Brevet FR2924497A1 — publié le 20090605

Description La mesure des paramètres électriques de l'épithélium au cours des différentes études électro- physiologiques permet non seulement. d'étudier le comportement de la membrane visa-vis des différents effecteurs biologiques, mais aussi de vérifier sa viabilité fonctionnelle. Parmi les pa-5 rainètres électriques les plus utilisés, la conductance est la plus importante à cause de sa signi- fication physiologique. Mais ce paramètre n'est pas accessible directement. Le but de cette étude a été de mettre au point un nouveau système de chambres de perméation d'Ussing avec un multimètre automatique numérique pouvant mesurer directement 10 la conductance de. l'épithélium intestinal et de démontrer que les électrodes de travail en platine pouvaient être remplacées par des électrodes en acier inoxydable 316L. L'étude de l'écoulement de la solution et la circulation du courant électrique dans les chambres de perméation a été effectuée à l'aide d'un logiciel de simulation Cornsol Multiphysic. 15 L'étude de l'interface électrode - électrolyte (inox-Ringer) a été effectuée par impédancemétrie avec un balayage en fréquence de 1Hz-20kHz. La détermination des paramètres électriques du modèle de Warburg a été réalisée à. partir du diagramme de Nyquist. La validation du modèle électrique de la nouvelle chambre d'Ussing ainsi obtenue a été réalisée sur intestin de rats et souris. 20 Les résultats obtenus sont : 1) l'utilisation du logiciel pour la simulation de la circulation de la solution et du courant. électrique ont permis de définir une chambre de perméation plus fonctionnelle. 2)l'impédancemètrie sur les électrodes en acier inoxydable donne les paramètres de Warburg suivants : cri = 2500 ;02 = 3000 ;a• = -0.5 ; 3 = -0.8 ce qui a permis de définir une 25 fonction de transfert à partir de laquelle le principe de mesure du multimètre numérique a été construit. 3) Le multimètre numérique réalisé permet d'obtenir simultanément la différence de potentiel, le courant de court-circuit et la conductance. Ces résultats confirment l'importance du modèle de Warburg pour la détermination des 30 paramètres électriques de l'interface électrode-électrolyte, et montrent que l'automatisation de la mesure de la conductance de l'épithélium peut être réalisée à partir d'un correcteur numérique. Les résultats suggèrent que l'utilisation complémentaire de signaux alternatifs et 2 2924497 continus avec un principe de mesure bien choisi permet de s'affranchir de difficultés de mesure des paramètres électriques de l'épithélium. 2924497 J Mesure de la Conductance Electrique de l'Epithélium avec compensation de la résistance de la solution physiologique à l'aide d'un multimètre Numérique automatique 1 Introduction La conductance transépithéliale est un paramètre très important pour déterminer la viabilité fonctionnelle d'un tissu biologique. La conductance ne permet pas d'évaluer à elle seule les effets des effecteurs sur la membrane biologique et par conséquent d'interpréter les mécanismes de transport d'un xénobiotique. Il est de coutume de mesurer le courant de court-circuit (Is,) l0 et la conductance (G). Le courant de court-circuit caractérise en effet le flux net des ions transportés à travers la membrane. Le matériel utilisé pour ce type de mesure se compose en général de chambres de pernréation et d'un clamp en tension ou courant. Les chambres sont ainsi pourvus de deux électrodes de travail, pour imposer un courant 15 électrique ou une tension au tissu et de deux électrodes de rnesure, pour l'obtention de la différence de potentiel nrembranairc. Ce travail a pour but d'étudier non seulement une nouvelle chambre de perméation pour faciliter le renouvellement de l'électrolyte non émulsionné au niveau de la membrane, mais aussi de tester un nouveau type d'électrode de travail et enfin proposer une nouvelle méthode de mesure pour déterminer automatiquement des paramètres 20 biologiques qui sont : la tension basale (/Fi), le courant de court-circuit (Is,) et la conductance membranaire (G). 2 Théorie Dans les chambres de pernréation d`Ussing. l'oxygénation de la solution physiologique (bullage) et surtout l'intéraction oxygène eau peut être considérée en configuration dispersée. Le bullage qui permet la circulation de la solution physiologique à l'intérieur de la chambre de perméation ne permet pas d'atteindre une vitesse de circulation très élevée ( 10 plus la température du liquide physilogique est constante à 37°c et circule dans un circuit fermé. L'écoulement peut être supposé dans ce cas comme étant dans un régime isotherme. En considérant ces observations nous avons décidé de trouver une forme de chambre qui permet d'obtenir un flux laminaire au niveau de la membrane biologique afin d'éviter que l'électrolyte ne stagne à ce niveau formant aussi une barrière qui empêche les solutés du liquide 15 physiologique d'atteindre la membrane biologique. Les études ont montré que la couche non émulsionnée du liquide physiologique qui est en contact avec le tissu biologique (" unstirred layer") peut faire varier la conductance meinbranaire )253 Nous avons également étudié la répartion du champ électrique dans la chambre en fonction des différentes électrodes et de leur emplacement dans les chambres de perméation en vu d'homogénéiser la densité de courant sur 20 la surface membranaire. Les mesures électriques dans la chambre de perméation sont réalisées par l'intermédiaire de quatre électrodes : deux électrodes de travail en acier inoxydable 316L et deux électrode au Calomel. Les électrodes de travail sont directement en contact avec le Ringer et forment ainsi 25 une interface électrode-électrolyte. L'objectif principal dans l'utilisation de ces électrodes est la simplification des montages du système. Les électrodes en acier inoxydable ne nécessitent aucune préparation spéciale avant. leur utilisation. De plus plusieurs études ont montré que le comportement électrique de l'acier inoxydable dans un électrolyte était similaire à celui du platine pour des faibles valeurs de densité de courant électriquei 1 0, Ces électrodes en acier inoxydable peuvent donc être considérées comme inattaquable dans une certaine plage de densité de courant et sont donc non toxiques pour les tissus, d'où leur utilisation en électrophysiologie. L'impédance électrode-électrolyte créée par l'utilisation de l'acier inoxidablc comme électrode de travail doit être prise en compte dans le système de mesure. Cette impédance se positionne en série avec l'impédance membranaire à mesurer. Un modèle très utilisé pour cette interface est celui de Warburg. Il est composé d'une capacité en série avec une résistance qui varient toutes les deux inversement proportionnellement à une puissance non entière de la fréquence C3 j1,, 0M) '8, zO Ztv=Ru+ =Qlw ùju2w jCww Avec: -1 La fonction de transfert du système n'est en fait qu'une approximation. nous avons en effet supposé l'impédance de l'interface électrode-électrolyte constante. En toute rigueur ces paramètres varient en fonction de la fréquence comme nous l'avons démontré précédemment (impédance de Warburg) ce qui reviendrait à corriger une fonction de transfert à dérivées non entières, l'identification du système serait alors plus compliquée. Pour simplifier nous avons volontairement considéré le système comme un système du premier ordre facilement identifiable et corrigeable. Nous nous imposons d'avoir une erreur statique nulle donc nous avons ajouté une intégration à la fonction de transfert en boucle ouverte. Le correcteur choisi a pour fonction de transfert : 1 + Tlp (6) C(p) = K~ x p2(1 + T2P) soit après décomposition en élérrient simple : (7) C(p) -Ii x(Tr-T2+ 1 +T22-T,T) - p p2 1 + Tep Cette équation est ensuite transformée sous forme de loi de commande facilement implémen- table dans un microcontrôleur à partir de la transformée en z. Puis en ajustant Tr, T2 et Kc 20 en fonction de T et K, la fonction de transfert en boucle fermée (FTBF) peut approcher celle d'un second ordre ou d'un premier ordre. r C C(z) = (1 - z- )transi[--L-1 102 z + P 1 + (Tr - T2)z + (T22 - T1T2 1. I e e.-Tz x Kc - ~2 (z- 1)2 - 1 ) La modélisation sous Matlab/Simulink du système (FIG. 2 et FIG. 3) corrigé montre une erreur statique nulle comme prévu, le temps de réponse et le dépassement dépendent, du choix 25 de TI, T2 et Kc, et par conséquent cle l'identification du système. 2924497 3 Matériels et méthodes Simulation mécanique Nous avons utilisé le logiciel Comsol Multipysic en mode conductive média DC application" et "Navier-Stockes application", pour simuler la chambre et observer le flux de l'électrolyte et la densité de courant électrique à l'intérieur de la chambre (FIG. 6 5 et FIG. 7). Les électrodes de travail sont simulées par un arc de cercle repésentant leur partie immergée dans l'électrolyte. Un courant. entrant de densité 1JLA/c7n2 est imposé à une électrode et un potentiel nul à l'autre. 10 Une chambre de perméation a été spécialement fabriquée en fonction des résultats des simulations. La chambre est usinée dans du Plexiglas (PMMA). Les deux électrodes de travail sont choisies en inox 316L et sont filetées pour être fixées dans la chambre par serrage, l'étanchéité est obtenue par des joints. Le chauffage est assuré par le système chauffant de la société TBC France, composé d'un 15 support chauffant et d'un régulateur de température. La draine de mesure électronique est coust.itée (FIG. 5) : -- d'un amplificateur d'instrumentation avec un gain de 10 qui réalise une différence entre les tensions des deux électrode de Calomel. d'un amplificateur à transimpédance avec un gain de 10000 pour convertir le courant électrique en une tension proportionnelle. d'un convertisseur analogique numérique 12 bits pour la mesure du courant électrique et un pour celle de la tension. d'un microcontrôleur qui réalise le calcul des lois de commande et le transfert des données 25 à l'ordinateur par RS232. d'un convertisseur numérique analogique 12 bits. d'un amplificateur d'entrée d'un générateur sinuoîdal type DDS û de plusieurs switchs et multiplexeurs pour sélectionner la configuration du système 30 Le système réalisé permet de générer des signaux d'exitation sinusoidaux et continus, corrigés ou non en fonction des mesures acquises. Le calcul de la résistance membranaire se fait en mesurant successivement la différence de potentiel basale Vb et le courant de court-circuit Ise toutes les 10s. Le but principal de l'électronique est d'asservir la tension membranaire à mm valeur voulue. Le système seul ne permettant pas d'avoir une erreur statique satisfaisante il faut corrigée la fonction de transfert de manière à obtenir une réponse statique proche de la consigne, un temps de réponse suffisamment rapide et un dépassement. limité. L'erreur statique détermine en fait la. tension à laquelle Vau, va être clampée après un temps donné (temps de réponse). Le dépassement ne doit pas être trop important pour éviter d'engendrer des densités de courants électriques trop importantes (> 100p 4/cm2) ce qui risquerait d'endommager la membrane biologique. Chaque membrane ayant une impédance différente, l'identification du système doit être réalisée à chaque expérimentation. La méthode utilisée est celle de la réponse indicielle. Il faut avant de réaliser cette mesure équilibrer les électrodes au Calomel c'est.: dire annuler la différence de potentiel entre les deux électrodes à vide. Ensuite il faut mesurer et annuler la résistance des l'électrolytes. Pour cela nous avons imposé une tension alternative d'amplitude crête à crête de 40mV. Nous avons testé cette mesure dans une plage de fréquence de 1Hz ù 20KHz. La résistance de l'électrolyte doit également être compensée à vide sans tissu en retranchant une tension proportionnelle au courant, électrique dans la chambre de perméation. La réponse indicielle du système (FIG. 4) est obtenue en mesurant la tension aux bornes des électrodes de Calomel dans la chambre avec tissu lorsque l'on impose un échelon de tension 25 de faible amplitude (6Orn.V) aux bornes des électrodes de travail en acier inoxydable. La tension obtenue est ensuite analysée pour déterminer la fonction de transfert du système indispensable à la conception du correcteur. Le calcul de Ise est fait en résolvant l'équation (2). V6ät correspond à la valeur de la différence 30 de potentiel corrigée entre les électrodes au Calomel pendant le régime statique.. la mesure prend ainsi en compte le cas ou l'erreur statique n'est pas nulle. La résistance de la solution physiologique (Re) est déterminé par impédancemétrie initialement et est supposé constant A0 pendant toute la durée de la manipulation. Le courant électrique dans la chambre(l) est mesuré lui aussi pendant le régime statique. Vb est mesuré avant chaque mesure de. Isc. Finalement on obtient Isc en passant par le calcul intermédiaire de l'impédance uiembranaire Z(,.Ij. Ise = (V,,fùTe,xIù4n) (8) La mesure de Vb se fait directement aux bornes des électrodes aux Calomel équilibrées, cette mesure est échantillonnée à une fréquence de 2500Hz sur 1024 points successifs 400m.$). Une moyenne est réalisée sur ces échantillons pour réduire le bruit. Une fois la différence de potentiel connue, une mesure de Isc est réalisée en asservissant la tension basale à une tension de 0V. Les mesures du courant de court-circuit sont réalisées sur 2048 points consécutifs correspondant à un temps de mesure d'environ 524m.s, le temps entre deux acquisitions étant égal à 256,us (524ms = 256�s x 2048) soit une fréquence d'échantillonnage de 3900Hz. Pour limiter l'influence du bruit de mesure; las mesures de la différence de potentiel corrigée et de Isc sont faites à partir dune moyenne sur les 1024 derniers points de la phase d'acqu:.sition, le régime transistoire est ainsi largement dépassé ( Le tissu est monté sur un filtre dont la résistance est négligeable. Un adap..ateur est utilisé pour réduire le diamètre du tissu utilisé, la surface étudiée est réduite à 0.2cm2. L'électrolyte utilisé est du Rincez, il est. thermostaté à une température de 37°c. Après montage sur la 30 chambre de perméation, le tissu est laissé au repos pendant 30 minutes. .1. Préparation de tissus : Les essais de la nouvelle chambre sont réalisé sur du jéjunum de souris. La nourriture des souris a été retirée 12 h avant les expériences; mais les animaux avaient l'accès libre à eau potable. Pour les études de l'électrophysiologie, les animaux ont été tués par la dislocation cervicale après anesthésie et. les segments d'Intestin d'animaux à jeun ont été enlevés et rincés de contenu intestinal avec solution de Ringer frais. Les estomacs de tous les animaux a été trouvé vides. Les morceaux de tissus ont été ensuite ouverts le long de la bordure mésentérique et sont montés bien aplatis entre les deux demi-chambres de percnéat.ion d'Ussing acryliques conçue d'après les résultats précédents. Etudes du courant de Court-circuit en chambres d'Ussing : La so. utioii du Ringer 10 isotonique utilisée dans les expériences est composée de (en in1\I) 115 NaCl, 25 NaHCO3, 1.2 MgC12, 1. 2 CaC12, 2.4 K2HPO4 et 0.4 KH2PO4. Le pH était 7.40 à 37°C. Une préparation intestinale est montée entre deux demi chambres en plexiglas déterminant un compartiment muqueux et un compartiment séreux. Ces demi chambres, dont l'ouverture est appliquée contre la surface exposée du tissu intestinal, sont perforées en compartiments contenant le liquide de 15 Ringer. Le pH du liquide de Ringer et sa saturation on oxygène sont maintenus constamment par un bullage permanent de carbogène. mélange gazeux composé d'oxygène et de dioxyde de carbone dans les proportions 95% de CO2 et 5% de CO2. Le bullage assure également le brassage permanent du milieu d'incubation dans les deux compartiments. Le potentiel électrique transépithélial reflétant l'asymétrie de charges électriques entre le 20 coté muqueux et séreux de la membrane, a été mesuré par les électrodes de calomel reliés par des ponts d'agaroses plongés dans une solution de KC1 de 3M dans 4% (w/v). Ces ponts ont été placés sur les deux côtés du tissu et sont adapté à chaque demi chambre. Le tout est relié à un amplificateur à haute impédance. Les paramètres électriques de l'épithélium ont été mesurés à partir des clamps de la société World Precision Instrument (WPI) modèle DVC1000 et à 25 partir du matériel spécialement conçu et défini précédement. Les résultats enregistré de façon continue sur un ordinateur à l'aide du logiciel Dagsoft (TBC France) et du logiciel Matlab . Différents produits dont l'effets électrophysiologiques sur le tissu intestinal sont parfaite-ment connus ont été testés avec le clamp numérique : le glucose et le carbachol (FIG. 9) et le glucose et la phloridzine (FIG. 10). 30 Résultats FIG. 1 : La figure 1 montre le modèle de la. chambre de perméation utilisé. L'interface électrode-électrolyte est représenté par le modèle de Warburg (Ru, + .W). L'épithélium est schématisé par une impédance Z(.(1/ ainsi que par une force éléctromotrice (FEM) matérialisant 5 l'existence de Isc. FIG. 2 : La figure. 2 montre le schéma électronique du clamp réalisé avec le logiciel Matlab/Simulink. 10 FIG. 3 : La. figure 3 montre le résulat d'une simulation du correcteur sous le logiciel Matlab/simulink. l'erreur statique est nulle et le temps de réponse est divisé par 4 par rapport au système non corrigé. FIG. 4 : La figure 4 montre une réponse indicielle obtenue sur avec la chambre de 15 perméation. Un échelon de tension d'une amplitude prédéterminée (63mV) est envoyé aux bornes des électrodes de travail en acier inoxydable. La différence de potentiel résultante aux bornes des électrodes de Calomel est ensuite mesurée, ensuite par la méthode graphique. Les constantes de temps et le gain du système sont ensuite identifiés. La constante de temps do-minante du système est celle de l'impédance de Warburg, le système peut donc être considéré 20 comme un premier ordre. FIG. 5 : La figure 5 montre la schéma d'une chambre d'Ussing et du clamp numérique fabriqué. 25 FIG. 6 : La figure 6 montre le résulat d'une siImlation de la circuilation du fluide dans la chambre de perméation avec le logiciel Comsol _Multiphysic. Les flèches sont proportionnelles à la vitesse de .l'électrolyte. L'écoulement est supposé laminaire dans des conditions isothermes et les différentes limites y compris celle de la membrane ont une condition de "non-glissement" imposée. Pour simuler l'arrivée de gaz, deux limites avec une condition de vitesse à l'entrée de 30 0.lcrn/s sont placées au niveau (lu petit capillaire incliné pour chaque demi chambre. FIG. 7 : La figure 7 montre le résultat d'une simulation de la densité de courant dans la "ta chambre de perméation avec le logiciel Comsol \lultiphvsic. Les flèches sont proportionnelles à la densité de courant, l'électrodes gauche (arc de cercle) impose un courant entrant. de densité 10E.r..4/cm2, l'électrode opposée (arc de cercle à droite) est fixée à la terre, toutes les autres limites de la figure sont imposés comme isolation électrique (PMM\IA). Le milieu interne est supposé isotrope. FIG. 8 : La figure 8 montre la comparaison entre le modèle de Warburg utilisé avec QI = 2500 ;a2 = 3000 ;a = -0.5 ;r3 = -0.8 et les valeurs expérimentales . Les mesures sont prises entre deux électrodes en inox316L d'une surface de 0.36cm.2 en contact avec une solution 10 de Ringer. Pour la première expérimentation (FIG. 9), du glucose 30niM est ajouté coté muqueux et séreux après 30 minutes de repos, les variations obtenues sur 1/ et Is, sont immédiates. Ise augmente de plus de 50itA en moins de deux minutes par rapport à sa valeur stabilisée au repos, 15 tandis que 14 augmente également de plus de 4rnV pour retrouver une valeur stable. L'ajout de Biodiabétine cotés muqueux et séreux en concentration 200yg/l induit une réduction de Is, et de 14 d'environ 20%. Avec l'ajout de Carbachol coté séreux en concentration 100,ug/l, 14 et I,,, augmente à nouveau instantanément, respectivement, de 2mV et 20u.A par rapport à la valeur stabilisée précédente, sous forme de pic qui atteint sa valeur maximale en moins de deux 20 minutes pour ensuite redescendre à. une valeur stable. Pour la deuxième expérimentation (FIG. 10) du glucose 30mM coté muqueux et séreux est ajouté après 30 minutes de repos et provoque là aussi une augmentation de 14 de 5m.V et de 60�A pour ISC. Après 10 minutes, de la phloridzine coté séreux en concentration 500pg/l 25 est ajoutée. U, diminue instatanément de 3rnV pour atteindre sa valeur de repos, I,.,. diminue similairement de 30 /1. Dans les deux cas la conductance membranaire rie varie que très peu puisque le courant de court-circuit et la ddp membranaire varient de façon similaire et quasi-ment simultanéIÜent, c'est un indicateur de l'intégrité nrcrnbranaire face au produit, utilisé. 30 Une troisième expérimentation (FIG. 11) a été réalisée pour comparer les résultats du clamp numérique avec un clamp classique WPI. Le clamp WPI est réglé pour mesurer le courant de court circuit en continu et ponctuellement (toutes les 30s) la ddp basalebasale. Les résultats montrent, que les variations du courant de court circuit mesurées par les deux c:ifférents clamps, dues aux les effets des solutés sur le tissu intestinal, sont. du même ordre. Par exemple sur l'une des chambre et son témoin l'ajout du glucose en concentration 30mAI provoque une varation maximale de I5, de 20pA/cnn2 mesuré avec le clamp WPI et de 35jr..1 /crrr2 paru celui mesuré avec le clamp numérique. L'augmentation de I,Se après l'ajout du Carbachol en concentration 100pg/1 est de 6011.A/cm.2 pour le courant, de court-circuit mesuré avec le clamp de \VPI et de 63p.4/crn2 pour celui mesuré avec le clamp numérique. 5 Discussion Simulation mécanique Le dessin de la chambre favorise une circulation laminaire et qua- siment parallèle à la surface (le la membrane pour renouveller au maximum l'électrolyte à ce niveau et ainsi éliminer des gradients de concentration perturbateurs. L'inclinaison de la conduite capillaire où le carbogène arrive permet au fluide de circuler le plus près possible de la membrane, tandis que son diamètre permet d'accélérer la vitesse du fluide à cette endroit par gui gradient de pression. La forme de la cavité permet également de renouveller l'électrolyte au niveau des électrodes pour éviter au maximum la formation de fines bulles et de dépots sur leur surface. D'autre part le billage étant simulé par une vitesse à l'entrée relativement petite ( Les flèches repésentant la densité de courant montrent une légère différence entre le bord de la membrane et son centre. C'est un compromis avec le renouvellement de l'électrolyte au niveau de l'électrode de travail. Cependant cette inhomogénéité bien que génante peut, être négligée si les deux électrodes de mesure se trouvent à égale hauteur par rapport à la membrane. Modélisation Les résultats montrent que le modèle de Warburg modifié par représente bien l'interface électrode-électrolyte (FIG. 8), les coefficients trouvés pour ce modèle sont (TI = 2500 ;cr2 = 3000;n, = -0.5 ; = -0.8. Dans les hautes fréquences l'impédance tend vers une valeur réelle qui correspond à la résistance du Ringer. Dans l'expérience nous trouvons environ 350Q. Ces résultats peuvent être vérifiés théoriquement en s'appuyant sur la résistivité du Ringer à 20°c donnée par[ et estimée à 80S2.cm. La formule utilisée pour obtenir la résistance à partir de la résistivité du milieu est. : p(e.crn) x longueur(cm) R(S't) sur f ace(cm2) Dans notre cas la distance séparant. les électrodes étant• de 3cm, la surface de travail de 0.75crn.2, la résistance théorique est de 320Q donc très proche de celle obtenue par nos mesures. Avec la diminution rie la fréquence l'impédance de Warburg devient dominante, une mesure classique du courant de court-circuit par la méthode du clarnpage correspond à cc cas de figure. Les résultats montrent que les mesures réalisées avec le clamp DVC1000 de WPI et le nouveau clamp basé sur le correcteur numérique sont similaires, les variations du courant de court-circuit sont du même ordre de grandeur. Ces résultats suggèrent donc que l'approximation du modèle des chambres de peruméation d'Ussing nouvellement conçues à un premier ordre à. coefficients constant est cohérent. Le procédé de mesure défini précédemment peut donc être utilisé pour la détermination automatique des trois paramètres électriques : différence de potentiel basale, courant de court-circuit et conductance du tissu biologique. Références [1] Antony M. Dymond. Caracteristics of the metal-tissue interface of stimulation electrodes. IEEE transactions on biornedical engineering, BAIE-23(4) :274-280, 1976. [2] Kenneth D. Fine, Carol A. Santa Ana, Jack L. Porter, and John S. Fordt.ran. Effect of changing intestinal flow rate on a rneasurement of intestinal permeability. Gastroenterology, 108 :983-989, 1995. [3] Hugo Fricke. the theory of electrolytic polariza.tion. Philo. 11lag., 14 :310-318. 1932. [4] L.A. Geddes. Historical evolution of circuit models for the electrode-eiecrrolyte interface. 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Revendications 1.Système de mesure des paramètres électriques de l'épithélium, notamment de la conductance transépithéliale, avec compensation de la résistance de la solution physiologique utilisant un correcteur numérique caractérisé par l'asservissement de la tension membranaire basale (équation 3) pour mesurer simultanément le courant de court-circuit et la conductance (équations 2 et 4).