Brevet FR2928655A1 — publié le 20090918

PROCEDE DE DETECTION EN TEMPS REEL DE MICROORGANISMES DANS UN MILIEU DE CULTURE LIQUIDE PAR LYSE CELLULAIRE Le domaine de l'invention est celui du contrôle microbiologique clinique ou industriel. Plus particulièrement, il s'agit d'une méthode permettant d'identifier un ou plusieurs microorganismes par une réaction de lyse cellulaire, effectuée simultanément à l'enrichissement de l'échantillon en microorganismes. L'analyse microbiologique nécessite des techniques précises et dont le temps d'obtention du résultat doit être le plus court possible. Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale. Dans le domaine agroalimentaire, le cahier des charges est identique. Il distingue cependant les microorganismes pathogènes et leurs toxines dont la recherche s' applique aux produits commercialisés, les microorganismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des produits bruts aux produits finis, tout au long de la chaîne, et les bactéries d'intérêt technologique telles les ferments. La détection rapide et précise de contaminations présumées permet de les contrôler et d'engager ainsi des actions correctives. Techniquement, l'analyse microbiologique peut mettre en oeuvre une ou plusieurs phases de pré-enrichissement/enrichissement, une ou plusieurs phases de détection, une ou plusieurs phases d'énumération des microorganismes. Pour des applications particulières telles le contrôle microbiologique agroalimentaire, une phase de confirmation peut également être requise, afin de répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. La phase de pré-enrichissement/enrichissement fait appel à des milieux de culture, sélectifs ou non, bien connus de l'homme du métier. Des milieux de culture prêts à l'emploi, souvent sous forme liquide, basés sur des formules de milieux traditionnels sont disponibles commercialement. La phase de détection se base sur la mise en évidence des caractères métaboliques des microorganismes recherchés. On utilise classiquement des substrats enzymatiques spécifiques. Ces substrats enzymatiques sont généralement composés de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, appelée également partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, appelée partie marqueur, généralement constitué par un chromophore ou un fluorophore. Par le choix de ces substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme ou de discriminer différents groupes de microorganismes. Ainsi, l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence sera la signature d'un genre ou d'un type de microorganismes. A cet égard, l'utilisation de milieux chromogènes permet la détection et l'identification simultanées des germes recherchés. Elle simplifie le processus et diminue sensiblement le délai d'obtention du résultat. On citera à titre d'exemple concret les milieux ChromID� de la demanderesse. Ces milieux chromogènes sont basés sur la détection de caractères métaboliques spécifiques des germes recherchés comme par exemple l'activité enzymatique beta-glucuronidase pour Escherichia coli. Cependant, certains microorganismes, ou certains sous-types comme par exemple Escherichia coli 0157 :H7, ne présentent pas d'activité enzymatique spécifique et ne peuvent donc pas être détectés à l'aide d'un milieu de culture chromogène. La phase de confirmation, quant à elle, est plus particulièrement attachée à l'analyse microbiologique dans le domaine agroalimentaire. En effet, lorsque le résultat des méthodes développées précédemment est positif, il est nécessaire de confirmer la présence du pathogène recherché. Ceci impose un test complémentaire et l'utilisation d'un principe de détection différent de celui utilisé lors de la première analyse. Les techniques de biologie moléculaire, basées sur les caractères génomiques des microorganismes recherchés, constituent l'un des moyens utilisés pour confirmer l'identification. On citera à titre d'exemple les techniques d'amplification classiques telles la PCR (Polymerase Chain Reaction) et la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), qui peuvent être couplées à des techniques de détection en temps réel connues de l'homme du métier. Les immuno-essais constituent une autre des technologies utilisées pour le test de confirmation. Ils font appel aux caractéristiques immunogènes des microorganismes recherchés. De façon non exhaustive, on peut citer les techniques ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), par compétition ou de type sandwich, ou les techniques d'immunoagglutination, détectant des épitopes des microorganismes recherchés. Ces dernières font appel à des supports solides fonctionnalisés, tels des billes (par exemple des particules de latex) recouvertes d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux, lesdits supports fonctionnalisés étant mis en contact avec un échantillon biologique, comme l'indiquent par exemple les brevets européens délivrés EP 0 701 624 et EP 1 199 567. Alternativement, comme décrit dans le brevet US-4,659,658, les particules solides peuvent être recouvertes de lectines se liant spécifiquement à des sucres situés à la surface d'un microorganisme donné. Dans tous les cas, l'apparition de l'agglutination permet d'identifier de façon certaine le microorganisme recherché. L'identification complète et précise d'un microorganisme dans un échantillon nécessite donc l'enchaînement de plusieurs étapes : enrichissement, détection confirmation. La standardisation des tests utilisés en routine a permis l'automatisation des méthodes de détection qui restent cependant longues à mettre en oeuvre. Un inconvénient de l'état de la technique est en effet que ces étapes sont réalisées de manière séquentielle. Un autre inconvénient est que la réaction d'interaction spécifique utilisée pour l'étape de confirmation, réaction immunologique ou réaction d'hybridation moléculaire, est, le plus souvent, lue en � point final �. Pendant ce temps, dans l'industrie agroalimentaire, l'intégralité du lot de produit fini est bloquée en attendant le résultat de la confirmation, et en clinique, la mise en place de l'antibiothérapie pertinente et des mesures de prévention est retardée. Au vu de l'état de la technique considéré, il manque donc un procédé combinant 30 les étapes d'enrichissement, de détection et d'identification précise. Concrètement, un tel procédé conjuguerait rapidité, spécificité, et sensibilité. La présente invention propose donc de pallier les inconvénients décrits supra en mettant en oeuvre simultanément une culture des microorganismes et au moins une réaction de lyse cellulaire par lesdits microorganismes, en milieu liquide. De façon plus précise, l'invention concerne en premier lieu un procédé de 5 détection d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact dans un conteneur ledit échantillon, un milieu favorisant la croissance et/ou la détection du ou des microorganisme(s) cible(s), et une population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) 10 cible(s) ; b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance du ou des microorganisme(s) cible(s) ; c) observer en temps réel une lyse de la population cellulaire, indiquant la présence du ou des microorganisme(s) cible(s), ou confirmant ladite 15 présence lorsque lesdits microorganismes cibles sont détectés à l'issue de l'étape b). Un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection et d'identification d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, 20 comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact dans un conteneur : un milieu favorisant la croissance et/ou l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s), ledit échantillon et population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) cible(s) ; 25 b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance du ou des microorganisme(s) cible(s) ; et c) observer en temps réel une lyse de la population cellulaire permettant de réaliser l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s)ou de confirmer ladite identification, lorsque le ou lesdits microorganismes cible(s) sont 30 identifiés dans ledit milieu de culture, à l'issue de l'étape b). Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de détection et d'identification d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) un milieu permettant la croissance et l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s), ledit échantillon et population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) cible(s) ; b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance des microorganismes ; et c) observer en temps réel une lyse de la population cellulaire permettant de compléter l'identification du ou des microorganisme(s), réalisée à l'issue de l'étape b). Par compléter l'identification, on entend apporter une information supplémentaire permettant de préciser l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s). Par exemple, à l'étape a) , le milieu de culture utilisé peut être spécifique des bactéries du genre Escherichia coli et comporter un substrat spécifique de ce genre bactérien, de sorte que la présence de telles bactéries dans l'échantillon à tester, se caractérise par une modification du milieu de culture, tel un changement de couleur, si le substrat utilisé est un substrat chromogène. La lyse de la population cellulaire (par exemple cellules Vero) intervenant à l'étape c) peut, par exemple, permettre de mettre en évidence une souche particulière du genre Escherichia coli, telle E. coli O157:H7, qui est une souche entéropathogène. Par population cellulaire, on entend tout type de cellule ou vésicule, d'origine naturelle ou issu du génie chimique ou biologique, susceptible d'être lysé de façon spécifique ou non spécifique par le ou les microorganisme(s) cible(s). Un type de cellule apte à être utilisé dans les procédés selon l'invention est par exemple les érythrocytes ou hématies. En effet, ces cellules sont lysées par les bactéries hémolytiques, en particulier les bactéries (3-hémolytiques, telles que certaines souches de Streptococcus et Listeria. Les hématies utilisées sont susceptibles de contenir des composés aidant à la détection, tel que des composés chromophores ou fluorophores, qui sont libérés lorsque les hématies sont lysées. Une technologie permettant d'encapsuler des composés dans les hématies a été développée par la société ERYtech Pharma�. Il peut également être envisagé l'utilisation de vésicules lipidiques dont la membrane peut être lysée de façon spécifique ou non par un type de microorganisme. C'est le cas par exemple des liposomes. La température favorisant la croissance des microorganismes est comprise entre 20 et 44°C et l'échantillon est maintenu à cette température pendant une durée suffisante pour permettre la détection des microorganismes, soit une durée comprise entre 6 et 96 heures. La mise en oeuvre combinée de ces différentes techniques et dans un conteneur unique permet à la fois de gagner du temps et de limiter les manipulations, donc les contaminations des manipulateurs ou des échantillons, entraînant dans ce dernier cas des faux-positifs. En outre, la mise en oeuvre de l'invention peut être automatisée. On notera également que le gain de temps est lié à la fois à la combinaison de deux étapes en une seule et à la détection de la lyse cellulaire en temps réel. Avantageusement, les étapes a) et c) des procédés décrits supra mettent en 20 oeuvre des composés chromogènes (également dénommés chromophores) ou fluorescents (également dénommés fluorophores). Plus particulièrement, dans les deux procédés de détection et d'identification, la détection peut préférentiellement mettre en oeuvre l'apparition ou la disparition d'une 25 coloration ou d'une fluorescence. Par ailleurs, dans tous les procédés objets de l'invention, la lyse cellulaire peut avantageusement être mise en évidence par l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la lyse cellulaire 30 consiste en une hémolyse, à savoir la lyse d'hématies. Un tel mode de réalisation est particulièrement avantageux quand on cherche à mettre en évidence des bactéries hémolytiques. En l'espèce, la réaction d'hémolyse va être mise en évidence par une disparition de la fluorescence. En effet, il s'avère que lors de la lyse des hématies, l'hémoglobine contenue dans ces dernières, se trouve libérée dans le milieu de culture. Elle vient alors masquer la fluorescence émise par les composés fluorogènes contenus dans le milieu de culture. De façon préférentielle, le conteneur est pris dans le groupe constitué par les microplaques, les microcupules, microtubes, les capillaires ou les cartes multipuits. Avantageusement, le procédé objet de l'invention peut en outre comporter une étape d'énumération des microorganismes, de préférence selon la méthode du nombre le plus probable explicitée dans le brevet EP 1 105 457 de la Demanderesse. En outre, l'invention a pour objet un kit de diagnostic permettant la mise en oeuvre du procédé suivant les différents modes de réalisation développés supra. Le kit comporte : - un conteneur ; - un milieu de culture sélectif ou non, ledit milieu de culture contenant ou non un substrat spécifique du métabolisme du genre ou de l'espèce microbienne à détecter ; et - une population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) cible(s). De façon avantageuse, le conteneur est pris dans le groupe constitué par les microplaques, les microcupules, microtubes, les capillaires ou les cartes multipuits. Selon un premier mode de réalisation préférentiel, la population cellulaire est constituée d'hématies. Selon un deuxième mode de réalisation préférentiel, la population cellulaire est constitué de liposomes. Le kit de diagnostic selon l'invention peut comporter en outre au moins un composé chromogène ou fluorescent. Enfin, un dernier objet de l'invention concerne l'utilisation d'un kit de diagnostic selon l'invention, pour détecter et/ou identifier au moins microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit, et des exemples non limitatifs donnés à titre d'illustration. Le procédé objet de l'invention peut être utilisé pour des échantillons d'origine alimentaire, environnementale ou clinique. L'échantillon est défini comme une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'oeufs, de fruits, de légumes, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment que des farines animales. On mentionnera aussi les échantillons liés à l'environnement tels les prélèvements de surface, d'eau, d'air. Les échantillons d'origine clinique peuvent correspondre à des prélèvements de fluides biologiques (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien), de selles, des prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaie, d'organes, de tissus ou de cellules isolées etc. Le contrôle microbiologique correspond à l'analyse d'un échantillon dans le but d'isoler et/ou d'identifier et/ou d'énumérer des microorganismes potentiellement présents tels des bactéries ou des levures. Techniquement, cette analyse comprend la croissance in vitro des microorganismes dans un milieu de culture. Par milieu de culture, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance des microorganismes. Le milieu de culture peut contenir d'éventuels additifs comme par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants etc. Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est-à-dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon ou sur boite de Pétri. Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries gram positif ou gram négatif, les levures, les moisissures et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'oeil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire. D'une manière générale, le milieu de culture peut en sus contenir un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou chromogène. Pour une détection indirecte, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant la croissance des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de 1'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine. Au sens de la présente invention, l'identification du microorganisme recherché, potentiellement effectuée par la recherche de ses caractères métaboliques, doit être confirmée. Cette confirmation peut faire appel à des réactions de lyse cellulaire : Par lyse cellulaire, on entend le résultat d'une action directe ou indirecte des microorganismes sur des cellules ou des vésicules, d'origine naturelle ou non, entraînant une lyse desdites cellules ou une destruction desdites vésicules. La présence dans l'échantillon de bactéries hémolytiques, telles que des streptocoques (3-hémolytiques, peut être détectée par la lyse des hématies contenues dans le milieu de culture. La lyse cellulaire peut être détectée visuellement, ou par un lecteur optique automatique selon différents principes connus de l'homme du métier parmi lesquels on citera, de manière non exhaustive : (1) la détection de l'apparition d'une fluorescence, par libération de fluorophores lors de la lyse, lesdits fluorophores étant initialement contenus dans les cellules ou vésicules en suspension dans le milieu de culture et ; (2) la disparition de la fluorescence dans le milieu, due à son masquage par l'hémoglobine libérée par lyse des hématies initialement en suspension dans le milieu de culture ; (3) la disparition de la fluorescence dans le milieu, due à son masquage par un composé libéré lors de la lyse, ledit composé étant initialement contenu dans les cellules ou vésicules en suspension dans le milieu de culture ; (3) la détection d'un changement ou d'une apparition de couleur par libération de chromophores, lors de la lyse initialement contenus dans les cellules ou vésicules, initialement en suspension dans le milieu de culture ; (4) la détection d'un changement de couleur du milieu de culture due à la libération d'hémoglobine par lyse des hématies initialement en suspension dans le milieu de culture. Les fluorophores utilisables ont été mentionnés supra et comprennent la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de 1'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine. Les chromophores utilisables sont ceux classiquement utilités dans les milieux de 15 culture chromogènes et bien connus de l'homme du métier. Les composés masquant la fluorescence utilisables sont par exemple le paranitrophénol ou l'hémoglobine. 20 Les opérations de culture/identification puis de lyse cellulaire en point final décrites en deux étapes sont, selon la présente invention, combinées en une seule étape, la lyse cellulaire étant détectée en temps réel. A titre d'illustration, on citera l'identification possible dans un échantillon d'origine alimentaire de Listeria monocytogenes : la détection de Listeria monocytogenes peut être effectuée à l'aide 25 d'un milieu de culture sélectif de cette bactérie et la confirmation de la présence de Listeria monocytogenes sera effectuée simultanément par la réaction de lyse cellulaire, détectée en temps réel. Cette réaction de lyse sera obtenu par exemple en utilisant des vésicules synthétiques, du type liposomes, portant à leur surface des motifs reconnus spécifiquement par l'hémolysine produite par Listeria monocytogenes, entraînant ainsi 30 la lyse desdites vésicules. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention peut être mise en oeuvre dans des conteneurs tels des microplaques, des microcupules, des microtubes, des capillaires etc. Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être associé à un dispositif automatique de contrôle microbiologique de type TEMPO� tel que développé par la demanderesse et peut facultativement permettre une énumération des microorganismes détectés. Le procédé, objet de l'invention, peut être mis en oeuvre à l'aide d'un kit comprenant : un milieu réactionnel contenant une base nutritive, des particules sensibilisées et éventuellement un substrat chromogène spécifique du ou des microorganismes recherchés. Ledit milieu est remis en suspension par un aliquot de l'échantillon à analyser. Avantageusement, le kit permettant de mettre en oeuvre le procédé selon l'invention peut aussi contenir un conteneur solide de type microplaque, microtube, microcupule, capillaire, carte VITEK� ou carte TEMPO�. EXEMPLE Enumération des Listeria ivanovii basée sur l'utilisation d'hématies d'origine animale Le test consiste ici en l'énumération de bactéries Listeria ivanovii par voie biochimique en utilisant le système TEMPO�, commercialisé par la demanderesse. Ce test est basé sur un masquage de la fluorescence après lyse spécifique des hématies (libération d'hémoglobine) par Listeria ivanovii, issue d'une souche pure (réf. ATCC 70408) initialement présentes dans un ou plusieurs puits de la carte. Protocole : Etape 1 : remise en suspension du milieu réactionnel par un aliquot de l'échantillon à analyser : Le milieu réactionnel contient : Des hématies d'origine animale (mouton, cheva) - Un marqueur fluorescent (e.g. 7-aminométhylcoumarine (7-AMC), 4-méthylumbélliférone (4-MU)) - Une base nutritive : Eau Peptonnée Tamponnée (référence bioMérieux 51094) Une suspension bactérienne de Listeria ivanovii (1000UFC/m1) est obtenue à partir d'un échantillon de souche pure. 4m1 de milieu réactionnel sont inoculés par un aliquote de 401a.l de la suspension bactérienne, ce qui correspond à une dilution à 1/100eme de la suspension bactérienne. Le milieu réactionnel est ensuite introduit dans une carte TEMPO�, conformément au protocole en vigueur, en vue de réaliser un dénombrement. Etape 2 : incubation de la carte : Les cartes TEMPO sont ensuite incubées à 37°C pendant 16 à 24h. Au cours de cette période d'incubation, la réaction de lyse des hématies due à la production de listeriolysines (hémolysine produites par les Listeria ivanovii) s'effectue simultanément à la croissance bactérienne, en cas de présence de cellules cibles dans le/les puits considérés. Etape 3 : lecture du test après 24h d'incubation : Après incubation, la présence de Listeria ivanovii, dans un ou plusieurs puits de la carte, va induire une lyse spécifique des hématies engendrant ainsi une libération d'hémoglobine et donc, un masquage de la fluorescence dans les puits concernés, définis alors comme positifs. Le nombre de puits positifs est ensuite comptabilisé pour déterminer via la table NPP un nombre d'unités formant colonies (UFC) de Listeria ivanovii par gramme ou millilitre d'échantillon. Tableau 1 : Unité Relative de Fluorescence (RFU) dans chaque type de puits de la carte TEMPO Type de puits Nombre de puits positifs Grand 12 Moyen 8 Petit 1 10 A partir du nombre de puits positifs obtenu, on détermine par la méthode du Nombre le Plus Probable (NPP), la concentration en bactéries de la suspension introduite dans la carte. Ce calcul est réalisé par l'algorithme chargé dans l'instrument TEMPO�. La 15 valeur obtenue est de 10 CFU/ml. Sachant que la suspension bactérienne avait été diluée au 1/100eme dans le milieu réactionnel, on retrouve la concentration de départ de cette dernière qui est de 1000CFU/ml.5 REVENDICATIONS 1. Procédé de détection d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact dans un conteneur : un milieu de culture permettant la croissance et/ou la détection du ou des microorganisme(s) cible(s), ledit échantillon et une population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) cible(s) ; b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance et/ou la détection du ou des microorganisme(s) cible(s) ; c) observer en temps réel une lyse de la population cellulaire, indiquant la présence du ou des microorganisme(s) cible(s), ou confirmant ladite présence lorsque lesdits microorganismes cibles sont détectés à l'issue de l'étape b). 2. Procédé de détection et d'identification d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact dans un conteneur : un milieu de culture permettant la croissance et/ou l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s), ledit échantillon et une population cellulaire susceptible d'être lysée par le ou les microorganisme(s) cible(s) ; b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance et /ou l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s) ; c) et observer en temps réel une lyse de la population cellulaire permettant de réaliser l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s)ou de confirmer ladite identification, lorsque le ou lesdits microorganismes cible(s) sont identifiés dans ledit milieu de culture, à l'issue de l'étape b). 3. Procédé de détection et d'identification d'au moins un microorganisme cible susceptible d'être présent dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à : a) mettre en contact dans un conteneur : un milieu de culture permettant la croissance et l'identification du ou des microorganisme(s) cible(s), ledit échantillon et population cellulaire susceptible d'être lycée par le ou les microorganisme(s) cible(s) ; b) soumettre l'ensemble à une température favorisant la croissance et l'identification des microorganismes ; et c) observer en temps réel une lyse de la population cellulaire permettant de compléter l'identification du ou des microorganisme(s), réalisée à l'issue de l'étape b). 4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la détection ou l'identification dans le milieu de culture met en oeuvre l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence. 5. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel la lyse cellulaire est mise en évidence par l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence. 6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le conteneur est pris dans le groupe constitué par les microplaques, les microcupules, microtubes, les capillaires ou les cartes multipuits. 7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, comportant en outre une étape d'énumération des microorganismes. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la 25 réaction de lyse de la population cellulaire met en oeuvre une réaction bactéries hémolytiques - hématies. 9. Kit de diagnostic microbiologique permettant la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications précédentes, et comprenant : 30 -un conteneur ;20un milieu de culture sélectif ou non, ledit milieu de culture contenant ou non un substrat spécifique du métabolisme du genre ou de l'espèce microbienne à détecter ; et une population cellulaire susceptible d'être lysée par le genre ou l'espèce microbienne à détecter. 10. Kit de diagnostic selon la revendication précédentes, dans lequel la population cellulaire est constituée de cellules ou vésicules naturelles et/ou issues du génie biologique ou chimique. 11. Kit de diagnostic selon la revendication précédente, dans lequel le conteneur est pris dans le groupe constitué par les microplaques, les microcupules, microtubes, les capillaires ou les cartes multipuits. 15 12. Kit de diagnostic selon l'une des revendications 9 à 10, comprenant en outre au moins un composé chromogène ou fluorescent. 13. Utilisation d'un kit de diagnostic selon l'une des revendications 9 à 1l, pour détecter et/ou identifier au moins un microorganisme susceptible d'être présent dans 20 un échantillon. 10