Brevet FR2930445A1 — publié le 20091030

La présente invention est relative à l'utilisation d'une composition contenant le 7-déhydrocholestérol ou un extrait naturel de micro-organisme ou végétal ou animal en comprenant, pour protéger les cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultraviolets. Le 7-déhydrocholestérol est un précurseur de la vitamine D trouvé naturelle-ment dans la peau. Le document GB-454260-A décrit la synthèse du 7-déhydrocholestérol à partir de l'acétate de 7-oxo-cholestéryle. Le document JP-1261326-A concerne un produit cosmétique contenant du 7- déhydrocholestérol pour favoriser la formation des pigments cutanés. Par ailleurs, l'exposition répétée de la peau aux rayonnements ultraviolets en-traîne des dommages dans les cellules de la peau et des muqueuses, en particulier dans les cellules appelées fibroblastes qu sont responsables du renouvellement des macromolécules constituant la matrice extracellulaire du derme (Goukassian D. et al, The FASEB J., 14 :1325-34,2000). Ces dommages sont naturellement réparés. Mais, quand ce n'est pas le cas, cela peut avoir des conséquences pour le bon fonctionnement des cellules (Goukassian D.A. et Gilchrest B.A., Rejuvenation Res.7 (3) :175-85,2004). De plus, on sait depuis longtemps que les cellules de la peau exposée au soleil perdent plus vite leur capacité de reproduction lorsqu'on les introduit en culture in vitro (Gilchrest B.A., J Gerontol., 35(4) :537-41,1980). Les cellules qui ne peuvent plus se reproduire sont appelées � cellules sénescentes �, et sont caractérisées par la forte expression d'une bêta-galactosidase active à pH 6. On trouve plus de cellules exprimant cette bêta-galactosidase aussi bien parmi les kératinocytes ou fibroblastes de la peau de personnes âgées, que dans les cultures de cellules vieillies par repiquages successifs (Dimri G.P. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 :9363-67,1995), ou dans les cultures ayant subi des stress ultra-violets répétés (Chainiaux F. et aI, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 34(11) :1331-9,2002). De plus, il a été récemment montré (Debacq-Chainiaux F. et al, J. Cell. Sci. 118(Pt4) :743-58, 2005) que les fibroblastes perdent avec l'âge une partie de leur capacité de réparation des dommages causés par les rayonnements ultra-violets (UV) (Goukassian D. et al, 2000, déjà cité). Enfin, il a été rapporté que les � cellules sénescentes � in vivo, ont des effets néfastes sur le tissu environnant (Funk W.D. et al, Exp Oeil Res.258 :270-8, 2000), et il parait important de pouvoir disposer de moyens pour éviter leur apparition. II apparaît donc qu'il serait très intéressant de pouvoir disposer de moyens pour éviter l'apparition de � cellules sénescentes � qui ont perdu la capacité de se reproduire, et qui, de plus, ont des effets néfastes sur les tissus environnants. Ainsi, l'un des buts de la présente invention est-il de fournir un moyen pour protéger les cellules cutanées contre l'apparition des � cellules sénescentes � qui est la conséquence d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultra-violets. Ce but, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, est atteint par l'utilisation d'une composition contenant du 7-déhydrocholestérol, un dérivé de 7- déhydrocholestérol ou un extrait naturel de microorganisme ou végétal ou animal en comprenant pour protéger les cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultraviolets. Avantageusement, le 7-déhydrocholestérol est sous la forme d'un dérivé hydrosoluble tel qu'un ester de l'acide phosphorique, ou de l'acide succinique. De préférence, cette composition comprend aussi au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, du resvératrol, du gallate d'épigallocatéchine, de la genistéine, de la daidzéine, de la formononétine, de l'équol, un extrait de thé vert. Avantageusement, elle comprend de 0,00001 à 95 % en poids, et de préfé- rence de 0,001 à 1 % en poids, de 7-déhydrocholestérol. La composition, selon la présente invention, est destinée à une application sur la peau ou les muqueuses et/ou à être ingérée. Avantageusement, cette composition stimule l'activité de la protéine p53 dans les cellules de la peau ou des muqueuses. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, est en particulier relative à des exemples de réalisation de la présente invention qui permettront à l'homme du métier de mieux comprendre celle-ci. Il a maintenant été trouvé de façon tout à fait inattendue et surprenante,et comme le montrent les exemples ci-après, que si le milieu de culture des fibroblastes soumis à des expositions aux ultra-violets répétées, est supplémenté, avant les irradiations, par un ajout de 7-déhydrocholestérol, on diminue de façon très significative le nombre de cellules qui passent à l'état Le 7-déhydrocholestérol utilisé dans les exemples et compositions ci-dessous est commercialisé par la société MMP Inc (USA). Exemple 1 : Atténuation par le 7-déhydrocholestérol des dommages causés à des fibroblastes en culture, par des expositions répétées à un rayonnement ultraviolet. Le 7-déhydrocholestérol utilisé est un échantillon de pureté supérieure à 96% fourni par la société MMP Inc. Des fibroblastes de derme de la même souche BJ que celle utilisée par Chai- niaux F. et al (2002, déjà cité) sont mis en culture par les méthodes classiques. L'absence de cytotoxicité du 7-déhydrocholestérol sur une durée de 9 jours, est vérifiée dans la gamme 0,25 à 1 pg /ml. Pendant 5 jours les fibroblastes sont exposés 1 fois par jour à une dose d'ultra-violets B de 500 mj/cm2. A la suite de chaque irradiation, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant 0,25 ; 0,5 ; ou 1 pg /ml de 7-déhydrocholestérol. Avant chaque nouvelle irradiation, ces milieux sont remplacés par un milieu ne contenant pas de 7-déhydrocholestérol. Après la dernière irradiation, les cellules sont laissées pendant 72 heures en contact avec un milieu supplémenté en 7-déhydrocholestérol, renouvelé toutes les 24 heures. Au terme de cette dernière période de contact, l'activité bêta-galactosidase à pH6 (bêta-galactosidase associée à la sénescence ou SA bêta-gal) est évaluée suivant la méthode de Dimri G.P. et al (déjà cité), sur au moins 400 cellules pour chaque concentration en 7-déhydrocholestérol. L'expérience a été réalisée deux fois. Les valeurs moyennes des pourcentages de cellules exprimant la SA bêta-gal sont regroupées dans le tableau I ci-après : On constate que : - les dommages causés par les expositions répétées aux rayons ultra-violets B ont entraîné une augmentation significative des fibroblastes présentant l'activité SA bêta-gal caractéristique des cellules qui ne peuvent plus se reproduire (qualifiées de � sénescentes �), - le traitement des cellules par le 7-déhydrocholestérol après les irradiations, a permis une atténuation des dommages causés par les ultra-violets de façon significative dès la concentration de 0,25 pg/ml, ce qui se traduit par un nombre de fibroblastes � sénescents � qui reste inférieur à celui des cultures n'ayant subi aucune irradiation. Tableau I Condition SA bêta-gal SA bêta-gal lére expérience 2ème expérience Contrôle sans UV 31,04 41,19 UV et Opg/ml de 7-déhydrocholestérol 38,65 49,19 UV et 0,25 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 27,00 33,19 UV et 0,5 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 26,17 34,13 UV et 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 26,28 35,48 II apparaît ainsi, que l'utilisation de 7-déhydrocholestérol, permet bien selon l'invention d'atténuer les dommages cellulaires causés par l'exposition aux rayonnements ultraviolets. 10 Exemple 2 : Pour protéger les cellules contre les stress oxydatifs, il est intéressant d'activer la protéine p53 (cf. de Magalhaes J.P. et al, Expert Gerontol. 39(9) : 1379-89, 2004). On a évalué la stimulation de l'expression de la protéine p53 dans les fibroblastes de l'Exemple 1 sous l'influence de 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol dans le milieu 15 de culture pendant 24 heures. Un contrôle positif a été réalisé en irradiant une culture des mêmes cellules par une dose de 150 mj/cm2 d'UVB. Après ces traitements on a extrait les protéines nucléaires des fibroblastes. Puis on a incubé 5pg de protéines nucléaires dans une microplaque recouverte 20 d'un oligonucléotide portant la séquence d'ADN spécifique susceptible de lier la pro- téine p53.5 Enfin, la teneur en protéine p53 liée a été évaluée par colorimétrie au moyen d'un anti-corps spécifique de cette protéine et d'un anticorps conjugué à la peroxydase (test TransAM de Active Motif, Rixensart, Belgique). Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau Il ci-dessous : Tableau II p53 Conditions par rapport au Contrôle à 0 pg/ml de 7- déhydrocholestérol 0 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 1 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 1,19 0 pg/ml de 7-déhydrocholestérol + UV 4,05 On a ainsi trouvé de façon surprenante que le traitement au 7-déhydrocholestérol en l'absence d'UV a augmenté de 19% la teneur des fibroblastes 10 en protéine p53. On a aussi confirmé que les expositions aux ultra-violets, en absence de 7-déhydrocholestérol, ont multiplié par 4 la teneur des fibroblastes en protéine p53. Cet exemple permet de mettre en évidence de façon surprenante que le 7-déhydrocholestérol stimule la protéine de défense p53 nécessaire à la prévention des 15 dommages causés par les rayonnements ultra-violets tels que l'apparition de � cellules sénescentes � ayant perdu la capacité de se reproduire et qui ont des effets néfastes sur le tissu environnant. Différentes compositions sont données ci-après à titre d'exemple pour illustrer les différents modes d'action ou d'utilisation du 7-déhydrocholestérol. 20 Composition N°1 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. On procède comme pour la réalisation d'une émulsion classique huile dans eau, c'est-à-dire qu'on mélange sous agitation à 85°C une phase hydrophobe contenant 0,05% en poids de 7-déhydrocholestérol et une phase aqueuse contenant cha- 25 cuve des matières premières destinées à conférer au produit les propriétés d'usage habituelles : stabilité, sécurité, étalement facile, toucher final agréable, etc. La teneur en 7-déhydrocholestérol clans cette crème est de 0,04% en poids.5 On refroidit ensuite sous agitation. Cette crème est appliquée sur le visage, le cou et les mains, de préférence le matin pour préparer la peau aux agressions quotidiennes Composition N°2 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. On réalise comme ci-dessus une émulsion huile dans eau contenant en plus de l'alpha-tocophérol ainsi que de l'acétate d'alpha-tocophérol ; et lors du refroidissement, à 45°C, on rajoute du phosphate de vitamine C en quantité suffisante pour arriver aux concentrations en poids dans la composition finale de : - 7-déhydrocholestérol 0,05 % - alpha-tocophérol 0,05 % - acétate d'alpha-tocophérol 0,2 0/0 - phosphate de Vitamine C, sel de Mg 0,2 %. Cette formulation est une crème de jour. Composition N°3 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs et de protection filtrante. On réalise comme pour la Composition N°1, une émulsion huile dans eau avec un ajout d'oxyde de titane suffisant pour que le facteur de protection SPF soit égal à 6. Le produit ainsi obtenu est destiné à être appliqué le matin sur les zones de peau non couvertes, et si possible l'application doit être renouvelée en milieu de jour-née. Composition N°4 : Gel cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. On réalise un gel acrylique hydroalcoolique contenant 0,02 % en poids de 7-déhydrocholestérol et contenant en outre 2 % en poids d'un extrait hydroglycolique de Glycyrrhiza glabra. Ce gel est appliqué le matin et en cours de journée sur les zones de peau exposées au soleil et aux pollutions. Composition N°5 : Complément alimentaire pour protéger la peau lors des expositions au soleil ou à la pollution. On réalise par les techniques classiques des comprimés dosés à 10 pg de 7-déhydrocholestérol par comprimé, d'une formulation de poudre comprenant 0,1% en poids de 7-déhydrocholestérol. Ces comprimés sont à prendre avec un peu d'eau au cours des repas du matin et de milieu de journée, à raison de un à deux comprimés par prise suivant l'intensité et la durée d'exposition attendue. Composition N°6 : Complément alimentaire pour préparer la peau à l'exposition au soleil. On réalise des capsules contenant 60 mg d'une formulation de poudre à 2 % en poids de 7-déhydrocholestérol, 15 mg d'extrait de thé vert et 25 mg de vitamine C par capsule. La dose quotidienne conseillée est de 2 à 4 capsules par jour, en fonction de l'intensité de l'exposition, en deux prises le matin et en milieu de journée avec un peu d'eau au moment du repas. Composition N°7 : Boisson pour protéger la peau lors des expositions au soleil. On réalise une boisson à base de lait de soja contenant 0,01 % en poids de 7- déhydrocholestérol. Cette boisson est présentée en doses de 100 ml. II est conseillé d'en boire une dose le matin et une dose en milieu de journée au moment des repas.20 REVENDICATIONS1. Utilisation d'une composition contenant le 7-déhydrocholestérol, un dérivé de 7-déhydrocholestérol ou un extrait de microorganismes, de végétal ou d'animal le comprenant, pour protéger les cellules contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultra-violets. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que le 7-déhydrocholestérol est sous la forme d'un dérivé hydrosoluble tel qu'un ester de l'acide phosphorique, ou de l'acide succinique. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée par le fait qu'elle comprend aussi au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, du resvératrol, du gallate d'épigallocatéchine, de la genistéine, de la daidzéine, de la formononétine, de l'équol, un extrait de thé vert. 4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,00001 à 95 % en poids de 7-déhydrocholestérol. 5. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,001 à 1 % en poids de 7-déhydrocholestérol. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que la composition est destinée à une application sur la peau ou les muqueuses. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que la composition est destinée à être ingérée. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par le fait que la composition stimule l'activité de la protéine p53 dans les cellules de la peau ou des muqueuses.