Brevet FR2928659A1 — publié le 20090918

Le cancer du testicule représente 1 à 2% des cancers chez l'homme, et 3,5% des tumeurs urologiques. C'est la tumeur la plus fréquente chez l'homme jeune, rare avant 15 ans et après 50 ans. Le risque est plus élevé chez les patients séropositifs pour le virus HIV. Le séminome est la forme la plus fréquente du cancer du testicule (40%), mais de nombreux autres types de cancer existent parmi lesquels le carcinome embryonnaire (20%), le tératocarcinome (30%) et le choriocarcinome (1%). Le diagnostic du cancer du testicule est d'abord clinique : il se présente souvent sous la forme d'une tuméfaction dure et irrégulière du testicule. L'échographie confirme la tumeur intra-testiculaire et l'échographie Doppler met en évidence l'augmentation de la vascularisation dans la tumeur. Dans certains cas, un examen par résonance magnétique (IRM testiculaire) peut être utile. Un scanner thoracique, abdominal et pelvien permet de rechercher une extension ganglionnaire du cancer. Un prélèvement sanguin pour le dosage des marqueurs tumoraux est quasi-systématique. Il permet d'orienter le diagnostic du type de tumeur. Deux marqueurs tumoraux principaux sont utilisés et dosés dans le sang : la (3-HCG et l'a-foetoprotéine. Mais ces marqueurs ne sont pas très spécifiques et de plus leur concentration à des niveaux physiologiques ne signifie pas une absence de tumeur. A ce jour, le diagnostic et le pronostic finaux sont posés après l'ablation du testicule atteint (orchidectomie) qui constitue le premier stade du traitement. Ensuite, en fonction du type de cancer et de son stade, un traitement complémentaire par radiothérapie ou chimiothérapie est appliqué. Il existe donc un réel besoin de pouvoir disposer de marqueurs spécifiques du cancer du testicule qui, de plus, permettent d'établir un diagnostic et un pronostic les plus précoces possible. L'événement rare que représente l'infection d'une cellule de la lignée germinale par un provirus exogène conduit à l'intégration dans le génome de l'hôte d'un ADN proviral ou provirus, celui-ci devenant partie intégrante du patrimoine génétique de l'hôte. Ce provirus endogène (HERV) est donc transmissible à la génération suivante de façon mendélienne. On estime qu'il existe environ une centaine de familles HERV représentant environ 8% du génome humain. Chacune des familles compte de quelques dizaines à des milliers de loci, qui sont le résultat de rétrotranspositions intracellulaires de copies transcriptionnellement actives. Les loci des familles HERV contemporaines sont tous sont défectifs pour la réplication, ce qui signifie la perte des propriétés infectieuses et implique donc un mode de transmission exclusivement vertical (mendélien). L'expression des HERV a été particulièrement étudiée dans trois contextes spécifiques, la placentation, l'auto-immunité et le cancer, qui sont associés à la différentiation cellulaire ou à la modulation de l'immunité. Il a ainsi été montré que la glycoprotéine d'enveloppe du locus ERVWEI de la famille HERV-W est impliquée dans le processus de fusion aboutissant à la formation du syncytiotrophoblaste. Il a par ailleurs été suggéré que la protéine Rec, variant d'épissage du gène env de HERV-K, pourrait avoir une implication dans le processus de tumorigenèse testiculaire. Cependant, il n'a pas encore été répondu à la question suivante : les HERV sont-ils des acteurs ou des marqueurs dans des contextes pathologiques ? Les présents inventeurs ont maintenant découvert et démontré que des séquences d'acides nucléiques, appartenant à des loci de la famille HERV-W, sont associées au cancer du testicule et que ces séquences sont des marqueurs moléculaires de la pathologie. Les séquences identifiées sont des séquences de promoteurs rétroviraux U3 de LTRs 5' (LTR ou � Long Terminal Repeat � selon la terminologie anglo-saxonne) qui sont hypométhylées dans un échantillon biologique cancéreux. Chez les mammifères l'ADN peut être méthylé au niveau des cytosines précédant une guanine (doublet CpG). Il s'agit du transfert d'un groupement méthyle du S-adénosyl méthionine à un résidu cytosine pour former du 5-méthylcytosine. La méthylation des doublets CpG situés dans une séquence promotrice, conduit généralement à une sous expression, voire à une absence d'expression, du gène associé. A contrario, si les doublets CpG contenus dans une séquence promotrice sont hypométhylés, l'expression du gène associé est favorisée. Le rôle de la méthylation dans la carcinogenèse a été récemment étudié. Ainsi, une hyperméthylation, au niveau de doublets CpG peut conduire à la sous expression de gène suppresseur de tumeur, alors qu'au contraire une hypométhylation de doublets CpG peut provoquer l'activation de proto-oncogènes. La présente invention a donc pour objet un procédé pour le diagnostic ou le pronostic, in vitro, du cancer du testicule dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'un cancer du testicule, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence ou de l'absence de méthylation de dinucléotides CpG dans au moins une séquence cible d'ADN génomique de l'échantillon, la séquence cible étant choisie parmi au moins une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 ou parmi au moins une séquence qui présente au moins 99% d'identité, de préférence au moins 99,5% d'identité et avantageusement au moins 99,6% d'identité avec une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 et leurs séquences complémentaires. Le pourcentage d'identité décrit ci-dessus a été déterminé en prenant en considération la diversité nucléotidique dans le génome. Il est connu que la variabilité nucléotidique est plus élevée dans les régions du génome riches en séquences répétées que dans les régions ne contenant pas de séquences répétées. A titre d'exemple, Nickerson D. A. et al.,[1] ont montré une diversité d'environ 0,3% (0,32%) dans des régions contenant des séquences répétées. Les séquences SEQ ID NOs : 1 à 6 correspondent respectivement aux séquences des promoteurs rétroviraux U3 des loci HW4TT, HW2TT, HW13TT, HWXTT, HW21TT, ERVWEI et la SEQ ID NO : 7 correspond à la séquence de l'activateur plus la séquence de la région U3 de ERVWEI. L'échantillon du patient comprendra généralement des cellules (telles que les cellules testiculaires). Elles peuvent être présentes dans un échantillon de tissu (tel que le tissu testiculaire) ou être trouvées dans la circulation. En général, l'échantillon est un extrait tissulaire de testicule ou un fluide biologique, tel que le sang, le sérum, le plasma, l'urine, ou encore le liquide séminal. Plus particulièrement le procédé comprend : (i) une extraction de l'ADN génomique à analyser dans l'échantillon, (ii) un traitement de l'ADN génomique extrait avec un ou plusieurs réactifs pour convertir les bases cytosine, des dinucléotides CpG, non méthylées en position 5 en uracile, (iii) au moins une amplification de l'ADN traité par mise en contact avec au moins deux amorces, (iv) la détermination, sur la base de la présence ou de l'absence de méthylation des cytosines des dinucléotides CpG, d'un état de méthylation de ladite séquence cible ou d'une valeur qui reflète l'état de méthylation de la séquence cible, par exemple le rapport nombre de cytosines méthylées des dinucléotides CpG / nombre total de cytosines des dinucléotides CpG. En particulier si le rapport, correspondant à un pourcentage de méthylation, est inférieur ou égal à 80%, de préférence inférieur ou égal à 60% et avantageusement inférieur ou égal à 30%, ceci peut être corrélé avec une présomption de cancer du testicule. Si nécessaire le procédé comprend une deuxième étape d'amplification après l'étape d'amplification décrite en (iii) qui consiste à mettre en contact les amplicons obtenus en (iii) avec au moins deux amorces pour amplifier la séquence cible. Par séquence cible on entend une séquence ou les séquences d'un ensemble de clones. La détermination, dans l'ADN, du taux de méthylation est effectuée par toute technique appropriée. L'état ou statut de méthylation d'une séquence ADN peut être établi par des méthodes utilisant des enzymes de restriction sensibles à la méthylation ou par des méthodes impliquant une modification chimique de l'ADN par le bisulfite de sodium, le sulfite d'hydrogène ou le disulfite, de préférence par une solution de bisulfite de sodium qui convertit les cytosines non méthylées en uraciles tout en ne modifiant pas les 5-méthylcytosines. L'analyse de la méthylation peut être effectuée par des méthodes classiques, telles que le séquençage, l'hybridation ou la PCR. Plusieurs méthodes d'analyse utilisent la technique de conversion au bisulfite d'ammonium, telles que la � Bisulfite sequencing PCR � (conversion au bisulfite d'ammonium, amplification de la séquence d'intérêt et séquençage), la � MSP � (� Methylation Specific PCR �, PCR spécifique de la méthylation) et la � MSO � (� Methylation Specific Oligonucleotide Microarray �) utilisant des puces ADN spécifiques pour l'ADN modifié. Toutes ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer pour illustration Cottrell S. E. [21. Ainsi, dans l'étape (ii) du procédé précité le traitement de l'ADN génomique comprend l'utilisation d'une solution choisie dans le groupe consistant en bisulfite, disulfite, sulfite d'hydrogène et leurs combinaisons ; de préférence une solution de bisulfite de sodium. Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé de diagnostic et/ou de pronostic, in vitro, du cancer du testicule comprend : (i) une extraction de l'ADN à analyser dans l'échantillon du patient, (ii) une détermination, dans l'ADN à analyser, du taux (pourcentage) de méthylation des cytosines des dinucléotides CpG compris dans au moins une des séquences ADN identifiées en SEQ ID NOs 1 à 7 ou dans au moins une séquence qui présente au moins 99% d'identité, de préférence au moins 99,5% , avantageusement au moins 99,6% d'identité, avec une séquence identifiée en SEQ ID NOs : 1 à 7, et (iii) une comparaison du taux (pourcentage) de méthylation des cytosines dans une ou des séquences ADN telle(s) que définie(s) en (ii) avec le taux (pourcentage) de méthylation desdites cytosines de la ou desdites séquence(s) présentes dans l'ADN extrait d'un échantillon biologique non cancéreux ; la détermination d'un taux de méthylation dans l'ADN à analyser inférieur au taux de méthylation dans l'ADN extrait de l'échantillon biologique non cancéreux pouvant être corrélé avec le diagnostic ou le pronostic d'un cancer du testicule. Par séquence hypométhylée on entend donc une séquence ADN comprenant un ou plusieurs doublets CpG dans laquelle une cytosine d'au moins un dinucléotide ou doublet CpG n'est pas méthylée en position 5 (c'est à dire qui ne contient pas de radical CH3 à la cinquième position de la base cytosine) par comparaison avec une même séquence ADN issue du même type d'échantillon non cancéreux. Pour déterminer l'état ou statut de méthylation d'une séquence cible on peut effectuer le rapport suivant : nombre de cytosines méthylées des dinucléotides CpG / nombre total de cytosines des dinucléotides CpG. Si le rapport, correspondant à un pourcentage de méthylation, est inférieur ou égal à 80%, de préférence inférieur ou égal à 60% et avantageusement inférieur ou égal à 30%, ceci peut être corrélé avec une présomption de cancer du testicule. L'invention a encore pour objet une séquence d'acide nucléique, isolée, consistant en moins une séquence ADN choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 ou parmi au moins une séquence qui présente au moins 99% d'identité (de préférence au moins 95,5% ou 95,6% d'identité) avec une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 et leurs séquences complémentaires. Les séquences précitées qui sont associées au cancer du testicule sont utilisées comme marqueurs moléculaires du cancer du testicule. Figures La figure 1 représente le principe de la méthode d'amplification WTA des ARNs. La figure 2 représente un schéma synoptique de la nature et de l'enchaînement des différentes étapes de prétraitement des données de puces à ADN selon la méthode RMA. La figure 3 illustre la nomenclature, la position et la structure des loci HERV-W surexprimés et présentant une perte de méthylation dans le testicule tumoral. La figure 4 est un histogramme représentant l'accroissement d'expression de cinq loci (HW4TT, HW2TT, HW13TT, HWXTT et HW21TT) respectivement dans trois paires d'échantillons testiculaires (testicule 1, testicule 2 et testicule 3), basé sur une quantification comparative échantillon tumoral/échantillon sain. En abscisse sont représentés les loci et en ordonné sont représentés les facteurs d'accroissement de l'expression entre tissu tumoral et tissu sain. Les figures 5 à 10 représentent le statut de méthylation de la région U3 de la LTR unique ou de la LTR 5' des différents loci, respectivement HW4TT, HW2TT, HW13TT, HWXTT, HW21TT et ERVWEI dans le testicule sain (normal) et dans le testicule tumoral issus d'un même patient, après amplification et analyse des séquences obtenues. Exemples : Exemple 1 : Identification de loci HERV-W exprimés dans des tissus cancéreux. Méthode : L'identification de loci HERV-W exprimés repose sur la conception d'une puce à ADN haute densité au format GeneChip proposé par la société Affymetrix. Il s'agit d'une puce à façon, développée spécifiquement, dont les sondes correspondent à des loci HERV-W. Les séquences de la famille HERV-W ont été identifiées à partir de la banque de données nucléiques GenBank en utilisant l'algorithme Blast (Altschul et al. 1990) avec la séquence du locus ERVWE1, situé sur le chromosome 7 en 7g21.2 et codant pour la protéine dénommée syncytine. Les séquences homologues à HERV-W ont été comparées à une bibliothèque contenant des séquences de référence de la famille HERV-W (ERVWEI) découpées en régions fonctionnelles (LTR, gag, pol et env) en utilisant le logiciel RepeatMasker (A.F.A. Smit and P. Green). Ces éléments constituent la banque HERVgDB. Les sondes composant la puce haute densité ont été définies sur un critère d'unicité de leurs séquences dans la banque HERVgDB. Les LTR provirales et solitaires HERV-W contenues dans la banque HERVgDB ont été extraites. Chacune de ces séquences, a été décomposée en un ensemble de séquences de 25 nucléotides (25-mers) la composant, soit autant de sondes potentielles. L'évaluation de l'unicité de chaque sonde a été réalisée par recherche de similarité avec l'ensemble des 25-mers générés pour toutes les LTRs de la famille considérée. Ceci a permis d'identifier l'ensemble des 25-mers d'occurrence unique pour chaque famille d'HERV. Ensuite, certains de ces 25-mers ont été retenus comme sondes. Pour chaque région cible U3 ou U5, un jeux de sondes a été constitué à partir des sondes identifiées comme uniques. Les échantillons analysés à l'aide de la puce haute-densité HERV correspondent à des ARN extraits de tumeurs et aux ARN extraits des tissus sains adjacents à ces tumeurs. Les 35 tissus analysés sont : l'utérus, le colon, le poumon, le sein, le testicule, la prostate et l'ovaire. Des ARN placentaires (tissu sain uniquement) ont également été analysés. Pour chaque échantillon, 400 ng d'ARN totaux ont été amplifiés à l'aide d'une méthode transcriptionnelle non biaisée connue sous le nom de WTA. Le principe de l'amplification WTA est le suivant: des amorces (RP-T7) comprenant une séquence aléatoire et une séquence promotrice T7 sont hybridées sur les transcrits ; des ADNc double-brin sont synthétisés et servent de matrice à une amplification transcriptionnelle par la T7 ARN polymérase ; les ARN anti-sens générés sont convertis en ADNc double brin qui sont ensuite fragmentés et marqués par introduction d'analogues nucléotidiques biotinylés aux niveaux des extrémités 3'OH par la terminale transferase (TdT) (cf. : Figure 1). Pour chaque échantillon, 16 �g de produits d'amplification marqués par la biotine ont été hybridés sur puce à ADN selon le protocole recommandé par la société Affymetrix. Les puces ont ensuite été lavées et marquées, selon le protocole recommandé. Les puces ont enfin été lues par un scanner afin d'acquérir l'image de leur fluorescence. L'analyse d'image réalisée à l'aide du logiciel GCOS permet d'obtenir des valeurs numériques d'intensité de fluorescence qui sont prétraitées selon la méthode RMA (cf. : Figure 2) avant de pouvoir réaliser une analyse statistique pour identifier les loci HERV exprimés spécifiquement dans certains échantillons. La comparaison des moyennes de plus de deux classes d'échantillons a été réalisée par la procédure SAM appliquée à un test de Fisher. Résultats : Le traitement des données générées par l'analyse sur puce à ADN à l'aide de cette méthode a permis d'identifier six jeux de sondes correspondant à une surexpression dans un seul échantillon : le testicule tumoral. Ces cinq jeux de sondes sont spécifiques de six loci précis référencés HW4TT, HW2TT, HW13TT, HWXTT, HW21TT et ERVWEI (cf. : Figure 3). Les informations relatives aux loci précités sont synthétisées dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Locus SEQ ID NO : Chromosome Position* HW4TT 8 4 41982184:41989670 HW2TT 9 2 17383689:17391462 HW13TT 10 13 68693759:68699228 HWXTT 11 X 113026618:113027400 HW21TT 12 21 27148627:27156168 ERVWEI 13 7 91935221:91945670 * Position donnée par rapport à la version ensemble n° 39 (juin 2006) (NCBI n° 36) 30 http : //www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html Le locus HW13TT est un provirus chimère de type HERV-W/L résultant de la recombinaison d'un provirus HERV-W et d'un provirus HERV-L. Cette chimère est telle que la région 5' constituée de la séquence partant du début de la LTR5' jusqu'à la fin du fragment gag déterminé est de type W et la région 3' constituée de la séquence partant du fragment subséquent pol jusqu'à la fin de la LTR3' (U3-R uniquement) est de type L. Il en résulte une fusion des régions 3' gag W-5' pol L. Exemple 2: Validation des loci surexprimés dans le testicule tumoral et détermination du facteur d'induction associé. Principe : Les loci identifiés comme surexprimés dans le testicule tumoral à l'aide de la puce HERV haute densité ont été validés par RT-PCR en temps réel sur trois paires d'échantillons testiculaires. La spécificité de cette surexpression est évaluée par l'analyse d'échantillons provenant d'autres tissus. A cette fin, des systèmes d'amplification spécifiques ont été mis au point et utilisés pour les loci identifiés, comme décrit dans le tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 Locus Amorce sens (SEQ ID NO :) Amorce antisens (SEQ ID NO :) Gène G6PD TGCAGATGCTGTGTCTGG (14) CGTACTGGCCCAGGACC (15) HW4TT GGTTCGTGCTAATTGAGCTG (16) ATGGTGGCAAGCTTCTTGTT (17) HW2TT TGAGCTTTCCCTCACTGTCC (18) TGTTCGGCTTGATTAGGATG (19) HW13TT CATGGCCCAATATTCCATTC (20) GGTCCTTGTTCACAGAACTCC (21) HWXTT CCGCTCCTGATTGGACTAAA (22) CGTGGGTCAAGGAAGAGAAC (23) HW21TT ATGACCCGCAGCTTCTAACAG (24) CTCCGCTCACAGAGCTCCTA (25) L'expression de ces loci est normalisée par celle d'un gène de ménage approprié : G6PD. Cette quantification d'expression a été réalisée à l'aide d'un appareil de RT-PCR en temps réel Mx3005P, commercialisé par la société Stratagene. 25 Résultats : L'étude des trois paires d'échantillons testiculaires indique que tous les loci putatifs identifiés, à l'exception de HWXTT, dont l'expression n'a pas pu être quantifiée dans le second couple d'ARN testiculaire, sont surexprimés dans le testicule tumoral par rapport au tissu sain (cf. : Figure 4).20 L'analyse de paires d'échantillons provenant d'autres tissus (colon, utérus, sein ovaire, poumon et prostate) montre que le phénomène de surexpression est restreint au testicule tumoral. Par conséquent, l'expression des cinq loci identifiés revêt le caractère de marqueur spécifique du cancer du testicule. Exemple 3 : Contrôle épigénétique de la transcription. 10 Principe : La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique, qui s'opère, chez les eucaryotes, par l'addition d'un groupement méthyle sur les cytosines des di-nucléotides 5'-CpG, et se traduit par une répression transcriptionnelle quand cette modification a lieu au sein de la séquence nucléotidique d'un promoteur. Mises à part quelques exceptions, les séquences 15 endogènes humaines d'origine rétrovirale sont contraintes, par ce processus de méthylation, à un état transcriptionnel silencieux dans les cellules de l'organisme en condition physiologique. Afin d'analyser le statut de méthylation de la LTR unique ou de la LTR 5' des cinq loci, la méthode dite de � Bisulfite Sequencing PCR � a été utilisée. Cette méthode permet, à 20 partir du séquençage d'un échantillon représentatif de la population, d'identifier l'état de méthylation de chaque dinucléotide CG sur chacune des séquences au sein du tissu étudié. L'information de méthylation étant perdue lors des étapes d'amplification, il convient, par la méthode de traitement de l'ADN génomique par le bisulfite de sodium, de traduire l'information de méthylation au sein même de la séquence nucléotidique. L'action du 25 bisulfite (sulfonation), suivie d'une désamination hydrolytique puis d'une désulfonation alcaline, permet en effet de modifier toutes les cytosines contenues dans l'ADN génomique en uracile. La vitesse de désamination des cytosines (C) sulfonées est cependant bien supérieure à celle des 5-méthyl-C sulfonées. On peut donc, en limitant le temps de réaction à 16 heures, transformer de manière stricte les cytosines non méthylées en uracile (U), tout en préservant 30 les cytosines possédant un groupement méthyle. Après le traitement au bisulfite de sodium, la séquence d'intérêt est amplifiée à partir de l'ADN génomique issu de la section testiculaire tumorale et de celui issu de la section testiculaire saine adjacente par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en deux étapes. La première PCR permet une sélection 10 15 20 spécifique de la séquence d'intérêt, la seconde PCR � nichée � permet d'amplifier cette séquence. La séquence ADN ayant été modifiée par le bisulfite, la conception des amorces a tenu compte du changement de code (C en U), et les amorces ont été choisies de manière à s'hybrider sur une zone ne contenant aucun CpG (leur état de méthylation, donc de conversion, étant a priori inconnu). Les séquences des amorces utilisées sont décrites dans les tableaux 3 à 8, ci-dessous. Tableau 3 ù locus HW4TT Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR CCAACATCACTAACACAACCT ( 2 6 ) GGGAGTTAGTAAGGGGTTTG ( 2 7 ) PCR nichée CAACCTATTAAACAAAACTAAATT (2 8) AGATTTAATAGAGTGAAAATAGAGTTT (2 9 ) Tableau 4 ù locus HW2TT Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR TTATTAGTTTAGGGGATAGTTG (30) ACACAATAAACAACC TAC TAAAT (31) PCR nichée GAGGGTAAGTGGTGATAAA (32) AACC TAC TAAATCCAAAAAAA (33 ) Tableau 5 ù locus HW13TT Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR TAGGATTTTAGGTTTATTGTTA (34) AAAAATAAAATATTAAACC (35) PCR nichée ATATGTGGGAGTGAGAGATA (3 6) CAACAACAAACAATAATAATAA (3 7 ) Tableau 6 ù locus HWXTT Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR TTGAGTTTTTTTATTGATAGTG (38) TCTAAATCCTATTTTCCTACT (39) PCR nichée GTTTTTTTATTGATAGTGAGAGAT (40) TAACAAACCTTTAATCCAAT (41 ) Tableau 7 ù locus HW21TT Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR TTTAGTGAGGATGATGTAATAT (42) CAACTTAATAAAAATAAACCCA (43) PCR nichée ATAATGTTTTAGTAAGTGTTGGAT (44) ACAATTACAAACCTTTAACC (45 ) Tableau 8 ù locus ERVWEI Amplification Amorce sens 5'-*3' Amorce antisens 5'-*3' (SEQ ID NO :) (SEQ ID NO :) Première PCR AATTCATTCAACATCCATTC (46) GGTTTAATATTATTTATTATTTTGGA (47) PCR nichée CTCTTACCTTCCTATACTCTCTAAA (48) AGAGTGTAGTTGTAAGATTTAATAGAGT (49 ) Après extraction sur gel, et purification, les amplicons sont clonés dans des plasmides, et ces derniers sont utilisés pour transformer des bactéries compétentes. Une douzaine de minipréparations d'ADN plasmidique sont réalisées à partir des bactéries transformées et les amplicons contenus dans les plasmides sont séquencés. On procède alors à l'analyse des séquences obtenues (cf. : Figures 5 à 10). Résultats : L'analyse de la région 5' des transcrits des loci identifiés a été réalisée à l'aide de la technique 5' Race. Elle a notamment permis de montrer que la transcription est initiée au début de la région R de la LTR 5' provirale. Ceci traduit l'existence d'un rôle promoteur de la région U3 de la LTR 5' provirale. 1. Etat de méthylation des séquences U3 de la LTR5'du locus HW4TT : La séquence U3 de la LTR5' du locus HW4TT de référence contient 5 sites CpGs. a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : sur 12 séquences analysées, 9 sont totalement méthylées. Les 3 autres présentent à chaque fois 1 CpG non méthylé sur les 5 que compte la région U3. Ceci représente donc une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW4TT s'élevant à 95% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : sur 12 séquences analysées, 5 (soit 41,66% des séquences) sont totalement déméthylées, 3 séquences ont 4 CpG sur 5 non méthylés, 2 séquences ont 2 CpG sur 5 non méthylés, 1 séquence a 1 CpG sur 5 non méthylé, et 1 séquence reste totalement méthylée. Ceci représente donc une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW4TT s'élevant à 30% dans l'échantillon testiculaire tumoral. 2. Etat de méthylation des séquences U3 de la LTR5'du locus HW2TT : La séquence U3 de la LTR5' du locus HW2TT de référence contient 5 sites CpGs. a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : sur 12 séquences analysées, 9 sont totalement méthylées, 1 possède son 2eme CpG non méthylé, 1 a le CpG en position 4 non méthylé, 1 a les CpG en position 4 et 5 non méthylés et 3 séquences présentent des mutations ponctuelles sur un ou deux CpG (une en position 3, une en position 5 et une en positions 4 et 5), reflétant très probablement des artefacts de PCR. Ceci représente donc une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW2TT s'élevant à 92,9% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : sur 12 séquences analysées, 6 sont totalement déméthylées. 5 séquences possèdent un ou deux CpG méthylé(s) (1 à la position 1, 1 autre à la position 5, 1 sur les positions 1 et 5, 2 aux positions 4 et 5 et 1 à la position 3). Enfin, une séquences possède 4 CpG méthylés sur 5 (positions 1, 2, 4 et 5). Ceci correspond à une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW2TT s'élevant à 20% dans l'échantillon testiculaire tumoral. 3. Etat de méthylation des séquences U3 de la LTR5'du locus HW13TT : La séquence U3 de la LTR5' du locus HW13TT de référence contient 3 sites CpGs. a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : un CpG supplémentaire par rapport à la séquence de référence est retrouvé dans 4 des 10 clones étudiés pour ce locus. Il est situé entre les CpG 2 et 3 et est méthylé. Dans les 6 autres clones, ce site est muté par rapport à la séquence de référence. Les 3 autres CpG de la région U3 sont méthylés dans les 10 séquences analysées. Ceci représente donc une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW13TT s'élevant à 100% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : le CpG supplémentaire indiqué ci-dessus est également retrouvé. Il est déméthylé dans 4 des 10 séquences analysées, muté dans 3 autres séquences et son état de méthylation est indéterminé dans les 3 dernières séquences. 7 séquences sur 10 sont totalement déméthylées et les 3 autres sont méthylées sur le 2ème et sur le 3eme CpG. Ceci correspond à une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW13TT s'élevant à 20% dans l'échantillon testiculaire tumoral. 4. Etat de méthylation des séquences U3 de la LTR solitaire du locus HWXTT : La séquence U3 de la LTR5' du locus HWXTT de référence contient 6 sites CpGs. a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : les 8 séquences analysées sont totalement méthylées, ce qui correspond à un pourcentage de méthylation de 100% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : les 9 séquences analysées 6 sont totalement déméthylées, ce qui correspond à un pourcentage de méthylation de 0%. 5. Etat de méthylation des séquences U3 de la LTR5'du locus HW21TT : La séquence U3 de la LTR5' du locus HW21TT de référence contient 7 sites CpGs. a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : les 10 séquences analysées ont toutes 6 CpG méthylés sur 7, pour 6 des séquences le 1" CpG est non méthylé et pour les 4 autres séquences le 4ème CpG est non méthylé. Ceci représente donc une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW21TT s'élevant à 85,7% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : sur 8 séquences analysées, 6 sont totalement déméthylées, 2 autres présentent un profil identique à l'un de ceux trouvés dans le tissu testiculaire sain, à savoir 6 CpG méthylés et le ter CpG non méthylé. Ceci correspond à une méthylation globale de la région U3 de la LTR5' du locus HW21TT s'élevant à 21,4% dans l'échantillon testiculaire tumoral. 6. Etat de méthylation des séquences de l'activateur et de la U3 de la LTR 5' du locus ERVWE1: Le locus ERVWEI comprend, en plus de sa région U3 promotrice, un activateur connu localisé directement en amont de la LTR5', et qui contient deux sites CpG (CpG 1 et 2). La séquence U3 de la LTR5' du locus ERVWEI de référence contient qant à elle 5 sites CpGs (CpG 3 à 7). a) dans l'échantillon de tissu testiculaire sain : sur 10 séquences analysées, 5 séquences ont les CpG 1 et 2 (activateur) et 5 (U3) non méthylés, 1 séquence a les CpG 2 et 5 non ùéthylés, 2 séquences ont les CpG 1 (activateur) et 7 (U3) non méthylés, 1 séquence a le CpG 7 uniquement non méthylé, et 1 enfin est totalement méthylée pour les 7 CpG. Au total, ceci correspond à un pourcentage de méthylation de 68,57% dans l'échantillon testiculaire sain ; b) dans l'échantillon de tissu testiculaire tumoral : sur les 10 séquences analysées, seules 3 séquences présentent pour chacune un unique CpG méthylé (CpG 4 ou CpG5 ou CpG6), les 7 autres séquences sont totalement déméthylées, ce qui correspond à un pourcentage de méthylation de 4,29%. Le niveau de méthylation très élevé des promoteurs rétroviraux U3 des loci considérés dans le tissu sain indique une répression de l'expression transcriptionnelle par un mécanisme épigénétique. En revanche, le niveau faible de méthylation de ces mêmes promoteurs dans le tissu tumoral traduit une levée d'inhibition transcriptionnelle dont découle l'expression significativement plus élevée mise en évidence à l'aide de la puce ADN HERV haute densité et à l'aide de la RT-PCR en temps réel. Ainsi, les promoteurs rétroviraux U3 des loci considérés apparaissent comme des marqueurs spécifiques du caractère tumoral du testicule. Références bibliographiques [1] Nickerson D. A. et al., DNA sequence diversity in a 9.7 ûkb region of the human lipoprotein lipase gene, Nature Genetics, Vol. 19, pp 233-240 (1998). [2] Cottrell S. E., Molecular diagnostic applications of DNA methylation technology, Clinical 10 Biochemistry 37, pp 595-604 (2004).5 REVENDICATIONS 1. Procédé pour le diagnostic ou le pronostic, in vitro, du cancer du testicule dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'un cancer du testicule, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la présence ou de l'absence de méthylation de dinucléotides CpG dans au moins une séquence cible d'ADN génomique de l'échantillon, la séquence cible étant choisie parmi au moins une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 ou parmi au moins une séquence qui présente au moins 99% d'identité avec une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 et leurs séquences complémentaires. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend : (i) une extraction de l'ADN génomique à analyser dans l'échantillon, (ii) un traitement de l'ADN génomique extrait avec un ou plusieurs réactifs pour convertir les bases cytosines, des dinucléotides CpG, non méthylées en position 5, en uraciles, (iii) au moins une amplification de l'ADN traité, (iv) la détermination, sur la base de la présence ou de l'absence de méthylation des 20 dinucléotides CpG, d'un statut de méthylation de ladite séquence cible ou d'une valeur qui reflète un état de méthylation de la séquence cible. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que dans (ii) le traitement de l'ADN génomique comprend l'utilisation d'une solution choisie dans le groupe consistant en 25 bisulfite, disulfite, sulfite d'hydrogène et leurs combinaisons. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon est choisi parmi un extrait tissulaire de testicule ou un fluide biologique, tel que le sang, le sérum, le plasma, l'urine et le liquide séminal. 5. Séquence d'acide nucléique, isolée, caractérisée en ce qu'elle consiste en au moins une séquence ADN choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 ou parmi au moins une séquence qui présente au moins 99% d'identité avec une des séquences identifiées en SEQ ID NOs : 1 à 7 ou leurs séquences complémentaires. 30 6. Utilisation d'au moins une séquence telle que définie dans la revendication 5, comme marqueur pour le diagnostic ou le pronostic in vitro du cancer du testicule.5