Brevet FR2936815A1 — publié le 20100409

La présente invention concerne un procédé d'évaluation du vieillissement cellulaire réalisé grâce à la combinaison de trois procédés incluant une analyse mitochondriale oxymétrique sur cellules buccales. Les méthodes anti-âge, destinées à lutter contre le vieillissement cellulaire se multiplient. Mais les méthodes d'évaluation de ce vieillissement cellulaire proposées sont rares. Les mitochondries, microorganites présents dans nos cellules, consomment de l'oxygène pour fournir, sous forme de molécules d'adénosine triphosphate (ATP), l'énergie nécessaire au bon fonctionnement du métabolisme cellulaire. En contrepartie, elles produisent des radicaux libres. Avec l'âge, les mitochondries s'altèrent. Leur production de radicaux libres augmente et est à l'origine du vieillissement cellulaire. A l'heure actuelle, une évaluation de la consommation d'oxygène mitochondriale peut être réalisée dans un cadre de recherche scientifique à partir d'une biopsie musculaire généralement. Ce type de prélèvement est invasif, il entraîne une lésion, nécessite l'utilisation d'un anesthésique local et implique une période de récupération. De plus, les résultats sont présentés de manière complexe et publiés dans des articles de presse spécialisés. Le procédé selon l'invention, consiste à permettre une évaluation de la consommation d'oxygène mitochondriale, sur une personne lambda. Cela, grâce à une méthode de prélèvement non invasive, indolore et ne nécessitant pas l'emploi d'un anesthésique local ni de période de récupération. L'invention inclut un procédé d'analyse mitochondriale oxymétrique réalisé selon des critères de qualité scientifique. L'invention inclut de plus, une représentation des résultats compréhensible sans connaissance scientifique particulière et permettant à la personne de s'auto-évaluer. Cette évaluation se fait à l'aide de données de références internes qui lui sont fournies. La personne peut également se créer son propre référentiel, entre groupe d'amis, famille, membre d'un club etc. L'invention concerne la combinaison de trois procédés et se déroule en trois étapes. PREMIERE ETAPE : Il est demandé à la personne de se rincer au préalable la bouche avec de l'eau, courante en règle générale. Le prélèvement buccal est réalisé par un frottis de la paroi interne des joues, à l'aide du matériel adapté à cet usage, de manière générale un écouvillon adapté, stérile et à usage unique. Il est inscrit sur l'étui contenant chaque écouvillon, les renseignements concernant la personne qui bénéficie du prélèvement, comme le nom, le prénom, le sexe, la date de naissance, la date du prélèvement ainsi que l'heure éventuellement. Il est également inscrit un numéro d'identifiant suffisamment clair pour permettre d'éviter toute confusion et ambiguïté d'identification. Ce numéro d'identifiant est celui qui sera apposé sur les récipients secondaires de transfert de l'échantillon prélevé, utilisés durant la procédure d'analyse. Ce numéro servira également de référence sur les programmes et les logiciels, d'acquisition et d'analyse informatique. Les étuis d'écouvillons sont archivés et accompagnés d'un dossier papier sur lequel sont reportées les données d'identification. Ces données pourront également faire l'objet d'un dossier informatique en respect des règles d'informatique et 40 liberté. DEUXIEME ETAPE : A l'issu de la première étape, l'échantillon issu du prélèvement buccal entre en procédure d'analyse oxymétrique constituant la deuxième étape. Le système d'analyse oxymétrique est constitué d'un mode opératoire, d'un appareil de mesure oxymètrique, d'un logiciel d'acquisition et d'analyse, de plusieurs réactifs, de plusieurs échantillons de calibrage, d'un échantillon de contrôle. Des procédures opératoires écrites décrivent les différentes étapes de l'analyse, les conditions de son exécution et de sa réalisation dans le respect des règles d'hygiène et de sécurité. Un calibrage de l'appareil de mesure oxymétrique, s'effectue avec des étalons de références quantitativement et qualitativement adaptés. Un échantillon de contrôle adapté permet de contrôler et de valider le bon fonctionnement du système d'analyse. L'échantillon est transféré dans une solution de réactifs adaptée, à base de mannitol et de sucrose par exemple. Les cellules buccales contenues dans l'échantillon peuvent au préalable être perméabilisées à l'aide d'un réactif spécifique comme la saponine. Alternativement, les mitochondries issues des cellules buccales peuvent être isolées et purifiées. En règle générale, chaque échantillon est divisé en deux aliquots qui seront analysés séparément afin de garantir une meilleure fiabilité à la mesure. Les mesures sont effectuées à l'aide de substrats spécifiques de l'activité mitochondriale comme par exemple le pyruvate et l'adénosine diphosphate (ADP). Les valeurs de références sont réalisées sur une population de référence, composé d'individus exempts de 20 pathologie et de traitements notoires et s'étalant sur un intervalle d'âge pouvant être compris par exemple entre 20 et 110 ans. Chaque population de référence est identifiée par un numéro de référence. Des dosages et mesures auxiliaires peuvent accompagner l'analyse oxymétrique comme par exemple un dosage par spectrophotométrie des protéines ou de l'activité d'une enzyme mitochondriale comme la citrate 25 synthase par exemple. Une sélection des différentes valeurs obtenues, est effectuée. Chaque valeur est constituée de manière générale de la moyenne des deux mesures effectuées sur les deux aliquots. Trois types de valeurs peuvent être sélectionnés : Une valeur de type 1 équivalente à une donnée brute. C'est à dire une donnée issue directement du système 30 d'analyse exprimant un débit de consommation d'oxygène, exprimé en unité de débit. En micromoles d'oxygène consommé par minute par exemple. Une valeur de type 2 équivalente à une donnée relative. C'est à dire par exemple, le rapport entre deux données brutes, exprimé en pourcentage ou sans unité. Ou bien par exemple, le rapport entre une donnée brute et une donnée d'un dosage auxiliaire, exprimé en unité relative, par exemple en micromoles d'oxygène 35 consommé par minute par milligramme de protéines. Une valeur de type 3 équivalente à une valeur de type 1 ou 2, transformée. C'est à dire une valeur correspondant à une donnée brute ou relative, à laquelle peut être appliqué arbitrairement un coefficient, pour faciliter notamment la lisibilité sur l'axe des ordonnés. Par exemple, des données de type 2 comprises dans un intervalle de 100 à 200 peuvent être transformées par un coefficient de division 10 afin d'apparaître 40 sur un intervalle allant de 10 à 20. TROISIEME ETAPE: A la suite de la deuxième étape, les valeurs sélectionnées entrent en procédure de représentation graphique constituant la troisième étape. La représentation graphique s'effectue à l'aide d'un logiciel adapté, classiquement utilisé. Sur l'axe des abscisses est représenté l'âge en années compris par exemple entre 20 et 110 ans, en ordre croissant ou décroissant. Sur l'axe des ordonnés, prénommé par exemple, "échelle de vieillissement cellulaire" ou "échelle de jeunesse cellulaire", peuvent être représentés les trois types de valeurs précédemment décrites. Les valeurs de références peuvent faire l'objet d'une courbe de tendance statistique, de type régression 10 linéaire par exemple, qui peut être représentée sur la représentation graphique. Les valeurs de références font l'objet d'un numéro de référence pour permettre des comparaisons entre plusieurs valeurs. Les valeurs de référence peuvent faire l'objet d'un code couleur supplémentaire pour faciliter ces comparaisons. Elles peuvent être prénommées par exemple "indices" ou "scores". La valeur de la personne bénéficiant de l'invention, porte alors la même dénomination. La valeur concernée peut être 15 accompagnée d'un écart par rapport à une valeur prédictive calculée à partir de la courbe de tendance statistique. A titre d'exemple non limitatif, deux représentations graphiques possibles, sont présentées dans les figures 1 et 2. Sur la figure 1, l'axe des ordonnées est prénommé "échelle de vieillissement cellulaire". Sur l'axe des abscisses, l'âge est représenté dans un intervalle de 20 ans à 70 ans, en ordre croissant. Les valeurs de 20 références sont prénommées "indices", sont mentionnées et positionnées par des croix. Le numéro de référence de ces valeurs est mentionné. La droite de régression linéaire apparaît également en pointillé. La valeur de la personne bénéficiant de l'invention est mentionnée et positionnée par un rond noir plein. Elle est prénommée "Votre indice". L'ensemble est entouré dans un cercle elliptique noir pour accentuer la visibilité. Sur l'axe des abscisses, l'âge de la personne est également positionné par un rond noir plein et prénommé 25 "votre âge". Sur la figure 2, l'axe des ordonnées est prénommé "échelle de jeunesse cellulaire". Sur l'axe des abscisses, l'âge est représenté dans un intervalle de 20 ans à 70 ans, en ordre décroissant. Les valeurs de références sont prénommées "scores", sont mentionnées et positionnées par des croix. Le numéro de référence de ces valeurs est mentionné. La droite de régression linéaire apparaît également en pointillé. La valeur de la personne 30 bénéficiant de l'invention est mentionnée et positionnée par un rond noir plein. Elle est prénommée "Votre score". L'ensemble est entouré dans un cercle elliptique noir pour accentuer la visibilité. Sur l'axe des abscisses, l'âge de la personne est également positionné par un rond noir plein et prénommé "votre âge". L'invention se destine particulièrement, en tant que service à la personne, à apporter un point de repère aux personnes soucieuses de lutter contre le vieillissement cellulaire, veillant par exemple à avoir pour 35 cela une alimentation équilibrée riche en antioxydants, à pratiquer une activité physique régulière, des méthodes de gestion du stress etc. REVENDICATIONS1. Un procédé d'évaluation du vieillissement cellulaire caractérisé en ce qu'il inclut la combinaison de trois procédés réalisés selon les trois étapes suivantes : - Un prélèvement buccal effectué chez une personne par frottis de la paroi interne des joues à l'aide du 5 matériel adapté à cet usage. - Une analyse de la consommation d'oxygène mitochondriale réalisée sur l'échantillon issu de l'étape précédente, grâce à l'utilisation d'un système d'analyse oxymétrique, composé notamment d'une procédure, d'un appareil de mesure oxymétrique, d'un logiciel d'acquisition et d'analyse, de divers substrats, réactifs et solutions. 10 - La détermination et la sélection d'une ou plusieurs valeurs issues de l'étape précédente et leur positionnement sur un graphique relatif à l'âge, réalisé à partir de données de références. 2. Le procédé selon la revendication n°1, caractérisé en ce que la personne est une personne quelconque. 3. Le procédé selon la revendication n°1, caractérisé en ce que la personne est une personne incluse dans un protocole d'évaluation d'un produit cosmétique ou d'un service cosmétique. 4. Le procédé selon la revendication n°l, caractérisé en ce que la personne est une personne incluse dans un protocole d'évaluation d'un aliment, d'un nutriment, d'un complément alimentaire ou d'un régime alimentaire. 20 5. Le procédé selon la revendication n°1, caractérisé en ce que l'analyse de la consommation d'oxygène mitochondriale s'effectue sur cellules entières. 6. Le procédé selon la revendication n°5, caractérisé en ce que les cellules bénéficient d'une étape de 25 perméabilisation préalable. 7. Le procédé selon la revendication n°1, caractérisé en ce que l'évaluation de la consommation d'oxygène mitochondriale s'effectue sur les mitochondries isolées avec éventuellement une étape de purification supplémentaire. 8. Le procédé selon la revendication n°I, caractérisé en ce que la valeur représentée est une donnée brute issue de l'appareil de mesure. 9. Le procédé selon la revendication n°I, caractérisé en ce que la valeur représentée est une donnée relative, 35 obtenue notamment à l'aide de dosages ou mesures auxiliaires. 10. Le procédé selon la revendication n°1, caractérisée en ce que la valeur représentée est une donnée brute ou relative, transformée.