Brevet FR2942049A1 — publié le 20100813

MICROSCOPE A PLASMON DE SURFACE A HAUTE RESOLUTION AVEC INTERFEROMETRE HETERODYNE FIBRE Domaine technique de l'invention La présente invention concerne un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant un interféromètre hétérodyne fibré, c'est-à-dire essentiellement constitué de fibres optiques. Le domaine technique de l'invention est celui de la conception de systèmes et procédés d'imagerie permettant la détection de faibles variations d'indice de réfraction dans un milieu d'observation et/ou d'objets diélectriques de l'ordre de quelques nanomètres ne présentant pas nécessairement des propriétés optiques remarquables (fluorescence, luminescence, résonance plasmonique localisée ou encore résonance Raman) et localisés près d'une surface et immergés dans tout milieu diélectrique et notamment dans l'air ou dans un milieu aqueux. Etat de la technique Un plasmon de surface est une onde électromagnétique de surface qui se propage au niveau d'une interface entre un métal et un milieu diélectrique 20 d'observation. L'excitation du plasmon de surface nécessite une lumière incidente polarisée et un milieu de couplage à l'interface métal/milieu diélectrique sous un angle particulier qu'on appelle généralement angle de résonance plasmon 8p. De par les propriétés de résonance des plasmons de surface, l'angle 6p (en 25 d'autres termes la condition de couplage) est très sensible aux moindres modifications des propriétés optiques au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique. Cette sensibilité rend exploitable le plasmon de surface pour la réalisation d'images d'objets de très petites tailles situés au niveau de l'interface métal/milieu diélectrique, lesdits objets modifiant les propriétés optiques du 30 plasmon de surface au niveau de cette interface, ce qui permet d'obtenir un contraste entre l'objet et son milieu. En outre le plasmon de surface étant une onde évanescente, il permet de s'affranchir des effets de volume au sein du milieu d'observation. Différentes configurations de microscopie de plasmon de surface ont déjà été proposées dans l'état de la technique. Un grand nombre d'entre elles reposent sur le principe d'excitation du plasmon dans la configuration dite de Kretschmann-Raether. Cependant, la résolution de ces systèmes, limitée par la propagation latérale du plasmon, est relativement faible, de l'ordre de quelques dizaines de microns seulement dans les longueurs d'onde visibles. Plus récemment, de nouvelles générations de microscopes à plasmon de surface dont la résolution n'est plus limitée par la propagation latérale du plasmon, mais simplement par la diffraction, ont été proposées. Ces différents microscopes ont tous pour idée commune de focaliser un faisceau laser avec un objectif à forte ouverture numérique et à fort grossissement au niveau d'une surface qui présente une couche métallique (or, argent, cuivre, aluminium, etc.) de quelques dizaines de nanomètres d'épaisseur. Ceci permet à la fois d'exciter et de confiner le plasmon de surface. On peut cependant différencier ces techniques d'une part par le profil d'illumination à l'entrée de l'objectif et d'autre part par le mode de détection du signal. En effet quand un faisceau arrive à l'entrée de l'objectif du microscope, seul un anneau très fin de lumière contribue à l'excitation du plasmon de surface. La partie du faisceau réfléchi qui contient l'information liée au plasmon de surface est très fine et se retrouve noyée dans le reste du faisceau lumineux. Sans traitement particulier du faisceau, l'imagerie est quasiment impossible. Dans certaines publications, notamment dans la demande de brevet japonais JP 2003083886, l'illumination et la détection reposent sur un filtrage spatial, à l'entrée de l'objectif, des rayons lumineux qui contribuent à l'excitation plasmon et sur l'élimination de ceux qui n'y contribuent pas. Dans certaines autres publications telles que les brevets américains US 6,970,249 et US 2004/0100636 ou encore dans l'article de M. G, Somekh, S. G Liu, T. S Velinov and C. W See, � Optical V(z) for high-resolution plasmon microscopy �, Optics Letters 25, 823 (2000) et, � High-resolution scanning surface-plasmon microscopy �, Applied Optics 39, 6279 (2000), il a été proposé l'utilisation d'un interféromètre. Bien que plus lourde à mettre en oeuvre cette méthode apporte une meilleure sensibilité. Cependant dans la configuration optique décrite, il n'y a qu'une fraction de l'énergie lumineuse incidente qui participe à l'excitation du plasmon de surface. Par ailleurs, la sensibilité et la stabilité des images obtenues selon ces techniques sont limitées et globalement insatisfaisantes pour pouvoir visualiser des objets de très petite taille, de l'ordre de quelques dizaines de nanomètres notamment, comme cela peut être le cas en biologie. Un but de la présente invention est de procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui présente une résolution et une sensibilité accrue par rapport aux microscopes à plasmon de surface existants. Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui procure une meilleure stabilité d'observation et une amélioration du faisceau lumineux d'excitation et d'observation du plasmon de surface. Un autre but de l'invention est de fournir un microscope à plasmon de surface qui permette l'observation de molécules et particules dans des milieux diélectriques aqueux, et notamment dans des liquides biologiques. L'invention vise notamment à procurer un microscope à plasmon de surface à haute résolution qui permette la détection et la visualisation d'objets de très faibles tailles, de l'ordre du nanomètre, tels que des molécules biologiques par exemple, sans avoir recours à des marqueurs chimiques, optiques ou radioactifs de ces objets. Un autre but de l'invention est enfin de fournir un microscope à plasmon de surface qui soit compact et simple à utiliser, et également adapté à un environnement de laboratoire biologique ou médical. Exposé de l'invention Les différents objectifs assignés précédemment sont atteints conformément 30 à la présente invention grâce à un microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant essentiellement : a) une source de lumière cohérente d'émission d'un faisceau lumineux d'excitation, et b) un milieu de couplage optique et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif à grande ouverture numérique, une huile à immersion et une lamelle de verre recouverte sur une face qui n'est pas en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique, et c) un interféromètre hétérodyne divisant le faisceau lumineux d'excitation émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage optique pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage optique pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et le faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par élément réfléchissant et par la couche métallique, et d) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et e) des moyens de détection du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et f) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique. Conformément à l'invention, l'interféromètre hétérodyne du microscope est constitué essentiellement d'au moins quatre fibres optiques de guidage, respectivement, du faisceau d'excitation, du faisceau de mesure, du faisceau de référence, et du faisceau interférométrique et reliés optiquement au niveau d'une première de leurs extrémités à un coupleur optique et chacune également reliées optiquement en leur seconde extrémité respectivement à la source lumineuse, au milieu de couplage optique, à l'élément réfléchissant du faisceau de référence, et aux moyens de détection du faisceau interférométrique. On entend ici par première extrémité des fibres optiques de l'interféromètre l'extrémité de chacune des fibres reliée au coupleur optique, et par seconde extrémité l'extrémité de chacune des fibres reliée à un autre élément du microscope distinct du coupleur optique. Le microscope de l'invention permet la détection d'objets diélectriques et métalliques d'un diamètre inférieur à 10 nm, sans marquage desdits objets. Il présente l'avantage, par rapport aux microscopes à plasmon de surface connus, de procurer une réduction importante de l'encombrement du microscope et des réglages optiques de celui-ci, car il permet la suppression de tout support mécanique des éléments optiques de l'interféromètre. De plus, le microscope de l'invention procure une amélioration importante et significative de la stabilité de l'interféromètre et de la qualité des faisceaux optiques mis en jeu, aussi bien les faisceaux de mesure et de référence que le faisceau interférométrique, ce qui permet une bien meilleure qualité et sensibilité des images obtenues. Selon l'invention, les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne peuvent être des fibres monomode ou multimodes. En pratique, le choix des fibres se fait selon les critères de stabilité et de sensibilité définis par l'utilisateur. Selon un mode préféré de réalisation du microscope de l'invention, les fibres optiques sont des fibres à maintien de polarisation à la longueur d'onde du faisceau lumineux d'excitation émis par la source. Toujours selon l'invention, le coupleur de liaison des fibres optiques de l'interféromètre est adapté aux propriétés des fibres optiques utilisées. Toujours selon l'invention, les fibres optiques dont la seconde extrémité est reliée respectivement à l'élément réfléchissant du faisceau de référence et au milieu de couplage et confinement du plasmon de surface coopèrent chacune avec au moins un modulateur acousto-optique. Selon un mode préféré de réalisation du microscope de l'invention, la fibre optique de guidage du faisceau lumineux d'excitation est reliée en sa seconde extrémité à la source lumineuse par l'intermédiaire au moins d'une lentille de collimation. Dans ce mode de réalisation préféré, le microscope de l'invention comporte également de façon avantageuse un isolateur optique et une lame demi-onde disposés entre la source de lumière et la lentille de collimation. Toujours dans ce mode de réalisation préféré, le microscope de l'invention comporte également avantageusement un convertisseur de polarisation positionné entre la lame demi-onde et la lentille de collimation. Ce convertisseur de polarisation permet de faire varier à volonté, le cas échéant de façon périodique, la polarisation du faisceau lumineux d'excitation de façon linéaire, circulaire, radiale, ou azimutale par exemple. La conversion de polarisation procurée par le convertisseur de polarisation permet de façon particulièrement avantageuse de réaliser une imagerie en mode différentiel, qui permet d'améliorer encore le contraste et la dynamique des images obtenues. Il est en effet ainsi possible de polariser alternativement à l'aide du convertisseur de polarisation le faisceau d'excitation en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale) et de balayer linéairement de façon alternative et synchrone de la polarisation alternative du faisceau d'excitation la couche métallique par le faisceau de mesure polarisé alternativement en mode pur p et en mode pur s. De façon avantageuse, la fibre de guidage du faisceau de mesure est reliée en sa seconde extrémité au milieu de couplage optique par l'intermédiaire d'une lentille de collimation qui collimate le faisceau de mesure sur l'objectif du milieu de couplage. Dans un mode particulier de réalisation du microscope de l'invention, l'élément réfléchissant du faisceau de référence est un miroir. De préférence, ce miroir est avantageusement constitué par un revêtement métallique déposé sur l'extrémité de la fibre de guidage du faisceau de référence. Dans un autre mode particulier de réalisation, l'élément réfléchissant du faisceau de référence est constitué par la lamelle de verre d'un milieu de couplage optique identique au milieu de couplage relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure, ladite lamelle étant revêtue sur une face non en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique de même qualité que celle qui revêt la lamelle de verre du milieu de couplage optique relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure. Ce mode particulier de réalisation du microscope de l'invention permet avantageusement de réaliser une imagerie par interférence de plasmon de surface entre le faisceau réfléchi généré par le faisceau de mesure et le faisceau réfléchi généré par le faisceau de référence. Dans une variante de réalisation du microscope de l'invention, l'objectif du milieu de couplage optique auquel est reliée la fibre de guidage du faisceau de mesure est remplacé par une lentille solide à immersion et la lentille de collimation du faisceau de mesure est intégrée sur la seconde extrémité de la fibre de guidage du faisceau de mesure, par assemblage ou sous la forme d'une fibre lentillée. Dans une autre variante de réalisation, la lentille de collimation reliant la fibre de guidage du faisceau de mesure au milieu de couplage optique et l'objectif du milieu de couplage optique sont tous deux remplacés par un axicon formé directement à la seconde extrémité de ladite fibre de guidage du faisceau de référence. Conformément à une autre caractéristique avantageuse du microscope de l'invention, celui-ci comporte un système de balayage de la surface métallique du milieu de couplage optique à l'aide du faisceau de mesure. Enfin, le microscope de l'invention peut également, dans un mode de réalisation, comporter un polariseur entre les moyens de détection du faisceau interférométrique et la seconde extrémité de la fibre de guidage dudit faisceau interférométrique, notamment pour augmenter le contraste des images dans la configuration en polarisation linéaire. Description des dessins D'autres caractéristiques et avantages du microscope de l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite en référence aux figures annexées parmi lesquelles : - la Figure 1 représente un premier mode de réalisation préféré d'un microscope à plasmon de surface conforme à la présente invention, la Figure 2 représente un diagramme de réponse V(z) du microscope de l'invention dans la configuration de la Figure 1, - la Figure 3 représente un mode de réalisation alternatif du milieu de 30 couplage optique du microscope, comportant un doublet de lentilles fixé sur une fibre optique, la Figure 4 représente schématiquement une première variante de réalisation du microscope de l'invention, la Figure 5 représente une seconde variante du microscope de l'invention adaptée à la réalisation d'une microscopie par interférence de plasmon. Description détaillée de modes de réalisation de l'invention La présente invention propose une nouvelle configuration de microscope à plasmon de surface à haute résolution pour l'observation de nanoparticules ou molécules sans marqueurs fluorescents dans l'air et en milieu aqueux. Dans cette configuration, de façon originale, le microscope comporte un interféromètre hétérodyne composé essentiellement de fibres optiques. En référence tout d'abord à la Figure 1, le microscope de la présente invention comporte tout d'abord une source de lumière cohérente 1, choisie dans l'exemple particulier présenté comme étant une source laser Hélium-Néon monomode, polarisé et stabilisé en amplitude. Cette source de lumière n'est cependant pas limitative et l'on peut envisager l'utilisation d'autres types de sources lumineuses cohérentes. La source de lumière 1 émet un faisceau laser d'excitation d'un plasmon de surface qui est injecté et dirigé par un interféromètre hétérodyne 6 jusqu'à un milieu de couplage optique 7 comportant, dans l'exemple de la Figure 1 et de manière classique pour un microscope à plasmon de surface, un objectif à forte ouverture numérique 8, une huile à immersion 9 et une lamelle de verre 10 recouverte d'une fine couche de métal 11, de préférence d'une fine couche d'or, au niveau de laquelle un plasmon de surface est généré par le faisceau laser d'excitation. L'interféromètre hétérodyne 6 du microscope de l'invention est composé essentiellement, comme représenté sur la Figure 1, d'au moins quatre fibres optiques 12, 13, 14, 15 reliées optiquement entre elles au niveau d'une première de leurs extrémités 12a, 13a, 14a, 15a par un coupleur optique 16. Ces fibres optiques 12, 13, 14, 15 sont de façon préférée des fibres monomode à maintien de polarisation. Au sens de l'invention, on entend par fibre optique à maintien de polarisation que les fibres optiques 12, 13, 14, 15 de l'interféromètre sont monomodes à la longueur d'onde du faisceau laser d'excitation de la source 1, c'est-à-dire que la propagation de la lumière dans ces fibres optiques s'effectue sur un seul mode guidé. Une première fibre optique 12 forme une fibre de guidage du faisceau d'excitation. Ce faisceau est injecté dans la fibre de guidage 12 par la seconde extrémité 12b de la fibre au moyen d'une lentille de collimation 5. Entre cette lentille de collimation 5 et la source de lumière 1, le faisceau d'excitation émis par ladite source traverse un isolateur optique 2, une lame demi-onde 3 et un convertisseur de polarisation 4. L'isolateur optique 2 a pour fonction d'éliminer le retour de faisceau lié à l'interféromètre 6 qui se comporte comme un miroir et qui déstabilise le laser. La lame demi-onde 3 quant à elle permet de contrôler l'orientation de la polarisation du faisceau d'excitation, le convertisseur de polarisation 4 étant lui destiné à générer une polarisation choisie du faisceau d'excitation avant son entrée dans la fibre de guidage 12, cette polarisation pouvant être linéaire, circulaire, radiale, ou azimutale par exemple. La fibre de guidage 12 est soudée en sa première extrémité 12a au coupleur optique 16. Ce coupleur 16 est du type à maintien de polarisation. Il divise le faisceau d'excitation guidé par la fibre 12 depuis la source de lumière 1 en deux faisceaux identiques dits de mesure et de référence respectivement, le faisceau de mesure étant transmis et guidé dans une seconde fibre optique de guidage 13 vers le milieu de couplage optique du microscope, le faisceau de référence étant lui transmis et guidé par une troisième fibre optique 14 jusqu'à un élément réfléchissant 17, cet élément étant dans cet exemple de réalisation un miroir 18. Les fibres optiques 13, 14 forment respectivement les bras de mesure 19 et de référence 20 de l'interféromètre hétérodyne 6. Ces deux bras, et donc les deux fibres 13, 14 sont connectées chacune à un modulateur acousto-optique 21, 22 qui décale la fréquence optique du faisceau de lumière transmis par chaque fibre 13, 14 d'une fréquence rire et l'hast. Le modulateur acousto-optique 22 du bras de référence 20 est connecté à une fibre optique 23 à maintien de polarisation dont l'extrémité 24 est recouverte d'un dépôt métallique faisant office de miroir 18. La lumière transmise dans ce bras 20, dont la fréquence a été décalée de fref est réfléchie par ce miroir 18, et repasse par le modulateur acousto-optique 22, la fibre optique 14, le coupleur 16 et est ensuite couplée dans un quatrième bras 25 de l'interféromètre 6 formé par une quatrième fibre optique 15. Elle subit un décalage en fréquence totale de 2S2ref. Dans le bras de mesure 19, la fibre optique 13 est connectée à un modulateur acousto-optique 21 qui décale la fréquence optique de la lumière transmise d'une fréquence fltest. Le modulateur acousto-optique 21 est connecté à une fibre optique à maintien de polarisation 26, en sortie de laquelle la lumière, qui est en fait le faisceau d'excitation, est collimatée par une lentille de collimation 28 sur l'objectif à forte ouverture numérique du milieu de couplage optique du microscope, pour illuminer la lame de verre sur lequel un échantillon E est placé pour être observé. La lumière du faisceau d'excitation transmise par l'objectif 8 est réfléchie par le système optique 10, 11, E, repasse par l'objectif 8 et retourne vers la lentille 27 qui focalise la lumière au niveau de l'extrémité de la fibre optique 26 pour y permettre sa réinjection. La lumière est à nouveau décalée en fréquence à la sortie du modulateur acoustique 21 de S2test. Après passage dans la fibre optique 13 et le coupleur 16, la lumière réfléchie est transmise dans le quatrième bras 25 de l'interféromètre hétérodyne 6 avec le faisceau réfléchi provenant du bras de référence. Elle subit un décalage global en fréquence de 2ftest. Ainsi le champ lumineux qui se propage dans le quatrième bras 25 de l'interféromètre est la superposition des faisceaux réfléchis provenant du bras de référence et du bras de mesure. A l'extrémité 15b de la fibre 15 formant le quatrième bras 25 se trouve un détecteur 28 photosensible, la puissance lumineuse présente une composante continue et une composante modulée dans le temps à la fréquence fm = 2(S2test ù S2ref) = 2 A52. A l'entrée du détecteur 28 un polariseur 29 peut être également rajouté dans le cas d'une polarisation linéaire du faisceau d'excitation de départ. Le microscope de l'invention, tel que représenté sur la Figure 1 et décrit ci-dessus procure un grand nombre d'avantages par rapport aux microscopes à plasmon de surface connus. En particulier, le microscope de l'invention procure une miniaturisation du microscope (partielle ou totale) liée à la réduction de l'encombrement de l'interféromètre 6 permise par l'utilisation de fibres optiques. L'intégration d'un interféromètre 6 fibré réduit fortement le volume du système car le remplacement des composants optiques par des fibres optiques élimine la nécessité d'utiliser des supports mécaniques et diminue ainsi le volume occupé par les bras de l'interféromètre. L'utilisation de fibres optiques permet également comme il va être décrit par la suite et est représenté aux Figures 3 et 4 de remplacer l'étage optique permettant l'agrandissement du faisceau et l'objectif de microscope par un système tout fibré ou un système fibre/lentille qui permet d'exciter le plasmon de surface et de le confiner. Cette partie du montage est donc moins volumineuse et peut être fixée en extrémité de la fibre optique. On peut ainsi réaliser une version de ce microscope totalement fibrée. L'utilisation de fibres optiques pour réaliser l'interféromètre 6 du microscope procure également une diminution drastique du nombre de réglages optiques, une amélioration de la stabilité de l'interféromètre, et une amélioration de la qualité des faisceaux optiques d'excitation, de mesure, de référence et du faisceau interférométrique. Dans un interféromètre en champ libre tel qu'utilisé dans les microscopes connus dans l'état de la technique, il faut superposer les faisceaux issus de chaque bras de l'interféromètre. Pour former le faisceau interférométrique que l'on va détecter pour former les images il faut donc aligner les deux faisceaux de référence et de mesure (ou plus exactement leurs faisceaux réfléchis) et maintenir dans le temps l'optimum de superposition de ces deux faisceaux. L'expression de l'intensité du signal interférométrique recueilli par le détecteur de l'interféromètre en champ libre s'écrit : (1) où Iref et Itest sont les intensités lumineuses issues des bras de référence et de test respectivement, est la phase du signal d'interférence, M(t) est un facteur variant entre 0 et 1, traduisant la superposition des deux faisceaux au niveau du détecteur. M(t) dépend dans ce cas de la qualité du recouvrement des deux faisceaux et par conséquent est une fonctionnelle du temps t. Dans un système en champ libre un rattrapage doit donc être fait en permanence pour compenser les dérives mécaniques des composants. Dans la pratique ceci implique un réalignement assez régulier de l'appareil (dépendant fortement des conditions de stabilité thermique de l'interféromètre) qui peut être entrepris soit par l'utilisateur, soit automatiquement si un système de rattrapage automatisé est introduit dans l'interféromètre. Ce rattrapage peut être réalisé par exemple par une motorisation à la fois du miroir du bras de référence et d'un miroir de renvoi en amont de la séparation des faisceaux. Les positions de ces miroirs sont réajustées par une boucle de rattrapage de positionnement du faisceau basée soit sur la détection de position du faisceau, soit sur le contrôle du signal optique lui même (optimisation). Dans une configuration fibrée comme proposée par l'invention, l'intensité du signal tiré du faisceau interférométrique s'écrit : (2) Cette fois ci M ne dépend pas du temps. En effet dans un interféromètre par fibre optique l'obtention du processus d'interférence se fait directement par couplage au sein des fibres optiques et ne nécessite par conséquent aucun post-réglage ou rattrapage de superposition des faisceaux. La réponse optique du microscope V(z) où z est la défocalisation de l'échantillon par rapport au foyer de l'objectif du microscope est donnée par la relation suivante : (3) Le signal optique S(x, y) de chaque pixel d'une image produite par le microscope à plasmon de surface étant directement proportionnel au module du troisième terme de l'équation (2) ci-dessus, c'est à dire : (4) La Figure 2 témoigne de la pertinence et de la performance d'un 10 microscope à plasmon de surface à interféromètre hétérodyne fibré fi tel que proposé par l'invention. Cette Figure 2 présente le module de la réponse optique d'un microscope à plasmon de surface en fonction de la défocalisation z de l'objectif du microscope par rapport à l'interface de la couche métallique 11 d'or recouvrant la lame de 15 verre 10 du milieu de couplage optique 7 avec le milieu d'observation (ici l'air), la couche métallique 11 présentant dans cet exemple une épaisseur de 45 nm. Comme on peut le remarquer sur ce diagramme, dans le domaine des z positifs il existe un phénomène d'oscillation dont la période Oz est reliée aux propriétés du plasmon de surface. 20 On peut également constater par comparaison de la courbe de réponse du microscope fibré avec celle d'un microscope en champ libre connu de l'art antérieur, que la réponse du microscope conforme à l'invention est sensiblement identique à celle du microscope en champ libre, donc que l'intensité du signal de réponse V(z) du microscope fibré est similaire à celle des microscopes en champ 25 libre. Cette comparaison valide donc la configuration fibrée de ce microscope. En outre, le système fibré est performant avec un nombre de photons bien inférieur à celui d'un système en champ libre. Dans le mode de réalisation préféré, un gain de sensibilité au niveau de la détection a été mesuré (facteur > 10), toute chose étant égale par ailleurs (laser, détecteur). Par ailleurs, le choix d'un microscope à interféromètre fibré permet naturellement une isolation supérieure du système qui le rend moins sensible aux fluctuations externes de température, vibrations acoustique et mécanique, ou de fluctuations de l'air. En outre, pour les mêmes raisons qu'indiquées précédemment, la propagation des champs électromagnétiques dans le coeur des fibres optiques utilisées assure une superposition totale des champs, éliminant les fluctuations du signal interférométrique liées aux fluctuations des positions respectives des faisceaux de mesure et de référence, telle qu'on peut l'avoir avec les microscopes en champ libre. Cette stabilité améliore fortement le rapport signal sur bruit du signal de phase de l'interféromètre et rend plus aisées des mesures fines à partir du signal de phase (en raccourcissant le temps d'intégration de la mesure). A la différence des microscopes à plasmon de surface en champ libre, il est donc possible d'exploiter avec le microscope de l'invention, qui utilise un interféromètre 6 à fibres optiques, le signal de phase et d'obtenir des images de la phase du signal de réponse V(z) du microscope. L'utilisation de la phase du signal V(z) permet notamment de façon avantageuse de distinguer la nature d'un échantillon observé à l'aide du microscope et donc, lorsque par exemple on étudie un milieu aqueux contenant différentes particules ou molécules, de savoir quel type de particule on observe à un instant t. Enfin, un dernier avantage singulier du microscope à interféromètre fibré de la présente invention est de permettre une amélioration de la qualité des faisceaux optiques mis en jeu, que ce soit le faisceau d'excitation, les faisceaux de mesure et de référence ou encore le faisceau interférométrique. En effet, la propagation de la lumière se faisant dans des fibres optiques monomode, le champ lumineux qui se propage dans le coeur de la fibre possède un profil en fonction de la distance radiale r au centre de la fibre qui peut s'approximer par une gaussienne (P( r 2 . Le faisceau qui arrive sur l'objectif de microscope présente un profil gaussien bien plus régulier que celui que l'on peut obtenir en champ libre. En outre la lumière réfléchie par l'échantillon E dans le bras de mesure 19 de l'interféromètre retourne dans la fibre optique 26 en étant filtrée spatialement lors de sa réinjection dans la fibre du fait de son passage par un coeur de quelques micromètres de diamètre, réalisant ainsi un nettoyage du faisceau. Comme cela a été évoqué précédemment, des variantes de réalisation particulièrement avantageuses du microscope à interféromètre fibré de la présente invention sont proposées conformément à l'invention et décrites ci-après en relation avec les Figures 3 et 4. Une première variante du microscope de l'invention est entièrement fibrée, depuis la source lumineuse jusqu'au milieu de couplage optique du microscope. Dans cette réalisation, la lentille de collimation 27 et l'objectif à grande ouverture numérique 8 du microscope de la Figure 1 sont remplacés par un doublet de lentilles (block B2 dans la Figure 4). La première lentille de ce doublet, non représenté sur la Figure 4, est intégrée sur l'extrémité de la fibre optique 26, soit sous la forme d'une fibre lentillée, c'est-à-dire que l'extrémité de la fibre 26 est elle même usinée et constitue un dioptre, soit comme représenté à la Figure 3 sous la forme d'un bloc optique 30 fixé à l'extrémité de la fibre 26 et comportant une première lentille 31 ainsi qu'une seconde lentille 32 qui est une lentille SIL (pour "solid immersion Zens" en anglais), dont une face plane 33 fait office de lame de verre et est recouverte d'une fine couche d'or 11 qui est au contact du milieu d'observation dans lequel se trouve par exemple un échantillon E à observer. Cette seconde lentille 32 permet la focalisation du faisceau de mesure issu de la première lentille 31 au niveau de l'interface couche d'or/milieu d'observation pour générer le plasmon de surface. Ce montage présente plusieurs avantages, en particulier d'être beaucoup plus compact qu'un objectif à immersion commercial tel qu'utilisé dans le microscope de la Figure 1. De plus, l'utilisation d'un doublet de lentille permet une fixation directe sur l'extrémité de la fibre optique 26 de transmission du faisceau de mesure, tout en proposant des ouvertures numériques supérieures aux objectifs commerciaux et en conséquence de permettre l'observation de milieux à plus forts indices (polymères denses, cristaux liquides, solvants non aqueux...). En effet en choisissant des lentilles SIL avec des indices de réfraction élevés (supérieurs à 2 voire plus) on augmente l'ouverture numérique. Une variante de réalisation non représentée consiste également à remplacer l'objectif 8 du microscope de la Figure 1 par une fibre dont l'extrémité présente un axicon. L'axicon est directement usiné à partir de l'extrémité de la fibre optique pour donner une forme conique au coeur de la fibre optique. Un tel axicon permet de générer un anneau de lumière convergeant dont l'angle d'incidence élevé permet d'exciter le plasmon de surface. Sur la Figure 4, les parties du microscope de l'invention qui peuvent être au choix fibrées ou non sont représentées sous forme de blocs B1, B2. Ainsi on peut constater qu'il est également possible, outre le milieu de couplage optique du microscope par un bloc B2 tel que par exemple le bloc 30 de la Figure 3, de remplacer la source de lumière et le conditionnement du faisceau lumineux d'excitation émis par cette source par un système tout fibré B1, tel que par exemple un laser fibré polarisé. Dans une autre variante représentée à la Figure 5, le microscope de l'invention comporte non pas un mais deux milieux de couplage optique 7, 7', placés chacun à l'extrémité du bras de mesure 19 et du bras de référence 20 du microscope et tous deux identiques dans leur constitution, notamment comportant un objectif 8', une huile à immersion 9' et un lame de verre 10' recouverte d'une couche d'or 11' de même qualité et épaisseur que celle du milieu de couplage optique 7 du bras de mesure 19. Dans cette configuration, l'élément réfléchissant 17 du microscope de la Figure 1 est remplacé par une lentille de focalisation 34 fixée à l'extrémité de la fibre optique 23 afin de collimater le faisceau de référence sur l'objectif 8' du second milieu de couplage optique 7'. Cette configuration particulière de microscope à plasmon de surface, jamais encore dévoilée, permet de réaliser une imagerie de plasmon de surface différentielle entre le signal extrait du faisceau de mesure et le signal extrait du faisceau de référence, qui tous deux comportent alors une information liée au plasmon de surface. Ainsi, il est possible de corriger le plasmon de surface formé au niveau du milieu de couplage du bras de mesure, au contact d'un échantillon observé, par un autre plasmon de surface de référence, obtenu sur une même couche mince d'or mais cette fois vierge de tout contact avec un échantillon. Ainsi, on augmente de façon considérable la sensibilité du microscope car il est possible de discriminer, dans le signal interférométrique et la réponse V(z) du microscope, le bruit lié à la couche d'or et au plasmon de surface de celui lié à l'échantillon observé. Bien entendu, dans cette configuration il est possible de remplacer les deux milieux de couplage optique 7, 7' par deux doublets de lentilles tel que décrit précédemment et représenté à la Figure 3. Dans toutes les variantes du microscope de l'invention présentées précédemment, il est possible d'agir par le biais du convertisseur de polarisation adjoint à la source lumineuse pour faire varier à façon la polarisation du faisceau lumineux d'excitation, et par voie de conséquence celle des faisceaux de mesure, de référence et interférométrique dans chacun des bras de l'interféromètre hétérodyne à fibres optiques 6. Selon un mode d'utilisation particulier du microscope de l'invention, il est intéressant d'utiliser le convertisseur de polarisation pour réaliser à l'aide du faisceau de mesure des balayages de la couche d'or du milieu de couplage optique en lignes alternativement polarisées en mode pur p (polarisation radiale) et en mode pur s (polarisation azimutale). Ainsi dans ce mode de fonctionnement, on pilote électroniquement le convertisseur de polarisation de façon à basculer selon une fréquence choisie d'une polarisation azimutale à une polarisation radiale du faisceau lumineux d'excitation émis par la source laser 1 de façon synchrone avec des composants mécaniques de déplacement selon les trois axes Z de l'objectif et X,Y; du milieu de couplage optique. Dans le cas où cet objectif est substitué par un doublet de lentilles comme décrit précédemment en relation avec les Figures 3 et 4, le déplacement concerne l'extrémité de la fibre optique 26 supportant le doublet. Ce mode d'illumination alterné de la couche d'or du milieu de couplage optique permet avantageusement de réaliser une imagerie différentielle de plasmon de surface. On obtient ainsi des images mieux contrastées, un gain en dynamique des images, ainsi qu'un rattrapage de la décroissance de la réponse V(z) du microscope lorsque la défocalisation z augmente par rapport à l'échantillon. Une autre utilisation du signal optique obtenu des faisceaux polarisés en mode pur s peut également être faite aux fins d'asservissement de la position verticale de l'objectif 8 au bout du bras de mesure par rapport à l'échantillon E à observer. En effet, l'analyse des signaux établis à partir du faisceau de mesure polarisé en mode s et réfléchi par la couche d'or du milieu de couplage optique permet de déterminer la valeur absolue de la position de l'objectif 8, et à partir de cette position, il est ensuite possible de corriger tous les drifts mécaniques et thermiques inhérents à une microscopie de haute résolution. Une telle technique de correction de la position de l'objectif du microscope n'est pas en soi totalement nouvelle en microscopie, cependant, avec le microscope de l'invention, la particularité réside dans le fait que c'est le système d'imagerie lui-même qui permet de faire la correction et non un système rapporté en parallèle au système d'imagerie. De ce fait, on ne complexifie point le microscope ni n'augmente de façon importante son coût d'ajustement, le tout sans perturber la mesure optique de plasmon. De plus, une telle faculté d'asservissement de la position de l'objectif 8 par rapport à l'échantillon observé permet d'avoir une plus grande précision dans les mesures de la fonction V(z), aussi bien en amplitude qu'en phase. Un autre avantage du microscope de la présente invention est de permettre la construction d'images en trois dimensions de la fonction V(z) mesurée. La construction de telles "cartes" tridimensionnelles de la fonction V(z) permet de trouver le plan optique de coupe où le contraste de l'image sera le meilleur. Pour ce faire, on réalise un post-traitement de ces images 3D puis par interpolation on détermine le plan Z où le contraste est optimum. REVENDICATIONS1. Microscope à plasmon de surface à haute résolution comportant essentiellement : a) une source (1) de lumière cohérente d'émission d'un faisceau lumineux d'excitation, et b) un milieu de couplage optique (7) et de confinement d'un plasmon de surface comportant un objectif (8) à grande ouverture numérique, une huile à immersion (9) et une lamelle de verre (10) recouverte sur une face qui n'est pas en contact avec l'huile d'immersion d'une couche métallique (11), et c) un interféromètre hétérodyne (6) divisant le faisceau lumineux d'excitation émis par la source de lumière en au moins un faisceau de référence et au moins un faisceau de mesure dirigé vers le milieu de couplage pour générer un plasmon de surface, l'interféromètre étant positionné entre la source lumineuse et l'objectif du milieu de couplage pour former un faisceau interférométrique entre le faisceau de référence et le faisceau de mesure après réflexion de chacun d'eux respectivement par élément réfléchissant (17) et par la couche métallique (10), et d) des moyens de balayage de la couche métallique à l'aide du faisceau lumineux de mesure, et e) des moyens de détection (28) du faisceau interférométrique issu de l'interféromètre, et f) des moyens de traitement et de formation d'une image à partir du faisceau interférométrique, et caractérisé en ce que l'interféromètre hétérodyne (6) est constitué essentiellement d'au moins quatre fibres optiques (12, 13, 14, 15) de guidage, respectivement, du faisceau d'excitation, du faisceau de mesure, du faisceau de référence, et du faisceau interférométrique et reliés optiquement au niveau d'une première de leurs extrémités (12a, 13a, 14a, 15a) à un coupleur optique (16) et chacune également reliées optiquement en leur seconde extrémité (12b, 13b, 14b, 15b) respectivement à la source lumineuse (1), au milieu de couplage optique (7), à l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence, et aux moyens de détection (28) du faisceau interférométrique. 19 2. Microscope selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne sont des fibres monomode ou multimodes. 3. Microscope selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les fibres optiques de l'interféromètre hétérodyne sont des fibres à maintien de polarisation. 4. Microscope selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les fibres optiques (13, 14) dont la seconde extrémité (13b, 14b) est reliée respectivement à l'élément réfléchissant du faisceau de référence et au milieu de couplage et confinement du plasmon de surface coopèrent chacune avec au moins un modulateur acousto-optique (21, 22). 5. Microscope selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la fibre optique (12) de guidage du faisceau lumineux d'excitation est reliée en sa seconde extrémité (12b) à la source lumineuse (1) par l'intermédiaire au moins d'une lentille de collimation (5). 6. Microscope selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comporte un isolateur optique (2) et une lame demi-onde (3) disposés entre la source de lumière (1) et la lentille de collimation (5). 7. Microscope selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il 20 comporte un convertisseur de polarisation (4) positionné entre la lame demi-onde (3) et la lentille de collimation (5). 8. Microscope selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la fibre (13) de guidage du faisceau de mesure est reliée au milieu de couplage par l'intermédiaire d'une fibre optique (26) et d'une lentille de collimation (27). 25 9. Microscope selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence est un miroir (18). 10. Microscope selon la revendication 9, caractérisé en ce que le miroir (18) est constitué par un revêtement métallique déposé sur l'extrémité d'une fibre (23) reliée à l'extrémité (14b) de la fibre (14) de guidage du faisceau de 30 référence. 11. Microscope selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'élément réfléchissant (17) du faisceau de référence est constitué par lalamelle de verre (10') d'un milieu de couplage optique (7') identique au milieu de couplage optique (7) relié à la fibre (13, 26) de guidage du faisceau de mesure, ladite lamelle (10') étant revêtue sur une face dépourvue de contact avec l'huile d'immersion (9') d'une couche métallique (11') de même qualité que celle qui revêt la lamelle de verre (10) du milieu de couplage optique relié à la fibre de guidage du faisceau de mesure. 12. Microscope selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que l'objectif du milieu de couplage optique auquel est reliée la fibre de guidage du faisceau de mesure est formé par une lentille solide à immersion (32) et la lentille de collimation (31) du faisceau de mesure est intégrée sur l'extrémité de la fibre de guidage du faisceau de mesure, par assemblage ou sous la forme d'une fibre lentillée. 13. Microscope selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comporte un axicon formé directement à l'extrémité de ladite fibre de guidage du faisceau de référence. 14. Microscope selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte un système de balayage de la surface métallique du milieu de couplage optique à l'aide du faisceau de mesure. 15. Microscope selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comporte un polariseur (29) positionné entre les moyens de détection (28) du faisceau interférométrique et la seconde extrémité (15b) de la fibre de guidage (15) dudit faisceau interférométrique.