Brevet FR2930647A1 — publié le 20091030

Méthode permettant d'identifier un composé modulant la pigmentation des follicules pileux humains et/ou protégeant les mélanocytes des follicules pileux humains. L'invention concerne un procédé de criblage de produits en vue d'identifier au moins un composé modulant la pigmentation des fibres kératiniques et/ou protégeant les mélanocytes du follicule pileux humains en survie in vitro. Le follicule pileux est une invagination tubulaire de l'épiderme qui s'enfonce jusqu'aux couches profondes du derme. La partie inférieure, ou follicule pileux, comporte elle-même une invagination dans laquelle se trouve la papille dermique. La partie inférieure du follicule pileux est une zone de prolifération cellulaire où se trouvent les précurseurs des cellules kératinisées constituant le cheveu. Les cellules en ascension issues de ces précurseurs se kératinisent progressivement dans la partie supérieure du bulbe, et cet ensemble de cellules kératinisées formera la tige pilaire. La couleur des cheveux et des poils repose notamment sur la présence en quantités et ratios variables de deux groupes de mélanines : les eumélanines (pigments bruns et noirs) et les phéomélanines (pigments rouges et jaunes). La pigmentation du cheveu et des poils requiert la présence de mélanocytes au niveau du follicule pileux du follicule pileux. Ces mélanocytes sont dans un état actif, c'est-à-dire qu'ils synthétisent des mélanines. Ces pigments sont transmis aux kératinocytes destinés à former la tige pilaire ce qui conduira à la pousse d'un cheveu ou d'un poil pigmenté. A ce jour il n'existe pas de techniques d'évaluation de la pigmentation et /ou de protection des follicules pileux humains qui permettent de mesurer in vitro sur un follicule pileux entier de follicule pileux la mélanine néosynthètisée. Il existe donc un besoin d'un procédé qui permette de suivre qualitativement et quantitativement le processus de néosynthèse de la mélanine du cheveu in vitro et d'apprécier quantitativement l'effet d'un composé ou d'un extrait sur la néo-synthèse de mélanine d'un follicule pileux humain isolé en survie in vitro. Dans l'art antérieur il est évoqué la possibilité d'évaluer la pigmentation dans l'épithélium rétinal de poulet grâce notamment aux propriétés d'incorporation de la thiouracile (Whittaker J.R., 1971. J Biol Chem, 246 (20): 6217-6226). Des études ultérieures ont démontré que la thiouracile s'accumule dans la mélanine néosynthétisée sans se fixer sur la mélanine déjà présente dans le tissu (Napolitano A et al., 1996. J Med Chem, 39, 5192-5201). Plus récemment des méthodes d'évaluation de la pigmentation de la peau ont été décrites, telle que celle permettant le suivi de l'incorporation de thiouracile radiomarquée [14C] dans un explan de peau de cobaye maintenue en survie in vitro (Imokawa et Motegi, 1993. J Invest Dermatol, 100(1), 47-54). Une méthode permettant la mesure de l'incorporation de thiouracile radiomarquée [14C] dans un modèle de co-cultures de mélanocytes-kératinocytes (Regnier M et al., Cell Mol Biol, 1999 Nov.45(7) :969-80) a été également décrite. Par ailleurs l'utilisation in vivo de la thiouracile marquée au [14C] pour localiser la synthèse de mélanine a été décrite dans le cadre diagnostic clinique des mélanomes métastatiques chez le rat ou la souris, ces essais ont permis d'observer que la thiouracile marquée au [14C] pouvait s'incorporer dans un certain nombre de structures telles que les follicules pileux (Yamada K. et al., J Invest Dermatol, 1988 Jun ; 90(6) : 873-876). Cependant aucun procédé permettant d'identifier le potentiel de substances à moduler la pigmentation des fibres kératiniques humaines et/ou la protection des mélanocytes des follicules pileux humains in vitro de façon précise n'a donc été décrit. Chez l'Homme, les processus biologiques et biochimiques qui conduisent à la pigmentation du cheveu présentent un certain nombre de différences avec ceux qui conduisent à la pigmentation de la peau. Ces différences amènent à considérer l'unité de pigmentation du cheveu comme tout à fait originale. ln vivo, outre le rôle déterminant des cycles pilaires dans la pérennité et la qualité de la pigmentation du cheveu, on observe pour l'unité de pigmentation active du follicule (phase anagène du cycle pilaire) les originalités suivantes: - l'organisation cellulaire tridimensionnelle unique est très particulière : les mélanocytes sont au contact des kératinocytes et sont disposés en � couronne � autour de la papille dermique ; - la dynamique de pigmentation se distingue nettement de celle du tissu cutané : si dans ce dernier un mélanocyte transfère ses mélanosomes à 36 kératinocytes en moyenne un mélanocyte de cheveu transfère ses mélanosomes à 5 kératinocytes (Tobin DJ and Paus R, 2001. Exp Gerontol, 36, 29-54). Par ailleurs contrairement à la peau où le processus de pigmentation est continu, le processus de pigmentation du cheveu est cyclique, intimement couplé au cycle pilaire (Commo S and Bernard B.A, 2000. Pigment Cell Res, 13(4) : 253-259 ; Slominski A et Paus R, 1993. J Invest Dermatol, 101, 90S-97S). A ce titre des signes particuliers qui traduisent la fin d'un cycle et l'arrêt concomitant de la pigmentation du follicule pileux sont observables chez la souris. La synthèse de mélanine se réduit et les dendrites qui conduisent la mélanine synthétisée par les mélanocytes vers les kératinocytes se rétractent (Slominski et Al., 1996. J Invest Dermatol, 106, 1203-1211 ; Slominski et al., 1994. J Invest Dermatol, 102, 862-869 ; - en outre, avec l'âge, dans les follicules pileux âgés une diminution de la population de mélanocytes est observée prématurément dans les follicules pileux âgés mais pas dans l'épiderme du scalp, entrainant le blanchissement des cheveux (Commo S, Gaillard O, and Bernard B, Br J Dermatol 2004) ; - enfin au plan enzymatique et de façon très surprenante, l'unité de pigmentation du follicule pileux humain ne dispose pas de l'enzyme trp2 (DOPAchrome tautomérase ; E.C. 5.3.3.12 ; Commo S et al., 2004. Pigment Ce/1 Res, 17(5), 488-497). Ce point est une des caractéristiques qui distinguent également le processus biochimique de pigmentation du follicule pileux humain de celui de certains rongeurs. Comme l'indique la littérature, l'enzyme trp2 est présente par exemple, dans les follicule pileux des souris (Prota G., et al., 1995 ; Pigment Ce/1 Res 1995 8:3 (153-163)). En conséquence, les différences ci avant citées peuvent conduire à des résultats différents au regard de la pigmentation du cheveu par rapport à celle de la peau pour un même actif. L'ensemble de ces distinctions liées à l'organisation cellulaire, à la dynamique des interactions cellulaires, et à la nature même du processus de synthèse de la mélanine, ne permet pas de transposer des résultats obtenus avec des actifs sur la pigmentation de la peau, à la pigmentation des fibres kératiniques, ou plus particulièrement du cheveu. Par ailleurs, dû notamment à l'absence de l'enzyme trp2, il n'est pas possible de transposer l'effet mesuré chez le rongeur (par exemple la souris) de composés sur la pigmentation de follicules pileux chez l'Homme. Il existe donc un besoin de développer in vitro une analyse qualitative ou quantitative précise du processus de pigmentation des fibres kératiniques et/ou de protection des mélanocytes des follicules pileux humains. Il existe aussi un besoin d'identifier des composés modulant la pigmentation et/ou la protection des mélanocytes du follicule pileux humains.35 Les inventeurs ont maintenant trouvé une méthode permettant d'identifier un composé modulant la pigmentation des follicules pileux humains et/ou protégeant les mélanocytes du follicule pileux humain en survie in vitro. L'invention concerne un procédé de criblage de produits en vue d'identifier au moins un composé modulant la pigmentation des fibres kératiniques et/ou la protection des mélanocytes du follicule pileux comprenant les étapes suivantes ; a) microdissection de follicules pileux humains et mise en oeuvre d'une méthode de cultures des follicules in vitro puis incubation d'au moins deux desdites cultures avec un traceur d'activité de mélanocytes des follicules pileux. b) incubation d'une desdites cultures préparées en a) avec un ou plusieurs produits à tester ; c) mesure, qualitative et /ou quantitative, de l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes dans les follicules pileux humains des cultures préparées en a) et b) ; d) sélection des composés pour lesquels une modulation de l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes est mesurée dans ladite culture préparée en b) par rapport à une culture témoin préparée dans les mêmes conditions mais en absence dudit composé à tester. Le procédé selon l'invention tel que décrit ci-dessus est particulièrement intéressant car il permet de mesurer de l'activité liée à l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux dans la mélanine néo-synthétisée présente dans lesdits follicules pileux, c'est-à-dire mesurer ainsi la quantité de mélanine néosynthétisée dans lesdits follicules pileux Selon un mode particulier, l'invention concerne un procédé tel que décrit plus haut dans lequel à l'étape b) une autre desdites cultures préparées en a) est également incubée avec un produit de référence stimulateur ou inhibiteur de pigmentation, et dans lequel à l'étape c) la modulation de l'incorporation du traceur d'activité desdits mélanocytes de cette culture comprenant le produit de référence avec la culture témoin est également mesurée. Comme produit de référence stimulateur de pigmentation, on peut citer par exemple la forskoline, les dérivés de la pro-opiomelanocortine tels que l'aûMSH, l'ACTH, les b-endorphines (Kauser et al., 2004. J Invest Dermatol, 123, 184-195), les eicosanoides dont notamment les prostaglandines et leur analogues à l'exemple des agonistes du récepteur EP des prostaglandines E2, ou du récepteur FP des prostaglandines F2 (Johnstone M A., Am J Ophthalmol 1997: 124: 544-547). Comme produit de référence inhibiteur de pigmentation, on peut citer par exemple l'acide kojique, l'hydroquinone, ou les composés tels que décrits dans Slominski A et al., 2004. Physiol Rev, 84, 1155-1228. Les composés testés selon le procédé de l'invention tel que décrit plus haut peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composé chimiques structurellement définis, de composés ou substances non caractérisées, ou d'un mélange de composés. Selon l'invention, lesdits follicules pileux humains sont obtenus à partir d'une biopsie de peau humaine par une microdissection. Lesdits follicules pileux obtenus sont viables, c'est-à-dire qu'ils présentent un follicule pileux dont l'intégrité morphologique a été préservée. Selon l'invention, par follicule pileux, on entend un ensemble comprenant une papille dermique autour de laquelle sont localisés des mélanocytes en nombre variable, une tige pilaire entourée de ses gaines. Ce follicule peut correspondre notamment à un poil, un cheveu, un cil ou un sourcil. Par fibres kératiniques on entend l'ensemble des structures, cuticule, cortex et medulla, qui constitue la tige pilaire. La biopsie, c'est-à-dire un prélèvement de peau humaine contenant au moins un follicule pileux, est issue plus particulièrement du cuir chevelu. Lesdits follicules pileux humains peuvent être obtenus selon la méthode telle que décrite dans le brevet US 5712169. La préparation de cultures de follicules pileux humains a) peut être réalisée en plaçant lesdits follicules pileux humains dans un milieu de survie de composition adéquat à la réception de biopsies. Le milieu de culture utilisé selon l'invention peut- être choisi parmi ceux couramment utilisé par l'homme du métier, tel que par exemple le milieu de culture William's E (Gibco-BRL) supplémenté notamment en glutamine, insuline, hydrocortisone et antibiotiques. Par traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux, utilisable selon l'invention, on entend une substance qui peut être incorporée dans une voie métabolique spécifique des mélanocytes, plus particulièrement la mélanogénèse, et qui peut être suivie et/ou mesurée par toute technique de dosage connu de l'homme du métier. Le traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux selon l'invention peut être notamment un composé modulant la pigmentation des fibres kératiniques. Le traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux selon l'invention peut être notamment un traceur de protection desdits mélanocytes. Selon la présente invention, l'activité des mélanocytes du follicule pileux représente la capacité des mélanocytes à produire de la mélanine ainsi que l'état de viabilité desdits mélanocytes. Dans le but de suivre ce traceur, on peut citer, à titre d'exemple et sans limitation, la microscopie optique, la microscopie confocale, ou la microscopie multiphotonique. Ledit traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux pourra notamment être choisi parmi les traceurs potentiels, qui peuvent être notamment suivi par marquage, tels que le 2-thiouracile, 5-iodo-2 thiouracile, 5 dihydroxyboryl-2-thiouracile, methymazole, thiourée, 2-mercaptobenzothiazole, listés notamment dans le � Pigmentary System : physiology and patophysiology � Edited by James Nordlund, Raymaon E.Boissy, Vincent J. Hearing, Richard A.King, Jean-Paul Ortonne, Oxford Edition. Lesdits traceurs d'activité des mélanocytes du follicule pileux sont plus particulièrement radiomarqués. Ledit traceur des mélanocytes du follicule pileux est de préférence la 2-thiouracile radiomarquée. Préférentiellement ladite thiouracile sera radiomarquée au carbone 14. Les quantités du traceur utilisées selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Selon l'invention, l'incubation lors des étapes a) et b) est effectuée avec le traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux (plus particulièrement le 2-Thiouracile [1401) à une concentration comprise de 0,1 �Ci/ml à 10 �Ci/ml, de préférence 3 �Ci/ml. Le temps d'incubation est généralement compris entre 4 heures et 7 jours. De préférence le temps d'incubation est compris entre 3 et 5 jours de préférence. Préférentiellement le temps d'incubation est de 5 jours. Selon l'invention, l'incubation lors de l'étape b) du composé à tester s'effectue dans des conditions et à une concentration déterminée suivant ledit composé. En particulier la mesure de l'activité des mélanocytes du follicule pileux, ou plus particulièrement la mesure de la pigmentation et/ou de protection des mélanocytes du follicule pileux, réalisée à l'étape c) telle que décrite plus haut est déterminée par mesure de l'activité liée à l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux dans la mélanine néo-synthétisée présente dans lesdits follicules pileux. Cette activité est corrélée à la quantité de mélanine néo-synthétisée dans lesdits follicules pileux. L'homme du métier est familier des techniques permettant l'évaluation qualitative ou la mesure quantitative de l'activité liée à l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux. De manière particulière, la mesure qualitative réalisée à l'étape c) selon l'invention est effectuée sur des coupes longitudinales desdits follicules pileux obtenus entiers, et/ou la mesure quantitative réalisée à l'étape c) selon l'invention est effectuée après lyse desdits follicules pileux. Plus particulièrement la mise en oeuvre de la mesure qualitative réalisée à l'étape c) selon l'invention comprend les étapes de congélation desdits follicules pileux, la réalisation de coupes histologiques à l'aide d'un cryostat, la mesure de la désintégration du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux, puis la superposition, le cas échéant, de l'image autoradiographique et de celle de la coupe histologique. En particulier, et à titre d'exemple et sans caractère limitatif, l'étape c) de mesure qualitative, peut être réalisée selon le protocole comprenant les étapes suivantes : - la mise en oeuvre de procédure standard de congélation desdits follicules pileux obtenus en b) ; - la réalisation de coupes histologique de 7�M d'épaisseur à l'aide d'un cryostat ; - lecture de l'activité radioactive issue de la 2-thiouracile [14C] avec le Micro-Imager M25 pendant un temps d'acquisition suffisant pour que les signaux soient mesurables. Ce temps varie de 1 h00 à 200h00, son analyse est réalisée à l'aide du logiciel B vision tel que décrit dans B.Gautier et B.A.Bernard, 2001. Skin Pharmacol, 14, 41-45 ; - la superposition, le cas échéant, de l'image autoradiographique et de celle de la coupe histologique. Plus particulièrement la mise en oeuvre de la mesure quantitative réalisée à l'étape c) selon l'invention comprend la lyse des follicules pileux par l'ajout d'une solution de lyse des follicules puis de liquide scintillant et enfin la lecture de l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux. En particulier, et à titre d'exemple et sans caractère limitatif, l'étape c) de mesure quantitative, peut être réalisée selon le protocole comprenant les étapes suivantes : - lavage desdits follicules pileux obtenus en b), suivi d'une lyse totale par immersion dans une solution de Soluène 350 porté à 50°C ; - l'ajout d'un liquide scintillant, suivi d'une agitation ; - lecture de l'activité de l'incorporation de 2-thiouracile [14C] avec l'aide de l'appareil TRILUX 1450 Micro-Beta. Par modulation de l'activité des mélanocytes du follicule pileux, ou plus particulièrement la modulation de la pigmentation et/ou protection des mélanocytes du follicule pileux, on entend toute variation de l'incorporation du traceur d'activité desdits mélanocytes, qualitative ou quantitative, diminution ou augmentation de l'intensité de celle-ci, qui peut correspondre à une modification de la quantité, de la concentration ou de la répartition du traceur de l'activité du mélanocyte. Selon l'invention les composés tels que sélectionnés à l'étape d) peuvent être en particulier ceux pour lesquels on observe une variation supérieure d'au moins 10%, particulièrement d'au moins 20%, plus particulièrement d'au moins 30%, de la pigmentation de ladite culture préparée en b) avec un ou plusieurs produits à tester par rapport à une culture témoin préparée en a) dans les mêmes conditions mais en absence dudit composé à tester. Selon l'invention les composés tels que sélectionnés à l'étape d) peuvent être en particulier ceux pour lesquels on observe une augmentation d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20%, ou une diminution de plus de 10%, de préférence de plus de 20% de la pigmentation de ladite culture préparée en b) avec un ou plusieurs produits à tester par rapport à une culture témoin préparée en a) dans les mêmes conditions mais en absence dudit composé à tester. Selon un mode particulier de l'invention, lorsqu'à l'étape b) une autre desdites cultures préparées en a) est également incubée avec un produit de référence stimulateur ou inhibiteur de pigmentation, la modulation de l'incorporation du traceur d'activité desdits mélanocytes de cette culture comprenant le produit de référence avec la culture témoin est également mesurée à l'étape c) afin de valider l'essai. Selon un mode particulier de l'invention, lorsque lors de l'étape b) une autre desdites cultures préparées en a) est incubée avec un ou plusieurs autres produits à tester, certains de cesdits produits pouvant être des produits de référence stimulateur ou inhibiteur de pigmentation, la sélection effectuée à l'étape d) est réalisée en ce qu'on mesure la modulation de l'activité des mélanocytes du follicule pileux, ou plus particulièrement de la pigmentation, (i) d'une culture comprenant le composé à tester avec une culture témoin préparée dans les mêmes conditions mais sans le composé à tester ; (ii) d'une culture comprenant le ou les autres produits à tester avec la culture témoin ; et en ce qu'on sélectionne les composés pour lesquels la modulation observée en (i) est supérieure d'au moins 10% à celle observée en (ii). Un autre avantage de l'invention est la mise en oeuvre d'un modèle de follicules pileux humains sur lequel les consommateurs, ou les consommatrices, pourront se projeter. L'invention a donc également pour objet une méthode pour la promotion d'un produit cosmétique consistant à faire état d'une efficacité, action ou propriété dudit produit démontrée par au moins un test opéré sur un sujet humain. Cette communication pourra être basée sur le modèle follicule pileux spécifique d'un produit ou d'une ligne de produit. Le modèle du follicule pileux selon l'invention permettra d'expliquer plus clairement les mécanismes à des non spécialistes du domaine concerné. Une telle promotion du produit pourra se faire par n'importe quel canal de communication. Elle pourra être faite notamment par la vendeuse, directement sur le point de vente, par la radio et la télévision, notamment dans le cadre de spots publicitaires. Elle pourra être faite également par le canal de la presse écrite, ou par le biais de tout autre document, en particulier à des fins publicitaires (prospectus). Elle pourra se faire également par INTERNET, ou par tout autre réseau informatique adéquat. Elle pourra être faite également directement sur le produit, notamment sur son packaging ou sur toute notice explicative qui peut lui être associée. Des visuels pourront être associés à une telle promotion, notamment sous forme de photographies, de vidéos, ou toute autre forme d'illustration, notamment des graphiques. De tels visuels seront représentatifs de l'effet du produit sur un ou plusieurs fibres kératiniques particulières. L'invention a également pour objet un kit d'évaluation de composés comprenant un follicule pileux humain en culture tel que défini à l'étape a) mentionnée plus haut, un traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux, et le cas échéant d'un produit de référence stimulateur ou inhibiteur de la pigmentation et/ou protégeant ou affaiblissant les mélanocytes du follicule pileux. L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un traceur d'activité des mélanocytes choisi parmi le groupe comprenant le 2-thiouracile, 5-iodo-2 thiouracile, 5 dihydroxyboryl-2-thiouracile, methymazole, thiourée, ou 2-mercaptobenzothiazole, qui peuvent être radiomarqués, et d'un follicule pileux humain pour tester l'effet de composés sur la pigmentation des fibres kératiniques et/ou la protection des mélanocytes du follicule pileux. L'invention a particulièrement pour objet l'utilisation de thiouracile radiomarquée, plus particulièrement de 2-thiouracile [14C], et d'un follicule pileux humain tel que décrit plus haut pour tester l'effet de composés sur la pigmentation des fibres pilaires. L'invention se rapporte enfin à l'utilisation d'un modulateur de l'activité des mélanocytes du follicule pileux, ou plus précisément d'un modulateur de la pigmentation et/ou protecteur des mélanocytes du follicule pileux susceptible d'être obtenu par la procédé tel que décrit plus haut pour la préparation d'une composition cosmétique pour prévenir et/ou limiter et/ou arrêter le développement de la canitie et/ou pour favoriser la pigmentation naturelle des cheveux et/ou des poils gris ou blancs. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 Mesure qualitative de la pigmentation de follicules pileux humains Après réception de biopsies provenant de donneurs volontaires ayant subi une intervention chirurgicale dans le cadre des règles éthiques en vigueur (accord d'Helsinki), les follicules pileux sont microdisséqués et placés individuellement dans un puits (plaque 24 puits) contenant 500�L de milieu de culture [William's (Gibco- BRL) supplémenté en glutamine, insuline, hydrocortisone et antibiotiques]. Ces différents follicules individualisés reçoivent 3 �Ci/ml de [14C]2-Thiouracile soit 1.5 �Ci /puits (concentration finale de 51.7 �M). La population totale de follicules étant composée de follicules diversement pigmentés (noirs, gris et blancs) ou sélectionnés, chaque type de follicule fait l'objet d'investigations séparément. Après la période d'incubation (dans un incubateur à 37°C, sous 5% de 002 et de 100% d'humidité pour une durée de quelques heures à quelques jours, préférentiellement 5 jours, les follicules pileux sont inclus dans du Tissue-Tek� et la procédure standard de congélation et de conservation des échantillons est mise en oeuvre. Des coupes histologiques de 7�M d'épaisseur sont réalisées à l'aide d'un cryostat (Leica CM3050) et déposées sur des lames de verre. Les signaux résultant de la désintégration de la thiouracile incorporée sont mesurés pendant 168h00 avec le Micro-Imager� M25 et analysés à l'aide du logiciel B vision +, (Biospace). Pour compléter l'analyse, une superposition de l'image autoradiographique et de l'image de microscopie optique de la coupe histologique est réalisée. Le principe de lecture du Micro-Imager� M25 est que les électrons émis lors du rayonnement de la molécule marquée au [14C] vont stimuler le papier scintillant placé sur l'échantillon. Les photons émis alors sont amplifiés avant d'être enregistrés grâce une caméra à fibres optiques. Résultats La figure 1A présente la localisation de la 2-thiouracile [14C] incorporée dans une coupe longitudinale d'un follicule pileux blanc. Cette figure montre que la thiouracile s'est très peu incorporée dans le follicule pileux. Un léger signal est détecté dans la partie proximale du follicule pileux dans une zone proche de la papille dermique La figure 1B précise et confirme cette localisation car elle représente la superposition de l'image obtenue en microscopie optique avec celle des signaux radioactifs obtenue avec le �Imager (voir flèche 1 B). La figure 2A présente la localisation de la 2-thiouracile [14C] incorporée dans une coupe longitudinale d'un follicule pileux gris. Cette figure montre que la thiouracile s'est incorporée dans les mélanocytes du follicule pileux gris ainsi que dans la fibre pilaire. La figure 2B précise et confirme cette localisation car elle représente la superposition de l'image obtenue en microscopie optique avec celle des signaux radioactifs obtenue avec le �Imager (voir flèche 2B). La figure 3A présente la localisation de la 2-thiouracile [14C] incorporée dans une coupe longitudinale d'un follicule pileux pigmenté. Cette figure montre que la thiouracile s'est fortement incorporée dans les mélanocytes du follicule pileux pigmenté ainsi que dans la fibre pilaire. La figure 3B précise et confirme cette localisation car elle représente la superposition de l'image obtenue en microscopie optique avec celle des signaux radioactifs obtenue avec le �Imager (voir flèche 3B). EXEMPLE 2 Mesure quantitative de la pigmentation de follicules pileux humains Après réception de biopsies provenant de donneurs volontaires ayant subi une intervention chirurgicale, les follicules pileux sont microdisséqués et placés individuellement dans un puits (plaque 24 puits) contenant 500�L de milieu de culture [William's E (Gibco-BRL) supplémenté en glutamine, insuline, hydrocortisone et antibiotiques]. Ces différents follicules individualisés reçoivent 3 �Ci/ml de [14C]-2- Thiouracile soit 1.5 �Ci /puits (concentration finale de 51.7 �M). L'incubation (37°C sous 5% de CO2, 100% d'humidité) varie de 3 à 5 jours. Après la période d'incubation chaque follicule subit après lavage une lyse totale par immersion (en plaque 24 puits adaptées) dans 250 pl_ de soluène-350 1 h15 à 1 h30 à 50°C. 250 pl de liquide scintillant (Optiphase � supermix �) sont ensuite ajoutés. La plaque est placée sur un agitateur pendant 10 à 15 minutes. La lecture de l'activité (f(incorporation de la 2- thiouracile [14C])) est effectuée à l'aide de l'appareil TRILUX 1450 Micro-Beta. Mesure quantitative et comparative de l'incorporation de 2-thiouracile [14C] dans le follicule pileux humain en présence d'acide kojique, inhibiteur de pigmentation, en présence de forskoline, stimulateur de pigmentation, ou en présence d'acide ellagique. 72 follicules pileux disséqués sont répartis de façon aléatoire en trois lots de 24 follicules et introduits individuellement dans des puits de boites de culture 12 puits. Chaque puits reçoit 500 pl de milieu de culture [William's E (Gibco-BRL) supplémenté en glutamine, insuline, hydrocortisone et antibiotiques]. Le lot � contrôle � est constitué de 24 follicules. Chaque follicule est introduit dans un puits contenant 500 pl de milieu de culture et 3 �Ci/ml de 2-thiouracile [14c] Le lot � acide kojique � est constitué de 24 follicules. Chaque follicule est introduit dans un puits contenant 500 pl de milieu de culture, 200 �M d'acide kojique et 3 �Ci/ml de 2-thiouracile [140+] Le lot � forskoline � est constitué de 24 follicules. Chaque follicule est introduit dans un puits contenant 500 pl de milieu de culture, 1 �M de forskoline et 3 �Ci/ml de 2- thiouracile [14c] 10 15 Le lot � acide ellagique � est constitué de 24 follicules. Chaque follicule est introduit dans un puits contenant 500 pl de milieu de culture, 1 pM d'acide ellagique et 3 �Ci/ml de 2-thiouracile [14C]. Après 5 jours d'incubation chaque follicule est lysé et l'incorporation de 2-thiouracile dans la mélanine néo-formée est quantifiée par la mesure des désintégrations /minutes (cpm / minutes). Résultats Tableau 1 Mesure de l'incorporation de la 2-thiouracile [14C] dans le follicule pileux humain isolé en survie in vitro (J=5), effet d'un inhibiteur de pigmentation (acide kojique) et d'un activateur de pigmentation (forskoline). N°Follicule Lot Contrôle Lot Lot acide Pileux humain forskoline kojique 200 pM �M 1 1066 883 626 2 830 1961 694 3 1785 3754 466 4 907 1608 690 5 1144 1494 11 6 1483 781 412 7 2155 1544 533 8 1288 2861 334 9 1711 847 496 1108 1707 650 11 974 1001 722 12 1131 1375 418 13 1533 1268 413 14 690 1144 554 1375 731 554 16 958 1161 686 17 581 587 440 18 830 1431 566 19 733 1971 277 20 860 1593 387 21 1152 1365 555 22 991 991 267 23 677 1190 278 24 5 462 367 Moyenne 1129 Moyenne 1405 Moyenne 495 0 +25% -56% (p Tableau 2 Mesure de l'incorporation de la 2-thiouracile [14C] dans le follicule pileux humain isolé en survie in vitro (J=5), effet de l'activateur de pigmentation forskoline et de l'acide ellagique. N°Follicule Lot Contrôle Lot Lot acide Pileux forskoline ellagique 1 pM humain 1 pM 1 1772 1681 1432 2 2740 1811 1222 3 1625 1726 2006 4 1323 1920 1494 5 740 2390 292815 6 1699 1614 2143 7 992 1514 2187 8 1421 1980 2683 9 1006 2458 1523 10 1089 1969 1053 11 1004 2124 1011 12 851 1946 1487 13 1258 1437 1856 14 1374 1403 1036 15 1565 1175 1156 16 1285 1690 1854 17 553 1173 1430 18 620 1585 813 19 819 2019 2256 20 1373 751 2273 21 579 1679 1263 22 326 1500 1286 23 571 1377 1308 24 352 1087 908 Moyenne 1122 Moyenne 1667 Moyenne 1609 0 +49% +43% (p REVENDICATIONS1- Procédé de criblage de produits en vue d'identifier au moins un composé modulant la pigmentation des fibres kératiniques et/ou protégeant les mélanocytes 5 du follicule pileux comprenant les étapes suivantes ; a) microdissection de follicules pileux humains et mise en oeuvre d'une méthode de cultures des follicules in vitro, puis incubation d'au moins deux desdites cultures avec un traceur d'activité de mélanocytes des follicules pileux ; b) incubation d'une desdites cultures préparées en a) avec un ou plusieurs produits à 10 tester ; c) mesure, qualitative et /ou quantitative, de l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes dans les follicules pileux humain des cultures préparées en a) et b) ; d) sélection des composés pour lesquels une modulation de l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes est mesurée dans ladite culture préparée en b) par 15 rapport à une culture témoin obtenue en a) préparée dans les mêmes conditions mais en absence dudit composé à tester. 2- Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que les dits follicules pileux humains sont viables et obtenus par microdissection. 3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit traceur d'acticité des mélanocytes est choisi parmi le groupe comprenant le 2-thiouracile, 5-iodo-2 thiouracile, 5 dihydroxyboryl-2-thiouracile, methymazole, thiourée, ou 2-mercaptobenzothiazole, radiomarqués. 4- Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que ledit traceur d'activité des mélanocytes est le [f4C]-2-thiouracile. 5- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que les composés 30 sélectionnés à l'étape d) sont ceux pour lesquels on observe une augmentation d'au moins 10% ou une diminution de plus de 10% de la pigmentation de ladite culture préparée en b) par rapport à une culture témoin préparée en a). 6- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que à l'étape b) 35 une autre desdites cultures préparées en a) est incubée avec un produit de référence stimulateur ou inhibiteur de pigmentation, et en ce que à l'étape c) la modulation de 20 25l'incorporation du traceur d'activité desdits mélanocytes de cette culture comprenant le produit de référence avec la culture témoin est également mesurée. 7- Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que le produit de référence est choisi parmi la forskoline ou l'acide kojique. 8- Procédé selon l'une des revendications 4 à 7 caractérisé en ce que l'incubation des étapes b) et c) s'effectue avec du 2-thiouracile [14C] à une concentration de 0.1 pCi/ml à 10 NCi/ml, pour une durée de 4 heures à 7 jours. 9- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la mesure de la pigmentation réalisée à l'étape c) est déterminée par mesure de l'activité liée à l'incorporation du traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux dans la mélanine néoformée desdits follicules pileux. 10- Procédé selon l'une des revendications 1.à 9 caractérisé en ce que la mesure qualitative réalisée à l'étape c) est effectuée sur lesdits follicules pileux obtenus entiers, et/ou la mesure quantitative réalisée à l'étape c) est effectuée après lyse desdits follicules pileux. 11- Kit d'évaluation de composés comprenant un follicule pileux humain en culture tel que défini à l'étape a) de la revendication 1, un traceur d'activité des mélanocytes du follicule pileux, et le cas échéant d'un produit de référence stimulateur ou inhibiteur de la pigmentation. 25 12 û Utilisation d'une méthode in vitro comprenant l'utilisation d'un traceur d'activité des mélanocytes choisi parmi le groupe comprenant le 2-thiouracile, 5-iodo-2 thiouracile, 5 dihydroxyboryl-2-thiouracile, methymazole, thiourée, ou 2-mercaptobenzothiazole, radiomarqués, et d'un follicule pileux humain pour tester 30 l'effet de composés sur la pigmentation des fibres kératiniques et/ou la protection des mélanocytes du follicule pileux. 10 15 20