Brevet FR2927169A1 — publié le 20090807

PROCEDE DE FONCTIONNALISATION DE LA SURFACE D'UN PORE. La présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation et plus particulièrement de bio-fonctionnalisation de la surface d'un pore. s Le terme pore (ou canal ou capillaire) désigne toute cavité débouchante ou non d'un matériau. La structure en trois dimensions d'un pore ou d'un canal ou d'un capillaire rend difficile sa fonctionnalisation. En effet, des techniques couramment utilisées pour la fonctionnalisation de surfaces planes, comme la i0 pulvérisation ou "spotting" par exemple, deviennent difficiles, voire impossibles à mettre en pratique pour des pores, canaux ou capillaires, cela étant d'ailleurs d'autant plus vrai que leur dimension diminue. D'une manière générale, les procédés de fabrication connus ne permettent pas ou permettent très difficilement de fonctionnaliser des 15 pores de manière localisée. Afin de fonctionnaliser un pore, il est courant d'utiliser des techniques classiques de fonctionnalisation de surface. Les plus courantes utilisent des propriétés d'auto-assemblage des molécules sur support. La silanisation, tout d'abord, réalise le greffage covalent 20 d'organosilanes à la surface de matériaux comme le verre ou le silicium. Ce procédé consiste le plus souvent à réaliser d'abord une fonctionnalisation par un groupement réactif qui permettra ensuite l'immobilisation de la molécule d'intérêt (Iqbal, S. et collaborateurs, "Solid-State nanopore channels with DNA selectivity", Nature Nanotechnology, 2007, 2: p. 243 et suivantes ; Karnik et 25 collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(3) : p. 547 et suivantes; Kim, Y. ù R. et collaborateurs, Biosensors & Bioelectronics, 2007. 22: p. 2926 et suivantes; Wanunu, M. et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(6) : p. 1580 et suivantes). Malgré son usage courant, le processus de silanisation reste encore mal maîtrisé et réclame un contrôle des paramètres du matériau qui 30 est critique pour la fiabilité de la modification de surface et la stabilité du dépôt (nature des fonctions de surface, absence de contamination, rugosité de la surface...). La formation de monocouches auto-assemblées d'alcanesthiols (Lee S. B. and Martin C. R., Chemistry of Materials, 2001, 13 (10) : p. 35 3236 et suivantes; Smuleac V. et collaborateurs, Chemistry of Materials, 2004, 16 (14) : p. 2762 et suivantes; Jagerski et collaborateurs, Nano-Letters, 2 2007, 7 (6) : p. 1609 et suivantes) se base sur la chimisorption des groupements thiol sur différentes surfaces métalliques comme l'or (le plus utilisé), l'argent, le platine, le cuivre ... Cette stratégie a été mise en pratique afin de réaliser la fonctionnalisation des nanopores par des brins d'ADN thiolés (Harrell, C. C. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 2004, 126, p. 15646 et suivantes). Un des inconvénients majeurs des techniques énoncées précédemment est le fait que la fonctionnalisation concerne le plus souvent non seulement le pore mais également la surface plane réactive qui l'entoure, lo partout où il y a un dépôt de solution contenant l'organosilane ou l'alcanethiol, sans localisation. Dans le cas des alcanes-thiol, le support est nécessairement métallique. Un article récent de Joakim Nilsson et collaborateurs, intitulé "Localized Functionalization of Single Nanopores" (Advanced Materials, 2006, 15 18, p. 427 à 431) décrit l'utilisation d'un nano faisceau d'ions focalisé ou nanoFlB (FIB : "Focused Ion Beam") pour la création d'un pore dans une surface de nitrure de silicium. La gravure du pore, le dépôt d'une couche de dioxyde de silicium sous le faisceau du faisceau FIB et une silanisation conduisent à la création de fonctions réactives en surface permettant 20 l'accrochage localisé de brins d'ADN. Cependant, ce procédé est multi-étapes et nécessite une silanisation préalable du support. D'autres auteurs ont décrit l'immobilisation de polymères conducteurs sur des surfaces diélectriques par le biais d'une silanisation du support par un organosilane fonctionnalisé par un pyrrole. Des monomères 25 pyrrole sont ensuite ajoutés dans le milieu et la polymérisation est amorcée grâce à un agent oxydant (Simon et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 1982, 104 : p. 2031 et suivantes; Faverolle et collaborateurs, Chemistry of Materials, 1998. 10 : p. 740 et suivantes). Il a également été décrit dans la littérature qu'il est possible 30 de fonctionnaliser des pores, dans des membranes de polycarbonate par exemple, en faisant intervenir des entités polymérisables. II est ainsi possible d'obtenir des tubes de polymère conducteur en réalisant la polymérisation dans un cadre confiné, délimité par des barrières physiques (pore, canal...) (Martin, C. R. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 35 1990, 112, p. 8976 et suivantes, Martin, C. R., Science, 1994, 266 (5193) : p. 1961 et suivantes) ou en présence d'agents externes qui structurent le milieu 3 de polymérisation de manière à ce qu'elle se fasse de façon orientée (Carswell et collaborateurs Journal of the American Chemical Society, 2003, 125 : p. 14793 et suivantes; Qu et collaborateurs, Journal of Polymer Science : Part A : Polymer Chemistry, 2004, 42: p. 3170 et suivantes). L'application de ces structures est le plus souvent reliée à la connectique, ce qui conduit la plupart des auteurs, le cas échéant, à dissoudre la matrice après création des tubes de polymère. Le pore est ici seulement un "moule", créateur de la forme cylindrique des polymères générés, et n'a pas vocation à être utilisé comme support actif. lo Schématiquement, deux procédés différents sont connus et utilisés : la polymérisation chimique et l'électropolymérisation. 1) Polymérisation chimique (article précité de Martin, C.R., Science, 1994, 266 (5193) : p. 1961 et suivantes; Martin C.R., Advanced Materials, 1991, 3 : p. 457 et suivantes). 15 Un moyen d'obtenir des nanotubes de polymères est de réaliser une polymérisation dite "chimique" d'un monomère tel que le pyrrole couramment cité. La technique expérimentale consiste à placer une membrane poreuse (polycarbonate ....) entre deux solutions aqueuses : une solution contenant le monomère pyrrole et l'autre solution contenant un agent 20 oxydant (comme FeCl3 par exemple) qui induit la polymérisation aux points de rencontre des deux solutions, c'est-à-dire dans les pores de la membrane. 2) Electropolymérisation (Menon, V. P. et collaborateurs, chemistry of Material, 1996, 8: p. 2382 et suivantes; Demoustier- Champagne et collaborateurs, European Polymer Journal, 1998, 34 (12) : p; 1767 et 25 suivantes). Il s'agit dans ce cas de déposer premièrement sur un côté d'une membrane une couche d'adhésion (du chrome par exemple) et de déposer ensuite par-dessus une couche métallique (or). On peut alors procéder à l'électropolymérisation du pyrrole sur cette surface grâce à une 30 cellule électrolytique à trois électrodes. Ces procédés permettent d'obtenir, lors d'une des étapes, des pores fonctionnalisés par un polymère pour obtenir des structures organisées utilisant le pore comme "moule". Des fonctionnalisations par des biotines ont ainsi été réalisées par Sapp et Collaborateurs (Chemistry of Materials, 1999, 35 11: p. 1183 et suivantes) en réalisant la polymérisation électrochimique des 4 monomères thiophène et pyrrole porteurs d'une fonction amine permettant le greffage d'un dérivé de la biotine. On notera par ailleurs que des monomères pyrrole porteurs de biomolécules sont connus en tant que tels (notamment Demandes de 5 brevet français FR 2 703 359 et FR 2 720 832). L'invention concerne un procédé permettant de réaliser une fonctionnalisation d'un pore localisée à sa surface, tout en simplifiant le procédé. L'invention concerne ainsi un procédé de fonctionnalisation io de la surface d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution de part et d'autre du pore, 15 b) appliquer un signal électrique, différence de potentiel ou courant, entre les deux électrodes pour réaliser ladite fonctionnalisation. Le signal électrique peut être constant ou bien modulé en fonction du temps (périodique ou non, pulsé, modulé en amplitude ou en fréquence, en escalier, en rampe, etc...). 20 Le support n'est pas nécessairement conducteur. Nul besoin de tapisser l'intérieur des pores d'une couche conductrice comme décrit pour l'électropolymérisation, ce qui simplifie grandement la démarche expérimentale. L'électropolymérisation est réalisée "à distance" avec des électrodes situées de part et d'autre de la surface à fonctionnaliser. Le 25 support, constitué de matériau organique ou inorganique, peut être de nature isolante, semi-conductrice ou conductrice. L'électropolymérisation à distance ne nécessite pas la présence d'un agent chimique oxydant. Le procédé d'électropolymérisation à distance est réalisable 30 en une seule étape de manipulation. La formation préférentielle du polymère sur les parois du pore peut s'expliquer par le fait que, un signal électrique étant appliqué de part et d'autre du pore, la chute de tension qu'il produit est principalement localisée à l'intérieur du pore d'où un fort gradient de potentiel induisant une formation 35 préférentielle du polymère. Le procédé peut comporter au moins une itération de a et de b avec une deuxième solution d'entités électroactivables. Ces entités peuvent être les mêmes ou avantageusement des entités différentes, ce qui permet notamment de disposer des couches déposées les unes sur les autres ou 5 côte à côte. Selon une première variante, le pore est ouvert à ses deux extrémités et une solution est placée dans deux compartiments dans chacun desquels débouche une extrémité du pore, au moins un des deux compartiments contenant lesdites entités électroactivables. i0 Selon une deuxième variante, le pore présente une seule extrémité débouchante et une des deux électrodes est placée au fond du pore, l'autre électrode étant placée dans un compartiment en communication avec l'extrémité débouchante du pore. Après b, il peut être prévu un rinçage. is Le matériau support peut être à base de silicium. Les entités électroactivables peuvent être des monomères électropolymérisables, notamment des monomères conducteurs pi-conjugués, de préférence un pyrrole, ou bien être porteuses de fonctions électrogreffables, notamment les groupements de diazonium, ou bien encore 20 être choisies parmi les métaux, les oxydes métalliques, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques ou être constituées par une peinture électrophorétique. La solution d'entités électroactivables peut comporter des ligands. 25 La solution d'entités électroactivables peut comporter un mélange d'entités électroactivables, notamment un monomère électropolymérisable et desdites entités électroactivables couplées à des ligands, par exemple greffées avec un oligonucléotide. En particulier, la solution peut présenter une sonde 30 oligonucléotidique (pyrrole-oligonucléotide), ou plus généralement du pyrrole couplé à une biomolécule. La solution d'entités électroactivables peut inclure des ions dopants d'intérêt, notamment l'héparine et/ou la chondroitine.. Le matériau support peut être à base de silicium. 35 Le signal électrique peut être une tension différentielle comprise de préférence entre 100 mV et 10 V. La différence de tension peut 6 être appliquée pendant une durée comprise entre 10 ms et 100 s, par exemple sous forme d'une d'impulsion. La concentration en entités électroactivables peut s'étendre dans une large gamme, à savoir entre 1 nM et 500 mM. Le procédé peut présenter une étape de détachement des entités électroactivables du support, par exemple par destruction de ce dernier ou sous l'action d'ultrasons. Le support peut présenter au moins une région de fonctionnalisation évasée (comportant ou non des paliers) qui jouxte le pore et en prolonge la surface. Les entités électroactivables peuvent comporter des molécules sondes, et le procédé peut comporter une étape d'association par reconnaissance notamment d'hybridation avec des molécules cibles complémentaires. Le procédé peut ensuite comporter une étape de dénaturation de ladite association par reconnaissance, éventuellement suivie d'une étape de nouvelle association par reconnaissance, notamment de réhybridation. Le procédé permet ainsi l'association par affinité d'une entité d'intérêt et permet la fabrication d'assemblages moléculaires. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention 20 apparaîtront mieux à la lecture de la description ci-après, en liaison avec les dessins dans lesquels : - la figure 1 est un schéma de principe illustrant le procédé selon l'invention, - les figures 2a à 2c représentent une cellule destinée à 25 recevoir une puce présentant un pore (montage a), - les figures 3 et 4 illustrent un montage adopté à une puce multi-pores, la figure 4 en étant un détail relatif au pore P, dans les conditions d'expérience, - la figure 5 illustre le format du test de fluorescence utilisé 30 pour valider la fonctionnalisation des pores - et les figures 6, 7, 8a et 8b représentent différents profils de pores mis en oeuvre dans les exemples. La présente invention est relative à un procédé de fonctionnalisation de la surface d'un pore par une entité organique ou 35 inorganique, en particulier par un polymère, qui a été générée électriquement grâce à l'application d'un signal électrique, notamment une différence de 7 potentiel électrique de part et d'autre du pore. Il permet de réaliser une fonctionnalisation de pores ou de canaux quelle que soit leur taille, en particulier des pores ou des canaux de dimension micrométrique et/ou nanométrique, par : - des groupements actifs permettant des interactions de faible énergie comme par exemple : . des charges de surface .des groupements de reconnaissance moléculaire ou biomoléculaire, tels que par exemple des biomolécules, des groupements to chimiques réactifs ou encore des chélateurs d'ions. - des entités organiques ou inorganiques notamment dans le but de réduire le diamètre d'ouverture du pore. On entend par le terme "pore" ou "canal" ou "capillaire" toute cavité, débouchante ou non, se trouvant dans un matériau. Leur distribution 15 spatiale sur le support peut être définie (cas d'une membrane usinée par exemple) ou statistique (cas typique d'un fritté). L'invention concerne toute taille de pore. Un pore 1 (figure 1) est placé entre deux compartiments 3 et 4 étanches contenant une solution 2 d'entités électroactivables qui baigne 20 également le pore 1. Une différence de potentiel par exemple 2 V est appliquée par une source de tension 5 entre deux électrodes 6 et 7 disposées de part et d'autre du pore 1, à une distance de quelques millimètres l'une de l'autre. L'entité électroactivable peut être choisie notamment parmi : 25 - Des monomères électropolymérisables tels les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les phénylènevinylènes, les phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. De préférence, le motif électropolymérisable est un pyrrole. Ce monomère est facilement 30 fonctionnalisable par une entité d'intérêt. De plus, le polypyrrole est un polymère biocompatible, stable à l'air et en solution à pH physiologique, ce qui constitue un atout dans le cadre d'une application dans le domaine des biocapteurs, - Des dérivés porteurs de fonctions électrogreffables telles les 35 groupements diazonium, 8 - Les métaux et oxydes métalliques, par exemple l'oxyde d'iridium, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques - Les peintures électrophorétiques. Le support poreux peut être de nature organique et/ou inorganique et indifféremment conducteur, semi-conducteur ou isolant électrique. On utilise de préférence des matériaux semi-conducteurs comme le silicium ou ses dérivés oxyde et nitrure. Dans l'exemple I ci-après, le monomère utilisé est le pyrrole. En effet, le polypyrrole est un polymère qui présente l'avantage d'être io biocompatible et est donc très intéressant pour élaborer des biocapteurs. II possède également l'atout d'être stable dans les conditions de manipulation des tests biochimiques (pH physiologique, tampons aqueux, présence d'oxygène ...). II s'agit également d'un polymère conducteur qui présente un caractère hydrophile permettant son utilisation dans des systèmes 15 biologiques. De plus chimiquement, la synthèse de conjugués pyrrolebiomolécule est très bien maîtrisée et se fait avec un bon rendement. Le polypyrrole, le polycarbazole, la polyaniline et le polythiophène appartiennent au groupe des polymères conducteurs pi-conjugués. 20 II est connu que les monomères correspondants sont électropolymérisables, à savoir qu'ils conduisent à la formation d'un polymère sous l'effet de l'application d'une différence de potentiel à la surface d'une électrode. Ces entités se comportent donc de la même manière en tenant compte de conditions de solvant et d'oxydation qui ne sont pas identiques 25 d'une entité à une autre. POLYPYRROLE û MISE EN OEUVRE DES EXEMPLES 1. - Matériel A) Réactifs et consommables : Le pyrrole est aliquoté à une concentration de 1 M en solvant 30 acétonitrile puis conservé à -20°C. Le pyrrole porteur d'un oligonucléotide a été préparé selon le protocole décrit dans la Demande de Brevet FR 2 703 359. Les séquences ADN utilisées sont les suivantes : . Py-sondelip6 : Py-(T)Io-5. GAC CGG TAT GCG ACC TGG TAT GCG3' 35 . Cible-Zip6-bio : biotine-5' CGC ATA CCA GGT CGC ATA CCG GTC3' 9 Les puces utilisées sont des membranes d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium. Elles comportent neuf pores de taille micrométrique répartis sur une surface de 2x2 cm2. B) Tampons utilisés (donnés à titre indicatif) : . Tampon d'électropolymérisation : 6g/L Na2HPO4/NaH2PO4, 2,9 g/L NaCl, 10 % v/v glycérol, 2% v/v acétonitrile (v/v = en volume). . Tampon d'hybridation: 0,02 M Na2HPO4/NaH2PO4,1,1 M NaCl, 5,4 mM KCI, 4% v/v 50X Denhardt , 0,2% v/v ADN de sperme de saumon, 0,3% v/v Tween 20 à pH 7,4 . Tampon de rinçage : PBS 5 comprimés/L, NaCl 23.375 g/L, Tween 20 0.15% v/v. C) Montaqes expérimentaux pour l'électropolymérisation à distance : Deux montages expérimentaux ont été validés. 15 a) Cellule d'électropolymérisation (voir figure 2a à 2c) : Le matériau de cette cellule C est du "Delrin" (marque déposée) polyoxyméthylène dit "Delrin POM". La cellule est scindée en deux compartiments étanches 3 et 4 en introduisant dans son réceptacle rectangulaire 34 une pièce support 8 comportant un ou plusieurs pores 1. Des 20 fils de platine par exemple peuvent être introduits dans chacun des compartiments 3 et 4 à travers les ouvertures 91 et 92 du couvercle 9 pour former les électrodes. 93 et 94 désignent les ouvertures de fixation du couvercle 9 sur la cellule C, et 95 et 96 les trous de fixation des vis sur la cellule C. 25 b) Montage sur puce "multipores" : Si on souhaite fonctionnaliser de manière différente chacun des pores d'une puce, il convient de travailler en parallèle avec une source de tension multivoies ou plusieurs sources de tension monovoie, par exemple un potentiostat multi-voies, ou plusieurs potentiostats mono-voie. 30 Dans le montage décrit en relation avec la figure 3, la puce 10 présente 9 pores P~ P9. Chaque pore est isolé entre deux compartiments étanches (31, 4i ; 32, 42 ; .... 39, 49). Autrement dit, il est possible de mettre chacun des neuf pores PI, P2 P9 qui ont ou non le même diamètre en contact avec une solution différente SI, S2 S9 d'entités électroactivables. 35 Chacun de ces compartiments est équipé d'électrodes auxquelles est appliquée une différence de potentiel électrique donnée. Il y a ainsi neuf io io électrodes de travail Etc, Et2,... Et3... Et9 qui sont reliées ou non au même potentiostat (ou plus généralement à la même source de tension) et neuf contre-électrodes qui peuvent être couplés à des électrodes de référence Eri, Er2, Er9. Les solutions S,, S2, S9 peuvent être ou non les mêmes. Un potentiostat PT "multi-voies"permet d'appliquer ces tensions simultanément (même si les valeurs en sont différentes). Chaque pore (PI, ... P9) d'une puce 10 est positionné entre deux compartiments étanches 31, 4i,... ; 39, 49 qui ont ici un volume de 10 �l. Le montage comporte un ou deux circuits imprimés 21, 22 io (Fig. 4) ayant une électrode circulaire intégrée 23, 28 reliable à un potentiostat extérieur. Dans au moins une des électrodes sont percés deux trous 26, 27 permettant d'introduire et d'évacuer du liquide via des capillaires en polytétrafluoroéthylène. Deux compartiments étanches 31 et 41 sont créés entre la puce 10 et les circuits imprimés 21 et 22 grâce à des joints toriques ls 24 et 25 (Figure 4). Afin de réaliser l'électropolymérisation de manière à obtenir un dépôt localisé 30 sur les parois des pores, on utilise : soit les électrodes intégrées aux circuits imprimés - soit des électrodes (fils métalliques non représentés) introduites dans des capillaires de part et d'autre du pore, 20 - soit des électrodes trempant directement dans un compartiment. Dans ce cas, une carte plastique (non représentée) est utilisée à la place du circuit imprimé. II) MISE EN OEUVRE A) Préparation du substrat : 25 a) Nettoyage : Dans un premier temps, la puce subit un nettoyage (67% acide sulfurique, 33% peroxyde d'hydrogène v/v) en salle blanche afin d'éliminer tout contaminant d'origine organique. La puce est trempée 10 min dans la solution puis rincée grâce à une circulation d'eau jusqu'à obtenir une 30 résistivité de 9 M.m. La puce est ensuite séchée dans une étuve à 180°C pendant 10 min. Elle peut ensuite être stockée à température ambiante. b) Augmentation de l'hydrophilie de la surface grâce à l'application d'un plasma oxygène : Cette étape permet de rendre la surface hydrophile, ce qui est 35 avantageux dans l'objectif de remplir le pore, quel que soit sa taille, par une solution majoritairement aqueuse. La puce est ainsi placée pendant 45 secondes dans un plasma 02 à une puissance de 100 W. c) Dépôt de polypyrrole : Une solution de polymérisation contenant 20 mM de pyrrole et 5 5�M de py-sondelip6 en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée pour réaliser des dépôts de polymère dans les pores. Les deux montages (a et b ci-dessus) ont été utilisés. Dans chaque cas, la puce comprenant des pores est introduite de manière à se trouver entre deux compartiments. La solution de 10 polymérisation est introduite dans les deux compartiments. Une électrode est insérée dans chaque compartiment et une différence de potentiel égale à 2 V est appliquée (En pratique, on peut utiliser une tension comprise de préférence entre 100 mV et 10V). Le suivi du déroulement du dépôt se fait en traçant la courbe de l'évolution de l'intensité du courant en fonction du temps : 15 l'allure de cette courbe (présence ou absence de signal électrique) permet de voir si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore (contact électrique) ou non (absence de signal électrique). La puce est ensuite retirée du montage puis rincée à l'eau, séchée à l'air comprimé et conservée sèche à 4°C. d) Vérification de la fonctionnalisation par microscopie de 20 fluorescence Afin de vérifier la formation d'un dépôt de polypyrrole, on utilise la microscopie de fluorescence. Le format du test utilisé est illustré à la figure 5. Il est réalisé en déposant des gouttes de 15 pl de liquide sur un pore. Le pore est tout d'abord saturé en Tampon d'hybridation (5 min à température 25 ambiante). Puis une goutte de cible biotinylée à 100 nM en Tampon d'hybridation est ajoutée (15 min, température ambiante). La puce est ensuite rincée abondamment avec le Tampon de rinçage. Chaque pore est ensuite incubé dans une solution de streptavidine-phycoérythrine (SAPE) à 10% (v/v = en volume) en Tampon de rinçage (15 min. à température ambiante). 30 La puce est ensuite placée entre lame et lamelle pour être observée en microscopie de fluorescence à 530 nm, longueur d'onde d'émission de la phycoérythrine. BIO FONCTIONNALISATION D'UN PORE PAR DES ACIDES NUCLEIQUES 35 EXEMPLE I - (Montage a) i) Création d'un dépôt de polypyrrole 12 Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de forme variables (rapport de forme Rf = diamètre du pore / épaisseur de la membrane dans laquelle il est percé) et ayant subi un traitement plasma est introduite dans la cellule bi-compartiments "Delrin POM" décrite ci-dessus. La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux compartiments de la cellule. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 pM de pyrrole-sonde Zip6 (py-sonde Zip 6) en tampon d'électropolymérisation. Puis, deux fils de platine sont introduits, un de chaque côté de la puce. Le premier est relié à la contre-électrode couplée à l'électrode de référence du potentiostat et le second à l'électrode de travail. Un potentiel de 2 V est appliqué pendant une durée donnée (entre 100 ms et 1 s) entre les deux électrodes (électrode de travail et contre-électrode). La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4°C. L'efficacité de la fonctionnalisation est vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus. ii) Résultats La manipulation a été réalisée avec des pores présentant différents rapports de forme : . Rf = 35 : pore de 70 �m de diamètre dans une membrane de 2 �m d'épaisseur et de 500 �m de côté (voir figure 6). On observe une émission de fluorescence sous la forme d'un cercle lumineux présent de chaque côté de la puce. Ses dimensions correspondent à celles du contour du pore, ce qui permet de déduire que la technique de fonctionnalisation est efficace et permet un dépôt de polymère localisé sur les parois d'un pore de taille micrométrique. Les clichés de microscopie électronique à balayage montrent une fine couche de dépôt ù de l'ordre de 30 nm ù sur le contour d'un pore. Ce dépôt est absent d'un pore non fonctionnalisé. . Rf = 1 avec un pore circulaire de 18 �m de diamètre dans une membrane de 20 �m d'épaisseur : cas d'un pore percé dans une membrane carrée de 50 �m de côté et de 20 �m d'épaisseur. Le dépôt est réalisé à une tension de 2 V appliquée pendant 100 millisecondes (figure 7). La réalisation du test de fluorescence exposé ci-dessus conduit à la présence d'anneaux lumineux de chaque côté du pore qui certifie 13 de la fonctionnalisation efficace et localisée du pore par un polymère porteur d'oligonucléotides. . Rf = 0,25 pore de diamètre 2 .1m dans une membrane de 8 �m d'épaisseur. Le pore d'une taille de 2 �m se trouve au fond d'un cône de plus grand diamètre égal à 10 �m. L'environnement du pore est dit de type � entonnoir � (figures 8a et 8b). Les clichés de microscopie de fluorescence montrent que c'est le contour du haut du cône (de dimension 10 �m) qui a été fonctionnalisé de manière localisée. to Cela constitue un résultat qui laisse la possibilité de contrôler le lieu de la fonctionnalisation selon la morphologie de l'environnement du pore. EXEMPLE II (montage b) : i) Création d'un dépôt de polypyrrole 15 Une puce multi-pores comportant des pores de rapports de forme Rf variables et ayant subi un traitement plasma 02 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4). La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux compartiments. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 �M de pyrrole-sonde-Zip6 en Tampon 20 d'électropolymérisation. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaires et de référence du potentiostat et la seconde à l'électrode de travail. Un potentiel de 2V est appliqué pendant 100 ms entre les deux électrodes. La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air 25 comprimé et stockée à 4°C. ii) Résultats L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus. Chacun des 9 pores de la puce multi-pores peut être étudié indépendamment, 30 éventuellement avec une fonctionnalisation spécifique pour chaque pore. . Rf = 1 pore de 18 �m de diamètre dans une membrane de 18 �m d'épaisseur. La microscopie à fluorescence confirme que le procédé de fonctionnalisation de surface fonctionne également pour toutes les valeurs 35 précitées de Rf en utilisant ce montage (présence d'un anneau fluorescent). 14 Des témoins ont été réalisés pour établir la spécificité de l'interaction biochimique aboutissant à la fonctionnalisation caractérisée par l'émission de fluorescence. Ces contrôles ont été réalisés sur les pores de 18 pm de diamètre (Rf = 1) d'une puce multi-pores : a) Potentiel électrique Pour ce faire, 15 �l d'une solution de polymérisation composée de 20 mM de pyrrole et 5 �M de pyrrole-sonde-Zip6 en tampon d'électropolymérisation sont déposés sur un pore et laissés en contact avec la surface pendant 5 min. La puce est ensuite rincée à l'eau et séchée à l'air comprimé (procédure identique à celle réalisée après une électropolymérisation à distance). La puce est conservée à 4°C puis elle subit la procédure du test de fluorescence décrit précédemment. Aucune fluorescence n'a pu être observée, preuve que l'application d'un potentiel électrique est nécessaire pour la fonctionnalisation du pore. b) Adsorption de conjuqué pyrrole-oligonucléotide Un autre contrôle a été réalisé dans le but d'étudier si l'application d'un potentiel favorise l'adsorption d'ADN à la surface du support. Pour ce faire, une solution de py-Sondelip6 à 5 �M en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée (pas de pyrrole dans ce cas), puis une différence de potentiel électrique a été appliquée selon le même protocole que celui utilisé pour le copolymère pyrrole/py-Sondelip6. L'absence de fluorescence montre que dans les conditions de travail, l'adsorption non spécifique de conjugué pyrrole-oligonucléotide est négligeable. c) Adsorption non spécifique lors de la procédure de révélation i) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure d'hybridation et de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en Tampon d'hybridation. Il n'y a pas, dans les conditions opératoires, de fluorescence parasite liée à l'adsorption non spécifique de la cible ADN biotinylée. ii) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en tampon d'hybridation suivie par une incubation de 15 minutes en tampon d'hybridation seul (sans la cible correspondante). La SAPE diluée en 15 tampon de rinçage est ensuite ajoutée selon le protocole décrit ci-dessus (Il. A, d). Le cliché de microscopie de fluorescence confirme que dans les conditions opératoires testées, la SAPE ne s'adsorbe pas sur la surface du support. s d) Dénaturation de l'hybridation Sur un pore fonctionnalisé et ayant subi la procédure de révélation en fluorescence décrite précédemment, on effectue un rinçage avec une solution de NaOH à 0,2 M pendant 2 s puis un rinçage abondant à l'eau et un séchage à l'air comprimé. On observe ensuite le pore en io microscopie de fluorescence à la longueur d'onde habituelle et avec les mêmes paramètres de sensibilité de la caméra (luminosité, contraste). On observe la disparition de la fluorescence après dénaturation de l'hybridation. Cela montre la spécificité de l'émission de fluorescence observée dans le cas d'une hybridation complémentaire. 15 e) Fluorescence après réhybridation La fluorescence d'un pore ayant subi une dénaturation via l'ajout de NaOH (d) réapparaît après réhybridation des sondes ADN par leur cible complémentaire. La démarche expérimentale suivie pour cette deuxième hybridation et sa révélation en fluorescence est exactement la même que 20 celle précédemment décrite pour l'hybridation. EXEMPLE III : FONCTIONNALISATION PAR DE L'OXYDE D'IRIDIUM : i) Création d'un dépôt d'oxyde d'iridium Une solution d'oxalate d'iridium est préparée selon le 25 protocole suivant (décrit dans l'article de A. M. Marsouk, Analytical Chemistry, 2003, 75 : p.1258 et suivantes) : 75 mg d'IrCl4 monohydrate sont dissous dans 50 mL d'eau distillée ; sont ajoutés ensuite 0.5 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 %, 365 mg d'oxalate de potassium hydraté et du carbonate de potassium anhydre pour ajuster le pH à 10.5. Une agitation de 10 minutes 30 est requise entre chaque ajout de produit. La solution est ensuite chauffée à 90 °C pendant quelques minutes, jusqu'à atteindre une couleur finale bleu nuit caractéristique de la forme complexée de l'Iridium (IV). La solution peut ensuite être stockée plusieurs mois à 4°C. Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de 35 forme Rf = 1 et ayant subi un traitement plasma 02 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4). 16 La solution d'oxalate d'iridium est introduite successivement dans les deux compartiments. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaire et de référence du potentiostat et l'autre à l'électrode de travail. Un potentiel de 0.80 V ou 0.85 V ou 0.90 V est appliqué pendant une durée de 5 s ou 10 s. De la même manière que pour les dépôts de polypyrrole, le suivi du dépôt se fait par chronoampérométrie afin de vérifier le bon contact électrique au travers du pore. La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée 1c- à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4 °C. ii) Résultats L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie électronique à balayage (MEB). Les clichés qui ont été obtenus montrent qu'un dépôt est 15 créé sur les parois du pore et seulement à l'intérieur de celui-ci, la surface alentour restant parfaitement propre. Un pore témoin, n'ayant pas subi de fonctionnalisation, ne présente quant à lui aucun dépôt sur les parois internes du pore. Cela montre que le procédé de fonctionnalisation fonctionne également pour des entités électroactivables tels que ces oxydes métalliques. 20 La texture des différents dépôts obtenus paraît différente d'un pore à l'autre, ceci pouvant être possiblement expliqué par des degrés d'oxydation de l'iridium variables. Ainsi, les demi-réactions électrochimiques impliquées dans le cas des oxydes d'iridium sont les suivantes: lr(OH) + H2O Ir(OH)2 + H+ + e-(-0,1V) 25 lr(OH)2 + H2O lr(OH)3 + H+ + é (0,3 V) lr(OH)3 + H2O lr(OH)4 + H+ + e- (0,8 V) ou IrO2 + 2H2O + H+ + e- (divergence selon les publications) Etant donné l'aspect visuel hétérogène des dépôts observés 30 en MEB à l'intérieur des pores, il est possible que, selon les conditions expérimentales utilisées, on n'obtienne pas les mêmes degrés d'oxydation moyens de l'iridium dans le (ou les) oxyde(s) formé(s). EXEMPLE IV : OBTENTION D'OBJETS STRUCTURES PAR LA TECHNIQUE D'ELECTRODEPOT A DISTANCE : 35 i) Création d'un dépôt de polypyrrole : 17 Une membrane de polycarbonate, comportant des pores de taille nanométrique, peut être insérée indifféremment dans les montages a ou b. Des dépôts de copolymère pyrrole/pyrrole-couplé avec un oligonucléotide peuvent ensuite être obtenus à l'intérieur de ces pores en suivant le protocole précédemment décrit. ii) Détachement des dépôts formés de leur support : La membrane est ensuite rincée à l'eau et introduite dans un bain de dichlorométhane afin de dissoudre le polycarbonate et libérer en solution les objets créés à l'intérieur des pores. Les entités électroactivables io peuvent être aussi détachées sans dissolution de la membrane, par exemple sous l'action de vibrations créées par des ultrasons. Par filtrations successives, les objets d'intérêt sont ensuite isolés ; il s'agit de nanostructures de pyrrole porteuses de sondes ADN possédant la forme des pores de la membrane. 15 CONCLUSION : Le procédé technique de fonctionnalisation selon l'invention est efficace et relativement facile à mettre en pratique. La reproductibilité des dépôts est satisfaisante et peut être encore améliorée en contrôlant les paramètres de manipulation plus 20 strictement : distance inter- électrodes figée contrôle de température contrôle de l'hygrométrie Cette nouvelle technique, permet de contrôler de manière 25 efficace la localisation de la fonctionnalisation de la surface d'un pore par des groupements réactifs. En effet, cette dernière est pour l'essentiel liée à l'organisation des lignes de champ électrique au sein du pore, elle-même dépendante de la structure de l'environnement du pore (à savoir de sa géométrie). 30 Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être peu coûteux : - en termes financiers car seul un équipement réduit est nécessaire : potentiostats, électrodes... en termes de temps car la procédure de dépôt dure 35 seulement quelques minutes. Le dispositif expérimental est de plus peu encombrant et facilement transportable. La stratégie est adaptable à tout type de support poreux, de nature organique ou inorganique, conducteur, semi-conducteur ou isolant, 5 quelle que soit la dimension des pores. Pour mesurer si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore, un moyen est de contrôler si le contact électrique entre les deux électrodes est effectif, auquel cas le chronoampérogramme mesuré lors du dépôt (par exemple de polypyrrole) présente un signal en intensité non nul. io Pour caractériser la formation du dépôt par exemple de polypyrrole, il est possible d'utiliser la microscopie de fluorescence, voire même la microscopie de fluorescence confocale afin d'avoir un aperçu tri-dimensionnel de la fluorescence à l'intérieur de la cavité. La microscopie électronique à balayage peut également permettre, par exemple dans le cas 15 de dépôt d'oxyde d'iridium, de caractériser le dépôt formé. Les entités électroactivables, en particulier électropolymérisables (pyrroles, thiophènes...), pouvant être fonctionnalisées, cette technique est parfaitement transposable à l'immobilisation au sein de pores de groupements actifs intervenant dans des interactions d'énergie 20 faible comme les groupements ioniques, peptides, anticorps, enzymes, chélateurs d'ions par exemple. Le polymère peut également servir de � couche de départ � pour un dépôt localisé, en particulier en utilisant des anions dopants d'intérêt comme les polysaccharides (héparine par exemple favorisant l'adhésion de 25 cellules (Zhou et al. Reactive & Functional Polymers, 1999. 39: p. 19 et suivantes)) ou les surfactants. Des empilements de type � multi-couche � peuvent être envisagés à partir des dépôts obtenus par � électrodépôt à distance �. II est ainsi possible de préparer un dépôt localisé (première couche) présentant par 30 exemple une certaine charge de surface ou un groupement chimique réactif qui favorise la fixation d'une deuxième couche d'entités organiques ou inorganiques donnée par rapport au support vierge. La technique a permis expérimentalement la mise en oeuvre d'une immobilisation d'ADN, ce dernier étant une biomolécule présentant un 35 aspect modulaire, c'est-à-dire pouvant être utilisée comme élément de reconnaissance biomoléculaire pour l'immobilisation via une hybridation d'une molécule d'intérêt fonctionnalisée par des cibles ADN complémentaires. Le procédé a également permis d'immobiliser une entité d'intérêt biologique, la biotine, par hybridation avec des sondes ADN immobilisées avec une cible complémentaire biotinylée, ce qui souligne l'aspect modulaire de la technique. Le dispositif expérimental peut de plus intégrer des dispositifs thermiques et optiques permettant par exemple des expériences de réticulation ou encore une visualisation de l'organisation des dépôts réalisés. Plusieurs applications peuvent être envisagées dans le domaine des biocapteurs miniaturisés ultrasensibles. Des membranes ~o poreuses biofonctionnalisées peuvent trouver des applications dans le domaine de la santé, en particulier pour la détection de (bio)molécules présentes en petite quantité dans des échantillons biologiques. De nombreuses équipes de recherche ont ainsi orienté leurs travaux vers la conception de systèmes permettant la détection de molécules uniques. Ces 1s compteurs de Coulter moléculaires ont fourni des résultats encourageants avec des pores protéiques (Vercoutere, W. et collaborateurs, Nature Biotechnology, 2001. 19 : p. 248 ; Bayley and Cremer, Nature, 2001. 413: p. 226 et suivantes). L'avantage considérable des pores synthétiques par rapport à 20 ces derniers réside dans la possibilité de : - moduler leurs propriétés en créant des charges, des groupements réactifs en surface, - contrôler la géométrie (diamètre du pore, épaisseur de la membrane...), 25 - réaliser une intégration plus aisée dans un appareillage microfluidique. Le procédé convient également à des applications dans le domaine de la micro- ou nano-chromatographie (échange d'ions, exclusion stérique, chromatographie d'affinité ou d'adsorption) pour la purification de 30 (bio)molécules. Des pores fonctionnalisés peuvent également être utiles pour réaliser la capture de bactéries ou de cellules, notamment en immobilisant de l'héparine ou de la chondoitine à l'intérieur d'un pore. Les membranes poreuses fonctionnalisées trouvent 35 également classiquement des applications dans les systèmes de purification et de filtration (eau, effluents...), la présence de chélateurs ou d'échangeurs 20 d'ions à la surface des pores étant susceptible de permettre de séparer sélectivement certains composants du liquide passant au travers de la membrane. L'immobilisation de particules catalytiques, contenant par exemple des métaux tels que le palladium ou le platine dans des pores, par l'intermédiaire du procédé décrit, pourrait permettre la création de micro- voire nano-réacteurs pour réaliser des réactions chimiques comme les hydrogénations par exemple. Le fait de pouvoir paralléliser ces réactions en utilisant des réseaux de pores répartis dans une membrane permet de faire io de la micro/nano-chimie combinatoire. L'électrodépôt de métaux par cette technique peut trouver également des applications dans les domaines des pots catalytiques (catalyse en phase gazeuse). Le procédé est enfin compatible avec la mise en oeuvre de techniques d'impression moléculaire (� molecular imprint �), ce qui ouvre des is applications intéressantes dans le domaine de l'électrophorèse capillaire par exemple. On comprendra que la solution d'entités électroactivables pour laquelle on a mentionné ci-dessus la présence éventuelle de sondes ADN, peut de manière plus générale comporter optionnellement des ligands, 20 à savoir : - des éléments de reconnaissance moléculaire et/ou biomoléculaire notamment les nucléotides, oligonucléotides, polynucléotides, ADN, ARN, PNA, peptides, polypeptides, anticorps, antigènes, enzymes, protéines, acides aminés, glycopeptides, biotines, haptènes, sucres, 25 oligosaccharides, polysaccharides, lipides, glycolipides, stéroïdes, hormones, récepteurs. - d'autres groupements affins notamment les chélateurs d'ions et les échangeurs d'ions. - des fonctions chimiquement actives notamment les 30 fonctions amine, amide, oxy-amine, ester actif, alcool, acide carboxylique, alcyne, thiol, époxyde, anhydride, chlorure d'acyle, aldéhyde et leurs dérivés. - des objets uniques (dans le cadre d'une immobilisation individuelle ou collective d'objets) notamment des microparticules et nanoparticules. Les particules peuvent être et/ou contenir des cellules 35 biologiques et/ou des composants et/ou des produits cellulaires, notamment des lignées cellulaires et/ou des globules et/ou des liposomes et/ou des 21 noyaux cellulaires et/ou des chromosomes et/ou des brins d'ADN ou d'ARN et/ou des nucléotides et/ou des ribosomes et/ou des enzymes et/ou des anticorps et/ou des protides et/ou des protéines et/ou des peptides et/ou des principes actifs et/ou des parasites et/ou des bactéries et/ou des virus et/ou des pollens et/ou des polymères et/ou des facteurs biologiques et/ou des stimulants et/ou des inhibiteurs de croissance et/ou des billes en suspension dans un liquide, et/ou des bioparticules en suspension dans une solution, et/ou des molécules. Les particules manipulées peuvent être et/ou contenir des particules solides insolubles telles que des particules magnétiques et/ou lo des particules diélectriques, ou des particules conductrices, ou des particules fonctionnalisées, ou des pigments, ou des colorants, ou des cristaux de protéines, ou des poudres, ou des structures de polymères, ou des substances pharmaceutiques insolubles, ou des fibres, ou des fils, ou des nanotubes de carbone, ou des agrégats (clusters) de petite taille formés par 15 agglomération de colloïdes - des groupements o présentant des particularités surfaciques • en termes de pH, notamment les couples acides/bases faibles et les composés amphotères 20 et/ou en termes d'hydrophilie et/ou d' hydrophobie et/ou d'amphiphilie, • et/ou en termes de polarité, o et/ou présentant des interactions de faible énergie 25 notamment • liaisons hydrogène, • interactions de Van der Waals, • interactions ioniques notamment échange de protons • interactions électrostatiques, 30 • ponts salins notamment ceux formés par des ions divalents comme les ions calcium et magnesium entre les groupements chargés négativement o et/ou étant des surfactants. - des modifications de surface préparant une modification 35 ultérieure : la couche de fonctionnalisation déposée sur les parois du pore comporte par exemple des moyens d'interaction ou de réaction avec des 22 molécules et/ou biomolécules.11 s'agit notamment de groupements modulaires tels que l'ADN, photoactivables tels que la benzophénone, électroactivables tels que les entités électroactivables mentionnées ci-dessus, ou bien encore thermoactivables tels que les polymères thermodurcissables. On notera que le ligand doit être couplé à une entité électroactivable pour permettre la fonctionnalisation par le procédé selon la présente invention. Il n'est pas nécessaire qu'il y ait dans la solution à la fois des entités électroactivables et des entités électroactivables couplées à un lo ligand : il peut aussi y avoir seulement des entités électroactivables couplées à un ligand, ou bien seulement des entités électroactivables . REVENDICATIONS 1) Procédé de fonctionnalisation de la surface d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités 5 électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution de part et d'autre du pore, b) appliquer au moins un signal électrique entre les deux électrodes pour activer les entités électroactivables et réaliser ladite fonctionnalisation. io 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une itération de a) et b) avec une deuxième solution d'entités électroactivables. 3) Procédé selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le pore est ouvert à ses deux extrémités et en ce qu'une solution 15 est placée dans deux compartiments dans chacun desquels débouche une extrémité du pore, au moins une des deux solutions contenant lesdites entités électroactivables. 4) Procédé selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le pore présente une seule extrémité débouchante, en ce qu'une 20 des électrodes est placée au fond du pore et en ce que l'autre électrode est placée dans un compartiment en communication avec ladite extrémité débouchante du pore. 5) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après b, il comporte un rinçage. 25 6) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont des monomères électropolymérisables, notamment des polymères conducteurs pi-conjugués. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont choisies parmi les pyrroles, les thiophènes, les 30 indoles, les anilines, les azines, les phénylènevinylènes, les phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés; 8) Procédé selon une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les entités électroactivables sont porteuses de fonctions 35 électrogreffables, notamment de groupements diazonium. 24 9) Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont choisies parmi les métaux, les oxydes métalliques, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques. 10) Procédé selon une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont constituées par une peinture électrophorétique. 11) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution comporte des entités électroactivables io couplées à des ligands. 12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la solution d'entités électroactivables comporte un mélange d'entités électroactivables notamment un monomère électropolymérisable et desdites entités électroactivables couplées à des ligands. 15 13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ladite solution comporte du pyrrole couplé à une biomolécule. 14) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution d'entités électroactivables inclut des ions dopants d'intérêt, notamment l'héparine et/ou la .chondroitine. 20 15) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériau support est à base de silicium. 16) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le signal électrique est une différence de tension électrique, notamment comprise entre 100 mV et 10V. 25 17) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la différence de tension est appliquée pendant une durée comprise entre 10 ms et 100 s. 18) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en entités électroactivables est 30 comprise entre 1 nM et 500 mM . 19) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une étape de détachement des entités électroactivables du support. 20) Procédé selon une des revendications précédentes, 35 caractérisé en ce que le support présente au moins une région de fonctionnalisation évasée qui jouxte le pore et en prolonge la surface. 5 21) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les entités électroactivables comportent des molécules sondes et en ce qu'il comportent une étape d'association par reconnaissance, notamment par hybridation avec des molécules cibles complémentaires. 22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de dénaturation de ladite association par reconnaissance, éventuellement suivie d'une étape de nouvelle d'association par reconnaissance, notamment de réhybridation. 10