Brevet FR2932817A1 — publié le 20091225

NOUVELLE SOUCHE STREPTOMYCES BARAKATEI, SES COMPOSES ACTIFS DERIVES ET LEUR UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DES PLANTES La présente invention a pour objet une nouvelle souche actinomycète Streptomyces barakatei J-2 ou une souche mutante de celle-ci, ainsi qu'un procédé de sélection de cette souche. L'invention vise aussi un procédé d'extraction et de purification de composés 5 actifs à partir d'une souche barakatei J-2 ou d'une souche mutante, ainsi que les composés actifs obtenus. L'invention concerne également l'utilisation de la souche barakatei J-2, d'une souche mutante ou d'un composé actif pour lutter contre des infections causées par des agents phytopathogènes et/ou pour stimuler la croissance des plantes. 10 La culture agricole a toujours eu une grande importance. Aujourd'hui, les cultures agricoles intensives se développent de plus en plus et la culture de végétaux sains constituent un aspect essentiel pour le bien être et la santé de l'homme. Or, les plantes sont fragiles et sont susceptibles d'être infectées par divers facteurs, en particulier par des agents phytopathogènes, qui réduisent de façon 15 conséquente la qualité et le rendement de l'agriculture. A titre d'exemple, on peut citer un champignon tellurique, Sclerotium rolfsii, agent phytopathogène redoutable qui sévit dans la plupart des régions tropicales et subtropicales. Cet agent fongique attaque plus de 500 familles différentes de plantes et cause diverses maladies dont la fonte des semis ou encore la 20 pourriture de la tige et de la racine. On sait que les maladies phytogènes réduisent de 12 à 14% la production agricole mondiale, 70% des dommages étant d'origine fongique. Il est donc indispensable de trouver des moyens efficaces pour lutter contre les infections causées par des agents phytopathogènes. Actuellement, plusieurs moyens de lutte sont employés. Un premier moyen, simple à mettre en oeuvre, consiste à pratiquer des techniques culturales telles que le labourage ou la rotation des cultures. Toutefois, les agents pathogènes comme Sclerotium rolfsii, produisent des sclérotes dans le sol qui leur permettent de survivre pendant plusieurs années, si bien que les pratiques culturales restent inefficaces en absence de moyens éradiquant dans le sol les formes de résistance et le mycélium pathogène. Une deuxième méthode, la plus utilisée, consiste à traiter chimiquement les cultures infectées. On connaît par exemple le traitement au bromure de méthyle, qui est le fongicide chimique le plus utilisé, généralement pour désinfecter le sol avant l'ensemencement des cultures. Toutefois, le traitement chimique n'est pas non plus satisfaisant car l'utilisation de produits chimiques provoque des effets négatifs sur l'environnement et sur la santé humaine. Le bromure de méthyle en particulier constitue une menace pour la stratosphère à cause du pouvoir catalyseur de l'atome de brome. En outre l'efficacité des agents chimiques est de plus en plus limitée du fait de l'apparition de souches pathogènes résistantes. Depuis quelques années, des solutions plus efficaces et plus respectueuses de l'environnement ont donc été recherchées. Les spécialistes se sont orientés vers la lutte biologique basée sur l'utilisation d'agents biologiques antagonistes naturels. Plusieurs microorganismes, tels que Trichoderma hazianum, Trichoderma koningii ou Pseudomonas fluorescens, ont été utilisés pour contrôler des maladies phytopathogènes, en particulier les infections induites par le champignon Sclerotium rolfsii. Toutefois les agents biologiques existants ne sont pas satisfaisants en terme d'efficacité et de fiabilité et il subsiste un besoin pour des agents biologiques naturels non toxiques pour l'homme et l'environnement, capables de lutter efficacement contre les maladies phytopathogènes. C'est pourquoi la présente invention vise à répondre à ce besoin en proposant une nouvelle souche bactérienne particulièrement efficace pour lutter contre les infections phytopathogènes. A cet effet l'invention a pour objet une souche actinomycète Streptomyces barakatei J-2 déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes CNCM sous le numéro I-3640 et au centre de collection de microorganismes belge LMG sous le numéro P-23734, ou une souche mutante, caractérisée par une séquence de l'AbNr 165 SEQ n°1 déposée dans la banque de données de nucléotides Pubmed/NCBI, sous la référence : DQ385990. Avantageusement, cette souche est très efficace dans la lutte biologique contre les agents phytopathogènes, notamment contre Sclerotium rolfsii. L'invention concerne également un procédé de sélection d'une souche barakatei J-2 ou d'une souche mutante ainsi qu'un procédé d'extraction et de purification de composés actifs (antibiotiques) à partir de ladite souche ou d'une souche mutante, qui présentent une activité antifongique et antibactérienne. La présente invention vise également des composés actifs produits par cette souche barakatei J-2 ou par une souche mutante. L'invention vise aussi l'utilisation de la souche J-2, d'une souche mutante ou de ses composés actifs pour le traitement des plantes, en particulier pour la lutte contre les infections phytopathogènes et/ou pour favoriser la croissance des plantes. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement, en regard des dessins annexés sur lesquels : - figure la qui représente une photo de plantules issues de graines de 5 Arabidopsis thaliana plantées dans un sol sans ajout de sclérotes de Sclerotium rolfsii, - figure lb qui représente une photo de plantules issues de graines de Arabidopsis thaliana plantées dans un sol infesté par des sclérotes de Sclerotium rolfsii, 10 - figure 1c qui représente une photo de plantules issues de graines de Arabidopsis thaliana prétraitées par la biomasse de la souche J-2 et plantées dans un sol infesté par des sclérotes de Sclerotium rolfsii, - figure 2a qui représente le résultat d'une RT-PCR sur l'expression d'un gène témoin EF1aA4, par Arabidopsis thaliana traitée ou non traitée par la 15 souche J-2, - figure 2b qui représente le résultat d'une RT-PCR sur l'expression d'un gène impliqué dans la défense naturelle des plantes, PR1, par Arabidopsis thaliana traitée ou non traitée par la souche J-2, et - figure 2c qui représente le résultat d'une RT-PCR sur l'expression d'un 20 gène impliqué dans la défense naturelle des plantes, PDF1,2, par Arabidopsis thaliana traitée ou non traitée par la souche J-2. 1. Protocole d'isolement de la souche J-2 selon l'invention La souche barakatei J-2 selon l'invention est isolée selon un procédé de sélection comprenant les étapes suivantes : 25 - mise en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir la souche barakatei J-2 et/ou une souche mutante, avec un milieu approprié pour la sélection de souches actinomycètes, - traitement dudit échantillon pour isoler les souches actinomycètes présentes, et - isolement de la souche barakatei J-2 et/ou d'une souche mutante, en fonction de sa capacité à inhiber des agents phytopathogènes. L'isolement de la souche selon l'invention a été effectué à partir d'échantillons de la rhizosphère d'un jardin de la palmeraie de Marrakech. Le protocole est décrit en suivant. Des échantillons de sol d'un jardin de la palmeraie de Marrakech sont prélevés avec une tarière de plus de 10cm de profondeur, après avoir retiré environ 3cm de la surface du sol. Les échantillons prélevés sont placés dans des sachets stériles en polyéthylène, fermés et stockés à 4°C. Les souches actinomycètes sont ensuite isolées sur un milieu OL (Oison) ou un milieu SEA (Soit Extract Agar) selon deux méthodes : traitement par chaleur-15 agitation ou traitement par chimiotactisme. Préférentiellement les échantillons sont traités par la méthode chaleur - agitation. Les échantillons sont mélangés, mis en suspension dans de l'eau distillée stérile (4g pour 36m1) et agités à 200 tours par minute pendant 30 minutes. Ils sont 20 ensuite traités à 50°C pendant 10 minutes. Chaque échantillon est ensuite dilué à 10-', dispersé (0,1 mL) à la surface d'un milieu OL ou d'un milieu SEA, préférentiellement SEA, puis incubé à 30°C pendant 21 jours. Selon une variante les échantillons peuvent être traités par chimiotactisme. 25 Des antibiotiques sont ajoutés dans le milieu d'isolation (OL et SEA), comme de l'acide nalixidique (10mg.L-1) et de la novobiocine (25mg.L-1). Préférentiellement on ajoute de l'acide nalixidique. Des composés antifongiques cycloheximides (40mg.1-1) peuvent également être ajoutés au milieu. Les échantillons sont ensuite incubés à 30°C pendant 3 semaines. Le traitement des échantillons peut être précédé par une étape de pré-traitement par exemple par chauffage, micro-ondes, pulsions électriques ou encore à l'aide de réactifs chimiques. Après traitement des échantillons, on isole les souches actinomycètes par reconnaissance au microscope sur la base de leurs caractéristiques morphologiques. Les actinomycètes sont transférés sur un milieu Bennett. Les isolats purs sont maintenus à 4°C pendant 2 mois. Alternativement, les cultures sont resuspendues 10 et conservées dans 20% de glycérol stérile à -20°C. Pour isoler spécifiquement la souche objet de la présente invention, on réalise un criblage en fonction de sa capacité à inhiber les agents pathogènes suivants - Sclerotium rolfsii - Fusarium oxysporum 15 - Verticillium dahliae - Botrytis cinerae - Pythium ultimum La sélection est réalisée par diffusion agar avec la méthode des cylindres (Bauer et al., 1966). Des actinomycètes purs sont inoculés sur un milieu Bennett. Après 20 une incubation de 5 jours à 30°C, un cylindre calibré (de 6 mm de diamètre) est découpé dans le milieu de culture et placé sur un milieu test contenant les agents phytopathogènes testés. Le milieu de culture est un milieu PDA pour les champignons pathogènes et un milieu Bennett pour les bactéries pathogènes. Les souches sont ensuite maintenues à 4°C pendant 4 heures pour permettre la 25 diffusion des composés antibiotiques puis incubées à 30°C. Les diamètres d'inhibition sont déterminés après 48 heures d'incubation. Parmi les différentes souches montrant une capacité d'inhibition des agents pathogènes testés, la souche barakatei J-2 selon l'invention est sélectionnée pour sa capacité d'inhibition des sclérotes de Sclerotium rolfsii et de la croissance hyphale de Sclerotium rolfsii. Pour le test de germination des sclérotes, des sclérotes de Sclerotium rolfsii sont collectés et désinfectés avec de l'hypochlorite de sodium à 2% pendant 3 minutes et lavés 3 fois avec de l'eau distillée stérile. Dix sclérotes sont disposés à la surface d'un support agar contenant un milieu PDA mélangé avec les souches d'actinomycètes, et le nombre de sclérotes germés est compté après 72heures d'incubation à 25°C. Pour le test de croissance hyphale, un disque mycélien de 8mm est prélevé à partir de colonies de 5 jours de Sclerotium rolfsii et transféré sur un support. Les croissances mycéliennes sont évaluées en mesurant le diamètre des colonies après 72 heures d'incubation à 25°C. La souche selon l'invention est sélectionnée pour sa capacité d'inhibition des sclérotes de Sclerotium rolfsii de 93% et de la croissance hyphale de Sclerotium rolfsii de 80%. Elle est reconnaissable par ses caractéristiques phénotypiques et physiologiques décrites ci-après. II. Caractérisation de la souche selon l'invention La nouvelle souche barakatei J-2 objet de l'invention est une souche bactérienne appartenant à la famille des actinomycètes et au genre des Streptomyces. Elle été déposée le 30 juin 2006 à la CNCM sous le numéro I-3640 et au LMG sous le numéro P-23734. Les actinomycètes ou les actinobactéries sont des bactéries à gram positif qui présentent une forme filamenteuse. Ce sont des bactéries saprophytes capables de dégrader de la matière organique dans le sol et d'utiliser des molécules plus complexes pour leur croissance. La souche bactérienne barakatei J-2 selon l'invention est caractérisée par un mycélium aérien blanc sur milieu ISP2 ou Bennett gélose. Le mycélium de substrat varie de jaune brun à gris brun selon le milieu de culture. La souche selon l'invention présente des spores lisses à chaînes en spirales de 5 type S. Les chaînes comprennent en moyenne 10 à 50 spores. La température de croissance est comprise entre 12 et 37°C, préférentiellement entre 28 et 32°C. Le pH du milieu de culture est préférentiellement compris entre 5 et 9. Pour sa croissance, la souche barakatei J-2 doit être mise en culture dans un 10 milieu contenant une variété de substances nutritives. Par exemple, comme source de carbone on peut utiliser le D-glucose, le mannitol, le lactose, le saccharose, le maltose et la dextrine. En revanche, il est préférable de ne pas utiliser le galactose, l'inositol, le sorbose, le fructose, l'arabinose, le raffinose, le rhamnose et la cellulose. 15 Comme source d'azote on peut utiliser les acides aminés, les sels nitrate et les sels ammonium. La souche barakatei J-2 n'hydrolyse pas l'amidon. Elle réduit les nitrates en nitrites et dégrade l'adénine, le Tween 20 et l'acétate de sodium. La souche selon l'invention peut également être caractérisée par ses 20 caractéristiques moléculaires. Les principales analyses moléculaires utilisées pour la détermination des espèces bactériennes sont le séquençage de l'ADN ribosomal (ADNr) 165 et l'hybridation ADN-ADN. L'hybridation ADN-ADN montre que la souche J-2 selon l'invention correspond à une nouvelle espèce dans le groupe des Streptomyces. Le séquençage de l'ADNr 165 consiste à extraire de l'ADN génomique puis à amplifier par PCR la partie 165 ADNr en utilisant des amorces spécifiques. Le produit de la PCR est ensuite utilisé pour séquencer la partie du 165 ADNr. L'amplification de la partie AbNr 165 de la souche bactérienne J-2 selon l'invention a été effectuée en utilisant deux amorces universelles 27f de séquence SEQ n°2 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') et 1492r de séquence n°3 (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). La séquence ADNr 165 caractérisant la souche bactérienne selon l'invention est la séquence SEQ n°1 1 cgaacgctgg ccgcgtgctt aacacatgca agtcgaacga tgaaccactt cggtggggat 61 tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct tcactctggg acaagccctg 121 gaaacggggt ctaataccgg atacaacact ctcgggcatc cgatgagtgt ggaaagctcc 181 ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 241 cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac tgggactgag acacggccca 301 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc tgatgcagcg 361 acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc tttcagcagg gaagaagcga 421 aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 481 gtagggcgcg agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtctgtcgc 541 gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg cagactagag 601 tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 661 caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 721 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cggtgggaac taggtgttgg 781 cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 841 gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg 901 cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catacaccgg aaacggccag 961 agatggtcgc ccccttgtgg tcggtgtaca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1021 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gttctgtgtt gccagcatgc 1081 ccttcggggt gatggggact cacaggagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga 1141 cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggcaggta 1201 caatgagctg cgaagccgtg aggcggagcg aatctcaaaa agcctgtctc agttcggatt 1261 ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat cagcagtgct 1321 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac 1381 acccgaagcc ggtggcccaa ccccttgtgg gagggagctg tcgaaggtgg gactggcgat 1441 tgggacgaag tcgtaacaag gtagccg Cette séquence SEQ n°1 est déposée dans la banque de donnée de nucléotides Pubmed/NCBI, sous la référence : DQ385990. La présente invention vise également les souches mutantes de la souche barakatei J-2. Par � souche mutante �, on entend désigner toute souche barakatei pouvant être obtenue par mutation sélective à partir de la souche barakatei J-2. Les techniques de mutation consistent à mettre la souche barakatei J-2 en présence d'un agent mutagène physique, tel qu'un rayonnement, ou d'un agent mutagène chimique, puis à sélectionner dans un milieu approprié les mutants d'intérêt restants en utilisant leur spectre antibiotique. La souche barakatei J-2 selon l'invention ou ses souches mutantes, montrent des activités biologiques importantes vis-à-vis de bactéries comme Micrococcus luteus, Bacillus substillus, Bacillus cereus et Streptomyces scabies, et contre des champignons phytopathogènes comme Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Botrytis cineria, Phythium ultimum, Verticillium dahliae, Sclerotium rolfsii. La souche barakatei J-2 selon l'invention ou ses souches mutantes présentent également une forte activité contre les champignons causant les maladies du bois de la vigne comme Phaeomoniella chlamydospora, Phaeomoniella aleophilum, Etypa tata, Fomitiporia mediterranea et Botryosphaeria obtusa. Le spectre d'activités de la souche barakatei J-2 selon l'invention vis-à-vis de certains micro-organismes est présenté dans le tableau ci-dessous. Quatre degrés d'activité ont été mesurés : - pas d'activité + activité (inhibition de 10 à 15 mm) + forte activité (inhibition de 15 à 20 mm) ++ très forte activité (inhibition supérieure à 20 mm) Micro-organisme Activité de J-2 Phaeomoniella chlamydospora ++ Phaeomoniella aleophilum ++ Fomitiporia mediterranea ++ Eutypa Iota ++ Botryosphaeria obtusa ++ Botryosphaeria dothidea ++ Sclerotium rolfsii +++ Botrytis cinerea ++ Verticillium dahliae +++ Fusarium oxysporum ++ Pythium ultimum ++ Streptomyces scabies +++ Micrococcus luteus +++ Bacillus substilis +++ Pseudomonas fluorescens - Escherichia coli - III. Composés actifs susceptibles d'être produits à partir de la souche barakatei J-2 La souche barakatei J-2 selon l'invention est capable de produire des composés actifs. La présente invention propose un procédé d'extraction et de purification de ces composés actifs issus de la souche barakatei J-2. Le procédé d'extraction et de purification selon l'invention comprend les étapes suivantes - fermentation de souches J-2, et - purification des composés actifs. L'étape de fermentation peut être mise en oeuvre selon le protocole décrit en suivant. Un prélèvement de la souche J-2 à partir d'une culture inclinée mature est inoculé dans un flacon Erlenmeyer contenant 50mL de milieu de culture stérile contenant 0,4% de glucose, 1% d'un extrait de malt et 0,4% d'un extrait de levure (ajusté au pH 7,2 avant stérilisation) et mis en culture sur un agitateur rotatif (250 tours par minute) à 30°C pendant 2 jours. Pour la production d'antibiotiques, 3 mL du milieu de culture sont transférés dans des flacons Erlenmeyer contenant chacun 100 mL du milieu de culture stérile décrit ci-avant, et mis en culture pendant 10 jours dans les mêmes conditions. La production de l'activité antibactérienne totale est réalisée sur une gélose nutritive par un test de diffusion sur gélose contre Bacillus subtilis ATCC 6633 et Mucore sp.. L'inhibition de la croissance est examinée après 24 heures d'incubation à 30°C. L'activité antimicrobienne est évaluée en mesurant le diamètre de la zone d'inhibition. Pour récupérer les composés actifs de la souche J-2, cette étape de fermentation est suivie d'une étape de purification. L'étape de purification des composés actifs peut être réalisée comme indiqué ci-après. Le bouillon de culture (10 litres) est centrifugé à 12 000 tours par minute pendant 15 minutes, et le surnageant est extrait deux fois avec un volume égal d'acétate d'éthyle. La phase organique est déshydratée avec du Na2SO4 et séchée avec un évaporateur rotatif. L'extrait brut rouge obtenu est suspendu dans un volume minimum de MeOH, est filtré à travers un filtre avec des pores de 45pm de diamètre et ensuite élué par HPLC en phase inverse dans les conditions suivantes pour obtenir des produits purs : colonne uptisphère UPSODB C18 (250x7,8 mm) soumise à un système solvant à gradient linéaire de 0% à 100% de MeOH pendant 45 minutes et à gradient isocratique à 100% MEOH dans H20 pendant 20 minutes, avec un débit de 1ml/minute et une détection UV à 220 nm. Les fractions correspondant aux pics actifs sont obtenues par test contre Bacillus subtilis et Mucore ramanniamus. Les composés actifs obtenus sont des antibiotiques impliqués dans la lutte 5 biologique et le contrôle des maladies phytopathogènes. La souche barakatei J-2 selon l'invention produit 8 antibiotiques différents, dont quatre ont été identifiés : Cl, C2, C3 et C4. Ces composés bioactifs appartiennent à la famille des cyclopeptides. Les composés Cl, C2 et C3 sont des tétracyclopeptides de formules connues 10 présentant une conformation nouvelle et le composé C4 est une nouvelle molécule. Le composé Cl est un tétracyclopeptide et répondant à la formule suivante : Le composé C2 est un tétracyclopeptide répondant à la formule suivante : Le composé C3 est un tétracyclopeptide répondant à la formule suivante : Caractérisation spectroscopique et physicochimique : Les décalages chimiques (arrangements) des atomes 1H et 13C, des composés Cl, C2 et C3 ont été mesurés en spectroscopie à résonance magnétique nucléaire 5 RMN. Le décalage chimique dans une molécule, décrit la dépendance des niveaux d'énergie magnétique nucléaire avec l'environnement électronique. Les décalages chimiques des atomes 1H et 13C, pour les composés Cl, C2 et C3 (dans du Cb3Ob à 298K) sont décrits dans les tableaux suivants : Position Cl bC bH (mult, J) Pro-a 58,6 4,22 (1H, m) Pro-p 28,1 2,33/1,92 (2H, m) Pro-y 21,8 1,98 (2H, m) Pro-5 44,8 3,55 (2H, m) Pro-Carbonyl 170,9 Val-a 60,1 4,06 (1H, m) Val-p 28,4 2,50 (2H, d sept, 2,6 , 7,0) Val-y 15,2 ; 17,5 1,11 ; 0,94 (6H, d, 7,0) Val-Carbonyl 165,9 Position C2 bC bH (mult, J) Pro-a 58,6 4,22 (1H, m) Pro-p 27,7 2,32/2,05 (2H, m) Pro-y 22,2 2,05/1,94 (2H, m) Pro-5 45,1 3,53 (2H, m) Pro-Carbonyl 171,4 Leu-a 58,3 4,14 (1H, m) Leu-p 38,0 1,92/1,54 (2H, m) Leu-y 28,4 1,90 (6H, m) Leu-5 21,9 ; 20,8 0,97 ; 0,98 (6H, d, 6,4) Leu-Carbonyl 167,5 Position C3 bC bH (malt, J) Pro-a 58,7 4,09 (1H, dd, 8,2, 6,2 1,8) Pro-p 28,0 2,11/1,22 (2H, m) Pro-y 21,3 1,83 (2H, m) Pro-5 44,5 3,55/3,39 (2H, m) Pro-Carbonyl 169,5 Phe-NH 8,00 (1H, br s)* Phe-a 56,3 4,47 (1H, dd, 4,9 1,8) Phe-p 36,8 3,19 (2H, dd, 14,3, 4,9) Phe-y 135,9 Phe-b 129,7 7,26 (2H, d, 7,3) Phe-e 128,0 7,31 (2H, m) Phe- 126,7 7,30 (1H, m) Phe-Carbonyl 165,5 Les molécules Cl, C2 et C3 extraites et purifiées à partir d'une souche barakatei J-2 ou d'une souche mutante selon l'invention présentent une configuration originale qui confère à ces composés actifs des caractéristiques particulières, 10 notamment une activité antibactérienne et antifongique. Les composés Cl, C2 et C3 obtenus à partir d'une souche barakatei J-2 ou d'une souche mutante sont solubles dans le méthanol et le bMSO. Ils montrent des activités biologiques importantes vis-à-vis de bactéries Bacillus substilus, Streptomyces scabies, Candida albicans et Mucore rammianus. En revanche, ils 15 n'ont aucun effet sur les bactéries gram-négatif. 16 5 L'activité antibiotique de chaque molécule Cl, C2 et C3 a été évaluée contre différents microorganismes tests afin de déterminer les concentrations minimales à utiliser pour inhiber le développement de ces microorganismes. Microorganismes Concentration en ug/mI Cl C2 C3 B. substilus 2 2 2 Micrococcus luteus 2 2 2 Streptomyces scabies 2 2 2 Escherichia coli - - - Pseudomonas aeroginosa - - - Mucor rammaniamus 8 4 4 C. albicans 8 4 4 Le composé C4 est une nouvelle molécule de formule Le composé C4 est très hydrophobe. Il est soluble dans le méthanol et montre une activité biologique importante vis-à-vis de Mucore rammianus. Ces composés Cl, C2, C3 et C4 produits par la souche J-2, susceptibles d'être obtenus par un procédé d'extraction et de purification simple à mettre en oeuvre à partir d'une souche barakatei J-2 ou d'une souche mutante, présentent un réel intérêt pour la lutte contre des microorganismes, en particulier contre des agents phytopathogènes. IV. Utilisation d'une souche barakatei J-2, d'une souche mutante ou d'un composé actif Les différentes études relatives aux caractéristiques de la souche J-2 ou d'une souche mutante et des composés actifs produits par cette souche, montrent que ladite souche et lesdits composés actifs sont très efficaces du point de vue de leurs propriétés antibactériennes et antifongiques, ce qui leur confère notamment la capacité d'être utilisés en tant qu'agents de lutte biologique. La souche barakatei J-2 selon l'invention, une souche mutante ou un composé actif produit à partir de cette souche, peuvent donc être utilisés en tant qu'agent antibactérien et/ou antifongique pour la protection des plantes et la lutte biologique contre des agents phytopathogènes, préférentiellement pour la protection des plantes et la lutte biologique contre les infections causées par des champignons phytopathogènes, encore plus préférentiellement pour la protection des plantes contre les infections causées par Sclerotium rolfsii. Ils peuvent également être utilisés pour la protection des plantes vis-à-vis de bactéries gram-positif. Selon un autre aspect la souche barakatei J-2 selon l'invention, une souche mutante ou un composé actif produit à partir de cette souche, sont également 25 particulièrement utiles pour stimuler la croissance des plantes. Des tests ont été effectués pour illustrer l'action de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs sur les plantes. 1) Etude des mécanismes de lutte biologique contre Sclerotium. rolfsii, sur la betterave à sucre Arabidopsis thaliana 1.a) Inhibition in vitro de Sclerotium rolfsii Le but de cette étude est de montrer la capacité de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs, à inhiber in vitro la croissance et la germination des sclérotes de Sclerotium rolfsii, champignon phytopathogène dont Arabidopsis thaliana est l'une des plantes hôte. L'étude est réalisée in vitro dans des boîtes de Pétri, selon le protocole opératoire décrit en suivant. La souche est cultivée en milieu liquide pendant 5 à 7 jours. Les cultures sont ensuite filtrées à l'aide d'un filtre millipore (0,45pm) et le filtrat obtenu est mélangé à un milieu PbA en surfusion dans les proportions suivantes (v/v : filtrat/PDA) : 0/1, 1/1, 2/1 et 3/1. Après couplage du mélange dans des boîtes de Pétri et solidification du milieu, un disque de 8 mm de diamètre prélevé d'une culture de Sclerotium Rolfsii âgée de 5 jours est déposé au centre de chaque boîte. Chaque traitement est répété 5 fois. La croissance mycélienne est mesurée après 48 heures et 72 heures d'incubation à 30°C. Pour mesurer l'inhibition de la germination on dépose 10 sclérotes de Sclerotium Rolfsii, préalablement désinfectés à l'eau de javel (1%) pendant 3 minutes et rincées à l'eau distillée stérile, dans des boîtes de Pétri contenant les mêmes proportions filtrat/PDA. Chaque traitement est répété 5 fois. Après 48 heures et 72 heures d'incubation à 30°C, on compte le nombre de 25 spores germées et on calcule le pourcentage d'inhibition de la germination, en appliquant la formule suivante : Pourcentage d'inhibition = (N - ng) x 100 / N avec N représentant le nombre de sclérotes total, et ng le nombre de sclérotes germés. Les résultats obtenus montrent que la souche J-2 selon l'invention a inhibé la germination de 100% des sclérotes de Sclerotium rolfsii. 1.b) Inhibition dans le sol de Sclerotium rolfsii Le but de cette étude est de montrer la capacité de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs, à inhiber dans le sol de culture l'activité de Sclerotium rolfsii, champignon phytopathogène dont Arabidopsis thaliana est l'une des plantes hôte. L'étude est réalisée dans un sol provenant de Zamemra région de boukala au 10 Maroc, selon le protocole opératoire décrit en suivant. Le sol est autoclavé pendant 8 heures à 120°C afin d'éliminer les Sclérotes naturels et la flore normale du sol. On met ensuite dans des sacs plastiques 25g de sol stérile que l'on mélange avec 20 sclérotes de Sclerotium rolfsii. Le mélange est inoculé par une suspension de 15 spores de la souche J-2 à raison de 108 ufc/g de sol. On réalise également un sachet témoin ne contenant pas le phytopathogène. Les sachets sont scellés et incubés à 30°C. Chaque traitement est répété 5 fois. Après 10 jours d'incubation, les sclérotes sont récupérés et désinfectés à 20 l'hyperchlorite de sodium (1%) pendant 3 minutes puis rincés avec de l'eau distillée stérile et mis en culture sur milieu PbA gélosé. Le pourcentage de mortalité des sclérotes est déterminé après 3 jours d'incubation à 30°C par la formule suivante (bavet, 1986) Pourcentage de mortalité = n x 100 / N 25 avec n représentant le nombre de sclérotes morts et N le nombre total de sclérotes. Les résultats obtenus montrent que la souche J-2 selon l'invention inhibe 93% de sclérotes de Sclerotium. rolfsii dans le sol. 1.c) Protection de graines de betterave à sucre contre la fonte des semis causée par Sclerotium. rolfsii Cette étude a pour objectif de montrer la capacité de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs, à protéger les graines de betterave à sucre des attaques de Sclerotium. rolfsii. L'étude est réalisée dans un sol provenant de Zamemra région de boukala au Maroc. La souche J-2 est cultivée dans un milieu Bennett. Après 7 jours d'incubation à 30°C, les cultures sont récupérées stérilement puis sont filtrées afin de séparer l'inoculum cellulaire du filtrat des cultures. Les sclérotes de Sclerotium rolfsii sont produites séparément. Un cylindre mycélien (5mm de diamètre), obtenu à partir d'une culture de 5 jours de Sclerotium rolfsii sur milieu PbA, est transféré dans des boites de Pétri contenant un milieu PbA. Après 3 semaines d'incubation à 25°C, les sclérotes formés sont raclés de la surface mycélienne et récupérés dans des boîtes stériles puis utilisés immédiatement. Les tests sont ensuite conduits dans des pots en plastique remplis avec du sol stérile ou non stérile à raison de 200g de sol par pot. Les pots sont pré-inoculés avec les sclérotes de Sclerotium rolfsii, puis ensemencés avec des graines de betterave à sucre traitées avec la souche J-2 à raison de 10$ spores/graines. L'ensemble est incubé dans une chambre de culture à 25°C sous une photopériode de 16 heures de lumière pour 8 heures d'obscurité. Les résultats obtenus, présentés sur les figures la à 1c, montrent que l'utilisation de la souche J-2 selon l'invention a permis de protéger les graines de betterave à sucre des attaques de Sclerotium rolfsii. En particulier le pré-traitement par la souche J-2 a permis d'avoir une réduction de plus de 60% de la maladie fonte de semis causée par Sclerotium rolfsii. 1.d) Protection de Arabidopsis thaliana contre la pourriture racinaire causée par Sclerotium rolfsii Le but de l'étude est de montrer la capacité de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs, à protéger les racines d'Arabidopsis thaliana contre les infections de Sclerotium rolfsii. L'étude est réalisée dans un sol provenant de Zamemra région de Doukala au Maroc. La souche J-2 est cultivée dans un milieu Bennett. Après 7 jours d'incubation à 30°C, les cultures sont récupérées stérilement puis sont filtrées afin de séparer l'inoculum cellulaire du filtrat des cultures. Les sclérotes de Sclerotium rolfsii sont produites séparément. Un cylindre mycélien (5mm de diamètre), obtenu à partir d'une culture de 5 jours de Sclerotium rolfsii sur milieu PDA, est transféré dans des boîtes de Pétri contenant un milieu PDA. Après 3 semaines d'incubation à 25°C, les sclérotes formés sont raclés de la surface mycélienne et récupérés dans des boites stériles puis utilisés immédiatement. Les tests sont ensuite conduits comme suit. L'inoculum de l'agent phytopathogène est ajouté à raison de 0,5g de sclérotes de Sclerotium rolfsii à 1kg de sol. Le sol infesté est placé dans des pots en plastique. Un témoin est réalisé avec un sol non infesté. Après 24 heures, le sol est mélangé avec l'inoculum cellulaire de la souche J-2 à raison de 108 cfu/g de sol. Des plants de betterave à sucre de 30 jours sont ensuite plantés dans les pots avec un espacement de 25 centimètres. Les plantes sont cultivées pendant 6 mois dans une chambre de culture à 25°C avec 16 heures de lumière et 8 heures d'obscurité, sous lumière artificielle. Les résultats obtenus montrent qu'après 6 mois de culture sous conditions contrôlées, l'utilisation de la souche J-2 selon l'invention permet de protéger les racines d'Arabidopsis thaliana contre les infections de Sclerotium rolfsii. En particulier la souche J-2 a permis de réduire l'indice de maladie de la pourriture racinaire de 66%. 2) Etude de la protection de la Vigne contre les maladies du bois Cette étude a pour objectif de montrer la capacité de la souche J-2 selon l'invention et de ses composés actifs à protéger in vitro des plants de vigne contre des maladies du bois (ESCA, Ethypiose, BHA) causées par des champignons phytopathogènes. Le protocole opératoire est le suivant. Des entre noeuds de vitro-plants de vigne (cépage sauvignon et cépage colombard) de 5 semaines sont découpés, traités avec des spores de la souche J-2 puis ensemencés dans un milieu MS sous conditions contrôlées. Après 5 semaines d'incubation, les feuilles de chaque vitro-plant sont traitées par une suspension de spores de champignons phytopathogène Eutypia tata. La lecture des résultats est réalisée après une semaine d'infection. Les résultats obtenus montrent que la souche J-2 est capable de protéger la vigne contre les infections de champignons phytopathogènes. 3) Activation des systèmes de défense naturels des plantes L'objectif de cette étude est d'évaluer la capacité de la souche J-2 et de ses 20 composés actifs, à activer des gènes de défense naturelle des plantes, en particulier d'Arabidopsis thaliana. Le protocole opératoire est décrit en suivant. Les plantules d'Arabidopsis thaliana sont pré-traitées au niveau des racines par J-2 ou par deux de ses composés actifs, puis sont réensemencées sur le milieu de 25 culture Gamgorg B5 gélosé déjà inondé par une suspension de spores de Sclerotium rolfsii (105 ufc/ml). L'ensemble est incubé dans une chambre de culture à 25°C. La lecture des résultats est effectuée après une semaine. On constate que le traitement de plantules d'Arabidopsis thaliana par la souche J-2 et par ses composés actifs, active l'expression des gènes liés à la défense des plantes. L'expression des gènes de défense d'Arabidopsis thaliana est mesurée en utilisant la technique de la RT-PCR. Les gènes de défense des plantes étudiés sont PR1 (gène responsable de la synthèse des molécules antifongiques des plantes), PDF1.2a (gène responsable de l'activation des voie éthylène et jasmonate, deux voies importantes de la défense des plantes) et PAL1. La RT-PCR est réalisée sur des plantules cultivées pendant 10 jours. Elle est basée sur l'extraction de leur ARN qui est ensuite converti en AbNc en utilisant le SuperscriptTM II RNAse H-Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen, Carisbad, USA) avec Oligo(dT)22. Les échantillons d'AbNc obtenus sont amplifiés dans un mélange de produits de 15 PCR. Les amorces spécifiques utilisés sont : - pour PR1 : PR1 f de séquence SEQ n°4 : 5' - CTG GCT ATT CTC GAT TTT TAA TCG - 3', PR1 r de séquence SEQ n°5 : 5' - TCC TGC ATA TGA TGC TCC TTA TTG - 3' ; excepté le produit de dimension de 562 pb, 20 - pour PDF1.2a : PbF1 f de séquence SEQ n°6 : 5' - TCA TGG CTA AGT TTG CTT CCA TCA TCA CCC - 3', PbF1 r de séquence SEQ n°7 : - 5' GTA GAT TTA ACA TGG GAC TGC GAC - 3' ; excepté le produit de dimension de 252 pb, - pour PAL1 : PAL1 f de séquence SEQ n°8 : 5' - CGG AGG AGG AGT GGA CGC TAT - 3', PAL1 r de séquence SEQ n°9 : 5' - TGC GAC ACC GTT TTT GGT 25 TCT - 34 ; excepté le produit de dimension de 378 pb. Le témoin de PCR est réalisé par l'utilisation du gène de nettoyage EF1 A4 (Liboz et al., 1990) : EF1 f de séquence SEQ n°10 : 5' - ATG CCC CAG GAC ATC GTG ATT TCA - 3', EF1 r de séquence SEQ n°11 - TTG GCG GCA CCC TTA &CT GGA TCA - 3' ; excepté le produit de dimension de 708 pb. Les conditions thermiques des cycles contiennent une étape de dénaturation initiale à 94°C, 2 minutes, suivie par 34 cycles pour PR1, PDF1.2a et PAL1 ou par 26 cycles pour EF1 A4, de 94°C, 30 secondes, 52°C 30 secondes, 72°C 30 secondes et se termine à 72°c pendant 10 minutes. Le produit PCR est chargé sur gel d'électrophorèse puis visualisé sous UV par fluorescence du bromure d'éthidium. Les résultats d'expériences de la RT-PCR, présentés sur les figures 2a à 2c, montrent que la souche J-2 active l'expression des gènes de défense des plantes PR1 (gène responsable de la synthèse des molécules antifongiques des plantes) et PDF1.2a (gène responsable de l'activation des voie éthylène et jasmonate, deux voies importantes de la défense des plantes). L'activation des ces gènes PR1 et PDF1.2a par la souche J-2 conduit à la 15 production : - d'antibiotiques végétaux, les phytoalexines, - de protéines de défense, les PR-protéines, et - de composés destinés à renforcer les parois des cellules végétales. REVENDICATIONS1. Souche Streptomyces barakatei J-2 déposée à la CNCM sous le numéro I-3640 et au LMG sous le numéro P-23734, caractérisée par une séquence de l'ADNr 165 SEQ n°1. 2. Procédé de sélection d'une souche selon la revendication 1, caractérisé 5 en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - mise en présence d'un échantillon biologique susceptible de contenir la souche barakatei J-2 vec un milieu approprié pour la sélection de souches actinomycètes, - traitement dudit échantillon pour isoler les souches actinomycètes 10 présentes, et - isolement de la souche barakatei J-2 en fonction de sa capacité à inhiber des agents phytopathogènes. 3. Composé actif obtenu par purification à partir d'une souche selon la revendication 1, caractérisé par la formule suivante : r H2C 4. Composé actif obtenu par purification à partir d'une souche selon la revendication 1, caractérisé par la formule suivante : 5. Composé actif obtenu par purification à partir d'une souche selon la revendication 1, caractérisé par la formule suivante : 28 6. Composé actif susceptible d'être obtenu par purification à partir d'une souche selon la revendication 1, caractérisé par la formule suivante : H 7. Utilisation d'une souche selon la revendication 1 ou d'un composé actif selon l'une des revendications 3 à 6, en tant qu'agent antibactérien et/ou antifongique pour la protection des plantes et la lutte biologique contre des agents phytopathogènes. 8. Utilisation selon la revendication 7, pour la protection des plantes et la lutte biologique contre les infections causées par des champignons phytopathogènes. 9. Utilisation selon la revendication 8, pour la protection des plantes contre les infections causées par Sc/erotium ro/fsii. 10. Utilisation selon la revendication 7, pour la protection des plantes vis-à-vis de bactéries gram-positif. 11. Utilisation d'une souche selon la revendication 1 ou d'un composé actif 15 selon l'une des revendications 3 à 6, pour activer les systèmes de défense naturels des plantes. 12. Utilisation d'une souche selon la revendication 1 ou d'un composé actif selon l'une des revendications 3 à 6 pour stimuler la croissance des plantes.