Brevet FR2925339A1 — publié le 20090626

Médicament pour le traitement du cancer du pancréas La présente invention est relative au traitement thérapeutique du cancer pancréatique. Elle concerne notamment une nouvelle composition pour le traitement de ce cancer et une méthode de traitement thérapeutique associée. Le cancer du pancréas est la sixième cause de décès par cancer en France (7181 décès en 2000), la cinquième cause de décès par cancer dans les pays industrialisés et aux États-Unis il est devenu la 4e cause de décès chez l'homme. En France son incidence est de 5 à 10/100 000 habitants par an et augmente légèrement chaque année (1 à 2%). Il représente 7 % des cancers de l'appareil digestif et touche plus souvent l'homme (60 %) que la femme (40 %). Le diagnostic étant souvent établi au stade avancé dans la moitié des cas des métastases sont détectées, ce qui fait que la durée moyenne de survie dans ce cancer n'est que de quelques mois avec 4 à 6 % de survivants à 5 ans. La médiane de survie, tous stades confondus, est de 4 à 7 mois et elle augmente de 15 à 18 mois chez les patients ayant subi une résection. Si la tumeur est non opérable ou bien présente des métastases, la chimiothérapie peut être envisagée chez les patients en bon état général et informés. Les taux de réponse sont de l'ordre de 15 à 30 %. Les médicaments utilisés sont la gemcitabine, la combinaison gemcitabine et oxaliplatine, le 5-fluorouracile associé à un dérivé du platine. Ces chimiothérapies permettent d'accroître modérément la médiane de survie des patients métastasés, qui est de 4 à 6 mois sans traitement. Malgré les progrès enregistrés avec de nouvelles chimiothérapies, le cancer du pancréas reste de pronostic très sévère. Même chez les patients opérés à visée curative, la survie n'est que d'environ 20 % à 5 ans, du fait de récidives locorégionales et métastatiques. Devant la gravité et le très mauvais pronostic qui accompagne un cancer du pancréas, l'accroissement progressif de son incidence dans la population des pays occidentaux notamment, il existe un réel besoin de proposer un traitement alternatif plus efficace que ceux proposés actuellement. L'Asparaginase est une enzyme produite à partir de microorganismes bactériens (E. coli ou Erwinia chrysanthemi) utilisée depuis une trentaine d'année en chimiothérapie anti-leucémique. Cette enzyme hydrolyse et déplète l'asparagine, acide aminé indispensable à la fabrication des protéines nécessaires à la vie cellulaire. Or, certaines cellules lymphoblastiques cancéreuses n'ont pas, à l'inverse des cellules normales, la capacité de fabriquer elles-mêmes leur asparagine et sont dépendantes de sources extracellulaires pour la synthèse de leurs protéines. Le traitement par l'Asparaginase les prive de ce constituant essentiel et abouti ainsi à leur mort. Cet antimitotique est sélectif des cellules tumorales. L'Asparaginase native induit cependant la production d'anticorps circulants à l'origine d'une augmentation de la clairance de l'Asparaginase et de réactions allergiques parfois très sévères (Wang B et al., Leukemia, 2003 ; 17 (8) : 1583-1588). Par ailleurs, la courte demi-vie de l'enzyme (24 h) implique des injections et des hospitalisations répétées. Ces limitations majeures ont conduit au développement d'une forme pégylée, la PEG-Asparaginase, qui a obtenu l'agrément de la FDA pour une utilisation en première intention dans le traitement de la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL). Dans les années 80, différents auteurs ont étudié les effets de l'Asparaginase in-vitro sur des lignées cellulaires humaines de cancer du pancréas. La première évidence d'effet de l'Asparaginase sur une lignée cellulaire humaine cancéreuse pancréatique (MIA Paca-2) est décrite en 1977 par Yunis et coll. (Yunis AA et coll., Int J Cancer, 1977 ; 19(1):128-35). L'Asparaginase, incubée en présence des cellules MIA Paca2 a un effet significatif sur la croissance des cellules à une concentration de 0,1 UI/ml et une inhibition totale de la croissance cellulaire avec mort cellulaire à des concentrations de 0,5 et 1 UI/ml. Les auteurs montrent également que cet effet est spécifique aux cellules pancréatiques car l'Asparaginase (utilisée à une concentration de 1 UI/ml) a un effet sur une autre lignée cancéreuse pancréatique (PANC-1). Mais aucun effet de l'Asparaginase n'est observé sur la croissance de lignées cellulaires humaines pulmonaire et de mélanome. Les auteurs n'ont pas déterminé le mécanisme de sensibilité des cellules MIA Paca-2 à l'Asparaginase. L'année suivante, les travaux de Wu et coll. ont confirmé ces résultats sur les cellules MIA Paca-2 et PANC-1 (Wu M, et coll., Int J Cancer, 1978 22(6):728- 33). Bien que le mécanisme ne soit pas encore clair, ceux-ci ont suggéré que l'action de l'Asparaginase sur les cellules cancéreuses pancréatiques passe par une inhibition de la synthèse protéique. Ces résultats ont également été obtenus avec une autre enzyme, l'Acinetobacter Glutaminase Asparaginase (AGA), avec une meilleure efficacité que l'Asparaginase (WU MC et coll., ln Vitro, 1982 Sep;18(9):750-4). Les auteurs montrent que cette enzyme inhibe totalement la croissance cellulaire des cellules MIA Paca-2 et PANC-1 à une concentration de 0, 0025 UI/ml (aucun effet à cette concentration avec l'Asparaginase) et que cette activité s'exerce également par l'activité glutaminase de l'enzyme. Un coup d'arrêt à l'intérêt d'utiliser l'Asparaginase dans le traitement du cancer du pancréas, est survenu à la suite de la publication de résultats obtenus lors d'un essai clinique de phase II visant à tester l'efficacité de l'Asparaginase dans le traitement du carcinome pancréatique (Lessner HE, et coll. Cancer Treat. Rep., 1980 ; 64:1359-1361). L'Asparaginase d'E. Coli a été injectée en IV à 1000 UI/Kg/jour à dix patients atteints de cancer pancréatique non résécable. Des effets secondaires lourds apparaissent rapidement. Le traitement a donc été stoppé prématurément. Ainsi la seule étude clinique réalisée conclut à l'absence d'effet thérapeutique de l'Asparaginase dans le cas du cancer pancréatique. Un regain d'intérêt est apparu plus récemment avec des travaux portant sur les formes pégylées de l'Asparaginase. Dans une étude préclinique présentée au congrès AACR en 1999 (Denis LJ et al. Proc Am Assoc Cancer Res, 1999:p.23) l'addition de PEG-Asparaginase à 1 UI/ml a permis d'inhiber la croissance cellulaire de 61% (MIA Paca-2), de 100% (PANC-1) et de 51% pour les cellules BxPC-3 incubées en présence de PEGAsparaginase à 10 UI/ml. L'IC50 de la PEG-Asparaginase pour les cellules MIA Paca-2 et PANC-1 est respectivement de 0,13 et 0,25 UI/ml. Les auteurs ont également réalisé une expérience in vivo en implantant des cellules MIA Paca-2 à des souris Nude. Après traitement de ces souris pendant 14 jours avec injection de PEG-Asparaginase (12,5 UI/g ou 25 UI/g par jour en i.p.) avec ou sans gemcitabine (80 mg/kg au jour 1, 4, 7 et 10 en i.p.), les auteurs observent une inhibition de la croissance cellulaire de 59 % (PEG-Asparaginase seule), de 63,5% (Gemcitabine seule) et de 85, 9% (PEG-Asparaginase et Gemcitabine). Des résultats complémentaires ont été présentés au congrès AACR de 2006 (Supra P. et al. AACR novembre 2006). Cette étude présente l'évaluation in vitro et in vivo de la PEG-Asparaginase (Oncaspar�, Enzon Pharmaceuticals) pour le traitement des tumeurs solides (pancréas, ovaire et lymphome). La cytotoxicité in vitro de la PEG-Asparaginase (IC50) est de 0,27 UI/ml (PANC-1), de 0,66 UI/ml (MIA Paca-2), de 0,46 UI/ml (PANC 10.05), supérieure à 20 UI/ml (CFPAC-2 et AsPC-1). L'efficacité in vivo de la PEG-Asparaginase a été déterminée sur des xenogreffes de cellules MIA Paca-2 (2,5X106 cellules) implantées à des souris. Ainsi, un traitement de PEG-Asparaginase (0,8 KUI/Kg) permet de diminuer de 14% le volume tumoral, la gemcitabine (80mg/Kg) permet une diminution de 29% et l'association des deux permet une diminution de 48%. L'association de la PEG-Asparaginase (Oncaspar�) et de la gemcitabine (Gemzar�) a un effet inhibiteur sur la croissance des tumeurs solides. L'Asparaginase étant utilisée depuis plus de 30 ans, les effets indésirables associés à cette enzyme sont bien connus et sont principalement : certaines allergies avec des manifestations cliniques, le diabète et la pancréatite, des troubles mentaux et des troubles de la coagulation. L'administration d'Asparaginase provoque des réactions d'hypersensibilité chez l'homme. Le mécanisme d'apparition est complexe et, à l'heure actuelle, n'est pas complètement élucidé. L'Asparaginase est un immunogène direct en raison de son poids moléculaire élevé (> 100 000 Da) et de sa nature protéique. Les réactions d'hypersensibilité pourraient relever soit d'un mécanisme IgE-dépendant (anaphylaxie au sens classique), soit d'une activation du complément. Elle conduit à la formation d'anticorps spécifiques chez de nombreux patients. L'Asparaginase provoque l'apparition d'IgG spécifiques circulantes qui possèdent des propriétés neutralisantes se traduisant par une augmentation de la clairance de l'enzyme et une réduction de son efficacité thérapeutique (Müller HJ, Boos J. Crit Rev Oncol/hematol 1998 ; (28):97-113). Ces anticorps ont été observés avec les trois formes d'Asparaginase (E. Coli, Erwinia et PEG-Asparaginase), bien que la forme PEG semble la moins immunogène. Les symptômes sont le plus souvent un simple érythème localisé voire même seulement une douleur au point d'injection, jusqu'à l'oedème laryngé, le bronchospasme et/ou l'hypotension, exceptionnellement un choc anaphylactique généralisé pour les cas les plus graves (Zubrod CG. Pediatrics, 1970 ; (45) : 555-9). Le taux d'incidence des réactions immuno-allergiques dues à l'Asparaginase est imprécis : entre 5 à 70% des patients traités. En moyenne, un quart des enfants développent une réaction sévère (Mathé G, Amiel JL, Clarysse A et al. Recent Results Cancer Res. 1970 (33) : 279-87; Woo MH, et al. Leukemia, 1998 Oct;12(10):1527-33 ; Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK. J Clin Oncol, 2000 Apr;18(7):1525-32.). Différents facteurs peuvent expliquer cette variabilité : préparations d'Asparaginase à partir de différentes souches bactériennes, utilisation de thérapies concomitantes, voie d'administration (IV ou IM). La fréquence des réactions augmente avec le nombre d'injections sur un cycle de traitement et le délai entre deux cures de traitement (Mathé 1970). Le développement d'anticorps spécifiques ou de réactions d'hypersensibilité est une cause fréquente d'interruption du traitement (Woo MH, Hak LJ, Storm MC, Sandlund JT, Ribeiro RC, Rivera GK. J Clin Oncol, 2000 Apr;18(7):1525-32). Chez les patients ayant développé des anticorps spécifiques, on peut observer une réduction de l'efficacité thérapeutique de l'Asparaginase se manifestant par une diminution de la durée et/ou de l'incidence des rémissions, ainsi que des modifications de la pharmacocinétique de l'Asparaginase. Chez les patients ayant présenté une réaction d'hypersensibilité, la crainte d'une réaction plus sévère conduit à interrompre le traitement par précaution. En raison de l'arrêt prématuré du traitement suite à des réactions allergiques, l'objectif thérapeutique de l'Asparaginase, qui est d'atteindre une déplétion en asparagine plasmatique sur une durée déterminée, est bien souvent non atteint. Le pancréas est un des organes cibles de la toxicité de l'Asparaginase probablement du fait d'une synthèse protéique élevée. Cette toxicité peut se manifester soit par une pancréatite aiguë (le plus souvent) soit par un diabète. La pancréatite aiguë dont les manifestations cliniques vont de la maladie bénigne spontanément résolutive, aux complications (hémorragie, pseudo-kyste) jusqu'à la maladie fulminante mortelle, est de mécanisme mal élucidé. Les pancréatites toxiques induites par des chimiothérapies utilisées en oncologie ne sont pas rares. Celle de l'Asparaginase est bien documentée et de nombreux cas ont été rapportés dans la littérature. L'incidence globale de l'Asparaginase en termes de pancréatites toute forme confondue, y compris les formes PEG, varie de 2 à 16 % selon les études (Knoderer HM et coll., Pediatr Blood Cancer. 25 août 2006 ; Müller 1998, 2 : 97-113 ; Alvarez OA et coll., Med. Pediatr. Oncol. 2000, 34(3) : 200-5). Ces pancréatites peuvent se compliquer d'hémorragies, de pseudo-kystes, mais les décès restent rares. L'apparition de pancréatite impose l'interruption de l'Asparaginase ainsi que la mise en route d'un traitement de cette pancréatite. Au vu de l'ensemble des études l'administration de doses répétées et relativement élevées d'Asparaginase (3000 UI à 60000 UI/m2/dose) est un facteur favorisant. L'autre complication pancréatique possible d'un traitement par Asparaginase est l'apparition de diabète dans 1 à 14% des cas selon les études. Le mécanisme semble être la diminution de la production d'insuline par les cellules 13 des îlots de Langerhans. L'hyperglycémie et la glycosurie sans kétonémie sont les symptômes les plus fréquents. Cet effet est réversible et disparaît à l'arrêt de la prise du traitement. L'hyperglycémie peut être majorée par l'administration concomitante avec la prednisone mais son risque de survenue est plus faible. Ainsi, l'utilisation de l'Asparaginase chez des patients dont le pancréas est altéré dans le cas du traitement du cancer pancréatique pourrait être dangereuse et ces effets indésirables doivent être pris en considération. L'essai clinique chez l'homme avec la forme native de l'Asparaginase rapporté supra (Lessner et coll. 1980) a montré que ces craintes sont parfaitement justifiées. D'un autre côté, les formes pégylées n'ont pas encore montré qu'elles étaient aptes à un usage en clinique humaine pour le traitement du cancer du pancréas. Les résultats obtenus jusqu'à présent se limitent à des résultats in vitro et in vivo sur des modèles de souris xénogreffes avec tumeur du pancréas. Or, l'aptitude des formes pégylées à être employées en clinique est loin d'être établie compte tenu du fait que la molécule reste d'une part allergisante (Müller et coll., 1998) et d'autre part toxique pour le pancréas (Knoderer 2006 ; Müller 1998; Alvarez 2000). Enfin, et en outre, l'efficacité clinique même de l'Asparaginase dans le cas du cancer du pancréas reste à démontrer. L'encapsulation de l'Asparaginase dans les érythrocytes en vue d'améliorer son index thérapeutique a fait l'objet de développements. Une étude de tolérance de l'Asparaginase encapsulée dans les globules rouges a été entreprise par Kravtzoff et coll. (C. Eur J Clin Pharmacol, 1996;51(3-4):221-5). Treize patients atteints principalement de lymphomes non Hodgkinien ont reçu une injection d'Asparaginase encapsulée dans les globules rouges (30 à 200 UI/Kg). L'étude montre une absence de réaction allergique par rapport à l'injection directe d'Asparaginase (27%). De plus, l'injection d'Asparaginase encapsulée dans les érythrocytes permet une déplétion en asparagine durant 50 jours consécutifs. D'autre part, WO-A-2006/016247 décrit l'encapsulation de l'Asparaginase dans les globules rouges et l'amélioration des propriétés pharmacocinétiques de l'enzyme dans le cadre d'une application au lymphome et à la leucémie lymphoblastique aigüe. Si la forme encapsulée de l'Asparaginase montre l'absence de réaction allergique, son administration encapsulée dans des globules rouges laisse planer un doute certain sur les conséquences au niveau pancréatique, notamment chez des patients en mauvais état général ou ayant un cancer pancréatique évolué, dans la mesure où, les globules rouges finissent par être détruits et libèrent leur contenu dans le compartiment vasculaire. De même, l'efficacité clinique n'a pas été démontrée. Les inventeurs ont pour la première fois démontré l'efficacité de l'Asparaginase encapsulée dans des globules rouges dans le modèle de souris xénogreffes avec tumeur du pancréas. Dans le même temps, ils ont obtenu des résultats montrant l'absence d'Asparaginase libre résiduelle dans le compartiment vasculaire. Ils ont également démontré que l'amélioration de la pharmacocinétique liée à l'utilisation des globules rouges permet d'utiliser des quantités d'enzymes très réduites par rapport à ce qui serait nécessaire d'utiliser sous forme libre ou sous forme PEG, réduisant d'autant plus les risques de toxicité pancréatique. Les résultats obtenus par les inventeurs ouvrent la voix à l'utilisation de l'Asparaginase encapsulée dans le traitement du cancer du pancréas, y compris chez des patients ayant une forme évoluée de ce cancer ou des patients sensibles. Un premier objet de l'invention est donc une suspension de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase comme médicament pour traiter un cancer pancréatique. Un deuxième objet de l'invention est une composition thérapeutique ou un médicament destiné au traitement du cancer pancréatique, comprenant une quantité efficace d'une suspension de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase. Typiquement, les globules rouges sont en suspension dans une solution saline pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir d'un milieu standard pour globules rouges, notamment d'une solution de NaCl (de préférence à 0,9%) éventuellement additionnée d'ingrédients tels que glucose, dextrose, adénine et/ou mannitol. Des milieux standards utilisables sont le SAG-mannitol et l'ADsol qui sont des solutions à base d'adénine, de glucose, de mannitol et de chlorure de sodium. La solution peut en outre comporter un conservateur tel que la L-carnitine. La solution peut aussi comprendre un ou plusieurs autres principe(s) actif(s), notamment agent(s) de chimiothérapie destiné(s) au traitement du cancer du pancréas, comme il va être décrit ci-après, ou principe(s) actif(s) destiné(s) à traiter des symptômes ou désordres pouvant accompagner le cancer pancréatique. La suspension peut être prête à l'emploi et avoir un hématocrite adapté pour être administrée par injection ou par perfusion sans dilution. Elle peut aussi être conditionnée de manière à devoir être diluée avant administration par injection ou par perfusion. Selon l'invention, l'hématocrite de la suspension prête à l'emploi est 20 avantageusement compris entre environ 40 et environ 70%, de préférence entre environ 45 et environ 55%, mieux d'environ 50%. Sous sa forme à diluer, l'hématocrite peut être supérieur, notamment compris entre environ 60 et environ 90%. La suspension est de préférence conditionnée sous un volume d'environ 25 10 à environ 250 ml. Le conditionnement est de préférence en poche de sang du type adapté pour une transfusion sanguine. La quantité d'Asparaginase encapsulée correspondant à la prescription médicale est de préférence contenue intégralement dans la poche de sang. La quantité d'Asparaginase encapsulée peut notamment être comprise 30 entre environ 30 et environ 300 UI par ml de suspension de globules rouges. Elle est de préférence comprise entre environ 70 et environ 150 UI par ml. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase ou d'une suspension de tels globules rouges, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'un cancer pancréatique. Cette utilisation reprend les caractéristiques présentées pour la suspension et la composition thérapeutique ou médicament. L'invention vise le traitement de patients quel que soit le stade de développement du cancer pancréatique, de la forme histologique prise par le cancer et de l'éventualité d'une pancréatite plus ou moins sévère. L'invention vise notamment : - le traitement d'un patient ayant une tumeur primitive du pancréas ; - le traitement d'un patient à adénopathie régionale, avec ou sans ganglions lymphatiques régionaux touchés ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique avec métastases à distance ; - le traitement d'un patient ayant un cancer de la tête du pancréas ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à adénocarcinome ductulaire ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à cystadénocarcinome mucineux ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à carcinome intraductulaire mucineux ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à adénocarcinome acinaire ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à tumeurs kystiques, éventuellement à cystadénocarcinome ; - le traitement d'un patient ayant un cancer pancréatique à tumeur des canaux excréteurs du pancréas ; - le traitement d'un patient ayant un cancer du pancréas endocrine ; - le traitement d'un patient après résection totale ou partielle du pancréas. Un autre objet encore de l'invention est une méthode de traitement du cancer pancréatique, dans lequel on administre à un patient qui en a besoin une dose efficace d'une suspension de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase, ou d'une composition thérapeutique ou médicament selon l'invention. Cette méthode peut être appliquée aux différentes formes de la maladie, comme cela a été décrit ci-dessus. L'administration se fait par injection intraveineuse ou intra-artérielle et de préférence par perfusion à partir d'une poche de sang ou analogue. L'administration est typiquement réalisée par intraveineuse dans le bras ou par cathéter central. On administre notamment d'environ 10 à environ 250 ml de suspension (une dose), composition thérapeutique ou médicament selon l'invention. A partir de 20 ml, on préfère employer la perfusion. La quantité d'Asparaginase encapsulée peut notamment être comprise entre environ 30 et environ 300 UI par ml de suspension de globules rouges. Elle est de préférence comprise entre environ 70 et environ 150 UI par ml. Un traitement comprend l'administration d'une dose ou de plusieurs doses selon le protocole décidé. Celui-ci peut prévoir plusieurs administrations à une fréquence mensuelle, par quinzaine ou hebdomadaire, sur la durée préconisée de traitement. Ce traitement peut consister à administrer l'équivalent de 20 à 500 UI d'Asparaginase par kg de poids corporel à chaque fois (par prise). De préférence, on administre de 50 à 150 UI par kg par prise. La présente invention prévoit également des associations des globules rouges encapsulant de l'Asparaginase avec des produits de chimiothérapie classique dans le traitement du cancer du pancréas. Ainsi, l'association peut être réalisée avec de la gemcitabine, du cisplatine, de l'oxaliplatine, le 5-fluorouracile associé à un dérivé du platine, par exemple cisplatine ou oxaliplatine. Dans un premier aspect, l'association se fait au sein de la suspension, composition thérapeutique ou médicament selon l'invention. Selon un deuxième aspect, l'association est une association par administration séparée, concomitante ou décalée dans le temps, au même patient. L'Asparaginase per se est désignée par le numéro de CAS: 9015-68-3. Sa 30 dénomination usuelle est Asparaginase ; ses autres dénominations communes sont: Colaspase, L-Asparaginase, L-Asparagine aminohydrolase. Le terme Asparaginase au sens de la présente invention recouvre l'Asparaginase de toute origine, elle peut être notamment d'origine naturelle ou recombinante, ainsi que tout dérivé incorporant l'Asparaginase, par exemple forme PEG, ou un fragment conservant l'activité de la L-Asparaginase. Il recouvre aussi l'Asparaginase quelle que soit l'origine bactérienne. Ainsi, l'Asparaginase peut être de type E. coli , notamment E. coli HAP-A-1-3, de type Erwinia chrysantemi ou de type Wolinella succinogenes. Par � type � on entend qu'elle peut être obtenue à partir d'une culture de la bactérie considérée ou qu'elle peut être recombinante c'est-à-dire une forme d'Asparaginase de cette bactérie obtenue par génie génétique. Dans une forme de réalisation préférée, elle est de type E. coli HAP-A-1-3, Le terme Asparaginase recouvre aussi les Asparaginase-like qui sont au sens de l'invention des enzymes bactériennes ayant une activité L-Asparagine aminohydrolase. A titre d'exemple, on peut citer l'Asparaginase Glutaminase d'Acinetobacter (AGA). Les techniques permettant d'encapsuler des principes actifs dans des globules rouges sont connues et la technique de base par lyse-rescellement, qui est préférée ici, est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EP-A-679 101, auxquels l'homme du métier pourra se référer. Selon cette technique, on alimente en continu le compartiment primaire d'un élément de dialyse (par exemple boudin de dialyse ou cartouche de dialyse) avec une suspension de globules rouges, tandis que le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension de globules rouges afin de lyser les globules rouges ; ensuite dans une unité de rescellement, on induit le rescellement des globules rouges en présence de l'Asparaginase par augmentation de la pression osmotique et/ou oncotique, puis l'on recueille une suspension de globules rouges contenant l'Asparaginase. Parmi les variantes décrites jusqu'à présent, on préfère la méthode décrite dans WO-A-2006/016247 qui permet d'encapsuler l'Asparaginase de manière performante, reproductible, sûre et stable. Cette méthode comprend les étapes suivantes : 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8°C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon de globules rouges de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque (y compris en parallèle), 3 - procédure de lyse et d'internalisation de l'Asparaginase, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8°C, comprenant le passage de la suspension de globules rouges à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8°C, dans une cartouche de dialyse ; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et 4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40°C, et en présence d'une solution hypertonique. Par � internalisation �, on entend pénétration de l'Asparaginase à l'intérieur des globules rouges. Notamment, pour la dialyse, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8°C, de préférence entre + 2 et + 6°C, typiquement aux alentours de + 4°C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %. La fragilité osmotique est avantageusement mesurée sur les globules rouges juste avant l'étape de lyse, en présence ou en l'absence d'Asparaginase dans la suspension. Les globules rouges ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes. Concernant la manière d'opérer la procédure de lyse-rescellement, avec mesure et prise en compte de la fragilité osmotique, l'homme du métier pourra se référer pour plus de détails à WO-A-2006/016247. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs. La Figure 1 est un graphe illustrant la régression tumorale en fonction du temps chez des souris traitées selon des protocoles différents. Exemple 1: Méthode d'encapsulation de la L-Asparaqinase en qlobules rouqes murins La L-Asparaginase (Kidrolase�, OPI-EUSA Limonest Francel est encapsulée dans des globules rouges murins (souris OF1) par la méthode de dialyse hypotonique en boudin de dialyse. Le sang est préalablement centrifugé afin d'enlever le plasma, puis est lavé trois fois en NaCl 0,9%. L'hématocrite est amené à 70% en présence de l'Asparaginase, ajoutée à une concentration finale de 400 UI / ml de globules rouges (GR), avant de démarrer la dialyse. La dialyse dure 50 minutes à 4°C contre un tampon de lyse à faible osmolarité. Les globules rouges murins sont ensuite rescellés grâce à l'ajout d'une solution à forte osmolarité et en incubant 30 minutes à 37°C. Après deux lavages en NaCl 0,9% et un lavage en Sag-Mannitol supplémenté en sérum albumine bovine BSA (6%), les globules rouges sont amenés à hématocrite 50%. Les globules rouges encapsulant la L-Asparaginase sont appelés L-Aspa GR. L'encapsulation génère des L-Aspa GR à une concentration de 40 UI de Asparaginase/ml de GR à 50% d'hématocrite. Au cours de la procédure d'encapsulation, le sang total, les GR lavés, les GR mélangés à la L-Asparaginase (avant dialyse) et les GR chargés en LAsparaginase (après dialyse) sont contrôlés pour : Hématocrite (Fit) Volume globulaire moyen (VGM) Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) Concentration en hémoglobine totale Numération cellulaire Des aliquotes des suspensions cellulaires sont prélevés avant et après la dialyse hypotonique pour mesurer l'activité enzymatique de la L-Asparaginase. Le dosage de la L-Asparaginase a été réalisé selon le protocole publié dans : Orsonneau et al, "Dosage automatique en cinétique de l'activité L-Asparaginase plasmatique en suivi thérapeutique des leucémies aiguës lymphoblastiques", Ann Biol Clin, 62 : 568-572. Exemple 2: Détermination des paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des L-Aspa GR chez la souris Des L-Aspa GR murins ont été injectés à des souris OF1 de façon à déterminer la durée de demi-vie des L-Aspa GR en circulation chez la souris ainsi que de démontrer la déplétion en L-Asparagine dans le plasma de souris. Une dose unique de 200 UI/Kg a été injectée à chaque souris par voie intraveineuse. La durée de demi-vie des L-Aspa GR est de 12,39 � 0,74 jours (calcul basé sur l'activité de l'enzyme). Lorsque la demi-vie des L-Aspa GR murins est calculée via un marquage cellulaire (CFSE-L-Aspa GR), la valeur est de 16,52 � 3,13 jours et de 15,83 � 3,31 jours pour des GR simplement marqués au CFDA-SE (CFSEGR). La déplétion en L-Asparagine plasmatique est totale ( Tableau 1 : Données pharmacocinétiques obtenues pour les L-Aspa GR et pour 20 les GR murins marqués au CFDA-SE (CFSE-GR) GR L-Asparaginase Survie à 24h Demie-vie Survie à 24h Demie-vie (jours) (jours) (%) (%) L-Aspa GR - -57,9 � 2,5 12,39 � 0,74 CFSE-L-Aspa GR 80,7 � 0,7 16,52 � 3,13 76,7 � 1,4 12,20 � 1,38 CFSE-GR 92,7 � 2,6 15,83 � 3,31 - - Tableau 2 : Mesure de l'activité L-asparaqinase résiduelle en fonction du temps des L-Aspa GR et de la L-Asparaqinase libre Temps 15 min 24h 3j 9j 14j 20j Activité L-Aspa GR 100 57,1 46,9 39,8 24,9 10,6 Asparaginase L-Aspa libre 100 3,3 0 0 0 0 résiduelle (%) En outre, le dosage de la L-Asparaginase plasmatique circulante montre qu'au-delà de 24 heures après l'injection des L-Aspa GR aux souris, les valeurs obtenues sont à la limite de détection du dosage (entre 1 et 3 UI / Litre). Exemple 3 : Répression des tumeurs humaines pancréatiques en réponse à une injection de L-Aspa GR chez la souris Le but de cette expérience est d'injecter des L-Aspa GR à des souris porteuses de tumeurs pancréatiques humaines et d'observer une régression tumorale. Une lignée sensible à la L-Asparaginase in vitro, et déficiente en L-Asparagine synthétase a été choisie : Mia PaCa-2. Pour étudier la régression tumorale suite à l'injection de L-Aspa GR, un protocole in vivo a été mis en place avec 4 groupes de 12 souris. Un traitement de référence dans le cancer du pancréas, la Gemcitabine, est inclus au protocole. Préparation des substances tests et contrôles Substance test 1: L-Asparaginase chargée dans des globules rouges murins (appelé L-Aspa GR). La procédure de préparation des L-Aspa GR est décrite auparavant (voir exemple 1). Substance test 2: Gemcitabine Substance contrôle 2: PBS (tampon de reprise de la Gemcitabine) 25 Culture des cellules Mia PaCa-2 Des cellules tumorales pancréatiques humaines (Mia PaCa-2) en phase de croissance exponentielle (provenance ATCC; American Type Culture Collection), ont été soumises à une digestion trypsique, puis comptées et lavées pour être finalement remises en suspension dans un milieu DMEM sans sérum afin de les injecter par voie sous-cutanée à 48 souris athymiques nu/nu. Animaux Les 48 souris athymiques nu/nu (nude balb/c), âgées de 5-6 semaines et d'un poids compris entre 18 et 22 g ont été fournies par Harlan (France). Les animaux sont gardés 7 jours dans une unité spécialisée SPF (� specific-pathogen- free � ) avant le traitement. Les 48 souris ont été réparties de façon aléatoire dans 4 groupes de 12 souris. Lorsque le volume tumoral a atteint 200 mm3, les souris ont subi des injections de : - Injection unique de L-Aspa GR (200 UI/Kg), par voie intraveineuse dans un volume ne devant pas excéder 10 ml/Kg - Quatre injections de Gemcitabine (60 mg/Kg) par voie intraveineuse Planification des traitements La planification a été organisée de la façon suivante: Groupe 1: Les souris ont reçu du PBS Groupe 2: Les souris ont reçu 4 injections de gemcitabine (60 mg/Kg), à raison de 2 injections par semaines pendant 2 semaines Groupe 3: Les souris ont reçu une injection unique de L-Aspa GR et 4 injections de gemcitabine (60 mg/Kg), à raison de 2 injections par semaines pendant 2 semaines Groupe 4: Les souris ont reçu une injection unique de L-Aspa GR L'injection des différents produits a été réalisée en aveugle. Une mesure des tumeurs a été réalisée régulièrement (tous les 3 à 4 jours) pendant 57 jours. Résultats La figure 1 est un graphe représentant la régression tumorale des différents groupes en fonction du temps. Les deux groupes contrôles (1 et 2) présentent des croissances tumorales régulières de 0 à 1058�939 mm3 et 1353�1016 mm3 respectivement. Le groupe 2 (gemcitabine) ne démontre pas un effet du médicament sur la croissance des tumeurs pancréatiques chez la souris (injection à un volume tumoral de 196�57 mm3 et à 57 jours, 1353�1016 mm3). En revanche, les injections de L-Aspa GR en association avec la gemcitabine ralentissent de façon importante la croissance tumorale : ce traitement a été injecté alors que les tumeurs faisaient 190�43 mm3 et après 57 jours, le volume tumoral est de 494�719 mm3 contre 1353�1016 mm3 pour les souris du groupe 2 traitées uniquement avec la gemcitabine. Enfin, les LAspa GR (groupe 4) sont encore plus efficaces sur la régression tumorale qu'en association avec la gemcitabine car après injection à un volume tumoral de 193�46 mm3, ce dernier n'atteint que 285�225 mm3 après 57 jours. Les globules rouges murins encapsulant la L-Asparaginase (L-Aspa GR) ont été le traitement le plus efficace pour ralentir la croissance des tumeurs pancréatiques humaines implantées chez la souris. De manière surprenante, les L-Aspa GR seuls sont plus efficaces sur la régression tumorale qu'en association avec la gemcitabine.20 REVENDICATIONS 1. Suspension de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase comme médicament pour traiter un cancer pancréatique. 2. Composition thérapeutique ou médicament destiné au traitement du cancer pancréatique, comprenant une suspension de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase. 3. Suspension, composition ou médicament selon la revendication 1 ou 2, prêt à l'emploi. 4. Suspension, composition ou médicament selon la revendication 1 ou 2, à diluer avant emploi. 5. Suspension, composition ou médicament selon la revendication 4, l'hématocrite avant dilution étant compris entre 60 et 90%. 6. Suspension, composition ou médicament selon la revendication 3, 4 ou 5, dans lequel l'hématocrite de la suspension prête à l'emploi est comprise entre environ 40 et environ 70%, de préférence entre environ 45 et environ 55%, mieux d'environ 50%. 7. Suspension, composition ou médicament selon l'une quelconque des 20 revendications précédentes, comprenant entre 30 et 300 UI d'Asparaginase par ml, de préférence entre 70 et 150 UI par ml. 8. Suspension, composition ou médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un agent de chimiothérapie. 9. Suspension, composition ou médicament selon la revendication 25 précédente, comprenant de la gemcitabine, du cisplatine, de l'oxaliplatine, du 5-fluorouracile associé à un dérivé du platine, par exemple cisplatine ou oxaliplatine, comme agent de chimiothérapie. 10. Utilisation de globules rouges encapsulant de l'Asparaginase pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'un cancer pancréatique. 30 11. Utilisation selon la revendication 10, pour la préparation d'un médicament, comprenant entre 30 et 300 UI d'Asparaginase par ml, de préférence entre 70 et 150 UI par ml. 12. Utilisation selon la revendication 10 ou 11, pour la préparation d'un médicament sous forme d'une suspension de 10 à 250 ml. 13. Utilisation selon la revendication 10, 11 ou 12, pour la préparation d'un médicament destiné à apporter de 20 à 500 UI d'Asparaginase, de 5 préférence de 50 à 500 UI par kg de poids corporel et par prise.