Brevet FR2946536A1 — publié le 20101217

UTILISATION D'UNE SOUCHE ATTENUEE DE MYXOMA VIRUS COMME ONCOLYTIQUE La présente invention est relative à l'utilisation d'une souche atténuée vaccinale de Myxoma virus comme agent oncolytique. Un virus oncolytique est un virus qui lyse préférentiellement les cellules cancéreuses, tout en n'ayant que peu d'effet sur les cellules non cancéreuses. La virothérapie oncolytique constitue une approche thérapeutique intéressante pour compléter l'arsenal des thérapies anticancéreuses disponibles. Le virus de la myxomatose (MYXV) également dénommé Myxoma virus, appartient au genre Leporipoxvirus dans la famille des Poxviridae. Il est l'agent responsable de la myxomatose, une maladie infectieuse majeure chez le lapin européen, et endémique en Europe. Ce virus présente un spectre d'hôte étroit et n'est pas pathogène pour l'Homme. La séquence complète du génome de la souche Lausanne du MYXV (souche pathogène de référence) est connue (CAMERON et al., Virology, 264, 298-318, 1999 ; GenBank NC 001132). Ce génome est constitué d'une molécule linéaire d'ADN bicaténaire d'environ 162 kpb. Il contient une région centrale fortement conservée dans la famille des Poxviridae, contenant les gènes essentiels à la réplication virale, encadrée par des zones plus variables contenant des genes dits de virulence, et deux répétitions inversées terminales (RIT) de 11,5 kbp. Il comprend au total 170 cadres de lecture ouverts dont 12 sont présents en double copie dans les RIT. Certaines des protéines codées par ces 12 cadres de lecture ont été identifiées comme constituant des facteurs de virulence, interférant avec les défenses immunitaires de l'hôte. On citera notamment la serpine Serpl, décrite comme possédant des propriétés inhibitrices de la réponse inflammatoire et de l'activation du complément ; les virocepteurs M-T1, M-T2, et M-T7, décrits comme interférant avec des chimiokines impliquées dans la réponse antivirale : CC-chimiokines dans le cas de M-T1, TNF dans le cas de M-T2, et l'IFN-gamma dans celui de M-T7 ; les protéines M-T2, MT4, et MT5, qui constitueraient des inhibiteurs de l'apoptose des cellules infectées. Malgré sa grande spécificité d'hôte, il a été montré que le MYXV pouvait infecter de façon productive un grande variété de cellules tumorales in vitro (SYPULA et al., Gen Ther Mol Biol, 8, 103-114, 2004), et qu'il présentait une activité oncolytique dans les cellules d'adénocarcinome pancréatique humain in vitro (WOO et al., Ann Surg Oncol, 15, 2329-35, 2008), et dans des modèles murins de gliomes, de médulloblastomes et de tumeurs rhabdoïdes humaines in vivo Lun (LUN et al., Cancer Res, 65, 9982-90, 2005; LUN et al., Cancer Res, 67, 8818-27, 2007 ; WU et al., Clin Cancer Res, 14, 1218-27, 2008). Il a ainsi été proposé de l'utiliser comme agent oncolytique (Demande PCT W02004/078206). La Demande PCT W02007/143548 rapporte que l'inactivation de certains gènes de Myxoma virus codant pour des protéines impliquées dans le tropisme cellulaire vis-à-vis des cellules de lapin (Ml IL, M063, M135, M136, M-T2, M-T4, M-T5 et M-T7) a des effets variables sur la capacité des Myxoma virus déficients pour ces gènes à infecter et tuer des cellules de gliome humain, et propose l'utilisation de Myxoma virus déficients pour l'un des gènes codant pour M1 IL, M063, M136, M-T4 ou M-T7 pour le traitement du cancer, notamment du gliome. Il a été rapporté que la permissivité des cellules tumorales humaines à l'infection par un Myxoma virus était liée d'une part au niveau d'activation de la sérine/thréonine kinase Akt-i/PKB dans la cellule tumorale, et d'autre part à l'expression chez le virus d'une protéine M-T5 fonctionnelle, qui est capable d'induire la phosphorylation et l'activation d'Akt-l/PKB. On peut ainsi distinguer 3 types de cellules tumorales : chez les cellules de type I, Akt-1/PKB est fortement activée de manière constitutive, et ces cellules sont permissives à l'infection par un Myxoma virus même si celui-ci n'exprime pas M-T5 ; chez les cellules de type II, le niveau basal d'activation Akt-1/PKB est faible, mais elle est activée par l'interaction avec M-T5 : ces cellules ne sont permissives qu'aux Myxoma virus exprimant M-T5 ; enfin, chez les cellules de type III, le niveau basal d'activation Akt-1/PKB est également faible, et elle n'est pas activée par M-T5 : ces cellules ne sont pas permissives aux Myxoma virus . Le traitement de cellules tumorales non permissives avec un agent capable d'augmenter l'activation d'Akt-1/PKB, tel que la rapamycine, permet d'améliorer grandement leur sensibilité à l'infection par les Myxoma virus (STANFORD & MCFADDEN, Expert Opin Biol Ther, 7, 1415-25, 2007 ; LUN et al., Cancer Res, 67, 8818-27, 2007). Les Inventeurs ont maintenant constaté qu'une souche atténuée vaccinale de Myxoma virus , la souche SG33, se répliquait plus efficacement et diffusait mieux dans les cellules tumorales, et possédait une activité oncolytique supérieure et un spectre d'action plus large qu'une souche sauvage telle que la souche Lausanne. La souche SG33 (CNCM I-1594) est décrite notamment dans le Brevet FR 2736358. Cette souche contient une délétion d'environ 15 kb dans la partie droite de son génome. Les gènes affectés par cette délétion sont listés dans le tableau I ci-après : Tableau I Nom du Position sur Produit Fonction putative/homologues gène le génome a (numéro d'accès GenBank)a connus M151R 146684- Serp2 (NP_051864) Serpine/SPI 2 du virus de la 147685 vaccine M152R 147688- Serp3 (NP_051865) Serpine 148488 M153R 148526- M153R/MV-Lap (NP_051866) Scrapine 149146 M154L 149883- gpl20-Iike (NP_051868) Fonction inconnue/M2 du virus de 149239 la vaccine M156R 149997- M156R (NP_051869) Résistance aux IFNs/K3L du virus 150305 de la vaccine ; elF2 alpha M008.1R 150313- Serp1 (NP_051870) Serpine 151422 M008R 151400- M-T8 (NP_051871) Protéine à motif Kelch/A55R du 152947 virus de la vaccine M007R 152998- M-T7 (NP_051872) Récepteur IFN-gamma/B8R du 153789 virus de la vaccine M006R 153826- M-T6 (NP_051873) Protéine à motif Kelch/A55R du 155355 virus de la vaccine M005R 155391- M-T5 (NP_051874) Protéine à motif ankyrine/B4R du 156842 virus de la vaccine M004.1R 156862- M4.1 (NP_051875) Fonction inconnue/C2L du virus 157134 swinepox M004R 157138- M-T4 (NP_051876) Facteur de virulence/B9R du virus 157851 de la vaccine M003.2R 158084- M3.2 (NP_051877) Fonction inconnue/T3C des 158425 capripoxvirus M003.1R 158495- m3.1L/R (NP_051878) Fonction inconnue/B15R du virus 158950 de la vaccine M002R 159129- M-T2 (NP_051879) Récepteur soluble du TNF 160109 alpha/B28R du virus de la vaccine M001 R 160189- M-T1 (NP_051880) Protéine liant les chimiokines/B29R 160971 du virus de la vaccine a Les positions sur le génome et les numéros d'accès GenBank sont ceux des gènes et protéines correspondants chez la souche de référence Lausanne. Les gènes M151R et M001 R ne sont que partiellement délétés, donnant lieu à des protéines tronquées inactives. Les gènes M152R, M153R, M154L, M156R, ainsi que les gènes de l'ITR droite M008.1R, M008R, M007R, M006R, M005R, M004.1R, M004R, M003.2R, M003.1R, et M002R sont complètement délétés, et les protéines correspondantes sont donc absentes. La présente invention a pour objet un Myxoma virus atténué chez 10 lequel les gènes M151R, M152R, M153R, M154L, M156R, et M001R sont inactivés, pour l'utilisation comme médicament oncolytique. Selon un mode de réalisation préféré d'un Myxoma virus atténué conforme à l'invention, un ou plusieurs des gènes M008.1R, M008R, M007R, M006R, M005R, M004.1R, M004R, M003.2R, M003.1 R, et M002R dudit Myxoma virus est 15 (sont) en outre inactivé(s). Selon une modalité avantageuse de ce mode de réalisation, ledit Myxoma virus est le virus SG33 (CNCM I-1594). L'utilisation d'un Myxoma virus conformément à l'invention est particulièrement avantageuse dans le cadre du traitement de cancers colorectaux, pancréatiques et ovariens, et notamment dans le cadre du traitement de cancers colorectaux. Avantageusement, pour la mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser un Myxoma virus atténué modifié exprimant un gène d'intérêt (par exemple un gene thérapeutique de type Thymidine kinase d'herpes virus, ou FCUI, produit de la fusion entre les gènes codant pour la Cytosine désaminase et l'Uracile phosphoribosyltransférase) (ERBS et al, Cancer Gene Therapy, 15, 18-28, 2008). Des Myxoma virus atténués modifiés pour exprimer un gène d'intérêt sont par exemple décrits dans le Brevet FR 2736358. Les Myxoma virus atténués utilisés conformément à la présente invention peuvent être administrés localement, par injection intra-tumorale. Il peuvent également être administrés par voie générale, notamment intra-veineuse; en effet, le fait qu'ils présentent une meilleure diffusion au sein de cultures de cellules tumorales in vitro et une meilleure efficacité oncolytique à faible multiplicité d'infection que le Myxoma virus sauvage, peut permettre de limiter les conséquences de la perte de particules virales avant l'atteinte de la zone tumorale cible. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les propriétés du Myxoma virus SG33, comparées à celles d'une souche sauvage de Myxoma virus . EXEMPLE 1 : COMPARAISON DE L'EFFICACITE DE REPLICATION DE LA SOUCHE SG33 ET DE LA SOUCHE SAUVAGE TOULOUSE 1 EN CELLULES TUMORALES HUMAINES. La souche SG33 est une souche de Myxoma virus atténuée par passages en série sur culture cellulaire ; la souche TOULOUSE 1 est une souche virulente classique de Myxoma virus, équivalente à la souche de référence LAUSANNE. Les souches SG33 et TOULOUSE 1 sont décrites dans le Brevet FR 2736358, et ont été respectivement déposées auprès de la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) sous les numéros I-1594 et I-1592. Les lignées de cellules tumorales humaines utilisées sont listées dans le Tableau II ci-dessous. Tableau II Lignée Collection de Type cellulaire Niveau Référence cellulaire reference basal (activation d'Akt) (dénomination) d'activation d'Akt RK-13 ATCC (CCL-37) Cellules de rein de lapin - - HUV-EC-C ATCC (CRL-1730) Cellules endothéliales - - humaines normales HCT-116 ATCC (CCL-247) Adénocarcinome élevé 1, 2 colorectal humain Caco-2 ATCC (HTB-37) Adénocarcinome élevé 2 colorectal humain PANC-1 ATCC (CRL-1469) Adénocarcinome élevé 3, 4 pancréatique humain Capan-2 ATCC (HTB-80) Adénocarcinome élevé 3, 4 pancréatique humain SK-OV-3 ATCC (HTB-77) Adénocarcinome élevé 5 ovarien humain OV-CAR-5 NCI60 (OV-CAR-5) Adénocarcinome faible 5 ovarien humain ATCC: American type Culture Collection NCI60: Collection de 60 lignées cellulaires tumorales de l'Institut national du cancer des États- Unis (1) WANG et al., PNAS, 103, 4640-5, 2006; (2) SHIMIZU et al, Clin Cancer Res. 11, 2735-46, 2005. ; (3) BONDAR et al, Mol Cancer Therap, 12, 989-97, 2002; (4) WOO et al, Ann Surg Oncol, 15, 2329-35, 2008 ; (5) ALTOMARE et al, Oncogene, 23, 5853-7, 2004. Chaque lignée cellulaire (1,2x106 cellules) a été infectée par les souches Toulouse 1 ou SG33 à une M.O.I. (multiplicité d'infection) de 3 (adsorption 90 minutes à 4°C, puis incubation à 37°C, en atmosphère à 5% de CO2) puis la production virale a été mesurée 4, 12, 24 et 48 heures post-infection. Pour cela, à chaque point de cinétique, les cellules ont été congelées, puis ont subi trois cycles de congélation-décongélation, et le surnageant appliqué sur cellules RK13 pour titrage par la méthode des plages. L'efficacité de réplication est déterminée par le rapport entre le titre viral initial, immédiatement après l'adsorption à 4°C (TO) et le titre viral 48 heures post- infection (T48). Les résultats (rapport T48/T0) obtenus à partir des courbes de titrage (réalisées en triplicat) sont représentés dans le Tableau III ci-dessous. Tableau III Lignée cellulaire Infection Toulouse 1 Infection SG33 RK-13 54,81 92,59 HUV-EC-C 0.22 2 HCT-116 1,15 17,13 Caco-2 2,71 30,36 PANC-1 3,67 4,33 Capan-2 3,96 5,28 SK-OV-3 3,34 5,71 OV-CAR-5 4,71 23,36 Les résultats obtenus à partir des courbes de titrage (réalisées en triplicat) montrent que la souche SG33 possède une capacité multiplicative supérieure, se manifestant par un rendement significativement meilleur. Des expériences d'adsorption ont en outre été effectuées sur les lignées cellulaires RK-13, HCT-116, Caco-2, PANC-1, Capan-2, SK-OV-3, et OVCAR-5. 106 cellules ont été infectées à M.O.I. de 5 par l'un ou l'autre des virus (Toulouse 1 ou SG33) à 4°C, puis lavées deux fois avant d'être congelées et de subir trois cycles de congélation-décongélation. Les virus adsorbés sont ensuite titrés sur cellules RK13. Les résultats représentant la moyenne de trois expériences indépendantes, sont illustrés par la Figure 1. En abscisse : souches testées ; en ordonnée : titre viral ; T1= Toulouse 1 ; SG= SG33 ; input= quantité théorique de virus dans chaque inoculum. Ces résultats montrent que la souche SG33 s'adsorbe plus 15 efficacement que la souche Toulouse 1 sur la totalité des lignées cellulaires testées. EXEMPLE 2: COMPARAISON DES CINETIQUES DE DIFFUSION DES VIRUS TOULOUSE 1 ET SG33 EXPRIMANT LA BETA-GALACTOSIDASE. Afin de suivre la diffusion virale au sein des tapis cellulaires infectés, des virus Toulouse 1 et SG33 exprimant la Béta-galactosidase, après insertion du gène Lac Z, 20 sous la dépendance d'un promoteur poxviral, dans le locus TK des genomes viraux (BERTAGNOLI et al., 1996, J.Virol., 70(8):5061-6) ont été utilisés. Chaque lignée cellulaire (lignées tumorales HCT-116, PANC-1, et SK-OV-3, et lignées témoins HUV-EC-C et RK13), à 90-95 % de confluence, a été infectée à une M.O.I. de 0,00005 et le nombre de foyers viraux (colorés en bleu) par 25 cupule (106 cellules) a été compté à 24, 48, 72, et 96 heures post-infection (réalisé en triplicat), après fixation des cupules correspondantes et application d'une couche d'agar contenant du X-Gal. Les résultats sont illustrés par la Figure 2. (Toulousel :graphique A ; SG33 : graphique B). En abscisse : temps après infection ; en ordonnée : Unité Formant 30 Foyers (FFU : Foci Forming Unit) pour 106 cellules . Ces résultats montrent que la souche SG33 diffuse plus efficacement dès 24 post-infection que la souche Toulouse 1 pour l'ensemble des cellules testées (p Ces résultats montrent que le pourcentage de survie cellulaire est significativement différent après infection par SG33 comparée à l'infection par Toulouse 1, pour les cellules HCT-116, Caco-2, Panc-1 et SK-OV-3 (p REVENDICATIONS1) Myxoma virus atténué chez lequel les gènes M151R, M152R, M153R, M154L, M156R, et MOO1R sont inactivés, pour l'utilisation comme médicament oncolytique. 2) Myxoma virus atténué pour l'utilisation comme médicament oncolytique selon la revendication 1, caractérisé en ce que un ou plusieurs des gènes M008.1 R, M008R, M007R, M006R, M005R, M004.1 R, M004R, M003.2R, M003.1 R, et M002R, dudit Myxoma virus est (sont) en outre inactivé(s). 3) Myxoma virus atténué pour l'utilisation comme médicament oncolytique selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit Myxoma virus est le virus SG33 (CNCM I-1594).