Brevet FR2933496A1 — publié le 20100108

Procédé de mesure du taux de Facteur VII activé dans un échantillon. DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à un procédé de mesure du taux de facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillon en utilisant un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI). ART ANTERIEUR La coagulation sanguine est un mécanisme qui permet aux organismes de contrôler les effusions de sang lors de lésions vasculaires et ainsi d'éviter les hémorragies. La coagulation sanguine se déroule selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Dans cette succession d'étapes (ou cascade) de la coagulation on distingue deux voies, appelées voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation. Toutes deux conduisent à la formation du complexe, appelé prothrombinase, constitué de facteur X activé (FXa), de facteur V activé (FVa), de phospholipides et de calcium. C'est la prothrombinase qui active la prothrombine en thrombine permettant la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble qui forme le caillot. La voie extrinsèque implique l'intervention du FVII présent dans le plasma. Toutefois, ce dernier doit être R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 -2 préalablement activé en FVIIa pour initier la cascade de la coagulation. Le FVIIa seul (non complexé au facteur tissulaire) présente une faible activité protéolytique. Cette activité est potentialisée lorsque le FVIIa est complexé au facteur tissulaire (FT), protéine associée à des phospholipides, qui est libérée lors de la lésion vasculaire. Le complexe FVIIa-FT transforme le facteur X en facteur Xa en présence d'ions calcium. Le complexe FVIIa-FT transforme aussi le FIX en FIXa. Les facteurs IXa et Xa, en retour, activent le FVII en FVIIa. Le facteur Xa complexé au facteur Va et aux phospholipides (prothrombinase) transforme la prothrombine en thrombine. La thrombine agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine et présente également d'autres activités parmi lesquelles l'activation du facteur V en Facteur Va et du FVIII en FVIIIa. La thrombine active également en présence de calcium le facteur XIII en facteur XIIIa qui permet la consolidation du caillot de fibrine. Alors que dans la voie extrinsèque de la coagulation le FIX est activé en FIXa par le complexe FVIIa/FT, dans la voie intrinsèque de la coagulation, le FIXa est généré à partir du FIX par le FXIa lui même activé par le facteur XII activé par le contact du sang avec une surface électronégative telle que le sous-endothélium. Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même R:'Brevets`28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 -3 en l'absence de Facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le FVIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements. La première approche fut d'obtenir le FVIIa à partir du plasma. Mais la production de FVIIa à partir du plasma est limitée par la disponibilité de la source d'approvisionnement et cette utilisation de plasma présente des risques de transmission d'agents pathogènes, comme par exemple le prion et les virus. Ces problèmes ont été résolus par Novo Nordisk Pharmaceuticals avec le développement d'un FVIIa recombinant (rFVIIa) qui est une glycoprotéine structurellement similaire au FVIIa plasmatique. La principale indication thérapeutique pour le rFVIIa (aux USA, EU et Japon) concerne le traitement du saignement spontané ou chirurgical des hémophiles A ayant développé des anticorps anti-facteur VIII et des hémophiles B ayant développé des anticorps anti-facteur IX. En Europe, il est aussi indiqué pour son utilisation chez des patients avec une déficience congénitale en FVII et chez les patients atteints de la thrombasthénie de Glanzmann. En outre, de nombreuses publications rapportent l'efficacité du rFVIIa dans le contrôle de l'hémorragie lors d'interventions chirurgicales, chez des patients qui n'ont ni déficit congénital en facteur de la coagulation ni de thrombasthénie. Cette utilisation de plus en plus large du FVIIa a conduit à mettre au point des méthodes pour (1) mesurer l'activité du FVIIa (2) déterminer la concentration en FVIIa R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 -4 (3) mesurer le taux de FVII activé. Les méthodes les plus connues pour détecter l'activité du FVIIa sont la mesure du temps de coagulation, le PTT (Partial Thromboplastin Time Temps Partiel de Thromboplastine), l'aPTT (activated partial thromboplastin time - Temps partiel de Thromboplastine activé), le TEG (thromboélastographe) et le TGT (test de génération de thrombine). Ces méthodes permettent de détecter l'activité du FVIIa mais ne permettent pas jusqu'à présent de mesurer directement le taux de FVII activé dans un échantillon. Un kit commercial de dosage immunologique du FVIIa est disponible (IMUBIND Factor VII ELISA kit) mais les conditions expérimentales pour la mise en oeuvre de cette technique sont difficilement maîtrisables. En effet ce kit est complexe à mettre en oeuvre et se caractérise par une plage dynamique extrêmement faible, une gamme linéaire de détection extrêmement limitée et surtout nécessite de travailler à une température de +4°C. D'autres méthodes de mesure de la concentration de FVIIa sont décrites dans la littérature, comme la mesure de son activité protéolytique avec l'utilisation de FT recombinant tronqué (Staclot VIIa-rTF, Stago) (US 5,472,850, US 5,741,658, WO 1992/018870, US 5,750,358, US 5,741,658, US 5,472,850, EP 0 641 443) ou la mesure de la concentration d'un complexe FVIIa-antithrombine (WO 03/004694). Cependant ces méthodes sont peu précises et difficiles à mettre en oeuvre. En effet ces méthodes ne permettent de traiter que quelques échantillons en même temps et pour des faibles R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 2933496 -5 concentrations en FVIIa le caillot formé n'est pas suffisant mettre en oeuvre correctement le procédé. Par aileurs, les méthodes de dosage fluorogénique ou chromogénique du FXa généré par le FVIIa se sont également révélées inappropriées pour mesurer la concentration de FVIIa car elles ne permettent pas de différencier l'effet du FVII de celui du FVIIa. Parmi les méthodes employées par certains biologistes pour évaluer l'efficacité d'un traitement avec le FVIIa, la thromboélastographie est quelquefois utilisée. Cette méthode consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé thromboélastogramme) généré par le thromboélastographe, le clinicien peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient. Bien que précise, cette méthode est fastidieuse, peu adaptée à une analyse routinière et répétitive, et difficilement applicable à un multiéchantillonnage car elle nécessite d'être effectuée dans l'heure qui suit le prélèvement sanguin. De plus, cette méthode ne permet pas de mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon. La méthode la plus connue pour mesurer le taux de FVII activé consiste à mesurer de manière indépendante la concentration en FVII+FVIIa et la concentration en FVIIa afin d'en déduire le taux de FVII activé (rapport concentration en FVIIa/concentration en FVII+FVIIa). Malgré le fait que la mesure de la concentration en FVII+FVIIa soit précise, les mesures directes de la R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 15 20 25 30 concentration en FVIIa demeurent imprécises et difficiles à mettre en oeuvre. Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé efficace et facile à mettre en oeuvre pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon, en particulier lorsque l'échantillon contient un mélange de Facteur VII non-activé et de Facteur VII activé. RESUME DE L'INVENTION La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que la mise en oeuvre d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI permet de mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon de manière fiable, reproductible et facile à mettre en œuvre, en particulier lorsque l'échantillon contient du facteur VII non-activé et du facteur VII activé. Les conditions expérimentales mises en œuvre dans le procédé de l'invention permettent ainsi d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans un échantillon et certains paramètres caractéristiques d'un test de génération de thrombine (TGT) et du thrombinogramme qui en résulte. Une telle corrélation permet de déterminer le taux de FVII activé dans un échantillon à tester, en comparant les paramètres du thrombinogramme dudit échantillon avec ceux de thrombinogrammes � standards � obtenus à partir de compositions comprenant des taux connus de FVII activé. R:ABrevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 -7 La présente invention concerne donc un procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon-test avec un plasma dépourvu en facteur VII (FVII) et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI), le mélange échantillon-test + plasma ayant une concentration finale en FVII+FVIIa allant de 10 pM à 80 pM ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ; c) obtenir un thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine (TGT) sur le mélange de l'étape b) ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme de l'étape c) à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards établis sur la base d'échantillons-standards dont le taux de Facteur VII activé est connu et varie entre chaque échantillon-standard ; e) déduire de l'étape d) une mesure du taux de Facteur VII activé dans l'échantillon-test. Le procédé de la présente invention comprend éventuellement une étape f) additionnelle consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans ledit échantillon-test à partir du taux déterminé à l'étape e). De préférence, les thrombinogrammes standards sont obtenus en effectuant un test de génération de thrombine sur un mélange contenant (i) un échantillon-standard dont le taux de facteur VII activé est connu, R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 -8 (ii) un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI, la concentration finale du mélange échantillon-standard + plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX et le FXI étant sensiblement identique à celle du mélange échantillon-test + plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII ,FIX et FXI, et (iii) des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine. Avantageusement, le paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence, le temps au pic et la vélocité lorsque ledit plasma est dépourvu en FVII et en FIX, ou dépourvu en FVII et en FXI ; et parmi le temps de latence et le temps au pic lorsque ledit plasma est dépourvu en FVII et en FVIII. Préférentiellement, les mélanges échantillon-test + plasma et échantillon-standard + plasma sont réalisés en utilisant un même plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Avantageusement, les composants initiateurs de la génération de thrombine comprennent un Facteur tissulaire (FT), des phospholipides, et du Cal, la concentration finale en ledit facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 1 à 10 pM, la concentration finale en lesdits phospholipides dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 0,1 à 5 gM et la concentration finale en Cal+ dans le mélange R:\Brevets\28000\28002 LFB`28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 2933496 -9 échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 14 à 18 mM. Avantageusement, le facteur FVII activé dont le taux est mesuré est d'origine plasmatique (pFVIIa), d'origine recombinante (rFVIIa) ou d'origine transgénique (TgFVIIa). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon-test est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un milieu de culture cellulaire sans sérum. La présente invention concerne également l'utilisation d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon-test. DESCRIPTION DETAILEE DE L'INVENTION Dans le cadre de la présente invention, par � Facteur VII �, ou � FVII �, on entend le Facteur VII non-activé correspondant à la proenzyme monocaténaire qui ne peut pas déclencher la coagulation. Par � Facteur VII activé � ou � FVII activé �, ou FVIIa on entend la protéine bicaténaire (enzyme), comprenant une chaîne lourde et une chaîne légère reliées entre elles par un pont disulfure, résultant du clivage du FVII (proenzyme), et qui se montre capable de déclencher la coagulation sanguine. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 10 15 20 25 30 2933496 - 10 - Par � FVII+FVIIa �, on entend la somme des concentrations ou la somme des quantités de FVII et de FVIIa présents dans un échantillon d'intérêt. La somme des quantités ou des concentrations de FVII et de FVIIa peut être mesurée, par exemple, par dosage immunologique en utilisant des kits disponibles commercialement tels que ASSERACHROM° VII:Ag de Diagnostica Stago (Référence 00241). Par � taux de Facteur VII activé � ou � taux de FVIIa �, on entend le rapport entre la quantité ou la concentration de Facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillon d'intérêt, et la somme des quantités ou des concentrations, respectivement, du Facteur VII et du Facteur VII activé (FVII+FVIIa) dans ce même échantillon d'intérêt. Le taux de FVII activé sera égal à 1 (c'est-à-dire 100%) pour un échantillon contenant uniquement du FVIIa mais ne contenant pas de FVII, ce taux sera égal à 0,5 (c'est-à-dire 50%) pour un échantillon contenant autant de FVIIa que de FVII, et il sera égal à 0 (c'est-à-dire de 0%) pour un échantillon contenant uniquement du FVII (ne contenant pas de FVIIa). Par � échantillon-test �, on entend un échantillon contenant du FVII, du FVII activé ou un mélange de ceux-ci, mais dont le taux de FVII activé n'est pas connu. Avantageusement, l'échantillon-test est purifié à partir de sang ou de plasma ou provient d'un liquide corporel, purifié ou non, tel que, par exemple, le lait d'un mammifère, un milieu de culture ou un homogénat cellulaire. RABrevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde ty déposée .doc 5 10 15 20 25 30 2933496 - 11 - Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon-test est un échantillon de lait de mammifère, en particulier un échantillon de lait de mammifère transgénique produisant du FVII et/ou du FVIIa dans son lait. Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon-test est un milieu de culture cellulaire sans sérum. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon à tester est un échantillon thérapeutique ou non contenant du FVIIa plasmatique (pFVIIa), recombinant (rFVIIa) ou transgénique (TgFVIIa), et du FVII, ou un mélange de ceux-ci sous forme liquide ou lyophilisée. Par � échantillon-standard �, on entend un échantillon dont le taux de FVII activé est connu et/ou choisi, en incorporant, par exemple, des quantités ou des concentrations appropriées de standard international de FVII (Blood Coagulation Factor VII Concentrate Human, NIBSC référence 97/592) ou de standard international de FVII activé (Blood Coagulation Factor Vila Concentrate Human, NIBSC référence 89/688), ou d'un mélange de ceux-ci, dans une solution d'intérêt, pour obtenir un taux souhaité de FVII activé. L'échantillon standard peut également être obtenu à partir de sang ou de plasma, ou provient d'un liquide corporel, purifié ou non, tel que, par exemple, le lait, ou un milieu de culture ou un homogénat cellulaire. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-08070] -Dde tq déposée .doc 5 10 15 20 25 30 2933496 - 12 - Le plasma, tel qu'utilisé dans le cadre de la présente invention, est d'origine animale, de préférence mammifère et préférentiellement humaine. Au sens de la présente invention, les expressions � déplété en � ou � dépourvu en � revêtent la même signification et peuvent être utilisées en tant qu'alternatives pour désigner un appauvrissement d'une solution d'intérêt (par exemple un plasma) en un composé (par exemple un facteur de coagulation sanguine), jusqu'à rendre indétectable la présence ce dernier. L'expression � plasma dépourvu en FVII et en au moins un facteur choisi parmi le FVIII, le FIX ou le FXI � signifie donc que la concentration respective de chacun de ces facteurs FVII, FVIII, FIX ou FXI dans le plasma considéré est inférieure à leur seuil de détection lorsque leur concentration est mesurée par les méthodes de dosage connues de l'homme du métier. A titre d'exemples de méthodes de dosage, on peut citer celles qui utilisent des kits ou réactifs commerciaux (par exemple, ASSERACHROM� VII:Ag de Diagnostica Stago (Référence 00241) ou Factor VII ELISA Set de KORDIA (Référence FVII-EIA). De préférence, le seuil de détection du FVII dans le plasma est d'environ 1 mUI/ml (0,5 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FVII ne peut être détecté. De préférence, le seuil de détection du FVIII dans le plasma est d'environ 10 mUI/ml (1 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FVIII ne peut être détecté. R:ABrevets\28000'28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc - 13 - De préférence, le seuil de détection du FIX dans le plasma est d'environ 0,2 mUI/ml (1 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FIX ne peut être détecté. De préférence, le seuil de détection du FXI dans le plasma est d'environ 0,5 mUI/ml (2,5 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FXI ne peut être détecté. Les techniques de déplétion du plasma en un facteur d'intérêt comprennent toutes les techniques connues de l'homme du métier. A titre d'exemple de techniques de déplétion, on peut notamment citer l'immunodéplétion, la déplétion chimique, ainsi que la combinaison de celles-ci. L'immunodéplétion consiste à utiliser des anticorps spécifiquement dirigés contre un antigène contenu dans une solution dans le but d'appauvrir substantiellement ladite solution en l'antigène considéré. Les anticorps utilisés pour réaliser une immunodéplétion peuvent être polyclonaux et/ou monoclonaux issus d'un seul ou de différents clones cellulaires. Les anticorps utilisés peuvent être dirigés directement contre l'antigène que l'on souhaite éliminer ou contre une protéine qui se lie à cet antigène. Un plasma déplété en FVII, FIX ou FXI pourra ainsi être obtenu en utilisant respectivement des anticorps anti-30 FVII, anti-FIX ou anti-FXI. Un plasma dépourvu en FVIII pourra être obtenu en utilisant des anticorps anti-FVIII ou des anticorps R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 IO 15 20 2530 - 14 - dirigés contre le facteur von Willebrand, une protéine plasmatique qui transporte le FVIII dans le sang. Un plasma déplété en FVIII pourra également être obtenu par déplétion chimique, en utilisant de l'EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) dans la mesure où le FVIII est un facteur dépendant du Cal-f. L'EDTA est ensuite éliminé par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple par dialyse. Avantageusement, le plasma utilisé pour mettre en oeuvre la présente invention est un plasma dépourvu en facteur VII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Avantageusement, le plasma utilisé pour mettre en oeuvre la présente invention est préparé à partir d'un plasma d'hémophile de type A, naturellement dépourvu en FVIII, à partir d'un plasma d'hémophile de type B, naturellement dépourvu en FIX, ou à partir d'un plasma provenant de patients présentant un déficit complet en facteur XI, lesdits plasmas naturellement dépourvus en FVIII, FIX ou FXI sont ensuite déplétés en FVII, par une méthode immunologique ou chimique telle que celles décrite plus haut. Dans un autre mode de mise en œuvre de l'invention, le plasma utilisé est préparé à partir d'un plasma normal qui est, dans un premier temps, déplété en FVII puis, dans un second temps, déplété en FVIII et/ou en FIX et/ou en FXI. Au sens de la présente invention, par � composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine � R.\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 - 15 - ou � composants initiateurs �, on entend les composants indispensables permettant de débuter la génération de thrombine à partir de la prothrombine. Les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprennent essentiellement une source d'ion calcium (Ca2+), un agent phospholipidique et du facteur tissulaire (FT), dans des concentrations suffisantes pour déclencher la réaction de génération de thrombine. Une source d'ions calciums appropriée dans le cadre de la présente invention correspond à toute source d'ions calcium biologiquement compatible, telle que le CaC12. La source de Cal+ peut être ajoutée au mélange échantillon/plasma extemporanément avec les autres composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ou de manière différée, c'est à dire après l'ajout des autres composants initiateurs de la réaction de génération de la thrombine. Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en ions calcium, il est entendu une concentration finale en ions calcium dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 14 à 18 mM, et en particulier égale à 16,7 mM. Des agents phospholipidiques appropriés pour être utilisés dans la présente invention peuvent se présenter sous la forme de concentré ou de lyophilisat et consistent, de préférence, en un mélange comprenant une quantité majoritaire de phosphatidylcholine et de R \Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 - 16 - phosphatidylsérine ou contenant exclusivement de la phosphatidylcholine et de la phosphatidylsérine. Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en agents phospholipidiques, il est entendu une concentration finale en agents phospholipidiques dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 0,1 à 5 4M, en particulier de 0,5 à 2 �M, et plus particulièrement égale à 1 12M. Un facteur tissulaire (FT) approprié pour être utilisé dans la présente invention peut être choisi dans le groupe constitué par tout facteur tissulaire natif, plasmatique, recombinant ou transgénique, tout Facteur tissulaire modifié, y compris tout Facteur tissulaire tronqué ayant perdu sa fonction d'activation du facteur VII en facteur VIIa, à condition que ledit Facteur tissulaire modifié ait conservé, même partiellement, sa capacité à agir en tant que cofacteur de l'activité enzymatique du facteur VIIa. Un facteur tissulaire modifié approprié peut, par exemple, être délété de son domaine transmembranaire tel que le facteur tissulaire du kit STACLOT de Diagnostica Stago (Référence 00281) disponible dans le commerce. Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en Facteur tissulaire, il est entendu une concentration finale en Facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 1 à 10 pM, en particulier de 4 à 6 pM, et plus particulièrement égale à 5 pM. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc - 17 - Dans le cadre de l'invention, l'échantillon test, l'échantillon standard, le plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX ou FXI, et/ou les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine peuvent se présenter sous forme liquide ou lyophilisée. Lorsqu'ils se présentent sous forme lyophilisée, ces composés peuvent avantageusement être remis en suspension, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, dans un solvant aqueux approprié, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI). La Demanderesse a donc mis au point un procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test reposant sur des conditions expérimentales spécifiques qui permettent de s'affranchir des désavantages résultant de la présence de FVII non activé dans l'échantillon-test. La première étape de ce procédé consiste à mélanger un échantillon-test contenant un taux inconnu de FVII activé avec un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en FVIII, et/ou en FIX et/ou en FXI, de sorte que la concentration finale en FVII+FVIIa dans le mélange résultant soit comprise dans la gamme allant de 10 pM à 80 pM. C'est cette combinaison spécifique des propriétés liées à la nature du plasma et à la gamme de concentration utilisées qui permet de mettre en œuvre le procédé de mesure du taux de FVII activé selon l'invention. Des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine sont ensuite ajoutés au mélange échantillon-test + plasma dans le but de déclencher la R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 10 15 20 25 30 - 18 - réaction de clivage qui conduit à la génération de thrombine à partir de la prothrombine contenue dans le plasma. Un test de génération de la thrombine est alors réalisé. Le test de la génération de thrombine (TGT) est un test connu de l'homme du métier (Thrombin generation assays: accruing clinical relevance, H. C Hemker, R. Al Dieri & S. Béguin, Curr. Opin. Hematol., 2004, 11, 170-5) qui permet de mesurer, de manière continue, la quantité de thrombine générée et le temps nécessaire pour générer cette thrombine lorsqu'un échantillon d'intérêt est mis en contact avec des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine. Le test de génération de thrombine débute lorsque l'échantillon d'intérêt (ou une solution comprenant ce dernier) est mis en contact avec des composants initiateurs de la réaction. Ce temps initial correspondant au début du test de génération de thrombine est appelé t0. La thrombine générée est ensuite révélée par l'utilisation d'un agent de révélation, de préférence par l'utilisation d'un agent fluorogénique, dont la dégradation par la thrombine provoque l'apparition d'un composé fluorescent, ou par l'utilisation d'un agent chromogénique. Avantageusement, l'agent fluorogénique ou l'agent chromogénique sont ajoutés au mélange échantillon + plasma en même temps que les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine. La fluorescence résultant de la dégradation de l'agent fluorogénique par la thrombine nouvellement générée est détectée par un dispositif de mesure tel qu'un R:\Brevets\28000`28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée doc 2933496 - 19 - fluorimètre. De préférence, le fluorimètre utilisé est pourvu de moyens d'enregistrement ou de moyens de traçage de la variation de fluorescence au cours du temps. Les données recueillies par le fluorimètre permettent d'établir la courbe de variation de la fluorescence au cours du temps, appelée thrombinogramme. Quatre paramètres dérivés peuvent être mesurés à partir d'un thrombinogramme : - la hauteur de pic, exprimée en nM de thrombine, correspond à la concentration maximale de thrombine générée à un instant tmax au cours de la réaction ; - le temps de latence, exprimé en minutes, correspond au temps qui s'écoule entre le début du Test de Génération de la thrombine (t0) et l'apparition de la thrombine ; - le temps au pic, exprimé en minutes, correspond au temps qui s'écoule entre le début du TGT (t0) et le 20 temps t max correspondant au maximum de thrombine générée ; - la vélocité, exprimée en nM de thrombine formée/min, correspond à la hauteur de pic divisée par la différence entre le temps au pic tmax et le temps de latence. Avantageusement, ces paramètres sont directement fournis par le dispositif utilisé pour mesurer la formation de la thrombine. Plus le taux de FVIIa dans l'échantillon d'intérêt est important, plus la thrombine est générée rapidement, plus le temps au pic est faible et plus la vélocité est élevée. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 25 30 5 15 20 25 30 - 20 - Afin de déterminer le taux de l'échantillon-test en FVII activé, des thrombinogrammes standards sont obtenus à partir d'échantillons-standards contenant un taux connu de FVII activé. Comme décrit ci-dessus pour l'échantillon-test, au moins deux échantillons-standards contenant des taux différents de FVII activé sont mélangés à un plasma dépourvu en FVII et en au moins un facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Des composants initiateurs de la réaction de génération de la thrombine sont ensuite ajoutés au mélange échantillon-standard + plasma pour débuter le Test de Génération de la Thrombine et pour obtenir les thrombinogrammes standards correspondant à chaque échantillon-standard. La concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon-standard + plasma est comprise entre 10 pM et 80 pM. De préférence, la concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon-standard + plasma est sensiblement identique à la concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon-test + plasma. Avantageusement, le plasma mélangé aux échantillons-standards est identique à celui qui a été mélangé à l'échantilon-test. A partir des thrombinogrammes standards obtenus, une interpolation est réalisée entre le taux de FVII activé contenu dans chaque échantillon-standard et l'un des paramètres dérivé d'un thrombinogramme. L'interpolation réalisée peut être de type linéaire, géométrique, cubique, polynomiale, lagrangienne ou newtonienne. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 - 21 - Avantageusement, l'interpolation réalisée correspond à la variation du temps de latence en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards, à la variation du temps au pic en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards ou à la variation de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards. Le taux de FVII activé contenu dans l'échantillon-test est déterminé en reportant au moins l'un des paramètres dérivés du thrombinogramme de cet échantillon-test sur une interpolation correspondante réalisée à partir des thrombinogrammes standards. Si le paramètre reporté est le temps de latence, l'interpolation utilisée correspondra à la variation du temps de latence en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards. Si le paramètre reporté est le temps au pic, l'interpolation utilisée correspondra à la variation du temps au pic en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards. Enfin, si le paramètre reporté est la vélocité, l'interpolation utilisée correspondra à la variation de la vélocité en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards. Le taux de facteur VII déterminé à partir de l'interpolation correspond donc au taux de facteur VII activé de l'échantillon-test. Le procédé de l'invention peut comprendre une étape additionnelle consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans l'échantillon-test à partir du taux de facteur VII activé déterminé à partir de l'interpolation. Dans ce cas particulier, la R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 2933496 - 22 - concentration de facteur VII activé répond à la formule suivante : Concentration de FVIIa = Taux de FVIIa x Concentration en FVII+FVIIa Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée. FIGURES : Figure 1 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange échantillonstandard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, et pour des taux de FVII activé allant de 0 à 100% (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides) Figures 2 et 2bis : Variations du temps de latence et du temps au pic, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides). Figure 3 . Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange échantillonstandard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FIX (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides). Figures 4, 5, et 6 : Variations du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FIX, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 15 20 25 30 - 23 - 50 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 pM Phospholipides). Figure 7 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange échantillonstandard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FXI (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 pM Phospholipides). Figures 8, 9, 10 et 11 : Variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVIII et en FXI, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides). Figure 12 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 10 pM dans le mélange échantillonstandard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 pM Phospholipides). Figures 13, 14, 15 et 16 : Variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 10 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 pM Phospholipides). Figure 17 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 80 pM dans le mélange échantillonstandard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides). R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 2933496 - 24 - Figures 18, et 19 : Variations du temps de latence et du temps au pic, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 80 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 �M Phospholipides). EXEMPLES Exemple 1 : Préparation d'un plasma dépourvu en FVII Des anticorps polyclonaux fabriqués dans le lapin dirigés contre le FVII plasmatique humain purifié ont été couplés à de la Sépharose activée au CNBr (Pharmacia), puis 2 mL du gel obtenu ont été placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4) . Ensuite, 6 mL de plasma humain ont été passés plusieurs fois sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII est resté fixé sur la colonne et l'éluat a été récupéré (plasma dépourvu en FVII). La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M pH 7,4). Exemple 2: Préparation d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, en FIX ou en FXI Des anticorps polyclonaux fabriqués dans le lapin dirigés contre le FVII plasmatique humain purifié ont été couplés à de la Sépharose activée au CNBr (Pharmacia) puis 2 mL du gel obtenu ont été placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH R:13revets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 15 20 25 30 2933496 - 25 - 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma commercial déjà déplété en FVIII, en FIX ou en FXI, chacun provenant de la Société Diagnostica Stago, ont été passés plusieurs fois sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII est resté fixé sur la colonne et l'éluat a été récupéré (plasma doublement dépourvu en FVII et en FVIII, en FIX ou en FXI). La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M pH 7,4). Exemple 3 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM On prélève le volume adéquat d'un échantillon de standard international de FVII (SI-FVII) fourni par le NIBSC et/ou de standard international de FVIIa (SIFVIIa) fourni également par le NIBSC afin d'obtenir un échantillon standard contenant un taux de FVII activé connu, que l'on ajoute à 80 ,.L de plasma dépourvu en FVII et en FVIII, (plasma dépourvu en FVIII provenant de la Société Diagnostica Stago ou étant un plasma d'hémophiles de type A, qui a été ensuite déplété en FVII comme dans l'Exemple 2), afin d'obtenir un mélange qui contient un taux de FVII activé fixé connu compris entre 0% et 100% pour une concentration de FVII+FVIIa comprise entre 10 pM et 80 pM. 20 �L de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) sont ajoutés au mélange comprenant le plasma et l'échantillon, à des concentrations finales de 5 pM en FT, 1 �M en phospholipides, (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4) et 16,7 mM en Cal+, et de 20 �L d'agent R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 10 20 25 30 -26- fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197). Les courbes de TGT standards (thrombinogrammes standards) ont été établies pour des taux fixes et connus de FVII activé compris entre 0% et 100%, de manière à obtenir des thrombinogrammes standards fournissant les divers paramètres (temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité). Les thrombinogrammes sont établis à l'aide d'un dispositif fluorimétrique de mesure du temps de formation de la thrombine (Fluoroskan - Thermo Electron) muni d'un logiciel pour établir les thrombinogrammes (Société Thrombinoscope BV), pour une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm. La figure 1 représente les thrombinogrammes standards obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa final dans le mélange plasma/échantillon et pour des taux de FVII activé variables allant de 0 à 100%. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 14 minutes pour un taux de facteur activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine. Les figures 2 et 2bis représentent respectivement les variations du temps de latence et du temps au pic, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans l'échantillon et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange plasma/échantillon. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 30 2933496 - 27 - Exemple 4 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FIX, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu en FIX, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été déplété de FVII selon la procédure des Exemples 1 et 2. La figure 3 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FIX. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 16 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FIX sans l'ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine. Les figures 4, 5, et 6 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu de FVII et de FIX. Exemple 5 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FXI, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 15 20 25 30 2933496 - 28 - L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu en FXI, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été déplété en FVII selon la procédure des Exemples 1 et 2. La figure 7 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FXI. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 12 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FXI sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine. Les figures 8, 9, 10 et 11 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FXI. Exemple 6 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 10 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant une concentration finale FVII+FVIIa de 10 pM. La figure 12 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 10 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII R:\Brevets\28000\28002 LFB'28002FR-080701 -Dde ty déposée .doc 5 10 20 25 30 2933496 - 29 - et en FVIII. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 21 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine. Les figures 13, 14, 15 et 16 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 10 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FVIII. Exemple 7 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 80 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant une concentration finale FVII+FVIIa de 80 pM. La figure 17 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 80 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FVIII. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 12 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 10 15 25 30 2933496 - 30 - et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine. Les figures 18, et 19 représentent respectivement les variations du temps de latence et du temps au pic en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 80 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FVIII. Exemple 8 : Mesure du taux de FVII activé d'un échantillon de lait de lapine contenant du FVII L'échantillon à tester présente un taux inconnu de FVII activé et sa concentration en FVII+FVIIA est de 500 pM. Un volume de 8 pL de cet échantillon à tester a été mélangé à 72 �L de plasma dépourvu en FVII et en FVIII tel que décrit précédemment. On obtient ainsi un mélange réactionnel à tester dont le volume est de 80 �L et dont la concentration en FVII+FVIIA est de 50 pM. Ensuite, on y a ajouté 20 il des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 1 �M en phospholipides, (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4), et 20 �l d'un agent fluorogénique calcique spécifique de la thrombine (concentration finale de 16,7 mM en Cal+) (réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197) Un TGT a été réalisé pour obtenir un thrombinogramme et les différents paramètres correspondants : temps de latence et temps au pic. R:'Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 5 10 15 20 30 - 31 - Parallèlement, des échantillons de FVII et de FVIIa (standards internationaux de FVII et de FVIIa fournis par le NIBSC ont été mélangés afin d'obtenir des échantillons standards dont le taux de FVII activé est connu et compris entre 0% et 100%. Ces échantillons standards ont été mélangés avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII tel que décrit précédemment afin d'obtenir une concentration en FVII+FVIIa de 50 pM. Puis, des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Phospholipides et FT) ont été ajoutés au mélange échantillon/plasma pour parvenir à des concentrations finales de 5 pM en FT et de 1 �M en phospholipides (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4). Enfin, 20 �l d'un agent fluorogénique calcique spécifique de la thrombine (concentration finale de 16,7 mM en Cal+)(réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197) ont été ajoutés au mélange précédent. Les paramètres de thrombinogrammes standards ont été mesurés de manière à tracer des courbes étalon pour chacun des paramètres en fonction du -log du taux de FVII activé(voir figures 2 et 2bis et tableau 1). Les valeurs des paramètres obtenus à partir du thrombinogramme du mélange contenant l'échantillon à testeront été reportées sur les différentes courbes étalon standard, ce qui permet de déduire une mesure du taux de FVII activé dans l'échantillon à tester. On obtient un temps de latence de 6 minutes et 30 secondes et un temps au pic de 18 minutes, en reportant ces valeurs sur les différentes courbes étalon, on en déduit une mesure du taux de FVII activé dans l'échantillon à tester égale à 20%. Exemple 9 : influence du lait de lapine sur le test de génération de thrombine R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc 10 15 20 25 -32- L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en prédiluant l'échantillon standard contenant un taux connu de FVII activé dans du tampon Owren-Koller contenant 1% de sérum albumine humaine (Tp OK - 1% SAH) ou dans du Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine. La figure 20 représente les thrombinogrammes standards obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa final dans le mélange plasma/échantillon et pour des taux de FVII activé de 0% et de 100%. Il est observé une parfaite superposition des thrombinogrammes de l'échantillon prédilué dans du Tp OK - 1% SAH et de l'échantillon prédilué dans du Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine ce qui permet de déduire que le lait de lapine n'a pas d'influence sur le TGT. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa ne génère pas de formation de thrombine. Les figures 21, 22 et 23 représentent respectivement les thrombinogrammes, les variations du temps de latence et du temps au pic, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon prédilué en Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine pour des taux de FVII activé fixés connus compris entre 0% et 100%. Les résultats obtenus montrent, comme dans l'exemple 3, qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans l'échantillon contenant du lait de lapine et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes pour une concentration en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange plasma/échantillon. Taux d'activation 0 % 5 % 10 % 20 % 40 % 60 % 80 % 100 % du FVII Temps de latence 11, 8 83 7,50 6,50 5,33 4,83 4,50 4,17 (min) 50 Temps au pic 23, (min) 50 21,00 19,67 18,00 16,67 16,00 15,50 14,33 Tableau 1 : 50 pM FVII+FVIIa final dans un plasma dépourvu en FVII et FVIII (5 pM FT - 1 �M PL) R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc Revendications1. Procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test, comprenant les étapes consistant à . a) mélanger ledit échantillon-test avec un plasma dépourvu en facteur VII (FVII) et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI), le mélange échantillon-test + plasma ayant une concentration finale en FVII+FVIIa allant de 10 pM à 80 pM ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ; c) obtenir un thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine (TGT) sur le mélange de l'étape b) d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme de l'étape c) à un paramètre 20 homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'échantillons-standards dont le taux de Facteur VII activé est connu et varie entre chaque échantillon-standard ; 25 e) déduire de l'étape d) une mesure du taux de Facteur VII activé dans l'échantillon-test. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel chacun desdits thrombinogrammes standards est obtenu en 30 effectuant un test de génération de thrombine sur un mélange contenant (i) un échantillon-standard dont le taux de facteur VII activé est connu, (ii) un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI, la R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -llde tq déposée .doc 15concentration finale du mélange échantillon-standard + plasma en FVII+FVIIa étant sensiblement identique à celle du mélange échantillon-test + plasma, et (iii) des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel, à l'étape d), ledit paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence, le temps au pic et la vélocité. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit plasma est dépourvu en FVII et en FIX, ou dépourvu en FVII et en FXI. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel, à l'étape d), ledit paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence et le temps au pic. 20 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit plasma est dépourvu en FVII et en FVIII. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans 25 lequel les mélanges échantillon-test + plasma et échantillon-standard + plasma sont réalisés en utilisant un même plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits composants initiateurs de la génération de thrombine comprennent un Facteur tissulaire (FT), des phospholipides, et du Cal+, la concentration finale R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080828 - Revs Modifs pr Rep Notif Irreg_.doc 30 5 10 15 25 30 2933496 - 35 - en ledit facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 1 à 10 pM, la concentration finale en lesdits phospholipides dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 0,1 à 5 �M et la concentration finale en Cal+ dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 14 à 18 mM. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel l'échantillon-test est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un milieu de culture cellulaire sans sérum. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le facteur FVII activé dont le taux est mesuré est d'origine plasmatique (pFVIIa), d'origine recombinante (rFVIIa) ou d'origine transgénique (TgFVIIa). 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant en outre l'étape f) consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans ledit échantillon-test à partir du taux déterminé à l'étape e). 12. Utilisation d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon-test. R:\Brevets\28000\28002 LFB\28002FR-080701 -Dde tq déposée .doc