Brevet FR2932089A1 — publié le 20091211

Utilisation d'un extrait de Limnophila comme agent cosmétique, et composition cosmétique le contenant. La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait de plantes appartenant au genre Limnophila comme agent cosmétique et une 5 composition cosmétique le contenant. Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de l'espèce végétale Limnophi/a conferta comme agent cosmétique, et son utilisation en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques, ainsi que les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites 10 compositions. Arrière plan technologique L'apoptose est un processus biologique actif d'élimination par fragmentation, de certaines cellules de l'organisme. Elle constitue une élimination programmée de cellules au 15 niveau des tissus biologiques, et sous contrôle génétique. L'élimination peut être naturelle (cellules surnuméraires dans un tissu) ou induite par différents stress. La cascade biologique de l'apoptose est connue et met en oeuvre nombre d'effecteurs tels que les caspases, notamment les caspases 20 effectrices 3 ou 7, qui vont réaliser le programme d'apoptose, et les caspases initiatrices 8 et/ou 9, qui vont le déclencher. On connaît également un certain nombre d'inhibiteurs de l'apoptose (Deveraux et al, Genes Dev. 13 (1999), pp. 239-252), parmi lesquels la survivine. Ces inhibiteurs régulent donc la survie des cellules 25 participant ainsi à l'homéostasie cellulaire dans les tissus biologiques. La survivine, seule membre de la famille des IAPs (Inhibitor of Apoptosis Protein), est une protéine bi-fonctionnelle, capable à la fois de pondérer l'apoptose des cellules et de réguler leur cycle cellulaire. La survivine inhibe en particulier l'activation de certaines 30 caspases, notamment les caspases 3, 7 et 9. Cette protéine est exprimée dans les tissus embryonnaires à forte croissance, mais ne l'est pas clans les tissus différenciés adultes, excepté dans les tissus ayant un renouvellement cellulaire physiologique et/ou engagés dans un processus de réparation. Ainsi au niveau cutané, elle est tout particulièrement exprimée par les kératinocytes de la couche basale de l'épiderme qui assurent la formation et le renouvellement de ce dernier. C'est dans cette couche basale que se trouvent les kératinocytes souches de l'épiderme, cellules à haut potentiel de régénération de ce tissu dont il a été démontré qu'elles étaient les plus efficaces à former un épiderme complet (JL Xie et al, J Piast Reconstr. Aesthet. Surg. 2007;60(9); 983-90). Or il a été montré que la survivine est principalement exprimée dans les cellules souches de l'épiderme (Marconi A, Dal/ag/io K, Lotti R, 15 Vaschieri Ç Truzzi F, Fantini F, Pincelli C, Stem cells 2007 25 149-155). A l'inverse une surexpression de la survivine montre une diminution significative du nombre de cellules apoptotiques dans l'épiderme après une exposition aux rayonnements ultraviolets (Grossman et al., 2001) Clin Invest 108; 991û999) 20 Il a aussi été démontré que l'inactivation des intégrines béta-1, abolit complètement l'expression cellulaire de la survivine (Marconi A et al, Stem cells 2007: 25 : 149-155) et conduit les cellules à l'apoptose. Les intégrines béta-1 sont des protéines d'adhésion par lesquelles les kératinocytes de la couche basale épidermique adhèrent aux 25 protéines de la jonction dermo-épidermique. Les intégrines béta-1 sont exprimées plus fortement par les cellules souches de l'épiderme (P Jones, Ce// 1993, 73 : 713-724, Kaur J Invest Dermatol 2006, 126, 1450-1458) ce qui corrobore l'observation d'une expression plus forte de la survivine dans ces cellules. 30 Or au cours du vieillissement, on observe une baisse de l'expression des intégrines béta-1 dans les kératinocytes (B Le Var/et et a/ J Investig Dermato/ Symp Proc. 1998, 3; 172-179) et dans les zones cutanées photoexposées ridées (S Bosset et al British J Dermatol 2003, 148; 7770-778). Ainsi les protéines assurant au niveau des cellules basales de l'épiderme le maintien de la survivine, diminuent avec l'âge et l'on observe parallèlement une augmentation de la sensibilité à l'apoptose de ces cellules ainsi qu'une diminution de cellules cyclantes (Zu/iani et al, J. Invest. Dermatol. 2004, 123:2, A50, 302), observations convergeant pour indiquer un probable déficit en survivine dans les peaux âgées. Outre son rôle régulateur de l'apoptose, la survivine a été identifiée comme un constituant du � chromosomal passenger complex � qui coordonne les chromosomes avec le cytosquelette au cours de la mitose ( rader et al, EMBO reports, 2006,7, 1, 85û94 ; elle joue donc un rôle essentiel dans la division normale des cellules, division altérée au cours du vieillissement avec pour corollaire, un moindre renouvellement de l'épiderme, son affinement, et le développement des rides. La survivine est donc un régulateur de la survie et de la résistance des kératinocytes ; elle agit en modulant la sensibilité à l'apoptose des kératinocytes localisés au niveau de la couche basale de l'épiderme dont les cellules souches. Elle régule aussi leur capacité de renouvellement et de régénération de l'épiderme. Elle permet ainsi d'épargner le capital cellulaire de l'épiderme et de maintenir un renouvellement cellulaire épidermique efficace. État de la technique Le document WO 2006/069192 (GILLfJIE Co) divulgue l'utilisation en cosmétique d'agents inhibiteurs de la survivine pour un effet de réduction de la pousse des poils et des cheveux. A ce jour, il n'a pas été décrit de composés agissant en tant que stimulant de l'expression de la survivine, pour des applications en 30 dermatologie ou cosmétique. Des auteurs ont décrit l'effet anti-oxydant et anti-radicaux libres d'un extrait aqueux de Limnophila aromatica administré par voie orale à des rats (Kukongviriyapan et al., Biol. Pharm Bull. 200730 (4) 661-666). Des auteurs ont étudié des extraits alcooliques de Limnophila conferta et Limnophila heterophy/la, administrés par voie orale à des rats et en ont conclu que ces extraits alcooliques présentent une activité intéressante pour la cicatrisation des plaies mais aucune activité significative sur un modèle d'inflammation aiguë (Reddy et al., Ire. J. Pharmacognosy (1991), 29, 2 145-153). Cependant, à ce jour, il n'existe pas de données concernant l'utilisation d'espèces végétales appartenant au genre Limnophila, et plus particulièrement l'espèce Limnophila conferta, sous la forme du produit d'un quelconque procédé d'extraction, en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis en évidence qu'un extrait obtenu à partir d'un matériel végétal comprenant ou formé par au moins une plante du genre Limnophila, en particulier de l'espèce végétale Limnophila conferta, active ou stimule l'expression de la protéine survivine dans les kératinocytes de la couche basale de l'épiderme, et plus particulièrement dans les cellules souches de ladite couche basale. Ledit extrait joue ainsi un rôle protecteur vis-à-vis des cellules régénératrices de l'épiderme humain et tout particulièrement des cellules souches de la couche basale de l'épiderme. Ces extraits peuvent ainsi être utilisés en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques, visant notamment à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets ou encore à favoriser la longévité cellulaire ou tissulaire ; à favoriser la reconstruction d'un épiderme endommagé, notamment par le rayonnement ultraviolet, ainsi que la cicatrisation de plaies cutanées de la peau normale et des plaies ulcéreuses cicatrisant mal ; à prévenir ou ralentir la chute des cheveux, à accélérer ou favoriser leur repousse ou le renforcement capillaire ; à favoriser la croissance des ongles et/ou en renforcer la résistance ; en tant qu'adjuvant prolongateur de cultures de cellules in-vitro à des fins de production d'épiderme de culture (épidermes reconstruits) dans un but thérapeutique, par exemple dans des greffes ou encore dans le maintien de populations purifiées de cellules souches épidermiques ou des follicules pileux in vitro à des fins thérapeutiques ou de recherche. Buts de l'invention L'invention a pour but principal de proposer l'utilisation d'un extrait végétal cosmétiquement acceptable obtenu à partir de plantes, 10 comme agent cosmétique. L'invention a également pour but l'utilisation dudit extrait en tant qu'agent cosmétique, ou comme agent actif dans des compositions cosmétiques, et les méthodes de soin cosmétique utilisant lesdites compositions : 15 a) pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en ralentir les effets ; et/ou b) pour la reconstruction de l'épiderme ou de son stratum corneum lorsqu'il est endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, et/ou 20 c) pour restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, accélérer ou favoriser leur repousse, notamment en cas d'alopécie ou pour renforcer les cheveux fragiles, et/ou d) pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa 25 résistance. L'invention a encore pour but principal de fournir une méthode de soin cosmétique, utilisant un extrait végétal cosmétiquement acceptable, notamment pour réaliser les soins cosmétiques indiqués ci-dessus. 30 L'invention a enfin pour but principal de fournir une méthode de culture in-vitro de cellules souches et/ou de cellules à haut potentiel clonogénique à des fins d'études fondamentales ou de production d'épiderme de culture, tel que de l'épiderme reconstruit, dans un but thérapeutique, par exemple, comme dans le cas de greffe, suite à des brûlures ou des plaies ulcéreuses qui cicatrisent mal, comprenant l'utilisation d'un extrait végétal acceptable avec ladite culture de cellules, obtenu à partir de plantes. Description de l'invention: Un premier objet de la présente invention porte sur l'utilisation d'un extrait végétal obtenu à partir d'un matériel végétal formé par, ou comprenant, au moins une plante dont l'espèce appartient au genre Limnophila, en particulier un extrait obtenu à partir d'un matériel végétal formé par, ou comprenant, au moins une plante de l'espèce végétale Limnophila conferta, comme agent cosmétique. Le matériel végétal utilisé peut être la plante entière ou une partie de la plante telle que la racine, le rhizome ou une partie aérienne, notamment la tige, les feuilles, les fleurs, les graines ou les boutons floraux. L'extrait est préférentiellement obtenu à partir des parties aériennes de la plante et en particulier des tiges et des feuilles. Préalablement à l'étape d'extraction elle-même, le matériel végétal peut avoir été séché et/ou broyé. Selon une mise en oeuvre préférée de l'extraction, le matériel végétal se trouve à l'état sec et broyé. Outre des plantes du genre Limnophila, et en particulier de l'espèce végétale Limnophila conferta , le matériel végétal à partir duquel est préparé l'extrait de l'invention peut comprendre une ou plusieurs autres plantes, indifféremment sous forme de plantes entières ou de parties de plante. Ces plantes peuvent être d'un genre différent du genre Limnophila, ou des plantes d'une autre famille, connues pour avoir des propriétés similaires ou complémentaires à celles mises en évidence pour les plantes du genre Limnophila. On pourra choisir en particulier des plantes dont les extraits sont connus pour ralentir ou prévenir les effets du vieillissement de la peau, par divers mécanismes tels que le maintien de l'intégrité de la structure de la peau ou une action sur les rides. L'extrait peut être préparé par différents procédés d'extraction connus de l'Homme du Métier. Toutefois, l'extraction est en particulier réalisée par mise en 10 contact du matériel végétal sélectionné avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires. Selon la présente invention, l'expression � solvant polaire � signifie que le solvant a une valeur d'indice de polarité P' qui est égale ou supérieure à une valeur de 4. 15 L'indice de polarité est une grandeur calculée sur la base de grandeurs thermodynamiques (de solubilité et de changement d'état) qui met en évidence le caractère plus ou moins polaire d'une molécule. On se reportera, pour les indices de polarité des solvants, à l'article de L.R. SNYDER ; Classification of the solvent properties of 20 common l/quids; Journal of Chromatography, 92 (1974), 223-230, qui est inclus par référence à la présente demande. A titre de solvant polaire ou de mélange de solvants polaires utilisable pour l'étape d'extraction, on choisira avantageusement un solvant ou un mélange de solvants choisi parmi l'eau, un alcool en Cl-C4, 25 choisi préférentiellement parmi l'éthanol ou le butanol, un glycol choisi préférentiellement parmi le glycérol, le butylène glycol et le propylène glycol et leurs mélanges. Les mélanges préférés sont des mélanges d'au moins un alcool et d'eau ou d'au moins un glycol et d'eau, comprenant au moins 100/0 v/v 30 d'alcool ou de glycol, le solde étant constitué d'eau. Parmi ces mélanges de solvant, on préfère un mélange d'eau et d'éthanol dans un rapport 50/50 v/v ou un mélange d'eau et de butylène glycol dans un ratio 50/50 v/v. L'étape d'extraction proprement dite est de préférence réalisée 5 par reflux à chaud, pendant au moins 30 minutes. Selon une autre variante de l'invention, l'extraction peut également être réalisée par un procédé mettant en oeuvre un solvant polaire à l'état subcritique, ledit solvant étant avantageusement de l'eau à l'état subcritique. 10 L'extraction peut aussi comprendre, de façon optionnelle, une étape supplémentaire consistant en un traitement du matériel végétal ou de l'extrait végétal, visant à le décolorer partiellement ou complètement, ou à le purifier. Cette étape de décoloration peut, par exemple, consister en un 15 traitement du matériel végétal préalablement à l'extraction elle-même, ou de l'extrait par une solution d'un solvant ou d'un mélange de solvants apolaires, de préférence en un traitement par un alcane en C6-C7, par exemple l'heptane, ou par un traitement consistant en une mise en contact de l'extrait avec des particules de charbon actif, ou bien encore 20 par un traitement à l'aide du CO2 à l'état supercritique. L'extraction peut être complétée par une étape d'élimination partielle ou totale des solvants d'extraction. Dans le premier cas, on concentre généralement l'extrait jusqu'à obtenir un concentré aqueux dépourvu de quantités significatives 25 de solvant organique, dans le second cas on obtient un résidu sec. De façon alternative, l'extrait obtenu peut se présenter sous forme d'une poudre après lyophilisation ou atomisation du produit de l'étape d'extraction dans le solvant ou mélange de solvant précité. La poudre peut être utilisée en l'état dans une composition 30 cosmétique ou dermatologique selon l'invention ou être re-dispersée dans un solvant ou un mélange de solvants. De façon générale, le produit de l'étape d'extraction peut être dissous ou dispersé dans un solvant ou un mélange de solvants, pour être utilisé à titre d'agent actif dans les compositions cosmétiques ou dermatologiques de l'invention. Le solvant ou le mélange de solvants dans lequel l'extrait est dissout ou dispersé peut être identique ou différent de celui ayant servi à l'extraction. L'extrait de l'invention peut également être adsorbé sur un support avantageusement choisi parmi les poudres de nylon, poreuses ou non poreuses et les micas ou toute substance minérale lamellaire. Dans ce cas, l'extrait utilisé est préférentiellement un extrait aqueux. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un extrait végétal d'une plante de l'espèce appartenant au genre Limnophila, de préférence un extrait de l'espèce végétal Limnophila conferta, en tant qu'agent actif dans des compositions cosmétiques. L'invention concerne en particulier l'utilisation de l'extrait dans une composition cosmétique, en tant que l'un des agents cosmétiques, ou comme l'un des agents actifs, destiné à réaliser les soins cosmétiques précités à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en ralentir les effets, et/ou pour la reconstruction de l'épiderme ou de son stratum corneum lorsqu'il est endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, et/ou pour restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, accélérer ou favoriser leur repousse, notamment en cas d'alopécie ou pour renforcer les cheveux fragiles, et/ou pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa résistance Selon l'invention, l'agent cosmétique, ou l'agent actif est plus particulièrement délivré par voie topique sous la forme d'une composition cosmétique le contenant comme l'un de ses agents actifs, en solution ou en dispersion dans au moins un véhicule cosmétiquement acceptable adapté à une application de ladite composition sur la peau du corps ou du visage. Ainsi, la composition cosmétique comprend une quantité efficace d'au moins un agent cosmétique tel que précédemment défini comprenant un extrait de la plante Limnophila, pour obtenir l'effet cosmétique recherché précité. Un autre objet de l'invention est une méthode de soin cosmétique pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en atténuer les effets, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance sur au moins une zone concernée de la peau du corps ou du visage, d'une quantité efficace d'au moins un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophila, tel que précédemment défini ou tel que résultant des exemples. Selon une première mise en oeuvre de l'invention, ladite méthode de soin cosmétique comprend l'application sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps présentant ou susceptible de présenter des signes de vieillissement cutané, d'une composition cosmétique, par exemple une crème ou un sérum, comprenant, comme l'un de ses agents actifs, au moins un extrait de la plante Limnophila, en vue d'obtenir un effet antiride, notamment par un phénomène de re- densification cellulaire de l'épiderme, et au creux des rides, et par l'accélération ou le maintien de son renouvellement. On sait que le phénomène de re-densification cellulaire de l'épiderme s'affine avec l'âge tandis que le renouvellement cellulaire de l'épiderme diminue avec l'âge. Selon une autre mise en oeuvre de l'invention, ladite méthode de soin cosmétique comprend l'application d'une composition comprenant, comme l'un de ses agents actifs, au moins un extrait de la plante Limnophila, sur des zones cutanées exposées au soleil, pour renforcer la résistance des kératinocytes de la couche basale de l'épiderme à l'apoptose de façon à réduire la perte de cellules qui en résulte au niveau basal et limiter ainsi le photo vieillissement. On sait que l'apoptose est induite par les UVB du rayonnement solaire. I1 Encore un autre objet de l'invention porte sur une méthode de soin cosmétique ou dermatologique pour la reconstruction de l'épiderme ou de son stratum corneum endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante précitée appartenant au genre Limnophi/a, en particulier un extrait de l'espèce végétal Limnophila conferta. Un autre objet de l'invention porte sur une méthode de soin cosmétique visant à restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, pour favoriser ou accélérer leur repousse, notamment en cas d'alopécie ou pour renforcer les cheveux fragiles, la croissance de la tige pilaire résultant de la multiplication des kératinocytes du bulbe pileux, caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie du cuir chevelu, d'une quantité efficace d'un agent cosmétiquement acceptable comprenant un extrait de la plante précitée appartenant au genre Limnophi/a, en particulier un extrait de l'espèce végétal Limnophila conferta. Encore un autre objet de l'invention porte sur une méthode de soin cosmétique pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa résistance, caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur l'ongle d'au moins une partie de la zone environnante, d'une quantité efficace d'au moins un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophi/a, en particulier une plante de l'espèce Limnophi/a conferta. Les essais réalisés par les inventeurs ont montré que les propriétés de l'extrait de l'invention peuvent être également obtenues ou améliorées dans des compositions cosmétiques, dans lesquelles l'extrait est associé avec d'autres agents actifs présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires de l'extrait de l'invention. En particulier, l'extrait de Limnophila peut être utilisé avec au moins un autre agent actif participant au maintien et à l'intégrité de la structure de la peau. Selon une première mise en oeuvre, la composition comprenant l'extrait selon l'invention peut en outre contenir au moins un autre agent cosmétiquement acceptable, en particulier activant ou stimulant l'expression de la survivine au niveau cutané, ledit agent pouvant être une molécule isolée ou le produit d'un procédé d'extraction, et étant avantageusement choisi parmi la forskoline ou un extrait en contenant tel qu'un extrait de Co/eus forskol ii, ou encore un extrait d'une plante du genre Lepechinia, en particulier de l'espèce végétale Lepechinia cau/escens, ou appartenant à l'une des espèces végétales parmi Nostoc commune, Scenedesmus dimorphus, Curcuma longa, Crocus sativus et Daniel/la oliveri. L'efficacité d'un agent actif cosmétique selon l'invention sera avantageusement améliorée par des molécules ou extraits capables de stimuler l'expression des protéines d'adhésion telles que les intégrines bêta 1 des kératinocytes épidermiques, et l'adhésion elle même de ces cellules (aspartate de magnésium, sels de manganèse et dérivés), certains peptides reconnus par l'intégrine comme la séquence arginine-glycine- acide aspartique, certains facteurs de croissance tels que le KGF). L'efficacité activatrice d'un agent actif cosmétique selon l'invention pourra également être avantageusement améliorée par des molécules ou extraits capables d'inhiber les phosphodiesterases qui dégradent l'AMPc, telles que les méthylxanthines et en particulier la cafeine, et conduisent à une augmentation du taux intracellulaire d'AMP cyclique. Les compositions comprenant un agent cosmétique tel que décrit précédemment peuvent en outre comprendre un ou plusieurs autres agents actifs pouvant être choisis parmi les substances ayant une activité éclaircissante de la peau ; les substances ayant une activité amincissante ; les substances ayant une activité hydratante ; les substances ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante ; les substances ayant une activité stimulant la microcirculation cutanée pour améliorer l'éclat du teint, en particulier du visage ; les substances ayant une activité séborégulatrice pour le soin des peaux grasses ; les substances destinées à nettoyer ou purifier la peau ; les substances ayant une activité antiradicalaire ; les substances destinées à atténuer ou retarder les effets du vieillissement de la peau, en particulier la formation de rides, par une activité visant à favoriser le maintien de la structure de la peau et/ou à limiter la dégradation de la matrice extracellulaire des couches superficielles du derme et de l'épiderme et/ou à obtenir un effet protecteur, correcteur ou restructurant de la peau ; les substances ayant une activité anti-inflammatoire. Outre l'extrait de l'invention, ladite composition cosmétique comprend au moins un excipient cosmétiquement acceptable qui peut être choisi parmi des pigments, des colorants, des polymères, des agents tensioactifs, des agents de rhéologie, des parfums, des électrolytes, des ajusteurs de pH, des agents anti-oxydants, des conservateurs, et leurs mélanges. La composition cosmétique selon (invention peut être par exemple un sérum, une lotion, une émulsion, par exemple une crème, ou bien encore un hydrogel, de préférence un masque, ou se présenter sous la forme d'un stick, ou encore d'un patch, ou encore un produit d'hygiène destiné au cuir chevelu tel qu'un shampoing ou un après-shampooing, ou bien encore un produit de maquillage, en particulier une composition destinée à être appliquée sur les ongles, par exemple un vernis à ongle. Les conditions de procédé pour l'obtention de l'extrait végétal de Limnophila, en particulier d'un extrait de l'espèce Limnophila conferta peuvent être les mêmes que celles décrites précédemment ou dans l'exemple 1 ou 2. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une composition cosmétique contenant au moins un extrait selon l'invention tel que précédemment défini seul ou en combinaison avec d'autres extraits, en solution ou en dispersion dans un véhicule cosmétiquement acceptable compatible avec une application topique sur la peau ou les ongles. Selon l'un quelconque des objets de l'invention, l'agent selon l'invention peut être délivré topiquement sous la forme d'une composition cosmétique comprenant, comme l'un de ses agents actifs, ladite composition comprenant en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable, par application de cette composition sur la partie du corps concernée. Enfin, un autre objet de l'invention porte sur une méthode de culture in-vitro de cellules souches et/ou de cellules à haut potentiel clonogénique à des fins d'études fondamentales ou de production d'épiderme de culture, tel que de l'épiderme reconstruit, dans un but thérapeutique, par exemple, comme dans le cas de greffe, suite à des brûlures ou des plaies ulcéreuses qui cicatrisent mal, caractérisée en ce qu'elle comprend l'ajout dans le milieu de culture d'un agent actif comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophi/a, en particulier une plante de l'espèce Limnophila conferta, en une quantité efficace pour le maintien en culture desdites cellules souches et/ou desdites cellules à haut potentiel clonogénique ou pour la production d'épiderme. Selon une variante, la concentration en agent(s) actif(s) ou en extrait est comprise entre 0,001% et 5% en poids du milieu de culture. Egalement, pour tout aspect de l'invention, par quantité efficace, on entend une quantité qui est au moins égale à la quantité nécessaire : a) pour prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou en ralentir les effets ; b) pour la reconstruction de l'épiderme ou de son stratum corneum lorsqu'il est endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, et/ou c) pour restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, accélérer ou favoriser leur repousse, notamment en cas d'alopécie, ou pour renforcer les cheveux fragiles, et/ou d) pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa résistance. e) pour le maintien en culture des cellules souches et/ou des cellules à haut potentiel clonogénique, afin de permettre de conserver ces cultures pendant un temps suffisant pour réaliser la culture dans de bonnes conditions, ainsi que pour réaliser la production d'épiderme, lorsqu'il y a lieu. En pratique, cette quantité efficace est aisément déterminable par l'homme de l'art. Généralement, la concentration efficace en agent comprenant l'extrait selon l'invention, ou en extrait, sera comprise entre 0,001% et 5% en poids, en particulier entre 0,01 et 3% en poids de la composition ou du milieu de culture. S'agissant de l'extrait, pour tout aspect, la concentration sera exprimée en poids d'extrait sec par rapport au poids de la composition. Comme démontré par des essais spécifiques qui ont été réalisés et rapportés aux exemples 1 et 2, l'agent cosmétique selon l'invention est efficace notamment en stimulant de manière inattendue l'expression de la survivine au niveau des cellules souches de la couche basale du derme ou de l'épiderme. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à partir de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de réalisation de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples, la température est en degrés Celsius, la pression est la pression atmosphérique, les quantités ou les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire. EXEMPLES MATERIELS ET METHODES 1. Activité d'un extrait de Limnophila conferta sur l'expression du gène de la survivine Wild Tyne (WT) (exemple 2). Le but de ces essais est d'étudier la modulation de l'expression du gène de la survivine wild type (WT) dans des kératinocytes humains normaux (KHN) traités par un extrait de Limnophila conferta. Le gène de la survivine WT est un des 5 isoformes connus du gène de la survivine. Les kératinocytes utilisés sont obtenus à partir de peau de femme caucasienne de 31 ans. 1.1 Traitement des cellules Les KHN sont ensemencés en boîte de Pétri de 100 mm de diamètre à raison de 1.500.000 cellules par boîte en milieu 1. 48 heures après l'ensemencement, les cellules sont traitées avec un extrait de Limnophila conferta (12,5 pg/ml) dilué dans du DMSO. Les cellules sont récupérées au bout de 8 heures de traitement pour en extraire les ARN totaux. 1.2 Obtention des ARN totaux à l'aide de l'extracteur EZ1 (Oiagen) Le milieu de culture des cellules est éliminé, et 500 pL de Qiazol (fourni dans le kit) sont ajoutés. Le lysat cellulaire est récupéré dans un tube de 1,5 mL. Les ARN totaux sont extraits selon le protocole du fournisseur. Les solutions d'ARNs totaux obtenues sont dosées, et leur qualité vérifiée, à l'aide d'une micro-plaque de 12 puits (RNA 6000 NanoChips) et d'un kit de réactifs (RNA 6000 Nano Reagents & Supplies). Les ARN totaux sont mis en présence d'une enzyme, la DNAse, pour éliminer l'ADN génomique éventuellement présent dans l'extraction. 0,5 pg d'ARN totaux est mis en présence de 1 pL de tampon 10X et 1 pL de DNAse RQ1 (1 U/pL) et 7 pL d'eau stérile (réaction dans 10 pL final) pendant 30 minutes à 37°C. La réaction est stoppée par l'ajout d'une solution d'arrêt pendant 10 minutes à 65°C, permettant d'inactiver la Dnase. 13 Réverse transcription 20 1.3.1 Réactifs de la RT-PCR EZ1 RNA Tissu Mini Kit RQ1 Rnase Free Dnase 25 Pd(N)6 dNTP RNAse inhibitor SuperSript Il Kit Hyprobe 30 Amorces Kit Béta-2-m Kit Brillant SybrGreenFournisseur Qiagen Promega Amersham Pharmacia Amersham Pharmacia Promega Invitrogen Roche Diagnostics Eurogentec Roche Diagnostics Stratagene 1.3.2 Protocole La réaction débute par l'ajout de 0,5 pL de dNTP 20 mM et de 1 SIL de pd(N)6 à 0,1 pg d'ARN traité par la DNAse (2,2 iiL) complété avec 8,3 pL d'eau. S'ensuit une incubation de 5 minutes à 65°C au cours de laquelle sont éliminées les structures secondaires des ARN. Replacé ensuite dans la glace, on ajoute 7 pL de mélange réactionnel contenant : - du tampon 5X qui doit être 1X final soit 4 pL - du DU 100 mM, 10 mM final soit 2 pL de la RNAsine soit 1 pL Les pd(N)6, hexanucléotides aléatoires, se fixent spécifiquement à tous les ARN lors d'une étape d'hybridation de 10 minutes à 25°C. Après l'ajout de 1 pL de transcriptase inverse, les échantillons sont incubés 1 heure à 42°C permettant à l'enzyme de synthétiser les brins d'ADNc. Cette étape est suivie d'une dénaturation de 15 minutes à 70°C nécessaire à la séparation des doubles brins ARN-ADNc. 1.4 PCR quantitative en temps réel L'effet de l'extrait de Limnophila conferta est évalué par PCR quantitative en temps réel avec le système Mx3000P de chez Stratagene en utilisant le kit Brillant SybrGreen. La composition du mélange réactionnel est la suivante : Composants Volume (pl) Concentration finale Core PCR Buffer 10X 2,5 1X MgCl2 50mM 2 4 mM dNTP 20mM 1 0,8mM Amorce sens (1/100ème) 2,5 500 nM Amorce antisens (1/100eme) 2,5 500 nM Glycérol 50% 4 8% DMSO 0.75 3% Tact DNA polymérase (5U/pL) 0.25 2.5U SYBR Green I '(1/3000eme) 1.25 0.167X H2O 6.25 Qsp 23 pL La différence majeure entre PCR classique et PCR quantitative en temps réel est liée à l'incorporation du SYBR Green lors de l'étape d'élongation. La fluorescence émise par ce composé lorsqu'il est incorporé dans l'ADN double brin est proportionnelle à la quantité de produit amplifié et mesurée à la fin de chaque cycle. Pour chaque échantillon, le nombre de cycles auquel apparaît le signal est déterminé par le logiciel et, grâce à une droite de calibration, la concentration en nombre de copies de transcrit est calculée. Pour un même essai, les niveaux d'expression des transcrits de la Survivine WT obtenus sont normalisés par rapport à la valeur obtenue pour le gène de ménage Béta-2-m. Ce gène dont l'expression est constitutive et invariante permet de s'affranchir de toute variation de quantités entre essais et notamment due à des efficacités de RT différentes. La PCR Béta-2-m est réalisée à l'aide du kit � LightCycler-h- (32m Housekeeping Gene Set �. 2. Etude de l'activité d'un extrait de Limnophila conferta sur l'expression de la protéine survivine (exemple 3) Le but de la présente étude est de regarder la modulation de l'expression de la protéine survivine dans des kératinocytes humains normaux (KHN) par un extrait de Limnophila conferta. 2.1 Culture cellulaire Les KHN sont cultivés en flasques 75 cm2, dans un incubateur à 37°C sous une atmosphère humide contenant 5°k CO2, dans du milieu pour kératinocytes sans sérum et complémenté d'EGF (Epidermal Growth Factor) et de BPE (Bovine Pituitary Extract) (KSFMc) (Gibco ref: 17005-034 + 37000-015). Les cellules sont ensemencées (jour J0) dans des microplaques 48 puits à raison de 50 000 cellules dans 500 pL de milieu par puits. Après 24 heures d'incubation (jour J1), les cellules sont devenues adhérentes et l'étape de traitement est alors réalisée. Le milieu d'ensemencement est retiré et le milieu de traitement, contenant chacun l'extrait de Limnophila conferta en solution dans un solvant (par exemple le DMSO) aux différentes concentrations, est alors ajouté dans chaque puits de culture. On prépare également un témoin à l'aide de ce même solvant et dans les mêmes proportions. Un pic d'expression de la survivine par les cellules est observé après 16 heures de traitement. Les puits sont alors rincés au PBS. La moitié des puits de la microplaque est utilisée pour lyser les kératinocytes et doser la survivine intracellulaire. L'autre moitié des puits de la microplaque est utilisée pour doser les protéines totales par la méthode BCA, ce qui permet de ramener la quantité de survivin dosée à une quantité unitaire de protéine. Une phase de mesure de cytotoxicité de chaque extrait végétal testé est préalablement nécessaire pour être en mesure d'évaluer ensuite l'effet de l'extrait à des doses non cytotoxiques. A cette fin, on détermine la dose cytotoxique de l'extrait par le test XTT (réf : Cell Proliferation Kit II, Roche Diagnostic). Le sel de tétrazolium (réactif )(TT) est transformé en formazan par les déshydrogénases localisées au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale. Seules les cellules vivantes dont la chaîne respiratoire est fonctionnelle sont capables de produire le Formazan, composé orange détecté à 450 nm. Chaque extrait testé est dilué pour préparer une gamme de dilution de raison 2 sur une microplaque, la concentration en extrait des échantillons à tester allant de 50 mg/ml à 0,195 mg/ml. Chaque dilution préalablement préparée est finalement diluée au 1000ème dans le milieu KSFM-C et mise alors au contact des kératinocytes pendant 48h, moment auquel s'effectuera le test de cytotoxicité. 2.2 Dosage de la protéine survivine On évalue l'activité d'extraits végétaux de plantes de l'espèce végétale Limnophi/a conferta vis-à-vis de l'expression de la survivine. Le dosage de la survivine est réalisé par un test immunoenzymatique ELISA (ref : Duoset Survivin ELISA de chez R&D Systems) sur des cultures de kératinocytes humains normaux. Le dosage des protéines totales est effectué par un test colorimétrique BCA (référence : BC Assay Kit, Uptima Interchim), par mesure d'absorbante à 570 nm. Pour le dosage ELISA de la survivine après 16 h de traitement, on effectue un rinçage des puits au PBS puis un ajout de 100 pl/puits de tampon de lyse incubé i0 minutes sous agitation douce. Ce tampon contient des anti-protéases, qui empêchent la dégradation des protéines dont la survivine lors de la lyse des cellules. On prépare la microplaque ELISA (référence Clear Microplate R&D systems DY992). Une gamme d'étalonnage avec la survivine humaine est préparée de 0 à 2000 pg/mL dans les mêmes conditions qu'avec les lysats cellulaires. Après blocage de la réaction enzymatique par de l'acide sulfurique, la quantification de la survivine est réalisée par mesure de l'absorbante à 450 nm. Exemple 1; préparation d'un extrait de parties aériennes de Limnophi/a conferta. Le matériel végétal, disponible dans le commerce auprès du fournisseur IDVP France, formé de parties aériennes comprenant les tiges et feuilles de Limnaphi/a conferta à l'état sec, est broyé extemporanément à l'aide d'un broyeur-mixeur de laboratoire, à une granulométrie moyenne de l'ordre de 0,1 à 1 mm. On introduit 10 g de végétal broyé dans un ballon de 250 ml dans lequel on ajoute 150 ml d'un mélange éthanol/eau (90/10 v/v). On met le ballon surmonté d'un réfrigérant à boules sous agitation magnétique dans un bain thermostaté, puis on chauffe jusqu'au reflux de solvant. Le reflux est maintenu 30 minutes sous agitation. Une fois le chauffage arrêté, on laisse refroidir le ballon à température ambiante hors du bain. Le mélange est ensuite filtré sous vide sur Büchner avec un filtre GF/F Whatman 70pm et une fiole tarée ; obtient ainsi le filtrat 1. Le gâteau est lavé sur le Büchner avec 50 ml du solvant d'extraction ; on obtient le filtrat 2. Les deux filtrats ont été réunis, pesés. Le filtrat ainsi obtenu est introduit dans un ballon préalablement taré, puis concentré à sec à l'évaporateur rotatif sous vide dans un bain d'eau à une température maximale de 50°C. Le résidu sec est quantifié pour déterminer le rendement massique d'extraction exprimé en masse d'extrait sec obtenu pour 100 g de matière végétale à l'état broyé sec de départ. Le rendement d'extraction est de 21%. Exemple 2 : activité d'un extrait de Limnophila conferta vis-à-vis de l'expression du gène codant pour la survivine WT. Des kératinocytes humains normaux ensemencés, en duplicate, en boîte de pétri 100 mm sont traités, à sub-confluence pendant 8 heures, par l'extrait de Limnophila conferta préparé selon l'exemple 1, dilué dans le DMSO à une concentration de 12,5 pg/ml. Un témoin (sans traitement) est également préparé. Le taux de transcrits codant pour le gène de la Survivine WT mesuré pour un échantillon est rapporté aux taux de transcrits codant pour le gène invariant Béta-2-m. Les résultats sont indiqués dans le tableau I ci-dessous Tableau I Survivine Pour 105 copies Moyenne Intervalle de Béta-2-m Confiance Témoin 441688 564860 109430 (non traité) 618640 507534 691577 Limnophilla 942611 792092 113305 813240 672602 739916 Conclusion : Le traitement avec 12,5 pg/ml d'extrait de Limnophila après 8 heures augmente de 40% le taux de transcrits du gène de la Survivine WT. Il existe ainsi une différence statistiquement significative (p Exemple 3 : activité d'un extrait de Limnophi/a conferta vis-à-vis de l'expression de la protéine survivine L'extrait sec préparé à l'exemple 1 est dilué à la concentration 15 de 12,5 mg/mi ou à la concentration de 25 mg/ml dans le DMSO. Lors du traitement sur cellules, l'extrait est ajouté dans le milieu de culture afin d'obtenir une concentration finale à 0,1% v/v, soit 12,5 pg/ml pour la première solution et 25 pg/ml pour la seconde solution. On prépare également un témoin à l'aide de ce même solvant, de 20 concentration finale 0,1% v/v. Le tableau I ci-dessous indique l'activité de l'extrait de l'exemple 1 vis-à-vis de la survivine, par rapport au niveau basal d'expression, représenté par le témoin solvant, qui constitue le 100% : Le résultat obtenu est indiqué dans le tableau II ci-dessous: Tableau II Plante Dose Survivine d'activation (pg/mi) (pg/mg protéines) Témoin -- 600 100 Limnophila conferta 12,5 776 129,3 Limnophila conferta 25 889 148,1 Conclusion : l'extrait de Limnophila conferta augmente significativement l'expression de la survivine par les kératinocytes, par rapport au niveau basal d'expression de la protéine (témoins). 10 Conclusion des exemples 2 et 3 : L'extrait de Limnophila conferta stimule l'expression des transcripts de la survivine WT, ainsi que l'expression de la protéine survivine elle-même. L'extrait testé agit donc positivement à la fois au niveau transcriptionnel (ARN) et au niveau traductionnel (protéine). 15 Exemple 4: Composition cosmétique comprenant un extrait des parties aériennes de Limnophila conferta. L'extrait sec obtenu à l'exemple 1 est solubilisé à 1% massique 20 dans un mélange éthanol/eau. On obtient une solution à 1% massique d'extrait sec qui est utilisée dans la composition cosmétique ci-dessous : - Extrait végétal de Limnophila conferta 0,1 °la Tensio actif(Arlacel� 165 VP) 5 % 25 Alcool cétylique 95% 15 Alcool stéarylique Cire d'abeille - Huile (Perleam�) Tri caprate/caprylate giycerides Huile silicone (diméthicone 100 CS) - Polymère (Keltrol�) Soude EDTA tetrasodique poudre Conservateurs - Eau La composition cosmétique est préparée de manière habituelle, bien connue de l'homme de l'art, par mélange des divers composants en une ou plusieurs étapes. Cette composition peut être appliquée sur les zones de la peau 15 journellement pendant plusieurs semaines pour obtenir les effets cosmétiques précités, Exemple 5 : Lotion tonique anti-rides comprenant un extrait de Limnophila conferta L'extrait sec obtenu à l'exemple 1 est solubilisé à 1% massique dans un mélange éthanol/eau. On obtient une solution à 1% massique d'extrait sec qui est utilisée dans la composition cosmétique ci-dessous : Extrait végétal de Limnophila conferta 2 % - Butylène glycol 3 °Io EDTA 0,1 Solubilisant 1 Concentré de parfum 0,3 °Io 30 - Ethanol 5 °Io 10 1% 1,5 % 8,5 3% 1% 0,35 °Io 0,04 °Io 0,1 °Io 0,5 °Io qsp 100 20 25 - Filtre UV (benzophénone-4) 0,13 Eau qsp 100 La composition cosmétique est préparée de manière habituelle, bien connue de l'homme de l'art, par mélange des divers composants en une ou plusieurs étapes. Cette composition peut être appliquée sur les zones de la peau comprenant des rides journellement pendant plusieurs semaines pour obtenir un effet d'atténuation ou de disparition complète desdites rides. Exemple G : Crème de jour anti-rides sous forme d'une émulsion comprenant un extrait de Limnophila conferta L'extrait sec obtenu à l'exemple 1 est solubilisé à 1% massique dans un mélange éthanol/eau. On obtient une solution à 1% massique d'extrait sec qui est utilisée dans la composition cosmétique ci-dessous : Extrait végétal de Limnophila conferta 2 °la - Steareth-21 (Brij 721) 2,5 Glycéryl stéarate (Tegrin) 1,1 % - Alcool stéarylique 5 % Tricaprate / caprilate glycérol 12,5 Butylène glycol 3 - Glycérine 2 °la - Conservateur 0,5 Concentré de parfum 0,5 Filtre UV (méthoxycinnamate d'octyle) 7,5 - Eau qsp 100 La composition cosmétique est préparée de manière habituelle, bien connue de l'homme de l'art, par mélange des divers composants en 30 une ou plusieurs étapes. Cette composition peut être appliquée sur les zones de la peau comprenant des rides journellement pendant plusieurs semaines pour obtenir un effet d'atténuation ou de disparition complète desdites rides. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait végétal d'une plante de l'espèce appartenant au genre Limnophila, en particulier un extrait de l'espèce 5 végétale Limnophila conferta, comme agent cosmétique. 2. Utilisation d'un extrait selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un extrait de la plante entière ou d'une partie de ladite plante, telle que la racine, le rhizome ou une partie aérienne, notamment la tige, les feuilles, les fleurs, les graines ou les boutons floraux. 10 3. Utilisation d'un extrait selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il est obtenu à partir des parties aériennes de la plante et en particulier des feuilles. 4. Utilisation d'un extrait selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'il est obtenu par mise en contact du 15 matériel végétal avec un solvant polaire ou un mélange de solvants polaires. 5. Utilisation d'un extrait selon la revendication 4, caractérisée en ce que le solvant polaire ou le mélange de solvants polaires utilisé(s) pour l'extraction et choisi parmi l'eau, un alcool en C1-C4, choisit 20 préférentiellement parmi le l'éthanol ou le butanol, un glycol choisit préférentiellement parmi le glycérol, le butylène glycol et le propylène glycol ou leur mélange. 6. Utilisation d'un extrait selon la revendication 5, caractérisée en ce que les mélanges préférés sont des mélanges d'au moins un alcool 25 et d'eau ou d'au moins un glycol et d'eau, comprenant au moins 10% v/v d'alcool ou de glycol, le solde étant constitué d'eau. 7. Utilisation d'un extrait selon la revendication 6, caractérisée en ce que le mélange de solvant comprend un mélange d'eau et d'éthanol dans un rapport 50/50 v/v ou un mélange d'eau et de butylène glycol 30 dans un ratio 50/50 v/v.lyophilisation ou atomisation du produit de l'étape d'extraction dans le solvant ou mélange de solvant précité. 9. Utilisation d'un extrait selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait de la plante peut être absorbé sur un support avantageusement choisi parmi les poudres de nylon�, poreuses ou non poreuses et les micas ou toute substance minérale lamellaire. 10. Utilisation d'un agent cosmétique comprenant l'extrait, tel que défini dans l'une quelconque des revendications précédentes pour prévenir ou retarder les signes du vieillissement cutané ou à en ralentir les effets et/ou pour le soin de l'épiderme ou de son stratum corneum endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, et/ou pour restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, pour accélérer ou favoriser leur repousse ou renforcer les cheveux fragiles, et/ou pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa résistance. 11. Composition cosmétique comprenant au moins un agent cosmétique ou agent actif comprenant un extrait d'une plante de l'espèce végétale du genre Limnophila, en solution ou en dispersion dans un véhicule cosmétiquement acceptable compatible avec une application topique sur la peau, ledit extrait étant en particulier tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'extrait de Limnophila est utilisé en association avec au moins un autre agent actif participant au maintien et à l'intégrité de la structure de la peau. 13. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'extrait précité est contenu dans ladite composition à une concentration comprise entre 0,001% et 5 % en poids sec d'extrait par rapport à la composition. 14. Méthode de soin cosmétique destinée à prévenir ou retarder l'apparition des signes du vieillissement cutané ou à en atténuer les effets, caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance sur au moins une zone concernée de la peau du corps ou du visage d'une quantitéefficace d'un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophila, en particulier une plante de l'espèce Limnophila conferta. 15. Méthode de soin cosmétique pour le soin de l'épiderme ou de son stratum corneum endommagé, notamment par les rayonnements ultraviolets, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie de la peau du visage ou du corps, d'une quantité efficace d'un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophila, en particulier une plante de l'espèce Limnophila conferta. 16. Méthode de soin cosmétique visant à restaurer le fonctionnement du cycle pilaire, pour prévenir ou ralentir la chute des cheveux, pour favoriser ou accélérer leur repousse ou pour renforcer les cheveux fragiles, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur au moins une partie du cuir chevelu, d'une quantité efficace d'au moins un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophila, en particulier une plante de l'espèce Limnophila conferta. 17. Méthode de soin cosmétique pour favoriser la croissance de l'ongle et/ou renforcer sa résistance, caractérisée en ce qu'elle comprend la délivrance, sur l'ongle d'au moins une partie de la zone environnante, d'une quantité efficace d'au moins un agent cosmétiquement acceptable comprenant au moins un extrait de la plante du genre Limnophila, en particulier une plante de l'espèce Limnophila conferta. 18. Méthode selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que ledit agent est délivré topiquement sous la forme d'une composition cosmétique comprenant ledit agent comme l'un de ses agents actifs, ladite composition comprenant en outre au moins un excipient cosmétiquement acceptable, par application de cette composition sur la partie du corps ou des ongles concernée. 19. Méthode selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisée en ce que la concentration en agent(s) actif(s) est comprise entre 0,001% et 5 % en poids de la composition.