Brevet FR2936246A1 — publié le 20100326

Champ de l'invention L'invention concerne le domaine de la chimie des acides nucléiques. Plus spécifiquement il concerne l'usage de molécules d'acides nucléiques et d'enzymes pour generer de multiples copies d'acides nucléiques néV- ynLhétiséS pour détecter des acides nucléiques présents dans des échantillons ou pour marquer des composés d'affinité et permettre ainsi de détecter indirectement l'interaction des composés d'affinité marqués avec leur cible ou encore pour permettre de réaliser des opérations de calcul moléculaire analogique ou digital à base de molécules d'acides nucléiques. gtat de l'art L'état de l'art d'aujourd'hui permet de détecter et de dénombrer des molécules individuelles d'acides nucléiques moyennant des manipulations complexes et des instruments complexes et très sensibles, par exemple comme décrit dans Nature Biotechnology, 26 (3) 2008, p317-325. Cependant, certaines applications de détection nécessitent des préparations simples et rapides pouvant être visualisées sans instrumentation. Il est par exemple possible de détecter sans instrument des acides nucléiques préalablement marqués par une haptène comme la biotine. Ces acides nucléiques marqués peuvent être hybridés sur des amorces attachées sur un support et cette hybridation est révélée par un procédé de coloration efficace, par exemple comme décrit dans Nucleic Acids Res. 200'7;35(10):e74. D'autres méthodes de coloration sont également bien connues de l'homme de l'art, par exemple l'utilisation de nanopatticules d'or ou de cabrant, fixés directement sur les acides nucléiques ou via une interaction avec une haptène, par exemple comme décrit dans Nucleic Acids Res, 2005 Jan 31;33(2):e17. Parmi les procédés de coloration efficaces bien connus de l'homme de l'art, on notera particulièrement l'utilisation de la phosphatase alcaline couplée à de la streptavidine qu~ reconnoitro la bioUnc attachée aux molécules d'acide nucléique marquees. Cette enzyme catalyse la formation et la précipitation d'un produit colore a partir d'une solution appropriée, par exemple 0BT'B[IP comme décrit dans Biosens Bioelectron. 2004 Feb :15;19(7):685-92. Ces méthodes de détection ne permettent pas de détecter moins de 10^9 à 101\6 molécules, alors que dans de nombreuses applications le nombre d'acides nucléiques présents dans la solution d'intérêt ne dépasse pas 10A6 molécules. Pour cela, l'usage d'acides nucléiques et d'enzymes pour générer de multiples 5 copies d'acides nucléiques néo-synthétisés à partir des acides nucléiques présents dans la solution reste très répandu et utile. Les méthodes qui permettent de générer de multiples copies sont connues de l'homme de l'art sous le terme d'amplification d'acides nucléiques. La méthode d'amplification la plus courante est la PCR, décrite en détail dans U.S. Pat. Nos. 10 4,683,195, 4,683,202 et 4,800,159. Depuis, de nombreuses autres méthodes ont été décrites et une revue avec les références appropriées est fournie dans W02008013462 et dans Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Mar;27(3):224-43. Parmi les méthodes d'amplification décrites à ce jour, on peut distinguer deux grands groupes : 15 - celles où il est nécessaire de soumettre les acides nucléiques de façon répétitive à un cycle de conditions différentes (par exemple des changements de température ou de solutions), celles où les copies d'acides nucléiques sont produites de façon continue dans 20 des conditions réactionnelles auxquelles il n'est pas apporté de modification par une action extérieure (en pratique, les conditions réactionnelles ne sont jamais strictement constantes car des réactifs sont consommés, le pH et la force ionique etc. peuvent se modifier du fait de la consommation des réactifs et de la chaleur peut être dégagée ou absorbée au cours de la réaction). 25 La présente invention se situe dans le groupe où les copies d'acides nucléiques sont produites de façon continue dans des conditions réactionnelles auxquelles il n'est pas apporté de modification par une action extérieure. Ces méthodes sont avantageuses car elles permettent d'éviter l'usage d'instrumentation pour soumettre les acides 30 nucléiques de façon répétitive à un cycle de conditions différentes. Dans ce groupe, on peut distinguer et isoler le groupe de méthodes se basant sur la génération de copies d'un acide nucléique circulaire. La génération de copies d'acides nucléiques circulaires se base sur l'observation de la réplication de certains virus, comme popularisée par la communication de Gilbert et Pressier (Gilbert W, Dressler D., DNA replication: the rolling circle mDde!,� Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1968;33:473-484). Dans ce mécanisme, le génome du virus forme un intermédiaire circulaire, simple brin comme dans le bactériophage oh[%174omdouble brin comme le bactériophage T4. Une amorce, parfois sous la forme d'un ARN de transfert, permet à une ADN oo 'rase ~ de réaliser une copie du génome. Lorsque la première copie est complète, l'extrémité du brin en cours de synthèse est séparée de l'intermédiaire circulaire sous l'action des contraintes géométriques agissant sur une molécule circulaire et sous l'action d'enzymes spécialisées. Cette ouverture spontanée de la structure circulaire à l'extrémité 5' du brin en cours de synthèse pemmetà la synthèse de continuer et de former un concatémère de 10 grande taille formé de la répétition de la séquence du génome. L'utilisation du mécanisme de � rolling circle � à des fins de production de concatémères copies d'acides nucléiques circulaires par voie purement enzymatique in-vitro est décrite par Fire 8tXu dans � Rolling nep!ication of short DNA cinc!es. � PnOC Nat! Acad Sci U S A. 1995 May 9; 92/10\: 4641-4645.) et "Method for constructing an 15 oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication", US5648245. Cette approche est connue de l'homme de l'art sous le terme � rolling circ!eannpUfication � ou RCA. Afin de favoriser l'ouverture de l'extrémité 5' du brin en cours de synthèse sans apport d'enzymes spécialisées, les molécules circulaires sont relativement courtes, typiquement de 50 à 5OOnudé}ides. 20 Cette méthode d'amplification permet d'obtenir des concatémères linéaires sous forme simple brin. Des étapes enzymatiques supplémentaires, permettent de convertir le concatémère simple brin en un concatémère double brin. La longueur du concatémère augmente linéairement avec le temps de réaction. Sous forme double brin, une digestion par une endonucléase de restriction permet également d'obtenir des fragments linéaires 25 formés d'une seule copie du fragment circulaire initial. Dans ce cas, le nombre de fragments obtenus augmente également linéairement avec la durée de fa réaction. Cette approche moléculaire constitue le coeur de nombreuses techniques dérivées qui sont décrites dans les références déjà citées (VVO2OO8O134G2, Nucleosides Nuc!eoiides Nucleic Ac/ds, 2008 Mar;27(3):22443). Par exemple, � NUc(eic acid 30 amplification method: ramificationextension amplification method (PAM)* US5942391 decrit comment coupler l'amplification linéaire de type RCA avec une amplification de type � strand disp!accmenL amplification SDA) en ajoutant une poire d'amorces appropriées. 4 L'amplification de type SDA repose sur la propriété de certaines ADN polymérases de pouvoir déplacer un brin d'ADN qui s'oppose à l'élongation du brin en cours, et ce sur des molécules linéaires en l'absence de toute contrainte géométrique, comme par exemple la polymérase du phage phi29Ou!a forme exo- du fragment de Klenow de l'ADN polymnéna08d'E. coll. La méthode RAM permet d'obtenir une amplification exponentielle de concatémères de différentes longueurs de forme double brin, étant entendu qu'un déséquilibre dans la quantité de chaque amorce permet d'obtenir en fin de réaction une certaine proportion de molécules simple brin. Néanmoins, cette approche produit des molécules de type concatémères de toutes tailles qui sont principalement sous forme double brin. Cette méthode n'est donc pas très efficace pour générer des amorces utilisables dans les méthodes d'hybridation pour une détection sans instrumentation. II est donc avantageux de disposer d'une méthode qui produise directement des 15 molécules sous forme simple brin de taille homogène. Une façon simple d'obtenir des molécules simple brin est d'utiliser une construction comme par exemple un plasmide circulaire de type pBR322 ou un fragment linéaire comportant un ou plusieurs promoteurs de transcription. L'utilisation de RNA polymérase permet alors d'obtenir des copies simple brin en quantité proportionnelle au 20 temps de réaction. Néanmoins l'amplification n'est pas exponentielle et les acides nucléiques produits sont de l'ARN qui sont des acides nucléiques qui nécessitent des précautions particulières pour les préserver des ribonucléases présentes sur la peau des manipulateurs. L'utilisation de l'ARN est donc plus délicate que celle de l'ADN, en particulier dans le cadre de méthodes de détection sans instrumentation automatisée. 25 Il est donc avantageux de disposer d'une méthode qui produise directement des molécules d'ADN sous forme simple brin de taille homogène. L'amplification de type SDA sur des molécules linéaires sans être couplée à une amplification de type R[Aa été décrite dans US5455166, et utilise dans ce cas un alpha ihio nucléotide triphosphate non naturel qui empêche la coupure par une enzyme de 30 restriction dont le site de reconnaissance doit être present dans la sequence des amorces utilisées pour l'amplification. Néanmoins, cette technique necessite d'utiliser deux enzymes différentes dans la mémo réaction. 5 Il est donc avantageux de disposer d'une méthode qui produise directement des molécules d'ADN sous forme simple brin de taille homogène par l'utilisation d'une seule enzyme. D'autres méthodes on eté décrites, qui combinent l'utilisation de plusieurs 5 enzymes, parfois la génération d'intermédiaires ARN, comme décrit dans Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,2OO8Mar/27(3):224'4]. Un objet de la présente invention est de décrire une méthode simple, qui permette de produire directement des molécules d'ADN sous forme simple brin de taille homogène par l'utilisation d'une seule enzyme, et ce notamment de manière amplifiée. 10 Des méthodes ont été décrites qui combinent l'utilisation d'acides nucléiques et d'enzymes pour réaliser des opérations de calcul moléculaires mais ne elles ne permettent pas de fournir les composants nécessaires à la réalisation de calculateurs puissants/momme discuté dans EM8Unepods VUL4 NO 1 (2003). Un autre objet de la présente invention est de décrire une méthode simple pour 15 réaliser des opérations de calcul moléculaire qui permette de réaliser des composants nécessaires à la réalisation de calculateurs puissants. Description succincte de l'invention 20 Selon un premier aspect, l'invention concerne un composé, nommé composé amnDUOæble, comprenant au moins un acide nucléique nommé fragment amno!ifiable, ledit fragment amplifiable étant composé essentiellement de nucléotides permettant une polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire ledit composé comprenant au moins un moyen d'arrêt de la polymérisation, nommé � liaison 25 de boucle �, constitué essentiellement de substances ne permettant pas la polymérisation, ledit fragmcntanmpüfiab!c comprenant une partie 3', une partie centrale, et une partie 5', !es parties 3' et 5' dudit fragment amplifiable étant toutes deux reliées entre-elles par au moins un moyen d'arret de polymérisation. On entend par ^acide nucléique ^, des po!ymeres dont l'unfté de base, ou 30 rnonomè/e, est le nucléotide. Ces nucléotides sont !/ës les uns aux autres par des liaisons phosphodiester ou alpha thiophosphodiesLer. Typiquement les acides nucléiques sont choisis parmi: ADN, ADNn, ADNmt, ADN ch!orop!oshque,AONc, ARN, ARNm, ARN non- codant, ARNm/, ARNr, ARN\, shARN, siARN' ARNpn, ARNpi, ARNpn ,ARWsno, AR0tm, [es oligonucléotides, et leurs dérivés. L'acide nucléique peut être sous forme simple ou double brin. On entend par �acide nucléique duplicable � un acide nucléique permettant la polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire, aux erreurs de copie près. Typiquement un acide nucléique complémentaire est obtenu par réplication ou transcription. Les erreurs de copie apparaissent généralement naturellement lors de la polymérisation de l'acide nucléique complémentaire et ne modifie pas la fonction de l'acide nucléique dans les conditions et but de la présente invention. On entend par � composé essentiellement de nucléotides permettant une polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire � un fragment comprenant des nucléotides et permettant la polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire. Sans limiter la portée de l'invention, le fragment amplifiable est constitué de nucléotides permettant une polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire. Avantageusement, le composé comprend au moins un moyen pour imposer une contrainte géométrique au fragment amplifiable pour que le brin complémentaire du fragment amplifiable ne puisse pas s'apparier dans les conditions de la polymérisation au fragment amplifiable sur la totalité de sa longueur pour permettre à un autre acide nucléique de s'hybrider sur le fragment amplifiable. De préférence, la liaison de boucle limite la distance bout-à-bout entre les extrémités 3' et 5' du fragment amplifiable à une � longueur de contrainte � ou � Le �, de manière à imposer ladite contrainte géométrique au fragment amplifiable. On entend par � distance bout-à-bout entre les extrémités 3' et 5' � la longueur d'un segment de droite virtuel séparant les extrémités 3' et 5'. Selon une variante, le composé permet la polymérisation d'un acide nucléique simple brin complémentaire par une enzyme possédant une activité ADN ou ARN polymérase, et de préférence la liaison de boucle arrête la polymérisation. Avantageusement, le fragment amplifiable est constitué essentiellement de nucléotides présents dans la nature et/ou artificiels. On entend par � nucléotide � les ribonucléotides, tels que par exemple : AN1P, TMP, UMP, GMP, CMP, ADP, TDP, UDP, GDP, CDP,ATP,'1 1P, UTP, GTP, CTP, CAMP, cGMP ; les desoxyribonucleotides, tels que par exemple : dAMP, dTMP, dUMP, dGMP, dCMP, dADP, dTDP, dUDP, dGDP, dCDP, dATP, d I I P, dUTP, dGTP, dC I P ; et leurs dérivés alpha-thiophosphates ; ainsi que l'ensemble de leurs dérivés présents dans la 7 nature et/ou artificiels. L'expression � présents dans la nature � couvre également les nucléotides de synthèse. Avantageusement, les composés de l'invention sont circulaires, formant ainsi une ou plusieurs boucles amplifia bles, éventuellement complexes lorsque la liaison de boucle 5 comprend au moins un acide nucléique duplicable. Par "boucle amplifiable", on entend une ou plusieurs boucles amplifiables, éventuellement complexes. Lors de la � duplication �, le premier brin complémentaire du fragment amplifiable est détaché du fait de la polymérisation d'un second brin complémentaire. Selon un mode de réalisation particulier Lc est égal à 1U nm, de pnéhénenc8à 5 10 nm, de pnéfénenceà 3nm. En particulier quand Lc = �N-n) x pû n x q), où x est le signe de multiplication, ou le - est le signe de soustraction, où N est le nombre de nucléotides contenus dans le fragment amplifiable, p est environ égal à 0.32nrn (nanomètres), q est environ égal à 0.75 nm (nanomètres), et n est de préférence compris entre 6 et 50, de préférence entre 15 8 et 30, de préférence entre 10 et 25. Avantageusement, la liaison de boucle bloque la synthèse d'un brin complémentaire par une ADN ou ARN polymérase. Selon un mode de réalisation, la liaison de boucle comporte un ou plusieurs nucléotides abaSiques ; et/ou un ou plusieurs nucléotides comportant un groupement 20 chimique sur les sucres, ou sur les bases, ou sur les groupements phosphates des liaisons 3'-5', ou à la place des bases qui les composent; et/ou deux nucléotides reliés par une liaison différente d'une liaison 3'-5' phosphate ou alpha-thiophosphate composant les acides nucléiques duplicables. Avantageusement, la liaison de boucle comporte au moins deux nucléotides 25 comportant un groupement chimique sur les sucres, et/ou sur les groupements phosphates des liaisons 3'-5', et/ou sur les bases, et/ou à la place des bases qui les composent, eL sont reliés per une liaison différente d'une liaison 3'-5' phosphate ou æ!pho'Lhiophosphotecompusa/{ acides nucléiques habituels. Selon une variante, une liaison de boucle comporte plusieurs nuc/éohdcsdont/es 30 bases sont reliees entre-elles par des liaisons covalentes, peuvent être reliees entre-elles par l'action de rayons UV, en particulier lorsqu'il s'agit d'un ou plusieurs dimeres de thymidine, 8 Selon une variante la liaison de boucle comprend également un ou plusieurs acide nucléiques /ié par au moins une de leur extrémités, ledit acide nucléique et le fragment amplifiable pouvant s'apparier au moins en partie. Selon une variante, les groupements chimiques mentionnés forment des liaisons 5 covalentes et/ou une interaction de forte affinité avec une particule essentiellement indéformable dans les conditions d'exploitation de l'invention et/ou avec un support solide. En particulier les particules essentiellement indéformables sont des protéines, des colloïdes, des micelles, des gouttelettes d'émulsion et/ou des surface solides recouvertes de telles particules indéformables ou par des films moléculaires. 10 Selon une variante, la liaison de boucle comporte deux nucléotides reliés par l'intermédiaire d'une structure moléculaire et/ou d'un polymère, ou d'une surface ou bloc de matière. Il faut noter que dans tous les cas la liaison de boucle peut être déformable, mais impose une distance bOutà bout maximale aux extrémités 3' et 5' inférieure à Lc dans les 15 conditions d'exploitation de l'invention. Selon une variante, le composé comprend un seul acide nucléique et une seule liaison de boucle, qui est appelé alors boucle amplifiable. Selon un mode de réalisation, le composé comprend au moins deux fragments amnp!iflab!es, nommé ainsi � multi-boucle amplifiable �, ledit composé comprenant 20 éventuellement dans au moins une liaison de boucle au moins un acide nucléique duplicable. Selon un second aspect, l'invention concerne un composé complexe comprenant un composé amplifiable, tel que défini précédemment, et une wgâchetbe � formée au moins en partie d'un acide nucléique, ladite gâchette comprenant au moins une région 25 appariée sur au moins une partie du fragment amplifia bye, ladite gâchette comprenant également au moins une région non appariée au fragment aniplifiabte pour permettre à un acide nucléique au moins partiellement complémentaire de la gâchette de s'apparier au moins dans une partie de cette région afin de libérer la partie du fragment amplifiable appariée à ladite gâchette, notamment par hybridation compétitive ou duplication de la 30 gâchette. On entend par � libérer le fait de séparer (es composés appariés et de laisser libre le composé complexe dans la region anciennement appariée (partie du fragment amplifiable) afin de rendre possible un nouvet appariement avec un acide nucléique complémentaire de la reglon. Avantageusement, ladite gâchette est appariée dans la partie 3' dudit fragment amplifiable. Un composé complexe ne comportant pas de gâchette peut être désigné par � composé débloqué� � ou composé amplifiable débloqué �. Selon une variante, les composés amplifiables bloqués peuvent comporter également des � gâchettes � nommées � gâchettes secondaires�, formée au moins en partie d'un acide nucléique, ladite gâchette secondaire comprenant au moins une région appariée sur au moins une partie d'une autre gâchette, ladite gâchette secondaire comprenant également au moins une région non appariée à ladite autre gâchette pour permettre à un acide nucléique au moins partiellement complémentaire de ladite gâchette secondaire de s'apparier au moins dans une partie de cette région afin de libérer la partie de ladite autre gâchette appariée à ladite gâchette secondaire, notamment par hybridation compétitive ou duplication de la gâchette. Avantageusement, la partie de la gâchette appariée au fragment amplifiable et/ou à la gâchette, est duplicable. Avantageusement, la partie 3' de la gâchette comporte suffisamment de nucléotides pour permettre à au moins une amorce de s'apparier sur cette partie. De préférence, l'extrémité 3' de la gâchette comprend un moyen empêchant le démarrage de la polymérisation à cette extrémité, par exemple quand le dernier nucléotide de l'extrémité 3' est un 2'3'-didesoxynucléotide. Avantageusement, dans les gâchettes primaires et/ou secondaires chaque partie peut consister en 8 nucléotides ou plus, de préférence 12 nucléotides ou plus, de préférence 18 nucléotides ou plus. Selon une variante, au moins une gâchette est reliée par au moins une de ses extrémité à la liaison de boucle. Selon un troisième aspect l'invention concerne un précurseur, formant notamment précurseur d'un composé tel que défini précédemment, ledit précurseur comprenant au moins un premier et un second acide nucléique, l'extrémité 3' du premier acide nucléique étant reliée à l'extrémité 5' du second acide nucléique par une liaison du type liaison de boucle. Ainsi, on peut facilement former un composé tel que défini précédemment par formation d'au moins une liaison covalente entre l'extrémité 5' et 3' du fragment amplifiable. Avantageusement, la liaison de boucle limite la distance bout-à-bout entre l'extrémité 3' du premier acide nucléique et l'extrémité 5' du second acide nucléique à une Selon un mode de réalisation, la méthode ou procédé comprend la mise en contact d'un mix amplificateur avec des substances d'origine biologique, géologique ou synthétique, vivantes ou inertes, ou un mélange de ces substances, qui ont été mises en contact avec des composés amplifiables, éventuellement complexes, et/ou leurs précurseurs et dont on a retiré les composés amplifiables, éventuellement complexes, et/ou leurs précurseurs ne présentant pas d'affinité avec la substance. Avantageusement, les substances, après avoir été séparées des composés amplifiables, éventuellement complexes, et/ou de leurs précurseurs ne présentant pas d'affinité avec eux, ont été mis en contact d'au moins un réactif permettant de transformer un précurseur de composé amplifiable en composé amplifiable. Selon un mode de réalisation, le procédé comprend la mise en contact d'un mix amplificateur avec des composés amplifiables, éventuellement complexes, et/ou leurs précurseurs qui ont été séparés des substances avec lesquelles ils ont préalablement été mis en contact. Avantageusement, les composés amplifiables, éventuellement complexes, et/ou leurs précurseurs, après avoir été séparés des substances avec lesquelles ils ne présentent pas d'affinité, ont été mis en contact d'au moins un réactif permettant de transformer un précurseur de composé amplifiable en composé amplifiable. Dans un autre de ses aspects, le procédé comprend la mise en contact du mix avec des acides nucléiques attachés à un support et dont la séquence est partiellement ou totalement identique à la partie centrale et/ou la partie 5' de fa séquence d'au moins un des fragments amplifiables présents dans le mix réactionnel. Avantageusement, les acides nucléiques attachés au support sont observes après avoir été séparés du mix réactionnel avec lequel ils avaient été mis en contact pendant un certain temps, de préférence après 20 secondes ou plus, de préférence après une 16 minute ou plus, de préférence après trois, dix, trente minutes ou plus ; ce temps étant déterminé par l'homme du métier en fonction des conditions opératoires. Selon une variante, la présence d'un moyen de détection, tel que d'acide nucléique et/ou de biotine et/ou de colorant et/ou de UuDrDphor8 et/ou d'haptène 5 retenus par les acides nucléiques attachés sur le support, est observée visuellement et/ou par un procédé de révélation et/ou par un instrument approprié. Avantageusement, une partie au moins des composés amplifiables et des acides nucléiques sont attachés sur le même support. Selon une variante, les acides nucléiques sont observés à l'échelle microscopique 10 afin de dénombrer les zones présentant une forte densité d'acide nucléique et/ou de biotine et/ou de colorant et/ou de fluorophore et/ou d'haptène retenus par les acides nucléiques attachés sur le support. Selon une variante, le support est une particule colloïdale ou une microbille. Dans un autre de ses aspects, le procédé comprend la mise en contact du mix 15 réactionnel avec des acides nucléiques, nommés �reporteur� ou � sonde de détection �, dont la séquence est partiellement ou totalement identique à la partie centrale et/ou la partie 5' de la séquence d'au moins un des fragments amplifiables présents dans le mix réactionnel, l'observation du mix réactionnel, de préférence après 20 secondes ou plus, de préférence après une minute ou plus, de préférence après trois, 20 dix ou trente minutes ou plus après que la réaction d'amplification ait débutée, soit pour faire un suivi en temps réel de l'amplification, soit pour quantifier les acides nucléiques générés à partir des fragments amplifiables, ce temps étant déterminé par l'homme du métier. Avantageusement, le mix réactionnel contient également un composé dont les 25 propriétés physico-chimiques changent en présence d'acides nucléiques sous forme doub/chdn. Avantageusement, tes acides nucléiques reporteurs sont de deux types différents le premier type étant partiellement ou totalement identique à la partie centrale de la séquence du fragment amplifiable, le second type etant partiellement ou totalement 30 identique à !a partie 5' de la séquence du fragment amp)ihob/e, /'un comportant un premier composé détectable, l'autre comportant un second composé qui module le signaf détectable du premier composé en fonction de la distance séparant les deux composés. Avantageusement, le procédé comprend la visualisation de molécules d'ADN pour observer celles présentes dans le mixamp!/[iraLeur, de préference après 20 secondes ou 17 plus, de préférence après une minute ou plus, de préférence après trois, dix ou trente minutes ou plus après le mix réactionnel soit formé, ce temps étant déterminé par l'homme du métier, Selon un mode de réalisation, la méthode de visualisation est l'électrophorèse en 5 gel ou l'électrophorèse capillaire d'une partie ou de la totalité du mix amplificateur. De préférence, au moins une partie des acides nucléiques présents dans le mix amplificateur sont dénombrés pendant qu'elles se déplacent en solution. Avantageusement, au moins une partie des acides nucléiques présents dans le mix amplificateur sont immobilisés sur une surface et dénombrés. 10 Dans un autre de ses aspects, les différents aspects de l'invention sont combinés pour détecter la présence d'acides nucléiques d'intérêt dans une solution en mettant cette solution en contact avec un mix amplificateur. Avantageusement, ces acides nucléiques d'intérêt ont au préalable été soumis à une température élevée, de préférence 90°C ou plus, de préférence 95°C ou plus, avant 15 d'être refroidie à la même température que le mix amplificateur. Avantageusement, les acides nucléiques d'intérêt ont été au préalable soumis à un cisaillement important, par exemple par action répétée de pipetage, suivi d'une digestion par une exonucléase qui digère par l'extrémité 3' les brins d'ADN sous forme duplex, par exemple l'exonucléase 20 En particulier, les acides nucléiques ont été au préalable : - digérés par deux enzymes de restriction possédant des sites de reconnaissance différents, quand la première de ces enzymes de restriction peut produire des protubérances 3' d'au moins 4 nucléotides de long et que la seconde ne produise pas de telles protubérances, 25 digérés par une exonucléase qui digère par l'extrémité 3' les brins d'ADN sous forme duplex, par exemple l'Exonucléase Ill. Dans un autre de ses aspects, /es différents aspects de l'invention sont combinés pour détecter la présence d'une substance d'intéret. En particulier, la substance d'intérëtest présente dans une solution et : 30 [a solution est mise en contact avec des composés ampllflables présentant une affinité avec !a subsLonce d'intërët, les complexes formés par les composés amp!ihab!esci la substance d'interêt sont séparés de la solution, par exemple par filtration ou par centrifugation, les complexes sépares sont mis en contact avec un nuixamp!i(/caLour. 18 Selon une variante, les liaisons de boucle des composés amptifiabtes comportent des anticorps présentant une affinité avec la substance d'intérêt. En particulier les composés amnp!ifiab!es comportent des multi-boucles 5 amplifiables dont le fragment arnp!ifiab!eet/Ou le second acide nucléique des composés complexes et/ou la liaison de boucle présente une affinité avec la substance d'intérêt. L'Invention concerne aussi dispositif réalisant des opérations logiques ou de calcul comprenant des opérations logiques ou de calcul mettant en oeuvre au moins un composé amplifiable et/ou au moins un composé complexe, et/ou au moins un 10 précurseur tel que défini précédemment. L'invention concerne également un opérateur logique choisi parmi l'opérateur � OU �, � ET�, � NON ET �, caractérisé en ce quil comprend la mise en oeuvre au moins un composé amplifiable et/ou au moins un composé complexe, et/ou au moins un précurseur tel que défini précédemment. 15 Dans un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé de détection de la présence d'une substance d'intérêt présente sur et/ou à la surface d'une fibre et/ou d'une matière solide et/ou poreuse et/ou fibreuse, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre du procédé d'amplification, et l'une quelconques de ses variantes et leurs combinaisons. Typiquement ce procédé est utilisable dans des investigations policières ou douanières. 20 En particulier, la surface comportant les substances d'intérêts est mise en contact avec des composés amplifiables présentant une affinité avec la substance d'intérêt, les composés amplifiables n'ayant pas interagit avec les substances d'intérêt sont séparées de la surface, et un mix amplificateur est mis en contact avec la surface. Dans un autre de ses aspects, l'invention concerne 'un procédé comprenant des 25 opérations de calculs moléculaires en observant l'évolution au cours du temps de la composition du mix amplificateur après l'avoir mis en contact avec au moins deux acides nucléiques différents et/ou pendant que l'on ajoute de façon séquentielle au moins un acide nucléique, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre du procédé d'amplification, et l'une quelconques de ses variantes et leurs combinaisons. 30 Selon une variante, (e mix amplificateur est réparti à yintérieurd'un réseau d'au moins deux compartiments reliés entre eux par au moins un passage. Avantageusement, les compartiments forment un réseau monodimensionnel, bidimcnsionne!ou tridimensionnel. 19 Avantageusement, le réseau bi- ou tri-dimensionnel est un réseau quasi-fractal ou aléatoire par exemple un gel, tel qu'un gel d'agarose. De préférence le réseau bidimensionnel possède une topologie plane, ou sphérique, ou torique, ou de ruban de Mobius. 5 De manière générale le réseau mono-, bi- ou tri-dimensionnel peut avoir une morphologie homologue à celle d'une représentation mathématique d'un phénomène naturel ou d'un système artificiel ou d'un concept théorique. Selon une variante, les acides nucléiques sont ajoutés à une partition des compartiments. 10 Avantageusement, au moins une partie des acides nucléiques et/ou des boucles amplificatrices est attachée par construction à la surface des compartiments, de préférence de façon spatialement ordonnée à la surface d'une partition des compartiments. En particulier, des acides nucléiques et/ou des composés amplifiables sont liés à 15 des acides nucléiques ou à des composés amplifiables attachées à la surface des compartiments. Avantageusement, des partitions de compartiments comportent également une source d'enzyme et de réactifs, par exemple et sans être restrictif, des ADN polymérases, des ARN polymérases, des andonudéases de restriction, des exonucléases, des 20 endonudéaSes,deS !igases,des terminal-transférases, des hélicaces, des ribosomes, des méthy!-transférases, des sels, des solvants, des tampons/des adjuvants, etc.. Selon une variante le déplacement des solutions a travers au moins une partie ou partition des compartiments est imposée, par exemple par des moyens tels que la mise sous pression ou dépression, ou le passage d'un courant électrique. 25 Dans un autre des ses aspects, l'invention concerne un procédé de détermination de variations génétiques, notamment pour réaliser des déterminations de niveaux d'express/on de gènes, et/ou pour détecter !a présence, et/ou doser des marqueurs biologiques et/ou toute autre molécule ou substance, et/ou pour détecter la présence e{/ou identifier des organismes vivants et/ou toute particule ou substance d'origine ~(} biologique, ledit procédé comprenant /a mise en œuvre du procede d'amplification, et l'une quelconques de ses variantes et leurs combinaisons. Dans un autre de ses aspects, ('invention concerne des calculateurs moleculaires, et/ou des réseaux de neurones artificiels, et/ou des systèmes auto-évolutifs, mettant en oeuvre le procédé d'amplification, et l'une quelconques de ses variantes et leurs combinaisons. Brève description des figures La figure 1A représente schématiquement un composé amplifiable (1) dans sa forme minimale. On identifie la liaison de boucle (10) ; le fragment amplifiable (2) où l'on distingue la partie 3' (3), la partie centrale (4), et la partie 5' (5). La flèche oriente les acides nucléiques dans le sens 5'-3'. 10 La figure 1B représente schématiquement un composé amplifiable (1') dans sa forme bloqué : On identifie en outre du composé amplifiable selon la figure 1A, une gâchette primaire (11), une gâchette secondaire (12), des acides nucléiques respectivement (13) et (14) dont les parties centrales sont complémentaires respectivement, aux parties 15 centrales et 5' du fragment amplifiable. On identifie également les liens (15) entre les acides nucléiques et la liaison de boucle. La figure 2 représente les différentes étapes de l'amplification. On identifie l'amorce d'amplification 101, et une enzyme 102 avec une activité ADN polymérase. La figure 3 est une reproduction d'une photographie de gel d'agarose, résultat de l'expérience de l'exemple 1. Figure 4 est une reproduction d'une image de membrane de nylon révélée par 25 chimioluminescence, résultat de l'expérience de l'exemple 2. Description détaillée de l'invention Cette invention tire notamment partie des caractéristiques suivantes : 30 l'impossibilité pour les ADN polymérises de réaliser une copie d'un fragment d'acide nucléique comprenant des bases altérées ou des liaisons anormales entre nucléotides la propension des acides nucléiques à conserver une conformation peu étirée afin de minimiser la surface de contact entre la partie aromatique des bases et l'eau dans laquelle elles sont en solution, 20 21 - la propension de deux acides nucléiques complémentaires à être plus stables sous forme double brin que sous forme simple brin. - la différence de rigidité entre molécules d'ADN simple brin et molécules d'ADN double brin. 5 Les composés amplifiables décrits dans l'invention ont été réalisés à la lumière de ces caractéristiques pour permettre d'obtenir un grand nombre de copies d'ADN simple brin quand ils font partie du mix amplificateur. Ils sont schématisés dans leur généralité dans la figure 1. Comme pour toute manipulation d'acides nucléiques sous forme simple brin, on peut vérifier avec des logiciels adaptés (par exemple, � nnfb/d� comme décrit dans NuckaicAcid Research 31 (13) 3406-15 (2003)), que les fragments amplifiables ainsi que tous les acides nucléiques interagissant dans les différents aspects de l'invention, ne forment pas de structures secondaires trop stables qui pourraient nuire aux interactions attendues. Bien que cela ne soit pas représenté sur la figure 113, le composé amplifiable peut aussi comporter au moins un acide nucléique au moins partiellement complémentaire à la partie 3' du hagmnentarnp!Uiab!e et relié par un lien à la liaison de boucle. Ces acides nucléiques permettent de limiter l'appariement de /a partie 3' du fragment amplifiable avec des d'acides nucléiques formant un appariement moins stable que l'appariement formé avec l'amorce d'amplification. De même, le composé amplifiable peut également comporter au moins une gâchette relié par un lien à la liaison de boucle. Le mécanisme d'amplification est schématisé dans la figure 2. Le mix amplificateur contient des amorces d'amplification (101) (en anglais � primers �) qui sont des amorces qui vont s'hybrider sur la partie 3' des fragments amplifiables (2). Cet ensemble pourra être étendu par l'ADN polymérase (102) présente dans le mix. Cependant, la liaison de boucle (1O) a été définie pour avoir une longueur bout-à-bout maximale, c'est-à-dire la longueur du segment géométrique dans !'espace entre les extrémités 5' et 3' du fragment amp!)Dob!c, ne permettant pas de relier les extrémités d'une molécule d'ADN double brin comportant N paires de nucleotides. Cette longueur ou distance est de préférence inférieure à N`0.32nm. Au bout d'un moment, le complexe en cours d'extension sera composé d'une partie simple bon ne comportant plus que n nuc!ëotides composé de la partie 5' du fragment omp!ifiob!e, d'une partie double brin comportant N -n nucléotides composée de la partie 3' du fragment ampllflable et de l'amorce étendue, et de la boucle de liaison de bout a -bout de longueur inferieure a L[. 22 Le fait que les deux extrémités du fragment amplifiable soient reliées entre elles impose une contrainte géométrique à la boucle (1). Pour que la réaction continue, il faut soit que la partie simple brin s'étire à son maximum, soit que la partie double brin se sépare à l'extrémité opposée à celle en cours d'extension. Une représentation schématique fait 5 l'objet de la figure 2 étapes II et III. L'étape II illustre une partie double brin étendue pratiquernentà son maximum, et l'étape III illustre d'une part une amorce étendue dont le produit d'extension possède une partie non appariée (104), donc simple brin, et une partie double brin (105). La figure 2 nnontr8à l'étape IV une boucle (1) sur laquelle trois amorces sont à 10 des stades de duplication différents : une première amorce (101) est appariée à la partie 3' (3) du fragment amplifiable (2) et est prête à être étendue ; une seconde amorce /101\ est en cours d'extension et son produit d'extension est encore apparié par son extrémité 3' sur la partie centrale (4) du fragment amplifiable (2) où son extension se poursuit alors que sa partie 5' est sous forme simple brin (104) ; une troisième amorce 15 (101) a fini d'être étendue et son produit d'extension reste apparié par son extrémité 3' à la partie G' /5\ du fragnnentarnp/Uiab/e (2) où son extension a été bloquée par la liaison de boucle (10) alors que sa partie 5' est sous forme simple brin (104) et qu'elle finit d'être détachée du fragment amplifiable (2) par la progression de l'extension de la seconde amorce (101). 20 L'invention définit une contrainte entre la longueur bout à bout de la liaison de boucle et le nombre de nucléotides du frægnnentarnpUfiab!e. Cette contrainte est telle que dans la situation présente l'extension de la partie simple brin est importante. L'étirer au maximum amènera à exposer davantage les bases composant les acides nucléiques au solvant dans lequel elles se trouvent, c'est-à-dire en général l'eau. Or ce sont des 25 molécules aromatiques essentiellement hydrophobiques et l'exposition à l'eau va avoir une incidence énergétique élevée dans les conditions habituellement utilisées pour des ADN po/ymné/ases, en particulier avec celles dont l'activité est optimale à basse température. A partir d'un certain niveau d'étirement (figure 2, étape Il), cette Incidence énergétique sera supérieure à l'incidence énergétique de l'ouverture de la double helice 30 au niveau de l'extrémité opposée à celle en cours d'extension effet, la partie simple brin nouvellement creée sur le brin neo synthébsë ne subit pas la contrainte imposee par la boucle de liaison au fragment amplifiable, et n'o pas bcsoin d'éke ët/réc (hgure Z, etape III). 23 A ce stade la réaction de polymérisation continue donc au fur et à mesure que les nucléotides de la partie 5' de l'amorce, c'est-à-dire aussi du brin se détachent du fragment amplifiable de par l'agitation brownienne. En effet, il est bien connu de l'homme de l'art que l'extrémité d'un fragment double brin est une structure 5 dynamique. La double hélice s'ouvre et se ferme continuellement à ses extrémités, et cela sur une distance d'un à plusieurs nucléotides. Cet effet est connu de l'homme de l'art par l'expression � respiration des extrémités�. Pendant que la partie 5' du brin néosynthétisé est ouverte, un nucléotide supplémentaire peut être ajouté à sa partie 3' par l'ADN polymérase (figure 2, étape III). Cependant, le nombre de nucléotides pouvant 10 rester sous forme double brin reste inchangé du fait des contraintes géométriques imposées par la liaison de boucle. Au cours de la synthèse, le partie double brin glisse virtuellement le long du fragment amplifiable, et l'on voit apparaître une protubérance simple brin correspondant à la partie 5' du brin néo-synthétisé. Simultanément, la partie 3' du fragment amplifiable 15 se retrouve également sous forme simple brin, et redevient accessible à l'hybridation avec une nouvelle amorce. Dans cette première phase de la réaction d'amplification il est critique que la synthèse du brin s'arrête bien ou du moins soit particulièrement ralentie au niveau de la liaison de boucle (figure 2, étape IV). Si cela n'était pas le cas, la synthèse continuerait 20 comme dans les amplifications reposant sur le principe de � rolling circle � (modèle du cercle tournant) mentionnées dans l'état de l'art. Si la synthèse du brin complémentaire est ralentie au niveau de la boucle, il faut un ralentissement suffisant pour que la synthèse d'une autre amorce libère la première amorce de la boucle. La réponse apportée par l'invention pour résoudre ce problème technique est de 25 relier les deux extrémités du fragment amplifiable par une liaison de boucle qui bloque ou arrête la synthèse du fragnnentarnp!/fiob!e par l'ADN polymérase. En effet, à l'exception notoire des liaisons 3"5' alpha thio-phosphodiester bien connues de l'homme de l'art, les liaisons entre nucléotides qui sont différentes des liaisons phosphodiester naturelles et qui permettent maigre tout à une ADN 30 po/ymërasc de poursuivre la synthèse sont exceptionnelles. De mème, les nucléotides non -naturels tels les � nucléotides ,> abasiques ou portant une haptene, en particulier Ta b/oLinc, sont connus pou/ b!oquerà toute fin pratique la copie des brins les portant. Ce type d'acide nucléique peut donc composer la liaison de boucle. 24 De ce fait, les fragments amplifiables ne comportent pas de nucléotide, ou séquence de nucléotides, bloquant la polymérase. Les nucléotides composant les acides nucléiques, y compris ceux de l'invention autres que ceux des fragments arnp!ifiab!es/ peuvent comporter des acides nucléiques 5 non-naturels, en particulier ceux portant des haptènes, des colorants et des fluorophores. En effet, ces derniers n'empêchent généralement pas un brin d'acide nucléique de s'hybrider, et le plus souvent, de tels acides nucléiques peuvent servir d'amorce dans la synthèse d'un brin complémentaire par une ADN polymérase. Par contre, comme indiqué dans la description générale, les acides nucléiques 10 des fragments amplifiables sont uniquement ceux qui ne bloquent pas la synthèse d'un brin complémentaire par une ADN polymérase. Marconséquent, au sens classique, des acides nucléiques circulaires dont un ou plusieurs nucléotides portent un groupement chimique bloquant l'activité d'une ADN polymérase, sont considérés dans le cadre de la présente invention comme des boucles 15 amplifiables dont les liaisons de boucles comprennent des nucléotides portant les groupements chimiques bloquant l'activité ADN polymérase en nombre suffisant pour bloquer la réplication du brin d'acide nucléique circulaire, pourvu que les conditions de longueur de liaisons (boucle de liaison) soient respectées par rapport à la plus longue partie non bloquante contigùe, qui constitue de fait le fragment amplifiable. 20 Par con' uent, un frægnnentd'acid8 nudéique drCu!aive pouvantêtnedupUcab!e dans certaines conditions (par exemple à haute température) mais qui comporte des séquences connues de l'homme de l'art sous le terme � inverted-repSat� Ou � inversées-répétées � suffisamment stables dans les conditions d'exploitation de l'invention, par exemple si les séquences inversées répétées sont formées d'une succession d'au moins 5 25 Cytosines ou Guanines, forme une boucle amplifiable dont la duplication est suffisamment ralentie au niveau de la liaison de boucle formée par l'appariement des parties comportant les séquences inversée-répétées. Par conséquent, un fragment d'acide nucléique circulaire pouvant être cluplicable comportant au moins une séquence comportant une région dite ° riche en G[ �, par 30 exemple une succession d'au moins 5 Cytosines et Guanines et qui est apparié au niveau de cette séquence à un acide nucléique pouvant être dop!icab!u maisdnnt!'exLrémité 3' n'est pas appariée au fragment circulaire ou dont !'extrëmité 3' ne permet pas a une po!ymehsaUon de démarrer à cette exhëmiLe, forme une boucle amplifiable dont la duplication est suffisamment ralentie au niveau de la liaison de boucle [ormeo par l'appariement entre le fragment circulaire et l'acide nucléique au niveau des régions �riches en GC �. Par conséquent, un acide nucléique circulaire duplicable apparié dans au moins une de ses régions à un second acide nucléique formant un appariement plus stable que ceux formés entre des acides nucléiques duplicables, par exemple si le second acide nucléique est un PNA, forme une boucle amplifiable dont la liaison de boucle est formée par les parties appariées. Comme pour les amplifications de type RCA, on utilise en général des fragments amplifiables comportant entre 50, 150 voire 500 nucléotides, et l'on vérifie expérimentalement au cas par cas l'efficacité d'amplification générée par des fragments plus longs. Pour qu'une amplification avantageuse puisse se faire, il faut qu'une seconde amorce puisse s'hybrider avec le fragment amplifiable malgré la présence du fragment néo-synthétisé. Pour que cela puisse se faire, il est nécessaire que la partie 3' du fragment amplifiable comporte suffisamment de nucléotides sous forme simple brin. Pour cela, il faut d'une part imposer une contrainte géométrique, et d'autre part s'assurer qu'elle soit dimensionnée de telle sorte que le nombre de nucléotides qui sont sous forme simple brin soit suffisant pour permettre à une amorce de se lier jusque dans sa partie 3'. Une réponse apportée par l'invention pour résoudre ce problème technique est d'une part de relier les deux extrémités du fragment amplifiable par une liaison de boucle qui induira une contrainte géométrique, et d'autre part de dimensionner la longueur bout-à-bout de cette liaison de telle sorte quelle soit inférieure à une longueur de contrainte Lc, et qui est définie par Lc=((N-n)xpûnxq) où x est le signe de multiplication, où - est le signe de soustraction, où N est le nombre de nucléotides contenus dans le fragment amplifiable, p est environ égal à 0.32nm (nanornètres), q est environ égal à 0.75 nm (nanomètres), et n est de préférence compris entre 6 et 50, de préférence entre 8 et 30, de préférence entre 10 et 25. L'invention fixe arbitrairement la valeur de q à 0.75 nm plutôt que 0.32 nm, qui est l'espacement typique entre plateaux de bases clans une molécule d'ADN double brin dans les conditions d'exploitation de l'invention, En effet, on s'attend à ce que la partie simple brin de la boude en cours de copie soit fortement étirée, donc loin d'être aussi compacte que des acides nucléiques sous forme double brin. L'invention définit donc implicitement des contraintes sur le dimensionnement de l'amorce qui devra comporter dans sa partie 3' de préférence entre 6 et 50, de préférence entre 8 et 30, de préférence entre 10 et 25 nucléotides dont la séquence est complémentaire à la séquence de la partie 3' du fragment amplifiable. De plus, l'amorce comporte de préférence au moins entre 0 et 10, de préférence entre 0 et 3 nucléotides de moins que la valeur de n dimensionnant la boucle amplifiable. Par contre, l'amorce peut avoir une partie 5' dont la longueur est quelconque, bien que l'on évite les molécules trop longues dont une partie de la séquence pourrait être complémentaire avec la partie 3' et former des structures internes avec celle-ci et limiter sa capacité à s'hybrider avec le fragment amplifiable. En fait, pour concevoir une boucle amplifiable on peut fixer au choix deux des paramètres parmi N, n et Lc, et déterminer la contrainte sur le troisième. Par exemple pour une liaison de boucle constituée d'un seul nucléotide modifié, Lc est environ égal à 0.75nm, et n est environ égal à 0.4 x N. L' amorce d'amplification comporte donc de préférence un nombre de nucléotides compris entre 6, 8 ou 10 et 0.4 x N. Par exemple, en fixant n à 20 qui est une taille d'amorce suffisamment longue 20 pour permettre une bonne spécificité d'hybridation, on peut définir N environ égal à au moins 50 nucléotides. Par exemple, pour une liaison de boucle constituée de biotines attachées au dernier nucléotide de chaque extrémité du fragment amplifiable, les biotines étant elles-mêmes liées par affinité à une streptavidine, on peut estimer Le à environ 3 nm, et on 25 détermine comme précédemment, N égal à au moins 60 nucléotides. L'hybridation d'une seconde amorce sur le fragment amplificateur est un événement énergétiquement favorable, car au niveau de la solution, le nombre de molécules simple brin diminue. Une fois la seconde amorce d'amplification hybridée sur le fragment 30 amplificateur, celui-ci est étendu par l'ADN polymérase. Grâce au phénomène de respiration, le premier brin néo-synthétisé libère transitoirement un ou deux nucléotides du fragment amplifiable, ce qui permet à la polymérase d'incorporer un ou deux nucléotides sur la seconde amorce d'amplification et de rendre la deshybridation du premier brin néo-synthétisé irréversible. Ainsi de proche en proche, le premier brin nec- 27 synthétisé est entièrement détaché du fragment amplifiable et remplacé par le second fragment n .Ace stade, le cycle d'amplification peut reprendre par l'arrivée d'une troisième amorce d'amplification, etc.. On comprend de cette description que le mécanisme d'amplification fournit 5 directement des acides nucléiques simple brin dont la séquence est complémentaire à celle du fragment amplîfiable. On comprend également de la description de l'invention que chaque boucle amplificatrice va produire un acide nucléique simple brin en un certain intervalle de temps. Le nombre M d'acides nucléiques produit par B boucles amplifiables sera donc 10 proportionnel au temps de néa[tiont : M=Bxt/~m où tau est ~~mpsmoyen ce réalisation d'un cycle d'amplification dans les conditions de 15 l'expérience. Cette relation n'est évidemment valable qu'après le premier cycle d'amplification, car tant qu'aucune copie complète n'est réalisée, M est égal à U. Une mesure précise du nombre de molécules produites au cours du temps permet de mettre en évidence un temps de latence qui correspond au temps moyen nécessaire pour réaliser la première copie sur chaque boucle, et qui peut s'avérer différent de tau. La faisabilité de cette invention a été vérifiée par la réalisation des expériences suivantes. Exemples Exemple 1 Mise en évidence_ de la formation de produits d'amplification Lo première expérience permet d~ mettre en évidence !a fonnat/on de pnzduhs d'amplification om révélant leur présence par électrophorèse sur gel et marquage 30 0uUrescenL Pour cela, 4 mix amplificateurs contenus dans des tubes type Eppendorf de 1,5m l ont été formulés selon le tableau suivant : 25 Mix amplificateur Na 1 2 3 4 8.351x1 solution de boucles amptifiables + + _ 0.35 pI ADN polymérase + - + 0.35 pl Amorce d'amplification + + + 20 pI Mix Tampon + + + + + : signifiant présence : signifiant absence La solution de boucles amplifiables est composée de : - 1 pl d'une solution à 188pM de l'oligonucléotide (ADN) de séquence GAAGAGATATAGGATTAGCCAATTGACGACAATGTCCCGACACCAGAAGCAGCATCAG T (SEQ ID N°1), comportant une biotine à chacune de ses extrémités et fabriqué à façon par Eurogentec, Belgique (syntaxe de commande : GAAGAGATATAGGATTAGCCAATTGACGACAATGTCCCGACACCAGAAGCAGCATCAG T [3'] Biotine [5] Biotine 200 OliGold) 2 pI d'une solution de streptavidine à lgjl (New England Biolabs, USA) 10 pI de tampon 10x Nebl (New England Biolabs, USA) 87 pI d'eau PCR (Sigma Aldrich, USA) On notera que dans cet exemple, l'oligonucléotide constitue un précurseur de boucle amplifiable, et que la séquence du fragment amplifiable correspond ici à celle de cet oligonucléotide. La solution de l'amorce d'amplification est composée de l'oligonucléotide (ADN) de séquence TAATGTCGTCACTGATGCTGC 1 t CTGGTGT (SEQ ID N°2) comportant une biotine à son extrémité 5', fabriqué à façon par Eurogentec, Belgique (syntaxe de commande : TAATGTCGTCACTGATGCTGCTTCTGGTGT 200 genomic [5'] biotin), en solution â 100pM dans de l'eau. L'ADN polymérase est une solution comportant 5U/pl d'activité ADN polymérase d'un mutant ayant perdu son activité exonuctease 3' du fragment de Klenow de l'ADN 25 polymérase I d'Escherichia coli (New England Biolabs, USA). Le mix tampon est une solution composée de 10 pl de tampon 10x Nebl (New England Biolabs, USA) 20 pl DMSO 29 - 3 pl d'une solution à 10mM d8dATP 10mM de dCTP, 10mM de dGTP et 10mM de dTTP(Finnzymes, Finlande) 67 pl d'eau PCR (Sigma Aldrich, USA) 5 Les mix amplificateurs 1 à 4sont placés à 370C. Après 1 heure, 10 pl du produit de réaction sont prelevés, mélangés à 2 pl d'une solution contenant du bleu de chargement (New England Biolabs, USA) contenant SYBr green et chargé sur gel d'agarose. Une image du gGl placé sur un bans-U!urninateurest reproduite figure 3. On y voit clairement qu'une bande correspondant au produit d'amplification est produite 10 uniquement quand le mix amplificateur est totalement formé, et absente quand le mix amplificateur est incomplet. La taille apparente de la bande est intermédiaire entre celle de l'amorce d'amplification et celle de la boucle amplifiable. Exemple 2 : Mise en évidence des produits d'amplification par hybridation sur un support 15 Une seconde expérience permet de mettre en évidence les produits d'amplification par hybridation sur un support comportant des acides nucléiques complémentaires aux produits d'amplification qui sont marqués par un groupement biotine présent sur l'amorce d'amplification. L'hybridation est révélée par 20 chimioluminescence après révélation par traitement à la streptavidine et à l'alkaline phophatase. Pour cela, on réalise unrnix amplificateur comprenant : - 1 pI de tampon 1Ox Neb 1 - 2 p!DMSO - 035 p!dNTPs 10mM - 0.35pl de l'amorce d'amplification ' 0.35 pi de boucle amplifiable ' 0.35 d'ADN po!yménase 6 pf d'eau. La provenance et la composition des réactifs est la mOrne que dans l'expérience précedente. 30 Après 1 heure d'incubation à 440C, la réaction est diluée par l'ajout de 400 pl d'une solution aqueuse, nommée �Solution Abis� composée de : - 3% SDS tampon sodium phosphate 25mM, pH 8.5, 5 - 75mMNacl (tous les réactifs: Sigma Aldrich, USA). Cette solution est utilisée pour recouvrir une membrane d'hybridation Nytran N (Schleicher &Schuell, USA) d'environ 1On x 2CO3 sur laquelle on a déposé et fixé par une 10 exposition de 40 secondes aux rayons ultra violet générés par un trans-illuminateur (VUtærLourmad : - 0.35 pl d'une solution lpM de l'oligonucléotide de séquence /*/C/u/C/G/*/C!C!o!G!C!/AC!8!8[AA{!üACGA[A/\!GTCCCG (SED ID N°3) 15 - 0.35 pl d'une solution 1pM de l'oligonucléotide de séquence GTAGTCCCAGTACGGTAGTGTCTCGCATGACATCTCACAGGATAAGACC (SEOIDv4) - 0.35 pl d'une solution 1pM de l'oligonucléotide de séquence 11AACTATACAATTGACGACAATGTCCCG (SEO ID N°5) 20 On notera que la séquence de la partie 3' du premier et du troisième ces oligonucléotides est identique à la séquence de la partie centrale du fragment amplifiable, alors que les parties 5' de ces oligonucléotides ainsi que le second oligonucléotide ne présentent pas d'homologie significative avec la séquence du fragment amplifiable. Après 30 minutes d'incubation, la membrane est retirée et placée successivement 25 pendant 5 minutes à chaque fois et sous agitation manuelle douce dans : - environ Zm!desolution Abis - 2 mi de solution Abis comportant également Z pl de streptavidine à 1 g/! - environ Zml de solution Abis 2rn de Solution Abs comportant également 2 p!d'a(ka!ine phoshphotase 30 ' 2 mi de solution Abis ' 1 ml de solution aqueuse comportant 40p1 de x CDP'sto/Assay bu[fer (25x) � 1 Mn/ de solution aqueuse comportant 48pi de 15 Exemple 3 : protocole possible pour la préparation des précurseurs : Des précurseurs de boucles amplifiables complexes peuvent être préparées en mélangeant une quantité nolaiæW des seconds acides nucléiques possédant une biotine 20 à leur extrémité 3' et dont l'extrémité S'est phosphorylé 5'phosphate avec une quantité molaire W de streptavidine et une deux quantités molaires W de biotine, en mélangeant une quantité molaire W des troisièmes acides nucléiques possédant une biCtineà leur extrémité 5' également avec une quantité molaire W de streptavidine et deux quantités molaires W de biotine, puis en mélangeant ces deux premiers mélanges en lui ajoutant 25 une quantité molaire W du premier acide nucléiques possédant une biotine à chacune de ses extrémités. Dans cette procédure, on prend soin d'ajouter dans les deux premiers mélanges les deux quantités molaires W de biotine afin d'obtenir majoritairement des constructions comportant une streptavidine, un seul des seconds ou troiséme acides nucléiques et deux biotines, ne laissant ainsi qu'un seul site de fixation à !æ streptavidine 30 disponible pour s'attacher à une extrémité du premier acide nucléique. Le mélange obtenu contient un mélange d'espèces moléculaires comportant rnajoritairement la construction attendue comportant un second ou un troisième acide nucléique, une skeptovidine, un premier acide nucléique, une streptavidin puis un troisième ou un second acide nucléique (2S1S2 deux 2S!53 +3SlS3' bien que seul !es2S!S3 soient actives mais 25153 sera aussi majoritaire). Cette dernière peut être séparée des constructions indésirables par exemple en les séparant par électrophorèse en gel d'agarose puis en les dégageant du gel par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, ou par exemple par une techniques de billes magnétiques dont la mise ne oeuvre pratique est bien connue de l'homme de l'art: en les capturant une première fois avec des billes magnétiques couvertes d'acides nucléiques complémentaire au second acide nucléique, en les séparant des billes magnétique, par exemple en portant le pH à 11.5 suivi d'une neutralisation du surnageant comportant les acides nucléiques, - en les capturant une seconde fois avec des billes magnétiques couvertes d'acides nucléiques complémentaires au troisième acide nucléique, en les séparant des billes magnétique, par exemple en portant le pH à 11.5 suivi d'une neutralisation du surnageant comportant les acides nucléiques. Certains aspects de l'invention enrichissent énormément le mécanisme d'amplification de base décrit plus haut, comme décrit dans la suite. En particulier, les gâchettes sont des acides nucléiques qui sont dessinés et dimensionnés de telle sorte qu'elles prennent la place des amorces d'amplification. Pour éviter qu'elles ne soient déplacées par l'amorce du fait de la respiration, on dimensionne les amorces de telle sorte que l'amorce comporte quelques nucléotides de moins que la partie 5' des gâchettes qui s'hybride au fragment amplifiable. La partie 3' des gâchettes n'est pas hybridée au fragment amplifiable, et de ce fait une gâchette ne se comporte pas comme une amorce. La gâchette bloque donc le mécanisme d'amplification. De préférence, l'extrémité 3' de la gâchette comprend un moyen empêchant le démarrage de la polymérisation à cette extrémité, par exemple quand le dernier nucléotide de l'extrémité 3' est un 2'3'-didesoxynucléotide. Pour débloquer ia gâchette, plusieurs mécanismes ont été conçus et constituent différents aspects de l'invention. Le premier consiste à fournir un acide nucléique dont la séquence de la partie 3` est complémentaire à celle de la partie 3' de la gâchette. En d'autres mots, il s'agit de fournir une amorce qui permet la synthèse d'un fragment complémentaire de la gâchette. Durant ce processus, la gâchette est séparée de la partie 3' du fragment amplifiable. Cela ]] permet à une amorce d'amplification de se fixer sur le fragment amplifiable et de démarrer l'amplification décrite plus haut. On comprend donc que le mécanisme d'amplification peut être démarré par des acides nucléiques dont la séquence est indépendante de celle de l'amorce d'amplification 5 et du fragment amplifiable. Ces amorces peuvent provenir d'acides nucléiques doubles brins moyennant un traitement enzymatique. Dans un des aspects de l'invention, des fragments d'ADN sont digérés par deux enzymes de restriction possédant des sites de reconnaissance différents, quand la première de ces enzyme de restriction peut produire des 10 protubérances 3' d'au moins 4 nucléotides de long et que la seconde ne produise pas de telles protubérances, suivi d'une digestion par une exonucléase qui digère par l'extrémité 3'/es brins d'ADN sous forme duplex. Les enzymes peuvent être par exemple Sph l e�A!u IeÉ!'exonudéaseIII. Un seul brin des fragments Sph Alu présente une protubérance 3' de 4 nucléotides. Celle-ci n'est pas digérée par l'exonucléase III alors que l'autre l'est, ce 15 qui fourni des fragments simple brin pouvant servir d'amorce. Comme les enzymes de restriction coupent à des positions prévisibles, chaque acide nucléique, par exemple de l'ADN génomique, mitochondriale ou viral, est transformé en acides nucléiques de séquences prévisibles. Connaissant la séquence des acides nucléiques d'intérêt, on peut évidement concevoir la séquence des gâchettes afin 20 que l'amplification soit déclenchée par les fragments issus de la préparation de l'acide nucléique d'intérêt. La séquence d'une gâchette comprend alors dans sa partie 3' la séquence complémentaire à la partie 3' de l'un des fragments issus de la préparation, alors que la séquence de la partie 5' est complémentaire à celle de la partie 3' du fragment amplificateur. 25 De préférence, cette partie 5' comprend 2 à 4 nucléotides de plus que les amorces amplificateurs, et est séparée de la partie 3' par 2 à 4 nucléotides essentiellement queyconqoes, par exemple la séquence TTl1, bien que !'on l'adapte au cos par cas au reste de la séquence de la gâchette afin d'éviter la formation de structures secondaires susceptibles d'interférer avec les proprieLës d'hybridation de la gàchette. On note la simplicite et l'efficacite du processus, car i! n'est pas nécessaire de réétudier des boucles amp!/6abiesspëcifiqucs propres a chaque acide nucléique d'intérêt. II suffit de dessiner un fragment simple brin de 40 à 50 nucléotides de long qui peut etre synthétise très facilement par les techniques de synthèse connues de Vhomme de l'art. 34 Une autre façon de libérer les boucles amplifiables de la présence de la gâchette, est de concevoir des gâchettes dont la séquence est totalement complémentaire à au moins une partie des fragments issus de la préparation des acides nucléiques. Afin d'éviter de devoir utiliser des boucles amplifiables spécifiques à chaque 5 fragment, il est avantageux de réserver cette approche aux gâchettes secondaires. On dessine donc une gâchette primaire dont la séquence de la partie 3' est partiellement ou totalement identique à la séquence de la partie centrale d'un des acides nucléiques issu de la préparation, et une gâchette secondaire dont la séquence de la partie centrale est complémentaire à la partie 3' de la gâchette primaire et dont les 10 séquences des parties 3' et 5' sont complémentaires aux séquences des parties æcUacenteSà la partie du fragment issu de la préparation qui a servi de base au dessin de la gâchette primaire. De cette façon, le fragment issu de la préparation peut s'hybrider totalement avec la gâchette secondaire, ce qui le détachera de la gâchette primaire. Afin de détacher 15 la gâchette primaire de la boucle amplifiable, on aura pris soin de rajouter un acide nucléique dont la séquence est complémentaire à la séquence ]'de la gâchette primaire, de sorte qu'elle puisse servir d'amorce et détacher la gâchette primaire débloquée comme décrit précédemment. Ce second mécanisme de déclenchement de l'amplification permet d'utiliser des 20 méthodes de préparation des acides nucléiques plus simples. Par exemple, on peut utiliser directement des ARN messager qui sont des acides nucléiques naturellement sous forme simple-brin. Par exemple, quand il s'agit d'acides nucléiques complexes tels les génomes de microorganismes ou eucaryotes, on peut simplement chauffer et refroidir rapidement les 25 acides nucléiques, ce qui permet de figer une grande partie des acides nucléiques sous forme simple brin. On peut également traiter les acides nucléiques avec un agent dénaturant qui est neutralisé rapidement, par exemple une solution à pH supérieur à 12.5, par exemple de la soude neutralisée par une solution acide, par exemple HCI. 30 On peut également digérer les acides nucléiques par une exonucléase qui digère par [extrémité 3' !es brins d'ADN sous forme duplex, par exemple !'exonodëase HI, ce qui conduira à /a formation d'acides nucléiques sous forme simple brin. Pour augmenter l'efficacité de ce traitement, il est utile de soumettre l'ADN en solution à des forces de cisaillement pour couper les fragments les plus longs. Cela peut être réalisé facilement en pipetant plusieurs fois de suite la solution avec les micro-pipettes utilisées couramment dans l'art. Un des aspects importants du mécanisme d'amplification de l'invention est de fournir des acides nucléiques sous forme simple brin. Ceux-ci peuvent bien entendu se comporter comme une amorce à leur tour. En particulier, ils peuvent servir d'amorce sur les gâchettes. En particulier quand le mix amplificateur réactionnel contient au moins une boucle bloquée, notée B2 dont la séquence de la partie 3' de la gâchette est la même que celle de la partie 5' du fragment amplifiable d'au moins une boucle amplifiable 10 distincte, notée B1, également contenue dans le mix amplifiable. Cette composition de mix amplificateur est très avantageuse quand les boucles B1 sont initialement bloquées et déblocables par des acides nucléiques préparés comme décrit plus haut. Quand le mix amplificateur comprend m molécules d'acides nucléiques susceptibles de débloquer B1, en début de réaction, m boucles B1 seront débloquées. 15 Chaque boucle B1 débloquée produira des acides nucléiques, notés S1, à partir du moment où elle aura été débloquée. Chaque acide nucléique S1 pourra débloquer une boucle B2, qui produira elle-même des acides nucléiques, notés S2, à partir du moment où elle aura été débloquée. En intégrant cette dynamique au cours du temps et en négligeant en première 20 approximation le temps nécessaire au déblocage des boucles B1, on obtient le nombre total d'acides nucléiques S2 produits au cours du temps, qui à partir d'un certain temps de réaction devient approximativement égal à : m/2 x (t/tau)^2 On constate que l'on obtient ainsi une amplification qui n'est plus linéaire avec le 25 temps, mais qui augmente comme le carré du temps, ce qui en pratique est beaucoup plus rapide. On comprend qu'il est tout à fait possible de chaîner plusieurs boucles bloquées pour obtenir une cinétique encore plus rapide, du type amplification polynomiale. Une cinétique exponentielle peut être obtenue quand le mix amplificateur 30 contient aussi au moins une boucle BI bloquée dont la séquence de la partie centrale de la gâchette est la même que celle de la partie 5' du fragment amplifiable de cette boucle bloquée. De plus, la séquence de la partie 3' de la gâchette peut être identique à celle de la partie 3' d'un fragment d'acide nucléique d'intérêt. De cette façon, la séquence du fragment amplifiable est indépendante de celle des fragments déclencheurs. 36 Cette composition de mix amplificateur est très avantageuse quand les boucles B1, initialement bloquées, sont débloquées par des acides nucléiques préparés comme décrit plus haut Quand le mix amplificateur comprend m molécules d'acides nucléiques susceptibles de débloquer B1, en début de réaction, m boucles BI seront débloquées. 5 Chaque boucle B1 débloquée produira des acides nucléiques, notés Si, à partir du moment où elle aura été débloquée. Chaque acide nucléique Si pourra débloquer une autre boucle bloquée B1, car la séquence de la partie ]'de Si est complémentaire à la partie centrale de la gâchette et peut donc servir d'amorce pour la débloquer. Le nombre de boucles débloquées augmentera donc approximativement de façon exponentielle après un certain temps de réaction, et par conséquent, également le nombre de fragments S1. Cette approche exponentielle présente les avantages et les inconvénients des amplifications exponentielles en général. Si elle permet d'obtenir beaucoup de signal en peu de temps et donc d'être avantageuse à des fins de détection de la présence ou de l'absence de l'acide nucléique déclencheur, il est en pratique difficile de déduire avec certitude la quantité d'acide nucléique déclencheur initialement présente à partir de la quantité d'acide nucléique produite au cours d'un intervalle de temps donné. De plus, la réaction est tellement rapide qu'elle peut épuiser le nombre de boucles bloquées au cours de la réaction, et donc fonctionner dans un mode tout ou rien, ce qui peut poser problème pour des fins de quantification mais qui peut être avantageux pour des fins de détection ou des fins de calcul moléculaire. I/ est par contre possible de tirer partie de la capacité de l'invention à permettre une amplification à la fois polynomiale et exponentielle en temps pour réaliser des applications combinées de dosage et de détection. En pratique, les méthodes de visualisation du nombre de molécules produites présentent un manque de linéarité. En effet, quand le signal est trop faible, il est masqué par le bruit de la mesure, quand le signal est trop fort, il sature l'instrument. Cela reste vrai pour une simple observation visuelle d'une coloration liée à la présence de molécules produites. De ce fait, si on réalise en parabole dans des récipients séparés ou au sein d'un même mélange, des amplifications à !a fois exponentielles et polynomiales d'ordre croissant, on peut tirer parti de l'effet de scuil pour disposer à la fois d'un test de la presence ou de l'absence des acides nucléiques ciblés et d'une évaluation du nombre de ces acides nucleiques. Dans la description précédente, l'amplification polynomiale ou exponentielle était déclenchée par des acides nucléiques débloquant des boucles amplifiables b/oquecs. I( 37 est évident que l'amplification démarre spontanément si on fournit des boucles non bloquées. Cet aspect est particulièrement intéressant si on utilise des boucles amplifiables présentant une affinité avec une substance. Par exemple, on peut utiliser des boucles amplifiables attachées à un anticorps. 5 Une façon simple de réaliser cela est d'utiliser des anticorps marqués avec une ou plusieurs biotines, et on y ajoute en proportion stoechiométrique des boucles amplifiables formées par exemple par de la streptavidine et des acides nucléiques modifiés à leur extrémité par des biotines. Tous ces composés sont disponibles commercialement. Il est clair que l'on obtient de la sorte des boucles amplifiables présentant une affinité avec une 10 substance, en fait celle qui est reconnue par l'anticorps. Il est donc facile de réaliser des tests de détection de la présence de substances, en particulier s'il s'agit de bactérie, de virus ou d'autres substances adsorbées ou déposées sur une surface, par exemple directement sur des objets comme une table d'opération ou des poignées de portes, ou sur des frottis réalises avec une languette en 15 matière plastique ou tout autre matériau adapté. {}n met alors en contact la surface avec une première solution, contenant un tampon (par exemple Tris-Hcl 5OmmM pH 7, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA), contenant les boucles amplifiables présentant une affinité avec les bactéries, virus ou substances à détecter. Après 1 à 5 minutes, cette première solution est rincée par une solution de 20 rinçage (par exemple Tris-Hel 5OmM pH 7, 10 mM NaCl). La solution de rinçage est éliminée en secouant la surface ou en y soufflant de l'air, puis on placera quelques micro-litres (par exemple 50)p! d'un rnixarnp!iOcateur. Le mix amplificateur peut comprendre une languette comportant des acides nucléiques identiques à la partie centrale et/ou 5' des boucles présentant une affinité (ou des boucles amplifiables secondaires utilisées 25 pour réaliser une amplification polynomiale ou exponentielle) attachés à sa surface, et les amorces d'amplification peuvent être marquées par une biotine ou un colorant, par exemple comme décrit dans Nuc!eicAcids Res. 2007;35(l0ee74, Après quelques minutes de réaction, la languette est retirée, rincée avec un tampon (par exemple Tris-Hel 50mM pH 7, 10 mM Na& et observee directement si des amorces d'amplification marquées aux 30 colorants ont été utilisées, Si des amorce marquées a la b/oiine ont été utilises, on peut procéder à une révélation de ces derniers en les mettant en contact, par exemple pendant 5 minutes avec une solution contenant des complexes strcptavidio alkaline phosphatase (SigmaAldrich) a une concentration de 100 pg//, suivi d'un rinçage (par exemple Tris-Hd 5OmNl pH 7, 10 mM NaCl), suivi d'une mise co contact avec une 38 Solution contenant du NB[-B(IP/ ' k] aldrich). Après environ 5 minutes, on peut rincer (par exemple Tris-Hel SOnnM pH 7, 10 mM Na[]) et observer la languette. Dans les deux cas de révélation, si une coloration apparait, on peut en déduire que la substance cible était présente sur la surface. On peut facilement multiplexer cette 5 procédure en utilisant plusieurs pluralités de boudes amnp!ifiab{cs présentant une affinité particulière, chaque pluralité ayant dans la partie centrale ou la partie 5' du fragment amplifiable une séquence particulière, et utiliser une languette comportant plusieurs zones distinctes sur chacune desquelles se trouve un acide nucléique de séquence identique à celle de chacune des parties centrale et 5' de chacune des pluralités de 10 boucle particulière. {}n peut également utiliser des systèmes de type � /atenæl flow � comme décrit dans Nucleic Acids R8s.2OU7;35(1O):e74. Un aspect intéressant de cette approche est qu'il n'est pas nécessaire de retirer les boudeSannp!ifiab!es de la surface comportant les substances d'affinité, contrairement à d'autres techniques bien connues de l'homme de l'art, par exemple les tests ELISA. 15 Cela permet de réaliser les tests sur des supports inédits, par exemple directement sur la peau, les cuirs, les tissus, les fourrures, etc.. Bien entendu, nous n'avons présenté ici qu'un exemple parmi un grand nombre de possibilités. Comme indiqué dans la description succincte, l'invention consiste aussi à combiner les différents aspects de l'invention telle que décrite pour répondre à un grand 20 nombre de problématiques rencontrés dans l'art. Une des applications intéressantes de l'invention consiste à réaliser des déterminations d'allèles sur des SNPS en utilisant les précurseurs !igab!esde type II (une approche analogue est possible avec les précurseurs ligables de type 1). On choisi alors les fragments dont les extrémités sont libres et dont l'extrémité 5' est phosphorillée de 25 telle sorte que leur séquence corresponde chacune à l'une des séquences adjacentes au SNP et que le dernier nucléotide de l'un des deux fragments soit identique à l'un ou à l'autre des allèles attendus. On met alors ces précurseurs en contact avec de l'ADN rendu simple brin par l'une des méthodes déjà décrite précédemment, dans une solution contenant une ADN ligase et son tampon approprié (par exemple 0.5 pl de T4 DNA !igoso 30 (NEB), 5 p/ de tampon !igose (Neb), 45 pt H20). Au bout de quelques minutes (par exemple 5 minutes) on inactive /o ligase en chauffant !æ solution a 65:C pendant 10 minutes ou en agitant la solution sur un agitateur orbitol de type Vortcx� avec une vitesse de rotation d'au moins 2000 tours/minute pendant au moins une minute. Puis on rajoutc la amorce amplificatrice, une ADN polymérase ainsi que les nucléotides et du 39 DM6O(par exemple, 7 pl DMSO grade, Sigma Aldrich), 10pl H20 (Sigma Aldrich), 0.5 pl d'ADN polymrase I d'E coli (NEB), 0.7 pl dNTP mix à 10 mM Dans ce processus, seuls les précurseurs dont la séquence des fragments 5 correspond totalement à l'allèle sont ligués et forment des boucles amplifiables. L'observation, par une des méthodes décrite dans l'invention, des produits d'amplification des boucles permet donc de déduire et/ou de quantifier la présence des allèles d'intérêt Les boucles bloquées permettent de définir des opérations logiques dont les signaux d'entrée sont réalisés par des acides nucléiques sous forme simple brin et les 10 signaux de sorties sont réalisés par les produits d'amplification des boucles qui ont été débloquées, directement ou indirectement, par les signaux d'entrée. Une des façons de réaliser l'opération logique �{}U� est d'utiliser un mix amplificateur comportant des boucles bloquées dont seules les parties 3' des gâchettes sont différentes. Les signaux d'entrée sont formés d'un mélange pouvant comporter des 15 acides nucléiques complémentaires à l'une et/ou à l'autre des parties 3' des gâchettes. Il est également possible d'utiliser une seule gâchette dont la séquence de la partie 3' comporte les séquences complémentaires des deux acides nucléiques réalisant les signaux d'entrée. Le signal de sortie est réalisé par les acides nucléiques produits par les boucles débloquées. 20 Une des façons de réaliser l'opération logique ET est d'utiliser un mix amplificateur comportant des boucles bloquées par des gâchettes primaires elles-mêmes bloquées par des gâchettes secondaires. Ces boucles ne seront débloquées que par la présence simultanée des deux acides nucléiques réalisant le signal d'entrée, le premier étant complémentaire à la partie 3' de la gâchette primaire et qui est bloquée par la 25 gâchette secondaire, le second étant complémentaire à la partie 3' de la gâchette secondaire. Le signal de sortie est réalisé par les acides nucléiques produits par les boucles débloquées. Une des façons de réaliser l'opération ET NON est d'utiliser un rnlx amplificateur comportant trois boucles bloquees. 30 La séquence de la partie 3' de gâchette de première boucle est complémentaire à la séquence du premier acide nucléique (A) formant les signaux d'entrée, et la séquence de la partie 5' de la première boucle cst Identique à la séquence de la partie 3' de la gâchette de la troisième boucle. 40 La séquence de la partie 3' de la gâchette de la seconde boucle est complémentaire à la séquence du second acide nucléique (B) formant les signaux d'entrée, et la séquence de la partie centrale de la seconde boucle est identique à la séquence de la partie 3' de la gâchette de la troisième boucle. 5 Ainsi, les fragments d'ADN produits par la seconde boucle, si elle est débloquée par l'un des signaux d'entrée, forment des gâchettes secondaires qui vont bloquer la gâchette primaire de la troisième boucle bloquée, qui ne peut plus être débloquée par les acides nucléiques produits par la première boucle. Le signal de sortie est réalisé par les produits d'amplification de la troisième boucle. Cette combinaison de boucle forme une 10 bascule logique ou mémoire. L'écriture ou stockage de l'information se fait par le second acide nucléique /8\, la lecture par le premier acide nucléique (A), et un 3em� acide nucléique identique à la partie 5' de la seconde boucle permet de régénérer la mémoire. Par analogie avec les calculateurs à base de portes logiques électroniques, ces trois opérations permettent de définir toute les fonctions logiques nécessaires à la 15 réalisation d'un calculateur en enchaînant les opérations à l'intérieur d'un même mix amplificateur ou par l'intermédiaire d'un réseau de compartiments reliés entre eux par des canaux, en particulier si les boucles sont immobilisées sur les surfaces des compartiments par l'intermédiaire de leur liaison de boucle. Selon un mode de réalisation, une partie au moins du réseau de compartiments 70 et de canaux est formé par la structure poreuse d'une matière, par exemple un gel d'agarose ou de po/yaory!emide, et une partie au moins des boucles amplifiables et de acides nucléiques sont immobilisés sur la matière poreuse. Une des particularités de la présente invention dans le cadre du calcul moléculaire est de pouvoir réaliser très simplement un système générant des impulsions 25 de molécules. Une des façons de réaliser des impulsions est d'utiliser un mix amplificateur comportant deux boucles. La séquence de la partie 3' de la gâchette de la première bouche est complernentaire a la séquence de ('acide nucléique formant le signal déclencheur de ~(} l'impulsion, et la séquence de (a partie 5' de la pren/iere boucle es Identique à la séquence de la partie 3' de la seconde boucle. La séquence de la partie centrale de fa seconde boucle est Identique la séquence de la partie 3' de la première boucle et la séquence de la partie 5' de la seconde boucle est identique à la séquence de la partle 3' de l'acide nucléique 41 déclencheur de l'impulsion. Le mix amplificateur peut comporter également des acides nucléiques dont la seule la séquence centrale est complémentaire à la séquence centrale des secondes boucles, et de préférence, ces acides nucléiques sont attachées aux liaisons de boucle des secondes boucles par une de leur extrémités. 5 Ainsi, les produits d'amplification de la première boucle se comportent comme des amorces d'amplification des secondes boucles. Les fragments d'ADN ainsi produits par la seconde boucle forment des gâchettes qui vont re-bloquer la première boucle. Ce processus de reblocage n'est pas instantané, et durant un certain intervalle de temps, mais uniquement durant cet intervalle de temps, les premières boucles débloquées 10 généreront des produits d'amplification qui constitueront l'impulsion. La durée de l'impulsion est également modulée par la quantité d'acide nucléique déclencheur. L'aspect génération d'impulsion de l'invention permet de concevoir des systèmes séquentiels de traitement de l'information et non pas uniquement parallèles comme dans les réalisations de calcul moléculaire connues de l'homme de l'art à ce jour. Bien entendu, 15 l'invention permet aussi de paralléliser le traitement séquentiel des informations. Une des façons de réaliser une opération d'expansion de signal est d'utiliser un mix amplificateur comportant une pluralité de boucles différentes dans leur partie centrale et 5', mais qui sont bloquées par la même gâchette. Ainsi des acides nucléiques dont la séquence de la partie 3' est identique peuvent déclencher la production d'une 20 pluralité d'acides nucléiques différents. Une des façons de réaliser un amplificateur opérationnel est d'utiliser un mix amplificateur comportant deux boucles bloquées et deux amorces d'amplification distinctes propres à chacune des boucles. La séquence de la partie centrale de la première boucle est identique à la 25 séquence de la partie 3' de la seconde boucle et la séquence de la partie 5' de la première boucle est complémentaire à la séquence de la partie 3' de la gâchette de la seconde boucle bloquée. La sequence de la partie centrale de la seconde boucle est identique à la séquence de la partie 3' de la première boude et la sequence de !a partie 5' de la 30 seconde boucle est complémentaire à la séquencc de la partie 3' de la gâchette de la premlere boucle bloquée. Chaque boucle peut comporter également un acide nucléique dont seul la partie centrale est complémentaire à la partie centrale du fragment amplificateur et qui est attaché ~ !d liaison d~ boucle par une de ses extrémités. Ces acides nudéiquce permettent de contrôler les hybridations non souhaitées des amorces d'amplification sur les parties centrales des fragments amplifiables, Pour cela, leur partie centrale dont la séquence est complémentaire à la partie centrale des fragments amplifiables peut comporte 2 à 4 nucléotides de plus que les amorces d'amplification. Une des façons de réaliser une telle boucle est d'utiliser un fragment amplifiable comportant une biotine à chacune de ses extrémités, et deux acides nucléiques comportant chacun une biotine à l'une de leur extrémité. Ces 3 fragments sont mélangé à de la streptavidine qui est une protéine qui permet de lier simultanément 4 biotines. Ainsi, les acides nucléiques produits par l'une des boucles constituent des gâchettes de l'autre boucle. Le niveau d'amplification de l'une des boucles est donc modulé positivement par le flux d'acides nucléiques de ses propres déclencheurs et modulé négativement par le flux d'acides nucléiques déclencheurs de la seconde boucle. Le signal de sortie est réalisé par les acides nucléiques produits par l'un ou par l'autre des boucles amplifiables. On comprend que les boucles de l'invention peuvent être vues comme des � transistors bio-moléculaires � que l'on peut combiner d'une infinité de façon de manière à réaliser des circuits produisant les fonctionnalités recherchées, que ce soit à des fins analytiques ou à des fins de calcul.