Brevet FR2931678A1 — publié le 20091204

UTILISATION DU TRILOSTANE POUR LE TRAITEMENT DE LA DEPRESSION L'invention concerne l'application du trilostane et de ses dérivés pour la fabrication de médicaments contre la dépression et notamment la dépression chez les sujets âgés. La dépression est un problème majeur de santé publique. Elle est en augmentation constante depuis de nombreuses années. De plus en plus de personnes connaîtront un épisode dépressif au cours de leur vie. C'est pourquoi, elle est d'ailleurs considérée comme la maladie du siècle par certains spécialistes. Elle touche 340 millions de personnes dans le monde et est actuellement la cinquième cause de mortalité et de handicap dans le monde. Le syndrome dépressif associe un syndrome mental (humeur dépressive : vision pessimiste du monde et de soi-même et ralentissement psychomoteur), et un syndrome physique (troubles du sommeil, de l'alimentation et de la sexualité). Le risque de suicide est important, l'absentéisme et le ralentissement psychique et moteur des malades représentent un coût important pour la société. Les dépressions sont divisées en deux grands groupes : les dépressions majeures (ou unipolaires) et les dépressions bipolaires (ou psychoses maniaco- dépressives). Ces dernières sont caractérisées par le passage très rapide de la dépression à l'euphorie et vice versa. Les dépressions majeures peuvent être endogènes, c'est à dire sans facteur déclenchant objectif, ou psychogènes : elles surviennent après un stress important tel qu'un deuil, un rejet, une perte du travail, de la santé. Les antidépresseurs classiques fonctionnent tous selon le même principe : augmenter la durée de vie d'un neurotransmetteur, et en particulier les amines biogènes (telles que la sérotonine et la noradrénaline) dans la fente synaptique. Ces neurotransmetteurs sont libérés par l'élément présynaptique. Le principe de la neurotransmission est d'être rapide. Après leur libération, les neurotransmetteurs doivent être éliminés de la fente synaptique. Pour cela, ils sont, soit dégradés par les monoamine oxydases, soit recapturés par l'élément présynaptique. Parmi les traitements, on distingue : - Les inhibiteurs des monoamine oxydases (IMAO) qui inhibent la dégradation et augmentent la disponibilité des amines biogènes pour la libération dans la fente synaptique. - Les antidépresseurs tricycliques qui inhibent la recapture et prolongent la durée de vie des amines biogènes dans la fente synaptique et donc leur action sur les récepteurs post-synaptiques. - Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS) qui exercent le même rôle que les tricycliques mais, comme leur nom l'indique, sélectivement sur la recapture de sérotonine. Cette sélectivité permet de réduire les effets secondaires des antidépresseurs. Par ailleurs, l'efficacité des antidépresseurs est contestée dans plusieurs études dont une récente anglo-américaine réalisée sur les antidépresseurs parmi les plus prescrits (Prozac�, Deroxat�, Zoloft� et Seropram(D) et dans laquelle les chercheurs concluent que ces médicaments n'auraient guère plus d'effets que des placebos (Kirsch et al, Plos Medecine, février 2008, vol.5, issue 2) ; dans une autre étude, il est indiqué que leur efficacité est surévaluée (Healthfacts, Nov, 1992) ; ces études ne font pas référence à une sous population particulière. En ce qui concerne les personnes âgées, l'efficacité réelle des antidépresseurs fait l'objet de controverses (Paille et al, Vo14, N°21 p9-34, Masson 2004). Plusieurs études, dont une réalisée au Canada, ont révélé que les ISRS ont des effets néfastes sur la santé mentale chez les personnes âgées et en particulier il a été constaté un risque accru de tentatives de suicide lors du premier mois de traitement (Juurlink et al, The American journal of psychiatry, 2006, Vol.163, n°5 pp813-821). De plus, tous ces antidépresseurs présentent deux défauts majeurs : 1) leur délai d'action est important, 2) il faut au minimum deux à trois semaines avant d'obtenir un effet; et la proportion de personnes insensibles au traitement, notamment les sujets âgés, est très importante. Etant donné que les antidépresseurs classiques ne sont pas pleinement satisfaisants et en particulier parmi la population âgée, il est donc utile de rechercher et mettre en oeuvre d'autres traitements qui agissent sur d'autres cibles et sont susceptibles de pallier aux déficiences des premiers. Parallèlement à ces déficiences monoaminergiques, dans la dépression et en général lors d'un stress, il y a entre autres, l'activation de l'axe HPA qui est en fait la voie neuroendocrinienne finale commune de tous les circuits centraux activés au cours du stress. L'axe HPA est constitué de l'hypothalamus, de l'hypophyse et des glandes surrénales. Une dérégulation de l'axe HPA se caractérise par une augmentation de la libération de l'adrénocorticotropine (ACTH) et donc de la corticostérone (CORT) circulante, qui pourra provoquer des troubles de l'humeur. Lors d'une situation normale, la CORT exerce un feedback négatif sur l'axe HPA, alors que lors de la dépression, il a été démontré que ce feedback exercé par la CORT est altéré. D'ailleurs les antidépresseurs corrigent les perturbations de l'axe HPA (Boyle et al, PNAS, 2005, 102(2) :473-478). Une autre structure importante, l'hippocampe, module l'activation de l'axe HPA notamment en exerce une action inhibitrice sur l'hypothalamus. La Demanderesse s'est intéressée à l'utilisation du trilostane (4,5-epoxy-17-hydroxy-3-oxoandrostane-1713-ol-3-one) qui est un modulateur d'activité enzymatique affectant la synthèse des stéroïdes neuroactifs. Il bloque la 3betahydroxystéroïde deshydrogénase (313-HSD) qui convertit notamment la prégnénolone en progesterone puis en alloprégnanolone (Potts GO et al, (1978) Steroids 32:257-67 ; Young Jet al, (1994) Endocrine 2:505-9 ; Phan VL et al, (1999) Eur JNeurosci 11:2385-96). Le blocage de cette enzyme va donc permettre de modifier les taux en neurostéroïdes, hormones synthétisées en périphérie et par le cerveau et servant de neuromodulateurs très puissants. Le trilostane est actuellement commercialisé en Grande-Bretagne sous la spécialité Modrenal� ; celle-ci étant prescrite dans les pathologies liées à l'hypercortisolémie, et également pour le traitement du cancer du sein avancé chez des femmes ménopausées. La demande de brevet GB1,123.770 divulgue l'utilisation du trilostane dans le traitement de pathologies comme la maladie d'Addison (insuffisance surrénale lente), en remplacement de la désoxycorticostérone. Diverses publications ont montré que le trilostane pouvait être utilisé pour traiter le cancer du sein, mais en association avec une autre molécule (Coombes et ai, Trilostane therapy for advanced breast cancer., Cancer Treat Rep 69: 4, 351-4, Apr, 1985 ; Chu et al, Trilostane with hydrocortisone in treatment of metastatic breast cancer., Breast Cancer Res Treat 13: 2, 117-21, Mar, 1989 ; Ingle et al, Evaluation of trilostane plus hydrocortisone in women with metastatic breast cancer and prior hormonal therapy exposure., Am J Clin Oncol 13: 2, 93-7, Apr, 1990 ; Williams et al., Multicentre cross-over study of aminoglutethimide and trilostane in advanced postmenopausal breast cancer., Clin Oncol (R Colt Radiol) 7: 2, 87-92, 1995). La demande EP125553A divulgue l'utilisation du trilostane en association avec un antioestrogène (de type tamoxifène) pour le traitement de cancers. La demande EP1455831A divulgue l'association d'un antiprogestatif qui a une activité FSH, méïotique et LRH -comme le trilostane - avec un progestatif dans le but de favoriser une stimulation ovarienne contrôlée. Dans la publication Le Roux et al, (Inhibition of progesterone secretion with trilostane for mid-trimester termination of pregnancy: randomized controlled trials., Hum Reprod 17: 6, 1483-9, Jun, 2002), qui fait état de résultats d'une étude clinique au terme de laquelle le trilostane a été considéré comme étant efficace lors d'une interruption de grossesse ; le trilostane ayant été administré en tant que prétraitement avant l'administration du misoprostol. On peut également citer les demandes EP1895964A et W006064291 A qui divulguent respectivement l'utilisation du trilostane dans une indication dermatologique liée à une modification de croissance des vaisseaux sanguins notamment, et son utilisation dans le traitement de cancers de la peau par inhibition de l'angiogénèse et/ou la vasculogénèse. Le trilostane est déjà décrit pour le traitement de l'hypercorticisme (syndrome de Cushing) chez le chien (Neiger R et al, (2002). Vet Rec 150:799-804). La demande WO02080930 décrit l'utilisation du trilostane comme inhibiteur de la production de cortisol dans le traitement de pathologies associées aux taux élevés d'hormone surrénales, et en particulier l'alopécie chez le chien, la lamitis chez le cheval, et la maladie de Cushing chez le chien et le cheval. Même si cette demande PCT spécule sur ces pathologies en les citant simplement, elle ne décrit nullement l'utilisation du trilostane dans le traiteraient de la dépression ou de l'anxiété chez l'animal, et encore moins le potentiel d'utiliser le trilostane ou ses dérivés pour induire une forte augmentation de l'expression des récepteurs aux oestrogènes ER(3, ni pour traiter la dépression chez des sujets âgés. La Demanderesse a montré dans la présente invention, que le trilostane possédait des propriétés comme antidépresseur et anxiolytique, en agissant sur des cibles complètement différentes de celles des antidépresseurs classiques ; elle montre également que le trilostane a le potentiel pour traiter efficacement ces pathologies chez les personnes âgées, constituant aussi une alternative intéressante aux traitements connus. Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte donc à l'utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés dans la préparation d'un médicament en vue de traiter la dépression ; le trilostane étant le principe actif préféré. On entend par � dérivé � du trilostane, tout principe actif ayant une structure chimique très proche de celle du trilostane comme l'épostane décrit dans la demande DE2855091, et les métabolites actifs du trilostane et dérivés comme le 17-kétotrilostane pour le trilostane. Selon un second aspect, l'anxiété est une autre indication pouvant être traitée par le trilostane ou un dérivé de celui-ci. Les Inventeurs ont en effet montré chez l'animal que le trilostane est efficace pour ces deux indications et sans altérer l'activité générale comme la locomotion, vitesse de déplacement ou lors des réponses stéréotypées. Le trilostane est particulièrement recommandée pour traiter la dépression chez des personnes qui ont auparavant subi des effets indésirables comme par exemple, de manière descriptive mais non limitative, des céphalées, des hallucinations ou des troubles du sommeil, après utilisation des antidépresseurs classiques. Les Inventeurs ont montré que l'effet du trilostane disparaît chez les souris surrénalectomisées et castrées, suggérant une action périphérique plutôt que centrale. Par ailleurs, les Inventeurs ont montré également que le trilostane permet de réduire l'augmentation des taux plasmatiques en corticostérone qui est un glucocorticoïde marqueur de l'activation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. Selon un troisième aspect de l'invention, le trilostane ou un dérivé de celui-ci est utilisé dans la préparation d'un médicament pour le traitement de la maladie d' Alzheimer Un médicament selon cette invention pourra être administré : - par voie orale, comme par exemple, sous forme de comprimés enrobés ou non, de gélules, de poudres, de granulés, de suspensions ou de solutions orales. Une telle forme pour l'administration par voie orale peut être soit à libération immédiate, soit à libération prolongée ou retardée ; - par voie parentérale, comme par exemple, sous forme de préparations injectables par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire; - par voie rectale, comme par exemple, sous forme de suppositoires ; - par voie topique, notamment transdermique, comme par exemple, sous la forme de " patch ", de pommade ou de gel. - par voie intranasale, comme par exemple sous forme d'aérosols et " sprays ". En fonction de la voie d'administration choisie, des diluants, excipients et/ou véhicules de la molécule active pourront être inclus. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, annexés par les figures suivantes : - la figure 1 illustre l'effet dose/réponse obtenu après administration à court terme de trilostane dans le test de la nage forcée chez des souris Swiss contrôles (gauche) et AdX/CX (droite) ; le nombre d'animaux est indiqué dans chaque colonne. *p Animaux : Le test de la nage forcée a été réalisé sur un lot de 12 souris mâles Swiss (Depré, St Doulchard, France), âgées de 6 à 8 semaines et pesant 32 +2g. Les groupes d'animaux sont logés dans des cages en plastique. Ils ont un libre accès à la nourriture et à l'eau, sauf lors des expériences comportementales au cours desquelles ils sont gardés dans un environnement régulé (22+1°C, 40-60% d'humidité) sous un cycle jour/nuit de 12 heures (jour à 07h00). Les expériences sont réalisées entre 09h00 et 17h00 dans un local expérimental situé dans l'animalerie et sont précédées par une période de 30 minutes de repos. Toutes les procédures animalières sont conduites selon un respect strict des directives EC du 24/11/1986. Molécule active Le trilostane a été acheté dans le commerce ; il a été mis en suspension dans de l'huile de sésame pure et injecté par voie sous-cutanée (se) dans un volume de 100�l par 20g de poids corporel. Enregistrement et traitement des données La session a été enregistrée par un caméscope CDD connecté à un microordinateur et les mouvements ont été analysés en utilisant le logiciel Videotracks� (Viewpoint, Champagne-au-Mont-d'Or, France). Deux niveaux de changements de pixels ont été analysés pour discriminer d'une part entre l'immobilité et lutte, et d'autre part entre lutte et nage. Etant donné que seule l'immobilité est considérée de façon non équivoque comme paramètre d'un désespoir comportemental, les autres comportements n'ont pas été analysés. Résultats On constate que les souris stressées montrent un amaigrissement persistant, par rapport à celles témoins non stressées, 1, 2 ou 3 semaines après l'initiation du stress. Les souris sacrifiées 24 heures après la dernière session de contention montrent une augmentation très significative du poids des glandes surrénales. Le groupe des souris stressées consomme davantage de liquide en fonction du temps que celui des témoins. L'anhédonie (préférence au saccharose dans notre cas) est significativement supérieure chez les souris témoins non stressées (environ 80%) en comparaison aux souris stressées (environ 60%) pour chaque jour de la mesure (résultats non montrés). On constate que chez les souris témoins qui ont reçu 12,5mg et 25mg de trilostane, le temps d'immobilité est réduit de façon significative par rapport aux souris témoins non traitées. En revanche, chez les souris surrénalectomisées et castrées, on constate que le temps d'immobilité n'est pas modifié après administration de trilostane. Ainsi, l'administration du trilostane par voie sous-cutanée réduit le temps de l'immobilité aux doses de 12,5 et 25 mg/kg indiquant un effet antidépresseur du produit. Etant donné que l'effet du trilostane sur la réduction de l'immobilité des souris est aboli chez les souris surrénalectomisées et castrées (AdX/CX mice), cela suggère un effet périphérique plutôt que central du produit. Test de stress chronique de contention Le stress de contention va engendrer un stress psychologique très fort, mais aussi avec une composante physique. Les souris (n=11 à 12 par groupe) ont été immobilisées dans des tubes en plastique à raison de 3 heures par jour, entre 11 h et 14 h, pendant 21 jours. Ainsi, les mouvements de leur tête et de leurs membres sont limités. Les souris contrôle restent à l'animalerie durant toute la période de stress. 24 heures après la dernière session de contention, les animaux ont été soumis à une séance de 6 min de nage forcée. Le trilostane a été administré par voie sous-cutanée 16 heures et 2 heures avant la session Les résultats sont montrés dans la figure 2. Les animaux stressés chroniquement montrent une tendance à une augmentation de l'immobilité dans le test de nage forcée, et un traitement à court terme de trilostane diminue significativement le temps d'immobilité chez les animaux témoins et chez les animaux stressés EXEMPLE 2: Effet des associations trilostane - antidépresseurs classiques dans le test de la nage forcée L'effet antidépresseur du trilostane est maintenant bien établi chez les souris soumises au test de nage forcée, nous nous sommes donc demandé si le trilostane pouvait faciliter l'effet antidépresseur d'autres antidépresseurs. Nous avons donc poursuivi l'étude de l'effet du trilostane en association avec des antidépresseurs classiques comme la sertraline, la fluoxétine, la désipramine et l'imipramine toujours en utilisant le test de la nage forcée décrit précédemment. Les résultats sont présentés dans la figure 3. La sertraline, qui est un antidépresseur inhibant le transporteur à la sérotonine, présente également une affinité très importante pour le récepteur sigma-1 contribuant ainsi à son activité pharmacologique. Le composé, administré seul, exerce un effet antidépresseur très significatif aux doses de 20 et de 40 mg/kg (figure 3A). La fluoxétine est un autre antidépresseur inhibant sélectivement le transporteur à la sérotonine qui réduit significativement le temps d'immobilité des souris à 30 et 60 mg/kg ip (figure 3B). La désipramine, antidépresseur tricyclique inhibant les transporteurs à la sérotonine et à la noradrénaline, réduit le temps d'immobilité des souris à la dose de 20 et 40 mg/kg ip (figure 3C). L'imipramine, un autre antidépresseur tricyclique présente un effet antidépresseur dans le test de nage forcée aux mêmes doses que la désipramine (figure 3D). Le traitement au trilostane montre un effet antidépresseur qui s'additionne à celui des antidépresseurs classiques testés ici. Cet effet semble plus important lorsque le traitement au trilostane est associé aux antidépresseurs ISRS (figure 3A et 3B) et est significatif avec la sertraline à forte dose. Ces observations suggèrent que le trilostane exerce son effet dans le test de nage forcée par un mécanisme pharmacologique différent de celui impliquant les systèmes monoaminergiques. Les effets des antidépresseurs classiques et du trilostane sont purement additifs. EXEMPLE 3 : Effet du trilostane sur l'activité de l'axe HPA Nous avons par la suite étudié l'action neuroendocrinienne du trilostane sur la réactivité de l'axe HPA. L'hormone ACTH est synthétisée par les cellules corticotropes de l'antéhypophyse. L'ACTH stimule la production du CORT par le cortex surrénal. La sécrétion d'ACTH est contrôlée par un mécanisme de régulation hypothalamo-hypophyso-surrénalienne et dépend principalement du taux de CORT plasmatique. Dosage de l'adrénocorticotropine (ACTH) Pour doser l'ACTH plasmatique nous avons utilisé un kit radioactif (ELSA ACTH, ORIS Group, Gif-sur-Yvette, France) qui repose sur le principe de la technique � sandwich � sur phase solide. Deux anticorps monoclonaux ont été préparés contre deux sites antigéniques éloignés l'un de l'autre sur la molécule d'ACTH, le premier est absorbé sur la phase solide ELSA et reconnaît la partie N terminale, le second marqué à l'iode 125 est utilisé comme traceur et reconnaît la partie C terminale. Les molécules d'ACTH présentes dans les standards ou les échantillons à tester sont prises en � sandwich � entre les deux anticorps. L'excès de traceur est aisément éliminé par une étape de lavage, il ne reste donc plus sur l'ELSA que le complexe anticorps adsorbé/antigène/anticorps marqué. La radioactivité liée à l'ELSA est alors proportionnelle à la quantité d'ACTH initialement présente dans l'essai. Mode opératoire Après avoir sacrifié les souris par décapitation, les échantillons de sang sont collectés des cerveaux dans 1 mg/ml d'EDTA ; ils sont centrifugés à 4°C, et le plasma est conservé à -20°C avec un ajout de S�l d'aprotinine (7,6TIU/ml, Sigma- Aldrich) jusqu'à son utilisation. L'ACTH plasmatique est testée en utilisant un kit RIA dans 50�1 d'échantillons non-extraits, selon les instructions du fabricant. La concentration d'ACTH détectable minimale était de 2 pg/ml et les coefficients de variations de l'essai -interne et externe- étaient respectivement de 6% et de 5%. La concentration en corticostérone plasmatique était mesurée à l'aide d'un test ELISA en utilisant l00111 d'échantillons non-extraits, selon les recommandations du fabriquant (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA). Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 4. Chez la souris, le trilostane n'affecte pas les taux d'ACTH circulants chez les individus sains, mais diminue très significativement, à la dose de 12,5 mg/kg, l'augmentation d'ACTH (350%) liée au stress de nage forcée (figure 4A). Les augmentations du taux d'ACTH ont lieu par l'intermédiaire de l'hypothalamus qui sécrète le CRF (Corticotropin Releasing Factor). Le dosage de la CORT plasmatique, glucocorticoïde sécrété par les glandes surrénales notamment en réponse au stress et marqueur de l'activation de l'axe HPA, a confirmé une action physiologique du trilostane sur l'axe HPA. Chez la souris, le trilostane n'affecte pas les taux de CORT circulants chez les individus sains, mais diminue très significativement l'augmentation de CORT liée au stress de nage forcée (Figure 4B). La concordance des doses actives montre que nous avons ici la confirmation endocrinienne de l'effet antidépresseur du trilostane. EXEMPLE 4 : Effet du trilostane sur l'expression de la 30-HSD Le trilostane est un modulateur d'activité enzymatique affectant la synthèse des stéroïdes neuroactifs. Il bloque la 313-HSD qui convertit notamment la prégnénolone en progesterone puis en alloprégnanolone. L'effet de l'administration à court terme de trilostane est analysé par RT-PCR dans le cerveau, sur des préparations d'ARNm d'hippocampes, et en périphérie, sur des préparations d'ARNm de glandes surrénales en fonction du stress et de l'administration du trilostane. Analyse semi-quantitative par RT-PCR de l'expression du gène de la 313-HSD et du gène des récepteurs aux estrogènes de type 13 Afin d'extraire les ARNs qui seront utilisés pour l'analyse des ARNm de la 3(3-HSD et des ER(3 et pour l'analyse semi-quantitative par RT-PCR, les animaux contrôles et stressés sont sacrifiés par décapitation après 15 minutes de nage forcée. L'hippocampe et les glandes surrénales sont rapidement prélevés et congelés à -80°C jusqu'à l'extraction des ARN. Les ARN totaux sont ensuite extraits à partir des tissus en utilisant le kit High Pure RNA Tissue (Roche, Meylan, France) selon les recommandations du fabricant. La concentration et la pureté des ARN sont évaluées par spectrométrie à densité optique (mesures à 260 et 280 nm). La synthèse d'ADNc est ensuite réalisée grâce à la reverse transcriptase à partir d'un mélange réactionnel de 20111. Pour cela, on mélange 1�g d'ARN total à 2 pl d'hexamères amorces aléatoires (0,51.tg/�1) (Amersham, Orsay, France) et on laisse incuber à 70°C pendant 5 minutes. Après refroidissement dans la glace, la solution est mélangée à 8�l de tampon 5X, à 2�l de chacun des dATP, dTTP, dCTP, dGTP (chacun 10mM) et 1�l (200U, Promega) de transcriptase reverse du virus de leucémie murin Moloney (M-MLV RT) et la réaction est réalisée selon les instructions du kit. Des réactions parallèles sont réalisées en absence d'enzyme pour évaluer une éventuelle contamination. Pour l'amplification de PCR, 1 �l d'ADNc total synthétisé en réaction de réverse transcription est utilisé pour les amorces suivantes. Les amorces utilisées pour détecter la 313-HSD sont ceux décrits par Schulte et al. (2007) : AATCTGAAAGGTACCCAGAA (sens) et TCATCATAGCTTTGGTGAGG (antisens). Les amorces utilisées pour détecter les ER(3 sont ceux décrits par Thakur et al. (2007) : ACAGTCCTGCTGTGATGAAC (sens) et ACTAGTAACAGGGCTGGCAC (antisens). Les réactions PCR sont réalisées grâce au kit Quantum RNA Classic 18S (Ambion). Les ADNc amplifiés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% et révélés au bromide d'éthidium. Les ratios sont exprimés en pourcentage de la valeur contrôle. Résultats Les résultats sont présentés en figure 5. Il s'avère que le stress de nage forcée n'affecte pas l'expression de 313-HSD, ni dans l'hippocampe (figure 5A) ni dans les glandes surrénales (figure 5C). Le trilostane, à 25 mg/kg s.c., induit une forte augmentation significative de l'expression de la 3(3-HSD dans l'hippocampe (figure 5B) ou dans les glandes surrénales (figure 5D), mais n'est pas affecté par le stress. Ceci suggère que l'inhibition de l'enzyme par le trilostane provoque certainement une augmentation de l'expression du gène de la 3(3-HSD afin de contrecarrer le blocage de l'activité de l'enzyme. EXEMPLE 5 : Effet d'un autre inhibiteur de la 313-HSD : la cyanokétone Nous avons testé un autre inhibiteur de la 3(3-HSD : la cyanokétone. L'administration de cyanokétone aux mêmes doses (6,25-50 mg/kg; s.c.) et selon le même protocole d'injection que le trilostane (administration à court terme) n'induit pas d'effet antidépresseur chez les souris dans le test de nage forcée (figure 6). Ceci suggère que l'effet antidépresseur du trilostane ne passe pas principalement par une inhibition de l'enzyme mais certainement par un autre mécanisme. EXEMPLE 6: Action de l'anti-oestrogène Fulvestrant� sur l'effet antidépresseur du trilostane Pour essayer de comprendre le mécanisme de l'effet antidépresseur du trilostane, nous avons évalué son effet sur les récepteurs aux oestrogènes en utilisant un antagoniste de ces récepteurs: le fulvestrant� (ICI 182,780). Nous avons constaté que l'effet antidépresseur du trilostane administré à court terme est bloqué lorsque les souris sont traitées avec de l'ICI 182,780; 1-4 mg/kg;s.c. (figure 7). La diminution du taux de récepteurs aux estrogènes, par l'administration de fulvestrant, chez les souris bloque l'effet antidépresseur du trilostane traduisant une implication de ces récepteurs dans l'effet du trilostane. Il faut de plus noter que le fulvestrant est une molécule qui ne passe pas la barrière hémato-encéphalique, ceci confirme donc une fois de plus une action périphérique plutôt que centrale du trilostane. EXEMPLE 7: Effet du trilostane sur l'expression du gène des récepteurs aux estrogènes de type Q Suite au résultat observé avec l'antagoniste des récepteurs aux estrogènes, nous avons mesuré l'effet du trilostane sur l'expression du gène des récepteurs aux estrogènes de type p. L'effet de l'administration à court terme de trilostane est analysé par RT-PCR dans le cerveau, sur des préparations d'ARNm d'hippocampes, et en périphérie, sur des préparations d'ARNm de glandes surrénales (figure 8). Le trilostane, à 25 mg/kg s.c., induit une forte augmentation significative de l'expression des ER(3 dans l'hippocampe et dans les glandes surrénales, mais l'expression n'est pas augmentée par le stress. Cette augmentation, liée au traitement, est plus importante au niveau de l'hippocampe (figure 8A) qu'au niveau des glandes surrénales (figure 8B). Chez les animaux non traités le stress de nage forcée augmente aussi l'expression des ER(3. Ce résultat indique que l'action principale du trilostane passerait par un 20 mécanisme d'induction de ER(31. EXEMPLE 8 : Effet anxiolytique et sur la locomotion du trilostane chez la souris Pour évaluer l'effet du trilostane sur l'anxiété, deux protocoles 25 comportementaux ont été utilisés: le test en champ ouvert et test appelé � light/dark exploration box �. Comportement en champ ouvert (� open-field behavior �) La mobilité générale et des mesures observables d'exploration, ainsi que l'anxiété ont été examinées dans une arène circulaire en bois (diamètre=75cm). Deux cercles concentriques ont été dessinés sur le sol (diamètres de 15 et de 45cm) ; le cercle externe étant divisé en 8 parties et le cercle du milieu étant divisé en 4 parties. La session en champ ouvert consiste à placer la souris dans le cercle central et de mesurer ses mouvements pendant 10 minutes grâce à une caméra vidéo. Les paramètres suivants ont été évalués : (1) l'activité de locomotion, en terme de nombres de parties traversées est ensuite calculée en tant que distance parcourue en mètre ; (2) durée d'immobilité ; (3) vitesse de locomotion ; (4) activité de locomotion dans les 5 parties centrales ; (5) fréquence de reculade ; (6) fréquence de toilettage, et (7) nombre de défécations. Activité de locomotion L'activité de locomotion a été mesurée spécifiquement dans des cages transparentes en PVC (40X40X25cm de haut), en utilisant un compteur à rayons infrarouges (Columbus Instruments). Les animaux ont été placés 2 heures dans les cages et l'activité horizontale a été enregistrée après 1 heure et durant 1 heure avec des intervalles de 10 minutes. Test d'anxiété dit � elevated plus maze � L'état d'anxiété des souris a été évalué en utilisant leur capacité à explorer un labyrinthe en forme de croix, où 2 branches sont ouvertes et non protégées peintes en blanc, et 2 branches fermées peintes en noir. Les branches qui se prolongent de la plateforme centrale, et le labyrinthe sont surélevés de 50 cm par rapport au sol. Chaque souris était placée au centre du labyrinthe et son comportement exploratoire a été enregistré pendant 10 minutes. Le temps passé et le nombre d'entrées dans les branches ouvertes ou fermées ont été enregistrés. Les résultats sont exprimés en temps total passé dans les branches ; nombre total d'entrées dans les branches ainsi qu'en temps passé dans chaque branche par visite. Boite exploratoire lumière/obscurité (ou � Light/dark exploratory box �) L'anxiété a également été évaluée en mesurant la présence d'un compartiment éclairé dans light/dark exploratory box . L'appareil en PVC a été divisé en 2 compartiments, un avec un fond et des parois en blanc (30X25X25cm de haut) ; le second avec un fond et des parois en noir (15X25X25cm de haut), séparés par une porte de 6X6cm. Une lampe à bulbe (75W) a été placée 1,5m au-dessus d'un compartiment blanc. Chaque souris a été placée dans le compartiment blanc et l'activité exploratoire a été enregistrée par vidéo et analysée grâce au logiciel Videotrack� (Viewpoint). Résultats Effet du trilostane sur l'activité générale L'effet du trilostane sur l'activité générale lors du test en champ ouvert est résumé dans le tableau 1 suivant (2 doses : 12,5 et 25mg/kg SC). Tableau 1 Paramètres comportementaux chez des souris traitées par le trilostane lors du test en champ ouvert Trilostane (mg/kg s.c) Paramètre Veh 12.5 25 Test stats.ANOVA Tps latence 8 � 4 5 � 2 2 � 1 F(2,23) = 1.39, avant p > 0.05 déplacement (sec) Locomotion 22.4 � 3.0 21.0 � 2.5 26.3 + 2.1 F(2,23) = 1.18, (mètre) p > 0.05 Loc. au centre 24.8 � 3.8 24.5 � 4.0 24.5 � 2.2 F 0.05 n 8 8 8 Outre le tableau 1, des résultats sont présentés dans la figure 9 (a) profils d'activité et (b) activité de locomotion totale ; (c) temps passé sur les branches ouvertes du labyrinthe et (d) nombre d'entrées dans les branches ouvertes et fermées ; et (e) temps passé dans le compartiment blanc de la black-and-white exploratory box. Les animaux ont reçu du trilostane (12,5 ou 25mg/kg SC) 16 et 2 heures avant les sessions comportementales. Le nombre d'animaux est indiqué en (b, c et e). *p L'activité de locomotion enregistrée pendant 60 minutes après l'administration du trilostane ou de la solution témoin (vehicule) a diminué progressivement dans le temps mais aucune différence parmi les groupes de traitement n'a été notée (voir la figure 9a). Ainsi, aucune différence n'a été observée en terme d'activité de locomotion totale (voir figure 9b). L'anxiété a été étudiée également de façon plus spécifique en utilisant deux protocoles comportementaux, le �elevated plus-maze test� (labyrinthe) et la light/dark exploratory box. Le trilostane a été administré au cours de 2 injections, dans la fourchette de doses allant de 6,3 à 50mg/kg SC. La figure 9c montre que lors du � elevated plus-maze test�, le trilostane augmente le temps passé dans les branches ouvertes avec un effet dose/réponse en courbe de Gauss. Un effet significatif a été observé à une dose de 12,5mg/kg. Le traitement a aussi permis à réduire les entrées dans la branche fermée (voir figure 9d), selon une relation strictement dose dépendante avec un effet significatif pour la dose la plus élevée, mais pas pour les branches ouvertes (voir figure 9d). Lors du test light/dark exploratory box,le trilostane augmente le temps passé dans le compartiment blanc (voir figure 9e) avec un effet dose-réponse en courbe de Gauss, un effet significatif étant observé à une dose de 12,5mg/kg. EXEMPLE 9: Effet du trilostane sur le contenu en BDNF dans 5 l'hippocampe et l'hypothalamus Dans la littérature, la neurotrophine BDNF a été rapportée comme étant impliquée dans la régulation de l'axe HPA en réponse à un stress aiguë ou chronique, et en particulier il a été observé une augmentation rapide des taux d'ARNm codant pour le BDNF dans l'hippocampe, l'hypothalamus et la glande pituitaire. D'autre 10 part, certains travaux révèlent que le BDNF serait impliqué dans la dépression. Ainsi, il a été entrepris dans le cadre de l'invention d'effectuer des dosages de cette neurotrophine dans l'hippocampe et l'hypothalamus. Protocole opératoire Les hippocampes et hypothalamus ont été prélevés après décapitation, 15 pesés, congelés rapidement dans de l'azote liquide à -80°C jusqu'à l'essai. Le test ELISA BDNF max a été réalisé selon les instructions du fabricant (Promega). Résultats La figure 10 montre les dosages du BDNF effectués pour les hippocampes (a) et hypothalamus (b) après administration de trilostane dans une fourchette de 20 doses allant de 6,3 à 50mg/kg en sous-cutané, chez des souris témoins non stressées et chez des souris ayant subi 15 minutes de nage forcée aux jours 1 et 2. Il en résulte que dans l'hippocampe, le stress induit une augmentation significative de 29% en concentration de BDNF, qui n'était pas atténuée par l'administration de trilostane, et que dans l'hypothalamus, aucun changement significatif du contenu en BDNF n'était 25 observé après administration de trilostane. Le stress dû à la nage forcée induit une augmentation de 27% en BDNF, et qui n'était pas atténuée de façon dose dépendante par le trilostane. Les doses de 25 et 50mg/kg induisent un blocage significatif de l'augmentation du contenu en BDNF induit par le stress. REVENDICATIONS1. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement de la dépression. 2. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement de l'anxiété. 3. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une population de sujets âgés. 4. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement de la maladie d'Alzheimer 5. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ce principe actif est administré par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale ou toute autre voie acceptable. 6. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon la revendication 1, caractérisée en ce que les sujets à traiter sont des personnes qui ont subi des effets indésirables liés à l'utilisation des antidépresseurs classiques.