Brevet FR2941373A1 — publié le 20100730

, 1 La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus en tant que principe actif dans une composition cosmétique et/ou dermatologique pour stimuler la synthèse de l'EMILIN-1. La présente invention concerne également l'utilisation du même principe actif pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer le relâchement de la peau et pour favoriser et/ou augmenter et/ou restaurer l'élasticité de celle-ci notamment lors d'une grossesse ou d'une prise ou d'une perte de poids importante. L'extrait de Thymus citriodorus en tant qu'actif selon la présente invention est également utilisé pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer et/ou lutter contre les effets dus à un étirement rapide et brutal de la peau, tels que les vergetures. Chez l'homme, sur le plan anatomique, la peau comprend deux parties principales. La partie superficielle mince qui s'appelle épiderme est rattachée à une partie interne plus épaisse, le derme. Le derme, clairement séparé de l'épiderme par la � jonction dermo- épidermique �, se poursuit en profondeur sans limite franche par 1'hypodeiine. Le derme est constitué de différents types cellulaires et en particulier des fibroblastes, responsables de la synthèse et de l'entretien du matériel extracellulaire. Ce sont des cellules d'origine mésenchymateuse, qui synthétisent le collagène, l'élastine, la substance fondamentale et les glycoprotéines de structure. Le derme est constitué d'un tissu conjonctif qui associe des fibres de collagène, des fibres élastiques et diverses cellules baignant dans une substance fondamentale amorphe. Par ses fibres et sa substance fondamentale, le derme contribue tout d'abord à donner à la peau ses propriétés mécaniques : élasticité, résistance au choc, etc. Les fibres du derme comprennent les fibres de collagène et les fibres élastiques. Elles représentent quantitativement les protéines de structure les plus importantes du derme, soit respectivement 75% et 5% en poids sec, rapporté aux protéines de structure. Leurs proportions relatives et leur disposition sont différentes selon les zones superficielles ou profondes du derme. Les fibres élastiques de la peau sont composées d'élastine. Elles sont disposées en fibres et en lames discontinues. Le réseau élastique de la peau est composé de trois sortes de fibres : les fibres oxytalanes, les fibres d'élaunine et les fibres élastiques proprement dites. Leur degré de maturité est fonction des proportions d'élastine et de glycoprotéines de structure associées. En microscopie optique, seules les fibres oxytalanes et les fibres élastiques matures sont visibles en utilisant des colorations spéciales, comme l'orcéine (après oxydation à l'oxone pour les fibres oxytalanes, d'où leur nom). Les fibres oxytalanes, sont situées dans le derme papillaire. Elles forment de fines arborisations perpendiculaires à la jonction dermo-épidermique. Les fibres élastiques matures sont situées au niveau du delme réticulaire, des septa interlobulaires de l'hypoderme, des glandes sébacées et des glandes sudorales ; elles se présentent comme des faisceaux ondulés, parfois anastomosés, situés entre les fibres de collagène. L'élastine, constituant majeur (90%) des fibres élastiques du derme adulte, est une protéine non glycosylée et très hydrophobe. Elle possède une résistance exceptionnelle aux attaques physiques et chimiques. L'élastine est synthétisée par les fibroblastes sous forme d'un précurseur, la tropoélastine, qui se polymérise. Contrairement à la plupart des protéines, l'élastine adopte diverses conformations et se replie au hasard, chaque molécule pouvant s'allonger ou rétrécir. L'ensemble du réseau peut donc se tendre ou se détendre comme un élastique. Les fibres d'élastine peuvent interagir avec les cellules (fibroblastes, leucocytes) par l'intermédiaire du récepteur à l'élastine. La synthèse des fibres élastiques commence au 3ère û 4èrne mois de développement et se poursuit durant la phase de croissance de l'individu. La fibrillogenèse débute par la synthèse des glycoprotéines de structure comme les fibrillines qui s'organisent dans l'espace extracellulaire et constituent une charpente sur laquelle se déposent les molécules de tropoélastine, précurseurs solubles de l'élastine (m/s 1996, n° 10, p. 1077 et 2001, n° 3, p. 327). Les dernières étapes de la formation des fibres élastiques sont la désamination oxydative des lysines de la tropoélastine, catalysée par une lysyl oxydase (LOX), et la formation d'acides aminés de pontage. La formation des acides aminés de pontage rend l'élastine insoluble, résistante à l'hydrolyse par la plupart des enzymes et surtout fonctionnelle en lui conférant ses propriétés d'élasticité. La liaison des fibres élastiques aux cellules via la fibuline-5 induit l'organisation optimale des fibres élastiques dans les tissus. Au cours du vieillissement, les fibres élastiques s'enrichissent en calcium qui accroît lui-même la liaison avec les lipides, diminuant ainsi l'élasticité du réseau d'élastine et donc des tissus. Le système élastique papillaire vertical du derme est dégradé et des complexes amorphes se forment avec le collagène. Cependant, si le réseau horizontal profond du derme se fragmente également, sa densité augmente. Il se crée sans doute des pontages radicalaires ou des modifications de la structure primaire des chaînes peptidiques. Au fur et à mesure du vieillissement, les fibroblastes synthétisent de plus en plus d'élastase, entraînant la dégradation de l'élastine en peptides d'élastine, présents dans la circulation sanguine puis éliminés dans les urines (� La peau û structure et physiologie � û A. Mélissopoulos, C. Levacher). Le rôle des fibres élastiques est donc essentiel pour maintenir l'élasticité de la peau et empêcher son endommagement lors du vieillissement et lors des états d'étirement conséquent de la peau, tels que la grossesse et la prise ou la perte de poids importante. Plusieurs études ont été menées afin de trouver des solutions permettant d'augmenter et de préserver l'élasticité de la peau. Les techniques de biologie moléculaire et d'invalidation de gènes chez la souris ont permis la caractérisation et l'étude structurale des différentes protéines et glycoprotéines composant les fibres élastiques comme les fibrillines, les MAGP (Microfibrillar-associated glycoproteins) et l'EMILIN-1 (Elastin microfibril interfaced protein). L'EMILIN-1 a un rôle dans l'adhésion de l'élastine aux autres structures cellulaires. Cette protéine se lie également à la fibuline 5. Elle est impliquée dans l'élastogenèse et dans le maintien de la morphologie des cellules vasculaires. L'EMILIN-1 est également impliquée dans l'homéostasie de la pression sanguine (Emilinl Deficiency Causes Structural and Functional Defects of Lymphatic Vasculature. Carla Danussi et al. Mol Celi Biol. 2008 June; 28 (12): 4026û4039). L'invalidation du gène codant pour l'EMILIN-1 chez la souris a révélé des altérations des fibres élastiques de l'aorte et de la peau. D'autres modifications ont été observées dans la morphologie et l'ancrage des cellules endothéliales. Les travaux scientifiques décrivant l'EMILIN-1 ont surtout mis en évidence son rôle dans l'élastogenèse du système vasculaire. L'EMILIN-1 n'a pas fait l'objet d'études sur son niveau d'expression et sur sa localisation au niveau des fibres élastiques du derme. La Demanderesse s'est donc intéressée à l'expression et la synthèse de l'EMILIN-1 dans les fibres élastiques situées au niveau de la peau. Elle a ainsi constaté que l'expression de l'EMILIN-1 sur les fibres oxytalanes et dans le derme réticulaire diminue avec l'âge ou après irradiation avec des ondes UVA/UVB ce qui expliquerait également la diminution de l'élasticité de la peau avec le vieillissement et sous l'effet des rayonnements UV. On comprend à la lecture de ce qui précède l'importance de l'EMILIN-1 dans la structure des fibres élastiques et par conséquent, la nécessité de stimuler et accélérer sa synthèse afin de prévenir et/ou diminuer le relâchement de la peau et de favoriser et/ou d'augmenter et/ou restaurer son élasticité. Le but de la présente invention est donc de mettre à disposition des moyens permettant de stimuler et/ou augmenter l'expression de l'EMILIN-1 au niveau du derme chez un mammifère et en particulier, chez l'homme. Il est connu qu'outre les phénomènes intrinsèques, tels que le vieillissement lié à l'âge, d'autres phénomènes extrinsèques, tels que le vieillissement dû à des facteurs externes, la grossesse et/ou la prise et/ou la perte de poids importante mettent à rude épreuve l'élasticité de la peau. De tels phénomènes peuvent avoir pour conséquence le relâchement cutané, l'apparition de vergetures et dans l'ensemble un aspect peu esthétique de la peau. Un autre but de la présente invention est de mettre à disposition des moyens permettant de prévenir et/ou retarder et/ou diminuer chez un mammifère en général, et en particulier chez l'homme le relâchement de la peau et en particulier, celui dû à la grossesse ou à une prise ou une perte de poids importante. Encore un autre but de la présente invention est de mettre à disposition des moyens permettant de favoriser et/ou d'augmenter et/ou de restaurer l'élasticité de la peau pendant et/ou après une grossesse ou une prise ou une perte de poids importante. La présente invention a également pour but de mettre à disposition des moyens pennettant de prévenir et/ou de retarder et/ou de diminuer et/ou d'atténuer et/ou de lutter contre les effets dus à un étirement rapide et brutal de la peau, tels que les vergetures. Pour atteindre ces buts, la Demanderesse a découvert de manière surprenante qu'un extrait de Thymus citriodorus stimule la synthèse de l'EMILIN-l. Cet extrait peut être contenu en tant que principe actif dans une composition cosmétique ou utilisé pour la préparation d'une composition dermatologique. Les extraits de Thymus citriodorus ont été déjà décrits dans l'art antérieur en tant que principes actifs anti-âge pouvant stimuler la synthèse du collagène et inhiber l'activité de certaines métalloprotéases (US 2009/0087501, US 2007/0122492, JP 2006 232740). Toutefois aucun des documents de l'art antérieur ne mentionne ou ne suggère qu'un extrait de Thymus citriodorus aurait une activité stimulante de la synthèse de 1'EMILIN-l. L'objet de la présente invention est donc l'utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus en tant que principe actif dans une composition cosmétique et/ou pour la préparation d'une composition dermatologique pour stimuler la synthèse de 1'EMILIN-1. Un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus en tant que principe actif dans une composition cosmétique et/ou pour la préparation d'une composition dermatologique pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer chez un mammifère en général, et en particulier chez l'homme le relâchement de la peau et en particulier, celui dû à la grossesse ou à une prise ou une perte de poids importante. Encore un autre objet de la présente invention est l'utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus en tant que principe actif dans une composition cosmétique et/ou pour la préparation d'une composition dermatologique pour favoriser et/ou augmenter et/ou restaurer l'élasticité de la peau pendant et/ou après une grossesse ou une prise ou une perte de poids importante. Un objet selon la présente invention est également l'utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus en tant que principe actif dans une composition cosmétique et/ou pour la préparation d'une composition dermatologique pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer et/ou atténuer et/ou lutter contre les effets d'un étirement rapide et brutal de la peau, tels que les vergetures. Le Thymus citriodorus, également connu sous le nom commun Thym citronné ou Thym citron, est une plante aromatique de la famille des Labiacées. Il provient du croisement de deux espèces botaniques : Thymus pilegioides et Thymus vulgaris. L'extrait utilisé dans l'invention est préférentiellement un extrait de feuilles de Thymus citriodorus. De façon avantageuse, cet extrait est un extrait aqueux et de préférence il comprend de la glycérine, qui joue le rôle de stabilisateur. De préférence, il s'agit d'un extrait aqueux obtenu selon un procédé comprenant au moins les étapes suivantes: - Extraction à l'eau des feuilles de Thymus citriodorus - Filtration Addition de glycérine L'extrait aqueux de Thymus citriodorus préférentiellement utilisé dans la composition selon l'invention, est un liquide translucide orange foncé et d'odeur caractéristique. Il présente les caractéristiques analytiques suivantes : pH : 5,9 Densité à 20°C : 1,13 Indice de réfraction : 1,402 Rapport plante/extrait : 1/20 De préférence la composition cosmétique ou dermatologique selon 15 l'invention comprend de 0,0001 à 1% d'extrait de Thymus citriodorus en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition Les compositions selon l'invention peuvent encore comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connus et classiques dans les compositions cosmétiques et dermatologiques tels que, à titre d'exemples et de façon 20 non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines comme la vitamine E, des filtres UV, etc... Grâce à ses connaissances en matière de cosmétique et/ou en dermatologie, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter aux compositions de l'invention et en quelles quantités en fonction 25 des propriétés recherchées. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l'homme du métier dans le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie sans autre restriction galénique que l'application sur le visage et sur le corps. De façon avantageuse, les compositions selon l'invention se présentent sous la 30 forme d'un gel, d'une crème, d'une lotion, d'une huile, d'un lait, d'un spray, etc. Quel que soit l'objectif, on peut proposer une application quotidienne, une ou deux fois par jour, pour une durée de quelques jours à plusieurs mois. 10 L'invention sera mieux comprise, et d'autres caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples qui suivent et qui font référence aux figures, où : - la figure 1 est une photographie qui représente une coloration de Verhoeff de réseaux de fibres élastiques dans le derme papillaire et le derme réticulaire provenant des explants de peau abdominale issus de femmes caucasiennes de classe d'âge allant de 20 à 72 ans ; - la figure 2 est une photographie qui représente l'immunomarquage de l'élastine dans le derme papillaire et le derme réticulaire, avec un anticorps polyclonal de lapin anti-élastine, révélé en FITC, avec les noyaux contre-colorés à l'iodure de propidium ; - la figure 3 est une photographie qui représente l'immunomarquage de la fibrilline-1 dans le derme papillaire et le derme réticulaire, avec un anticorps monoclonal de souris anti-fibrilline-1, révélé en FITC, avec les noyaux contre-colorés à l'iodure de propidium ; - la figure 4 est une photographie qui représente l'immunomarquage de l'EMILIN-1 dans le deüne papillaire et le derme réticulaire, avec un anticorps polyclonal de lapin anti-EMILIN-1, révélé en FITC, avec les noyaux contre-colorés à l'iodure de propidium ; - la figure 5 est une photographie qui représente l'immunomarquage de l'EMILIN-1 dans le derme papillaire et le derme réticulaire d'une peau normale et d'une peau ayant été irradiée avec des rayonnements UVA et UVB. L'immunomarquage étant réalisé avec un anticorps polyclonal de lapin anti-EMILIN-1, révélé en FITC, avec les noyaux marqués au DAPI ; - la figure 6 est un graphe qui représente l'effet de différentes concentrations de Thym citronné sur l'expression de l'EMILIN-1 par les fibroblastes dermiques humaines. EXEMPLE 1 Cet exemple a pour but de permettre la visualisation du réseau élastique du derme papillaire et profond sur des coupes de peau humaine par des moyens de coloration spécifique et d'immunomarquage. Tout d'abord ont été réalisées des coupes histologiques de plasties différentes sans vergeture dans la région abdominale issues de femmes caucasiennes de classes d'âge allant de 20 à 72 ans. Les coupes ont été réalisées dans plusieurs zones et trois coupes ont été montées sur lame. 1. Traitement histologique Pour la coloration de Verhoeff, les explants inclus dans la paraffine ont été coupés à 5�m à l'aide d'un microtome type Minot, Leica RM 2125 et les coupes ont été collées sur des lames de verre histologiques silanisées Superfrost�. Des explants congelés ont été coupés à 7 �m dans un cryostat Leica CM 3050. Les coupes ont été collées sur des lames de verre histologique silanisées Superfrost� Plus pour les immunomarquages. 2. Observations microscopiques Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique et de fluorescence, à l'aide d'un microscope Leica type Orthoplan, à l'objectif de grossissement x 250. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra numérique Sony tri CCD et le logiciel d'archivage de données Leica IM1000. - Coloration des fibres élastiques Le réseau de fibres élastiques a été coloré selon la méthode de Verhoeff. Immunomarquage de l'élastine L'élastine a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal de lapin anti élastine, (Novotec 25011) dilué au 1/800ème pendant 1 nuit à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine révélé en FITC avec les noyaux contre colorés à l'iodure de propidium. - Immunomarquage de la fibrilline-1 La fibrilline-1 a été marquée à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris anti-fibrilline-1, clone 11.C1.3, de chez Neo Markers, ref MS 231 dilué au 1/200ème pendant 1h à température ambiante avec un système amplificateur Vectastain RTU Universal VECTOR avidine/biotine et révélé en FITC. Les noyaux ont été contre colorés à l'iodure de propidium. - Immunomarquage de l'EMILIN-1 L'EMILIN-1 a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal de lapin anti-EMILIN-1, (Santa Cruz SC-50430) dilué au 1/100ème pendant 1 h à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine révélé en FITC avec les noyaux contre colorés à l'iodure de propidium. 3. Résultats Les fibres oxytalanes sont des composantes du réseau élastique. Elles sont orientées perpendiculairement à la jonction dermo-épidermique et ont un rôle d'accroche de l'épiderme sur le derme. Elles sont reliées aux fibres élaunines qui elles- mêmes sont reliées au réseau de fibres élastiques matures. Les résultats ainsi obtenus par la coloration de Verhoeff (figure 1), montrent que les fibres oxytalanes diminuent nettement avec l'âge. En revanche, le réseau de fibres élaunines ne semble pas varier en fonction de l'âge. Il n'y a donc pas de modifications du réseau dans le derme réticulaire. Le marquage avec un anticorps anti-élastine humaine (figure 2) montre que, sur les fibres oxytalanes, l'élastine diminue avec l'âge. En revanche, sur les fibres élaunines, il y a peu de modifications. Le réseau dans le derme réticulaire est quant à lui, peu modifié. Le marquage avec un anticorps anti-fibrilline-1 humain (figure 3) montre que, sur les fibres oxytalanes, il est observé une modification modérée. Les modifications des fibres élaunines observées ne semblent pas liées à l'âge. Dans le derme réticulaire, l'intensité de marquage diminue légèrement, mais c'est surtout la densité de marquage sur les fibres qui diminue avec l'âge. Le marquage avec un anticorps anti-EMILIN-1 humain (figure 4) montre que, sur les fibres oxytalanes, il est observé une diminution de la densité de marquage avec l'âge. En conclusion, il ressort des observations faites dans cet exemple que les fibres oxytalanes diminuent avec l'âge. La fibrilline-1 humaine quant à elle diminue avec l'âge dans le derme papillaire, et l'EMILIN-1 diminue sur les fibres oxytalanes et dans le derme réticulaire. EXEMPLE 2 Cet exemple a pour objectif de montrer les effets de certains facteurs extrinsèques, tels que les rayons ultraviolets sur la synthèse de l'EMILIN-l. Cet immunomarquage a été réalisé sur des coupes congelées issues de plasties différentes sans vergeture dans la région abdominale issues de femmes caucasiennes de classes d'âge allant de 20 à 72 ans. Le traitement histologique et les observations microscopiques ont été réalisés selon le même protocole que celui décrit à l'Exemple 1. Protocole d'irradiation : A partir d'une plastie abdominale, des expiants de peau ont été préparés et mis en survie en milieu spécifique BEM (BIO-EC's Explants Medium). A JO, chaque expiant a été placé sur une grille dans un puits (plaque 6 puits) avec 8 mL de milieu de culture. Un lot d'expiant de peau a été vieilli expérimentalement par 2 séances d'irradiation en UV A (8 J/cm2) et en UV B (2 J/cm2) à JO et à J4 (irradiateur Vilber Lourmat, France). Un lot témoin n'a reçu aucune irradiation. Les cultures de peau ont été ensuite arrêtées à J7 pour réaliser l'immunomarquage de la protéine Emilin-1. Immunomarquage de l'EMILIN-1 L'EMILIN-1 a été marquée sur coupes congelées avec un anticorps polyclonal (Santa Cruz SC-50430) dilué au 1/100ème pendant 1 h à température ambiante couplé à un second anticorps révélé en FITC (Isothiocyanate fluorécent) avec les noyaux marqués au DAPI (Diaminido Phényl Indol). Le marquage avec un anticorps anti-EMILIN-1 (figure 5) montre que l'irradiation UVA/UVB d'un expiant de peau humaine entraîne une diminution de l'expression de l'EMILIN-1 sur les fibres oxytalanes et dans le derme réticulaire. Les résultats des essais des deux exemples précédents permettent clairement d'identifier l'EMILIN-1 dans le réseau élastique du denne. Ils montrent également que le vieillissement, intrinsèque et actinique, a un effet sur le niveau d'expression de l'EMILIN-1. Cette glycoprotéine du réseau élastique subit autant les modifications liées à l'âge que les autres composants du réseau comme l'élastine et la fibrilline-1. EXEMPLE 3 Dans cet exemple le niveau d'expression de l'EMILIN-1 dans des fibroblastes dermiques humains a été évalué par immunomarquage, après un traitement de ces fibroblastes avec un extrait de Thym citronné (commercialisé par la société CEP Solabia en tant que Glycérola B de Thym citronné Bio). 1 Protocole expérimental 1.1 Culture Les fibroblastes humains normaux (FHNs) sont ensemencés à raison de 70 000 cellules par puits en plaque 6 puits sur lamelle en milieu MEM (Minimum Essential Medium) additionné de 10% SVF (Sérum de Veau Foetal). Les cellules sont 30 incubées à 37°C, 5% CO2. Après 48 heures les cellules sont traitées en MEM 2% SVF aux différentes concentrations non cytotoxiques d'extrait de Thym citronné soit 1%, 0,5% et 0,1%. Deux traitements témoins sont réalisés : - témoin non traité : MEM 2% SVF - témoin vitamine C : vitamine C à 0,003% dans MEM 2% SVF. La vitamine C est connue pour stimuler la synthèse des protéines du réseau dermique (fibres collagéniques, fibres élastiques) constituant ainsi une référence positive. Les cellules sont incubées pendant 15 jours. Les traitements sont renouvelés tous les 3-4 jours. Le premier jour de traitement est noté JO. 1.2 Arrêt et fixation des cultures A J3, J10 et J14, les fibroblastes en culture sont observés au microscope optique pour rendre compte de l'intégrité cellulaire. Ils sont ensuite fixés au méthanol pendant 4 minutes à -20°C. 1.3 Immunomarquage 1.3.1 Marquages 1.3.1.1 Principe de 1'immunomarquage Sur la préparation cellulaire, les anticorps anti-EMILIN-1 de lapin dits primaires se fixent spécifiquement sur l'EMILIN-l. Ensuite, un deuxième anticorps, dit secondaire d'une deuxième espèce animale (chèvre) est couplé à une molécule fluorescente et dirigé contre les anticorps de la première espèce animale (lapin) permettant ainsi de visualiser et d'augmenter le signal de marquage. Sur la préparation cellulaire, les anticorps de chèvre antiimmunoglobulines de lapin couplés à la rhodamine se fixent spécifiquement sur les anticorps de lapin anti-EMILIN-1. Observée en lumière ultraviolette, la rhodamine fixée fluoresce en rouge et permet de localiser l'EMILIN-1. 1.3.1.2 Visualisation de 1'EMILIN-1 Les lamelles sont séchées. Une zone de marquage est délimitée au crayon Dako. Chaque étape de marquage est réalisée avec un volume de 100 �l de solution par zone de marquage. Les sites de marquage non spécifiques sont saturés en déposant une solution de BSA 2 % (Bovine Serum Albumin) pendant 10 minutes à température ambiante. L'anticorps anti-EMILIN-1 de lapin est dilué au 25ème dans la BSA 1%. Les tapis cellulaires sont incubés en présence de cette solution d'anticorps pendant une heure à température ambiante avant d'être rincés au PBS (Phosphate Buffer Saline). La révélation de cet anticorps dit primaire se fait par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire couplé à la rhodamine (molécule fluorescente) dilué au 100ème dans la BSA 1%. Les lames sont incubées une heure à température ambiante à l'obscurité avant d'être rincées au PBS. Enfin un dernier marquage est réalisé pour localiser les noyaux cellulaires. Une solution de Dapi à 10 ng/ml en PBS est déposée sur les cellules pour une durée de 15 minutes à l'obscurité et à température ambiante avant d'effectuer un dernier lavage au PBS. Les lamelles sont ensuite montées sur des lames de verre avec du milieu de montage (mounting medium) puis fixées avec du vernis avant d'être observées au microscope à fluorescence (Nikon Eclipse 50i). 1.3.2 Observation Les tapis cellulaires sont observés au grossissement x 200 au microscope à fluorescence (Nikon Eclipse 50i). 15 champs par lame sont photographiés. Les images de fluorescence (rhodamine) indiquent les régions de localisation de la protéine EMILIN-1. Les images de fluorescence DAPI indiquent les noyaux cellulaires et donc le nombre des cellules par champs. Les clichés photographiques sont analysés par le logiciel d'analyse d'image Lucia. Les évaluations sont réalisées sur l'intensité de marquage de l'EMILIN-1 rapportée au nombre de cellules par champ. Les résultats sont représentés sur la figure 6. 2. Résultats 2.1 Validation des expérimentations A J3, le marquage de l'EMILIN-1 est intracellulaire. Au cours du temps, un réseau extracellulaire s'organise : le marquage évolue d'une localisation périnucléaire vers une localisation sur l'ensemble de la cellule et enfin vers l'apparition d'un réseau extracellulaire. Au cours du temps, l'intensité de marquage de 1'EMILIN-1 augmente : entre J3 et J14, l'intensité du marquage de l'EMILIN-1 des cellules témoins augmente de 72%. Il y a donc une synthèse d'EMILIN-1 au cours du temps sans aucun traitement. A J3, le marquage de l'EMILIN-1 n'évolue pas dans tous les cas de figure. A J10, la présence de Vitamine C à 0,003% dans le milieu augmente l'intensité de marquage de 67% par rapport aux cellules non traitées. Cette augmentation est encore plus nette à J14 et atteint 109%. La vitamine C induit la synthèse d'EMILIN- 1 par les fibroblastes humains dermiques. Ces différentes données permettent de valider le modèle quant à l'augmentation de la synthèse de l'EMILIN-1 au cours du temps ainsi que l'augmentation de cette expression en présence de Vitamine C. 2.2 Effet de l'extrait de Thym citronné sur l'expression de l'EMILIN-1 A J3, il n'y a pas de différence entre les marquages des cellules traitées à l'extrait de Thym citronné par rapport aux cellules non traitées. A J10, l'extrait de Thym citronné à la plus forte concentration (1%) augmente l'intensité de marquage de l'EMILIN-1 de 34%. Ce marquage se localise au niveau intracellulaire principalement. A J14, l'intensité du marquage en présence de l'extrait de Thym citronné aux plus fortes concentrations (0,5% et 1%) augmente de 57% et 54% respectivement. Dans ces conditions expérimentales, le marquage semble s'orienter vers un marquage extracellulaire. 3. Conclusion 25 Dans ces conditions expérimentales, comme présenté sur la figure 6, l'expression de l'EMILIN-1 par les fibroblastes normaux humains du derme est fortement augmentée par la présence de la vitamine C à 0,003% dans le milieu (+ 67% à J10 et +109% à J14 par rapport aux cellules non traitées). En présence de l'extrait de Thym citronné l'expression de l'EMILIN-1 est également augmentée à hauteur de 34% 30 à Jl0 et de 54% à J14 (pour une concentration de 1% de l'extrait). L'extrait de Thym citronné est donc un bon activateur de la synthèse de l'EMILIN-1 par les fibroblastes normaux humains en monocouche. EXEMPLES DE COMPOSITIONS 20 Les pourcentages sont des pourcentages en poids par rapport au poids total de la composition. EMULSION E/H % PEG 30 DIPOLYHYDROXYSTEARATE 4,00 TRIGLYCERIDES C16-Cl 8 HYDROGENES 5,00 PEG-45/DODECYL GLYCOL COPOLYMER 1,20 TRYGLYCERIDE C8-Clo 19,00 HUILE DE VASELINE FLUIDE 8,00 GLYCOLS 10,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 POLYOSES D'AVOINE 1,00 EAU DEMINERALISEE Q.s.P 100 LOTION % GLYCOL 2,00 CHLORURE DE SODIUM 1,00 ETHANOL 5,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 0,50 TROMETHAMINE 0,80 CONSERVATEURS 0,50 SOLUBILISANT 0,30 PARFUM 0,10 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 GEL % CARB OXYMETHYLC ELLULO S E 0,03 CARBOMER 0,60 SOUDE 0,17 GLYCERINE 5,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 D-PANTHENOL 75L 0,30 POLYOSES D'AVOINE 1,00 PALMITATE DE VITAMINE A 0,10 ACETATE DE TOCOPHEROL 0,05 HUILE DE RICIN HYDROGENEE PEG-40 1,35 CHELATANT 0,03 CONSERVATEURS 0,50 COLORANT 0,017 PARFUM 0,30 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 GEL-CREME H/E % ACRYLOYL DIMETHYL TAURATE/VP COPOLYMER 0,70 HELIOGEL� 0,50 GLYCOLS 5,00 CARBOMER 0,50 SOUDE 0,055 CARB OXYMETHYLC ELLULO S E 0,30 TRYGLYCERIDE C8CIO 4,50 DICAPRYLYL CARBONATE 6,00 ESTER SYNTHETIQUE 3,00 HUILE DE SILICONE 1,50 ACETATE DE TOCOPHEROL 0,05 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 CONSERVATEUR 0,10 C H E LA TANT 0,20 PARFUM 0,30 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 EMULSION H/E % ACRYLOYL DIMETHYLTAURATE/VP 0,50 COPOLYMER HELIOGEL� 0,70 GLYCOLS 4,00 POTASSIUM CETYL PHOSPHATE 0,30 C 14-22 ALCOHOLS & C 12-20 ALKYL GLUCOSIDE 2,00 CETEARYL ETHYLHEXANOATE 4,00 CAPRYLIC/CAPRIC TRIGLYCERIDE 8,00 BEURRE DE KARITE 3,00 DIMETHICONE 1,00 EXTRAIT DE THYMUS CITRIODORUS 1,00 CHELATANT 0,10 CONSERVATEUR 0,10 PARFUM 0,40 EAU DEMINERALISEE Q.S.P 100 25 30 REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait de Thymus citriodorus dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition dermatologique comme actif stimulant la synthèse de l'EMILIN-1. 2. Utilisation selon la revendication 1, dans laquelle l'extrait de Thymus citriodorus est un extrait de feuilles. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l'extrait de Thymus citriodorus est un extrait aqueux. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 15 précédentes, dans laquelle la composition comprend de 0,0001 à 1 % d'extrait de Thymus citriodorus en poids de matière sèche par rapport au poids total de la composition. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 20 précédentes, dans laquelle la composition comprend en outre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs tels que des adoucissants, des colorants, des agents filmogènes, des tensio-actifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des filtres UV, et des vitamines. 25 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer le relâchement de la peau. 7. Utilisation selon la revendication 6 pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer le relâchement de la peau dû à la grossesse et/ou à une prise ou une perte 30 de poids importante. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour favoriser et/ou augmenter et/ou restaurer l'élasticité de la peau.10 9. Utilisation selon la revendication 8 pour favoriser et/ou augmenter et/ou restaurer l'élasticité de la peau pendant et/ou après une grossesse ou une prise ou une perte de poids importante. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer et/ou atténuer et/ou lutter contre les effets d'un étirement rapide et brutal de la peau. 11. Utilisation selon la revendication 10 pour prévenir et/ou retarder et/ou diminuer et/ou atténuer et/ou lutter contre les vergetures.