Brevet FR2937249A1 — publié le 20100423

NOUVELLES UTILISATIONS PHARMACEUTIQUES DE NANOPARTICULES La présente invention a pour objet de nouvelles utilisations pharmaceutiques de nanoparticules, notamment dans le domaine du traitement du cancer. L'élimination des cellules cancéreuses est assurée par chimiothérapie en utilisant des molécules de synthèse principalement anti-mitotiques. Les médicaments antinéoplasiques classiques inhibent la prolifération cellulaire en io interagissant de façon non-spécifique avec les processus de réplication cellulaire (duplication des acides nucléiques, fonctionnement correct du fuseau mitotique, synthèse des purines et des pyrimidines, etc.). Les médicaments antinéoplasiques innovants, par contre, sont principalement des anticorps monoclonaux dirigés contre des antigènes tumoraux spécifiques. Ces molécules peuvent être nues 15 (comme, par exemple, le Herceptin�) ou véhiculer des médicaments cytotoxiques ou des particules radioactives (comme, par exemple, le Ibritumomab, administré en association avec d'autres médicaments antinéoplasiques pour traiter les lymphomes non hodgkiniens). L'utilisation des molécules anti-mitotiques présente un inconvénient majeur. 20 En effet, ces molécules s'attaquent à toutes les cellules cancéreuses mais également aux cellules non cancéreuses. Cela implique que de nombreux types cellulaires à division rapide sont touchés (peau, globules rouges, globules blancs, plaquettes...). Les effets secondaires peuvent donc être très importants et souvent on observe une réduction des schémas thérapeutiques, ce qui limite l'efficacité de 25 la thérapie. Une partie des médicaments antinéoplasiques classiques, en outre, est cancérogène, ce qui implique un risque de développer une nouvelle tumeur chez les patients ainsi traités, mais aussi chez les personnes préposées à la manipulation des médicaments. Les médicaments de deuxième génération, qui, 30 dans la plupart des cas, sont encore considérés comme traitements de deuxième choix, conjointement à des effets secondaires mineurs, offrent souvent un résultat thérapeutique inférieur à celui des médicaments classiques, et en plus sont extrêmement coûteux. Ainsi, la présente invention a pour but de fournir un nouveau médicament anti-cancéreux sélectif et efficace, c'est-à-dire un médicament efficace sur les cellules cancéreuses mais n'attaquant pas les cellules non cancéreuses, et dont, en plus, la production est relativement peu onéreuse. La présente invention a pour but de fournir un médicament anti-cancéreux inhibant la survie cellulaire des cellules cancéreuses sans inhiber celle des cellules non cancéreuses. La présente invention concerne des nanoparticules de SiC (carbure de silicium) pour leur utilisation dans le cadre du traitement du cancer. io La présente invention concerne donc l'utilisation de nanoparticules de SiC pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer. Les nanoparticules de SiC sont chimiquement, thermiquement et mécaniquement stables. Par ailleurs, elles sont stables aux radiations (UVA, UVB et rayons X notamment). Elles sont non toxiques et faciles d'incorporation, 15 notamment dans les cellules vivantes saines, ce qui permet de les utiliser comme marqueur fluorescent (Botsoa et al., Applied Physics Letters, 92, 173902, 2008). Ainsi, les inventeurs ont constaté, après incorporation de nanoparticules de SiC, que celles-ci présentent un fort effet thérapeutique sur les cellules cancéreuses, sans toutefois affecter les cellules non cancéreuses. 20 En effet, les nanoparticules de SiC mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention provoquent la mort des cellules cancéreuses humaines tout en permettant aux cellules humaines saines de survivre. Selon un mode de réalisation préféré, les nanoparticules susmentionnées présentent une taille comprise de 0,5 nm à 1 �m. 25 Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la taille desdites nanoparticules est inférieure à 10 nm, de préférence inférieure à 7 nm, et préférentiellement inférieure à 5 nm. Selon un mode de réalisation avantageux, la présente invention concerne des nanoparticules telles que définies ci-dessus pour leur utilisation dans le cadre 30 du traitement du cancer, caractérisées en ce qu'elles sont sous forme d'une suspension. De préférence, les nanoparticules selon la présente invention sont sous forme d'une suspension dans un tampon physiologique aqueux. L'expression "tampon physiologique aqueux" désigne ici toute solution physiologique compatible pouvant être administrée à un être humain. Parmi les tampons physiologiques adaptés, on peut notamment citer le sérum physiologique, les milieux de culture pour cellules in vitro tels que par exemple les milieux RPMI ou DMEM. Dans le cadre de la présente invention, lesdites nanoparticules, sous forme d'une suspension, sont présentes à une concentration comprise de 0 à 20 g.L-' dans ladite suspension. Selon un mode de réalisation particulier, les nanoparticules susmentionnées io sont présentes dans ladite suspension à une concentration comprise de 0,5 g.L-' à 2 g.L-1. La présente invention concerne également les nanoparticules de SiC susmentionnées pour leur utilisation dans le cadre du traitement du cancer, caractérisées en ce que ces nanoparticules sont administrées par voie 15 intraveineuse, par exemple sous forme d'une solution aqueuse. Les nanoparticules susmentionnées peuvent également être administrées par injection locale par seringue. Une autre voie d'administration appropriée de ces nanoparticules est la voie cutanée, par exemple en appliquant sur le site cancéreux à soigner une crème ou 20 une lotion les contenant. On peut également envisager d'administrer lesdites nanoparticules par voie orale par ingestion de comprimés ou de solutions les contenant. Selon un mode de réalisation préféré, les nanoparticules utilisées dans le cadre de la présente invention sont susceptibles d'être obtenues selon un procédé 25 de gravure d'un substrat de SiC, la gravure étant obtenue par attaque électrochimique du substrat de SiC. L'expression "substrat de SiC" désigne, dans le cadre de la présente invention, tout composé chimique constitué des atomes de silicium (Si) et de carbone (C) liés chimiquement entre eux. La structure atomique du substrat de 30 SiC (et donc des nanoparticules) peut être monocristalline, polycristalline ou amorphe. Le polytype du substrat de SiC peut être par exemple : 6H-SiC, 4H-SiC, 3C-SiC, 15R-SiC, 21 R-SiC, 24R-SiC, 27R-SiC, etc. La composition chimique du substrat de SiC peut être par exemple : SiC ou tout autre composé exprimé par la formule SixC(1-x) avec 0 FIGURES Les Figures 1, 2 et 3 représentent le pourcentage de survie cellulaire de différentes lignées cellulaires traitées par différentes concentrations de nanoparticules de SiC, et ce, respectivement, après 24, 48 ou 72 heures d'incubation. Les rectangles hachurés correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire HSC (lignée cancéreuse humaine) ; les rectangles noirs correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire AT84 (lignée cancéreuse murine) et les io rectangles blancs correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire SG (lignée cellulaire saine humaine immortalisée). La Figure 4 représente l'effet d'une molécule anticancéreuse, à savoir le paclitaxel, sur différentes lignées cellulaires humaines après 72 heures de 15 traitement. Le pourcentage de survie cellulaire est indiqué pour différentes concentrations de paclitaxel. Les rectangles hachurés correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire HSC ; les rectangles noirs correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire AT84 et les rectangles blancs correspondent aux résultats pour la lignée cellulaire SG. 6 20 PARTIE EXPÉRIMENTALE Description des essais effectués Les nanoparticules de carbure de silicium (SiC) pénètrent dans les cellules animales. Elles se fixent d'abord sur des éléments présents dans le cytoplasme des cellules puis elles se concentrent dans le noyau des cellules. On a testé l'effet d'une exposition de plusieurs types cellulaires à différentes concentrations de nanoparticules de SiC. io Les nanoparticules ont été produites par anodisation électrochimique à faible résistivité à partir d'un wafer de 3C-SiC polycristalline de 1 cm. Le procédé de gravure a duré pendant trois heures sous illumination UV, à un courant d'intensité 25 mA/cm2, en utilisant une dilution de 1:1 HF 50% éthanol comme électrolyte. Après gravure, un réseau très poreux de nanocristaux interconnectés de 3C-SiC 15 est formé. La couche ultra-poreuse est séchée naturellement à l'air ambiant. La nano-poudre de 3C-SiC obtenue par broyage de la couche nano-poreuse est mise en suspension dans une solution de tampon Krebs. Cette suspension est centrifugée à 5000xg pendant trois minutes afin de sédimenter les gros cristaux insolubles. La partie supérieure contenant les nanoparticules très petites 20 (inférieures à 10 nm) en suspension uniforme est utilisée pour les essais. La survie cellulaire a été mesurée à l'aide d'une méthode colorimétrique au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Cette molécule de couleur jaune est réduite par les enzymes déshydrogénases 25 mitochondriales en sel de couleur bleu. Ceci permet de quantifier la viabilité cellulaire en réponse à un traitement. En effet, plus le nombre de cellules est élevé, plus elles transforment de MTT et donc plus la coloration bleue est intense. La survie des cellules a été mesurée avant et après exposition à différentes 30 concentrations de nanoparticules de SiC (0,1 - 0,5 - 1 mg/mL dans une suspension de milieu RPMI 10% FCS). Les cellules ont été cultivées sur des plaques de 96 puits en présence de nanoparticules de SiC pendant 18 heures et ensuite les milieux ont été remplacés 7 par des milieux de culture standard sans nanoparticules (milieu RPMI 10% FCS, Sigma). La viabilité des cellules est mesurée après différentes durées (24, 48 et 72 s heures). Les cultures de cellules ont ensuite été utilisées pour réaliser le test au MTT. La viabilité cellulaire a été mesurée par la différence de densité optique aux longueurs d'onde 450 et 504 nm, en utilisant un spectrophotomètre relié à un lo système informatique (Power Wave, Bio-Tek Instrument Inc.). L'absorbance mesurée est alors directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de survie mesuré dans les conditions initiales avant l'exposition des cellules aux nanoparticules de SiC. 15 Résultats Les expérimentations ont été effectuées sur trois lignées de cellules : - une lignée de cellules cancéreuses humaines (HSC) (lignée cellulaire de carcinome squameux humain HSC-2 dérivée de la cavité orale) ; 20 - une lignée de cellules humaines saines immortalisées (SG) (lignée cellulaire humaine immortalisée de l'épithélium gingival, don du Dr. Babich) ; et - une lignée de cellules cancéreuses de souris (AT84) (lignée cellulaire dérivée d'un carcinome squameux oral spontané de souris C3H, don du Dr. Shillitoe). 25 La viabilité des cellules est mesurée après différentes durées (24, 48 et 72 heures). Les résultats correspondants sont indiqués respectivement dans les Figures 1, 2 et 3. 30 En observant les résultats, on note en comparant les lignées HSC (cancéreuses humaines) et SG (humaines immortalisées) que la survie des cellules cancéreuses humaines est significativement diminuée dès 24 heures pour la dose 0,5 mg/mL. Cet effet significatif est seulement présent chez les cellules des lignées cancéreuses. Pour une concentration supérieure, l'effet inhibiteur des nanoparticules augmente. A 1 mg/mL, la viabilité des cellules humaines immortalisées est légèrement diminuée. Il existe une différence significative de l'effet des nanoparticules entre les cellules saines et les cellules cancéreuses. Les effets sont d'autant plus importants quand la durée de l'exposition des cellules augmente (voir 48 et 72 heures pour la dose 0,5 mg/mL sur les cellules cancéreuses humaines). La survie des cellules HSC est de 20 % en réponse à 1 mg/mL après io 72 heures, alors que celle des cellules SG (humaines immortalisées) est de 70%. Les effets sur la lignée AT84 (cellules cancéreuses de souris) sont très significatifs pour la concentration 1 mg/mL (p Les résultats obtenus sur des lignées de cellules saines et cancéreuses en culture montrent que les nanoparticules de SiC diminuent spécifiquement le nombre de cellules cancéreuses alors que les cellules saines sont très 20 significativement moins affectées par les nanoparticules de SiC. La comparaison des effets des nanoparticules avec une molécule anticancéreuse (le paclitaxel) montre que les pourcentages d'inhibition de la survie cellulaire sont du même ordre (Figure 4). 25 Il faut souligner que le traitement avec les nanoparticules n'a duré que 18 heures et que les cellules ont ensuite été rincées, alors que les médicaments anticancéreux ont été appliqués aux cultures cellulaires pendant les 72 heures de l'étude. La différence de l'effet des nanoparticules entre les cellules cancéreuses et 30 non cancéreuses met en évidence un effet sélectif des nanoparticules de SiC sur l'inhibition des cellules cancéreuses. i0 20 REVENDICATIONS1. Nanoparticules de SiC pour leur utilisation dans le cadre du traitement du cancer. 2. Nanoparticules selon la revendication 1, caractérisées en ce que leur taille est comprise de 0,5 nm à 1 �m. 3. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisées en ce que leur taille est inférieure à 10 nm, de préférence inférieure à 7 nm, et préférentiellement inférieure à 5 nm. 15 4. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisées en ce qu'elles sont sous forme d'une suspension. 5. Nanoparticules selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'elles sont sous forme d'une suspension dans un tampon physiologique aqueux. 6. Nanoparticules selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles sont présentes à une concentration comprise de 0 à 20 g.L-1, et de préférence de 0,5 g.L-' à 2 g.L-1. 25 7. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce qu'elles sont administrées par voie intraveineuse, par injection locale, par voie cutanée ou par voie orale. 8. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 30 caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues selon un procédé de gravure d'un substrat de SiC, la gravure étant obtenue par attaque électrochimique du substrat de SiC.10 9. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées pour le traitement de formes avancées de cancers avec métastases. 10. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisées en ce qu'elles sont fonctionnalisées chimiquement. 11. Nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisées en ce qu'un médicament anti-cancéreux est greffé à leur surface. 15