Brevet FR2936816A1 — publié le 20100409

La présente invention concerne un milieu de culture pour la détection des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (SARM ou MRSA). L'invention concerne également l'utilisation de ce milieu, ainsi qu'une méthode pour identifier des bactéries MRSA. Les Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline sont des souches de Staphylococcus aureus, caractérisées par leur résistance à un antibiotique, la Méticilline, et aux antibiotiques apparentés telle que l'Oxacilline. Le plus souvent cette résistance est conférée par l'expression d'un gène, mecA, entraînant la production d'une protéine modifiée, PLP2a (également appelée PBP 2a ou PBP 2'). Les bactéries MRSA représentent un fort pourcentage des infections nosocomiales, et sont souvent à l'origine de problèmes de santé graves et potentiellement mortels. Transmis le plus souvent de façon croisée entre les patients via le personnel soignant, les MRSA sont très contagieux et responsables d'infections endémiques très difficiles à contrôler. Outre un traitement adapté, le dépistage des porteurs de MRSA, et l'isolement des patients colonisés constituent la méthode la plus efficace, aujourd'hui recommandée par des organismes officiels tels que la Society for Healthcare Epidemiology of America (Société Américaine pour l'Epidémiologie Hospitalière). Un dépistage précoce et systématique est donc essentiel. La détection des MRSA peut se faire par différentes techniques. Il est ainsi possible de détecter des MRSA par des techniques de biologie moléculaire. A ce titre, on peut citer notamment la demande EP887424. De telles méthodes restent toutefois coûteuses en test de routine, et requiert un personnel qualifié. Il est également possible d'utiliser des milieux de culture conventionnels pour détecter les Staphylococcus aureus, tel que le milieu décrit dans la demande EP1390524. La détection de MRSA se fait lors d'une étape supplémentaire, par un test d'agglutination spécifique, (Slidex MRSA, bioMérieux) ou par une méthode de diffusion sur gélose en présence d'un disque Oxacilline (recommandations du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie). Il est également possible de mettre en culture les bactéries susceptibles d'être des MRSA sur milieux gélosés en présence d'antibiotiques. De tels milieux peuvent être également chromogènes, ce qui facilite la lecture et la détection des MRSA. On peut citer notamment le milieu décrit dans la demande EP1543147. Toutefois, la détection d'une activité phosphatase dans les conditions décrites étant peu spécifique, il est nécessaire de la combiner avec la détection de plusieurs autres activités enzymatiques ce qui réduit la fertilité du milieu et accroît son coût. L'invention se propose de résoudre les lacunes de l'état de la technique en présentant un nouveau milieu de détection sensible, spécifique, et rapide pour isoler et identifier des Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline (MRSA). D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de combinaison d'antibiotiques, à une concentration faible et prédeterminée, permettait d'obtenir un excellent milieu de détection pour isoler et identifier des Staphylococcus aureus résistants à la Méticilline (MRSA). Cet effet est d'autant plus surprenant que les antibiotiques, utilisés séparément, ne permettent nullement de différencier des MRSA aux concentrations selon l'invention. Avant d'aller plus avant, les définitions suivantes, nullement limitatives, permettront de mieux comprendre l'invention. Au sens de la présente invention, on entend par milieu réactionnel, un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes, telles que les Staphylococcus aureus. Ce milieu réactionnel peut soit servir uniquement de milieu de révélation, soit de milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu réactionnel constitue également le milieu de culture. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. Préférentiellement, le milieu selon l'invention est un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcasesoja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press). Le milieu réactionnel selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des solutions tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu réactionnel peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Petri. Lorsque la présentation est sous forme de gel en flacon, on réalise préférentiellement une régénération (passage à 100°C) préalable du milieu avant de couler en boîte de Petri. Préférentiellement, le milieu selon l'invention est un milieu sélectif, c'est à dire un milieu comprenant des inhibiteurs qui privilégient la croissance des bactéries Staphylococcus aureus. On peut citer notamment le Chlorure de Lithium (LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de Sodium (NaCl), Déféroxamine, composé vibriostatique 0/129. Au sens de la présente invention, le substrat d'une activité enzymatique ou métabolique est choisi parmi tout substrat pouvant être hydrolysé en un produit qui permet la détection, directe ou indirecte d'une activité enzymatique ou d'un métabolisme, telle que notamment une activité osidase, préférentiellement une activité alpha glucosidase, estérase, préférentiellement une activité phosphatase, peptidase, préférentiellement une activité coagulase, ou métabolisme d'un hydrate de Carbone, préférentiellement le Mannitol. Il peut s'agir d'un substrat naturel ou synthétique. Le métabolisme du substrat provoque une variation des propriétés physico-chimiques du milieu réactionnel ou des cellules d'organismes. Cette variation peut être détectée par des méthodes physico-chimiques, notamment des méthodes optiques par l' oeil de l'opérateur ou à l'aide d'instruments, spectrométriques, électriques, magnétiques, ... Préférentiellement, il s'agit d'une variation des propriétés optiques, telles qu'une modification d'absorption, de fluorescence ou de luminescence. Comme substrat chromogène, on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl, flavone, alizarine, acridine, phénoxazine, nitrophénol, nitroaniline, naphtol, catéchol, hydroxyquinoline, coumarine. Préférentiellement, le(s) substrat(s) utilisé(s) dans la présente invention est(sont) à base d'indoxyl Comme substrat fluorescent, on peut citer notamment les substrats à base d'umbelliférone ou de coumarine, à base de résorufine, phénoxazine, naphtol, naphtylamine, 2'-hydroxyphénylhétérocycle ou 2'-aminophényl-hétérocycle ou encore à base de fluorescéïne. Comme substrat d'activité enzymatique alpha glucosidase, on peut citer plus particulièrement les substrats 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; Dihydroxyflavone-alpha- glucoside ; 3,4-Cyclohexénoesculétine-alpha-glucoside ; 8-Hydroxiquinoline-alpha- glucoside ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl- N-méthyl-alpha-glucoside ; 6-Chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 5-Bromo-3-indoxyl-alpha- glucoside ; 5-Iodo-3-indoxyl-alpha-glucoside ; 6-Fluoro-3-indoxyl-alpha-glucoside ; Alizarine-alpha-glucoside ; Nitrophényl-alpha-glucoside ; 4-Méthylumbelliferyl-alpha- glucoside ; Naphtholbenzein-alpha-glucoside ; Indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside ; Naphtylalpha-glucoside ; Aminophényl-alpha-glucoside ; Dichloroaminophényl-alpha-glucoside. Préférentiellement, le substrat utilisé dans la présente invention est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside, préférentiellement en combinaison avec le 5-Bromo-4-chloro-3- indoxyl-N-méthyl-alpha-glucoside. Comme substrat d' activité enzymatique phosphatase, on peut citer plus particulièrement les substrats 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-phosphate ; 3,4-Cyclohexénoesculétine-phosphate ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-phosphate ; 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-méthyl-phosphate ; 6-Chloro-3-indoxyl-phosphate ; 5-Bromo-3-indoxyl-phosphate ; 5-Iodo-3-indoxyl- phosphate ; 6-Fluoro-3-indoxyl-phosphate ; Nitrophényl-phosphate ; 4-Méthylumbelliferylphosphate ; Indoxyl-N-méthyl-phosphate ; Naphtyl-phosphate. Comme substrat de coagulase, on peut citer plus particulièrement les substrats Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-methylcoumarine, Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide, Z-Gly-Pro-Arg-4-Methoxy-beta-naphtylamide, Plasminogène. En général ces substrats sont utilisés en combinaison avec une source de Prothrombine telle que la Prothrombine purifié ou le Plasma sanguin. Le substrat utilisé dans la présente invention peut être en combinaison avec d'autres substrats, tels qu'un substrat d'osidase et notamment beta-glucosidase ou beta-ribosidase, estérase et notamment phosphatase ou phospholipase, peptidase et notamment coagulase. Les substrats de l'invention sont utilisables dans une large gamme de pH, notamment entre pH 5,5 et 10. préférentiellement entre 6,5 et 10. Lorsque le milieu selon l'invention comprend un substrat ou plusieurs substrats d'activité enzymatique alpha glucosidase, la concentration en substrat(s) est préférentiellement comprise entre 0,01 et 2 g/1, encore plus préférentiellement entre 0,02 et 0,2 g/1, et, avantageusement, elle est de 0,1 g/l. En effet, à cette concentration de substrat, on obtient un meilleur contraste de coloration. Le substrat peut être également un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme. Dans le cas du métabolisme d'un hydrate de Carbone, c'est préférentiellement le Mannitol couplé à un indicateur de pH. Au sens de la présente invention, un antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines est un antibiotique préférentiellement choisi parmi o Une céphalosporine de première génération, telle que : Cefalexine, Cefaloridine, Cefalotine, Cefazoline, Cefadroxil, Cefazedone, Cefatrizine, Cefapirine, Cefradine, Cefacetrile, Cefrodaxine, Ceftezole o Une Céphalosporine de deuxième génération, telle que : Cefoxitine, Cefuroxime, Cefamandole, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicide, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazole, Cefprozil, Ceforanide o Une céphalosporines de troisième génération, telle que : Cefotaxime, Ceftazidime, Cefsulodine, Ceftriaxone, Cefmenoxime, Latamoxef, Ceftizoxime, Cefixime, Cefodizime, Cefetamet, Cefpiramide, Cefoperazone, Cefpodoxime, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxone, Cefoperazone, Cefbuperazone o Une céphalosporine de quatrième génération, telle que Cefepime, Cefpirome Les céphamycines telles que Cefoxitine, Cefotetan, Cefmetazole, Cefbuperazone, Latamoxef 10 sont une sous-famille des céphalosporines. Dans le cadre de la présente invention, l'antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines est préférentiellement la Cefoxitine, et peut être en combinaison avec la Cefotaxime. Au sens de la présente invention, un antibiotique qui appartient à la famille des carbapenemes 15 est un antibiotique préférentiellement choisi parmi Meropeneme, Ertapeneme, Imipeneme, Doripeneme, Faropeneme. Dans le cadre de la présente invention, l'antibiotique qui appartient à la famille des carbapenems est préférentiellement 1'Ertapeneme. Au sens de la présente invention, un antibiotique qui appartient à la famille des aminosides est 20 un antibiotique préférentiellement choisi parmi Amikacine, Gentamicine, Isepamicine, Kanamycine, Netilmicine, Streptomycine, Tobramycine. Par concentration infra-inhibitrice, on entend une concentration inférieure à la concentration en antibiotique nécessaire à l'inhibition des MSSA, en milieu de culture apte a la recherche de 25 S. aureus à partir d'un échantillon biologique, tel que le milieu chromlDTM S. aureus (bioMerieux). Cette concentration est inférieure à environ 3 mg/1 dans le cas de la Cefoxitine, environ 2 mg/1 dans le cas de Cefotaxime, environ 1 mg/1 dans le cas de 1'Ertapenem, environ 2 mg/1 dans le cas de la Cefoperazone, environ 2 mg/1 dans le cas de Cefpodoxime, environ 1 mg/1 dans le cas du Cefdinir. 30 Par association prédéterminée de deux antibiotiques, on entend une association de deux antibiotiques particuliers, chacun des 2 étant à une concentration infra-inhibitrice particulière. Une telle association peut être déterminée notamment par le test de l'exemple A. Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement d'aspiration bronchique, trachéale ou pulmonaire, de liquide pleural, d'un lavage broncho- alvéolaire, d'expectorations, du sang ou d'une biopsie pulmonaire, de liquide articulaire ou péricardique ; liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de périnée, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire. A ce titre, l'invention concerne un milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant une association prédéterminée de deux antibiotiques, un premier antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines et un deuxième antibiotique, ledit premier et deuxième antibiotique étant chacun à une concentration infra-inhibitrice. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier antibiotique appartient à la sous-famille des céphamycines. Selon un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, ledit premier antibiotique est la Cefoxitine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique appartient à la famille des carbapenems. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique appartient à la famille des céphalosporines. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique appartient à la famille des aminosides. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend en outre un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique, préférentiellement une activité osidase, estérase ou peptidase, ou métabolique, préférentiellement le métabolisme d'un hydrate de Carbone. Dans le cas d'une activité osidase, c'est préférentiellement une activité alpha-glucosidase. Dans le cas d'une activité estérase, c'est préférentiellement une activité phosphatase. Dans le cas d'une activité peptidase, c'est préférentiellement une activité coagulase. Dans le cas du métabolisme d'un hydrate de Carbone c'est préférentiellement le Mannitol couplé à un indicateur de pH. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le substrat est un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique osidase, préférentiellement alpha-glucosidase. Ledit substrat d'une activité enzymatique alpha-glucosidase est préférentiellement un indoxyl-alpha-glucoside. Préférentiellement, le substrat utilisé est le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-alpha-glucoside (X-N-méthyl-alpha-glucoside). Préférentiellement, ce substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,01 et 2 g/1, préférentiellement entre 0,02 et 0,3 g/l. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu comprend un deuxième substrat enzymatique ou métabolique. Ce substrat peut être un substrat d'alpha-glucosidase ou un autre substrat. Préférentiellement, ce deuxième substrat est un substrat d'alpha glucosidase. Lorsque ledit milieu comprend un deuxième substrat d'alpha-glucosidase, ce substrat est préférentiellement le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-alpha-glucoside (X-alpha-glucoside). Préférentiellement, ce deuxième substrat est présent dans le milieu à une concentration comprise entre 0,01 et 2 g/1, préférentiellement entre 0,02 et 0,3 g/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier et/ou deuxième antibiotique 15 appartenant à la famille des céphalosporines est choisi parmi o une céphalosporine de première génération, préférentiellement Cefalexine, Cefaloridine, Cefalotine, Cefazoline, Cefadroxil, Cefazedone, Cefatrizine, Cefapirine, Cefradine, Cefacetrile, Cefrodaxine, Ceftezole o une céphalosporine de deuxième génération, préférentiellement Cefoxitine, 20 Cefuroxime, Cefamandole, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicide, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazole, Cefprozil, Ceforanide o une céphalosporine de troisième génération, préférentiellement: Cefotaxime, Ceftazidime, Cefsulodine, Ceftriaxone, Cefmenoxime, Latamoxef, Ceftizoxime, Cefixime, Cefodizime, Cefetamet, Cefpiramide, Cefoperazone, 25 Cefpodoxime, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxone, Cefoperazone, Cefbuperazone o une céphalosporine de quatrième génération, préférentiellement Cefepime, Cefpirome Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit deuxième antibiotique appartenant à 30 la famille des carbapenems est choisi parmi Meropeneme, Ertapeneme, Imipeneme. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la combinaison de deux antibiotiques est choisie parmi les combinaisons Cefoxitine - Cefotaxime ou Cefoxitine - Ertapenem. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu peut comprendre, en outre, au moins un inhibiteur qui privilégie la croissance des bactéries Staphylococcus aureus, tel que Chlorure de lithium(LiCI), Azide de sodium (NaN3), Colistine, Amphotéricine, Aztréonam, Colimicine, Chlorure de sodium(NaCl) et Déféroxamine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu comprend, en outre, un mélange d'inhibiteurs, comprenant quatre inhibiteurs, qui privilégie la croissance des bactéries du genre Staphylococcus, qui sont LiCl, composé vibriostatique 0/129, Aztréonam, et. Amphotéricine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et la Cefotaxime. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefotaxime est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et la Ceftriaxone. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Ceftriaxone est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et l'Ertapenem. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Ertapenem est comprise entre 0,5 et 0,75 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et la Cefpodoxime. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefpodoxime est comprise entre 0,75 et 1 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et la Cefoperazone. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,5 et 1 mg/. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoperazone est comprise entre 0,5 et 0,75 mg/1, préférentiellement entre 0,75 et 1 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'association de deux antibiotiques comprend la Cefoxitine et le Cefdinir. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefoxitine est comprise entre 0,25 et 1,5 mg/1, préférentiellement entre 0,25 et 0,75 mg/l. Préférentiellement, ladite concentration infra inhibitrice en Cefdinir est comprise entre 0,05 et 0,5 mg/1, préférentiellement entre 0,1 et 0,25 mg/l. L'invention concerne également l'utilisation in vitro d'un milieu réactionnel tel que défini ci avant pour isoler et identifier des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline 5 (MRSA). Lors de l'utilisation de ce milieu, les MRSA sont préférentiellement détectés par une activité a-glucosidase spécifique qui permet d'obtenir des colonies colorées ou fluorescentes. Les autres espèces de Staphylococcus aureus apparaissent incolores ou d'une couleur ou fluorescence différente de celle des colonies de S. aureus. 10 L'invention concerne enfin un procédé de détection et/ou d'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir des bactéries 15 Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) sur un milieu réactionnel tel que défini ci avant b) on incube c) on identifie les colonies de MRSA. L'incubation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre 30°C et 42°C. 20 Les MRSA sont préférentiellement détectées par une activité a-glucosidase spécifique qui permet d'obtenir des colonies colorées ou fluorescentes. Les autres espèces de Staphylococcus apparaissent incolores ou d'une couleur ou fluorescence différente de celle des colonies de S. aureus. 25 Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple A - Test pour déterminer l'association prédéterminée de deux antibiotiques selon l'invention 30 Le test ci dessous peut être mis en oeuvre pour définir l'association prédéterminée de deux antibiotiques selon l'invention, qui dépend des antibiotiques employés et plus généralement de la formulation du milieu réactionnel. Pour aider à sa compréhension, ce test est mis en oeuvre ci-dessous dans le cas d'une combinaison Cefoxitine et Cefotaxime, à partir d'un kit de souches de microorganismes, comprenant des MSSA et des MRSA, mais ce test peut bien évidemment être mis en oeuvre pour d'autres antibiotiques. Dix milieux réactionnels aptes à la recherche de S aureus dans un échantillon biologique (tel qu'un milieu chromlDTM S. aureus, bioMérieux) et différentes concentrations en Cefoxitine (entre 0 et 3 mg/1) et Cefoxatime (entre 0 et 2 mg/) sont utilisés pour obtenir des concentrations en antibiotiques comprises entre 0 et 5 mg/1. Les différentes concentrations sont espacées de façon régulière, par exemple selon une distribution arithmétique ou géométrique. Chacun des milieux est aliquoté de façon à ce que chaque souche de microorganisme puisse être ensemencée en culture pure sur chacun des milieux. Après un temps d'incubation adapté, préférentiellement 18 à 24 heures, à une température appropriée, préférentiellement 30 à 37°C, les milieux sont examinés de façon à sélectionner le milieu comprenant une association en Cefoxitine et Cefotaxime permettant de révéler le plus grand nombre de MRSA tout en les différenciant du plus grand nombre de souches MSSA. Il peut être nécessaire de répéter l'expérimentation en adaptant les concentrations en chacun des antibiotiques. Exemple B û Milieu selon l'invention comprenant un substrat alpha glucosidase 1. Préparation du milieu selon l'invention Les milieux testés dans les expériences ci après étaient des milieux comprenant comme milieu de base le milieu chromlD MRSA (bioMérieux réf. 43 451), et comprenant les éléments suivants (g/1) Milieu T : milieu témoin chromlD MRSA (réf. 43 451), comprenant notamment un substrat X-N-méthyl-alpha-glucoside à une concentration de 0,1 g/1 et de la Cefoxitine à 4 mg/1. Milieu S : milieu T, comprenant en outre, un substrat X-alpha-Glucoside, à une concentration de 25, 37, 45 ou 50 mg/1 Milieu A : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par le Ceftriaxone, à une concentration de 1 ; 2 ; 4 ; 8 ; 16 ; 32 mg/1 Milieu B : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par le Cefotaxime à une concentration de 1 ; 2 ; 4 ; 8 ; 16 ; 32 mg/1 Milieu C : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par l'Ertapenem à une concentration de 0,1 ; 0,25 ; 0,5 ; 0,75 ; 1 mg/1 Milieu D : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par le Cefoperazone à une concentration de 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 mg/1 Milieu E : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par le Cefpodoxime à une concentration de 0,5 ; 1 ; 1,5 ; 2 mg/1 Milieu F : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Cefotaxime aux concentrations ci dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,5 0,5 1 1 [Cefotaxime] en mg/1 0,5 1 0,5 1 Milieu G : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Ceftriaxone aux concentrations ci 10 dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,5 0,5 1 1 [Ceftriaxone] en mg/1 0,5 1 0,5 1 Milieu H : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Ertapenem aux concentrations ci dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 [Ertapenem] en mg/1 0,25 0,5 0,75 1 0,25 0,5 0,75 1 Milieu I : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant 15 substituée par une combinaison Cefoxitine/Cefpodoxime aux concentrations ci dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 [Cefpodoxime] en mg/1 0,5 1 1,5 2 0,5 1 1,5 2 Milieu J : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Cefoperazone aux concentrations ci dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 [Cefoperazone] en mg/1 0,5 0,75 1 1,5 0,5 0,75 1 1,5 20 Milieu K : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Cefotaxime, aux concentrations ci dessous, comprenant en outre un mélange d'inhibiteurs privilégiant la croissance des Staphylococcus aureus. [Cefoxitine] en mg/1 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 [Cefotaxime] en mg/1 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 Milieu L : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par le Cefdinir à une concentration de 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ; 8 mg/1 Milieu M : milieu S (concentration X-alpha-glucoside : 45 mg/1), la Cefoxitine étant substituée par une combinaison Cefoxitine/Cefdinir, aux concentrations ci dessous [Cefoxitine] en mg/1 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 [Cefdinir] en mg/1 0,1 0,1 0,1 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 2. Ensemencement et lecture des milieux Différents sets de souches de bactéries, toutes issues de la collection de la Demanderesse, mises en suspension dans de l'eau physiologique, ont été ensemencées pour donner des colonies isolées sur le milieu. Les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 48 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 18h ou 24 heures d'incubation. L'intensité de coloration était également observée selon une échelle de 0 à 4 (0 : absence de coloration, 4 : coloration très intense). Les souches détectées correspondent aux souches formant des colonies colorées sur le milieu. 3. Résultats : 3.1 Milieu pour détecter des MRSA comprenant 2 substrats d'alpha-glucosidase Les résultats obtenus lors de l'utilisation de un ou deux substrats d'alpha-glucosidase sont présentés dans le tableau 1. Tableau 1 û Intensité de coloration des colonies lors de l'utilisation de 2 substrats d'alpha glucosidase Milieu T Milieu S Milieu Milieu [X a Glu] = 25 mg/1 [X a Glu] = 37 mg/1 [X a Glu] = 50 mg/1 Souches Incubation Intensité de Intensité de Intensité de Intensité de coloration verte coloration verte coloration verte coloration verte MRSA 18h 2 2 2,5 3 24h 2 2 3 3 > 40h 2 2,5 3 3 MRSA 18h 0 0 0 0 24h 2 2 2,5 3 > 40h 3 3 4 4 MRSA 18h 1,5 1,5 2 3 24h 2 2 4 4 > 40h 2 3 4 4 MRSA 18h 2 2 3 3 24h 2 2 4 4 > 40h 2,5 2,5 4 4 MRSA 18h 0,5 0,5 0 0 24h 1 0,5 1,5 2,5 > 40h 2,5 3 4 4 MRSA 18h 2 2 2,5 3 24h 2,5 2,5 2,5 2,5 > 40h 2,5 3 4 4 MRSA 18h 0 0 0 0 24h 1 1 3 4 > 40h 2 3 4 4 MRSA 18h 0 0 0 0 24h 0 0 0 0 > 40h 3 3 4 4 MRSA 18h 1,5 1,5 3 2,5 24h 2 2 4 4 > 40h 2,5 3 4 4 MRSA 18h 0 0 0 0 24h 0 0 2 3 > 40h 2,5 3 4 4 L'ajout d'un deuxième substrat d'alpha-glucosidase permettait d'intensifier fortement la 5 coloration des colonies, permettant ainsi de mieux repérer les colonies de MRSA. 3.2 Milieu pour détecter des MRSA comprenant un antibiotique choisi parmi la Ceftriaxone, la Cefotaxime, l'Ertapenem, la Cefoperazone, la Cefpodoxime ou le Cefdinir lo Les résultats obtenus lors de la substitution de la Cefoxitine par un autre antibiotique sont présentés dans les tableaux 2a à 2e. 14 Lecture 18h 7/10 9/10 8/10 3/10 Lecture 24h 8/10 10/10 10/10 6/10 Lecture 18h 3/10 9/10 7/10 3/10 Lecture 24h 3/10 9/10 7/10 3/10 Lecture 18h 7/10 6/10 3/10 1/10 Lecture 24h 9/10 9/10 5/10 3/10 Lecture 18h 3/10 7/10 3/10 Lecture 24h 3/10 7/10 3/10 Lecture 18h 7/10 9/10 9/10 8/10 Lecture 24h 7/10 10/10 10/10 10/10 Lecture 18h 10/10 10/10 10/10 Lecture 24h 10/10 10/10 10/10 Lecture 18h 5/10 8/10 8/10 5/10 Lecture 24h 5/10 10/10 8/10 6/10 Lecture 18h 10/10 9/10 5/10 Lecture 24h 10/10 9/10 6/10 Tableau 2a ù Substitution de la Cefoxitine par la Ceftriaxone Milieu T A Antibiotique Cefoxitine Ceftriaxone Concentration (mg/1) 4 1 2 4 Tableau 2b ù Substitution de la Cefoxitine par la Cefotaxime Milieu T B Antibiotique Cefoxitine Cefotaxime Concentration ( mg/1) 4 1 2 4 ) ) Tableau 2c ù Substitution de la Cefoxitine par l'Ertapenem Milieu T C Antibiotique Cefoxitine Ertapenem Concentration (mg/1) 4 0,1 0,25 0,5 0, ) _ Tableau 2d ù Substitution de la Cefoxitine par la Ce f operazone Milieu T D Antibiotique Cefoxitine Cefoperazone Concentration (mg/1) 4 0,5 1 1,5 Tableau 2e ù Substitution de la Cefoxitine par la Cefpodoxime Milieu T E Antibiotique Cefoxitine Cefpodoxime Concentration (mg/1) 4 0,5 1 1,5 2 MRSA (Nb souches Lecture 18h 5/10 9/10 8/10 8/10 5/10 détectées / Nb de souches) Lecture 24h 5/10 10/10 9/10 8/10 7/10 MSSA (Nb souches Lecture 18h _ 10/10 10/10 8/10 6/10 détectées / Nb de souches) Lecture 24h 10/10 10/10 8/10 6/10 2 MRSA (Nb souches 4/10 détectées / Nb de souches) 5/10 MSSA (Nb souches 4/10 détectées / Nb de souches) 4/10 8 16 32 MRSA (Nb souches détectées / Nb de souches) 3/10 MSSA (Nb souches détectées / Nb de souches) 8 16 32 MRSA (Nb souches détectées / Nb de souches MSSA (Nb souches détectées / Nb de souches 75 1 MRSA (Nb souches 8/10 5/10 détectées / Nb de souches 9/10 9/10 MSSA (Nb souches 8/10 4/10 détectées / Nb de souches) 9/10 6/10 10 Tableau 2f û Substitution de la Cefoxitine par le Cefdinir Milieu T L Antibiotique Cefoxitine Cefdinir Concentration (mg/1) 4 0,25 0,5 1 2 4 8 MRSA (Nb souches Lecture 18h 5/10 3/10 3/10 2/10 détectées / Nb de souches) Lecture 24h 6/10 4/10 4/10 4/10 1/10 MSSA (Nb souches Lecture 18h détectées / Nb de souches) Lecture 24h 5/10 1/10 Les antibiotiques Cefoxatime, Ceftriaxone, Ertapenem, Cefpodoxime, Cefoperazone et 5 Cefdimir ne permettaient pas d'obtenir seuls une sensibilité et une spécificité permettant la discrimination des MRSA et des MSSA. 3.3 - Milieu pour détecter des MRSA comprenant une combinaison d'antibiotiques choisi parmi les couples Cefoxitine/Ceftriaxone, Cefoxitine/Cefotaxime, lo Cefoxitine/Ertapenem, Cefoxitine/Cefoperazone ou Cefoxitine/Cefpodoxime Les résultats obtenus lors de l'utilisation de combinaisons d'antibiotiques sont présentés dans le tableau 3. ?au 3 - Détection de colonies MRSA lors de l'utilisation d'une combinaison d'antibiotiques (détection exprimée en nombre de souche détectées par nombre de souches totales) ilieu T F T G T H ntibiotique 1 Cefoxitine Cefoxitine Cefoxitine Cefoxitine Cefoxitine Cefoxitine )ncentration 4 0,5 1 0,5 1 4 0,5 1 0,5 1 4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 ntibiotique 1 g/1) ntibiotique 2 Aucun Cefotaxime Aucun Ceftriaxone Aucun Ertapenem )ncentration 0 0,5 0,5 1 1 0 0,5 0,5 1 1 0 1 0,25 0,5 0,75 1 0,25 0,5 ntibiotique 2 g/1) cture 18h 6/10 9/10 8/10 6/10 5/10 6/10 9/10 8/10 9/10 8/10 6/10 7/10 8/10 7/10 7/10 6/10 7/10 7/10 cture 24h 8/10 10/10 8/10 6/10 6/10 8/10 10/10 10/10 10/10 8/10 6/10 8/10 8/10 8/10 8/10 7/10 8/10 8/10 � cture 18h 4/10 1/10 1/10 6/10 4/10 4/10 3/10 3/10 9/10 6/10 2/10 7/10 3/10 1 cture 24h 5/10 2/10 1/10 6/10 5/10 4/10 4/10 5/10 9/10 8/10 5/10 10/10 6/10 1 ilieu T I T J ntibiotique 1 Cefoxitine Cefoxitine Cefoxitine )ncentration 4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 0,75 0,75 4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,75 0,75 ntibiotique 1 g/1) ntibiotique 2 Aucun Cefpodoxime Aucun Cefoperazone )ncentration 0 2 0,5 1 1,5 2 0,5 1 1,5 2 0 1,5 0,5 0,75 1 1,5 0,5 0,75 ntibiotique 2 g/1) cture 18h 5/10 5/10 8/10 5/10 5/10 1/10 6/10 5/10 4/10 1/10 5/10 5/10 6/10 5/10 5/10 2/10 5/10 5/10 cture 24h 5/10 5/10 8/10 5/10 5/10 5/10 7/10 5/10 5/10 3/10 5/10 7/10 9/10 5/10 5/10 4/10 6/10 6/10 cture 18h 4/10 6/10 2/10 6/10 4/10 3/10 2/10 4/10 3/10 cture 24h 4/10 7/10 1/10 5/10 7/10 5/10 4/10 3/10 1/10 4/10 4/10 Milieu T M Antibiotique 1 Cefoxitine Cefoxitine Concentration 4 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,75 Antibiotique 1 (mg/1) Antibiotique 2 Aucun Cefdinir Concentration 0 0,1 0,1 0,1 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 Antibiotique 2 (mg/1) Lecture 18h 6/10 7/10 6/10 6/10 4/10 4/10 5/10 4/10 3/10 2/10 Lecture 24h 7/10 8/10 7/10 7/10 4/10 5/10 5/10 4/10 4/10 4/10 Lecture 18h _ 4/10 1/10 1/10 1/10 Lecture 24h _ 5/10 1/10 1/10 1/10 1/10 Les associations d'antibiotiques ci dessus permettaient d'obtenir une spécificité et une sensibilité supérieure à celles obtenues lors de l'utilisation d'un seul antibiotique. 3.4 - Milieu pour détecter des MRSA comprenant une combinaison d'antibiotiques Cefoxitine/Cefotaxime et un mélange d'inhibiteurs privilégiant la croissance des Staphylococcus aureus. Les résultats obtenus lors de l'utilisation de combinaisons d'antibiotiques sont présentés dans le tableau 4. Tableau 4 û Détection de colonies MRSA lors de l'utilisation d'une combinaison d'antibiotiques Cefoxitine/Cefotaxime et un mélange d'inhibiteurs (détection exprimée en nombre de souches détectées par nombre de souches totales) Milieu T K Antibiotique 1 Cefoxitine Cefoxitine Concentration Antibiotique 1 4 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 (mg/1) Antibiotique 2 Aucun Cefotaxime Concentration Antibiotique 2 0 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 (mg/1) Lecture 18h 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10 5/10 Lecture 24h 9/10 8/10 9/10 8/10 8/10 8/10 9/10 Lecture 18h Lecture 24h _ 3/10 2/10 1/10 La combinaison d'antibiotiques Cefoxitine/Cefotaxime associée à un mélange d'inhibiteurs privilégiant la croissance des Staphylococcus aureus permettait d'obtenir une excellente spécificité et sensibilité. MRSA MSSA MRSA MSSA Exemple C û Milieu selon l'invention comprenant un substrat phosphatase Les expériences similaires à celles présentées dans l'exemple B ont été réalisées, le substrat alpha glucosidase étant substitué par un substrat de phosphatase 6-Chloro-3-Indoxyl phosphate (Rose-Phosphate) , l'association en antibiotiques étant cefoxitine et cefotaxime Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5. Milieu T M Antibiotique 1 Cefoxitine Cefoxitine Concentration 4 0,75 0,75 0,75 0,75 1 1 Antibiotique 1 (mg/1) Antibiotique 2 Aucun Cefotaxime Concentration 0 0 0,5 0,75 1 0,5 0,75 Antibiotique 2 (mg/1) Lecture 18h 10/10 10/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Lecture 24h 10/10 10/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Lecture 18h _ 10/10 Lecture 24h _ 10/10 2/10 La combinaison d'antibiotiques Cefoxitine/Cefotaxime associée au substrat 6-Chloro-3-Indoxyl phosphate (Rose-Phosphate) permettait d'obtenir une excellente spécificité et sensibilité. MRSA MSSA REVENDICATIONS1) Milieu réactionnel pour la détection et/ou l'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) comprenant une association prédéterminée de deux antibiotiques, un premier antibiotique qui appartient à la famille des céphalosporines et un deuxième antibiotique, ledit premier et deuxième antibiotique étant chacun à une concentration infra-inhibitrice. 2) Milieu réactionnel selon la revendication 1 selon lequel ledit premier antibiotique appartient à la sous-famille des céphamycines. 3) Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 selon lequel ledit deuxième antibiotique appartient à la famille des carbapenems. 4) Milieu réactionnel selon la revendication 1 ou 2 selon lequel ledit deuxième antibiotique appartient à la famille des céphalosporines. 5) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon lequel il comprend en outre un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique 6) Milieu réactionnel selon la revendication 5, selon lequel ladite activité enzymatique est une activité osidase, estérase ou peptidase 7) Milieu réactionnel selon la revendication 6, selon lequel ladite activité enzymatique osidase est une activité alpha-glucosidase. 8) Milieu réactionnel selon la revendication 5, selon lequel ladite activité métabolique est le métabolisme d'un hydrate de Carbone. 9) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 selon lequel il comprend, en outre, un deuxième substrat d'une activité enzymatique ou métabolique. 10) Milieu réactionnel selon la revendication 9 selon lequel ledit un deuxième substrat est un substrat d'une activité enzymatique alpha-glucosidase. 11) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 selon lequel ledit premier et/ou deuxième antibiotique appartenant à la famille des céphalosporines est choisi parmi : o Une céphalosporine de première génération préférentiellement choisi parmi Cefalexine, Cefaloridine, Cefalotine, Cefazoline, Cefadroxil, Cefazedone, Cefatrizine, Cefapirine, Cefradine, Cefacetrile, Cefrodaxine, Ceftezole o Une Céphalosporine de deuxième génération, préférentiellement choisi parmi Cefoxitine, Cefuroxime, Cefamandole, Cefaclor, Cefotetan, Cefonicide, Cefotiam, Loracarbef, Cefmetazole, Cefprozil, Ceforanide o Une céphalosporines de troisième génération, préférentiellement choisi parmi Cefotaxime, Ceftazidime, Cefsulodine, Ceftriaxone, Cefmenoxime, Latamoxef, Ceftizoxime, Cefixime, Cefodizime, Cefetamet, Cefpiramide, Cefoperazone, Cefpodoxime, Ceftibuten, Cefdinir, Cefditoren, Ceftriaxone, Cefoperazone, Cefbuperazone o Une céphalosporine de quatrième génération, préférentiellement choisi parmi Cefepime, Cefpirome 16) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 selon lequel ledit deuxième antibiotique appartenant à la famille des carbapenems est choisi parmi Meropeneme, Ertapeneme, Imipeneme 17) Milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 selon lequel la combinaison de deux antibiotiques est choisie parmi la combinaison Cefoxitine - Cefotaxime ou Cefoxitine - Ertapenem. 18) Utilisation in vitro d'un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour isoler et identifier des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA). 19) Procédé de détection et/ou d'identification de bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la Méticilline (MRSA) dans un échantillon biologique selon lequela) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir des bactéries Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline MRSA sur un milieu réactionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 b) on incube c) on identifie les colonies comme étant des colonies de MRSA.