Brevet FR2933869A1 — publié le 20100122

La présente invention a pour but l'utilisation d'un extrait aqueux ou organique ou hydro-organique de Microsorum pour la fabrication d'une composition cosmétique de soin de la peau ou du cheveu. Metua pua'a est le nom vernaculaire de certaines fougères communes à Tahiti comme dans d'autres îles Polynésiennes et en particulier de Microsorum scolopendria et Microsorum membranifolium de la famille des Polypodiaceae (Ho R et al, Communication au IVème Colloque International sur les Plantes Aromatiques et Médicinales d'Outre-Mer, Tahiti, Polynésie Française, 2006 ; ainsi que Ho R et al, Communication au XVIème International Ecdysone Workshop, Ghent, Belgique, 2006). Ces plantes contiennent en particulier des ecdystéroïdes. Par exemple Microsorum scolopendria contient de l'ecdysone et de la 20-hydroxy-ecdysone à côté d'autres ecdystéroïdes (Snogan E et al, Phytochem. Anal. 18, 441-450, 2007) et Microsorum membranifolium contient en outre la 2-deoxy-20-hydroxyecdysone (Ho R et al, J Chromatogr Sci 46, 102-110, 2008). Ces fougères sont utilisées comme plantes ornementales. De plus, les frondes (feuilles) et les rhizomes de Metua pua'a, sont utilisés comme ingrédients pour la préparation de remèdes traditionnels utilisés en particulier comme purgatif ou vermifuge (Pétard P, Plantes utiles de Polynésie, pp 78-80. Raau Tahiti, 1986. Haere po no Tahiti). Par ailleurs, on sait que le vieillissement, et notamment le vieillissement des tissus conjonctifs, tels que la peau, est dû en grande partie à l'apparition de cellules à l'état � sénescent � qui sécrètent des enzymes susceptibles de dégrader la matrice extracellulaire, des cytokines pro inflammatoires, et des facteurs de croissance (Campisi J et d'Adda di Fagagna F, Nature Reviews Mol Cell Biol. 8, 729-740, 2007). Il a en effet été établi lors d'études de réplication de cultures de cellules, ainsi que lors d'études de cellules de peaux de personnes âgées, que les cellules cutanées peuvent passer dans un état tien particulier qualifié de � sénescent � par les spécialistes en Biologie Cellulaire. Dans cet état, elles ne peuvent plus se reproduire, et elles expriment une enzyme particulière appelée �bêta galactosidase associée à la sénescence � ou SA bêta-gal, caractérisée par le fait qu'elle est active à pH 6 (Dimri GP et al, Proc Nat Acad Sci USA, 92 : 9363-67, 1995). Enfin il apparaît que les � cellules sénescentes � in vivo peuvent avoir des effets néfastes sur le tissu environnant (Funk W.D. et al, Exp Cell Res.258 :270-8) et qu'il parait important de disposer de moyens pour éviter leur apparition. Il semble donc qu'il serait très intéressant de pouvoir disposer de moyens pour éviter l'apparition de �cellules sénescentes � qui ont perdu la capacité de se reproduire, et qui ont des effets néfastes sur les tissus environnants. D'autre part, on sait que la peau des zones exposées, et en particulier la peau du visage, vieillit plus rapidement en raison des stress oxydatifs provoqués par les rayonnements ultra violets et la pollution atmosphérique qui engendrent des radicaux libres, des peroxydes, de l'oxygène singulet et de l'ion superoxyde, qui peuvent dégrader dans l'organisme les protéines (enzymes, protéines de structure...), les lipides des membranes biologiques, les acides nucléiques... . C'est la raison pour laquelle il convient de protéger ces zones de peau par des produits cosmétiques adaptés. Par ailleurs on connaît l'enzyme hème-oxygénase ou HO-1. Cette enzyme catalyse la dégradation de l'hème en monoxyde de carbone, en fer libre, et en biliverdine (Pae H-O et al, J Clin Biochem Nutr. 42, 197-203, 2008). Le monoxyde de carbone CO est maintenant reconnu comme un important médiateur, en particulier responsable de la photo-immunoprotection des cellules de Langerhans par les rayonnements UVA dans la peau (Allanson et al, J Invest Dermatol. 124,644-50, 2005). Le fer qui pourrait être dangereusement pro-oxydant à l'état libre est immédiatement complexé par une protéine spécialisée appelée ferritine. La biliverdine est transformée rapidement par la biliverdine réductase en bilirubine, un puissant antioxydant (Stocker R et al, Science. 235, 1043-6, 1987 ; Bach FH, Wien Klin Wochenschr . 114, 1-3, 2002). Ainsi l'hème-oxygénase et la ferritine jouent dans l'organisme un rôle protecteur important et il serait très intéressant de disposer de substances susceptibles d'activer leur expression dans les cellules cutanées. Aussi un des buts de la présente invention est-ii de stimuler, dans les cellules cutanées, la biosynthèse de certaines protéines entrant en jeu dans leur protection contre les stress oxydatifs, en particulier l'hème-oxygénase HO-1 et la ferritine. Un autre but de l'invention est de fournir un produit dont le principe actif est naturel. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite sont atteints, selon la présente invention, par l'utilisation d'un extrait aqueux ou organique ou hydroorganique de Microsorum pour la fabrication d'une composition cosmétique de soin de la peau ou du cheveu. De préférence, le Microsorum est choisi parmi les espèces commutatum, grossum, maximum, membranifolium, punctatum, rubidum, scolopendria, et plus particulièrement membranifolium et scolopendria. Avantageusement, la composition cosmétique selon la présente invention est un produit de protection anti-vieillissement contre les effets des stress oxydatifs ou des rayonnements ultra-violets. Selon un mode préféré de réalisation de la présente invention, l'extrait de Microsorum est un extrait de fronde ou de rhizome réalisé avec un ou plusieurs des solvants suivants : eau, méthanol, éthanol, propanol, butanol, propylène glycol, butylène glycol. Avantageusement, cet extrait est une fraction éthanolique, propanolique ou butanolique d'un extrait méthanolique ou hydro-éthanolique. De préférence, la concentration finale exprimée en extrait sec de Microsorum dans la composition cosmétique est de 0,001 à 10 % en poids et même plus particulièrement de 0,05 à 1 % en poids. Avantageusement, la composition cosmétique contient également au moins une substance active telle qu'un dérivé d'acide ascorbique, un tocophérol, un dérivé de tocophérol, un dérivé de rétinol, la forskoline, la caféine, la sérine, le glycérol, le resvératrol, un extrait de Centella, un extrait de Ginseng, un extrait de Notoginseng, un extrait de Rhodiola, un extrait d'Eleutherococcus, un extrait de Glycyrrhiza, un extrait de Scutellaria, un extrait de Griffonia, l'arbutine, l'acide kojique, un filtre UV . De préférence, la composition cosmétique est sous la forme d'une émulsion huile dans eau, d'une émulsion eau dans huile, d'une émulsion multiple, d'une lotion, d'un gel, d'une suspension de liposomes, d'une suspension de sphérules lipidiques. Avantageusement, on utilise un extrait aqueux ou hydro-éthanolique de Microsorum pour la fabrication d'un complément alimentaire anti-vieillissement. Ainsi, la présente invention a notamment pour but la réalisation de nouveaux produits cosmétiques pour protéger la peau contre le vieillissement caractérisés en ce qu'ils contiennent des extraits de Microsorum tels que Microsorum scolopendria, ou Microsorum membranifolium, et plus particulièrement des extraits de rhizome et de fronde (feuille) : il a été en effet trouvé de façon surprenante qu'une fraction particulière d'un extrait de Microsorum est susceptible de protéger les cellules cutanées contre l'apparition de la � sénescence �. Pour l'obtention des extraits, on choisit un solvant susceptible d'extraire les composés relativement polaires sans extraire trop de sucres libres ou de substances très hydrophobes. Le méthanol est un bon compromis, mais on peut aussi utiliser un mélange eau-éthanol ou l'eau chaude. Dans le cas d'un extrait au méthanol chaud, on pourra après évaporation réaliser une extraction avec un solvant apolaire pour éliminer des produits colorés tels que les caroténoïdes et les produits de dégradation de la chlorophylle toujours présents dans les feuilles. Dans le cas d'une extraction à l'eau chaude, on peut après séchage réaliser une partition avec le butanol pour recueillir les composés moins polaires et se débarrasser des sucres. Pour la réalisation des compositions cosmétiques, on choisit en général des dispersions d'une phase grasse dans l'eau ou l'inverse, de manière à rassembler dans la formule un maximum d'ingrédients destinés à conférer au produit des propriétés d'étalement facile, une consistance donnée, un toucher final agréable, une bonne stabilité, une protection contre les contaminations microbiennes ... Dans certains cas on préférera des formulations plus compliquées telles que les émulsions multiples ou les liposomes, ou au contraire plus simples telles que les lotions ou les gel:; aqueux. La description, qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, est en particulier relative à des exemples de réalisation qui permettront à l'homme du métier de mieux comprendre la présente invention. Exemple 1 : Obtention d'un Extrait Brut de Microsorum scolopendria. 50 g de frondes (feuilles) séchées de Microsorum scolopendria (M. scolopendria) sont extraits au soxhlet par 100 ml de méthanol pendant deux fois 7 heures. L'extrait méthanolique est évaporé à l'évaporateur rotatif pour donner 10,25 g d'Extrait Brut sec. Exemple 2 : Obtention d'une Fraction Butanolique de l'extrait brut de Microsorum scolopendria (M. scolopendria). On prépare 146,5 g d'extrait brut méthanolique sec tel qu'à l'Exemple 1 à partir de 715 g de frondes sèches de Microsorum scolopendria. Cet extrait sec est repris par un équivalent de méthanol, un équivalent de chloroforme, et un équivalent d'eau. On obtient ainsi deux phases que l'on laisse décanter. La phase polaire est séparée, puis concentrée pour donner 28,21 g. Cette phase polaire sèche est reprise par 200 ml d'eau avant l'ajout de 200 ml de n-butanol. On sépare la phase organique, puis on l'évapore pour obtenir 1,25 g. Cette fraction sèche est alors reprise par 2 ml d'un mélange eau-éthanol 3 :1 et passée pour purification sur une colonne de gel polyamide (47 x 3 cm) avec le même mélange hydro-alcoolique comme solvant. Le premier volume de solvant de 300 ml correspond au volume mort de la colonne et n'est pas retenu. Le deuxième volume de 300 ml d'éluat est recueilli et évaporé pour donner 500 mg de Fraction Butanolique sèche d'extrait de Microsorum scolopendria. Exemple 3 : Obtention d'une fraction éthanolique de Microsorum scolopendria. 50 g de frondes (feuilles) de Microsorum scolopendria sont macérées pendant 24 h dans 100 ml d'un mélange d'eau et d'éthanol 1 à 1 en volume. Après filtration, on évapore l'extrait à sec. On reprend l'extrait sec par 50 ml d'éthanol à 96° pour prépare une fraction éthanolique. On filtre sur Celite, et on évapore l'éthanol pour obtenir la fraction éthanolique sèche de Microsorum scolopendria. Exemple 4 : Obtention d'un Extrait Brut de Microsorum membranifolium. 30 g de frondes (feuilles) séchées de Microsorum membranifolium sont extraits à froid pendant un jour par 100 ml de méthanol. L'extrait est ensuite séché par évaporation du solvant au ballon rotatif pour donner 6 g d'extrait brut de M. membranifolium. Exemple 5 : Obtention d'un extrait brut de Microsorum membranifolium. 100 g de rhizomes secs de Microsorum membranifolium sont broyés, puis extraits avec 300 ml d'un mélange d'eau et d'éthanol 1/1 en volume. Après filtration, on évapore l'extrait à sec. Exemple 6: Test qualitatif d'activité sur les cellules cutanées des extraits de Microsorum scolopendria. Des fibroblastes humains normaux sont cultivés pendant 48 h dans du milieu DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal. Puis on ajoute à des aliquotes de la culture par l'intermédiaire d'une solution mère dans le DMSO, 10 �g/ml de l'extrait brut de M scolopendria de l'Exemple 1, ou 2 �g/ml de la fraction butanolique de M. scolopendria de l'Exemple 2, et on laisse incuber ces cultures pendant 24 h, de même que des cultures de contrôle sans extrait. Après 24 h de contact avec l'extrait ou la fraction à tester, on réalise une analyse différentielle de l'expression des gènes dans les fibroblastes au moyen d'alignements de séquences d'ADN complémentaires (� c-DNA arrays �) déposés sur une membrane de polyamide. Pour cela, on extrait les ARN messagers totaux, puis on les �reverse-transcrit� en utilisant un mélange d'amorces correspondant aux c-DNA déposés sur la membrane, en présence de déoxynucléotide-triphosphate marqué au phosphore radioactif 33P. Ainsi des séquences de d'ADN marquées sont préparées, et peuvent alors être �hybridées � sur les c-DNA cible déposés en excès sur la membrane. Après lavage, les alignements de c-DNA. sont révélés par autoradiographie et les taches obtenues sont soumises à une analyse d'image qui par comparaison avec une série de gènes témoin, donne une appréciation semi-quantitative des gènes qui sont sur-exprimés ou sous-exprimés dans les cellules. On a ainsi pu constater (Tableau 1) que les gènes de l'hème-oxygènase HO-1 et de la ferritine étaient sur-exprimés dans la cultures de fibroblastes incubée en présence de l'extrait de M. scolopendria, mais pas de manière significative dans la culture traitée avec la fraction butanolique. 6 Tableau 1 Gène Extrait Brut de Exemple 1, Fraction But. de Exemple 2, 10�g/ml 2�g/ml Hème Oxygénase HO-1 159 126 Ferritine 162 116 Exemple 7: Test quantitatif d'activité des extraits de M. scolopendria sur les cellules cutanées. Pour confirmer les résultats de l'Exemple 5, une analyse par RT-PCR quantitative a été réalisée. Pour cela, les ARN messagers totaux de la culture traitée par l'extrait brut de M. scolopendria de l'Exemple 5 ont été soumis à une réaction en chaîne avec la polymérase (PCR) dans un � Light Cycler�� de Roche Molecular Systems Inc. Ce système comprend un � thermo cycler � optimisé pour des réactions PCR extrêmement rapides, et un fluorimètre pour évaluer à 521 nm, le colorant SYBR Green I qui s'intercale de façon spécifique entre les double hélices d'ADN à chaque cycle de duplication. Les couples de � primer � suivants ont été utilisés : - Hème-oxygénase I (HO-1, code gene bank NM-002133) - Ferritine (FTH1, code gene bank NM-002032). Le gène de la glycéraldehyde-3-phosphate déhydrogénase (G3PDH) a été utilisé comme marqueur de référence. Les résultats exprimés en % de l'expression du gène considéré dans la culture traitée avec l'extrait brut de M. scolopendria, par rapport à la culture contrôle non-traitée sont donnés au Tableau 2. Tableau 2 Gène % Expression Heme Oxygenase 1 189 % Ferritine 139 %25 Ainsi l'extrait brut de Microsorum scolopendria active l'expression des gènes de l'hème-oxygénase et de la ferritine dans les fibroblastes de peau. Exemple 8 : Test de prévention de la sénescence des cellules cutanées par la fraction butanolique d'un extrait de Microsorum scolopendria (F Bu de M.s.). Ce test met en évidence l'atténuation par la fraction butanolique de l'exemple 2 des dommages causés à des fibroblastes en culture, par des stress oxydatifs répétés résultant d'expositions répétées à un rayonnement ultraviolet. Des fibroblastes de derme de la même souche BJ que celle utilisée par Chainiaux F. et al (Int. J. Biochem. Cell. Biot. 34(11) :1331-9,2002) sont mis en culture par les méthodes classiques. L'absence de cytotoxicité de la fraction butanolique de l'exemple 2 sur une durée de 24 heures, est vérifiée dans la gamme 50 à 250 �g /ml. Pendant 5 jours les fibroblastes sont exposés 1 fois par jour à une dose d'ultra- violets B de 200 mj/cm2. 24 heures avant le premier traitement aux UV, et à la suite de chaque irradiation, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant 50, 125, et 250 �g /ml de fraction F Bu de M.s.. Avant chaque nouvelle irradiation, ces milieux sont remplacés par un milieu ne contenant pas de fraction F Bu de M.s.. Après la dernière irradiation, les cellules sont laissées 72 heures en contact avec du milieu supplémenté en F Bu de M.s., renouvelé toutes les 24h. Au terme de cette dernière période de contact, l'activité bêta-galactosidase à pH6 (bêta-galactosidase associée à la sénescence ou SA bêta-gal) est évaluée suivant la méthode de Dimri G.P. et al (déjà cité), sur au moins 400 cellules pour chaque concentration en F Bu de M.s.. L'expérience a été réalisée deux fois. Les valeurs moyennes des pourcentages de cellules exprimant la SA bêta-gal sont regroupées dans le Tableau ci-après.30 Tableau 3 Condition SA bêta-gal SA bêta-gal lère expérience 2ème expérience Contrôle sans UV 31,04 41,19 UV et 0�g/ml de F Bu de M.s. 38,65 49,19 UV et 50 �g/ml de F Bu de M.s. 25,97 36,42 UV et 125 �g/ml de F Bu de M.s. 25,59 36,05 UV et 250 �g/ml de F Bu de M.s. 25,98 30,45 Or. constate que : - les dommages causés par les expositions répétées aux rayons ultra-violets B ont entraîné une augmentation significative des fibroblastes présentant l'activité SA bêta-gal caractéristique des cellules qui ne peuvent plus se reproduire (qualifiées de � sénescentes �). - le traitement des cellules par la fraction butanolique de Microsorum scolopendria de l'exemple 2 avant et après les irradiations, a permis une atténuation des dommages causés par les ultra-violets dès la concentration de 50 �g/ml, ce qui se traduit par un nombre de fibroblastes � sénescents � qui reste inférieur à celui des cultures n'ayant subi aucune irradiation. Il apparaît ainsi, que l'utilisation de la fraction d'extrait de Microsorum scolopendria, permet bien selon l'invention d'atténuer les dommages causés aux cellules cutanées par l'exposition répétée à un stress oxydatif. Composition N°1 : Crème de soin de la peau anti-vieillissement. On procède comme pour la réalisation d'une émulsion classique huile dans eau, c'est-à-dire qu'on mélange sous agitation à 85°C une phase hydrophobe et une phase aqueuse contenant chacune des matières premières destinées à conférer au produit les propriétés d'usage habituelles : stabilité, sécurité, étalement facile, toucher final agréable, etc. On refroidit ensuite sous agitation et à 50°C, on rajoute 0,5 % d'extrait brut de Microsorum scolopendria tel qu'à l'Exemple 1. On continue le refroidissement sous agitation jusqu'à la température ordinaire. Cette crème est appliquée sur le visage, le cou et les mains, de préférence le matin pour que le principe stimulant les défenses naturelles ait le temps de pénétrer jusqu'aux cellules vivantes, afin d'être en contact en milieu de journée quand les intensités d'irradiation UV solaires sont à leur maximum. Composition N°2 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. Or_ réalise comme ci-dessus une émulsion huile dans eau contenant du palmitate de rétinol ; lors du refroidissement à 45°C, on rajoute de l'extrait fractionné de Microsorum scolopendria tel qu'à l'exemple 2, ainsi qu'un extrait glycolique de Scutellaria baicalensis en quantité suffisante pour arriver aux concentrations en poids dans la composition finale de : - extrait fractionné de Microsorum scolopendria 0,2 % - palmitate de rétinol 0,05 % - extrait glycolique de Scutellaria baicalensis 2 %. Cette formulation est une crème de jour. Composition N°3 : Crème cosmétique de protection anti-vieillissement et de protection filtrante. On réalise comme pour la Composition N°1, une émulsion huile dans eau avec un ajout d'oxyde de titane suffisant pour obtenir un facteur de protection SPF égal à 6, puis on ajoute un extrait de Microsorum scolopendria tel qu'à l'Exemple 1 sous agitation à 45°C en quantité suffisante pour arriver à 0,4 % d'extrait en poids dans la préparation finale. Le produit est destiné à être appliqué le matin sur les zones de peau non couvertes, et, si possible, l'application doit être renouvelée en milieu de journée.30 Composition N°4 : Gel cosmétique de protection anti-vieillissement, pour peaux sensibles. On réalise un gel acrylique hydroalcoolique titré à 0,3 % en poids d'extrait de Microsorum membranifolium tel qu'à l'Exemple 4 et contenant en outre 2 % en poids d'extrait hydro glycolique de Glycyrrhiza glabra. Composition N°5 : Crème hydratante de protection anti-vieillissement. On réalise comme pour la Composition 1 une émulsion huile dans eau contenant 0,5% d'extrait de Microsorum membranifolium de l'Exemple 5, 3% de glycérol, et 1% de sérine, ces trois constituants étant rajoutés à la fabrication lors du refroidissement, lorsque la température a atteint 50°. Composition N°6 : Lotion Capillaire Antichute On réalise une lotion capillaire hydro alcoolique antichute contenant 0,5 % d'extrait de Microsorum scolopendria tel qu'à l'Exemple 1 et 0,1 % de saponines de rhizome de Panax Notoginseng. Composition N°7 : Complément alimentaire pour protéger la peau avant toute exposition au soleil ou aux pollutions. On réalise par les techniques classiques des comprimés dosés à 5 mg par comprimé de fraction éthanolique sèche d'un extrait hydro éthanolique 1/1 de Microsorum scolopendria tel qu'à l'Exemple 3. Ces comprimés sont à prendre avec un peu d'eau au cours des repas du matin et de milieu de journée, à raison de un à deux comprimés par prise suivant l'intensité et la durée d'exposition attendue. Composition N°8 : Boisson de complément alimentaire pour protéger la peau lors des expositions au soleil. On réalise une boisson à base d'eau de coco contenant 0,01 % en poids de fraction éthanolique sèche d'extrait de Microsorum scolopendria tel qu'à l'Exemple 3. Cette boisson est présentée en doses de 100 ml. Il est conseillé d'en boire une dose chaque matin au petit déjeuner. REVENDICATIONS1. Utilisation d'un extrait aqueux ou organique ou hydro-organique de Microsorum pour la fabrication d'une composition cosmétique de soin de la peau ou du cheveu. 2. Utilisation selon la revendication 1 telle que le Microsorum est choisi parmi les espèces commutatum, grossum, maximum, membranifolium, punctatum, rubidum, scolopendria, et plus particulièrement membranifolium et scolopendria. 3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2 telle que la composition cosmétique est un produit de protection anti-vieillissement contre les effets des stress oxydatifs ou des rayonnements ultra-violets. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 telle que l'extrait de Microsorum est un extrait de fronde ou de rhizome réalisé avec un ou plusieurs des solvants suivants : eau, methanol, ethanol, propanol, butanol, propylène glycol, butylène glycol. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4 telle que l'extrait est une fraction éthanolique, propanolique ou butanolique d'un extrait méthanolique ou hydro-éthanolique. 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 telle que la concentration finale exprimée en extrait sec de Microsorum dans la composition cosmétique est de 0,001 à 10 % en poids. 30 7. Utilisation selon la revendication 6 telle que la concentration finale exprimée en extrait sec de Microsorum dans la composition cosmétique est plus particulièrement de 0,05 à 1 % en poids. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7 telle que la composition cosmétique contient également au moins une substance active telle qu'un dérivé d'acide ascorbique, un tocophérol, un dérivé de tocophérol, un dérivé de retinol, la forskoline, la caféine, la sérine, le glycérol, le resveratrol, un extrait de Centella, un extrait de Ginseng, un extrait de Notoginseng, un extrait de Rhodiola, un extrait d'Eleutherococcus, un extrait de GlycyrrHza, un extrait de Scutellaria, un extrait de Griffonia, l'arbutine, l'acide kojique, un filtre UV . 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 telle que la composition cosmétique est sous la forme d'une émulsion huile dans eau, d'une émulsion eau dans huile, d'une émulsion multiple, d'une lotion, d'un gel, d'une suspension de liposomes, d'une suspension de sphérules lipidiques. 10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la composition est contenue dans un comprimé.