Brevet FR2929958A1 — publié le 20091016

Procédé de criblage de composés anti-tuberculeux Domaine de l'invention La présente invention concerne, en particulier, un procédé de criblage de composés destinés à la prévention ou au traitement de la tuberculose. Arrière plan technique La tuberculose demeure un problème crucial de santé dans le monde. On estime en effet qu'un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis, l'agent causal de la tuberculose, et que cette maladie provoque la mort de plus de 2 millions de personnes par an. La situation est telle que l'OMS a déclaré que la lutte contre cette maladie est une priorité. Malgré un programme de suivi des traitements dans les régions les plus touchées, la situation reste préoccupante. Les facteurs aggravants sont la paupérisation des populations, la fréquente co-infection du bacille tuberculeux et du virus du SIDA, et l'apparition de souches résistantes. Les traitements actuels reposent principalement sur l'utilisation d'antituberculeux qui inhibent la biosynthèse de constituants de l'enveloppe (isoniazide, éthambutol), la transcription (rifampin), la synthèse de protéine (streptomycine) et d'acides nucléiques (quinolones), et pyrazinamide. L'apparition de souches multirésistantes (MDR) est encore aggravée par l'apparition de souches XDR (Extensive Drug Resistant). Il est donc nécessaire de renouveler l'arsenal à la disposition des médecins pour lutter contre cette maladie. La compréhension des mécanismes moléculaires permettant au bacille tuberculeux de se multiplier dans un environnement hostile, tel que le macrophage, et de survivre dans l'hôte, est importante dans le cadre de la mise au point de nouvelles stratégies pour combattre la maladie. L'enveloppe cellulaire des mycobactéries pathogènes joue un rôle important dans les interactions hôte-pathogène et dans la résistance de ces microorganismes aux traitements chimio-thérapeutiques (Daffé & Draper (1998) Advances in microbial physiology 39 131-203; Jarlier & Nikaido (1990) J. Bacteriol. 172:1418-1423). L'enveloppe est constituée d'une membrane plasmique classique, entourée d'une paroi complexe formée de glucides et de lipides, qui elle-même est entourée d'une couche externe (Daffé & Draper (1998) Advances in microbial physiology 39 131-203). La nature chimique inhabituelle de cette enveloppe la rend difficile à dégrader par l'hôte. Le compartiment le plus externe de l'enveloppe cellulaire des espèces mycobactériennes pathogènes consiste en une structure liée de façon lâche, nommée capsule (Chapman et al. (1959) J. Bacteriol. 77: 205-211; Daffé & Draper (1998) Advances in microbial physiology 39: 131-203; Hanks (1961) Int. J. Leprosy 26:172-174). Il a été précédemment montré que la capsule est essentiellement composée de glucides et de protéines, avec seulement une quantité limitée de lipides spécifiques de l'espèce ou du type de bactérie (Lemassu et al. (1996) Microbiology 142: 1513-1520, Ortalo-Magné et al. (1995) Microbiol. 141: 1609-1620). Bien que les mycobactéries relarguent une partie de ce matériel dans le milieu de culture durant la croissance in vitro (Ortalo-Magné et al. (1995) Microbiol. 141: 1609-1620), il est clair que la capsule recouvre les bactéries qui se multiplient in vivo (Schwebach et al., (2002) Infect. Immun. 70: 2566-2575), vraisemblablement retenue par la membrane des phagosomes (Daffé & Draper (1998) Advances in microbial physiology 39: 131-203). Le principal constituant glucidique de la capsule de M. tuberculosis, qui représente jusqu'à 80% des polyosides extracellulaire, est un a-glucane de haut poids moléculaire (>100,000 Da) composé d'un noyau - 4-a-D-GIc-1 - qui est branché en moyenne tous les 5 à 6 résidus par des oligoglucosides (Dinadayala et al., (2004) J. Biol. Chem. 279: 12369-12378; Lemassu & Daffé, (1994) Biochem. J. 297: 351-357, Ortalo-Magné et al. (1995) Microbiol. 141: 1609-1620). Etant donné que la véritable nature de la surface mycobactérienne n'a été élucidée que très récemment, il n'y a à l'heure actuelle que peu d'information disponible sur les fonctions biologiques de ses constituants. Résumé de l'invention Les inventeurs ont démontré que les gènes glgC, glgA, Rv3032 et glgB codent pour des protéines impliquées dans la biosynthèse du glucane et /ou du glycogène de M. tuberculosis. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que, de manière inattendue, le gène glg8, codant pour l'enzyme de branchement, est essentiel à la survie de Mycobacterium tuberculosis (voir l'Exemple 2). De plus, ils n'ont pu observer aucune croissance bactérienne après inactivation concomitante des gènes gigA et Rv3032, codant pour les enzymes d'élongation. Ceci indique que des composés inhibant le fonctionnement des produits de ces gènes auront une activité antibactérienne. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, pour l'identification de composés à activité antibiotique. La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés à activité antibiotique, comprenant les étapes suivantes : - mettre un composé dont on souhaite déterminer l'activité antibiotique en présence d'une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 ; - mesurer l'activité de l'enzyme en présence du composé ; - comparer l'activité de l'enzyme en présence du composé à son activité en l'absence du composé ; - sélectionner le composé comme antibiotique si l'activité de l'enzyme en présence du composé est plus faible qu'en l'absence du composé. La présente invention concerne également un composé inhibant une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, pour son utilisation comme antibiotique. La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé inhibant une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, pour la préparation d'un antibiotique. La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement d'une infection bactérienne chez un individu, comprenant l'administration à l'individu d'un composé inhibant une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, notamment dans une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace. La présente invention concerne également un vaccin comprenant une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, à titre de substance active. Par ailleurs, les inventeurs ont montré de manière inattendue qu'une souche mycobactérienne mutante dans laquelle le gène gigA est inactif se maintenait significativement moins bien dans des organes infectés qu'une souche sauvage (voir l'Exemple 4). Une telle caractéristique est avantageuse pour la préparation d'un vaccin antituberculeux à partir de cette souche. La présente invention concerne donc également un vaccin comprenant au moins une souche bactérienne du genre Mycobacterium, notamment de l'espèce M. tuberculosis, dans laquelle le gène gigA est inactivé. Description détaillée de l'invention On désigne par � antibiotique � un composé ayant une activité antibactérienne. Il peut notamment s'agir d'un bactériostatique ou d'un bactéricide. De préférence, les antibiotiques selon l'invention ciblent des bactéries du genre Mycobacterium et plus préférablement de l'espèce Mycobacterium tuberculosis. On désigne par � polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 � un assemblage d'unités a- D-glucose, de préférence sous forme pyranose, qui sont reliées entre elles par l'intermédiaire d'une liaison glycosidique formée à partir du groupement hydroxy porté par l'atome de carbone en position 1 de la molécule de glucose et du groupement hydroxy porté par l'atome de carbone en position 6 ou par l'atome de carbone en position 4 de la molécule de glucose. Une représentation d'une molécule d'a-D-glucopyranose (a-D-Glcp) est donnée ci-après : OH Une représentation d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 est donnée dans la Figure 1. De préférence, le polymère de glucose est choisi dans le groupe constitué du glucane et du glycogène. On désigne par � glycogène � un polymère de glucose de haut poids moléculaire, en particulier ayant un poids moléculaire supérieur à 100,000 Da, composé de résidus - 4-a-D-Glc-1 - branchés, tous les 5 à 6 résidus environ, sur le groupement hydroxy situé sur le carbone en position 6 de la molécule de glucose par des enchaînements d'unités a-D-Glc également reliée entre elles par l'intermédiaire de liaisons a-1,4. In vivo, le glycogène bactérien, notamment mycobactérien, est principalement localisé à l'intérieur de la cellule. On désigne par � glucane �, un polymère de glucose dont les caractéristiques structurales sont similaires à celles du glycogène. In vivo, le glucane, notamment mycobactérien, est principalement localisé à la surface de la bactérie. On désigne par � enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 �, toute enzyme d'origine bactérienne qui catalyse une réaction d'allongement d'un polymère de glucose en ajoutant une ou plusieurs unités a-D-Glcp sur un groupement hydroxy libre situé sur le carbone en position 4 ou en position 6 des glucoses du polymère. On désigne par � enzyme d'origine bactérienne �, toute enzyme qui peut être trouvée à l'état naturel dans une bactérie ou qui est dérivée d'une telle enzyme par un nombre limité de modifications. De préférence l'enzyme est choisie dans le groupe constitué d'une a-1,4-glucosyltransferase et d'une enzyme de branchement. L'a-1,4-glucosyltransferase, également appelée glycogène synthase, est définie par la classe EC 2.4.1.11 dans la classification de l'union internationale de biochimie et de biologie moléculaire. L'enzyme de branchement est définie par la classe EC 2.4.1.18 dans la classification de l'union internationale de biochimie et de biologie moléculaire. De préférence, l'enzyme appartient au genre Mycobacterium et plus préférablement appartient à l'espèce Mycobacterium tuberculosis. Comme on l'entend ici, une enzyme � appartient � au genre Mycobacterium et à l'espèce Mycobacterium tuberculosis, si elle est exprimée à l'état naturel par des telles bactéries. De préférence, l'enzyme est choisie dans le groupe constitué de GIgA, de GIgB et de Rv3032, et plus préférablement l'enzyme est GIgB. GIgA est une a-1,4-glucosyltransferase qui est codée par le gène gigA. Chez M. tuberculosis gigA est également noté Rv1212c et est représenté par SEQ ID NO : 21. GIgA de M. tuberculosis est représenté par SEQ ID NO : 22. GIgB est une enzyme de branchement qui est codée par le gène glg8. Chez M. tuberculosis glg8 est également noté Rv1326c et est représenté par SEQ ID NO : 23. GIgB de M. tuberculosis est représenté par SEQ ID NO : 24. Rv3032 est une a-1,4-glucosyltransferase qui est codée par le gène Rv3032. Chez M. tuberculosis Rv3032 est représenté par SEQ ID NO : 25. Le rôle de ces enzymes dans la synthèse du glycogène et du glucane de M. tuberculosis est résumé dans la Figure 1. Comme on l'entend ici, � l'identification � de composés à activité antibiotique comprend toute activité aboutissant à la mise en évidence de composés à activité antibiotique. Il peut s'agir de méthodes expérimentales ou de modélisation, dans lesquelles les composés sont sélectionnés à partir de banques de molécules, physiques ou modélisées, ou sont synthétisés, in vitro ou in silico. Comme on l'entend ici, le � criblage � désigne une méthode dans laquelle on recherche un composé ayant la caractéristique d'inhiber une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 au sein d'une banque de molécule. De préférence, le criblage est un criblage à haut débit. La mesure de l'activité enzymatique de telles enzymes est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Takata et al. (1994) Applied and Env. Microbiol. 60: 3096-3104, Guan et Preiss (1993) Plant Physiol. 102: 1269-1273. Les vaccins de l'invention sont utiles tant pour prévenir les infections bactériennes que pour les traiter. Le vaccin comprenant une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 permet d'induire la production d'anticorps dirigés contre l'enzyme et donc doués d'une activité antibactérienne. S'agissant du vaccin comprenant au moins une souche bactérienne du genre Mycobacterium dans laquelle le gène glgA est inactivé, il est particulièrement adapté à la production de vaccins vivants atténués. D'autres gènes que glgA peuvent également être inactivés afin de moduler la virulence de la souche. De nombreuses techniques sont disponibles et bien connues de l'homme du métier, dont celles présentées dans les Exemples, pour inactiver glgA. Description des figures Figure 1 La figure 1 représente la voie métabolique de synthèse du glycogène et du glucane dans M. tuberculosis. Figure 2 La figure 2 représente le rapport Glc / (Glc + Ara + Man) (axe des ordonnées) pour les souches indiquées en abscisse. Les écarts statistiquement significatifs par rapport à la souche H37Rv sont repérés par deux étoiles (**). Figure 3 La figure 3 représente la masse de glycogène rapportée à la masse de bactérie (quantité de glycogène, axe des ordonnées) en prenant la souche H37Rv comme base 100, pour les souches indiquées en abscisse. Les écarts statistiquement significatifs par rapport à la souche H37Rv sont repérés par deux étoiles (**). Figures 4 à 9 Les figures 4 à 9 représentent la multiplication et la persistance (axe des ordonnées, Log du nombre d'unité formant colonies (UFC) par organe) de H37Rv sauvage (triangles), de H37RvAtreZ (carrés), de H37RvAgIgC (cercles), de H37RvARv3032 (losanges), et de H37RvAgIgA (croix) dans les poumons (figures 4, 6 et 8) et la rate (figures 5, 7 et 9) de souris BALB/c, en fonction du temps (axe des abscisses, nombre de jours après infection). Les résultats sont exprimés comme la moyenne � écart-type du nombre d'UFC pour 5 souris infectées. Les souris ont été infectées soit par intraveineuse (H37Rv, H37RvARv3032, H37RvAgIgA, figures 6 à 9) soit par voie aérienne (H37Rv, H37RvAtreZ, H37RvAgIgC, figures 4 et 5). Le symbole étoile (*) représente les écarts statistiquement significatifs. Exemples Matériels et méthodes Souches bactériennes et conditions de culture E. col/ XL1-blue, la souche utilisée pour les expériences de clonage, a été propagée dans le milieu de Luria Bertani (LB) (pH 7.5) (Becton Dickinson, Sparks, MD). M. tuberculosis H37Rv a été cultivée à 37°C en milieu Middlebrook 7H9 supplémenté par 10% de milieu d'enrichissement ADC (Difco) et 0,05% de Tween 80, et en milieu minimum de Sauton sous forme de pellicules de surface, sur un milieu agar Middlebrook 7H11 supplémenté en OADC (Difco). Lorsque nécessaires, les antibiotiques ont été ajoutés aux concentrations suivantes : kanamycine, 20 pg/ml; hygromycine B, 50 pg/ml. Du saccharose à 2% a été ajouté au milieu solide pour la sélection des mutants par échange d'allèles. Construction des mutants treZ, glgB, glgA, glgC et glgA-Rv3032 La méthodologie ts/sacB décrite par Pelicic et al. (1997) Proc. Nat/. Acad. Sc/. USA 94: 10955-10960 a été utilisée pour remplacer les allèles aux loci treZ (Rv1562c), glgC (Rv1213) et Rv3032 de M. tuberculosis H37Rv. Le gène gigA (Rv1212c) a été invalidé en utilisant une procédure de recombinaison homologue en deux étapes (Jackson et al. (2001) In Mycobacterium tuberculosis protocols. Vol. 54. Parish, T. and Stocker, N.G. (eds). Totowa N J: Humana Press, pp. 59-75). Le caractère essentiel de glg8 (Rv1326c) a été étudié en suivant une stratégie classique basée sur la construction d'une souche mérodiploïde (Jackson et al. op. cit.). Des stratégies PCR classiques on été utilisées pour amplifier les gènes treZ, glg8, gigA, Rv3032 et glgC de M. tuberculosis H37Rv. gigA et ses régions flanquantes ont été amplifiés en utilisant les amorces glgA.1 (5'-gcggaattccgcggtcgcattttcacgtgg-3', SEQ I D NO : 1) et glgA.2 (5'-gcggaattcggatggtcgacgaccatatcc-3', SEQ ID NO : 2). L'allèle invalidé du gène gigA a été construit en clonant le gene de résistance à la kanamycine (Km) à partir de pUC4K (Amersham Pharmacia Biotech) dans les sites Ncol de gigA. La 9 digestion par Ncol à conduit à la suppression de 253 pb de la séquence codante de gigA. glgA::Km a ensuite été cloné dans pJQ200-xylE (Stadthagen et al., (2007) J. Biol. Chem. 282:27270-27276), pour donner pJQgIgAKX, le plasmide utilisé pour le remplacement allélique. glgB et ses régions flanquantes ont été amplifiées en utilisant les amorces B130.2 (5'-gcatttggtcctgaagaagctacg-3', SEQ ID NO: 3) et B130.4 (5'-ggggatatccacagcgccgaagtgggcgg-3', SEQ ID NO : 4). L'allèle invalidé du gène glgB a été construit en clonant la cassette Km dans les sites Sali de glgB. La coupure par Sali a conduit à la suppression de 740 pb de la séquence codante de glgB. glgB::Km a ensuite été cloné avec le marqueur coloré xylE (Pelicic et al. op. cit.) dans le site BamHl de pJQ200 (Quandt & Hynes. (1993) Gene 127: 15-21) pour donner pJQgIgBKX, la construction a été utilisée pour le remplacement allélique au locus glgB. glgC et ses régions flanquantes ont été amplifiées en utilisant les amorces C364.1 (5'-cccgaattcggctgggatagacccgcaac-3', SEQ ID NO : 5) et C364.2 (5'-cccgaattcggcgtttcatcagcagttcg-3', SEQ ID NO : 6), puis insérée dans le vecteur pGEM�-T easy (Promega), pour donner pGEMTgIgC. L'allèle invalidé du gène glgC a alors été construit en clonant la cassette Km dans le site BamHl de glgC. glgC::Km a été finalement cloné avec le gène xylE dans le site BamHl de pPR27 (Pelicic et al. op. cit.), pour donner p27glgCKX. treZ a été amplifié en utilisant le couple d'amorces B48.2 (5'-gcttcctgggcggcgcataccatc-3', SEQ ID NO : 7) et B48.3 (5'-cccgaattcggccggctccgcagcccgcag-3', SEQ ID NO : 8). L'allèle invalidé du gène treZa été construit en clonant la cassette Km dans le site Xhol de treZ treZ::Km a ensuite été cloné avec le gène xylE dans le site BamHl de pPR27, pour donner p27treZKX. Le gène Rv3032 et ses régions flanquantes ont été amplifiées par PCR à partir de l'ADN génomique de M. tuberculosis H37Rv en utilisant les amorces Rv3032.1 (5'-gggctgcagatcgccggcgcgctggcc-3', SEQ ID NO : 9) et Rv3032.2 (5'- tgagccatgtcgcctccctgg-3', SEQ ID NO : 10). L'allèle invalidé, Rv3032::Str, a été obtenu en insérant une cassette de résistance à la streptomycine dans le site de restriction Smal de Rv3032. Rv3032::Str a ensuite été cloné dans pPR27-xylE coupé par Notl et à bouts francs pour obtenir pPR27Rv3032SX, la construction utilisée pour le remplacement allélique dans H37RvAgIgA. Complémentation des mutants glgA, glgB, glgC and treZ Les copies sauvages des gènes gigA, glg8, glgC and treZ de M. tuberculosis H37Rv portées par le plasmide d'expression mycobactérienne pVV16 (Jackson et al., 2000), respectivement dans pVVgIgA, pVVglgBtb, pVVglgC et pVVtreZ, ont été utilisées pour les études de complémentation. Les amorces utilisées pour amplifier glgC étaient glgC.1 (5'- gggctôcaôccatgagagaagtgccgcac-3', SEQ ID NO: 11) et glgC.2 (51- cccaagcttgatccaaacacccttgcccacg-3', SEQ ID NO : 12). glgZ.2 (5'- tggtgggcatatgcctgaattccgagtatgggc-3', SEQID NO : 13) et glgZ.3 (51-gggaaôcttggccggctccgcagcccgcag-3', SEQ ID NO : 14) ont été utilisées pour amplifier treZ glgA.5 (5'-ccgcgcgcatatgcgggtggcgatgttgactc-3', SEQ ID NO : 15) et glgA.6 (5'-cccaagcttcgcgcacaccttccggtagatg-3', SEQ ID NO : 16) ont été utilisées pour amplifier gigA. glgB.1 (5'-cccccccccatatôagtcgatccgagaaactcacc-3', SEQ ID NO : 17) et glgB.2 (5'-gggaaôcttggcgggcgtcagccacagcgc-3', SEQ ID NO : 18) ont été utilisées pour amplifier glg8. De plus, le gène glg8 d'E. col/ a été amplifié par PCR en utilisant les amorces glgBc.5 (5'-ggccgggcatatgtccgatcgtatcgatagagac-3', SEQ ID NO : 19) et glgBc.6 (5'-cccaagcttttctgcctcccgaaccagccag-3', SEQ ID NO : 20) puis cloné dans pVV16, pour donner pVVglgBcoli. Les amorces ont été conçues pour générer des produits PCR correspondant aux gènes entiers dépourvus de leur codons STOP et portant les sites de restriction Ndel ou Pstl et Hindlll (soulignés dans les séquences d'amorces ci-dessus), permettant un clonage direct dans pVV16. Dans ce vecteur, les gènes sont exprimés de manière constitutive sous le contrôle des signaux de transcription et de traduction de hsp60 et les protéines recombinantes produites portent une étiquette de six histidines à leur extrémité C-terminale. La production des protéines recombinantes dans les mutants complémentés a été analysée par immunomarquage avec l'anticorps monoclonal Penta-His de Qiagen comme décrit précédemment (Jackson et al., (2000) J. 8iol. Chem. 275: 30092-30099). Croissance et persistance de M. tuberculosis chez la souris Des souris BALB/c femelles (âgées de 6 à 8 semaines) achetées chez CERJanvier (Le Genest St Isle, France) ont été infectées par voie aérienne avec M. tuberculosis H37Rv sauvage ou avec les souches mutantes treZ et glgC comme décrit précédemment (Raynaud et al. (2002) Mol. Microbiol. 45: 203-217). Des souris ont été infectées par voie intraveineuse par 105 UFC de M. tuberculosis sauvage ou par les mutants glgA et Rv3032 comme décrits par Jackson et al. (1999) Infect. Immun. 67: 2867-2873. Cinq souris ont été utilisées par point expérimental et par souche. Extraction, purification et analyse des glucane et glycogène mycobactériens Les souches de M. tuberculosis ont été cultivées en voile sur milieu de Sauton. Les polysaccharides relargués dans le milieu de culture, dont le glucane, ont été extraits et purifiés selon Lemassu & Daffé (1994) op. cit. Le contenu en glucane a été déterminé après analyse en chromatographie gazeuse des produits d'hydrolyse trimethylsililés, en observant le taux de glucose (provenant du glucane) libéré par rapport à celui du mannose et de l'arabinose constitutifs d'autres exopolysaccharides (manane et arabinomanane). Les glucanes ont été purifiés selon Lemassu et Daffé (1994) op. cit. Les glycogènes intracellulaires ont été extraits à partir de bactéries stérilisées, lavées, pesées, puis cassées à la presse de French (140 bars). Après élimination des cellules non cassées et des parois par centrifugations, les glycogènes ont été purifiés selon Bueding & Orrell (1964) J Biol Chem. 239: 4018-20. Le contenu en glycogène a été donné par le rapport de la masse de glycogène purifié ramené à la masse de bactéries. Les glycogènes et glucanes ont été analysés par RMN et par DLS selon Dinadayala et al., (2004) J. Biol. Chem. 279: 12369-78. Exemple 1 Identification de gènes de M. tuberculosis H37Rv impliqués dans la biosynthèse de l'a-D-glucane et du glycogène Les glucanes de la capsule de M. tuberculosis et de la souche BCG de M. bovis sont composées d'unités répétées de résidus - 4-a-D-Glcp-1 - et de quelques unités 4-a-D-Glcp substituées en position 6 avec un à plusieurs résidus a-D-Glcp, indiquant une structure de type glycogène hautement branchée. Etant données les ressemblances structurales entre l'a-D-glucane et le glycogène, on pense que la synthèse des deux polyosides implique des réactions catalytiques semblables. Les deux polyosides peuvent même partager, au moins partiellement, une voie de biosynthèse commune. En plus du gène Rv3032 de l'a-1,4 glucosyltransférase, dont il a récemment été montré qu'il était impliqué dans la synthèse du 6-O-methylglucosyl lipopolysaccharide (MGLP) et du glycogène (Stadthagen et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:27270-27276), quatre gènes ont été identifiés comme pouvant potentiellement participer à la synthèse de l'a-D-glucane et/ou du glycogène dans le génome de M. tuberculosis H37Rv. Rv1213 code pour une ADPGIc pyrophosphorylase. Le produit de ce gène partage 35% d'identité d'acides aminés avec l'ADPGIc pyrophosphorylase (GlgC) d'E. col/ qui est responsable de la synthèse du donneur de glucosyle, l'ADP-Glc. Rv1213 est immédiatement adjacent au gène putatif de la glycogène synthase, gIgA (Rv1212c), dont l'orthologue chez Corynebacterium glutamicum a été impliqué dans la synthèse du glycogène (Tzvetkov et al. (2003) Microbiology 149:1659-1673). Rv1326c code une enzyme de branchement de l'a-1,4-glucane potentiellement responsable du branchement des unités oligoglucosyles sur le squelette glucosidique (Garg et al. (2007) Protein Expr. Purif. 51:198-208). Rv1326c partage 48% d'identité d'acides aminés (63% de similarité) avec l'enzyme de branchement d'E. coll. Ce gène de type glgB de M. tuberculosis est arrangé en opéron avec gIgE (Rv1327c), un gène codant une glucanase dont l'orthologue chez M. smegmatis est nécessaire à la dégradation et au recyclage du glycogène (Belanger & Hatfull (1999) J. Bacteriol. 181:6670-6678). Il est aussi adjacent à un autre gène catabolique, glgP (Rv1328), codant probablement une glycogène phosphorylase (Schneider et al. (2000) Mol. Gen. Genet. 263: 543- 553). Finalement, Rv1562c (treZ) est le troisième gène d'un opéron qui a été impliqué dans le métabolisme du tréhalose (De Smet et al. (2000) Microbiology 146: 199-208 ; Woodruff et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 28835-28843). La similarité de séquence que Rv1562c partage avec les enzymes de branchement de l'a-1,4-glucane bactériennes (26% d'identité avec la protéine GIgB d'E. col/ sur un recouvrement de 241 acides aminés) suggérait qu'il pouvait aussi catalyser le branchement du glycogène et/ou de l'a-D-glucane. Toutefois, les inventeurs ont montré qu'il n'était pas impliqué dans cette activité tandis qu'il est maintenant connu pour être impliqué dans la synthèse du tréhalose. La voie métabolique de synthèse du glycogène et du glucane dans M. tuberculosis est résumée dans la Figure 1. Exemple 2 Invalidation des gènes glgA, glgB, glgC et treZ par échange d'allèle chez M. tuberculosis H37Rv glgA, glgC et treZ ont été invalidés par recombinaison homologue dans M. tuberculosis H37Rv comme indiqué ci-dessus. Le remplacement allélique aux loci glgA, glgC et treZ a été confirmé dans chaque mutant par hybridation de Southern. Un mutant glgA, un mutant treZ et un mutant glgC ont été sélectionnés pour la suite de l'étude et sont respectivement désignés H37RvAgIgA, H37RvAtreZ et H37RvAgIgC. De manière inattendue, en dépit de plusieurs tentatives d'invalidation du gène glgB gene chez M. tuberculosis H37Rv, aucun candidat d'échange allélique n'a pu être isolé. Il a toutefois été possible de réaliser un crossover simple au locus glgB. Afin de déterminer si l'impossibilité d'invalider le gène glgB était due à son essentialité, les inventeurs ont alors réalisé une expérience d'échange allélique en utilisant une souche mérodiploïde de M. tuberculosis. Cette souche a été construite en transformant le clone ayant subi un crossover simple au locus glgB avec pVVglgBtb. Le remplacement génique a ensuite été mis en oeuvre en suivant les procédures classiques (Jackson et al. op. cit.). Une analyse par PCR et hybridation de Southern de 8 clones correspondant à des recombinants ayant potentiellement subi un double crossover ont montré que l'échange allélique avait eu lieu au locus chromosomique glgB de 5 d'entre eux. Ainsi, l'expression de glgB à partir de pVVglgBtb est suffisante pour la survie d'un mutant invalidé de M. tuberculosis, ce qui indique que ce gène est essentiel à la croissance. Le remplacement allélique au locus glgB de M. tuberculosis a également pu être mis en oeuvre en présence d'une copie sauvage du gène glg8 d'E. col/ exprimé à partir de pVVglgBcoli, suggérant que les deux orthologues de glg8 ont une fonction similaire. Enfin, bien qu'il soit possible d'obtenir des mutants invalidés simples pour gigA et Rv3032 (Stadthagen et al. op. cit.), deux expériences indépendantes d'invalidation du gène Rv3032 dans H37RvAgIgA afin de créer un mutant déficient pour les deux a-1,4 glucosyltransferases ont été infructueuses. Ainsi, une copie fonctionnelle d'au moins un de ces deux gènes est nécessaire à la croissance de M. tuberculosis H37Rv. Exemple 3 Analyse qualitative et quantitative des mutants glgA-, glgB-, glgC" et treZ chez M. tuberculosis H37Rv L'analyse de la production de glucane est donnée par le rapport glucose (Glc) versus Glc + arabinose (Ara) + mannose (Man) (Figure 2), le glucose étant le seul monosaccharide constitutifs du glucane, et l'arabinose et le mannose les constitutifs de mananne et d'arabinomanne. L'analyse de la production de glycogène est donnée par le rapport de masse du glycogène versus la masse de bactéries (Figure 3). Etape d'activation : Les Figures 2 et 3 montrent que l'inactivation de glgC modifie la biosynthèse du glycogène intracellulaire, mais aussi celle du glucane de surface. Il est à noter que cette différence quantitative est accompagnée d'une différence qualitative, puisque le rayon du glucane estimé par DLS diminue de 28 à 22 nm. Le phénotype est restauré chez le mutant complémenté. La protéine GIgC est donc impliquée dans la biosynthèse des deux polysaccharides. Etape d'élongation La biosynthèse du glucane est affectée de la même façon chez le mutant glgA-, mais pas chez les mutants Rv3032" et TreZ. De plus, le gène Rv3032, dont le rôle dans la biosynthèse du glycogène est déjà connu, complémente le phénotype du mutant gigA- ce qui indique une redondance fonctionnelle entre les deux enzymes codées par ces gènes. La protéine GIgA est donc impliquée dans la biosynthèse du glucane alors que la protéine codée par le gène Rv3032 est connue pour son implication dans la biosynthèse du glycogène. Etape de branchement : Le gène glgB étant essentiel, l'implication de ce gène a été étudiée sur la souche mérodiploïdes H37RvAgIgB/pVVglgBtb. La production de glucane et de glycogène ne représentant respectivement que 57% et 37% de ce qu'elle est dans la souche sauvage, et les analyses par DLS et par polarimétrie montrant que la structure des polysaccharides est affectée, la protéine GIgB est donc impliquée dans les voies de biosynthèse du glucane et du glycogène. Exemple 4 Multiplication et persistance des mutants glgA, glgC et treZ chez la souris Un modèle d'infection murin a été utilisé pour analyser les effets de l'invalidation de glgA, Rv3032, glgC ou treZ sur la virulence de M. tuberculosis H37Rv. La capacité des souches sauvages et mutantes de se multiplier et de persister dans les poumons et la rate de souris BALB/c a été étudiée par analyse des UFC. Comme cela est représenté dans les Figures 4 à 9, les charges bactériennes des organes dans les souris infectées par H37RvAtreZ, H37RvAgIgC et H37RvARv3032 étaient comparables à celles de souris infectées par la souche parentale H37Rv sur une période de 90 à 100 jours. Par comparaison, la capacité de H37RvAgIgA à se maintenir dans les deux organes durant les étapes tardives de l'infection était réduite de manière significative. A 42 et 90 jours post-infection, les poumons de souris infectées par le mutant glgA portaient environ 10-fois moins d'UFC que ceux de souris infectées avec la souche témoins, M. tuberculosis H37Rv.30 REVENDICATIONS1. Utilisation d'une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6, pour l'identification de composés à activité antibiotique. 2. Utilisation selon la revendication 1, pour l'identification de composés ciblant les bactéries du genre Mycobacterium. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour l'identification de composés ciblant les bactéries de l'espèce Mycobacterium tuberculosis. 4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le polymère de glucose est choisi dans le groupe constitué du glucane et du glycogène. 5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'enzyme est choisie dans le groupe constitué d'une a-1,4-glucosyltransferase et d'une enzyme de branchement. 20 6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle l'enzyme appartient au genre Mycobacterium. 7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle l'enzyme appartient à l'espèce Mycobacterium tuberculosis. 8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle l'enzyme est choisie dans le groupe constitué de GlgA, de GlgB et de Rv3032. 9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle l'enzyme est 30 GlgB. 10. Procédé de criblage de composés à activité antibiotique, comprenant les étapes suivantes : 25- mettre un composé dont on souhaite déterminer l'activité antibiotique en présence d'une enzyme bactérienne catalysant la synthèse d'un polymère de glucose dans lequel les glucoses sont liés entre eux par l'intermédiaire de liaisons a-1,4 et a-1,6 ; - mesurer l'activité de l'enzyme en présence du composé ; - comparer l'activité de l'enzyme en présence du composé à son activité en l'absence du composé ; - sélectionner le composé comme antibiotique si l'activité de l'enzyme en présence du composé est plus faible qu'en l'absence du composé. 11. Procédé selon la revendication 10, pour cribler des composés ciblant les bactéries du genre Mycobacterium. 12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, pour cribler des composés ciblant les bactéries de l'espèce Mycobacterium tuberculosis. 13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel le polymère de glucose est choisi dans le groupe constitué du glucane et du glycogène. 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel l'enzyme est telle que définie dans l'une des revendications 5 à 9.