Brevet FR2944104A1 — publié le 20101008

EXTINCTION DE L'AUTOFLUORESCENCE DES TISSUS BIOLOGIQUES EN TOMOGRAPHIE RESOLUE EN TEMPS DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR L'invention concerne le domaine de l'imagerie optique appliquée au domaine médical et notamment de l'imagerie de fluorescence in vivo et ex-vivo. Elle concerne principalement le domaine technique de l'imagerie optique diffuse, et de son application à l'imagerie optique diffuse de fluorescence ou à la détermination de propriétés optiques de milieux diffusants. Elle peut notamment être appliquée à des échantillons de tissus biologiques ou à des parties du corps animal ou humain dont les dimensions sont compatibles avec les profondeurs de pénétration des rayonnements optiques utilisés. Ces techniques permettent de mettre en oeuvre des systèmes de diagnostic non invasifs grâce à l'utilisation de rayonnements non-ionisants, faciles d'utilisation et peu coûteux. Pratiquement, un marqueur fluorescent ou fluorophore (substance chimique d'une molécule capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation) est injecté au sujet et se fixent sur certaines molécules spécifiques, par exemple des tumeurs cancéreuses. La zone d'intérêt est éclairée à la longueur d'onde d'excitation optimale du fluorophore et le signal fluorescent est détecté. L'imagerie 2 optique de diffusion û sans injection de marqueur fluorescent û est déjà utilisée en milieu clinique, notamment dans les domaines de la mammographie et de la neurologie. L'imagerie optique de fluorescence (avec injection de fluorophore spécifique) est quant à elle limitée à ce jour à des applications � petit animal � en raison du manque de marqueurs adaptés et injectables à l'humain, et du problème d'autofluorescence des tissus qui se pose pour la détection en profondeur. En effet, pour appliquer cette méthode au diagnostic, par exemple de cancers, chez l'être humain, le signal spécifique à détecter est situé plus profondément sous la peau que chez le petit animal. Mais ce signal faiblit avec la profondeur, principalement à cause de l'absorption et de la diffusion des tissus, et se confronte à un signal parasite qui perturbe la détection. Ce signal parasite est appelé � auto-fluorescence � et désigne la fluorescence de tissus auxquels aucune substance chimique ou fluorophore spécifique n'a été injecté : il s'agit de la fluorescence naturelle du tissu, due principalement à la présence de molécules appelées fluorophores endogènes (collagène, élastine, NADH, flavines, porphyrines), qui ont elles aussi, le potentiel d'émettre de la lumière lorsqu'elles sont stimulées. L'imagerie de fluorescence in vivo est donc souvent limitée par le problème de l'autofluorescence des tissus biologiques. Par conséquent, l'amélioration de contraste que l'on peut obtenir en marquant les cellules à l'aide 3 de fluorophores, dépend fortement du rapport entre la fluorescence des marqueurs et la fluorescence endogène, ou autofluorescence. Pour augmenter ce contraste, on cherche à diminuer le bruit (constitué principalement par l'autofluorescence) par rapport au signal (la fluorescence du marqueur). Pour détecter une inclusion fluorescente à une profondeur de quelques centimètres dans les tissus biologiques, on peut utiliser un dispositif tel que celui de la figure 1, qui permet de suivre la fluorescence temporellement après chaque impulsion d'excitation (c'est la tomographie résolue en temps). Un laser 8 d'excitation Saphir-titane délivre un train d'impulsion à une fréquence de 80 Mhz (durée entre les impulsions : 12.5 ns) avec une puissance moyenne de quelques centaine de milliwatts. Ce laser est accordable en longueur d'onde de par exemple entre 700 nm à 950 nm pour exciter différents types de fluorophores. De préférence, l'excitation se fait dans les longueurs d'onde du rouge ou du proche infra-rouge. Ce type d'imagerie de fluorescence est appelée imagerie de fluorescence résolue en temps. La fréquence des impulsions varie typiquement que quelques centaines de kHz à quelques centaines de MHz. Les sources utilisées peuvent être des diodes laser pulsées picosecondes, ou des lasers femtosecondes. La durée de chaque impulsion lumineuse étant généralement inférieure à 1ns, on parlera alors de sources lumineuses pulsées subnanosecondes. 4 Le laser est injecté dans une fibre optique 10 d'excitation qui va permettre de sonder l'échantillon 20. La fluorescence émise par l'inclusion fluorescente présente dans l'échantillon est collectée par une deuxième fibre optique 12 - de détection - et le signal de fluorescence filtré (la référence 16 désigne un filtre) est mesuré à l'aide d'un tube photomultiplicateur 4 raccordé à une carte 13 de comptage de photons (TCSPC) synchronisée avec une partie prélevée du laser d'excitation via une photodiode 9. Ce montage permet de mesurer le signal de fluorescence et de le suivre spatialement (temporellement). Un exemple de mesure réalisée avec ce type de dispositif est donné en figure 2. La courbe I, représente le signal de fluorescence mesuré en présence d'une inclusion fluorescente (alexa750) placée à lcm de profondeur par rapport aux fibres d'excitation et d'émission, dans un milieu simulant le tissu biologique (mêmes propriétés optiques d'absorption et de diffusion) qui est l'intralipide. La courbe II représente le même signal enregistré sans l'inclusion fluorescente. Ce signal représente la fluorescence endogène émise par le milieu environnant (l'intralipide), il s'agit de l'autofluorescence. Celle-ci est présente dans la courbe I et masque le signal que l'on souhaite mesurer et qui provient de l'inclusion fluorescente. Pour retrouver ce signal (courbe III), il faut faire la soustraction des deux signaux (courbes I et II). Dans le cas où on souhaite appliquer cette technique à l'imagerie de tissus cancéreux in vivo, la soustraction des deux signaux devient impossible, car, une fois le fluorophore injecté au patient, il est 5 impossible de l'enlever pour enregistrer l'autofluorescence, dont l'intensité est variable selon l'endroit où on se trouve dans le tissu. En outre, plus la profondeur augmente, plus le signal d'excitation diminue, par diffusion optique dans les tissus. Ceci va diminuer fortement l'excitation de l'inclusion fluorescente par rapport à l'excitation du tissu biologique qui se trouve devant. Par conséquent, la fluorescence endogène excitée dans des zones se trouvant proche de la fibre d'excitation va émettre un signal d'autofluorescence beaucoup plus fort que le signal de fluorescence émis par l'inclusion fluorescente placée à quelques centimètres de profondeur qui, elle, reçoit un faible signal d'excitation à cause de la diffusion optique de celui-ci dans les tissus. Pour diminuer l'effet de l'autofluorescence dans les tissus biologiques, d'autres techniques basées sur des analyses assez complexes sont proposées dans différentes publications. L'article de Steinkamp, J.A et al., "Dual- laser, differential fluorescence correction method for reducing cellular background autofluorescence". Cytometry, 1986. 7(6): p. 566-574, décrit une méthode pour diminuer l'autofluorescence dans les cellules marquées par des anticorps fluorescents. Cette technique est basée sur l'utilisation de deux lasers, 6 le premier excitant le fluorophore et l'autofluorescence, et le deuxième laser, décalé spectralement par rapport au premier, excitant uniquement l'autofluorescence. Une soustraction de ces deux signaux permet d'obtenir le signal de fluorescence, en supposant que l'autofluorescence soit comparable spectralement et quantitativement dans les deux cas. L'excitation a lieu dans le bleu (400 nm) et les mesures se font dans un cadre de détection de la fluorescence à l'échelle de la cellule (pas de mesure en profondeur). Une autre technique est décrite dans l'article de Lakowicz, J.R., et al., "Background suppression in frequency-domain fluorometry". Analytical biochemistry, 2000. 277(1): p. 74û85 et dans l'article de Herman, P, et al, "Real-time background suppression during frequency domain lifetime measurements". Analytical biochemistry, 2002. 309(1) . p. 19û26. Elle est basée sur l'utilisation d'un fluorophore (MLC : metal ligand complex) d'une très longue durée de vie (entre 20ns et 10ps) dans un milieu dont la durée de vie de l'autofluorescence est courte par rapport au fluorophore (propylene glycol, plasma humain). La fluorescence, ainsi décalée temporellement, peut être détectée avec un photomultiplicateur déclenché après l'émission de l'autofluorescence (gating). Le fluorophore est mélangé avec le milieu, et l'excitation se fait dans le bleu (400 nm) qui est une région de forte absorption des tissus (tandis que l'eau n'absorbe pas beaucoup à 400nm). Dans ce document, il 7 n'y a pas de mesure en profondeur, et en outre le fluorophore étudié n'est pas injectable à l'homme. Une autre technique est décrite dans l'article de Levenson, R.M. et al., "Spectral imaging and microscopy". American Laboratory, 2000. 32(22) . p. 26-32 et dans celui de Mansfield, J.R., et al., "Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging". Journal of biomedical optics, 2005. 10(4): p. 1-7. Ces auteurs sont les seuls qui traitent le problème de l'autofluorescence en infrarouge (pour l'imagerie en profondeur). Cette technique assez complexe est basée sur l'excitation et la détection multispectrale: un spectre est réalisé en chaque pixel de l'image. Les images obtenues en trois dimensions (x, y, longueur d'onde) sont ensuite analysées minutieusement à l'aide d'algorithmes mathématiques pour corriger la contribution de l'autofluorescence. Cette technique a été industrialisée dans un appareil � maestro � pour l'imagerie du petit animal. Les fluorophores utilisés sont de type Qdot� (non injectable à l'homme) dont la durée de vie est très grande (dizaine de ns). Enfin, l'article de Gao, M., et al., "Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography". Applied optics, 2005. 44(26) . p. 5468-5474, propose une étude sur des fantômes optiques (intralipide) en implantant des inclusions (billes en plastique remplies d'une solution fluorescente Cy5). Des algorithmes mathématiques sont employés pour la reconstruction des images des billes 8 fluorescentes. La profondeur des inclusions est d'environ 1 cm au maximum. D'une manière générale, il se pose donc le problème de trouver un nouveau procédé, permettant de réduire, dans un signal d'imagerie de fluorescence résolue en temps, la contribution de l'autofluorescence par rapport à celle des sources de fluorescence associées à des marqueurs. Un tel procédé est de préférence apte à être mis en oeuvre pour des signaux résultant d'une excitation en profondeur. En outre, un tel procédé est de préférence aisé à mettre en oeuvre, sans analyse ou traitement complexe du signal temporel. Il se pose également le problème de trouver un nouveau dispositif, permettant de mettre en oeuvre un tel procédé. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant ou environnant le marqueur, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur fluorescent dans ce milieu, b) on dirige vers ce milieu, contenant au moins un marqueur fluorescent, une pluralité de premières impulsions d'un premier faisceau d'excitation à au moins une première longueur d'onde et une pluralité de deuxièmes impulsions d'un deuxième faisceau d'excitation à au moins une deuxième longueur 9 d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, c) on détecte au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, du marqueur fluorescent. Le milieu diffusant contient des substances ou molécules endogènes, qui donnent lieu à l'émission d'un signal de fluorescence, dit autofluorescence. Les premières impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de l'autofluorescence, tandis que les deuxièmes impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de la fluorescence du marqueur fluorescent. Les premières et les deuxièmes impulsions sont temporellement alternées, une deuxième impulsion étant séparée d'une première impulsion précédente d'une durée inférieure ou égale à la durée de déclin de l'autofluorescence du milieu diffusant. Le décalage temporel est par exemple inférieur à 2 ns ou à 1 ns ou à 500 ps ou à 100 ps, mais est supérieur à 0 (>0). L'invention permet de diminuer fortement la contribution de l'autofluorescence dans un signal de fluorescence résolu en temps, et ce de manière optique, à l'aide d'une double excitation, dont l'une est décalée spectralement et temporellement par rapport à l'autre. Chaque deuxième impulsion vient après une durée inférieure à la durée de vie de l'autofluorescence, le milieu diffusant étant alors quasiment aveugle à la deuxième longueur d'onde, et va exciter le fluorophore pour produire un signal dans une région spectrale de détection correspondant aux moyens 10 de détection. On ne réalise pas une excitation multiphotonique du milieu diffusant c'est-à-dire une première excitation, avec la première impulsion, relayée ensuite par une deuxième excitation à partir de l'état excité atteint lors de la première excitation ; donc chaque deuxième impulsion va exciter le marqueur et pratiquement pas le milieu diffusant du fait de l'aveuglement précédemment décrit. Les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement, par exemple d'une valeur au moins égale à 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. On peut ainsi réaliser une excitation adaptée de l'autofluorescence lorsque celle-ci est située dans une gamme spectrale plus faible que la fluorescence du fluorophore ou du marqueur fluorescent exogène ou injecté. De préférence on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. Les premières impulsions et les deuxièmes impulsions peuvent avantageusement être envoyées vers le milieu diffusant par une même fibre optique. Ainsi un même volume du milieu examiné subit chacun des deux rayonnements. L'invention permet de réaliser un examen en profondeur, dans le milieu examiné ou diffusant. Par 30 exemple, au moins un marqueur fluorescent est situé à 11 une distance d'une interface entre le milieu diffusant et le milieu extérieur comprise entre 3 cm et 5 cm. Avantageusement, le milieu diffusant est visqueux ou solide. On peut réaliser en outre un filtrage d'au moins une partie du signal d'autofluorescence qui provient du milieu diffusant. Un procédé selon l'invention peut comporter en outre une étape de réalisation d'une image représentant la localisation ou la position d'au moins un marqueur fluorescent dans le milieu diffusant. L'invention concerne également un dispositif de tomographie de fluorescence résolue en temps d'un milieu diffusant, comportant : a) des moyens formant source de rayonnement pour former des premières impulsions de rayonnement, à au moins une première longueur d'onde, b) des moyens formant source de rayonnement pour former des deuxièmes impulsions de rayonnement à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant temporellement alternées, c) des moyens pour amener les premières et 25 deuxièmes impulsions de rayonnement dans un milieu diffusant, d) des moyens pour détecter au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, provenant du milieu étudié. 30 Dans un tel dispositif, les premier et deuxième faisceaux d'excitations peuvent 12 préférentiellement être décalés spectralement de telle sorte que l'excitation du fluorophore par les premières impulsions soit négligeable. Le décalage pourra être d'au moins 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter : - des moyens de filtrage d'un signal de fluorescence, - et/ou des moyens pour réaliser une image à partir de signaux de fluorescence, résolus en temps. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS 15 - La figure 1 représente un dispositif pour mettre en oeuvre un procédé selon l'art antérieur, - la figure 2 est un exemple de mesure réalisée selon l'art antérieur, - la figure 3 représente un dispositif pour 20 mettre en oeuvre l'invention, - la figure 4 représente dans le temps, des impulsions du premier laser et du deuxième laser, - la figure 5 représente le décalage spectral entre l'autofluorescence et la fluorescence 25 des fluorophores, - la figure 6 représente une courbe de saturation. 10 13 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Un exemple de dispositif pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est représenté en figure 3. Ce dispositif comporte une première source 8 de rayonnement en impulsions et une deuxième source 80 de rayonnement en impulsions. Chacune de ces sources est de préférence une source laser émettant dans l'infra rouge. Du point de vue temporel, la largeur de chaque impulsion (de l'une ou l'autre source) compatible avec l'invention ne doit pas dépasser quelques centaines de femtoseconde (elle est donc inférieure à 10-13s ou à 10-12s) , afin que tous les photons émis par la deuxième source déclenchent simultanément l'excitation du milieu autofluorescent et ceci avant le déclin de la fluorescence du milieu environnant (l'autofluorescence), qui est compris entre quelques centaines de picosencondes et quelques nanosecondes. Ceci permet de rendre le milieu environnant majoritairement aveugle à la deuxième impulsion : lorsque celle-ci arrive, une molécule de ce milieu est encore dans l'état électronique excité et il lui impossible de réabsorber un autre photon. La lumière émise par la première source 8, est envoyée par une fibre 10 vers la cellule 20 qui contient le milieu à analyser. La lumière émise par la deuxième source 80, rejoint également la fibre 10 et est aussi envoyée vers la cellule 20. Il peut y avoir deux fibres différentes, une pour chaque laser, mais à condition que le point d'excitation soit le même pour les deux faisceaux, ou 14 que les deux faisceaux convergent sensiblement sur une même zone, car ce point ou cette zone va émettre de l'autofluorescence et sera aveugle à la deuxième impulsion. Les deux sources sont synchronisées par des moyens 17 de synchronisation. Les impulsions de la deuxième source sont décalées spectralement par rapport aux impulsions de la première source. Par exemple la première source émet à une longueur d'onde d'environ 700 nm (longueur d'onde adaptée notamment au cas de l'excitation de l'intralipide comme source d'autofluorescence, dont le temps de déclin est d'environ 500 ps), tandis que le spectre de la deuxième source est centré à une longueur d'onde d'environ 750 nm. Les impulsions de la deuxième source sont décalées temporellement par rapport aux impulsions de la première source par des moyens 81 formant ligne à retard. On donne plus loin des explications plus détaillées concernant ces deux types de décalage entre les deux sources 8 et 80. On injecte donc dans le milieu 20 les faisceaux de la première source et de la deuxième source, qui fonctionnent toutes deux en impulsions et de manière synchronisée. Les puissances des deux sources sont déterminées de façon à ce que la première source produise un aveuglement significatif du milieu diffusant, et que la seconde source permette l'obtention d'un signal de fluorescence exploitable. 15 Les deux sources peuvent éventuellement avoir la même puissance, si cela permet de satisfaire à cette condition. La référence 21 désigne des moyens de focalisation des faisceaux. Une fibre 12 permet de collecter le rayonnement de fluorescence issu du milieu 20. Les deux fibres 10, 12 peuvent être déplacées l'une par rapport à l'autre. Ceci présente un intérêt lorsque la technique de reconstruction de l'image met en oeuvre les algorithmes de localisation 3D, par exemple selon l'enseignement des documents US20080067420, EP1762982, ou US20070049807. Elles sont par exemple montées sur des moyens de déplacement en translation verticaux et horizontaux (suivant les axes X, Y et Z de la figure 3). Pour cela on peut mettre en oeuvre une ou des platines montées en translation pour déplacer les extrémités des fibres optiques. Dans tous les cas la translation peut être pilotée par ordinateur. La source 8 d'impulsions de rayonnement peut également être utilisée comme moyen de déclenchement de la carte TCSPC 13 : un miroir semiréfléchissant 17 et un détecteur 9 permettent de prélever une partie du signal du laser 8 et de l'utiliser comme déclencheur des moyens 13. Un filtre interférentiel 16 et/ou un filtre coloré absorbant les faibles longueurs d'onde peuvent être placés devant le détecteur 4 pour sélectionner la lumière de fluorescence d'un fluorophore disposé dans le milieu 20 et optimiser l'élimination de la lumière 16 d'excitation. Un filtre peut aussi permettre d'éliminer tout ou partie de l'autofluorescence résiduelle au moment de l'excitation du fluorophore Des moyens électroniques 24 tels qu'un ordinateur ou un micro ordinateur ou un calculateur sont programmés pour mémoriser et traiter les signaux du détecteur 4. Ces moyens comportent une unité centrale 26 programmée pour traiter des données temporelles de fluorescence obtenues par un procédé selon l'invention. Un signal de fluorescence résolu en temps, détecté lors de la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif selon l'invention, sera sensiblement similaire à celui de la courbe I de la figure 2. En particulier ces moyens 24 permettent de mettre en oeuvre un procédé de reconstitution à partir des données temporelles, par exemple tel que décrit dans le document EP 1884765 ou US 2008067420 ou EP1762982, ou US20070049807. Une image représentant le positionnement du ou des fluorophores dans le milieu 20 examiné peut ensuite être visualisée sur des moyens de visualisation 27. Les moyens 24 permettent éventuellement de commander ou de contrôler d'autres parties du dispositif expérimental, par exemple la position des fibres 10, 12. D'autres éléments peuvent être utilisés pour la détection : un photomultiplicateur, ou une photodiode à avalanche, ou une caméra rapide, ou un ensemble Caméra et � HRI � -High Rate Imager-. Tous ces systèmes peuvent être utilisés pour la détection, en les plaçant après les moyens de filtrage 16. 17 Le milieu étudié 20 est un milieu diffusant, par exemple un tissu biologique. Dans ce type de milieu, un rayonnement incident peut pénétrer avec une profondeur de pénétration pouvant atteindre quelques cm, par exemple 3 cm ou 5 cm. Les valeurs exactes dépendent de la puissance de la source utilisée et des propriétés optiques du milieu, notamment du coefficient d'absorption et du coefficient de diffusion réduit. On ainsi pu atteindre une profondeur de 3.5 cm dans de la viande ex-vivo et 3 cm dans un milieu biomimétique à la prostate humaine. Autrement dit, des fluorophores situés à une distance comprise entre 0 cm (donc situés très proches de la surface définie comme l'interface entre le milieu 20 et le milieu extérieur) et 3 cm ou 5 cm à distance de cette surface vont pouvoir être détectés. Les moyens de détection 4 détectent donc un rayonnement qui provient de la zone du milieu diffusant excitée par les faisceaux des sources 8, 80. Ce rayonnement traverse le milieu diffusant en direction de la frontière entre le milieu diffusant et le milieu extérieur, puis atteint les moyens 4 de détection. Le milieu étudié peut être un milieu vivant. Il peut s'agir par exemple d'une zone du corps humain ou animal. En effet, le dispositif décrit ici est tout à fait applicable à l'imagerie in-vivo ou ex-vivo. Pour une application � in vivo � on peut injecter à l'homme ou à l'animal un ou des marqueurs fluorescents non-toxiques, exemple ICG (vert d'indocyanine) ou d'autres types de marqueurs 18 fluorescents connus de l'homme du métier, par exemple du document PCT/FR2007/000269. L'enveloppe corporelle de l'homme ou de l'animal peut constituer alors l'interface du milieu diffusant avec le milieu extérieur ; dans ce cas on injecte la lumière dans le milieu à travers l'épiderme (cas de l'étude de la fluorescence du sein ou des testicules) ou, lors d'une endoscopie, à travers la paroi du canal utilisé (par exemple : paroi rectale dans le cas d'une endoscopie rectale). On peut aussi utiliser une sonde échographique par contact direct. Comme déjà expliqué, il y a également excitation d'autres éléments du milieu, créant une fluorescence parasite, ou une autofluorescence. De préférence le milieu 20 est visqueux ou fluide. On donne plus loin, avec la figure 6, un exemple avec une solution eau et intralipide 1%, qui a la même viscosité que l'eau. L'efficacité de la technique est d'autant plus grande que l'on atteint le régime de saturation (décrit plus loin) qui permet l'aveuglement des molécules ; ce régime est atteint plus aisément dans le cas du solide. Dans ce régime, les molécules du milieu environnent sont aveuglées, à l'état excité. Du point de vue temporel, les impulsions d'excitation des deux sources sont distribuées comme représenté schématiquement en figure 4.Les impulsions de la première source sont désignées par I1r celles de la deuxième source 80 par I2. Chaque impulsion I2 est séparée de l'impulsion I1 précédente par une durée At, fixe, mais réglable à l'aide des moyens 81. De 19 préférence, chaque impulsion du deuxième laser est décalée temporellement de l'impulsion précédente du premier laser d'une durée At (K0), inférieure à la durée caractéristique du déclin de l'autofluorescence ; par exemple, dans le cas de l'intralipide, dont la durée de vie est d'environ 500 ps, la valeur de At sera comprise entre 0 et 500 ps (0 Ce décalage temporel At dépend notamment de la nature du milieu ou des tissus traversés, et en particulier de la durée de déclin de l'autofluorescence. Par exemple cette durée est d'environ 1 ns, dans de la viande (ex vivo). Pratiquement, le décalage temporel est déterminé, selon les cas de figures, notamment en fonction de la puissance des sources et des propriétés d'autofluorescence du milieu. D'une façon générale, on cherche à ce que la seconde impulsion soit activée lorsque les molécules des tissus sont toujours aveuglées par le premier faisceau, mais aussi à ce que le signal d'auto fluorescence soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas pris en compte par le détecteur de fluorescence (et ce malgré le filtrage). On cherche à ce que la première impulsion n'excite pas le fluorophore. La largeur de bande d'excitation d'un fluorophore étant relativement large, il est préférable, du point de vue spectral, que la première source soit spectralement décalée par rapport à la source d'excitation du fluorophore. Le décalage spectral entre les deux faisceaux est par exemple de 50 20 nm ou plus (la valeur de 50 nm est une valeur moyenne de la largeur spectrale de la fluorescence) dans la limite de possibilité de filtrage. Plus précisément, la longueur d'onde du deuxième faisceau laser est de préférence supérieure à celle du premier faisceau laser, afin de pouvoir filtrer (avec un filtre passe-haut) la fluorescence de l'inclusion, comme expliqué ci-dessous en liaison avec la figure 5. Mais l'inverse est également possible : on peut utiliser une longueur d'onde du deuxième faisceau laser inférieure à celle du premier faisceau laser. Le filtrage (pour séparer la fluorescence que l'on cherche à observer de l'autofluorescence et de la lumière du premier faisceau laser) est alors réalisé : à l'aide d'un filtre passe-bande commercial (généralement de largeur spectrale de l'ordre de quelques dizaines de nm, par exemple comprise entre 10 nm et 50 nm). En figure 5 on a représenté un exemple de spectre d'autofluorescence (cas de l'intralipide, courbe A) et le spectre de la fluorescence du fluorophore (courbe F). Ce schéma permet d'illustrer le décalage spectral qui permet de dissocier la fluorescence de l'autofluorescence. La ligne T en trait interrompu représente la transmission spectrale du filtre utilisé pour la détection. On a donc intérêt à réaliser ici une excitation avec le premier laser 8 (impulsions I1 de la figure 4, déjà commentée ci dessus) à longueur d'onde plus courte que l'excitation réalisée avec le deuxième laser 80 (impulsions I2 de la figure 4). Le laser 8 21 permet d'exciter l'autofluorescence, et le laser 80 la fluorescence. Lorsque l'excitation à l'aide du laser 80 est réalisée, les molécules autofluorescentes sont déjà saturées par le laser 8, et elles ne peuvent plus réabsorber l'énergie du laser 80 car ce dernier intervient avant le déclin de l'autofluorescence. Dans les conditions de décalage spectral, et temporel indiquées ci-dessus, chaque molécule qui peut donner lieu à une émission d'autofluorescence et qui a absorbé un photon du premier faisceau laser est excitée à un certain niveau, qui présente une certaine durée de vie 'auto (environ 500 ps dans le cas de l'intralipide). Si le deuxième faisceau laser arrive dans le milieu suffisamment tôt, au moins avant ' to, elle est encore dans son état excité et n'a pas encore donné lieu à une émission d'autofluorescence. Elle n'est donc pas disponible pour être excitée par un photon du deuxième faisceau laser lorsque ce dernier arrive. Autrement dit, les molécules déjà excitées ne pourront être actives sous l'influence de photons du deuxième faisceau laser (dans l'exemple déjà choisi : à 750 nm) qu'après la fin du processus d'autofluorescence, c'est-à-dire après le début de la deuxième impulsion laser. Par contre, les photons du deuxième laser vont pouvoir être absorbés par les molécules de marqueur fluorescent et donner lieu à une émission de fluorescence (décalée spectralement et temporellement) que l'on souhaite observer et ces photons ne seront pas (ou peu) absorbés par les molécules qui contribuent 22 usuellement à l'autofluorescence. Le milieu environnant devient ainsi aveugle à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore. Il y a néanmoins une émission d'autofluorescence, car les molécules excitées par le premier faisceau finissent par donner lieu à une telle émission. Mais cette autofluorescence résiduelle peut être filtrée spectralement. Dans le cas de l'intralipide, l'autofluorescence résiduelle est située aux environs de 630 nm et est filtrée spectralement par exemple par filtre de type Chroma Z66OLP. Ainsi, seule la fluorescence du fluorophore est détectable, l'autofluorescence ayant alors été considérablement réduite. Si la densité d'énergie incidente et la durée d'irradiation du premier laser, éventuellement la fréquence des impulsions, sont suffisantes, il peut même se produire un phénomène qui est la saturation de l'état excité concerné des molécules du milieu environnant. Ce processus n'est pas en lui-même nécessairement destructif pour ces molécules, mais les effets de photoblanchiment et de photo-dégradation sont d'autant plus importants que l'intensité incidente est élevée (ce qui est voulu dans cette technique). Les tissus, qui sont des tissus vivants, peuvent alors être endommagés, mais l'endommagement reste plus faible que dans le cas d'une biopsie, où il y a prélèvement de quelques centimètres de tissus. Un exemple de ce phénomène de saturation est traduit par la courbe de la figure 6, mesurée dans l'intralipide. La valeur du seuil de puissance moyenne 23 avant saturation est d'environ 100 mW (flux de photons incident de 1020 photons/cm2/s).5 REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant (20), dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur fluorescent dans ce milieu diffusant, b) on réalise des excitations du milieu, à l'aide d'une pluralité de premières impulsions d'un premier faisceau d'excitation à au moins une première longueur d'onde et d'une pluralité de deuxièmes impulsions d'un deuxième faisceau d'excitation à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant alternées, une deuxième impulsion étant séparée d'une première impulsion précédente d'une durée inférieure ou égale à la durée de déclin de l'autofluorescence du milieu diffusant, c) on détecte au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, du marqueur fluorescent. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement d'une valeur au moins égale à 50 nm. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel chaque premier faisceau d'excitation a une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel les premières impulsions et les deuxièmes impulsions sont envoyées vers le milieu diffusant par une même fibre optique (10). 15 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel au moins un marqueur fluorescent est situé à une distance d'une interface entre le milieu diffusant (20) et le milieu extérieur comprise entre 3 20 cm et 5 cm. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu diffusant est visqueux ou solide. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel on réalise en outre un filtrage d'au moins une partie du signal d'autofluorescence qui provient du milieu diffusant (20). 10 25 30 26 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel on réalise en outre une image représentant la position d'au moins un marqueur fluorescent dans le milieu diffusant (20). 11. Dispositif de tomographie de fluorescence résolue en temps d'un milieu diffusant (20), comportant : a) des moyens (8) formant source de rayonnement pour former des premières impulsions de rayonnement, à au moins une première longueur d'onde, b) des moyens (80) formant source de rayonnement pour former des deuxièmes impulsions de rayonnement à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant alternées, c) des moyens (10) pour amener les premières et deuxièmes impulsions de rayonnement dans 20 un milieu diffusant (20), d) des moyens (4) pour détecter au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, provenant du milieu étudié. 25 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitations sont décalés spectralement. 13. Dispositif selon la revendication 12, 30 dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitations sont décalés spectralement d'au moins 50 nm. 10 14. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 13, dans lequel chaque premier faisceau d'excitation a une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. 15. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 14, comportant en outre des moyens (16) de filtrage d'un signal de fluorescence. 16. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 15, comportant des moyens (24, 26, 27) pour réaliser une image à partir de signaux de fluorescence, résolus en temps. 15