Brevet FR2930264A1 — publié le 20091023

NOUVELLE SOUCHE DE LACTOBACILLUS PARACASEI SUBSP. PARACASEI DOTEE DE PROPRIETES ANTIMICROBIENNES ET IMMUNOMODULATRICES L'invention est relative à une nouvelle souche de 5 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei dotée de propriétés antimicrobiennes et immunomodulatrices. De très nombreuses études scientifiques oit rapporté les effets bénéfiques sur la santé de certains microorganismes présents dans des aliments fermentés, 10 notamment des produits laitiers. Ces microorganismes sont communément dénommés �probiotiques�. Selon la définition généralement admise à l'heure actuelle, les probiotiques sont : � des microorganismes vivants, qui lorsqu'ils sont consommés en quantités adéquates, ont un effet bénéfique sur 15 la santé de l'hôte � (Rapport FAO/OMS sur L'évaluation des propriétés sanitaires et nutritionnelles des probiotiques dans les aliments, y compris le lait en poudre contenant des bactéries lactiques vivantes ; Cordoba, Argentine ; 1-4 octobre 2001). 20 Il a été montré que la consommation de produits alimentaires contenant des bactéries probiotiques peut produire des effets favorables sur la santé, par l'intermédiaire notamment du rééquilibrage de la flore intestinale, de l'amélioration de la résistance aux 25 infections, et de la modulation de la réponse immunitaire. Les microorganismes probiotiques utilisés en alimentation humaine sont généralement des bactéries lactiques, appartenant principalement aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium, et notamment à l'espèce 30 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (décrite dans la Demande de brevet EP0794707). Les effets bénéfiques sur la santé ne sent toutefois généralement pas communs à l'ensemble des bactéries d'un même genre, ni même d'une même espèce. Ils rie se 35 rencontrent, le plus souvent, que chez certaines souches ; en outre, les effets observés peuvent varier qualitativement et/ou quantitativement d'une souche probiotïque à l'autre, y compris à l'intérieur d'une même espèce. Pour qu'un microorganisme puisse être considéré comme étant potentiellement utilisable comme probiotique, il doit satisfaire à au moins un, et idéalement plusieurs, des critères suivants . - présenter une activité inhibitrice vis-à-vis de microorganismes pathogènes pouvant être présents dans la flore intestinale, cette activité pouvant résulter soit de la capacité à adhérer aux cellules intestinales, excluant ou réduisant ainsi l'adhérence des pathogènes, soit de :a capacité à produire des substances inhibant les pathogènes, soit de la combinaison de ces deux caractéristiques ; - présenter des propriétés immunomodulatrices, et notamment immunostimulantes et/ou anti-inflammatoires. En outre, si ce microorganisme est destiné à être incorporé dans un produit laitier, il doit de préférence présenter une croissance satisfaisante sur lait. Enfin, il doit conserver une bonne viabilité, au cours de la production et de la conservation de l'aliment dans =Lequel il est incorporé, ainsi qu'après l'ingestion de cet aliment par le consommateur, de manière à pouvoir atteindre l'intestin et à survivre dans le milieu intestinal. Il est toutefois à noter que bien que =_a viabilité soit essentielle pour répondre à la définition actuelle de � probiotique �, il a été montré que certains des effets bénéfiques associés à des souches probiotiques pouvaient être obtenus même en l'absence de bactéries vivantes, et étaient attribuables à certaines fractions bactériennes ou à des fractions actives de leurs surnageants de culture. Par exemple, la Demande PCT WO2004093898 décrit une préparation immunomodulatrice obtenue par fractionnement du surnageant de culture de la souche CNCM I-2219. Les Inventeurs sont maintenant parvenus à isoler 35 une nouvelle souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, et répondant aux critères indiqués ci-dessus. La présente invention a pour objet cette souche, qui e été déposée selon le Traité de Budapest, auprès de =_a CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris), le 9 novembre 2006, sous Le numéro I-3689. La souche CNCM I-3689 possède les caractéristiques suivantes: - Morphologie microorganisme Gram-positi petits bacilles fins, isolés ou petites chaires. - Fermentation des sucres suivants (résultats obtenus sur une galerie api 50 CH - Milieu MRS API à 37DC pendant 48h): Ribose, galactose, D-glucose, D-fructose, 'D- mannose, mannitol, N-acétylglucosamine, arbutine, cellobiose, maltose, lactose, trehalose, melezitose, D-turanose, D- tagatose, gluconate. Elle possède d'autre part des propriétés anti- microbiennes, se traduisant par une forte capacité à inhiber la croissance en culture de microorganismes pathogènes, notamment Escherichia coli, Salmonella enteritidis et Listeria monocytogenes. La souche CNCM I-3689 possède également des 20 propriétés immunomodulatrices, et notamment anti- inflammatoires. La présente invention englobe également pour objet des souches de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei susceptibles d'être obtenues par mutagénèse ou par 25 transformation génétique de la souche CNCM I-3689. De préférence, ces souches conservent au moins les propriétés anti-microbiennes, ou les propriétés immunomodulatrices de la souche CNCM I-3689. Il peut s'agir de souches dans lesquelles un ou plusieurs des gènes endogènes de la souche CNCM I-3689 30 a (ont) été muté(s), par exemple de manière à modifier certaines de ses propriétés métaboliques (e.g. la capacité de cette souche à métaboliser des sucres, sa résistance au transit intestinal, sa résistance à l'acidité, sa post acidification ou sa production de métabolites). Il peut 35 s'agir également de souches résultant de la transformation génétique de La souche CNCM I-3689 par un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, permettant par exemple de conférer à ladite souche des caractéristiques physiologiques supplémentaires, ou d'exprimer des protéines d'intérêt thérapeutique ou vaccinal, que l'on souhaite administrer par l'intermédiaire de ladite souche. Ces souches peuvent être obtenues à partir de La souche CNCM I-3689 par les techniques classiques de mutagénèse aléatoire ou dirigée et de transformation génétique de lactobacilles, telles que celles décrites par exemple par GURY et al. (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2001) ou par VELEZ et: al. (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3601, 2007), ou par la technique dénommée � genome shuffling � (PATNAIK et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; Wang Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007). La présente invention a également pour objet des fractions cellulaires pouvant être obtenues à partir d'une souche de Lactcbacillus paracasei subsp. paracasei conforme à l'invention. Il s'agit notamment de préparations d'ADN ou de préparations de parois bactériennes obtenues à partir de cultures de ladite souche. Il peut s'agir également de surnageants de culture ou de fractions de ces surnageants. La présente invention a également pour objet des compositions comprenant une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei conforme à l'invention, ou une fraction cellulaire obtenue à partir de celle-ci. Ces compositions peuvent être notamment des ferments lactiques, associant une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei conforme à l'invention avec une ou plusieurs autre(s) souche(s) de bactéries lactiques, probiotique(s) ou non. A titre d'exemple de souches de bactéries lactiques, on peut citer les souches Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus. I1 peut s'agir également de produits alimentaires, et notamment de produits laitiers, ou de produits pharmaceutiques ou cosmétiques comprenant une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei conforme à l'invention, ou une fraction cellulaire obtenue à partir de celle-ci. Lorsque ladite souche est présente sous forme de bactéries vivantes, celles-ci seront de préférence présentes à raison d'au moins 105 ufc par gramme, avantageusement au moins 106 ufc par gramme de produit, plus avantageusement au moins 10' ufc par gramme et encore plus avantageusement au moins 108 ufc par gramme. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre qui se réfère à des exemples illustrant les propriétés antimicrobiennes, immunomodulatrices et anti-infectieuses de La souche CNCM I-3689. EXEMPLE 1 : COMPARAISON DES PROPRIETES DE L.A. SOUCHE CNCM 1-3689 AVEC CELLES DE SOUCHES PROBIOTIQUES CONNUES Les propriétés de la souche CNCM I-3689 ont é:_é comparées avec celles de différentes souches de l'art antérieur, connues pour leurs propriétés probiotiques. La liste de ces souches est donnée dans Le Tableau I ci-dessous. Tableau I Numéro de publication Genre Espèce Dénomination(s) de Demandes de Brevet Lactobacillus johnsonii NCC533 = Lai = CNCM EP0577903 I-1225 Lactobacillus acidophilus NCFM WO2004032639 Lactobacillus acidophilus La-5 Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus paracasei CRL431 = ATCC 55544 Lactobacillus rhamnosus LGG = ATCC 53103 US4839281 Lactobacillus rhamnosus HN001 = NM97/09514 WO9910476 Lactobacillus plantarum ATCC 17449=17= DSMZ 201 W C F S __ Lactobacillus plantarum Probi 299v = DSM WO9391823 9843 Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 Lactobacillus reuteri Biogaia SD 2112 = WO2004034808 ATCC55730 Bifidobacterium breve ATCC 15700 Bifidobacterium breve BBC50 = CNCM I-2219 EP1189517 Bifidobacterium infantis ATCC 15697 Bifidobacterium longum BB536 Bifidobacterium longum NCC2705 = CNCM I 2618 Bifidobacterium animalis BB12 = ATCC 27536 subsp. lactis _ animalis HN019 = NM97/01925 WO9910476 Bifidobacterium subsp. lactis _ 1- Activité antimicrobienne La recherche d'activités anti-microbiennes a été effectuée contre trois bactéries pathogènes cibles : Escherichia coli E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 et Listeria monocytogenes 4B. Les bactéries lactiques ont été mises en culture sur boîtes de Petri dans deux milieux différents: milieu Elliker (ELLIKER et al., J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956), et milieu TGV (Tryptone-Glucose- Meat Extract). Les boîtes sont incubées à 37°C jusqu'à apparition de colonies bactériennes. Les cultures de Bifidobacterium ont été effectuées sous anaérobiose. Une couche d'agar contenant du milieu BHI (brain--heart infusion) et le pathogène est alors coulée à la surface des boîtes. Les boîtes sont incubées de nouveau à 37°C pendant 24h. Les diamètres des zones d'inhibition du pathogène sont ensuite mesurés autour de chaque colonie de bactéries lactiques. Le score 1 correspond à un diamètre entre 1 et 3 mm. Le score 2 correspond à un diamètre entre 4 et 6 mm. Le score 3 correspond à un diamètre supérieur à 6 mm. Chaque expérience a été menée trois fois indépendamment pour chaque souche. Les scores obtenus sur les pathogènes cibles dans chaque expérience ont été additionnés, pour obtenir, pour chaque bactérie lactique, un score global d'activité antimicrobienne. Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-après. Ces résultats montrent que parmi les souches testées, la souche CNCM I-3689 est avec la souche ATCC55544 celle qui possède l'activité anti-microbienne la plus élevée. Tableau II Genre Espèce Référence (1) (2) (3) (4) (5) Score anti- E. co/i/ Listerial Listeriai Salmonella Salinonella pathogènes Elliker Elliker TGV /Elliker /TGV (1+2+3+4+5) Lactobacillus paracasei DN 114121 = CNCM I-3689 3 3 2 3 2 13 subsp. paracasei Lact+obllus paracasei CRL431-ATCC55544 2 3 3 3 2 13 Lactobacillus pa l I l 2 1 _.__ 3 3 11 2 Lactobacillus rhamnosus LGG = ATCC 53103 Lactobacillus plantarum ATCC 14917= DSMZ 2 1 2 3 2 10 20174=WCFS1 Lactobacillus casei Shirota 2 3 1 1 2 9 Lactobacillus rhamnosus HN001 = NM97/09514 1 1 2 3 2 9 Lactobacillus johnsonii NCC533=Lal=1-1225 1 1 1 2 1 6 Lactobacillus plantarum Probi 299v = DSM 9843 1 1 1 1 1 5 Lactobacillus acidophilus La-5 1 1 2 0 1 5 Lactobacillus acidophilus NCFM 1 1 1 0 1 4 Bifidobacterium animalis subsp. BB12 = ATCC 27536 1 0 0 0 2 3 lactis Lactobacillus reuteri Biogaia SD 2112 0 1 0 1 0 2 ATCC55730 Bifidobacterium longum BB536 0 0 0 0 0 0 Bifidobacteriurn ~~~ iu - Ali """"92 yc I n n n I n i i n i animes subsp. riîvv i y - rvlv1a / /v I 5 u u lactis Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 0 0 0 0 0 0 Bifidobacterium infantis ATCC 15697 0 0 0 0 0 0 Bifidobacterium breve BBC50 = I-2219 0 0 0 0 0 0 Bifidobacterium breve ATCC 15700 0 0 0 0 0 0 Bifidobacterium longum NCC2705 = CNCM I-2618 0 0 0 0 0 0 co 2 - Immunomodulation Les propriétés immunomodulatrices des différentes bactéries lactiques ont été évaluées par la mesure du ratio IL-10/IL-12. Des prélèvements de sang humain, obtenus chez des sujets sains, ont été dilués à un ratio 1:2 avec du PBS-CA (GIBCO) et purifiés grâce à un gradient de Ficoll (GIBCO. Après une centrifugation à 400xg pendant 30 min à 20°C, les PBMC (� peripherical blood mononuclear cells �) ont été prélevés. Trois étapes de lavage ont ensuite été effectuées, puis les PBMC ont été resuspendus dans un milieu de culture RPMI (GIBCO) supplémenté avec 1% de sérum de veau foetal, 1% de L-glutamine (GIBCO) et 150 �g/ml de gentamycine (GIBCO). Les PBMC ont été comptés au microscope et ajustés à une concentration de 2x106 cellules/ml, puis distribués (en aliquots de lml) dans des plaques 24-puits de cultures cellulaires (Corning, Inc.). Les souches de Lactobacillus ont été cultivées en milieu MRS (DE MAN et al., J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960), et les souches de Bifidobacterium en milieu MRS supplémenté avec 0.03 % de L-cystéine (Sigma) sous anaérobiose. Toutes les souches ont été incubées à une température de 37°C. La croissance des bactéries a été arrêtée en phase stationnaire, et les bactéries ont ensuite été lavées et resuspendues à une concentration de 3 unités MacFarlan dans du PBS contenant 20% de glycérol. Un volume de 10 �l de préparation bactérienne a été ajouté dans chaque puits des plaques contenant les PBMC (ratio bactéries:cellule 10:1). Les plaques ont été incubées pendant 24 h à 37°C sous une atmosphère contenant centrifugé CO2. ;tee rpm et aux propriétés surnageant a ensuite été aspiré, stocké à -20°C. Les souches bactériennes contrôles, 5% de à 2000 immunomodulatrices connues, ont été inclues dans PBS 20 % glycérol, sans bactéries, a également comme contrôle négatif. L'expérience a été menée le test. Du été utilisé pour chaque souche sur des PBMCs issus de trois donneurs différents. 10 L'expression des cytokines a été mesurée par des tests ELISA en utilisant des kits commerciaux (Pharmingen, BD Biosciences). Deux cytokines ont été étudiées : IL-10 et IL-12. Pour chaque souche testée, la moyenne du ratio IL-10/IL-12 a été calculée. Ces résultats sont rassemblés dans Le Tableau III suivant. Tableau III Genre Espèce Référence Ratio IL-10/1-12 Lactobacillus paracasei subsp. DN 114121 = CNCM I-3689 11,8 paracasei Lactobacillus plantarum Probi 299v = DSM 9843 12,7 Lactobacillus acidophilus La-5 23,5 Lactobacillus acidophilus NCFM 23,6 Lactobacillus ,iohnsonii NCC533=La1=1-1225 23,7 Lactobacllus plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1 25,0 Lactobacillus reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 25,4 Bifidobacterium longum BB536 26,4 Bifidobacterium animes subsp. lactis HN019 = NM97/01925 28,7 Bifidobacterium animes subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 32,4 Lactobacillus rhamnosus LGG = ATCC 53103 34,5 Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 42,0 Bifidobacterium infantis ATCC 15697 51,4 Bifidobacterium breve BBC50 = 1-2219 58,6 Lactobacillus casei Shirota 67,6 Bifidobacterium breve ATCC 15700 68,5 Bifidobacterium longum NCC2705 = CNCM 1-261_8 72,6 Lactobacillus rhamnosus HN001 = NM97/09514 _ 92,1 Lactobacillus paracasei CRL431=ATCC55544 164,0 Ces résultats montrent que la souche CNCM I-3689 présente d'importantes propriétés anti-inflammatoires sur ce modèle. Aucune des souches de référence testées ne présente d'aussi bonnes propriétés. La Figure 1 représente le ratio IL-10/IL-12 de chaque souche bactérienne en fonction de son score anti- pathogèn.e (unité arbitraire) déterminés ci-dessus. Cette Figure montre à quel point la souche CNCM I-3689 se différencie par rapport aux autres souches testées. - Survie au stress intestinal Un modèle in vitro reflétant les conditions de stress intestinal a été utilisé. Des cultures de bactéries lactiques sont réaliséjes 5 dans du lait supplémenté avec de l'extrait de levure. Les cultures sont incubées pendant 24 à 48h, selon les espèces (jusqu'à la phase stationnaire de culture). Un jus intestinal artificiel composé de sels biliaires de porc (à 3.3 g/1) et de tampon carbonate NaHCO3 (à 10 16,5 g/1) est réalisé. Le pH est ajusté à 6,3. 1 ml de ce jus intestinal est ajouté à 100 gl de culture bactérienne. Les cultures sont ensuite incubées 5 heures. Ensuite, les populations bactériennes avant et après le stress sont évaluées sur boîtes. Les valeurs sont exprimées de la manière suivante : Stress intestinal = log (ufc5h/ufc0h). ufcXmin étant la concentration en bactéries exprimée en Unités Formant Colonies (UFC) après X minutes d'incubation. Pour le stress intestinal, la survie est bonne quand la valeur est supérieure à -0,5, moyennement bonne quand la valeur est comprise entre -0,5 et -1,5 et mauvaise quand la valeur est inférieure à -1,5. Les résultats sont donnés dans le Tableau IV 11 15 20 25 suivant. Tableau IV Genre Espèce Référence Stress intestinal Lactobacillus paracasei subsp. DN 114121 = CNCM 1-3689 -0,40 _ paracasei Bifidobacterium animais subsp. lactis HN019 = NM97/01925 3,40 Bifidobacterium infantis ATCC 15697 2,79 Lactobacillus reuteri Biogaia SD 2112 ATCC55730 1,00 Lactobacillus ,Johnsonii NCC533=La1=1-1225 0,69 Bifidobacterium animes subsp. lactis BB12 = ATCC 27536 0,07 Lactobacillus paracasei CRL431=ATCC55544 0,04 Lactobacillus rhamnosus HN001 = NM97/09514_ 0,00 Lactobacillus rhamnosus LGG = ATCC 53103 -0,07 Bifidobacterium breve ATCC 15700 -0,14 Bifidobacterium longum NCC2705 = CNCM I-2618 -0,22 Lactobacillus acidophilus La-5 -0,23 Lactobacillus plantarum ATCC 14917= DSMZ 20174=WCFS1 -0,79 Bifidobacterium breve BBC50 = I-2219 -0,91 Lactobacillus plantarum Probi 299v = DSM 9843_ -1,04 Bifidobacterium longum BB536 -1,12 Lactobacillus acidophilus NCFM -1,45 Lactobacillus casei Shirota -1,50 Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 -1,91 4- Conclusion Les résultats illustrés dans les Tableaux II, III et IV ci-dessus montrent que, parmi les différentes souches testées, la souche CNCM I-3689 est la seule à présenter à la fois des propriétés anti-microbiennes et des propriétés anti-inflammatoires importantes, accompagnées en outre de bonnes propriétés de résistance aux stress intestinal. EXEMPLE 2 : CROISSANCE SUR LAIT DE LA SOUCHE CNCM I-3689 Les propriétés de croissance sur lait de la souche CNCM I-3689 ont été testées en utilisant le protocole suivant . Un milieu constitué de lait écrémé reconstitué par de l'eau additionnée de poudre de lait écrémé a été ensemencé avec la souche CNCM I-3689 (5,6x106 ufc/g ou 1,1x107 ufc/g). L'activité fermentaire de cette souche, reliée à sa croissance, est mesurée en suivant en continu le pH du milieu de croissance. Les résultats sont illustrés par le graphique présenté à la Figure 2. Ces résultats montrent que la souche CNCM I-3689 est capable de croître efficacement sur du lait, et qu'elle peut donc être utilisée dans la fabrication de produits laitiers fermentés. REVENDICATIONS1) Souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei possédant des propriétés anti-microbiennes et immunomodulatrices, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-3689. 2) Souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei possédant des propriétés anti-microbiennes et/ou immunomodulatrices, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'une souche selon la revendication 1 par mutagenèse ou transformation génétique. 3) Fraction cellulaire possédant des propriétés anti-microbiennes et/ou immunomodulatrices, caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue à partir d'une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Composition comprenant une souche de Lactobacillus paracasei subsp. paracasei selon =La revendication 1, ou une fraction cellulaire selon =La revendication 3. 5) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un produit alimentaire.