Brevet FR2937153A1 — publié le 20100416

La présente invention concerne un dispositif pour la visualisation en trois dimensions en microscopie ainsi qu'un procédé de visualisation utilisant un tel dispositif. Le domaine de la présente invention est la microscopie de fluorescence en champ large permettant d'obtenir des informations tridimensionnelles concernant l'objet, ou la cellule, observé. En biologie cellulaire, pour réaliser une image en trois dimensions, il est connu d'utiliser la microscopie confocale de fluorescence. Cette technique permet de visualiser un échantillon suivant des tranches d'épaisseurs contrôlées (de l'ordre du micromètre) avec une résolution généralement de l'ordre de 0,5 �m. Elle est utilisée pour l'imagerie tridimensionnelle en s'appuyant sur un découpage de l'échantillon en tranches régulièrement espacées. Il convient alors de réaliser le nombre nécessaire de prises de vues. À chaque fois, l'objet observé est exposé avec un rayon laser. Un premier inconvénient de cette technique est qu'il convient de réaliser plusieurs prises de vue pour obtenir une vue tridimensionnelle, ce qui limite la cadence d'acquisition. Lorsqu'on souhaite augmenter la résolution, il convient d'augmenter le nombre de prises de vues et donc de limiter encore la cadence d'acquisition. Dans le cas d'observation de cellules, celles-ci sont à chaque fois soumises à un rayonnement laser qui peut les endommager. En outre, dans le domaine de la microscopie de fluorescence, compte tenu des prises de vue multiples, une dose d'éclairement importante est imposée et est associée à une usure des fluorophores, ce qui est connu sous le nom de phénomène de photoblanchiement. Enfin, le matériel utilisé pour réaliser de telles images en trois dimensions est un matériel onéreux. Il convient en outre de réaliser un calibrage lors des prises de vues, ce qui rend le procédé également onéreux. D'autres techniques sont également connues pour obtenir une visualisation en trois dimensions en microscopie. II est connu ainsi par exemple de déplacer l'objet observé de manière à réaliser un balayage. L'image est ensuite reconstituée. On retrouve ici aussi des problèmes de cadence d'acquisition. Une troisième technique, la stéréovision, utilise deux ou plusieurs dispositif de prise de vue pour visualiser sous des angles différents un même objet. Les images sont alors analysées à l'aide de logiciels afin de fournir la troisième dimension. La présente invention a alors pour but de fournir un dispositif ûet un procédé associéû permettant de facilement réaliser une visualisation en trois dimensions en microscopie. De préférence, le matériel mis en oeuvre sera d'un prix de revient limité. Avantageusement, ce dispositif et le procédé associé permettront une cadence d'acquisition suffisante pour permettre de suivre une trajectoire d'un objet observé. De préférence également, la mise en oeuvre de la présente invention pour l'observation d'une cellule n'endommagera pas, ou le moins possible, la cellule observée. À cet effet, la présente invention propose un dispositif pour la visualisation en trois dimensions en microscopie qui, selon la présente invention, comporte un support présentant une face sensiblement plane dans laquelle sont réalisés des sillons, et la surface des sillons est réfléchissante de manière à former un miroir, un objet à visualiser étant destiné à venir prendre place dans un sillon. De cette manière, un objet disposé dans un sillon se trouve face à deux faces réfléchissantes. En observant l'objet et ses reflets, par exemple sur une prise de vue en deux dimensions telle une photo classique, on observe l'objet vu sous des angles différents. En outre, la position des reflets par rapport à l'objet lui-même sur la prise de vue permet de déterminer la position de l'objet dans un plan perpendiculaire au plan de la prise de vue. Un reconstruction tridimensionnelle peut ainsi être envisagée. II suffit de connaître la géométrie du support, qui est fixe, pour déterminer la troisième dimension. Dans une forme de réalisation préférée, ladite face du support comporte un ensemble de sillons parallèles espacés selon un pas prédéterminé. On obtient ainsi une orientation privilégiée donnée par l'axe longitudinal des sillons. Les sillons sont de préférence des sillons en V. Ainsi, les miroirs réalisés sont des miroirs plans et les calculs à réaliser pour faire une reconstruction en trois dimensions sont plus faciles et plus fiables. Avantageusement, l'angle formé entre une paroi d'un sillon et la face plane est d'environ 54°. On peut par exemple prévoir un angle compris entre 52 et 56°. II a été remarqué lors d'essais réalisés en laboratoire que cet angle donnait des résultats plus précis. Pour réaliser les surfaces réfléchissantes, une forme de réalisation avantageuse prévoit que les sillons sont recouverts d'une couche d'un métal choisi dans l'ensemble comportant l'or, l'argent, le platine et l'aluminium. De tels métaux sont d'une part faciles à déposer en couche mince et d'autre part permettent d'obtenir un miroir de bonne qualité. L'invention est plus particulièrement destinée à l'observation d'objets dont la taille est de l'ordre du micromètre (1 �m = 10"6 m). Les sillons présentent alors par exemple une largeur comprise entre 2 �m (soit 2 10"6 m) et 100 �m et présentent une longueur comprise entre 2�m et 0,01 m. Le support est avantageusement réalisé en silicium. Ce matériau permet de réaliser les sillons par gravure humide. Ce procédé, et ce matériau, permettent d'obtenir des supports avec une géométrie bien définie à un prix de revient intéressant. La présente invention concerne également un dispositif pour la visualisation en microscopie et en trois dimensions comportant un microscope, une lamelle de microscope et des moyens de prise de vues associés au microscope, caractérisé en ce qu'un dispositif tel que décrit plus haut est fixé sur la lamelle de microscope, et en ce que les moyens de prise de vues sont reliés à un dispositif de traitement d'images permettant de restituer des images en trois dimensions à partir d'une image reçue et comportant d'une part l'image de l'objet à observer et d'autre part ses reflets dans le sillon correspondant. Dans un tel dispositif pour la visualisation en microscopie et en trois dimensions, les moyens de traitement d'images sont par exemple intégrés dans un micro-ordinateur présentant un écran de visualisation, sur lequel il est alors possible de restituer une image tridimensionnelle. Enfin la présente invention concerne aussi un procédé de visualisation en microscopie d'un objet en trois dimensions. Selon l'invention, ce procédé comporte les étapes suivantes : - mise en place de l'objet à observer dans un sillon réalisé sur un support et présentant une surface concave réfléchissante, - prise de vue à travers un microscope de l'objet observé, et de ses reflets sur la surface réfléchissante du sillon, - analyse de l'image de l'objet et de ses reflets afin de construire une image tridimensionnelle de l'objet à observer. Des détails et avantages de la présente invention ressortiront mieux de la description qui suit, faite en référence aux dessins schématiques annexés sur lesquels : La figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif pour la visualisation microscopique en trois dimensions selon la présente invention, Les figures 2a à 2d illustrent schématiquement un procédé permettant l'obtention du dispositif de la figure 1, La figure 3 est un schéma de principe pour une application de la présente invention, et La figure 4 est un schéma à partir duquel peuvent être réalisés des calculs pour la construction d'une image tridimensionnelle à partir d'une image 2D d'un objet à observer et de ses reflets. La figure 1 montre une forme de réalisation préférée d'un dispositif utilisé pour une visualisation en trois dimensions en microscopie selon la présente invention. Sur cette figure, on reconnaît une plaque 2. Celle-ci est destinée à servir de support pour des objets à observer. Cette plaque est par exemple de forme rectangulaire et présente une épaisseur très faible par rapport à sa longueur et sa largeur. Elle présente ainsi deux faces principales. On supposera, dans la suite de la description, que cette plaque est disposée à l'horizontale. Elle présente ainsi une face supérieure 4 et une face inférieure parallèle à la face supérieure. La figure 1 représente à échelle agrandie une partie de la face supérieure 4 de la plaque 2. La face supérieure 4 de la plaque 2 est sensiblement plane et on remarque des sillons 6 creusés dans cette face supérieure 4. Dans la forme de réalisation préférée représentée sur cette figure, chaque sillon 6 présente une forme en V. Les sillons 6 sont disposés parallèlement les uns aux autres avec un pas régulier. D'autres formes de sillons et d'autres dispositions des sillons pourraient être envisagées. Pour donner une indication sur les dimensions des sillons 6, on a représenté sur la figure 1 une barre d'échelle 8 qui correspond à 400 �m. Cette barre d'échelle 8 est donnée à titre simplement illustratif et nullement limitatif. Ainsi, à titre d'exemple, la largeur d'un sillon est par exemple comprise entre 2 et 100 �m tandis que la longueur d'un sillon est par exemple comprise entre 2�m et 1 cm. Le pas séparant deux sillons 6 peut être ajusté en fonction des objets à observer. Chaque sillon 6 présente deux facettes 10, chaque facette 10 correspondant à une branche du V. Ainsi, une facette 10 rejoint la face supérieure 4 de la plaque 2 au fond 12 du sillon 6 correspondant. Chaque facette 10 d'un sillon 6 est recouverte d'un matériau réfléchissant. Il s'agit ici de préférence d'un métal qui peut être déposé en très fine couche. Les métaux utilisés peuvent être par exemple de l'or, du platine, de l'aluminium ou de l'argent. Le dépôt est réalisé sur les facettes 10 de manière à obtenir des facettes réfléchissantes. Ces facettes 10 forment ainsi des "micro-miroirs" dont la géométrie est parfaitement contrôlée. Les figures 2a à 2d illustrent la réalisation de sillons 6 sur une face d'une plaque 2. Dans la forme de réalisation préférée décrite ici et illustrée sur la figure 2, la plaque 2 est réalisée en silicium. Une résine 14 est enduite et traitée suivant des motifs de dimensions déterminées. Ces motifs sont transférés sur une couche 16 de nitrure se trouvant sur le silicium. Un traitement par gravure humide (par action de potasse par exemple) est réalisé sur le silicium et on obtient alors des sillons comme représenté sur la figure 2c. La couche 16 de nitrure est ensuite éliminée et le silicium est recouvert d'un fin dépôt métallique 18. Il est choisi dans ce mode de réalisation de recouvrir à la fois les facettes 10 des sillons 6 et le reste de la face supérieure 4 de la plaque 2 par le dépôt métallique 18. Ce dernier est réalisé de manière à obtenir une surface réfléchissante. La plaque 2 munie de ses micro-miroirs forme alors un support pour recevoir les éléments à observer. La plaque 2, en tant que support d'observation, est alors fixée à l'aide d'un dispositif mécanique de taille macroscopique sur une lamelle de microscope (non représentée). Ce dispositif mécanique permet de réaliser un serrage entre la plaque 2 et la lamelle de microscope. Un tel dispositif de serrage est connu de l'homme du métier et déjà utilisé dans le domaine de l'observation microscopique et n'est pas décrit ici. L'ensemble formé par la lamelle de microscope, la plaque 2 avec ses micro-miroirs et l'échantillon à observer est alors placé sur un support de microscope (non représenté). Il s'agit ici d'un microscope tout à fait classique comme ceux couramment utilisés dans les laboratoires. II peut s'agir d'un microscope droit ou inversé. La figure 3 illustre le principe à la base de l'invention et permettant d'obtenir une restitution en trois dimensions en utilisant la plaque 2 et ses micro-miroirs pour recevoir l'échantillon à observer. Sur la figure 3, on a représenté à échelle agrandie deux facettes 10 d'un sillon 6 de la plaque 2. Il s'agit ici d'une vue en coupe dans un plan repéré par un repère (Y, Z). Deux billes 20 fluorescentes sont disposées entre les facettes 10 du sillon 6 représenté. Dans le cas de figure représenté, les deux billes 20 sont alignées selon l'axe Z. Chacune des billes 20 se reflète dans chacune des facettes 10. On obtient ainsi pour la bille se trouvant le plus près du fond 12 deux reflets 20', 20" et pour la bille plus éloignée du fond 12 deux reflets 20', 20". Les billes 20 et leurs reflets 20' et 20" sont observés à travers un objectif 22 associé à des moyens de prise de vue non représentés. L'observation des billes 20 se fait selon la direction donnée par l'axe Z. Comme les facettes 10 formant des micro-miroirs sont inclinées par rapport à l'angle d'observation, les images réfléchies présentent une vue de côté des billes 20. En outre, la position des reflets 20' et 20" selon l'axe Y dépend de la position selon l'axe Z de la bille réfléchie. Sur l'image obtenue (partie droite de la figure 3), on a au centre l'image d'une bille 20 qui est disposée entre l'image de ses reflets 20' et 20". La partie droite de la figure 3 correspond à une prise de vue d'un montage similaire à celui montré sur la partie gauche de la figure 3 avec uniquement la bille 20 se trouvant le plus près du fond 12 du sillon 6. Comme il ressort du paragraphe précédent, la position de la bille dans le repère (X, Y) est donnée directement par l'image issue de la prise de vue et la position selon l'axe Z peut être calculée grâce aux reflets 20' et 20" de la bille 20. Ceci ouvre donc la voie à une reconstruction tridimensionnelle à partir d'une seule vue de la scène capturée par un microscope optique. Cette reconstruction tridimensionnelle peut être réalisée en utilisant une approche relativement similaire aux techniques utilisées en stéréovision. Il s'agit ici d'observer des points singuliers dans deux vues d'une même scène prise avec un point de vue décalé. La figure 3 représente une situation simple dans laquelle un point lumineux, correspondant à la bille 20, et à ses deux reflets primaires. D'après l'image obtenue, on connaît les coordonnées en X et en Y de la bille 20 et on souhaite déterminer ses coordonnées en Z. En raison de l'invariance des micro- miroirs selon l'axe X, les coordonnées en X ne sont pas utiles pour une reconstruction tridimensionnelle. Dans la suite, des relations entre Y et Z sont données. Pour établir ces relations, deux problèmes nous préoccupent : comment se comportent les reflets d'un objet subissant une translation selon l'axe Y seulement ? comment se comportent les reflets d'un objet subissant une translation selon l'axe Z seulement ? Un paramètre important ici est l'angle que font les facettes 10 par rapport à la face supérieure 4 de la plaque 2. Cet angle est appelé a et est représenté sur la figure 4. Sur cette dernière figure, l'orientation de l'axe Z est inversée par rapport à l'orientation retenue sur la figure 3. Un angle R est défini de la manière suivante : f3=--2a z Afin de simplifier les calculs, seul le cas du reflet gauche (20') est développé ici. Les calculs concernant le reflet droit (20") sont des calculs similaires, au signe près. On suppose tout d'abord une translation A2 qui est la translation du point A représenté sur la figure 4 selon un vecteur ey de longueur Ay. On compare les positions relatives des points A et A2 ainsi que les positions relatives de leurs reflets respectifs A' et A2'. Sur la figure 4, des flèches 24 illustrent le sens d'observation de la scène par l'utilisateur. Sur la figure 4, on remarque que le point A2 est à droite de A. De même, le point A2' est à droite du point A'. On appelle ay la variation de la coordonnée en y entre A' et A2'. On a alors l'équation suivante : Sy /1y si:n(/3) (2) On suppose maintenant que le point A se déplace selon l'axe Z pour venir prendre la place du point A3. Le reflet A' du point A se déplace alors pour venir dans la position A3'. A3 se translate par rapport à A selon Oz. On définit de même selon l'axe Z un déplacement bz entre A' et A3'. Dans ce cas, on a l'équation suivante : (1) dz = 8z cos(fl ) (3) On peut alors généraliser et supposer que le point A se translate d'une part selon l'axe Y et d'autre part selon l'axe Z. Le reflet A' du point A se déplacera alors, dans la direction de l'axe Y, d'un écart ôtotal qui est donné par l'équation suivante : Stotal = Sy + Sz = dy - si-n(f) + dz • cos() (2) + (3) On en déduit l'expression de Az tlz = 5totai ù sin(fl) cas(/?) Pour l'image A" du point A, la seule différence dans les calculs est sur le signe de Oz. On obtient ainsi l'équation suivante : sin(fl ) ù Stotal (5) L'image que l'on obtient par les moyens de prise de vue à travers l'objectif 22 et le microscope nous donne les quantités ôtotal et Ay. L'angle f3 est fixe et est déterminé par la gravure du silicium (cf. figure 2 et réalisation des sillons 6 plus haut). On remarque ici que cette méthode de reconstruction ne nécessite aucun calibrage. Le principe de stéréovision pour repérer les coordonnées en Z s'applique également en utilisant les deux reflets (gauche et droit). Pour cela il convient de combiner les équations (4) et (5) : 'total + Sdroite d}, = total total 2. sin(f) Sgauche _ Sdroite QZ = total total 2. cos(j3) Grâce à l'utilisation de la plaque 2 munie sur sa face supérieure 4 de sillons 6 et de micro-miroirs, il est possible de réaliser une reconstruction tridimensionnelle avec deux vues de la même scène. Ainsi, avec une seule image, on effectue trois mesures tridimensionnelles. Cette information redondante peut être utilisée pour évaluer la cohérence des mesures tridimensionnelles réalisées, cette caractéristique étant pertinente pour quantifier la qualité des reconstructions. Pour valider cette méthode de reconstruction, des billes d'un diamètre de 1 �m ont été collées sur une lamelle de microscope et placées sous les micro-miroirs formés par les facettes 10. Ainsi, les billes 20 utilisées sont situées sur une même surface avec une même altitude z (cas différent de la figure 3). On a donc (4) Llz = cos() gauche ' rn) Stotai ù d SI7I {Az = dV sinCfi) ù Sdroite QZ _ iota! cos(B) cos(f) (6) dans les équations (4) et (5) une valeur Az = 0. En déplaçant les billes dans le plan (X, Y), on mesure btota, et Dy et on calcule les valeurs Az. Les résultats expérimentaux indiquent que l'écart moyen entre les billes et de - 45 nm � 306 nm (avec 80 mesures réalisées, 1 nm = 10-9 m). Un tel résultat permet donc de valider la méthode proposée. Comme indiqué plus haut, une forme de réalisation préférée prévoit que le support pour les échantillons à observer est réalisé à partir d'un substrat en silicium. Bien entendu, il est envisageable d'utiliser un support pour les échantillons à observer dans une autre matière. Dans le cas d'une plaque 2 en silicium, les stratégies de micro-usinage permettent de concevoir des micro-miroirs avec différentes géométries. Ceci revient à modifier l'angle R introduit notamment dans l'équation (1) ci-dessus. Des essais ont été réalisés avec des facettes 10 inclinées par rapport à la face supérieure 4 d'un angle proche de 35° puis avec un angle proche de 54° (correspond à la valeur de l'angle a). Il est alors apparu que les mesures effectuées avec des micro-miroirs inclinés de 54° environ sont nettement plus précises que celles effectuées avec des micro-miroirs inclinés d'environ 35°. Un mode de réalisation préféré de l'invention prévoit donc une plaque 2 en silicium avec des facettes 10 des sillons 6 inclinés de 54° environ par rapport à la face supérieure 4 de la plaque 2. Pour la reconstruction tridimensionnelle à partir des prises de vue effectuées à travers le microscope, un logiciel est utilisé pour réaliser les calculs ci-dessus. L'appareil de prise de vue est de préférence un appareil numérique. Un logiciel de traitement d'image est alors utilisé pour déterminer la position de l'image de la bille et de ses reflets. Un tel logiciel est déjà connu et n'est pas décrit ici. Une fois la position de la bille, ou plus généralement de l'élément à observer, et les positions de ses reflets déterminées, le logiciel spécifique effectue la reconstitution tridimensionnelle de l'élément observé. Des moyens de visualisation sont avantageusement prévus pour montrer la reconstruction réalisée. Dans la pratique, un micro-ordinateur est par exemple associé au microscope et à son appareil de prise de vue (appareil photo numérique par exemple). Les logiciels de traitement d'image, de reconstruction tridimensionnelle et de visualisation sont alors implantés dans le micro-ordinateur qui comprend avantageusement également un écran de visualisation. La présente invention peut être utilisée par exemple pour l'observation en biologie cellulaire. On peut, à titre d'exemple illustratif et nullement limitatif, procéder à l'observation de levures ou de cellules de mammifères. Pour de telles applications, un gène des cellules est marqué en fluorescence par des techniques de génie génétique connues des personnes réalisant habituellement des observations de cellules par microscope. Le noyau de la cellule apparaît comme une structure ronde autour du foyer de fluorescence ainsi réalisé. II est alors possible, grâce à la reconstruction tridimensionnelle décrite plus haut, d'observer en 3D la trajectoire d'un gène à l'intérieur du noyau correspondant. De telles observations peuvent être réalisées en utilisant des microscopes optiques standards, qui sont les outils très largement diffusés dans la communauté scientifique. De tels microscopes, contrairement aux microscopes confocaux, sont peu chers. Le dispositif selon l'invention permet donc l'utilisation de microscopes classiques pour réaliser des observations telles celles réalisées avec des microscopes confocaux. De ce fait, l'invention permet de réaliser à bon marché des observations tridimensionnelles. En outre, on remarque qu'avec un dispositif selon l'invention, aucun calibrage n'est nécessaire. De plus, toutes les longueurs d'ondes peuvent être utilisées. De ce fait, la présente invention est adaptée à la microscopie rapide. Elle est relativement peu coûteuse en lumière pour la reconstruction tridimensionnelle. On remarque également que les plaques décrites dans la description qui précède peuvent être réalisées à coût réduit. La technique de gravure est une technique connue et couramment mise en oeuvre permettant ainsi d'obtenir des supports bon marché. La présente invention ne se limite pas aux formes de réalisation préférées du dispositif et du procédé décrites ci-dessus à titre d'exemples non limitatifs et aux variantes évoquées. Elle concerne également toutes les variantes de réalisation à la portée de l'homme du métier dans le cadre des revendications ci-après. REVENDICATIONS1. Dispositif pour la visualisation en trois dimensions en microscopie, caractérisé en ce qu'il comporte un support (2) présentant une face (4) sensiblement plane dans laquelle sont réalisés des sillons (6), et en ce que la surface des sillons (6) est réfléchissante de manière à former un miroir, un objet (20) à visualiser étant destiné à venir prendre place dans un sillon (6). 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite face (4) du support (2) comporte un ensemble de sillons (6) parallèles espacés selon un pas prédéterminé. 3. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les sillons (6) sont des sillons en V. 4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'angle (a) formé entre une paroi (10) d'un sillon (6) et la face (4) plane est d'environ 54°. 5. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les sillons (6) sont recouverts d'une couche d'un métal choisi dans l'ensemble comportant l'or, l'argent, le platine et l'aluminium. 6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les sillons (6) présentent une largeur comprise entre 2 �m (soit 2 10"6 m) et 100 pm et présentent une longueur comprise entre 2 �m et 0,01 m. 7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le support (2) est en silicium. 8. Dispositif pour la visualisation en microscopie et en trois dimensions comportant un microscope, une lamelle de microscope et des moyens de prise de vues associés au microscope, caractérisé en ce qu'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 7 est fixé sur la lamelle de microscope, et en ce que les moyens de prise de vues sont reliés à un dispositif de traitement d'images permettant de restituer des images en trois dimensions à partir d'une image reçue et comportant d'une part l'image de l'objet à observer et d'autre part ses reflets dans le sillon correspondant. 9. Dispositif pour la visualisation en microscopie et en trois dimensions selon la revendication 8, caractérisé en ce que les moyens de traitement d'images sont intégrés dans un micro-ordinateur présentant un écran de visualisation. 10. Procédé de visualisation en microscopie d'un objet en trois dimensions, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :- mise en place de l'objet (20) à observer dans un sillon (6) réalisé sur un support (2) et présentant une surface concave réfléchissante, - prise de vue à travers un microscope de l'objet (20) observé, et de ses reflets (20', 20") sur la surface réfléchissante (10) du sillon (6), - analyse de l'image de l'objet (20) et de ses reflets (20', 20") afin de construire une image tridimensionnelle de l'objet à observer.