Brevet FR2925503A1 — publié le 20090626

L'invention concerne la préparation d'un anticorps polyclonal qui permet une détection sensible et spécifique de l'EBP (pour � Elastin Binding Protein � ou protéine se liant à l'élastine). L'EBP est une des trois sous-unités protéiques du complexe récepteur de l'élastine. Ce complexe est impliqué dans de nombreux phénomènes physiopathologiques comme le remodelage tissulaire, la cicatrisation, l'élastogenèse, la mécanotransduction, certains dérèglements cardio-vasculaires, l'angiogenèse et la progression tumorale. On sait désormais que l'EBP est en fait une forme épissée de la (3-galactosidase (13-Gal) lysosomale nommée S-Gal (Hinek et al, 1993). Contrairement à la 13-Gal, S-Gal peut fixer les peptides d'élastine grâce à un domaine spécifique de 32 résidus qui est la conséquence de l'épissage (Morreau et al, 1989, J Biol Chem 264:20655-20663 ; Gautier Moroy, Thèse de Doctorat, Université de Reims Champagne-Ardenne, décembre 2005 �Etude Structurale du domaine d'interaction du récepteur de l'élastine. Approches biochimiques, biophysiques et bioinformatiques �). Malgré l'intérêt qu'elle peut susciter, on ne sait toujours pas où est localisée précisément l'EBP à la surface des cellules. De plus, la quantité de récepteurs présents à la surface des cellules reste inconnue. Enfin, sa dynamique intra et péricellulaire restent inconnues. En conséquence, il est très difficile d'appréhender la biologie de l'EBP et les rôles qu'il tient dans telle ou telle situation physiopathologique. Ces nombreuses interrogations proviennent surtout du manque d'outils commercialisés permettant d'étudier cette protéine tant in vitro que sur coupes fixées ou encore in vivo. En effet, il n'existe à ce jour aucun anticorps commercial dirigé contre cette protéine qui permette de le détecter spécifiquement. Une préparation d'anticorps reconnaissants l'EBP a déjà été rapportée. Ainsi, Hinek et al, 1993, utilisent un anticorps polyclonal préparé à partir d'un peptide synthétique correspondant au domaine de liaison à l'élastine de l'EBP. Mecham et al, 1988 décrivent l'utilisation d'un anticorps monoclonal, désigné �BCZ �, dirigé contre l'EBP bovine. Cependant ces anticorps présentent une spécificité et une sensibilité faibles. En effet, l'anticorps décrit par Hinek et al, 1993 est produit en injectant directement le peptide synthétique libre. Par ailleurs, l'anticorps � BCZ � de Mecham, quant à lui, est dirigé contre l'EBP bovin, une protéine dont on ne connaît pas précisément la séquence, aussi son utilisation sur du matériel humain reste difficile. Il existait donc un besoin réel d'un anticorps anti-EBP présentant une meilleure spécificité et une meilleure sensibilité. Résumé de l'invention : Les inventeurs fournissent maintenant un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine EBP (� Elastin Binding Protein �), susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant l'immunisation d'un mammifère non-humain avec une protéine recombinante, constituée d'un fragment antigénique de l'EBP fusionné à une protéine support, et la purification du sérum obtenu par séparation des immunoglobulines G (IgG) du sérum et élimination des anticorps dirigés contre la protéine support. Légende des figures : La Figure 1 montre des gels de Western blots utilisant l'anticorps à différentes étapes de purification. (A) sérum pré-immun (1/2000), (B) sérum du troisième prélèvement (1/2000), (C) IgG concentrées après purification sur colonne DEAE Affiblue (Biorad, Marnes-la-coquette, France) gel (1/2000), (D) IgG concentrées après purification sur colonne GST-sépharose, fractions non retenues (1/1000) La Figure 2 montre un Dot Blot avec l'anticorps anti-S-Gal (anti-V32) à différentes quantités d'antigène GST-V32. Temps d'exposition 5 minutes. La Figure 3 montre un gel de Western blot utilisant l'anticorps anti-S-gal sur un extrait cellulaire total de fibroblastes dermiques humains. Anticorps dilué à 1/1000. 25 Description détaillée de l'invention : Définitions L'EBP ou Elastin Binding Protein est une protéine de 67kDa correspondant à une forme 30 enzymatiquement inactive, issue d'un épissage alternatif de la 13-galactosidase. Sa séquence d'ADNc est décrite dans Morreau et al, 1989, et est rapportée dans le listing annexé, en tant que SEQ ID NO : 1 (Numéro d'accès EMBL M27508). La séquence d'acides aminés de l'EBP humaine est montrée en annexe (SEQ ID NO : 2). L'anticorps anti-EBP de l'invention sera désigné indifféremment anti-EBP ou anti-S-gal. La protéine support est une protéine immunogène, de préférence d'une taille supérieure à 20 kDa, choisie pour sa facilité d'utilisation durant les phases de purification de l'antigène. Il est entendu que la protéine support n'est pas l'EBP. Le terme � isolé �, pour � fragment antigénique isolé � ou � acide nucléique isolé � signifie que le fragment antigénique ou l'acide nucléique est considéré libre de son 10 environnement natif. Le terme � spécifiquement �, quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison spécifique d'un anticorps pour un antigène, signifie que l'anticorps interagit avec l'antigène sans interaction substantielle avec d'autres antigènes. Des constantes d'association supérieures à 108 L.mol-' sont préférables. 15 Préparation de l'antigène L'antigène utilisé pour préparer l'anticorps polyclonal est une protéine recombinante, constituée d'un polypeptide antigénique de moins de 50 acides aminés qui comprend la séquence SEQ ID NO : 3, fusionné à une protéine support. 20 La séquence SED ID NO : 3 est une séquence de 32 acides aminés, correspondant au fragment allant de l'acide aminé 83 à l'acide aminé 114 de la séquence de l'EBP humaine (SEQ ID NO : 2). Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide antigénique comprend la séquence SEQ ID NO : 3 flanquée, à ses extrémités N- et C-terminales, de 4 à 7 acides aminés de 25 la séquence de l'EBP humaine native (montrée en SEQ ID NO : 2). De préférence encore, 5 acides aminés sont ajoutés de part et d'autre du polypeptide de 32 acides aminés, le polypeptide antigénique étant alors le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 4. Ce fragment antigénique isolé, de la protéine EBP humaine (� Elastin Binding Protein 30 �) consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, est d'ailleurs nouveau et fait partie de l'invention, de même que l'acide nucléique isolé codant pour ce fragment. Le polypeptide antigénique est exprimé sous la forme d'une protéine recombinante, en fusion avec une protéine support. Pour cela, on peut construire de manière avantageuse un vecteur, tel qu'un plasmide, comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante, de préférence constituée d'un fragment antigénique consistant en la séquence SEQ ID NO : 4, fusionné à une protéine support. La protéine recombinante de fusion peut être obtenue par un procédé classique de production de protéines recombinantes, comprenant le transfert du plasmide dans une cellule hôte, dans des conditions permettant l'expression de la protéine recombinante codée par le plasmide, et la récupération de la protéine ainsi produite. Les vecteurs utiles à cette fin comportent généralement un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent de préférence pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilisera de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les virus vecteurs pouvant notamment être des adénovirus, des rétrovirus, des poxvirus ou des virus herpétiques. L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes. Lorsque l'on souhaitera l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on pourra utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus seront, par exemple, les rétrovirus ou les AAV. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique. Parmi les cellules utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules procaryotes, notamment bactériennes (E.coli, JM 109 (DE3)) ou de levure, de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères, et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple. Obtention de l'anticorps polyclonal La protéine antigénique recombinante est utilisée pour produire un anticorps polyclonal 10 dirigé contre la protéine EBP humaine, par un procédé comprenant les étapes consistant à: a. immuniser un mammifère non-humain avec une protéine recombinante, constituée d'un polypeptide antigénique de moins de 50 acides aminés qui comprend la séquence SEQ ID NO : 3, fusionné à une protéine support, étant entendu que la protéine 15 support n'est pas l'EBP ; b. prélever le sang du mammifère, récupérer le sérum ; c. purifier le sérum par séparation des immunoglobulines G (IgG) du sérum et élimination des anticorps dirigés contre la protéine support ; d. recueillir l'anticorps polyclonal dirigé contre la protéine EBP, ainsi obtenu. 20 Dans ce procédé, la protéine de support peut être d'origine procaryote ou eucaryote. Par exemple il peut s'agir de la glutathion-S-transférase (GST), ou de toute molécule marqueur (comme la protéine KLH par exemple). 25 Le mammifère non-humain est de préférence un lapin, qui est le plus souvent sacrifié. Mais il peut aussi s'agir d'une souris, un rat, un chien, d'un primate non-humain, d'un cheval, d'une chèvre, d'un mouton, etc. L'épuisement de l'antisérum obtenu peut être réalisé en employant un immunoadsorbant 30 contenant la protéine support. Dans un mode particulier de l'invention, le procédé comprend les étapes consistant à : a. immuniser un lapin avec une protéine recombinante produite par une bactérie transformée avec un plasmide comprenant une séquence codant pour la protéine recombinante constituée d'une polypeptide antigénique ayant la séquence SEQ ID NO :4 fusionnée à la GST ; b. prélever le sang du lapin et récupérer le sérum ; et c. purifier le sérum par chromatographie sur colonne de résine composée d'agarose portant des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE), puis chromatographie sur colonne GST-sépharose. Utilisations de l'anticorps polyclonal : Un aspect de l'invention concerne l'anticorps polyclonal ainsi obtenu, qui se lie spécifiquement à l'EBP. Un autre aspect de l'invention concerne une trousse de diagnostic comprenant cet anticorps, et éventuellement de l'EBP comme étalon. L'anticorps peut être surtout utile pour des applications in vitro, ou ex vivo, sur des échantillons biologiques dans lesquels on cherche à détecter la protéine EBP. L'anticorps permet notamment de réaliser des Western blots et des marquages d'immunocytochimie. Divers formats d'immunoessais bien connus de l'homme du métier peuvent aussi être utilisés: en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Dosages ELISA, radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes- anticorps formés. Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Exemples : Exemple 1 : Surproduction et purification de l'antigène La séquence d'intérêt codant pour la séquence de 32 acides aminés, désigné peptide V32, (SEQ ID NO :3) du site de fixation des peptides d'élastine est amplifiée par PCR. L'ADN amplifié comprend l'ADN codant pour V32 ainsi que l'ADN codant pour 5 acides aminés en amont et en aval, commun à l'EBP et à la (3-galactosidase humaine afin de maintenir la structure du peptide V32. Cette séquence est amplifiée et digérée puis liguée dans le plasmide pGEX-4T3 préalablement digéré. Des bactéries JM 109 (DE3) rendues préalablement compétentes sont transformées par la construction plasmidique obtenue. La surproduction de la protéine de fusion GST-V32 est induite par 0,4 mM d'IPTG pendant 4h, suite à quoi la culture est soniquée et centrifugée. Le surnageant obtenu, qui contient la GST-V32 surproduite (30 kDa), est ensuite purifié sur une colonne glutathion Sépharose qui est utilisée pour la purification des protéines de fusion GST. Le surnageant obtenu est placé en batch avec la résine puis le tout est lavé avec du tampon Tris-EDTA. L'élution de la GST-V32 qui est accrochée à la colonne est obtenue par addition d'un excès de glutathion libre à 30 mM dans du tampon Tris-EDTA après un lavage avec ce tampon. Les six premières élutions sont enrichies en GST-V32 et sont rassemblées. La fraction totale est ensuite lyophilisée et reprise dans du NaCl 0,9 %. A ce stade, la pureté de l'antigène GST-V32 est estimée à plus de 95% sur gel. Exemple 2 : Obtention et purification de l'anticorps anti-EBP (S-Gal) Deux lapins blancs de Nouvelle Zélande sont immunisés par injection sous cutanée ou intradermique de 200 �g de GST-V32 dilués dans 500 �l de NaCl 0,9% supplémenté de 500 �l d'adjuvant de Freund complet. Après deux semaines, ils sont de nouveau immunisés avec 500 gl de solution de GST-V32 supplémentées de 500 �l de Freund Incomplet. Cette immunisation est répétée deux fois à deux semaines d'intervalle. Avant immunisation (sérum préimmun) et une semaine après chaque injection, des prélèvements sanguins sont effectués. Si le lapin a développé une réponse immunitaire 7 adéquate, son sang est collecté à la fin de la période d'immunisation et coagulé pendant une heure à 37°C puis le sérum est récupéré et centrifugé à 10000 g pendant 20 min à température ambiante et aliquoté par 1 ml. La purification des IgG est réalisée à haute pression sur colonne DEAE Affiblue Gel qui a pour particularité de retenir les protéines du sérum et de ne pas fixer les IgG. La résine est composée d'agarose portant des groupements DEAE (diéthylaminoéthyl) et la teinture Cibacron blue F3GA. Les groupements DEAE lient les protéines chargées négativement alors que le Cibacron blue a un rôle d'affinité différentielle pour un grand nombre de protéines présentes dans le sérum. Ainsi les immunoglobulines sont purifiées en une étape. Pour réaliser la colonne, la résine est stockée dans du tampon d'équilibration ou tampon A (28 mM NaCl, 20 mM Tris-HC1 pH 8) contenant de 0,02 à 0,05 % d'azide. Elle est déposée sur la colonne en maintenant un flux constant avec ajout de tampon A jusqu'à obtention de 10 ml de résine. A la première utilisation, la résine est lavée par 3 volumes de 0,5 M NaCl. Après dialyse de 2 ml de sérum contre 50 volumes de tampon A de colonne à 4°C sur la nuit, le produit est appliqué sur la colonne puis elle est lavée par 40 ml de tampon A. Le flux est réglé à lml/min. La purification est suivie par mesure de la densité optique à 280 nm. Les fractions positives sont ensuite rassemblées et concentrées par Amicon Ultra. La colonne GST-Sépharose est utilisée pour séparer les anticorps dirigés contre la partie GST de l'antigène injecté des anticorps dirigés contre la partie S-Gal (V32). La colonne est lavée par du tampon A (100 volumes) et mise en batch avec les anticorps concentrés issus de la purification précédente. La colonne est lavée par du tampon A (50 volumes). Les fractions non retenues, contenant les IgG dirigées contre l'EBP, sont récupérées et concentrées sur Amicon Ultra. Les éléments fixés sont élués par du tampon glycine 2M à pH 3 et la colonne est lavée avant d'être réutilisée. Exemple 3 : Validation de l'anticorps anti-EBP (S-Gal) Afin de démontrer l'efficacité des différentes étapes de purification, une série de Western blots utilisant les différentes fractions de purification a été réalisé. Ces Western blots comportent trois pistes, une contient un extrait bactérien après l'induction de 4 h (EB), une comporte l'antigène GST-V32 purifié (GST-V32) et enfin une comporte de l'EBP recombinant purifié (EBPr) (voir Figure 1). Le sérum brut (Figure lB) permet de reconnaître de façon diffuse les protéines purifiées telles que la GST-V32 et l'EBPr. Cette reconnaissance s'affine au cours des étapes de purification. Afin de déterminer la sensibilité de détection de l'antigène par l'anticorps, un dot blot a été réalisé (voir Figure 2). Cette expérience permet de constater que l'anticorps anti-S-Gal reconnaît l'antigène GST-V32 jusqu'à des quantités de l'ordre du ng quand il est dilué à 1/2000. Cette reconnaissance correspond parfaitement aux données attendues lors de la production d'un anticorps polyclonal. Il est à signaler qu'il s'agit d'un temps d'exposition du film court. A ce temps l'ensemble des points est net. A des temps d'exposition plus longs, la netteté des faibles concentrations s'affinent mais un bruit de fond diffus apparaît pour les grandes quantités. Afin d'évaluer le potentiel d'utilisation de l'anticorps pour détecter l'EBP sur des fibroblastes dermiques humains (FDH), deux types d'expérience ont été menés. Immunocytochimie : Les inventeurs ont utilisé des méthodes d'immunocytochimie avec l'anticorps en 20 présence et en absence de GST-V32 pour essayer de co-localiser l'EBP et la neuraminidase-1, une autre sous unité du complexe récepteur. Matériels et méthodes : Des lamelles de verre sont stérilisées par trempage dans un bain d'alcool à 70 % (v/v) et par passage à la flamme. Elles sont ensuite placées dans les puits d'une plaque 6 puits 25 de culture cellulaire. Celle-ci est ensemencée avec des fibroblastes dermiques humains à raison de 40000 cellules par puits et incubée 48 h dans du milieu DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium) contenant du Glutamax comme source de glutamine supplémenté de 10 % de Sérum de Veau Foetal (SVF, acheté chez PAN-Biotech-Gmbh, distribué par Dutcher, Brumath, France) et de 200 UI/ml de pénicilline et 50 �g/ml de 30 streptomycine, à 37°C sous 5 % de CO2. Les cellules sont ensuite lavées 3 fois en PBS puis fixées à l'aide de formaldéhyde à 4 % (v/v) dilué dans du PBS. Après 3 lavages de 5 min avec du PBS, la couche cellulaire est saturée pendant 30 min à température ambiante grâce à une solution de BSA 3 % (p/v) dilué dans du PBS. Les lamelles sont incubées avec l'anticorps anti-EBP (anti-V32) dilué au 1/25° dans le tampon de blocage pendant 1 h. Afin d'évacuer la spécificité de cet anticorps, des expériences de compétitions ont été réalisées à l'aide de l'antigène GST-V32. Dans ces conditions, l'anticorps est pré-incubé pendant 1h à température ambiante avec un excès d'antigène avant incubation avec les cellules. Après 5 lavages de 5 min avec du PBS, une incubation d' lh est réalisée avec l'anticorps secondaire AlexaFluor 488 anti-lapin. Dans des expériences de double marquage, un second marquage est réalisé dans les mêmes conditions en utilisant comme anticorps primaire un anticorps anti- neuraminidase-1 dilué au l/50e et un anticorps secondaire, l'anticorps AlexaFluor 568 anti lapin. Avant montage, une solution de fluorophore permettant de visualiser les noyaux (Hoechst-3342 de Sigma à 1 mg/ml) est diluée au 1/1000e dans du PBS puis mise en présence des lamelles durant 10 min. Les cellules sont lavées 5 fois 5 min avec du PBS. Les lamelles sont ensuite montées sur des lames grâce au milieu de montage VECTASHIELD Hard Set (Vector laboratories). Les lames sont ensuite étudiées par microscopie confocale. Le tableau I récapitule les anticorps utilisés en immunocytochimie.20 Tableau I : Récapitulatif des anticorps utilisés en Immunocytochimie Anticorps anti-neuraminidase-1 Anticorps polyclonal de lapin dérivé de l'immunisation par une protéine de fusion excluant le signal peptide (45 acides aminés) et les six premiers acides aminés en N-terminal de la neuraminidase lysosomale humaine (Abcam, réf. Ab34866) Anticorps anti-IgG de lapin couplé à de Anticorps secondaire permettant la l'Alexafluor 488 détection par microscopie à fluorescence ou confocale (Invitrogen, réf. A 11001) Anticorps anti-IgG de lapin couplé à de Anticorps secondaire permettant la l'Alexafluor 568 détection par microscopie à fluorescence ou confocale (Invitrogen, réf. A11036) Résultats : En absence de GST-V32, un marquage diffus de la cellule est constaté avec des zones plus denses. Ce marquage disparaît totalement en présence d'un excès de GST-V32 démontrant ainsi la spécificité de l'anticorps. Par ailleurs, la superposition du marquage S-Gal avec le marquage Neu-1 confirme que le signal observé correspond bien à la sous unité EBP du complexe récepteur de l'élastine. Western Blot Matériels et méthodes : Après une électrophorèse sur SDS-PAGE, le gel est mis au contact d'une membrane de nitrocellulose (PROTRAN-Schleicher et Schuell, Dutcher, Brumath, France), et placé dans une cuve de transfert (système Biorad) contenant du tampon de transfert (Tris-HCI 20 mM, pH 8,8, glycine 150 mM, méthanol 20 % (v/v)). L'ensemble est relié aux bornes d'un générateur. La migration des protéines, chargées négativement (charge négative au SDS), se fait de la borne û vers la borne + à 30 V sur la nuit en chambre froide ou à 70V pendant 1h30. La membrane de microcellule récupérée après le transfert est lavée à l'eau distillée, colorée 10 min au rouge ponceau S (0,5 % p/v) dans acide acétique 1 % (v/v) afin de vérifier la présence des protéines, lavée aux tampons TBS (10 mM de Tris-HC1, pH 7,5 150 mM de NaCl) puis TTBS (composition identique au TBS supplémenté de 1 ml/l de Tween 20) jusqu'à élimination de la coloration. La membrane est ensuite incubée sous agitation durant 1h avec une solution de saturation de lait écrémé 5 % (p/v) dans TTBS ou de BSA 2 % (p/v), de manière à saturer l'ensemble de la membrane. Après 3 lavages successifs au TTBS (5 min pour chaque), la membrane est mise en présence avec l'anticorps primaire de 1h30 à température ambiante à une nuit complète à 4°C. Cet anticorps est spécifique de la protéine recherchée. Après une nouvelle série de lavages, l'anticorps secondaire est à son tour mis en contact avec la membrane à l'abri de la lumière durant 1h à l h30 selon l'anticorps à température ambiante, pour permettre la réaction de la peroxydase. L'anticorps secondaire reconnait l'espèce de l'anticorps primaire et se fixe à celui-ci. Il reconnait les IgG de l'espèce à identifier. Après un lavage de 5 bains au TTBS et 2 au TBS pendant 5 min à l'obscurité, les 20 protéines marquées sont révélées par chimiluminiscence (Kit ECL, Amersham Biosciences, Saclay, France). Lorsque cela est nécessaire, les anticorps sont découplés de la membrane par incubation à 55°C pendant 30 min dans une solution composée de 62,5 mM Tris/HCI pH 6,7, 2 % SDS (p/v) et 100 mM f3-mercaptoéthanol. Cinq lavages de 1h avec du TTBS contenant 25 0,02 % NaN3 (p/v) permettant d'éliminer le (3-mercaptoéthanol. La membrane est ensuite saturée avec la solution de saturation et incubée avec les anticorps selon le protocole décrit précédemment. Résultats : 30 L'analyse par Western blot de l'extrait total cellulaire de fibroblastes dermiques humains fait apparaître deux bandes à 67 et 59 kDa qui correspondent aux deux formes possibles de l'EBP décrites dans la littérature (Blood et al, 1988, J Cell Biol 107:1987- 1993 ; Larbi et al, 2005, Biochem Biophys Res Commun 332:787-792 ; Yamamoto et al, 2002, Cell Biol Int 26:441-449). Par ailleurs, on peut noter l'absence de bruit de fond (voir Figure 3). Cette dernière expérience montre l'efficacité et la spécificité de l'anticorps en Western 5 blot. Références bibliographiques - Blood et al, 1988, J Cell Biol 107:1987-1993 - Hinek et al, 1993, J Clin Invest, 91:1198-1205 - Larbi et al, 2005, Biochem Biophys Res Commun 332:787-792 - Mecham et al, 1988, Biochem Biophys Res Commun 151:822-826 - Moroy, Thèse de Doctorat, Université de Reims Champagne-Ardenne, décembre 2005 � Etude Structurale du domaine d'interaction du récepteur de l'élastine. Approches biochimiques, biophysiques et bioinformatiques � - Morreau et al, 1989, J Biol Chem 264:20655-20663 - Yamamoto et al, 2002, Cell Biol Int 26:441- 449 Revendications 1. Procédé in vitro de préparation d'un anticorps polyclonal dirigé contre la protéine 5 EBP humaine (� Elastin Binding Protein �), ledit procédé comprenant les étapes consistant à : - purifier du sérum d'un mammifère non-humain par séparation des immunoglobulines G (IgG) du sérum et élimination des anticorps dirigés contre la protéine support, ledit sérum ayant été préalablement obtenu par (a) 10 immunisation du mammifère non-humain avec une protéine recombinante, constituée d'un polypeptide antigénique de moins de 50 acides aminés qui comprend la séquence SEQ ID NO : 3, fusionné à une protéine support, étant entendu que la protéine support n'est pas l'EBP, et (b) prélèvement du sang du mammifère et récupération du sérum ; 15 - recueillir l'anticorps polyclonal dirigé contre la protéine EBP, ainsi obtenu. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel 1c polypeptide antigénique comprend la séquence SEQ ID NO : 3 flanquée, à ses extrémités N- et C-terminales, de 4 à 7 acides aminés de la séquence de l'EBP humaine native. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le polypeptide antigénique est le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la protéine 25 recombinante a été produite dans une cellule procaryote. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la protéine de support est une protéine d'origine procaryote. 30 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel la protéine de support est la glutathion-S-transférase (GST). 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le mammifère non-humain est un lapin. 8. Procédé selon la revendication 7, comprenant les étapes consistant à : purifier le sérum du lapin par chromatographie sur colonne de résine composée d'agarose portant des groupements diéthylaminoéthyl (DEAE), puis chromatographie sur colonne GST-sépharose, ledit sérum ayant été préalablement obtenu par (a) immunisation d'un lapin avec une protéine recombinante produite par une bactérie transformée avec un plasmide comprenant une séquence codant pour la protéine recombinante constituée d'une polypeptide antigénique ayant la séquence SEQ ID NO : 4 fusionnée à la GST, et (b) prélèvement du sang du lapin et récupération du sérum. 9. Anticorps polyclonal dirigé contre la protéine EBP humaine (� Elastin Binding Protein �, susceptible d'être obtenu par le procédé de l'une des revendications 1 à 8. 10. Trousse de diagnostic contenant l'anticorps tel que défini à la revendication 9. 11. Fragment antigénique isolé, de la protéine EBP humaine (� Elastin Binding Protein �) consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4. 12. Acide nucléique isolé, codant pour le fragment antigénique tel que défini à la revendication 11. 13. Plasmide comprenant une séquence codant pour une protéine recombinante constituée d'un fragment antigénique tel que défini à la revendication 11 fusionné à une protéine support. 30 14. Procédé in vitro d'obtention d'une protéine recombinante de fusion utile pour la mise en oeuvre du procédé de la revendication 1, comprenant le transfert du plasmide de la revendication 13, dans une cellule hôte, dans des conditions25permettant l'expression de la protéine recombinante codée par le plasmide, et la récupération de la protéine ainsi produite.