Brevet FR2931825A1 — publié le 20091204

PROCEDE D'ENRICHISSEMENT ET DE SOLUBILISATION DE PROTEINES MEMBRANAIRES La présente invention concerne, de façon générale, le 5 domaine de l'étude des protéines. Plus précisément, l'invention concerne, selon un premier de ses aspects, un procédé d'enrichissement et de solubilisation de protéines membranaires, comprenant des étapes de : 10 - enrichissement des protéines totales d'un échantillon de cellules ; centrifugation de l'extrait jusqu'à obtention d'un surnageant et d'un culot qui contient les protéines membranaires ; et 15 - dissolution du culot par une solution comprenant un agent tensioactif. Pour solubiliser les protéines de membrane cellulaire, il est connu notamment d'utiliser le Triton X-100, le SDS, le CHAPS, ou le Tergitol� NP40. Toutefois, l'utilisation de tels 20 agents n'est pas satisfaisante lorsque l'on veut soumettre les protéines à une électrophorèse bidimensionnelle. Par exemple, l'utilisation de SDS n'est pas compatible avec une séparation selon la charge des protéines en électrophorèse bidimensionnelle. 25 On connaît également la demande de brevet publiée FR 2 899 901 qui décrit l'utilisation de tensioactifs fluorés de type sulfobétaïne pour solubiliser les protéines membranaires avant de les soumettre à une électrophorèse bidimensionnelle. Toutefois, le gel d'électrophorèse qui peut être obtenu ne 30 révèle que peu de spots, et donc seulement un petit nombre des protéines membranaires. Dans ce contexte, la présente invention a pour but de proposer un procédé exempt de l'une au moins des limitations précédemment évoquées, et en particulier un procédé amélioré 35 d'enrichissement et solubilisation des protéines membranaires. A cette fin, le procédé de l'invention, par ailleurs conforme à la définition générique qu'en donne le préambule ci-dessus, est essentiellement caractérisé en ce que ladite solution comprend au moins un premier agent tensioactif et au moins un deuxième agent tensioactif, qui sont choisis dans la famille des nonylphénols polyéthoxylés de formule C9H19-C6H4-(OCH2CH2) n-OH où n représente un entier compris entre 4 et 15 pour le premier agent tensioactif, ou compris entre 30 et 70 pour le deuxième agent tensioactif. Les premier et deuxième agents tensioactifs sont des détergents non ioniques de nom de marque Tergitol�. Par exemple, la solution de dissolution du culot inclut de 1 à 6% en poids d'au moins un premier agent tensioactif et de 1 à 5% en poids d'au moins un deuxième agent tensioactif. De préférence, le premier agent tensioactif est choisi parmi le Tergitol� NP4 de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) 4-OH ou le Tergitol� NP7 de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) 7-OH. Le deuxième agent tensioactif est de préférence le Tergitol� NP40 de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) 40-OH. Plus préférentiellement, n représente un entier égal à 4 ou à 7 pour le premier agent tensioactif, et n égal à 40 pour le deuxième agent tensioactif. Le procédé selon l'invention comprend en outre avantageusement une étape de séparation des protéines membranaires par électrophorèse bidimensionnelle du culot solubilisé, et de préférence par électrophorèse bidimensionnelle à haute résolution. Notamment, l'électrophorèse est une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. De manière avantageuse, le procédé selon l'invention n'inclut aucune étape de purification des protéines membranaires à partir de l'échantillon de cellules. Le procédé comprend en outre une étape d'identification des protéines séparées par électrophorèse, de préférence par 35 spectrométrie de masse. L'échantillon de cellules est préférentiellement un échantillon de cellules d'origine humaine. Selon l'invention, les cellules peuvent être par exemple des cellules musculaires ou des lymphocytes. Le procédé selon l'invention inclut avantageusement en outre une étape de réhydratation du gel d'électrophorèse bidimensionnelle, avant l'étape (10) de séparation, à l'aide d'une solution de réhydratation comprenant un agent mouillant tel qu'un polyphénol polyéthoxylé de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) 7-OH. A la fin de l'étape de centrifugation, le culot contient les débris cellulaires incluant les membranes et donc les protéines membranaires. Un des avantages de l'invention est de proposer une solution tensioactive qui permette de travailler directement sur ce culot contenant les protéines membranaires, sans passer nécessairement par une étape de purification des membranes. Une telle étape peut faire partie du procédé selon l'invention. Toutefois, la possibilité de son omission est avantageuse en ce que cette purification des membranes représente une étape supplémentaire, longue, et qui requiert une quantité plus importante de matériel biologique de départ. Le culot, une fois solubilisé, autrement dit repris dans la solution tensioactive, peut être soumis directement à une électrophorèse bidimensionnelle ou électrophorèse 2D. L'électrophorèse 2D permet une séparation plus précise que celle obtenue avec une électrophorèse à une seule dimension, mais requiert une quantité de protéines plus grande. Or, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une bonne enrichissement et une bonne solubilisation des protéines membranaires, et donc une quantité de protéines permettant de très bons résultats en électrophorèse 2D sans nécessiter une grande quantité de matériel biologique en amont du procédé. Ainsi, le procédé de l'invention s'applique tout à fait à des échantillons cellulaires prélevés in vivo, et en particulier chez l'homme. Ce procédé présente en outre l'avantage d'être simple à mettre en oeuvre en ce que, par exemple, il ne nécessite pas d'étape de purification des protéines membranaires à partir de l'échantillon cellulaire. Par la combinaison avec l'électrophorèse bidimensionnelle, le procédé permet également une séparation et une identification plus précises de protéines membranaires à partir d'un échantillon cellulaire. Les gels d'électrophorèse obtenus avec l'invention permettent de visualiser de nombreux spots, qui sont en outre d'intensité satisfaisante, et donc facilement identifiables notamment en spectrométrie de masse. L'invention concerne aussi l'utilisation d'au moins un premier agent tensioactif et au moins un deuxième agent tensioactif, qui sont choisis dans la famille des nonylphénols polyéthoxylés de formule C91119-C6H4- (OCH2CH2) n-OH où n représente un entier compris entre 4 et 15 pour le premier agent tensioactif, ou compris entre 30 et 70 pour le deuxième agent tensioactif, pour solubiliser des protéines membranaires extraites de cellules humaines. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description détaillée qui en est faite ci-après, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence à la figure 1 annexée qui représente schématiquement le procédé selon l'invention. On travaille à partir d'un échantillon cellulaire qui est soit une biopsie 1 soit une culture de cellules. L'invention concerne en particulier les cellules humaines, telles que cellules musculaires ou lymphocytes. Les cellules de la biopsie sont, en étape 2, isolées et lavées. On récupère un culot 3 après des centrifugations 35 douces pour le lavage. Ce culot 3 est repris dans une solution tampon 4 qui est par exemple un mélange d'urée, de CHAPS, de DTT, et de Tris base, pour la lyse des cellules. Le mélange obtenu est soumis à une étape 5 de congélation dans de l'azote liquide, puis est décongelé à température ambiante, et mélangé au vortex. Ces opérations sont répétées plusieurs fois, et de préférence au moins quatre fois. En étape 6, le mélange est centrifugé à haute vitesse pendant le temps nécessaire pour obtenir un culot, soit de l'ordre d'au moins 5 minutes. Un culot 7 est obtenu, qui contient les débris cellulaires, et notamment les membranes. Ce culot 7 est repris par une solution 8 de dissolution et de solubilisation des protéines membranaires. Cette solution inclut au moins un premier et un deuxième agent tensioactif de la famille des nonylphénols polyéthoxylés de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) n-OH, un premier à chaîne courte où n est compris entre 4 et 15, et un deuxième à chaîne longue où n est compris entre 30 et 70. On obtient un mélange 9 contenant principalement les protéines membranaires solubilisées. Le mélange 9 peut être soumis en étape 10 à une électrophorèse 2D, pour obtenir un gel 11 sur lequel on observe des spots ou tâches 12, par exemple en spectrométrie de masse. Les résultats d'électrophorèse peuvent autrement être observés par coloration ou par fluorescence. Lors de l'électrophorèse, les protéines ont migrées dans une première dimension et une première direction 13 en fonction de leur point isoélectrique, et dans une deuxième dimension et une deuxième direction 14 en fonction de leur poids moléculaire. On peut encore améliorer le procédé selon l'invention par l'utilisation de Tergitol� NP7 comme agent mouillant lors de la préparation du gel d'électrophorèse bidimensionnelle à haute résolution, dans la solution de réhydratation de ce gel, comme décrit dans la publication � High performance twodimensional gel electrophoresis using a wetting agent Tergitol� NP7 � par D. Laoudj-Chenivesse et al., WILEY-VCH, 2002. Exemple : Enrichissement des protéines membranaires de cellules de muscle chez l'homme On peut travailler à partir d'un échantillon de cellules en culture ou à partir d'une biopsie. Dans cet exemple, il 10 s'agit d'une biopsie de muscle. Une fois les cellules de la biopsie isolées, elles sont lavées. Le lavage consiste en des centrifugations successives douces à 4°C en présence de PBS puis, pour un dernier lavage, 15 en présence d'un mélange constitué de 50% d'eau et 50% de PBS. L'enrichissement des protéines totales, à partir des cellules entières, est alors réalisé. Pour cela, le culot obtenu en fin de lavage, contenant les cellules entières, est repris dans un mélange incluant 8 M 20 d'urée, 4% en volume de CHAPS, 65 mM de DTT, et 40 mM de Tris base. Le culot ainsi dissous est plongé dans l'azote liquide, puis décongelé à température ambiante, et enfin mélangé. Ces opérations sont répétées au moins quatre fois. 25 Le culot dissous et décongelé est alors soumis à une étape de centrifugation, à température ambiante, à très haute vitesse telle que 13000 rotations par minute, et pendant plusieurs minutes, de préférence au moins 5 minutes et tout préférentiellement pendant 15 à 20 minutes. 30 Le surnageant obtenu contient les protéines totales solubles. Le nouveau culot obtenu, contenant 10% des protéines totales, est repris dans une solution tensioactive comprenant 6 M d'urée, 40 mM de Tris base, 3% en volume de Tergitol� 35 NP40, et 5% en volume de Tergitol� NP4. Le volume de solution tensioactive est déterminé en fonction de la taille du culot, et est facilement adapté par l'homme du métier à cette taille. Les protéines membranaires, contenues dans ce nouveau culot, ainsi extraites et solubilisées, sont soumises à une électrophorèse bidimensionnelle. Cette électrophorèse sépare les protéines d'une part selon leur point isoélectrique, d'où l'avantage d'utiliser un agent tensioactif non ionique, et d'autre part selon leur poids moléculaire. Le procédé selon l'invention ainsi appliqué à un échantillon de cellules musculaires humaines a permis notamment un enrichissement de la protéine alpha-sarcoglycane, mise en évidence sur le gel d'électrophorèse par spectrométrie de masse. REVENDICATIONS1/ Procédé d'enrichissement et de solubilisation de protéines membranaires, comprenant des étapes de : - enrichissement des protéines totales d'un échantillon de cellules (1) ; - centrifugation (6) de l'extrait jusqu'à obtention d'un surnageant et d'un culot (7) qui contient les protéines membranaires ; et - dissolution du culot (7) par une solution (8) comprenant un agent tensioactif ; ledit procédé étant caractérisé en ce que ladite solution (8) comprend au moins un premier agent tensioactif et au moins un deuxième agent tensioactif, qui sont choisis dans la famille des polyphénols polyéthoxylés de formule C9H19-C6H4-(OCH2CH2)n-OH où n représente un entier compris entre 4 et 15 pour le premier agent tensioactif, ou compris entre 30 et 70 pour le deuxième agent tensioactif. 2/ Procédé selon la revendication 1, dans lequel n représente un entier égal à 4 ou à 7 pour le premier agent tensioactif, et n égal à 40 pour le deuxième agent tensioactif. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre une étape (10) de séparation des protéines membranaires par électrophorèse bidimensionnelle du culot solubilisé (9), et de préférence par électrophorèse bidimensionnelle sur gel à haute résolution. 4/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel aucune étape de purification des protéines membranaires à partir de l'échantillon de cellules (1) n'est réalisée. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, comprenant en outre une étape d'identification des protéines membranaires, après l'étape (10) de séparation par électrophorèse bidimensionnelle, par spectrométrie de masse.6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'échantillon de cellules (1) est un échantillon de cellules d'origine humaine. 7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, incluant en outre une étape de réhydratation du gel d'électrophorèse bidimensionnelle, avant l'étape (10) de séparation, à l'aide d'une solution de réhydratation comprenant un agent mouillant tel qu'un polyphénol polyéthoxylé de formule C9H19-C6H4- (OCH2CH2) 7-OH. 8/ Utilisation d'au moins un premier agent tensioactif et au moins un deuxième agent tensioactif, qui sont choisis dans la famille des polyphénols polyéthoxylés de formule C9H19-C6H4-(OCH2CH2)n-OH où n représente un entier compris entre 4 et 15 pour le premier agent tensioactif, ou compris entre 30 et 70 pour le deuxième agent tensioactif, pour solubiliser des protéines membranaires extraites de cellules humaines.