriale est un indicateur intracellulaire des dommages oxydatifs et du vieillissement cellulaire. De nombreux désordres dégénératifs sont aussi associés à l'augmentation des niveaux de pro-oxydants et à la chute de l'activité de l'aconitase dans la mitochondrie (Bulteau et al., Biochemistry, 2003 42, 14846-14855). L'inactivation de l'aconitase entraîne notamment un changement des ratios NADH/NAD+. En effet, la production de NADH par -ketoglotaiate déshydrogénase et i'isocitrate deshydtogénase sera diminuée dans le cycle de Krebs du fait de la baisse d'activité de l'aconitase ((f Hurnphries et 01 , supra, Nulton Persson et al., J Biol Chem, )001 2 76 )33W-)-3 361) Dans ces conditions d'accomnlation de NAD , on observe une augmentation des EROs à cause de l'auto-oxydation des métabolites réduits. Une telle inactivation peut également initier une cascade de réactions oxydatives contribuant à l'accumulation de protéines endommagées (cf Humphries et al., 2006 supra). Il est donc essentiel, au cours du vieillissement, de maintenir un degré suffisant d'activité pour l'aconitase mitochondriale dans les cellules cutanées, afin de prévenir l'accumulation de ces dommages cellulaires et de favoriser les processus de réparation et la réactivation de l'aconitase endommagée par ces EROs. RESUME DE L'INVENTION Les inventeurs de la présente invention ont mis en évidence que l'activité de l'aconitase mitochondriale diminue d'environ 85% dans des fibroblastes de derme humains en culture issus de donneurs de 70 ans en comparaison avec ceux issus les donneurs de 20 ans, sans changement d'expression de la protéine avec l'âge. Partant de ce constat, ils ont démontré qu'il est possible de protéger totalement l'aconitase mitochondriale et de rétablir son activité dans ces fibroblastes âgés mis en culture, par un traitement desdits fibroblastes à l'aide de molécules ou d'extraits d'origine végétale, alors que ce même traitement appliqué aux fibroblastes d'un jeune donneur ne modifie pas l'activité de l'aconitase mitochondriale. Un tel effet de stimulation de l'activité de l'aconitase mitochondriale permet à cet enzyme de conserver son rôle central dans le cycle de Krebs et dans la préservation de l'ADN mitochondrial, et ainsi de préserver le fonctionnement, notamment métabolique, des cellules cutanées. 1 résulte du rétablissement de l'activité de l'aconitase mitochondriale des cellules de la peau de sujets âgés, un effet de ralentissement du vieillissement cellulaire au niveau cutané se traduisant par un effet cosmétique anti-â Buts de l'invention a invention a pour but principal de fournir dec rT.10léCUIOS ou traits, en particulier d'origine végétale, stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané, leur utilisation en tant qu'agents actifs dans des compositions cosmétiques, et les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites compositions. L'invention a encore pour but principal de fournir une méthode de soin cosmétique anti-âge par stimulation de l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané. L'invention a pour but principal de proposer l'utilisation de molécule(s) ou d'extrait végétal cosmétiquement acceptable, comme agent actif dans des compositions cosmétiques. L'invention a également pour but l'utilisation de ladite molécule ou dudit extrait en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques anti-âge, et les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites compositions pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en ralentir les effets. Description de l'invention Un objet de la présente invention vise ainsi une méthode de soin cosmétique pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en atténuer les effets, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'au moins un agent actif cosmétiquement acceptable activant ou stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané. Un autre objet de la présente invention vise ainsi également une méthode de soin cosmétique pour le soin de !a peau endommagée, notamment par le rayonnement ultraviolet, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'un agent actif cosmétiquement acceptable activant ou stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané. Selon une caractéristique particulière des méthodes de :'invention, l'agent actif délivré topiduement est incorporé dans une composition cosmétique comprenant en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable L'agent actif cosmétique acceptable stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale peut être une molécule purifiée, d'origine naturelle ou synthétique, ou bien être le produit d'un procédé d'extraction à partir d'une matière première, en particulier une matière première d'origine végétale. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent 1t1 actif cosmétique précité comprend, ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante choisie dans le groupe comprenant celles appartenant au genre Citrus ou les hybrides issus du croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, celles appartenant au genre Morinda ou bien celles 15 appartenant au genre Hibiscus. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'agent actif précité comprend, ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins un hybride appartenant au genre x Citrofortunella, résultant du croisement des genres Citrus et 20 Fortunella, et en particulier le Calamondin (x Citrofortunella microcarpa). Selon un mode de réalisation particulier, l'agent actif précité est un extrait du fruit de Calamondin. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, agent actif précité comprend, ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant à r+.spe, v eget,iie Morinda Citrifolin_ 5e ùn uni_ variante bdtion partit älier ; , l'agent actif t un extrait du fruit de Morinda Citrifolia 1 encore Un outre mcdr_ de ation p. c û+: U ` cl- -nt ta tif j ec te CCmprencl, ou s ` c msf1t_u `entielle ment eet,i (.)hI_enu a partir d'au mores une plante appartena t s ~ç s cln ceiitralt et fl~ u d ni ut:, sabdahfféii. 30 uf Le matériel végétal utilisé pour la préparation de l'extrait peut a plante entière ou une partie de la plante telle que la racine, le rhizome ou une partie aérienne, notamment la tige, les feuilles, les fleurs les graines, les fruits ou les boutons floraux. Il peut être avantageusement constitué du fruit entier ou d'une partie du fruit d'une des espèces mentionnées précédemment. Un extrait préféré est obtenu à partir des fleurs de l'espèce végétale Hibiscus sabdariffa. un tel extrait est par exemple commercialisé sous la dénomination ACIDES DE FLEURS� par la société Greentech. Un extrait préféré est obtenu à partir du fruit du calamondin. Un autre extrait préféré est obtenu à partir du fruit de Morinda citrifolia. Un tel extrait est par exemple commercialisé sous la dénomination CITRIFOLINE� par la société Solabia. Préalablement à l'étape d'extraction elle-même, le matériel végétal peut avoir été séché et/ou broyé, ou encore à l'état fraîchement récolté. L'extrait peut être préparé par différents procédés d'extraction connus de l'Homme du Métier. L'extraction peut être réalisée sans solvant, par exemple par pressage, notamment d'un fruit entier ou d'une partie d'un fruit. Toutefois, l'extraction est avantageusement réalisée par mise en contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires, notamment par trempage, macération ou décoction dudit matériel végétal dans le solvant ou mélange de solvant approprié. ~e solvant polaire est avantageusement choisi parmi Veau, un alcool en CI-C4, en particulier l'éthanol ou le butanol, un glycol choisi préférentiellement parmi le glycérol, le butylèneglycol et le propylèneglycol et leurs mélanges. Les mélanges préférés sont des mélanges dau moins un alcool et d'eau ou d'au moins un glycol et d'eau, comprenant au moins 10% v/v d'alcool ou de glycol, le solde étant constitue d'eau. L'extraction peut aussi comprendre, de façon optionnelle, une étape supplémentaire consistant en un traitement du matériel végétal ou de l'extrait végétal, visant à le décolorer partiellement ou complètement, ou à le purifier, par exemple par un traitement du matériel végétal ou de l'extrait par une solution d'un solvant ou d'un mélange de solvant apolaires ou par un traitement consistant en une mise en contact de l'extrait avec des particules de charbon actif, ou bien encore par un traitement à l'aide du CO2 à l'état supercritique. L'extraction peut être complétée par une étape d'élimination partielle ou totale des solvants d'extraction. Dans le premier cas, on concentre généralement l'extrait jusqu'à obtenir un concentré aqueux dépourvu de quantités significatives de solvant organique, dans le second cas on obtient un résidu sec. De façon alternative, le produit de l'étape d'extraction peut être lyophilisé ou atomisé sous la forme d'une poudre. La poudre peut être utilisée en l'état dans une composition cosmétique selon l'invention ou être dispersée ou dissoute dans un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires ou encore être adsorbée sur un support solide. Selon une variante de réalisation de la présente invention, l'agent stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale est délivré par voie topique sous la forme d'une composition cosmétique comprenant ledit agent et au moins un excipient cosmétiquement acceptable, par application de cette composition sur la peau du corps ou du visage, ou sur les phanères. La composition cosmétique selon l'invention comprend une quantité efficace d'extrait de l'invention pour obtenir l'effet recherché. Par "quantité efficace", pour tout aspect de l'invention, on entend une quantité qui est au moins égale à la quantité nécessaire pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets, La composition cosmétique selon l'invention comprend avantageusement de 0,001 et 5 0 en poids, de préférence comprise entre 0,01 et 3 % en poids de la composition, en agent actif stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale. Elles peuvent également avantageusement comprendre d'autres agents actifs présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention, et au moins un excipient cosmétiquement acceptable qui peut être notamment choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges. La composition cosmétique selon l'invention peut être formulée sous forme, par exemple, d'un sérum, une lotion, une crème, un hydrogel, de préférence un masque, ou bien se présenter sous la forme d'un stick ou d'un patch. La présente invention concerne enfin une utilisation des agents actifs tels que définis ci-dessus en tant qu'agent actif cosmétique destiné à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou les traiter, ledit agent cosmétique stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau des cellules de la peau. L'invention porte également sur une utilisation de l'agent actif cosmétique de l'invention pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou les traiter. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à partir de la description explicative qui va suivre t Description des Figures La Figure 1 est relative à la modulation de l'activité aconitase mitochondriale avec l'âge, mesurée après culture et traitement de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, selon l'exemple 2 : (A) mesure de l'activité aconitase mitochondriale (cf. ex. 2, paragraphe 3) ; (B) dosage d'aconitase mitochondriale par Western-Biot (WB) (cf. ex. 2, paragraphe 4). La Figure 2 est relative aux modifications du site actif de l'aconitase mitochondriale avec l'âge, mesurées après culture et traitement de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, selon l'exemple 2 ; Séparation et mesure des formes d'aconitase mitochondriale par Immunoelectrofocusing (IEF) puis Western-blot (ex. 2, paragraphe 5). La Figure 3 est relative à la mesure de l'activité aconitase mitochondriale mesurée après culture de fibroblastes humains issus de donneurs âgés de 20 et 70 ans, mis en culture selon l'exemple 2, puis traitement par des actifs cosmétiques pendant 48 heures (cf. ex. 2, paragraphe 3) : extrait d'Hibiscus sabdariffa 1,5% ; extrait de calamondin 2,5 % ; extrait de Morinda citrifolia 2%. EXEMPLES Exemple 1--opréparation d'un_ extrait de calamondin utilisé pour os_ _soc o réaliser les tests 30 On prépare l'extrait de calamondin (x Citrofortunella microcarpa) par pressage de fruits entiers de la plante. Après filtration puis centrifugation, la pulpe de fruits est extraite par un mélange d'eau et de polygly érol 925 L'extrait obtenu contient 35-45% en poids de matière sèche et est utilisé pour les tests de l'exemple 2, ainsi que pour la fabrication de compositions cosmétiques, notamment celle de l'exemple 3. Exemple 2 - Mesure d'activité de l'aconitase -nitochondria e dans des fibroblastes humains. MATERIEL ET METHODES 10 1. Culture des fibroblastes humains et traitement Extraits testés 15 - extrait de calamondin selon l'exemple 1 - extrait aqueux de fleurs d'Hibiscus sabdariffa, commercialisé sous la dénomination ACIDES DE FLEURS@ par la société Greentech, comprenant 22-25% en poids de matière sèche. - extrait hydroglycolique de feuilles de Morinda citrifolia, 20 commercialisé sous la dénomination CITRIFOLINE� par la société Solabia, comprenant 1,5 à 1,8% en poids de matière sèche. Milieux et réactifs 25 Milieu de culture des fibroblastes DMEM 1/mI de glucose Gibco ) IO SVF Pyruvate clé sodium '100mM (Glhuo l0ns-p1 agents actifs ep Fibroblastes humains en culture primaire provenant d'une plastie d'un donneur âgé de 20 ans et d'un donneur âgé de 70 ans, à passage 12. Ensemencement à 30 Fibroblastes 15.10 5 cellules/boite de 75 cm2 en triplicata dans le milieu DMEM (10 ml/boîte) 15 Traitement à 35 Les solutions-mères sont diluées dans le milieu DMEM pour atteindre les concentrations mentionnées ci-dessous : - extrait d'Hibiscus sabdariffa à 1,5% en poids dans le milieu - extrait de Morinda citrifolia à 2 % en poids dans le milieu 20 - extrait de calamondin à 2,5% en poids dans le milieu, soit environ 1% en poids de matière sèche. Récupération des cellules à 37 Préparation des mitochondries 2 rinçages au PBS Sur lit de glace récupération dans 2 ml de tampon d'homogénéisation. b - Isolation des mitochondries On part pour chaque donneur de 32 boites T75. Les cellules â confluence sont lavées deux fois avec le tampon PBS pH 7.2 (tampon phosphate sodium pH 2 ù 0,13 M de NaCl, 3 mM de KG, 8 mM de Na2HPO4 et M de K.1-12po4) et sont décollées par grattage, puis 30 centrifugées à 1500 g à 4°C pendant 5 minutes. Le culot cellulaire est lavé avec le tampon PBS, centrifugé à nouveau puis mis dans la glace. Le culot est repris dans le tampon d'homogénéisation froid (0,3 M mannitol, 0,1% BSA, 0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES, ajuster à pH 7.4 avec KOH, 5 fois le volume du culot), homogénéisé sur glace avec un homogénéisateur de verre de 2 ml. La suspension cellulaire est centrifugée à 1000g à 4°C pendant 10 minutes. On centrifuge de nouveau le surnageant à 10000g à 4°C pendant 15 minutes. Le surnageant contient la fraction cytosolique, le culot représente la fraction mitochondriale. La fraction mitochondriale est lavée 2 fois avec le tampon d'homogénéisation froid. On mesure la concentration de protéines selon la méthode de Bradford. 2. Dosage des protéines (méthode de Bradford),. a - Préparation de la gamme étalon Solution mère de BSA: 50pg/ml ( BIORAD ; protéine standard) Protéines BSA (pl) H2O (pl) (dag/tube) 0 800 780 2 40 760 60 740 4 80 720 100 700 6 120 6 160 640 Dans chaque tube, on additionne 200pi de bleu de Coomassie 20 G250. Le bleu est préparé extemporanément par dilution ai. /5ème de la solution-mère. b - Préparation des échantillons - si la concentration protéique > 3mg/ml, on dilue les extraits cellulaires au 1/100ème, puis on prélève lOOpl de la dilution. + 7000 d'eau mQ + 200pl de bleu - si la concentration protéique est c - Dosage des échantillons On homogénéise les échantillons par vortex, puis après 5 15 minutes au repos, on lit la densité optique au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 595nm. 3. Dosage de l'activité aconitase mitochondriale 20 a ù Réactifs - Tampon TRIS 25mM pH 7,5 (Sigma) - citrate de sodium (Sigma) -Isocitrate dehydrogenase (Sigma) 25 - MnC12(Sigma) Principe du_dosage_de l'activité aconitase mltochondnale On quantifie l'activité de l'aconitase mitochondriale par la 30 mesure de l'absorbance à 340 nm dans un milieu réactionnel contenant 0 2 mM NADP+, 5 mM de citrate de sodium et une unité/mi de isocitrate deshydrogénase dans 25 mM Tris-HO plus 0,6 mM MnCl2 et 0,05 % Triton X-1.00. Pour le dosage, 50pg de protéines mitochondriales sont ajoutées à 1,0 ml de milieu réactionnel à 25°C. Les mesures à 340 nm sont enregistrées dans des cuvettes de 1 cm à des intervalles de 5 minutes et l'activité aconitase mitochondriale est calculée selon l'augmentation linéaire de l'absorbance à 340 nm pendant environ 5 minutes. L'activité est obtenue en utilisant un coefficient d'extinction molaire pour NADPH de 6,22 x 103 M-1 cm-1 et en supposant la conversion par l'isocitrate dehydrogenase d'une molécule de citrate en une molécule de NADPH. 4. Dosage de l'aconitase mitochondriale par Western-blot (WB) a - Principe du dosage 15 L'électrophorèse des protéines est réalisée en minigel de polyacrylamide de lmm à 1,5mm d'épaisseur, en conditions dénaturantes et réductrices, en tampon discontinu selon la méthode de Laemmli (Nature, 1970 ; 227, 680). Les gels à 12% T, 2J% C permettent de séparer les protéines de faibles poids moléculaires (20 à 120 kDa). Les 20 gels à 8% T 2,7%C permettent de séparer les protéines à hauts poids moléculaires (35 à 250 kDa). Les solutions nécessaires à l'élaboration des gels sont présentées en annexe A. 25 Gel de séparation Le gel est coulé au moins deux heures avant la migration. Le coulage du gel est réalisé à l'aide d'une pipette jusqu'à environ 0,5 mm du bas du peigne prévu pour le gel de concentration. On ajoute de l'éthanol absolu en surface pour obtenir une ligne de base régulière (� MI /gel). 10 Gel de concentration L'éthanol est éliminé. On coule 2,5ml de gel à l'aide d'une pipette Pasteur de transfert en polyéthylène (Biorad) puis les peignes sont insérés. Le gel est polymérisé après une heure. b -Préparation des échantillons On soumet les protéines mitochondriales à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 12% T en conditions réductrices, selon 10 Laemmli. Les échantillons (25-40pg des protéines) sont réduits pendant 5 minutes à 100°C dans le tampon de dépôt. Après dépôt des échantillons et des marqueurs, la migration s'effectue à 200V pendant 1 heure dans un tampon 50 mM Tris-HCI, 100 mM glycine, 2 mM EDTA pH 8.4 contenant 0,1% de SDS. 15 c û Electrophorèse Dépôts Les échantillons sont chauffés à 95°c pendant 5 min. 20 Le volume à déposer est fonction de la quantité de protéine désirée (volume maximum = 25 pl pour un gel de lmm et 40pl pour un gel de 1,5mm). La quantité de référence est 10 pg de protéines, correspondant à 10 pl ; elle est ensuite adaptée selon l'expression de la protéine ciblée. 25 Les peignes sont retirés. On verse 200 ml du tampon de migration 1X sur les gels, dans le compartiment central entre tes deux gels, puis dans la cuve au quart. On dépose les échantillons à 'aide d'une pointe effilée adaptée sur la micropipette ainsi que 10 pl de témoins précolorés à bas poids 30 moléculaires (Biorad, Prestained SDS-PAGE standards Low Range) ou à haut poids moléculaires (Amersham, Full Range Rairibow).5 Migration L'électrophorèse est réalisée à température ambiante, à 200V. Celle-ci est arrêtée lorsque le front de migration est sorti du gel (environ 40 minutes de migration). Transfert serai-sec des protéines sur membrane Deux feuilles épaisses de papier filtre (Biorad) et les membranes de cellulose (Biorad) sont trempées dans le tampon de transfert de Towbin (PNAS, 1979, 76 (9) 4350-4) (voir annexe B). Dans l'appareil de transfert semi-sec (Biorad) une feuille de papier filtre épaisse humidifiée est déposée sur l'anode. Une fois la migration terminée, le gel de concentration est éliminé et le gel de séparation est déposé sur la membrane de cellulose. La membrane comprenant le gel est déposée sur la feuille de papier filtre. La deuxième feuille de papier filtre est déposée sur le gel. Au cours de la fabrication du "sandwich", on prend soin d'éliminer toutes bulles d'air à l'aide d'une tige en verre pour ne pas gêner le transfert. L'appareil est fermé par un couvercle constitué de la cathode. Le transfert de protéines est réalisé à 10 V pendant 90 minutes. Marquage au rouge Ponceau Pour vérifier la qualité du transfert, les protéines sont colorées au rouge Ponceau (Sigma). La membrane de cellulose est rincée à l'eau milliQ puis trempée une fois dans un bain au rouge Ponceau pendant 10 minutes sous agitation. Elle est ensuite lavée clans plusieurs bains d'eau milliQ jusqu'à ce que la coloration ne subsiste que sur les bandes protéiques. La membrane est insérée dans un plastique et scannée, Les bandes protéiques peuvent être quantifiées pour déterminer la totalité des protéines transférées. Blocage_ des _ sites_ de ii_aisons aspéçifiques La membrane est placée sous agitation pendant une nuit à 4°C bien 90 minutes à température ambiante dans une solution de blocage des sites de liaisons aspécifiques constituées de 5% de lait écrémé (Régilait) dans du tampon PBS-T (cf. annexe B) (20ml/membrane). Immunodétection Les références et les dilutions optimales des anticorps sont données en annexe C. Après blocage des sites non spécifiques, la membrane est rincée rapidement dans du PBS-T. Cette membrane est mise en présence de l'anticorps primaire dilué à la concentration optimale dans du PBS-T 10 avec ou sans lait 5% (m/v) selon l'anticorps, pendant 60 minutes sous agitation à température ambiante ou une nuit à 4°C. Elle est ensuite rincée rapidement puis trois fois 10 minutes dans du PBS-T afin d'éliminer l'excès d'anticorps libre non fixé. Puis elle est mise en contact avec l'anticorps secondaire adéquat couplé à la 15 peroxidase dilué dans le PBS-T ou le lait 5% (5ml) sous agitation à température ambiante. Après 45 minutes d'incubation, elle est rincée rapidement deux fois, puis lavée 5 fois pendant 5 minutes avec du tampon PBS-T et une dernière fois dans du PBS 1X. Egouttée, elle est placée sur un film alimentaire (SARAN), coté protéine vers le haut. 20 La membrane est révélée à l'aide d'un kit de détection par chimioluminescence (Amersham; ECL Western blotting), hautement sensible utilisant le luminol comme substrat de la péroxydase. Sous l'action de la péroxydase et d'un amplificateur, le luminol est oxydé et passe dans un état excité transitoire. Le retour à l'état fondamental se fait 25 par émission de photons qui impressionnent un film autoradiographique placé sur la membrane. On mélange 1 ml de chacune des deux solutions du kit de détection, soit 2 ml, volume minimum nécessaire au recouvrement de la membrane. Aussitôt, le mélange est versé uniformément sur la membrane 30 et laissé en contact pendant exactement une minute à température ambiante. La membrane égouttée est enfermée sous film alimentaire Saran et mise sous cassette à l'abri de la lumière, puis recouverte d'un film autoradiographique pré-flashé (Amersham, Hyperfilm En), Après 5 minutes d'exposition, le film autoradiographique est révélé. Un nouveau film peut être exposé si nécessaire, pour optimiser le signal désiré (jusqu'à 1h de temps d'exposition). Les bandes sont quantifiées grâce au logiciel Gels Analysts 3.01 5. Dosage de l'aconitase mitochondriale par IEF, Cette technique permet de séparer les trois formes de l'aconitase mitochondriale, la forme active [4Fe-4S]2+, la forme inactive [3Fe-4S]+ et la forme apoenzyme, selon leur point isoélectrique. 50 ^g de protéines mitochondriales sont déposées sur un gel IEF pH 3-10 (Biorad). La migration s'effectue dans le système criterion (Biorad) pendant 1 heure à 100V ; 1 heure à 250V et 30 minutes à 500V. Après la migration, le gel est transféré sur une membrane de nitrocellulose et un Western-blot anti-aconitase mitochondriale est réalisé conformément au protocole décrit au paragraphe 4. RESULTATS L'activité aconitase mitochondriale a été mesurée après Isolation des mitochondries à partir de ces cultures cellulaires. On met en évidence une baisse de l'activité aconitase mitochondriale avec le vieillissement. Ces mesures indiquent une diminution d'environ 85% de l'activité de l'aconitase mitochondriale dans les mitochondries des donneurs de 70 ans en comparaison avec les donneurs de 20 ans ( cf figure 1). Cependant, il n'y a pas de différences significatives dans l'expression de l'enzyme, c'est-à-dire au niveau de la quantité d'enzyme présente dans les jeunes et dans les vieux fibroblastes (cf figure 1). 30 Pour vérifier si ia baisse ae i`activité ae aconitase mitochondriale mise en évidence chez les fibroblastes âgés n'était pas due des dommage-es oxydatlfs du niveau du centre Fry j de enzyme, d effectué une séparation des trois formes structurales de l'en yme (apoeozyme, forme active et forme inactive selon leur point isoélectrique, par isoelectrofocusing (IEF). A l'aide de cette méthode, on met en évidence une différence avec l'âge au niveau de l'apcenzyme, mais il n'y a aucune différence aux niveaux des autres formes (cf. figure 2). Nous avons montré que l'aconitase mitochondriale voyait son activité diminuer avec l'âge dans des fibroblastes de derme humains en culture. Cette baisse d'activité ne s'accompagnant pas d'un changement d'expression de la protéine avec l'âge. Partant de ce résultat, nous avons caractérisé l'effet des agents actifs testés sur l'activité de l'aconitase mitochondriale dans des fibroblastes de derme issu de ces donneurs d'âge différents (cf. figure 3 et tableaul). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à l'activité de l'aconitase mitochondriale dans des fibroblastes non traités d'un jeune donneur (20 ans), qui constitue le 100%. (%) non traité Calamond M. Hibiscus in citrifolia ans 100 97 125 115 70 ans 18 108 121 67 Tableau 1 Activité de l'aconitase mitochondriale de fibroblastes de donneurs âgés de 20 ans et 70 ans. Ces résultats indiquent qu'un traitement par ces extraits permet mitas- niitochondriale de l'action d ~' ante. Il ~~~ '~~ suite 1nificative de l'aconits se ndto hondriale ] heures tihroblaslies de donneurs tige.: de 20 ans avec e anche men"ti"ii traitement sur cl c' 3stes de donneurs suite une , tJtc3 s n Ct ctln 'ale I ns'vnic. flormulationscosmétiques envie 3 : composition cosmétique comprenant un extrait de calamondin. L'extrait obtenu à l'exemple 1 est utilisé tel quel dans la composition cosmétique ci-dessous - Extrait végétal de Calamondin (EX1) Tensio actif (Arlacel� 165 VP) Alcool cétylique 95% Alcool stéarylique Cire d'abeille Huile (Perleam�) Tri caprate/caprylate glycerides Huile silicone (diméthicone 100 CS) Polymère (Keltrol�) - Soude EDTA tetrasodique poudre Conservateurs Eau La composition cosmétique est préparée de manière habituelle, bien connue de l'homme de l'art, par mélange des divers composants en une ou plusieurs étapes. Cette composition est une crème de nuit qui peut être appliquée sur le visage quotidiennement pendant plusieurs semaines pour 25 obtenir Ir:`: effets cosmétiques ante-ace précé ernment Indiques,: 0,35 % 0,04 % 0,1 % 0,5 9/o qsp 100 ANNEXE A 1 - Tampons et solutions utilisées pour les gels cl'élec rophorese en conditions dénaturantes et réductrice, en tamil n discontinu Solution de monomères: 10 acrylamide Bis-acrylamide, 30% T, 2,67% C (Biorad) Tampon de gel de résolution: Tris-HCL 1,5M pH 8,8. - 18,15g de Tris base(Sigma) pour 100 ml d'eau distillée - pH ajusté à 8,8 avec de l'HCL 12N Tampon de gel de concentration: Tris-HCL 0,5M pH 6,8. - 6g de Tris base pour 100 ml d'eau distillée - pH ajusté à 6,8 avec de l'HCI 12N Tampon de migration 10X: Tris 0,25M pH 8,3 , glycine 1,92M; SDS 1% Persulfate d'ammonium.: (NH4)2S208: Sigma à 1.O h(i v), 20 it O) fi 'n1! - Tris base - Glycine (Research Organics Inc) - SDS 10% (Sigma) - Eau distillée 12 g 57,6 g 40 ml qs 400 ml Tampon échantillon r,ou(t.2ur LacnimL.. Tris- HCL (,06M Heu de 1)1( rl ont'd'oun u, 15 1.0 Bleu de bromophénol 10X ( solution saturée : On disperse une pointe de spatule de bleu de bromophénol dans 5 ml de Tampon Laemrnli 2X. Après agitation, sonication puis centrifugation, on récupère le surnageant. Il - Gels d'éle rophorese ._ -Préparation du gel de résolution à 12% T Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel (10ml) finale Solution de monomère 4,0 ml 12%T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 2,5 ml 0,375M SDS 10% 100 pl 0,1% Persulfate d'ammonium (10%) 50 pl 0,05% TEMED(Research Organics Inc) 5 pl Eau distillée 3,4 ml -Préparation du gel de concentration à 8% T Solutions Volumes Concentrations pour 2 gel s (5ml) finale Solution de monomère 2 ml 8%T; 2,7% C Tampon de gel de résolution 1,25 ml 0,375M SDS 10% 50 pl 0,1% Persulfate d'ammonium (IO%) 25 pl 0,05% TEMED(Research Organics Inc) 5 pl Eau distillée 4,2 ml ANNEXE B Solutions pour le transfert et l'im u odétection Tampon de transfert de Towbin : Tris-HO_ 25mM, pH 8,3 ; Glycine 192 mM; 20% Méthanol - Tris base 3,03g - Glycine(Research Organics Inc) 14,4 g à dissoudre dans 100ml d'eau distillée - Méthanol 200 ml - Eau distillée qs 1000 ml Tampon PBS-T Dilution au 1/10 du PBS 10X (Invitrogen) + Tween 20 à 0,1% (Sigma) Rouge Ponceau (Sigma) Solution à 0,1% (p/v) dans une solution d'acide acétique à 5% 5 ANNEXE C Liste anticorps primaires et secondaires Ref. : Bulteau et al. Biochemistry, 2003 ; 42, 14846-14855 Anticorps Anti-Aconitase humaine Anti rabbit IgG HRP référence Non commercial. (cf ref. ci-desssous) Amersham dilution 1/1000èm e 1/50000è me Temps d'incubation 1 heure 1 heure REVENDICATIONS1. Méthode de soin cosmétique pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en atténuer les effets, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'au moins un agent actif cosmétiquement acceptable activant ou stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané. 2. Méthode de soin cosmétique pour le soin de la peau endommagée, notamment par le rayonnement ultraviolet, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'un agent actif cosmétiquement acceptable activant ou stimulant l'activité de l'aconitase mitochondriale au niveau cutané. 3. Méthode selon la revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'agent actif délivré topiquement est incorporé dans une composition cosmétique comprenant en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'agent actif comprend ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante choisie dans le groupe comprenant celles appartenant au genre Citrus ou les hybrides issus du croisement d'espèces végétales dont l'une au moins appartient au genre Citrus, celles appartenant au genre Morinda ou bien celles appartenant au genre Hibiscus. 5. Méthode selon rune des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'agent actif comprend ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins un hybride appartenant au genre x Citrofortunellai résultant du croisement des genres Citrus et Fortunella, en particulier le calamondin (x Citrofortunella microcarpa 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractensec en JL Ul 1 tÂLI diL LIU Il Llll Ut' 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit agent actif comprend ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant à l'espèce végétale Morinda citrifolia. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, 7, caractérisée en ce que l'agent actif est un extrait du fruit de Morinda citrifolia. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit agent actif comprend ou est constitué essentiellement d'un extrait végétal obtenu à partir d'au moins une plante appartenant à l'espèce végétale Hibiscus sabdariffa. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'agent actif est un extrait de fleurs d'Hibiscus sabdariffa. 11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la concentration en agent actif est comprise entre 0,001% et 15 5%, de préférence de 1 % à 3 %, en poids de la composition. 12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que l'agent actif activant ou stimulant l'expression de l'activité de l'acotinase est associé à une molécule ou à un extrait inhibant les di phosphoesterases, de préférence la caféine. 20 13. Méthode selon l'une des revendications 3 à 12, caractérisée en ce que la composition cosmétique selon l'invention peut être formulée sous forme d'un sérum, une lotion, une émulsion, par exemple une crème, ou bien encore un hydrogel, de préférence un masque, ou se présenter sous la forme d'un stick, ou encore d'un patch. 25