Brevet FR2942042A1 — publié le 20100813

METHODE DE DIFFERENCIATION D'ECHANTILLONS DE SERUM OU PLASMA La présente invention concerne une méthode de différenciation d'au moins deux échantillons de sérum ou plasma humain. Les Centres de Ressources Biologiques (CRB) sont des centres de ressources spécialisés dans l'acquisition (prélèvements), la conservation, la validation, l'étude et la distribution de collections d'organismes et d'échantillons biologiques non renouvelables (tissus, fragments de tissus, sérums, plasmas, etc.). Des échantillons de sérum ou plasma, conservés par les Centres de Ressources Biologiques, sont souvent destinés à des analyses sérologiques ou protéomiques, dans le cadre d'études comparatives sujets cas/sujets témoins ou sujets exposés/sujets non exposés. Il est important, pour la validité scientifique de ces études, que les échantillons comparés supposés différents ne proviennent effectivement pas du même prélèvement sanguin. Or, il peut arriver que, suite à des erreurs de manipulation intervenant par exemple lors de la collecte des échantillons, leur aliquotage, leur enregistrement ou leur conservation, les échantillons de sérum ou plasma à comparer supposés différents proviennent en fait d'un même prélèvement sanguin, conduisant de ce fait à des résultats erronés. Dans ce contexte, il est donc nécessaire d'introduire un contrôle de la qualité des échantillons de sérum ou plasma à comparer, de manière à s'assurer que ces échantillons proviennent bien de prélèvements sanguins différents. Cependant, il n'existe actuellement aucune méthode pour effectuer ce contrôle, qui soit rapide, fiable et puisse être utilisée en routine. La Demanderesse s'est alors donnée pour but de pourvoir à une méthode de différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma humain. La Demanderesse a découvert que chaque sérum ou plasma humain possède une empreinte sérologique. Cette empreinte sérologique peut être déterminée en mesurant la concentration d'immunoglobulines de classe G (IgG) polyclonales dirigées contre au moins trois antigènes différents sélectionnés pour leur capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée chez l'Homme. La Demanderesse a aussi mis en évidence que la mesure de la concentration d'IgG dirigées contre seulement trois antigènes tels que définis ci-avant était suffisante pour déterminer une empreinte sérologique. La Demanderesse a alors mis au point une méthode de différenciation d'au moins deux échantillons de sérum ou plasma humain, comprenant une étape de comparaison de ladite empreinte sérologique entre les échantillons. Plus particulièrement, la Demanderesse a montré que deux échantillons de sérum ou plasma humain différents présentent entre eux au moins une concentration d'IgG (polyclonales) différente pour un même antigène choisi parmi les protéines EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), PT de B. pertussis et OMP2 de C. pneumoniae. La présente invention a en conséquence pour objet une méthode de différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma humain, ladite méthode comprenant une étape de comparaison de la concentration, dans les échantillons, d'immunoglobulines de classe G (IgG) dirigées contre au moins trois antigènes différents sélectionnés pour leur capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée, une concentration différente entre lesdits deux échantillons pour au moins une IgG dirigée contre un même antigène signifiant que les deux échantillons proviennent de deux prélèvements sanguins différents. La concentration desdites IgG peut être déterminée par n'importe quelle méthode connue de l'Homme du métier, telle que les méthodes suivantes : ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), EIA (Enzyme Immunoassay), RIA (Radio Immunoassay), immunofluorescence, multiplex (Bio-Plex�, Luminex�), Western blot ou par puce à protéines, de préférence par la méthode ELISA. De préférence, la concentration d'IgG dirigée contre un antigène correspond à la valeur moyenne d'au moins trois mesures (triplicate). De préférence encore, la concentration desdites immunoglobulines est déterminée par spectrophotométrie afin de mesurer une densité optique. On entend par � immunoglobuline de classe G dirigée contre un antigène �, une IgG qui est capable de se lier à un antigène ou à un fragment peptidique de cet antigène comprenant un épitope. On entend par � immunité humorale acquise de longue durée � ou � réponse immunitaire humorale acquise de longue durée �, une immunité humorale spécifique d'un antigène qui l'a induite et se caractérisant par la formation de lymphocytes B à mémoire (portant des IgG de membranes spécifiques dudit antigène) chez les sujets. Ces lymphocytes B à mémoire peuvent rester présents dans l'organisme pendant au moins 10 ans, voire à vie, après le premier contact avec ledit antigène par infection ou vaccination. On entend par � un antigène ayant la capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée �, un antigène qui est capable de provoquer une réponse immunitaire humorale acquise de longue durée chez un humain. L'Homme du métier connait de nombreux antigènes capables d'induire une immunité humorale acquise de longue durée chez l'Homme, tels que ceux induisant la production d'anticorps infectieux ou vaccinaux de longue durée. Parmi les anticorps infectieux de longue durée, on peut citer ceux dirigés contre la protéine EBNA-1 exprimée par le virus d'Epstein-Barr, les protéines de choc thermique (HSP) telles que HSP60 (par exemple celle d'E. coli ; numéro d'accession AAS75782.1 ou GI:45686198 dans la base de données GenBank, ou celle de Chlamydia trachomatis, Yi et al., Infect. Immun., 1993, 61: 1117-1120), HSP70 et HSP90 (voir pour revue Zügel and Kaufman, Clin. Microbiol. Rev., 1999, 12: 19-39), les protéines OMP2 ou MOMP (Major Outer Membrane Protein ; e.g., numéro d'accession AAB24363.1 ou GI:260973 dans la base de données GenBank) exprimées par Chlamydophila pneumoniae (Cunningham et Ward, FEMS Microbiol. Lett., 2003, 227: 73-79) ou les lipopolysaccharides (antigènes O) des bactéries à Gram-négatif (voir pour revue Helander et al., Lipopolysaccharides, Encyclopedia of Life Sciences, 2001, John Wiley & Sons, Ltd.). Parmi les anticorps vaccinaux de longue durée, on peut citer ceux dirigés contre la toxine tétanique (tétanospasmine) produite par Clostridium tetani (e.g., numéro d'accession PO4958.2 ou GI:135624 dans la base de données GenBank), la protéine de capside du virus de la poliomyélite (e.g., numéro d'accession ABW24064.1 ou GI:158252122 dans la base de données GenBank) ou la protéine PT, la pertactine (e.g., numéro d'accession P14283.3 ou GI:464364 dans la base de données GenBank) ou la phytohémagglutinine (FHA, e.g., numéro d'accession CAD12824.1 ou GI:17154501 dans la base de données GenBank) produites par Bordetella pertussis (Guiso et al., Vaccine, 2007, 25: 1390-1397). Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, lesdits antigènes proviennent de trois microorganismes de genres différents. On entend par � microorganisme �, un virus, une bactérie, un parasite, un champignon ou une levure, de préférence un virus ou une bactérie. Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, lesdits antigènes sont sélectionnés parmi les antigènes du virus d'Epstein-Barr (EBV), les antigènes de Bordetella pertussis et les antigènes de Chlamydophila pneumoniae. Selon une disposition préférée de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, lesdits trois antigènes sont la protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), la protéine PT de B. pertussis et la protéine OMP2 de C. pneumoniae. Le virus d'Epstein-Barr, aussi appelé EBV (Epstein-Barr virus) ou HHV-4 (Human herpesvirus 4) est responsable de la mononucléose infectieuse (MNI) et est impliqué dans certains cancers chez l'Homme. La majorité de la population mondiale adulte a été infectée par ce virus, et environ 90 à 100 % des individus infectés le sont à vie en raison des propriétés particulières de ce virus ; en effet, la marque d'une infection à EBV est la capacité de ce virus à établir une infection non productrice et quiescente dans les lymphocytes B, qui persiste généralement sans apparition de symptômes durant toute la vie du sujet infecté (infection latente). La persistance génomique du virus (latence de type I) est liée à l'expression de protéines virales, dont la protéine de latence nucléaire EBNA-1 (Epstein Barr Nuclear Antigen 1, numéro d'accession P03211 ou GI:119110 dans la base de données GenBank). Les immunoglobulines de classe G (IgG) anti-EBNA-1 apparaissent lors de la primo-infection et persistent toute la vie chez la majorité des individus infectés ; ces IgG peuvent disparaître chez les personnes immunodéprimées notamment (Henle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1987, 84: 570-574 ; Ascherio et al., JAMA, 2001, 286: 3083-3088). La protéine EBNA-1 présente un épitope immunodominant de séquence Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Pro-Pro-Arg-Arg-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Arg-Pro-Phe-Phe-Hi s- Pro-Val (SEQ ID NO: 1) (acides aminés 389 à 409 de la séquence de la protéine de numéro d'accession P03211 définie ci-dessus) (Fachiroh et al., J. Clin. Microbiol., 2006; 44: 1459-1467 ; Blake et al., J. Immunol., 2000, 165: 7078-87). Bordetella pertussis est un coccobacille à Gram négatif, responsable de la coqueluche chez l'Homme. Dans l'organisme, la bactérie se fixe, par l'intermédiaire d'adhésines, à l'épithélium cilié de l'appareil respiratoire. Elle se multiplie alors et synthétise plusieurs toxines, dont la protéine PT (toxine de pertussis) (numéro d'accession PO4977 ou GI:136005 dans la base de données GenBank). La majorité de la population mondiale est vaccinée contre B. pertussis. Les vaccins anticoquelucheux sont généralement constitués soit de bactéries entières (comprenant la toxine PT) inactivées (vaccin cellulaire), soit d'un mélange d'antigènes comprenant la toxine PT recombinante (vaccin acellulaire). Les IgG anti-PT persistent pendant de nombreuses années après la maladie ou la vaccination. La protéine PT présente un épitope immunodominant de séquence Leu-Thr-Trp-Leu-Ala-Ile-Leu-Ala-Val-Thr-Ala-Pro-Val-Thr-Ser-Pro-Ala-Trp-Al a-Asp-Asp (SEQ ID NO: 2) (acides aminés 16 à 36 de la séquence de la protéine de numéro d'accession PO4977 définie ci-dessus) (Raupach et al., Microb. Pathog., 1994; 17: 213-226 ; Locht et al., Infect. Immun., 1987, 55: 2546-2553). La bactérie Chlamydophila pneumoniae (anciennement Chlamydia pneumoniae) est responsable, chez l'Homme, d'infections respiratoires, qui varient des formes asymptomatiques aux bronchites et pneumonies. Elle évolue sous trois formes antigéniquement distinctes : le corps élémentaire (CE), forme extracellulaire de dissémination de l'infection, le corps réticulé (CR), forme intracellulaire de multiplication et le corps aberrant (CA), forme de persistance responsable de l'infection chronique. Le corps élémentaire est constitué d'une membrane cytoplasmique et d'une paroi proche de celle des bactéries à Gram négatif. La paroi externe renferme plusieurs protéines riches en résidus cystéine dont la protéine majeur de membrane externe (Major Outer Membrane Protein ou MOMP) d'un poids moléculaire d'environ 40 kDa et la protéine OMP2 (numéro d'accession P23700 ou GI:129112 dans la base de données GenBank). MOMP et OMP2 sont des marqueurs d'une infection par cette bactérie. La majorité de la population adulte mondiale a été en contact avec cette bactérie et l'immunité acquise est de très longue durée (Cunningham et Ward, 2003, cité ci-dessus ; Halme et al., Scand. J. Immunol., 1998, 47: 517-520). La protéine OMP2 contient le fragment peptidique de séquence Met-Thr-Ala-Lys-Lys-V al-Arg-Leu-Val-Arg-Arg-Asn-Lys-Gln-Pro-Val-Glu-Gln-Lys-Ser (SEQ ID NO : 3), contenant lui-même un fragment immonuréactif (acides aminés 2-16 ; Cunningham et Ward, 2003, cité ci-dessus). Ce fragment (SEQ ID NO : 3) présente un index d'hydrophobicité égal à -2,5 déterminé selon la méthode de Kyte-Doolittle (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 1982, 157:105-32) ; il peut donc être considéré comme un épitope immonodominant (Margalit et al., J. Immunol., 1987, 138: 2213-2229). Les épitopes potentiels des antigènes peptidiques peuvent être identifiés par toute méthode connue de l'Homme du métier, notamment la technique Pepscan� (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998-4002; Geysen et al., J. Immunol. Methods, 1987, 102, 259-274). Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, lesdites IgG lient un épitope choisi parmi le peptide de séquence SEQ ID NO : 1, le peptide de séquence SEQ ID NO : 2 et le peptide de séquence SEQ ID NO : 3, tels que définis ci-dessus. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, les antigènes ou les fragments peptidiques tels que définis ci-dessus peuvent être conjugués, optionnellement par l'intermédiaire d'un espaceur peptidique, à la biotine pour faciliter leur fixation sur un support solide, par exemple sur une plaque multi-puits sensibilisée à la streptavidine lorsque la comparaison des concentrations d'anticorps s'effectue à l'aide de la méthode ELISA. A titre d'exemple non limitatif d'espaceur peptidique, on peut citer le dipeptide de séquence Gly-Gly. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'invention, les échantillons de sérum ou plasma sont choisis parmi le groupe comprenant les échantillons de : - sérum ou plasma non hémolysé, - sérum ou plasma non lactescent, - sérum ou plasma non-lipémique, - sérum ou plasma non déshydraté, et - plasma prélevé sur un anticoagulant, tel que l'EDTA, le citrate ou l'héparine, de préférence l'EDTA. Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, la méthode comprend les étapes suivantes : (a) fixer les peptides de séquence SEQ ID NO : 1, 2 et 3, sur un support approprié, notamment une microplaque, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine tels que définis ci-dessus ; (b) optionnellement diluer les échantillons de sérum ou plasma à tester entre 1/20 à 1/200, de préférence au 1/40e dans du tampon de dilution sérum/anti-sérum pour les tests mettant en oeuvre les peptides de séquences SEQ ID NO : 1 et 2, et entre 1/200 à 1 /1000, de préférence au 1/400e dans ledit tampon pour le test avec le peptide de séquence SEQ ID NO : 3 ; (c) mettre en contact une fraction des échantillons dilués (par exemple 100 microlitres) avec chacun des trois peptides respectivement ; (d) ajouter un anticorps anti-IgG humaine marqué de façon appropriée ; (e) déterminer la quantité de complexes antigène/IgG/anticorps anti-IgG formés de manière à déterminer la concentration dans les échantillons des IgG liant les peptides de séquences SEQ ID NO : 1, 2 ou 3. (f) comparer les concentrations d'IgG entre les échantillons. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, ledit support est lavé entre les étapes (c) et (d), et/ou (d) et (e). On entend par � anticorps anti-IgG �, un anticorps entier ou un fragment d'anticorps (par exemple un fragment Fab) capable de se lier à n'importe quelle IgG humaine. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, l'anticorps anti-IgG marqué est un anticorps anti-IgG conjugué à une enzyme choisie parmi, l'acétylcholinestérase, la bêta-galactosidase, la glucose-6 phosphate déshydrogénase, la glucose oxydase, le lysozyme, la malate déshydrogénase, la peroxydase et la phosphatase alcaline, de préférence la phosphatase alcaline. Les méthodes de conjugaison entre un anticorps sont bien connues de l'Hommes du métier. Certains sont disponibles commercialement. Selon encore une autre disposition particulière de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, les quantités de complexes antigène/IgG/anticorps anti-IgG sont déterminées par spectrophotométrie (mesure de la densité optique). Selon une disposition de ce mode de mise en oeuvre de l'invention, l'anticorps anti-IgG humaine marqué est conjugué à la phosphatase alcaline. Dans ce cas, la détermination de la quantité de complexes antigène/IgG/anticorps anti-IgG formés peut être effectuée à l'aide d'un substrat approprié, de préférence le pNPP (para-nitrophényl phosphate) et par la mesure de la densité optique (DO) à 405 nm. La méthode de différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma selon la présente invention s'applique aussi à la différenciation d'échantillons de sérum ou plasma dans une banque d'échantillons en comparant deux à deux lesdits échantillons selon la méthode définie ci-dessus. La présente invention a également pour objet une méthode de détermination d'une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain, comprenant une étape de détermination de la concentration, dans l'échantillon, d'immunoglobulines de classe G (IgG) dirigées contre au moins trois antigènes différents sélectionnés pour leur capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée, tels que définis ci-dessus ; l'empreinte sérologique étant définie par les concentrations respectives des IgG contre lesdits au moins trois antigènes différents sélectionnés. Les concentrations sont déterminées par une méthode telle que définie ci-dessus. La présente invention a aussi pour objet un kit ou coffret pour différencier des échantillons de sérum ou plasma humain ou déterminer une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain, comprenant : - une protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), une protéine PT de B. pertussis et/ou une protéine OMP2 de C. pneumoniae, telles que définies ci-dessus, ou - un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 1, un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 2 et/ou un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine, - et optionnellement un anticorps anti-IgG humaine. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation : - d'une protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), d'une protéine PT de B. pertussis et/ou d'une protéine OMP2 de C. pneumoniae, telles que définies ci-dessus, ou - d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 1, d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 2 et/ou d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine, pour différencier des échantillons de sérum ou plasma humain, ou déterminer une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à la validation de la méthode selon la présente invention. EXEMPLE : VALIDATION DE LA METHODE DE DIFFERENCIATION DE DEUX ECHANTILLONS DE SERUM OU PLASMA HUMAIN La méthode décrite ci-dessous n'est pas utilisée pour rendre un résultat quantitatif, mais uniquement un résultat qualitatif permettant de s'assurer que deux échantillons de plasma ou sérum proviennent bien de prélèvements différents. Cette méthode est basée sur la détection de trois marqueurs sérologiques spécifiques (antigènes) par la mesure de la densité optique (DO) à 405 nm en utilisant la technique ELISA. Par conséquent, les paramètres suivants n'ont pas d'influence sur les résultats de la méthode et n'ont pas été validés : justesse, pente, linéarité, sensibilité, corrélation avec une méthode de référence. Les seuls paramètres qui sont critiques pour les résultats rendus par cette méthode sont la fidélité (répétabilité intra-essai et inter-essai) et la spécificité. La validation de la fidélité de la méthode a été réalisée selon la procédure de validation proposée par le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI ; EP10-A3 Preliminary Evaluation of Quantitative Clinical Laboratory Measurement Procedures ; Approved Guideline ; Third edition, 68 p). Le risque de conclure de manière erronée sur l'identité de deux échantillons lorsque ceux-ci appartiennent à des prélèvements différents (spécificité de la méthode), ainsi que la possibilité de tester des échantillons aussi bien de sérum que de plasma humain ont été validés. 1. Matériels et Méthodes : Les échantillons de sérum et plasma humain ont été fournis par le Centre de Ressources Biologiques du Centre Hospitalier Universitaire d'Amiens (France). Trois peptides (épitopes) immunodominants d'antigènes capables d'induire une immunité de longue durée chez l'Homme ont été utilisés : - le peptide de séquence SEQ ID NO : 1, fragment de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr, - le peptide de séquence SEQ ID NO : 2, fragment de la toxine PT de Bordetella pertussis, - le peptide de séquence SEQ ID NO : 3, fragment de la protéine OMP2 de Chlamydophila pneumoniae. Ces peptides ont chacun été conjugués à une molécule de biotine en position N-terminale par l'intermédiaire d'un espaceur peptidique de séquence Gly-Gly, donnant respectivement les marqueurs sérologiques PEPEB (Biotinyl-Gly-Gly-SEQ ID NO : 1), PEPBP (Biotinyl-Gly-Gly-SEQ ID NO : 2) et PEPCP (Biotinyl-Gly-Gly-SEQ ID NO : 3). La méthode de couplage a été décrite dans l'article de Geahlen et al., 1992 (Anal. Biochem., 1992, 202: 68-70). Les concentrations d'IgG se liant aux peptides de séquence SEQ ID NO : 1, 2 ou 3 respectivement ont été mesurés à l'aide de la méthode ELISA, bien connue de l'Homme du métier, selon le procédé suivant : - fixer les conjugués peptidiques (PEPEB, PEPBP et PEPCP) à une plaque multi-puits sensibilisé à la streptavidine ; - mettre en contact les échantillons de sérum ou plasma (100 �l), dilués dans du tampon de dilution sérum/anti-sérum (PBS 1X, 4% NaCI, 0,1% Tween 20), avec chacun desdits conjugués ; incuber pendant l h�5 min à 37°C�2°C sous légère agitation ; - laver trois fois avec du tampon de lavage (PBS 0,1X, 0,1% Tween 20) ; ajouter (100 pl) dans chaque puits un anticorps anti-IgG humaine couplé à la phosphatase alcaline (A3187, Sigma-Aldrich), capable de se fixer aux complexes antigène / IgG précédemment formés ; incuber pendant 1 h�5 min à 37°C�2°C sous légère agitation ; laver trois fois avec le tampon de lavage ; - ajouter (100 pl) dans chaque puits le substrat (1 mg/mL) (para-nitrophényl phosphate (pNPP) dans du tampon Tris/MgC12) ; - incuber, 20 min pour les tests avec le marqueur PEPEB et 30 min pour les tests avec les marqueurs PEPBP et PEPCP, dans l'obscurité à température ambiante ; - ajouter (25 pl) de solution stop (NaOH 4N) ; - effectuer la lecture de la densité optique à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque (Thermo Labsystems Multiscan) dans la demi-heure qui suit l'ajout de la solution stop (faire le blanc sur les puits incubés avec du tampon de dilution sérum/antisérum seul). 2. Résultats : a) Etude de fidélité Trois sérums, SER REF 1, SER REF 2 et SER REF 3, provenant de trois individus différents ont été aliquotés par 100 pl et conservés à -80°C. Les dilutions des échantillons de sérums et les temps d'incubation avec le pNPP auxquels les trois sérums de référence permettent d'obenir des densités optiques (DO) à 405 nrn "basses", "intermédiaires" et "hautes" respectivement, et ceci pour chacun des trois marqueurs sérologiques, ont été définis. Les résultats sont présentés dans les Tableaux I, II et III suivants: Tableau I : DO à 405 nm obtenue en fonction des dilutions pour le marqueur sérologique PEPEB. SER REF dilution temps (min) DO à 405 nm attendue 1 1 /2560 20 0,11-0,17 1 1 /320 20 0,76-0,95 _ 1 1 /80 20 1,92-2,16 Tableau II : DO à 405 nm obtenue en fonction des dilutions pour le marqueur sérologique PEPBP. SER REF dilution temps (min) DO à 405 nm attendue 3 160 30 0,11-0,17 1 80 30 0,81-0,91 1 20 30 1,98-2,16 Tableau III : DO à 405 nm obtenue en fonction des dilutions pour le marqueur 5 sérologique PEPCP. SER REF dilution temps (min) DO à 405 nm attendue 2 160 30 0,04-0,08 3 80 30 0,14-0,22 3 20 30 0,36-0,66 Afin de déterminer la fidélité de la méthode, les densités optiques "basses", "intermédiaires" et "hautes" obtenus à partir des lots de sérum de référence ont été mesurées pendant 5 jours, vis-à-vis des trois marqueurs sérologiques PEPEB, 10 PEPBP et PEPCP, dans l'ordre suivant des sérums de référence (SER REF), sans modification ni interruption : 2, 3, 1, 2, 2, 1, 1, 3, 3 et 2. Les résultats, pour chaque marqueur sérologique, sont présentés dans les Tableaux IV, V et VI suivants : Tableau IV : calcul de la fidélité (CV) pour le test avec le marqueur sérologique 15 PEPEP DO basse DO DO haute intermédiaire variance des moyennes quotidiennes (VM) 0,001 0,019 0,040 variance poolée intra-essai (VW) 0,001 0,006 0,006 variance ajustée inter-essai (VD)=(VM)- 0,000 0,004 0,011 (V W)/3 variance combinée VT=VW+VD 0,001 0,010 0,017 déviation standard combinée (S)= iVT 0,031 0,101 ù 0,132 grande moyenne (0) 0,137 0,856 2,044 CV%=(S)/O x 100% 0,228 0,118 0,064 Tableau V : calcul de la fidélité (CV) pour le test avec le marqueur sérologique PEPBP DO basse DO DO haute intermédiaire variance des moyennes quotidiennes (VM) 0,001 0,002 0,006 variance poolée intra-essai (VW) 0,001 0,003 0,004 variance ajustée inter-essai (VD)=(VM)- 0,000 0,000 0,001 (V W)/3 variance combinée VT=VW+VD 0,001 0,003 0,005 déviation standard combinée (S)=JVT 0,029 0,053 0,069 grande moyenne (0) 0,137 0,856 2,044 CV%=(S)/O x 100% 0,213 0,062 0,034 Tableau VI : calcul de la fidélité (CV) pour le test avec le marqueur sérologique PEPCP DO basse DO DO haute intermédiaire variance des moyennes quotidiennes (VM) 0,000 0,001 0,004 variance poolée intra-essai (VW) 0,000 0,003 0,032 variance ajustée inter-essai (VD)=(VM)- 0,000 -0,001 -0,009 (VW)/3 variance combinée VT=VW+VD 0,000 0,002 0,023 déviation standard combinée (S)=~VT 0,020 0,044 0,150 grande moyenne (0) 0,059 0,184 0,508 CV%=(S)/O x 100% 0,344 0,236 0,295 Ces résultats montrent que la fidélité intra- et inter-essai est maîtrisée sur toute la gamme de validité (DO "basses", "intermédiaires" et "hautes") de la méthode. b) Etude de la spécificité Pour l'étude de la spécificité, 91 échantillons de sérums humains différents ont été testés. Ceux-ci correspondent à (912-91)/2 combinaisons binaires (ou par paires) possibles de deux échantillons de sérum, c'est-à-dire à 4095 combinaisons différentes. La densité optique (DO) à 405 nm a été mesurée pour chacun des trois marqueurs sérologiques (PEPEB, PEPBP et PEPCP). Les échantillons de sérum ont été dilués au 1/40e pour les tests avec les marqueurs sérologiques PEPBP et PEPCP, et au 1/400e pour le test avec le marqueur sérologique PEPEB. Les tests ont été réalisés en triplicata. Les résultats sont représentés au Tableau VII ci-dessous, où : - PEPEB 1, 2 et 3 représentent respectivement les 3 valeurs de la DO pour le test avec le marqueur sérologique PEPEB ; - PEPBP 1, 2 et 3 représentent respectivement les 3 valeurs de la DO pour le test avec le marqueur sérologique PEPBP ; - PEPCP 1, 2 et 3 représentent respectivement les 3 valeurs de la DO pour le test avec le marqueur sérologique PEPCP ; MY PEPEB, PEPBP et PEPCP représentent la valeur moyenne de la DO pour chacun des 3 marqueurs sérologiques ; - Ecart PEPEB+, PEPBP+ et PEPCP+ représentent l'intervalle de confiance supérieur de chaque moyenne, en prenant en compte le CV% correspondant à chaque peptide (PEPEB, PEPBP ou PEPCP) et pour chaque concentration ; - Ecart PEPEB-, PEPBP- et PEPCP- représentent l'intervalle de confiance inférieur de chaque moyenne, en prenant en compte le CV% correspondant à chaque peptide (PEPEB, PEPBP ou PEPCP) et pour chaque concentration. SERUM PEPE PEP PEPE MY Ecart Ecart PEPB PEPB PEPB MY Ecart Ecart PEPC PEP PEP MY Ecart Ecart BI EB2 B3 PEPE PEPE PEPE Pl P2 P3 PEPB PEPB PEPBP PI CP2 CP3 PEP PEP PEPC B B + B- P P+ - CP CP+ P- 9979 0,04 0,00 0,00 0,01 0,02 0,01 0,07 0,07 0,09 0,08 0,10 0,06 0,03 0,01 0,01 0,02 0,02 0,01 9673 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,26 0,23 0,24 0,24 0,30 0,18 0,06 0,04 0,04 0,05 0,06 0,03 9978 0,03 0,03 0,02 0,03 0,03 0,02 0,32 0,30 0,29 0,30 0,32 0,29 0,05 0,08 0,08 0,07 0,09 0,05 14952 0,07 0,01 0,02 0,03 0,04 0,03 0,29 0,33 0,31 0,31 0,33 0,29 0,07 0,09 0,02 0,06 0,08 0,04 14986 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,28 0,32 0,26 0,29 0,36 0,22 2,00 2,01 2,26 2,09 2,72 1,46 14992 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,03 0,28 0,29 0,35 0,31 0,32 0,29 0,15 0,24 0,17 0,19 0,24 0,13 14958 0,06 0,03 0,03 0,04 0,05 0,03 0,52 0,47 0,54 0,51 0,54 0,48 0,05 0,10 0,11 0,09 0,12 0,06 14964 0,03 0,06 0,04 0,04 0,05 0,03 0,55 0,54 0,51 0,53 0,56 0,51 0,10 0,09 0,26 0,15 0,20 011 26262 0,04 0,05 0,04 0,04 0,05 0,03 0,61 0,66 0,57 0,61 0,64 0,58 0,12 0,17 0,20 0,16 0,21 0,11 15007 0,04 0,05 0,05 0,05 0,06 0,04 0,53 0,51 0,50 0,51 0,54 0,49 0,55 0,53 0,44 0,51 0,66 0,35 32331 0,06 0,05 0,05 0,05 0,07 0,04 0,54 0,54 0,47 0,52 0,54 0,49 0,26 0,20 0,23 0,23 0,30 0,16 37038 0,01 0,13 0,021 0,05 0,07 0,04 0,58 0,52 0,61 0,57 0,60 0,54 0,13 0,10 0,09 0,11 0,14 0,07 14984 0,07 0,05 0,08 0,07 0,08 0,05 0,51 0,49 0,46 0,49 0,51 0,46 0,78 0,54 0,29 0,54 0,70 0,38 14967 0,08 0,07 0,06 0,07 0,09 0,05 0,66 0,59 0,71 0,65 0,69 0,62 0,13 0,18 0,16 0,16 0,20 0,11 40363 0,02 0,02 0,19 0,08 0,10 0,06 0,55 0,51 0,56 0,54 0,57 0,51 0,14 0,14 0,21 0,16 0,21 0,11 10901 0,08 0,10 0,09 0,09 0,11 0,07 0,30 0,29 0,31 0,30 0,32 0,29 0,07 0,07 0,10 0,08 0,11 0,05 14936 0,08 0,10 0,11 0,10 0,12 0,07 0,75 0,72 0,76 0,74 0,78 0,71 0,05 0,09 0,09 0,08 0,10 0,05 15003 0,18 0,06 0,07 0,10 0,13 0,08 0,41 0,58 0,50 0,50 0,52 0,47 0,39 0,28 0,36 0,34 0,45 0,24 14915 0,13 0,15 0,13 0,14 0,17 0,10 0,76 0,74 0,60 0,70 0,74 0,67 0,18 0,18 0,20 0,19 0,24 0,13 25239 0,16 0,15 0,15 0,15 0,19 0,12 0,43 0,51 0,46 0,47 0,49 0,44 0,13 0,15 0,19 0,16 0,20 0,11 14941 0,17 0,16 0,16 0,16 0,20 0,12 0,53 0,51 0,49 0,51 0,54 0,48 0,80 0,83 0,83 0,82 1,07 0,57 10902 0,17 0,17 0,20 0,18 0,23 0,14 0,50 0,60 0,57 0,56 0,58 0,53 0,17 0,22 0,23 0,21 0,27 0,14 40518 0,20 0,18 0,16 0,18 0,23 0,14 0,62 0,59 0,57 0,59 0,62 0,56 0,24 0,41 0,20 0,28 0,37 0,20 13546 0,18 0,18 0,18 0,18 0,23 0,14 0,71 0,80 0,78 0,76 0,80 0,73 0,14 0,22 0,24 0,20 0,26 0,14 25843 0,18 0,18 0,18 0,18 0,23 0,14 0,92 0,94 0,86 0,91 0,95 0,86 0,38 0,37 0,39 0,38 0,49 0,27 31924 0,19 0,18 0,18 0,18 0,23 0,14 0,58 0,56 0,56 0,57 0,60 0,54 0,17 0,11 0,15 0,14 0,19 0,10 14916 0,19 0,20 0,21 0,20 0,25 0,15 0,45 0,45 0,50 0,47 0,49 0,44 0,27 0,31 0,25 0,28 0,36 0,19 13698 0,25 0,20 0,19 0,21 0,27 0,16 0,61 0,76 0,66 0,68 0,71 0,64 0,25 0,16 0,16 0,19 0,25 0,13 10378 0,21 0,24 0,25 0,23 0,29 0,18 0,30 0,37 0,35 0,34 0,36 0,32 0,17 0,09 0,09 0,12 0,15 0,08 14913 0,24 0,25 0,22 0,24 0,30 0,18 0,75 0,79 0,75 0,76 0,80 0,73 0,32 0,35 0,34 0,34 0,44 0,24 61:0 9�`0 8Z'0 8Z`0 5Z`0 0�`0 590 l L'0 89`0 L9'0 690 89`0 001 1 l ` 1 904 I 90: 1 90: 1 50: 1 0L�Z� 86`0 L6`0 58`0 55`0 ZO` l 8L`0 6L`0 5L`0 18`0 117`0 917`0 �17`0 1717`0 �17`0 �17`0 77`0 601 �0` 1 170` l 170` 1 ZO` 1 _9_17671_ LO` 1 Z0` 1 S 1 ` 1 68`0 Z0' I Z8 I 511 00` l 06`0 86`0 l 1 `1 �66171 ZI`I L6`0 �6`O 56`0 �0`l 9b01Z 61 7 0L� ZZS l � OZ`0 L�`0 6Z`0 ��`0 5Z`0 8Z`0 Ob`0 1717 `0 Z17`0 117`0 017`0 ZZ`0 Zb`0 Z�`0 0�`0 SE'0 1� 0 Sb`0 05`0 Lb`0 �17`0 Lb`0 Z5`0 OZ`0 9E`0 8Z`0 ZZ`0 SZ`O L�`0 59`0 ZL`0 89`0 L5`0 ZL'0 9L`0 Z8`O �Z`0 Z17`0 ��`0 �`0 I �`0 Z�`0 9L`0 1 78`0 08`0 ZL`0 Z8`0 98`0 Z8`0 l l 96`0 Z6`O L60 00 l 81`0 ��`0 SZ`0 Z`0 �Z`0 8Z`0 LS`0 �9`0 09`0 59`0 95`0 65`0 8L`0 SO` l Z6`0 Z6`0 06`0 �6`0 Z l `0 �Z`0 81 `0 81'0 51'0 OZ`0 8940 I ZL'0 5L`0 1L'0 69'0 5L`0 ZO' 1 88'0 �8'0 L0'1 5L`0 ÀVA 0�`0 17L'0 00'1 �0'0 LO'0 50`0 170`0 �0`0 80`0 6V0 I 0�`0 0�`0 0�`0 L8'0 178`0 178'0 �6'0 018L 1 LO'0 171'0 11'0 Z1'0 01'0 01'0 l �`0 I ��`0 I �`0 17�`0 17�`0 1 CO 96'0 �8'0 18`0 68'0 08'0 St. 1017 ZS'0 L6`0 5L`0 7L`0 �L`0 LL`0 1717`0 : r I 917`0 917`0 L17'0 510 OL`0 56`0 �8'0 98'0 58`0 LL`0 896171 I 1'0 OZ`0 51'0 91'0 171'0 91'0 1L'0 5L`0 8L'0 �L`0 bL`0 59`0 88'0 9L'0 �L`0 �L`0 �8`0 _ L081 Z 8�`0 1L'0 175`0 15'0 Z5'0 09'0 85`0 • I 19`0 19`0 09'0 19'0 179`0 L8'0 9L'0 OL`0 6L'0 8L'0 9L6171 51'0 8V0 ZZ`0 OZ`0 9V0 61'0 85`0 r • I 19'0 �9'0 �L`0 917'0 �9'0 58'0 17L`0 �8'0 1L'0 89'0 0SS017 IZ`0 6�`0 0�`0 0�`0 E'0 8Z`0 69'0 I �L`0 99'0 17L'0 6L'0 __Z9`0 178`0 �L`0 ZL'0 9L'0 ZL'0 ÀVJ 01'0 61'0 51'0 11'0 5140 81'0 L5'0 I 09'0 99'0 09'0 SS40 Z9`0 178'0 �L`0 �L`0 OL`0 LL`0 �98L 1 96'0 6L` 1 LE` l 1 b` I 0171 I �` l 617`0 55`0 ZS`0 917`0 175`0 95`0 617`0 99'0 85`0 85`0 95`0 65`0 50617 1 L 1'0 1 �`0 17Z`0 17V0 �Z`0 5Z`0 99'0 I OL`0 99'0 99'0 LL`0 917'0 Z9'0 175`0 Z5'0 ZS'0 L5'0 17Z95Z Z5'0 O5'0 517`0 �Z`0 17t0 Z1'0 Et() 81'0 �1'0 SZ`O 51'0 05`0 I �5`0 95`0 OZ`O 19'0 �5'0 175`0 55`0 15'0 866171 1Z`0 01740 1�`0 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ZZ`0 81`0 L9'0 5L`0 IL `0 99'0 �L`0 17L'O LZ`O L�`0 ZE'0 6Z`0 ��`0 17�`0 500 110 800 11`0 800 50`0 1710 817`0 917`0 L10 �17`0 817`0 ZZ`0 L�`0 0�0 ��0 6Z`O LZ`0 ��OL� �17 ` 1 99`Z 170`Z 06`Z 96`Z LZ`0 18`0 06`0 98`0 68`0 176`0 17L`O ZZ`O LE`0 6Z`0 8Z `O Z�0 8Z`O 17b�LZ 91'0 0�`0 �Z`0 1Z`0 LZ`O ZZ`0 17L`0 Z8`O 8L`0 5L`0 18`0 LL`O ZZ`0 9E'0 6Z'0 6Z'0 6Z'0 8Z`0 195E I 171'0 5Z`0 . 61'0 91'0 91'0 9Z`O 05`0 55'0 �S`O ZS`0 95`0 05`0 61'0_ ZE`O SZ`O 5Z`0 9Z`O 5Z`0 6�6171 81'0 ��`0 St() LZ'0 9t0 ZZ'0 09'0 99'0 �9`0__ 11'0 I Z`O 91'0 �1'0 91'0 61'0 S6'0 S0'1 00'1 61'1 I Z`Z OL` 1 1 Z'Z 96'0 176'1 I CO 8L'0 SL`0 S 1'0 6t0 ZZ'0 9Z'O OZ`O OZ`O LL'O S8'0 18'0 917'0 58`0 S9'0 LL`0 OS`0 69'0 178`0 Z6'0 88'0 90'0 21`0 60'0 60'0 80`0 60'0 �S`0 6S'0 9S'0 Z 1 `0 ZZ`O L 1 `0 OZ`0 171'0 L 1'0 Z6'O 10'1 96'0 11'0 OZ`O S 1'0 OZ`0 S1'0 01'0 8S`0 179`0 19'0 81'0 17�`0 92`0 61'0 1�'O 8Z'0 179'0 OL`0 L9'0 69'0 LZ` 1 86'0 �0'1 00'1 16'0 L�`0 117`0 6�`0 917` I OL'Z 80'Z 06` 1 90'Z 8Z'Z S6'0 S0'1_ 00'1 90'0 �1'0 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Les échantillons de plasma ont été dilués au 1/40e pour les tests avec les conjugués peptidiques PEPBP et PEPCP, et au 1/400e le test avec le conjugué peptidique PEPEB. Chaque échantillon a été testé en triplicata. Le Tableau VIII ci-dessous représente les moyennes et écarts-types des résultats (Densité Optique) obtenus : Echantillons PEPEB PEPBP PEPCP 72528 0,55 +/-0,1 0,36+/-0,006 0,13+1-0,006 72549 2,34+/60,01 0,81+1-0,13 0,29+/-0,02 72547 0,03+/-0,01 0,44+/-0,05 0,25+1-0,06 P 1 0,73+/-0,05 0,26+/-0,01 0,21+/-0,05 P2 0,61 +/-0,03 0,42+/-0,03 0,24+/-0,05 P3 1,22+/-0,17 0,26+/-0,006 0,15+/-0,07 P4 2,85+1-0,11 0,41 +/-0,01 0,23+/-0,006 P5 0,47+/-0,09 1,12+/-0,12 0,25+/-0,03 P6 2,03+1-0,15 0,49+/-0,05 0,09+/-0,01 P7 0,2+1-0,02 0,24+/-0,03 0,15+/-0,07 Les échantillons présentent tous entre eux une concentration (Densité Optique) différente pour au moins un même marqueur sérologique. Ces résultats montrent que la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention permet de différentier au moins deux échantillons de plasma humain. d) Conclusion La précision de la méthode est suffisante à lui rendre une excellente spécificité pour le but recherché : la différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma humain. Aussi bien les échantillons de plasma que les échantillons de sérum conviennent à la méthode selon la présente invention. REVENDICATIONS1. Méthode de différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma humain, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de comparaison de la concentration, dans les échantillons, d'immunoglobulines de classe G (IgG) dirigées contre au moins trois antigènes différents sélectionnés pour leur capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée, une concentration différente entre lesdits deux échantillons pour au moins une IgG dirigée contre un même antigène signifiant que les deux échantillons proviennent de deux prélèvements sanguins différents. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites IgG sont choisies dans le groupe constitué par les IgG dirigées contre la protéine EBNA-1 exprimée par le virus d'Epstein-Barr, les protéines de choc thermique, les protéines OMP2 ou MOMP exprimées par Chlamydophila pneumoniae, les lipopolysaccharides des bactéries à Gram-négatif, la toxine tétanique produite par Clostridium tetani, la protéine de capside du virus de la poliomyélite ou la protéine PT, la pertactine ou la phytohémagglutinine produites par Bordetella pertussis. 3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits antigènes proviennent de trois microorganismes de genres différents. 4. Méthode selon la revendication 2 ou la revendication 3 caractérisée en ce que lesdits antigènes sont choisis parmi les antigènes du virus d'Epstein-Barr, de Bordetella pertussis et de Chlamydophila pneumoniae. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdits antigènes sont la protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr, la protéine PT de B. pertussis et la protéine OMP2 de C. pneumoniae. 6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites IgG lient un peptide choisi parmi le peptide de séquence SEQ ID NO : 1, le peptide de séquence SEQ ID NO : 2, et le peptide de séquence SEQ ID NO : 3. 7. Méthode de détermination d'une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détermination de la concentration, dans l'échantillon, d'immunoglobulines de classe G (IgG) dirigées contre au moins trois antigènes différents sélectionnés pour leur capacité à induire une immunité humorale acquise de longue durée, tels que définis à l'une quelconque des revendications 3 à 6 ; l'empreinte sérologique étant définie par les concentrations respectives des IgG contre lesdits au moins trois antigènes différents sélectionnés. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la concentration desdites IgG est déterminée à l'aide d'une méthode choisie parmi les méthodes ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), EIA (Enzyme Immunoassay), RIA (Radio Immunoassay), d'immunofluorescence, multiplex, Western blot ou par puce à protéine. 9. Méthode de différenciation de deux échantillons de sérum ou plasma selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 8, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: (a) fixer les peptides de SEQ ID NO : 1, 2 et 3, sur un support approprié, notamment une microplaque, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine ; (b) optionnellement diluer les échantillons de sérum ou plasma à tester ; (c) mettre en contact une fraction des échantillons ou des échantillons dilués avec chacun des trois peptides respectivement ; (d) ajouter un anticorps anti-IgG humaine marqué de façon approprié ; e) déterminer la quantité de complexes antigène/IgG/anticorps anti-IgG formés de manière à déterminer la concentration dans les échantillons des IgG liant les peptides de séquences SEQ ID NO : 1, 2 ou 3. (f) comparer les concentrations d'IgG entre les échantillons. 10. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit anticorps anti-IgG humaine marqué est un anticorps anti-IgG humaine conjugué à la phosphatase alcaline et que la quantité de complexes antigène/IgG/anticorps anti-IgG formés est déterminée à l'aide du para-nitrophényl phosphate par la mesure de la densité optique à 405 nm. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que les échantillons de sérum ou plasma sont choisis parmi le groupe comprenant les échantillons de sérum ou plasma non hémolysé, de sérum ou plasma non lactescent, de sérum ou plasma non-lipémique, de sérum ou plasma non déshydraté, et de plasma prélevé sur un anticoagulant. 30 12. Kit ou coffret pour différencier des échantillons de sérum ou plasma ou déterminer une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain comprenant : - la protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), la protéine PT de B. pertussis et/ou la protéine OMP2 de C. pneumoniae, ou 20 25- un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 1, un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 2 et/ou un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine, - et optionnellement, un anticorps anti-IgG humaine. 13. Utilisation (i) de la protéine EBNA-1 du virus d'Epstein-Barr (EBV), de la protéine PT de B. pertussis et/ou de la protéine OMP2 de C. pneumoniae, ou (ii) d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 1, d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 2 et/ou d'un peptide comprenant ou constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, chacun desdits peptides pouvant être conjugué à une molécule de biotine, pour différencier des échantillons de sérum ou plasma humain, ou déterminer une empreinte sérologique d'un échantillon de sérum ou plasma humain.