Brevet FR2938921A1 — publié le 20100528

La présente invention est relative au domaine du diagnostic/pronostic du diabète chez un sujet. La cyclophiline D (CypD) est une protéine soluble située dans la matrice mitochondriale et qui appartient à la famille des chaperones peptidyl- prolyl cis-trans isomérases (Bowles KR et al., 1999, Hum Genet, 105, 582-586). La CypD joue un rôle important dans l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) qui déclenche des processus qui conduisent notamment à la mort cellulaire apoptotique et/ou nécrotique (Baines CP et al., 2005, Nature, 434, 658-662). Le diabète est une affection extrêmement fréquente qui se manifeste principalement par une hyperglycémie, caractérisant une intolérance au glucose. On distingue principalement deux types de diabète : le diabète de type 1 caractérisé par la disparition de la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots de Langerhans du pancréas et le diabète de type 2 caractérisé par une diminution de l'action de l'insuline sur les tissus cibles. De lourdes complications sont également associées au diabète dont les maladies cardiovasculaires, les accidents cérébraux, les neuropathies, l'insuffisance rénale, la cécité, les amputations etc, ce qui aggrave l'invalidité, diminue l'espérance de vie des sujets atteints et engendre des couts médicaux très importants. En effet, le risque de survenue de toutes ces complications chez les sujets diabétiques est 2 à 3 fois supérieur par rapport aux individus non diabétiques. Les cas de diabète peuvent apparaître de manière sporadique ou sur 25 la base d'une appartenance à une population à risque dans le cas d'apparenté(s) déjà atteint(s) par la maladie. Le dépistage des personnes à risque peut être effectué en détectant la présence de certains auto-anticorps. Cependant, leur détection n'est pas forcément liée à la présence d'un diabète. 30 D'après les données de l'OMS, on peut s'attendre à un nombre de diabétiques d'environ 300 millions d'ici à 2025. En 2003, 5,1 % des adultes dans le monde sont diabétiques et ils seront probablement 6,3 %, d'ici 2025. Ainsi, le diabète est un problème majeur de santé publique, aux conséquences humaines et financières considérables. 35 Il est donc important de disposer de nouveaux outils de diagnostic permettant de détecter un diabète, notamment de façon très précoce, et de fournir des moyens additionnels et/ou complémentaires pour améliorer la valeur prédictive du dépistage de cette maladie. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert, de façon surprenante et tout à fait inattendue, que l'invalidation du gène qui code la cypD (gène ppif) est responsable du développement d'un diabète, et en particulier d'une insulino-résistance. Ainsi, le niveau d'expression de la cyclophiline D peut être utilisé en tant que marqueur, ledit niveau étant une indication de la présence ou du risque de développer un diabète, et en particulier un diabète associé à une insulino-résistance. Plus précisément, la présente invention a essentiellement pour objet un procédé pour déterminer la pré-disposition, la présence et/ou pour le suivi du diabète chez un sujet consistant à mesurer in vitro le niveau d'expression de la cyclophiline D dans un échantillon biologique dudit sujet. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un ou plusieurs réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD, ainsi qu'un kit (trousse ou nécessaire), pour déterminer in vitro la pré-disposition, la présence et/ou pour le suivi du diabète. Selon un premier aspect, l'invention a donc pour objet un procédé de détermination in vitro du niveau d'expression de la cyclophiline D dans un échantillon biologique comprenant les étapes consistant à mesurer le niveau d'expression de la cyclophiline D dans ledit échantillon biologique et le comparer à celui d'un échantillon de référence, ledit niveau d'expression étant associé à la présence ou au risque de développer un diabète s'il est significativement inférieur à celui de l'échantillon de référence. Au sens de la présente invention, on entend par � échantillon biologique �, tout échantillon provenant d'un sujet et susceptible de contenir un matériel biologique permettant de détecter ex vivo l'expression du gène codant la CypD (gène ppif) et de mesurer son niveau d'expression. Le matériel biologique peut notamment consister en des protéines ou des acides ribonucléiques (ARN), et en particulier des ARN messagers. Ainsi, dans le cadre de l'invention � mesurer le niveau d'expression de la CypD � signifie détecter et quantifier in vitro ou ex vivo la protéine CypD elle-même, ou détecter et quantifier ex vivo tout autre matériel biologique qui reflète l'expression du gène codant la CypD. On entend par � échantillon de référence �, un échantillon biologique de préférence de la même nature que celui de l'échantillon biologique à tester ou d'une nature compatible pour constituer une référence quant au niveau d'expression de la CypD, et issu d'un sujet non-diabétique, et de préférence exempt de toute autre pathologie, et en particulier de toute pathologie connue pour avoir un effet sur le niveau d'expression de la CypD. Par � niveau d'expression significativement inférieur à celui de l'échantillon de référence �, on entend un niveau d'expression inférieur ou égal à environ 80 % du niveau d'expression mesuré dans l'échantillon de référence, de préférence inférieur ou égal à environ 70 % du niveau d'expression mesuré dans l'échantillon de référence. En particulier, l'échantillon biologique peut être un fluide biologique tel que du sang total, des cellules circulantes du sang telles que des cellules mononucléaires ou encore un tissu tel que le muscle squelettique, le tissu adipeux, le tissu cardiaque, la peau, etc, ou des cellules isolées à partir d'un tel tissu, du moment que cette échantillon contient du matériel biologique dont la détection correspond ou permet de mettre en évidence l'expression du gène ppif codant la CypD. Les inventeurs ont montré que l'expression de la CypD peut notamment être mesurée sur des cellules mononucléaires isolées à partir de sang total (voir exemples). Dans le cadre de la présente invention, on préférera tout particulièrement utiliser comme échantillon biologique des cellules mononucléaires isolées à partir du sang, desquelles on pourra extraire en particulier les protéines qui seront utilisées en tant que matériel biologique pour la détermination du niveau d'expression de la CypD. Le matériel biologique susceptible de refléter l'expression du gène codant la CypD peut être extrait des échantillons biologiques par tout moyen classique bien connu de l'homme du métier et spécifiquement adapté à la nature du matériel choisi (ARN, protéine etc), par exemple comme décrit dans Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 1989. "Molecular cloning, a /aboratory manuaf' ou bien à l'aide de kits appropriés et disponibles dans le commerce tels que ceux vendus par la société Quiagen, etc. Par ailleurs, toute technique de mesure quantitative de l'expression des gènes et de comparaison des niveaux d'expression bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en oeuvre de la présente invention. Les techniques de mesure et de comparaison seront choisies pour être spécifiquement adaptées au type de matériel biologique choisi. A titre d'exemples de méthode de quantification, on citera notamment les techniques basée sur des micro-puces, des PCR en temps réel ou toute autre technique permettant une quantification (séquençage, Western blot etc...). Cependant, selon une variante préférée de la présente invention, le niveau d'expression de la CypD est déterminé par une mesure quantitative de la protéine CypD. Ainsi, la mesure du niveau d'expression de la CypD réalisée dans le cadre du procédé selon l'invention fait appel aux connaissances de l'homme du métier qui sait préparer les réactifs spécifiques (par exemple conception d'amorces, de puces, d'anticorps, etc) ou choisir ces réactifs parmi ceux qui sont déjà disponibles dans le commerce pour déterminer le niveau d'expression de la CypD. Le procédé selon l'invention permet notamment de déterminer la présence d'un diabète mais également de déterminer la prédisposition au diabète avant son apparition, par exemple chez un sujet dont un membre de sa famille souffre déjà de diabète. Dans le cadre de la présente invention, un niveau d'expression de CypD significativement bas, c'est-à-dire significativement inférieur à celui mesuré dans un échantillon biologique de référence, constitue un marqueur de susceptibilité à cette pathologie et à ses complications. De plus, chez un sujet dont on sait déjà qu'il souffre de diabète, le procédé selon l'invention peut également permettre d'évaluer la gravité du diabète ainsi que le risque de survenue des complications vasculaires et des atteintes cardiaques, cérébrales, rénales, hépatiques, etc... qui accompagnent cette pathologie en fonction de sa sévérité. Dans ce cadre, le suivi du niveau d'expression de la CypD peut aussi avoir un intérêt dans l'évaluation de l'efficacité des thérapeutiques qui sont mises en oeuvre pour traiter le diabète et/ou ses complications. De préférence, le procédé selon la présente invention permet la mise 30 en évidence de la présence ou du risque de développer un diabète qui est associé à une insulino-résistance. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention permet de déterminer la présence ou le risque de développer un diabète de type 1 ou de type 2, et de préférence un diabète 35 de type 2. De plus, l'échantillon biologique à tester pour déterminer la présence ou le risque de développer un diabète est de préférence issu d'un sujet non- obèse. Par � sujet non-obèse �, on entend tout sujet dont l'indice de masse corporelle (IMC) est inférieur à 27. Selon un deuxième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'un ou plusieurs réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD pour pour déterminer in vitro la pré-disposition, la présence et/ou le suivi d'un diabète. Cette utilisation permet en particulier de pouvoir déterminer si le niveau d'expression du gène codant la CypD dans un échantillon biologique à tester est significativement inférieur à celui présent dans un échantillon de référence. On entend par � réactif spécifique de l'expression du gène codant la CypD �, tout réactif (tels que des amorces, une sonde, un anticorps, etc) qui réagit avec ou s'hybride ou se lie de manière spécifique à ce gène, ou à tout produit de ce gène, intermédiaire ou final, qui peut refléter l'expression de ce gène (par exemple l'ARN messager ou la protéine CypD elle-même). En particulier, ces réactifs sont spécifiques de l'expression du gène codant la CypD (gène ppif) dans la mesure où ils ne permettent pas de détecter l'expression d'autres cyclophilines telles que les cyclophilines A ou B. Comme indiqué ci-dessus, tout procédé connu de l'homme du métier peut être utilisé ensuite pour déterminer de manière quantitative le niveau d'expression du gène codant le CypD. Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé mentionné ci-dessus, comprenant au moins les éléments suivants : un ou plusieurs réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD et adapté(s) au type de matériel biologique extrait de l'échantillon biologique, - éventuellement les réactifs et/ou dispositifs nécessaires et adaptés en fonction du type de matériel choisi pour effectuer l'extraction du matériel biologique, et - éventuellement les réactifs et/ou dispositifs nécessaires et adaptés pour la détection et/ou la quantification relative de l'expression du gène codant la CypD par rapport à celle d'un échantillon de référence (témoin positif). De même que précédemment pour le procédé, l'utilisation de réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD et le kit ou nécessaire selon l'invention permettent en particulier de déterminer la pré- disposition, la présence et/ou le suivi du diabète, en particulier du diabète de type 1 ou de type 2, et de préférence du diabète de type 2 chez un sujet, et de manière préférée du diabète associé à une insulino-résistance. Par ailleurs, ledit sujet est de préférence un sujet non-obèse. L'implication de la cyclophiline D dans le diabète a été mise en évidence par l'étude de différents paramètres physiologiques caractéristiques de cette maladie chez des souris dont le gène qui code la cyclophiline D a été invalidé (souris CypD-KO ou CypD -/- ou ppif -/-). L'étude de ces paramètres est décrite plus en détail dans les exemples qui suivent et qui se réfèrent aux figures annexées dans lesquelles : La figure 1 représente le taux de glucose mesuré dans un échantillon de sang (en mg/dl) issu de souris CypD-KO (triangles gris) et de souris normales (carrés noirs) en fonction de l'âge (en semaines). La figure 2 représente le taux de glucose mesuré dans un échantillon de sang (en mg/dl) issu de souris CypD-KO (triangles gris) et de souris normales (carrés noirs) âgées de 22 semaines en fonction du temps (en minutes) qui suit une injection de glucose à raison de 2 mg/g de poids corporel de souris. La figure 3 représente le taux de glucose mesuré dans un échantillon de sang (en mg/dl) issu de souris CypD-KO (triangles gris) et de souris normales (carrés noirs) âgées de 22 semaines en fonction du temps (en minutes) qui suit une injection d'insuline à raison de 0,75 mU/g de poids corporel de souris. La figure 4 représente le poids corporel (en grammes) des souris CypD-KO (triangles gris) et des souris normales (carrés noirs) en fonction de l'âge (en semaines). L'analyse statistique des résultats exposés dans les figures 1 à 4 a été effectuée à l'aide d'un test anova-2 (two way ANOVA) pour tous les résultats répétés dans le temps et d'un test anova-1 (one way ANOVA) pour les autres. L'astérisque correspond à une valeur p Animaux Les analyses indiquées ci-dessous ont été effectuées sur deux groupes de souris : - un groupe de 10 souris dont le gène codant la cyclophiline D a été invalidé (souris CypD-KO ou CypD -/- fournies par l'équipe du Pr Korsmeyer, 10 USA) et dénommé ci-après groupe CypD ; et - et un groupe de 10 souris normales (B6-129, qui correspond au fond génétique des souris CypD-KO) et dénommé ci-après groupe contrôle. 1) Hyperglycémie Le taux de glucose (glycémie) a été mesuré sur un échantillon de 15 sang prélevé chez les souris CypD-KO et les souris normales toutes les deux semaines, depuis l'âge de 4 semaines et jusqu'à 24 semaines. Une gouttelette de sang est récupérée au bout de la queue de chaque souris et déposée sur bandelette, puis la -glycémie est mesurée à l'aide d'un glucomètre. 20 Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 1. 2) Intolérance au glucose Une injection de glucose à raison de 2 mg/g de poids corporel a été réalisée par voie intra-péritonéale à chacune des souris du groupe CypD et du groupe contrôle. Le taux de glucose a été mesuré comme indiqué 25 précédemment sur des échantillons de sang issus des souris CypD-KO et des souris normales prelevés 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après l'injection de glucose. Les mesures ont été réalisées séparément avec des souris âgées de 8, 12,16 et 22 semaines (souris CypD-KO et normales). 30 Les résultats obtenus à partir des groupes de souris âgées de 22 semaines sont regroupés dans la figure 2. 3) Résistance à l'insuline Une injection d'insuline a été réalisée par voie intra-péritonéale à chacune des souris du groupe CypD et du groupe contrôle. Le taux de 35 glucose a été mesuré comme indiqué précédemment sur des échantillons de sang issus des souris CypD-KO et des souris normales et prélevés 15, 30 et 45 minutes après l'injection d'insuline. Les mesures ont été réalisées séparément avec des souris âgées de 8, 12, 16 et 22 semaines (souris CypD-KO et normales). L'injection d'insuline a été faite à raison de 0,5 mU/g de poids corporel chez les souris âgées de 8 semaines et à raison de 0,75 mU/g de poids corporel chez les souris âgées de plus de 8 semaines. Les résultats obtenus à partir des groupes de souris âgées de 22 semaines sont regroupés dans la figure 3. 4) Suivi du poids Le poids des souris du groupe CypD et du groupe contrôle a été 10 mesuré chaque semaine à partir de la cinquième semaine et jusqu'à 23 semaines. L'ensemble des résultats reproduits dans les figures 1 à 4 montrent que les souris CypD-KO développent un diabète et en particulier une insulino-résistance. De plus, ce diabète se développe en l'absence de 15 surpoids. Par conséquent, ces résultats démontrent le rôle de la CypD dans le développement d'une insulino-résistance et d'un diabète. EXEMPLE 2 - Détermination de l'expression de la CypD A) Dans les cellules périphériques mononucléaires isolées à 20 partir de sang total de lapin L'échantillon de sang de lapin est collecté dans un tube avec EDTA, puis conservé (jusqu'à 16 heures) à température ambiante (environ 20°C). Quatre millilitres de sang sont versés dans un tube de 15 ml avec 3 ml de lymphoprep (tube U-04 UNI-SEP+, Abcys) puis le tube est centrifugé 25 pendant 20 minutes à 1000 g à une température de 19°C environ. Après avoir retiré le plasma à l'aide d'une pipette Pasteur, la couche de lymphocytes est prelévée à l'aide d'une autre pipette Pasteur puis collectée dans un nouveau tube. Un premier lavage est effectué par ajout de PBS (qsp 4 ml) et 30 centrifugation pendant 20 minutes à 1000 g à une température de 19°C environ. Le surnageant est éliminé et un deuxième lavage est effectué par ajout de PBS (qsp 4 ml) et centrifugation pendant 20 minutes à 1000 g à une température de 19°C environ. Une fois le surnageant éliminé, le culot est suspendu dans 45 pl de SLB (1% NP40, 20 mM Tris-HCI, 138 mM NaCl, 2.7 35 mM KCI, 1 mM MgCl2, 5 % Glycérol, 5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 20 mM NaF, 1 mM DU, pH 8.0) additionné d'inhibiteurs de protéases (cocktail anti- protéases Sigma P2714, la concentration finale de ces inhibiteurs dans le tampon SLB étant AEBSF 2 mM, E-64 14 pM, Bestatin 130 pM, Leupeptin 0,9 pM, Aprotinin 0,3 pM, EDTA 1 mM). La quantité de protéines est mesurée par la technique Biuret (exprimée en mg de protéines par ml de sang total) sur un échantillon et le reste est congelé à -80°C jusqu'à utilisation. B) Dans le tissu cardiaque de souris Les protéines sont extraites à partir du tissu cardiaque de souris normales ou CypD-KO et quantifiées à l'aide de protocoles d'extraction et de quantification classiques dans le domaine. L'expression de la CypD est ensuite mise en évidence par une technique classique de Western Blot à l'aide d'un anticorps anti-cyclophiline D (E11AE12BD4, Calbiochem, Cat#Ap1035) utilisé au 1/2000ème à partir de 10, 50, 100 et 200 �g de protéines extraites à partir de cellules périphériques mononucléaires sanguines de deux lapins et à partir de 10 �g de protéines extraites du tissu cardiaque de trois souris normales et de trois souris CypD KO.. La quantité de protéines est normalisée par rapport à l'expression de l' a-actine à l'aide d'un anticorps anti-actine (A2066, Sigma) utilisé au 1/2000ème Les anticorps secondaires couplés à la peroxidase sont utilisés au 1/10000ème (anti-souris pour la CypD, NA931, Amersham, GE Healthcare ; anti-lapin pour l'actine, NA934, Amersham, GE Healthcare). La révélation est effectuée par chimioluminescence à l'aide d'un kit (ECL Plus Western Blotting Detection Reagents, RPN2132, Maersham, GE Healthcare). Les résultats de Western Blot sont regroupés sur la figure 5 annexée et montrent l'expression de la CypD dans les cellules périphériques mononucléaires isolées à partir de sang total et dans le tissu cardiaque des souris normales (WT). REVENDICATIONS1. Procédé de détermination in vitro du niveau d'expression de la cyclophiline D dans un échantillon biologique comprenant les étapes consistant à mesurer le niveau d'expression de la cyclophiline D dans ledit échantillon biologique et le comparer à celui d'un échantillon de référence, ledit niveau d'expression étant associé à la présence ou au risque de développer un diabète s'il est significativement inférieur à . celui de l'échantillon de référence. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le niveau d'expression de la cyclophiline D consiste à détecter et quantifier la protéine CypD. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué des cellules mononucléaires isolées à partir du sang. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon de référence est issu d'un sujet non-diabétique. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet de déterminer la présence ou le risque de développer un diabète associé à une insulino-résistance. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet de déterminer la présence ou le risque de développer un diabète de type 1 ou de type 2, et de préférence un diabète de type 2. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est issu d'un sujet non-obèse. 8. Utilisation d'un ou plusieurs réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD pour déterminer in vitro la pré-disposition, la présence et/ou le suivi d'un diabète chez un sujet. 9. Utilisation selon 1a revendication 8, caractérisée en ce qu'elle permet de déterminer la pré-disposition, la présence et/ou le suivi d'un diabète associé à une insulino-résistance. 10. Utilisation selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle permet de déterminer la pré-disposition, laprésence et/ou le suivi d'un diabète de type 1 ou de type 2, et de préférence de type 2. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que ledit sujet est un sujet non-obèse. 12. Kit de détermination de la pré-disposition, de la présence et/ou du suivi d'un diabète comprenant au moins les éléments suivants : - un ou plusieurs réactif(s) spécifique(s) de l'expression du gène codant la CypD et adaptés au type de matériel biologique extrait de l'échantillon biologique, - éventuellement les réactifs et/ou dispositifs nécessaires et adaptés en fonction du type de matériel choisi pour effectuer l'extraction du matériel biologique, et - éventuellement les réactifs et/ou dispositifs nécessaires et adaptés pour la détection et/ou la quantification relative de l'expression du gène codant la CypD par rapport à celle d'un échantillon de référence (témoin positif). 13. Kit selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'il permet de déterminer la pré-disposition, la présence et/ou le suivi d'un diabète associé à une insulino-résistance. 14. Kit selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisée en ce qu'il permet de déterminer la pré-disposition, la présence et/ou le suivi d'un diabète de type 1 ou de type 2, et de préférence de type 2. 15. Kit selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, 25 caractérisé en ce que l'échantillon biologique est issu d'un sujet non-obèse.