Brevet FR2944292A1 — publié le 20101015

L'invention a pour objet une méthode de purification du virus rabique qui a été obtenu à partir d'une culture de cellules. D'une façon générale, les récoltes de virus obtenues à partir de cultures cellulaires infectées contiennent non seulement les virus désirés mais aussi les protéines et l'ADN des cellules qui sont des impuretés dont il convient de se débarrasser. Les quantités en protéines et en ADN cellulaires relarguées sont d'autant plus importantes que les virus sont responsables d'une lyse cellulaire importante et/ou que les récoltes virales sont effectuées tardivement. Outre les impuretés d'ordre cellulaire, les protéines du milieu dans lequel se trouvent les cellules infectées sont également des impuretés dont on cherche aussi à se débarrasser lors de la mis en oeuvre du procédé de purification virale. Lorsque les virus servent à la fabrication de vaccins on cherche à obtenir des préparations qui soient le plus pur possible pour éviter le développement de réactions allergiques contre les impuretés protéiques. Il existe également dans certains pays limitant à 100 pg/dose vaccinale voire moins la quantité maximale autorisée d'ADN cellulaire dans les vaccins comprenant des produits obtenus à partir de lignées cellulaires continues. Différents procédés de purification du virus rabique ont déjà été décrits dans l'art antérieur : U.S. 4,664,912 décrit une méthode de purification du virus rabique par centrifugation zonale après qu'il ait été inactivé à la 13 propiolactone. Une autre méthode consiste à combiner une chromatographie par exclusion de taille et une chromatographie par échange d'anions lorsque le volume de la récolte de virus à purifier est important. U.S. 4,725,547 décrit une méthode de purification du virus rabique par chromatographie d'affinité sur cellulofine sulfate (ester d'acide sulfurique et de cellulose). WO 97/06243 décrit une méthode de purification des virus, notamment du virus rabique à partir d'une culture de cellules Vero infectées. Le procédé comprend une chromatographie par échange d'anions suivie d'une chromatographie par échangeuse de cations et est complété par une chromatographie d'affinité par chélation métallique. En utilisant ce procédé, le taux d'ADN résiduel contenu dans une dose de vaccin est Un procédé de purification de virus particulièrement performant devrait permettre d'éliminer de façon optimale les impuretés protéiques et l'ADN cellulaire tout en 25 garantissant un rendement maximal en virus rabique purifié et il existe toujours le besoin de trouver de nouveaux procédés qui répondent à ces critères. Un but de l'invention est de fournir un nouveau procédé de purification qui répond à ces critères. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de purification qui convient pour 30 purifier du virus rabique à partir d'une récolte qui a été obtenue en utilisant comme milieu d'infection virale un milieu qui ne contient pas de sérum d'origine animal ou de protéine sérique. 2944292 -3- Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de purification permettant d'obtenir une suspension de virus rabiques entiers purifiés non dégradés pouvant être sous la forme d'une suspension de virus inactivés, de virus atténués ou de virus vivants. 5 A cet effet, la présente invention a pour objet : Un procédé de purification du virus rabique comprenant une seule étape de chromatographie par échange d'ions, la dite étape étant une chromatographie par échange de cations selon laquelle : a) on met en contact le surnageant d'une culture de cellules 10 infectées par ce virus avec un support de chromatographie échangeur de cations de sorte que le virus rabique se fixe sur ce support, et dans un deuxième temps b) on élue le virus de son support. 15 De façon préférée, le support de chromatographie échangeur de cations est composé d'une matrice de polyméthacrylate sur laquelle sont greffés par liaison de covalence des groupements sulfo isobutyl. Selon un aspect du procédé selon l'invention les cellules qui sont infectées par le virus 20 rabique sont les cellules VERO. Selon un autre aspect du procédé selon l'invention, le surnageant de culture des cellules infectées par le virus rabique a été obtenu en utilisant un milieu d'infection virale qui ne contient pas protéine sérique. Selon un autre aspect, le surnageant de culture des cellules infectées par le virus rabique a été obtenu en utilisant un milieu d'infection virale qui ne contient pas de protéine ayant un poids moléculaire supérieur à 10 KD. 30 Dans un mode de réalisation du procédé selon l'invention, on clarifie le surnageant de culture de cellules infectées par le virus rabique avant de le mettre en contact avec le support de chromatographie échangeur de cations. 25 2944292 -4- De façon particulièrement préférée, le procédé de purification selon l'invention est caractérisé en ce que la quantité de protéines totales mesurée dans l'éluât correspond à moins de 40% de la quantité de protéines totales mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique, en ce que la quantité d'ADN mesurée 5 dans l'éluât correspond à moins de 5%, de préférence à moins de 2,5% et de façon encore plus préférée à moins de 1% de la quantité d'ADN mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique et en ce que la quantité de virus mesurée dans l'éluât correspond à au moins 70% de la quantité de virus mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique. 10 Dans un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, après avoir élué le virus de son support chromatographique on concentre éventuellement l'éluât puis on le traite avec une nucléase. 15 Dans un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, on concentre l'éluât selon une méthode d'ultrafiltration suivie d'une diafiltration. Dans un aspect particulier du procédé selon l'invention, la nucléase est une endonuclease. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend une étape supplémentaire de purification du virus rabique selon laquelle on soumet l'éluât à une ultra centrifugation sur un gradient de saccharose et on recueille la ou les fractions du gradient qui contiennent le virus purifié. 25 Dans un autre aspect de l'invention, on inactive le virus rabique au moyen d'un agent d'inactivation virale après l'avoir purifié selon un procédé de l'invention. Dans un aspect particulier, l'agent d'inactivation virale est la 13-propiolactone. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un vaccin contre la rage selon lequel : a) on infecte une culture de cellules avec le virus rabique, 20 30 2944292 -5- b) on purifie le surnageant de culture de cellules infectées que l'on recueille à l'issue de l'étape a) selon un procédé de l'invention, c) on conserve la suspension de virus purifié obtenue en b) dans un tampon de conservation, et 5 d) on répartit la suspension de virus purifié obtenue en c) sous la forme de vaccins uni-doses ou multi-doses. Selon un autre aspect, il s'agit d'un procédé de fabrication d'un vaccin contre la rage selon lequel : 10 a) on infecte une culture de cellules avec le virus rabique, b) on purifie le surnageant de culture de cellules infectées que l'on recueille à l'issue de l'étape a) selon un procédé de l'invention, c) on mélange la suspension de virus purifié obtenue en b) dans un tampon de lyophilisation, 15 d) on répartit le mélange obtenu en c) sous la forme de vaccins uni-doses ou multi-doses, et e) on lyophilise les doses de vaccins. L'invention a finalement pour objet un vaccin contenant du virus rabique purifié et 20 inactivé selon lequel la quantité d'ADN résiduel mesurée par PCR quantitative et la quantité de protéines totales qui sont présentes dans une dose efficace de vaccin (ou dans une dose de vaccin qui contient 2,5 UI dans le test NIH) sont respectivement inférieures à 20 pg et à 40 �g et de façon préférée inférieures à 10 pg et à 20 �g et étant entendu que plus de 70 % des protéines totales sont des protéines du virus rabique. 25 Description détaillée de l'invention Le procédé de purification du virus rabique selon l'invention comprend une seule étape de chromatographie par échange d'ions, la dite étape chromatographique étant une 30 chromatographie par échange de cations. Contrairement à ce que laisse envisager l'état de l'art, les inventeurs ont mis en évidence que les performances d'une chromatographie par échange de cations sont meilleures que celles d'une chromatographie par échange d'anions. Les �performances d'une chromatographie� au sens de l'invention sont 2944292 -6- calculées sur la base de la quantité de virus rabique et d'ADN que l'on retrouve dans l'éluât par rapport à la quantité initiale de virus et d'ADN qui ont été mis en contact avec le support chromatographique, dans les limites de capacité de charge du support chromatographique. A quantités équivalentes de virus et d'ADN qui ont été mis en 5 contact avec le support chromatographique, la performance du support chromatographique est d'autant meilleure que la quantité de virus retrouvé dans l'éluât est importante et que la quantité d'ADN résiduel est faible. Sans vouloir être lié par la théorie, il semble que le virus rabique possède une double polarité, positive et négative qui lui permet de se fixer à la fois sur des supports échangeurs d'anions (type TMAE) et 10 sur des supports échangeurs de cations (type S03). Les résultats présentés dans l'exemple 1 montre que les performances des essais réalisés sur échangeurs d'anions (faible ou fort, sous la forme de membrane ou de particules de gel) sont médiocres au regard de celles que l'on peut obtenir avec des échangeurs de cations. Ces performances sont particulièrement bonnes lorsque le support est constitué d'une matrice en 15 polyméthacrylate sur laquelle sont greffés par liaison de covalence des groupements sulfo isobutyl qui jouent le rôle de ligands. Le support est classiquement sous la forme de particules dont la taille varie généralement entre 20 et 100 �m, de façon préférée entre 40 et 90 �m. Ce type de support est notamment commercialisé par MERCK sous la dénomination de Fractogel � EMD S03- (type M). Ce type de support est placé dans 20 une colonne chromatographique dont la longueur et le diamètre sont choisis en fonction du volume de récolte à purifier. On peut également utiliser comme support une membrane chargée macroporeuse prête à l'emploi où les groupements sulfo isobutyl sont greffés sur une membrane en polyméthacrylate. 25 Grâce au procédé selon l'invention, on peut éliminer, en une seule étape chromatographique par échange de cations en utilisant un support de polyméthacrylate sur lequel sont greffés par liaison de covalence des groupements sulfo isobutyl, à la fois plus de 60% des protéines totales, au moins 2,5 logio d'ADN, de façon préférée au moins 3,0 logio d'ADN et de façon encore plus préférée au moins 3,5 logio d'ADN (ce 30 qui correspond à l'élimination de plus de 99% de l'ADN cellulaire) tout en conservant un rendement en virus rabique d'au moins 70%. (c'est à dire que l'on retrouve dans l'éluât une quantité de virus rabique qui correspond au moins à 70% de celle qui a été initialement mise en contact avec le support chromatographique). Ces performances sont 2944292 -7- observées notamment lorsque le surnageant de culture de cellules infectées par le virus rabique a été obtenu en utilisant un milieu d'infection virale qui ne contient pas de protéine sérique dans sa composition. Par � protéine sérique � on entend une protéine contenue dans le sérum animal. 5 Le procédé de purification du virus rabique en une seule étape de chromatographie par échange de cations est caractérisé en ce que les quantités de protéines totales et d'ADN mesurées dans l'éluât chromatographique correspondent respectivement à moins de 40 % de la quantité de protéines totales mesurée dans le 10 volume de surnageant de culture de cellules infectées par le virus rabique et à moins de 5 %, de préférence moins de 2,5 % et de façon encore plus préférée à moins de 1 % de la quantité d'ADN mesurée dans le volume de surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique. Par contre, au moins 70 % de la quantité de virus rabique présente dans le volume de surnageant qui a été mis en contact avec le support 15 chromatographique est retrouvée dans l'éluât. Les �protéines totales � au sens de l'invention correspondent à la somme des protéines cellulaires, des protéines du virus rabique et des protéines du milieu de culture cellulaire et/ou du milieu d'infection virale. Les protéines cellulaires et les protéines du 20 milieu de culture et/ou du milieu d'infection virale représentent les impuretés (impuretés protéiques) que l'on cherche à éliminer tandis que l'on cherche à conserver au maximum les protéines du virus rabique. La quantité de virus rabique est évaluée sur la base de la mesure de la glycoprotéine G 25 du virus rabique qui se fait habituellement par une méthode ELISA de type � sandwich � comme celle qui est décrite dans l'exemple 1. On utilise comme anticorps de capture, un anticorps spécifique du site antigénique IIc de la glycoprotéine G (Journal of Clinical investigation (1989), vol. 84, pp 971 à 975) et comme anticorps de révélation un anticorps neutralisant le virus rabique reconnaissant le site antigénique III de la 30 glycoprotéine G (Biologicals (2003), vol., pp 9 à 16). Les résultats sont exprimés en UI sur la base de l'utilisation d'un étalon de référence, qui a été calibré vis-à-vis de la référence internationale du NIBSC. 2944292 -8- Pour mesurer la quantité de protéines totales on utilise la méthode de Bradford bien connue de l'homme du métier. Pour mesurer la quantité d'ADN, on utilise de préférence une méthode de PCR 5 quantitative (qPCR) basée sur la quantification d'un fragment d'ADN du génome de la cellule (de préférence on cible un fragment d'ADN qui est répété de nombreuses fois dans le génome de la cellule). Lorsque le virus rabique est produit à partir de cellules Vero, la quantification de l'ADN résiduel durant le procédé de purification du virus est basée sur la quantification du fragment d'ADN alpha satellite du singe vert africain 10 après amplification PCR en utilisant une méthode similaire à celle qui est décrite par Lebron J.A. et coll. dans Developments in Biologicals (2006), vol 123, pp35-44 et qui est détaillée dans l'exemple 1. Cette méthode est très avantageuse car elle permet de mesurer tous les ADN cellulaires qui ont plus de 200 paires de bases. 15 Le surnageant de culture contenant le virus rabique est produit à partir d'une culture de cellules qui ont été infectés par le virus rabique. Toute culture de cellules dans lesquelles le virus rabique se réplique convient à l'objet de l'invention. Il peut s'agir de cultures primaires de tissus animaux, comme les cultures primaires embryonnaires de poulets (par exemple les cultures primaires de fibroblastes embryonnaires de poulets (PECF)), 20 les cultures primaires de cerveaux de souriceaux, les cultures primaires de reins de singe, de lapin, de hamster ou de chien, mais de façon préférée, on utilise une culture de cellules provenant de lignées cellulaires établies qui dérivent des cultures primaires de tissus animaux. Il s'agit notamment des lignées de cellules provenant de primates telles que la lignée VERO, WI-38, MRC5, PERC.6, la lignée 293, de chevaux, de vaches (telle 25 que la lignée MDBK), de moutons, de chiens (telles que la lignée MDCK), de chats, de rongeurs (telles que la lignée BHK21, HKCC ou CHO). De façon particulièrement préférée, on utilise la lignée de cellules Vero qui comporte de nombreux avantages: c'est une lignée continue facilement cultivable à l'échelle industrielle qui a un très faible pouvoir mutagène et qui est très sensible au virus rabique. 2944292 -9- Les cellules peuvent être cultivées en suspension ou sur un support selon qu'elles ont des propriétés d'adhésion ou non, en mode batch, feed batch ou selon un mode de culture en continue et par perfusion. Dans le cas de culture de lignées cellulaires à l'échelle industrielle ou semi-industrielle, 5 on utilise généralement des biogénérateurs, dont le volume est supérieur à 10 litres et pouvant aller jusqu'à plus de 2000 litres, comprenant un système d'agitation, un dispositif d'injection d'un courant gazeux de CO2 et un dispositif d'oxygénation. Ils sont équipés de sondes mesurant les paramètres internes du bio-générateur comme le pH, l'oxygène dissous, la température, la pression de la cuve ou certains paramètres 10 physicochimiques de la culture (comme la consommation en glucose, de glutamine ou la production de lactates et d'ions ammoniums). Les sondes de pH, d'oxygène et de température sont reliées à un bio-processeur qui assure en permanence la régulation de ces paramètres. Dans le cas de lignées cellulaires adhérentes cultivées en biogénérateurs, le milieu de culture contient des microporteurs qui sont des microbilles sur lesquelles se 15 fixent les cellules. Ces microporteurs sont maintenus en suspension par agitation mécanique, ou au moyen d'un courant gazeux. Dans le cas des cellules de la lignée Vero ont utilise habituellement des microporteurs dont la matrice électrostatique adhésive est à base de dextran substituée par des groupements N, N diethylaminoéthyle qui sont commercialisés notamment par Amersham Biosciences sous la dénomination de 20 Cytodex 1, ou Cytodex 2. On peut également utiliser comme microporteurs des microbilles de Cytodex 3 commercialisés par Amersham Biosciences. Le milieu qui sert à la culture des cellules, encore appelé milieu de culture cellulaire peut être supplémenté ou non en sérum d'origine animale, ou contenir une ou plusieurs protéines sériques comme l'albumine humaine ou être dépourvu de toute protéine 25 d'origine animale, ou même être dépourvu de toute protéine. De façon préférée, on utilise un milieu de culture cellulaire dépourvu de toute protéine sérique qui peut être à l'origine du développement de réaction d'hypersensibilité chez le sujet vacciné (Swanson MC et coll, Journal of Infectious Disease (1987) ; 155(5) :909-913). Des exemples de milieux exempts de toute protéine sérique pouvant convenir à l'objet de 30 l'invention sont commercialisées sous les dénominations de VP SFM (InVitrogen), Opti Pro TM serum-free (InVitrogen), Episerf (InVitrogen), Ex-cell � MDCK (Sigma- Aldrich), Ex-Cell TM Vero (SAFC biosciences) MP-BHK� serum free 2944292 - 10 - (MP Biomedicals), SFC-10 BHK express serum free (Promo cell), SFC-20 BHK express protein free (Promo cell), HyQ PF Vero (Hyclone Réf. SH30352.02), Hyclone SFM4 Megavir , le milieu MDSS2 (Axcell biotechnology), le milieu DMEM Iscove modifié (Hyclone), les milieux nutritifs de Ham (Ham -F10, Ham-F12), le milieu de leibovitz L- 5 15 (Hyclone). De façon particulièrement préférée, on utilise un milieu de culture cellulaire dépourvu de toute protéine sérique et caractérisé en ce que les protéines du milieu sont uniquement des protéines de bas poids moléculaire ( 35 % de sucrose). L'étape d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose est généralement réalisée selon la méthode dite du � flux continu � lorsque les volumes à traiter sont importants ou en rotor lorsque les volumes sont relativement faibles. 2944292 -16- L'ultracentrifugation sur gradient de saccharose se fait habituellement sur � coussins de saccharose� à une température voisine de 5°C. L'éluât qui a été traité avec une endonucléase peut être sous une forme non concentrée ou concentré 10 fois, 20 fois, 50 fois, 100 fois, 150 fois, ou même plus. Le ratio entre le volume total de l'éluât soumis 5 à l'étape d'ultracentrifugation et le volume total du gradient de saccharose se situe habituellement entre 0,5 et 2,0 et de façon préférée entre 0,5 et 1,5. La densité du � coussin � de saccharose de faible densité se situe habituellement dans une gamme allant de 10 à 35 % tandis que la densité du � coussin � de saccharose de forte densité se situe habituellement dans une gamme allant de 40 à 60 %. Le volume de saccharose de 10 faible densité est généralement plus important que le volume de saccharose de forte densité et ce d'autant plus que le volume de l'éluât soumis à l'étape d'ultracentrifugation est important. Habituellement le ratio entre le volume de saccharose de forte densité et le volume de saccharose de faible densité se situe entre 0,3 et 0,7. La durée de l'ultracentrifugation est fonction de la vitesse d'ultracentrifugation 15 qui est en générale > 30000 g. Un temps d'ultracentrifugation de 2 heures suffit généralement lorsque la vitesse d'ultracentrifugation est > 65000 g. Après ultracentrifugation, le produit réparti dans le gradient est déchargé à la pompe péristaltique et fractionné. Le taux de saccharose contenu dans chaque fraction est mesuré à l'aide d'un réfractomètre. On mesure aussi dans chaque fraction la quantité de 20 virus rabique sur la base du dosage de la glycoprotéine gpG par ELISA et la quantité de protéines totales par la méthode de Bradford. On établit ainsi le profil de séparation. A l'issue de ces analyses, les fractions du gradient contenant essentiellement le virus rabique sont sélectionnées et rassemblées. On arrive à éliminer au cours de cette étape plus de 85 % et de préférence plus de 90 % des protéines totales, essentiellement les 25 impuretés protéiques puisque le rendement en virus rabique est > 70 % et de préférence > 80 %. Ainsi, lorsque l'on combine dans le procédé de purification selon l'invention les étapes de clarification du surnageant viral qui a été obtenu notamment en utilisant un milieu d'infection virale dépourvu de toute protéine sérique, de chromatographie par échange de cations sur un support constitué d'une matrice en polyméthacrylate sur 30 laquelle sont greffées par liaison de covalence des groupements sulfo isobutyl suivie éventuellement d'une étape d'ultrafiltration et/où de diafiltration, de traitement par une endonuclease et d'ultracentrifugation sur gradient de saccharose on obtient une composition de virus rabique purifié qui, pour une quantité en virus rabique 2944292 - 17 - correspondant à 4,5 UI (sur la base de la mesure de la gpG par ELISA) contient moins de 50 pg d'ADN résiduel, de façon préférée moins de 20pg d'ADN résiduel et de façon encore plus préférée moins de 10 pg d'ADN résiduel (mesuré par qPCR) et contient moins de 40 �g de protéines totales, de façon préférée moins de 20 �g de protéines 5 totales (mesuré par la méthode de Bradford) dont au moins 70 % des protéines totales sont des protéines virales. Le rendement global en virus purifié est d'au moins 45 %, et de façon préférée d'au moins 50 % et de façon encore plus préférée d'au moins 60 %. Le rendement global en virus purifié est calculé sur la base du ratio entre la quantité de virus présent dans la (les) fractions du gradient recueillie après ultracentrifugation et la 10 quantité de virus présent dans le surnageant viral avant clarification. A titre d'exemple, le tableau I ci-dessous indique pour chaque étape du procédé de purification du virus rabique à partir d'un surnageant de culture de cellules Vero infectées les quantités de virus récupérées ainsi que les quantités d'ADN et de protéines éliminées. 15 Tableau I : Tableau indicatif sur les différentes étapes du procédé de purification du virus rabique avec les rendements associés en virus et les quantités d'ADN et de protéines éliminées. Etape Quantité de virus Quantité de Quantité d'ADN récupéré (en %)* protéines éliminé éliminées (en (en log 10)*** %)** à global à global A global l'étape l'étape l'étape Clarification 90 90 ND ND ND ND Chromatographie sur 89 80 60 60 ND ND support EMD/S03- Ultrafiltration/diafiltration 97 77 18 67 2,7 2,7 Traitement benzonase + 70 54 88 96 1,6 4,3 Ultra centrifugation sur coussins de sucrose 2944292 - 18 - *: la quantité de virus rabique est déterminée sur la base du dosage de la glycoprotéine G du virus rabique par ELISA selon la méthode décrite dans l'exemple 1. * * : la quantité de protéines totales est mesurée par la technique de Bradford 5 *** : la quantité d'ADN est mesurée par qPCR selon la méthode décrite dans l'exemple 1. ND : Non déterminé Le virus rabique purifié recueilli après l'étape d'ultracentifugation est généralement sous une forme trop concentrée que l'on dilue souvent pour éviter la formation 10 d'agrégats viraux lors du stockage. On utilise habituellement comme tampon de dilution un tampon phosphate à un pH d'environ 8, éventuellement additionné d'une solution saline comme par exemple une solution de chlorure de sodium. Etape d'inactivation virale Le procédé de purification du virus rabique tel que décrit dans l'invention se termine par 15 une étape d'inactivation virale lorsque le virus est destiné à la fabrication d'un vaccin inactivé. L'inactivation virale peut être réalisée aux moyens d'agents chimiques bien connus de l'homme du métier tels que le formaldéhyde, le glutaraldéhyde, ou la 13 propiolactone. On peut également utiliser le procédé d'inactivation tel que décrit dans WO 2005/093049 qui consiste à mettre en contact la solution virale purifiée avec un 20 composé hydrophobique photo activable et à exposer ce mélange à la lumière. Parmi les composés hydrophobiques photo activables on cite l'azidobenzene, 1-azidonaphthalene, 4-azido-2- nitro-l-(phenylthio) benzene, 1-azido-4-iodobenzene, 1-azido-5-iodonaphthalene, 3-phenyl-3H-diazirene, 3-phenyl-3-(trifluoromethyl)-3H- diazirene, 3-(3-iodophenyl)-3-(trifluoromethyl)-3H-diazirene, 1- azidopyrene, adamantanediazirene, 25 12- (4-azido-2-nitrophenoxy)-stearic acid, w- (m-diazirinophenoxy) fatty acid, 12 [ (azidocarbonyl) oxy] stearic acid, 12-azidostearic acid, 11- (3-azidophenoxy) undecanoic acid or w- (m- diazirinophenoxy) undecanoic acid ou le 1,5-iodonaphtyl azide. De façon préférée, on utilise la 13 propiolactone (BPL) car c'est à la fois un agent d'inactivation virale et un agent alkylant entrainant des coupures dans l'ADN. Il peut 2944292 - 19 - donc contribuer également à la réduction du taux d'ADN résiduel et à l'inhibition de son activité biologique. L'inactivation du virus rabique est réalisée au moyen d'une solution de (3 propiolactone dilué entre 1/3500 et 1/4000 (concentration finale dans la solution contenant le virus purifié) à une température d'environ 12°C. Plus la concentration en 13 5 propiolactone est faible et plus le temps nécessaire à l'inactivation du virus est important. Généralement l'inactivation du virus se fait dans un intervalle de temps allant de 12 h à 48 h. On neutralise l'activité de la 13 propiolactone par simple chauffage de la solution à une température d'environ 37°C pendant environ 2 h. On vérifie ensuite que le pH de la solution est > 7,0. Au besoin, on rectifie le pH au moyen d'une solution de 10 soude diluée ou alternativement la solution contenant le virus purifié est tamponnée au moyen d'une solution à base d'un tampon phosphate, pH û 8 avant le traitement à la 13 propiolactone, ce qui évite toute acidification de la solution lors de l'hydrolyse de la 13 propiolactone. La suspension virale purifiée selon le procédé de l'invention est en générale conservée 15 dans un tampon de conservation comme par exemple dans un tampon Tris ou un tampon phosphate. Bien que l'on puisse mélanger directement la suspension virale purifiée avec le tampon de conservation, on procède généralement à une étape de diafiltration dans le tampon de conservation, au besoin complétée par une étape d'ultrafiltration si le virus purifié n'est pas suffisamment concentré. Le stock de virus purifié ainsi préparé est 20 finalement stérilisé par filtration sur membrane ayant une porosité 1-1) Production du virus rabique sur cellules VERO en milieu sans sérum Les cellules de la lignée VERO, après les avoir adaptées à des conditions de culture en milieu sans sérum comme décrit dans WO 01/40443, ont été transférées dans 10 un biogénérateur de 10 à 20 litres contenant des microporteurs de cytodex 1 dans le milieu VP SFM (Invitrogen). Après une période de culture de 3 à 4 jours à 37°C en maintenant un pH d'environ 7.2 � 0.2 , une saturation en oxygène de 25 % � 10 % et en soumettant le milieu à une faible agitation, les cellules ont été infectées avec du virus rabique à une multiplicité d'infection de 0,01 dans un milieu d'infection virale contenant 15 du milieu VP SFM (Invitrogen). Dans le cas des essais qui ont été réalisés avec le support chromatographique Fractogel EMD-SO3-, la production du virus rabique a été réalisée à l'échelle de 150 litres en utilisant des biogénérateurs de 150 litres. On a récolté les surnageants de culture des cellules infectées aux jours J7 (Rl), J11 (R2) et J15 (R3). Après chaque récolte, on a réintroduit du milieu d'infection virale neuf. 20 1.2) Clarification et analyse des récoltes L'étape de clarification a été réalisée en utilisant deux filtrations frontales successives ; la première en utilisant un pré-filtre en polypropylène de 8 �m (Sartopure PP2, SARTORIUS) qui élimine les quelques microporteurs aspirés lors de la récolte, les cellules Vero décollées des supports et les débris cellulaires de taille importante ; la 25 deuxième en utilisant un filtre PES, composé de la combinaison de deux filtres 0,8 �m et 0,45 �m (Sartopore 2, SARTORIUS) qui élimine les agrégats. La quantité de virus rabique présente dans les récoltes clarifiées a été déterminée en mesurant la quantité de glycoprotéine G (gpG) mesurée par la méthode ELISA suivante : 30 On a répartit dans les puits d'une microplaque ELISA environ 0,12�g/100�1 d'une solution d'un anticorps monoclonal 1112-1 anti-gpG (dont les caractéristiques sont décrites dans Journal of Clinical investigation (1989), volume 84, pages 971 à 975 ) 2944292 - 23 - préalablement diluée dans un tampon de � coating � (tampon carbonate/bicarbonate 0,2M, pH 9,6). Après une incubation d'une nuit en chambre froide, suivie de plusieurs lavages avec un tampon de lavage (tampon phosphate additionné de Tween 20, 0,05 %), on a distribué dans chaque puits 100 �l d'un tampon de saturation (tampon phosphate 5 additionné de sérum albumine bovine à 1 %). Après une incubation d'une heure à 37°C, suivie de plusieurs lavages, on a réalisé une gamme de dilution de chaque échantillon à tester dans un tampon de dilution (tampon phosphate additionné de Tween 20 à 0,05 % et de sérum albumine à 0,1 %). En parallèle, on a réalisé dans chaque microplaque une gamme de dilution d'un étalon de référence, qui a été calibré vis-à-vis de la référence 10 internationale du NIBSC (par exemple PISRAV). Après une nouvelle incubation d'une heure à 37°C, suivie de plusieurs lavages, on a distribué dans chaque puits 100 �l d'une solution d'un anticorps monoclonal Dl de souris anti-gpG (dont les caractéristiques sont décrites dans Biologicals (2003), volume 31, pages 9 à 16) qui a été biotinylé et utilisé après dilution au 1/5000 dans le tampon de dilution. Les plaques ont été laissées 1 heure 15 à 37°C puis lavées à plusieurs reprises avant de distribuer dans chacun des puits 100 �l d'une solution de streptavidine couplée à la peroxydase (Southern Biotechnology Associates) préalablement diluée au 1/15000 dans le tampon de dilution. Après une nouvelle incubation d'une heure à 37°C suivie de plusieurs lavages on a distribué dans chaque puits 100 �l d'une solution d'un tampon citrate 0,05 M, pH 5 contenant le 20 substrat de révélation (0-Phenylènediamine). Après un temps d'incubation de 30 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière on a stoppé la réaction de révélation en ajoutant 50 �l/puits d'une solution d'H2SO4 2N. La lecture spectrophotométrique des microplaques a été réalisée à deux longueurs d'onde (492 nm et 620 nm). La densité optique mesurée est la différence entre les deux lectures pour 25 tenir compte de l'absorption du plastique. Le calcul de l'activité relative a été effectué par la méthode des droites parallèles selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne. Le titre en virus rabique de l'échantillon est basé sur la détermination de la concentration en glycoprotéine G du virus rabique qui est exprimée en UI/ml par rapport à la référence. 30 La quantité de protéines totales présente dans les récoltes clarifiées a été mesurée en utilisant la méthode classique de Bradford commercialisé sous la forme d'un Kit par Biorad (Ref : 500-0006) 2944292 - 24 - La quantité d'ADN présente dans les récoltes clarifiées a été mesurée par q-PCR. Le protocole opératoire est similaire à celui qui est décrit par Lebron J.A. et coll. dans Developments in Biologicals (2006), vol 123, pp35-44. Après avoir extrait au moyen du 5 kit commercial DNA Extractor de Wako Pure Chemicals l'ADN résiduel des récoltes clarifiées, on a introduit dans chaque échantillon une quantité fixe d'un ADN exogène qui sert de contrôle interne de l'amplification par PCR. En parallèle, on a préparé un échantillon d'ADN génomique provenant de cellules Vero lysées par congélations/décongélations successives, traitées par la suite à la RNase A à raison de 10 2 mg de RNase A pour 2,5.105 cellules, puis enfin que l'on a ensuite purifié en utilisant le kit QlAamp Virus BioRobot 9604 (QIAGEN). L'ADN purifié a été quantifié par spectrophotométrie à 260 nm. A partir de cet ADN purifié (ADN standard) on a réalisé une gamme d'étalonnage en réalisant des dilutions de raison 10. Les échantillons provenant des récoltes clarifiées ainsi que les échantillons de la gamme d'étalonnage ont 15 été soumis ensuite à un cycle d'amplification par PCR après avoir rajouté pour chaque essai la sonde fluorescente Alpha -MPr3, les deux amorces, le prémélange 2X QuantiTect Probe Master Mix (Qiagen) dans un volume d'eau dépourvu de toute nucléase (qsp 50 �l). Le cycle d'amplification a été réalisé en utilisant l'appareil Light Cycler 480 (Roche Applied Science) en utilisant le programme 95°C, 15 min.; 40 cycles 20 comprenant deux étapes 95°C, 15 sec.; 60°C, 60 sec. On a ensuite calculé par interpolation la quantité d'ADN résiduel extrait des récoltes clarifiées sur la base de la mesure de la fluorescence observée par rapport à la gamme d'étalonnage établie avec l'ADN standard. La quantité d'ADN résiduel a été ajustée par un facteur correctif correspondant au rendement de charge mesuré pour l'échantillon par l'intermédiaire de la 25 quantification de l'ADN exogène. En général, les concentrations en glycoprotéine G (correspondant au titre en virus rabique), en protéines totales et en ADN dans les récoltes clarifiées se situaient dans des gammes allant de 1 à 3 UI/ml pour la glycoprotéine G, de 50 à 100 �g/ml pour les protéines totales et de 5 à 50 ng/ml pour l'ADN. 30 2944292 - 25 - 1.3) Mesure des performances de différents supports chromatographiques pour leur capacité à éliminer les acides nucléiques et à retenir le virus rabique L'élimination de l'ADN cellulaire dans les récoltes clarifiées a été évaluée sur les supports chromatographiques suivants : 5 Supports anioniques - Fractogel � EMD TMAE (Merck) (échangeur d'anions fort) ; - Fractogel � EMD DEAE (Merck) (échangeur d'anions faible) - Membrane chargée positivement Sartobind � Q (Sartorius) - Membrane chargée positivement Mustang � Q (Pall) 10 Support cationique - Fractogel � EMD S03- (Merck) (échangeur de cations fort) Des essais préliminaires ont été réalisés sur la membrane chargée positivement Sartobind� de façon à identifier la meilleure concentration en sel pour éluer le 15 virus par chromatographie échangeuse d'anions. Ces essais ont montré que le virus était élué tout au long du gradient de sel y compris à 1M. Ceci était également vrai pour les autres supports anioniques. Les profils d'élution obtenus nous ont conduits à choisir une forte concentration en NaCl pour éluer le maximum de virus. L'ADN étant élué à partir de 350-400 mM, le compromis a 20 été de choisir une concentration en NaCl de 450mM. Les supports ont été ensuite équilibrés en tampon TRIS 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,5. Les récoltes clarifiées ont été ensuite mises en contact avec les différents supports étudiés. Les supports ont été ensuite rincés en tampon Tris 20 mM, NaCl 150mM, pH 7,5. Le virus a été ensuite décroché du support au moyen d'un 25 tampon d'élution Tris 20 mM, Nacl 450 mM, pH 7,5 Les essais sur colonne de Fractogel � ont été réalisés en utilisant la récolte clarifiée R1. Entre 35 et 50 UI de virus rabique et entre 13 et 25 �g d'ADN ont été injectés par ml de gel. Les essais sur membrane ont été réalisés en utilisant la récolte clarifiée R2. 13 UI 30 de virus rabique et entre 350 et 450 ng d'ADN ont été injectés par cm de membrane. 2944292 - 26 - Les conditions opératoires utilisées pour la chromatographie échangeuse de cations sur Support Fractogel� EMD SO3- ont été également optimisées. Le support Fractogel� EMD SO3- a été équilibré en utilisant un tampon Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH =7,5. 5 Les essais sur support Fractogel� EMD SO3- ont été réalisés en utilisant la récolte clarifiée R1. On a contrôlé la conductivité du milieu (entre14 mS/cm et 20 mS/cm) et le pH (entre 7,5 et 7,7). Environ 50 UI (sur la base du dosage de la glycoprotéine G) de virus rabique ont été injectés par ml de gel. Le support a été ensuite lavé en tampon Tris 20mM, NaCl 150mM, pH= 7,5 puis 10 le virus a été élué dans le tampon Tris 20mM, NaCl 600 mM, pH=7,5 avec récupération du pic viral en une fraction indépendante. Le support a été finalement régénéré en tampon Tris 20mM, NaCl 1M, pH=7,5 Les résultats obtenus figurent dans le tableau II ci-dessous 15 Tableau II : Performances des différents supports chromatographiques Caractéristiques du Volume Volume Titre Rendt. en Titre ADN quantité support injecté dans lequel viral* virus Résiduel ADN chromatographique se trouve le (mUUml) (ng/ml) éliminé (en produit %). d'intérêt ADN Mustang Q 6,93 L 7,3 L 875 47 % 4** 93% Sartobind Q 1,65 L 1,82 L 894 50% 1** 98% Fractogel 1L 1,065 L 744 54% 196** 48% EMD-TMAE Fractogel 0,990 L 1,01 L 672 70% 161** 73% EMD-DEAE 2944292 - 27 - *: le titre en virus rabique a été déterminé sur la base de la mesure de la glycoprotéine G par ELISA ** : le titre en ADN résiduel a été mesuré par q PCR directement sur le produit recueilli 5 * * * : le titre en ADN résiduel a été mesuré par qPCR après concentration de l'éluat d'un facteur 6 par ultrafiltration Les supports membranaires chargés positivement (Sartobind� (Sartorius) ou Mustang� Q (Pall)) facilitent l'élimination de l'ADN (plus de 90% de l'ADN est éliminé dans la fraction recueillie) mais par contre les rendements en virus 10 récoltés sont relativement faibles ( 50%) mais au détriment de l'élimination de l'ADN (73 % de l'ADN est éliminé dans le meilleur des cas). Par contre, lorsque l'on 15 utilise le support cationique Fractogel� EMD SO3-, on observe à la fois une très bonne élimination de l'ADN (plus de 95 % de l'ADN est éliminé dans la fraction recueillie) et un très bon rendement en virus récolté (> 70 %). Les performances chromatographiques du support cationique Fractogel� EMD SO3- sont donc meilleures que celles que l'on constate avec les supports chromatographiques 20 anioniques. 1-4) Mesure des performances chromatographiques de différents supports chromatographiques cationiques 25 Nous avons cherché à optimiser le rendement en virus récolté en testant d'autres supports cationiques. Les caractéristiques des supports cationiques qui ont été testés sont les suivantes : - Membrane chargée négativement Sartobind� S (Sartorius) : membrane cellulosique sur laquelle est greffée des groupements d'acide sulfonique 30 - Membrane chargée négativement MustangTM S (Pall) : membrane de polyethersulfone sur laquelle est greffée des groupements d'acide sulfonique - Gel CaptoTM S (GE Healthcare): gel dont la matrice est à base d'agarose sur laquelle sont greffés des groupements sulfo ethyl - 28 - Fractogel� EMD SO3- (Merck): gel dont la matrice est à base de polymethacrylate sur laquelle sont greffés des groupements sulfoisobutyl Les conditions opératoires qui ont été utilisées pour la chromatographie sur ces différents supports sont les mêmes que celles qui ont été utilisées pour la chromatographie sur support Fractogel� EMD SO3- (Voir paragraphe 1-3). Différents paramètres ont été évalués pour la chromatographie sur membrane Sartobind� S (Sartorius) (volume de support : 7 ml) : le pH de la récolte clarifiée injectée qui se situait dans une gamme allant de 7,5 à 8,0, la conductivité de la récolte clarifiée injectée qui se situait dans une gamme allant de 4,5 mS/cm à 17,9 mS/cm et la charge virale injectée qui se situait dans une gamme allant de 4 UI/ml à 11 UI/ml de support. Quels que soient les paramètres étudiés, les rendements en virus obtenus ont toujours été En conclusion, sur l'ensemble des supports chromatographiques anioniques et cationiques testés, le support Fractogel� EMD S03- (Merck) est le seul qui présente des performances qui soient réellement exploitables au plan industriel puisque le rendement en virus est > 70 % et élimine en une seule étape plus de 95 % de l'ADN. 2944292 - 29 - Exemple 2 : Intérêt de la combinaison d'une étape de chromatographie sur support Fractogel� EMD SO3- avec une étape de traitement à la benzonase dans le procédé de purification du virus rabique. 5 Pour évaluer l'intérêt de cette association, on a comparé cette méthode à une méthode de purification du virus rabique par double traitement à la benzonase. Le traitement à la benzonase est utilisé classiquement pour éliminer les acides nucléiques se trouvant dans un produit biologique. Lorsqu'on répète ce traitement enzymatique on augmente encore l'élimination de l'ADN. 10 On a comparé un procédé de purification du virus rabique qui utilise un � double traitement à la benzonase � avec le protocole de l'invention selon lequel on a combiné une étape de chromatographie échangeuse de cations sur support Fractogel� EMD SO3- avec un traitement à la benzonase. Dans le cas du double traitement à la benzonase (UF-Bz-UF-Bz) le protocole de 15 purification qui a été utilisé correspond à celui qui est décrit dans le Tableau III ci-après : 5 10 15 20 2530 - 30 - Tableau III - Etapes du procédé de purification du virus rabique par double traitement à la benzonase (UF-Bz-UF-Bz). Récolte clarifiée 0,45 �m Ultrafiltration / Dialfiltration Concentration 20 x C Benzonase 15 U/ml de récolte Ajustement MgC12 2mM Ultrafiltration / Dialfiltration Concentration 5 x C 35 40 45 50 Ajustement MgC12 2mM Benzonase � 15 U/ml de récolte Ultracentrifugation sur gradient de saccharose 10 15 20 30 35 40 45 -31 Dans le cas du traitement combinant une chromatographie échangeuse de cations sur support Fractogel� EMD SO3- et un traitement à la benzonase (CEX- UF-Bz) le procédé de purification qui a été utilisé correspond à celui qui est décrit dans le Tableau IV ci-après : Tableau IV Etapes du procédé de purification du virus rabique par combinaison d'une chromatographie échangeuse de cations sur support fractogel� EMD SO3- et traitement à la benzonase (CEX-UF-Bz). Récolte clarifiée 0,45 �m Chromatographie Fractogel EMD S03- Ultrafiltration / Dialfiltration Concentration 100 x C Ajustement MgC12 2mM Benzonase � 15 U/ml de récolte Ultracentrifugation sur gradient de saccharose 25 2944292 - 32 - Dans les deux cas le procédé de purification a été réalisé en partant d'une même récolte R1 clarifiée d'un volume d'environ 20 litres qui a été divisée en deux 5 parties égales Dans le cas du procédé UF-Bz-UF-Bz les deux ultrafiltrations ont été réalisées sur membrane PES Medium Screen 100KD (PALL) et suivies d'une diafiltration en tampon Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,5, la première étape d'ultrafiltration aboutissant à une réduction d'un facteur d'environ 20 le volume de la récolte clarifiée, tandis que la deuxième ultrafiltration a entrainé une réduction d'un facteur global d'environ 100 le volume de la récolte clarifiée. Avant chaque traitement à la benzonase, on a rajouté une solution de MgC12 de sorte que la concentration dans le diafiltrat était 2 mM. Le traitement à la benzonase a été réalisé en ajoutant 15 U/ml de récolte brute au milieu réactionnel et en laissant le milieu réactionnel pendant 2 heures à température du laboratoire. Dans le cas du procédé CEX- UF-Bz, l'étape chromatographique a été réalisée selon les modalités décrites dans le paragraphe 1-3. L'éluat contenant le virus purifié a été ensuite concentré d'un facteur d'environ 5, puis diafiltré et traité à la benzonase en utilisant le même protocole que celui qui a été utilisé dans le procédé UF-Bz-UF-Bz. Dans les deux procédés, l'étape d'ultracentrifugation a été réalisée sur coussins de sucrose 34-60 % avec un rotor 45 type Ti à 21000 rpm pendant 2 h à +5°C. Les fractions du gradient contenant le virus purifié ont été recueillies, rassemblées puis analysées pour leur contenu en ADN, en virus et en protéines totales. Le Tableau V, ci-après, indique aux différents stades de purification les titres en ADN, en gpG, et en protéines totales, obtenus en fonction du procédé utilisé. -33- Tableau V : Bilan des deux procédés de purification Stade paramètres Proc. UF-Bz-UF-Bz Proc. CEX-UF-Bz purification volume 9620 ml 9620 ml Récolte clarifiée Titre ADN (ng/ml) 270 Titre gpG (UI/ml) 1,7 ADN/gpG 713 x 103 pg/4,5 UI volume 100 ml UF-Bz-UF Titre ADN (pg/ml) NT Titre gpG (UI/ml) 106,6 UI/ml volume 100 ml CEX-UF Titre ADN (pg/ml) NT Titre gpG (UI/ml) 113 UI/ml volume 800 ml 800 ml Titre ADN (pg/ml) 1,1 x 103 4,5 Rendement en virus* 63% 55% UF/Bz/UF : correspond au stade du deuxième diafiltrat dans le protocole UF-Bz-UF-Bz 5 juste avant le deuxième traitement à la benzonase. CEX/UF : correspond au stade du diafiltrat obtenu après élution chromatographique et concentration de l'éluat par ultrafiltration dans le protocole CEX- UF-Bz juste avant le traitement à la benzonase 10 Après UC : correspond au stade où les fractions du gradient contenant le virus purifié ont été rassemblées après ultracentrifugation et après avoir ajusté le volume total de telle sorte qu'il soit 12,5 fois plus concentré que le volume de la récolte clarifiée * : le rendement en virus est calculé sur la base des titres ELISA gpG 2944292 - 34 - Les résultats du tableau V montrent que la combinaison d'une chromatographie sur support Fractogel� EMD SO3- suivi d'un traitement à la benzonase (procédé CEX-UFBz) est bien plus efficace dans l'élimination de l'ADN qu'un double traitement à la benzonase (procédé UF-Bz-UF-Bz). On arrive à réduire d'au moins lLogio supplémentaire la quantité d'ADN résiduelle en utilisant le procédé CEX-UF-Bz. Ces résultats ont également été confirmés à des échelles de volumes différents. On note également que le procédé CEX-UF-Bz élimine également d'une façon plus efficace les protéines contaminantes que le procédé UF-Bz-UF-Bz puisque l'on retrouve presque deux fois moins de protéines totales par unité de virus (exprimée sous la forme d'UI de gpG) (5,4 �g dans le procédé CEX-UF-Bz au lieu de 8 �g par UI de gpG dans le procédé UF-Bz-UF-Bz. Ceci résulte du fait que plus de 65 % des protéines sont éliminées lors de l'étape de chromatographie sur support Fractogel� EMD SO3-. Ces résultats montrent que la combinaison d'une étape de chromatographie sur support Fractogel� EMD SO3- avec une étape de traitement à la benzonase dans le procédé de purification du virus rabique exerce une action conjuguée sur l'élimination de l'ADN dans les récoltes clarifiées de virus rabique qui est bien supérieure à l'effet observé lors d'un double traitement à la benzonase.20 REVENDICATIONS1. Un procédé de purification du virus rabique comprenant une seule étape de chromatographie par échange d'ions, la dite étape étant une chromatographie par échange de cations, selon laquelle : a) on met en contact le surnageant d'une culture de cellules infectées par ce virus avec un support de chromatographie échangeur de cations de sorte que le virus rabique se fixe sur ce support, et dans un deuxième temps b) on élue le virus de son support. 2. Un procédé selon la revendication 1, selon lequel le support de chromatographie échangeur de cations comprend une matrice de polyméthacrylate sur laquelle sont greffés par liaison de covalence des groupements sulfo isobutyl. 3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, selon lequel les cellules infectées par le virus rabique sont les cellules VERO. 4. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 3, selon lequel le surnageant de culture des cellules infectées par le virus rabique a été obtenu en utilisant un milieu d'infection virale qui ne contient pas de protéine sérique. 5. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, selon lequel le surnageant de culture des cellules infectées par le virus rabique a été obtenu en utilisant un milieu d'infection virale qui ne contient pas de protéine ayant un poids moléculaire supérieur à 10 KD. 6. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, selon lequel on clarifie le surnageant de culture de cellules infectées par le virus rabique avant de le mettre en contact avec le support de chromatographie échangeur de cations. 7. un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la quantité de protéines totales mesurée dans l'éluât correspond à moins de 40 % de la quantité de protéines totales mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique, en ce que la quantité d'ADN mesurée dans l'éluât correspond à moins de 5 %, de préférence à moins de 2,5 % et de façon encore plus préférée à moins de 1 % de la quantité d'ADN mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique et en ce que la quantité de virus mesurée dans l'éluât correspond à au-2- moins 70 % de la quantité de virus mesurée dans le surnageant qui a été mis en contact avec le support chromatographique. 8. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, selon lequel après avoir élué le virus de son support chromatographique on concentre éventuellement l'éluât puis, on le traite avec une nucléase. 9. Un procédé selon la revendication 8, selon lequel on concentre l'éluât selon une méthode d'ultrafiltration suivie d'une diafiltration. 10. Un procédé selon la revendication 8 ou 9, selon lequel la nucléase est une endonuclease. 11. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant une étape supplémentaire de purification du virus rabique selon laquelle on soumet l'éluât à une ultra centrifugation sur un gradient de saccharose et on recueille la ou les fractions du gradient qui contiennent le virus purifié. 12. Un procédé selon lequel on inactive le virus rabique au moyen d'un agent d'inactivation virale après l'avoir purifié selon l'une des revendications 1 à 11. 13. Un procédé selon la revendication 12, selon lequel l'agent d'inactivation virale est la 13-propiolactone. 14. Un procédé de fabrication d'un vaccin contre la rage selon lequel : a) on infecte une culture de cellules avec le virus rabique, b) on purifie le virus rabique à partir du surnageant de culture de cellules infectées que l'on recueille à l'issue de l'étape a) selon un procédé tel que décrit dans l'une des revendications Ià13, c) on conserve la suspension de virus purifié obtenue en b) dans un tampon de conservation, et d) on répartit la suspension de virus purifié obtenue en c) sous la forme de vaccins uni-doses ou multi-doses. 15. Un procédé de fabrication d'un vaccin contre la rage selon lequel : a) on infecte une culture de cellules avec le virus rabique,-3- b) on purifie le virus rabique à partir du surnageant de culture de cellules infectées que l'on recueille à l'issue de l'étape a) selon un procédé tel que décrit dans l'une des revendications Ià13, c) on mélange la suspension de virus purifié obtenue en b) dans un tampon de lyophilisation, d) on répartit le mélange obtenu en c) sous la forme de vaccins unidoses ou multi-doses, et e) on lyophilise les doses de vaccins. 16. Un vaccin contenant du virus rabique purifié et inactivé que l'on peut obtenir selon le procédé de fabrication tel que décrit dans la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que la quantité d'ADN résiduel mesurée par PCR quantitative et la quantité de protéines totales qui sont présentes dans une dose efficace de vaccin (ou dans une dose de vaccin qui contient 2,5 UI selon le test NIH) sont respectivement inférieures à 20 pg et à 40 tg et de façon préférée sont respectivement inférieures à 10 pg et à 20 ug et étant entendu que plus de 70 % des protéines totales sont des protéines du virus rabique.