Brevet FR2940318A1 — publié le 20100625

NOUVEAUX BIOTRACEURS ET LEURS UTILISATIONS POUR LE CONTROLE DES INSTALLATIONS DE FILTRATION Les procédés de filtration par membrane sont utilisés dans de nombreux domaines pour concentrer ou purifier des liquides. Dans certaines applications (traitement de l'eau, industrie agroalimentaire...), il est important de pouvoir contrôler l'état des membranes en cours d'utilisation (on parle aussi de leur intégrité) afin d'assurer la qualité du produit final. A titre d'exemple, on peut citer les usines de production et de traitement des eaux qui sont équipées de systèmes de filtration permettant de limiter la teneur en biocontaminants et autres composés (virus, bactéries, etc.) des eaux en sortie. Ainsi, la technologie membranaire (ultrafiltration en particulier) est largement utilisée en raison de ses fortes capacités d'abattement en virus. L'abattement (ou rétention) d'un système de filtration est défini par le taux de composés retenus. Pour garantir le contrôle et la qualité des installations, il est nécessaire de pouvoir caractériser en ligne (directement sur les installations) et en dynamique, c'est-à-dire dans le temps, la rétention des systèmes de filtration utilisés, et ce afin de qualifier objectivement les performances de rétention des systèmes de filtration, d'augmenter les performances de garantie sanitaire des usines et de diminuer la demande en désinfectants chimiques. Les seuils de coupure (c'est-à-dire 90% de rétention du composé cible) des membranes sont actuellement évalués grâce à des traceurs très petits, de type polymère et protéine tels que les PEG (polyéthylène glycol) et les dextran. Ces traceurs ont des propriétés différentes de celles des virus, que ce soit en termes de taille, de forme ou de densité. Ils ne sont donc pas adaptés pour mimer le comportement des virus lors de la filtration et ne peuvent donc pas caractériser de façon satisfaisante la dynamique de rétention des systèmes membranaires en cours de filtration. Il est donc nécessaire de mettre à disposition un traceur qui soit facilement détectable et quantifiable en ligne et qui puisse mimer au mieux le comportement en filtration des virus. Les bactériophages (encore appelés phages) sont des virus de bactéries non pathogènes pour l'homme et son environnement. Ils sont couramment utilisés comme microorganismes de référence pour quantifier la rétention en virus des systèmes membranaires (Membrane filtration guidance manual : Environmental Protection Agency, 2005 ; US 5 645 984 A, et US 5 731 164 A). En effet, ils sont très similaires à des virus pathogènes véhiculés par l'eau du point de vue de la taille, de la forme et des propriétés de surface. Cependant, les méthodes existantes pour quantifier les bactériophages (dénombrement des plages de lyses, PCR quantitative, cytométrie en flux...) ne sont pas suffisamment rapides et représentatives des volumes filtrés pour les applications visées. Des substituts aux virus pathogènes ont été envisagés dans la littérature. On peut notamment citer des nanoparticules d'or détectées par potentiométrie (Gitis et al, Journal of Membrane Science, 276, 2006, 1999-207). Mais, malgré des tailles similaires, ces particules ne sont pas représentatives des virus car ces nanoparticules ont une densité beaucoup plus grande et une surface nettement plus lisse que les virus. D'autre part, elles sont beaucoup moins déformables. Dans une autre approche, on peut trouver des traceurs tels que des bactéries dont la surface a été modifiée avec des particules paramagnétiques de manière à pouvoir collecter et détecter lesdites bactéries par application d'un champ magnétique (US 2003/168408). Cependant la mise en oeuvre de la détection de tels traceurs reste difficile. Dans une autre étude, des bactériophages modifiés ont aussi été envisagés comme traceurs (Gitis et al., Water Research, 36(2002), 4227-4234 et demande WO2007/046095). Une des modifications proposée réside dans le greffage de fluorochromes en surface de bactériophages MS2 pour pouvoir ainsi détecter directement lesdits bactériophages modifiés par fluorimétrie. Cette approche pertinente reste cependant limitée par de faibles volumes analysables (au maximum 1 mL, la cellule fluorimétrique ne pouvant être alimentée en continue à cause du caractère fortement colmatant de toutes suspensions biologiques). Le greffage d'enzymes (de masse moléculaire plus de 200 fois plus importante que celle des fluorochromes) en surface de bactériophages T4 a également été envisagé. Dans ce cas particulier, les limitations résident principalement dans la grosseur du phage T4 (mesurant environ 150 nm de long et 78 nm de large) rendant ainsi l'utilisation du traceur obsolète pour les membranes d'ultrafiltration ou de nanofiltration ainsi que dans la méthode de détection associée (par chimiluminescence ECL) où de faibles volumes sont analysés (de l'ordre de 20 microlitres). On notera que pour un tel traceur, les auteurs n'ont pas apporté de caractérisation du traceur ainsi présenté et rien ne permet de quantifier le nombre de traceurs présents dans un échantillon et donc d'apporter des valeurs sur les seuils de détection Il est donc désirable de mettre à disposition des biotraceurs les plus représentatifs possibles des virus, permettant une méthode de détection rapide, continue et compatible avec des volumes importants. De même, il est désirable de pouvoir s'assurer de la caractérisation reproductible et quantitative dudit traceur. Ainsi, la présente invention concerne une nouvelle méthode de détection par ampérométrie de biotraceurs constitués d'un bactériophage marqué en sa surface par une ou plusieurs sonde(s) enzymatiques greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. Ainsi, le procédé de détection dans un échantillon à analyser de biotraceurs selon l'invention comprend préférentiellement : - la préparation d'une cellule ampérométrique comprenant : - une électrode de travail, - une contre-électrode, - une électrode de référence, ces trois électrodes étant reliées par un potentiostat-galvanostat ; - une solution comprenant l'échantillon à analyser et au moins un biotraceur comme défini ci-avant, - un électrolyte, - un oxydant, - un donneur d'électrons (R), et - la mesure par ampérométrie du courant ainsi généré. 30 Préférentiellement, l'électrolyte comprend un tampon permettant de fixer le pH de la solution. 25 Préférentiellement, la méthode de détection selon l'invention est telle que le seuil bas de détection en biotraceurs est généralement supérieur ou égal à 102, plus préférentiellement supérieur ou égal à 104 pfu/mL. Il n'y a pas de limitation de détection haute en concentration en biotraceurs et si besoin, une dilution de l'échantillon peut être réalisée avant analyse. A titre de phages convenant à l'invention, tout type possédant des protéines à leur surface peut convenir. Le phage utilisé sera préférentiellement choisi parmi des phages pouvant être facilement amplifiés dans des souches bactériennes. De préférence, les phages choisis ont des cycles de réplication dans des bactéries non pathogènes. Ces phages peuvent être choisis dans toutes les familles de phages connues. Le type de phage (taille) sera notamment choisi en fonction du type de filtration à caractériser (en particulier vis-à-vis du seuil de coupure de la membrane). Pour une filtration de type microfiltration (MF), ultrafiltration (UF) et/ou nanofiltration (NF), le phage utilisé est tout préférentiellement le phage MS2. Mais des phages de taille et de masses moléculaires plus élevées peuvent également convenir au procédé de microfiltration. Ainsi, les phages MS2 en particulier sont des virus sphériques d'un diamètre moyen de 30 nm, recouverts d'une coque protéique appelée capside et conviennent à l'invention. Les bactériophages peuvent être obtenus auprès d'organismes agréés tels que l'ATCC ou l'Institut Pasteur. Ainsi, le bactériophage MS2 correspond à la souche ATCC15 597-B1. Les phages ainsi marqués sont également appelés biotraceurs. Les termes phages et bactériophages sont interchangeables et se rapportent à des virus qui infectent des bactéries Une molécule de biotine est fixée sur une ou plusieurs protéines de la capside du phage. La biotine utilisée est modifiée de façon à présenter une fonction terminale réactive. Ladite biotine ainsi modifiée est ici appelée biotine activée. La biotine est une molécule extrêmement petite et hydrophile, ce qui lui permet de diffuser aisément vers ses sites d'accroche pour y réagir. Elle est largement utilisée dans le cadre de tests biochimiques pour sa capacité à former des liaisons covalentes avec les protéines et en raison de sa petite taille. Un spacer peut par ailleurs être introduit avant la fonction terminale réactive de la biotine activée. Les molécules de biotine utilisées sont activées pour réagir avec des sites privilégiés de la capside protéique du phage utilisé. A titre d'exemple, des molécules de biotine activées pour réagir avec les groupes amines primaires ù NH2, notamment présents dans les acides aminés lysines ont été choisies pour le phage MS2 de façon à établir une liaison covalente de type amide. En effet, la capside des phages peut être composée de protéines contenant au moins une lysine. Il en est ainsi notamment des phages MS2 dont la capside est composée de 180 protéines identiques possédant chacun un site lysine accessible pour ce type de greffage (Lin et al., J. Mol. Biol., 1967, 25(3), 455-463). Les molécules de biotine activées peuvent être obtenues auprès de sociétés commerciales telles que Perbio Science, telles que à titre illustratif, les biotines EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin. Les sondes enzymatiques sont fixées à la biotine activée par une interaction très forte (caractérisée par une constante d'association élevée), comparable à une liaison covalente dans une large gamme de pH et de températures. A titre de sondes enzymatiques, on peut utiliser tout complexe composé de : - une protéine support apte à interagir avec la biotine activée, et - une enzyme de type oxydo-réductase. Le choix de la sonde enzymatique (complexe enzyme/protéine support) dépend généralement de : - la taille finale du biotraceur désirée vis-à-vis de la membrane à caractériser, - la sensibilité liée à la détection de l'enzyme, - et des interactions desdites molécules avec la membrane du système de filtration à caractériser. Lesdites protéines support de la sonde enzymatique peuvent par exemple être choisies parmi la neutravidine, l'avidine ou la streptavidine. A titre d'enzyme, on peut notamment citer l'oxydo-réductase � Horse Radish Peroxydase � (HRP), communément employée en immunologie pour sa forte activité et sa faible masse moléculaire. Ainsi, à titre de sondes enzymatiques, on préfère notamment le complexe neutravidine-HRP, commercialisé par Perbio Science par exemple. Préférentiellement, les biotraceurs selon l'invention sont tels que : - ils sont disponibles dans une suspension où sont absentes des sondes libres, et/ou - le nombre moyen de sondes enzymatiques greffées par phage est compris entre 20 et 100, de préférence compris entre 40 et 60 en fonction des conditions de synthèse, et/ou - l'activité catalytique moyenne des biotraceurs kcat est comprise entre 2.104 et 4.104 min-1. En mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, il se produit une réaction d'oxydation du donneur d'électrons (R) en présence de l'oxydant et du biotraceur selon l'invention, en le donneur oxydé (0) correspondant, ladite réaction d'oxydation étant catalysée par ledit biotraceur. Plus précisément, la réaction d'oxydation est catalysée de façon irréversible par l'enzyme de la sonde enzymatique du biotraceur. Le donneur oxydé (0) ainsi formé diffuse vers l'électrode de travail. Une tension de polarisation � Vpolarisation �, inférieure au potentiel d'équilibre du couple oxydo-réducteur donneur oxydé (0) / donneur d'électrons (R), est appliquée entre l'électrode de travail et l'électrode de référence, de sorte que le donneur oxydé (0), arrivé au voisinage de l'électrode de travail, est réduit en composé donneur d'électrons (R), générant ainsi un courant de réduction 1 (appelé courant cathodique). Le courant de réduction I, mesuré au cours du temps est directement proportionnel à la concentration en donneur oxydé (0) formé en solution, donc à la quantité totale de sondes enzymatiques greffées et donc à la quantité totale d'enzymes greffées. Ladite méthode de détection peut donc être qualitative ou quantitative. A titre de donneurs d'électrons (R), on peut notamment citer l'iodure ou le 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (appelé communément TMB). A titre d'oxydant, il convient de choisir un oxydant permettant de réaliser la réaction d'oxydo-réduction catalysée par l'enzyme de la sonde enzymatique greffée sur le biotraceur. Ainsi, le peroxyde d'hydrogène convient avantageusement pour l'enzyme HRP. L'enzyme HRP catalyse en effet de façon irréversible la réaction d'oxydation de (R), en présence de peroxyde d'hydrogène, de façon à former le donneur oxydé (0) correspondant et de l'eau, selon la réaction : Donneur d'électrons (R) + H2O2 - Donneur d'électrons oxydé (0) + H2O Le rapport de la concentration en oxydant sur la concentration en donneur d'électrons (R) peut varier de 1 à 10. Ce choix contribue notamment à limiter la réaction spontanée d'oxydation du donneur d'électrons (R) en présence de l'oxydant. Les électrolytes peuvent être choisis parmi tout électrolyte habituellement utilisé, tel que NaCl, KCI. La concentration de l'électrolyte est généralement inférieure à 1 M, préférentiellement inférieure à 0,3 M. Le pH de la solution à analyser est choisi de telle manière que l'activité de l'enzyme greffée soit la plus favorisée et que l'oxydation spontanée du donneur d'électrons (R) soit la plus défavorisée. Dans le cas où l'enzyme est la HRP et le donneur d'électrons est le TMB, le pH peut être fixé entre 5 et 7. Les tampons convenant à l'invention peuvent être choisis parmi tout tampon habituellement utilisé, tels que citrate-phosphate, phosphate, etc... L'électrode de travail est avantageusement une électrode de travail à disque tournant (EDT) qui peut être notamment constituée de platine, de carbone vitreux ou d'or. On notera que le dimensionnement de la surface active de l'électrode de travail dépend de la quantité de donneur oxydé (0) présent en solution et donc du volume de la solution à analyser : plus le volume de solution est grand et plus la surface active peut être choisie grande. La contre-électrode est avantageusement une électrode de platine. Généralement, la surface de l'électrode de travail présente une surface faible par rapport à la surface de la contre-électrode. Ainsi, à titre illustratif, la surface de la contre-électrode de platine peut être de 5 à 10 fois plus grande que celle de l'électrode de travail. L'électrode de référence peut être choisie parmi les électrodes de référence habituellement utilisées en électrochimie (telles que Ag/AgCI). La tension de polarisation est généralement telle que l'oxydation spontanée du donneur d'électrons (R) soit la plus défavorisée et que la réduction du donneur oxydé (0) à l'électrode de travail soit la plus favorisée. Tout montage potentiostat-galvanostat fonctionnant en mode potentiostat ou galvanostat peut être utilisé ; on préfère cependant le mode galvanostat permettant de mesurer le courant. Le temps de l'analyse est généralement compris entre 1 et 30 minutes. Avantageusement, la méthode de détection peut être menée en externe (par échantillonnage) ou en continu, c'est-à-dire en ligne. La présente invention concerne également le procédé de contrôle de système de filtration. Ledit procédé comprend : - l'introduction d'au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage dans l'alimentation dudit système, - l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) dudit système de filtration selon l'invention. Préférentiellement, l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) est réalisée dans un échantillon dudit perméat. La détection de courant dans l'échantillon à analyser (par exemple un échantillon du perméat) permet d'identifier la présence des biotraceurs mimant les virus dans les eaux de sortie. Lorsqu'une quantification des biotraceurs dans le perméat (ou rétentat) est désirée, cela peut être notamment réalisé par l'étape comprenant la comparaison du courant mesuré à des valeurs de référence. De plus, la réalisation de valeurs de référence par l'étalonnage du courant en fonction de la quantité (ou concentration) de traceurs permet d'accéder par simple mesure du courant à la quantité (ou concentration) des biotraceurs dans l'échantillon analysé, Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de contrôle permet de déterminer l'abattement dudit système de filtration. On définit par abattement Ab le logarithme décimal du rapport de la concentration d'alimentation en biotraceurs Ca sur la concentration en biotraceurs dans le perméat Cp : Ab = log (Ca/Cp) [équation 0] Pour cela, ledit procédé comprend en outre : - l'étape de détection de biotraceurs dans l'alimentation dudit système, puis - l'étape de détection de biotraceurs dans le perméat et/ou rétentat dudit système, puis - la comparaison du courant dans le perméat (ou rétentat) avec le courant obtenu dans l'alimentation. Préférentiellement, on opère par échantillonnage de l'alimentation et du perméat (ou rétentat). Selon un autre objet, la présente invention concerne également l'utilisation de cellules ampérométriques classiques pour la détection d'activités enzymatiques. Les biotraceurs constitués d'un bactériophage de type MS2 marqué, tel que : - ledit bactériophage présente des protéines à la surface de sa capside, - une molécule de biotine activée est greffée à une ou plusieurs desdites protéines, et - une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) est(sont) fixée(s) sur ladite biotine. Selon un autre objet, la présente invention concerne donc un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué, tel que ledit bactériophage est un phage MS2 qui comprend à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s)de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. Préférentiellement, le biotraceur selon l'invention peut comprendre les modes de réalisation décrits ci-avant en référence avec le procédé selon l'invention. Selon un autre objet, la présente invention concerne également le procédé de préparation desdits biotraceurs. Ainsi, ledit procédé comprend les étapes suivantes : - accrochage d'une molécule de biotine activée à une ou plusieurs protéine(s) présente(s) à la surface du bactériophage à marquer, puis - greffage d'une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) à ladite (auxdites) biotine(s). Les techniques d'accrochage de la biotine et de la fixation de la sonde enzymatique sont bien connues de l'homme du métier. Préférentiellement, lesdites molécules de biotine activées sont accrochées aux lysines des protéines de surface du bactériophage. Selon un mode préférentiel, on opère en excès de biotine de sorte qu'une molécule de biotine activée est accrochée à chaque lysine accessible des protéines à la surface du bactériophage à marquer. Le procédé peut également comprendre l'étape ultérieure de purification, préférentiellement par chromatographie liquide d'exclusion stérique (appelée aussi High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC), afin d'éliminer les sondes enzymatiques libres. Si nécessaire, une étape de purification peut être réalisée après l'accrochage de la biotine activée aux phages, les phages étant alors séparés des molécules de biotine activée non greffées. Cette étape de purification est avantageusement réalisée par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC). Le procédé, peut dans un mode de réalisation préféré, comporter une étape préliminaire de production des phages à marquer. Cette étape de production comprend les étapes consistant à : - amplifier les phages à marquer ; - mettre en suspension les phages ainsi amplifiés ; - purifier les phages. Les phages sont amplifiés en présence de bactéries hôtes, par exemple selon le protocole par voie solide recommandé par l'ATCC. On notera que cette amplification peut être réalisée en milieu liquide ou solide. Le temps et les conditions d'amplification dépendront du type de phage utilisé et pourront facilement être déterminés par l'homme du métier. Les phages ainsi amplifiés sont ensuite remis en suspension en milieu liquide, par exemple dans de l'eau physiologique ou préférentiellement dans du tampon phosphate neutre (appelé communément PBS) pour être purifiés. L'étape de purification peut comprendre une lyse des bactéries, par exemple au chloroforme et une ou plusieurs étapes de centrifugation suivies de filtrations. Les phages ainsi purifiés peuvent être conservés en milieu liquide, préférentiellement dans du PBS. Le procédé peut également comprendre le dénombrement des phages ainsi amplifiés et purifiés, par exemple par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) ou par des techniques de dénombrement de phage en milieu aqueux (notamment selon la norme ISO 10705-1). Selon un autre objet, la présente invention concerne également un kit comprenant : - une solution comprenant au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué, comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage; et - une cellule ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre-électrode et une électrode de référence, - un électrolyte, - un donneur d'électrons (R) et, - un oxydant. Préférentiellement, l'électrolyte comprend un tampon. Les donneurs d'électrons, les oxydants, les électrolytes, les tampons, l'électrode de travail, la contre-électrode et l'électrode de référence peuvent être choisis parmi ceux préférés pour le procédé de détection de biotraceurs selon 20 l'invention. La solution peut contenir une concentration de biotraceurs allant jusqu'à 1012 pfu/mL. L'invention sera mieux comprise à l'aide des figures suivantes : 25 La figure 1 représente schématiquement un biotraceur selon l'invention, où (1) représente la protéine du capside du phage, (2) la molécule de biotine activée, (4) la protéine support de la sonde enzymatique (à titre d'exemple la molécule de neutravidine) reliée de manière covalente à une ou deux molécules d'enzymes 30 HRP C (5), (3) constituant la sonde enzymatique. La figure 2 représente la distribution en taille d'un lot de phages obtenu selon l'exemple 1 (après amplification et extraction au chloroforme). 15 La figure 3 représente les chromatogrammes à 254 nm de suspensions de phages natifs amplifiés et extraits au chloroforme aux concentrations CO, C0/4 et CO/10, où (1) représente le pic des phages natifs et (2) le domaine des protéines. La figure 4 présente les chromatogrammes obtenus à 254 nm de la biotine seule (courbe 1), des phages natifs (courbe 2), des phages marqués par la biotine (courbe 3). La figure 5 représente les chromatogrammes à 210 nm de la sonde enzymatique seule (courbe 1), d'une suspension purifiée de phages marqués par la biotine (courbe 2), d'un mélange de biotraceurs et de sondes en excès (courbe 3), d'un mélange de biotraceurs et de phages marqués par la biotine dans le cas où les sondes sont en défaut (courbe 4). La figure 6 représente le descriptif schématique d'une méthode de détection, où, à titre illustratif, un phage MS2 est utilisé et le perméat est analysé. De façon alternative, le rétentat ou l'alimentation pourraient également être analysés, et un autre phage pourrait être utilisé. La figure 7 supérieure représente un exemple de courbes ampérométriques d'une même alimentation en traceurs (4 volumes croissants échantillonnés) ; la figure 7 inférieure représente la droite de calibration associée à l'exemple (donnant les pentes mesurées en fonction des concentrations en traceurs dans la cellule de mesure, exprimées en unité de dénombrement de phages natifs). Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention. EXEMPLES Exemple 1 : Préparation du biotraceur Un biotraceur est représenté à la Figure 1. ^ Réactifs : - Bactériophages MS2 (ATCC, souche 15 597-B1), Bactéries E. col/ K-12 non pathogènes (disponible au LISBP), Biotine activée (Perbio Science, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, ref. 21335), Sondes enzymatiques de type Neutravidine-HRP (Perbio Science, ImmunoPure NeutrAvidin, HRP Conjugated, ref. 31 001), Tampon commercial PBS neutre (Perbio Science, BupH Phosphate Buffered Saline Packs, ref. 28 372), - Pyrogallol (Sigma Aldrich, ref. 25 4002), Peroxyde d'hydrogène (Roth, Hydrogen Peroxide 30 % stabilisé, ref. 8070), Sels nécessaires à la réalisation de tampons et électrolytes : o NaCl (Roth, ref. 3957), o Na2HPO4, 2H2O (Roth, ref. 4984), o NaH2PO4, 2H2O (Roth, ref. T879) ^ Matériel utilisé : - Spectrophotomètre à plaques (Multiscan Ascent), - Appareillage de chromatographie liquide Akta-Purifier avec caractérisations UV (210, 254 et 280 nm) et système de collecte (GE Healthcare), - Colonne de chromatographie liquide par exclusion de taille : colonne Superose6 (GE Healthcare, ref. 10/300 GL), - Granulomètre NanoSizer ZS (Malvern Instruments). ^ Méthodes : - Protocole ATCC d'amplification des phages par voie solide, - Norme ISO 10 705-1 sur le dénombrement des phages en milieux aqueux. La première étape de réalisation des traceurs réside dans l'obtention de suspensions de phages concentrées, purifiées et dénombrées. o Purification des phages : L'obtention des phages concentrés peut être réalisée selon des méthodes connues telles que le protocole de l'ATCC. La purification des suspensions de phages amplifiés est nécessaire pour éliminer tous débris bactériens et/ou libérer les phages encore contenus dans des bactéries hôtes. En effet, les débris bactériens présentent également des sites lysines, susceptibles de réagir avec les molécules de biotine activées. Deux étapes de purification sont nécessaires. La première étape est une étape d'extraction au chloroforme pour lyser les bactéries restantes sans altérer les bactériophages (Adams, Bacteriophages, Intersciences Publishers, 1959). L'ensemble chlororoforme/ suspensions est centrifugé deux fois à 9000 rpm. Le surmageant est récupéré puis filtré sur filtre stérile à 0,2 microns. Les suspensions sont stockées à 4°C dans leur tampon PBS neutre et dans des contenants en verre pour limiter les phénomènes d'adsorption des protéines. Les conditions de stockage des phages ont été choisies selon les données de la littérature (Feng et al., Ind. Microbiol. Biotechnol., 30, 549-552, 2003) pour minimiser la détérioration de la capside à long terme. Pour quantifier la taille des phages, une caractérisation granulométrique est réalisée avec un ZetaSizer Nano ZS (Malvern) (figure 2). La courbe de distribution de taille montre un pic unique, reproductible, centré sur une valeur moyenne de 31 nm (valeur moyennée sur les cinq acquisitions). Ce diamètre moyen est tout à fait en accord avec les données de la littérature. La chromatographie liquide d'exclusion stérique High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) peut être également utilisée pour quantifier la concentration en phage dans les suspensions obtenues (figure 3). Les analyses sont réalisées avec une colonne ayant une gamme de résolution en masses moléculaires comprise entre 5 et 5000 kDa (et admettant une charge maximale de 40 000 kDa). En effet, la masse moléculaire des phages MS2 natifs est de 3600 kDa (Kuzmanovic et al., Structure, 2003 Nov; 11(11):1339-48.). L'éluant est du tampon PBS neutre. Les détections sont faites par spectrophotométrie UV. L'absorbance mesurée dans ce cas en UV 254 nm est donnée en fonction du volume élué. Plus le volume élué est petit et plus le composé correspondant à ce volume a une masse moléculaire élevée. Sur la figure 3, le pic d'élution (1) centré sur environ 11,3 mL correspond aux phages natifs. Les pics (2) correspondent aux protéines issues très probablement de la lyse des bactéries ou du milieu de culture solide entraîné lors de la mise en suspension des phages amplifiés. Les aires des pics (1) étant directement proportionnelles aux concentrations des composés dans l'échantillon, la technique de High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) pourra donc aussi être utilisée pour quantifier des suspensions de phages. La suspension de phages pourrait également être purifiée des protéines en collectant la fraction éluée entre 9,5 et 14 mL. Cependant, la purification n'est pas menée à son terme afin de ne pas diluer les suspensions de phages. o Dénombrement : La détermination précise de la concentration en phages purifiés permet la détermination de la concentration en traceurs. Un dénombrement des suspensions de phages purifiées peut être réalisé avant l'étape de greffage. Le protocole suivi est celui de la norme ISO 10 705-1. La seconde étape de l'obtention du biotraceur consiste donc à marquer les suspensions de phages obtenus précédemment (i.e. les suspensions obtenues après amplification des phages, extraction au chloroforme, centrifugation et filtration à 0,2 �m) par les molécules de biotine puis à éliminer les molécules de biotine non greffées par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC). La biotine activée, introduite en très large excès, est directement dissoute dans quelques mL de la suspension de phages pour favoriser le contact entre réactifs. La réaction est conduite dans un récipient en verre à température ambiante, à pH neutre (c'est-à-dire celui de conservation des phages) et à l'abri de la lumière. Le mélange est agité pendant une heure et quart puis stocké tel quel une nuit minimum à 4°C. Pour éliminer les molécules de biotine non greffées, le mélange après réaction de greffage est purifié par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC). L'éluant est toujours du PBS neutre. Les chromatogrammes sont représentés à la figure 4. On distingue 3 courbes : - courbe 1 : chromatogramme de la biotine seule faisant apparaitre un pic caractéristique de la molécule aux environs de 20 mL, - courbe 2 : chromatogramme de la suspension de phage avant greffage faisant apparaitre le pic caractéristique des phages à environ 11,3 mL et les protéines résiduelles de la suspension à partir de 20 mL, - courbe 3 : chromatogramme de la suspension après greffage faisant apparaitre un pic à environ 11,3 mL correspondant aux phages greffés (en effet, les molécules de biotine ont une masse moléculaire trop faible pour que la variation de masses moléculaire (2,8 %) entre les phages natifs et les phages greffés soit visible sur les chromatogrammes) et un pic à saturation au-delà de 20 mL correspondant à l'excès de biotine. La fraction correspondante aux phages marqués par les molécules de biotine est collectée entre 9,5 et 14 mL dans un tube en verre et stockée à 4°C en vue du marquage par les sondes enzymatiques. A ce stade, il n'est pas possible de dire si le marquage par les molécules de biotine a été effectif. Seule une caractérisation du mélange après réaction avec les sondes enzymatiques permet de conclure à l'efficacité de ce greffage. La troisième étape consiste alors à fixer les sondes enzymatiques sur les phages biotinylés obtenus précédemment puis à éliminer les sondes enzymatiques non fixées. Les sondes enzymatiques sont reconstituées dans de l'eau ultra pure puis introduites en grand excès dans la fraction de phages marqués par la biotine. La réaction est conduite à température ambiante, à pH neutre, à l'abri de la lumière et sous agitation (120 rpm) pendant 30 minutes. Pour éliminer les sondes enzymatiques non greffées, le mélange post- réactionnel est purifié par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC). En effet, la masse moléculaire des biotraceurs est estimée à plus de 5000 kDa (compte-tenu des masses moléculaires des sondes enzymatiques) mais à moins de 40 000 kDa (charge maximale de la colonne de chromatographie), ce qui permet leur récupération dans le pic d'exclusion total. L'éluant est toujours du PBS neutre. Les chromatogrammes (figure 5) obtenus à 210 nm, longueur d'onde pour laquelle on obtient la meilleure sensibilité de réponse des sondes enzymatiques montrent : - la sonde enzymatique (courbe 1) caractérisée par un pic centré sur un volume approximatif de 15 mL, - la suspension de phages biotinylés (courbe 2) purifiés par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) caractérisée comme précédemment par un pic à environ 11,3 mL, - la suspension de biotraceurs synthétisés après greffage de sondes enzymatiques en large excès (courbe 3) : on distingue le pic du biotraceur centré aux environs de 8,5 mL et l'excès de sondes enzymatiques (pic centré sur 15 mL) (remarque : un très léger décalage est visible entre ce dernier pic et celui de la courbe 1 car les lots de sondes utilisées dans les deux cas ne présentaient pas exactement les mêmes caractéristiques : cf fournisseur). En comparant les courbes 2 et 3, on constate un déplacement net du pic des phages biotinylés (11,3 mL) vers les plus petits volumes (8,5 mL), avec un écart significatif AV = 2,8 mL. Ceci traduit une augmentation de la masse moléculaire des phages natifs et garantit l'efficacité des greffages biotine et sondes enzymatiques et donc l'obtention des biotraceurs. Dans le cas où les sondes enzymatiques sont introduites par défaut, l'analyse par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) permet de visualiser les phages biotinylés non greffés (courbe 4, épaulement pic à 8,5 mL et pic à 11 mL). La collecte des biotraceurs est réalisée entre 7,5 mL et 10 mL de volume d'élution (courbe 3). L'activité des lots collectés est caractérisée qualitativement par spectrophotométrie en testant l'activité enzymatique choisie avec le substrat adapté. A titre d'exemple, l'activité HRP (oxydo-réductase) a été évaluée par réaction entre le pyrogallol et le peroxyde d'hydrogène conduisant à un produit coloré en présence de l'activité enzymatique. Ces tests qualitatifs positifs confirment rapidement la présence et l'activité des enzymes et attestent de la bonne fabrication des biotraceurs. Les biotraceurs sont également caractérisés quantitativement pour déterminer la quantité de sondes greffées et mesurer l'activité catalytique des biotraceurs. La purification des biotraceurs par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC) permet en effet de collecter la fraction correspondant à l'excédent de sondes. Cette fraction est alors dosée par spectrophotométrie selon une technique bien connue de l'homme du métier. La quantité de sondes greffées est alors déduite par différence entre la quantité initiale connue de sondes introduites pour le marquage et la quantité de sondes en excès collectée. La connaissance de la quantité d'enzymes greffées permet ainsi d'évaluer un nombre moyen de sondes greffées par phage. On peut alors si besoin, exprimer la quantité de traceurs en équivalent de sondes enzymatiques, ce qui permet alors par spectrophotométrie de mesurer l'activité catalytique des sondes greffées (en d'autres termes l'activité catalytique des biotraceurs) selon une technique bien connue de l'homme du métier. La même étude peut se faire aussi par la méthode ampérométrique selon l'exemple 2. On notera que des purifications successives des lots de biotraceurs ont été menées pour s'assurer de l'efficacité du procédé de purification. La répétabilité de la méthode de marquage exposée ci-dessus a été évaluée sur neuf lots de biotraceurs réalisés à partir du même lot de phages natifs dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus (une étude qualitative répliquée 4 fois et 2 études quantitatives : l'une répliquée 3 fois et l'autre 2 fois) attestent d'une très bonne répétabilité de la méthode décrite. Une caractérisation granulométrique des biotraceurs peut être réalisée. A titre d'exemple, les biotraceurs synthétisés à partir de phages MS2, marqués à la biotine et par le complexe neutravidine-HRP montrent un diamètre moyen de 64,5 nm, ce qui les rend parfaitement pertinents pour la caractérisation de système d'ultrafiltration ou de microfiltration. Cette technique de marquage peut donc être généralisée à toute capside protéique dont les structures sont compatibles pour un marquage. Exemple 2 : détection ampérométrique • Première étape : En solution, si l'enzyme fonctionne à saturation (soit sans limitation due au substrat) et que la réaction catalysée est irréversible, on peut écrire : [O](t) = [enzyme]totale. kcat .t [équation 1] avec : - [O](t) : concentration en donneur oxydé formé en solution au temps t (en mail-1), - [enzyme]totale : concentration totale en enzymes greffées présentes en solution (en mail-1), - kcat : activité molaire de l'enzyme greffée (en mol.mol-'.min-1 soit min-1), - t : temps de la réaction catalysée par les enzymes greffées (min). La constante kcat traduit plus explicitement le nombre de molécules de donneur oxydé formé en solution par molécule d'enzyme présente en solution et par unité de temps. Pour l'enzyme choisie, dont la cinétique peut être modélisée par une cinétique de type Michaelis-Menten (donnée de la littérature : Veitch et al. Phytochemistry 65, 249-259 (2004), vérifiée expérimentalement), l'enzyme fonctionne à saturation lorsque la concentration en substrat [S] n'est pas limitante : [S] > 10x Km (Km = constante de Michaelis-Menten en mail-1 de l'enzyme choisie). Dans le cadre de l'étude, la concentration [S] fixée est toujours choisie de manière à remplir cette condition quelle que soit la gamme des concentrations en enzyme utilisées. ^ Seconde étape : D'autre part, dans le cas d'un régime contrôlé par la diffusion, le courant généré au temps t : I(t), lié à la réduction du donneur oxydé sur l'électrode, est le courant limite de diffusion. Ce courant est un courant cathodique de réduction, donc compté négativement et suit la loi suivante : I(t) = - n.F.S.Do.[O](t)/b [équation 2] avec : - I(t) : courant de réduction généré au temps t (A ou C.s-l), - [O](t) : concentration en donneur oxydé formé en solution au temps t (mol.m-3), - n : nb d'e- échangés (-), - F : cte de Faraday (C.mol-l), - S : surface active d'électrode (m2), - Do : coefficient de diffusion de O vers l'EDT (m2.s-'), - ô : couche de diffusion (m). Cette loi traduit la diminution du courant avec l'augmentation de la quantité de donneur oxydé formé au cours du temps. Le transfert du donneur oxydé vers l'électrode de travail est contrôlé par la diffusion si l'hydrodynamique au sein de la solution est fixée par l'électrode de travail : en l'occurrence une électrode à disque tournant et que la vitesse de rotation de l'électrode co (tr.min-l) est choisie telle que, à tout moment, la quantité de donneur oxydé O consommé à l'électrode soit inférieure à 1% de la quantité totale de donneur oxydé O présente en solution. En introduisant l'équation 1 dans l'équation 2, il vient donc : I(t) = - n.F.S.Do.kcat.t.[enzyme]totale /ô [équation 3] Au bout d'un certain temps, ce courant se stabilise (cela est du à l'oxydation totale du donner d'électrons R). Dans ces conditions, la concentration en donneur oxydé O est constante et le courant limite de diffusion est constant. On l'appelle courant limite de diffusion en régime stationnaire et on le note 'stationnaire. D'après l'équation 3, il apparaît donc si que si l'on choisit un temps t suffisant pour que le courant soit significatif, il est possible de corréler le courant mesuré à ce temps là à la quantité d'enzymes totale présente en solution. Cependant, pour plus de précision et pour se dédouaner de tout souci de référence en courant, on peut préférer travailler avec la pente à l'origine Vo (A.s-l) définie en dérivant l'équation 3 par rapport au temps : Vo = (d'/dt)t=o = - n.F.S.Do.kcat.[enzyme]totale/ô = constante [équation 4] Soit en valeur absolue : 1 Vo 1 = (d'/dt)t=o = n.F.S.Do.kcat.[enzyme]totale/ô [équation 5] Ainsi, en mesurant expérimentalement la pente Vo et avec une courbe d'étalonnage obtenu par ampérométrie et/ou par spectrophotométrie, il est possible d'accéder à la quantité d'enzymes greffées dans la cellule de mesure et donc à la quantité de biotraceurs dans la cellule de mesure et par des considérations de volumes à la quantité en traceurs dans l'échantillon. Afin d'expliciter l'emploi conjoint du biotraceur et de la méthode de détection dans l'étude visée, un schéma général est présenté en Figure 6. Une telle étude menée à des temps différents permet de connaître l'évolution de la concentration en biotraceurs dans le perméat au cours de la filtration. L'alimentation et le rétentat (ou concentrat) peuvent analysés selon la même démarche. 1. Système et protocole de mesure a. Réactifs et matériels ^ Réactifs : - 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine encore appelé TMB (SIGMA Aldrich, ref. 87750), - Peroxyde d'hydrogène (ROTH, Hydrogen Peroxide 30 % stabilisé, ref. 8070), - Sels nécessaires à la réalisation de tampons et électrolytes : o NaCl (Roth, ref. 3957), o Na2HPO4, 2H2O (Roth, ref. 4984), o NaH2PO4, 2H2O (Roth, ref. T879), o Acide citrique (Sigma, ref. 251275). ^ Matériel: Un système complet de détection ampérométrique (Metrohm). Le potentiostat choisi est un MicroAutolab (Metrohm), ayant une résolution de 30 fA et mesurant le nA de manière répétable. La cellule ampérométrique est une cellule en verre de Karl Fisher thermostatable (Methrom) à couvercle plat pour permettre un nettoyage et un positionnement des électrodes plus facile, de volume maximum 130 mL. Deux canules permettant un barbotage en diazote peuvent également être positionnées sur le couvercle. L'électrode de travail choisie est une électrode à disque tournant (EDT) Metrohm de surface active un disque platine de diamètre 5 ou 3 mm, adapté au volume de travail de la cellule. L'électrode de travail présente un contact mercure entre la tige tournante et le corps d'électrode, assurant ainsi une transmission du signal minimisant le bruit. Le système d'asservissement de l'EDT permet d'imposer une vitesse de rotation comprise entre 100 et 10000 rpm. La contre-électrode est une grille de platine de surface active choisie 6,5 fois plus grande que celle de l'électrode de travail. L'électrode de référence choisie est une électrode Ag/AgCI à double jonction. On notera que les paramètres volume de cellule, matériau et surface de l'électrode de travail, surface et géométrie de la contre-électrode peuvent varier en fonction de l'optimisation du système de détection et les différentes applications désirées. b. Protocole de mesure L'enzyme choisie admet de nombreux donneurs d'électrons possibles. Dans le cadre de l'application et au vu de la littérature (Volpe et al., Analyst, June 1998, Vol. 123 (1303-1307)), le donneur d'électrons utilisé pour cet exemple est le TMB. L'enzyme étant la HRP, l'oxydant est le peroxyde d'hydrogène. Le rapport de la concentration en peroxyde d'hydrogène sur la concentration en TMB est fixé à 5. Le volume total maximal de solution à analyser est fixé à 78 mL avec ce système. Les concentrations de réactifs : c'est-à-dire TMB et peroxyde d'hydrogène sont choisis de manière à ce que l'enzyme fonctionne à saturation. La quantité de TMB est inférieure à celle du peroxyde d'hydrogène pour limiter la réaction spontanée. L'électrolyte tampon choisi est un tampon citrate-phosphate pH = 5 à 0,1 mail-1 contenant aussi 0,1 mail-1 d'électrolyte NaCl. Un disque de 5 mm en platine est choisi comme surface active de l'électrode de travail. La vitesse de rotation de l'EDT est fixée à 1130 rpm. Avant toute mesure, une analyse du blanc (c'est-à-dire TMB et peroxyde d'hydrogène seuls en présence) est effectuée pour quantifier la part de la réaction spontanée sur le courant produit et donc sur les pentes à l'origine mesurées. Le mécanisme d'oxydation du TMB est un mécanisme à deux étapes (Josephy et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 257, n°7, Issue of April 10, pp. 36669-3675, 1982) générant deux formes oxydées du TMB : un composé intermédiaire oxydé partiellement noté TMBox1 lors de la première étape, et un composé oxydé totalement noté TMBox2 lors de la seconde étape. Il est au choix possible de doser TMBox1 ou TMBox2. Dans le cas où TMBox2 est dosé (Fanjul-Bolado et al., Anal. Bioanal. Chem. (2005) 382: 297- 302), le protocole de mesure comprend : - une étape d'incubation de la solution contenant au moins un biotraceur, les réactifs : TMB et peroxyde d'hydrogène, et l'électrolyte tampon. Cette étape d'incubation est réalisée dans la cellule de mesure ampérométrique pendant 1 à 30 min sous agitation, - une étape de rajout d'acide phosphorique concentré de manière à oxyder tout le TMBox1 possiblement présent en solution en TMBox2, - une étape de mesure de courant dans la minute suivant l'introduction de l'acide phosphorique. Dans cet exemple, le TMBox1 est préférentiellement dosé. Pour analyser un échantillon, celui-ci est introduit dans la cellule de mesure. La tension de polarisation est fixée à 240 mV. Le volume maximal échantillonable est fixé à 60 mL. Le volume de la cellule, déduit du volume des réactifs, est complété avec de l'électrolyte tampon. L'EDT est mise en rotation, cela suffit pour assurer le mélange du volume à analyser. Puis, le TMB est introduit et le peroxyde d'hydrogène à son tour. Dès l'introduction du peroxyde d'hydrogène, l'acquisition démarre. L'analyse est actuellement menée à température ambiante sans désoxygénation de la solution. Le temps d'acquisition pour le blanc est fixé à la durée maximale d'analyse. Le temps d'acquisition pour l'analyse des échantillons est choisi de manière à ce que le nombre de points acquis soit suffisant pour avoir une bonne précision sur la mesure de la pente Vo. La durée de l'analyse varie de 1 à15min. La figure 7a montre un exemple de courbes ampérométriques. Quatre volumes d'une même alimentation en biotraceurs ont été analysés, correspondant à quatre concentrations en biotraceurs dans la cellule de mesure, exprimées en unité de dénombrement de phages natifs : CO, 2,00 x CO, 4,65 x CO et 5,80 x CO. La figure 7b représente la droite de calibration associée à l'exemple (donnant les pentes mesurées en fonction des concentrations en traceurs dans la cellule). La linéarité de la pente avec la concentration en traceurs traduit le fait que, sur cette gamme de concentrations, le greffage peut être considéré comme uniforme. REVENDICATIONS1. Procédé de détection dans un échantillon à analyser d'un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. 2. Procédé selon la revendication 1, tel que ledit procédé de détection comprend: - la préparation d'une cellule ampérométrique comprenant : - une électrode de travail, - une contre-électrode, - une électrode de référence, ces trois électrodes étant reliées par un potentiostat-galvanostat ; - une solution comprenant l'échantillon à analyser et au moins un biotraceur comme défini ci-avant, - un électrolyte, - un oxydant, - un donneur d'électrons (R), et - la mesure par ampérométrie du courant ainsi généré. 9. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le donneur d'électron est choisi parmi le groupe composé de l'iodure ou du 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine. 10. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel l'électrode de travail est constituée d'un matériau choisi dans le groupe composé de platine, carbone vitreux ou or. 30 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2, 3 ou 4, dans lequel la contre électrode est une électrode de platine.256. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel l'oxydant est le peroxyde d'hydrogène. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que le bactériophage est un phage MS2. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, tel que l'électrolyte comprend en outre un tampon. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, tel que lesdites molécules de biotine activées sont choisies parmi les biotines aptes à réagir avec les groupes amines primaires. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes tel que ladite sonde enzymatique est un complexe contenant : - une protéine-support apte à interagir avec la biotine activée, et - une enzyme de type oxydo-réductase. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ladite protéine-support est choisie parmi la neutravidine, l'avidine ou la streptavidine. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, tel que ladite enzyme est la Horse Radish Peroxydase (HRP). 13. Procédé de contrôle d'un système de filtration comprenant : - l'introduction de un ou plusieurs biotraceur(s) constitué(s) d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée(s) préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage dans l'alimentation dudit système, - l'étape de détection de(s)dit(s) biotraceur(s) dans le perméat et/ou dans le rétentat dudit système de filtration par ampérométrie, selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.14. Procédé selon la revendication 13, comprenant en outre : - l'étape de détection de biotraceurs dans l'alimentation dudit système, puis - la comparaison du courant obtenu dans le perméat et/ou rétentat avec le courant obtenu dans l'alimentation. 15. Biotraceur constitué d'un bactériophage MS2 marqué, ledit bactériophage comprenant à sa surface une ou plusieurs sondes enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage. 16. Biotraceur selon la revendication 15, tel que la(les) sonde(s) enzymatique(s) et/ou la(les) molécule(s) de biotine activée(s) sont telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 17. Procédé de préparation du biotraceur selon l'une quelconque des revendications 15 au 16 comprenant les étapes suivantes : - accrochage d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée(s) à au moins une protéine présente à la surface du bactériophage à marquer, puis - greffage d'une sonde enzymatique à ladite (auxdites) biotine(s). 18. Procédé selon la revendication 17 comprenant en outre l'étape de purification du biotraceur marqué ainsi obtenu. 19. Procédé selon la revendication 18 tel que ladite purification est effectuée par High Performance Liquid Chromatography - Size Exclusion Chromatography (HPLC-SEC). 20. Procédé selon la revendication 17, 18 ou 19, comportant en outre une étape préliminaire de production des bactériophages à marquer par amplification, puis mise en suspension et purification.21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans lequel ladite molécule de biotine activée est accrochée à une lysine des protéines de surface du bactériophage. 22. Kit comprenant : - une solution comprenant au moins un biotraceur constitué d'un bactériophage marqué comprenant à sa surface une ou plusieurs sonde(s) enzymatique(s) greffée(s) par l'intermédiaire d'une ou plusieurs molécule(s) de biotine activée préalablement fixée(s) à une ou plusieurs protéine(s) de la capside dudit bactériophage, et - une cellule ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre-électrode, une électrode de référence, - un électrolyte, - un donneur d'électron, et - un oxydant. 23. Kit selon la revendication 22 comprenant en outre un tampon. 24. Kit selon la revendication 22 ou 23 tel que ladite solution, les dites électrodes et/ou biotraceur sont tels que définis selon l'une quelconque des revendications 2 à 12.