Brevet FR2925068A1 — publié le 20090619

PROCEDES DE PRODUCTION D'ACIDE SUCCINIQUE La présente invention concerne des procédés de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation en conditions anaérobies. L'acide succinique (ou acide butanedioïque) est un acide organique avec deux groupes carboxyles, de formule semi-développée COOH-CH2-CH2-COOH, qui intervient dans le métabolisme cellulaire, comme intermédiaire métabolique du cycle de Krebs dans la mitochondrie. Il trouve de nombreuses applications dans les domaines cosmétiques, agroalimentaires, pharmaceutiques, textiles et dans les plastiques. Ainsi il est par exemple utilisé comme intermédiaire de synthèse des plastiques pour la fabrication de 1,4 butanediol, de tétrahydrofuranne et de gammabutyrolactone. De nouveaux produits dérivés de l'acide succinique sont en constant développement, incluant le développement de polyesters. Généralement, les esters de l'acide succinique ont le potentiel d'être de nouveaux solvants "verts" qui peuvent substituer les solvants plus nuisibles pour l'homme et l'environnement. La production d'acides carboxyliques, tels que l'acide malique, l'acide succinique ou l'acide fumarique, à partir de matières premières renouvelables (en l'occurrence par le 20 biais des processus de fermentation) est connue de l'Homme du métier. Le succinate est un intermédiaire métabolique lors de la fermentation anaérobie par des bactéries produisant du propionate, mais ces procédés de fermentation résultent en la production de très faibles rendements et titres en acide succinique. Ces dernières années, beaucoup de microorganismes producteurs d'acide succinique ont 25 été isolés, comme par exemple les bactéries anaérobies du rumen, Bacteroides ruminicola et Bacteroides amylophilus. Toutefois, les organismes du Rumen sont très instables lors des procédés de fermentations, et ne sont donc pas utilisables de manière industrielle pour la production d'acide succinique. On sait depuis longtemps qu'un mélange de plusieurs acides, dont l'acide succinique est 30 produit à partir de la fermentation de E. coli en présence de glucose et de CO2 comme substrats carbonés, comme décrit par JL Stokes en 1949 � Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia cati � J. Bacteriol., 57: 147-158. Cependant, pour chaque mole de glucose fermentée, seule 0.3 à 0.4 Moles d'acide succinique sont produites. Des études ont donc été menées sur des bactéries, en particulier Escherichia cati, modifiées génétiquement de manière à inactiver les voies métaboliques consommant le NADH nécessaire à la fabrication de l'acide succinique et de manière à activer les voies métaboliques de production du succinate (sel de l'acide succinique). En effet, le chemin métabolique fermentaire qui permet la conversion de l'oxaloacétate en malate, puis fumarate et enfin succinate nécessite deux moles de NADH par mole de succinate produit. Le verrou métabolique majeur pour la production de succinate et donc la biodisponibilité cellulaire en NADH. Pour solutionner cette difficulté, le document US 7.223.567 décrit l'utilisation d'une souche Escherichia cati recombinante surproductrice de succinate pour la même quantité de NADH disponible. Cette souche Escherichia cati SBS550 MG pHL 413 présente une inactivation des produits des gènes adhE, ldhA (impliqués dans les voies consommatrices de NADH), et une inactivation des produits des gènes ack-pta et du gène iciR (activant la voie glyoxylate), et contient un vecteur plasmidique surexprimant un gène PYC exogène. L'article de Sanchez et al. (intitulé �Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia cati to increase succinate yield and productivity � in Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239), le brevet américain US 7 223 567 et la demande de brevet américain US 2005/0042736 ont développé de nouvelles conditions de culture et de production associées à cette souche pour améliorer ses rendements de production en acide succinique. L'homme du métier recherche constamment de nouveaux procédés améliorés de production d'acide succinique. En particulier, l'homme du métier cherche à optimiser le rendement et la productivité obtenus. Par ailleurs, les méthodes de fermentation classiques conduisent à d'importants rejets en dioxyde de carbone dans l'atmosphère, ce qui est bien évidemment peu désirable.30 Selon un aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation anaérobie d'une souche d'Escherichia coli, comprenant : (A)une étape de fermentation d'une source de carbone dans un fermenteur, avec apport de CO2, réalisée avec évents du fermenteur fermés de manière à ce que l'apport de CO2 soit asservi à la consommation de CO2 par la souche ; suivie, avant épuisement total de la source de carbone, d' (B) une étape de fermentation de la source de carbone restante, sans apport de CO2, de manière à consommer le CO2 résiduel. L'homme du métier est familier avec les techniques de fermentation (telles que notamment décrites dans Fermentation & Biochemical Engineering Handbook : principles, process design & equipment, 2nd ed 1996 de VOGEL Henry C. et TODARO Celeste L.). La fermentation est une réaction biochimique qui consiste généralement à libérer de l'énergie, ou à produire certains métabolites d'intérêt, à partir d'un substrat organique sous l'action d'enzymes microbiennes. La fermentation est généralement conduite dans des dispositifs (fermenteurs) adaptés au processus de fermentation, c'est-à-dire adaptés à la culture de microorganismes dans les conditions voulues (dispositifs permettant le cas échéant de contrôler les équilibres gazeux du milieu de culture, notamment par des conduits d'entrée et/ou de sortie en gaz, évents, etc ; dispositifs permettant l'introduction de milieu de culture et autres substances ; dispositifs permettant de contrôler, réguler, modifier d'autres types de paramètres, tels que l'agitation, la température, le pH, etc). L'homme du métier est également familier avec la fermentation en conditions anaérobies. Selon la présente invention, ceci désigne des conditions de culture en l'absence d'oxygène. De manière préférée, des conditions de culture anaérobies sont des conditions de culture en présence de dioxyde de carbone. Selon un mode de réalisation, les conditions de fermentation anaérobies en présence de CO2 et/ou avec apport de CO2 sont des conditions de fermentation en saturation de CO2. Par � avant épuisement total de la source de carbone � lors de l'étape (A), on entend un instant de l'étape (A) où le milieu de fermentation contient une quantité résiduelle en source de carbone pouvant être intégralement transformée par la souche en acide succinique et/ou succinate grâce au CO2 disponible en solution à cet instant (sous forme de CO2 dissous ou de HCO3'). Lors de l'étape (A), le(s) évent(s) du fermenteur étant fermé(s) et l'alimentation en CO2 du fermenteur étant maintenue, l'apport de CO2 est réalisé de manière discontinue, automatiquement ajusté en fonction de la consommation du CO2 par la souche pour la production d'acide succinique et/ou succinate. Par � automatiquement ajustée �, on entend, compte tenu de l'équilibre thermodynamique entre la phase liquide (milieu de fermentation) et la phase gazeuse (� atmosphère �) présentes dans le fermenteur (évent(s) fermé(s)), qu'un apport d'une quantité donnée de CO2 ne peut intervenir que suite à la consommation d'une quantité équivalente par la souche par fermentation (et donc la production concomitante d'acide succinique et/ou succinate). Lors de l'étape (B), il n'y a pas d'apport de CO2, ce qui signifie que l'apport en CO2 réalisée lors de l'étape (A) est interrompu. Ceci peut notamment être réalisé par coupure de l'alimentation en CO2. Avantageusement selon l'invention, la fermentation lors de l'étape (B) consomme le CO2 (résiduel dissous) et les ions HCO3' présents dans le milieu de fermentation. Selon un mode préféré de réalisation, avant le début de l'étape (A), l'apport de CO2 est réalisé par injection, avec évents du fermenteur ouverts, de manière à atteindre la saturation du milieu de fermentation en CO2 A titre d'exemple, le CO2 peut être introduit par injection à un débit de 0,15-0,40 vvm (volume de CO2 par volume de culture par minute), de préférence 0,3 vvm. Par � milieu de fermentation saturé en CO2 �, on entend le fait que le milieu de culture contient la quantité maximale en CO2 qui peut y être dissous dans les conditions correspondantes (température, pH, etc). Par exemple ceci peut correspondre à une concentration de 1-2 g/L, par exemple de l'ordre de 1, 5 g/L à 37°C, pH 7. Selon un mode de réalisation, l'étape (A) et/ou l'étape (B) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,0, de préférence 6,4-6,8, de préférence 6,5-6,6. Selon un mode de réalisation, la source de carbone est le glucose. Selon un mode de réalisation, au début de l'étape (A), le milieu de fermentation comprend 15-40 g/L, de préférence 15-25 g/L, de préférence 15-20 g/L de glucose. Selon un mode de réalisation, au début de l'étape (B), le milieu de fermentation comprend 2-6 g/L, de préférence environ 4 g/L de glucose. Selon un mode de réalisation préféré, la souche d'Escherichia Coli est une souche qui possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC. Ce génotype permet avantageusement de favoriser la production d'acide succinique par fermentation en présence de CO2. Le symbole A indique que le gène en question a été inactivé, par exemple par mutation, délétion, interruption, insertion, ou � clown �-régulation, par exemple par introduction d'un codon stop, insertion ou délétion résultant en un changement du cadre de lecture, mutation ponctuelle, etc. Le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC correspond donc â : - AadhE : inactivation de l'alcool déshydrogénase ; - AldhA : inactivation de la lactate déshydrogénase ; - AiclR : inactivation de l'isocitrate lyase (également connue sous le nom de aceA) - Aackpta : inactivation de l'acétate kinase-phosphotransacétylase ; - PYC : expression d'un gène de pyruvate carboxylase. Ceci indique que la souche exprime le gène PYC, par exemple grâce à une transformation par un plasmide portant un exemplaire fonctionnel de ce gène, ou par intégration génomique d'un exemplaire fonctionnel de PYC. Le gène PYC est avantageusement le gène pyc de Lactococcus lactis. Selon un mode de réalisation très préféré, la souche d'Escherichia Coli est la souche SBS550MG ù pHL413. Cette souche est décrite dans Sanchez et al., Metabolic Engineering, 7 (2005) 229-239, et dans les documents US 7,223,567 et US 2005/0042736. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'acide succinique, comprenant : (i) une étape de production de succinate de magnésium par fermentation en conditions anaérobies d'une souche d'Escherichia Coli en présence de CO2, lors de laquelle le pH est régulé par ajout, dans le milieu de fermentation, d'un composé de magnésium, et (ii) une étape de conversion du succinate de magnésium formé à l'étape (i) en acide succinique. Par �réguler le pH �, on entend selon la présente invention, l'action de maintenir la valeur du pH du milieu de culture dans un certain intervalle ou sélection de valeurs. Selon l'invention, le pH peut être régulé de différentes façons : - régulation dans un intervalle : la valeur du pH est maintenue dans un certain intervalle de valeurs. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois sortir de l'intervalle considéré ; - régulation �point bas � : la valeur du pH est maintenue au dessus d'une valeur seuil. La valeur du pH peut alors varier au cours du temps, sans toutefois descendre en deçà de la valeur seuil ; - régulation à une valeur unique : la valeur du pH est maintenue à cette valeur de manière constante au cours du temps. Par � ajout d'un composé �, on entend l'introduction du composé dans le milieu de culture. L'ajout peut se faire selon différentes modalités : ajout d'une suspension et/ou ajout d'une solution et/ou ajout d'un solide (par exemple sous forme de poudre). Selon un mode de réalisation, le composé de magnésium de l'étape (i) est choisi parmi l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de magnésium, et le carbonate de magnésium. De préférence, il s'agit de l'oxyde de magnésium (magnésie, de formule MgO). L'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de magnésium ou le carbonate de magnésium peuvent être ajoutés sous forme de poudre ou sous forme de suspension, typiquement de suspension aqueuse, par exemple à des concentrations de 20 % à 30 % p/v. Selon un mode de réalisation, l'étape (i) se déroule à un pH dans l'intervalle 6,0-7,0, de préférence 6,4-6,8, de préférence 6,5-6,6. Selon un mode de réalisation, les étapes (i) et (ii) sont réalisées dans un milieu contenant la source de carbone utilisée, typiquement du glucose, et notamment à des concentrations de 10-30 g/L, par exemple 20 g/L. Selon un mode de réalisation, l'étape (ii) comprend une acidification. Cette acidification peut être réalisée de différentes manières. Selon un mode de réalisation, l'acidification est réalisée par ajout d'au moins un acide choisi parmi l'acide orthophosphorique, l'acide oxalique, et l'acide sulfurique. Ces acides peuvent être ajoutés purs ou sous forme de solutions aqueuses concentrées. Selon un autre mode de réalisation, l'étape (ii) comprend : (ii-a) une étape de conversion du succinate de magnésium formé à l'étape (i) en succinate de sodium, et (ii-b) une étape de conversion, par électrodialyse bipolaire, du succinate de sodium formé à l'étape (ii-a) en acide succinique. L'étape (ii-a) peut typiquement être réalisée par ajout de carbonate de sodium. Le carbonate peut être ajouté sous forme de solution ou de poudre, typiquement de solution aqueuse, par exemple à des concentrations de 1 à 2 M. Le carbonate de magnésium, insoluble, précipite. Le carbonate de magnésium peut être traité dans un four à haute température, par exemple un four â > 700°C. Il en résulte du MgO et du CO2, dont l'un au moins peut être recyclé. Le carbonate de magnésium peut être alternativement valorisé en tant que tel. Le succinate de sodium peut avantageusement être traité par électrodialyse bipolaire (ce qui n'est pas le cas du succinate de magnésium), donnant de la soude et de l'acide succinique, qui peut être cristallisé. La technique d'électrodialyse bipolaire est par ailleurs bien connue de l'homme du métier. La soude produite peut le cas échéant être reconvertie, avec le CO2 précédemment émis du four haute température, pour former du carbonate de sodium. L'ensemble des étapes est représenté à la Figure 3. Selon un mode de réalisation préféré, la souche d'Escherichia coli est une souche qui possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC. Selon un mode de réalisation très préféré, la souche d'Escherichia Coli est la souche SBS550MG û pHL413. Cette souche est décrite dans Sanchez et al., Metabolic Engineering, 7 (2005) 229-239, et dans les documents US 7,223,567 et US 2005/0042736. Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé d'obtention d'acide succinique comprenant : - un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate choisi parmi ceux décrits ci-dessus ; - une étape d'acidification des ions succinate en acide succinique par exemple par ajout d'acide fort dans le moût, - optionnellement une étape de purification de l'acide succinique ; et - une étape de cristallisation de l'acide succinique. Selon un mode de réalisation, dans tous les procédés décrits ci-dessus, l'étape de purification comprend une purification éthanolique qui se déroule comme suit : - filtration (élimination d'un précipité protéique), par exemple sur Büchner et/ou sur terre de filtration du mout acidifié, -optionnellement, concentration du filtrat par évaporation sous vide (de préférence, suivant un facteur de concentration entre environ 2 et 8), -ajout d'éthanol, par exemple de l'éthanol 95%, dans un rapport 1/1 à 5/1, pour provoquer la précipitation des sels (l'acide succinique reste soluble), - séparation du précipité salin par filtration, par exemple sur une membrane, - récupération de l'éthanol par évaporation sous vide, -traitement sur charbon actif, puis filtration sur plaque et terre de filtration, La Figure 1 illustre les performances en production d'acide succinique par fermentation anaérobie en fonction du composé utilisé pour réguler le pH. La Figure 2 compare les cinétiques de production selon que MgO ou NaOH est utilisé 20 pour réguler le pH. La Figure 3 représente un mode de réalisation pour la production d'acide succinique : conversion de succinate de magnésium en acide succinique par ajout de carbonate de sodium. L'invention est illustrée par les exemples de réalisation ci-dessous, qui sont non- 25 limitatifs. Exemples Exemple 1 : Production d'acide succinique par fermentation anaérobie selon deux modes différents d'apport du CO2 avec évent du fermenteur ouvert ou fermé 30 Le procédé de production d'acide succinique comprend : - une phase de préculture en Erlenmeyer, - une phase de culture en conditions aérobies dans un milieu de culture comprenant du corn steep comme source d'azote et du glucose comme source de carbone, cette phase permettant la production de biomasse, et - une phase anaérobie permettant la production proprement dite en acide succinique. Les phases en conditions aérobie et anaérobie sont réalisées dans un même fermenteur. La souche utilisée est la souche SBS550MG-pHL413. Phase aérobie : La souche SBS550MG-pHL413 est précultivée en Erlenmeyer pendant 17h à 37°C, sous agitation à 125 rpm. 400 ml de milieu sont inoculés par la souche dans un Erlenmeyer de 2 litres à 2 chicanes. La composition de ce milieu de préculture est la suivante : tryptone 10g/L extrait de levure 5g/L NaCl 10 g/L Antibiotiques (ampicilline, carbenicilline, oxacilline) 67 mg/L La souche ainsi précultivée est placée dans un fermenteur de 15L dans un milieu de culture dont la composition est la suivante : Glucose : 2 g/L départ + 2 g/L lorsque les premiers 2g/L sont consommés Corn steep : 60 g/L Sels et g/L antibiotiques : (NH4)2SO4 0,25 K2HPO4 0,7 KH2PO4 1,2 KC1 2 CaCl2 0,2 MgSO4 0,25 Ampicilline 0,067 Biotine 0.001 Thiamine 0.001 L'inoculum obtenu par préculture en Erlenmeyer représente 3% du volume total du milieu cultivé dans le fermenteur. Les conditions de culture lors de la phase aérobie sont une température de 37°C, une agitation de 500 rpm, une aération de 1 vvm et pas de régulation de pH (le pH est simplement ajusté à 7,5 avant stérilisation du milieu). Phase anaérobie : o Protocole avec apport continu de CO2 - On ajoute dans le milieu : glucose : 20 g/L départ + 15 g/L à 24h + 4 g/L à 50h. - La fermentation est réalisée à pH 6,4 avec une injection continue de CO2 à un débit de 0.3 vvm (L/L/min), à 37°C, évent du fermenteur ouvert, sous agitation 250 rpm. - Elle se termine en 63,5 h avec un titre final en acide succinique de 30 g/L dans le milieu de culture. - La quantité globale de CO2 consommée s'établit à (0,3 vvm x 60 min x 63,5 h / 22,4 mo1/L x 44 g/mol) 2245 g/L, soit 73 g/g d'acide succinique formé. - Par ailleurs, une concentration de 2 g/L d'HCO3- (correspondant à 1,5 g/L de CO2) est présente en fin de fermentation dans le milieu de culture. o Protocole selon l'invention Le protocole de fermentation est identique à celui ci-dessus, excepté que - au début de la phase anaérobie, du CO2 est introduit dans le fermenteur à un débit de 0.3 vvm pendant 1 minute de façon à chasser l'air résiduel issu de la phase aérobie, - la pression du réseau de CO2 est réduite à 0,4 bar, - l'évent du fermenteur est fermé hermétiquement de façon à empêcher la sortie du CO2, - ainsi, l'injection de CO2 est précisément ajustée à sa consommation tout au long de la fermentation, - l'injection de CO2 est coupée lorsque la concentration résiduelle en glucose atteint 4 g/L de façon à consommer l'HCO3- résiduel dissous dans le milieu.30 Résultats selon l'invention - concentration finale en acide succinique produit dans le milieu de culture en fin de fermentation : 30 g/L, ce qui est identique à la concentration obtenue avec apport continu en CO2. - concentration de HCO3' résiduel dans le milieu de culture en fin de fermentation : 0,3 g/L (ce qui représente une réduction de 85% par rapport à la concentration obtenue avec apport continu en CO2). - consommation de CO2 : 0,59 g/1 au départ + 6 g/1 fixé sur le succinique, soit 0,2 g / g d'acide (ce qui représente une réduction de 99,7% par rapport à la concentration obtenue avec apport continu en CO2) Ainsi, avantageusement selon l'invention, tout en maintenant le rendement de production d'acide succinique, on évite d'importants rejets en dioxyde de carbone : - le fait de travailler en réacteur clos limite naturellement les rejets, et - par ailleurs, on observe une diminution de la concentration en HCO3' résiduel dans le milieu de culture en fin de fermentation. Or, l'acidification de l'HCO3- résiduel dans le milieu de culture en fin de fermentation conduit à un dégagement de CO2. Exemple 2 : Production d'acide succinique par fermentation anaérobie avec un milieu minéral et régulation du pH avec différents composés, dont un à base de 20 magnésium La souche utilisée est la souche SBS550MG ù pHL413. Lors de la phase de fermentation en conditions anaérobies, le pH est régulé à une valeur de 6,75 en utilisant différents composés : NaOH, NH3, KOH, CaO, ou MgO. Le schéma du protocole est le suivant : 25 - Pré culture en Erlenmeyer ; - Subculture en fermenteur ; - Production en fermenteur : 2 phases : o Phase aérobie : production de biomasse, o Phase anaérobie : production d'acide succinique en présence de CO2. 30 Chaque étape est détaillée ci-dessous : Préculture en Erlenmeyer Milieu g/L Tryptone 10 Extrait de levure 5 NaCl 10 KH2PO4 3 Na2HPO4 6 NH4C1 1 MgSO4, 7H20 0,25 NaCl 0,5 antibiotiques 67 mg/L (ampicilline, carbenicilline, oxacilline) -incubation à 37°C pendant 20 h. Production en fermenteur : 2 phases Phase aérobie : production de biomasse Milieu Glucose : 10 g/L départ + 10 g/L quand les premiers 10 g/L sont consommés Sels : g/L (NH4)2HPO4 6 K2HPO4 0,5 K2SO4 1 KC1 2 MgSO4, 7H20 2 - Oligo Eléments (0E) et vitamines : idem subculture - Inoculum 13% ; - 37°C, agitation : 450 rpm, aération : 1 vvm ; - Régulation pH à 6,75 par ajout de NaOH 5N, respectivement NH3 28 % p/v, respectivement KOH 5N, respectivement CaO 20 % p/v, respectivement MgO 20 % p/v. Phase anaérobie : production succinique avec apport de CO2 - ajout de glucose 20 g/L ; - injection CO2 à 0,2 vvm ; - 37°C, agitation 250 rpm ; -Régulation pH à 6,75 par ajout de NaOH 5N, respectivement NH3 28 % p/v, respectivement KOH 5N, respectivement CaO 20 % p/v, respectivement MgO 20 % p/v. Pour chaque protocole, la quantité d'acide succinique produit est mesurée par HPLC. Les résultats sont représentés en Figure 1, avec les productivités et les rendements obtenus sur des phases de production courtes correspondant à la consommation de 20 g/L de glucose. De façon surprenante et avantageuse selon l'invention, pour la régulation du pH lors de la fermentation anaérobie, l'utilisation de MgO donne de loin les meilleures performances avec un rendement supérieur à 100% et une productivité volumique 2,5 fois supérieure à celle obtenue avec la plus efficace des autres bases (NaOH). Le tableau ci-dessous complète la comparaison en montrant que l'utilisation de MgO donne en outre le meilleur rendement de production de biomasse, et la plus faible synthèse de co-produit. Rendement Productivité Rendement Productivité Co- Biomasse volumique Acide spécifique produits Acide Succinique Acide Succinique Succinique Y x/g PV sa Y sa/g PS sa Acides malique + pyruvique % glucose g/L/h % glucose g/g/h % aérobie anaérobie anaérobie anaérobie succinique NaOH 25 0,9 91 0,24 26 NH3 29 0, 8 62 0,20 22 KOH 25 0,5 72 0,16 48 CaO 32 0,3 68 0,12 50 MgO 35 2,3 103 0, 48 21 sa = acide succinique Cinétique de production : comparaison de la régulation du pH par ajout de MgO et par ajout de NaOH La Figure 2 compare l'évolution du titre en acide succinique obtenu en prolongeant les phases de production en présence de soude ou de magnésie. Cette comparaison révèle un autre avantage inattendu de l'utilisation de MgO : le faible ralentissement de la cinétique au cours de l'accumulation de l'acide succinique. Avantageusement, l'utilisation de MgO permet d'accroître la productivité et la vitesse de production d'acide succinique par rapport à l'utilisation de NaOH. En outre, l'utilisation de MgO permet d'atteindre des concentrations (titres) en acide succinique supérieures à 50 g/L. Exemple 3 : Obtention d'acide succinique par fermentation anaérobie et acidification La souche utilisée est la souche SBS550MG û pHL413. Le procédé de production 5 d'acide succinique de l'Exemple 1 (avec MgO comme agent de régulation du pH) est suivi d'une étape d'acidification par ajout de différents acides : Acide ortho phosphorique : Purification par formation et précipitation de magnésium phosphate tribasique (très insoluble). On ajoute 1 mole d' H3PO4 pour 1 mole de succinique en phase aqueuse. Ceci conduit à la formation de magnésium 10 phosphate monobasique très soluble. - Acide oxalique : Purification par formation et précipitation d'oxalate de magnésium très insoluble. Il n'y a pas de perte d'acide succinique. On obtient rapidement l'acide succinique débarrassé de son contre-ion. 15 Exemple 4: Obtention d'acide succinique par fermentation anaérobie et conversion en succinate de sodium La souche utilisée est la souche SBS550MG û pHL413. Le procédé de production d'acide succinique de l'Exemple 1 (avec MgO comme agent de régulation du pH) est suivi d'une étape de formation de carbonate de magnésium et de succinate de sodium, 20 par ajout de carbonate de sodium. Le carbonate de magnésium, insoluble, précipite. Il n'y a pas de pertes d'acide succinique. Le carbonate de magnésium peut être traité dans un four à haute température, par exemple un four â > 700°C. Il en résulte du MgO et du CO2, dont l'un au moins peut être recyclé. Le carbonate de magnésium peut ensuite avantageusement 25 être valorisé. Le succinate de sodium peut être traité par électrolyse bipolaire, donnant de la soude et de l'acide succinique, qui peut être cristallisé. Cette soude peut être reconvertie, avec le CO2 précédemment émis du four haute température, pour former du carbonate de sodium. 30 L'ensemble des étapes est représenté à la Figure 3. Exemple 5 : Obtention d'acide succinique par fermentation anaérobie, purification éthanolique et cristallisation Le procédé de production d'acide succinique de l'Exemple 1 (avec NaOH comme agent de régulation du pH) est suivi d'une étape de purification éthanolique comme décrit ci-dessous : - centrifugation du milieu de fermentation (moût) (5000g, 15', 20°C) (élimination de la biomasse), - ajout d'acide sulfurique 95% au surnageant jusqu'à obtention d'un pH 1,5, - filtration du moût sur Büchner avec plaque SEITZ EK et terre de filtration FW20 (élimination d'un précipité protéique), - concentration du filtrat par évaporation sous vide (facteur de concentration oscille entre environ 2 et 8), - ajout d'éthanol 95%, 2 volumes d'éthanol pour 1 volume du filtrat concentré pour provoquer la précipitation des sels (l'acide succinique reste soluble), - séparation du précipité salin par filtration sur une membrane millipore 3 microns, -récupération de l'éthanol par évaporation sous vide, - traitement charbon actif (2%/sec de PUREFLOW C - 80°C - 1 heure) puis filtration sur plaque SEITZ EK et terre de filtration FW20, - évapocristallisation (Tp bain marie 75°c - Pression résiduelle 60 mbars - MS masse cuite environ 50%), -refroidissement de la masse cuite sous agitation à 20°C, - séparation des cristaux par filtration sur une membrane millipore 3 microns, - clairçage des cristaux avec de l'eau déminéralisée, - séchage des cristaux une nuit à 60°c sous vide.25 Revendications 1 Procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate par fermentation en conditions anaérobies d'une souche d'Escherichia coli, comprenant : (A) une étape de fermentation d'une source de carbone dans un fermenteur, avec apport de CO2, réalisée avec évents du fermenteur fermés de manière à ce que l'apport de CO2 soit asservi à la consommation de CO2 par la souche ; suivie, avant épuisement total de la source de carbone, d' (B) une étape de fermentation de la source de carbone restante, sans apport de CO2 , de manière à consommer le CO2 résiduel. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, au début de l'étape (A), le milieu de fermentation est saturé en CO2. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-2 dans lequel l'étape (A) et/ou l'étape (B) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,0, de préférence 6,4-6,8. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-3, dans lequel la source de carbone est le glucose, et dans lequel : - au début de l'étape (A), le milieu de fermentation comprend 15-40 g/L de glucose, et - au début de l'étape (B), le milieu de fermentation comprend 2-6 g/L de glucose. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-4, dans lequel la souche d'Escherichia Coli possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC ; de préférence la souche d'Escherichia coli est la souche SBS550MG ù pHL413. 6. Procédé d'obtention d'acide succinique, comprenant : un procédé de production d'acide succinique et/ou d'ions succinate selon l'une quelconque des revendications 1-5 ; - le cas échéant, une acidification des ions succinate en acide succinique ; - une étape de purification de l'acide succinique, de préférence une purification éthanolique ; et -optionnellement, une étape de cristallisation de l'acide succinique. 7. Procédé de production d'acide succinique, comprenant : (i) une étape de production de succinate de magnésium par fermentation en conditions anaérobies d'une souche d'Escherichia coli en présence de CO2, lors de laquelle le pH est régulé par ajout, dans le milieu de fermentation, d'un composé de magnésium, et (ii) une étape de conversion du succinate de magnésium formé à l'étape (i) en acide succinique. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel à l'étape (i), le composé de magnésium est choisi parmi l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de magnésium, et le carbonate de magnésium. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7-8, dans lequel l'étape (i) se déroule à un pH dans un intervalle de 6,0-7,0, de préférence 6,4-6,8. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8-9 dans lequel l'étape (ii) 25 comprend une acidification. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel l'acidification est réalisée par ajout d'au moins un acide choisi parmi l'acide ortho-phosphorique, l'acide oxalique, l'acide sulfurique. 30FR 07 59827 19 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7-9, dans lequel l'étape (ii) comprend : (ii-a) une étape de conversion du succinate de magnésium formé à l'étape (i) en succinate de sodium, et (ii-b) une étape de conversion, par électrodialyse bipolaire, du succinate de sodium formé à l'étape (ii-a) en acide succinique. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7-12, dans lequel la souche d'Escherichia coli possède le génotype AadhE AldhA AiclR Aackpta PYC, de préférence la souche d'Escherichia col/ est la souche SBS550MG ù pHL413. 14. Procédé d'obtention d'acide succinique, comprenant : un procédé de production d'acide succinique selon l'une quelconque des revendications 7-13 ; - une étape de purification de l'acide succinique, de préférence une purification éthanolique ; et - optionnellement, une étape de cristallisation de l'acide succinique.