Brevet FR2946881A1 — publié le 20101224

ACTIVITE MULTIMODALE D'OLIGONUCLEOTIDES G-QUARTET ET COMPOSITIONS MICROBICIDES [001] La présente invention concerne une composition pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses dues au virus d'immunodéficience humaine et infections associées. [2] Depuis la découverte en 1983 du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), agent responsable du SIDA, de nombreux médicaments antirétroviraux ont été mis au point pour lutter contre les différentes phases du cycle rétroviral du VIH-1, par exemple (i) la phase d'infection et l'entrée du rétrovirus, (ii) la transcription inverse, dans laquelle le génome d'ARN simple brin du rétrovirus est transcrit de manière inverse en cADN simple brin avant d'être copié en ADN double brin, (iii) l'intégration dans le génome de cellules infectées, grâce à laquelle l'ADN viral double brin généré par la transcriptase inverse est introduit dans un chromosome de la cellule hôte établissant l'état latent proviral, (iv) , la synthèse de protéines structurelles virales et la formation de nouveaux virus viables. Plus précisément, plusieurs médicaments antirétroviraux ont été mis au point pour cibler les trois enzymes virales, la transcriptase inverse (RT), la protéase et l'intégrase (IN). [3] De nombreux inhibiteurs de transcriptase inverse ont été mis au point comme par exemple l'AZT�, qui est vendu sous les marques Retrovir� et Zidovudine� par la société Glaxo Wellcome, l'inhibiteur RT ddl, vendu sous les marques Videx� et Didanosine� par Bristol-Myers Squibb, l'inhibiteur RT ddC, vendu sous les marques HIVID� et didéoxycytidine par Hoffman-La-Roche, l'inhibiteur RT d4T, vendu sous les marques Zerit� et Stavudine� par Bristol-Myers Squibb, l'inhibiteur RT 3TC, vendu sous les marques Epivir� et Lamivudine� par Glaxo Wellcome, et l'inhibiteur RT Nevirapine�, vendu sous la marque Viramune� par Boehringer Ingelheim, [4] De même, de nombreux inhibiteurs de protéase ont servi au traitement de l'infection par le VIH-1. Les inhibiteurs de protéase bloquent l'enzyme dont le VIH-1 a besoin pour mener à bien son cycle de réplication et la formation de nouveaux virus 1 viables. Les inhibiteurs de protéase approuvés englobent par exemple le Saquinavir� vendu sous la marque Invirase� par les laboratoires Hoffman-La-Roche, ou le Rotinavir�, qui est vendu sous la marque Norvir� par les laboratoires Abbott, et Indinavir� vendu sous la marque Crixivan� par Merck & Co. [005] Du fait de la pression exercée par les médicaments, des virus résistants sont rapidement apparus compte tenu de la faible fidélité de la RT et de la vitesse élevée de multiplication du virus (Clavel, F. et al., 2004, N Engl J Med 350:1023-1035). 10 [006] On utilise actuellement des trithérapies combinant plusieurs inhibiteurs, comme des inhibiteurs de transcriptase inverse avec un inhibiteur de protéase en � cocktail �, ciblant ainsi plus d'une seule phase du cycle de réplication du VIH chez les patients à un stade avancé du SIDA. Ces thérapies englobent par exemple, une combinaison d'inhibiteurs de protéase tels que le saquinavir� et d'inhibiteurs de la RT, ou une 15 combinaison d'AZT, de 3TC et d'inhibiteurs de protéase comme le ritonavir�. Les effets secondaires sont relativement courants, comme par exemple des symptômes gastro-intestinaux avec nausée, vomissement, diarrhée et hépatite. [7] L'IN est une protéine de 32 kDa codée par l'extrémité 3' du gène pol qui joue un 20 rôle essentiel dans la réplication virale. Elle catalyse l'intégration de l'ADN proviral dans le génome des cellules infectées en deux temps. Premièrement, la phase de � 3'-processing � consiste en la suppression de deux nucléotides au niveau du LTR, et ensuite, la phase de transfert de brin se traduit par l'intégration de l'ADN processé dans l'ADN cellulaire. Compte tenu du rôle qu'elle joue dans la réplication, la recherche 25 d'inhibiteurs dirigés contre l'IN a augmenté ces 10 dernières années. [8] Récemment, certains inhibiteurs de l'IN sont entrés dans la phase thérapeutique. Mais, l'utilisation de ces inhibiteurs a conduit à l'apparition de souches résistantes (Malet, I., et al., 2009. J Antimicrob Chemother 63:795-804). Cette enzyme est difficile à 30 cibler parce qu'elle fait partie d'un complexe de préintégration multimérique (PIC) et parce que la plupart des inhibiteurs actifs sur l'IN in vitro ne sont pas capables d'inhiber l'enzyme à l'intérieur de la cellule (Miller MD et al, 1997, J Virol. 71:5382-5390). En outre, la conception rationnelle de médicaments comme cela a été fait pour la RT et la 2 protéase n'est toujours pas envisageable dans le cas de l'IN compte tenu du manque de disponibilité de la structure tridimensionnelle de l'enzyme entière. Cependant, l'intégration est une phase très attractive dans la mesure où elle ne comporte pas d'homologues cellulaires connus à ce jour et est essentielle pour la réplication et la prolifération du VIH-1 (LaFemina RL, 1992, J Virol 66:7414-7419). Cette phase permet l'incorporation permanente du provirus VIH-1 dans le génome cellulaire et conduit à une infection chronique. [009] Diverses familles d'inhibiteurs d'IN ont été signalées (Semenova, E. A., 2008, J Mol Biol 235:1532-1547), tels que les dicétoacides (DKA), qui inhibent plus spécifiquement la réaction de transfert de brin de l'intégration. De plus, des mutations de résistance sont apparues dans le gène d'IN confirmant l'IN comme la cible ex vivo. Un inhibiteur d'IN, le raltegravir�, est désormais intégré à la HAART (thérapie antirétrovirale hautement active) des malades du SIDA. Cette molécule est également, comme les DKA, plus spécifique de la réaction de transfert de brin (Hicks C et al, Clin Infect Dis, 2009, 48:931-9). Cependant, bon nombre de ces médicaments anti-IN souffrent d'une cytotoxicité élevée. [0010] Une autre classe d'inhibiteurs d'IN d'intérêt se compose d'oligonucléotides structurés en quartet de guanine (G), également désigné ODN G-quartet. Ces molécules forment une structure très résistante in vitro, responsable de l'inhibition d'IN in vitro (Jing, N. et al., 1998. J Biol Chem. 273:34992-34999; Jing, N., et al., 2000, J. Biol.Chem 275:21460-21467). L'effet inhibiteur ex vivo de l'ODN T30177 (Zintevir�) a fait l'objet d'études, grâce tout d'abord à son activité contre l'entrée virale et également lors de l'intégration (Ojwang, J. O., et al, 1995, Antimicrob Agents Chemother 39:2426-2435). Cependant, des études portant sur les souches de virus résistantes au T30177 n'ont montré que des mutations sur le gène de la gp120, impliqué dans le processus d'entrée virale (Este, J. A. et al., 1998, Mol Pharmacol 53:340-345). [0011] Des composés ou compositions microbicides sont également utilisés à titre préventif contre les infections dues au VIH-1. Ils sont conçus pour détruire les virus, réduire leur capacité à établir une infection, et/ou constituer une barrière physique 3 empêchant les virus VIH-1 d'atteindre les cellules cibles. Ces microbicides englobent par exemple, le Cyanoviran�, le PRO 2000�, ou le Tenofovir�. [0012] L'éradication totale des virus VIH-1 n'a cependant jamais pu être obtenue du fait de l'existence de réservoirs, qui permettent la survie du virus malgré une réponse immunitaire efficace (Chun, T. W. et al., L. Proc Natl Acad Sci U S A 94:13193-13197). Toutes ces raisons soulignent le besoin de découvrir de nouveaux médicaments antirétroviraux et de proposer une voie thérapeutique potentiellement nouvelle d'inhibition du VIH-1. Résumé de l'invention [0013] Selon la présente invention, une famille particulière d'oligonucléotides G-quartet désignée ci-après Andevir, a été mise en évidence par la Demanderesse comme possédant une activité antivirale multimodale, à savoir, le ciblage de plusieurs phases du cycle de réplication rétroviral, et possédant en plus de manière surprenante une activité microbicide puissante. [0014] Ces oligonucléotides G-quartet représentent donc un traitement médical substantiellement amélioré et un médicament efficace pour prévenir les infections rétrovirales et en cas d'infections pour empêcher la réplication et la prolifération rétrovirales. Les ODN G-quartet sont particulièrement utiles en tant que compositions microbicides pharmaceutiques. Avantageusement, l'utilisation du traitement médical et de la composition microbicide peut contribuer à prévenir la transmission du VIH-1 et d'autres virus. [0015] Description des Figures [0016] Figure 1 Chronologie d'addition de différents médicaments. Les cellules HeLa P4 ont été infectées par un surnageant viral VIH-1 La; comme cela est décrit dans l'Exemple 1 ci-dessous. A différents moments après le début de l'infection par le VIH-1, 10 pM de sulfate de dextran, 10 pM d'AZT, ou 500 nM d'oligonucléotide Andevir a été ajouté à une culture de cellules infectées. L'infection a été ensuite maintenue pendant 24 heures pour donner les résultats décrits à l'Exemple 1. Les valeurs sont les moyennes de 3 expériences différentes. Les résultats ont été exprimés en comparaison avec la réplication du VIH-1 observée sans médicament. 4 [0017] Figures 2A et 2B: Effets de l'Andevir sur l'infectivité du VIH-1. [0018] (A)- Effet de l'incubation du VIH-1 à température ambiante sur l'infectivité virale. Des virus dans des milieux de culture ont été incubés sur des laps de temps différents à température ambiante. Les virus ont été ensuite centrifugés sur des membranes Vectaspin (Whatman), lavés trois fois au PBS, et resuspendus dans les milieux de culture, puis ajoutés aux cellules HeLa P4 (virus centrifugé). La réplication du VIH-1 a été étudiée avant d'utiliser les cellules HeLa P4, comparée à la réplication virale non traitée (virus non traité). (B)- Effets de l'Andevir sur l'infectivité des particules virales. Les particules de VIH-1 isolées ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante avec différentes concentrations d'Andevir. Après trois lavages intensifs au PBS, les virus récupérés dans le volume initial ont été utilisés pour infecter la culture de cellules HeLa P4. Après 24 heures d'infection, l'infectivité du VIH-1 a été révélée comme cela est détaillé dans l'Exemple 1 avec 4-MUG. 10 pM de VD-84 (inhibiteur de RT) et 1 pM de TBA ODN ont été utilisés comme témoins. Les valeurs sont les moyennes de 3 expériences différentes. [0019] Figure 3 : Quantification des acides nucléiques viraux en présence d'Andevir [0020] Des cellules HeLa P4 ont été infectées par des virus VIH-1 en présence d'une série de dilutions d'Andevir. Après 2 heures d'infection, les cellules sont lavées, traitées à la trypsine, puis lavées à nouveau. L'ARN total a été extrait pour le soumettre à une RT-PCR quantitative. Pour la quantification de l'ADN, les cellules ont été infectées par le VIH-1 pendant 24 heures en présence de différentes concentrations d'Andevir, avant de les laver et de les traiter à la trypsine, puis de les laver à nouveau avant extraction de l'ADN total et quantification par PCR en temps réel. [0021] Figure 4 : Inhibition de la réplication du VIH-1 par Andevir transfecté û (A) Les cellules HeLa P4 ont été transfectées en présence de différents lipides cationiques selon les instructions du fabricant. Au bout de 24 heures, les cellules ont été infectées et la réplication virale a été déterminée avant d'utiliser le 4-MUG. La barre 1 correspond à une infection virale à 100% sans transfection. Les barres 2 à 4 correspondent à une transfection réalisée par DMRIE-C, Jet-PEI et Lipofectamine 2000 respectivement. (B) Des cellules HeLa P4 ont été transfectées en présence de Lipofectamine 2000 seule (A) ou bien avec de la Lipofectamine 2000 complexée avec des dilutions sériées 5 d'Andevir (^) 24 heures avant infection, ou bien incubées en présence de différentes concentrations d'Andevir seul (o). [0022] Figure 5: Détection de l'ADN intégré en présence d'Andevir [0023] Des cellules ont été transfectées avec différentes quantités du complexe Andevir/Lipofectamine 2000. L'infection a été réalisée pendant 24 heures avant d'extraire l'ADN viral comme cela est décrit dans l'Exemple 1 ci-dessous. Une première Alu-PCR est réalisée avant de faire une PCR nichée à l'aide de 5 pl de produits d'amplification Alu-PCR. Les produits d'amplification sont analysés sur 1% de gel d'agarose. La ligne 1 : marqueur ; Lignes 2 et 3, cellules non infectées. Lignes 4 et 5, cellules infectées. Lignes 6, 7 et 8 : cellules transfectées par 1000, 500 et 250 nM de Lipofectamine 2000 ; Lignes 9, 10 et 11 : cellules infectées transfectées par 1000, 500 et 250 nM de Lipofectamine 2000. Lignes 12, 13 et 14 : cellules non infectées transfectées par 1000, 500 et 250 nM de complexe Andevir/Lipofectamine 2000. Lignes 15, 16 et 17 ; cellules infectées transfectées par 1000, 500 et 250 nM de complexe Andevir/Lipofectamine 2000. Ligne 18 : cellules non infectées incubées avec 1000 nM d'Andevir seul. Ligne 19 : cellules infectées en présence de 1000 nM d'Andevir seul. [0024] Figure 6 : Séquences de la gp120 virale à partir d'un virus résistant à l'Andevir [0025] Les séquences de la gp120 de virus résistants obtenus en présence de concentrations croissantes d'Andevir ont été comparées avec la séquence gp120 du génome H9L~; (référence K 02013). La séquence de virus obtenue en présence de 4 pM (virus 4 �M) ou 10 pM (virus 10 �M) d'Andevir est fournie. Les différents domaines de la protéine gp120 sont indiqués par des flèches. [0026] Description détaillée de l'invention [0027] On entend par � oligonucléotide � (ODN) une molécule composée de deux ou plusieurs déoxyribonucléiques ou ribonucléotides et d'acides ribo- ou déoxyribonucléiques modifiés. Selon un mode de réalisation préféré, la structure de base de l'ODN possède une longueur minimale de 15 nucléotides. [0028] Le terme consacré � bases � renvoie aux pyrimidines et purines, ou bien des bases modifiées ou des dérivées de celles-ci. L'abréviation suivante : "A" renvoie à l'adénine, mais selon le contexte, peut également renvoyer au ribose, au déoxyribose ou 6 aux formes modifiées du ribose ou du déoxyribose. De même, "T" renvoie à la thymine ou la thymidine, "U" renvoie à l'uracil ou l'uridine, "G" renvoie à la guanine ou la guanosine, et "C" renvoie à la cytosine ou la cytidine. [0029] On entend par � inhibition � de la réplication virale, une inhibition partielle ou totale de la réplication virale ou même une diminution de la réplication virale. La dose inhibitrice ou � dose thérapeutique � des composés de la présente invention peut être déterminée en évaluant les effets de l'oligonucléotide sur la réplication virale dans une culture de cellules ou chez un animal. La quantité d'oligonucléotide administrée en dose thérapeutique dépend de l'âge, du poids, du type de traitement concurrent et de la nature de la condition virale en cours de traitement. [0030] L'expression � dose effective thérapeutique � dans ce contexte renvoie à la dose d'ODN G-quartet provoquant un effet thérapeutique chez un animal ou un humain. La dose thérapeutique administrée à un animal ou à un humain à traiter comportera une quantité suffisante d'oligonucléotide pour provoquer un effet spécifique, par exemple, (1) effet microbicide, (2) inhibition de l'entrée virale, (3) inhibition de protéine ou enzymes virales, (4) inhibition de la transcriptase inverse, et (5) inhibition de l'intégrase. L'homme de l'art comprendra sans peine que la dose dépend de toute une variété de paramètres, comme l'âge, le sexe, la taille et le poids de l'humain ou de l'animal à traiter. Face à un ensemble de paramètres donné, l'homme de l'art n'aura aucun mal à déterminer la dose appropriée. [0031] Dans le présent contexte, � ODNs G-quartet � correspond aux oligonucléotides possédant une structure à trois dimensions stabilisée par des tétrades de guanosine. L'expression � tétrades de guanosine � renvoie à la structure constituée de huit liaisons hydrogène par coordination des quatre atomes 06 de la guanine. Au-delà de la liaison hydrogène entre les guanines, la stabilité des quadruplexes résulte des interactions parmi les quartets empilés de même que de la coordination avec les cations situés au centre (par exemple Na' ou K+). Comme il ressort de nombreuses études physiques et biochimiques précédentes, les études RMN et cristallographiques suggèrent que le repliement est facilité par la liaison H de type Hoogsten plane par les résidus G. La cristallographie a montré que la structure était stabilisée de manière sélective par la 7 liaison étroite d'un petit cation monovalent avec l'oxygène O6 de guanosine. De tels oligonucléotides G-quartet peuvent être actifs comme monomère ou comme dimère. [0032] La Demanderesse a pu établir que les ODN G-quartet particuliers selon l'invention possédaient une activité multimodale, ciblant ainsi de multiples phases du cycle de vie du rétrovirus. En effet, les ODN G-quartet empêchaient l'entrée virale dans les cellules, la transcription inverse du génome viral, et son intégration dans le chromosome de la cellule hôte. La Demanderesse a démontré pour la première fois que les ODN G-quartet présentaient une activité microbicide importante après incubation avec le virus seul. Ces résultats représentent clairement une avancée majeure pour le traitement de l'infection virale. [0033] La présente invention concerne donc une composition microbicide comprenant une quantité efficace thérapeutiquement d'un ODN G-quartet et un excipient acceptable pharmaceutiquement. [0034] Conformément à la présente invention, l'ODN G-quartet Andevir possède une structure de base 5'-(G)3(H)n(G)3(H)n(G)2H(G)3H-3' (noyau 1) ou 5'-(G)4(H)n(G)3(H)n(G)2H(G)3-3' (noyau 2) dans laquelle H représente une base soit une adénine (A) ou une pyrimidine, et dans laquelle n est un entier égal à 1 ou 2. De préférence, H est une thymidine ou une adénine. Dans la structure de base 1 comprenant le noyau 1, le nucléotide aux positions 4 et 15 peut être une thymidine, le nucléotide aux positions 8 et 11 peut être une adénine. Dans le noyau 2 (ou structure de base 2), le nucléotide à la position 5 peut être une thymidine, le nucléotide aux positions 9 et 12 peut être une adénine. La longueur minimale de la structure de base est de 15 nucléotides. D'autres séquences aléatoires peuvent être ajoutées en 5' et/ou en 3'. De préférence, les séquences d'ODN G-quartet sont 5'-GGGGTGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 1), 5'-GGGGAGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 2), 5'- GGGGTGGGTGGAGGGT-3' (SEQ ID NO : 3), 5'-GGGGTGGGAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 4), ou 5'-GGGGTGGGTGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 5). Les nucléotides à la position 5 peuvent être T, A, AA, TT, TA, AT ou TTA. Les nucléotides à la position 9 peuvent être A, T, TT, AT, TA ou AA. De manière encore plus préférentielle, l'oligonucléotide ou ODN G-quartet possède une séquence de base 5'- 8 GGGGTGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 1) de 16 nucléotides et a été désigné Andevir. Les oligonucléotides peuvent contenir des liaisons internucléosides phosphorothioates ou peuvent contenir des bases modifiées chimiquement. La chimie peut être ADN ou ARN. [0035] Les oligonucléotides G-quartet selon la présente invention peuvent éventuellement être modifiés en 3' ou en 5' par l'ajout d'un groupement de remplacement tel que la propylamine, la poly-L-lysine, le cholestérol, des chaînes d'acides gras présentant des carbones en C2-G24, du cholestérol avec un ligand triglycylique, ou de la vitamine E. [0036] La Demanderesse a montré récemment que les oligonucléotides G-quartet Andevir selon la présente invention présentaient une puissante activité d'inhibition IN in vitro. Il est apparu que la séquence minimale d'ODN riche en guanine responsable de la meilleure inhibition comprenait des séquences de noyau 1 ou 2 comme cela est décrit plus haut avec 15 nucléotides au minimum. La longueur de la séquence de préférence particulière était de 16 nucléotides. Les oligonucléotides selon la présente invention ont été désignés Andevir. La structure RMN des oligonucléotides selon la présente invention a été déterminée en présence d'ions K+. L'aptamère se replie en une structure en quartet de G dimérique particulièrement stable. [0037] La Demanderesse a mis en évidence un mécanisme multimodal unique d'action des oligonucléotides G-quartet Andevir selon la présente invention. En effet, les oligonucléotides Andevir selon la présente invention ont permis de bloquer la réplication du VIH-1 dans les cultures de cellules infectées avec une 1650 de seulement 20 nM. La Demanderesse a démontré que les ODN G-quartet de la présente invention désignés Andevir avaient un effet microbicide important en plus de leur effet d'inhibition sur la phase précoce d'entrée des virus, de l'inhibition de la transcription inverse dans les cellules infectées, et de l'inhibition de la phase d'intégration. [0038] Comme le montre la Figure 1, les oligonucléotides Andevir peuvent agir dès les premières phases virales. La meilleure inhibition a été obtenue en ajoutant ensemble l'inhibiteur et le virus aux cellules et l'inhibition fut complète avec une faible quantité de composé, à savoir 200 nM. Une préincubation des particules virales avec l'Andevir avant 9 infection a permis de réduire l'infectivité des virus, indiquant clairement une action de type agent microbicide. Cet effet a été obtenu par l'ajout de concentrations plus fortes d'Andevir (Figure 2). [0039] Les ODN G-quartet de la présente invention, désignés Andevir, permettaient également d'inhiber les phases précoces de l'entrée virale. L'activité inhibitrice de l'Andevir a été suivie après analyses de transfection. En fait, une inhibition a été obtenue mais à des concentrations plus élevées qu'avec Andevir seul (Figure 4). Tous ces résultats confirment que les oligonucléotides Andevir selon la présente invention possèdent une action multimodale, d'une part par interaction directe avec ou à l'intérieur de la particule virale, et d'autre part à l'intérieur de la cellule. [0040] Les oligonucléotides Andevir présentent un effet important sur les populations d'acides nucléiques virales. D'une part, l'entrée virale a été affectée par les inhibiteurs selon la présente invention résultant en une diminution de 50% de la quantité d'ARN viral détecté et ce quelle que soit la concentration d'inhibiteur utilisée (Figure 3). D'autre part, l'inhibition observée sur la quantité d'ADN du VIH-1 est dose dépendante (Figure 3). Cette expérience a permis de souligner un effet patent sur la synthèse d'ADN VIH-1, qui se déroule pendant la phase de transcription inverse. [0041] Des mutants résistants aux oligonucléotides G-quartet Andevir ont été générés, par ajout d'Andevir au moment de l'infection. Ces mutants présentaient plusieurs mutations sur gp120 (Figure 6). La résistance virale de la mutation N269K contre le bicyclame a été décrite. Le bicyclame agit au niveau de l'interaction entre le gp120 et le co-récepteur CXCR4 (de Vreese, K., V. et al., 1996, J Virol 70:689-696; Gerlach, L. O., 2001, J Biol Chem 276:14153-14160). La résistance virale contre le DS a été également décrite avec cette mutation, le DS est un inhibiteur non spécifique d'entrée virale agissant sur la phase d'adsorption. De nombreux virus de type sauvage ont montré une asparagine dans cette position, de sorte que la mutation N269K pourrait être due à l'impact de l'Andevir sur le virus. La mutation Q278H a été localisée en une position décrite dans la résistance virale contre T30177 (Este JA, et al., 1998, Mol Pharmacol 53:340-34), contre les bicyclames (de Vreese, K., V. et al., 1996, J Virol 70:689-696) et contre le DS (Este JA, et al., 1997, Mol Pharmacol 52:98-104). Tous ces inhibiteurs du VIH-1 sont des molécules polyanioniques. Cette position est par conséquent une 10 position de résistance courante aux polyanions. Cependant, dans la plupart des cas, cette mutation est associée à une délétion aux positions 364-368 (FNSTW), qui sont des séquences très variables chez les virus de type sauvage. Enfin, une mutation N4281 distincte est apparue dans la séquence virale résistante. Il pourrait s'agir d'une évolution de la population virale liée à la pression sélectionnée, provoquée par une concentration accrue d'Andevir dans les milieux de culture, même si cette position est extrêmement variable dans la séquence de virus de type sauvage. La position était située dans un domaine intervenant dans l'interaction avec le CD4. Les oligonucléotides Andevir selon l'invention possèderaient un mécanisme d'inhibition différent et distinct de ceux des molécules polyanioniques citées, et cela pourrait être lié à l'interaction entre gp120 et CXCR4 et/ou CD4. [0042] Par conséquent, la Demanderesse a mis en évidence que les ODN G-quartet selon la présente invention désignés Andevir étaient non seulement des inhibiteurs in vitro du VIH-1 IN, mais interféraient en outre avec d'autres phases du cycle viral, telle que l'entrée du virus, et la transcription inverse, et surtout présentaient une action microbicide importante. Il est en effet crucial de proposer des médicaments multimodaux ciblant plusieurs phases de cycle de réplication virale et présentant en outre un puissant effet microbicide. [0043] Les compositions microbicides de la présente invention sont particulièrement utiles pour la prévention et/ou le traitement des infections par le VIH et des co-infections qui sont associées au virus d'immunodéficience humaine. [0044] Les compositions microbicides peuvent être administrées par intraveineuse, localement ou oralement. Ces compositions peuvent être sous forme de mousse, de crème, de bain, de gel, de suppositoire, d'ovule, de lotion, d'onguent, de film, de comprimé, de comprimé effervescent, de tampon, de pulvérisateur ou aérosol, ou encore d'anneau vaginal. Les formulations microbicides selon la présente invention peuvent être appliquées aux cavités corporelles, à la peau, aux muqueuses. De préférence, les administrations sont topiques ou locales, et se font de manière encore plus préférentielle, par applications vaginales. 11 [0045] On préfère les administrations topiques pour obtenir un effet préventif de la composition. On préfère les administrations intraveineuses ou orales pour obtenir un effet curatif. [0046] Les formulations microbicides comprennent les oligonucléotides G-quartet Andevir selon la présente invention ainsi qu'un excipient acceptable pharmaceutiquement, et optionnellement une base ou un véhicule acceptable cosmétiquement. Ces excipients sont bien connus de l'homme du métier. Les présentes compositions peuvent en outre comprendre des agents microbicides supplémentaires dirigés contre les bactéries, les virus, les champignons, les parasites, et optionnellement des spermicides. [0047] Même si le traitement médical et le médicament sont particulièrement utiles pour inhiber le VIH-1 et d'autres maladies infectieuses associées chez l'homme, ils peuvent également servir à des fins vétérinaires pour les maladies infectieuses chez les animaux, à savoir, chez les chiens, les chats, les oiseaux, les chevaux, les ovins, les bovins, ainsi que les tous autres animaux de ferme de même que les rongeurs, etc... [0048] La présente invention porte également sur un procédé de prévention des infections virales, et plus particulièrement les infections rétrovirales. Le procédé consiste à mettre le virus au contact de la composition microbicide de l'invention, comme cela est décrit ci-dessus, simultanément ou avant tout contact avec les cellules, avec les microorganismes pour prévenir les infections. 12 EXEMPLES [0049] Exemple 1: Préparation des oligonucleotides ou ODN [0050] Des sels de sodium de sulfate de Dextran et de l'AZT (3'-azido-3'déoxy- thymidine) ont été obtenus auprès de la société Sigma. Le L-731,988 a été donné par le laboratoire de recherche Merck. Un oligonucléotide G-quartet (5'-GGGGTGGGAGGAGGGT-3', SEQ ID NO : 1) et l'ODN TBA (5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' ; SEQ ID NO : 6) a été obtenu auprès de la société MWG Biotech. De même, les autres ODN G-quartet préférentiels selon la présente invention, tels que 5'-GGGGAGGGAGGAGGGT-3' (SE ID NO : 2), 5'-GGGGTGGGTGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 3), 5'-GGGGTGGGAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO: 4), ou 5'-GGGGTGGGTGG TGGGT-3' (SEQ ID NO : 5) ont été synthétisés. [0051] Exemple 2: Lignées cellulaires et virus [0052] Les cellules HeLa P4 codant une 6-galactosidase sous contrôle du LTR viral dont la traduction est activée par Tat ont été maintenues dans un milieu DMEM (Invitrogen) complémenté avec 10% de SVF inactivé, 1 mg/ml de généticine (G418, Gibco-BRL). On a cultivé des cellules MT4 et H9Laï dans un milieu glutamax RPMI 1640 (Invitrogène) avec un complément de 10% de SVF inactivé. [0053] Les virus VIH-1 ont été obtenus après 48h de co-culture des cellules MT4 (0,5 x106 /ml) et des cellules H9Laï (1 x 106 /ml), infectées de manière chronique par un isolat VIH-1 LaT, dans un milieu glutamax RPMI 1640 complémenté avec 10% de SVF inactivé, à 37°C en atmosphère humidifiée à 5% CO2. La culture cellulaire a été ensuite centrifugée et le surnageant a été filtré sur une membrane de 0,45 lm avant congélation à -80°C. [0054] Exemple 3: Infectivité virale [0055] L'infectivité a été évaluée sur des cellules HeLa P4 exprimant le récepteur CD4 et le gène de 6-galactosidase sous le contrôle du LTR du VIH-1. Les cellules HeLa P4 ont été étalées dans un milieu comprenant 200 pl de milieu DMEM complémenté avec de 10% de SVF inactivé dans des plaques à 96 puits avec 10.000 cellules par puits. Après incubation toute la nuit à 37°C, dans une atmosphère humidifiée à 5% CO2, le 13 surnageant a été ensuite éliminé, et 200 pl de préparation virale a été rajoutée. Après 24 heures d'infection, le surnageant a été éliminé, les puits ont été lavés 3 fois avec 200 pl de PBS. Chaque puits a été rempli avec 200 pl d'un tampon de réaction contenant 50 mM de Tris-HCI pH 8,5, 100 mM de B-mercaptoéthanol, 0,05 % de Triton X-100 et 5 mM 4-méthylumbélliféryl-B-D-galactopyranoside (4-MUG) (Sigma). Au bout de 24 heures, la réaction a été mesurée dans un lecteur de microplaque à fluorescence (Cytofluor II, Applied Biosystems) à 360/460 nm Ex/Em. [0056] Exemple 4: Purification virale [0057] Les virions VIH-1 Laï (200 pl) ont été soumis à une ultrafiltration à travers une membrane Anopore de 0,02 lm dans un tube Vectaspin de 1,5 ml (Whatman) pendant 11 min à 5 000 g. Après 3 lavages avec du PBS, le concentrat viral a été remis en suspension dans 200 pl de milieu glutamax DMEM complémenté avec 10% de SVF inactivé. 100 pl de concentrat viral ont été utilisés pour infecter 10.000 cellules HeLa P4 par puits dans une plaque multipuits à 96 puits. [0058] Exemple 5: Essais de transfection [0059] Les cellules HeLa P4 ont été transfectées avec DMRIE-C, Jet-PEI et Lipofectamine 2000 (Invitrogène). Des complexes ODN/lipides cationiques ont été obtenus selon les indications des fabricants. La concentration d'ODN utilisée pour les complexes était de 2 pM. 24 heures avant la transfection, les cellules ont été étalées dans des plaques de 24 puits à raison de 100.000 cellules/puits, et incubées pendant 24 heures à 37°C dans une atmosphère humidifiée et à 5% de CO2. Le jour suivant, lorsque les cellules étaient confluentes à 60-80%, les complexes de transfection ont été préparés et ont été ajoutés à 150 pl de milieu DMEM frais sans SVF. Au bout de 4 heures, 150 pl de milieu de DMEM frais contenant 20% de SVF a été rajouté dans chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 20 heures à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 avant infection par VIH-1. [0060] Exemple 6: [0061] Les cellules HeLa P4 ont été étalées dans 200 pl de milieu DMEM complémenté avec 10% de SVF inactivé, 1 mg/ml G418, dans une plaque à 96 puits à raison de 10.000 cellules par puits. Après incubation toute la nuit à 37CC, dans une atmosphère humidifiée à 5% CO2, le surnageant a été éliminé et remplacé par un milieu frais en 14 présence de virus VIH-1. Le médicament a été rajouté à des temps variables après infection (de 0 à 10 heures), et la culture a été maintenue pendant 24 heures. L'activité de la 6-galactosidase a été mesurée dans un lecteur de microplaque à fluorescence après addition d'un substrat. [0062] Exemple 7: Extraction de l'ARN viral et RT-PCR quantitative [0063] Les cellules HeLa P4 ont été étalées dans des plaques à 24 puits à raison de 100.000 par puits avant infection par le virus VIH-1 La;. Au bout de 2 heures, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et ont été soumises à un traitement à la trypsine afin d'éliminer les virus VIH-1 fixés à la surface de la membrane cellulaire et pour récupérer les cellules infectées du puits. Les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS. L'ARN total a été extrait selon le procédé Trizol (Gibco-BRL) selon les recommandations du fabricant. Le précipité d'ARN obtenu a été lavé dans 75% d'éthanol avant dissolution dans de l'eau traitée au DEPC avant de procéder à des expériences de RT-PCR quantitatives. [0064] Des amorces spécifiques de l'ARNm cellulaire GAPDH (amorce sens 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3' (SEQ ID NO: 7); amorce antisens 5'-TCCTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3' ; SEQ ID NO : 8) ont été utilisées pour l'amplification par RT-PCR en temps réel SYBR Green. La RT-PCR quantitative a été faite avec le kit � IscriptTM One-step RT-PCT� (Biorad) dans un volume final de 25 pl avec 300 nM de chaque amorce, 0,5 pl de RT et 10 pl d'extrait d'ARN. Le programme de PCR était de 50°C pendant 10 minutes, 95CC pendant 5 minutes, (95°C pendant 10 secondes; 62°C pendant 30 secondes; 72°C pendant 30 secondes) pendant 40 cycles dans un appareil à PCR MyiQ (Biorad). [0065] Afin de déterminer la quantité d'ARN VIH-1 par RT-PCR quantitative, des amorces spécifiques (amorce sens LTRNecO01 5'-GCCTCAATAAAGCTTGCCT-3' ; SEQ ID NO : 9; amorce antisens LTR131 5'-GGCGCCACTGCTAGAGAT-3' ; SEQ ID NO: 10) ont été utilisées avec un procédé RT-PCR MGB TagMan en temps réel (Applied Biosystems). La sonde interne TagMan VIH-1 (6-FAM AAGTRGTGTGTGCCCMGB ; SEQ ID NO : 11) transportait le marqueur 6-carboxyfluorescéine en 5', et le quencher 6-carboxytétraméthylrhodamine en 3' (Applied Biosystems). La RT-PCR 15 quantitative a été réalisée dans un volume final de 50 pl avec un tampon de 25 pl de � SuperScript III Platinum One-step qRT-PCT� (Applied Biosystems), 200 nM de chaque amorce, 200 nM de sonde MGB, 1 pl de ROX (passive reference dye), 1 pl de RT et 10 pl d'extrait d'ARN et a été analysée dans un thermocycleur à système de détection de séquence ABI Prism 7.000 (Applied Biosystems). Le cycle programmé était de 48°C pendant 15 minutes, (95°C pendant 2 minutes; 95°C pendant 15 secondes; 60°C pendant 30 secondes) pendant 55 cycles. [0066] Pour déterminer le nombre de copie d'ARN cellulaire et viral, une courbe standard a été préalablement réalisée avec des dilutions en série d'ARN GAPDH transcrit in vitro (kit Ambion "MEGAscript") et à partir de solutions commercialisées d'ARN VIH-1 (AcroMetrix). [0067] Exemple 8: Extraction de l'ARN viral et PCR quantitative [0068] Afin de quantifier l'ADN du VIH-1, les cellules HeLa P4 ont été placées dans des plaques à 96 puits à raison de 10.000 par puits avant infection par le virus VIH-1 La;. Au bout de 24 heures, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et traitées à la trypsine afin d'éliminer les virus fixés à la surface de la membrane cellulaire, permettant ainsi de récupérer les cellules infectées du puits. De plus, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS. L'ADN total a été extrait à l'aide du kit � High pure viral nucleic acid � (Roche Applied Science) et soumis à une PCR quantitative. [0069] Quantification d'ADN viral par PCR gag: Des amorces spécifiques du gène cellulaire GAPDH (amorce sens 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3' ; SEQ ID NO : 7; amorce antisens 5'-TCCTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3' ; SEQ ID NO : 8) ont été utilisées afin de vérifier par PCR SYBR Green en temps réel que des quantités d'ADN égales ont été utilisées dans chaque essais. Les amorces spécifiques à une région du gène gag (amorce sens 5'-GCCTATTGCACCAGGCCAGAT-3' ; SEQ ID NO : 12; amorce antisens 5'-GTGAAGCTTGCTCGGCTCTTAGA-3' ; SEQ ID NO : 13) ont été utilisées pour quantifier l'ADN VIH-1 total présent dans les cellules infectées avec le procédé SYBR Green. Une PCR quantitative a été réalisée dans un volume final de 25 pl avec un tampon de 12,5 pl de � PCR Quantitative SYBR Green kit� (Biorad), 300 nM de chaque amorce et 10 pl d'extrait d'ADN. Le cycle programmé était de 95°C pendant 1 16 minute 30, (95°C pendant 10 secondes; 60CC pendant 20 secondes; 72°C pendant 10 secondes) pendant 42 cycles dans un thermocycleur PCR en temps réel MyiQ (Biorad). Pour déterminer le nombre de copie de gène, une courbe d'étalonnage a été préalablement réalisée avec des dilutions en série à partir d'ADN de cellules non infectées (gène GAPDH) et à partir de dilutions de plasmides pNL4-3 codant tous les gènes viraux (gène gag). [0070] Quantification d'ADN intégré par Alu-PCR : La polymérase ADN Phusion high fidelity (Ozyme) a été utilisée pour réaliser cette PCR. 20 pl d'ADN a été rajouté à un mélange contenant 500 nM d'amorces, 200 nM dNTP, et 10 pl de tampon 5X HF dans un volume final de 50 pl. Les amorces étaient l'Alu-164 (5'-TCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGG-3' ; SEQ ID NO : 14) et le PBS (5'-TTTCAGTCCCTGTTCGG GCGCCA 3' ; SEQ ID NO : 15). Le programme était de 30 secondes à 98CC, 35 cycles (10 secondes à 98CC, 20 secondes à 60°C, 2 minutes 30 secondes à 72CC) et 72°C pendant 5 minutes. Une PCR nichée a été réalisée avec les amorces NI-1 (5'-CACACACAAGGCTACTTCCCT-3' ; SEQ ID NO : 16) et NI-2 (5'-GCCACTCCCCAGTCCCGCCC-3' ; SEQ ID NO : 17) en utilisant 5 pl des produits de l'Alu-PCR. L'enzyme Ampli Taq Gold de la société Promega a été utilisée pendant 12 minutes à 94CC, 42 cycles (94CC pendant 1 minute, 60°C pendant 1 minute, 72°C pendant 1 minute) et 7 minutes à 72°C. [0071] Exemple 9: Sélection de souches résistantes aux virus [0072] Des cellules MT4 ont été tout d'abord infectées avec du virus VIH-1 La; en présence d'oligonucléotides Andevir à la concentration inhibitrice de 50% (1G50). Les cultures ont été incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% CO2, jusqu'à ce que l'on détecte un effet cytopathique. Les surnageants de culture ont été utilisés pour infecter de nouvelles cellules MT4 en présence de concentrations croissantes d'oligonucléotides Andevir allant jusqu'à 10 pM (500 fois la concentration IC50 de l'Andevir). [0073] Exemple 10: Analyse de la séquence d'ADN des virus résistants [0074] L'ARN viral des virus VIH-1 sauvage et des virus VIH-1 résistants aux oligonucléotides Andevir ont été extraits à partir des surnageants avec le kit � High Pure 17 Viral RNA kit � (Roche Applied Science). Une RT-PCR a été réalisée avec le kit � Titan One Tube RT-PCR kit� de Roche Applied Science pendant un programme de cycle de 45 minutes à 45CC, 5 minutes à 94CC, (1 minute à 60°C; 2 minutes à 68CC) pendant 40 cycles et 7 minutes à 68°C. 2111 des produits RT-PCT ont été soumis à une réaction PCR avec le kit � AmpliTaq Gold with GeneAmp � (Roche Applied Science). Le programme de cycle était de 12 minutes à 94°C, (30 secondes à 94°C; 30 secondes à 55°C, 2 minutes à 72CC) pendant 40 cycles et 7 minutes à 72CC. Une phase de purification a été réalisée sur une colonne S-400 HR (Pharmacia) avant séquençage. [0075] Le séquençage a été réalisé avec le kit � Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction � (PE Biosystems). Le programme de cycle était de 1 minute à 96°C, (10 secondes à 96°C; 5 secondes à 50CC ; 4 minutes à 60°C) pendant 25 cycles. Les produits de séquençage ont été purifiés avec du Sephadex (Sigma) avant de réaliser le séquençage avec le séquenceur génétique Beckmann et le kit � CEQTM 2000XL DNA Analysis System� (Beckmen Coulter). Les couples d'amorces qui ont été utilisés pour l'amplification par PCR et le séquençage sont résumés dans le Tableau 2. [0076] Exemple 11: Administration des oligonucléotides G-quartet Andevir à des temps variables après l'infection [0077] Le mode d'action des oligonucléotides G-quartet Andevir selon la présente invention a été évalué en les administrant à des temps variables après infection. Les cellules HeLa P4 ont été infectées à l'instant 0. Une quantité de 500 nM d'Andevir (susceptible d'inhiber complètement la réplication du virus IHV-1) a été rajoutée, à la culture de cellules à des instants variables allant de 0 à 10 heures après infection par le virus VIH-1. La culture cellulaire infectée a été maintenue pendant 24 heures, et l'infectivité du VIH-1 a été mesurée par l'activité de la [i-galactosidase contrôlée par le LTR du VIH-1 tel que décrit plus haut. Le sulfate de dextran (DS), qui inhibe l'adsorption du virus au niveau de la membrane cellulaire, et le 3'-azido-3'déoxy-thymidine (AZT) qui agit sur la transcription inverse, ont été utilisés comme contrôles. Comme le montre la Figure 1, l'inhibition totale de la réplication du VIH-1 a été obtenue lorsque le DS est ajouté en même temps que le virus. L'effet inhibiteur du DS a ensuite rapidement baissé : 60% d'inhibition a été conservée lorsque le médicament est rajouté 4 heures après l'infection. L'AZT était active lorsqu'il était ajouté au moment de l'infection, mais l'inhibition n'était plus que de 70% lorsque l'AZT était ajouté 4 heures après l'infection, et 18 de 50% s'il était rajouté 6 heures après l'infection. L'Andevir était également actif lorsqu'il était ajouté au moment de l'infection, mais un excellent niveau d'inhibition était conservé plusieurs heures après l'infection (inhibition de 50% en cas d'addition 4 heures après l'infection). Une inhibition de la réplication VIH-1 avec une efficacité plus faible a été également observée lorsque l'on a ajouté le médicament 10 heures après l'infection, tandis que l'AZT et le DS étaient inefficaces dans ces conditions. Ces résultats montrent les effets supérieurs de l'Andevir lorsque ce dernier est ajouté dans les toutes premières heures après l'infection. [0078] Exemple 12: Inhibition de l'infectivité des particules isolées VIH-1 [0079] L'activité inhibitrice des oligonucléotides Andevir a été obtenue lorsque le virus et l'inhibiteur sont ajoutés aux cellules. La capacité des oligonucléotides Andevir d'inhiber l'infectivité des particules isolées de VIH-1 a été examinée en ajoutant les oligonucléotides Andevir à des temps variables. Brièvement, les virus VIH-1 ont été incubés à température ambiante en présence de différentes concentrations d'inhibiteur. Les virus ont été séparés de l'Andevir non lié par centrifugation à travers des membranes VectaSpin. L'infectivité des particules traitées a été étudiée en infectant des cellules HeLa P4 comme cela est décrit précédemment. [0080] Des expériences similaires sur l'inhibition de l'infectivité des isolats du VIH-1 et du VIH-2 sont réalisées en utilisant les oligonucléotides Andevir selon la présente invention tels que les 5'-GGGGAGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 2), 5'-GGGGTGGGTGGAGGGT-3' (SEQ ID NO : 3), 5'-GGGGTGGGAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 4), ou 5'-GGGGTGGGTGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 5). La capacité de ces ODN à inhiber l'infectivité des particules isolées est étudiée. Les virus VIH-1 ou VIH-2 sont incubés à température ambiante en présence de différentes concentrations d'inhibiteurs ODN tels que listés ci-dessus. Les virus sont séparés de ces ODN non liés par centrifugation à travers des membranes VectaSpin, et l'infectivité des particules traitées est étudiée par infection des cellules HeLa P4 comme cela est décrit précédemment. [0081] Tout d'abord, une incubation virale à température ambiante peut réduire l'infectivité en endommageant le virus. Ce point a été vérifié en laissant incuber les particules virales à température ambiante dans des milieux dilués et sur des durées variables. Ces virus ont été ensuite centrifugés dans des membranes Vectaspin, lavés 19 trois fois avec du PBS, remis en suspension dans des milieux de culture, et enfin utilisés pour infecter les cellules HeLa P4 (virus centrifugés). Les virus qui ont été soumis à des incubations à température ambiante mais pas à la centrifugation Vectaspin ont été utilisées comme témoins (virus non traités). Comme le montre la figure 2 A, l'infectivité virale des virus non traités n'a pas été affectée par une incubation de 60 minutes à température ambiante, alors qu'une incubation de 120 minutes a montré une baisse de la réplication de 20%. Pour les mêmes durées d'incubation, la centrifugation a affecté l'infectivité virale. En effet, une perte de réplication virale supérieure à 20% a été observée lors d'une incubation de 60 minutes suivie d'une centrifugation. La durée d'incubation de 30 minutes à température ambiante a donc été choisie pour procéder à d'autres analyses. [0082] Les effets de différentes concentrations d'oligonucléotides Andevir sur l'infectivité de particules isolées ont été étudiés. L'incubation des particules de VIH-1 avec des dilutions en série d'oligonucléotides Andevir a permis de montrer un effet inhibiteur patent dose dépendant (Figure 2 B). Une inhibition complète avec une concentration d' oligonucléotides Andevir de 10 pM a pu être atteinte, alors qu'une inhibition de 50% a été obtenue à une concentration d'environ 1 �M. Les effets de deux autres molécules ont été également analysés. Le VD-84 est un composé curie-pyridinone qui agit comme inhibiteur non nucléosidique de la RT. Il avait été démontré que le VD-84 inhibait l'infectivité virale des particules isolées probablement grâce à son affinité élevée pour la RT. Comme cela était prévisible, le VD84 a complètement inhibé l'infectivité des particules virales prétraitées (Figure 2 B). L'ODN TBA est un ODN 15-mer capable de former des G-quartets, pour lequel nous n'avons pas pu détecter d'effet inhibiteur sur la réplication du VIH-1. A une concentration de 1 �M, l'ODN TBA n'a présenté qu'une faible inhibition de l'infectivité du VIH-1 (Figure 2 B). [0083] En conclusion, une préincubation des oligonucléotides Andevir avec les particules virales a clairement montré un effet inhibiteur important et spécifique sur l'infectivité du VIH-1. Cependant, cette inhibition a été obtenue avec des concentrations de l'ordre du micromolaire. Etant donné que l'on a obtenu une inhibition complète de la réplication VIH-1 avec des concentrations nanomolaires d'inhibiteur, il semblerait que l'inhibition de l'infectivité ne soit pas le seul processus intervenant dans l'inhibition du VIH-1 provoquée par l'oligonucléotide Andevir. 20 [0084] Exemple 13: Effets des ODN G-quartet Andevir sur les phases d'entrée virale et de transcription inverse [0085] L'effet de l'oligonucléotide Andevir sur l'entrée du VIH-1 dans les cellules a été ensuite évalué. Les cellules HeLa P4 ont été infectées en présence de concentrations croissantes d'oligonucléotide Andevir. Après 2 heures d'infection, l'ARN total a été extrait et l'ARN viral a été quantifié par RT-PCR en temps réel. La Figure 3 montre qu'environ 50% de l'ARN du VIH-1 ont pu être récupérés quelle que soit la concentration d'Andevir utilisée. [0086] L'effet de l' oligonucléotide Andevir sur l'ADN du VIH-1 obtenu par transcription inverse a été évalué. Les cellules HeLa P4 ont été infectées en présence de diverses concentrations d'inhibiteur, et la culture a été maintenue 24 heures. Les cellules ont été lavées avant d'extraire l'ADN total comme cela a été décrit dans l'Exemple 1. L'amplification du gène gag a été utilisée pour déterminer la quantité d'ADN VIH-1 par PCR quantitative. Comme le montre la Figure 3, une inhibition dose dépendante a été observée en augmentant les concentrations d'oligonucléotide Andevir. Lorsque la concentration d'oligonucléotide Andevir susceptible d'inhiber totalement la réplication du VIH-1 (à partir de 200 nM) a été rajoutée, la quantité d'ADN VIH-1 détectée dans les cellules infectées était très faible, aux alentours de 5%. L'ARN viral a encore été détecté même à des concentrations d'oligonucléotide Andevir de l'ordre de 3200 nM, tandis que l'ADN était totalement absent. Par conséquent, alors que l'ARN du VIH-1 a toujours détecté et l'ADN viral était pratiquement absent dans les mêmes conditions, nous en concluons que la synthèse d'ADN viral a été fortement affectée par l'oligonucléotide Andevir. [0087] De même, les effets des oligonucléotides G-quartet Andevir selon la présente invention : 5'-GGGGAGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO : 2), 5'-GGGGTGGGTGGAGGGT-3' (SEQ ID NO : 3), 5'-GGGGTGGGAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 4), ou 5'-GGGGTGGGTGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 5), sont évalués sur l'entrée du VIH-1 dans les cellules. Des cellules HeLa P4 sont infectées en présence de concentrations croissantes d'ODN. Après 2 heures d'infection, l'ARN total est extrait et l'ARN viral est quantifié par RT-PCR en temps réel. 21 [0088] Exemple 14: Inhibition spécifique par les ODN Andevir de la phase d'intégration [0089] Les résultats ont montré un mécanisme d'action bimodal de l'Andevir : une inhibition sur l'entrée virale et une inhibition sur la synthèse d'ADN viral lorsque l'on ajoute des ODN aux cultures cellulaires au moment de l'infection. Les phases 10 antérieures à l'intégration ont été clairement inhibées par l'ajout des oligonucléotides Andevir selon l'invention. Par conséquent, il a été nécessaire d'analyser l'inhibition dans des conditions dans lesquelles l'effet sur l'entrée virale est contourné. Dans cette perspective, des essais de transfection ont été utilisés de sorte à éviter toute interaction entre le virus et l'ODN à l'extérieur de la cellule. Plusieurs agents de transfection ont été 15 testés, mais tous n'étaient pas adéquats pour la réalisation d'une infection après transfection. La Lipofectamine 2000 a montré une faible stimulation de la réplication du VIH-1 (Figure 4 A, barre 4). Cet agent, qui est non cytotoxique dans nos conditions, a ainsi été retenu pour procéder à d'autres analyses. 20 [0090] Différentes quantités du complexe préformé Andevir/Lipofectamine 2000 ont été incubées avec des cellules HeLa P4 pendant 24 heures. Les cellules ont été ensuite infectées par le VIH-1. Au bout de 24 heures, l'infectivité virale a été déterminée. La Lipofectamine 2000 seule n'a pas inhibé l'infectivité du VIH-1 jusqu'à une concentration d'1 pM (Figure 4 B). En présence d'Andevir seul, une inhibition dose dépendante a été 25 obtenue avec 200 nM Andevir. L'inhibition observée en présence de dilutions d'Andevir transfecté était beaucoup faible, avec une inhibition de 60% avec 2 pM d'Andevir/Lipofectamine 2000. Ainsi, il n'a jamais été possible d'obtenir une inhibition totale de l'infectivité du VIH-1 avec une concentration de 2 pM d'Andevir utilisée dans la formation du complexe, alors qu'une inhibition de 100% a été obtenue en présence de 30 200 nM d'Andevir seul. Enfin, aucune inhibition n'a pu être observée par transfection en présence d'un ODN témoin (non montré). [0091] L'ensemble de ces résultats a permis de montrer que le niveau d'inhibition de réplication du VIH-1 telle qu'obtenue avec le complexe de transfection était nettement 22 plus faible que celle qui est obtenue avec l'Andevir seul. Par contre, cela reflète probablement l'inhibition sur une cible intracellulaire. L'ADN viral a été alors quantifié afin de déterminer la cible d'inhibition après transfection d'Andevir dans les cellules infectées. L'ADN viral a été amplifié par PCR en temps réel avec les amorces situés dans le gène gag. Aucun changement de quantités d'ADN n'a été détecté en présence ou en l'absence de concentrations croissantes d'Andevir transfectés (Fig 5 et Tableau 1) suggérant que la synthèse de l'ADN viral n'était pas inhibée. Dans un second temps, l'ADN intégré a été amplifié spécifiquement par Alu-PCR suivie de PCR nichée comme cela est décrit ci-dessus. L'intégration virale a été affectée en présence de complexes Andevir/Lipofectamine 2000 (Figure 5). Ainsi, il a été démontré que l'Andevir inhibait clairement l'intégration dans un contexte cellulaire. [0092] Exemple 15: Souches virales résistantes à l'Andevir [0093] Les souches virales résistantes à l'Andevir ont été sélectionnées en exposant le virus à des concentrations croissantes de médicament Andévir. Les virus résistants ont été cultivés en présence d'une concentration finale de 10 pM d'Andevir. Les gènes gp120, IN et RT ont été séquencés (Tableau 2). Dans le gène codant pour la protéine gp120, trois mutations ont été trouvées (N269K, Q278H, N4281; Figure 6) confirmant l'effet inhibiteur de l'Andevir sur l'entrée virale. Aucune mutation n'a été observée sur les deux gènes IN et RT. 23 REVENDICATIONS1. Une composition microbicide comprenant une quantité thérapeutique efficace d'au moins un oligonucléotide G-quartet et d'un excipient acceptable pharmaceutiquement. 2. Composition microbicide selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit oligonucléotide G-quartet comprend une séquence de base 5'-(G)3(H)n(G)3(H)n(G)2H(G)3H-3' ou 5'-(G)4(H)n(G)3(H)n(G)2H(G)3-3', d'une longueur minimale de 15 nucléotides, dans laquelle H représente une Adénine, une Thymidine, ou un Uracile, n est un entier égal à 1 ou 2. 3. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit oligonucléotide G-quartet comprend une séquence de base choisie parmi 5'-GGGGTGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 1), 5'-GGGGAGGGAGGAGGGT-3' (SEQ ID NO: 2), 5'-GGGGTGGGT GGAGGGT-3' (SEQ ID NO : 3), 5'-GGGGTGGGAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 4), ou 5'-GGGGTGGGTGGTGGGT-3' (SEQ ID NO : 5). 4. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une administration intraveineuse, orale ou topique. 5. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'une mousse, d'une crème, d'un bain, d'un gel, d'un suppositoire, d'un ovule, d'une lotion, d'un onguent, d'un film, d'un comprimé, d'un comprimé effervescent, d'un tampon, d'un pulvérisateur, d'un anneau vaginal ou d'un aérosol. 6. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une application directe aux cavités corporelles, à la peau, aux muqueuses. 24 7. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme appropriée pour une application topique vaginale. 8. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la prévention et/ou de traitement de l'infection par le VIH. 9. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la prévention des infections par le VIH-1, caractérisée en ce qu'elle se 10 présente sous forme appropriée pour une administration topique. 10. Composition microbicide selon l'une quelconque des revendications précédentes pour le traitement des infections par le VIH-1, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme appropriée pour une administration intraveineuse ou orale. 25