Brevet FR2936245A1 — publié le 20100326

NOUVEAUX SUBSTRATS D'O6-ALKYLGUANINE-ADN ALKYLTRANSFERASE ET SES MUTANTS ETAT DE LA TECHNIQUE Les effets mutagènes et cancérigènes des composés électrophiles comme la N-méthyl-N-nitrosourée sont pour l'essentiel dus à l'06-alkylation des résidus guanine de l'ADN. Des mécanismes de protection contre cette alkylation de l'ADN existent chez les mammifères et les bactéries, et l'06-alkylguanine-ADN alkyltransférase (AGT) en particulier est capable de réparer ces lésions. L'AGT transfère le groupe alkyle en position 06 de la guanine alkylée sur un groupe thiol d'une de ses propres cystéines, ce qui entraîne une alkylation irréversible de l'AGT. Ce transfert de groupe s'opère par une substitution nucléophile de type 2, ce qui explique pourquoi le transfert de groupes benzyle est également possible, en plus du transfert de groupes alkyle. Dans la mesure où la surexpression de l'AGT dans les cellules tumorales est la raison principale de la résistance à des médicaments dont l'action est basée sur l'alkylation de l'ADN, comme la procarbazine, la dacarbazine, le temozolomide et la bis-2-chloroéthyl-N-nitrosourée, l'utilisation d'inhibiteurs de l'AGT a été proposée comme agent sensibilisant dans le cadre de traitements chimiothérapeutiques (Pegg et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51:167-223, 1 995). Le brevet US 5 691 307 décrit des dérivés d'06-benzylguanine portant divers substituants sur le groupe benzyle, ainsi que leur utilisation pour diminuer les niveaux d'AGT dans les cellules tumorales et ainsi augmenter eur sensibilité aux traitements basés sur l'emploi d'agents alkylants. De même, la demande de brevet WO 97/20843 divulgue d'autres composés pour cette utilisation, sous la forme de dérivés d'06-benzyl et 06-hétérooarylméthyl-pyrimidine. Le brevet DE 199 03 895 divulgue un dosage de l'AGT basé sur la réaction entre des dérivés biotinilés d'06-alkylguanine et l'AGT, conduisant à la biotynilation de l'AGT, ce qui permet sa séparation sur des plaques recouvertes de streptavidine et sa détection, par exemple par un dosage ELISA. Cette technique est proposée pour suivre les niveaux d'AGT dans des tissus cancéreux, ainsi que pour mettre en évidence des inhibiteurs de l'AGT. WO 01/85221 propose d'utiliser des dérivés radioactifs fluorés ou iodés d'06-benzylguanine pour détecter l'AGT. Damoiseaux et al. ChemBiochem. 4:285-287, 2001 divulguent des dérivés d'06-alkylguanine incorporés dans des oligodeoxyribonucléolides et leur utilisation comme sondes destinées à marquer l'AGT, encore une fois dans le but de mesurer les niveaux d'expression de cette enzyme dans des cellules cancéreuses afin d'améliorer l'efficacité de traitements de chimiothérapie. La demande WO 02/083937 décrit une méthode pour détecter et manipuler une protéine d'intérêt fusionnée à l'AGT, consistant à mettre en contact cette protéine de fusion avec un substrat d'AGT portant un marqueur, ce qui permet après transfert de la molécule d'intérêt sur I'AGT, de détecter ou de manipuler cette protéine d'intérêt. Cette demande divulgue également diverses protéines de fusion comportant l'AGT, les principes généraux relatifs à la structure des substrats d'AGT, ainsi qu'une variété de marqueurs et de méthodes pour détecter ledit marqueur. La demande WO 2004/031404 décrit des protéines de fusion particulières comprenant l'AGT et une protéine d'intérêt susceptible d'être utilisées dans la méthode décrite précédemment, des protéines de fusion marquées obtenues par cette méthode et une méthode utilisant lesdites protéines de fusion. Les demandes WO 2004/031405 et WO 2005/085470 décrivent des substrats d'AGT 15 particuliers portant un ou plusieurs marqueurs ainsi que leurs procédés de fabrication, ces substrats étant susceptibles d'être utilisés dans la méthode décrite dans WO 02/083937. Des exemples de substrats d'AGT sont les dérivés de benzylguanine et benzylcytosine ci-après : BG-Vistagreen 20 H2N . Nii`. CI- 25 BG-505 30 35 BG-diaceétylfluorescéine (DAF) NH N teLNH2 H NH BC-diacétylfluorescéine 1 1 BC-Vert Oregon NH2 DESCRIPTION : L'invention concerne de nouveaux substrats de l'enzyme AGT ou de ses mutants, constitués d'un benzylnucléotide lié de manière covalente à une molécule d'intérêt via un bras de liaison comportant un cycle à 5 ou 6 atomes. Ces substrats sont particulièrement adaptés pour la mise en oeuvre de la technique de détection et de manipulation de protéines d'intérêt fusionnées à l'AGT, telle que décrite dans la demande de brevet WO 02/083937. Cette technique est actuellement exploitée par la société Covalys à l'aide des enzymes connues sous les dénominations commerciales � SNAP-tag � et � CLIP-tag �. Par AGT (06-alkylguanine ADN a/kyltransférase), on entend ici l'AGT sauvage quelle que soit son origine (humaine, de souris, de rat etc..) et ses mutants fonctionnels capables de transférer une molécule d'intérêt conjuguée à un substrat benzylnucléotide sur une fonction thiol de l'enzyme. Les enzymes SNAP-tag (Juillerat et al.,Chemistry & biology, Vol.10, 313-317 Avril 2003) et CLIP-tag (Gautier et al, Chemistry et Biology, 15, 128-136, février 2008) commercialisées par la société Covalys sont des mutanl:s de l'AGT humaine dont les substrats sont respectivement, l'06-benzylguanine (ci-après dénommée BG) et l'02-benzylcytosine (ci-après dénommée BC). L'enzyme N-AGT (Gronemeyer et al., (Protein engineering, design & selection, vol. 19, no 7, pp 309-3016, 2006) est un autre mutant de cette enzyme dont la réactivité avec l'06-benzylguanine est meilleure que celle de l'enzyme SNAP-tag. De manière tout à fait inattendue, la réactivité des substrats de l'AGT selon l'invention avec cette enzyme AGT, et en particulier avec ses mutants SNAP-tag, CLIP-tag et N-AGT est bien meilleure que celle des substrats classiques de ces enzymes, ce qui se traduit par une cinétique de marquage de l'AGT beaucoup plus rapide. Les substrats d'AGT selon l'invention permettent ainsi d'étendre l'application de l'AGT et ses mutants à des domaines NH2 BC-tétraméthylrodhamine où les concentrations en substrats et les temps de marquage étaient jusqu'à présent limitant (criblage à haut débit, diagnostic, imagerie médicale,...). Les substrats d'AGT selon l'invention sont les composés de formule (I) : ùA--L2ùM (I) dans laquelle : Y ûO forment ensemble un nucléotide choisi parmi : la guanine, la cytosine, l'uracile, la 10 thymine, la xanthine, l'hypoxanthine ; L, et L2 sont des bras de liaison ; M est une molécule d'intérêt ou un groupe réactif ; A représente un cycle carboné ou un hétérocycle monoazoté, aromatique ou saturé, non substitué ou substitué par un groupe carboxyle, et comportant 5 ou 6 atomes. 15 Les substrats de formule (I) dont le nucléotide est la guanine, la xanthine ou l'hypoxanthine répondent à la formule (Il) : ùAùL2ùM 20 dans laquelle L,, A, L2 et M ont les mêmes significations que ci-dessus et RI est choisi 25 parmi l'hydrogène, le groupe NH2, ou le groupe OH et le groupe oxo. On notera que lorsque R, est le groupe NH2 ou OH, le groupe Y-O est respectivement la guanine ou la xanthine. Dans le cas où R, est un groupe OH, la forme majoritaire est le tautomère dans lequel R, est un groupe oxo et la liaison entre le carbone en position 2 et l'azote en position 3 de la purine est une liaison simple. 30 Les substrats de formule (II) dans lesquels RI est un groupe NH2 sont préférés. Ces substrats préférés sont des dérivés de benzylguanine. 5 Les substrats de formule (I) dont le nucléotide est la cytosine, la thymine ou l'uracile répondent à la formule (III) : AùL2ùM R3 10 dans laquelle : L,, A, L2 et M ont les mêmes significations que ci-dessus ; - R2 est choisi parmi les groupes NH2, OH et oxo ; et - R3 est choisi parmi l'hydrogène et le groupe CH3. Dans le cas ou R2 est un groupe OH, la forme majoritaire est le tautomère dans lequel R2 est 15 un groupe oxo et la liaison entre le carbone en position 4 et l'azote en position 3 de la pyrimidine est une liaison simple. Les substrats de formule (III) dans lesquels R2 est un groupe NH2 et R3 est l'atome d'hydrogène sont préférés. Ces substrats préférés sont des dérivés de cytosine. 20 GROUPE A Le groupe A est un cycle carboné ou un hétérocycle monoazoté, aromatique ou saturé, non substitué ou substitué par un groupe carboxyle comportant 5 ou 6 atomes. De préférence, le groupe A est un radical divalent choisi parmi les groupes suivants : 25 HOOC 15 20 BRAS DE LIAISON Les bras de liaison L, et L2 relient respectivement le benzylnucléotide et la molécule d'intérêt au groupe A. La structure de ces bras de liaison est déterminée par la voie de synthèse chimique choisie pour conjuguer le groupe A avec le benzylnucléotide d'une part, et la molécule d'intérêt d'autre part. De manière générale les bras de liaison sont constitués par une simple liaison covalente ou par un radical organique divalent, choisi parmi les groupes al La molécule d'intérêt peut être de nature et de fonction très diverses comme le montre la littérature sur la technologie SNAP-tag, et dépend de l'application envisagée. En particulier la molécule d'intérêt peut être choisie parmi : un composé luminescent ou un fluorophore, une molécule radioactive, un membre d'un couple de partenaires de liaison, une molécule susceptible d'interagir avec d'autres molécules biologiques, une molécule capable de se lier de manière covalente ou non-covalente avec d'autres molécules, une molécule capable de générer des radicaux hydroxyles lorsqu'elle est exposée à de l'H2O2 et de l'acide ascorbique, une molécule capable de générer des radicaux réactifs après exposition à la lumière, une molécule liée de manière covalente à un support solide, un lipide ou tout autre molécule capable de s'insérer dans la membrane plasmique, et une biomolécule ayant des propriétés enzymatiques, chimiques ou physiques d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulier, la molécule d'intérêt est choisie parmi l'avidine, la streptavidine et la biotine. Dans un autre mode de réalisation, la molécule d'intérêt est un marqueur susceptible de générer ou de moduler un signal mesurable, en particulier un composé luminescent ou un 25 fluorophore. Dans ce cas, et à titre d'exemple non-limitatif, la molécule d'intérêt peut être choisie parmi les composés luminescents ou fluorescents suivants : Les fluorophores organiques, tels que les cyanines et leurs dérivés, (en particulier celles connues sous les dénominations commerciales DY647, Cy5, DY490), la 30 fluorescéine et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la carbopyronine et ses dérivés, l'oxazine et ses dérivés, les AlexaFluors, le crystal violet et ses dérivés, les perylènebisimides et leurs dérivés, les squaraines, les BODIPYs, le NBD (nitrobenzoxadiazole) et ses dérivés, le DABCYL (acide 4-((4-(diméthylamino) phényl) azo) benzoique) et ses dérivés ; 35 - Les fluorophores protéiques, tels que la GFP et ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B- phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celle connue sous la dénomination XL665 ; Les complexes de lanthanides fluorescents, tels que es cryptates de lanthanides, les chélates de lanthanides (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de néodymium). La molécule d'intérêt peut également être un accepteur d'érergie non-fluorescent et par exemple peut être choisie parmi les produits connus sous les dénominations commerciales ci-après : les produits QXL de la société Anaspec et en particulier les produits QXL 570, QXL 610, QXL 670 et QXL 680 ; les produits DYQ660 et DYQ661 de la société Dyomics ; les produits QSY7, QSY9 et QSY21 de la société Invitrogen ; les produits ATTO540Q, ATTO580Q, ATTO621 Q de la société ATTO-TEC De manière préférée, la molécule d'intérêt est choisie parmi les produits connus sous les dénominations commerciales ci-après : DY647; d2 ; ATTO647N ; 5-ex-fluorescéine ; 5,6-carboxyfluorescéine ; le cryptate d'europium Py-bipy ; le complexe de terbium DOTA-TATP ; le cryptate d'europium py-bipy-tétraacide, le cryptate d'europium tris-bipy, le cryptate de terbium Tb(KR), le cryptate d'europium trisbipy-pentaacicle, le cryptate d'europium Py-biTATP. De manière encore plus préférée, le fluorophore est choisi parmi les fluorophores suivants : DY647, ATTO647N, 5-ex-fluorescéine, Tb(KR). Les figures 1A et 1B donnent les formules de quelques fluorophores fonctionnalisés (porteurs d'un groupe réactif tel qu'un groupe NHS) dont la synthèse est connue ou bien qui sont disponibles commercialement, et pouvant être utilisés comme intermédiaires pour fabriquer les composés selon l'invention. De nombreux fluorophores porteurs d'un groupe réactif facilitant leur couplage à d'autres molécules sont disponibles commercialement. Par exemple, les fluorophores suivants sont commerciaux : DY647-NHS, DY490-NHS (Dyomics), 5,6-carboxyfluorescéine, 5-Exfluorescéine (Invitrogen), ATTO647N-NHS (ATTO TEC), cryptate d'europium trisbipyridine (Cisbio) La synthèse de cyanines portant divers substituants est largement décrite dans la littérature. On peut citer en particulier les cyanines et leurs procédés de synthèse décrits dans les brevets américains US 5,268,486, US 5,627,027 et le brevet Européen EP 1,322,770. Les complexes de terre rare sont des composés connus qui sont décrits par exemple dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. D'autres chélates sont composés d'un ligand nonedenté tel que la terpyridine (EP 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909). Le terre rare est de préférence l'europium ou le terbium. Les cryptates de terres rares et leur préparation sont quant à eux décrits notamment dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 601 113 et la demande WO 01/96 877. La synthèse du fluorophore Tb(KR)-NHS est décrite dans la demande de brevet WO 2008/063721. Le DOTA-TATP-Tb et sa préparation sont décrits dans l'article de R. A. Poole et al., dans Org. BiomolChem., 2005, 3, 1013-1024. GROUPE REACTIF Typiquement, le groupe réactif est un groupe, respectivement, électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. La réaction de conjugaison entre un composé selon l'invention comportant un groupe réactif et une molécule d'intérêt portant un groupe fonctionnel entraîne la formation d'une liaison covalente comportant un ou plusieurs atomes du groupe réactif. De préférence, le groupement réactif est un groupe dérivé d'un des composés ci-après : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide carboxylique, un diazoalcane, une haloacétamide, une halotriazine, telle que la monochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un 1 ydroxysuccinimidyl ester, un hydroxysulfosuccinimidyl ester, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyridyl dithio)-propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule : O 0 (l NH )v (CH2)w NCS --(, I I NH--(CH2) w NCO O (II NH~(CH2) w NH2 -( 01 1 NH)-(CH2) N3 v w NH-)ù(CH2) SH v w NH)ù(CH2)w NH-Ar O NHù}ù(CH2) w S-S-Ar C) I )v O (CH2)NùN O O (II NHù)ù(CH2) NC:' v w 0 0 (Il NH-)ù(CH2) N3 (II NH-)ù(CH2) OùN v w v w Il >- O S03- (Il NH)ù(CH2) w 0 dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons saturé ou insaturé,comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par 5 un atome d'halogène. De manière préférée, le groupe réactif est un acide carboxylique, une amine, un succinimidyl ester d'acide carboxylique, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un group maléimide, une amine aliphatique. Les composés de formule (1) selon l'invention dans lesquels le groupe M est un groupe 10 réactif sont des intermédiaires de synthèse utiles pour l'obtention des composés de formule (I) dans laquelle M est une molécule d'intérêt. 12 COMPOSES PREFERES: Les composés de formules suivantes, dans lesquelles M et L2 sont tels que définis précédemment, sont particulièrement préférés. Pour chaque formule, on indique ci-après la signification du groupe LI-A. LI-A forme un groupe benzamide : L2ù M NH _m NH NH 2 LI-A forme un groupe nicotinamide : L2ùM N C NH2 NH NH ùM LI-A forme un groupe isonicotinamide : L2ùM N C NH~~ \ N H2 O NH L2ùM O NH L,-A forme un groupe trans-cyclohexylamide L2ùM N NH 2 LùM O NH LI-A forme un groupe cis-cyclohexylamide : L2ùM N NH~~ -Ni H 2 NH L2ù M NH 14 L,-A forme un groupe pipéridinylamide : NùL2ùM ~ \N C NH~~ NH 2 NH O NH I \N--L2ùM L,-A forme un groupe carboxybenzamide : L2ùM ~~ \N NH~~ NH 2 HOOC NH 2 NH ùM Dans la suite de la présente description, on utilisera les abréviations ci-après : DCC : Dicyclohexylcarbodiimide DTT : Dithiothréitol THF : Tetrahydrofurane DMF : Diméthylformamide anhydre TBTU : O-(benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate TEAB : triéthylammonium bicarbonate SPDP : N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionate TCEP : hydrochlorure de tris[2-carboxéthyl]phosphine DMSO : diméthylsulfoxyde anhydre DIPEA : diisopropyléthylamine TFA : acide trifluoroacétique BG : 06-benzylguanine BC : 02-benzylcytosine Milieu DMEM : "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" Milieu de culture cellulaire, disponible commercialement et utilisé dans de nombreuses applications. SVF : sérum de veau fétal Ester de NHS : Ester de N-hydroxysuccinimide FRB : domaine de liaison de la protéine FRAP avec le complexe FKBPùrapamycine (en langue anglaise "FKBPùrapamycin binding domain of FRAP") FRAP : protéine se liant au complexe FKBP-rapamycine (en langue anglaise, "FKBPù10 rapamycin binding protein") FKBP : protéine se liant à la protéine FK506 (en langue anglaise, "FK506 binding protein") GST : Gluthation-S-transférase TBP : trisbipyridine. L'expression "cryptate d'europium TBP" ou l'acronyme KTBP désigne un composé vendu par Cisbio, dont la formule est indiquée dans la figure 1A 15 Les fluorophores suivants sont disponibles dans le commerce : DY-647-NHS (Dyomics), 5,6-carboxyfluorescéine, 5-Ex-fluorescéine (Introgen), ATTO647N-NHS (ATTO TEC), cryptate d'europium trisbipyridine (Cisbio) La synthèse du fluorophore Tb(KR)-NHS est décrite dans la demande de brevet WO 2008/063721. 20 SYNTHESES: I) SYNTHESES DE COMPOSES DE TYPE BENZYLGUAIVINE-FLUOROPHORE Ces composés sont les composés présentés dans la partie expérimentale comme les composés de référence : ils ne comportent pas de groupe L1-A-L2 entre la benzylguanine et 25 le fluorophore. La préparation de ces composés est décrite dans la littérature et consiste à mettre en contact un dérivé BG portant un groupe réactif susceptible de réagir avec un fluorophore porteur d'un autre groupe réactif. Les schémas de synthèse ci-après sont basé sur l'utilisation de dérivés BG-NH2 ou BG-SH, qui seront mis en contact par exemple avec un 30 fluorophore portant un ester de N-hydroxysuccinimide ou un groupe maléimide. De tels fluorophores sont disponibles dans le commerce. Synthèse de BG-NH2 : BG-NH2 a été synthétisé selon le protocole décrit dans l'article de Antje Keppler et al., dans Nature Biotechnology, 2003, 21, 86-89. 35 Synthèse de BG-SH Le BG-SH a été synthétisé selon la séquence décrite dans le schéma 1. La réaction du BG-NH2 avec SPDP (N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionate) suivie d'une réduction du pont disulfure avec le TCEP (hydrochlorure de tris[2- 15 carboxéthyl]phosphine) ou de DTT conduit avec un bon rendement au BG-SH souhaité dans les conditions opératoires bien connues de l'homme du métier. BG-NH2 BG-SH Schéma 1 Synthèse de BG-fluorophore et de BG-S-fluorophore Les BG-Fluorophores et BG-S-Fluorophores ont été préparés selon les méthodes généralement utilisées pour ce type de couplage. Le BG-NH2 réagit facilement avec un fluorophore comportant une fonction d'ester de NHS conduisant ainsi après purification par HPLC préparative au BG-fluorophore correspondant. Dans le cas ou le fluorophore porte une fonction maléimide, le BG-SH est utilisé conduisant ainsi au BG-S-fluorophore (Schéma 2). NH2 N---./LN N^NNH2 H 20 BG-NH2 BG-Fluorophore Fluorophore o Fluorophore iI H^NJ\NH2 O N---/L tJ Fluorophore H NLN N----N' NH2 O O F3O V OF3 CO2H CO2H L'acide 4-aminométhylbenzoïque est protégé sous forme de trifluoroacétate permettant ainsi, dans la suite de la synthèse une déprotection douce en rrilieu légèrement basique. CI=3 NH 30 2) Précurseurs des méthylnicotinamide et méthylisoniconitinamide o o F3CÂOJLCF3 NH2 ~CO2H H2, Pd/C 10% NCMeOHy 7- CO2H I e N F2CYNH O r'Ne F3CYNH O A partir des dérivés commerciaux cyanonicotinyles, les composés correspondant 5 aminométhylnicotinyles sont obtenus par hydrogénolyse. Les groupements amino sont ensuite protégés par un groupe trifluoroacétate. 3) Précurseurs des trans-cyclohexylamide, cis-cyclohexylamide, pipéridinylamide CO2H Co2H NH2 H2, Pd/C 10% McOH NC O 0 F3CÂOx'CF3 Ç02H Ç02H Ç02H Y Y Fmoc Fmoc 10 Les composés ci-dessus sont disponibles commercialement ou peuvent être préparés par des procédés bien connus de l'homme du métier. 4) Précurseur du carboxyméthylazidobenzamide 1) n-BuLi 2) CICO2Me tBuOAc HCIO4 CO2H CO2H CO2Me CO2tBu Co2tBu X NaN3 DMF CO2Me CO2Me TFA 15 Co2H Co2tBu X CO2Me L'acide 3-bromo-4-méthylbenzoïque est converti en acide 3-carboxyméthyl -4-méthylbenzoïque correspondant en utilisant les conditions standard généralement utilisées : échange halogène-lithium formant une espèce lithiée qui réagit avec un électrophile (diméthyle carbonate ou CICO2Me). La fonction acide carboxylique libre est ensuite protégée sous forme d'ester de tertiobutyle permettant d'obtenir ui système de déprotection orthogonal. L'introduction du groupement azido est réalisée en deux étapes : bromation radicalaire du méthyle aromatique suivi de la substitution de l'atome de brome par l'azoture de sodium. Enfin l'ester de tertiobutyle est déprotégée en présence de TFA conduisant ainsi au précurseur souhaité. Couplage des groupes A portant des groupes réactifs avec une benzylguanine et un fluorophore 1) Fluorophores NHS La stratégie générale de synthèse des produits selon l'invention comportant une benzylguanine et un fluorophore est présentée sur le schéma 3 lorsque le fluorophore est utilisé sous forme d'ester de NHS. Les groupes A N-Protégés (dont la synthèse ou la source ont été présentées précédemment), sont activés soit sous forme d'anhydrides (utilisation de DCC), soit sous forme d'esters de N-hydroxysuccinimidyle (utilisation du TBTU). Ces intermédiaires réagissent rapidement avec le BG-NH2 conduisant ainsi au produit de formule BG-L1-A N-protégé. En fonction du groupement protecteur porté par l'atome d'azote du groupe A, les conditions de déprotection utilisées permettent d'obtenir le composé BG-L1-A-NH2. En présence d'un fluorophore comportant une fonction ester de N-hydroxysuccinimidyle, ce composé réagit dans des conditions douces conduisant ainsi aux composés BG-L,-A-L2-fluorophore. 2) Fluorophores Maléimide Il est également possible d'utiliser des fluorophores portant un groupe fonctionnel maléimide. Les dérivés de BG portant le groupe LI-A peuvent être préparés selon la même stratégie que celle décrite pour la préparation des BG-SH à partir des BG-L,-A-NH2. Ainsi la réaction de BG-L1-A-NH2 avec SPDP, suivie de la réduction au TCEP permet d'accéder aux composés BG-L1-A-NH-CO-(CH2)2-SH (Schéma 4). Ces derniers conduisent aux BG-L1-AL2-Fluorophore en présence d'un fluorophore portant un groupe maléimide. Les composés selon l'invention sont bien sûr particulièrement adaptés au marquage de protéines de fusion comprenant une molécule d'intérêt et une enzyme AGT. Ainsi l'invention concerne également une méthode de marquage d'une protéine d'intérêt par un groupe M, ladite protéine d'intérêt étant exprimée sous forme de protéine de fusion avec une enzyme AGT, cette méthode comprenant une étape de mise en contact de ladite protéine de fusion avec un composé selon l'invention. Cette méthode est ici mise en oeuvre dans les exemples suivants pour étudier la réactivité enzymatique des composés selon l'invention avec différents variants de l'AGT, dans un modèle in vitro et dans un modèle cellulaire. 20 Schéma 3 A 5 IO Protection = Fmoc, CF3CO-, -N2 A 'ùNH2 NùI Protection 2) BG-NH2 Différentes conditions d'activation: - DCC, THF - DMF, TBTU Déprotection H2N--I A Différentes conditions de déprotection: - Pipéridine 5%-DMF - TEAB 1M, A - H2, Pd/C 10%, MeOH N Protection 1) Activation O N~N NN~NH2 H Fluorophore ON~N N~N~NH2 15 Fluorophore 20 J 25 Schéma 4 NL N N;:':-I,.NH2 H H N~ ùN\ S, S O TCEP H ùN\ ^ 'SH O A A 5 A N ùNH2 o 21 N--./L. HNNH2 N \^_ /SH Fluorophore o (NH Fluorophore A oy NH O N-,/L HNNH2 N 22 TEST DE REACTIVITE ENZYMATIQUE Les exemples qui suivent ont pour objet de mesurer la cinétique de transfert d'un fluorophore sur une protéine de fusion comprenant une enzyme AGT (SNAP-tag, N-AGT ou CLIP-tag), à partir d'un substrat de référence (de type benzylnucléotide-fluorophore) ou bien à partir de composés selon l'invention (benzylnucléotide-L1-A-L2-fluorophore). Ces exemples permettent de mettre en évidence la réactivité bien supérieure des substrats selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tag et un de ces variants, en comparaison avec les substrats de l'art antérieur. La mesure de la réactivité des substrats avec l'enzyme SNAP-tag est effectuée soit dans un modèle in vitro, soit dans un modèle sur cellules vivantes. Mode opératoire du test de réactivité enzvmatiaue sur modèle in vitro : Le test de réactivité des substrats selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tag est basé sur un test in vitro de marquage d'une protéine recombinante. Ce marquage est mis en évidence par la détection d'un signal de FRET entre deux protéines, chacune marquée par un fluorophore membre d'un couple de partenaires de FRET. En l'occurrence, on utilise les protéines FRB et FKBP qui interagissent en présence de rapamicyne. La protéine FKBP est marquée par un premier fluorophore par la technologie SNAP-tag : pour cela une protéine de fusion GST-SNAPtag-FKBP est produite à partir du plasmide pSET-26b selon le protocole du kit commercial (SNAP express pSTE7-26b kit Covalys Biosciences AG Witterswil/Switzerland). Cette protéine de fusion est ensuite mise en contact avec le premier fluorophore conjugué à un dérivé de BG de référence ou à un dérivé de BG selon l'invention. La protéine FRB est quand à elle couplée par des techniques classiques de conjugaison avec un composé fluorescent donneur (Cryptate d'europium TBP (KTBP), Cisbio Bioassay) ou accepteur (DY647, Dyomics) selon les cas, en suivant les protocoles fournis avec ces produits. Le tableau ci-dessous explicite la nature des couples de fluorophores dans chacun des exemples 1 à 4 suivants : Exemple BG conjugué avec : FRB fusionnée avec : 1 DY647 KTBP 2 ATT0647 KTBP 3 5-Ex-fluorescéine KTBP 4 Tb(KR) DY647 5 DY647 KTBP 6 Tb(KR) DY647 Dans chaque exemple, 2 nmoles de protéine recombinante FRB marquée avec un cryptate d'europium ou DY647 (2eme fluorophore), sont co-incubées à température ambiante avec 2 nmoles de protéine recombinante GST-SNAP-tag-FKBP et des concentrations croissantes de BG marquée par le premier fluorophore (BG-fluorophore de l'art antérieur ou BG-L1-A- L2-fluorophore selon l'invention). Les lectures de fluorescence se font à 620 nm et à 665 nm sur RubyStar (BMG laboratory) après une excitation à 337 nm. Les lectures sont réalisées avant et après induction de l'interaction protéique FRB/FKBP par 100 nM de rapamycine. Cette interaction se traduit par l'émission d'un signal de TR-FRET. L'enzyme SNAP-tag rie pouvant fixer qu'un seul groupement fluorescent, l'augmentation du signal de TR-FRET est directement proportionnelle au pourcentage de protéines marquées dans le milieu réactionnel. Ce modèle in vitro permet d'établir des cinétiques de marquage enzymatique en fonction de l'excès de substrat engagé dans la réaction. Les résultats sont indiqués soit en d665 soit en % de marquage suivant les formules 15 suivantes : d 665 = (signal à 665 nm avec la protéine GST-ST-FKBP) - (signal à 665 nm sans la protéine GST-ST-FKBP). Le pourcentage de marquage est obtenu par comparaison avec le signal correspondant au marquage maximal qui est obtenu après 18 heures d'incubation. 20 % marquage = (d665 à t mesure / d665 18 h d'incubation) x 100. Mode opératoire du test de réactivité enzymatique sur modèle cellulaire. Ce mode opératoire permet de tester la réactivité de substrats selon l'invention avec une AGT exprimée par des cellules COS 7 sous forme de protéine de fusion avec le récepteur 25 transmembranaire au glutamate de type 2 (mGIuR2). Différents mutants d'AGT ont été analysés dans cette étude : SNAP-tag-ST26 ou CLIP-tag de la société Covalys ou le mutant N-AGT décrit par Gronemeyer et al (Protein Engineering, Design & Selection, vol. 19, no 7, pp. 309-316, 2006). Plasmides : 30 - Plasmide SNAP-tag-mGIuR2, préparé à partir du plasmide pSET-26b selon le protocole du kit commercial (SNAP express pSTE7-26b, kit Covalys Bioscierices) - Plasmide pcdna3.1 : invitrogen Ce plasmide est utilisé comme contrôle négatif ; les cellules transfectées avec ce plasmide sont désignées cellules � mock � et permettent de déterminer le niveau de marquage non spécifique. 35 Protocole : La transfection transitoire des cellules est effectuée par électroporation à l'aide un électroporateur Biorad : 10 millions de cellules sont transfectées par 1 pg SNAP-tag-mGIuR2 + 3pg pcdna3.1 dans un volume final de 300pl. Les paramètres d'électroporation sont : 280V & 1000pF. 24 Les cellules sont ensuite ensemencées à la densité de 150 000 cellules par puits dans des plaques Greiner (noire fond opaque) préalablement incubées avec de la poly-ornithine pendant 30 minutes à 37'C. Les cellules sont cultivées dans du milieu DMEM + Rouge Phénol + 10% SVF + Penicilline/Streptomycine + acides aminés non essentiels à 37'C et 5% CO2. Après 24h d'expression, un premier lavage est effectué avec 100pl de ce même milieu. Le marquage de la protéine de fusion AGT-mGIuR2 s'effectue dans 100pI de milieu complet avec des concentrations croissantes de BG-fluorophore ou BG-LI-A-L2-fluorophore selon l'invention pendant l h à 37t. Avant la lecture, 4 lavages sont effectués avec 100pl de Tris- Krebs. Pour les substrats porteurs des fluorophores ATTO647 (exemple 2), DY647 (exemples.1 et 5) et (exemple 3), la lecture est réalisée dans 100pl de Tris-Krebs en fluorescence directe à 682 sur Rubystar, et à 520 nm pour ceux porteurs de 5-Ex-fluorescéine (exemple 3). Pour les substrats porteurs du complexe de terbium KR (exemples. 4 et 6), la lecture est réalisée dans 100pI de Tris-Krebs en fluorescence en temps résolu à 620 nm sur Rubystar. EXEMPLE 1 : BG-méthylbenzamide-DY647 Comparaison des réactivités entre les BG-DY647 & BG-méthylbenzamide-DY647 et l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence BG-DY647 : //N~QN \ N NH, H 30 Structure du substrat BG-méthylbenzamide-DY647 : NH NN / HNNH2 • Résultats de réactivité enzymatique et de marquage protéique in vitro La fiqure 2 représente l'évolution du pourcentage de marquage de l'enzyme SNAP-tag en fonction de la concentration en substrat. Ces résultats montrent que le marquage est fortement amélioré après 30 min d'incubation avec le substrat selon l'invention comportant un motif méthylbenzamide, et ce quelle que soit la concentration de substrat testée. • Résultats obtenu sur modèle cellulaire Effet avec l'enzyme SNAP-tag ST26 La concentration permettant la demi-saturation de l'enzyme est de 168 nM avec le composé de référence alors qu'elle est de seulement 91,3 nM avec le substrat selon l'invention (fiqure 3). Ces résultats obtenus sur cellules vivantes confirment ceux obtenus dans le modèle in vitro. Cette faible concentration de demi-saturation avec les composés selon l'invention permet de travailler en faible concentration de substrat, ici inférieure à 100 nM. Afin de valider l'effet du substrat selon l'invention sur un autre mutant de I'AGT, une caractérisation de marquage extracellulaire avec le mutant NAGT a été réalisée. Effet avec l'enzyme N-AGT La figure 4 montre les résultats obtenus avec l'enzyme N-AGT, un mutant plus réactif que SNAP-tag, et là encore la concentration de demi-saturation est environ 2 fois moins élevée avec le composé selon l'invention (22,3 nM) par rapport au substrat de référence (43 nM). Cet exemple montre que la réactivité supérieure des substrats selon l'invention n'est pas spécifique de l'enzyme SNAP-tag ST-26 mais est également observée lorsque des variants de cette enzyme sont utilisés.25 26 EXEMPLE 2 : BG-Méthvlbenzamide-ATTO647 Comparaison de la réactivité de BG-ATTO647N / BG-méthylbenzamide-ATTO647 N avec l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat BG-Méthylbenzamide-ATTO647N : Structure du substrat de référence: BG-ATTO647N H ATTO647N 10 15 • Résultats de réactivité enzymatique et de marquage protéique in vitro La fiqure 5 représente l'évolution du pourcentage de marquage de l'enzyme SNAP-tag en 20 fonction de la concentration en substrat après 30 min d'incubation : Là encore on observe que le pourcentage d'enzyme marquée par l'ATTO647 est bien meilleur lorsque le substrats selon l'invention sont utilisés, et cela quelle que soit la concentration de substrat. Cet exemple montre que l'effet des substrats selon l'invention ne dépend pas de la nature de 25 la molécule d'intérêt puisque des résultats similaires sont obtenus avec 2 fluorophores différents, DY647 (exemple 1) et ATTO647. 30 EXEMPLE 3 : BG-méthylbenzamide-5-Ex-fluorescéine Comparaison de la réactivité de BG-5-Ex-fluorescéine / BG-méthylbenzamide-5 Ex-fluorescéine avec l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence BG-5-Ex-fluorescéine: NH2 Structure du substrat BG-méthylbenzamide- 5 fluorescéine-EX : • Résultats de réactivité enzymatique et de Marquage protéique in vitro Les résultats présentés sur la fiqure 6 montrent là-encore que la réactivité du substrat selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tagST-26 est meilleure que celle du substrat de référence, et cela alors même que la réactivité du substrat BG-5-Ex-fluorescéine de référence peut être considérée comme correcte. Ces résultats confirment également que l'effet des substrats selon l'invention ne dépend pas de la nature de la molécule d'intérêt qui y est conjuguée.20 EXEMPLE 4 : BG-méthvlbenzamide-Tb(KR) Comparaison de la réactivité de BG-Tb(KR) / BG-méthylbenzamide-Tb(KR) avec l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence : BG- Tb(KR) : 15 20 Structure du substrat BG-méthylbenzamide-Tb(KR) : O NH HN NH • Résultats de réactivité enzymatique et de marquage protéique in vitro Les résultats présentés sur la figure 7 montrent là encore une bien meilleure réactivité des substrats selon l'invention avec l'enzyme SNAP-tag par rapport au substrat de référence.. 25 On note qu'ici la molécule conjuguée n'est pas un fluorophore organique comme dans les exemples précédents mais un complexe constitué d'un polymacrocycle et d'une terre rare, beaucoup plus volumineux que les fluorophores testés dans les exemples précédents. Cet exemple illustre à nouveau le caractère universel des substrats selon l'invention qui peuvent être conjugués à une variété de molécules. 30 • Résultats obtenu sur modèle cellulaire Les résultats obtenus sur le modèle in vitro sont confirmés lorsque le substrat BG-méthylbenzamide-Tb(KR) est utilisé pour marquer une protéine transmembranaire exprimée à la surface de cellules vivantes. Les concentrations de demi-saturation mesurées avec le substrat selon l'invention sont de 15,4 nM avec l'enzyme SNAP-tag-ST26, et de 6,4 nM avec le mutant N-AGT (Figure 8) alors qu'elle est de 60 nM avec un substrat de référence BG-Tb(KR) (SNAP-tag). EXEMPLE 5 : BG-aminonicotinamide-DY647 Comparaison de la réactivité de BG-DY647 / BG-Aminométhylricotinamide-DY647 avec l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence BG-DY647 : N' NH= Structure du substrat BG-aminomethylnicotinamide -DY647 : • Résultats de réactivité enzymatique et de Marquage protéique in vitro Les courbes de la fiqure 9, montrent que le pourcentage d'enzyme marquée après 30 minutes d'incubation avec des substrats comportant un motif aminométhylnicotinamide est également bien meilleur que celui observé avec le substrat de référence, et cela quelle que soit la concentration en substrat. 30 Par ailleurs, le gain de réactivité observé avec le substrat comportant un motif aminométhylnicotinamide est du même ordre de grandeur que celui obtenu avec les substrats comportant un motif méthylbenzamide. Ces résultats suggèrent qu'une certaine variabilité est possible au niveau du motif 5 aromatique des substrats selon l'invention (motif A de la formule I) EXEMPLE 6 : BG-aminonicotinamide-Tb(KR) Comparaison de la réactivité de BG- Tb(KR) / BG- Aminonicotinamide - Tb(KR) avec l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence : BG-Tb(KR) /-\ /---CN NH NH NH HN HN NH NH 15 Structure du substrat BG-aminomethylnicotinamide-Tb(KR) : 0 H CN N/ HN NH HN NH O J_--N N--2. O 0 -0 Tb3+ O O N \ NH HN NH O HO On a obtenu des résultats similaires à ceux obtenus avec les composés des exemples précédents. 20 EXEMPLE 7 : BC-méthvlbenzamide-Tb(KR) Comparaison de la réactivité de BC-Tb(KR) / BC-méthylbenzamide-Tb(KR) avec l'enzyme CLIP-tag. Comme mentionné précédemment, l'enzyme CLIP-tag est un mutant de l'AGT réactif avec 5 les dérivés de la benzylcytosine, et est commercialisée par la société Covalys, comme l'enzyme SNAP-tag. Structure du substrat de référence : BC-Tb(KR) o o NH NH Tb3+ 10 15 NH NH NH NH /N 20 Structure du substrat BC-méthylbenzamide-Tb(KR) : o o I NH CH2-NH II (CH2)6 30 25 • Résultats obtenu sur modèle cellulaire Le modèle cellulaire utilisé dans cet exemple est différent de celui utilisé dans les exemples précédents : 35 Les cellules sont soit cotransfectées avec un plasmide codant pour la protéine de fusion CLIPtag-mGIuR2 et un autre plasmide codant pour la protéine de fusion SNAPtag-mGIuR2, soit transfectées avec un seul plasmide codant pour la protéine de fusion SNAPtag-mGIuR2. Chaque population de cellule est incubée en présence de 300 nM de BG-méthylbenzamide-DY647 et de concentrations croissantes de substrats de référence (BC-Tb(KR)) ou de 32 substrat selon l'invention (BC-méthylbenzamide-Tb(KR)). La fluorescence est mesurée à 665 nm en mode TR-FRET sur Rubystar et le signal mesuré est représentatif d'un transfert d'énergie consécutif à la dimérisation de deux monomères de mGluR2 marqués respectivement par DY647 et Tb(KR). On peut observer sur la figure 10 que la concentration de demi-saturation de CLIPtag par le dérivé de benzylcytosine selon l'invention est de 131 nM, alors qu'elle est de 820 nM avec le composé de référence. (Le signal observé dans les cellules exprimant SNAPtag-mGIuR2 seulement correspond au signal de fixation non spécifique de BG-DY647 par CLIPtag) Cet exemple confirme que l'effet inattendu des substrats selon l'invention n'est pas limité à 10 SNAPtag / benzylguanine mais est également observé avec CLIPtag / benzylcytosine. EXEMPLE 8 : BC-méthylbenzamide-DY647 Comparaison de la réactivité de BC-DY647 / BC-méthylbenzamide-DY647 avec l'enzyme CLIP-tag 15 On procède dans cet exemple comme dans l'exemple 7 mais les cellules sont incubées en présence de 300 nm de BG-méthylbenzamide-Tb(KR) et de concentrations croissantes de substrat de référence (BC-DY647) ou de substrat selon l'invention (BC-méthylbenzamide-DY647) dont les formules sont ci-dessous : Substrat de référence (BC-DY647) H2N s 3 H 25 33 Substrat BC-méthvbenzamide-DY647 : NH SO2H NH H2N N n Les résultats présentés sur la figure 11 confirment la meilleure réactivité du substrat selon l'invention (demi-saturation : 240 nM) par rapport au substrat de référence (demi-saturation : 1570 nM). Les synthèses des composés suivants sont décrites ci-après : Composé 1 : benzylguanine-Dy647 Composé 2 : benzylguanine-5,6-carboxyfluorescéine Composé 3 : benzylguanine-5-Ex-fluorescéine-Ex Composé 4 : benzylguanine-ATTO647N Composé 5 : benzylguanine-Tb(KR) Composé 6 : Acide 4-((2,2,2-trifluoroacétamido)méthyl)benzoïque Composé 7 : Trifluoroacétamidométhylbenzamide-BG Composé 8 : Aminométhylbenzamide-BG Composé 9 : Dy647-méthylbenzamide-BG Composé 10 : ATTO647N-méthylbenzamide-BG Composé 11 : 5,6-carboxyfluoresceine-méthylbenzamide-BG Composé 12 : 5-fluorescéine-Ex-Benzylamide-BG Composé 13 : Tb(KR)-méthylbenzamide-BG Composé 14 : BG-SH Composé 15 : BG-méthylbenzamide-SH Composé 16 : acide 2-(trifluoroacétamidométhyl)nicotinique Composé 17 : acide 2-(trifluoroacétamidométhyl)isonicotinique Composé 18 : DY647-aminométhylisonicotinamide-benzylguanine Composé 19 : DY647-aminométhylnicotinamide-benzylguanine Composé 20 :Tb(KR)-aminométhylnicotinamide-benzylguanine Composé 21 : benzylguanine-N-Fmoc-pipéridine Composé 22 : benzylguanine-pipéridine Composé 23 : DY647-pipéridine-benzylguanine Composé 24 : benzylguanine-trans-4-(Fmoc-amino)-cyclohexane Composé 25 : benzylguanine-trans-4-amino-cyclohexane Composé 26 : DY647-trans-cyclohexane-benzylguanine Composé 27 : benzylguanine-cis-4-(Fmoc-amino)-cyclohexane Composé 28 : benzylguanine-cis-4-amino-cyclohexane Composé 29 : DY647-cis-cyclohexane-benzylguanine Composé 30 : Benzylcytosine-DY647 Composé 31 : Benzylcytosine-Tb(KR) Composé 32 : Aminométhylbenzamide-BC Composé 33 : DY647-méthylbenzamide-BC : Composé 34 : Tb(KR)-méthylbenzamide-BC: Composé 1 : benzylguanine-DY647 NH DMSO sO3 H Dans un ballon de 10 ml on a introduit 4,2 mg (15,5 pmol) de 5-aminométhylbenzylguanine et 11,8 mg (15,5 pmol) de DY647-NHS. Les produits ont été partiellement solubilisés dans 4 20 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. Le mélange a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 25 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. Un solide bleu a été obtenu (8,5 pmol par mesure de densité optique, 55%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M+H+1 895,3. 30 Composé 2, : benzylguanine-5,6-carboxyfluorescéine HO DMSO NLN H~NNH2 Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml on a introduit 100 pl de solution à 10 mmol.l-' dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et 100 pl de solution à 10 mmol.l-' dans du diméthylesulfoxyde anhydre (1 pmol) de 5,6-carboxyfluorescéine-NHS. Le mélange a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative est effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions sont collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide jaune (900 nmol par mesure de densité optique, 90%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) mlz : [M+H+] 629,1. Composé 3 : benzylguanine-5-Ex-fluorescéine. HO N N N NNH2 H Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml on a introduit 100 pl de solution à 10 mmol.F1 dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et 100 pl de solution à 10 mmol.l' dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1 pmol) cle 5-fluorescéine-Ex-NHS. Le mélange a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne HO + O s O tre O DMSO O NH HN" S~ O Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions on été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide jaune (650 nmol par mesure de densité optique, 65%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 746,1. Composé 4 : benzylguanine-ATTO647N ~NN HAN NH2 ATTO647N~f O o O. ATTO647N NH DMSO N N NH2 Dans un ballon de 10 ml on a introduit 1,8 mg (6,7 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et 5 mg (6,6 pmol) d'ATT0647-NHS. Les produits ont été partiellement solubilisés dans 5 ml de diméthylsulfoxyde anhydre. Le mélange a étéagité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une 15 colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide 20 bleu (3,6 pmol par mesure de densité optique, 54,5%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M'] 898. Composé 5 : benzylguanine-Tb(KR) NH2 NH Tb(KR) NHNNH2 25 Dans un tube Eppendorf del,5 ml on a introduit 100 pl de solution à 10 mmol.l-' dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et 100 pl de solution à Tb(KR) O OyN DMSO N~N ~~ NH N NH2 10 mmol.f-' dans du diméthylsulfoxyde anhydre (1 pmol) de Tb(KR)-NHS. Le mélange a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 25 mM d'acétate de triéthyl ammonium. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 25 mM d'acétate de triéthyl ammonium. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (650 nmol par mesure de densité optique, 65%) correspondant au produit souhaité. 10 MS (ES+) m/z : [M+H+] 1685,6. Composé 6 : Acide 4-((2,2,2-trifluoroacétamido)méthyl)benzoïque 0 NH2 F3CÂOCF3 HO2C Dans un ballon de 100 ml on a pesé 2,38 g (15,7 mmol) d'acice 4-(aminométhyl) benzoïque. 15 On a mis le ballon dans un bain d'eau et de glace et on a ajouté lentement 5,6 ml (59 mmol) d'anhydride trifluoroacétique. En fin d'addition, on a laissé le mélange réactionnel remonter à température ambiante et on a laissé sous agitation, le mélange réactionnel pendant deux heures. On a ajouté 16,5 ml d'eau à 4'C. On a filtré le pré cipité sur fritté, rincé avec 2 x 3 ml d'eau à 20 4'C et fait séché sous vide en présence de pentoxyd e de phosphore pendant 48 h. On a obtenu un solide blanc (3,27 g û 13,2 mmol - 84%) correspondant au produit souhaité. MS (ES-) m/z : [M-H+] 246,2. Composé 7 : Trifluoroacétamidométhylbenzamide-BG NH2 HO2C O Nk__ DCC H THF o NH HO2C 25 Dans un ballon de 10 ml, on a pesé 593 mg (2,4 mmol) c'acide trifluoroacétamidométhyl benzoïque. On a solubilisé cet acide dans 4 ml de tétrahydrofuranne anhydre et on a ajouté 324,4 mg (1,2 mmol) de 1,3-dicyclohexylecarbodiimide. On a laissé sous agitation, à température ambiante, pendant deux heures. Le précipité blanc de dicyclohexylurée obtenu 30 a été filtré sur fritté. Dans un ballon de 25 ml, on a pesé162,2 mg (0,6 mmol) de 6••aminobenzylguanine et on a ajouté 2 ml de diméthylformamide anhydre. Puis on a ajouté la solution d'anhydride trifluoroacétamidométhyle benzoïque dans le THF et 200 pl de diisopropyléthylamine. On a laissé le mélange réactionnel, sous agitation, à température ambiante pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. On a évaporé à sec, sous pression réduite, le mélange réactionnel jusqu'à l'obtention d'un solide jaune. On a trituré dans 5 ml d'acétonitrile et filtré sur fritté. On a ensuite rincé avec 2 x 1 ml d'acétonitrile et mis à sécher sous vide pendant 48 h. On a obtenu un solide beige (289 mg û 0,58 mmol - 96%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 500,1. Composé 8 : Aminométhylbenzamide-BG NÂCF3 NH NH2 Na2CO3 / MeOH N~N N^N~NH2 H N Î~N HNNH2 Dans un ballon de 50 ml, on a pesé 25 mg (50 pmol) de N-(4-((2-amino-9H-purin-6-yloxy)méthyl)benzyl)-4-((2,2,2- trifluoroacétamido) méthyl)benzamide. On a ajouté 10 ml de méthanol, 2 ml d'une solution aqueuse saturée en Na2CO3 et 4 ml d'eau. On a laissé sous agitation une nuit à température ambiante. La déprotection a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (17,5 mg û 43 pmol - 87%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 404,3. 39 Composé 9 : DY647-méthylbenzamide-BG NH NH SO3H On a repris 2 pmol d'aminométhylbenzamide-BG dans 100 pI de diméthylsulfoxyde anhydre. On a ajouté 2 pmol de DY647-NHS en solution dans 300 pI de diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pI de diisopropyléthylamine. On a laissé sous agitation pendant deux heures, à température ambiante. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (1 pmol par mesure de densité optique, 50%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 1028.4. Composé 10 : ATTO647N-méthylbenzamide-BG NH2 NH ATTO647N HN NH DMSO / DIPFA On a repris 200 nmol d'aminométhylbenzamide-BG dans 100 pI de diméthylsulfoxyde anhydre. On a ajouté 200 nmol de ATTO647N-NHS en solution dans 20 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et 1 pI de diisopropyléthylamine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant deux heures, à température ambiante. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (149 nmol par mesure de densité optique, 74%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M'] 1031,5. Composé 11 : 5,6-carboxyfluoresceine-méthylbenzamide-BG N NH2 HO On a repris 1 pmol d'aminométhylbenzamide-BG dans 100 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre. On a ajouté 1 pmol de 5,6-carboxyfluoresceine-NHS en solution dans 50 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pL de diisopropyléthylamine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure, à température ambiante. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP'18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide jaune (600 nmol par mesure de densité optique, 60%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M+H'] 762,1. 30 Composé 12 : 5-Ex-luoresceine-Benzylamide-BG o On a repris 1 pmol d'aminométhylbenzamide-BG dans 100 pI de diméthylsulfoxyde anhydre. On a ajouté 1 pmol de 5-fluoresceine-Ex-NHS en solution dans 40 pI de diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pI de diisopropyle amine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure, à température ambiante. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP'18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide jaune (400 nmol par mesure de densité optique, 40%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 879,3. Composé 13 : Tb(KR)-méthylbenzamide-BG o o Tb(KR) o~Nto NH2 Dans un ballon de 10 ml, on a pesé 2,3 mg (8,5 pmol) d'aminométhylbenzamide-BG dans 2 ml de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 6 pmol de Tb(KR)-NHS en solution dans 2 ml de diméthylformamide anhydre et 20 pl de diisopropyle amine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant deux heures, à température ambiante. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RPI8 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau 25 mM acétate de triéthyle ammonium pH 6. On a évaporé le DMF sous pression réduite et on a repris le résidu dans de l'eau. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans l'eau 25 mM acétate de triéthyle ammonium pH 6. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide 5 blanc (2,2 pmol par mesure de densité optique, 36%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 1819,3. Composé 14 Préparation du BG-SH NH2 NL HNNH2 N INA 0 SPDP tampon MOPS 0,05 M pH7 DTT BG-NH2 BG-SH 10 Dans un ballon de 10 ml on a pesé 0,8 mg (3 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine que l'on a solubilisé dans 200 pl de diméthylformamide anhydre et 1,5 ml de tampon MOPS 0,05 M pH 7. On a jouté 1,1 mg (3,6 pmol) de SPDP. On a laissé le mélange réactionnel, sous agitation, pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck 15 Lichrospher RPI8 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. On a ajouté au mélange réactionnel 2,2 mg (14,4 pmol) de DTT et laissé celui-ci sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 20 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (2,1 pmol par mesure de densité optique, 70%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 358,9. 25 30 43 Composé 15 : BG-méthylbenzamide-SH NH2 SPDP tampon MOPS 0,05 M - pH 7 NH DU NH N H O Dans un ballon de 10 ml, on a repris 4,5 pmol d'aminométhylbenzamide-benzylguanine dans 200 pl de diméthyleformamide anhydre et 1,5 ml de tampon MOPS 0,05 M pH 7. On a ajouté 1,7 mg (5,4 pmol) de SPDP. On a laissé le mélange réactionnel, sous agitation, pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. On a ajouté au mélange réactionnel 2,5 mg (16,2 pmol) cle DTT et on l'a laissé sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (3 pmol par mesure de densité optique, 66%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M+H� 492,2. Composé 16 : acide 2-(trifluoroacétamidométhyl)nicotinique O O O F3CUOyCF3 HO" v~ i O O N NH2 HO CF3 Dans un ballon de 100 ml, on a pesé 500 mg (3,58 mmol) d'acide 6-cyanopyridine-3-carboxylique et solubiliser dans 50 ml de méthanol. On a ensuite ajouté 30 mg de palladium à 10 % sur du charbon et de l'hydrogène sous une atmosphère pendant quatre heures. La réaction est suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Le produit formé a précipité. On a ajouté 40 ml d'eau déminéralisée au mélange réactionnel, puis on a filtré sur de la célite le palladium et concentré le mélange réactionnel sous pression réduite dans un ballon de 50 ml. On a mis le ballon dans un bain de glace/eau et on a ajouté lentement 4 ml d'anhydride trifluoroacétique. On a laissé le mélange réactionnel remonter à température ambiante et sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC. On a ajouté au mélange réactionnel 20 ml d'éther et on l'a mis dans un bain glace/eau pendant 20 min. On a filtré sur fritté le précipité et on l'a mis à sécher sous vide pendant 48 h. On a obtenu un solide blanc (450 mg û 1,81 mmol - 54%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 249. Composé 17 : acide 2-(trifluoroacétamidométhyl)isonicotinique H2, Pd/C 10 % MeOH NH2 OyOH NCN CF3 Dans un ballon de 50 ml, on a pesé 100 mg (675 pmol) d'acide 6-cyanopyridine-4- carboxylique et on l'a solubilisé dans 30 ml de méthanol. On a ensuite ajouté 10 mg de palladium à 10 % sur du charbon et de l'hydrogène sous une atmosphère pendant quatre heures. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Le produit formé a précipité. On a ajouté 20 ml d'eau déminéralisée au précipité, filtré sur de la célite le palladium et concentré sous pression réduite dans un ballon de 50 ml. On a mis le ballon dans un bain de glace/eau et ajouté lentement 3 ml d'anhydride trifluoroacétique. On a laissé la température du mélange réactionnel remonter à la température ambiante et on l'a maintenu sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC. On a ajouté au mélange réactionnel 10 ml d'éther et on l'a mis dans un bain glace/eau pendant 20 min. On a filtré sur fritté le précipité et on l'a mis à sécher sous vide pendant 48 h. On a obtenu un solide blanc (110 mg û 443 pmol - 67%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 249. Composé 18 : DY647-aminométhylisonicotinamide-benzylguanine H Dy647-NHS DMSO I DIPEA O HO S0 O Dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 1 pmol d'aminométhylisonicotinamidebenzylguanine on a ajouté une solution de 1 pmol de Dy647-NHS dans 100 pI de diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pI de diisopropyléthylamire. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (470 nmol par mesure de densité optique, 47%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 1029,3. Composé 19 : DY647-aminométhylnicotinamide-benzy1guanine O Dy647-NHS O DMSO I DIPEA N----)':N NN~NH2 H O Nv 'N H^N NH2 O HO S0 O Dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 1 pmol d'aminométhylnicotinamidebenzylguanine ajouter une solution de 1 pmol de Dy647-NHS dans 100 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pl de diisopropyléthylamine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un g-adient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (540 nmol par mesure de densité optique, 54%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M+H.] 1029,3. O HNy Tb(KR) DIPEA O NLN N NNH2 Dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 1 pmo d'aminométhylnicotinamidebenzylguanine on a ajouté une solution de 1 pmol de Tb(KR)-NHS dans 100 pl de 15 diméthylsulfoxyde anhydre et 2 pl de diisopropyléthylamine. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau 25 mM acétate de triéthyle ammonium pH 6. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 20 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau 25 mM acétate de triéthyle ammonium pH 6. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression 'éduite. On a obtenu un solide bleu (400 nmol par mesure de densité optique, 40%) correspondant au produit souhaité. MS (ES') m/z : [M+H'] 1820,3 û [M+2H'] / 2 = 910,5. Composé 20 : Tb(KR)-aminométhylnicotinamide-benzylguanine : O HN NH2 Tb(KR)-NHS N~N HNNH2 DMSO 25 Composé 21 : benzylguanine-N-Fmoc-pipéridine u HN~O Dans un ballon de 50 ml, on a pesé 48,1 mg (178 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et on l'a solubilisé partiellement dans 10 ml de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 62,5 mg (178 pmol) de 4-carboxy-N-Fmoc-pipéridine et 57,1 mg (178 pmol) de TBTU. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RPI8 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu unsolide blanc (38 mg, 35%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 604,5. Composé 22 : benzylguanine-pipéridine HN~O HNO DMF 5% piperidine \/ N--../L N N N~NH2 H 48 Dans un tube eppendorf de 1,5 ml, on a pesé 1,8 mg (3 pmol) de benzylguanine-N-Fmocpipéridine et on l'a solubilisé dans 190 pI de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 10 pI de pipéridine et On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RPI8 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide triflJoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc correspondant au produit souhaité. II a été directement utilisé dans la réaction suivante sans mesure de rendement. MS (ES+) m/z : 382,3. Composé 23 : DY647-pipéridine-benzylguanine Dans un ballon de 25 ml contenant 1,8 pmol de benzylguanine-pipéridine, on a ajouté 800 pl de diméthylsulfoxyde anhydre, 4p1 de diisopropyléthylamine et 0,14 mg (1,8 pmol) de Dy647-NHS. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP'18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (700 nmol par mesure de densité optique û 40%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : 1006,75. 30 Composé 24 : benzylguanine-trans-4-(Fmoc-amino)-cyclohexane : HN HN DMF HO TBTU N N/-1.,NH2 Dans un ballon de 50 ml, on a pesé 51 mg (189 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et on l'a solubilisé partiellement dans 20 ml de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 69 mg (189 pmol) de trans-4-(Fmoc-amino)-carboxycyclohexane et 60,7 mg (189 pmol) de TBTU. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (16 mg, 13,7%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+) 618 ,6. Composé 25 : benzylguanine-trans-4-amino-cyclohexane HN HN /Nv N HN NH2 DMF 5 % piperidine Dans un tube eppendorf de 1,5 ml, on a pesé 1,2 mg (2 pmol) de benzylguanine-trans-4-(Fmoc amino)-cyclohexane et on l'a solubilisé dans 190 pI de diméthylformamide anhydre. Ajouter 10 pl de pipéridine et on a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc correspondant au produit souhaité. Il a été directement utilisé dans la réaction suivante sans mesure de rendement. MS (ES+) m/z : 396,3. Composé 26 : DY647-trans-cyclohexane-benzylguanine DIPEA HN O DMSO NH2 HN O + Dans un ballon de 25 ml contenant 2 pmol de benzylguanine-trans-4-amino-cyclohexane on a ajouté 800 pI de diméthylsulfoxyde anhydre, 4pl de diisopropyléthylamine et 0,14 mg (1,8 pmol) de DY647-NHS. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (600 nmol par mesure de densité optique û 33%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : 1020,8.25 Composé 27 : benzylguanine-cis-4-(Fmoc-amino)-cyclohexane u HN~O TBTU HN O DMF + Nv `N N^N --)-.NH2 H Dans un ballon de 50 ml, on a pesé 61,3 mg (226 pmol) de 6-aminométhylbenzylguanine et on l'a solubilisé partiellement dans 20 ml de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 82,7 mg (226 pmol) cis-4-(Fmoc-amino)-carboxy-cyclohexane et 72,8 mg (226 pmol) de TBTU. On a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant deux heures. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (28 mg, 20%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 618 ,6. Composé 28 : benzylguanine-cis-4-amino-cyclohexane HNO DMF 5 % piperidine NH2 --- -- (il N~N H^N NH2 Dans un tube eppendorf de 1,5 ml, on a pesé 0,7 mg (1,1 prnol) de benzylguanine-cis-4-(Fmoc-amino)-cyclohexane et on l'a solubilisé dans 190 pl de diméthylformamide anhydre. On a ajouté 10 pl de pipéridine et on a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP'18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc, correspondant au produit souhaité. Il a été directement utilisé dans la réaction suivante sans mesure de rendement. MS (ES+) m/z : [M+H+] 396,3. Composé 29 : DY647-cis-cyclohexane-benzylguanine Dans un ballon de 25 ml contenant 1 pmol de benzylguanine-cis-4-amino-cyclohexane, on a ajouté 800 pl de diméthylsulfoxyde anhydre, 4pl de diisopropyléthylamine et 0,7 mg (1 pmol) de DY647-NHS et on a laissé le mélange réactionnel sous agitation pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (400 nmol par mesure de densité optique û 40%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : 1020,8. NH2 o HN"O o HN~O o rv N ~i N Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 25 mM d'acétate de triéthyle ammonium. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide 5 blanc (350 nmol par mesure de densité optique, 35%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 1645,2 [M+2H+]/2 823,4. Composé 32 : Aminométhylbenzamide-BC o HxcF3 O N CF3 TBTU H DMSO MeOH O O N'N N'LN H2NH2Ni Na2CO3 OH NH O NH NH2 10 Dans un tube eppendorf de 2 ml, on a pesé 6 mg (26 pmol) d'aminométhylbenzylcytosine et 6,4 mg (26 pmol) d'acide trifluoroacétamidométhyl benzoïque. On a solubilisé le mélange dans 600 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et on a ajouté 9,2 mg (28,6 pmol) de TBTU et 8 pl de diisopropyléthylamine. Le mélange réactionnel a été agité pendant deux heures. La 15 réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP'18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. On a évaporé à sec sous pression réduite le mélange réactionnel jusqu'à obtention d'un 20 solide blanc ;a été repris dans 2 ml de méthanol, on a ajouté 2 ml de solution aqueuse saturée en Na2CO3 et 4 ml d'eau. Le mélange a été agité toute une nuit. La déprotection a été suivie par HPLC. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. 25 Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (8,5 pmol par mesure de densité optique, 32%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 364,4. 30 Composé 33 : DY647-méthylbenzamide-BC : NH2 NH SO3H DMSO/DPEA N'N HZN Dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 1 pmol d'aminométhylbenzamide-BC, on a ajouté 1 pmol de DY647-NHS en solution dans 140 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et 4 pl 5 de diisopropyléthylamine. Le mélange réactionnel a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 10 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 0,2% d'acide trifluoroacétique. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide bleu (400 nmol par mesure de densité optique, 40%) correspondant au produit souhaité. MS (ES+) m/z : [M+H+] 988,6 [M+Na+] 1010,6 [M+K+] 1026,6. 15 Composé 34 : Tb(KR)-méthylbenzamide-BC: NH NH SO3H O O Tb(KR) + o çNro DMF / DIPEA /\ N Tb(KR) O NH H2N Dans un tube eppendorf de 1,5 ml contenant 1 pmol d'aminométhylbenzamide-BC, on a ajouté 1 pmol de Tb(KR)-NHS en solution dans 120 pl de diméthylsulfoxyde anhydre et 4 pl de diisopropyléthylamine. Le mélange réactionnel a été agité pendant une heure. La réaction a été suivie par HPLC sur une colonne Merck Lichrospher RP°18 5 pm 125 x 4,6 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 25 mM d'acétate de triéthyle ammonium. Une purification par HPLC préparative a été effectuée sur une colonne Vydac C18 10 pm 250 x 22 avec un gradient d'acétonitrile dans de l'eau à 25 mM d'acétate de triéthyle ammonium. Les fractions ont été collectées et concentrées sous pression réduite. On a obtenu un solide blanc (270 nmol par mesure de densité optique, 27%) correspondant au produit souhaité. 10 MS (ES+) m/z : [M+H+] 1779,3 [M+2H+]/2 890. REVENDICATIONS1. Composé de formule (I) : ùAùL2ùM (I) 30 dans laquelle : YùO forment ensemble un nucléotide choisi parmi : la guanine, la cytosine, l'uracile, la thymine, la xanthine, l'hypoxanthine ; LI et L2 sont des bras de liaison ; M est une molécule d'intérêt ou un groupe réactif ; A représente un cycle carboné ou un hétérocyclemonoazoté, aromatique ou saturé, non 15 substitué ou substitué par un groupe carboxyle, et comportant 5 ou 6 atomes. 2. Composé selon la revendication 1 de formule (II) : 20 (II) / C I L1ùAùL2ùM NH~~ R N i dans laquelle L,, A, L2 et M les mêmes significations que précédemment, et 25 R, est choisi parmi : H, NH2, un groupe OH ou un groupe oxo. 3. Composé selon la revendication 2, caractérisé en ce que R, est un groupe NH2. 4. Composé selon la revendication 1 de formule (III) : NnN AùL2ùM 35 R R3 dans laquelle LI, A, L2 et M sont tels que définis dans la revendication 1 ; R2 est choisi parmi : NH2, OH ou oxo, 40 R3 est choisi parmi l'hydrogène et le groupe CH3. 2 5. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que R2 est un groupe NH2 et R3 est H. 6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que A est choisi parmi les groupes divalents suivants : HOOC 7. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que L1 et L2 sont identiques ou différents et sont une liaison covalente ou un radical organique bivalent choisi parmi : les groupes alkylène linéaires ou ramifiés en C1-C20, contenant éventuellement une ou plusieurs doubles ou triples liaisons; les groupes cycloalkylène en C5-C8 et les groupes arylène en C6-C14, lesdits groupes alkyène, cycloalkylène ou arylène contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou un ou plusieurs groupe(s) carbamoyle ou carboxamido, et lesdits groupes alkylène, cycloalkylène ou arylène étant éventuellement substitués par des groupes alkyle en C1-C8, aryle en C6-Ct4, ,sulfonate ou oxo; 8. Composé selon la revendication 7, caractérisé en ce que L1 et L2 sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes divalents suivants : 1) ù(CH2)n 0 0 Il II 2) ù(CH,)oùNH-Cù(CH2)m C 3) ù(CH2)nù0ù(CH2)m 0ù(CH2)P0 0 Il II 4) -(CH2)r,-0-(CH2)m 0-(CH2)p-NH-C-(CH2) C- 0 I I 5) -(CH2)r,-NH-C-(CH2)p O~ 0 6) -(CH2),,-NH-C-(CH2)P N 0>r -S-(CH2)r 0 7) -(CH2),ä-NH-C-(CH2)P S 0 I I 8) -(CH2)r,-NH-C (CH2)F; S-(CH2)r 0 9) -(CH2),-NH-C 10) -(CH2),-NH 0 I I 11) -(CH2)n-NH-C-(CH2)p 12) -(CH2)n NH-(CH2)p dans lesquels n, m, p, r sont des nombres entiers de 1 à 16, de préférence de 1 à 5.20 9. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que L, est un groupe divalent de formule suivante : O\ ùCH2ùNH 10. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 9, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes : L2ù M NH~~NNH 2 NH L2ùM N NH~~ NH 2 NH NH O ~ \N NH~~/\NH 2 L2ùM L2ùM O L2ùM NH61 O Il NH NùL2ùM HOOC O NH II / \ L2ùM NH~~ NH N 2 dans lesquelles L2 et M sont tels que définis dans la revendication 1. 11. Composés selon l'une quelconque des revendications 1, 4, 5 et 9, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes : j N C NH~~ NH 2 NH ùM NH ùM 10O ùM LùM O NH NùL2ùM 2 NH NH 12. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que L2 est choisi parmi les groupes suivants : O (CH2) q CH2ùNH (CH2) q O (CH2)u II NH (CH2)ùt CH2ùNH CH2ùNHdans lesquelles q, u, t dont des nombres entiers compris entre 1 et 10 13. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que M est un marqueur susceptible de générer ou de moduler un signal mesurable. 5 14. Composé selon les revendications 1 à 12, caractérisé en ce que M est une molécule d'intérêt est choisie parmi : un composé luminescent ou un fluorophore, une molécule radioactive, un membre d'un couple de partenaires de liaison, une molécule susceptible d'interagir avec d'autres molécules biologiques, une molécule capable de se lier de manière 10 covalente ou non-covalente avec d'autre molécules, une molécule capable de générer des radicaux hydroxyle lorsqu'elle est exposée à de l'H2O2 et de l'acide ascorbique, une molécule capable de générer des radicaux réactifs après exposition à la lumière, une molécule liée de manière covalente à un support solide, un lipide ou tout autre molécule capable de s'insérer dans la membrane plasmique, et une biomolécule ayant des propriétés 15 enzymatique, chimiques ou physique d'intérêt.. 15. Composé selon la revendication 14, caractérisé en ce que M est choisi parmi : l'avidine, la streptavidine, la biotine. 20 16. Composé selon la revendication 14, caractérisé en ce que M est choisie parmi les composés luminescents ou fluorophores suivants : - les Fluorophores organiques tel que les cyanines et leurs dérivés, la fluorescéine et ses dérivés, la coumarine et ses dérivés, la rhoclamine et ses dérivés, la carbopyronine et ses dérivés, l'oxazine et ses dérivés, les AlexaFluors, le crystal 25 violet, et ses dérivés, les perylènebisimide et ses dérivés, les squaraines, les BODIPYs, le NBD (nitrobenzoxadiazole) et ses dérivés, le DABCYL (acide 4-((4-(diméthylamino) phényl) azo) benzoïque) et ses dérivés ; - les Fluorophores protéiques tels que la GFP et ses variants, les protéines fluorescentes extraites de coraux, les phycobiliprotéines, telles que la B- 30 phycoérythrine, la R-phycoérythrine, la C-phycocyanine, les allophycocyanines, en particulier celle connues sous la dénomination XL665 ; - les complexes de lanthanides fluorescents tels que les cryptates de lanthanides, les chélates de lanthanides (en particulier les chélates et cryptates d'europium, de terbium, de samarium, de dysprosium, de néodymium). 35 17. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que M est un groupe réactif choisi parmi les groupes suivants : un acrylamide, une amine activée (par exemple une cadavérine ou une éthylènediamine), un ester activé, un aldéhyde, un halogénure d'alkyle, un anhydride, une aniline, un azide, une aziridine, un acide 40 carboxylique, un diazoalcane, une haloacétamide, une halotriazine, telle que lamonochlorotriazine, la dichlorotriazine, une hydrazine (y compris les hydrazides), un imido ester, un isocyanate, un isothiocyanate, un maléimide, un halogénure de sulfonyle, ou un thiol, une cétone, une amine, un halogénure d'acide, un hydroxysuccinimidyl ester, un hydroxysulfosuccinimidyl ester, un azidonitrophényl, un azidophényl, une 3-(2-pyridyl dithio)- propionamide, glyoxal et en particulier les groupes de formule : O i - NHù)ù(CH2) NCO v w NH+(CH2) N3 /v w NH+(CH2) w S-S-Ar O O (II NH)-(CH2) NCS v w O (II NH)-(CH2) NH2 v w O (Il NH-)ù(CH2) SH v w ( Il NH)-(CH2) NH-Ar ( /v w C) (ILNH) v S03- O Il ( NH)ù(CH2) v w OùN =CH2 O dans lesquels w varie de 0 à 8 et v est égal à 0 ou 1, et Ar est un hétérocycle à 5 ou 6 10 chaînons liés par des liaisons saturées ou insaturées, comprenant 1 à 3 hétéroatomes, éventuellement substitué par un atome d'halogène. 18. Composé selon la revendication 17, caractérisé en ce que M est un groupe réactif choisi parmi les groupes suivants : un acide carboxylique, une amine, un succinimidyl ester 15 d'acide carboxylique, un haloacétamide, une hydrazine, un isothiocyanate, un group maléimide, une amine aliphatique. 19. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes : NH O 66o 11,3+ O O NH NH HN NH N`/~ 10 15 NH NH NH O o o- o 20 NH 20. Méthode de marquage d'une protéine d'intérêt par un groupe M, ladite protéine d'intérêt étant exprimée sous forme de protéine de fusion avec une enzyme AGT, 25 caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de mise en contact de ladite protéine de fusion avec un composé selon les revendications 1 à 16 ou 19. o I