Brevet FR2925491A1 — publié le 20090626

La présente invention a pour objet une nouvelle famille de lipides cationiques et leur utilisation comme vecteurs de délivrance in vitro, ex vivo et in vivo d'agents biologiquement actifs, notamment d'acides nucléiques, de peptides, de protéines, de polysaccharides et de lipides dans les cellules vivantes, dans les tissus, dans les organes et/ou dans les organismes, humains, animaux et/ou végétaux. La délivrance intracellulaire d'agents biologiquement actifs trouve application dans de nombreux domaines allant de la biologie à la médecine. En biologie, l'introduction dans les cellules d'acides nucléiques (transfection) (gène ou plasmides, ADN codant linéaire, chromosomes artificiels, ARN messager, ARN interférents, ARN double brin comme les ARNsh), d'oligonucléotides antisens, de ribozymes peut être utilisée notamment pour l'étude de la régulation de l'expression de gènes ou pour l'élucidation de leur fonction. De même, le transport intracellulaire de peptides, de protéines, de polysaccharides, de lipides et de toute autre molécule biologiquement active permet d'appréhender et d'étudier les mécanismes biologiques fondamentaux. En médecine, ces techniques ont été développées pour la délivrance de peptides ou de protéines thérapeutiques, d'oligonucléotides antisens et de ribozymes (thérapies antisens), d'ARNsi et de gènes (thérapie génique) pour pallier entre autres à une déficience métabolique, à un désordre génétique ou à une infection. Il existe de nombreuses méthodes pour introduire des acides nucléiques dans les cellules que l'on peut classer en trois catégories: physiques, biochimiques et biologiques. Les méthodes biologiques font appels à des organismes infectieux comme les virus ou les bactéries. Les approches physiques comprennent notamment l'électroporation, la micro-injection, la sonoporation ou la magnétofection. Enfin, les méthodes biochimiques de transfection associent des réactifs chimiques aux acides nucléiques (Conwell, C.C. .et col. (2005) Adv. Genet. 53, 1-18). D'une part, le phosphate de calcium ou le dextran DEAE sont utilisés dans des méthodes de co-précipitation, d'autre part des polymères cationiques substitués ou non par des ligands, des lipides cationiques sous forme de systèmes organisés ou non (liposomes, vésicules unilamellaires ou multilaméllaires, phases hexagonales, micelles) et/ou un mélange des ces différentes entités, forment des complexes (polyplexes, lipoplexes ou lipopolyplexes) avec les acides nucléiques via des interactions électrostatiques et permettent leur passage à travers les membranes cellulaires. Parmi les principaux lipides cationiques connus, on peut notamment citer de rnanière non exhaustive et à titre d'exemples: - des lipides cationiques monovalents sous forme de sels d'ammonium quaternaires, tels que le DOTMA (chlorure de N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium) (Felgner, P.L. et col. (1987) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 84 (21), 7413-7417) commercialisé en association avec un lipide neutre, le DOPE (diolléoylphosphatidyléthanolamine), sous le nom de LipofectinTM ; les analogues métabolisables du DOTMA tels que le DOTAP (1,2-dioleoy-3-trimethylammonium propane) (Leventis, R. et Silvius, J.R. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1023, 124-132) ; le DMRIE (Felgner, J.H. et col. (1994) J. Bio/. Chem. 269(4), 2550-2561) ; ou bien encore le DDAB (bromure de dioctadécyldiméthyl ammonium), commercialisé en association avec un lipide neutre sous la dénomination de TransfectACETM ; - des lipides cationiques monovalents sous forme de sels de pyridinium tels que le SAINT-2 (chlorure de N-méthyl-4-(dioleyl)méthylpyridinium) (Ruiters, M.H.J., PCT WO2006/043809) ; - des lipides cationiques multivalents sous forme de lipospermines tels que le DOGS (5-carboxyspermylglycine-dioctadécylamine) (Behr, J.-P. et col. (1989) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 86 (18), 6982-6986) et le DOSPA (Trifluoroacétate de 2,3-d ioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N, N-dimethyl-propanammonium), fournies sous les dénominations commerciales respectives de TransfectamTM et LipofectamineTM ; - des lipides cationiques multivalents sous forme de lipopolylysines (Zhou, X. et col. (1991) Biochem. Biophys. Acta 1065, 8-14) ; - des dérives cationiques du cholestérol tel que le DC-Chol (3(3[N-(N',N'-dimethylaminomethane)-carbamoyl]cholestérol) (Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1), 280-285). La délivrance d'acides nucléiques par des lipides cationiques formulés (lipofection) présente de nombreux avantages car ils ne sont pas immunogéniques, contrairement aux agents viraux, sont simples à utiliser, permettent de délivrer des acides nucléiques sans limite de taille, et peuvent être produits en grande quantité. De plus, la lipofection est la méthode la plus employée dans les laboratoires de recherches pour transfecter les cellules in vitro grâce à sa facilité d'utilisation, son efficacité en présence ou en absence de sérum pour une grande variété de types cellulaires, notamment les cellules adhérentes et sa versatilité pour la délivrance des acides nucléiques. Toutefois, ces vecteurs synthétiques sont peu ou ne sont pas efficaces pour la itransfection de certains types cellulaires, notamment les cellules en suspension comme les lymphocytes, les cellules souches, les cellules primaires (ne se divisant pas)... L'efficacité réduite des lipides cationiques à transfecter certaines cellules comme les lignées cellulaires en suspension s'explique par une faible capacité des lipoplexes à s'attacher à la surface de ces cellules. En effet, contrairement aux cellules adhérentes, celles-ci possèdent très peu de protéines transmembranaires polyanioniques comme les Heparan Sulfate Proteoglycans (HSPGs) qui sont les principaux points d'encrage des lipoplexes sur les membranes plasmiques (Kopatz, I. et col. (2004) J. Gene Med. 6, 769-776 ; Wiethoff, C.M. et col. (2001) J. Biol. Chem. 276, 32806-32813 ; Mislick K.A. et col. (1996) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 93, 12349-12354). Néanmoins, diverses approches utilisant des ligands spécifiques tels que la transferrine (Kursa, M. (2003) Bioconjugate Chem. 14, 222-231 ; Kakudo, T. et col. (2004) Biochemistry 43, :5618-5628), le facteur épidermique de croissance (epidermal growth factor EGF), des anticorps monoclonaux (Guillem, V.M. et col. (2002) J Controlled Released 83, 133-146 ; Guillem, V.M. et col. (2002) J. Gene Med. 4, 170-182 ; Puls, R.L. et col. (1999) Gene Ther. 6, 1774-1778 ; Thurnher, M. et col. (1994) Glycobiology 4 (4), 429-435) ou des peptides (Wagner, E. (1999) Adv. Drug Deliv. Rev. 38 (3), 279-289 ; Uduehi A. et col. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38, 201-209), couplés ou associés à un polymère cationique ou à un co-lipide formulé avec les lipides cationiques, ont été testés avec succès. Les cellules quiescentes sont également très difficiles à transfecter au moyen de la lipofection, car en l'absence de moyens de ciblage du noyau tels que des séquences de localisation nucléaire, les complexes présents dans le cytosol ont du mal à passer à travers les pores de la membrane nucléaire et à être ainsi transcrit. Plusieurs approches utilisant des complexes ternaires (lipoplexes: lipides cationiques et acides nucléiques plus un élément de ciblage nucléaire) à base d'histones, de séquences de localisation nucléaire peptidiques, ont été étudiées pour contourner ce problème (Khalil I.A. (2006) Pharmacol. Rev. 58, 32-45 ; Medina-Kauwe, L.K. (2005) Gene Ther. 12, 1734-1751; Escriou, V. et col. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (2), 295-306 ; Ma, H. et col. (2001) Curr. Pharm. Biotechnol. 2 (1), 1-17; Hagstrom, J.E. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1284 (1), 47-55). Cependant, l'addition de ces éléments de ciblage aux lipides cationiques rend la formulation et la préparation des complexes délicates et leur utilisation est ainsi très limitée. De plus, leur efficacité in vitro et in vivo demeure incertaine. Par conséquent, le développement de nouveaux lipides cationiques intégrant dans la même molécule les fonctions de complexation aux acides nucléiques et de ciblages permettrait de s'affranchir de l'utilisation d'éléments de ciblage supplémentaires (membrane et noyau) et apporterait une solution à ces obstacles majeurs. Par ailleurs, l'efficacité in vivo de la lipofection demeure trop faible (Evans, C.H. et col. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 243-258) et de nouveaux lipides plus performants sont nécessaires. Leur application in vivo est limitée par la dégradation enzymatique des complexes, leur pharmacologie et par la présence de protéines et de polysaccharides dans les fluides corporels et le mucus, qui inhibent fortement la transfection. Les principaux paramètres qui affectent les efficacités de transfection des lipoplexes ont été largement étudiés (Solodin, I. et col. (1995) Biochemistry 34 (41), 13537-13544 ; Templeton, N. S. et col. (1997) Nat. Biotech. 15 (7), 647-652 ; Thierry, A. R. et col. (1995) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 92 (21), 9742-9746 ; Li, S. et col. (1997) Gene Ther. 4 (9), 891-900 ; Liu, Y. et col. (1997) Nat. Biotechnol. 15 (2), 167-173 ; Liu, F. et col. (1997) Gene Ther. 4 (6), 517-523 ; Song, Y. K. et col. (1997) Hum. Gene Ther. 8 (13), 1585-1594; Hong, et col. (1997) FEBS Letters 400 (2), 233-237). Ces études ont montré qu'on obtenait les meilleurs niveaux d'expression de gènes in vivo en utilisant des ratios lipides/acides nucléiques relativement haut. Néanmoins, l'utilisation d'un large excès de lipides cationiques ou de lipoplexes s'accompagne souvent d'une toxicité significative. Ainsi, la cytotoxicité des lipides cationiques demeure un des inconvénients majeurs de cette méthode, aussi bien in vitro qu'in vivo. Elle est due, principalement, à une mauvaise biodégradabilité des lipides cationiques qui ne sont pas naturellement présent dans les cellules. De nombreux efforts ont été effectués dans cette optique. Ainsi, l'équipe de Scherman a développé des lipides présentant une liaison sensible au milieu réducteur dans les chaînes grasses afin de faciliter leur métabolisme (WO 9938821). D'autre part, Boomer et col. ont incorporé un groupement vinyl éther, sensible au pH, et plus particulièrement au milieu acide, dans le bras espaceur de leur lipide cationique afin d'induire un clivage rapide du lipide dans le milieu acide des endosomes. Ce clivage entraîne une déstabilisation de la structure des lipoplexes qui sont enchâssés dans la membrane des endosomes et permet une libération précoce de I"ADN des endosomes vers le cytosol avant que celle-ci ne soit dégradée par les nucléases (Boomer, J.A. (2002) Gene Transfer Pharm. Res. 19 (9), 1292-1301). Dans le même but, l'équipe de Szoka a construit une famille de lipides cationiques munie d'un bras espaceur contenant un groupement ortho ester linéaire ou cyclique, stable à pH physiologique, et qui s'hydrolyse à pH acide (Chen, H. et col. (2007), J. Med. Chem. 50 (18), 4269-4278). Enfin, la présence de groupements esters dans les lipides cationiques permet une meilleure biodégradabilité de ceux-ci dans les cellules, car les groupements esters sont facilement clivés par les estérases endogènes. Il existe de nombreux exemples de lipides cationiques contenant des groupements esters parmi lesquels on peut citer les tétraesters DMTM(Gly) et DOTM(Gly), synthétisés par l'équipe de Nantz, et dont l'influence sur la diminution de la cytotoxicité à été étudiée (Aberle, A.M. et col. (1998) Biochemistry 37 (18), 6533-6540). Tous ces lipides ont montré une meilleure biodégradabilité en milieu intracellulaire, induisant une très faible cytotoxicité. Néanmoins, ces entités n'ont pas intégré les éléments de ciblage décrit précédemment et ont ainsi une efficacité réduite sur les cellules en suspension et non mitotique. C'est pourquoi il est nécessaire de concevoir de nouveaux lipides complètement biodégradables dans les cellules et contenant les éléments de ciblage mentionnés ci-dessus. Actuellement il existe un grand nombre de lipides cationiques commerciaux (réactif de transfection) développés spécifiquement pour le transport d'acides nucléiques. Les procédures de transfection utilisant ces réactifs sont communément utilisées dans la plupart des laboratoires biomédicaux. Curieusement, beaucoup moins de progrès ont été réalisés dans la conception de réactifs dédiés au transport d'autres biomolécules tels que les peptides et les protéines, malgré des ressources considérables consacrées à l'isolation et l'évaluation de peptides, d'anticorps, d'antigènes et de protéines recombinantes. En fait, toutes les protéines recombinantes et les anticorps monoclonaux actuellement utilisés en clinique sont dirigés vers une cible extracellulaire et non intracellulaire (Krejsa, C. et col. (2006) Nat Rev Drug Discov 5, 507-521). S'il existait une méthode efficace pour délivrer des peptides, des protéines ou toutes autres biomolécules à l'intérieur des cellules, il ne serait pas nécessaire de restreindre les candidats potentiels à un traitement thérapeutique aux molécules secrétées ou membranaires. L'introduction directe de peptides et/ou de protéines dans les cellules peut être utile dans des domaines variés tels que la régulation du cycle cellulaire, le contrôle de l'apoptose, l'immunologie et la régulation de la transcription. Cette approche peut ainsi permettre aux chercheurs d'étudier la fonction des molécules transportées, de bloquer ou d'induire une fonction intracellulaire dans les cellules vivantes, de développer leur utilisation thérapeutique potentielle contre un grand nombre de maladies aussi diverses que le cancer, les inflammations et les infections ainsi que de développer de nouveaux vaccins. Par exemple, le transport d'anticorps monoclonaux dans les cellules peut être utilisé pour bloquer de manière spécifique une cible intracellulaire. Cette approche a déjà été démontrée via la transfection d'ADN codant pour des anticorps (" Intrabodies ") (Mhashilkar, A. M. et col. (1997) J Virol 71, 6486-6494; Chen, S. Y. et col. (1994) Hum Gene Ther 5, 595-601 ; Shaki-Loewenstein, S. et col. (2005) J Immunol Methods 303, 19-39 ; Williams, B. R. et col. (2006) Curr Med Chem 13, 1473-1480). Toutefois, cette stratégie est longue et laborieuse, et le transport direct d'anticorps recombinants peut s'avérer être une méthode beaucoup plus attractive car ces anticorps sont notamment très faciles à produire en grande quantité. Plusieurs approches ont été étudiées pour transporter des peptides, des 30 protéines et d'autres biomolécules fonctionnelles dans des cellules. La micro- injection et l'électroporation ont été utilisées pour introduire des protéines fonctionnelles à l'intérieur des cellules avec des degrés variables de succès (Marrero, M. B. et col. (1998) J. Biot. Chem. 270, 15734-15738 ; Fenton, M. et col. (1998) J. Immunol. Methods 212, 41-48 ; Abarzua, P. et col. (1995) Cancer Reg;. 55, 3490-3494). L'approche la plus étudiée pour le transport de macromolécules, de peptides ou de protéines dans les cellules emploie une classe spéciale de peptides et/ou de protéines ayant la capacité de passer à travers les membranes cellulaires par un mécanisme dit de transduction. (Schwarze, S. R. et col. (2000) Trends Cell Biol. 10, 290-295 ; Murriel, C. L. et col. (2006) Expert Opin Drug Deliv 3, 739-746). C'est en fait une courte séquence peptidique riche en résidus basiques (essentiellement des lysines et des arginines) appelée PTD ("Protein Transduction Domain") ou CPP ("Cell- Penetrating Peptides") qui confère à ces protéines la propriété de transloquer à travers les parois des cellules et également d'atteindre le noyau des cellules. Les trois principaux exemples de PTD sont les protéines HIV-1 TAT (Trans-activating transcriptional activator : Trans-activateur de transcription) (Green, M. et col. (1988) Cell 55, 1179-1188 ; Frankel, A. D. et col. (1988) Cell 55, 1189-1193), HSV-1 VP22 (Herpes Simple Virus Type I VP 22 Transcription Factor) (Elliott, G. et col. (1997) Ce/1 88, 223-233) et Antp (Drosophile Antennapedia Homeotic Transcription Factor) (Joliot, A. et col. (1991) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 88, 1864-1868). Toutefois, une des principales limitations de l'utilisation des PTDs est la nécessité de former une liaison covalente, soit par voie chimique, soit par clonage, entre la séquence PTD et la molécule d'intérêt, ce qui n'est pas sans conséquence sur l'activité biologique de cette dernière. Par exemple, il peut entraîner une modification de la conformation de la protéine ou bien encore interférer avec sa fonction par encombrement stérique. De plus, l'efficacité de ces systèmes est fortement dépendante de la structure et de la taille de la molécule à transporter. Ils sont très efficaces pour des peptides ou de petites protéines solubles présentant une versatilité structurale, mais sont limités pour des systèmes complexes et multimériques. Ainsi, les PTDs ne sont pas efficaces pour le transport d'ADN contrairement aux lipides cationiques. Les scientifiques doivent donc actuellement employer des méthodes sophistiquées, longues et limitées dans leur application pour le transport intracellulaire de molécules biologiquement actives. A l'heure actuelle, la méthode indirecte consistant à transfecter un ADN codant pour une protéine demeure celle la plus utilisée pour obtenir cette protéine dans des cellules. Il existe donc un besoin crucial de développer un système de transport simple et robuste, similaire aux agents de transfection, pour la délivrance intracellulaire de peptides, de protéines, d'anticorps et autres biomolécules. En effet, une formulation lipidique permettant d'associer rapidement et de manière non covalente les protéines et autres molécules, de protéger celles-ci de l'environnement biologique et de les transporter à l'intérieur des cellules sans limite de taille ou sans altérer leur fonction apporterait un bénéfice indéniable dans tous les aspects de la biologie cellulaire, la génomique, la génomique fonctionnelle et la protéomique. Or, la majorité des lipides cationiques employés en transfection s'avèrent complètement inefficaces pour le transport des autres biomolécules à l'intérieur des cellules. Néanmoins, quelques exemples ont été rapportés sur l'utilisation de lipides cationiques pour le transport de protéines dans les cellules (Debs, R. J. et col. (1990) J. Biol. Chem. 265, 10189-10192 ; Baubonis, W. et col. (1993) Nucleic Acids Res 21, 2025-2029 ; Huang, L. et col. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 761-768 ; Farhood, H. et col. (1995) Anal. Biochem. 225, 89-93 ; Guillaume, C. et col. (2000) J. Pharm. Sci. 89, 639-645 ; Sells, M. A. et col. (1995) BioTechniques 19, 72-78 ; Walker, C. et col. (1992) Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 89, 7915-7918 ; Zelphati, O. et col. (2001) J Biol Chem 276, 35103-35110 ; Dalkara, D. et col. (2004) Mol Ther 9, 964-969). La lipofectin, le DC-Chol et le TransACE ont été utilisés pour co-transporter de l'ADN associée à des protéines (Baubonis et col. (1993) ; Debs et col. (1990) ; Farhood et col. (1995)). Cependant, leur efficacité reste très faible, et a nécessité l'addition d'agent lysosomotropique (Debs et col. (1990)). De plus, le rôle de ces lipides cationiques demeure questionnable, les protéines utilisées étant en mesure d'entrer dans les cellules seules (Farhood et col. (1995) ; Huang et col. (1995)). Walker et col. ont également utilisé un lipide cationique (DOTAP) pour transporter un antigène dans les cellules, mais la discrimination entre la présentation de l'antigène à l'intérieur ou à l'extérieur des cellules est difficile à établir et la fonctionnalité de la protéine transportée n'est pas démontrée (Walker et col. (1992)). Des lipides phosphonocationiques (GLB73 et GLB43) ont encore été utilisés in vitro et in vivo pour transporter la p-galactosidase, mais sans mettre en évidence l'influence des lipides sur le nombre de cellules positives à la I3-galactosidase, aucune autre protéine fonctionnelle n'ayant été testée par ailleurs (Guillaume et col. (2000)). Dans la plupart des exemples mentionnés ci-dessus, l'efficacité de transport a été évaluée après fixation et perméabilisation des cellules, ce qui complique l'interprétation des résultats. Plus récemment, Zelphati et col. ont développé un lipide cationique trifluoroacétylé pour la vectorisation intracellulaire de protéines (Zelphati et col. (2001)). Celui-ci a permis de transporter dans des cellules vivantes un certain nombre de protéines biologiquement actives et s'est avéré plus efficace que de nombreux lipides cationiques commerciaux. Des études similaires ont ensuite été réalisées avec les lipides DOGS et Chol-Sper (Dalkara, D. et col. (2006) J Control Release 116, 353-359 ; Dalkara et col. (2004)). Jusqu'à l'heure actuelle, l'utilisation de lipides cationiques semble moins bien adaptée au transport de protéines qu'au transport d'acides nucléiques, entre autres parce qu'il n'existe toujours aucun système lipidique connu qui permette la délivrance de protéines en présence de sérum. Ainsi, la vectorisation intracellulaire de protéines, de peptides et d'autres molécules, hormis les acides nucléiques, reste une approche extrêmement isolée et limitée. Bien qu'il existe un certain nombre de produits commerciaux à base de lipides cationiques, efficaces pour la délivrance d'acides nucléiques dans les cellules en culture, et quelques uns plus spécialement mis au point pour le transport de protéines, aucun d'entre eux n'est adapté pour le transport de tous les types de biomolécules en présence de sérum. Par ailleurs, ces agents de transfection sont peu efficaces sur les cellules en suspension et primaires et s'accompagnent souvent d'une forte toxicité qui limite leur action in vivo. La présente invention a pour objet de fournir une nouvelle famille universelle de lipides cationiques, compatibles avec la présence de sérum et non toxiques, permettant une délivrance efficace in vitro, ex vivo et in vivo de tous les types de biomolécules telles que les acides nucléiques, les peptides, les protéines, les polysaccharides et les lipides dans les cellules vivantes. En effet, la structure innovante de ces nouveaux lipides cationiques permet d'allier : 1. les propriétés amphiphiles des lipides cationiques pour former des structures organisées (liposomes, micelles...) permettant le transport et la vectorisation de molécules actives vers leur cible, leurs propriétés à former des complexes non covalents avec les acides nucléiques chargés négativement (lipoplexes), et leurs propriétés à déstabiliser les membranes cellulaires. 2. les propriétés de la tête cationique, constituée par des acides aminés basiques présents dans les PTD, connus pour leur aptitude à s'attacher aux cellules et passer les barrières transmembranaires dont la barrière nucléaire. En outre, ces séquences d'acides aminés basiques interagissent naturellement avec plusieurs types de biomolécules dont les acides nucléiques, les peptides et les protéines et sont complètement non toxiques. Par ailleurs, ces nouveaux composés sont capables de transfecter les cellules avec une grande efficacité en présence de sérum grâce à leur faible capacité à interagir avec les composantes du milieu sérique. 3. la capacité à se dégrader rapidement en milieu intracellulaire grâce à la présence d'un bras espaceur entre la partie lipophile et la tête cationique munie d'un groupement fonctionnel incorporant une liaison sensible à son environnement (pH, oxydo-réduction, enzymes...) et clivable en milieu cyto:solique. Les composés issus de la dégradation qui en résultent sont des molécules naturelles (acides gras, acides aminés naturels) facilement métabolisés par la cellule. Le caractère biodégradable de ces molécules les rend par conséquent non cytotoxiques. Pour atteindre ce but, l'invention a pour objet un composé amphipathique cationique de formule (I) : Rù{E )m(AA)n ((Y) (z)] (l) p q s dans laquelle : R représente une région lipophile qui peut comprendre une ou plusieurs chaînes alkyle, comprenant 6 à 24 atomes de carbone, préférentiellement entre 10 et 18 atomes de carbone, 30 ramifiée ou linéaire, insaturée ou saturée, éventuellement fluorée ; ou un ou plusieurs groupes cycliques ou polycycliques connus pour être lipophile comme un groupe stéroïde (par exemple un dérivé du cholestérol), un groupe polyaromatique (par exemple dérivé du25 naphtalène, du dansyle, de l'anthracène), ou un groupe dérivé d'alcaloïde ; ou - un lipide naturel ou synthétique. Eventuellement, R peut être constitué d'une combinaison de ces différents groupements. R peut comporter un ou plusieurs hétéroatomes. E représente un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 8, et pouvant comporter éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes ; m est un entier égal à 0 ou à 1 ; AA représente le reste d'un acide aminé ; n est un entier égal à 0 ou à 1; W1 et W2, identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 6, pouvant éventuellement comprendre un ou plusieurs hétéroatomes ; L représente un groupement fonctionnel pouvant incorporer au moins une liaison sensible à son environnement, stable en milieu extracellulaire et rapidement clivée dans le milieu intracellulaire car sensible - à des stimuli tels que la décroissance du pH (par exemple des groupements éther de vinyle ou acylhydrazone sensibles au milieu acide) ou un changement du potentiel d'oxydoréduction (par exemple une liaison disulfide, clivée en milieu réducteur), - aux enzymes (par exemple une liaison ester, clivée par les estérases endogènes) ; ou encore aux radiations lumineuses (porteuses de groupements photosensibles par exemple) ; p est un entier égal à o ou à 1; Y est un groupe hydrocarboné ramifié, pouvant comprendre de 1 à 20 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 12, et/ou un ou plusieurs hétéroatomes, et pouvant être couplé de manière covalente éventuellement au groupe W2 ou AA ou E ou R d'une part, et au moins à deux groupes Y et/ou Z d'autre part ; û q est un entier compris entre 0 et 8, de préférence entre 0 et 3 ; û Z représente un acide aminé basique ; û r est un entier compris entre 1 et 16, de préférence entre 1 et 8, étant entendu que si q est égal à 1 alors r est au moins égal à 2 et que si r est 5 supérieur à 1, alors les groupements Z peuvent être identiques ou différents; û s est un entier égal à 1 ou 2 ; et ses sels d'addition physiologiquement acceptables. 10 Dans ce qui précède et ce qui suit, on entend par "hétéroatome", un atonie choisi parmi l'azote, l'oxygène, le soufre et les halogènes comme par exemple le brome, l'iode, le chlore et le fluor. De même, on entend par "reste d'un acide aminé", le groupe d'atomes qui 15 subsiste de cet acide aminé lorsque celui-ci est lié de manière covalente, d'une part au groupement E ou R, et d'autre part à un ou plusieurs groupes W1 ou Y ou Z. De même encore on entend par "groupe hydrocarboné" tout groupe composé d'un ou plusieurs atomes de carbone, éventuellement lié(s) à un ou 20 plusieurs atome(s) d'hydrogène. Selon une première disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), R répond de préférence à la formule (II) : A "b D 25 R2B a dans laquelle : • R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 6 à 24 atomes 30 de carbone, préférentiellement de 10 à 18. • A et B, identiques ou différents, représentent un groupement ûC(0)-O- ; -O-C(0)- ; -CO-NH- ; -NH-CO- ; -NH-ou -0-. • a est un entier compris entre 1 et 6, de préférence a est un entier égal à R 1/ 1 ou 2. • b est un entier compris entre 0 et 6, de préférence b est un entier égal à O ou 1. • D représente un groupement -NH-, -CO-, -O- ou -S-. Parmi les structures correspondant à la formule (II), R répond préférentiellement à la formule (III) (Exemple 1.1 ci-dessous) : RI\/O\/\O/ R2O O ou bien encore à la formule (IV) (Exemple 1.8 ci-dessous) : o H R1 N N H RZNO H dans lesquelles RI et R2 ont la même signification que précédemment. Dans les formules (III) et (IV), R1 et R2 représentent de préférence, une chaîne alkyle, alcényle ou alcynyle en Cu à C. Selon une autre disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), E 25 peut être absent ou E peut servir de bras espaceur et répond alors à la formule (V) : -GI-XI-GI-, dans laquelle X1 représente un groupe alkylène formant pont et pouvant comprendre de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4, tandis que G1 peut représenter un groupe -CO-ou -NH-. Parmi les composés selon l'invention, E répond de préférence à la formule 30 CO-XI-CO dans laquelle X1 à la même signification que précédemment et est lié par une liaison amide à la région lipophile R d'une part, et soit au reste AA, soit directement au groupe W1 ou Y ou Z d'autre part. Selon l'invention, l'acide aminé, dont le reste est symbolisé par AA dans la 15 20 forrnule (I), peut être, de préférence, choisi parmi les vingt acides aminés qui entrent dans la constitution des protéines, à savoir l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'alanine, l'arginine, l'asparagine, la cystéine, la glutamine, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, la tyrosine, le tryptophane et la valine. En particulier, AA peut être choisi parmi l'acide aspartique, l'acide glutamique, l'isoleucine, la leucine, la lysine et la phénylalanine, l'acide aspartique (exemple 1.14), l'acide glutamique (exemple 1.15) et la lysine (exemple 1.12) étant particulièrement préférés. Toutefois, cet acide aminé peut également être choisi parrni des acides aminés plus rares comme par exemple, la [3-alanine, l'acide yaminobutyrique, l'acide a-aminoadipique, l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, la phénylsérine, l'acide a,s-diaminopimélique, l'ornithine et tous autres acides aminés modifiés, tout acide aminé étant susceptible de convenir puisqu'il comporte, par définition, deux groupes fonctionnels, l'un acide carboxylique, l'autre amine, autorisant sa liaison covalente, d'une part, au bras espaceur E ou à R, d'autre part, à au moins un groupe W1 ou Y ou Z. Le choix de l'acide aminé dépend notamment de la valeur que l'on souhaite donné à s dans la formule (I), dans la mesure où il doit comporter au moins trois groupements fonctionnels pour que s puisse être égal à 2, alors qu'il suffit qu'il ne comporte que deux groupements fonctionnels pour avoir s égal à 1. Conformément à l'invention, on préfère que AA soit le reste d'un acide aminé appartenant à la série L. Toutefois, il est également possible que AA soit le reste d'un acide aminé de la série D. Selon une autre disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), Wi peut répondre à la formule (VI) : -G2-X2- et W2 peut répondre à la formule (VII) : -X3-G3- dans lesquelles X2 et X3, identiques ou différents, peuvent représenter un groupe alkylène formant pont et pouvant comprendre de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4, tandis que G2 et G3, identiques ou différents, peuvent représenter un groupe -CO-, -NH- ou -0-. W1 forme une liaison covalente avec un groupe AA, E ou R d'une part, et avec le groupe L d'autre part, alors que W2 forme une liaison covalente avec un groupe L d'une part, et avec un groupe Y ou Z d'autre part. Selon une autre disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), L peut représenter un groupement ester (-CO-O-), disulfide (-S-S-), éther de vinyle (-O-C=C-), acylhydrazone (-CO-NR-N=CR'R"), les groupements esters (exemple 1.1) et disulfides (exemple 1.6) étant particulièrement préférés. Ces groupements forrnent une liaison covalente avec les groupements W1 d'une part et W2 d'autre part. Selon une autre disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), Y répond de préférence à la formule (VIII) : -CO-X4-NH-X5-N-[X6-NH]2- ou (IX): - NH-X5-N-[X6-NH]2-, dans lesquelles X4, X5 et X6, identiques ou différents, peuvent représenter un groupe alkylène formant pont et pouvant comprendre de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4. Dans les formules (VIII) et (IX), X4 représente, de préférence, un méthylène, tandis que X5 et X6 peuvent représenter de préférence, un groupe alkylène formant pont et comprenant de 1 à 4 atomes de carbone et, mieux encore, 2 atomes de carbone. Y possède donc trois groupements fonctionnels lui permettant de former une liaison covalente avec éventuellement W2 ou AA ou E ou R d'une part, et au moins deux groupes Y et/ou Z d'autre part. Selon une autre disposition préférée de l'invention, dans la formule (I), Z représente un acide aminé basique choisi de préférence parmi la lysine (exemple 1.1), l'ornithine (exemple 1.6), l'arginine (exemple 1.7), l'histidine (exemple 1.4) et la sérine (exemple 1.5). L'acide aminé Z possède une fonction acide carboxylique qui autorise sa liaison covalente avec éventuellement Y ou W2 ou AA ou E ou R d'une part, et une ou deux fonctions basiques réactives (amine, alcool...) permettant de former éventuellement une liaison covalente avec un ou deux autres groupes Z d'autre part. Conformément à l'invention, on préfère que l'acide aminé basique appartienne à la série L. Toutefois, il est également possible qu'il appartienne à la série D. Selon l'invention le composé amphipathique cationique de formule (1) peut être en solution sous la forme de sel ; le contre ion peut alors être un anion organique ou inorganique acceptable d'un point de vue physiologique, avantageusement choisi parmi des anions organiques tels que CF30OO- et CH30OO- ou inorganiques tels que Br-, Cr, r et F. Parmi les composés de formule (I) convenant aux fins de l'invention, on peut citer à titre non-exhaustif les composés dont la formule est la suivante : 16 .1 NH2 1. 2 NH2 1.3 0 NH2 1.4 1.5 1.6 NH2 1.7 1.8 1.9 NH2 n 1.10 H2NNH2 NH2 1.12 O H HN H10 .13 NH2 1.14 18 tiy / NH NH N O H N H H N 1.15 NH2 NH2 1.16 H H H 1.17 •H O H OO O^~N 0NH2 H2N N'LNH H HN O NH2 NNN 'LNH H H NH2 H HZNNHz HN O O N•~iN~/~NNH2 O H 101 H H NH2 O OH O H O~~O N~iS N 1.18 1.19 HH2N N-/ NH2 NÔ O O-~~N HN O NH2 H HN H2N O OH O O H H NH2 O~O NNtVNNH2 O H O H O HN_ O 1.20 H2N NH2 H2N N H2 Les composés selon l'invention peuvent être préparés à partir de matériels de départ facilement accessibles dans le commerce, en utilisant des méthodes de synthèse et de purification bien connues par l'homme du métier. Les schémas réactionnels pour la préparation de certains composés préférés de la présente invention sont illustrés dans les figures 1 à 3 et les méthodes de préparation de ces composés sont décrites en détails dans les exemples ci-dessous. Par ailleurs, une méthode de synthèse sur support solide (Byk G. et col. (1997) Tetrahedron Lett. 38 (18), 3219-3222) a été employée pour la préparation de certains polyacides aminés basiques comme intermédiaire de synthèse pour la préparation de composés de l'invention. Cette méthode est décrite en détail dans HN 0 H O H NH2 O un des exemples ci-dessous et le schéma réactionnel est illustré dans la figure 3. Les composés convenant aux fins de l'invention sont obtenus sous forme de sels qui peuvent être préparés par des techniques standard, comme illustré par exemple dans les schémas réactionnels des figures 1 et 2. Dans ces exemples, l'étape de formation de sels de trifluoroacétate correspond également à une étape de déprotection des fonctions amines et/ou guanidines des acides aminés basiques portés par les composés de l'invention. Un autre objet de l'invention concerne des compositions comprenant au moins un composé répondant à la formule (I), particulièrement des compositions cosmétiques et/ou pharmaceutique, ou encore des réactifs de laboratoire. Encore un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un composé répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, encore appelé agent de transfert, et au moins un acide nucléique ou un polynucléotide. Préférentiellement, l'agent de transfert et l'acide nucléique peuvent être présents en quantité telle que le rapport de charges positives de l'agent sur les charges négatives de l'acide nucléique peut être compris entre 0,1 et 50, préférentiellement entre 0,5 et 20. Ce rapport peut être ajusté aisément par l'homme du métier en fonction de l'agent utilisé, de l'acide nucléique et du type de cellules à transfecter. Avantageusement, selon l'invention, la composition peut comprendre une quantité d'agent de transfert comprise entre 1 et 12 nanomoles par pg d'acide nucléique, et de manière préférée entre 1 et 9 nanomoles d'agent de transfert par pg d'acide nucléique. Aux fins de la présente invention, l'acide nucléique peut être un acide désoxyribonucléique (ADN) ou un acide ribonucléotide (ARN) ou un acide nucléique modifié tels qu'un acide nucléique peptidique (�Peptide Nucleic Acids �, PNA), des oligonucléotides morpholinos ou des aptamères. Son origine n'importe pas : naturelle ou artificielle. Il peut être d'origine animale, humaine, végétale, bactérienne ou virale. Sa fonction à titre d'agent thérapeutique peut être un gène codant pour un polypeptide et/ou une protéine d'intérêt dans une cellule hôte ou peut être une fonction antisens venant contrôler l'expression d'un gène, sa transcription en ARN ou sa traduction en protéine. Il peut aussi agir en tant que ribozyme ou ARN interférents (ARNsi ou ARNsh ou ARNmi) avec l'expression d'un gène. Sous un aspect particulier l'acide nucléique code de manière opérante pour un polypeptide d'intérêt pharmaceutique qui, lors de son expression dans la cellule hôte, permet de pallier un disfonctionnement de l'organisme récepteur. Une composition selon l'invention est par conséquent utile en recherche et développement in vitro et in vivo ou en thérapie génique in vivo et ex vivo. L'acide nucléique peut aussi coder de manière opérante pour un polypeptide capable de générer une réponse immune à son encontre chez les humains ou les animaux ou d'induire une réponse immune. Par conséquent, une composition selon l'invention trouve une application particulière dans la thérapie génique, le domaine des vaccins, et de l'immunothérapie, notamment pour traiter ou prévenir des cancers ou des infections bactériennes ou virales. Pour usage dans les domaines de la thérapie génique, des vaccins et de l'immunothérapie, l'acide nucléique est avantageusement de l'ADN et comprend de préférence une cassette d'expression constituée d'une ou plusieurs séquences d'ADN codant le polypeptide d'intérêt sous contrôle d'un ou plusieurs prornoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles. Il peut être aussi un ARN de type ARNsi ou oligonucléotides antisense. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un agent de transfert répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, et au rnoins un polypeptide ou une protéine. Préférentiellement, l'agent de transfert et le polypeptide ou la protéine peuvent être présents en quantité telle que la quantité d'agent de transfert (composé de Formule (I)) peut être comprise entre 1 et 10 nanomoles d'agent de transfert selon l'invention par pg de polypeptide, et de rnanière préférée entre 1 et 3 nanomoles d'agent par pg de polypeptide. Aux fins de la présente invention, le polypeptide peut être un peptide ou une protéine d'intérêt pharmaceutique. La délivrance de polypeptides dans les cellules représente une alternative à la thérapie génique pour développer de nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre de nombreuses maladies telles que le cancer, les désordres inflammatoires et génétiques, les infections et les déficiences métaboliques comme le diabète. Parmi ces peptides et ces protéines d'intérêt, on peut citer par exemple les anticorps, les antigènes, les lymphokines, les interleukines, les facteurs de nécroses et d'apoptoses, les interférons, les facteurs de croissance, les activateurs de tissue plasminogène, le facteur VIII:c, l'énrthropoïétine, l'insuline, la calcitocine, la thimidine kinase, etc.. Une telle composition selon l'invention ouvre également de nouveaux champs d'investigation en protéomique pour l'élucidation de mécanismes moléculaires complexes. Par exemple, la délivrance dans les cellules de protéines impliquées dans les phénomènes d'apoptose peut aider à l'élucidation des mécanismes de mort cellulaire programmée. Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant un agent de transfert répondant à la formule (I) telle que définie précédemment, et au moins une molécule biologiquement active autre qu'un acide nucléique ou un polypeptide. II peut s'agir d'un principe actif, d'un polysaccharide, d'un lipide, d'un peptoide, etc... Par exemple, les peptoides peuvent être utilisés avec succès comme analogue des peptides d'intérêt thérapeutique. Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de s'associer au composé répondant à la formule (I), aux molécules biologiquement actives ou au complexe agent de transfert / molécules biologiquement actives et d'en améliorer le pouvoir transfectant et la pharmacologie. Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent comprendre comme adjuvant un ou plusieurs lipides neutres (zwitterioniques ou dépourvu de charges ioniques), anioniques ou cationiques. Préférentiellement, les lipides utilisés sont des lipides neutres à deux chaînes grasses, du cholestérol ou des dérivés du cholestérol. Ils peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) (Farhood H. et col., Biochim Biophys. Acta (1985), 1235-1289), I'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl-, dipalmitoyl-, dimyristoyl-, dilauroylphosphatidyléthanolamines (DSPE, DPPE, DMPE, DLPE), ainsi que leurs dérivés N-méthylés un à trois fois (DOPC, DPPC, DMPC), les phosphatidylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphyngomyélines), les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2), ou encore les éthers lipides. Des lipides comportant une seule chaîne grasse peuvent aussi être utilisés, parmi lesquels les lysophosphatides, les lysophosphatidylcholines, les lysophosphatidyléthanolamines, les Iysophosphatidylglycérols, les lysophosphatidylsérines ou encore les acides lysophosphatidique. Ces différents lipides peuvent être naturels ou synthétiques. Les adjuvants pouvant entrer dans la composition selon l'invention peuvent aussi être un ou plusieurs polymères, naturels ou synthétiques, co-polymères et/ou dendrimères. Ces polymères peuvent être cationiques tels que les polyamines, parmi lesquelles la polyéthylènimine, la polylysine, la polyornithine, ou encore le polybrène et le chitosane. Les polymères peuvent également être anioniques tels que l'acide polyglutamique, l'acide polypropylacrylique, l'acide hyaluronique et l'acide polylactique-co-glycolique (PGLA), ou neutres tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou encore certains polysaccharides tels que les galactomannanes. Les compositions selon l'invention peuvent aussi comprendre comme adjuvant des nanoparticules, notamment des particules magnétiques, des particules à base de composés organiques ou inorganiques. Les adjuvants peuvent également être des polypeptides, des protéines, des oses, du glycérol, des cyclodextrines, des histones, l'acide désoxycholique et tout autre � activateur � (� enhancer �) qui améliore l'efficacité de livraison et la pharmacologie. Les compositions peuvent aussi comporter des adjuvants capables de cibler spécifiquement un déterminant à la surface et/ou à l'intérieur des cellules. Ces éléments de ciblage peuvent être attachés de manière covalente ou non covalente au composé répondant à la formule (I) ou à toutes autres molécules contenues dans la composition comprenant le composé de formule (I). Ces éléments de ciblage peuvent être des ligands de récepteurs exprimés à la surface des cellules ciblés, par exemple un sucre, un folate, la transferrine, l'insuline, une hormone, un peptide, un anticorps, un métabolite, des vitamines ou toute autre molécule pouvant reconnaître un récepteur extracellulaire. Ils peuvent aussi être un élément de vectorisation intracellulaire pour cibler des compartiments spécifiques tels que les mitochondries, le noyau ou le cytoplasme, comme par exemple un signal de localisation nucléaire ou mitochondriale. D'une manière générale, l'élément de ciblage peut-être un sucre, un peptide, une protéine, un anticorps, un fragment d'anticorps, un ligand ou un fragment de ligands. L'adjuvant peut aussi être un fluorophore tel que la rhodamine, la fluorescéine ou la biotine. Les compositions selon l'invention peuvent aussi comprendre des virus, par exemple des lentivirus, des rétrovirus, des adénovirus, le virus de l'herpès, des baculovirus, et/ou des organismes unicellulaires, par exemple des bactéries, des levures, des champignons ou des parasites. Préférentiellement, les compositions selon l'invention ont un ratio molaire adjuvant / agent de transfert compris entre 0 et 20, et plus préférentiellement entre 0,5 et 3. L'invention s'étend également à toute composition telle que définie ci-dessus et comprenant en outre un ou plusieurs autres agents connus pour 10 transfecter les acides nucléiques, les polypeptides ou tout autre molécule biologiquement active. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un agent de transfert tel que défini précédemment pour le transfert d'acides nucléiques, de polypeptides ou de tout autre molécule biologiquement active dans les cellules. 15 Cette utilisation peut être dans tout domaine où le transport d'une molécule d'intérêt biologique est nécessaire. On pense en particulier aux domaines cosrnétique et/ou pharmaceutique, ou encore des réactifs de laboratoire. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé de Formule (I) pour la préparation d'une composition destinée au transfert d'acides nucléiques, 20 de polypeptides ou de tout autre molécule biologiquement active dans les cellules. L'invention concerne en outre l'utilisation d'une composition comprenant au moins un composé de Formule (I) pour le transfert d'acides nucléiques, de polypeptides ou de tout autre molécule biologiquement active dans les cellules. 25 Les compositions comprenant l'agent de transfert selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administration par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention 30 contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré ou pour une administration par voie topique. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutions injectables. Les doses d'acide nucléique, de polypeptide ou de tout autre molécule biologiquement active, utilisés pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe, dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation par injection ou greffe. L'invention se rapporte en outre à une méthode de transfert d'une molécule d'intérêt biologique dans des cellules, comprenant les étapes suivantes : 1. la mise en contact de la molécule d'intérêt biologique avec un agent de transfert répondant à la formule (I) tel que défini ci-dessus, ou avec une composition telle que définie précédemment pour former un complexe molécule active / agent de transfert, 2. la mise en contact des cellules avec le complexe formé en 1. Selon l'invention, à l'étape 2, l'ordre d'addition des cellules et/ou des complexes est indifférent. Préférentiellement, cette méthode est utilisée in vitro et/ou dans des expériences réalisées avec des cellules préalablement isolées et/ou in vivo. Dans le cas d'une composition comprenant un ou plusieurs autres agents de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvants, la méthode selon l'invention peut en outre comprendre une ou plusieurs étapes de mise en contact de l'agent de transfert selon l'invention avec différents agents de transfection et/ou avec le ou les adjuvants. Avantageusement selon l'invention, l'étape 1 peut être précédée d'une étape de mise en contact du composé de formule (I) avec d'autres agents de transfection et/ou avec le ou les adjuvants. Les complexes agent de transfert selon l'invention / molécule biologiquement active sont formés en mélangeant deux solutions contenant l'une la composition à base de l'agent de transfert selon l'invention, en présence ou en absence d'un ou plusieurs adjuvant et/ou d'un ou plusieurs autres agents de transfection, et l'autre la molécule biologiquement active à délivrer en présence ou en absence d'un ou plusieurs adjuvant et/ou d'un ou plusieurs autres agents de transfection. Les complexes se forment en quelques secondes et peuvent être chargés négativement, positivement, ou être neutres, en fonction de la quantité de lipide ajoutée à la molécule à transporter. La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (utilisation in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (utilisation in vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence par exemple de 0,01 à 1000 pg de molécule d'intérêt biologique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses de molécules actives allant de 0,01 à 10 mg peuvent être utilisées. Les agents de transfert selon l'invention sont particulièrement intéressants pour leur utilisation dans le transfert de molécules biologiquement actives dans les cellules primaires ou dans des lignées établies. II peut s'agir de cellules eucaryotes telles que endothéliales, épithéliales, fibroblastiques, hépatiques, hématopoïétiques (lymphocytes, monocytes, macrophages, dendritiques, etc...), musculaires, nerveuses (neurones, cellules gliales, astrocytes), etc... Il peut également s'agir de cellules procaryotes (bactéries) et végétales, de cellules d'insectes, des levures ou de parasites. Elles peuvent se présenter sous forme différenciées ou pluripotentes. L'invention a aussi pour objet des kits de transfert de matériel biologiques comprenant au moins un composé de Formule (I) ou au moins une composition comprenant au moins un composé de Formule (I), et éventuellement d'autres solutions utiles à la réalisation d'un transfert de matériel biologique. Les intéressantes propriétés des composés selon l'invention permettent d'envisager de nombreuses autres utilisations comme en particulier l'utilisation comme adjuvant dans une composition, particulièrement dans un vaccin. Les définitions suivantes sont fournies pour faciliter la compréhension de certains termes utilisés fréquemment dans cet exposé : • Par "molécule biologiquement active " ou "molécule active" ou "agent biologiquement actif " ou "molécule d'intérêt biologique " ou "principe actif', on entend toute molécule ou macromolécule ayant une activité spécifique dans les cellules et qui trouve des applications dans de nombreux domaines allant de la biologie cellulaire à la médecine. Il peut s'agir d'acides nucléiques (ADN, ARN...), de polypeptides, de protéines, de principes actifs, de polysaccharides, de peptoides, etc... • Par " polypeptide " on entend tout enchaînement d'acides aminés quelle que soit sa taille. Ainsi, ce terme recouvre notamment les notions de peptides et 5 de protéines. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée. 10 Notamment, la demanderesse propose à titre non limitatif divers protocoles opératoires ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis en oeuvre pour préparer les agents de transfert selon l'invention. II est bien entendu à la portée de l'homme du métier de s'inspirer de ces protocoles ou produits intermédiaires pour mettre au point des procédés analogues en vue de conduire 15 à ces mêmes composés. Figures : Fiqure 1 : Schéma réactionnel pour la synthèse du 181GSCO Id (composé de Formule 1.6) dans lequel à chaque étape les réactifs et conditions utilisés sont : 20 i) Successivement a. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-Hydroxysuccinimide (NHS), Dichlorométhane / N,N'-Diméthylformamide (CH2Cl2 / DMF), Température Ambiante (TA) (environ 25°C) ; b. Dichlorure de cystamine, Triéthylamine (TEA), DMF, TA ; 25 ii) Successivement a. Dioleoylglycerosuccinate (DOGS), DCC, NHS, CH2Cl2/ DMF, TA ; b. TEA, CH2Cl2, TA ; iii) Acide trifluoroacétique (CF30OOH), CH2Cl2, TA. Figure 2 : Schéma réactionnel pour la synthèse du 181GSGIu(CO)2 4e 30 (composé de Formule 1.15) dans lequel à chaque étape les réactifs et conditions utilisés sont : i) Successivement a. N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), Hydroxybenzotriazole (HOBt), CH2Cl2/ DMF, TA ; b. L-Glutamate de di-tert butyl (H-Glu(OtBu)-OtBu), CH2Cl2, TA ; ii) CF3COOH, CH2Cl2, TA; iii) Successivement a. DIC, HOBt, CH2Cl2/ DMF, TA ; b. Boc-Orn(Boc)-NH-(CH2)2-S-S-(CH2)2-NH2 lb, TEA, CH2Cl2, TA ; iv) CF3COOH, CH2Cl2, TA. Figure 3 : Schéma réactionnel pour la synthèse sur support solide de la bis- lysine 5e, utilisé ensuite comme intermédiaire de synthèse pour la préparation du 10 181GSCL2 5f (composé de Formule 1.18) dans lequel à chaque étape les réactifs et conditions utilisés sont : i) Diisopropyléthylamine (DIPEA), CH2Cl2, TA ; ii) Tris-(2-aminoethyl)amine, CH2Cl2, TA ; iv) Na,Nc-di-tert-butyloxycarbonyl-L-Lysine (Boc-Lys(Boc)-OH), DIC, 15 HOBt, CH2Cl2, TA ; v) CF3CH2OH, CH2Cl2, TA. Figure 4A: histogramme représentant l'activité de transfert (% de cellules transfectées) in vitro de la formulation lipidique 181GSCO (composé de Formule 1.6) / DOPE pour le transport d'ADN (pCMV-EGFP) dans plusieurs lignées 20 cellulaires (Vero, NiH3-T3, A549, PC-12). Figure 4B : histogramme représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation lipidique 181GSCO (composé de Formule 1.6) / DOPE pour le transport d'ADN (pCMV-LacZ) dans les cellules Vero (quantité de 33-galactosidase), en fonction de la quantité d'ADN (pg) et de la quantité de lipide 25 formulé (0,5, 1, 2 pI). Figure 5 : Histogramme représentant l'activité de transfert (intensité de fluorescence) in vitro de 181GSCR (composé de Formule 1.7), formulé avec du DOPE ou du cholestérol, pour le transport d'ADN (pCMV-EGFP) dans les cellules NiH3-T3, en fonction de la quantité d'ADN et de la quantité de lipide 30 formulé. Figure 6 : Histogramme représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation lipidique 181GSCO (composé de Formule 1.6) formulée ou non avec différents ratio de DOPE dans les cellules Hela-GFP pour le transport d'ARN Si (antti-GFP) (% d'inhibition de l'expression de la GFP). Figure 7. Histogramme représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation lipidique 181GSCR (composé de Formule 1.7) / DOPE dans les cellules Hela-GFP pour le transport d'ARN Si (anti-GFP) (% d'inhibition de l'expression de la GFP), en fonction de la concentration en ARN Si (en nM) et du temps d'incubation exprimé en heures. Fiqure 8A, 8B, 8C : Photos représentant l'activité de transfert in vitro des formulations : - 181GSCO (composé de Formule 1.6) / DOPE, pour le transport o d'IgG de chèvre marqué à la fluorescéine dans des cellules NiH3-T3 (Fig. 8A), o de R-Phycoerythrine dans des cellules Vero (Fig. 8B), o de f3-Galactosidase dans des cellules Hela, (Fig. 8C), - 181 GSCR (composé de Formule 1.7) / DOPE, pour le transport o d'IgG de chèvre marqué à la fluorescéine dans des cellules NiH3-T3 (Fig. 8D), et 181 GIuO2 (composé de Formule 1.11) / DOPE pour le transport o de R-Phycoerythrine dans des cellules Hela (Fig. 8E), Figure 9A et B : Courbes représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation 181GSCO (composé de Formule 1.6) / DOPE dans les cellules NiH3-T3 pour le transport d'un anticorps IgG de chèvre marqué à la fluorescéine. L'activité de transfert est déterminée en % de cellules fluorescentes (Fig. 9A) et en quantité de protéines internalisées dans les cellules (Fig.9B) en fonction du temps d'incubation. Figure 10A et B : Histogrammes représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation lipidique 181GIuO2 (composé de Formule 1.11) / DOPE dans les cellules en suspension Jurkat pour le transport d'ADN (pCMV-EGFP), en fonction de la quantité de lipide formulé (pI). L'activité de transfert est déterminée en quantité de GFP exprimées dans les cellules (Fig. 10A), et en % de cellules fluorescentes (Fig.10B). Figure 11 : Histogramme représentant l'activité de transfert (intensité de fluorescence) in vitro des lipides 181 GSCR (composé de Formule 1.7) et 181 GSGIu(CO)2 (composé de Formule 1.15) formulé avec DOPE dans les cellules en suspension Jurkat pour la délivrance intracellulaire d'un ARN-Si fluorescent. Figure 12 : Photo représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation 181 GSCO (composé de Formule 1.6) / DOPE dans les cellules en suspension 5 Jurkat pour le transport d'une protéine (BSA) marquée à la TRITC. Figure 13 : Photo représentant l'activité de transfert in vitro de la formulation 181 GIuO2 (composé de Formule 1.11) / DOPE dans les neurones primaires pour le transport d'ADN (pCMV-EGFP). Fiqure 14 : Histogramme représentant la quantité totale de protéines (erg) 10 exprimées par les cellules Hela en fonction de la quantité de lipides 1.6, 1.7 et 1.11 formulés avec du DOPE (pM). Les cellules ont été incubées 48 h avec ou sans lipides dans une plaque 96 puits et la quantité de protéines par puits a été déterminée par un test de Bradford. Exemples : 15 A. SYNTHESES D'AGENTS DE TRANSFERT SELON L'INVENTION a) Matériel La majorité des réactifs et des solvants proviennent de chez Merck (Darmstadt, Allemagne), VWR Prolabo (Briare, France), Sigma-Aldrich SARL (Saint Quentin Fallavier, France) et Fluka (Division de Sigma-Aldrich, Saint 20 Quentin Fallavier, France). Les dérivés de glycérolipides (DOGS, DPGS, DMGS, DLGS) proviennent de chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Les acides aminés protégés (Boc-Orn(Boc)-OH, Boc-Lys(Boc)-OH, Boc-Arg(Boc)2-OH, HGlu(OtBu)-OtBu.HCI) proviennent de chez Bachem Biochimie SARL (Voisin-le-Bretonneux, France). Tous les solvants anhydre proviennent de chez Sigma- 25 Aldrich et Fluka et utilisés tels quels. b) Méthodes • Techniques de chromatographie Les chromatographies sur couches minces (CCM) sont réalisées sur des plaques d'aluminium 5 x 7,5 cm recouvertes de gel de silice 60 F254 (Merck). 30 Les composés sont révélés sous lumière UV (X = 254 nm), à l'iode, par immersion dans un révélateur à la ninhydrine (0,2 % dans le butanol) suivi d'une étape de chauffage à 150°C pour les composés possédant une fonction amine primaire, ou par immersion dans un révélateur au cérium / molybdate (H2O / H2SO4 concentré / (NH4)6Mo7O24.4H2O / Ce(SO4)2.3H2O : 90 / 10 / 15 / 1) suivi d'une étape de chauffage à 110°C pour les composés soufrés. Les produits de synthèse sont purifiés sur colonnes de chromatographie sur silice. Les séparations chromatographiques flash sont effectuées sur gel de silice 5 60 (230-400 mesh ASTM) (Merck). • Spectrométrie de masse Préparation des échantillons : Les produits à analyser sont dissous (0,01 mg.mL-1) dans un mélange méthanol/eau 50/50 (v/v) ou acétonitrile/eau 50/50 (v/v) et les solutions sont 10 directement introduites (5pL.min-l) dans la source électrospray par l'intermédiaire d'une pompe à seringue (Harvard Apparatus, Les Ulis, France). Appareillage : Les spectres de masse sont réalisés sur un appareil Waters-Micromass (Manchester, U.K.) Q-TOF équipé d'une source d'ion électrospray assistée 15 pneumatiquement (Z-Spray). L'azote est utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 250 et 50 L/h, respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement fixées à 80 et 150 °C. La tension du capillaire est de � 180 V (� ESI). Pour les expériences de dissociation induite par collision (CID : Collision Induced 20 Dissociation), l'argon est utilisé comme gaz de collision, à une pression de l'analyseur indiqué à 5 x 10-5 Torr et une énergie de collision réglée à 90 V. Les mesures de masse exacte sont effectuées sur un appareil Waters-Micromass (Manchester, U.K.) LCT, équipé d'une source électrospray assistée pneumatiquement (Z-spray), et muni d'un nébulisateur additionnel (Lockspray) 25 pour le composé de référence (Nal). L'azote est utilisé comme gaz de désolvatation et de nébulisation avec un débit de 500 et 20 L/h, respectivement. Les températures de la source et du gaz de désolvatation sont respectivement fixées à 80 et 120 °C. La tension du capillaire est de � 3,0 kV et la tension de cône de � 100 V (� ESI). 30 Les spectres sont accumulés à une vitesse de 3 secondes par scan pour une gamme de masse comprise entre 100 et 3500 uma. La résolution utilisée est de 9000 FWHM pour le Q-TOF et 3000 FWHM pour le LCT. L'acquisition des données et leur traitement sont réalisés avec le programme MassLynx V3.5. • Couplage LC/MS Certains composés sont analysés par Chromatographie Liquide Haute Performance couplé à la Spectrométrie de Masse (LC/MS). La CLHP est réalisée avec un appareil Waters Alliance 2695, muni d'une colonne analytique Alltech PrevailTM C18 (Lexington, KY, USA). La détection est effectuée en sortie de colonne CLHP par un spectromètre de masse Waters-Micromass Q-TOF. c) Synthèses Exemple 1 : Préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Cystamido-Ornithine (composé Id : 181GSCO) On obtient le 181GSCO, ou composé Id, de formule : o H N'-''iS'S'-''iN OO TFA~ NH3 � O NH3 TFA o H Id en trois étapes à partir de la Na,N,-di-Boc-ornithine la (Figure 1) H N 0 o o la 2.1 Etape 1 : préparation du Cystamido-di-Boc-Ornithine (lb) 0 H HN H H2NSSN Nuo o o lb Dans un ballon de 100 mL sec, la Na,Nc-di-Boc-ornithine la (1,22 mmol ; 406 mg) est préalablement placée sous atmosphère inerte puis dissoute dans 20 mL de CH2Cl2 anhydre sous agitation. Le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) fraîchement recristallisé (1,83 mmol ; 378 mg) et en solution dans 5mL de CH2Cl2 anhydre, puis le N-Hydroxysuccinimide (NHS) (1,83 mmol ; 211 mg) en solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un ballon de 25 mL, le dichlorure de cystamine (6,1 mmol ; 1,37 g) est dissous dans 1 mL d'eau. A cette solution, est ajoutée de la triéthylamine (12,2 mmol ; 1,7 mL) sous agitation, puis 10 mL de DMF. Cette solution est agitée pendant 10 minutes à 50°C puis immédiatement ajoutée au milieu réactionnel. Après 24h d'agitation à température ambiante, un important précipité s'est formé dans le milieu réactionnel. La mixture est alors filtrée, le gâteau est lavé avec CH2Cl2 (2 x 20 mL), et les filtrats ainsi obtenus sont regroupés et évaporés sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (élution : CH2Cl2/MeOH 95/5 puis 8/2 (v/v)). On isole ainsi 260 mg du composé 1 b soit un rendement de 46 %. CCM : Rf 1 b = 0,6 (CH2Cl2 / MeOH 8/2 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 467, 1 [M+H]+, calculé à 467,2 pour C19H39N4O5S2. 2.2 Etape 2 : préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Cystamidodi-Boc-Ornithine (1c) 1c Dans un ballon de 100 mL sec, le 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Succinate (DOGS) (0,485 mmol ; 350 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte puis est dissous dans 20 mL de CH2Cl2 anhydre sous agitation. Le DCC fraîchement recristallisé (0,727 mmol ; 150 mg) et en solution dans 5 mL de CH2Cl2 anhydre, puis le NHS (0,727 mmol ; 84 mg) en solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un ballon de 10 mL sec, le composé lb (0,535 mmol ; 250 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte, puis dissous dans 10 mL de CH2Cl2 anhydre. A cette solution, est ajoutée de la triéthylamine (0,535 mmol ; 75 pL) sous agitation. La solution est agitée pendant 10 min à /'o température ambiante puis additionnée au milieu réactionnel. Après 24 h d'agitation à température ambiante sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (gradient d'élution de 0 à 5% MeOH dans CH2Cl2). On isole ainsi 414 mg du composé 1c soit un rendement de 73 %. CCM : Rf 1c = 0,8 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 1169, 6 [M+H]+, calculé à 1169,8 pour C62H113N4O12S2 ; m/z mesuré à 569,4 [M+H+Na]2+, calculé à 569,4 pour C62H113N4O12S2Na. 2.3 Etape 3 : Préparation du 181GSCO (Id) o H N~~S Si~N~o H ----Ni-13 TFAG OH o Id NH3 O 0 TFA Dans un ballon de 50 mL, le composé 1c (0,342 mmol ; 400 mg) est dissous dans 8 mL de CH2Cl2, puis 2 mL d'acide trifluoroacétique sont ajoutés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 1 h sous agitation à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Pour chasser les traces d'acide trifluoroacétique en excès, le résidu final est repris 3 fois de suite dans 5 mL de dichlorométhane puis évaporé à sec. On isole ainsi 410 mg du composé Id sous forme d'un sel de trifluoroacétate. La réaction est quantitative. Le rendement total de la synthèse (3 étapes) est de 34%. CCM : Rf Id = 0,1 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) CLHP : Rt = 39,73 min (gradient ternaire H2O / CH3CN / CH3CN + 10 % CH3COOH, Débit = 1 mUmin). ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 969;6739 [M+H]+, calculé à 969,6748 pour C52H97N408S2 (déviation : 0,9 ppm). Exemple 2 : Préparation de la DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Cystamido-Arginine 2d (181GSCR) On obtient le 181GSCR, ou composé 2d, de formule : o N H NH2 TFA g 2d en trois étapes à partir de la Na,N(,,Nw,-tris-Boc-L-Arginine 2a. o HN0 0 H HO N~NH N0 o 2a 2.1 Etape 1 : préparation de la Cystamido-tris-Boc-L-Arginine (2b) o o o 2b o Dans un ballon de 250 mL sec, la Nî,Nw,N(Aris-Boc-L-Arginine 2a (1, 21 mmol ; 875 mg) est préalablement placée sous atmosphère inerte puis dissoute dans 30 mL de DMF anhydre sous agitation. Le N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) (1,82 mmol ; 282 pL), puis le N-Hydroxysuccinimide (NHS) (1,82 mmol ; 209 mg) en solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un ballon de 50 mL, le dichlorure de cystamine (6,1 mmol ; 1,37 g) est dissous dans 2 ml_ d'eau. A cette solution est ajoutée de la triéthylamine (12,2 mmol ; 1,7 mL) sous agitation, puis 20 mL de DMF. Cette solution est agitée pendant 5 minutes à 50°C puis immédiatement ajoutée au milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 24 h sous agitation à température ambiante. Les solvants sont ensuite évaporés sous vide primaire jusqu'à obtenir un résidu huileux de 1 à 2 mL. Ce résidu est repris dans 50 mL de CH2Cl2 sous agitation. Le précipité qui s'est formé est alors filtré et lavé avec du CH2Cl2 (2 x 10 mL). Les filtrats sont recueillis et évaporés sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (élution : CH2Cl2/MeOH 95/5 puis 9/1 (v/v)). On isole ainsi 345 mg du composé 2b soit un rendement de 47 %. CCM : Rf 2b = 0,6 (CH2Cl2 / MeOH 8/2 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 609,2 [M+H]+, calculé à 609,3 pour 10 C25H49N607S2. 2.2 Etape 2 : préparation de la DiOleoyl-Glycero-Succinyl- Cystamido-tris-Boc-L-Arginine (2c) o 2c Dans un ballon de 250 mL sec, le 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Succinate 15 (DOGS) (0,33 mmol ; 240 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte puis est dissous dans 20 mL de CH2Cl2 anhydre sous agitation. Le DCC fraîchement recristallisé (0,50 mmol ; 103 mg) et en solution dans 5 mL de CH2Cl2 anhydre, puis le NHS (0,50 mmol ; 58 mg) en solution dans 5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction 20 est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un ballon de 50 mL sec, le composé 2b (0,50 mmol ; 305 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte, puis dissous dans 15 mL de CH2Cl2 anhydre. A cette solution, est ajoutée de la triéthylamine (0,50 mmol ; 70 pL) sous agitation. La solution est agitée pendant 10 min à température ambiante 25 puis additionnée au milieu réactionnel. Après 24 h d'agitation à température ambiante sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (gradient d'élution de 0 à 2 % MeOH dans CH2Cl2). On isole ainsi 239 mg du composé 2c soit un rendement de 55 %. CCM : Rf 2c = 0,9 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 1311,7 [M+H]+, calculé à 1311,9 pour C68H123N6014S2 ; m/z mesuré à 667,4 [M+H+Na]2+, calculé à 667,4 pour C68H123N6O14S2Na. 2.3 Etape 3 : Préparation du 181GSCR (2d) Dans un ballon de 50 mL, le composé 2c (0,17 mmol ; 220 mg) est dissous dans 5 mL de CH2Cl2, puis 5 mL d'acide trifluoroacétique sont ajoutés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 1 h sous agitation à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Pour chasser les traces d'acide trifluoroacétique en excès, le résidu final' est repris 3 fois de suite dans 5 mL de dichlorométhane puis évaporé à sec. On isole ainsi 210 mg du composé 2d sous forme d'un sel de trifluoroacétate. La réaction est quantitative. Le rendement total de la synthèse (3 étapes) est de 26 %. CCM : Rf 2d = 0,1 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) CLHP : Rt = 39,46 min (gradient ternaire H2O / CH3CN / CH3CN + 10 % CH3COOH, Débit = 1 mL/min). ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 20 1011,6984 [M+H]+, calculé à 1011,6966 pour C53H99N6O8S2 (déviation : 1,8 ppm). Exemple 3 : Préparation du DiLauroyl-Glycero-Succinyl-Cystamido-Lysine (3) (12GSCL) O O 0 H - NH3 TFAe 3 TFA0 H3N~ La procédure de synthèse est identique à la synthèse du 181GSCO 25 (Exemple 1) mais en utilisant la Na,N5-di-Boc-L-Lysine au lieu de la Na,NE,-di-Boc-L-Ornithine et le 1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3- Succinate (DLGS) au lieu du 1,2-C)ioleoyl-sn-Glycero-3-Succinate (DOGS). On obtient un rendement total de 31 %. CCM : Rf 3 = 0 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 819,5356 [M+H]+, calculé à 819,5339 pour C40H77N408S2 (déviation : 2,1 ppm). Exemple 4 : Préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Glutamido-bis- (Cystamido-Ornithine) : 181GSGIu(CO)2 ; (Composé 4e : Figure 2) On obtient le 181GSGIu(CO)2, ou composé 4e, de formule : H NH3TF N~~S~S~~NX v v re3 TFn ' H H O 4e O N /~S~S~~N(~ 3TF H 0NH2 `TFA en quatre étapes à partir du 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Succinate(DOGS) 4a (Figure 2). O O O HONH O o o C17H33O H C17H33 yo0 o o OH 4a 4.1 Préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-di-OtBu-Glutamate (4b) Dans un ballon de 10 mL sec, le 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Succinate (DOGS) 4a (0,031 mmol ; 22,5 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte puis est dissous dans 3 mL de CH2Cl2 anhydre sous agitation. Le DIC (0,047 mmol ; 7,3 pL) puis, HOBt (0,047 mmol ; 6,4 mg) en solution dans 500 pL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un deuxième ballon de 5 mL sec, le H-Glu(OtBu)- OtBu.HCI (0,047 mmol ; 14 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte, puis dissous dans 500 pL de CH2Cl2 anhydre. A cette solution, est ajoutée de la o i' H H o O 4b triéthylamine (0,047 mmol ; 6,6 pL) sous agitation. La solution est agitée pendant 10 min à température ambiante puis additionnée au milieu réactionnel. Après 24 h d'agitation à température ambiante sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (gradient d'élution de 0 à 1 % MeOH dans CHCI3). On isole ainsi 28,1 mg du composé 4b soit un rendement de 93 %. CCM : Rf 4b = 0,9 (CHCI3 / MeOH / AcOH 95/5/0,2 (v/v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 984,8 [M+Naj+, calculé à 984,7 pour 10 C56H99NO11 Na. 4.2 Préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Glutamate (4c) o o o o 4c o Dans un ballon de 10 mL, le composé 4b (0,026 mmol ; 25,5 mg) est dissous dans 1,6 mL de CH2Cl2, puis 400 pL d'acide trifluoroacétique sont 15 ajoutés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 1 h sous agitation à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Pour chasser les traces d'acide trifluoroacétique en excès, le résidu final est repris 3 fois de suite dans 5 mL de dichlorométhane puis évaporé à sec. On isole ainsi 24, 4 mg du composé 4c. La réaction est quantitative. 20 CCM : Rf 4c = 0,1 (CHCI3 / MeOH / AcOH 95/5/0,2 (v/v/v) ; Rf 4b = 0,9) ESI-MS + : m/z mesuré à 871,6 [M+Na)+, calculé à 871,6 pour C48H82N011 Na. 4.3 Préparation du DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Glutamido- di(Cystamido-di-Boc-Ornithine) (4d) oJ O ( H 0 00NNN N0k O H IOI H HN0 O H O o 4d Dans un ballon de 10 mL sec, le composé 4c (0,015 mmol ; 12,5 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte puis est dissous dans 3 mL de CH2>Cl2 anhydre sous agitation. Le DIC (0,045 mmol ; 7,0 pL) puis, HOBt (0,045 mmol ; 6,1 mg) en solution dans 0,5 mL de DMF anhydre, sont successivement additionnés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue 2 h sous agitation et sous atmosphère inerte à température ambiante. Dans un deuxième ballon de 10 mL sec, le composé lb (synthèse décrite précédemment dans l'exemple 1) (0,045 mmol ; 21,0 mg) est préalablement placé sous atmosphère inerte, puis dissous dans 1,5 mL de CH2Cl2 anhydre. A cette solution, est ajoutée de la triéthylamine (0,045 mmol ; 6,2 pL) sous agitation. La solution est agitée pendant 10 min à température ambiante puis additionnée au milieu réactionnel. Après 24 h d'agitation à température ambiante sous atmosphère inerte, la réaction est stoppée et le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Le produit de couplage est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice (gradient d'élution de 0 à 5 % MeOH dans CH2Cl2). On isole ainsi 20,6 mg du composé 4d soit un rendement de 80 %. CCM : Rf 4d = 0,35 (CH2Cl2 / MeOH 95/5 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 1769,2 [M+Naj+, calculé à 1769,0 pour 20 C86H155N9O19S4Na. 4.4 Préparation du 181GSGIu(CO)2 (4e) Dans un ballon de 10 mL, le composé 4d (0,011 mmol ; 20 mg) est dissous dans 1,6 mL de CH2Cl2, puis 400 pL d'acide trifluoroacétique sont ajoutés dans le milieu réactionnel. La réaction est alors maintenue pendant 1 h sous agitation 25 à température ambiante. Le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide primaire. Pour chasser les traces d'acide trifluoroacétique en excès, le résidu final est repris 3 fois de suite dans 5 mL de dichlorométhane puis évaporé à sec. On isole ainsi 19,5 mg du composé 4e sous forme d'un sel de trifluoroacétate. La réaction est quantitative. CCM : Rf 4e = 0 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v) ; Rf 4d = 0,9) ESI-MS + : m/z mesuré à 1346,9 [M+H]+, calculé à 1346,8 pour 5 C66H124N9011S4 ; m/z mesuré à 1368,9 [M+Na]+, calculé à 1368,8 pour 0661-1123N9011 S4Na. Exemple 5 : Préparation de la DiOleoyl-Glycero-Succinyl-Cystamidobis-Lysine (5f) (181GSCL2) On obtient le 181GSCL2, ou composé 5f, de formule : à partir du composé bis-lysine 5e dont la préparation est décrite ci-dessous. 5.1 Préparation d'une bis-Lysine branchée comme précurseur de synthèse des agents de transfert : synthèse de [Boc-Lys(Boc)-NH-(CH2)2]2-N-(CH2)2-NH-CH2-COOH (5e) par SPPS (Figure 3) 15 On obtient le composé 5e, de formule : 10 O H HON 5e o NH en quatre étapes à partir de la résine Chlorotrityl chloride 5a (Figure 3) 20 ci • Etape 1 : ancrage d'une fonction acide sur un support polymérique 5a pour obtenir le composé 5b o 0,vxoBr 5b De la résine Chlorotrityl chloride 5a (1,4 mmol Cl / g résine ; 5 g) est chargée dans un réacteur SPPS, 50 mL de CH2Cl2 sont ajoutés et le mélange est agité pendant 5 min. De l'acide bromoacétique (8,5 mmol ; 1,2 g) est ajouté, suivi de DIPEA (9 mmol ; 1,5 mL). Le réacteur est agité pendant 2 h à température ambiante. Le liquide est filtré et la résine est lavée successivement avec CH2Cl2 et iPrOH (10 x 50 mL) puis avec MeOH (2 x 50 mL). Enfin, la bromoacétyl-résine obtenue (composé 5b, Figure 3) est séchée sous un courant d'azote. • Etape 2 : Couplage du tris-(2-aminoéthyl)amine avec la brornoacetyl-résine 5b pour obtenir le composé 5c o NH2 H 5c NH2 Le tris-(2-aminoethyl)amine (70 mmol ; 10,2 g) est dissous dans 50 mL CH2Cl2 et chargé dans le réacteur contenant la bromoacétyl-résine 5b (étape 1). Le réacteur est agité pendant 2 h à température ambiante. Le solvant est filtré et la résine lavée successivement avec CH2Cl2 et iPrOH (10 x 50 mL). Enfin, la bisaminoéthyl-résine obtenue (composé 5c, Figure 3) est séchée sous un courant d'azote. Le test de Kaiser est positif. • Etape 3 : Couplage de la Na,NÈ di-Boc-L-Lysine avec la bis-aminoéthyl-résine 5c pour obtenir le composé 5d30 10 Les Na,N,-di-BocL-Lysine (28 mmol ; 9,70 g) et 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) (30 mmol ; 4,05 g) sont dissous dans 50 mL CH2Cl2 / DMF 4 / 1 (v/v). Le DIC (30 mmol ; 5,1 mL) est additionné à la solution d'acide aminée et le milieu réactionnel est maintenu sous agitation et sous atmosphère inerte pendant 30 min.. La solution est ensuite chargée dans le réacteur contenant la bis- 15 aminoéthyl-résine 5c (étape 2). Le réacteur est agité pendant 18 h à température ambiante. Le solvant est filtré et la résine lavée successivement avec CH2Cl2 et iPrOH (10 x 50 mL) puis avec MeOH et éther (2 x 50 mL). Enfin, la bis-(di-Boc-Lysine)-résine obtenue (composé 5d, Figure 3) est séchée sous un courant d'azote. Le test de Kaiser est négatif. 20 • Etape 4 : Clivage de la bis-(di-Boc-Lysine)-résine 5d pour obtenir le composé 5e O NH 5e HO La bis-(di-Boc-Lysine)-résine 5d (étape 3) est chargée dans un ballon de 250 mL équipée d'un barreau magnétique. Une solution composée de 50 mL de 25 CH2Cl2 et 25 mL de CF3CH2OH est ajoutée et le mélange est agité pendant 2 h à température ambiante. La solution est filtrée, la résine est lavée avec CH2Cl2 (2 x 10 rnL) et les phases organiques ainsi obtenues sont rassemblées et évaporées sous vide primaire. Le produit clivé est ensuite purifié par flash chromatographie sur gel de silice avec comme éluant CH2Cl2 / MeOH 9 / 1 (v/v). On isole ainsi 1,98 g du composé 5e soit un rendement total de 34 % à partir de la résine Chlorotrityl chloride. CCM : Rf 5e = 0,4 (CHCI3 / MeOH 9/1 (v/v)) ESI-MS + : m/z mesuré à 854,4 [M+Na]+, calculé à 854,5 pour C38H71 N8O12Na. 5.2 Préparation de 181GSCL2 (5f) NH3 TFÀj NS^s'•.NIr, NN^^, NH H o H 5f o La procédure de synthèse est identique à la synthèse du 181GSCO (Exemple 1) mais en utilisant le composé 5e au lieu de la Na,Nc-di-Boc-ornithine 15 (la). On obtient un rendement total de 25 %. CCM : Rf 5f = 0 (CH2Cl2 / MeOH 9/1 (v/v)) ESI-HRMS (haute résolution avec détection en mode positif) : m/z mesuré à 1269,9072 [M+H]+, calculé à 1269,9021 pour C65H125N10O10S2 (déviation : 4,0 ppm). 20 B. PREPARATION DE FORMULATIONS CYTOFECTANTES A PARTIR DES AGENTS DE TRANSFERT SELON L'INVENTION Exemple 6 : Formulation sous forme de liposomes, vésicules ou micelles dans l'eau Un des lipides cationiques décrits dans les exemples précédents est 25 dissous à une concentration donnée dans du chloroforme. D'autre part, un co- lipide (dioléoylphosphatidyléthanolamine, dioléoylphosphatidylcholine, cholestérol, cholestérol-amine...) est également dissous à une concentation donnée dans du chloroforme. En combinant différentes quantités de ces deux solutions dans un pilulier, différentes compositions d'un mélange de lipide cationique et de co- lipide sont obtenues. Le chloroforme est ensuite évaporé sous vide primaire pour obtenir un film lipidique le long des parois du pilulier. Ce film est réhydraté avec une quantité donnée d'eau déionisée stérile. Après complète réhydratation du film, la dispersion est soumise à sonication pour forrner de petits liposomes unilamellaires. Par exemple, on mélange dans un pilulier 600 pL (6 mg ; 5 pmol) d'une solution de 181GSCO (exemple 1) à 10 mg.mL-' dans du chloroforme et 372 pL (3,72 mg ; 5 pmol) d'une solution de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) à 10 Img.mL-i dans du chloroforme. Le chloroforme est évaporé à sec sous vide primaire et le film lipidique obtenu est remis en suspension dans 5 mL d'eau déionisée stérile. Après réhydratation pendant une nuit à 4°C, la dispersion est soumise à sonication pendant 15 minutes. Exemple 7 : Formulation sous forme de liposomes, vésicules ou 15 micelles par injection éthanolique dans l'eau Un des lipides cationiques décrits dans les exemples précédents est dissous à une concentration donnée dans du chloroforme. D'autre part, un colipide (dioléoylphosphatidyléthanolamine, dioléoylphosphatidylcholine, cholestérol, cholestérol-amine...) est également dissous à une concentration 20 donnée dans du chloroforme. En combinant différentes quantités de ces deux solutions dans un pilulier, différentes compositions d'un mélange de lipide cationique et de co-lipide sont obtenues. Le chloroforme est ensuite évaporé sous vide primaire pour obtenir un film lipidique le long des parois du pilulier. Ce film est alors re-dissous dans une petite quantité d'éthanol (entre 3 et 5 % du 25 volume finale de la formulation). Cette solution éthanolique est ensuite injectée rapidement à l'aide d'une seringue Hamilton dans un volume donné d'eau deionisée sous agitation. Par exemple, on mélange dans un pilulier 600 pL (6 mg ; 5 pmol) d'une solution de 181GSCO (exemple 1) à 10 mg.mL-' dans du chloroforme et 372 pL 30 (3,72 mg ; 5 pmol) d'une solution de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) à 10 rng.mL-' dans du chloroforme. Le chloroforme est évaporé à sec sous vide primaire et le film lipidique obtenu est re-dissous dans 150 pL d'éthanol. La solution éthanolique est ensuite injectée rapidement à l'aide d'une seringue Hamilton dans un ballon contenant 5 mL d'eau déionisée sous forte agitation. L'agitation est maintenue pendant quelques minutes. Exemple 8 : Formulation dans une solution éthanolique Un des lipides cationiques décrits dans les exemples précédents est dissous à une concentration donnée dans du chloroforme. D'autre part, un colipide (dioléoylphosphatidyléthanolamine, dioléoylphosphatidylcholine, cholestérol, cholestérol-amine...) est également dissous à une concentration donnée dans du chloroforme. En combinant différentes quantités de ces deux solutions dans un pilulier, différentes compositions d'un mélange de lipide cationique et de co- lipide sont obtenues. Le chloroforme est ensuite évaporé sous vide primaire pour obtenir un film lipidique le long des parois du pilulier. Ce film est alors re-dissous dans une solution éthanol / eau déionisée 80 / 20 (v/v) sous forte agitation. Par exemple, on mélange dans un pilulier 600 pL (6 mg ; 5 pmol) d'une solution de 181GSCO (exemple 1) à 10 mg.mL-' dans du chloroforme et 372 pL (3,72 mg ; 5 pmol) d'une solution de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) à 10 mg.mL-' dans du chloroforme. Le chloroforme est évaporé à sec sous vide primaire et le film lipidique obtenu est re-dissous dans 5 mL d'une solution éthanol / eau 80 / 20 (v/v). C. APPLICATIONS : TRANSPORT DE MOLECULES ACTIVES DANS LES CELLULES VIVANTES Exemple 9 : Utilisation des agents de transfert selon l'invention pour le transport d'ADN dans les cellules vivantes '9.1 Matériel Le plasmide, avec lequel on souhaite transfecter les cellules, est soit un pCMV-LacZ, soit un pCMV-EGFP. pCMV-LacZ comporte le gène codant pour une enzyme, la p-galactosidase, sous promoteur du gène CMV. L'activité de la f3-galaci:osidase produite dans les cellules est facilement mesurable à l'aide de tests colorimétriques. Le pCMV-EGFP comporte le gène codant pour une protéine fluorescente, la GFP, sous contrôle du promoteur du gène CMV. La GFP produite dans les cellules est observée au microscope à fluorescence et quantifiée par FACS. Les plasmides sont préparés à partir de cultures bactériennes (E. Coli) et purifiés sur colonne d'affinité. Les solutions d'acides nucléiques obtenues sont diluées à 1 mg.mL-' dans l'eau et stockées à -20°C. 9.2 Protocole de transfection 1. Préparation des cellules : Les cellules immortalisées adhérentes (Vero, NIH-3T3, HeLa) sont mises en culture dans une plaque de culture cellulaire 96 puits (15000 cellules par puit dans 100 pL de DMEM) un jour avant l'essai de transfection et sont transfectées alors qu'elles sont en phase exponentielle de croissance et à 80 % de la confluence. Les cellules immortalisées en suspension (Jurkat, K562) sont préparées le jour avant la transfection à une densité de 2 à 5 x 106 cellules par mL. Le jour de la transfection 0.5 à 1 x 105 cellules sont mises en culture dans une plaque de culture cellulaire 96 puits. Les solutions d'ADN et les formulations lipidiques obtenues selon l'exemple 6 sont portées à température ambiante, et sont délicatement agitées en pipetant plusieurs fois les solutions, par aspiration et refoulement, avant d'être utilisées pour la transfection. On prépare ensuite les complexes ADN / formulation lipidique à différentes teneurs en ADN et en formulation lipidique de la façon suivante. 2. Dilution de la formulation lipidique : Dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL, la formulation lipidique est diluée avec du milieu de culture (DMEM). On prépare trois solutions diluées à différentes concentrations de formulation lipidique (Tablel). Table 1 : Solutions diluées de la formulation lipidique Volume formulation Volume de Volume formulation lipidique (pL) DMEM (pL) lipidique / puits (pL) Solution A 2 198 0,5 Solution B 4 196 1 Solution C 8 192 2 3. Dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL, la solution mère d'ADN (1 mg.rnL-1) est diluée dans du milieu de culture (DMEM). On prépare trois solutions diluées à différentes concentrations d'ADN (Table 2). Table 2 : Solutions diluées d'ADN Volume solution mère Volume de Quantité d'ADN / d'ADN (pL) DMEM (pL) puits (pg) Solution D 1 199 0,25 Solution E 2 198 0,5 Solution F 4 196 1 4. Les complexes ADN / formulation lipidique sont préparés dans des tubes Eppendorf 1,5 mL, en mélangeant 50 pL de chaque solution diluée de formulation lipidique avec 50 pL de chaque solution diluée d'ADN. Les mixtures sont agitées délicatement en pipetant plusieurs fois les solutions, par aspiration et refoulement, puis incubées pendant 20 minutes à température ambiante. 5. Les 100 pL de complexes sont ajoutés sur les cellules en culture en milieu complet (transfection en présence de sérum), et la mixture est homogénéisée par agitation de la plaque de culture cellulaire pour permettre une distribution uniforme sur les cellules. 6. Les cellules sont incubées à 37°C en atmosphère humide contenant 5 % de CO2 jusqu'à la mesure de l'expression du transgène. En fonction de l'activité du promoteur, l'efficacité de la transfection peut être évaluée de 24 à 72 heures post-transfection. Un changement de milieu peut-être effectué 24 h post-transfection (Figure 4 et 9). Exemple 10 : Utilisation des produits selon l'invention pour le transport d'ARN si dans les cellules vivantes 10.1 Matériel Le plasmide avec lequel on souhaite transfecter les cellules est un ARN Si 20 anti-EGFP (Ambion, TX, USA), dont la séquence est 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCUU (sens) et 5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCUU (antisense). L'efficacité de la séquence à inhiber la GFP produite dans les cellules est 25 observée au microscope à fluorescence et mesurée par FACS. Un ARN Si contrôle a été utilisée pour mesurer l'inhibition non spécifique. Les solutions d'ARN sont à 1 pmol.L- ' dans l'eau et sont stockées à -20°C. 10.2 Protocole de transfection 1. Préparation des cellules : 30 Les cellules Hela-GFP sont mises en culture dans une plaque de culture cellulaire 24 puits (60000 cellules par puit dans 400 pL de DMEM) un jour avant l'essai de transfection et sont transfectées alors qu'elles sont en phase exponentielle de croissance et à 80 % de confluence. 2. La solution d'ARNSi et la formulation lipidique obtenue selon l'exemple 6 sont portées à température ambiante, et sont délicatement agités en pipetant plusieurs fois les solutions, par aspiration et refoulement, avant d'être utilisées pour la transfection. 3. Dans un tube Eppendorf de 1,5 mL, la solution mère d'ARN Si (1 pmol.L 1) est diluée dans un volume total de 50 pL avec du milieu de culture (DNIEM). Une série de plusieurs solutions diluées sont préparées (Table 3) afin de tester l'efficacité d'inhibition du plasmide à plusieurs concentrations finales (1 nM, 10nM et 20nM). Table 3 : Solutions diluées d'ARN Si Concentration Quantité d'ARN Si Volume d'ARN Si Volume de DMEM finale en ARN Si (ng) à 1 pmol.L (pL) (pL) (nmol.L1) 1 6,75 0,5 49,5 10 67,5 5 45 20 135 10 40 4. Dans un tube Eppendorf de 1,5 mL, la formulation lipidique est diluée dans un volume total de 50 pL avec du milieu de culture (DMEM). Une série de plusieurs solutions diluées sont préparées pour chaque concentration finale d'ARN Si (Table 4). Table 4: Solutions diluées de la formulation lipidique Concentration finale en Volume formulation Volume de DMEM ARN Si (nmol.L-1) lipidique (pL) (pL) 1 1 49 10 2 48 3 47 5. Les complexes ARN Si / formulation lipidique sont préparés en additionnant les 50pL de la solution diluée de plasmide aux 50pL de la solution 20 diluée de formulation lipidique. La mixture est agitée délicatement en pipetant plusieurs fois la solution, par aspiration et refoulement, puis incubée pendant 20 minutes à température ambiante. 6. Les 100 pL de complexes sont ajoutés sur les cellules en culture en milieu complet (transfection en présence de sérum), et la mixture est 25 homogénéisée par agitation de la plaque de culture cellulaire pour permettre une distribution uniforme sur les cellules. 7. Les cellules sont incubées à 37°C en atmosphère humide contenant 5 % de CO2 pendant 72 h. Les cellules sont ensuite tripsinisées et l'efficacité d'inhibition est observée par microscopie électronique et/ou analysée quantitativement par FACS (Figures 5 et 6). Exemple 11 : Utilisation des produits selon l'invention pour le transport de protéines dans les cellules vivantes 11. 1 Matériel Les polypeptides que l'on souhaite délivrer dans les cellules sont une IgG de chèvre purifiée (Sigma-Aldrich SARL, Saint Quentin Fallavier, France), préalablement marquée à la fluorescéine, une R-Phycoerythrin (Invitrogen, San Diego, CA, USA) et une 13-galactosidase (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Les polypeptides sont utilisés en solution à 100 pg.mL"' dans du PBS. L'efficacité de transport des polypeptides marqués dans les cellules est observée au microscope à fluorescence et est quantifiée par FACS. L'activité de la 33- galactosidase produite dans les cellules est facilement mesurable à l'aide de tests colorimétriques. 11.2 Procédure 1. Préparation des cellules : Les cellules immortalisées adhérentes (Vero, NIH-3T3, HeLa) sont mises en culture dans une plaque de culture cellulaire 24 puits (75000 cellules par puit dans 400 pL de DMEM) un jour avant l'essai de délivrance des polypeptides, ou protéines ou anticorps afin qu'elles soient en phase exponentielle de croissance et à 80 % de la confluence lors de l'expérience. Les cellules immortalisées en suspension (Jurkat, K562) sont préparées le jour avant la transfection à une densité de 2 à 5 x 106 cellules par mL. Le jour de la transfection 1.5 à 5 x 105 cellules sont mises en culture dans une plaque de culture cellulaire 96 puits. 2. La solution de polypeptide et la formulation lipidique obtenue selon l'exemple 8 sont portées à température ambiante, et sont délicatement agités en pipetant plusieurs fois les solutions, par aspiration et refoulement, avant d'être utilisée pour l'essai de délivrance. 3. Dans le fond d'un tube Eppendorf de 1,5 mL, on ajoute 2 pL de la formulation lipidique. 4. On additionne alors 1 pg de polypeptide dans le tube contenant la formulation lipidique. La mixture est agitée délicatement en pipetant plusieurs fois la solution, par aspiration et refoulement, puis incubée pendant 10 minutes à température ambiante. 5. Puis 100 pL de milieu de culture (DMEM) sont additionnés à la mixture polypeptide / formulation lipidique et la solution est agitée délicatement en 1pipetant plusieurs fois, par aspiration et refoulement. 6. Les complexes sont alors immédiatement ajoutés sur les cellules en culture en milieu complet (transfection en présence de sérum), et la mixture est homogénéisée par agitation de la plaque de culture cellulaire pour permettre une distribution uniforme sur les cellules. 7. Les cellules sont incubées à 37°C en atmosphère humide contenant 5 % de CO2 selon des conditions standard. L'efficacité de délivrance intracellulaire des polypeptides ou protéines ou anticorps est analysée après 3 à 48 h d'incubation (Figures 7, 8 et 10). REVENDICATIONS 1.) Composé amphipathique cationique de Formule (I) : (I) R--(-E )m(AA)n ((Y)q (Z) r s dans laquelle : R représente une région lipophile qui peut comprendre un ou plusieurs groupements choisi(s) parmi une ou plusieurs chaînes alkyle, comprenant 6 à 24 atomes de carbone, préférentiellement entre 10 et 18 atomes de carbone, ramifiée ou linéaire, insaturée ou saturée, éventuellement fluorée ; ou un ou plusieurs groupes cycliques ou polycycliques connus pour être lipophile comme un groupe stéroïde (par exemple un dérivé du cholestérol), un groupe polyaromatique (par exemple dérivé du naphtalène, du dansyle, de l'anthracène), ou un groupe dérivé d'alcaloïde ; ou un lipide naturel ou synthétique ; E représente un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 8, et pouvant comporter éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes ; m est un entier égal à 0 ou à 1; AA représente le reste d'un acide aminé ; n est un entier égal à 0 ou à 1; W1 et W2, identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, linéaire ou ramifié, pouvant comprendre de 1 à 15 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 6, pouvant éventuellement comprendre un ou plusieurs hétéroatomes ; L représente un groupement fonctionnel pouvant incorporer au moins une liaison sensible à son environnement, stable en milieu extracellulaire et rapidement clivée dans le milieu intracellulaire car sensible - à des stimuli tels que la décroissance du pH (par exemple des groupements éther de vinyle ou acylhydrazone sensibles au milieuacide) ou un changement du potentiel d'oxydoréduction (par exemple une liaison disulfide, clivée en milieu réducteur), aux enzymes (par exemple une liaison ester, clivée par les estérases endogènes) ; ou encore - aux radiations lumineuses (porteuses de groupements photo-sensibles par exemple) ; - p est un entier égal à 0 ou à 1 ; - Y est un groupe hydrocarboné ramifié, pouvant comprendre de 1 à 20 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 12, et/ou un ou plusieurs hétéroatomes, et pouvant être couplé de manière covalente éventuellement au groupe W2 ou AA ou E ou R d'une part, et au moins à deux groupes Y et/ou Z d'autre part ; - q est un entier compris entre 0 et 8, de préférence entre 0 et 3 ; - Z représente un acide aminé basique ; - r est un entier compris entre 1 et 16, de préférence entre 1 et 8, étant entendu que si q est égal à 1 alors r est au moins égal à 2 et que si r est supérieur à 1, alors les groupements Z peuvent être identiques ou différents; - s est un entier égal à 1 ou 2 ; et ses sels d'addition physiologiquement acceptables. 2.) Composé selon la revendication 1, caractérisée en ce que R comprend un ou plusieurs hétéroatomes. 3.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que R répond à la formule (Il) : A b D R2 ) B a dans laquelle : • RI et R2, identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, linéaire, ramifié et/ou cyclique, saturé ou insaturé, comprenant de 6 à 24 atomes de carbone, préférentiellement de 10 à 18. • A et B, identiques ou différents, représentent un groupement ùC(0)-O- ; -O-C(0)- ; -CO-NH- ; -NH-CO- ; -NH- ou -0-. • a est un entier compris entre 1 et 6, de préférence a est un entier égal à 1 ou 2. • b est un entier compris entre 0 et 6, de préférence b est un entier égal à Oou 1. • D représente un groupement -NH-, -CO-, -O- ou -S-. 4.) Composé selon la revendication 3, caractérisée en ce que R répond à la formule (III) : RI O R2 0 O 20 ou bien encore à la formule (IV) : RZ~NO H dans lesquelles RI et R2 ont la même signification que précédemment, préférentiellement R1 et R2 sont une chaîne alkyle, alcényle ou alcynyle en 25 C12 à C18. 5.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que E répond alors à la formule (V) : -G1-X1-GI-, dans laquelle - X1 représente un groupe alkylène formant pont et comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4, et 30 - G1 représente un groupe -CO- ou -NH-. 6.) Composé selon la revendication 5, caractérisée en ce que E répond à la formule CO-XI-CO dans laquelle X1 à la même signification que décrites à la revendication 4. 7.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que W1 répond à la formule (VI) : -G2-X2- et W2 répond à la formule (VII) : -X3-G3- dans lesquelles X2 et X3, identiques ou différents, représente un groupe aikylène formant pont et comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4, tandis que G2 et G3, identiques ou différents, représentent un groupe -CO-, -NH- ou -0-. 8.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que L représente un groupement ester (-CO-O-), disulfide (-S-S-), éther de vinyle (-O-C=C-), acylhydrazone (-CO-NR-N=CR'R"), préférentiellement un groupement ester ou disulfide. 9.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que Y répond à la formule (VIII) : -CO-X4-NH-X5-N-[X6-NH]2- ou (IX): - NH-X5-N-[X6-NH]2-, dans lesquelles X4, X5 et X6, identiques ou différents, représentent un groupe alkylène formant pont et comprenant de 1 à 8 atomes de carbone, préférentiellement de 1 à 4. 10.) Composé selon la revendication 9, caractérisée en ce que X4 représente un méthylène. 11.) Composé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce que X5 et X6 représentent, un groupe alkylène formant pont et comprenant de 1 à 4 atomes de carbone, préférentiellement 2 atomes de carbone. 12.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que Z représente un acide aminé basique choisi de préférence parmi la lysine, l'ornithine, l'arginine, l'histidine et la sérine. 13.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le contre ion des sels d'addition physiologiquement acceptables est choisi parmi des anions organiques, préférentiellement CF30OO- et CH30OO- ou inorganiques, préférentiellement Br, Cr, 1- et F. 14.) Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, choisi parmi les composés de formule : 56I.1 0 NH2 1.2 /\/ NH2 1.3 NH2 1. 4 H N NH2 O N HN- 1.5 1.6 H N-iS-S---iN H NH2 1.7 H S H15.8 1.9 N H2 1.10 1.12 H2NNH2 HN H N O H2H2 H N~O H H2N NH2 57 NH210Ny z 1.14 1.15 1.16 H S N H OH O - H 0.... OO -N N N NH O O H O H NH2 H 1.17 O NH2 NH2 58 1.13 NH2 NH2 NH2 NH2 Z 2 NNH H H N N^~N NN~NH H H NH2 H H2N O NH2 H N 0.18 1.19 HH2N NH2 59 o H /---i O H O~` O NH lL-/~~~ z HN O H2N J 1.20 H2N NH2 H O O kN H H NH2 N~/~N~~N NH2 H ~ I0I _ HN, O 0 HN 0 ~iN~/~N I H H NH2 2 H2N NH2 15.) Composition, préférentiellement cosmétique ou pharmaceutique ou réactif de laboratoire, comprenant un composé de Formule (I) tel que défini à l'une 10 quelconque des revendications 1 à 14. 16.) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un acide nucléique ou un polynucléotide. 17.) Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que le composé de Formule (I) et l'acide nucléique sont présents en quantité telle que le 15 rapport de charges positives du composé de Formule (I) sur les charges négatives de l'acide nucléique est compris entre 0,1 et 50, préférentiellement entre 0,5 et 20. 18.) Composition selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17,caractérisée en ce que la quantité de composé de Formule (I) est comprise entre 1 et 12 nanomoles par pg d'acide nucléique, et de manière préférée entre 1 et 9 nanomoles par pg d'acide nucléique. 19.) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend 5 en outre au moins un polypeptide ou une protéine. 20.) Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce que le composé de Formule (I) et le polypeptide ou la protéine sont présents en quantité telle que la quantité de composé de Formule (I) est comprise entre 1 et 10 nanomoles de composé par pg de polypeptide, et de manière préférée 10 entre 1 et 3 nanomoles par pg de polypeptide. 21.) Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une molécule biologiquement active autre qu'un acide nucléique ou un polypeptide comme par exemple un principe actif, un polysaccharide, un lipide, un peptoide. 15 22.) Composition selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un adjuvant tel un ou plusieurs lipides neutres (zwitterioniques ou dépourvu de charges ioniques), anioniques ou cationiques, comme par exemple des lipides neutres à deux chaînes grasses, du cholestérol ou des dérivés du 20 cholestérol, plus particulièrement choisi parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl-, dipalmitoyl-, dimyristoyl-, dilauroylphosphatidyléthanolamines (DSPE, DPPE, DMPE, DLPE), ainsi que leurs dérivés N-méthylés un à trois fois 25 (DOPC, DPPC, DMPC), les phosphatidylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphyngomyélines), les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGM1 et GM2), 30 ou encore tel les éthers lipides, ou encore des lipides comportant une seule chaîne grasse, parmi lesquels les lysophosphatides, les lysophosphatidylcholines, les lysophosphatidyléthanolamines, les lysophosphatidylglycérols, les lysophosphatidylsérinesou encore tel les acides lysophosphatidique, qu'ils soient naturels ou synthétiques ou encore tel un ou plusieurs polymères, naturels ou synthétiques, copolymères et/ou dendrimères, cationiques tels que les polyamines, parmi lesquelles la polyéthylènimine, la polylysine, la polyornithine, ou encore le polybrène et le chitosane, ou anioniques tels que l'acide polyglutamique, l'acide polypropylacrylique, l'acide hyaluronique et l'acide polylactique-coglycolique (PGLA), ou neutres tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou encore certains polysaccharides tels que les galactomannanes, ou encore tel des nanoparticules, notamment des particules magnétiques, des particules à base de composés organiques ou inorganiques ou encore tel des polypeptides, des protéines, des oses, du glycérol, des cyclodextrines, des histones, l'acide désoxycholique et tout autre "activateur" ("enhancer") qui améliore l'efficacité de livraison et la pharmacologie ou encore tel des adjuvants capables de cibler spécifiquement un déterminant à la surface et/ou à l'intérieur des cellules, éventuellement attaché de manière covalente ou non covalente au composé répondant à la formule (I) ou à toutes autres molécules contenues dans la composition comprenant le composé de formule (I), par exemple des ligands de récepteurs exprimés à la surface des cellules ciblés, par exemple un sucre, un folate, la transferrine, l'insuline, une hormone, un peptide, un anticorps, un métabolite, des vitamines ou toute autre molécule pouvant reconnaître un récepteur extracellulaire, ou un élément de vectorisation intracellulaire pour cibler des compartiments spécifiques tels que les mitochondries, le noyau ou le cytoplasme, comme par exemple un signal de localisation nucléaire ou mitochondriale comme par exemple un sucre, un peptide, une protéine, un anticorps, un fragment d'anticorps, un ligand ou un fragment de ligands ou encore un fluorophore tel que la rhodamine, la fluorescéine ou la biotine ou encore des virus, par exemple des lentivirus, des rétrovirus, des adénovirus, le virus de l'herpès, des baculovirus, et/ou des organismes unicellulaires, par exemple des bactéries, des levures, des champignons ou des parasites. 23.) Utilisation d'un composé de Formule (I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou d'une composition telle que définie dans l'une quelconque des revendications 15 à 22, pour la préparation d'une composition destinée au transfert d'acides nucléiques, de polypeptides ou de tout autre molécule biologiquement active dans les cellules. 24.) Méthode de transfert in vitro ou ex vivo d'une molécule d'intérêt biologique dans les cellules comprenant les étapes suivantes : 1. la mise en contact de la molécule d'intérêt biologique avec un composé répondant à la formule (I), tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou avec une composition telle que définie à l'une quelconque des revendications 15 à 22, pour former un complexe molécule active / agent de transfert, 2. la mise en contact des cellules avec le complexe formé en 1. 25.) Méthode selon la revendication 24, caractérisée en ce que les cellules utilisées sont des cellules préalablement isolées. 26.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 24 ou 25, caractérisée en ce que elle comprend en outre une ou plusieurs étapes de mise en contact du composé de formule (I) avec un ou plusieurs autre(s) agent(s) de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvants. 27.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 24 à 26, caractérisée en ce que l'étape 1 est précédée d'une étape de mise en contact du composé de Formule (I) avec un ou d'autres agents de transfection et/ou d'une étape de mise en contact du composé de Formule (I) avec le ou les adjuvants. 28.) Kit de transfert de matériel biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé répondant à la Formule (I) tel que décrit dans les revendications 1 à 14 ou une composition telle que décrites à l'une des revendications 15 à 22. 29.) Kit de transfert pour la mise en oeuvre de la méthode telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 26 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé répondant à la Formule (I) tel que décrit dans les revendications 1 à 14 ou une composition telle que décrites à l'une 63des revendications 15 à 22.