Brevet FR2927809A1 — publié le 20090828

La présente invention a pour objet une nouvelle utilisation du N-acétyl-taurinate de zinc. Le N-acétyl-taurinate de zinc appartient à la famille des dérivés de la taurine à activité neuro-musculaire renforcée, qui sont décrits dans le brevet FR 2 384 751. On a maintenant trouvé de façon surprenante que le N-acétyl-taurinate de zinc (ATA-Zn) peut être utilisé pour prévenir et/ou traiter les maladies avec accumulation de lipofuscine. L'accumulation de lipofuscine peut être due notamment au vieillissement ou à un stress oxydatif. Le vieillissement est constitué par un ensemble de modifications fonctionnelles qui diminuent progressivement l'aptitude de la personne à assurer son équilibre physiologique. Une des manifestations du vieillissement est l'accumulation dans les tissus, de la lipofuscine, qui est une substance auto-fluorescente et nondégradable ; elle constitue le stigmate majeur du vieillissement. Le stress oxydatif (ou stress oxydant) est une agression des cellules et des tissus résultant d'un dérèglement des réactions d'oxydation dans les cellules qui entraîne la formation de substances toxiques, telles que les radicaux libres (ou espèces réactives del' oxygène dénommées � Reactive Oxygen Species � (ROS)) dans les publications anglo-saxonnes). Le stress oxydatif peut toucher l'ensemble des tissus et des métabolismes, participer au veillisement et à un grand nombre de pathologies, telles que les maladies cardio-vasculaires (athéro-thrombose), les cancers, les maladies inflammatoires, les maladies métaboliques (diabète sucré, obésité) et les maladies dégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la cataracte ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge. La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est la première cause de malvoyance dans les pays industrialisés chez les adultes ayant plus de 55 ans. Elle se manifeste par un épaississement de la zone maculaire de la rétine ou une atrophie de cette zone et parfois par des saignements. (Opthal. Physiol. Opt. 2003, 23 : 383-399 et Optometry in practice, vol.5 (2004) 15-32) Le zinc est très concentré dans les tissus oculaires, en particulier dans la rétine et l'épithélium pigmentaire. Il agit comme cofacteur pour les enzymes antioxydantes (la déshydrogénase et la catalase rétinienne). Les antioxydants, tels que les vitamines C et E, les caroténoïdes et le zinc peuvent limiter les risques de progression de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. En particulier, il a été démontré que le zinc joue un rôle important dans le maintien de la fonction oculaire normale et que l'utilisation du zinc comme complément alimentaire peut diminuer le processus de vieillissement chez les souris (Journal of the American college of nutrition, 2001, vol.20, n°2, 106-118). On sait également que le zinc semble avoir un rôle fondamental dans la prévention du diabète sucré et de ses complications (Li X et al. Diabetes and methallothionein. Mini-Reviews in Medical Cherm:st/y 2007;7:761-768.) Cependant, l'utilisation du zinc en complément alimentaire doit être envisagée avec précaution car un excès de zinc peut entraîner des effets toxiques. De plus, des études ont montré que la taurine interagit étroitement avec le zinc dans le développement de la rétine chez le rat (J. Nutr. 1997, Jun ; 127(6) :1206-13) et que la taurine en complément alimentaire, augmente l'absorption de zinc par les fibroblastes (Biometals, 1994, 7, 237-243). On a maintenant trouvé de façon surprenante que le N-acétyl-taurinate de zinc peut prévenir et/ou traiter les maladies avec l'accumulation de lipofuscine due notamment au vieillissement ou à un stress oxydatif, en particulier les maladies de la rétine, notamment la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. Ainsi, la présente invention a pour objet le N-acétyl-taurinate de zinc de formule : [CH3-CO-NH-CH2-CH2-SOA-2Zn2+ pour prévenir et/ou traiter les maladies avec l'accumulation de lipofuscine due notamment au vieillissement ou à un stress oxydatif, en particulier, les maladies de la rétine, notamment pour prévenir et/ou retarder la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. L'invention a également pour objet l'utilisation du N-acétyl-taurinate de zinc de formule : [0-13-CO-NH-CI-12-CF-12-SO3]-2Zn2+ pour la préparation de médicaments utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies liées à l'accumulation de lipofuscine due notamment au vieillissement ou à un stress oxydatif, en particulier, les maladies de la rétine, notamment pour prévenir et/ou retarder la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. Le N-acétyl-taurinate de zinc est préparé par action de l'anhydride acétique sur la taurine en présence d'acétate de zinc selon un procédé analogue à celui décrit pour la préparation du N-acétyl-taurinate de sodium par M. TERAKOA (Hoppe-Seyler Zeitschrift für Physiologische Chemie, 145, 242 (1925)). De préférence, on utilise le N-acétyl-taurinate de zinc dihydraté. Pour l'administration aux patients souffrant de maladies liées à l'accumulation de lipofuscine due au vieillissement ou à un stress oxydatif, telles que notamment les maladies de la rétine, en particulier la dégénérescence maculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique, le N-acétyl-taurinate de zinc est mélangé en tant que principe actif avec un excipient pharmaceutiquement acceptable couramment utilisé pour la préparation de compositions pharmaceutiques administrables par voie orale, parentérale ou locale. Avantageusement, le N-acétyl-taurinate de zinc peut être présenté sous les formes administrables : par voie orale, telles que comprimés, dragées, capsules, gélules, sachets solutions, contenant le principe actif à la dose unitaire de 0,06 à 1 g et, pour les solutions de 0,6 à 5 g par 10 ml ; par voie parentérale, telles que solutions injectables conditionnées en ampoules, contenant de 0,1 à 2 g de principe actif par ampoule ; par voie locale, telles que lotions, crèmes, pommades, solutés, collyres, etc... La dose à administrer journellement est généralement de 0,06 à 10 g et de préférence de 1 à 2 g. L'activité de ATA-Zn sur le vieillissement a été mesurée par la détermination de la quantité de lipofuscine dans certains tissus chez les rats agés (rétine, prostate et hippocampe). L'activité antioxydante du N-acétyl-taurinate de zinc a été démontrée en utilisant la lignée de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes ARPE-19, qui constitue un outil couramment utilisé pour l'étude de la physiologie et de la pathologie de la rétine. Cette lignée cellulaire a été décrite par : a) Dunn KC et al., "a human retinal pigment epithelial cell fine with differentiated properties". Exp Eye Res. 1996;62:155ù169; b) Alizadeh M et al., "Downregulation of differentiation specific gene expression by oxidative stress in ARPE-19 celle. Invest Ophtha/mol Vis Sci 2001; 42:2706-13 c) Hui Cai et al. "Gene expression profile of cultured adult compared to immortalized human retinal pigment epithelium" Mo/ecu/ar Vision 2006, 12: 1-14. d) Ishida BY et al. High density lipoprotein mediated lipid efflux from retinal pigment epithelial cells in culture. Br J Ophta/mo/ 2006; 90:616-620. Les tests réalisés reportés ci-après montrent que seul le N-acétyl-taurinate de zinc a un effet sur la production d'adénosine triphosphate (ATP) par les cellules ARPE-19 traitées par ATA-Zn, puis exposées à l'eau oxygénée (H202). En revanche, le zinc seul ou la taurine seule n'ont aucun effet. D'autres tests ont montré que l'effet du N-acétyl-taurinate de zinc sur la production d'ATP par les cellules ARPE-19 est quasi identique voire même supérieur à celui des antioxydants de référence, tels que l'acide docosahexaénoïque (DHA), la lutéine et la zéaxanthine. La lutéine et la zéaxanthine sont des pigments naturels de la famille des caroténoïdes qui sont concentrés dans la macula et la protègent des dommages causés par l'oxydation ou la lumière. La lutéine et la zéaxanthine sont des compléments alimentaires naturels utilisés dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. L'invention va être maintenant décrite plus en détail par la préparation et les tests ci-après. PREPARATION On a mélangé 20,25 g de taurine et 17,5 g d'acétate de zinc pur sec et on a ajouté 50 g d'eau pure. On a chauffé la suspension résultante à une température comprise entre 65 et 75°C et on a ajouté à cette suspension, 45 g d'anhydride acétique puis on a chauffé à 100-105°C. On a ensuite ajouté 100 ml d'éthanol anhydre au mélange réactionnel résultant à une température comprise entre 70 et 75°C. On a finalement obtenu 30 � 3 g du produit attendu sous la forme d'une poudre blanche soluble dans l'eau et peu soluble dans l'éthanol (rendement pondéral : 36,25 %). Analyse (en pourcentages) Analyse Calculé Trouvé C 24,16 22,75 H 4,05 4,60 N 7,04 5,73 Zn* 16,4 16,7 * dosage de Zn par EDTA TESTS PHARMACOLOGIQUES 10 I) Test in vivo a) Effet de l'A TA -Zn sur l'accumulation intracellulaire de lipofuscine dans /a rétine, la prostate et l'hippocampe de rats âgés. Des rats albinos Sprague-Dawley males, âgés de 16 mois, ont été mis dans des cages en plastique standard, par groupe de 5, avec de l'eau et de la nourriture 15 ad libitum. Les conditions de vie des-animaux étaient les suivantes : Cycle de lumière jour:nuit, 12:12h, température constante de 22 � 2°C et humidité relative de 60 %. Pour le traitement chronique, on a administré aux rats, de 1' ATA-Zn per os, une fois par jour pendant 4 semaines, à la dose de 40 mg/kg (n=6). Les animaux 20 témoins ont reçu uniquement de l'eau (véhicule) pendant la même durée (n=6). 24 heures après la fin du traitement, les rats ont été anesthésiés avec de l'équithésine (2,5 mg/kg, i.p.) et perfusés par voie trans-cardiaque avec 1 % de paraformaldéhyde et 1,25 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate de sodium à 0,1 % (pH 7,4) obtenu à partir d'anhydride arsénieux et d'acétate de 25 potassium. Les échantillons des tissus prélevés (rétine, prostate et hippocampe) ont été ensuite coupés au cryostat en petits morceaux (1 mm') et fixés dans un mélange de formaldéhyde et de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate pendant deux heures. Ensuite, les échantillons ont été fixés dans du tétraoxyde d'osmium deshydraté en concentration ascendante d'acétone et de toluène et enfin inclus dans des blocs de résine (résine EPON). Les morceaux de tissus ainsi traités ont été examinés au microscope à fluorescence BX-60 Olympus. La rétine, la prostate et l'hippocampe ont montré une accumulation claire et significative de lipofuscine. La fluorescence dans tous les tissus a été quantifiée en utilisant un système d'analyse d'image (KS 300 ; Karl Zeiss). L'analyse a été effectuée en mesurant le pourcentage de surface occultée par la présence de fluorescence et comparée à une zone standard de 2000 ilm2 (fluorescence de lipofuscine exprimée en % de surface par rapport à la zone standard) en utilisant un grossissement de l'objectif X40 et une caméra vidéo microscope digitale Zeiss Sound Vision (agrandissement total sur l'écran de l'ordinateur 7500X). Les valeurs mesurées dans les surfaces d'absence de fluorescence des morceaux de tissus, ont été soustraites comme bruit de fond de l'image binaire résultante. L'analyse a été réalisée en prenant cinq morceaux différents par tissu (rétine, prostate et hippocampe) par animal et en choisissant 3 champs différents, au hasard, pour chaque morceau. Les résultats exprimés en moyenne � écart standard et analysé par le test-t sont reportés sur les figures 1, 2 et 3 qui sont des histogrammes exprimant la fluorescence de la lipofuscine (% de surface) dans les tissus de la rétine (Figure 1) de la prostate (Figure 2) et de l'hippocampe (Figure 3) après administration du véhicule ou de l'ATA-Zn. L'administration chronique de l'ATA-Zn à la dose de 40 mg/kg per os a produit une réduction significative du pourcentage de la surface occupée par la fluorescence (positive) de lipofuscine dans la rétine, la prostate et l'hippocampe, chez les rats âgés, par rapport aux animaux témoins. Ce test montre que l' ATA-Zn peut inhiber l'accumulation de lipofuscine liée au vieillissement dans les tissus de la rétine, de l'hippocampe et de la prostate.30 II) Tests in vitro a) Matériels et méthodes Dans les tests ci-après, on a utilisé la lignée de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes humaines ARPE-19. Pour évaluer le rôle protecteur de l'ATA-Zn, vis-à-vis d'un stress oxydant de l'épithélium rétinien, on a utilisé le modèle expérimental ci-après. Des cellules ARPE-19 cultivées dans un milieu approprié [mélange milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) et milieu Ham's F12] contenant (10 % de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur ; 2mM glutamine ; 0,1 mM de milieu essentiel minimal [référence ?]; une solution d'acides aminés non essentiels et du sulfate de gentamicine, dans des micro-plaques ayant 96 puits, ont été exposées à différentes concentrations d'eau oxygénée (H202) qui sont toxiques pour ces cellules. Les taux cellulaires d'ATP ont été mesurés en utilisant le test disponible dans le commerce qui mesure la production d'ATP � ATPLite-M � fabriqué par PERKIN ELMER à l'aide d'un lecteur multiplaques de PERKIN ELMER Life Sciences, Boston, MA. Ce test est basé sur le principe que la production d'ATP dépend de la viabilité des cellules et le fait que la diminution ou l'augmentation d'ATP reflète une altération correspondante de la viabilité des cellules. L'effet protecteur d'ATA-Zn a été testé en traitant les cellules ARPE-19 avec de l'ATA-Zn et en les exposant ultérieurement à l'eau oxygénée. Différents temps d'exposition et différentes doses ont été utilisées. Des tests comparatifs ont été également effectués. Les résultats de ces tests sont reportés sur les figures 5 à 9 qui sont des graphes donnant la production d'ATP, exprimées en pourcentage par rapport à la production de'ATP de cellules témoins (ayant reçu uniquement le véhicule) en fonction des concentrations d'H202, d'ATA-Zn ou des substances de comparaison. b) Test 1 : détermination des doses efficaces de l'A TA-Zn et de sa toxicité. Les cellules ARPE-19 ont été traitées avec différentes concentrations de l'ATA-Zn (10-3 à 10-9 M) dissous dans un véhicule constitué d'un milieu de culture exempt de sérum et contenant 0,01 % de DMSO (concentration connue pour ne pas affecter la viabilité des cellules). La production d'ATP par les cellules ARPE-19 ainsi traitées a été déterminée 24 heures après l'addition de l'ATA-Zn. On a aussi déterminé la production d'ATP de cellules témoins traitées uniquement avec le milieu de culture exempt de sérum et contenant 0,01 % de DMSO (véhicule). Les résultats obtenus, reportés sur la figure 4, montrent que les concentrations faibles de ATA-Zn (10-9 M, 10-8M et 10-7M) sont capables d'induire une augmentation de la viabilité des cellules alors que des concentrations plus élevées (10-3M) sont toxiques pour ces cellules. c) Test 2 : effet cytoprotecteur and-stress oxydatif Dans ce test on a utilisé les concentrations de l'ATA-Zn qui induisent une production significative d'ATP par les cellules ARPE-19, puis, après 1,5 heure, on a soumis ces cellules à un traitement avec H202 à la dose toxique de 700 pM. Les résultats obtenus, rassemblés sur la figure 5, montrent que l'ATA-Zn est capable de protéger les cellules d'un stress oxydatif, seulement à la concentration de 10-8M alors qu'à la concentration de 10-9M, l'ATA-Zn n'est pas efficace, et qu'à la concentration de 10-7M, il potentialise même l'effet toxique de H202. d) Test 3 : effet cytoprotecteur de ATA-Zn sur les cellules soumises à un stress oxydatif Les cellules ARPE-19 ont été exposées à différentes concentrations de H202 (exprimées en pM) en présence ou en l'absence de ATA-Zn à 10-8M (traitement une heure et demi avant l'exposition à H202). Les résultats reportés sur la figure 6 montrent que l'ATA-Zn est capable de protéger les cellules ARPE-19 d'un stress oxydatif induit par différentes concentrations de H202. En fait, les concentrations toxiques de H202 n'ont pas été capables d'affecter de manière significative la viabilité des cellules lorsque celles-ci ont été pré-traitées avec de l'ATA-Zn. Les tests ci-dessus montrent que l'ATA-Zn peut exercer un rôle thérapeutique potentiel, dans le traitement des différentes pathologies de l'épithélium rétinien soumis à un stress oxydatif.30 e) Test comparatif n°l détermination des doses efficaces de taurine et de Zn 50* Dans ce test, on a comparé l'effet de la taurine simple ou N-acétylée et du sulfate de zinc sur la prolifération des cellules ARPE-19. La taurine a été utilisée à deux concentrations (2mM et 10-8M) et le sulfate de zinc a été utilisé aux concentrations ci-après : 30pm et 10-8M. Les résultats rassemblés sur la figure 7 montrent que ni le sulfate de zinc ni la taurine aux différentes concentrations utilisées n'ont été capable d'induire un effet prolifératif significatif sur les cellules ARPE-19. 0 Test comparatif n°2 : détermination de l'effet cytopmtecteur en milieu oxydant. De manière à déterminer l'effet anti-oxydant du sulfate de zinc, de la taurine simple ou N-acétylée et de I' ATA-Zn, on a pré-traité les cellules ARPE-19 avec différentes concentrations de ZnSO4, de taurine simple ou N-acétylée et de I' ATA-Zn. Ensuite, on a soumis les cellules pendant 24 heures à un traitement avec de l'eau oxygénée à 700 pM. Les résultats obtenus, qui sont rassemblés sur la figure 8, confirment la capacité de l'ATA-Zn à protéger les cellules ARPE-19 d'un stress oxydatif. On notera que le sulfate de zinc à la concentration de 10-8M induit un effet protecteur inférieur à celui del' ATA-Zn. La taurine et le sulfate de zinc à la concentration de 30pM n'ont pas été capables de protéger les cellules contre le stress oxydant induit par H202. g) Test comparatif n°3: comparaison avec /es and-oxydants connus DHA /utéine et zéaxanthine. Dans ce test on a comparé l'effet de l'ATA-Zn à celui obtenu avec le DHA, la lutéine et la zéaxanthine, qui sont couramment utilisés dans les études cliniques et pré-cliniques en particulier pour leurs propriétés antioxydantes et dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Les résultats de la figure 9 montrent que l'ATA-Zn a un effet comparable aux anti-oxydants connus. REVENDICATIONS 1. Utilisation du N-acétyl-taurinate de zinc pour la préparation de médicaments utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies avec accumulation de lipofuscine. 2. Utilisation selon la revendication 1 pour la préparation de médicaments utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies avec accumulation de lipofuscine due au vieillissement. 10 3. Utilisation selon la revendication 1 pour la préparation de médicaments utiles pour prévenir et/ou traiter les maladies avec accumulation de lipofuscine due à un stress on/datif. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour la 15 préparation de médicaments utiles pour prévenir et/ou retarder la dégénérescence oraculaire liée à l'âge et la rétinopathie diabétique. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le N-acétyl-taurinate est dihydraté. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation de médicaments pour l'administration orale. 7. Utilisation selon la revendication 6, pour la préparation de médicaments 25 sous forme de gélules, sachets, comprimés ou solutions contenant 0,06 à 1 g par dose unitaire ou 0,6 à 5 g / 10 ml de solution. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la préparation de médicaments pour l'administration parentérale. 9. Utilisation selon la revendication 8, pour la préparation de médicaments sous forme d'ampoules injectables contenant 0,1 à 2 g par ampoule. 20 30 10. Composition pharmaceutique utile pour prévenir et/ou traiter les maladies avec accumulation de lipofuscine, caractérisée en ce qu'elle contient du N-acétyltaurinate de zinc à titre de principe actif en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme de gélules, sachets, comprimés ou solutions contenant 0,06 à 1 g par dose unitaire ou 0,6 à 5 g/10 ml de solution. 10 12. Composition pharmaceutique selon la la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'ampoules injectables contenant 0,1 à 2 g par ampoule. 13. N-acétyl-taurinate de zinc pour prévenir et/ou traiter les maladies avec 15 accumulation de lipofuscine. 14. N-acétyl-taurinate de zinc pour prévenir et/ou traiter les maladies liées à 1' accumulation de lipofuscine due au vieillissement. 20 15. N-acétyl-taurinate de zinc pour prévenir et/ou traiter les maladies liées à 1' accumulation de lipofuscine due à un stress oxydatif. 16. N-acétyl-taurinate de zinc pour prévenir et/ou retarder la dégénérescence maculaire liée à l'âge ou la rétinopathie diabétique. 25