Brevet FR2934050A1 — publié le 20100122

-1 �Procédé et dispositif de lecture d'une émulsion� Domaine technique La présente invention concerne un procédé de lecture d'une érrmision. Elle concerne aussi un dispositif de lecture d'une émulsion mettant en oeuvre 'e procédé selon l'invention. Dans ce document, on entend de manière générale par � lecture d'une émulsion � une extraction d'informations à partir de cette émulsion. Des exemples d'application de l'invention sont de manière non limitative la détection et/ou le tri de microgouttes pouvant jouer le rôle de microréacteurs chimiques ou biologiques ou pouvant contenir des cellules ou des molécules spécifiques, dans des domaines tels que l'expression de gènes ou le diagnostic. Etat de la technique antérieure Les gouttes d'eau d'une émulsion inverse eau dans huile constituent des micro-compartiments pouvant jouer le rôle de microréacteurs chimiques ou biochimiques indépendants et permettant de réaliser de très nombreuses réactions en parallèle. Un premier type de réaction concerne l'expression d'un gène unique par gout:te et le domaine de l'évolution dirigée. On part d'une banque de gènes codants par exemple pour des variantes d'une enzyme, on exprime ces gènes et on trie les gouttes sur la base de l'activité de ces variantes d'enzyme (par exemple, par fluorescence). Deux techniques ont été décrites qui permettent le tri à haut débit de ces banques de gouttes : la microfluidique et la cytométrie de flux. Ces techniques sont complexes, avec la nécessité d'un expérimentateur et d'un matériel spécialisé. La microfluidique est encore au stade du développement et un Trieur de Cellules Activé par Fluorescence (ou FACS pour � Fluorescence Activated Cell Sorter �) coûte plusieurs centaines de milliers d'euros. Lors des expériences utilisant un FACS, des émulsions doubles eau dans huile dans eau sont utilisées afin d'avoir une phase continue aqueuse et ceci complique notablement la formulation. Les débits maximaux qui sont obtenus avec ces 2934050 -2 techniques de FACS ou de microfluidique qui trient les gouttes une par une sont de 1000 à 10000 gouttes par seconde. Pour le tri de banques génomiques, les débits atteints par ces techniques actuelles sont donc insuffisants. 5 Un deuxième domaine d'application des émulsions considérées comme des microréacteurs est le diagnostic et plus généralement la détection de molécules. Là encore, le débit est fondamental, car c'est lui qui va fixer la sensibilité du test. Le but de la présente invention est de proposer un procédé et un 10 dispositif de lecture d'une émulsion plus rapide que ceux de l'état de l'art. Exposé de l'invention Cet objectif est atteint avec un procédé de lecture d'une émulsion comprenant des gouttes, ledit procédé comprenant : un balayage bidimensionnel de l'émulsion par un système optique, 15 - une construction d'une image bidimensionnelle de l'émulsion à partir dudit balayage. L'émulsion comprend une phase continue entourant les gouttes. La phase continue comprend de préférence de l'huile, et les gouttes comprennent de préférence de l'eau. 20 L'émulsion peut être une émulsion inverse de gouttes d'eau dans une phase continue d'huile, une émulsion directe de gouttes d'huile dans une phase continue d'eau, une émulsion double de gouttes d'eau dans des gouttes d'huile dans une phase continue d'eau, ou une émulsion double de gouttes d'huile dans des gouttes d'eau dans une phase continue d'huile.. 25 La phase continue est de préférence solide à température ambiante lors du balayage. La phase continue peut avoir une température de liquéfaction supérieure à 37°C, de préférence supérieure à 40°C, plus précisément de préférer ce supérieure à 50°C. 30 Durant le balayage de l'émulsion, l'émulsion est de préférence maintenue à une température inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre un suivi dans le temps d'une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins 2934050 -3 une des gouttes, ledit suivi comprenant une réitération des étapes de balayage et de construction. De même, le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une localisation de gouttes comprenant un type donné de molécule ou de cellule 5 par analyse de l'image bidimensionnelle de l'émulsion. La localisation peut comprendre une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation sur l'image bidimensionnelle. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre un prélèvement des gouttes comprenant le type donné de molécule ou de 10 cellule. Le prélèvement peut comprendre par exemple : - un déplacement d'une extrémité d'une micropipette à des coordonnées où a été localisée une goutte comprenant le type donné de molécule ou de cellule, et une aspiration de cette goutte par la micropipette. 15 Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre un dénombrement de gouttes comprenant un type donné de molécule ou de cellule par analyse de l'image bidimensionnelle de l'émulsion. Le dénombrement peut comprendre une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation sur l'image bidimensionnelle. 20 La construction de l'image bidimensionnelle comprend de préférence au cours du balayage : - une projection de différentes images partielles de l'émulsion via le système optique sur un détecteur, - une combinaison des différentes images partielles de l'émulsion 25 acquises par le détecteur. Les images partielles sont de préférence des images de signaux de fluorescence émis par l'émulsion. L'émulsion est de préférence une émulsion inverse de gouttes d'eau dans de l'huile. 30 L'émulsion est de préférence étalée de manière à avoir une épaisseur comprise entre 1 et 100 couches de gouttes. Le système optique peut avoir une profondeur de champ sensiblement égale ou supérieure à l'épaisseur de l'émulsion étalée. Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre : 2934050 -4- - un placement de l'émulsion entre deux lames parallèles dont une au moins est transparente pour permettre la construction de l'image bidirnensionnelle, - un mouvement de cisaillement entre les deux lames jusqu'à ce que de 5 l'émulsion soit monodisperse. Dans ce document, on dit qu'une émulsion est monodisperse quand l'écart-type de la distribution des diamètres des gouttes à l'intérieur de cette émulsion est inférieur à 30% de la moyenne des diamètres de ces gouttes. 10 Suivant encore un autre aspect de l'invention, il est proposé un dispositif de lecture d'une émulsion comprenant des gouttes, ledit dispositif mettant en oeuvre le procédé selon l'invention et comprenant : - un logement pour recevoir l'émulsion, - un système optique, 15 - des moyens pour effectuer un balayage bidimensionnel de l'émulsion par le système optique, - des moyens pour construire une image bidimensionnelle de l'émulsion à partir d'un balayage bidimensionnel de l'émulsion. L'émulsion comprend une phase continue entourant les gouttes et 20 ayant une température de liquéfaction donnée, et le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens pour maintenir l'émulsion à une température inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue durant le balayage de l'émulsion. De même, le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre 25 des moyens pour suivre dans le temps une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins une des gouttes. De plus, le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens pour localiser des gouttes comprenant un type donné de molécule ou de cellule, les moyens de localisation comprenant des 30 moyens d'analyse de l'image bidimensionnelle de l'émulsion. Le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens pour prélever des gouttes comprenant le type donné de molécule ou de cellule. Les moyens de prélèvement peuvent par exemple comprendre : 2934050 -5- - une micropipette, - des moyens pour déplacer une extrémité de la micropipette à des coordonnées d'une goutte comprenant le type donné de molécule ou de cellule et localisée par les moyens de localisation, et 5 des moyens pour aspirer cette goutte par la micropipette. De plus, le dispositif selon l'invention peut comprendre en outre des moyens pour dénombrer des gouttes comprenant un type donné de molécule ou de cellule, les moyens de dénombrement comprenant des moyens d'analyse de l'image bidimensionnelle de l'émulsion. 10 Les moyens de construction de l'image bidimensionnelle comprennent de préférence : - un détecteur sur laquelle le système optique est agencé pour projeter différentes images partielles de l'émulsion au cours d'un balayage, - des moyens pour combiner les différentes images partielles de 15 l'émulsion acquises par le détecteur au cours du balayage. Les images partielles sont de préférence des images de signaux de fluorescence émis par l'émulsion. Le logement peut être agencé pour que l'émulsion soit étalée à l'intérieur du logement, de préférence de manière à avoir une épaisseur 20 comprise entre 1 et 100 couches de gouttes. Le système optique peut avoir une profondeur de champ sensiblement égale ou supérieure à l'épaisseur de l'émulsion étalée. De plus, le logement comprend de préférence deux lames parallèles dont une au moins est transparente, et des moyens pour 25 appliquer un mouvement de cisaillement entre les deux lames jusqu'à ce que de l'émulsion soit monodisperse. Description des figures et modes de réalisation D'autres avantages et particularités de l'invention apparaîtront à la 30 lecture de la description détaillée de mises en oeuvre et de modes de réalisation nullement limitatifs, et des dessins annexés suivants : - les figures 1 et 2 illustrent un mode de réalisation préférentiel de dispositif selon l'invention ; et 2934050 -6- - la figure 3 illustre une image bidimensionnelle d'émulsion, obtenue à partir du dispositif des figures 1 et 2. On va décrire, en référence aux figures 1 à 3, un mode de réalisation préférentiel de dispositif 1 selon l'invention mettant en oeuvre un procédé 5 selon l'invention. Le dispositif 1 comprend : - un logement 2 pour recevoir une émulsion 3 qui comprend des gouttes 21, - un système optique 4, plus particulièrement un système de 10 microscopie optique, - une platine 5 motorisée selon trois directions orthogonales X, Y, Z, agencée pour déplacer le logement 2 et donc l'émulsion 3 par rapport au système optique selon les trois directions X, Y et Z ; on parlera indifféremment de position du logement 2 ou de position de l'émulsion 15 3. La platine 5 est en particulier agencée pour effectuer un balayage bidimensionnel de l'émulsion 3 par le système optique 4, - une unité d'analyse 6, comprenant typiquement une unité centrale d'un ordinateur, un circuit électronique numérique, un circuit électronique analogique, un microprocesseur et/ou des moyens logiciels, 20 - un écran 20 relié à l'unité 6. Par balayage bidimensionnel de l'émulsion 3 par le système optique 4, on entend un déplacement relatif du système optique 4 par rapport à l'émulsion selon au moins deux directions spatiales orthogonales X et Y, les directions X, Y étant typiquement contenues dans un plan parallèle à 25 l'émulsion 3, aux lames 14, 15 et à un plan focal du système optique 4 correspondant au plan focal objet de l'objectif 7). Le système optique 4 comprend : - Ln objectif de microscope 7, un miroir dichroïque 8, 30 - un filtre dichroïque 9, un jeu de lentilles 10,. - un détecteur 11 qui consiste typiquement en une caméra CCD, une source de lumière blanche 12 agencée pour éclairer le logement 2 et l'émulsion 3, et 2934050 -7- - un laser d'excitation 13, agencé pour émettre un rayonnement sur le logement 2 et l'émulsion 3. Dans une variante, on peut utiliser à la place du laser 13 une lampe à arc au rnercure munie d'un filtre d'excitation. 5 Lors du balayage de l'émulsion 3 par le système optique, la position relative de l'émulsion 3 par rapport au système optique 4 change. L'émulsion émet de la lumière qui est captée par l'objectif. Cette lumière est par exemple émise par diffusion de lumière blanche provenant de la source 12, et/ou par émission de fluorescence suite à une excitation de l'émulsion 10 par le laser 13. La lumière captée par l'objectif 7 et provenant de l'émulsion correspond à une portion de l'émulsion, et passe à travers le miroir 8 et le filtre 9, puis est focalisée sur la caméra CCD 11 par le jeu de lentilles 10. Pour chaque position relative de l'émulsion 3 par rapport au système optique 4, la caméra 11 acquiert ainsi une image partielle donnée de 15 l'émulsion 3, cette image partielle correspondant à la portion de l'émulsion imagée par le système optique 4 pour cette position relative. Ainsi, le système optique est agencé pour projeter sur la caméra 11 différentes images partielles de l'émulsion au cours d'un balayage de l'émulsion par le système optique 4. Les images partielles peuvent comprendre des images 20 partielles de l'émulsion par fluorescence, par luminescence et/ou en lumière blanche, selon la nature de la lumière éclairant l'émulsion et selon la nature du filtre 9. Dans une réalisation préférée, les images partielles sont des images de signaux de fluorescence émis par l'émulsion. Comme il sera expliqué par la suite en détaillant le procédé selon 25 l'invention, l'unité d'analyse 6 est agencée pour : construire une image bidimensionnelle de l'émulsion à partir d'un balayage bidimensionnel de l'émulsion par le système optique 4 au moyen de la platine 5, cette construction s'effectuant par une combinaison des différentes images partielles de l'émulsion acquises 30 par la caméra 11 au cours du balayage ; - analyser une image bidimensionnelle de l'émulsion construite par cette unité 6, de manière à : o localiser dans cette image bidimensionnelle des gouttes spécifiques 22 comprenant un type donné de molécule ou de 2934050 -8 cellule et déterminer les coordonnées de chacune des gouttes 21, 22 dans cette image bidimensionnelle, et/ou o dénombrer dans cette image bidimensionnelle des gouttes spécifiques 22 comprenant un type donné de molécule ou de 5 cellule ; - suivre dans le temps une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins une des gouttes, en stockant et en comparant des images bidimensionnelles successives construites par cette unité 6. 10 Par image bidimensionnelle de l'émulsion, on entend un ensemble de données représentatives de l'émulsion (comme par exemple une intensité, une ou plusieurs couleurs, des signaux de fluorescence, etc...) en fonction de deux coordonnées spatiales orthogonales X et Y. Typiquement, ces données peuvent être stockées : 15 - sous forme graphique dans un fichier image type JPEG, BITMAP, ou autre pouvant être directement affiché sur l'écran 20, ou - sous forme brute dans un fichier de données comme un fichier texte, un fichier d'un tableur ou autre. Le filtre 9 est agencé pour laisser passer un signal de fluorescence 20 spécifique émis par les gouttes spécifiques 22 mais pour bloquer les longueurs d'onde émises par le laser 13, de sorte que la caméra soit agencée pour détecter ce signal de fluorescence spécifique. L'unité 6 est agencée pour enregistrer ce signal de fluorescence spécifique comme faisant partie des données de l'image bidimensionnelle. 25 Le logement comprend deux lames parallèles 14, 15 entre lesquelles est placée l'émulsion 3. Ces deux lames 14, 15 sont sensiblement parallèles à un plan focal du système optique 4, plus particulièrement ces deux lames 14, 15 sont sensiblement parallèles au plan focal objet de l'objectif 7. Une de ces lames 15 est agencée pour être située entre l'émulsion 3 et le 30 système! optique 4 (ou l'objectif 7), et est transparente. Le système optique 4 est agencé pour imager l'émulsion 3 à travers cette lame transparente 15 pour permettre la construction de l'image bidimensionnelle. L'autre lame 14 est située du côté opposé au système optique 4 par rapport à l'émulsion 3. 2934050 -9- En outre, le logement 2 est agencé pour que l'émulsion soit étalée entre les deux lames 14, 15 de manière à avoir une épaisseur comprise entre 1 et 100 couches de gouttes. Dans un mode de réalisation préféré, le système optique 4 a une profondeur de champ égale à l'épaisseur de 5 plusieurs couches de gouttes 21, voire même sensiblement égale ou supérieure à l'épaisseur totale de l'émulsion étalée, de sorte qu'en balayant une unique fois l'émulsion, on crée une image bidimensionnelle de l'ensemble de l'épaisseur de l'émulsion. Le dispositif 1 comprend en outre des moyens motorisés 16 agencés 10 pour appliquer un mouvement de cisaillement entre les deux lames 14, 15 jusqu'à ce que de l'émulsion 3 soit monodisperse. Le dispositif 1 comprend en outre des moyens 17 pour maintenir l'émulsion 3 à une température constante inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue 23 durant le balayage de l'émulsion. Ces 15 moyens de maintient comprennent typiquement : - une sonde agencée pour mesurer la température de la lame 14 et/ou 15 et/ou directement la température de l'émulsion 3, - des moyens pour chauffer et/ou réfrigérer la lame 14 et/ou 15 et/ou directement l'émulsion 3, de manière à réguler la température de 20 l'émulsion à la température constante. Enfin, le dispositif 1 comprend en outre des moyens pour prélever des gouttes spécifiques 22. Les moyens de prélèvement (représentés uniquement sur la figure 2) comprennent : - une micropipette 18, 25 - une platine 19 motorisée selon les trois directions orthogonales X,Y,Z, agencée pour déplacer la micropipette par rapport au logement 2 et à l'émulsion 3 selon les trois directions X, Y et Z, et pour déplacer une extrémité de la micropipette à des coordonnées d'une goutte spécifique 22 localisée l'unité 6, et 30 - des moyens de succion (non représentés) agencés pour aspirer cette goutte le long de la micropipette. Pour permettre un accès de la micropipette 18 à l'émulsion 3, la lame 14 est amovible et peut donc être retirée comme représenté sur la figure 2. 2934050 -10 On va maintenant décrire le procédé de lecture selon l'invention mis en oeuvre par le dispositif 1. Ce procédé de lecture de l'émulsion 3 selon l'invention comprend : - une fabrication de l'émulsion 3 sous une forme grossière polydisperse, 5 en utilisant une des techniques suivante pour obtenir un cisaillement limité : champ électrique, ultrasons, agitateur magnétique, ou cisaillement manuel ; puis - un placement de l'émulsion 3 dans le logement 2 et entre les deux lames parallèles 14, 15 ; puis 10 - un chauffage de l'émulsion par les moyens 17 à une température supérieure à sa température de liquéfaction ; puis - un mouvement de cisaillement entre les deux lames 14, 15 jusqu'à ce que de l'émulsion sous forme liquide soit monodisperse, c'est-à-dire jusqu'à ce que l'écart-type de la distribution des diamètres des gouttes 15 21 soit inférieur à 30% de la moyenne des diamètres des gouttes 21 ; ce mouvement de cisaillement est crée par les moyens motorisés 16 ; puis - un retrait de la lame 14 et un refroidissement de l'émulsion par les moyens 17 à une température inférieure à sa température de 20 liquéfaction, puis - au moins un balayage bidimensionnel de l'émulsion par le système optique 4 au moyen de la platine 5 ; au cours de chaque balayage, la position relative de l'émulsion 3 par rapport au système optique 4 change, et pour différentes positions relatives de l'émulsion 3 par 25 rapport au système optique 4, la caméra 11 acquiert ainsi différentes images partielles données de l'émulsion 3, chaque image partielle correspondant à une portion donnée de l'émulsion imagée par le système optique pour une position relative donnée; pour chaque balayage, les images partielles acquises au cours de ce balayage sont 30 adjacentes entre elles et sont réparties le long des deux directions orthogonales de balayage X, Y ; et - pour chaque balayage, une construction d'une image bid.iriensionnelle 24 de l'émulsion à partir dudit balayage, cette construction comprenant : 2934050 -11 o une projection des différentes images partielles de l'émulsion via le système optique 4 sur la caméra 11, et une acquisition de ces images partielles par la caméra 11 ; et o une combinaison, par l'unité 6, des différentes images 5 partielles de l'émulsion acquises par la caméra au cours dudit balayage . Chaque image partielle peut par exemple correspondre à une portion de l'émulsion ayant une largeur typique de 100 micromètres, alors que l'image bidimensionnelle 24 peut correspondre à une vue de l'émulsion de plusieurs 10 centimètres carré de surface. Même en utilisant un objectif 7 avec un grossissement X10, on observe une surface de 3.3 mm X 3.3 mm par image partielle, soit environ 100 000 gouttes ayant un diamètre de 1 micromètre. On peut ainsi détecter une fluorescence équivalente à celle de 500 molécules de fluorescéine. On enregistre l'image partielle correspondante et 15 on se déplace sur une zone immédiatement adjacente avant d'enregistrer une nouvelle image partielle. On peut ainsi lire 10 images partielles par seconde ou plus pour construire une image bidimensionnelle, soit 1 million de gouttes 21 par seconde et 1 milliard de gouttes 21 en 15 minutes. L'image bidimensionnelle 24 de la figure 3 se décompose en neuf 20 images partielles adjacentes délimitées par des pointillés. On remarque que l'image bidimensionnelle 24 de la figure 3 n'est que schématique, et que la taille des gouttes 21a été considérablement augmentée et que le nombre de gouttes 21 a été considérablement diminué pour une meilleur visibilité. En effet, l'image bidimensionnelle 24 correspond en réalité à une vue de 2.5 l'émulsion de plusieurs centimètres carré de surface, et comprend donc typiquement des centaines de milliers de gouttes 21 de 1 micromètres de diamètre. Dans une variante, on peut se contenter de lire les images partielles et les traiter en temps réel, sans reconstruire de grande image sous la forme 30 d'un fichier image, mais juste de manière à construire un fichier regroupant diverses données représentatives de l'émulsion (telles les coordonnées de gouttes spécifiques 22, les signaux de fluorescence, etc...). L'émulsion 3 est une émulsion inverse de gouttes d'eau 21 dans une phase huileuse 23 appelée par la suite huile 23. Ces gouttes consistent plus 2934050 - 12 précisérnent en des microgouttes ou microcapsules 21 ayant un diamètre typique compris entre 100 nanomètres et 100 micromètres, de préférence de 0,5 micromètre à 5 micromètres, plus préférentiellement d'environ 1 micromètre. Pour des raisons optiques, les indices optiques de l'huile 23 et 5 des compartiments aqueux 21 sont sensiblement égaux. Parrni ces gouttes d'eau 21, certaines gouttes spécifiques 22 contiennent un ou plusieurs type(s) donné(s) de molécule chimique et/ou biologique à localiser. Ces molécules ou cellules sont de préférence fluorescentes, ou sont accompagnées d'un ou plusieurs marqueur(s) 10 fluorescent(s), de manière à émettre un signal de fluorescence spécifique suite à une excitation par le laser 13. Ces molécules ou cellules sont de préférence contenues dans chaque goutte dans une quantité supérieure à un certain seuil de détection. Du fait de ces molécules et/ou cellules, au moins une réaction chimique ou biologique peut se produire dans chacune 15 des microcapsules spécifiques 22. Par réaction biologique, on entend de manière générale toute réaction de biologie moléculaire ou de biologie cellulaire. Ainsi, chaque microcapsule spécifique 22 joue le rôle d'un microréacteur chimique ou biochimique indépendant et permet de réaliser de très nombreuses réactions en parallèle (jusqu'à dix milliards de réaction 20 par millilitre). Un premier exemple de réaction concerne l'expression d'un gène unique par goutte et le domaine de l'évolution dirigée. On part d'une banque de gènes codants par exemple des variantes d'une enzyme, puis on exprime (par transcription/traduction in vitro) ces gènes. Le dispositif selon 25 l'invention permet de localiser et prélever les gouttes spécifiques 22 comprenant ce gène unique sur la base de l'activité de ces variantes d'enzyme, par exemple grâce à un signal fluorescence émit uniquement par les gouttes spécifiques 22 comprenant ce gène unique, ce signal étant détecté par la caméra 11 et compris dans les données de l'image 30 bidimensionnelle 24. Un deuxième domaine d'application des émulsions considérées comme des microréacteurs est le diagnostic et plus généralement la détection de molécules tels des polluants ou des agents bioterroristes. Les gouttes 21 servent alors à augmenter la concentration locale d'un produit à détecter, 2934050 -13 ce qui permet d'abaisser le seuil de détection par rapport à une détection en volume. Dans ce cas, les gouttes spécifiques 22 sont des gouttes qui contiennent une certaine concentration de molécule ou cellule supérieure à leur seuil de détection par fluorescence. Les gouttes peuvent servir à 5 compartimenter l'expression in vitro d'une ou plusieurs protéines rapporteuses, l'expression de ces protéines étant à la base du test de diagnostic. Comparativement à des procédés de lecture linéaire selon l'art antérieur mis en oeuvre dans un micro-canal ou dans un � FACS �, le 10 procédé selon l'invention a donc pour avantage d'être plus rapide, ce qui est particulièrement pratique pour la recherche de gouttes spécifiques 22 rares parmi l'ensemble des gouttes 21. Après le retrait de la lame 14, l'émulsion 3 est étalée sur la lame 15 de manière à avoir une épaisseur inférieure à celle de 10 couches de gouttes 15 21. Une couche de gouttes est une couche ayant comme épaisseur le diamètre moyen des gouttes 21. Dans une variante, l'émulsion 3 est étalée sur la lame 15 sous la forme d'une monochouche de gouttes 21, c'est à dire que l'émulsion a une épaisseur égale à celle d'une unique couche de gouttes, car cela facilite un prélèvement de goutte par la micropipette 18. 20 Dans une autre variante, l'émulsion 3 est étalée sur la lame 15 de manière à avoir une épaisseur de plusieurs couches de gouttes 21 (typiquement 10 couches), car cela est particulièrement avantageux avec un système optique 4 qui a une profondeur de champ sensiblement égale ou supérieure à l'épaisseur de l'émulsion étalée : cela permet en effet de faire une 25 recherche des gouttes spécifiques 22 dans l'ensemble des couches de l'émulsion 3 avec un unique balayage, ce qui est avantageux lorsque les gouttes spécifiques 22 sont rares. En outre, l'émulsion comprend une phase continue d'huile 23, entourant les gouttes 21, et ayant une température de liquéfaction (c'est-à-dire une 30 température au-delà de laquelle cette huile passe de l'état solide à l'état liquide) supérieure à 0°C, de sorte que de manière générale cette huile est solide à température ambiante lors du balayage. Plus précisément, la température de liquéfaction de l'huile 23 est supérieure à 37°C, et même supérieure à40°C, voir même de préférence supérieure à 50°C. 2934050 -14- Ainsi, l'émulsion a une température de liquéfaction (c'est-à-dire une température au-delà de laquelle cette émulsion passe de l'état solide à l'état liquide) supérieure à 0°C, de sorte que de manière générale l'émulsion est solide à température ambiante lors du balayage. Par solide, on entend un 5 état non liquide et non gazeux. Dans certains cas particuliers, cet état solide peut être un gel, un verre ou un état cristallisé. Plus précisément, la température de liquéfaction de l'émulsion est supérieure à 37°C, et même supérieure à 40°C, voire même de préférence supérieure à 50°C. De cette manière, l'émulsion peut ainsi être chauffée à une température 10 (typiquement 25°C ou 37°C) idéale pour une réaction biologique ou chimique tout en restant solide lors de son balayage. Ainsi, le procédé selon l'invention comprend en outre, durant chaque balayage de l'émulsion, un maintient de l'émulsion à une température (typiquement 25°C ou 37°C) inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue 23. Ce 15 maintient est mis en oeuvre par les moyens de maintient 17. Une formule d'émulsion 3 utilisable est la suivante : la phase continue huileuse 23 comprend: o une fraction volumique dans l'huile en Span6O de x%, avec x compris entre 0,5% et 5%, de préférence sensiblement égal à 20 2,5%, o une fraction volumique dans l'huile en cholestérol de y%, avec y compris entre 0,5% et 5%, de préférence sensiblement égal à 2,5%, o une fraction volumique dans l'huile en Dodecane de (100-x-y) 25 %, les gouttes 21 comprennent une solution aqueuse comprenant des molécules et/ou de cellules à isoler dans les gouttes, et de l'eau. L'émulsion comprend : - une fraction volumique en eau de 40% à 90 %, de préférence 30 sensiblement 70%, qui permet de former les gouttes, et - et une fraction volumique en phase huileuse de 10 % à 60 %, de préférence de sensiblement 30%. 2934050 -15 Le procédé selon l'invention comprend en outre les étapes suivantes mis en oeuvre par l'unité d'analyse 6 pour chaque image bidimensionnelle construite: - une localisation dans l'image bidimensionnelle 24 des gouttes 5 spécifiques 22 (c'est-à-dire une détermination des coordonnées de chaque goutte spécifique 22 dans l'image bidimensionnelle 24) par analyse de l'image bidimensionnelle 24 ; la localisation et l'analyse comprennent typiquement une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation (logiciel NIS, de chez Nikon) sur l'image 10 bidimensionnelle ; typiquement, les gouttes spécifiques sont localisées car elles émettent un signal de fluorescence spécifique qui est détecté par la caméra 11 et qui fait partie des données de l'image bidimensionnelle : le laser 13 émet un rayonnement qui excite des molécules, cellules et/ou marqueurs fluorescents contenus dans les 15 gouttes spécifiques 22, le filtre 9 laisse passer le signal de fluorescence émis par chaque goutte spécifique 22 mais bloque les longueurs d'onde émise par le laser 13, de sorte que la caméra détecte chaque signal de fluorescence spécifique, puis l'unité 6 enregistre les coordonnées spatiales et les valeurs de chaque signal 20 de fluorescence spécifique comme faisant partie des données de l'image bidimensionnelle ; - un dénombrement dans l'image bidimensionnelle 24 des gouttes spécifiques 22 (c'est-à-dire un calcul du nombre de gouttes spécifiques 22 dans l'image bidimensionnelle 24) par analyse de 25 l'image bidimensionnelle de l'émulsion ; le dénombrement et l'analyse comprennent typiquement une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation (logiciel NIS, de chez Nikon) sur l'image bidimensionnelle. Dans une première variante, le procédé selon l'invention 30 comprend ensuite un prélèvement d'une ou plusieurs des gouttes spécifiques 22, le prélèvement de chaque goutte 22 comprenant : - un déplacement de l'extrémité de la micropipette 18 à des coordonnées où a été localisée une goutte spécifique 22 ; la micropipette est déplacée par la platine 19, et ce déplacement est 2934050 -16 automatisé car après avoir localisé une goutte spécifique 22, l'unité d'analyse 6 communique directement les coordonnées de cette goutte 22 à la platine 19 ; et - une aspiration de cette goutte spécifique 22 le long de la micropipette 5 18. On prélève ainsi une à une un petit nombre de gouttes 22 par rapport au nombre total de gouttes 21 lues, grâce aux moyens de succion. Typiquement, moins de 10 000, de préférence moins de 1000 ou moins de 100 gouttes 22 sont prélevées. Lorsque ces gouttes prélevées 22 10 contiennent chacune un gène, on peut ensuite amplifier ces gènes (après avoir éliminé la phase huile) par une des techniques d'amplification de gènes de type molécule unique (par exemple : � single molecule PCR �, � single molecule PCR � en émulsion) Dans une deuxième variante, combinable avec la première variante, le 15 procédé selon l'invention comprend en outre un suivi dans le temps d'une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins une des gouttes spécifiques 22, ledit suivi comprenant une réitération des étapes de balayage et de construction, et éventuellement de localisation et/ou de dénombrement. Pour réaliser ce suivi, l'unité 7 stocke et compare 20 différentes images bidimensionnelles successives construites par cette unité 6 L'émulsion 3 étant solide pendant et entre tous les balayages réalisés pour le suivi de la réaction, les gouttes 21 ne bougent pas et on peut donc identifier chaque goutte 21 de manière non équivoque, ce qui permet des 25 suivis cinétique (impossibles par FACS). L'utilisation d'une émulsion solide permet également de supprimer tout échange de solutés entre es gouttes. Les gouttes 21 ne bougeant pas, on peut immédiatement repérer l'évolution de la fluorescence de chacune de ces milliers de gouttes 21 au cours du temps. 30 Bien sûr, l'invention n'est pas limitée aux exemples qui viennent d'être décrits et de nombreux aménagements peuvent être apportés à ces exemples sans sortir du cadre de l'invention. En particulier, la micropipette 18 du dispositif 1 peut être remplacée par tout autre dispositif de micromanipulation connu de l'homme du métier. 2934050 - 17 En outre dans une variante, fa micropipette 18 ou tout autre dispositif de micromanipulation la remplaçant est immobile, et la platine 19 déplace la lame 15 relativement au dispositif de micromanipulation 18. 5 REVENDICATIONS1. Procédé de lecture d'une émulsion (3) comprenant des gouttes (21, 22), ledit procédé comprenant : - un balayage bidimensionnel de l'émulsion (3) par un système optique (4), - une construction d'une image bidimensionnelle (24) de l'émulsion (3) à partir dudit balayage. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'émulsion (3) comprend une phase continue (23) qui entoure les gouttes (21) et qui est solide à température ambiante lors du balayage. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la phase 15 continue a une température de liquéfaction supérieure à 37°C, de préférence supérieure à 40°C, plus précisément de préférence supérieure à 50°C. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 20 caractérisé en ce que durant le balayage de l'émulsion, l'émulsion est maintenue à une température inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 25 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un suivi dans le temps d'une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins une des gouttes (22), ledit suivi comprenant une réitération des étapes de balayage et de construction. 30 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une localisation de gouttes (22) comprenant un type donné de molécule ou de cellule par analyse de l'image bidimensionnelle (24) de l'émulsion (3). 2934050 -19- 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la localisation comprend une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation sur l'image bidimensionnelle. 5 8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un prélèvement des gouttes (22) comprenant le type donné de molécule ou de cellule. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le 10 prélèvement comprend : un déplacement d'une extrémité d'une micropipette (18) à des coordonnées où a été localisée une goutte (22) comprenant le type donné de molécule ou de cellule, et une aspiration de cette goutte (22) par la micropipette (18). 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un dénombrement de gouttes (22) comprenant un type donné de molécule ou de cellule par analyse de l' mage bidimensionnelle (24) de l'émulsion (3). 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le dénombrement comprend une utilisation d'un algorithme de seuillage et segmentation sur l'image bidimensionnelle. 25 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction de l'image bidimensionnelle comprend au cours du balayage : une projection de différentes images partielles de l'émulsion via le système optique (4) sur un détecteur (11), 30 - une combinaison des différentes images partielles de l'émulsion acquises par le détecteur (11). 20 2934050 -20- 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que les images partielles sont des images de signaux de fluorescence émis par l'émulsion. 5 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'émulsion (3) est une émulsion inverse de gouttes d'eau (21, 22) dans de l'huile (23). 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, 10 caractérisé en ce que l'émulsion (3) est étalée de manière à avoir une épaisseur comprise entre 1 et 100 couches de gouttes. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le système optique (4) a une profondeur de champ sensiblement égale ou 15 supérieure à l'épaisseur de l'émulsion (3) étalée. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre: -un placement de l'émulsion (3) entre deux lames (14, 15) parallèles 20 dont une (15) au moins est transparente (24), - un mouvement de cisaillement entre les deux lames (14, 15) jusqu'à ce que de l'émulsion (3) soit monodisperse. 18. Dispositif de lecture d'une émulsion (3) comprenant des gouttes 25 (21, 22), ledit dispositif comprenant : - ur logement (2) pour recevoir l'émulsion (3), - un système optique (4), - des moyens (5) pour effectuer un balayage bidimensionnel de l'émulsion (3) par le système optique (4), 30 - des moyens (11, 6) pour construire une image bidimensionnelle (24) de l'émulsion à partir d'un balayage bidimensionnel de l'émulsion. 19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'émulsion comprend une phase continue (23) entourant les gouttes (21), et en ce 2934050 -21 qu'il comprend en outre des moyens (17) pour maintenir l'émulsion (3) à une température inférieure à la température de liquéfaction de la phase continue durant le balayage de l'émulsion. 5 20. Dispositif selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (6) pour suivre dans le temps une réaction chimique ou biologique se déroulant dans au moins une des gouttes (22). 10 21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (6) pour localiser des gouttes (22) comprenant un type donné de molécule ou de cellule, les moyens de localisation comprenant des moyens d'analyse de l'image bidimensionnelle (24) de l'émulsion. 15 22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens (18, 19) pour prélever des gouttes (22) comprenant le type donné de molécule ou de cellule. 23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que les moyens de prélèvement comprennent : ure micropipette (18), - des moyens (19) pour déplacer une extrémité de la micropipette à des coordonnées d'une goutte (22) comprenant le type donné de molécule ou de cellule et localisée par les moyens de localisation (6), et - des moyens pour aspirer cette goutte par la micropipette. 24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens (6) pour dénombrer des gouttes (22) comprenant un type donné de molécule ou de cellule, les moyens de dénombrement comprenant des moyens d'analyse de l'image bidimensionnelle (24) de l'émulsion. 2934050 - 22 ù 25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 18 à 24, caractérisé en ce que les moyens de construction de l'image bidirnensionnelle comprennent : - un détecteur (11) sur laquelle le système optique (4) est agencé pour 5 projeter différentes images partielles de l'émulsion (3) au cours d'un balayage, - des moyens (6) pour combiner les différentes images partielles de l'émulsion acquises par le détecteur (11) au cours du balayage. 10 26. [)ispositif selon l'une quelconque des revendications 18 à 25, caractérisé en ce que le logement (2) est agencé pour que l'émulsion (3) soit étalée de manière à avoir une épaisseur comprise entre 1 et 100 couches de gouttes (21, 22). 15 27. [)ispositif selon la revendication 26, caractérisé en ce que le système optique (4) a une profondeur de champ sensiblement égale ou supérieure à l'épaisseur de l'émulsion étalée (3). 28. [)ispositif selon l'une quelconque des revendications 18 à 27, 20 caractérisé en ce que le logement (2) comprend deux lames parallèles (14, 15) dont une (15) au moins est transparente, et des moyens (16) pour appliquer un mouvement de cisaillement entre les deux lames (14, 15) jusqu'à ce que de l'émulsion (3) soit monodisperse. 2.5