Brevet FR2929805A1 — publié le 20091016

-1- UTILISATION DE BACILLUS SUBTILIS, PUMILUS ET CEREUS POUR STIMULER LES DEFENSES NATURELLES DES PLANTES DESCRIPTION DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une nouvelle utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus de clones de Bacillus subtilis, cereus et pumilus, comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes entières, notamment pour la vigne, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux, ainsi que pour accroître la concentration des composés phénoliques à propriétés organoleptiques, par application foliaire, racinaire ou par injection,. Elle concerne également le procédé d'obtention desdits composants, la composition qui les incorpore et son utilisation. ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les plantes ont développé au cours de leur évolution divers mécanismes de défense efficaces contre de nombreux agents pathogènes comme les champignons, les bactéries, les virus et les insectes. Si certains mécanismes de défense sont constitutifs, d'autres sont induits lorsque la plante a reconnu soit l'un des composants du microorganisme, soit un éliciteur externe (reconnaissance non spécifique). Le recoupement de nombreuses études liées aux modifications métaboliques associées à la résistance induite a mis en évidence des similarités importantes dans les réponses de différentes espèces végétales. Nous citerons à titre d'exemple trois catégories de variations métaboliques : - une intense stimulation des enzymes clés Peroxydase et Phenylalanine ammonialyase aboutissant, par activation de la voie des phénylpropanoïde, au renforcement de la barrière mécanique naturelle des cellules végétales (lignine, subérine...), à la synthèse de phytoalexines, de composés phénoliques et de l'acide salicylique ; - l'activation de la lipoxygénase (voie des octanoïdes) intervenant dans la production de l'acide jasmonique ; - la production d'une large gamme de peptides et de protéines de défense (protéines PR ou Pathogenesis-related proteins) parmi lesquelles, la chitinase, la [3-1,3-glucanase, des inhibiteurs de protéases et de polygalacturonase. II a été démontré que plusieurs substances de nature et de structure chimique diverses possèdent la propriété de stimuler les défenses naturelles des plantes. Outre les oligosaccharides, certaines protéines et oligopeptides se sont révélés efficaces et les effets des éliciteurs peptidiques et glycoprotéiques sur les plantes supérieures sont bien documentés (Ricci et al, 1989 ; Nürnberger et al, 1994 ; Pugin et al, 1997 ; Ebel et Mithôfer, 1998 ; Martinez et al, 1999 ; Picard et al, 2000, Martinez et al, 2001). D'autres molécules telles que les phosphonates (Bonomelli et al, 2002), l'acide (3-aminobutyrique (Daire et al, 2002 ; Zimmerli et al., 2001 ; Cohen et al., 1999 ; Reuveni et al, 1999) se sont également avérées actives en tant qu'éliciteurs. Les bactéries des espèces Bacillus subtilis (B.s.), cereus (B.c.) et pumilus (B.p.) sont maintenant bien connues pour les toxines fongicides qu'elles produisent et leurs utilisations. Jusqu'à présent l'intérêt de formulations commercialisées à base de Bacillus subtilis, cereus ou pumilus réside d'une part dans leur spécificité d'action vis-à-vis d'un ou plusieurs ordres de champignon(s) pathogène(s) et d'autre part dans leur innocuité vis-à-vis des organismes non cibles et de l'environnement. Les principales composantes de cette activité sont attribuées aux peptides produits pendant le développement de B.s., B.c. ou B.p. On peut notamment citer les peptides caractérisés chimiquement sous les noms de fengycine, surfactine, subtiline, iturine, agrostatine pour B.s., zwittermicine pour B.c., et kristenine, pepsidine pour B.p.. Ces peptides sont produits abondamment durant la multiplication des cellules, et agissent directement sur la germination ou la croissance des champignons pathogènes. C'est grâce à ces composantes essentielles que les propriétés des Bacillus sp sont employées en protection des cultures contre les champignons pathogènes, en tant que solution alternative aux fongicides chimiques. On peut citer par exemple les Bacillus tels que B.subtilis (Cho, K.y. et al WO 2005090553) à l'encontre de Colletotrichum sp ; B.cereus (Stabb E.v., Jacobson 2.5 L.m., Handelsman J. ; Applied and Environ Micobio, 1994, 60 (12), 4404-4412) efficace contre Phytophtora sp. ; et B.pumilus (Lehman L.j. et al ; US 20010022968) ayant des actions décrites contre Uncinula sp et Peronospora sp. RESUME DE L'INVENTION La particularité de l'invention réside à la fois dans le mode et le mécanisme d'action 30 des souches de Bacillus subtilis, cereus ou pumilus et / ou de protéines issues de ces bactéries ainsi que dans leur actions physiologiques sur les plantes. En effet, selon l'invention, il ne s'agit plus ici d'utiliser les bactéries, les protéines ou peptides de Bacillus subtilis, cereus ou pumilus pour leurs propriétés fongicides mais pour leur capacité à stimuler les défenses naturelles des plantes entières, et 35 notamment sur la vigne. Ces nouveaux types d'éliciteurs sont donc capables de - stimuler différentes activités enzymatiques largement impliquées dans les mécanismes de résistance induite contre les parasites des végétaux. La spécificité de l'invention repose sur l'utilisation : - des bactéries, des protéines ou des peptides issus des clones de Bacillus subtilis, déposés à la collection ATCC (American Type Culture Collection) sous les numéros 55614 et 6633, - des bactéries, des protéines ou des peptides issus des clones de Bacillus cereus, déposés à la collection ATCC (American Type Culture Collection) sous les numéros 21928, 21929, 53522 et 55609, - et enfin des bactéries, des protéines ou des peptides des clones de Bacillus pumilus, déposés à la collection ATCC sous les numéros 31132 et 31340, et à la collection NRRL sous le numéro B-30087. La présente invention a donc pour objet un procédé de lutte contre des agents pathogènes (champignons et / ou bactéries et / ou virus et / ou insectes) de plantes agronomiquement utiles, caractérisé en ce qu'il comprend l'application auxdites plantes de nouveaux éliciteurs. Selon l'invention, l'utilisation de ces composés est essentiellement destinée à la viticulture, à l'arboriculture et au maraîchage mais pourrait s'appliquer à d'autres végétaux notamment les grandes cultures. L'invention concerne donc la production des bactéries et de leurs peptides antibiotiques comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes, ces derniers permettant une action principalement préventive mais aussi curative. Le mode d'action des peptides produits par les souches de Bacillus sp. se déroule comme suit : les structures peptidiques se logent à l'intérieur des membranes cellulaires et forment un canal ionique ou pore qui modifie la perméabilité membranaire (dépolarisation), constituant un signal précoce pour le déclenchement de la cascade d'événements métaboliques amenant la résistance de la plante face à ses agresseurs. Le procédé selon l'invention est en outre caractérisé en ce que : - les bactéries, les protéines ou les peptides sont incorporées à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant ; - la composition se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse ; - la composition se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. Le procédé selon l'invention est également caractérisé en ce que l'application desdits composés est réalisée avec une fréquence de 10 à 15 jours, cas le plus courant en agriculture. Les mécanismes de défense sont stimulés à chaque nouveau traitement. Le choix des marqueurs biochimiques s'est ici porté sur la mesure de l'activité des peroxydases et des phytoalexines (le resvératrol notamment). Les peroxydases sont impliquées dans les réponses précoces à une stimulation des défenses. Ce sont donc des marqueurs du déclenchement d'une réaction de défense comme : - le renforcement des parois cellulaires et la constitution cle barrières pariétales qui bloquent la progression du pathogène à l'intérieur des cellules de l'hôte. - la production de composés phénoliques intervenant dans les mécanismes antigerminatifs de défense. Ces composés phénoliques peuvent aussi intervenir dans les mécanismes de résistance des plantes aux pathogènes. Dans le cas de la vigne, ce sont les phytoalexines qui contrôlent le bon aboutissement du mécanisme de défense. On parlera essentiellement des stilbènes et de son constituant majeur, le resvératrol. La concentration des composés phénoliques à propriétés organoleptiques est accrue et plus particulièrement des phytoalexines telles que le resvératrol (trans- 3,5,4-trihydroxystilbène) ainsi que les anthocyanidines (3-0-13 monoglucosides) dans le cas de la vigne. L'activité biologique de ces composés sur la croissance de multiples microorganismes phytopathogènes a été établie (Adrian et al., 1997) ainsi que leur rôle dans la régulation de nombreuse interactions plantes-pathogènes (Adrian et Jeandet, 2005). On peut aussi signaler les autres propriétés intéressantes des composés phénoliques, tels que les propriétés anti-oxydantes et oenologiques. En effet, les anthocyanes sont responsable de la couleur rouge du vin et les tanins de l'astringence et de la charpente de ces derniers. Un repérage qualitatif des phytoalexines peut être effectué directement dans tout ou partie d'organismes par observation sous UV. En effet, le resveratrol possède une absorbance maximale à 308 nm et fluoresce en bleu sous cette longueur d'onde (Jeandet et al, 1997). De plus, la production de phytoalexines (stilbènes) peut être quantifié par des analyses HPLC en phase inverse. Une illustration plus détaillée de l'invention est présentée à l'aide des exemples 35 suivants qui ne sont en aucun cas destinés à limiter le cadre de cette invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Exemple 1 : Obtention des bactéries de Bacillus subtilis, cereus et pumilus ainsi que des protéines et peptides. Le procédé optimisé d'obtention de bactéries, de protéines ou de peptides de 5 Bacillus subtilis, cereus et pumilus selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) une phase de culture bactérienne consistant : - à utiliser comme milieu de culture, le milieu relativement simple (MS) dont la composition est la suivante : KH2PO4 (2,5 g/I) ; K2HPO4(2,5 g/1) ; (NH4)2HPO4 (lg/l) ; 10 MgSO4, 7H2O (0,2 g/I); MnSO4, 7H20 (7 mg/I) ; Fe(SO4), 7H2O (0,01 g/I), CaCl2 (10 mg/I); à ajouter à cette solution saline standard, 1% (p/v) de D-glucose et à ajuster le pH à 7; - à stériliser ledit milieu par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes ; - à mettre en culture en ensemençant une pré culture de bactéries en milieu MS 15 pendant 15 heures à 30°C sous agitation ; - à placer les fioles contenant les bactéries en cultures à 37°C sous agitation rotative douce (150 rpm) pendant 5 à 7 jours ; b) une phase de séparation des bactéries et des protéines, réalisée à 4°C, consistant : 20 - à centrifuger à 4500 rpm, pendant 30 minutes, le contenu de chaque fiole ; - à reprendre le culot dans NaCl 1M, lavé deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis resuspendu dans un volume d'eau déminéralisée ; - à purifier la partie protéique sur un gradient discontinu de sucrose selon la 25 méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48°C pendant 16 heures], la concentration en protéines étant déterminée par la méthode de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983). :30 Exemple 2 : Effet physiologique et agronomique de Bacillus subtilis, cereus et pumilus sur les feuilles de tomate De jeunes plants de tomates en pots ont été traités par les Bacillus subtilis, cereus et pumilus (cultures bactériennes à 10' bactéries/mL) par pulvérisation foliaire puis un prélèvement de jeunes feuilles pour le dosage des peroxydases a été effectué 24 35 heures et 7 jours après le traitement. Le dosage des peroxydases se fait par spectrophotométrie en utilisant le guaïacol (guaïcol = méthoxy-2-phénol) comme substrat. Incolore au départ, il prend rapidement une teinte brune orangée lorsqu'il est oxydé. Cette propriété rend possible l'étude de la cinétique enzymatique par spectrophotométrie. On peut suivre la réaction en mesurant la variation d'absorbance au cours du temps à 470 nm. La préparation de l'extrait végétal pour l'extraction de ces protéines solubles est réalisée par broyage des feuilles fraîches dans un tampon acétate de sodium, 50 mM, pH 6 contenant du PolyVinylPyrolidone et en présence de sable de fontainebleau. L'extrait est alors centrifugé à 10 000 g pendant 5 minutes à 4°C. La cinétique est suivie après addition de guaïacol et de peroxyde d'hydrogène au surnageant. La modalité de traitement par les Bacillus subtilis, cereus ou pumilus selon l'invention ont été comparées à l'activité peroxydasique générée par un extrait d'algue ainsi qu'à un témoin eau. On ajoute aux traitements une modalité à base d'E. coli, sachant que cette bactérie est non productrice de métabolites. Ce microorganisme constituera donc, la référence de base de la stimulation provoquée uniquement par la présence de la bactérie (et non pas des métabolites). Chaque modalité a été répétée 6 fois. Tableau N°1 : Dosage de l'activité peroxydasique (ADO / minute / gramme de matière fraîche) des feuilles de tomate à différents temps. Modalité testée Activité peroxydasique (4DO/min/g MF) % d'augmentation par rapport au témoin Prélèvement 24 h Prélèvement 7 jours 24 h 7 j Témoin eau 54,85 � 8,90 68,18 � 8,60 Extrait d'algue 57,24 � 10,20 80,72 �10,39 4,35 18,39 Escherichia coli 63,23 � 6,41 82,43 � 7,42 15,28 20,90 Bacillus subtilis ATCC55614 72,39 � 4,55 93,73 � 9,61 31,98 37,47 Bacillus cereus A TCC55609 74,12 � 5,25 94,98 � 9,85 35,13 39,30 Bacillus pumilus NRRL 71,23 � 3,95 90,77 � 8,24 29,86 33,13 B30087 ~ Dans le cas des deux prélèvements (24 heures et 7 jours), l'activité peroxydasique décelée dans les plants traités par Bacillus subtilis, cereus ou pumilus selon l'invention est largement supérieure au témoin (parfois plus de 30%). En comparant avec l'effet produit par E. coli, la différence obtenue constitue l'activité élicitrice des métabolites produits par les différentes espèces de Bacillus (B.s., B.c., B.p.). Exemple 3 : Effet physiologique et agronomique des peptides iturine (B. subtilis), zwittermicine (B. cereus) et pepsidine (B. pumilus) sur les feuilles de vigne. Les essais sont réalisés sur de très jeunes feuilles de vigne (3 jours maximum après débourrement). Le cépage étudié est la Syrah, cultivé en pots, sous serre. Les traitements sont effectués par aspersion de l'éliciteur. Les tables de culture sont divisées en 7 modalités comprenant les peptides iturine, zwittermicine, pepsidine à deux doses d'emplois (100 pg/mL et 2 mg/mL) ainsi qu'un témoin eau. Chaque modalité a été répétée 6 fois. Les feuilles adultes sont prélevées au cours d'une cinétique d'élicitation au temps t = 0, 9 heures, 5 jours et 15 jours. Une fois le matériel végétal broyé dans le tampon adéquat, on procède à un dosage des peroxydases. Tableau N°2 : Dosage de l'activité peroxydasique (ADO / minute / gramme de matière fraîche) des feuilles de vigne à différents temps. Modalité testée Activité peroxydasique ( AD0/min/g MF) % d'augmentation par rapport au témoin Prélèvement 9 h Prélèvement 5 jours 9 h 5 j Témoin eau 18,52 � 0,65 14,9 � 4,3 Iturine (100 pg/mL) 20,02 � 0,68 24,4 � 3,5 8,09 63,75 Iturine (2 mg/mL) 25,32 � 1,20 30,1 � 4,0 36,72 102,01 Zwittermicine (100 pg/mL) 21,97 � 1,07 25,7 � 3,2 18,63 72,48 Zwittermicine (2 mg/mL) 29,12 � 1,91 31,7 � 4,6 57,24 112,75 Pepsidine (100 pg/mL) 19,02 � 0,67 22,4 � 3,3 2,70 50,34 Pepsidine (2 mg/mL) 22,33 � 0,79 25,6 � 2,7 20,57 71,81 Ces tests montrent une stimulation rapide de l'activité peroxydasique après pulvérisation, particulièrement pour l'iturine et la zwittermicine. Ce taux d'activité important est parfois préservée au delà de 15 jours. Exemple 4 : Induction par l'iturine (issue de B.subtilis), la zwittermicine (B.cereus), 20 et la pepsidine (B.pumilus), de la production de resvératrol dans les cultures cellulaires de vigne. Des cultures cellulaires de V. vinifera L. cv. � Chardonnay � ont été obtenues à partir de cals matures placés dans un milieu Murashing et Skoog (MS) et agités pendant 5 à 7 jours à 110 rpm, à l'obscurité, à 23°C et sous une hygrométrie de 35%. Les cellules sont dès lors en phase exponentielle. Les cellules ont ensuite été filtrées sur un filtre métallique (60 mesh = maillage de 50 �m). Le repiquage des suspensions est effectué tous les 7 jours pendant la phase exponentielle dans du milieu MS frais. Une culture cellulaire en phase de croissance exponentielle (5 à 7 jours) a été aliquotée par 20 mL dans des Erlenmeyers stériles de 150 mL. Parallèlement, une culture bactérienne fraîche en croissance exponentielle a été centrifugée 10 min à 4000 g, le culot de bactéries a été re-suspendu et ajusté à la concentration désirée dans du MgCl2 (10 mM). La suspension de bactéries a alors été dosée au spectrophotomètre, une D.O. de 0,1 à 600 nm correspondant à une concentration de 10' bactéries/mL. Ensuite, quelques soient les modalités, ce sont 200 �L de culture bactérienne qui ont été inoculés dans les cultures cellulaires. Le témoin a été réalisé par inoculation de 200 �L de MgCl2 10 mM car c'est le tampon de reprise des bactéries. Les peptides ont été achetés dans le commerce dont la source est bien issue de chacune des bactéries concernées. Les modalités testées pour chaque peptide sont : le peptide ; le peptide traité à 100°C. La concentration de chaque peptide testé est de 5 mg/mL de milieu de culture cellulaire. Après inoculation, ces cellules ont été observées sous UV pour détecter le resvératrol, dont la longueur d'onde d'absorbance maximalle est 308nm (Jeandet et al., 1997). Les prélèvements et la quantification du resvératrol se font comme suit : 5 mL de cultures sont prélevés à Ohpi, 24hpi, 48hpi, 72hpi, 96hpi (hpi = heure post inoculation). Le milieu est séparé des cellules par filtration sous vide puis lavé par deux volumes d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle est mise à évaporer au rotavapor. L'extrait obtenu est récupéré par 1 mL de méthanol qui sera analysé par HPLC en phase inverse afin de détecter et quantifier les stilbènes (Jeandet et al., 1997). Les stilbènes ont étés élués par un gradient linéaire d'acétonitrile variant de 10% (v/v) d'acétonitrile à 0 min, 85% (v/v) d'acétonitrile à 18 min, 85% (v/v) d'acétonitrile à 23 min, 10% (v/v) d'acétonitrile à 28 min et 10% (v/v) d'acétonitrile à 35 min. L'acétonitrile et l'eau ont été filtrés sur une membrane de 0,45 �m et dégazés sous vide. Le système utilisé comprend un contrôleur de gradient (modèle Waters 600), un injecteur automatique (modèle Waters 717 plus), un détecteur UV/visible à double longueur d'onde (modèle Waters 490E) et une colonne (250 mm x 4 mm, 5 �m) en phase inverse Lichocart Merck C18 (Merck Clevenot Corp., Darmstadt, Germany). La colonne a été équilibrée 5 min avec 10% d'acétonitrile (10% v/v) avant le passage del' échantillon. Le débit d'éluant a été de 1 mL.min-l. L'identification des stilbènes a été faite par comparaison des temps de rétention du standard (trans-resvératrol, Sigma) et des composés des échantillons à une longueur d'onde de 308 nm, qui correspond à la longueur d'onde maximale d'absorbation des stilbènes (Jeandet et al., 1997). La quantification a été faite par comparaison de l'aire des pics des composés élués avec l'aire des pics obtenus après avoir réalisé une gamme étalon de trans-resvératrol sur la colonne (2, 10, 20, 50, 100, 200 ng.mL 1) (Jeandet et al., 1997). Tableau N°3: Quantité de trans-resvératrol produit par des cultures de vignes élicitées (exprimées en mg.L-' de milieu de culture). Modalité testée Ohpi 24hpi 48hpi 72hpi 96hpi Témoin eau 0 0 0 0 0 Iturine 0 0 1,45 8,32 42,73 Iturine 100°c 0 0 0,06 0,16 0,29 Zwittermicine 0 0 2,31 10,67 55,46 Zwittermicine 100°c 0 0 0,11 0,23 0,42 Pepsidine 0 0 0 0 10,22 Pepsidine 100°c 0 0 0 0 _ 0,11 La production de resvératrol est optimale dans les cultures cellulaires au bout de 96hpi après inoculation. Les traitements dénaturants à 100°C démontrent que c'est bien la structure secondaire des peptides qui est responsable de la majeure partie de l'élicitation et conforte le mode d'action éliciteur décrit en page 4. Exemple 5 : Induction par B.subtilis et B.cereus et B.pumilus de la production de phytoalexines (resvératrol) dans les feuilles de vigne. Des feuilles de boutures végétatives obtenues à partir de sarments ont été infiltrées avec les cultures bactériennes à 10' bactéries/mL de B.s. et B.c. et B.p., Ec et MgCl2 puis pesées et broyées dans un mortier contenant du sable de Fontainebleau. Les différents extraits ont été repris dans du méthanol et ont ensuite été évaporés sous vide à 40°C au rotavapor. Le culot a été resuspendu dans du méthanol à raison de 20 mL de méthanol par mg.MF-1. La conservation de ces extraits a été faite sous vide par un gaz inerte (azote) à 4°C et à l'abri de la lumière. -10- La CCM (Chromatographie sur Couches Minces) a été réalisée sur plaque de silice avec du tampon de migration composé de chloroforme : acétate d'éthyle : acide formique dans les proportions 5:4:1. Les extraits méthanoliques de feuilles de vigne 24h après traitement B.s. et B.c. et B.p., Ec, MgCl2 ont été analysés par HPLC en phase inverse afin de détecter et quantifier les stilbènes (Jeandet et al., 1997), comme décrit à l'exemple 4. Tableau N°4 : Quantité de trans-resvératrol dans des feuilles de vignes infectées. Traitement Quantité de Crans- resv+ératrol (pg/g de matière fraîche) Témoin (MgCl2) 12.8 Infection par Escherichi coli 134.4 Infection par Bacillus subtilis ATCC 55614 254.7 Infection par Bacillus cereus ATCC 55609 295.2 Infection par Bacillus pumilus NRRL B-30087 197.8 La CCM et l'HPLC ont permis de mettre en évidence la présence de phytoalexines, et plus précisément de trans-resvératrol dans les traitements B.s., B.c. et B.p. et Ec. L'observation des feuilles sous UV de la CCM confirme de façon qualitative la présence de phytoalexines dans les traitements B.s., B.c. et B.p. et Ec. De plus, la fluorescence, et donc la présence de phytoalexines, est plus spécialement marquées au niveau des stomates, zones d'entrée des pathogènes. Les résultats de I'HPLC indiquent que le quantité de trans-resveratrol est significativement supérieure dans les traitements B.s., B.c. et B.p. Ces résultats valident la forte stimulation de la production de phytoalexines, en l'occurrence le trans-resvératrol, chez les plantes infiltrées par les B.s., B.c. et B.p., en comparaison avec les témoins. Exemple 6 : Test in vitro de Botrytis cinerea pulvérisé sur vigne inoculée par B. subtilis, B. cereus ou B. pumilus. Botrytis cinerea souche 630 est cultivée en boite de Pétri sur milieu PDA. Les conidies sont récupérées par du PDB 1/2 et quantifiées à la cellule de Malassez afin d'ajuster la concentration des conidies à 105 conidies.mL-1. Les boutures fructifères sont préparées selon Lebon et al., 2004. L'inoculation des boutures se fait au stade pleine floraison lorsque 50% des capuchons floraux sont tombés par trempage des inflorescences dans la solution de conidies. Les inflorescences sont ensuite - 11 - couvertes le temps du développement du mycélium. On pulvérise 1 mL de chacun des cultures bactériennes (10$ bactéries/mL) sur chaque inflorescence. Ces pulvérisations foliaires sont réalisées 7 jours avant inoculations fongiques afin de mettre les plantes dans un état de défense maximale. On observe le pourcentage d'attaques des inflorescences de vignes infectées au Botrytis cinerea (pourriture grise) et Plasmopara viticola (mildiou de la vigne). Tableau N°5 : Pourcentage d'attaque des inflorescences de vignes infectées de pourriture grise et de mildiou. Modalité testée Pourcentage d'attaque des inflorescences de Botrytis cinerea Plasmopara viticola Témoin eau 75 � 2,1 89 � 2,6 Bacillus subtilis ATCC55614 46 � 0,8 65 � 1,9 Bacillus cereus ATCC55609 35 � 0,5 41 � 0,7 Bacillus pumilus NRRL B30087 62 � 1,8 59 � 2,2 On peut donc constater une bonne efficacité de B. subtilis et surtout B.cereus (inhibition de l'attaque d'environ 50%) contre Botrytis cinerea et Plasmopara viticola. Par contre, il est à noter que B.pumilus est moins efficace que les autres, particulièrement sur Botrytis cinerea. Exemple 7 : Effet de protection anti-pathogénique de Bacillus subtilis cereus et pumilus par stimulation des défenses naturelles de la plante La composition à base de bactéries et de protéines de Bacillus subtilis cereus et pumilus préparée selon l'exemple 1 est pulvérisée sur différentes plantes afin de tester leur résistance vis-à-vis de divers pathogènes. A titre d'exemple et en comparaison des témoins non traités, les effets protecteurs de la composition selon l'invention se sont révélés efficaces lors de traitements préventifs renouvelés régulièrement. Nous citerons les couples plante / pathogène suivants sur lesquels la composition selon l'invention peut être utilisée pour réduire : - lorsqu'elle est appliquée aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales ; - lorsqu'elle est appliquée aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales telles que la "Sharka" ; - 12 - - lorsqu'elle est appliquée à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le "Court-Noué" ; - lorsqu'elle est appliquée aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales ; - lorsqu'elle est appliquée aux oléagineux, notamment le soja, le tournesol, les melons, les carottes, le chou-fleur et les pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Scierotinia Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes et virales. REVENDICATIONS1- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus des clones de Bacillus subtilis, déposés à la collection ATCC (American Type Culture Collection) sous les numéros 55614, et 6633, comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes entières, contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. 2- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus des clones de Bacillus cereus, déposés à la collection ATCC (American Type Culture Collection) sous les numéros 21928, 21929, 53522 et 55609, comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes entières contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. 3- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus des clones de Bacillus pumilus, déposés à la collection ATCC sous les numéros 31132 et 31340, et à la collection NRRL sous le numéro B-30087, comme stimulateurs des défenses naturelles des plantes entières contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux. 4- Procédé d'obtention d'une composition contenant des bactéries, des protéines ou des peptides, tels que définis dans l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) une phase de culture bactérienne consistant : - à utiliser comme milieu de culture, le milieu relativement simple (MS) dont la composition est la suivante : KH2PO4 (2,5 g/1) ; K2HPO4 (2,5 g/1) ; (NH4)2HPO4 (lg/l) ; MgSO4, 7H20 (0,2 g/l); MnSO4, 7H20 (7 mg/1) ; Fe(SO4), 7H20 (0,01 g/l), CaCl2 (10 mg/1); à ajouter à cette solution saline standard, 1% (p/v) de D-glucose et à ajuster le pH à 7; - à stériliser ledit milieu par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes ; - à mettre en culture en ensemençant une pré culture de bactéries en milieu MS pendant 15 heures à 30°C sous agitation ; - à placer les fioles contenant les bactéries en cultures à 37°C sous agitation rotative douce (150 rpm) pendant 5 à 7 jours ; b) une phase de séparation des bactéries et des protéines, réalisée à 4°C, consistant : - à centrifuger à 4500 rpm, pendant 30 minutes, le contenu de chaque fiole ; - à reprendre le culot dans NaCI 1M, lavé deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis resuspendu dans un volume d'eau déminéralisée ;-14- - à purifier la partie protéique sur un gradient discontinu de sucrose selon la méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48°C pendant 16 heures], la concentration en protéines étant déterminée par la méthode de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983). 5- Composition, telle qu'obtenue selon la procédé tel que défini à la revendication 4, caractérisée en ce que les bactéries, les protéines ou les peptides ainsi obtenus sont incorporés à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant. 6- Composition, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse. 7- Composition, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. 8- Utilisation de la composition, selon la revendication 5, 6 ou 7, par application foliaire, racinaire ou par injection. 9- Utilisation de la composition, selon la revendication 8, pour stimuler la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques. 10- Utilisation de la composition, selon la revendication 8, pour réduire : - lorsqu'elle est appliquée aux céréales, notamment le blé, le maïs et le riz, l'attaque des oïdiums, des septorioses, des rouilles, des fusarioses, des pyricularioses et des maladies bactériennes et virales ; - lorsqu'elle est appliquée aux arbres fruitiers, notamment le poirier et le pommier, l'attaque des oïdiums, des tavelures, des monilioses, des maladies bactériennes et virales telles que la "Sharka" ; - lorsqu'elle est appliquée à la vigne, l'attaque de l'oïdium, du mildiou, du Botrytis, des maladies du bois, des maladies telluriques et virales telles que le "Court-Noué" ; - lorsqu'elle est appliquée aux gazons et en horticulture, les attaques des pythiacés, champignons à sclérotes, fusarioses, oïdiums, maladies bactériennes et virales ; - lorsqu'elle est appliquée aux oléagineux, notamment le soja et le tournesol, aux melons, aux carottes, au chou-fleur et aux pommes de terre, l'attaque des oïdiums, des mildious des pythiacées (Phytophtora, Pythium), des champignons à sclérotes (Rhizoctonia, Sclerotinia Pyrenochaeta), des champignons vasculaires (Fusarium, Verticillium), des maladies bactériennes et virales.