Brevet FR2945951A1 — publié le 20101203

i La présente invention est relative à une nouvelle composition de 1-O-alkylglycerols. Elle concerne également une préparation pharmaceutique comprenant une telle composition, ainsi que l'utilisation de cette composition pour la fabrication d'un médicament pour le traitement du cancer. L'huile de foie de requin est utilisée de manière ancestrale en médecine populaire dans les pays scandinaves et au Japon, pour ses propriétés fortifiantes, ou encore cicatrisantes. Son utilisation a depuis été étendue et connaît aujourd'hui un intérêt grandissant. Les études chimiques effectuées sur l'huile de foie de requin ont permis d'y caractériser un certain type d'éther lipides présents en abondance, les 1-O-alkylglycérols (AKG) sous forme diacylée : les alkyldiacylglycérols (AKDAG). Chez les mammifères et les humains, les AKDAG sont présents dans la moelle osseuse, la rate et le foie. Ils sont également présents en plus faibles quantités dans le lait maternel, et les ganglions lymphatiques. Mais la source d'AKDAG la plus abondante et la plus utilisée est l'huile de foie de certains requins. Les AKG sont composés d'une chaîne aliphatique liée à un glycérol par une liaison éther en position sn-1 ; on parle alors de 1-O-alkylglycérol. La liaison éther confère une grande stabilité aux AKG et les rend résistants à l'hydrolyse. Ci-dessous est représentée la formule semi-développée de l'alcool sélachylique ou AKG 18:1 (S). OH HOC Dans l'ensemble de la présente demande, on entend par AKG x:y un 1-O-alkylglycérol comportant x atomes de carbone dans la chaine 0-alkyle et y insaturation(s). Ainsi, pour l'alcool sélachylique, on est en présence de dix-huit atomes de carbone et d'une insaturation. Quand cette désignation est suivie de la désignation "n-9", cela signifie que l'insaturation est située sur le neuvième atome 2 de carbone à partir du dernier carbone de la chaine (sur le septième si on utilise la désignation "n-7", etc.). Les AKG naturels les plus courants sont les suivants : AKG 12:0 = 1-O-Dodecyl-sn-glycérol ; AKG 14:0 = 1-O-Tetradecyl-sn-glycérol ; AKG 16:0 = 1-O-Hexadecyl-sn-glycérol=alcool chimylique ; AKG 18:0 = 1-O-Octadecyl-sn-glycérol =alcool batylique ; AKG 16:1 = 1-0-(Z)-9'-Hexadecenyl-sn-glycerol ; AKG 18:1 n-9 = 1-0-(Z)-9'-Octadecenyl-sn-glycerol= alcool sélachylique. Les alkyldiacylglycérols sont présents dans l'huile de foie de requin (20% dans une huile sans squalène), ainsi que dans l'huile de foie de chimère qui en contient 50%. L'huile de foie de requin et de chimère est déjà commercialisée à titre de complément alimentaire. On connaît l'effet anti-tumoral des alkylglycérols en général et de 15 l'huile de foie de requin en particulier. L'état (de la technique) en la matière peut être illustré par les documents : - WO-2008/037538 ; - WO-98/32447 ; 20 - Pedrono F et ail. (2004): "Natural alkylglycerols restrein growth and metastasis of grafted tumors in mice" et - Brohult A (1986): "Reduced mortality in cancer patients after administration of alkoxyglycerols". La composition moyenne de la fraction purifiée d'AKG naturels 25 extraite d'huile de foie de requin est la suivante (pourcentages en poids) : - AKG14:0: 2à3%; - AKG16:0: 11à16%; - AKG 16:1: environ 11 % ; - AKG18:0: 3à6%; 30 - AKG C18:1 n-9: environ 60% ; - AKG C18 :l n-7 : 7 à 10%. Le présent demandeur a constaté qu'une composition particulière de ces AKG de base, qu'ils soient d'origine naturelle ou synthétique, avait une action amplifiée pour le traitement du cancer et qu'elle agissait plus précisément, en 35 fonction du type de cellules et du type de cancer, sur : - la diminution du nombre de métastases ; 3 - la diminution de la croissance tumorale ; - la diminution de la diffusion métastasique ; - la variation (diminution) du poids de la rate et du nombre de splénocytes ; - et qu'elle avait un effet anti-angiogénèse. Ainsi, la présente invention se rapporte en premier lieu à une composition de 1-O-alkylglycérol (AKG), caractérisée en ce qu'elle est constituée (pourcentages en poids) : - d'au moins 85 % d'AKG en C18:1 n-9 et C16:1 ; - moins de 0,5 % d'AKG en C18:0 ; - moins de 15 % d'AKG en C12:0 et C14:0. La composition selon l'invention est particulièrement active car composée essentiellement d'AKG monoinsaturés, les autres composés étant soit inactifs, soit peu actifs, soit pourvus d'un effet délétère. Selon d'autres caractéristiques avantageuses et non limitatives de cette composition : - elle contient 90 % d'AKG en C18:1 n-9 et C16:1 ; - le ratio C18:1/C16:1 est compris entre 1:10 et 10:1 ; - ledit ratio est compris entre 8:1 et 9:1. - lesdits AKG sont d'origine naturelle ; - lesdits AKG proviennent d'huile de foie de requin ; - lesdits AKG sont des AKG de synthèse, sous leur forme active de l'énantiomère (S). L'invention concerne également une préparation pharmaceutique 25 comprenant une composition telle que décrite ci-dessus, l'utilisation d'une telle composition pour la préparation d'un médicament pour le traitement du cancer, ainsi que son utilisation à titre de complément alimentaire ou d'aliment diététique. Elle concerne aussi un procédé de fabrication d'une composition selon l'une des caractéristiques précédentes, à partir d'huile de foie de requin qui 30 consiste à mettre en oeuvre les étapes suivantes : - désqualinisation de l'huile ; - transestérification du résidu huileux et récupération de la fraction d'intérêt ; - extraction sélective de la fraction d'intérêt ; 35 - élimination des esters d'alcools aliphatiques en C1 à C10, linéaires ou ramifiés restants, par saponification ; 10 15 20 4 - séparation des alkyl glycérols par l'urée. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à la lecture de la description détaillée qui va suivre, de certains modes de réalisation. 1. Tests in vivo et résultats Modèle : Des souris femelles syngéniques C57B1/6 âgées de 6 à 8 semaines, sont greffées avec des cellules cancéreuses LLC 1 (Lewis Lung 10 Carcinome), à raison de 1/10-6 cellules/100 �l en intramusculaire. Elles sont testées en animalerie, avec un cycle normal de lumière, à 20°C, et une nourriture en accès libre constituée d'un mélange de granulés + AKG + huiles et vitamines (2g/j). Un groupe témoin reçoit de l'huile d'olive. On forme des groupes constitués de 12 souris/groupe. Le traitement nutritionnel commence dès le premier 15 jour de la greffe et s'achève après 20 jours. Les AKG distribués sont ceux constitutifs de la fraction purifiée d'AKG naturels extraite d'huile de foie de requin. Analyse des résultats Après euthanasie des souris, les poumons sont prélevés et les 20 métastases sont comptées en double aveugle sous loupe binoculaire. Les résultats sont traités statistiquement avec le logiciel GraphPad avec le test t non paramétrique de Mann et Whitney en raison de la distribution non gaussienne des échantillons. La différence est considérée comme significative lorsque p 2ème étude avec un mélange d'AKG reconstitué Le traitement nutritionnel à base d'AKG de synthèse montre un effet plus marqué comparé au mélange avec une réduction significative du nombre de métastases, respectivement de 60% et 43% par rapport au groupe témoin (olive). Ces valeurs ne peuvent être comparées avec les valeurs obtenues lors de la première étude générale car le protocole a duré 10 jours de plus. Mais ces résultats montrent que certains composants du mélange naturel sont sans effet ou ont au contraire des effets nocifs. Les tests décrits plus haut sont maintenant renouvelés. Toutefois, cette fois-ci, on teste individuellement chacun des AKG (utilisation d'AKG de synthèse). Etude des effets anticancéreux des AKG de synthèse à chaine 20 saturée. C12 :0 diminution de 18,7% du volume tumoral par rapport au groupe témoin olive, pas d'effet significatif sur le nombre de métastases. C14 :0 pas d'effet significatif sur la croissance tumorale, le nombre 25 de métastase et la diffusion métastasique. C16 :0 diminution significative de 34,4% du nombre de métastases par rapport au groupe témoin olive, C18 :0 aucun effet significatif, tendance à augmenter le volume tumoral et le nombre de métastases. 30 Etude des effets anticancéreux des AKG de synthèse à chaine insaturée. C 16 :1 C 18 :1 n-9 Volume tumoral -74,5% -50% Nombre de métastases -91,3% -72,1% 6 Ces tests montrent l'efficacité très nette des AKG C16 :1 et C18 :1 n-9 par rapport au groupe témoin olive, à 25 mg/j/souris. Effet dose sur les AKG purs : C18 :1 n-9 effet visible dès 18,75 mg/j/souris et effet plateau au-delà de 25mg/j/souris. 2. Effets des AKG sur le poids des organes Le foie et la rate sont des organes dont le poids peut être modifié en présence d'une inflammation et/ou d'un traitement. En effet, une hépato- 15 splénomégalie est un des symptômes inflammatoires dû à l'augmentation concomitante du volume du foie et de la rate. Les effets des AKG sur ces organes ont donc été observés. Modèle : des souris femelles syngéniques C57B1/6 âgées de 6 à 8 20 semaines, sont greffées avec des cellules cancéreuses LLC1 (Lewis Lung Carcinome) à raison de 1/10-6 cellules/100 �l en intramusculaire. Elles sont élevées en animalerie, avec un cycle normal de lumière, à 20°C, et une nourriture en accès libre constituée d'un mélange granulés + AKG + huiles et vitamines (2g/j). Un groupe témoin reçoit de l'huile d'olive. On forme des groupes 25 constitués de 12 souris/groupe. Le traitement nutritionnel commence dès le premier jour de la greffe et s'achève après 20 jours. Analyse des résultats Après euthanasie des souris, les rates et les foies sont prélevés et 30 pesés. Les résultats sont traités statistiquement avec le logiciel GraphPad avec le test t non paramétrique de Mann et Whitney en raison de la distribution non gaussienne des échantillons. La différence est considérée comme significative lorsque p 7 Chez le groupe témoin olive, le poids des rates a triplé chez les souris greffées par rapport aux souris saines. Pour les groupes nourris avec le C16 :0 et C18 :0, le poids des rates est quasiment identique au groupe témoin. Il est sensiblement plus important chez le groupe nourri au C18:0. En revanche, on voit une tendance à la baisse pour le groupe nourri avec la fraction purifiée d'AKG extraite d'huile de foie de requin.Les effets sont surtout très significatifs pour les groupes nourris au C16 :1 et C18 :1 n-9 où les rates conservent un poids pratiquement identiques à celui des souris saines. Ces résultats suggèrent que les AKG C16:1 et C18:1 n-9 auraient un 10 effet important de réduction de l'inflammation au niveau de la rate chez la souris cancéreuse. Etude du poids du foie Concernant l'étude des foies, on observe des poids similaires entre le 15 groupe témoin olive et les souris saines. Cependant, on observe une diminution significative pour les groupes nourris avec le C16 :1 et le C18 :1 n-9. 3. Résultats de l'étude in vitro 20 La néoangiogenèse tumorale est une étape-clef qui permet la croissance et le développement de la tumeur primaire (apport de nutriments, développement d'un réseau qui permet de coloniser d'autres tissus). Modèle : les cellules HUVEC sont isolées à partir de cordons 25 ombilicaux humains. Les cellules sont cultivées dans le milieu basal de croissance pour cellule endothéliale supplémenté avec un milieu de croissance pour cellules endothéliales. Elles sont cultivées à 37°C en atmosphère humide enrichie en CO2. La prolifération des cellules HUVEC est étudiée en présence ou en absence d'AKG testés à différentes concentrations. Les cellules sont marquées par 30 l'incorporation de thymidine tritié, ce qui permet de mesurer la synthèse d'ADN et donc la néoangiogenèse. Les AKG C16 :1 et C18 :1 inhibent très significativement l'incorporation de la [3H]-thymidine dans les cellules HUVEC : respectivement 2272 DPM contre 8431 pour le témoin, et 1647 DPM contre 10279 pour le témoin. En revanche, le C12 :0 et le C14 :0 n'ont aucun effet significatif à la même dose. 35 L'AKG C18 :0 a tendance à augmenter l'incorporation de thymidine tritié à la même dose. 8 4. Process d'obtention de la composition en AKG spécifiques Etape 1 : desqualinisation de l'huile Desqualinisation de l'huile de foie de requin. Cette opération est réalisée par distillation moléculaire à court trajet. Le distillat obtenu contient le squalène (45% à 65%) possédant une pureté supérieure à 99% alors que le résidu (55% à 35%) est composé de triglycérides (75% à 80%), d'éthers de glycérol diacylés (18% à 25%) ainsi que 5 à 10% de stéroïdes, d'acides gras et de composés de structures inconnues. . Cette désqualinisation peut aussi être réalisée par d'autres moyens tels que l'extraction par CO2 supercritique (Carlos F. Torres.Luis Vasquez.Francisco J. Senoras.Guillermo Reglero J. Amer.Chem.Soc (2007)84 :443-448). Etape 2 : transestérification du résidu huileux et récupération de la fraction d'intérêt Transestérification du résidu huileux en esters butyliques d'acides gras et en éthers de glycérols à l'aide de n-butanol et de n-butylate de potassium ou sodium. Après les traitements habituels, à savoir acidification jusqu'à pH 7, lavage à l'eau pure et évaporation du n-butanol à 50°C sous 20mbars, on récupère la fraction F1 composée de : esters butyliques d'acides gras (75 à 80%) ; alkyl glycérols (18 à 25%) ; stérols et dérivés minoritaires (5 à 10%). Etape 3 : Extraction sélective de la fraction d'intérêt F1 est extrait sélectivement par le mélange constitué d'heptane, de méthanol et d'eau. Puis la phase inférieure (méthanolique) est récoltée. La phase supérieure est à nouveau extraite deux fois de suite avec du méthanol et de l'eau. Les phases méthanoliques sont rassemblées et lavées par le même volume d'eau. La phase supérieure ainsi obtenue est soumise à une évaporation sous vide (20mbars) à chaud pour éliminer le méthanol et l'eau. On obtient alors la fraction F2 composée de : esters butyliques d'acides gras (11%) ; alkyl glycérols (78%) ; 10 15 20 25 9 stérols et dérivés minoritaires (11%). Etape 4: Elimination des esters butyliques restants par saponification Afin d'éliminer les esters butyliques restants, on fait une saponification de F2 à l'aide de potasse. Le milieu est alors extrait par un mélange 50/50 d'éther éthylique et d'eau. La phase supérieure est récoltée et séchée sur sulfate de sodium. L'éther éthylique est évaporé. On obtient alors la fraction F3 composée de : esters butyliques d'acides gras (0%) ; alkyl glycérols (89%) ; cholestérol et dérivés minoritaires (11%). Etape 5 : Séparation des alkylglycérols par l'urée On mélange F3 avec de l'éthanol, du méthanol et de l'urée. On chauffe à 70°c, puis on laisse la solution revenir à température ambiante pendant 4H, puis on laisse à 4°C pendant 18H. On filtre ensuite la solution pour récolter : - un chlatrate ; - la phase alcoolique ; Celle-ci est évaporée sous vide. Le résidu est repris par de l'acide chlorhydrique 1N et de l'acétate d'éthyle. Après lavage par 100ml d'eau, l'acétate d'éthyle est évaporé. On obtient une huile dont la composition en alkyl glycérols est la suivante (analyse en chromatographie gazeuse) : AKG % 17:0 0,0 14:0 0,4 16:1 9,8 16:0 1,8 18:1 n-9 80,9 18:1 n-7 7,0 18:0 REVENDICATIONS1. Composition de 1-O-alkylglycérol (AKG), caractérisée en ce qu'elle est constituée (pourcentages en poids) : - d'au moins 85 % d'AKG en C18:1 n-9 et C16:1 ; - moins de 0,5 % d'AKG en C18:0 ; - moins de 15 % d'AKG en C12:0 et C14:0. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle contient au moins 90 % d'AKG en C18:1 n-9 et C16:1. 3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée par le fait que le ratio C18:1/C16:1 est compris entre 1:10 et 10:1. 4. Composition selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit ratio est compris entre 8 :1 à 9:1. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que lesdits AKG sont d'origine naturelle. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée par le fait que lesdits AKG proviennent d'huile de foie de requin. 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait que lesdits AKG sont des AKG de synthèse sous leur forme active de l'énantiomère (S). 8. Préparation pharmaceutique comprenant une composition selon 20 l'une des revendications précédentes. 9. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 7 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement du cancer, notamment pour diminuer le nombre de métastases, diminuer la croissance tumorale, diminuer la diffusion métastasique, diminuer le poids de la rate, ou à effet anti-angiogenèse. 25 10. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 7 à titre de complément alimentaire ou d'aliment diététique. 11. Procédé de fabrication d'une composition selon l'une des revendications 1 à 6, à partir d'huile de foie de requin, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en oeuvre les étapes suivantes : 30 - désqualinisation de l'huile ; - transestérification du résidu huileux et récupération de la fraction d'intérêt ; - extraction sélective de la fraction d'intérêt ;- élimination des esters d'alcools aliphatiques en C1 à Cio, linéaires ou ramifiés restants, par saponification ; - séparation des alkyl glycérols par l'urée.