Brevet FR2947838A1 — publié le 20110114

MOYENS ET METHODES DE DETECTION ET D'IDENTIFICATION D'UNE NOUVELLE BACTERIE RESPONSABLE D'AFFECTIONS PHYTOSANITAIRES SUR DES PLANTES (COURGETTES) ET NOUVELLES PLANTES RESISTANTES Le domaine de l'invention est celui de la détection des infections (notamment bactériennes) sur des plantes, et en particulier sur des courgettes. Plus précisément, l'invention concerne des moyens, des méthodes et des kits de détection et d'identification des bactéries provoquant lesdites infections, ces moyens, méthodes et kits relevant de la biologie moléculaire et/ou de l'immunologie et/ou de la microbiologie. L'invention vise également une nouvelle bactérie responsable d'infections (notamment bactériennes) sur des plantes, et en particulier sur des courgettes. L'invention a trait par ailleurs à des méthodes d'identification et de création de plantes résistantes à cette nouvelle bactérie. La distribution et le commerce de semences implique pour les sociétés semencières la nécessité de fournir des semences exemptes, à certains seuils définis, de pathogènes et des maladies y associées, qu'ils soient d'origine virale, fongique ou bactérienne. En effet, la contamination d'une semence dans un lot peut éventuellement et rapidement déclencher une épidémie dans la serre ou dans le champ où les plantes issues de ces semences sont cultivées. Cette épidémie peut, selon les cas, ravager la culture du champ ou de la serre et induire des pertes considérables de rendement et donc d'exploitation pour l'agriculteur. Ainsi par exemple la bactérie Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis qui peut être présente sur les semences de tomate. Elle est transmise mécaniquement ou par les eaux d'irrigation et peut anéantir tout un champ de production en provoquant des flétrissements des plantes. Afin d'éviter ou de ralentir la propagation territoriale de certains pathogènes, le commerce international des semences est régulé, notamment par la nécessité de fournir des certificats phytosanitaires pour le transit des graines d'un territoire à l'autre. La qualité sanitaire des semences est donc un critère majeur pour leur commercialisation des semences et pour la gestion de la qualité sanitaire des cultures. Il est donc important de connaître l'état sanitaire des graines. Ainsi, les lots de semences contaminées, peuvent être soit traités ou décontaminés, soit détruits. La transmission de bactéries par la semence est une étape critique dans l'écologie de nombreuses bactéries phytopathogènes (micro-organismes ayant une écologie liée aux végétaux et qui sont capables d'attaquer des plantes) mais également dans l'épidémiologie des maladies qu'elles occasionnent. Les bactéries survivent dans les semences pendant des durées très longues pouvant même être supérieures à la durée de vie de la semence. Dans certaines circonstances dépendant des agents pathogènes et des régimes climatiques, la semence contaminée représente l'unique source d'inoculum dans une culture. Pouvoir contrer cette source d'inoculum représente donc un enjeu majeur pour lutter efficacement contre les bactéries phytopathogènes. La lutte contre ces bactéries passe par leur détection et leur identification. Les techniques traditionnelles de détection et d'identification de bactéries phytopathogènes sur semences se répartissent généralement en deux catégories : 1) les techniques � classiques � d'isolement des souches sur des milieux sélectifs, suivies de test de pathogénicité consistant en des inoculations de souches isolées sur plantes témoin saines. 2) les autres techniques développées récemment basées sur des réactions immunologiques de type ELISA qui sont rapides, simples d'utilisation et peu coûteuses. Par ailleurs, il est important de pouvoir rapidement diagnostiquer, dans une serre ou dans un champ, l'apparition d'un pathogène afin de pouvoir prendre les mesures de sauvegarde adéquates de la culture. Plus l'identification est rapide et précise, plus les actions de lutte seront efficaces. Des mesures rapides permettent généralement de diminuer les doses des traitements appliqués sur la culture. Ces traitements ayant un coût économique et environnemental, leur diminution est importante pour l'agriculteur. Les plantes particulièrement visées par l'invention sont les courgettes et les infections bactériennes susceptibles de les affecter. Plus précisément, on s'intéresse dans ce qui suit à la courgette Cucurbita pepo qui est une plante annuelle à tige courte, à port dressé dans ses premiers stades de développement, sans ramification, à feuilles de grande dimension, longuement pétiolées, découpées et rugueuses. La plante est monoïque, à grandes fleurs jaunes et à fruit de couleur et de morphologie très variables (J.Y. Péron 2006 Lavoisier: économie de la courgette 327-328). En France, la production de courgette est concentrée dans le sud est qui représente 60% des surfaces, tant en production de serre que de plein champs. La production de 2008 représente environ 134 000 tonnes, en production de frais et en production pour la transformation. Si la France exporte environ 20 000 tonnes de courgettes, elle en importe surtout 100 000 tonnes, principalement de l'Espagne, du Maroc et d'Italie qui sont aussi des pays de production (Note Agreste Conjoncture, Novembre 2008). Les graines et plantes de courgettes peuvent subir divers types d'agression de pathogènes, qu'ils soient de nature virale, fongique ou bactérienne. Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention est de comprendre et d'identifier les causes des affections phytosanitaires des plantes et des semences, et en particulier des courgettes. Un autre objectif essentiel de l'invention est de mettre au point des moyens, des méthodes et des kits efficaces, fiables, rapides, spécifiques et économiques de détection et d'identification des agents pathogènes, notamment des bactéries, responsables de ces affections phytosanitaires. Un autre objectif essentiel de l'invention est que ces moyens, des méthodes et des kits de détection et d'identification puissent être mis en oeuvre sur des échantillons, de préférence végétaux, et, plus préférentiellement encore sur des graines (semences), des plantes entières, des parties de plantes, ou sur les sols de culture (en plein air ou sous abri) afin de vérifier son éventuelle contamination par ladite bactérie. Un autre objectif essentiel de l'invention est de mettre au point des moyens et des méthodes performants de lutte contre ces affections phytosanitaires, telles que des moyens et des méthodes d'identification, voire de création, de plantes résistantes à ces affections phytosanitaires. DESCRIPTION SOMMAIRE DE L'INVENTION S'étant fixé ces objectifs, parmi d'autres, il est du mérite de la demanderesse d'avoir récemment identifié dans des lots de semences et sur des plants de courgettes Cucurbita pepo une nouvelle bactérie pathogène responsable de symptômes, qui, jusqu'alors, n'étaient pas corrélés à une bactériose. Cette nouvelle bactérie pathogène provoque des nécroses sur les cotylédons des plantules, des décolorations sur les jeunes feuilles, un rabougrissement de la plante et le blocage de son développement. Une attaque plus tardive dans le développement de la plante provoque des nécroses sur les feuilles, nécroses brunes entourées d'un halo jaune et dans ce cas l'incidence sur la production est seulement mineure. Cette nouvelle bactérie a été identifiée et caractérisée par les inventeurs comme étant une bactérie du type Pseudomonas syringae, nommée Pseudomonas syringae pv. Peponis, en raison de sa spécificité sur les courgettes. Pseudomonas syringae est une bactérie gram négative, pathogène des plantes et dont les souches sont définies suivant leur capacité à attaquer certains hôtes. Des souches spécifiques ont été définies sur plus de 50 espèces végétales qu'elles sont susceptibles d'attaquer. Les Pseudomonas sont un groupe large et très ubiquiste. Forts de cette avancée, les inventeurs ont également développé de nouvelles techniques de détection et d'identification de ces bactéries phytopathogènes et donc de diagnostic des 35 maladies phytosanitaires subséquentes. Les objectifs susvisés, parmi d'autres, sont ainsi atteints par la présente invention qui concerne tout d'abord une nouvelle bactérie responsable des symptômes évoqués ci- dessus, à savoir la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM I-4159. Cette bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis a été identifiée et caractérisée par des techniques faisant appel notamment: • à la biologie moléculaire, • à l'immunologie, • à la microbiologie, • à des tests comparatifs sur des cultures comprenant des témoins positifs contaminés voire des témoins négatifs sains. Cela a ouvert l'accès à de nouvelles techniques de détection et d'identification qui allient sensibilité, spécificité et facilité d'utilisation et qui sont applicables sur des échantillons de type sol, semences, plante entière ou partie de plante. Les techniques de biologie moléculaire sont notamment l'hybridation de sondes spécifiques de séquences d'acides nucléiques de ladite bactérie ou l'amplification génétique. C'est ainsi qu'ont été mis au point des tests de détection PCR (Polymerase Chain Reaction) sur des bactéries du haricot (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) et sur des bactéries de la tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis). Les techniques immunologiques sont par exemple de type ELISA. Les techniques microbiologiques sont notamment des cultures cellulaires et des études 20 biochimiques et morphologiques. L'invention a également pour objet: • Des nouveaux moyens (ou outils) de biologie moléculaire, à savoir des marqueurs moléculaires (sondes et amorces) spécifiques de la nouvelle bactérie identifiée Pseudomonas syringae pv. Peponis; (par exemple sonde formée par tout ou partie de la 25 séquence nucléotidique SEQ ID N°11 ou SEQ ID N°12 et amorces par exemple choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°9 ou SEQ ID N°10). • De nouveaux anticorps aptes à reconnaitre et à se lier de manière spécifique à la nouvelle bactérie identifiée Pseudomonas syringae pv. Peponis. • De nouvelles méthodes d'identification et de détection de cette nouvelle bactérie 30 dans un échantillon donné. Ces méthodes peuvent être mises en oeuvre à l'aide de divers techniques et moyens susvisés de biologie moléculaire, d'immunologie, de microbiologie et de cultures comparatives de plantes. • Des nouveaux kits de détection de la nouvelle bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant au moins un desdits moyens (outils) susmentionnés pour la mise en 35 oeuvre d'au moins une desdites méthodes de d'identification et de détection de la nouvelle bactérie. • L'utilisation de l'une des méthodes et/ou de l'un des outils de la présente invention pour identifier la présence de la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis dans un lot de graine, sur une plante, sur une plantule, sur une partie de plante, voire dans un sol. • Une nouvelle méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant l'inoculation d'au moins une plante avec la bactérie et l'identification de la plante qui ne présente pas les symptômes de sensibilité à la bactérie. • Une nouvelle méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en oeuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. • Une nouvelle méthode de création de plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis comprenant l'identification d'une première plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, son croisement avec une plante sensible à ladite bactérie et l'identification dans la descendance de ce croisement de plante résistante à la bactérie. • Une nouvelle méthode de sélection d'un lot de semences caractérisé en ce qu'il met en oeuvre au moins l'une des méthodes et/ou au moins l'un des outils de diagnostics selon la présente invention pour identifier la contamination dudit lot de semence par la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis. Il est bien évident que les méthodes de détection de la nouvelle bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis peuvent être utilisés séparément ou bien de manière combinée. Ainsi la nouvelle bactérie identifiée peut être détectée au moyen de techniques de biologie moléculaire et/ou au moyen de techniques d'immunologie et/ou e microbiologie et/ou au moyen d'un milieu de culture spécifique. Ces nouveaux moyens et méthodes permettent de déterminer si les graines (semences) ou les plantes sont infectées par cette nouvelle bactérie et donc affectées par la maladie correspondante. Selon un aspect particulier de l'invention, la plante est une plante de la famille des cucurbitacée, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. DEFINITIONS Afin de mieux comprendre l'invention, il convient tout d'abord de rappeler ou de donner quelques définitions. Au sens de la présente demande :35 - Par plante, on entend par exemple un végétal à quelque stade de développement que ce soit, notamment : graine, embryon, ou tout autre stade plantule ou de la plante adulte. - Par courgette, on entend par exemple une plante du genre Cucurbita. La courgette est notamment un ensemble de cultivars de l'espèce Cucurbita pepo et de la sous-espèce Cucurbita pepo ssp. pepo. - Par marqueur moléculaire, on entend par exemple un fragment spécifique d'une séquence d'ADN pouvant être identifiée au sein du génome d'un individu et pouvant être notamment utilisée pour localiser un gène d'intérêt, vérifier si un individu a hérité d'une caractéristique particulière d'un parent ou différencier des individus. Il peut s'agir ou non d'une séquence codante. Le marqueur peut être dominant, co-dominant. La détection du marqueur moléculaire, ou sa non-détection, permet de sélectionner les individus présentant le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière, ou au contraire, de ne pas sélectionner les individus ne présentant pas le gène d'intérêt ou la caractéristique particulière. Dans la présente invention, les marqueurs moléculaires permettent de tester rapidement les bactéries, les graines, les plantes ou les parties de plantes et d'identifier les bactéries comme étant ou pas des bactéries Pseudomonas Syringae pv. peponis, et/ou de diagnostiquer la présence ou l'absence de cette bactérie sur les graines, les plantes ou les parties de plantes analysées. Un marqueur moléculaire spécifique selon la présente invention sera un marqueur moléculaire identifiant spécifiquement la bactérie Pseudomonas Syringae pv. peponis. Il permet de différencier cette bactérie d'autres bactéries, notamment d'autres bactéries Pseudomonas. Le marqueur 4Ba est un tel marqueur moléculaire spécifique. - Par partie de plante on entend notamment le pollen, les ovules, les embryons, les feuilles, les anthères, les tiges, les pétioles, les racines, les fruits, les graines, les fleurs, les bourgeons, les protoplastes, les cals, les cellules et tissus cellulaires. - Par résistance d'une plante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis on entend par exemple la capacité d'une plante à restreindre la croissance et le développement de la bactérie et! ou les dommages qu' ils occasionnent, en comparaison avec des plantes sensibles et dans des conditions similaires, environnementales et de pression de cette bactérie Les plantes résistantes peuvent exprimer quelques symptômes de la maladie ou quelques dommages en cas de forte pression de la bactérie. - Par sensibilité d'une plante à la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, on entend par exemple l'incapacité d'une plante à restreindre la croissance et le développement de la bactérie, développant alors les symptômes de nécroses sur les cotylédons des plantules, de décolorations sur les jeunes feuilles, de rabougrissement de la plante et du blocage de son développement. - Par gène de ménage on entend par exemple des gènes qui interviennent dans les métabolismes principaux, gènes communs à toutes les bactéries, codant pour des fonctions essentielles - Par amorce, on entend une séquence artificielle d'ADN, courte (de 4 à 30 paires de bases) 5 complémentaire d'un des brins du fragment d'ADN que l'on souhaite amplifier par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou que l'on souhaite séquencer. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION 10 Les inventeurs ont donc levé le voile sur un problème phytosanitaire lié aux cultures de courgettes Cucurbita pepo. Ce problème se manifeste principalement par les nécroses foliaires sur jeunes plantules. En conditions de basse température, les symptômes peuvent devenir systémiques, provoquant des éclaircissements sur jeunes feuilles et un blocage des plantes. Une attaque tardive sur plantes adultes se manifestera par la présence 15 de nécroses entourées d'un halo jaune sur les feuilles, sans grand dommage sur le rendement. C'est au niveau jeune plant que les dommages sont les plus marqués et aussi à ce stade que la transmission de plantules à plantules est la plus dangereuse. Ce problème affectant largement le rendement des plantes, il est apparu indispensable aux inventeurs d'identifier cette nouvelle bactérie et de fournir des procédés d'identification, de 20 caractérisation de celle-ci mais aussi de fournir des procédés permettant de détecter la présence ou l'absence de cette bactérie sur un échantillon donné, de préférence un échantillon de plante ou de graine donnée, de préférence de courgette. L'identification d'un nouveau problème phytosanitaire sur des cultures de 25 courgettes manifesté par des symptômes de nécrose foliaires encore jamais vus sur de jeunes plantules à conduit les présents inventeurs à identifier une nouvelle bactérie déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM I-4159. Cette nouvelle bactérie a été identifiée par les présents inventeurs comme une bactérie Pseudomonas syringae, et, de part sa présence sur des graines de courgettes, a été 30 nommée Pseudomonas syringae peponis. Selon un autre objet de l'invention, la bactérie Pseudomonas syringaea peponis comprend au moins une séquence d'acides nucléiques sélectionnée parmi les séquences nucléiques SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°10, SEQ ID N°11, SEQ ID N°12 et SEQ ID N°13. 35 La qualité sanitaire des semences étant un caractère majeur pour la commercialisation des semences et pour la gestion de la qualité sanitaire des cultures, il est capital de pouvoir disposer de moyens d'identification de la présence ou de l'absence d'une bactérie dans un échantillon, que cet échantillon soit une graine, une plante, une partie de plante, voire éventuellement un sol d'un champ ou de serre. Les présents inventeurs ont donc développé divers moyens et méthodes d'identification et de détection de la bactérie Pseudomonas syringae peponis ainsi que les moyens (outils) permettant la mise en oeuvre desdites méthodes. Moyens d'identif cation et_de détection relevant de_la biologie moléculaire Sondes: La présente invention a pour objet : Un marqueur moléculaire 4Ba de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus. Un marqueur moléculaire 4Ba caractérisé en ce qu'il est défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°10 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10. Un marqueur moléculaire 4Ba caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend tout ou partie de la SEQ ID N°11 ou de la séquence SEQ ID N°12 (séquence complémentaire de SEQ ID N°11). Un des objets de la présente invention concerne également la séquence d'acide nucléique isolée consistant en tout ou partie de la séquence SEQ ID N°11 ou de la séquence SEQ ID N°12, caractérisée en ce qu'elle permet la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Cette séquence d'acide nucléique permet de réaliser au moins une sonde d'acides nucléiques spécifique de ce marqueur 4 Ba et en particulier de tout ou partie de SEQ ID N°11 ou SEQ ID N°12. Ces sondes sont des séquences d'ADN ou d'ARN marquées (par un composé fluorescent, un radioisotope, ou une enzyme ou tout autre molécule adaptée) que l'on utilise pour détecter des séquences homologues (complémentaires) par hybridation in situ ou in vitro avec leur séquence nucléique complémentaire. Elles permettent alors la détection et/ou la localisation du marqueur 4Ba et par conséquent de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, objet de la présente demande. De préférence, selon la présente invention, on préférera les sondes d'ADN. La réalisation et l'utilisation des sondes marquées faisant appel à des techniques largement connues de l'homme de l'art, elles ne seront pas rappelées dans le présent exposé. Amorces: La présente invention a pour objet une (ou plusieurs) amorce(s) nucléotidique(s) pour la détection et l'identification de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend a. de 10 à 30 acides nucléiques dont au moins 8 acides nucléiques consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°9 intégrale; b. de 10 à 30 acides nucléiques dont au moins 8 acides nucléiques consécutifs de la séquence SEQ ID N°10, et, de préférence, la séquence 10 SEQ ID N°10 intégrale; c. de 8 à 30 acides nucléiques de la séquence SEQ ID N° 11; d. de 8 à 30 acides nucléiques de la séquence SEQ ID N° 12; ou e. un couple d'amorces comportant une première amorce (a) et/ou (c) et une seconde amorce (b) et/ou (d). 15 De manière encore plus préférée, l'amorce nucléotidique comprend la séquence SEQ ID N°9 ou la séquence SEQ ID N°10. Méthodes d'identi fii_cation_et de_détection relevant de labiol_ogie moléculaire La présente invention a pour objet une méthode de détection et d'identification de 20 bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie supra, dans un échantillon, à l'aide d'un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs susdéfinis et/ou au moins une amorce susdéfinie. De préférence, le moyen de biologie moléculaire comprend: - une sonde d'ADN spécifique de tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 11 ou de 25 la SEQ ID N° 12 permettant une hybridation, et/ou - un couple d'amorces (e) tel que défini supra permettant une amplification en chaîne par polymérase (PCR Polymerase Chain Reaction). Selon un mode préféré de la présente invention, la méthode d'identification et de détection 30 de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon est caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'un marqueur moléculaire spécifique de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Ce marqueur moléculaire est amplifié dans le génome de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis alors qu'il ne l'est pas dans le génome des autres bactéries Pseudomonas syringaea. 35 Moyens et_méthodes d'identification et de détection relevant de l'immunologie L'invention a également pour objet un anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie supra et une méthode immunologique de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon à l'aide de cet anticorps. Selon une variante possible, la méthode de détection immunologique comprend une première étape de traitement d'un échantillon en vue d'en extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis, puis la mise en contact dudit échantillon traité avec un anticorps spécifique de ladite bactérie. Moyens et_éthodes_'identification_et_de détection relevant_e a_microbiolo.ie Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisé en ce qu'elle consiste à mettre en oeuvre un milieu de culture spécifique LBCA additionné ou non de lincomycine. Ce milieu de culture permet d'une part d'inhiber la croissance de la plupart des autres souches bactériennes se trouvant dans l'échantillon à analyser et d'autre part d'identifier la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis grâce à son caractère levane parmi les éventuelles souches bactériennes qui pourraient croître dans le milieu. Moyens_e_méthodes d'identifiçation et_..__détection_relevant_de_cultures comparées__de 20 plantes Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon végétal, caractérisée en ce qu'elle comprend : (1) le traitement dudit échantillon, de préférence par broyage ou macération, en vue 25 d'extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis, (2) l'inoculation de plantes ou de graines exemptes de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis avec l'extrait obtenu en (1), (3) la culture desdites plantes ou graines inoculées issues de l'étape (2), (4) la comparaison morphologique des plantes ou graines issues de l'étape (3) avec 30 des plantes issues de plantes ou de graines inoculées avec la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, pour en déduire l'infection ou la non-infection de l'échantillon objet de la détection et de l'identification. De préférence, l'échantillon est issu d'une plante sélectionnée parmi les plantes de la 35 famille des cucurbitacées, une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis et une plante de courgette cucurbita pepo. Combinaisons Une variante de la présente invention consiste à combiner les moyens et/ou les méthodes de détection de la Pseudomonas syringaea peponis. L'invention vise donc une méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle combine au moins deux méthodes choisies dans le groupe comprenant : i. La méthode relevant de la biologie moléculaire; ii. La méthode relevant de l'immunologie ; iii. La méthode relevant de la microbiologie; iv. La méthode relevant de cultures comparées de plantes. Une variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'un milieu de culture sélectif LBCA additionné ou non de lincomycine combinée avec la mise en oeuvre d'un moyen de biologie moléculaire pour la détection et l'identification de la bactérie. Ainsi, la nature des bactéries qui se développent sur le milieu sélectif et qui présentent le caractère levane est confirmé par l'analyse de marqueur moléculaire et/ou d'une sonde spécifique d'une séquence génétique de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. De manière alternative, une autre variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection et d'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'un milieu de culture sélectif LBCA additionné ou non de lincomycine combinée avec la mise en oeuvre d'un moyen immunologique pour la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Ainsi, la nature des bactéries qui se développent sur le milieu sélectif et qui présentent le caractère levane est confirmé par la reconnaissance de l'anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. De manière encore alternative, une autre variante préférée de l'invention consiste en une méthode de détection de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'un moyen immunologique selon un des aspects de la présente invention et la mise en oeuvre d'un moyen de biologie moléculaire selon un des aspects de la présente invention pour la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Dans ce dernier cas, la mise en oeuvre du moyen immunologique peut suivre ou bien précéder la mise en oeuvre du moyen de biologie moléculaire. Echantillons La détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon les différents aspects de la présente invention peut être réalisée sur graine, une plante, une partie de plante ou un sol. La détection peut être réalisée sur la graine notamment lorsqu'il s'agit de déterminer l'état sanitaire d'un lot de graine, c'est-à-dire sa contamination éventuelle par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. La détection peut être réalisée sur une plante, sur une plantule ou sur une partie de plante notamment avant un transfert de la plante et ou de la plantule entre deux localisation, par exemple entre une serre ou la plantule se développe initialement et un champ ou elle est transplantée pour achever sa croissance et porter des fruits. La détection peut aussi être faite sur une plante, sur une plantule ou sur une partie de plante lorsque l'infection par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est suspectée, que des symptômes soient déjà présent ou pas encore. L'identification la plus rapide et la plus précise de la contamination d'une graine, d'une plante ou d'une plantule permet de prendre les mesures de sauvegarde adéquates, qu'il s'agisse de décontaminer les graines ou de traiter la plante ou la plantule. La détection peut encore être envisagée sur un échantillon de sol, par exemple dans un champ ou dans une serre dans lequel une culture de plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est envisagée. En cas de contamination avérée du lieu de culture envisagée, une autre plante pourra être semée, par exemple une plante résistante à la bactérie, ou les moyens de luttes mis en oeuvre très rapidement, avant même l'apparition des premiers symptômes. Avantageusement, la détection de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon les différents aspects de la présente invention est réalisée sur une graine, une plante, une partie de plante d'une plante de la famille des cucurbitacée, de manière préférée d'une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. Kits La présente invention concerne également un kit pour la détection et l'identification de la bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il 30 comprend : un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs susdéfinis et/ou au moins une amorce susdéfinie, et/ou au moins un anticorps susdéfini, et/ou au moins un milieu de culture LBCA additionné ou non de lincomycine. 12 35 ldentifiçation de_plantes résistantes La présente invention vise également une méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend : l'inoculation d'au moins une plante, d'au moins une graine ou d'au moins une partie de plante avec cette bactérie, puis l'identification de la ou des plante(s) résistante(s) ne présentant pas les symptômes de sensibilité à cette bactérie. Un autre objet de l'invention peut être la méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en oeuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la présente demande. Avantageusement, cette plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo réation de_plantes résistantes La présente invention concerne encore une méthode de création de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis caractérisée en ce qu' elle comprend : (1) l'identification d'une plante résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, (2) le croisement de cette plante résistant avec une plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, et (3) l'identification de plante résistante dans la descendance de la plante issue de l'étape (2). Avantageusement, la plante identifiée comme résistante à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. La plante sensible à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis est une plante de la famille des cucurbitacées, de manière préférée une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis tel que notamment cucumis melo (melon) ou cucumis sativus (concombre), de manière encore préférée une plante de courgette cucurbita pepo. Selon un mode préféré de l'invention le croisement de la plante résistante avec la plante sensible est réalisée entre des plantes de même espèce, par exemple un croisement entre deux plantes de cucurbita pepo, entre deux plante de cucumis melo voire entre deux plantes de cucumis sativus. Toutefois, le croisement peut aussi avoir lieu au sein du même genre, par exemple entre une plante cucurbita pepo et une plante cucurbita moschata. La mise en oeuvre et la réalisation de ces croisements est connue de l'homme du métier. Sélection d'un lot de semence Selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode de sélection d'un lot de semence caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre : la méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie ci-dessus, dans un échantillon, selon laquelle on met en oeuvre au moins l'une des méthodes choisies dans le groupe comprenant : i. La méthode relevant de la biologie moléculaire; ii. La méthode relevant de l'immunologie iii. La méthode relevant de la microbiologie; iv. La méthode relevant de cultures comparées de plantes, et/ou la méthode d'identification d'une plante résistante susdéfinie, - et/ou le kit de détection et d'identification susdéfini. Par sélection d'un lot de semence, on entendra l'identification d'un lot de semence qui puisse être directement vendu, transféré, que ses graines soient mises en culture dès que le lot sera identifié et diagnostiqué comme non contaminé par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis alors qu'un autre lot devra être soit décontaminé soit détruit lorsqu'il sera diagnostiqué contaminé par la bactérie Pseudomonas syringaea peponis. Bien évidemment, la méthode de sélection d'un lot de semence selon l'invention peut combiner au moins deux des méthodes i., ii., iii. et iv. évoquées ci-dessus. Cette méthode de sélection d'un lot de semence peut mettre en oeuvre au moins le marqueur moléculaire 4 Ba tel que défini précédemment, et/ou au moins une amorce spécifique du marqueur moléculaire 4Ba telle que définie précédemment, et /ou au moins l'anticorps apte à reconnaitre la bactérie selon l'invention tel que défini précédemment, et/ou le kit de détection de la bactérie, et/ou au moins l'une des méthodes de détection telles que mentionnées ci-dessus. EXEMPLES : I/ Identification d'une nouvelle souche bactérienne: I/Analyse biochimique de la souche bactérienne inconnue. Les présents inventeurs ont identifié différents lots de graines de courgettes Cucurbita pepo contaminés par une bactérie dont les symptômes de nécrose foliaires sur les jeunes plantules qui sont issues de ces graines sont, jusqu'à présent, inconnus. Les bactéries sont extraites des semences de courgette par broyage avec un broyeur à marteau de type 14 Stomacher durant 10 minutes dans un sachet prévu à cet effet. Les souches de bactéries issues des différents échantillons de graines de courgettes contaminés sont nommées de A à F. La caractérisation de ces bactéries est réalisée par différents tests biochimiques qui permettent de vérifier si la bactérie à un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s'il y a formation d'un acide à la suite de l'utilisation d'un hydrate de carbone (sorbitol), si un composé particulier est utilisé comme seule source de carbone, si un acide aminé peut être transformé (arginine), si un enzyme particulier peut être présent (oxydase) ou si des molécules complexes peuvent être dégradées (gélatine) : Ces différents test sont bien connus de l'homme de l'art lors de l'identification de bactéries. Ces derniers permettent d'identifier la bactérie inconnue comme une bactérie du type Pseudomonas syringaea (cf tableau 1). Tableau 1 : tests biochimiques pour déterminer la nature des bactéries inconnues Souche gram arginine Oxydase gélatine Nitrate Levane King B tabac Souche A - - - + .. + - + Souche B - - - + - + - + Souche C - - - + - + - + Souche D - - - + - + - + Souche E - - - + - + - + Souche F - - - + - + - + Souche esculine pectine saccharose DL lactose L+ tartrate D-tartrate érythritol Mannitol Souche A + - + + - - + + Souche B + .. + + - - + + Souche C + .. + + - - + + Souche D + - + + - - + + Souche E + - + + - - + + Souche F + - + + - - + + Souche sorbitol Tween 80 Dnase PP pH5 PP pl-18 H&L Souche A + + - - - oxydatif Souche B + + - - - oxydatif Souche C + + - - - oxydatif Souche D + + - - - oxydatif Souche E + + - - - oxydatif Souche F + + - - - oxydatif PP signifie polypectate. Au vu des résultats obtenus sur les différents tests pratiqués et répertoriés dans le tableau 1 ci-dessus, la bactérie inconnue a pu être identifiée comme une bactérie du type Pseudomonas syringaea. L'année suivante, 10 nouveaux lots de graines de courgettes contaminés par la bactérie inconnue sont identifiés par les inventeurs et les bactéries contaminantes isolées. : A partir de plantes présentant des symptômes (nécroses) sur cotylédons ou feuilles, les isolements pour identification sont réalisés ; un prélèvement des nécroses est réalisé et cette partie du tissu végétal est dilacérée dans l'eau et en condition stérile. Un extrait du liquide où la bactérie est supposée présente est étalé dans une boîte de Pétri contenant un milieu artificiel classique permettant une croissance bactérienne. Ces boîtes sont positionnées dans une étuve à 30°C favorable à la croissance bactérienne. Le développement et l'isolement de colonies bactériennes sont le point de départ de l'identification plus précise par la suite des tests biochimiques. Ces dernières sont nommées de PsW1 à PsW1 0. Les premières expériences ayant orienté l'identification des bactéries inconnues vers des bactéries de type Pseudomonas syringae, des analyses biochimiques spécifiques à l'analyse des bactéries Pseudomonas syringae sont réalisées afin de confirmer la nature des bactéries PsW1 à PsW10. Ces tests LOPAT sont la production de levane (la polymérisation du fructose en polyfructose), la présence d'oxydase (la détermination de la présence de l'enzyme cytochrome C oxydase), la dégradation de la pectine (la détermination de la présence de pectinases), la présence d'arginine déshydrolase (la transformation de l'arginine par l'arginine déshydrolase) et l'hypersensibilité au tabac (la mise en évidence du pouvoir pathogène d'une bactérie par le dessèchement des zones d'inoculation sur les feuilles de tabac). Une analyse sur milieu Hugh et Leifson (H&L) permet de déterminer la voie métabolique du glucose. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous : Tableau 2 : tests LOPAT pour confirmer la nature des bactéries inconnues Souche Levane Oxydase Pectine Arginine tabac H&L PsW 1 + - - - + oxydatif PsW2 + - - - + oxydatif PsW3 + - - - + oxydatif PsW4 + - - - + oxydatif PsW5 + - - - + oxydatif PsW6 + - - - + oxydatif PsW7 + - - - 4- oxydatif PsW8 + - - - + oxydatif PsW9 + - - - + oxydatif PsW I O - - - - - fermentatif Les analyses confirment que les souches de la bactérie inconnue PsW 1 à PsW9 sont bien des souches de bactéries Pseudomonas syringae ayant les mêmes caractères que les six souches initiales A à E. Seule la souche PsW 10 présente des différences et ne correspond donc pas à une souche de bactérie Pseudomonas syringae. Une vérification morphologique est alors réalisée au moyen d'un microscope sur des bactéries à l'état frais (bactéries en pleine croissance ; isolée sur un milieu artificiel en boîte de Pétri, généralement à 30°C, après 48h): toutes les souches sont morphologiquement identiques sauf la souche PsW1O. La microscopie montre, pour les souches PsWI à PsW9, des bacilles long à moyen, isolés ou plus rarement groupés par deux, mobiles et ayant un déplacement aléatoire. La souche PsW10, quant à elle, est un bacille très court ovoïde (cocobacile), statique donc non flagellé, groupé souvent par 2. Ces différentes analyses permettent de confirmer que la nouvelle bactérie inconnue est du type Pseudomonas syringae. 2/Analyse de la séquence nucléotidique du gène rrs codant l'ARNI6S : Résultat du séquençage et de l'analyse du gène rrs codant l'ARN 16S (SEQ ID N°13) : GTCGAGCGGCAGCACGGGTACTTGTACCTGGTGGCGAGCGGCGGACGGGTGA GTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGCTCGGAAACGGACGC TAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCT ATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAG GCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGAC ACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCG AAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGTTTTGACGTTA CCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGA GGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTG TTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTG GCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATAC TGACACTGAGGTGCGAAAGCGTNNANAGCAAACAGNNTTAGATACCCTGGTA GTNNACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTG GCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGA GATGGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCT TAGTTACCAGCACATTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTAC ACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTA ATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAG CTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG La recherche de séquences homologues dans les banques de données de séquences nucléiques par le logiciel BLASTn a abouti à trouver une homologie très forte avec des séquences de Pseudomonas fluorescent oxydase-négatif. La première séquence affichée est celle de P. s. pv. glycinea (1417 sur 1426 bases analogues). Ce gène n'est cependant pas suffisamment discriminant pour conclure sur l'identité de l'espèce bactérienne et a fortiori du pathovar auquel appartient la souche. 3/Analyse de la diversité génomique des souches : Pour étudier la diversité génomique des souches et préciser leur identité phylogénétique, les présents inventeurs ont choisi deux gènes de ménage gyrB qui code pour la sous unité 13 de la gyrase bactérienne et rpoD qui code pour le facteur sigma de l'ARN polymérase tels qu'identifiés en 2000 par S. Yamamoto et al. dans �Phytogeny of the genus Pseudomonas / intragenic structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes � Microbiology (2000), 146, 2385-2394. L'ADN est extrait selon la méthode décrite par Llop et al. Journal of Microbiological Method (1999), 37, 23-31, les gènes étant amplifiés par PCR classique suivant la méthode et avec les amorces décrites par Yamamoto. Le séquençage des amplifications est réalisé par la société Genescreen. Pour le gène gyrB UP-1E: 5' CAGGAAACAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA 3' (SEQ ID N°1) APrU: 5' TGTAAAACGACGGCCAGTGCNGGRTCYTTYTCYTGRCA 3' (SEQ ID N°2) M13: 5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3' M13R: 5' CAGGAAACAGCTATGACC 3' Pour le gène rpoD Amorce sens (ou F pour Forward) 70F : 5' ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT 3' (SEQ ID N°3) Amorce anti-sens (ou R pour Reverse) 70R : 5' ATAGAAATAACCAGACGTAAGTTNGCYTCNACCATYTCYTTYTT3' (SEQ ID N°4) Les séquences nucléotidiques obtenues sont identiques pour toutes les souches de la 5 bactérie inconnue (de la souche A à la souche F), tant pour le gène gyrB que pour le gène rpoD. Séquence consensus du gène rpoD de la bactérie Pseudomonas responsable de la maladie sur courgette (SEQ ID N°5): 10 CGAAATCGCCAAACGTATCGAAGAAGGCATCCGTGAAGTGATGGGCGCAATC GCGCACTTCCCAGGCACGGTTGACCACATTCTCTCCGAATACACACGCGTCAC CAGTGAAGGCGGTCGCCTTTCCGATGTTCTGAGTGGCTATATCGACCCGGACG ACGGCATTGCGCCGCCTGCCGAAGTCCCGCCGCCTGTCGACCCCAAGGCCGTC 15 AAGGCCGAAGGTGCCGATGACGACGAGGAAGAGTCGGCAGACGCCAGCGACG AAGAAGACGAAGTCGAGAGCGGTCCTGATCCGGTCATCGCCCAGCAGCGCTTC GGTGCGGTTTCCGATCAAATGGAAATCACCCGCAAGGCCCTGAAGAAATTTGG TCGCGACGACAAGCACGCCATTGCCGAAATGGTTGCACTGGCCGAACTGTTCA TGCCGATCAAACTGGTTCCAAAACAGTTTGAAGGCCTGGTGGAGCGTGTACGC 20 GGTGCCCTTGAGCGTCTTCGTGCCCAGGAACGCGCCATCATGCAGCTGTGTGT ACGTGATGCACGTATGCCGCGCGCCGACTTCCTGCGCCAGTTCCCGGGCAACG AAGTTGACGAAAGCTGGACTGACGCACTGGCCAAGGGCAAGAGCAAATACGC CGAAGCCATCGGTCGCCTGCAGCCTGACATCCAGCGTTGCCAGCAGAAGCTGT CCGCACTGGAAGAAGAGACCGGCCTGAAAATCGCCGAGATCAAGGACATCAA 25 CCGTCGCATGTCGATCGGTGAGGCCAAGGCCCGCCGCGCGAA Séquence consensus du gène gyrB de la bactérie Pseudomonas responsable de la maladie sur courgette (SEQ ID N°6): GCGATATCCAGTGCGCCTTTACGACGGGTCATCTCACGCGCCTTGCGCGCAGC 30 TTCACGGGCACGGGCTGCGTCGATCATCTTGCCGACAACCGCTTTGGCTTCATT CGGGTTTTCCAACAGGAAGTCGGAGAAGTACTTGCCCATTTCCTGTTCGACAG CCGTTTTGACTTCGGACGAAACCAGCTTGTCCTTGGTCTGCGAGCTGAACTTTG GATCAGGCACCTTGACCGAAATGATCGCCGTCAGACCTTCACGCGCGTCATCG CCAGTGGTCGCGACCTTGTGCTTCTTGGCCAGACCTTCCTGCTCGATGTAGTTG 35 TTCAGGTTGCGCGTCAACGCAGAACGGAAACCCACCAGGTGAGTACCGCCATC ACGCTGCGGGATGTTGTTGGTGAAGCACAGCAGGTTCTCGTTGAAGCTGTCGT TCCACTGCAGAGCAATTTCGACACCGATACCGTCATCACGCTGAATGTTGAAG TGGAACACTTCGTTGACCGGCGTTTTATTGGTGTTCAGGTACTCAACGAACGCG CGCAGACCGCCTTCGTATTTGAACAATTCTTCCTTACCGCTGCGCTCATCCTTG AGGACAATGCCGACACCGGAGTTCAGGAAGGACAGTTCACGAATCCGCTTGGC CAGAATGTCCCAGCTGAAGTGGATGTTCTTGAACGTTTCAGCGGAAGGCTTGA AGTGGATCTGAGTGCCTGTGCTGTCACTTTCACCGACGATCTTCATCGGTTCCT GTGGAACACCATGAACATAGGTCTGTTCCCAGATCTTGCCGCTGCGGCGAACC GTCAGCAACAGAAGCTCTGAAAGGGCGTTAACCACAGAGACACCTACACCGT GCAAAC Une analyse d'homologie de séquences est réalisée au moyen du programme BLASTn sur le serveur du NCIMB (http://www.ncimb.nlm.nih.gov) afin d'identifier des souches bactériennes présentant des homologies de séquences avec la bactérie inconnue. Les résultats sont présentés dans les deux tableaux suivants (Tableaux 3 et 4). Le pourcentage d'identité est calculé sur la longueur nucléotidique présentant le maximum d'identité entre les deux séquences comparées Tableau 3 : Résultats des analyses d'homologies pour le gène rpoD : La séquence du gène rpoD de la bactérie inconnue est comparée aux séquences du gène rpoD d'autres souches bactériennes. En fonction des informations disponibles sur les séquences de ces autres souches bactériennes la comparaison se fait sur toute la longueur de la séquence du gène rpoD de la bactérie inconnue (780 nucléotides) ou moins. Souche Longueur (nt) Identité Pourcentage d'identité CFBP2356dysoxyliPTG 1 corrpoD2 809 777/780 (99%) CFBP2353theaeG8corrpoD2 809 775/779 (99%) CFBP 1754papulansPTG 1 cor rpoD2 809 775/779 (99%) CFBP2339acerisPTG I corrpoD2 809 768/780 (98%) Tableau 4 : Résultats des analyses d 'homologies pour le gène gyrB : Souche Longueur (nt) Identité Pourcentage d'identité CFBP17311apsaPT_Glcor gyrB2 890 847/859 (98%) CFBP2105pisiPT_G I cor gyrB2 890 842/859 (98%) CFBP2896japonicaPT G 1 cor gyrB2 888 841 /859 (97%) CFBP2213atrofaciensPT G l cor gyrB2 890 8391859 (97%) CFBP1617aptataPT_G1cor gyrB2 , 887 839/859 (97%)25 Les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD des bactéries Pseudomonas syringae isolés des lots de graines de courgette contaminées par la bactérie inconnue ont été comparées avec les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD d'autres bactéries Pseudomonas syringae. La plus forte homologie de séquence est retrouvée entre les séquences nucléotidiques des gènes gyrB et rpoD de la bactérie inconnue et celles de la bactérie Pseudomonas syringae pv. syringae n°CFBP1392. D'autres bactéries Pseudomonas syringae montrent aussi des homologies proches, il s'agit de Pseudomonas syringae pv. lapsa, pv. pisi et pv. aptata. On peut en conclure que la bactérie inconnue est une souche de Pseudomonas syringae. 4/ Mise au point d'un milieu de culture adapté à l'isolement de la bactérie phytopathogène de type Pseudomonas syringaea Afin de pouvoir conduire des expérimentations nécessaires à l'étude de cette nouvelle bactérie Pseudomonas syringae responsable de la bactériose sur courgette, les inventeurs ont dû identifier un milieu de culture adéquat à la bactérie. a) Détermination du spectre d'antibiorésistance des souches d'études: Dans une première étape, les inventeurs ont déterminé le spectre d' antibiorésistance des souches de la bactérie Pseudomonas syringae inconnue, en la testant sur une gamme d'antibiotique couramment utilisé en phytobactériologie. Les résultats sont présentés dans le tableau 5. Tableau 5 : résultats des tests de résistance aux antibiotiques par détermination de la 25 concentration minimum inhibitrice (CMI) des antibiotiques. Concentration Souche Souche Souche Souche Souche Souche inférieure/ A B C D E F Concentration (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (me) supérieure (mg/L) nitrofurantoïne >128 >128 >128 >128 >128 >128 bacitracine 2/2 >128 >128 >128 >128 >128 >128 colistine 2/2 128 >128 >128 >128 >128 >128 Céfalotine 8/32 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Céfuroxime 8/32 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Kasugamycine 4 4 4 4 4 4 Gentamicine 4/8 50,5 128 >128 >128 >128 >128 >128 Rifampicine 4/16 8 2 4 16 2 8 Rifamycine SV 32 32 8 32 32 32 Pénicilline G 0,25/16 128 64 64 64 128 64 Carbénicilline 128/128 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Ampicilline 4/16 32 32 32 32 32 32 Triméthoprime 4/8 >128 >128 >128 >128 >128 >128 A. nalidixique 8/16 4 4 4 4 4 4 A. oxolinique 2/4 1 1 1 1 1 1 Vancomycine 4/16 >128 >128 >128 >128 >128 >128 Chloramphénicol 8/16 32 32 32 16 32 32 Novobiocine 2/16 128 128 128 128 128 128 Tellurite 32 32 32 32 32 32 Azide Na 4 2 4 2 2 2 La concentration inférieure signifie qu'à partir de cette concentration donnée d'antibiotique, un effet sur la croissance de la bactérie est observé. La concentration supérieure signifie qu'au-delà de cette concentration d'antibiotique, la 5 bactérie ne se développe plus. A une concentration d'antibiotique située entre la concentration inférieure et la concentration supérieure, une croissance moyenne de la bactérie est observée. Pour la bacitracine, la colistine, la spectinomycine et la carbénicilline, la concentration inférieure est identique à la concentration supérieure ce qui signifie qu'il s'agit d'un "tout 10 ou rien" : en dessous de la concentration inférieure donnée d'antibiotique, la bactérie, objet de la présente invention, se développe et, au dessus de cette même concentration dudit antibiotique, ladite bactérie ne se développe pas. Les tests ont été effectués à partir de dépôts de 2 pl de suspensions bactériennes à 106 UFC/mL, soit 103 UFC. Les lectures ont été réalisées après 2, 3, 4,5 et 6 jours de cultures à 15 27°C. La concentration minimum inhibitrice des antibiotiques est mesurée en mg/1. Les antibiotiques bacitracine, colistine et lincomycine sont dosés aux concentrations respectives de 5,104 U/mg, 21,03 U/mg et 863 U/mg. Les résultats de concentration minimum inhibitrice indiquent que les 6 souches de la bactérie inconnue étudiées sont résistantes à plusieurs des antibiotiques testés. La céfalexine, la céfalotine et la céfuroxine étant de la même famille et ayant le même mode, un seul sera conservé pour les étapes suivantes. Les antibiotiques conservés pour la mise au point d'un milieu de culture sélectif à l'agent causal de la maladie sur courgette sont donc la nitrofurantoïne, la bacitracine, la céfalexine, la lincomycine, la carbénicilline, le trimethoprime, la vancomycine et la novobiocine. b/ Mise au point du milieu de culture. Dans la littérature et en particulier dans les trois publications suivantes : - Plant Pathogenic Bacteria. Third edition. N.W. Schaad, J.B. Jones and W. Chun, - S.K. Mohan and N.W. Schaad. An improved agar plating assay for detecting Pseudomonas syringae pv. syringae and Ps. pv. phaseolicola in contamined bean seed. Phytopathology 77 : 1390-1395, et - Schaad N.W., et al. 1995. A combined biological and enzymatic amplification (BioPCR) technique to detect Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in bean seed extract. Phytopathology 85 : 243-2, sont décrits plusieurs milieux de culture donnés comme sélectifs ou adaptés aux Pseudomonas syringae comme par exemple les milieux KBC, BCBRVB, MSP et LBCA. Ces milieux sont à base de King B (KBC, BCBRVB) ou se basent sur un caractère biochimique pour une reconnaissance morphologique facile (MSP : caractère levane, à savoir la croissance bombée des bactéries et fluorescence bleu ; LBCA : caractère levane mis en évidence). D'après les résultats de concentration minimum inhibitrice obtenus et en se basant sur les milieux connus dans la littérature, différents milieux à base de King B et de LBCA additionné d'antibiotiques sont testés (cf. Tableau 6). Tableau 6 : Milieux de culture testés pour la culture de la bactérie inconnue : - KB sans antibiotique - KBC + carbénicilline + bacitracine - KBC + carbénicilline + lincomycine + novobiocine - KBC + nitrofurantoïne + novobiocine - KBC + lincomycine + bacitracine - KBC + lincomycine + nitrofurantoïne + triméthoprime 10 15 Description des milieux : Les antibiotiques sont ajoutés à 100mg/L (concentration finale dans le milieu) sauf la vancomycine, la bacitracine et la novobiocine qui sont à 20mg/L, la céfalexine à 80mg/L et 5 la carbénicilline, la lincomycine et le triméthoprime qui sont à 50mg/L. King B 20g Protéose peptone Glycérol 10mL ou 12.6g K2HPO4 1.5g MgSO4, 7H2O 1.5g Agar 15g q.s.p. IL BCBRVB 950mL King B Après autoclave, ajouter le mélange d'antibiotique suivant dans 10mL d'éthanol + 40mL d'eau distillée : bacitracine (10mg), vancomycine (6mg), rifampicine (0.5mg), cycloheximide (75mg) et bénomyl (0.25mg) - KBC - KBC + vancomycine + carbénicilline - KBC + vancomycine + novobiocine - KBC + bacitracine + vancomycine + carbénicilline - LBCA + novobiocine - LBCA + bacitracine - KBC + carbénicilline + novobiocine - KBC + carbénicilline + lincomycine + nitrofurantoïne - KBC + carbénicilline + lincomycine + bacitracine - KBC + nitrofurantoïne + triméthoprime - KBC + lincomycine + nitrofurantoïne + novobiocine - MSP - BCBRVB - KBC + bacitracine + vancomycine - KBC + vancomycine + novobiocine + carbénicilline - LBCA - LBCA + lincomycine - LBCA + triméthoprime 25 KBC King B 900mL Après autoclave, ajouter 100 ml d'acide borique stérile 1.5% en solution aqueuse, 8mL de céfalexine 10mg/mL et 2 mL de cycloheximide 100mg/mL MSP Saccharose 20g Peptone 5g K2HPO4 0.5g MgSO4, 7H2O 25.Omg Agar 20g Ajuster le pH à 7.2-7.4, autoclaver puis ajouter 8mL de céfalexine 10mg/mL, 2mL de cycloheximide 100mglmL, lmL de vancomycine 10mg/mL et 1mL de BBT 15mg/mL 20 25 LBCA Levure Bacto-peptone Saccharose Acide borique Agar q.s.p. NaOH Autoclaver puis 100mg/mL. 2g 5g 50g 1.5g 15g 1L 2mL ajouter 8mL de céfalexine 10mg/mL et 2mL de cycloheximide Ces milieux sont initialement testés sur des isolats de souche bactérienne afin d'identifier lesquels permettent une croissance de la bactérie inconnue. 8 milieux sont sélectionnés, les autres inhibant de façon plus ou moins conséquente la croissance de la bactérie pathogène. 30 Milieu 1 : KBC additionné de bacitracine et de vancomycine Milieu 2 : KBC additionné de vancomycine et de novobiocine Milieu 3 : KBC Milieu 4 : MSP 35 Milieu 5 : BCBRVB Milieu 6 : LBCA Milieu 7 : LBCA additionné de lincomycine Milieu 8 : LBCA additionné de novobiocine Ces milieux sont alors utilisés non plus sur des isolats de la souche bactérienne inconnue, mais directement sur des macérats de graines contaminées avec la souche bactérienne inconnue(le macérat est la phase liquide obtenue après mise en présence d'un échantillon de semences dans une quantité d'eau, obtenu généralement après agitation, voir un broyage). Comme les graines ne sont pas uniquement porteuses de la bactérie inconnue mais aussi contaminées par d'autres bactéries qui constituent une flore saprophyte, il est nécessaire que le milieu choisi favorise la croissance de la bactérie inconnue mais pas celle des autres bactéries. Les tests sur macérât de graines contaminées montrent que les milieux à base de King B n'ont pas un pouvoir inhibiteur suffisant car d'autres souches bactériennes, différentes de la souche bactérienne inconnue croissent malgré les antibiotiques. Ces milieux sont donc éliminés. De manière similaire, le milieu MSP n'inhibe pas assez la flore saprophyte qui se trouve dans les macérats de graines et est éliminé pour les mêmes raisons. Les milieux à base de LBCA présentent un avantage par rapport aux milieux à base de King B puisque le LBCA permet de différencier la souche d'étude par un caractère biochimique, le caractère levane : les Pseudomonas ont un aspect légèrement nacré et les colonies sont très bombées, rondes. De plus, la concentration en saccharose étant très élevée dans ces milieux, (50g/L) elle inhibe la croissance de la flore saprophyte. Ainsi, lorsque du macérât de graine contaminé par la bactérie inconnue est testé sur les milieux à base de LBCA, on observe après 48h d'incubation sur boîte quelques colonies à la morphologie très remarquable et spéciale aux bactéries Pseudomonas. Il subsiste encore quelques colonies de la flore saprophyte mais elles sont facilement reconnaissables grâce au caractère levane. On notera que le milieu LBCA additionné de novobiocine inhibait légèrement la croissance 25 de la bactérie Pseudomonas et a été écarté par précaution ; sur des lots à très faible contamination, il aurait été possible de ne pas identifier la contamination. D'après les résultats obtenus lors des différents tests, les milieux LBCA et LBCA additionné de lincomycine (LBCAL) (50mg/L) sont les mieux adaptés pour tester la qualité sanitaire des semences de courgettes et la présence de la bactérie inconnue. 30 5/Mise au point d'un test de pouvoir pathogène La bactérie inconnue pouvant être maintenant cultivée et maintenue sur un milieu de culture, les inventeurs ont mis au point un test de pouvoir pathogène afin de vérifier sa 35 pathogénicité. Une suspension de bactérie à 108 CFU/ml est réalisée à partir d'une culture fraîche de bactéries à tester (24 heures de culture sur milieu gélosé approprié LBCA). Des graines de courgette saines sont ajoutées à la suspension et laissées macérées pendant 1 h30 à 2h en agitation constante, puis récupérées et semées en pots. Un témoin est aussi réalisé avec des graines baignant dans de l'eau. Il faut alors compter 6 à 8 jours pour observer les premières nécroses sur cotylédons des plantules. On observe aussi de façon récurrente un éclaircissement nervaire au bout de 10 à 14 jours, variant suivant la virulence des souches testées). Les graines des plantes macérées avec les bactéries à tester mettent plus de temps à lever que les graines macérées dans l'eau et les cotylédons sortent déformés, enroulés ; les feuilles ne sont pas symétriques et on observe une crispation de la plante après la deuxième feuille. Cette méthode permet l'expression de symptômes typiques et quantifiables. Ce test peut être utilisé pour mesurer la virulence de souches bactériennes et pour mesurer la sensibilité de génotype de courgette. Il peut aussi être utilisé pour identifier la présence de la bactérie. Enfin, il permet une quantification de la virulence des souches et de la sensibilité des plantes. Ainsi, il permet d'identifier des plantes résistantes à la bactériose induite par la bactérie inconnue. 6 / Identification phénotypique de l'agent pathogène par l'étude du pouvoir pathogène sur Cucurbita pepo Le pouvoir pathogène de différentes souches de bactéries de type Pseudomonas est testé selon la description faite précédemment. Les résultats sont présentés de façon succincte dans le tableau ci-dessous. Tableau 7 : Etude du pouvoir pathogène de bactéries Pseudomonas Genre Espèce Pathovar Isolé de Nombre Pathogène de sur souches courgette testées Pseudomonas congelans Graminés 1 - Pseudomonas syringae Syringae Phaseolus vulgaris 3 - Pseudomonas syringae Lapsa 1 - Pseudomonas syringae atrofaciens Triticum aestivum 1 - Pseudomonas syringae Japonica Hordeum vulgare 1 - Pseudomonas syringae Aptata Cucumis melo 3 + (a) Pseudomonas syringae Panici Panicum sp. 1 Pseudomonas syringae Aceris Acer sp. 1 - Pseudomonas syringae Dysoxili Dysoxylum 1 - spectabile Pseudomonas syringae Papulans Malus sylvestris 1 - Pseudomonas syringae Pisi Pisum sativum 1 - Pseudomonas syringae Tabaci Nicotiana tabacum l - Pseudomonas syringae lachrymans Cucumis sativus 1 - Entérobactérie 1 - Pseudomonas syringae* 50 + (b) (*) Cinquante isolats de la bactérie inconnue sont isolés à partir de différents graines, plantes et partie de plante de courgette Cucurbita pepo contaminés. (a) provoquant des symptômes atypiques tels que nécroses centrales sur cotylédons niais qui n'empêche pas la plante de continuer sa croissance. (b) provoquant des symptômes typiques de la bactérie inconnue : nécroses en bordures de feuille et/ou cotylédons avec halo jaune, éclaircissements nervaire, blocage de la croissance à un stade avancé de la maladie. Ces résultats de test de pouvoir pathogène, conduisent les inventeurs à conclure que seules les souches de bactéries Pseudomonas syringae isolées de courgette provoquent une maladie typique et gênante pour la croissance des plantules de courgette. Les bactéries Pseudomonas syringae pv. aptata provoquent des nécroses mais n'ont aucune incidence sur le bon développement de la plante. Puisque toutes les souches isolées de courgette provoquent un type de symptômes singulier sur Cucurbita pepo, qui se différencient de ceux causés par les souches de Pseudomonas syringae pv. aptata, les inventeurs proposent de nommer la bactérie inconnue provoquant les symptômes typiques sur courgette Pseudomonas synringae pv. peponis. II/ Recherche de signature génétique utilisable pour l'identification de la nouvelle souche bactérienne Pseudomonas syringae peponis: Les inventeurs ont réalisé un nouveau séquençage et une analyse de l'homologie des séquences des gènes gyrB et rpoD de Pseudomonas syringae peponis comparées à d'autres bactéries de type Pseudomonas et plus particulièrement celles présentées dans le tableau 7 précédent. Les résultats de ces analyses sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous :30 Tableau 8: résultats des tests d'homologie des séquences des gènes gyrB et rpoD de Pseudomonas syringae peponis comparées à d'autres bactéries de type Pseudomonas Genre Espèce Pathovar Homologie sur gyrB avec Homologie sur rpoD avec P. s. pv. peponis P. s. pv. peponis Pseudomonas congelans 832/859 760/780 Pseudomonas syringae Syringae 850/859 768/780 Pseudomonas syringae Lapsa 847/859 764/780 Pseudomonas syringae atrotaciens 839/859 766/780 Pseudomonas syringae Japonica 8411859 767/780 Pseudomonas syringae Panici 8331859 766/780 Pseudomonas syringae Aceris 831/859 768/780 Pseudomonas syringae Dysoxyli 802/859 777/780 Pseudomonas syringae Aptata 839/859 762/775 Pseudomonas syringae Papulans 802/859 775/779 Pseudomonas syringae Pisi 842/859 765/780 Pseudomonas syringae lachrymans 769/833 749/780 Pseudomonas syringae Tabaci 789/857 748/780 Les niveaux d'homologie identifiés laissent très peu de place au polymorphisme dans ces séquences. Une zone à l'intérieur du gène gyrB de la souche Pseudomonas syringae peponis pourrait toutefois présenter un intérêt car une succession de trois nucléotides forme une combinaison unique au sein du groupe génomique 1 des bacteries Pseudomonas syringae. La figure 1 illustre dans un rectangle cette séquence particulière dans le gène gyr B de la bactérie Pseudomonas syringae peponis Recherche de marqueurs moléculaires spécifiques de la bactérie pathogène sur courgette Pseudomonas syringae peponis. Au sein du gène rpoD, aucune séquence spécifique à la souche Pseudomonas syringae peponis ne peut être isolée, aucune zone de ce gène n'étant spécifique de celle-ci. Le gène rpoD est donc exclu pour le dessin d'amorces spécifique. Néanmoins le gène gyrB présente une zone (voir encadré dans la figure 1) qui pourrait être suffisamment spécifique de la souche Pseudomonas syringae peponis, même si le nombre de sites polymorphes reste insuffisant pour obtenir de manière sûre une amplification spécifique. Le marqueur PsCo est défini par le couple d'amorces de séquences nucléotidiques suivantes : Amorce sens (ou F pour Forward) PsCoF : 5' CTTCACGCGCGTCATCGCCA 3' (SEQ ID N°7) Amorce anti-sens (ou R pour Reverse) PsCoR : 5' CGCCGGTCAACGAAGTGTTCC 3' (SEQ ID N°8) Une amplification par réaction en chaîne (PCR) est réalisée afin d'amplifier le marqueur PsCo chez la bactérie Pseudomonas syringae peponis. Produits Concentration finale Volume (�l) dans 20 �l Eau Stérile MilliQ 9 5x Tampon coloré lx 4 MgC12 (25 mM) 1.5 mM 1,2 dNTP (2,5 mM) 0,2 mM 1,6 Amorce 4BaF (20 �M) 0,5 �M 0,5 Amorce 4BaR (20 .iM) 0, 5 �M 0,5 Taq Polymérase (5U/�l) 0,05U 0,2 ADN 3 Programmes pour le couple d'amorce PsCoF/PsCoR. Programme d'amplification pour PCR classique : lx 95°C 04:00 30x 95°C 00 : 30 72°C 00 : 30 lx 72°C 07:00 15°C co 20 La figure 2 montre les résultats de cette PCR. L'amplifiât du marqueur PsCo est de 252 paires de bases. Comme la figure 2 le montre, ce marqueur défini par le couple d'amorce PsCoF/ PsCoR n'est pas spécifique de la bactérie Pseudomonas syringae. pv. peponis (NF8, NC8, ENS, Co9A, Nm2) car il amplifie aussi 25 des séquences génétiques différentes de celles de la souche d'étude, à savoir des séquences génétiques de bactéries Pseudomonas syringae pv. aptata (5428, 1617 et 5429), Pseudomonas syringae pv. pisi (2105), Pseudomonas syringae pv. atrofaciens (2213) et Pseudomonas syringae pv. lapsa (1731). 15 Prépara Les inventeurs se sont alors tournés vers un autre couple d'amorces utilisé au laboratoire pour différencier des souches de Xanthomonas arboricola, basés sur l'amplification d'une séquence comprise dans un opéron codant une NRPS (non ribosomal peptide synthesis). Ce couple d'amorce n'avait jamais été testé chez Pseudomonas. Le marqueur 4BaF est défini par le couple d'amorces de séquences nucléotidiques suivantes : Amorce sens (ou forward) 4BaF : 5'GAACAGCAGCCAGTTACG 3' (SEQ ID N°9) Amorce anti-sens (ou reverse) 4BaR : 5'TACGCAGTCGATGAGTCC 3' (SEQ ID N°10) Une amplification par réaction en chaîne (PCR) est réalisée afin d'amplifier le marqueur 10 4Ba chez la bactérie Pseudomonas syringae peponis. Le mélange réactionnel est identique à celui utilisé pour le marqueur PsCo, mais les conditions de PCR sont les suivantes : Programme d'amplification pour PCR classique : lx 95°C 04:00 30x 95°C 00 : 30 56°C 00 : 30 72°C 00 : 30 lx 72°C 07 : 00 15°C oo La figure 3 montre les résultats de cette PCR. L'amplifiât du marqueur 4Ba est de 198pb. De manière surprenante, alors que ce marqueur défini par le couple d'amorces 4BaF/4BaR a été spécifiquement créé pour différencier des 25 souches de Xanthomonas campestris, une bactérie spécifiquement pathogène des crucifères, il montre une spécificité vis-à-vis du Pseudomonas syringae pv. peponis puisque seules les souches d'intérêt (Nm2, Clug, NF8, NC8, ENS, Co9A) sont amplifiées (voir figure 3). Aucune autre des souches de Pseudomonas syringae du groupe 1 testées ne sont pas amplifiées. 30 Ce marqueur moléculaire 4Ba a pu être séquencé grâce à ces amplifications. Les séquences sens et anti-sens de ce marqueur spécifique de Pseudomonas syringae pv. peponis sont les suivantes : Séquence du marqueur moléculaire 4B (SEQ ID N°11): 35 5 'GAACAGCAGCCAGTTACGACGCTCGGCAGGCGACGCACAGTCGATCGAGAG GTAGCACGCACCGGCTTTGAGTACGCCCAAGAGCGCTGCAACCTGCCACTCGG AGCGCATCATGCAGATACCGACGACATCACCGGGCTGCACATCCTTGCGAAGC AATATGTCGGCAATTTTGTCGGCGGACTCATCGACTGCGTA3' 15 20 Séquence du brin complémentaire du marqueur moléculaire 4B (SEQ ID N°12): 5'TACGCAGTCGATGAGTCCGCCGACAAAATTGCCGACATATTGCTTCGCAAGG ATGTGCAGCCCGGTGATGTCGTCGGTATCTGCATGATGCGCTCCGAGTGGCAG GTTGCAGCGCTCTTGGGCGTACTCAAAGCCGGTGCGTGCTACCTCTCGATCGAC TGTGCGTCGCCTGCCGAGCGTCGTAACTGGCTGCTGTTC3' Les résultats des tests de spécificité des marqueurs moléculaires PsCo et 4Ba sont résumés dans le tableau 9 Tableau 9 : Test de spécificité des marqueurs moléculaires Souches Nombre de souches testées PsCoF/PsCoR 4BaF/4BaR P. congelans 1 - - P.s.pv. syringae 3 - - P.s.pv.lapsa 1 + - P.s.pv. atrofaciens 1 + - P.s.pv. panici 1 - - P.s.pv. japonica l - - P.s.pv. aceris I - - P.s.pv. ciysoxyli I - - P.s.pv. aptata 3 + - P.s.pv. papulans I - - P.s.pv. pisi l + - P.s.pv.lachrymans I - - P.s.pv. tabaci 1 - - Entérobactérie 1 - - P.s.pv. peponis 50 + + Ainsi le marqueur 4Ba défini par le couple d'amorces 4BaF et 4BaR montre une spécificité vis-à-vis de la bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis puisque seules les souches de cette bactérie sont amplifiées (voir figure 3). Les autres souches de Pseudomonas syringae 15 du groupe 1 ne sont pas amplifiées. III/ Mise au point de procédures de détection de la bactérie à partir d'échantillons Les auteurs de la présente invention ont mis au point deux procédures de détection de la 20 bactérie Pseudomonas syringae pv. peponis, à savoir une technique de Bio-PCR et une technique de Seed-PCR. Ces deux techniques combinent une amplification biologique de10 la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis à une amplification spécifique de l'ADN par réaction PCR. Toutefois ces deux méthodes se différencient par le milieu d'amplification biologique de la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis. L'amplification biologique présente un intérêt non négligeable par rapport à d'autres techniques de PCR visant à identifier par exemple des lots de semences contaminées : en effet l'amplification biologique permet de s'assurer que les lots sont contaminés par des bactéries vivante alors qu'une simple PCR pourrait révéler comme contaminé un lot dans lequel les bactéries pathogènes sont mortes et ne sont donc plus un danger pour la culture. Pour la Bio-PCR, les milieux de culture utilisés sont ceux sélectionnés dans les exemples 3 à 5, à savoir le LBCA et le LBCAL. Le temps d'incubation optimal des bactéries est de 48 heures, mais 24 heures suffisent pour l'apparition des premières colonies détectables en PCR. En ce qui concerne la Seed-PCR l'amplification biologique se fait sur les graines en germination. Il a été montré qu'un pathogène présent dans une graine augmente sa population en même temps que la germination cette même graine (thèse de M. Niknejad-Kasempour, 1998). Ainsi en faisant germer des semences de courgette contaminées dans des conditions optimales pour le pathogène, la population de bactérie augmente, la graine en germination correspond au milieu de culture (il n'y a pas de milieu de culture spécifique, le macérât de germination des semences constitue le milieu de culture). L'amplification biologique pour la Seed-PCR se fait en boîte de germination 48h à 27°C, les graines étant alors lavée 1h30 dans de l'eau distillée en erlen pour en extraire toutes les bactéries pathogènes comme saprophytes : les graines germées ont les téguments ouverts ce qui facilite la sortie des bactéries, une simple macération suffit dans le cas des semences germées pour en extraire les bactéries. Des tests préliminaires ont montrés que lorsque une PCR était faite directement après lavage de boîtes (pour Bio-PCR) ou lavage de graines germées (pour Seed-PCR) en faisant simplement bouillir les suspensions, aucun signal n'est détecté ; trop d'inhibiteurs de PCR sont contenus dans les semences et un nombre trop important de cellules sont présentes dans le tube de réaction. Il est donc nécessaire de réaliser une extraction d'ADN sur les échantillons issus de l'amplification biologique, que ce soit pour la technique de BIO-PCR ou de SEED PCR. 1/Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par 35 Bio-PCR. Différents sous échantillons de 100 graines d'un lot initial de 500 graines sont transférés dans des sacs Stomacher avec membrane filtrante et y sont ajoutés 50 mL d'eau distillée stérile. Les sacs sont ensuite fermés hermétiquement pour éviter toute fuite de broyât. Les échantillons sont broyés uns à uns pendant dix minutes. Les broyats de chaque sous échantillon sont ensuite récupérés puis étalés sur milieu LBCA et LBCAL. Les boîtes sont mises à incuber à 27°C pendant 24h. A noter que de manière facultative, les broyats peuvent être dilués dans le but d'effectuer un dénombrement de Pseudomorzas syringae pv. peponis dans le broyât brut. Ainsi, une gamme de dilution de raison 10 peut être préparée jusqu'à une dilution au millième ; 1001.1L de chaque dilution sont ensuite étalés sur LBCA et LBCAL au râteau et mis à incuber à 27°C. La lecture du dénombrement se fera ensuite après 48h d'incubation, par dénombrement visuel des colonies développées. Après 24h d'incubation à 27°C, les boîtes de broyât brut sont lavées avec 2 mL d'eau distillée stérile à l'aide d'un râteau stérile. 1,5mL de ce lavât est récupéré pour l'extraction d'ADN Après centrifugation de 5 minutes à 13000 tours par minutes (rpm.), le surnageant est jeté et le culot repris dans 750�L de tampon d'Edwards (200mM TrisHCl pH 7,5, 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0,5% SDS, 2% PVP 360) avant incubationlh à température ambiante sous agitation douce. Une nouvelle centrifugation de 5 min. à 10000rpm permet de récupérer 700�L de surnageant qui est transféré dans un tube Phase Lock Gel� (Eppendorf). 1 volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (700�L) est ajouté dans le tube qui est mélangé doucement pendant 1 minute puis centrifugé 15 minutes à 14000rpm. Le surnageant est transféré dans un tube ordinaire (1,5mL) ou l'on ajoute 0,6 volume d'isopropanol (424L) avant de mélanger doucement par inversion et placer le tube à -20°C pendant 20 à 25 minutes. Une nouvelle centrifugation 2 minutes à 14000rpm et 4°C permet d'obtenir un culot qui est lavé dans 500�L d'alcool 70° conservé à -20°C et une nouvelle fois centrifugé 2 minutes à 14000rpm et 4°C. Le culot est séché 15 minutes à 60°C et resuspendu dans 501,1L d'eau ultrapure stérile pour être conservé à -20°C. Le mélange réactionnel pour la PCR est préparé dans un volume final de 20 �l selon le tableau 8 ci-dessus. La PCR est réalisée dans des tubes appropriés à raison de l7pl du mélange réactionnel et 3 pl de l'ADN cible. Le programme d'amplification de la PCR classsique est réalisé à l'aide d'un thermocycleur (icycler BioRAD). lx 95°C 04:00 30x 95°C 00 : 30 56°C 00 : 30 72°C 00 : 30 lx 72°C 07:00 15°C co35 Les produits d'amplification sont analysés sur gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE 0,5 X préparé selon : 1. Préparation du tampon TBE 5x : Produits 1 litre Tris base 54g Acide borique 27,5g EDTA 4,65g IL Préparation de 2% de gel agarose pour l'électrophorèse : Produits 100 ml Agarose 2g Tampon TBE 0,5x 100 ml III. Préparation du bromure d'éthidium : Produits 1 litre bromure d'éthidium (10 mg /ml) 200 �l Eau distillée stérile 1000 ml Le gel est chargé, dans chaque puit, avec 8 �l de chaque produit amplifié auxquels sont ajoutés 8 �l de marqueur de poids moléculaire 100 paires de bases (pb) (au moins 1 par 15 gel).L'ensemble est soumis à une électrophorèse sous un voltage constant (100 V) et la migration des produits amplifiés est visualisée à l'aide d'un transluminateur à UV, après coloration au bromure d'éthidium (BET) et rinçage. La figure 4 illustre les résultats de cette PCR. A, B, C et D sont des échantillons d'ADN extraits de quatre lots de semence de courgette 20 différents, A, B et C étant contaminés par Pseudomonas syringae peponis, D étant un lot non contaminé par la bactérie. � 1 � est un témoin positif constitué par une amplification d'ADN d'une souche pure de Pseudomonas syringae peponis pathogène sur courgette. 4 � est un témoin négatif de PCR qui est faite avec de l'eau stérile. Pour les trois échantillons contaminés A, B et C, la bande à 200 paires de bases est bien 25 présente, de même d'ailleurs que pour le témoin positif � 1 �alors que pour le lot D non contaminé, aucune bande n'est présente. Ceci confirme bien que le marqueur 4 Ba est bien 10 spécifique de la bactérie pathogène Pseudomonas syringae pv. Peponis et que celle-ci est détectable avec la technique de Bio-PCR 2/Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par 5 Seed-PCR. Les produits et appareillages pour réaliser la Seed-PCR sont identiques à ceux de la Bio-PCR. Il n'y a toutefois pas besoin de préparer un milieu de culture, seules sont nécessaires des boîtes de germination et du papier plissé ou buvard afin de faire germer les graines. La taille des échantillons et des sous échantillons analysés sont les mêmes que pour la Bio- 10 PCR à savoir des échantillons de 500 graines divisés en 5 sous échantillons de 100 graines pour l'analyse. Chaque boîte de germination contient un papier buvard dans le fond et un papier plissé de 25 plis. Chaque boîte contiendra un sous-échantillon de 100 graines. 4 graines sont réparties par plis et 30mL d'eau stérile sont ajoutés. Les boîtes de germination sont mises à 15 incuber à 27°C en étuve pendant 48h. Après cette incubation, des radicelles d'environ 2cm sont visibles avec quelques fois des racines secondaires. Les semences sont récupérées et transvasées dans un erlenmeyer de 250mL auquel sont ajoutés 50mL d'eau distillée stérile. Les graines sont lavées 1 heure à température ambiante et sous agitation constante (agitateur à plateau universel). 1,5mL de macérât sont récupérés en tubes de 2mL pour 20 l'extraction d'ADN. Les protocoles d'extraction d'ADN ainsi que les protocoles des PCR sont identiques à ceux mis en oeuvre pour la Bio-PCR. De même, l'interprétation des résultats se fera exactement de la même façon. Dans les cas de la Seed-PCR, seule la partie amplification biologique change par rapport à la Bio-PCR. 25 IV/ Procédure de détection de Pseudomonas syringaea. pv. peponis dans les semences par test sérologique Même si les test sérologiques présentent certains problèmes de spécificité en ce qui concerne la reconnaissance de la bactérie d'intérêt par rapport à d'autres bactéries pouvant 30 se trouver sur la graine, la plante ou sur une partie de plante, des tests de type Elisa et ses variantes DAS/TAS (double and triple antibody sandwich) peuvent se révéler utiles car ils sont généralement simples d'utilisation et peu coûteux. Ces test peuvent se faire au laboratoire, mais les dernières années ont aussi vu la mise au point de tests utilisables directement dans les champs, dans les serres, basés sur ces 35 techniques d'immunologies : une bandelette comporte un ou plusieurs anticorps qui vont fixer la bactérie dont l'absence/présence veut être confirmée. Si la bactérie Pseudomonas syringaea pv. peponis est présente dans l'échantillon soumis (un broyat ou une macération de feuille, de partie de plante ou de graine), elle sera révélée par l'ajout d'un second anticorps auquel un enzyme est généralement liés et dont l'ajout du substrat déclenche une réaction enzymatique révélant, généralement par une coloration spécifique, la présence de la bactérie d'intérêt. Les anticorps peuvent être préparés par les techniques connues de l'homme du métier, à savoir par exemple des antisérums préparés chez le lapin et le poulet. L'immunisation peut être pratiquée chez le lapin par injection par voie intraveineuse d'une suspension de cellules vivantes de la bactérie Pseudomonas syringae peponis selon, par exemple, le protocoloe décrit par Trigalet et al en 1978. Les prélèvements de sérums s'effectuent ainsi après le 4e rappel. Chez le poulet, l'immunisation peut se faire par voie souscutanée avec une suspension de cellules vivantes additionnée d'adjuvant complet de Freund, par exemple 0,5 ml d'adjuvant pour 1,5 ml de suspension bactérienne. Les injections peuvent être faites à raison d'une piqûre par semaine pendant 3 semaines, le prélèvement étant fait 6 jours après la dernière piqûre et après 3 rappels. Les immunoglobulines peuvent être extraites de ces sérums par chromatographie d'affinité par exemple sur des colonnes de Sépharose 4B. Leur élution de la colonne d'affinité peut être obtenue avec un tampon HC1 - glycine 0,1 M pH 2,8. Après neutralisation et concentration par ultrafiltration sur membrane Amicon PM 10, les immunoglobulines peuvent être stockées au congélateur. La concentration de la solution est déterminée d'après la valeur de la densité optique à 280 nm. Les immunoglobulines qui seront utilisées comme anticorps secondaire peuvent par exemple être couplées à la phosphatase alcaline type III R (Sigma EC n° 3.1-3.1) par l'intermédiaire du glutaraldéhyde (méthode en un temps) selon le procédé décrit par VASRAMEA et al., en 1978. Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) peut être réalisé par exemple suivant la méthode sandwich d'après les travaux de Clark et Adams (1976) ou encore selon la méthode de double couche d'après Scherrer & Bernard (1977). Les réactions peuvent être réalisées à loisir en microplaques ou en cuves. Si le test ELISA est un test immunologique destiné généralement à détecter une protéine dans un liquide biologique, il peut être toutefois aussi utilisé pour détecter la présence de bactéries, notamment de la bactérie Pseudomonas syringae peponis identifiée par les auteurs de la présente invention. Les immunoglobulines (300 pl à 10 pg/ml) peuvent être réparties dans les micropuits des microplaques. L'adsorption sera faite 5 h à 37 °C ou 1 nuit à 4 °C. Après 3 lavages avec le liquide physiologique, le dépôt de l'échantillon (un broyat ou une macération de feuille, de partie de plante ou de graine sont déposée dans les puits) est réalisé à raison de 200 �l par micropuit et l'incubation se fait 2 h à 28 °C. Après élimination de l'échantillon par lavage au liquide physiologique, 250 �l du couplage anticorps-enzyme (anticorps secondaire) peut être ajouté et laissés 4 h à 37 °C. La révélation de la réaction sera obtenue avec 0,8 mglml de p- nitrophényl phosphate dans un tampon Tris-HCI 0,05 M, NaCI 1 M pH 8,0 A( REGN & mELrrrHaL, 1960). La lecture s'opèrant, pour cette réaction, par exemple à 405 nm au spectrophotomètre Beckman DBG. Dans chaque série de test figurent des témoins de réaction (bactérie Pseudomonas syringae peponis et tampon comme témoins positifs/négatifs) La phosphatase alcaline catalysant la transformation du p-nitrophényl phosphate incolore en p-nitrophenol jaune, la présence de la bactérie Pseudomonas syringae peponis dans l'échantillon est révélée lorsque l'ajout du substrat de l'enzyme entraîne un changement de la couleur dans le puit. Eventuellement, la réaction peut même être quantifiée par colorimétrie à partir d'une courbe d'étalonnage réalisée avec des concentrations connues de bactéries puisque le nombre de molécules d'anticorps secondaires fixées dépend du nombre de bactéries immobilisées par l'anticorps primaire. REVENDICATIONS1. Bactérie Pseudomonas syringaea peponis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence de nucléotides sélectionnée parmi les séquences de nucléotides SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°9, SEQ ID N°10, SEQ ID N°11, SEQ ID N°12 et SEQ ID N°13. 2. Bactérie selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a été isolée et déposée le 19.05.2009 auprès de la Collection Nationale de Culture de MicroOrganismes sous le numéro CNCM I-4159. 3. Marqueur moléculaire 4Ba de la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est défini par le couple d'amorces nucléotidiques constitué d'une part, par la séquence SEQ ID N°9 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et d'autre part, par la séquence SEQ ID N°10 et/ou au moins une séquence comprenant au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10. 4. Marqueur moléculaire 4Ba selon la revendication 3, caractérisé en ce que sa séquence nucléotidique comprend tout ou partie de la SEQ ID N°11 ou de la séquence SEQ ID N°12. 5. Amorce(s) nucléotidique(s) pour la détection et l'identification de la bactérie 25 Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend : a. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°9, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°9 intégrale; b. de 10 à 30 nucléotides dont au moins 8 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N°10, et, de préférence, la séquence SEQ ID N°10 intégrale; c. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 11; d. de 8 à 30 nucléotides de la séquence SEQ ID N° 12; ou e. un couple d'amorces comportant une première amorce (a) et/ou (c) et une seconde amorce (b) et/ou (d). 30 35 6. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, à l'aide d'un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs selon l'une des revendications 3 ou 4 et/ou au moins une amorce selon la revendication 5. 7. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que le moyen de biologie moléculaire comprend: - une sonde d'ADN spécifique de tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 11 ou de la SEQ ID N° 12 permettant une hybridation, et/ou - un couple d'amorces (e) tel que défini dans la revendication 5 permettant une amplification en chaîne par polymérase (PCR Polymerase Chain Reaction). 8. Anticorps apte à reconnaître la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon. 9. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, à l'aide d'au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 8. 10. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle consiste à mettre en oeuvre un milieu de culture spécifique LBCA additionné ou non de lincomycine. 11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la mise en oeuvre d'un moyen de biologie moléculaire tel que défini dans la revendication 6. 12. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon végétal, caractérisée en ce qu'elle comprend : (1) le traitement dudit échantillon, de préférence par broyage ou macération, en vue d'extraire d'éventuelle(s) bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis, (2) l'inoculation de plantes ou de graines exemptes de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis avec l'extrait obtenu en (1), (3) la culture desdites plantes ou graines inoculées issues de l'étape (2),(4) la comparaison morphologique des plantes ou graines issues de l'étape (3) avec des plantes issues de plantes ou de graines inoculées avec la bactérie Pseudomonas syringaea peponis, pour en déduire l'infection ou la non-infection de l'échantillon objet de la détection et de l'identification. 13. Méthode selon l'une des revendications 6, 7, 9 à 12, caractérisée en ce que l'échantillon est issu d'une plante sélectionnée parmi les plantes de la famille des cucurbitacées, une plante du genre cucurbita ou du genre cucumis et une plante de courgette cucurbita pepo. 14. Méthode de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle combine au moins deux méthodes choisies dans le groupe comprenant : i. La méthode telle que définie dans la revendication 6 ou 7; ii. La méthode telle que définie dans la revendication 9 ; iii. La méthode telle que définie dans la revendication 10; iv. La méthode telle que définie dans la revendication 12. 20 15. Kit de détection et d'identification de bactérie(s) Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend : - un moyen de biologie moléculaire choisi dans le groupe comprenant au moins l'un des marqueurs tels que définis dans l'une des revendications 3 à 4 et/ou au 25 moins une amorce telle que définie dans la revendication 5, - et/ou au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 8, et/ou au moins un milieu de culture LBCA additionné ou non de lincomycine. 16 Méthode d'identification de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas 30 syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend : - l'inoculation d'au moins une plante, d'au moins une graine ou d'au moins une partie de plante avec cette bactérie, puis - l'identification de la ou des plante(s) résistante(s) ne présentant pas les 35 symptômes de sensibilité à cette bactérie. 10 1517. Méthode d'inoculation d'un échantillon avec une bactérie, caractérisée en ce que l'inoculum mis en oeuvre comprend la bactérie Pseudomonas syringaea peponis telle que définie dans la revendication 1 ou 2. 18. Méthode de création de plantes résistantes à la bactérie Pseudomonas syringaea peponis caractérisée en ce qu'elle comprend : (1) l'identification d'une plante résistante à cette bactérie Pseudomonas syringaea peponis selon la méthode de la revendication 16, (2) le croisement de la plante résistante identifiée en étape 1) avec une plante sensible à cette bactérie, (3) l'identification de plante résistante dans la descendance de la plante issue de l'étape (2) selon la méthode de la revendication 16. 19. Méthode de sélection d'un lot de semence caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre la méthode de détection et d'identification telle que définie dans au moins l'une des revendications 6, 7, 9, 10, 11, 12 et 14 et/ou la méthode d'identification telle que définie dans la revendication 16 et/ou le kit tel que défini dans la revendication 15.