Brevet FR2930444A1 — publié le 20091030

L'invention a pour objet des micelles polymérisées, leurs procédés de préparation et leurs applications. Un grand nombre de molécules à activité thérapeutique et en particulier les molécules anti-cancéreuses présentent une faible solubilité dans l'eau, provenant des propriétés intrinsèques hydrophobes de la molécule. En effet, ces molécules doivent avoir un certain degré d'hydrophobicité pour pouvoir être internalisées dans les cellules. La vectorisation des molécules thérapeutiques a pour but de contourner les problèmes associés en io particulier à la solubilité, la stabilité, la pharmacocinétique, la biodistribution desdites molécules et leur ciblage spécifique. Différents systèmes de vectorisation de composés hydrophobes ont été décrits dans la littérature comme pouvant transporter des quantités suffisantes de molécules à activité thérapeutique à travers les différentes 15 barrières biologiques pour atteindre efficacement leur site d'action. Une de ces techniques de vectorisation consiste à encapsuler un principe actif dans une microsphère formée par une matrice de polymères tels que les poly(alkylcyanoacrylates), les poly(anhydrides), l'acide poly(lactique). 20 Ces microsphères ont des tailles de 20pm à 100pm excluant leur usage par voie intra-veineuse et permettent dies taux d'inclusion relativement faible entre 0.2% et 3.5% de composés hydrophobes. Les micelles de polymères, autre technique de vectorisation, désignent des 25 dispersions colloïdales composées de polymères amphiphiles avec des domaines hydrophiles et hydrophobes distincts. Ces micelles de polymères sont des structures supramoléculaires en coeur/coque. Les micelles de polymères sont composées de polyéthers utilisés en combinaison avec des poly(éthylène glycol) pour former des polymères amphiphiles sous forme 30 de copolymères diblocs (pluroniques : PPO-co-PEG) ou de copolymères triblocs (poloxamers : PEG-co-PPO-co-PEG). Ces micelles de polymères ont une taille comprise entre 50nm et 100nm. Les taux d'inclusion de composés dans les micelles de polymères sont compris entre 0.1% et 40% selon la méthode d'inclusion utilisée : inclusion par évaporation, inclusion par dialyse ou inclusion par nanoprécipitation. Les micelles de polymères sont donc des vecteurs permettant l'incorporation de quantités importantes de composés hydrophobes mais nécessitant une mise en oeuvre (synthèse et inclusion) technique et industrielle difficile. Les systèmes de vectorisation par les liposomes et les vésicules de to polymères sont étudiés de façon intensive et plusieurs formulations de médicaments par ces systèmes sont actuellement en phase clinique dont certaines ont même été approuvées pour leur utilisation clinique. Les liposomes et les vésicules de polymères peuvent inclure des principes actifs hydrophiles dans le coeur aqueux de la vésicule ou des molécules ts hydrophobes dans la bicouche cle polymères. Les liposomes et les vésicules de polymères ont des structures (MLV vésicules multilamellaires, SUV vésicules unilamellaires de petites tailles, LUV vésicules unilamellaires de grande taille, GUV vésicules géantes) et des tailles très différentes comprises entre 100nm et 1000nm. Les liposomes et les 20 vésicules de polymères sont des véhicules de principes actifs importants dans la vectorisation de molécules hydrophiles. En 2003, un nouveau type d'organisation à la surface des nanotubes de carbone a été mise en évidence les nanobagues, i.e. une structuration 25 d'amphiphiles en anneaux sur toute la longueur des nanotubes. Les nanobagues sont des anneaux de surfactants polymérisés formés à la surface des nanotubes puis séparés de leur support carboné pour les utiliser comme agents de solubilisation de principes actifs hydrophobes (WO 2004/092231). Les nanobagues sont cependant des nanovecteurs 30 difficilement industrialisables. Les vecteurs de délivrance décrits supra répondent plus ou moins bien au challenge de la vectorisation qui est de transporter suffisamment de principe actif de façon efficace et peu toxique afin de traiter la pathologie. Ces vecteurs répondent au problème de la solubilité des principes actifs hydrophobes sans pour autant résoudre les problèmes de taille de vecteur, de mise en oeuvre ou d'industrialisation. La présente invention a donc pour but de proposer une nouvelle stratégie pour obtenir des nanovecteurs ayant une capacité d'inclusion des principes actifs hydrophobes supérieure à celle des vecteurs classiques de la littérature et ayant une formulation Io simple facilitant son industrialisation future. La présente invention concerne des micelles polymérisées caractérisées en ce qu'elles comprennent des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules amphiphiles comportant une ou deux ls chaînes lipidiques comprenant chacune un ou deux motifs polymérisables, de types diacétylénique, vinyle, acrylate ou styrène, liées à une tête polaire. Selon la présente invention, on entend par � micelles � des objets sphériques auto-assemblés avec une surface hydrophile et un coeur 20 lipophile et dont la taille est inférieure à 100nm. On entend par � amphiphiles � ou � surfactants � des molécules organiques ayant la particularité d'être à la fois hydrophile et hydrophobe. Les amphiphiles, caractérisés par leurs propriétés antagonistes, ont des propriétés particulières en solution et s'organisent spontanément en milieux 25 aqueux sous différentes microstructures. L'invention porte, de manière préférée, sur des micelles polymérisées comprenant des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules amphiphiles de formule générale AùXùBùLùZ où A représente CH3 (CH2)mC=CùC-Cù(CH2) ou CH2=CHù ou CH2=CHùC6H4- , n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16; où X représente COùNH ou NHùCO ou une liaison, X est une liaison si B 5 est une liaison et L est une liaison ; où B représente ù(CH2)m C=CùC-Cù(CH2) ou -CH=CHùC6H4- ou une liaison, n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16 ; où L représente ù(CH2),ùCH[NHù.COùA']ù ou une liaison, r étant un entier de 1 à 16 et A' représente A ; to où Z représente ùCONHù(CH2)5 CHùN ,,CH2-R2 R, CH2-R2 ou ,CH2-R2 ùNHCOù(CH2)S CHùN\ R' CH2-R2 s étant un entier de 1 à 16 avec R2 représentant COOH ou SO3H ou OSO3H ou OP03H2 ou OP02H2 avec RI représentant H ou un radical COOH ou SO3H ou OSO3H ou OP03H2 ou 15 OP02H2 ou un groupe ùCO-NH-(CH2)t-CH3, t étant un entier de 1 à 16, ou Z peut être également des têtes polaires hydrophiles neutres, de type sucre ou polysaccharide, ainsi que leurs sels d'addition avec un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. 20 Parmi les acides pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre non limitatif les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, trifluoroacétique, lactique, pyruvique, malonique, succinique, glutarique, fumarique, tartrique, maléïque, citrique, ascorbique, oxalique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, camphorique. 25 Parmi les bases pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre non limitatif l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, la triéthylamine, la tertbutylamine. De préférence, l'invention concerne des micelles polymérisées comprenant des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules 5 amphiphiles de formule générale AùXùBùLùZ où A représente CH3 (CH2); C=CùC-Cù(CH2) net m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16; où X représente COùNH ou NHùCO ou une liaison, X est une liaison si B Io est une liaison et L est une liaison ; où B représente ù(C-12), C=CùC-Cù(CH2)n ou une liaison, n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16 ; où L représente ù(CH2),----CH[NH--COùA']ù ou une liaison, r étant un entier de 1 à 16 et A' représente A ou CH2=CHù ou CH2=CH-C6H4ù ; 15 où Z représente ,CH2-000H ûNHCO-(CH2)S CH-N\ R, CH2 COOH ./CHZCOOH R~ CH2-COOH , s étant un entier de 1 à 16 avec RI représentant H ou un radical COOH ou un groupe ùCO-NH-(CH2)t-CH3, t étant un entier de 1 à 16, ou Z peut être également des têtes polaires 20 hydrophiles neutres, de type sucre ou polysaccharide, ainsi que leurs sels d'addition avec un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. L'invention s'étend également aux micelles polymérisées constituées de molécules amphiphiles dont les têtes polaires hydrophiles neutres sont de 25 type éthers couronnes. 6 ou ûCONH-(CH2)S CH-N\ Avantageusement, l'invention porte sur des micelles polymérisées dont la tête polaire Z est fonctionnalisée. Par micelles polymérisées � fonctionnalisées �, on entend des micelles polymérisées modifiées par des ligands à reconnaissance moléculaire pour les faire évoluer vers des vecteurs intelligents et sélectifs afin d'identifier de façon spécifique des antigènes ou des récepteurs surexprimés à la surface de cellules cibles telles que les cellules cancéreuses ou infectieuses. Pour cela, les micelles polymérisées doivent être fonctionnalisées par des ligands spécifiques dont l'accroche à la surface du vecteur se fait par un to couplage chimique. Avantageusement, les ligands accrochés à la surface des micelles polymérisées sont : les fluorophores ou agents d'imagerie nucléaire (99Tc, 111ln 1251 19F 64Cu) ou optique (cyanine, fluorescéine, luciférase, quantum dots) ou magnétique (particules d'oxyde de fer), l'acide folique, le mannose, 15 le galactose, des anticorps, des ligands de type RGD. De manière préférée, les micelles polymérisées selon l'invention sont fonctionnalisées au niveau de la tête polaire Z par un acide folique. Dans un mode de réalisation préféré, les micelles polymérisées sont fonctionnalisées selon un procédé tel que décrit dans l'exemple 5. 20 La fonctionnalisation de surface des micelles polymérisées rend donc lesdites micelles polymérisées furtives et permet le ciblage de cellules spécifiques. L'invention s'étend également aux micelles polymérisées incluant un ou 25 des composés hydrophobes au sein des amphiphiles polymérisés selon l'invention. On entend par � composés hydrophobes � des molécules de petites taille possédant une faible solubilité dans l'eau inférieure à 1 g par litre dans tout ou partie de la zone de pH ou des protéines ou des acides nucléiques 30 ayant des problèmes de solubilité ou de stabilité en milieux aqueux. De manière préférée, les micelles polymérisées selon l'invention sont constituées des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile II-4 de formule O HOO H N OH O 0' OH De manière également préférée, les micelles polymérisées sont constituées des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile II-23 de formule O O OH HO O~/NH O N H H Avantageusement, les micelles polymérisées selon l'invention sont constituées des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule COOH O N/(CH2)C NCOOH H IY R, 5 10 15 Les micelles polymérisées sont également formées à partir des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule O (CHZ)5\/- NCOOH N H R, De manière préférée, les micelles polymérisées selon l'invention sont constituées des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule ONH H (CHZ) u N'''(CH2) NCOOH O COOH Préférentiellement, les micelles polymérisées sont formées à partir des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule R, H NCH2)g N COOH COOH Avantageusement, les micelles polymérisées selon l'invention sont constituées des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule COOH H O5 La présente invention a également pour objet le procédé de préparations des composés selon l'invention caractérisé en ce que : R - R -~ + R"ùNHZ Rù = A-X-B-LùZ N-R" H o R = A-X-B-L avec R" = tête polaire L'invention s'étend également aux compositions pharmaceutiques comprenant des micelles polymérisées selon l'invention. Avantageusement, ces compositions pharmaceutiques comprennent un ou 10 plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables, i.e. un ou plusieurs véhicules ou excipients inertes, non toxiques et appropriés. En ce qui concerne les excipients pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre non limitatif les liants, les diluants, les délitants, les 15 stabilisants, les conservateurs, les lubrifiants, les odorants, les aromatisants ou les édulcorants. Parmi les compositions pharmaceutiques selon l'invention, on retiendra plus particulièrement celles qui conviennent pour l'administration par voie orale, parentérale et notamment intraveineuse, per ou transcutanée, 20 nasale, rectale, perlinguale, oculaire, respiratoire et plus spécifiquement les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les gélules, les glossettes, les capsules, les tablettes, les préparations injectables, les OH R' Base R' = Cl, Br, OCOCH3, O-N ou R" = A-X-B-L avec R = tête polaire O 2930444 Il aérosols, les gouttes oculaires ou nasales, les suppositoires, les crèmes, pommades ou gels dermiques. La voie d'administration préférée est la voie intraveineuse et les compositions pharmaceutiques correspondantes peuvent permettre la libération instantanée ou différée des principes actifs. La présente invention porte également sur l'utilisation des micelles polymérisées selon l'invention comme vecteurs de molécules hydrophobes. L'invention s'étend également à l'utilisation des micelles polymérisées comme vecteurs de principes actifs hydrophobes. Par � vecteur �, on entend toute molécule ou assemblage de molécules pouvant transporter un principe actif, une protéine ou un acide nucléique vers son site d'action par ciblage de ligands spécifiques ou de façon passive par solubilisation ou stabilisation de l'espèce en question On entend par � principe actif � toute molécule, protéine ou acide nucléique possédant un effet thérapeutique. Différentes méthodes d'inclusion de principes actifs sont développées afin d'optimiser le taux d'inclusion ou d'incorporation dans les micelles polymérisées. Les méthodes d'inclusion selon l'invention sont : la méthode � vortex � qui consiste en l'inclusion par agitation vortex d'une solution aqueuse de micelles polymérisées et de principe actif à l'état de poudre pendant environ 30 minutes ; la méthode � vortex/sonication � qui consiste en l'inclusion par agitation vortex combinées à des cycles de sonication d'une solution aqueuse de micelles polymérisées et de principe actif à l'état de poudre pendant environ 2 heures ; la méthode � agitation à 20°C � qui consiste en l'inclusion par agitation magnétique à température ambiante pendant environ 12 heures d'une solution aqueuse de micelles polymérisées et de principe actif à l'état de poudre ; la méthode � agitation à 500C � qui consiste en l'inclusion par agitation magnétique à environ 50°C pendant environ 12 heures d'une solution aqueuse de micelles polymérisées et de principe actif à l'état de poudre ; la méthode � évaporation de DCM � qui consiste en l'inclusion par addition du principe actif solubilisé dans du dichlorométhane (DCM) à une solution aqueuse de micelles polymérisées chauffée à environ io 50°C. A l'issue de la séquence d'inclusion, la solution est filtrée afin d'éliminer l'excès de principe actif non inclus. L'invention concerne, de manière préférée, une méthode d'inclusion par 15 agitation magnétique pendant 12 heures à 50°C d'une solution de micelles polymérisées et de principe actif. L'inclusion de principe actif dans les micelles polymérisées est contrôlée par l'énergie d'agitation et la température. Le taux d'incorporation est amélioré par une agitation plus énergique, une mise en contact plus longue et une température plus 20 élevée. De préférence, les solutions micellaires obtenues à l'issue de l'étape d'inclusion sont stérilisées par filtration sur filtre de 0.22pm en vue d'injection en intraveineuse sans perte de concentration de principe actif. 25 L'étude d'inclusion menée sur les micelles a mis en évidence l'effet de la polymérisation de la micelle sur la capacité d'incorporation de principe actif. Les micelles doivent être polymérisées afin que ce nanovecteur ait la capacité d'inclure une quantité très importante de principes actifs. Un taux d'incorporation de S39625 de 48 C% est obtenu pour ce transporteur, soit un 30 taux 5 fois supérieur à celui obtenu avec la formulation nanobague. L'étude d'inclusion menée sur différents principes actifs a confirmé l'aptitude ce de nanovecteur à solubiliser différents types de molécules hydrophobes avec de forts taux d'inclusion. Les travaux réalisés sur une molécule de référence, le paclitaxel, a permis de comparer les valeurs des taux d'incorporation avec les données de la littérature. Les micelles polymérisées de l'amphiphile II-4 ont permis d'inclure le paclitaxel à un taux d'inclusion de 33 %. Dans la littérature, des taux d'inclusion du paclitaxel compris entre 6,7 % et 14,3 % ont été atteints avec différents types de vésicules, des taux d'incorporation compris entre 0,2 % et 27 % avec des lo nanoparticules, et des taux d'inclusion compris entre 0,2 et 25 % avec les micelles de polymères. Les micelles polymérisées se présentent donc comme un nanovecteur avec un pouvoir de solubilisation remarquable qui a permis de solubiliser des principes actifs de structures et de poids moléculaires différents. 15 La présente invention porte enfin sur un procédé d'obtention des micelles polymérisées selon l'invention. Ce procédé d'obtention comprend les étapes suivantes : les composés lipidiques à polymériser selon l'invention sont auto- 20 assemblés en micelles sphériques ; les micelles sphériques auto-assemblées sont polymérisées. Par � auto-assemblage � de molécules amphiphiles, on entend l'organisation spontanée en micelles sphériques des molécules amphiphiles en milieux aqueux à une concentration supérieure à la 25 concentration micellaire critique ou CMC. La concentration micellaire critique de la molécule amphiphile II-4 telle que décrite supra a été déterminée expérimentalement à 0.082mg/ml. L'invention s'étend également au procédé d'obtention de micelles 30 polymérisées dans lequel l'étape de polymérisation est de type irradiation lumineuse ou photopolymérisation. La photopolymérisation est une méthode de polymérisation particulièrement bien adaptée à la polymérisation des motifs diacétyléniques. La photopolymérisation est une méthode � propre � utilisant une irradiation lumineuse à 254nm et aucun agent chimique externe. La photopolymérisation des motifs diacétyléniques implique la formation d'intermédiaires diradicalaires : la première étape consiste à former l'espèce diradicale par une excitation photonique ; la deuxième étape est la réaction de propagation du radical à un nouveau motif polymérisable se trouvant à proximité, faisant ainsi grandir la chaîne io polymérique ; la dernière étape est une étape de terminaison par couplage de deux radicaux. L'invention s'étend aussi au procédé d'obtention de micelles polymérisées dans lequel l'étape de polymérisation est de type polymérisation radicalaire. 15 Les motifs vinyles et acrylates sont généralement polymérisés par polymérisation radicalaire. Cette voie de polymérisation est connue et couramment utilisée. L'initiation de la polymérisation radicalaire peut-être effectuée à l'aide d'un initiateur radicalaire généré par dissociation thermique et homolytique, réaction d'oxydo-réduction ou par des 20 irradiations. Enfin, l'invention s'étend également au procédé d'obtention de micelles polymérisées dans lequel l'étape de polymérisation comprend plusieurs types de polymérisation successives, par exemple une photopolymérisation 25 puis une polymérisation par initiateur radicalaire. La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les figures et exemples suivants : Figure 1 : Structure chimique du S39625 ; 30 Figure 2: Méthode d'inclusion du S39625 dans les micelles polymérisées et non-polymérisées ; 5 15 20 25 Figure 3 : (1) chromatogramme du S39625 dans l'acétonitrile, (2) chromatogramme des micelles non-polymérisées / polymérisées, (3) chromatogramme du S39625 inclus dans les micelles non-polymérisées, (4) chromatogramme du S39625 inclus dans les micelles polymérisées ; Figure 4: (1) chromatogramme du S39625 solubilisé dans l'acétonitrile, (2) chromatogramme du S39625 inclus dans les micelles polymérisées ; Figure 5: Structures des principes actifs hydrophobes (1) S44563, (2) 42909, (3) paclitaxel et (4) pyrène ; Figure 6: Structure chimique du 4-amino-3-hydroxy-1-sulfonatenaphthalène ; Figure 7 : Spectres de fluorescence du 4-amino-3-hydroxy-1-sulfonatenaphthalène, des nanobagues et des micelles polymérisées fonctionnalisées par le fluorophore et de l'échantillon de contrôle (excitation à 345nm) ; Figure 8: (A) spectres d'absorbance de l'amine III-9, des micelles polymérisées et des micelles polymérisées fonctionnalisées par l'amine III-9 (B) spectres de fluorescence de l'amine III-9, des micelles polymérisées fonctionnalisées par l'amine III-9 et de l'échantillon de contrôle (excitation à 280nm). EXEMPLE 1 : SYNTHESE DES MOLECULES AMPHIPHILES II-4 ET II-23 1.1 Synthèse de la molécule amphiphile II-4 La première étape de cette synthèse selon le schéma 1 consiste à préparer la partie hydrophile de la molécule amphiphile (dérivé de l'acide nitrilotriacétique) à partir de la N-benzyloxycarbonyl-L-lysine (Z-L-lysine). 30 Schéma 1 : o Br.^~OH O 0 bh. NaOH, 50'C Rdr=quafl O ,är') 6 FI O f OH HO 0 FilN~N~~ OH 11.2 PdrC rdtm5096 La deuxième étape de la synthèse selon le schéma 2 consiste à coupler la tête hydrophile II-2 avec l'acide 10,12-pentacosadiynoique préalablement 5 activé. Schéma 2 : 0 rN OH `b y~~OH Frei 0 Rds.quani. 0 H HO 1 O o 0'OH OIEA Ml=76% 1I.3 11.4 L'acide pentacosadiynoique est activé par le N-hydroxysuccinimide en 10 présence de N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide pour donner l'acide activé Il-3. Le tensio-actif II-4 est obtenu par le couplage peptidique entre la tête hydrophile NTA II-2 et de l'acide activé II-3. Le produit pur est obtenu par précipitation dans l'eau par ajout d'acide chlorhydrique. ls 1.2 Synthèse de la molécule amphiphile II-23 La molécule amphiphile II-23 est un surfactant comportant deux types de motifs polymérisables : un motif diacétylénique polymérisable par irradiation lumineuse à 254nm et un motif acrylate réticulable par bombardement électronique. 20 La première étape de la synthèse consiste à préparer la partie hydrophile de la molécule amphiphile (tête NTA) à partir de la N-benzyloxycarbonyl-L-lysine (Z-L-lysine) conformément au schéma 1 puis de protéger les acides carboxyliques sous forme d'esters ter-butyliques. On obtient la tête hydrophile protégée tBu-NTA nommée II-14. La deuxième étape de la synthèse est résumée dans le schéma réactionnel 3 suivant. Schéma 3 : -4-- a 0.,,o nt)-a û Par-4w%, U-12 o,,,,-.OH )" Hf: --Ir. Mie neF.vore- rk,eO, o "'CFIn-3 o rf-"' ,Ç*, ä,cr, 1f-I& r,.,�) rme Fkt=78'•t 11.14 -I9 Mt jî,2o, H - .ee a Nt-fe,t. n' -,-;-, 9 9 r ),. re''''>l U-21 - e-1--wr l622 4^.te^2% 0 te 1 en,,.beb u,2310 EXEMPLE 2 : PREPARATION ET CARACTERISATION DES MICELLES POLYMERISEES 2.1 Préparation des micelles polymérisées Les micelles sphériques sont des arrangements d'amphiphiles obtenus à partir de la concentration micellaire critique (CMC). Ces organisations de forme sphérique ont une surface hydrophile et un coeur lipophile ou hydrophobe. Le tensio-actif II-4 s'arrange sous forme de micelles sphériques lorsque le io pH de la solution aqueuse est supérieur à 10. Au delà du pH=10, le doublet non liant de l'amine tertiaire de la partie hydrophile du surfactant est libéré conduisant à l'augmentation du volume de la tête polaire, et en dessous de cette valeur de pH des liaisons hydrogènes peuvent s'établir entre les carboxylates et l'hydrogène de l'amine tertiaire protonée conduisant à la 15 diminution du volume de la tête NTA de l'amphiphile II-4. Les micelles auto-assemblées et polymérisées d'amphiphile II-4 sont préparées selon le schéma 4 par irradiation lumineuse à 254nm d'une solution aqueuse à pH=12 de II-4 pendant 5 heures puis le pH est ajusté au pH physiologique par dialyse contre une solution à un pH compris entre 7 20 et 8. Schéma 4 : 25 On observe que la polymérisation par irradiation lumineuse de l'amphiphile II-4 structuré sous forme de micelles est un processus relativement lent et qu'une conversion de la totalité des aimphiphiles II-4 en polydiacétylénique devrait être atteinte pour des temps de polymérisation au-delà de 5 heures. 2.2 Caractérisation des micelles polymérisées L'analyse des micelles polymérisées d'amphiphiles II-4 est réalisée par granulométrie laser. Cette technique, basée sur la diffusion quasi élastique de la lumière et la spectroscopie croisée de corrélation de photon, permet de déterminer la distribution en taille d'un échantillon. L'analyse en intensité d'un échantillon de micelles polymérisées à 50mg/ml io par l'appareil Nanophox présente un pic principal de population à 4,9nm. L'analyse en nombre de l'échantillon de micelles polymérisées à 1 mg/ml par l'appareil Malvern Zetasizer a mis en évidence la présence d'une population unique à 5,1 nm. La polymérisation des micelles induit un phénomène de contraction des ts micelles pouvant s'expliquer par le fait que la polymérisation fige l'assemblage des amphiphiles et limite les phénomènes de gonflements. EXEMPLE 3 : INCLUSION DU S39625 DANS LES MICELLES POLYMERISEES ET DANS LES MICELLES NON-POLYMERISEES 20 3.1 Méthode d'inclusion du S39625 Le S39625 a été encapsulé dans une solution de 10mg/mI de micelles non-polymérisées et de micelles polymérisées par la méthode � d'agitation et chauffage à 50°C � telle que détaillée dans la description et représentée 25 Figure 2. 3.2 Détermination du taux d'inclusion du S39625 par HPLC Le taux d'inclusion du S39625 est déterminé par la méthode HPLC en phase inverse. Cette technique se base sur la différence d'interaction des 30 molécules entre la phase mobile et la phase stationnaire. Cette différence se répercute sur les temps de rétention de ces molécules. Pour des conditions HPLC données, une même molécule a toujours le même temps de rétention. Les conditions HPLC en phase inverse pour la détermination du taux d'inclusion du S39625 sont une colonne de silice greffée RP-18° pour la phase stationnaire et un gradient d'eau et d'acétonitrile de 5% à 100% pour la phase mobile. La détection du S39625 en sortie de colonne est réalisée par un détecteur UV à une longueur d'onde de 385nm. Une courbe d'étalonnage du S39625 dans l'acétonitrile a été réalisée par HPLC inverse. Dans ces conditions d'HPLC, le principe actif S39625 présente un temps de rétention de 25,8 minutes. io Le temps de rétention du S39625 encapsulé dans des micelles polymérisées a également été déterminé par HPLC en phase inverse pour laquelle le gradient de solvant est remplacé par un régime isocratique en acétonitrile pur. L'acétonitrile est un des meilleurs solvants du S39625 et son utilisation en tant qu'éluant permet de s'assurer du relargage très 15 rapide du principe actif et de son élution comme une entité libre. 3.3 Résultats du taux d'inclusion du S39625 Les résultats d'incorporation du S39625 sont calculés à partir de la Figure 3. 20 Le chromatogramme du S39625 inclus dans les micelles non-polymérisées présente, le trois pics à 3,2 minutes, 25,8 minutes et 31,9 minutes. Au vu de l'aire du pic à 25,8 minutes, l'incorporation du principe actif dans les micelles non-polymérisées est compris entre 1,7 et 3,3%. Le chromatogramme du S39625 inclus dans les micelles polymérisées 25 présente un large pic à un temps de rétention très faible. Cette forte diminution du temps de rétention montre d'une part, que l'hydrophobicité du S39625 est fortement masquée par la surface très hydrophile de la micelle polymérisée et d'autre part que l'association S39625/micelles polymérisées est particulièrement robuste. 30 Le chromatogramme du S39625 solubilisé dans l'acétonitrile présente un pic à 5,2 minutes alors que le S39625 inclus dans la micelle polymérisée présente deux pics à 4,0 et à 4,9 minutes. Le taux d'inclusion dans les micelles polymérisées du S39625 et de ses produits de dégradation est estimé par intégration des deux pics. Le taux d'incorporation de ces molécules dans les micelles polymérisées est donc de 48%. Pour une concentration en amphiphile identique (10 mg/ml), la solubilité et donc la capacité d'encapsulation des micelles polymérisées est améliorée d'un facteur 5 par rapport aux nanobagues et d'un facteur 13 par rapport aux micelles non polymérisées. EXEMPLE 4 : INCLUSION DE PRINCIPES ACTIFS HYDROPHOBES DANS LES MICELLES POLYMERISEES Des tests d'inclusion sont menés sur des principes actifs hydrophobes S42909, S44563, le paclitaxel une molécule active hydrophobe de référence et le pyrène une molécule très hydrophobe. Les formules chimiques de ces principes actifs hydrophobes sont représentées Figure 5. L'inclusion de ces principes actifs a été menée avec des solutions de micelles polymérisées à 10mg/ml par la méthode de chauffage à 50°C pendant 12 heures. L'ensemble des résultats du Tableau 1 présente une forte incorporation des molécules hydrophobes dans les micelles polymérisées avec des taux d'inclusion supérieurs à 24% et une augmentation de la solubilité des principes actifs dans l'eau de 30 000 à 500 000. 30 Tableau 1 : Solubilité dans Principe Masse l'eau de Taux Taux NOde re Solubilité d'inclusion d'inclusion dans Actif molaire la massiquef molaire9 molécules l'eau (en Molécule (g/mol) molécule (en "/o) (en %) micelle" mg/mL) pg/mL) S 39625 430 0,09 48 56 125 9,00 S 44563 912 2,00 45 36 56 8,30 S 42909 462 0,20 24 29 42 3,15 Paclitaxel 853 0,40 3'1 25 33 4,55 Pyrène 202 0,01 34 63 167 5,25 f Ratio massique (en %) entre médicament et médicament + transporteur 5 x 100 dans la formulation après traitement g Ratio molaire (en % entre médicament et médicament + Amphiphile Il-4 x 100 dans la formulation après traitement h Ratio molaire entre médicament et Amphiphile II-4 x nombre d'amphiphile/micelle (100 molécules) lo EXEMPLE 5 : FONCTIONNALISATION DES MICELLES POLYMERISEES 5.1 Fonctionnalisation par le 4-amino-3-hydroxy-sulfonatenaphthalène Les micelles polymérisées sont fonctionnalisées par un fluorophore 15 hydrophile, le 4-amino-3-hydroxy-sulfonatenaphthalène décrit Figure 6. Ce fluorophore a une longueur d'onde d'excitation de 340nm et une longueur d'onde d'émission de 455nm. L'accroche du fluorophore s'effectue par un couplage peptidique dans l'eau à pH basique (pH=12) avec comme agent de couplage le 20 dicyclohexylcarbodiimide (DCC). Ce greffage a été réalisé en fort excès de fluorophore (50 équivalents) et d'agent de couplage (100 équivalents), et les échantillons ont été purifiés par colonne d'exclusion de taille. La fonctionnalisation des micelles polymérisées a été suivie par spectroscopie à fluorescence afin de mettre en évidence le greffage du 25 fluorophore à la surface du nanovecteur. Les spectres de fluorescence des 22 micelles polymérisées fonctionnalisées montrent une évolution du pic de fluorescence du 4-amino-3-hydroxy-sulfonatenaphthalène avec un shift bathochrome de fluorescence de 492nm (Figure 7). Le contrôle met en évidence que le shift de fluorescence des micelles polymérisées provient s bien du greffage covalent du fluorophore à la surface du nanovecteur. 5.2 Fonctionnalisation par de l'acide folique Le récepteur folate étant surexprimé à la surface des cellules cancéreuses, l'acide folique est très largement utilisé pour le ciblage spécifique des io cellules cancéreuses du cerveau, du rein, du sein, des ovaires et des poumons. Pour réaliser l'étape de couplage de l'acide folique aux micelles polymérisées, l'acide folique a été modifié afin d'introduire une fonction amine permettant le greffage. Le couplage du dérivé aminé de l'acide 15 folique III-9 à la surface des micelles polymérisées s'effectue par un couplage peptidique dans l'eau à un pH basique (pH=12) avec de la DCC comme agent de couplage. Ce greffage est réalisé en fort excès de dérivé aminé de l'acide folique (50 équivalents) et d'agent de couplage (100 équivalents). L'échantillon a été purifié par filtration puis par colonne 20 d'exclusion de taille. Les spectres d'absorption de la Figure 8 montrent que le dérivé aminé de l'acide folique III-9 est bien présent à la surface des micelles polymérisées du fait de la présence du pic à 285nm. Les spectres de fluorescence des micelles polymérisées fonctionnalisées montrent une évolution des pics de 25 fluorescence du dérivé aminé de l'acide folique à 360nm et 450nm. 30 EXEMPLE 6 : ETUDE TOXICOLOGIQUE DES MICELLES POLYMERISEES La distribution des micelles polymérisées dans l'organisme est un paramètre primordial à tester afin de déterminer le mode d'excrétion et le mode d'accumulation desdites micelles polymérisées. Pour réaliser cette étude, l'amphiphile II-4 est radiomarqué au carbone 14 afin de synthétiser la micelle polymérisée radiomarquée pour une étude de pistage par autoradiographie chez le rat. L'amphiphile radiomarqué au lo carbone 14 est obtenu avec une activité spécifique de 7.6pCi/mg. L'administration des micelles polymérisées chez le rat s'effectue à une dose de 4MBq/kg et 100mg/kg pour un volume d'administration de2.5ml/kg. Pour ce faire, une solution à 40mg/ml est nécessaire avec une activité spécifique de 7.6pCi/mg. 15 L'étude d'accumulation/élimination des micelles polymérisées radiomarquées au carbone 14 a été menée sur 3 rats males de type Wistar. Une dose unique de 100mg/kg des micelles polymérisées [14C] a été administrée par voie intraveineuse (bolus) à chacun des rats, et les 20 animaux ont été euthanasiés à 10 minutes, 24 heures et 48 heures. Les urines des rats 24 heures et 48 heures ont été récoltées afin de mesurer leur activité par scintillation liquide. La quantification des niveaux de radioactivité dans les tissus a été effectuée par radioluminographie de sections spécifiques des rats, obtenues par cryomicrotomie. 25 L'analyse des radioluminogrammes du rat 10 minutes, i.e. euthanasié à 10 minutes, met en évidence une distribution généralisée de radioactivité dans le corps du rat due à une concentration élevée de micelles polymérisées dans le sang. Des niveaux élevés de radioactivité ont été détectés dans 30 certains tissus tels que les poumons, les reins et ses substances médullaires, le foie, les glandes adrénales ou la rate. L'analyse des radioluminogrammes des rats 24 heures et 48 heures, i.e. respectivement euthanasié à 24 et 48 heures, révèle une concentration de radioactivité élevée dans le foie, la paroi intestinale, la rate, les glandes adrénales, les reins et la moelle osseuse.5 REVENDICATIONS1. Micelles polymérisées caractérisées en ce qu'elles comprennent des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules amphiphiles comportant une ou cieux chaînes lipidiques comprenant chacune un ou deux motifs polymérisables, de types diacétylénique, vinyle, acrylate ou styrène, liées à une tête polaire. 2. Micelles polymérisées selon la revendication 1, caractérisées en ce io qu'elles comprennent des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules amphiphiles de formule générale AùXùBùLùZ où A représente CH3 (CH2)m C=C-C-Cù(CH2)" ou CH2=CHù ou CH2=CH-C6H4ù , n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16; 15 où X représente CO-NH ou NH-CO ou une liaison, X est une liaison si B est une liaison et L est une liaison ; où B représente ù(CH2 m C=CùC-Cù(CHZ),- ou ùCH=CH-C6H4ù ou une liaison, n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16 ; où L représente ù(CH2).-CH[NH-COùA']ù ou une liaison, r étant un 20 entier de 1 à 16 et A' représente A ; où Z représente ,CH2-R2 ou ,,CH2-R2 ùNHCOù(CH2)S CHùN\ R CH2-RZ s étant un entier de 1 à 16 avec R2 représentant COOH ou SO3H ou OSO3H ou OP03H2 ou OP02H2 avec RI 25 représentant H ou un radical COOH ou SO3H ou OSO3H ou OP03H2 ou OP02H2 ou un groupe -CO-NH-(CH2)t-CH3, t étant un entier de 1 à 16, ou Z peut être également des têtes polaires hydrophiles neutres, de type sucre ùCONHù(CH,):CHùN\ RI CH2-R2 ou polysaccharide, ainsi que leurs sels d'addition avec un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. 3. Micelles polymérisées selon les revendications 1 et 2, caractérisées en ce qu'elles comprennent des molécules amphiphiles polymérisées obtenues à partir de molécules amphiphiles de formule générale AùXùBùLùZ où A représente CH3 (CH2)m C=CùC-Cù(CH2) net m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16; io où X représente COùNH ou NHùCO ou une liaison, X est une liaison si B est une liaison et L est une liaison ; où B représente ù(CH 2 m C=CùC:-Cù(CH2 n ou une liaison, n et m, identiques ou différents, étant des entiers de 1 à 16 ; où L représente ù(CH2)r--CH[NH--COùA']ù ou une liaison, r étant un 15 entier de 1 à 16 et A' représente A cu CH2=CHù ou CH2=CHùC6H4ù ; où Z représente ,CH2-COOH ùCONHù(CH2);CHùN\ CH2-COOH ou ,CH2-COOH ùNHCOù(CH2); CHùN\ R~ CH2-COOH , s étant un entier de 1 à 16 avec RI représentant H ou un radical COOFi ou un groupe 20 ùCO-NH-(CH2)t-CH3, t étant un entier de 1 à 16, ou Z peut être également des têtes polaires hydrophiles, neutres, de type sucre ou polysaccharide, ainsi que leurs sels d'addition avec un acide ou une base pharmaceutiquement acceptable. 25 4. Micelles polymérisées selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisées en ce que la tête polaire Z est fonctionnalisée. . Micelles polymérisées selon la revendication 4, caractérisées en ce la tête polaire Z est fonctionnalisée par un acide folique. 6. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, 5 caractérisées en ce qu'elles incluent un ou des composés hydrophobes. 7. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont obtenues à partir de la molécule amphiphile II-4 de formule 0 O HO 0 H NOH OH 8. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont obtenues à partir de la molécule amphiphile II-23 de formule 0 HO O NH O WN H 9. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont obtenues à partir de la molécule amphiphile de formuleCOOH (CHZ), N COOH N H R, 10. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont 5 obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule ~~N~(C-iZ)~/N~~ COOH H R, 11. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont lo obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule NH Ri H N N -- ~~(CH )/~/ (CHZ), COOH 0 0 COOH 12. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont 15 obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule R, N ~~N~~COOH COOH COOH O513. Micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisées en ce que les molécules amphiphiles polymérisées sont obtenues à partir de la molécule amphiphile de formule 14. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend des micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13. 15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle to comprend un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. 16. Utilisation des micelles polymérisées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 comme vecteurs de molécules hydrophobes. 15 17. Utilisation des micelles polymérisées selon la revendication 16, caractérisées en ce que les molécules hydrophobes sont des principes actifs hydrophobes. 18. Procédé d'obtention des micelles polymérisées selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : les molécules amphiphiles à polymériser selon les revendications 1 à 13 sont auto-assemblées en micelles sphériques ; les micelles sphériques auto-assemblées sont polymérisées. 25 19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les micelles sphériques auto-assemblées sont photopolymérisées. R, COOH20. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que les micelles sphériques auto-assemblées sont polymérisées par polymérisation radicalaire.5