Brevet FR2937538A1 — publié le 20100430

Produit antigrippal et ses méthodes de préparation Champs de l'invention: Devant la problématique du risque de pandémie de la grippe aviaire, les solutions 5 thérapeutiques existantes sont uniquement d'origines synthétiques et coûteuses. En effet, comme tous les virus de type A, le sous-type H5N1 a une grande capacité à muter au cours du temps, ainsi qu'à échanger ses gènes avec des virus grippaux appartenant à d'autres types infectants d'autres espèces. Un sous-type de virus peut 10 cesser de circuler pendant plusieurs années dans la population humaine mais rester présent dans une population animale. Si la population animale est alors en contact direct avec un être humain, elle pourra lui transmettre à nouveau le virus. Un sous-type de virus peut également être nouvellement créé par un réassortiment génétique qui se produit lors d'une co-infection d'un hôte par deux virus différents. 15 Si ce nouveau virus possède des segments H5 et NI propres au virus aviaire, il échappera complètement à la reconnaissance du système immunitaire humain. S'il possède également des gènes lui permettant de se multiplier efficacement chez les mammifères, il aura alors la faculté de se transmettre d'homme à homme aussi efficacement que la grippe classique. 20 L'apparition d'un virus grippal appartenant à un sous-type viral totalement inconnu de la population humaine, comme le H5N1, rend la mémoire immunitaire de l'homme totalement inefficace. C'est ce qui rend plausible une dissémination rapide et mondiale du virus. 25 Les experts de la grippe reconnaissent aujourd'hui qu'une nouvelle pandémie semble inévitable. Elle sera probablement causée par un virus H5N1 dérivé de la souche grippale aviaire qui circule actuellement en Asie et arrive aux portes de l'Europe. L'idée d'un vaccin n'est pas une solution satisfaisante au regard de l'évolution possible 30 du virus lors du passage à l'homme. Ce que l'on sait, c'est que la production d'un vaccin demandera au moins six mois une fois la souche circulante isolée et que, compte tenu de la capacité de production mondiale des fabricants de vaccins, ces six mois ne permettront pas de produire plus 35 d'un milliard de doses monovalentes. Deux doses étant nécessaires pour acquérir une protection, moins de 500 millions de personnes, soit 14 % de la population mondiale, pourront être vaccinées. Cela fait une place particulièrement importante aux traitements antiviraux qui seront donc en première ligne pour combattre une éventuelle pandémie dans un premier temps. 40 RESUME DE L'INVENTION L'invention porte sur une Composition utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et au traitement des infections virales induites par les virus de la 45 famille des Orthomyxoviridae, elle comporte : Des extraits de feuilles d'olivier Des extraits de pépins de pamplemousse Des extraits de romarin ^ Des extraits de thé vert Du curcumin Cette composition thérapeutique se caractérise par des teneurs en extraits de feuilles d'olivier comprises entre 0.01 à l00 mg par Kg. Cette composition thérapeutique se caractérise également par des teneurs en extraits de 10 pépins de pamplemousse comprises entre 0.01 à 100 mg par Kg. Cette composition thérapeutique peut se présenter sous différentes formes, sous forme de poudres compactées ou non, sous forme liquide, solution ou dispersion, sous forme semi-solide ou gélifiée ou émulsionnée ou dispersée, ou sous forme d'aérosol. Cette composition thérapeutique peut être administrée voie orale, par injection intraveineuse, par inhalation, soit à l'aide d'un spray, d'un diffuseur, ou par imprégnation préalable dans un tissu, ou par tout autre moyen approprié connu en soi. 2 0 La présente invention porte sur les capacités antivirales de diverses formulations à partir d'antioxydants, et plus particulièrement à partir d'extraits végétaux possédant des propriétés antioxydantes. Ces antioxydants, de par leur activité antibactérienne constituent une barrière aidant dans la prévention de nouvelles infections favorisées par l'attaque des virus. La présente invention réside dans l'association desdites substances 25 qui permet d'en potentialiser l'efficacité. La présente invention porte sur les virus de la famille des Orthomyxoviridae dont le virus de la grippe et plus particulièrement celui de la Grippe aviaire. La présente invention porte également sur une formulation utilisant des compositions 30 pharmaceutiques ou chimiques permettant l'amélioration, le traitement et la prévention de maladies associées avec les virus grippaux. L'atteinte de l'organisme par le H5N1, virus de la grippe aviaire, se caractérise par le déclenchement d'une réaction inflammatoire exagérée, qui se traduit par une sécrétion 35 de mucosité, type pneumonie qui entraîne une détresse respiratoire chez le sujet atteint. C'est ce symptôme qui est responsable de l'exceptionnelle sévérité de la maladie. L'action de l'invention sera de diminuer cette réponse inflammatoire, c'est ce que la littérature scientifique tend à prouver dans les différentes publications qui servent de références. 15 Ces publications décrivent que les différents composants de l'invention interfèrent avec les mécanismes généraux de la réponse inflammatoire de l'organisme au virus de la grippe aviaire. Ainsi l'action de l'invention permettra de diminuer le phénomène de détresse 5 respiratoire qui a souvent un effet létal chez le sujet atteint, lui permettant de passer le stade critique de la maladie. La diversité des modes d'actions sur le virus, sur sa multiplication et ses effets permettent d'envisager de nombreuses applications de l'invention, notamment grâce aux 10 différentes formes galéniques envisageables qui représentent un avantage essentiel de lutte contre la pandémie de la grippe aviaire. L'invention représente une barrière prophylactique de contamination entre humains, dans le cas d'une pandémie, par exemple par imprégnation des masques de protections leur assurant une efficacité plus sure et plus durable. 15 Dans un autre exemple, elle pourra servir d'assainisseur de l'air des lieux publics par sa diffusion en aérosol dans les gaines d'aération, ce qui permettrait de diminuer les conséquences financières d'une pandémie pour la société. DESCRIPTION Une association méthodique de différents principes actifs dont chacun est décrit dans la littérature scientifique comme agissant sur plusieurs bactéries et virus pathogènes. Le 25 concept de l'invention est basé sur la synergie de ces différents actifs décrits. En effet, la multiplication du virus de la grippe est un mécanisme complexe décrit sous la forme de plusieurs étapes. La combinaison de ces différents principes actifs permet d'agir sur la plupart de ces étapes au lieu de se focaliser sur une étape particulière ; c'est cette approche qui permet de gagner en efficacité. 30 D'autre part, l'invention représente un dérivé de produits naturels non toxiques déclinable selon plusieurs formes et qu'il pourra donc être utilisé plus facilement au niveau des différents facteurs de propagation du virus sans toxicité pour l'environnement et ses habitants. 35 Il a été fabriqué des prototypes selon l'invention, ces prototypes ont été testés à plusieurs niveaux. Il a tout d'abord été vérifié l'activité des principes actifs contenus dans l'invention. Ils ont été testés avec succès contre diverses souches microbiennes comme 4 0 Escherichia Coli ; Staphylococcus aureus, Salmonella spp ou Streptococcus pneumoniae. L'efficacité in vitro contre Haemophilus influenzae a été ensuite réalisée en dose-réponse. Ces résultats préliminaires qui sont reportés dans l'exemple 1 ci-dessous démontrant une activité. 20 45 Exemple 1 : Date Jo J+1 jour d'analyse Résultats : UFC / ml Concentration Extrait 2 Extrait 2 Extrait 2 Extrait 2 (ppm) sans PA avec PA sans PA avec PA 250 18 16 0 0 500 18 1 0 0 1000 11 0 0 0 2000 16 0 0 0 Tableau 1 : Effet comparé de composant du ND235 et de son solvant sur haemophilus 5 influenzae par dénombrement après contamination initiale d'environ 100UFC/ml. Interprétation Simplifiée : Dès le jour 0 le bacille est bloqué avec le principe actif (PA) soit à 12% avec 250 10 ppm de PA soit à 94,4 % avec 500 ppm de PA soit à 100% avec des quantités supérieures de PA. 4 Exemple 2 : Nous avons alors élaboré et réalisé une formulation galénique permettant une utilisation plus aisée et plus efficace du ND235 facilitant les études de toxicité aiguë in vitro du ND235. Les résultats de cette étude présentés dans le tableau 2 ci-dessous montrent la très faible toxicité du ND235. Concentration (g/1) ND235 Témoin Cellules Moyenne Ecart Type Moyenne Ecart Type INDICE DE VIABILITE CELLULAIRE 7,50E+00 0,553 0,18275393 0,126 0,05201653 2,50E+00 0,84733333 0,26023515 0,173 0,05201653 8,33E-01 1,073 0,20751626 0,273 0,05201653 2,78E-01 1,70266667 0,07965132 0,282 0,05201653 9,26E-02 1,44666667 0,1268122 0,266 0,05201653 3,09E-02 0,70166667 0,04101626 0,302 0,05201653 1,03E-02 0,361 0,09534674 0,265 0,05201653 3,43E-03 0,24666667 0,09856132 0,235 0,05201653 1,14E-03 0,219 0,08758425 0,283 0,05201653 3,81E-04 0,19466667 0,0903567 0,269 0,05201653 1,27E-04 0,206 0,10742905 0,298 0,05201653 4,23E-05 0,203 0,05973274 0,259 0,05201653 Tableau 2 : Effet dose - réponse de ND235 sur la viabilité des lymphocytes humains en Culture. Interprétation simulifiée : 1) Quelle que soit la concentration de ND235, les valeurs des indices de viabilité 15 (de 0,2 à 1,7) sont supérieures aux valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,2 à 0,3). Ceci montre que le ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de 7g/1. 2) Dans les concentrations supérieures à 2 10-3 g/l (lignes 8 à 1), le ND235 20 stimule la croissance cellulaire par rapport au témoin cellulaire avec un pic d'activité à la concentration de 0,3 g/1 (ligne 4) On remarque que le ND235 n'est pas toxique puisqu'au contraire, il stimule la croissance cellulaire lorsque ses concentrations sont supérieures ou égales à 2 10"3 g/I. Après avoir vérifié la non toxicité du ND235 sur des cellules humaines sanguines en culture, nous avons étudié l'éventuelle toxicité sur d'autres types tissulaires qui sont plus susceptibles à l'infection par le virus de la grippe, les cellules rénales MDCK. 25 Exemple 3 : La toxicité a été évaluée dès l'ajout du produit (toxicité aiguë) et 24h après l'ajout du produit (éventuel effet cytostatique) Concentration Témoin Association 1 Association 2 Association 3 Association 4 ND235 (~) Sans Produit INDICE DE VIABILITE CELLULAIRE 1,00E-4-01 0,370 � 0,039 1,773 � 0,022 1,8961-0,061 1,764 � 0,022 1,726 � 0,013 1,839 � 0,020 3,33E+00 0,353 � 0,045 1,820 � 0,136 1,682 � 0,389 1,634 � 0,099 1,749 � 0,061 1,817 � 0,053 1,11E+00 0,350�0,065 1,746�0,122 1,617�0,182 1,476�0,029 1,686�0,105 1,531 �0,100 3,70E-01 0,364 �0,067 1,545 � 0,089 1,3051-0,051 1,4431-0,127 1,421 � 0,036 1,1981-0,048 1,23E-01 0,391 � 0,081 0,772 � 0,088 0,6921-0,073 0,7201-0,082 0,7751-0,072 0,692 � 0,042 4,12E-02 0,398 � 0,038 0,489 � 0,039 0,484 � 0,058 0,484 � 0,071 0,4791-0,075 0,515 � 0,055 1,37E-02 0,389 � 0,050 0,431 � 0,029 0,446 � 0,035 0,440 � 0,037 0,449 � 0,042 0,444 � 0,037 4,57E-03 0,336 � 0,061 0,412 � 0,053 0,411 � 0,075 0,393 � 0,059 0,3761- 0,068 0,365 � 0,078 Tableau 3 : Effet direct en dose - réponse de ND235 et de diverses associations de ses principes actifs sur la viabilité des MDCK en Culture. 10 Interprétation simplifiée : 1) Quelle que soit la concentration de ND235 ou des différentes associations de ses principes actifs, les valeurs des indices de viabilité (de 0,3 à 1,9) sont supérieurs aux valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,3 à 0,4, colonne 2). Ceci montre que le 15 ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de 10 g/l. 2) Dans les concentrations supérieures à 1,7 10-2 g/l (lignes 7 à 1), le ND235 et les différentes associations de ses principes actifs stimulent la croissance cellulaire par rapport aux témoins cellulaires. 20 Concentration Témoin Association Association Association Association ND235 Sans 1 2 3 4 Produit INDICE DE VIABILITE CELLULAIRE 1,00E+01 0,429 � 0,010 1,856 � 0,061 1,829 � 0,048 1,733 � 0,118 1,770 � 0,076 1,819 � 0,078 3,33E+00 0,385 � 0,004 1,638t 0,044 1,750 � 0,046 1,657 � 0,044 1,715 � 0,080 1,839 � 0,079 1,11E+00 0,429 � 0,011 0,962t 0,068 0,760 � 0,019 0,866 � 0,043 0,897 � 0,036 0,689 � 0,018 3,70E-01 0,448 � 0,018 0,610 � 0,036 0,469 � 0,027 0,610 � 0,066 0,601 � 0,030 0,477 � 0,027 1,23E-01 0,476 � 0,001 0,464 � 0,006 0,440 � 0,005 0,455 � 0,006 0,448 � 0,006 0,443 � 0,007 4,12E-02 0,443 � 0,018 0,427 � 0,023 0,436 � 0,028 0,437 � 0,035 0,437 � 0,012 0,440 � 0,026 1,37E-02 0,448 � 0,024 0,431 � 0,028 0,397 � 0,021 0,391 � 0,020 0,403 � 0,004 0,401 � 0,030 4,57E-03 0,454 � 0,047 0,462 � 0,053 0,422 � 0,021 0,413 � 0,009 0,406 � 0,034 0,389 � 0,009 1,52E-03 0,442 � 0,032 0,437 � 0,014 0,434 � 0,001 0,397 � 0,051 0,392 � 0,075 0,444 � 0,004 Tableau 4 : Effet à 24h en dose - réponse du ND235 et de diverses associations de ses principes actifs sur la viabilité des MDCK en Culture. Interprétation simplifiée : 1) Quelle que soit la concentration de ND235 ou des différentes associations de ses principes actifs, les valeurs des indices de viabilité (de 0,38 à 1,84) sont supérieures 10 aux valeurs des témoins cellules sans produit (de 0,38 à 0,45). Ceci montre que le ND235 n'est pas toxique même aux concentrations les plus élevées de 10g/1 (première ligne). 2) Dans les concentrations supérieures à 3 10-1 g/1 (lignes 4 à 1), le ND235 et les 15 différentes associations de ses principes actifs stimulent la croissance cellulaire par rapport aux témoins cellulaire. On remarque que le ND235 n'est pas toxique puisqu'au contraire, il stimule la croissance cellulaire des MDCK lorsque ses concentrations sont supérieures ou égales à 20 0,3 g/1 .5 Modes d'actions du ND235 au niveau de la cellule infectée (figure 1) Action du ND235 sur l'étape 1 L'amarrage du virus de la grippe à la cellule cible est permis par l'interaction entre une hémagglutinine virale et des récepteurs d'acide sialique situés à la surface des cellules (Lamb, 1989). On peut comparer ce fonctionnement à un système de clé et de serrure. Une partie de la sous unité HA1 (la clé), tournée vers l'extérieur, a une forme bien particulière et reconnaît une molécule précise : l'acide sialique (la serrure), qui est présente à la surface de certaines cellules. Les deux formes se reconnaissent parfaitement. Cette reconnaissance entre l'HA et l'acide sialique entraîne l'attachement de la particule virale à la cellule cible (la clé est insérée dans la serrure). Le blocage de cette étape de fixation du virus à la cellule hôte par un des principes actif 15 du ND235 a été clairement démontré par des travaux publiés dans des revues scientifiques de bon niveau (Facteur d'Impact > 3). Le ND235 bloque la multiplication du virus et diminue donc les interactions cellulaires dues à l'infection, ce concept a un effet directement destructeur du virus au niveau de la cellule atteinte, ce qui diminue l'excès de réponse immunitaire qui entraîne dans le cas 20 de la grippe aviaire la détresse respiratoire souvent responsable de la mort du sujet infecté. --~ Action du ND235 sur l'étape 12 25 Libération des nouveaux virus : Les nouvelles particules virales restent attachées à la membrane de la cellule qui les a produit, à cause de la liaison entre l'Hémagglutinine (du virus) et l'acide sialique (de la cellule). Les protéines NA cassent cette liaison, permettant ainsi aux nouveaux virus de se détacher et d'aller infecter de nouvelles cellules cibles. Une des actions du principe actif contenu dans le ND235 va empêcher 30 l'action de la neuraminidase (NA) qui est responsable du détachement du virus de la cellule hôte et de la libération de nouveaux virus infectieux. Le blocage de cette libération des particules infectées dans la cellule va de ce fait diminuer le nombre de virus mis en circulation. Le ND235 va modérer la réponse inflammatoire des différentes cellules atteintes par l'attaque virale. 35 ù- Conclusion sur les modes d'actions cellulaires du ND235 Plusieurs principes actifs contenus dans le ND235 présentent une action reconnue contre le virus de la grippe aviaire. Cette action a d'ailleurs fait l'objet de publications 40 reconnues dans différents journaux scientifiques de bon niveau. Les actions antivirales décrites démontrent leur efficacité en bloquant la production du virus dans la cellule, notamment au niveau des étapes 6 et 7 de régulation de la production des protéines virales et de synthèse des protéines virales efficaces. Ainsi le nombre de virus produit sera diminué et le ND235 agira sur la cellule à 45 l'identique des mécanismes précédents en agissant sur l'infection et ses conséquences Une deuxième étude a été menée afin de vérifier l'effet antiviral du ND235 Contre le virus de la grippe Influenza A. Principe de l'étude : Les cellules MDCK sont les cellules de référence pour l'étude de la multiplication du virus de la grippe de type A. Pour notre étude d'effet antiviral, nous avons choisi d'utiliser une souche de référence du virus influenza de type HIN1, la souche A/PRI8/34. Cette souche virale a été obtenue chez un patient Portoricain et ce virus de référence est accessible au niveau de la banque Américaine de tissus et virus (American Type Culture Collection). L'infection virale est suivie par son effet cytopathogène (CPE) sur les cellules en culture. Cet effet peut être observé par l'apparition de plages de lyse sur des monocouches cellulaires (Plaque Forming Unit ; PFU). Si l'on augmente la concentration virale on peut étendre la lyse cellulaire à tout ou partie de la monocouche cellulaire. Les expériences sont réalisées dans des plaques de culture 96 puits qui sont colorées au cristal violet. La coloration va résulter de la présence de cellules. Ainsi la disparition de la couleur attestera de la destruction viro-induite des cellules. Par ailleurs, nous vérifierons en parallèle dans des puits contenant différentes concentrations de notre produit sans virus, qu'il n'entraîne pas de lyse cellulaire confirmant son absence de toxicité dans notre système. L'activité antivirale du ND235 est établie en comparant les effets de différentes dilutions du ND235 en présence de quantités décroissantes de virus. Les quantités de virus utilisées pour l'infection sont données en TCID50. La TCID50 est la concentration virale qui va donner un effet CPE sur 50% des cellules en culture. Les expériences sont réalisées en triplicate. Cellules : Les cellules MDCK dérivent de cellules isolées par S.H. Madin et N.B. Darby en 1958 à partir d'un rein d'une chienne adulte de race cocker epagneul. Ces cellules sont accessibles au niveau de la banque Américaine de tissus et virus ATCC. Les cellules MDCK sont cultivées à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2 35 dans du milieu DMEM avec 10% de sérum de veau foetal en présence d'antibiotiques Pénicilline Streptomycine. Virus : La souche virale d'influenza A utilisée est la souche A1PR/8/34 de type HIN1 (ATCC VR- 1249). 45 Lors de l'infection, les cellules MDCK sont cultivées à 33°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2 et dans du milieu MEM avec de la BSA 0,125 % et en présence de 1�g / ml de trypsine traitée à la TPCK (Perbio SA, Be). 40 Protocole : Des plaques de culture de 96 puits sont ensemencées à raison de 5 10 4 cellules MDCK par puits. Ces cellules sont cultivées à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2 dans du milieu DMEM avec 10% de sérum de veau foetal en présence d'antibiotiques Pénicilline Streptomycine. Lorsqu'elles forment une monocouche confluente elles sont infectées par des quantités décroissantes de virus résultant de dilutions au tiers en cascade d'une solution stock de virus. Le titre de la solution stock de départ du virus établi dans des plaques de culture 96 puits est de 81 TCID50. Ces infections sont effectuées en absence ou présence de ND235 à différentes concentrations. Les cellules sont ensuitre maintenues en culture à 33°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2 pendant quatre jours puis sont colorées au Cristal Violet. Les effets cytopathogènes sont alors enregistrés afin d'établir le pourcentage d'inhibition de l'infection virale obtenu par les différentes concentrations de ND235. Les quantités de cellules restantes sont estimées par la mesure de l'absorption de la monocouche à 595 nm réalisée dans un lecteur de microplaque. Les valeurs d'absorption à 595 nm sont corrigées par celles des absorptions non spécifiques mesurées à 405 nm. Les résultats des valeurs moyennes et des écarts types sont présentés dans le tableau 3 et sous forme de diagramme. 10 Résultats : Viral InputConcentration en ND 235 0% 0% 0% 4% 4% 4% 0,4% 0,4% 0,4% 0,04% 0,04% 0,04% -0,007 0,005 0,002 -0,004 -0,006 0,024 -0,008 -0,007 -0,01 -0,006 -0,006 -0,005 -0,012 0,018 -0,01 -0,009 0,03 0,053 0,073 -0,003 -0,005 0,034 0,02 0,004 -0 ,005 0,003 0,093 0,352 0,317 0,273 0,235 -0,004 0,049 -0,006 0,009 0,025 0 025 0,024 0,115 0,527 0,201 0,653 0,508 0,453 0,244 0,493 0,325 0,06 , 0,038 0,177 0,513 0,686 0,737 0,74 0,596 0,447 0,462 0,755 0,643 0,49 0,471 0,494 0,483 0,457 0,734 0,815 0,537 0,478 0,52 0,592 0,533 0,407 0,331 0,477 0,481 0,745 0,828 0,753 0,621 0,414 0,465 0,582 0,646 0,351 0,535 0,512 0,436 0,731 0,728 _ 0,91 0,407 0,374 0,591 0,644 0,59 0,353 Tableau 1 : Données brutes des absorbances en fonction de la concentration en ND23 5 et des quantités virales. Viral Input : quantités de virus en TCID50 utilisées pour l'infection au temps O. 0,3 0,1 Ctrl30 Titre CONTROLE ND235 4 % ND235 0,4 % ND235 0,04 % viral 81 + + + + + + + + + + + + 27 + + + + + + + + + + + + 9 + + + +- +- +- +- + + + + + 3 + + + - + - _ _ +- - +- + 1 + + - - - - - - - - - - 0,3 - - - - - - - - - .. - - 0,1 - - - - - - - - - - - - Ctrl - - - - - - - - - - _ - Tableau 2: Inhibition de l'infection par le virus Influenza A par différentes concentrations de ND235 Titre viral : en TCID50. Effet : + : destruction > 60% des cellules ; + - : destruction de 30 % à 60 % des cellules ; - : présence de 70 % à 100% des cellules. Interprétation : Les différentes concentrations de produit ND235 sont efficaces contre le virus. On peut calculer le pourcentage d'inhibition virale en comparant les puits infectés par les plus faibles dilutions virales efficaces en présence et absence du produit. Ainsi il résulte que : ND235 4 % : 80 % d'inhibition virale ND235 0,4 % : 84 % d'inhibition virale ND235 0,04 % : 73 % d'inhibition virale Dans les puits témoins contenant les différentes concentrations de ND235 en absence de virus (ligne Ctrl) la coloration n'est pas diminuée en présence de ND235. La diminution 20 de l'intensité de la coloration aurait attesté d'une toxicité. On confirme les résultats de nos études préalables de toxicité montrant que le ND235, même aux concentrations les plus élevées ne présente pas de toxicité. Viral Input ND235 4 % ND235 0,4 % ND235 0,04 % Control 0,1 0,7753 � 0,0458 0,5000 � 0,1078 0,5263 t 0,1552 0,4297 � 0,0855 0,3 0,6687 � 0,1877 0.5117 � 0,0304 0,5107 � 0,0945 0,4827 � 0,0115 1 0,7210 � 0,0303 0,5017 � 0,0820 0,6293 � 0,1330 0,2427 � 0,2442 3 0,4603 � 0,2333 0,4017 � 0,1393 0,2927 � 0,2183 0,0547 � 0,0523 9 0,3140 � 0,0396 ~ 0,0933 � 0,1255 0,0093 � 0.0155 0,0303 � 0,0544 27 0,0247 � 0,0313 0,0217 � 0,0445 0,0193 � 0,0150 -0,0020 � 0,0173 81 0,0047 � 0,0168 -0,0083 � 0,0015 -0,0057 � 0,0006 0,0000 � 0,0060 - Tableau 3 : Valeurs moyennes et déviation standard des absorbances en fonction de la concentration en ND235 et des viral input. Viral input : en TCID50. Les valeurs d'absorptions à 595 nm ont été corrigées par les valeurs d'absorption à 405nm. La figure 2 rend compte de l'effet du ND235 sur l'infection des cellules MDCK par Influenza A Virus. Interprétation simplifiée de la figure 2 : Les valeurs d'absorption dans les puits contrôle sans virus (première série, 0 TCID50) 15 sont de l'ordre de 0,75 et 0,45 en présence respectivement de 4 % ND235 et de 0 cYo (control) de ND235. Ainsi, le ND235 aux concentrations les plus élevées (ND235 4 %) va favoriser le développement des cellules en comparaison des cellules témoin n'ayant pas de ND235 (Control). Pour les concentrations 10 et 100 fois inférieures en ND235, cet effet stimulant la croissance cellulaire est moins prononcé mais semble toutefois 2 0 présent. Ces résultats sont en accord avec ceux que nous avons obtenus lors de l'étude de toxicité in vitro de notre produit indiquant un effet bénéfique sur la croissance cellulaire. Les différentes concentrations présentées de ND235 (série 1) bloquent efficacement des doses de virus détruisant 50 % des cellules. Pour les infections virales effectuées avec 25 trois fois et neuf fois plus de virus (séries 3 et 9) on observe encore une inhibition du virus par le ND235 mais de façon dose-dépendante, les concentrations en ND235 les plus élevées conférant la meilleure protection. Conclusion : 30 Le ND235 est un antiviral efficace contre l'infection in vitro par le virus influenza de type A. Nous avons démontré que son efficacité est dose - dépendante. Il ressort de cette étude que le ND235 à une concentration de 0,4 % présente une efficacité antivirale de 84 %. Il est important de noter qu'à une dose dix fois inférieure, 35 l'efficacité du ND235 reste remarquable. En effet elle est de l'ordre de 75 %. D'autre part, il est utile de rappeler que ce produit est complètement naturel et que l'efficacité de ses constituants tant au niveau antiviral qu'au niveau de la diminution de la réponse immunitaire a été décrite dans la littérature scientifique. Enfin, l'intérêt de ce 40 produit réside également dans le fait qu'il va bloquer le virus de la grippe par différents mécanismes ce qui, à l'inverse d'un produit unique comme l'oseltamivir ou l'amantadine, va très largement diminuer la probabilité d'apparition de mutants résistants. 45 LEGENDE DES FIGURES : La figure 1 représente le schéma de la multiplication du virus de la grippe A et le mode 5 d'action du ND235. Dans cette figure, l'interférence du ND235 est symbolisée grâce aux quatre flèches aux traits épais partant des chiffres romains I et II. Dans la figure, les numéros correspondent aux différentes étapes séquentielles du cycle d'infection de la cellule par le virus de la grippe A . Ces phases sont les suivantes : 10 1) Attachement du virus à la cellule 2) Entrée dans la cellule par endocytose 3) Diminution du pH 4) Fusion, libération du contenu du virus dans la cellule 5) Entrée de l'ARN viral dans le noyau 15 6) Fabrication de nouveaux brins d'ARN viral 7) Fabrication des protéines virales 8) Sortie de l'ARN viral du noyau 9) Migration des éléments 10) Assemblage 2 0 11) Bourgeonnement 12) Libération des nouveaux virus 25 La figure 2 représente l'effet du ND235 sur l'infection des cellules MDCK par Influenza A Virus. En abscisse sont données des concentrations croissantes de virus et en ordonnée les valeurs d'absorption proportionnelles au nombre de cellules. Les mesures sont_ effectuées en absence (Control) et en présence de quantités croissantes de ND235 ( 0,04 %, 0,4 % et 4 %). 13 REVENDICATIONS1. Composition utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et au traitement des infections virales induites par les virus de la famille des 5 Orthomyxoviridae caractérisée en ce qu'elle comporte : Des extraits de feuilles d'olivier Des extraits de pépins de pamplemousse Des extraits de romarin Des extraits de thé vert 10 Du curcumin 2. Composition thérapeutique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend 0.01 à 100 mg par Kg d'extraits de feuilles d'olivier 15 3. Composition thérapeutique selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend 0.01 à 100 mg par Kg d'extraits de pépin de pamplemousse 4. Composition thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de poudres compactées ou non, 2 0 sous forme liquide, solution ou dispersion, sous forme semi-solide ou gélifiée ou émulsionnée ou dispersée, ou sous forme d'aérosol 5. Composition thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'elle est administrée par voie orale, par injection intraveineuse, 25 par inhalation, soit à l'aide d'un spray, d'un diffuseur, ou par imprégnation préalable dans un tissu. 14