Brevet FR2934490A1 — publié le 20100205

La présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique du lipochroman-6 pour améliorer l'éclat du teint de la peau, notamment du visage. Le lipochroman-6 est un composé de formule (I) : (I) Il est décrit dans l'art antérieur comme anti-oxydant, piégeur de 10 radicaux libres, en tant qu'inhibiteur de la peroxydation des lipides et protecteur des cellules contre les dommages induits par le peroxynitrite. Il est utilisé en tant qu'agent anti-âge dans des compositions cosmétiques. Les espèces réactives de l'oxygène (EI20) ont la capacité d'oxyder tous les composants cellulaires, glucides, ADN, lipides, protéines 15 (Davies et al, J Biol 'hem, 1987, 262(20): 9895-901; Hall/wel/ et al, Am J Clin Nutr, 1993, 57(5 Suppl): 7155-245; discussion 24S-25S; Stadtman, Methods Enzym% 1995, 258: 379-93), ce qui conduit à leur détérioration. En conséquence, les cellules ont développé des mécanismes de défenses anti-oxydantes spécifiques des différentes espèces oxydantes, du 20 lieu de production de ces espèces ainsi que de leurs cibles biologiques. On distingue d'une part la défense anti-oxydante non enzymatique, qui fait appel à des composés de petits poids moléculaires tels que la mélatonine, l'acide lipoïque, le coenzyme Q, la mélanine, les vitamines C et E, le glutathion (GSH), et d'autre part la 25 défense anti-oxydante enzymatique telle la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase, les peroxyredoxines, la sulfiredoxine et le système thioredoxine / thioredoxine réductase. Les protéines sont des cibles privilégiées des modifications oxydatives. Les protéines oxydées peuvent être soit dégradées soit 30 réparées. Un système majeur impliqué dans la dégradation des protéines oxydées est le protéasome (Davies, Biochimie; 2001, 83(3-4): 301-10). L'un des seuls systèmes de réparation des protéines oxydées est le système méthionine sulfoxyde réductase (Msr) qui permet d'inverser le processus d'oxydation en réduisant les méthionine sulfoxydes en méthionines. La méthionine, un acide aminé essentiel pour l'espèce humaine, constitue un excellent agent de détoxification des ERO, également appelées système � piégeur � ou � scavenger � en anglais, car elle réagit très rapidement avec une grande partie des espèces oxydantes de la cellule en conditions physiologiques (H2O2, OH*, peroxynitrite, chloramine, acide hypochloreux (Levine et al, Proc Nat/ Acad Sci USA 1996, 93(26): 15036-40 ; Ber/ett et al, J Biot Chem, 1997, 272(33): 20313-6.; Tien et a/, Proc Nat/ Acad Sci USA 1999, 96(14): 7809-14). La plupart des protéines contiennent dans leur séquence primaire au moins une méthionine, et bien souvent, l'oxydation de ces méthionines engendre une perte d'activité de la protéine. On cite comme exemple la protéine inhibitrice de l'activité élastase, au niveau cutané. En effet, l'oxydation de méthionines dans la séquence primaire d'acides aminés de cette protéine inhibitrice rend celle-ci inefficace pour protéger l'élastine. Les modifications oxydatives de la méthionine au sein des protéines peuvent être réparées réversiblement par l'action de MsrA et MsrB, enzymes qui font partie du système Msr (Méthionine Sulfoxyde Réductase). Les enzymes MsrA et MsrB (globalement nommées Msr) sont ubiquitaires dans tous les tissus de l'organisme. Leur rôle est d'inverser la réaction initiale d'oxydation de la méthionine en rnethionine sulfoxyde (Met-S(0)), pour former à nouveau la méthionine. Il s'agit là d'un des rares phénomènes d'oxydation réversible. Les structures tridimensionnelles de leurs sites actifs sont symétriques. Chacune des deux enzymes reconnaît spécifiquement un diastéréoisomère de la méthionine sulfoxyde (formes -S pour MsrA et -R pour MsrB). Leur rôle, bien que complémentaire, est donc très spécifique. Les protéines oxydées ont des propriétés optiques différentes des protéines non-oxydées. La technique de dichroïsme circulaire a montré que la lumière que renvoie une protéine oxydée est différente de celle que renvoie une protéine non-oxydée. (Friguet et al, Arch Biochem Biophys, 1994, 311:168-73). Etant plus hydrophobes, elles s'agrègent plus facilement et peuvent même se réticuler entre elles de manière anormale. Outre les protéines oxydées, des composés fluorescents comme la lipofuscine sont également susceptibles de s'accumuler dans les cellules 5 (Brink et al, Free Radic Bio/ Med, 2002, 33: 611-9). La lipofuscine, pigment fluorescent formé à partir de l'oxydation et de l'agrégation de protéines et de résidus lipidiques est maintenant considérée comme un marqueur du vieillissement cellulaire (Terman et a/, Int J Biochem Cal/ 8/o% 2004, 36: 1400-4). 10 De ce fait, l'accumulation de protéines oxydées et/ou de lipofuscine peut avoir un impact sur la peau, et en particulier sur le teint de la peau, en provoquant un dérèglement du cycle cellulaire au niveau cutané, aboutissant à une altération de sa coloration naturelle, déterminée génétiquement, et sur la perception visuelle qu'en a un observateur. On 15 parle alors de teint � terne �. Cette altération peut être liée au phénomène de vieillissement cutané, qu'il soit intrinsèque, c'est-à-dire déterminé génétiquement, ou extrinsèque, c'est-à-dire provoqué par des facteurs externes tels que les UV. Elle peut également avoir pour origine la maladie, le stress, la 20 consommation de tabac ou tout autre facteur susceptible d induire une oxydation des protéines au niveau cellulaire. Les inventeurs de la présente invention ont mis en évidence de façon surprenante, que le lipochroman-6 permet une diminution du taux de protéines oxydées dans des cellules cutanées traitées par cette 25 molécule, à la fois en stimulant l'expression des gènes codant pour les enzymes MsrA et MsrB, mais également en stimulant son activité de réparation réversible du dommage oxydant pour rendre aux protéines leur fonctionnalité. L'utilisation du lipochroman-6 dans des compositions 30 cosmétiques destinées à une application cutanée permet ainsi de limiter les dommages causés par l'accumulation de ces protéines oxydées affectant le bon fonctionnement de la cellule, contribuant ainsi à l'amélioration du teint. L'amélioration du fonctionnement des cellules de l'épiderme, qui résulte de l'utilisation du lipochroman-6, conduit à une régularisation du renouvellement cellulaire, ainsi que de la différentiation des kératinocytes migrant de la couche basale vers la couche cornée. Ce phénomène de régularisation du renouvellement cellulaire de la couche cornée permet de rendre la surface de cette couche cornée à la fois plus régulière et plus lisse. La lumière incidente est ainsi mieux réfléchie par la surface (formée par la couche cornée) de la peau, provoquant la perception visuelle par l'observateur, d'une plus grande luminosité, d'un teint de peau plus éclatant. Un premier objet de l'invention porte ainsi sur l'utilisation du lipochroman-6 en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique destinée à une application sur au moins une partie de la peau du visage, pour améliorer l'éclat du teint. Un autre objet de l'invention porte sur l'utilisation du lipochroman-6 en tant qu'agent actif dans une composition cosmétique destinée à une application sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, pour améliorer et/ou restaurer l'éclat du teint de la peau, notamment dans le cas où l'altération teint est lié au vieillissement cutané. Cette nouvelle utilisation vise notamment à améliorer et/ou restaurer l'éclat du teint de la peau du visage sur laquelle est appliquée ladite composition. Un autre objet de l'invention est de fournir une méthode de soin cosmétique destinée à améliorer et/ou restaurer l'éclat du teint de la 25 peau. Ainsi, selon une première caractéristique essentielle, la présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique du lipochroman-6 en tant qu'agent actif destiné à améliorer et/ou à restaurer l'éclat du teint de la peau, notamment de la peau du visage. 30 Selon une variante avantageuse de l'invention, cet agent actif est contenu dans ladite composition en quantité suffisante pour obtenir une diminution du taux de protéines oxydées dans les cellules de la peau après application de ladite composition sur la peau. Selon une autre variante avantageuse de l'invention, cet agent actif est utilisé en quantité suffisante pour stimuler l'expression des gènes codant l'enzyme Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) et/ou leur activité de réparation du dommage oxydant pour rendre aux protéines leurs fonctionnalités. Comme cela ressort des exemples qui suivent, l'agent actif agit à la fois sur msra et sur msrb et tout particulièrement sur msrb. Le lipochroman-6 est présent au sein de la composition cosmétique à une concentration comprise entre 0,001% et 5% en poids 10 de la composition et de préférence comprise entre 0,01% et 1% en poids. Selon une deuxième caractéristique essentielle, l'invention concerne une méthode de soin cosmétique de la peau, en particulier de la peau du visage, destinée à améliorer et/ou à restaurer l'éclat du teint. Cette méthode comprend l'application sur la partie de la peau concernée 15 d'une quantité efficace d'une composition cosmétique contenant du lipochroman-6 en tant qu'agent destiné à améliorer et/ou restaurer l'éclat du teint de la peau. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit, donnée en regard des 20 exemples et des figures auxquelles ces exemples font référence. Plus précisément les figures 1, 2 (2a à 2e et 3) illustrent respectivement: - figure 1, donnée en référence à l'exemple 2, l'action du Lipochroman-6 sur l'activité Msr, 25 - figure 2, donnée en référence à l'exemple 3, les différentes étapes (figure 2a, 2b, 2c, 2d, 2e) de l'analyse d'images permettant d'évaluer le taux de protéines oxydées et le nombre de cellules et - figure 3, donnée en référence à l'exemple 3, l'effet du Lipochroman 6 sur la teneur en protéines oxydées des cellules de 30 l'épiderme. On notera que l'exemple 1 met clairement en évidence l'effet du lipochroman-6 sur l'expression des gènes msra et msrb et que l'exemple 2 montre clairement l'effet de ce même lipochroman-6 sur l'activité de la méthionine sulfoxyde réductase. L'exemple 3, lui, met en évidence la diminution du taux d'oxydation des protéines en présence de lipochroman-6. Tous ces effets du lipochroman-6 sont confirmés par les remarquables propriétés d'amélioration du teins: obtenues avec les compositions exemplifiées dans les exemples 4 à 6. Ainsi, les nouvelles propriétés mises en évidence par les inventeurs de la présente invention ont pour conséquence la possibilité d'utilisation du lipochroman-6 dans toutes les applications où l'on cherche à améliorer l'éclat du teint de la peau, en particulier de la peau du visage. EXEMPLES EXEMPLE 1 : effet du lipochroman-6 sur l'expression des gènes codant les protéines MsrA et MsrB. On évalue l'effet du lipochroman-6 sur l'expression basale des gènes codant les protéines MsrA et MsrB, par la méthode de RT-PCR 20 quantitative (PCR en temps réel ; RT-Q-PCR). Le modèle choisi est celui des kératinocytes épidermiques humains normaux (KHN) cultivés in vitro. On réalise au préalable une cytotoxicité sur kératinocytes. Les résultats des tests de viabilité au MTr et l'observation des 25 tapis cellulaires conduisent à sélectionner les concentrations non-cytotoxiques, pour la suite des essais. MATERIELS ET METHODES 30 1. Modèle biologique - Type : kératinocytes épidermiques humains normaux (KHN) - Milieu de culture : milieu SFM (Invitrogen) - Facteur de croissance épidermique (EGF) 0.25 ng/ml et extrait pituitaire (EP) 25 pg/ml (EGF, EP, Invitrogen) - Gentamycine 25 pg/ml (Sigma) - Milieu d'essai : milieu SFM sans EGF et sans EP (SFM-EP- EGF) 2. Produits à l'essai Lipochroman-6 : solution-mère à 10 rng/ml dans l'éthanol, diluée en milieu d'essai à des concentrations de 0,01 mg/mi et 10 0,005 mg/ml. 3. Cytotoxicité préalable - plaques de 96 puits cellules/puits : 15000 KHN en milieu SFMùEPùEGF 15 - paramètre d'évaluation: hydrolyse MTT, observations morphologiques 4. Cultures et traitements Les kératinocytes sont ensemencés et pré-cultivés pendant 24 20 heures, en milieu de culture SFM complet (plaques 24 puits) puis placés en milieu SFMùEPùEGF. A confluence, les cellules sont traitées ou non (témoin) par le produit à l'essai et cultivées pendant 24 h à 37°C et 5 % de CO2. Chaque traitement est réalisé en triplicate. Les surnageants de culture sont ensuite 25 recueillis et les tapis cellulaires sont rincés avec une solution de PBS (Invitrogen), puis 300 pl de Tri-Reagent (Sigma) sont ajoutés. Les plaques sont ensuite congelées à -80°C. 5. RT-PCR quantitative (RT-Q-PCR) L'expression des gènes msra et msrb est évaluée par RT-Q-PCR à partir des ARN messagers (ARNm) extraits des tapis cellulaires de chaque traitement. Pour chaque traitement, les trois échantillons sont assemblés en un seul avant l'extraction de l'ARN. 5.1. Transcription inverse Les principales étapes du protocole sont les suivantes : - Extraction des ARN totaux à l'aide de Tri-Reagent selon le protocole du fournisseur. - Elimination des traces d'ADN potentiellement contaminant par 10 traitement avec le système DNA-free (Ambion). - Réalisation de la réaction de transcription inverse en présence de l'amorce oligo(dT) et de l'enzyme Superscript II (Gibco). Les réactions de PCR sont réalisées à l'aide des amorces Séquences des amorces TGGTTTTGCAGGAGGCTATAC (SEQ ID No : 1) GTAGATGGCCGAGCGGTACT (SEQ ID No : 2) GCGACAGTCCACTCTTCAGTT (SEQ ID No : 3) CCCAGGTCCATCAGGAAACA (SEQ ID No : 4) Le marqueur de référence pour l'étude est le gène suivant : Nom du gène GenBank n° Liver glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) X01677 5.2. PCR Quantitative Les réactions de PCR (réaction en chaîne par polymérase) sont 20 réalisées par PCR quantitative avec le système � Light Cycler � (Roche Molecular Systems Inc.) selon les procédures recommandées par le fournisseur. Ce système d'analyse nécessite, pour être performant, une mise au point préalable des conditions d'analyse des différentes amorces. Ce système est formé de deux composants principaux : un thermocycleur 25 optimisé permettant des transferts thermiques extrêmement rapides et un fluor/métre mesurant en continu l'intensité de fluorescence incorporée dans l'ADN (détection à 521 nm). Le mélange réactionnel (10 pl final) pour chaque échantillon est le suivant : suivantes : Nom du gène msra msrb 15 - 2,5 pl d'ADNc dilué au 1/10è'. - amorces des différents marqueurs utilisés - mélange réactionnel (Roche) contenant l'enzyme taq DNA polymérase, le marqueur SYBR Green I (fluorophore qui s intercale dans 5 l'ADN double brin, au cours de l'étape d'élongation) et du MgCl2. 5.3. Analyse des Q-PCR LIncorporation de fluorescence dans l'ADN amplifié est mesurée en continu au cours des cycles de PCR. Ce système permet d'obtenir des 10 courbes de mesure de la fluorescence en fonction des cycles de PCR et d'évaluer ainsi une valeur d'expression relative pour chaque marqueur. Le nombre de cycles est déterminé à partir des points de � sortie � des courbes de fluorescence. Pour un même marqueur analysé, plus un échantillon sort tard (nombre de cycles élevé), plus le nombre initial de 15 copies de l'ARNm est faible. La valeur de l'expression relative (RE) est exprimée en unités arbitraires (AU) selon la formule suivante : (1/2 nombre de cydes) x 106. RESULTATS : Effets du Iipochroman-6 sur l'expression 20 des gènes msra et msrb Les résultats sont présentés dans les tableaux 2 et 3 : msra/ G3PDH G3PDH Mb RE*G3PDH RE*Mb 9/0 Traitement Conc. Cycles Cycles (AU) (AU) Mb/G3PDH Témoin 19,03 26,88 Témoin - 18,66 26,83 2,327 8,18.10"3 3,58.10"3 100 18,50 26,92 0,01 18,93 26,83 mg/ml 18,99 26,79 1,961 8,66.103 4,42.10-3 124 Lipochroman-6 18,96 26,73 0,005 18,88 26,84 0,005 19.00 26.91 1,994 8,251.10-3 4,14.103 116 mg/mi 18.93 26.81 25 Tableau 2 : effets du traitement au lipochroman-6 sur l'expression relative du gène MsrA. Résultats rapportés à /'expression du marqueur de référence. RE*=Expression Relative exprimée en unités arbitraires (AU), n==3. msrb/ G3PDH Traitement Conc. G3PDH Mb RE*G3PDH RE*Mb Mb/G3PDH Témoin Cycles Cycles (AU) (AU) 19,03 24,98 Témoin - 18,66 24,99 2,327 3,165.10-2 1,38.10-2 100 18,50 24,78 0,01 18,93 24,62 mg/ml 18,99 24,60 1,961 4,018.10-2 2,05.10"2 148 Lipochroman-6 18,96 24,49 0,005 18,88 24,68 mg/ml 19,00 24,86 1,994 3,516.10-2 1,76.10-2 127 18,93 24,75 Tableau 3: effets du traitement au /ipochroman-6 sur /'expression relative du gène 5 MsrB. Résultats rapportés à l'expression du marqueur de référence. RE*=Expression Relative exprimée en unités arbitraires (AU), n =3. Conclusion : les résultats montrent que le lipochroman-6 présente une activité inductrice plus forte vis-à-vis de l'expression du gène 10 msrb par rapport à l'activité mesurée vis-à-vis de la msra. Ce résultat traduit une spécificité d'action dans la réduction de la forme -R de la méthionine sulfoxyde. EXEMPLE 2 : modulation de l'activité de la méthionine 15 sulfoxyde réductase (Msr) par le Iipochroman-6. MATERIEL ET METHODES 1. Milieux et réactifs 20 Culture des Kératinocytes K-SFM-Supp/émenté - Kératinocytes-SFM avec L-Glutamine (Gibco� Invitrogen) - Kératinocytes-SFM Supplément (Gibco� Invitrogen) - Tampon Phosphate (PBS) X10 pH 7,2 (Sigma-Aldrich) 25 - Penicilline-Streptomycine (Sigma-Aldrich) - Diméthyl Sulfoxide DMSO (Sigma-Aldrich) 10 - Sérum foetal de bovin (FBS) (Gibco� Invitrogen) - Solution de Trypsine 0,25%-EDTA (Sigma-Aldrich) - Réactifs Bio-Rad Protein Assay : (Biorad) - Bovine Serum Albumin (Sigma-Aldrich) - DTT Dithiothréitol (Amersham-Biosciences) - CelLyticN M (Sigma-Aldrich) - Acétate d'éthyle (VWR) - Sigma-Fluor High (Sigma-Aldrich) - Substrat N-acétyl-(3H)-méthionineR,S sulfoxyde (Amersham- Biosciences) 2. Culture cellulaire Les kératinocytes sont issus de plasties de peau provenant d'abdomens de donneurs sains âgés de 47 ans. Ils sont cultivés en milieu KSFM complet (KSFMc) à 37°C et 5% de CO2 puis congelés dans l'azote liquide. Déconqé/ation des cellules Avant de décongeler les cellules, la température du bain-marie est fixée à 37°C et le milieu de culture KSFM supplémenté (K-SFM-S) est préchauffé. Le cryotube est sorti de l'azote liquide et placé au bain-marie à 37°C jusqu'à décongélation, puis lavé à l'éthanol à 70% avant ouverture. Pour éliminer le DMSO, les cellules sont prélevées stérilement, placées dans 10 ml de milieu préchauffé, puis remises en suspension par retournements. On centrifuge à 200 g, 5 minutes, à 4°C, Le surnageant est aspiré, le culot cellulaire est repris par 2 ml de milieu de culture K-SFM-S et placé dans une flasque 175 et complété à 10 ml de milieu de culture. Les cellules sont placées dans un incubateur humide à 37°C, 30 sous atmosphère à 5% CO2. Le milieu de culture est changé le lendemain. Passage des cellules Les cellules arrivées à confluence sont décollées par action de la trypsine, comptées et réensemencées à 2,5x106 cellules par flasques de cultures T75. Traitement des cellules par la trypsine Le milieu est aspiré et éliminé. Les cellules sont lavées par 2 ml de tampon PBS, aspiré et éliminé. Le lavage est répété 2 fois. On additionne 1 ml de solution de trypsine 0,25%-EDTA préchauffée, diluée au 1/2 avec du tampon PBS. On place le flacon dans I incubateur à CO2 5% et 37°C pendant 1 à 2 minutes. On arrête l'action de la trypsine par ajout de 2ml de milieu K-SFM-S, 50% (FBS). Les cellules sont centrifugées à 200 g, 5 minutes, 4°C. Le surnageant est aspiré et le culot de cellules est repris par 4 mL de milieu de culture. Les cellules sont comptées au NucleoCounter, Chemometec (Bioblock) et ensemencées à 2,5x106 cellules par flasque 175, dans 10 ml de milieu de culture K-SFM-S. Les cellules sont maintenues en culture jusqu'au passage P3. Lors du passage P3, les cellules sont gardées une nuit en culture et utilisées le lendemain pour le traiternent par les actifs. 3. Traitements des cellules par le lipoc:hroman-6 Préparation des solutions de lipochroman-6 La poudre de lipochroman-6 (fournisseur Lipotec) est tout 25 d'abord diluée dans 20 �L d'éthanol absolu. On prépare ensuite une solution-mère à 10 mg/mL dans le milieu K-SFM-S. Préparation de la Gamme de dilution de lipochroman-6 On prépare une solution intermédiaire à 1 mg /mL (dilution 30 20�L dans 2001_11_ de milieu K-SFM-S) à partir de la solution-mère de lipochroman-6. Les dilutions sont réalisées dans le milieu K-SFM-S à partir de la solution intermédiaire à 1 mg/ml. La gamme de concentrations en lipochroman-6 est la suivante: n° solutions Concentration (mg/ml) 0 0 __ 1 0,0025 2 0,0050 _ 3 0,0075 4 0,0100 0,0125 _ 6 0,0150 5 Traitements des kératinocvtes parie lipochroman-6 Le milieu est aspiré des flasques de cellules (passage P3) et remplacé par du milieu contenant les différentes dilutions d'actifs. Après 24 heures de traitement, les cellules sont lavées au tampon PBS, puis traitées par la trypsine. Les cellules sont finalement comptées au NucleoCounter, Chemometec (Bioblock). On mène le traitement sur 3,2 à 3,7x107 cellules par flasque. 4. Dosage des protéines par la méthode de Bradford : 15 Préparation des extraits protéiques, lyse cellulaire Les cellules sont centrifugées à 900 g, 10 minutes à 4°C. Les culots de cellules sont repris par 1 ml de tampon PI3S, placés dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml, puis centrifugés à 450 g, 5 minutes à 4°C. Le 20 culot est repris par 150 �l de tampon CelLytic'TM-M. Les cellules sont ensuite incubées pendant 15 minutes dans un agitateur thermostaté à 5°C et centrifugées 15 minutes à 12000 g. Le surnageant protéique est transféré dans un nouveau tube Eppendorf et maintenu à 5°C. 25 Dosage des protéines Préparation de la gamme étalon Solution-mère d'albumine sérique bovine (BSA) à 1 mg/ml La gamme est préparée conformément au tableau ci-dessous : Qté BSA (pg/tube) BSA (pl) H20 (pl) 0 0 100 2 2 98 4 4 96 6 6 94 8 8 92 10 90 12 12 88 Préparation des échantillons Les extraits protéiques sont dilués au 1/1Oe et le dosage est 10 réalisé sur 10 pl complété à 100 �l d'eau. Dans chaque tube, on additionne 1 ml de réactif � Bio-rad protein assay � (Bio-rad) dilué extemporanément au 1/sème dans l'eau. Après homogénéisation et 5 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance des échantillons est mesurée au spectrophotomètre (Kontron Instrument) à une longueur d'onde de 595 nm. 5. Mesure de l'activité Msr Principe du dosage On mesure l'activité Msr à partir des extraits protéiques en utilisant le substrat N-acétyl (3H) -méthionine (R, S) sulfoxyde dans un mélange réactionnel de 30 pl contenant du Tris-HCI pH 7.5, 25 mM, MgCl2 10 mM, DTT 15 mM, à 37°C. On arrête la réaction par ajout de 500 gl d'HCI 1 N. Le produit de la réaction est extrait avec 1,2 ml d'acétate d'éthyle. Protocole La quantité nécessaire de protéines est prélevée et complétée avec de l'eau jusqu'à un volume réactionnel de 20,8�L dans un tube Eppendorf de 2 mL gardé dans la glace. On ajoute 0,75 �L de Tris-HCI, pH 7,5, à 25 mM + 3 �L de MgCl2 à 10 mM + 0,45 �L de DTT à 15 mM, puis 5 �L de substrat radioactif dilué au 1/100ème dans l'eau. Les tubes sont agités et incubés à 37°C pendant 30 minutes à 2 heures, en fonction des conditions de cinétiques enzymatiques. La réaction est arrêtée par 500 �L d'HCI 1 N. Le produit de la réaction est extrait avec 1,2 ml d'acétate d'éthyle et les tubes sont agités pendant 1 minute, jusqu'à l'obtention d'une émulsion. Après centrifugation à 15000 g pendant 5 minutes à température ambiante, on prélève 1 ml de la phase organique supérieure qui est mise à compter dans une fiole à scintillation et additionnée de 2 ml 15 de scintillant Sigma Fluor. 6. Détermination des conditions de cinétiques Les dosages d'activités Msr sont réalisés pour chaque point en 20 triplicate et répétés 2 fois. Les conditions du dosage sont les suivantes : 30 pg de protéines, incubation à 37°C pendant 90 minutes. RESULTATS L'action du lipochroman-6 sur l'activité Msr est représentée sur 25 la figure 1. Conclusions : L'addition de lipochroman-6 sur des kératinocytes humains en culture stimule l'activité Msr de ces cellules. A la dose de 0,05%, l'activité 30 est augmentée de 44%. EXEMPLE 3 Effet du lipochroman-6 sur la teneur en protéines oxydées des cellules de l'épiderme. MATERIEL ET METHODES 5 1. Culture de cellules Les manipulations de cellules sont menées dans des conditions aseptiques sous hotte à flux laminaire. Des kératinocytes humains normaux (KHN) isolés à partir de 10 prélèvements de peau humaine effectués sur deux donneurs différents (ci-après notés KHN002 et KHN 9726) sont mis en culture en flasques 175 en milieu KSFM complet (KSFMc) (Invitrogen GIBCO) à 37°C et 5% de CO2 et ensemencés à raison de 20 000 cellules par puits dans des systèmes de culture Lab-Tek II, 8 puits (Nalge Nunc International). 15 2. Traitement Après 48h de culture, les cellules sont traitées avec les solutions de traitement (voir ci-dessous). 20 Préparation de la solution-mère de lipochroman-6 On prépare une solution de lipochroman-6 à 0,004% en poids/volume (solution A). Pour cela, on solubilise 20 mg de poudre de lipochroman-6 25 (fournisseur Lipotec) dans 2 ml d'éthanol (solution à 10 mg/ml). Cette solution est diluée (40 pl de la solution mère dans 10 ml de milieu KSFm) pour obtenir la solution A Préparation des solutions de traitement Les solutions de traitement sont préparées par dilution de la solution A préparée ci-dessus dans le milieu KSFMc, pour obtenir le pourcentage correct en lipochroman-6. Traitements réalisés sur 3 puits par type de cellule : - témoin : KSFMc - témoin solvant : solution d'éthanol 0,1% en milieu KSFMc. - lipochroman 0,001% - lipochroman 0,002% 3. Immunocoloration des protéines oxydées Après 48 heures de traitement, le KSFMc est aspiré. Les cellules sont rincées au tampon phosphate (PBS) (PBS Tablets, Invitrogen GIBCO), puis fixées à la formaline (Formalin Solution 10% Neutral Buffered, Sigma) pendant 10 minutes à température ambiante. Après rinçage au PBS, les chambres de culture sont remplies avec une solution de Triton 0,1% (Triton X-100, Sigma) pendant 10 minutes, puis rincées au PBS. Les chambres de cultures ensuite démontées et les lames sont plongées dans une solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine (300 mg de DNPH (Fluka)) dans un mélange éthanol/acide sulfurique (98,5 ml/1,5 ml) pendant 30 minutes. Le DNPH réagit avec les groupements carbonyl des protéines oxydées selon la réaction suivante : O+H 2N-NHù1 NO2 -NO,- N-NH - -NO,+ H2O NO2 Protéine + DNPH --~ Protéine-DNP + H20 Les lames sont rincées au PBS. Les cellules sont ensuite recouvertes d'une solution de PBS/BSA à 1% (10g/l) pendant 30 minutes à température ambiante. Les groupements dinitrophényl (DNP) fixés sur les protéines 30 oxydées sont reconnus par un anticorps primaire anti-DNP. Pour cela, selon une première étape, les lames sont recouvertes d'une solution d'anticorps primaire (monoclonal mouse anti-DNP antibody, Sigma), diluée au 1/500eme dans une solution PBS/BSA à 1%, incubées pendant 60 minutes à température ambiante en étuve, puis rincées par une solution PBS-Tween 0,1% (Tween20, Merck). Selon une deuxième étape, les cellules sont recouvertes d'une solution d'anticorps secondaire (Alexafluor 546 Goat anti-mouse, Invitrogen) dans une solution PBS/BSA 1%, et incubées à l'abri de la lumière pendant 60 minutes. Les lames sont ensuite rincées au PBS-Tween, puis au PBS. Selon une troisième étape, quelques gouttes d'un milieu aqueux de montage (Fluorescent Mounting Medium, DAKO) sont déposées sur les lames, qui sont ensuite conservées à 4°C et à l'obscurité. 4. Acquisition d'images en microscopie confocale 15 Les photos sont faites en microscopie confocale (microscope Axioplan, Zeiss, et Laser à Krypton-Argon, BioRad) à l'aide du logiciel LaserSharp 2000 (BioRad). Pour chaque condition, on réalise trois photos à l'objectif x40 selon les mêmes paramètres d'acquisition (gain, iris). 20 La longueur d'onde d'excitation du fluorochrome est 546 nm et la longueur d'onde d'émission est 573 nm. En pratique, on applique une fluorescence d'excitation à 546 nm par le laser de confocal sur les cellules. Le fluorochrome Alexafluor 546 qui représente les protéines oxydées réémet une 25 fluorescence à 573 nm qui est récupérée par un filtre spécifique et que l'on peut observer. La fluorescence mesurée est ainsi directement proportionnelle à la quantité de protéines oxydées. 5. Analyse d'images 30 On analyse les photos à l'aide du logiciel d'analyse d'image Leica QWin. Un programme permet de quantifier la coloration au DNPH pour évaluer le taux de protéines oxydées et le nombre de cellules. Le programme détecte la coloration fluorescente des protéines oxydées. Une zone de détection la plus représentative possible (nombre, taille, densité des cellules, intensité du marquage) est délimitée. On mesure la fluorescence des protéines oxydées dans la zone délimitée, et on dénombre les cellules dans la même zone, par comptage des noyaux cellulaires. (voir figures 2a, 2b, 2c, 2d et 2e) Le procédé comprend dans l'ordre les étapes suivantes : - ouverture de l'image à analyser (Fig. 2a) - détection de la coloration des protéines oxydées (Fig. 2b) - traçage de la zone de détection (Fig. 2c) et soustraction des zones colorées (Fig. 2d). - pointage des cellules (Fig. 2e). RESULTATS L'effet du lipochroman-6 sur l'oxydation des protéines est mesuré sur les deux types de kératinocytes humains normaux (KHN). Pour cela, on estime la surface de marquage des protéines oxydées, la surface de la zone de mesure et le nombre de cellules dans la surface de mesure, à l'aide d'un système de traitement d'images. 1. Méthodes statistiques Données manquantes, aberrantes Les pourcentages sont calculés sur la base des personnes répondant (n=6) sauf cas des valeurs manquantes ou non-réponse, où la base est indiquée par � /n.5 � . Pour les tests en appariés, si une valeur manque pour un sujet, celui-ci est retiré de l'analyse. On utilise le test de Dixon pour déterminer les valeurs aberrantes. Degré de sianificativité des tests statistiques L'analyse statistique est réalisée avec un risque d'erreur a=5%. p indique la significativité du test : * Si p 0.10 = NS (non significatif), la valeur de p n'est pas indiquée. Analyse des données qualitatives Le tri à plat des questions qualitatives consiste à recenser les effectifs puis calculer les fréquences des différentes réponses possibles (exprimées en pourcentage). Le test du x2 est utilisé pour comparer les pourcentages. Analyse des données quantitatives On réalise en premier lieu une analyse descriptive. On utilise l'analyse de la variance (ANOVA) pour comparer les moyennes des modalités d'un facteur. Si le test de Student est utilisé, il est indiqué par un 'T'. 25 Logiciels Statgraphics Plus Centurion package el: Uniwin 6.0 sous Windows NT. 30 2. Effet du traitement par le lipochroman-6 sur la teneur en protéines oxydées des cellules cutanées. Des tests unilatéraux sont utilisés pour calculer les 5 signifcativités (sauf pour le témoin solvant) pour lequel un test bilatéral est utilisé : témoin/témoin solvant. Taux de protéines oxydées / cellules KHN 0002 KHN 9726 Moyenne Diminution % / Excipient témoin Témoin 102.1 102.9 102.5 93.6 110.2 101.9 Excipient témoin NS NS NS 0,00% Lipochroman-6 76.3 88 82.1 -19.43% 0,001% S ( EXEMPLE 4 - Crème de jour anti-rides pour renforcer la luminosité du teint. La composition est une émulsion huile-dans-eau comprenant le lipochroman-6 (% exprimés en poids par rapport au poids de la composition) : Lipochroman-6 0,05 Extrait de Centella asiatica 0,5 Stéareth-21 2,5 Glyceryl stéarate 1,1 Alcool stéarylique 5 Tricaprate / caprilate glycérol 11,5 Butylèneglycol 3 Glycérine 2 Conservateur 0,5 Concentré de parfum 0,5 Filtre UV 7,5 Eau qsp 100 La crème est appliquée de préférence le matin sur le visage. EXEMPLE 5 - Lotion � coup d'éclat � comprenant le lipochroman-6. La composition cosmétique est une lotion (0/0 exprimés en poids par rapport au poids de la composition) : Lipochroman-6 Butylène glycol 0,05 3 EDTA 0,1 Solubilisant 1 Concentré de parfum 0,3 Ethanol 5 Filtre UV 0,1 Eau qsp 100 La lotion appliquée sur le visage, par exernple en fin de journée pour le soir, restaure l'éclat du visage. EXEMPLE 6 - Poudre de maquillage comprenant le Ipochroman-6. La composition cosmétique est une poudre compactée (% 15 exprimés en poids par rapport au poids de la composition) : Lipochroman-6 0,05 Actif hydratant (glycérine) 2,4 Agents de cohésion 3,5 Filtres UV 18 20 Agents de texture 49 Liant 16 Concentré de parfum 0,1 Conservateurs 0,6 Pigments 6 25 Excipient (talc, mica) qsp 100 La poudre, appliquée sur le visage procure un effet coloré et restaure l'éclat du visage.10 REVENDICATIONS1. Utilisation dans une composition cosmétique destinée à une application topique sur la peau du lipochroman-6 en tant qu'agent actif destiné à améliorer et/ou à restaurer l'éclat du teint de la peau, notamment de la peau du visage. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit agent actif est contenu dans ladite composition en quantité suffisante pour obtenir une diminution du taux de protéines oxydées dans les cellules de la peau après application de ladite composition sur la peau. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit agent actif est utilisé en quantité suffisante pour stimuler l'expression des gènes codant l'enzyme Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) et/ou leur activité de réparation du dommage oxydant pour rendre aux protéines leurs fonctionnalités. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration en lipochroman-6 de ladite composition est comprise entre 0,001% et 5% en poids de la composition et de préférence entre 0,01% et 1% en poids. 5. Méthode de soin cosmétique de la peau, en particulier de la peau du visage, destinée à améliorer et/ou à restaurer l'éclat du teint, caractérisée en ce qu'elle comprend l'application sur la partie de la peau concernée d'une quantité efficace d'une composition cosmétique, en particulier d'une composition telle que définie dans l'une des 25 revendications 1 à 4 contenant du lipochroman-6 en tant qu'agent destiné à améliorer l'éclat du teint de la peau.