Brevet FR2929489A1 — publié le 20091009

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la production de Tuber magnatum, communément désignée truffe blanche, qui est un champignon comestible possédant une grande valeur commerciale. ART ANTERIEUR Tuber magnatum, aussi désignée truffe blanche du Piémont ou encore truffe d'Alba, est un champignon comestible rare et très apprécié des consommateurs. io Tuber magnatum est un champignon ectomycorhizien qui pousse et mûrit d'octobre à décembre dans les terrains argilo-calcaires de l'Italie septentrionale, en général à une profondeur de 5 à 50 centimètres. Ce champignon vit en symbiose préférentiellement avec les peupliers (peuplier noir, peuplier blanc, peuplier tremble, etc.). Tuber magnatum peut aussi vivre en symbiose avec d'autres essences 15 d'arbres tels que les chênes, les tilleuls et les noisetiers. Du fait que Tuber magnatum est rare dans la nature mais qu'il est très apprécié des consommateurs, il existe un besoin pour la mise au point de techniques permettant la mise à la disposition du public de ce champignon en quantité et qualité désirées. Il existe en premier lieu un besoin pour la mise au point 20 de techniques permettant l'obtention, en quantité et qualité désirées, de mycélium de Tuber magnatum, en vue de réaliser la mycorhization des essences compatibles, puis de réaliser la culture des essences mycorhizées pour la production de ces champignons. A la connaissance du demandeur, il n'existe à ce jour aucune technique 25 ayant permis la production de mycélium de Tuber magnatum dans des conditions permettant la mycorhization des essences compatibles, malgré les nombreuses tentatives qui ont été réalisées dans l'état de la technique. Ainsi, dans un article de revue relatif aux méthodes de culture des champignons comestibles, Hall et al. avaient observé que des techniques de 30 production avaient été mises au point pour une variété de champignons, tels que Lactarius deliciosus, Lyophyllum shimeji, Rhizopogon rubescens, Sui/lus granulatus, Terfezia, ainsi qu'une grande variété de Tuber (Hall et al., 2003, Trends in Biotechnology, Vol. 21 (N° 10) : 433-438). Parmi les Tuber pour lesquels des techniques de culture avaient été mises au point, ces auteurs citent les exemples de 35 Tuber borchii, Tuber melanosporum et Tuber uncinatum. Mais Hall et al. (2003, cité ci-dessus) avaient aussi souligné qu'aucune technique n'avait pu être mise au point pour la culture de Tuber magnatum. Dans l'objectif de parvenir ultérieurement à définir des techniques de production contrôlée de Tuber magnatum, divers travaux scientifiques ont été réalisés afin de mieux comprendre la physiologie de ce champignon et en particulier la nature des interactions de ce champignon avec l'écosystème environnant. Illustrativement, Murat et al. avaient confirmé qu'aucune technique de production contrôlée de Tuber magnatum n'était possible en 2005, alors que de telles techniques étaient pleinement disponibles pour Tuber borchii et Tuber io uncinatum et Tuber melanosporum (Murat et al., 2005, FEMS Microbiology Letters, VI. 245 : 307-313). En conséquence, ces auteurs s'étaient attachés à étudier les interactions de Tuber magnatum avec son écosystème et les résultats obtenus leur avaient permis de conclure que des analyses supplémentaires étaient nécessaires pour améliorer la connaissance de l'écosystème de Tuber magnatum et ainsi 15 augmenter les chances de succès pour une future mise au point d'une production expérimentale de ce champignon. Egalement, Barbieri et al. avaient observé que, malgré les succès obtenus avec de nombreuses truffes comestibles, telles que Tuber melanosporum, Tuber aestivum et Tuber borchii, il n'avait pas été mis au point de technique de production 20 contrôlée de Tuber magnatum (Barbieri et al., 2007, Environmental Microbiology, Vol. 9 (n° 9) : 2234-2246). Ces auteurs, qui avaient étudié la diversité des communautés microbiennes associées à Tuber magnatum, avaient conclu que des bactéries potentiellement aptes à fixer l'azote étaient susceptibles de contribuer au développement et à la maturation des ascomes de ces truffes. 25 Ainsi, à la connaissance du demandeur, le besoin pour un procédé de production contrôlée de Tuber magnatum n'a toujours pas été satisfait à ce jour. RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé pour l'obtention de mycélium de 30 Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a), associé ou non associé aux racines de plantes. Dans certains modes de réalisation du procédé, les racines de plantes consistent en des racines transformées par Agrobacterium rhizogenes. Dans certains modes de réalisation du procédé, les racines proviennent de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilla, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus. Dans certains modes de réalisation du procédé, l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, y compris des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia. io Dans certains modes de réalisation du procédé, ledit procédé comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture exempt de racine. Dans certains modes de réalisation du procédé, ledit procédé, après l'étape c), 15 comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) . La présente invention est aussi relative à un mycélium de Tuber magnatum caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé défini ci-dessus. 20 La présente invention concerne aussi un procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules ou de boutures avec un mycélium de Tuber magnatum obtenu par le procédé ou avec un mycélium de Tuber magnatum tels que définis ci-dessus; 25 b) culture in vitro des plantules ou boutures inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre la courbe de croissance de Tuber magnatum en 30 présence de racines de peuplier transformées par Agrobacterium rhizogenes. En ordonnées : taille du mycélium de Tuber magnatum, exprimée en millimètres. En abscisses, temps écoulé à partir de l'incubation du fragment de carpophore avec les racines de peuplier, exprimé en jours. La Figure 2 illustre une comparaison du niveau de croissance du mycélium 35 de Tuber magnatum, respectivement en l'absence (partie gauche de la figure 2) ou en présence (partie droite de la figure 2) de racines de Ciste transformées par Agrobacterium rhizogenes. En ordonnées : productions de cultures de mycelium à partir d'un morceau de carpophore de Tuber magnatum (pourcentage). La Figure 3 représente un cliché d'un fragment de carpophore de Tuber magnatum en l'absence de racine de plante. La Figure 4 représente un cliché d'un fragment de carpophore de Tuber magnatum en présence de racines de Populus transformées par Agrobacterium rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation. La Figure 5 représente un cliché d'un fragment de carpophore de Tuber io magnatum en présence de racines de Daucus carota transformées par Agrobacterium rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation. La Figure 6 représente un cliché d'un fragment de carpophore de Tuber magnatum en présence de racines de Cistus transformées par Agrobacterium rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation. 15 La Figure 7 représente un cliché de plantules (boutures) de Populus mycorrhizées par Tuber magnatum. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION De manière surprenante, les inventeurs ont montré que du mycélium de 20 Tuber magnatum pouvait être obtenu de manière simple, en cultivant in vitro, dans des conditions contrôlées, un fragment de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plantes. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour l'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : 25 a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a), en association ou non avec des racines de plantes. Comme cela est montré dans les exemples, un seul fragment de tissu de 30 Tuber magnatum est suffisant à l'étape a) pour l'obtention de mycélium à la fin de l'étape a). Toutefois, deux fragments de tissu ou plus de deux fragments de tissu de Tuber magnatum peuvent être cultivés in vitro à l'étape a) sans entraîner d'inconvénient particulier. Dans certains modes de réalisation illustrés dans les exemples, on utilise à 35 l'étape a) un ou plusieurs fragments de carpophore de Tuber magnatum. Toutefois, le procédé selon l'invention peut aussi être mis en oeuvre en utilisant, à l'étape a), des fragments d'autres types de tissu de Tuber magnatum, tels que des fragments de mycorhize ou encore des fragments de mycélium. On préfèrera en général utiliser un ou plusieurs fragments de carpophore de Tuber magnatum, du fait que le carpophore est un organe pour lequel les caractéristiques morphologiques de Tuber magnatum sont le plus aisément reconnaissables. On utilisera également du mycélium de Tuber magnatum, cultivé in vitro, obtenu par ledit procédé. On préférera utiliser des fragments de Tuber magnatum prélevés stérilement io dans les tissus internes du carpophore pour éviter d'introduire des microorganismes telluriques indésirables dans les cultures ultérieures. Ces microorganismes indésirables se situent à la surface externe des carpophores, en contact avec le sol. Dans certains modes de réalisation du procédé, le ou les fragment(s) de tissu de Tuber magnatum et les racines de plante sont mis en contact entre eux au 15 cours de l'étape a). Toutefois, comme cela est illustré dans les exemples, du mycélium de Tuber magnatum peut être produit au cours l'étape a) de culture in vitro sans interaction physique étroite entre le fragment de tissu de Tuber magnatum et les racines de plante. 20 Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les racines de plantes en croissance qui sont présentes à l'étape a) du procédé produisent ou libèrent un ou plusieurs métabolites qui sont nécessaires au développement ou à la croissance du mycélium. Ainsi, dans certains autres modes de réalisation du procédé, le ou les 25 fragment(s) de tissu de Tuber magnatum sont simplement incubés ensemble au cours de l'étape a), la caractéristique importante étant la présence des racines de plante. Cette incubation conjointe permet que des métabolites libérés par les racines de plante dans le milieu de culture diffusent dans le milieu de culture jusqu'au fragment(s) de tissu de Tuber magnatum. 30 On a montré selon l'invention que l'étape a) peut être réalisée avec une grande variété de racines de plante. Dans certains modes de réalisation, on utilise à l'étape a) du tissu racinaire isolé qui a été précédemment préparé à partir de plantes. Préférentiellement, le tissu racinaire isolé est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage intenses, par 35 exemple avec de l'eau stérile ou encore avec du milieu de culture, afin d'éliminer la presque totalité ou la totalité des micro-organismes susceptibles d'y être initialement associés. Ainsi, des racines de plante isolées à partir d'une plante entière et ayant été soumises à une ou plusieurs étapes de lavage appropriées peuvent être utilisées avec succès, à l'étape a) du procédé. Toutefois, des racines isolées à partir de plantes entières ont une pérennité réduite. De telles racines présentent en particulier l'inconvénient de se développer et se différencier dans le milieu de culture et ainsi de donner naissance à des plantules. C'est la raison pour laquelle on réalise l'étape a) du procédé préférentiellement avec du tissu racinaire dont la capacité des cellules constitutives à se différencier en des tissus autres que du tissu racinaire a été bloquée. Préférentiellement, on utilise des racines de plantes qui ont été transformées avec Agrobacterium rhizogenes. Les racines de plantes transformées avec Agrobacterium rhizogenes se transforment en � hairy roots � qui présentent l'avantage de se développer exclusivement en un tissu racinaire qui peut être cultivé à long terme et repiqué, sans nécessiter un nouveau recours à une étape d'isolement de racines à partir d'une plante entière. De plus, sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les racines transformées par Agrobacterium rhizogenes, encore nommées � hairy roots � ou � root organ cultures � (ROC), produisent au cours de leur croissance des métabolites secondaires importants qui contribuent au développement du mycélium de Tuber magnatum, à l'étape a) du procédé de l'invention. Les techniques de transformation de tissu racinaire avec Agrobacterium rhizogenes sont bien connues par l'homme du métier. A titre illustratif, les racines de plante utilisées à l'étape a) du procédé peuvent être issues d'une transformation par différentes souches bactériennes, comme les souches 15384, 1724, 8196 ou 2659 de Agrobacterium rhizogenes. De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, on peut utiliser à l'étape a) des racines originaires d'une grande variété de plantes, puisque du mycélium de tuber magnatum est produit avec des racines de plantes aussi éloignées que des essences ligneuses et les carottes. Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise à l'étape a) des racines d'une plante appartenant à une essence ligneuse. De manière générale, on utilise à l'étape a) du procédé des racines de plantes hôtes de Tuber magnatum. Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise des racines originaires de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Salix, Ostrya, Corylus, Castanea, Tilla, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus, le cas échéant sous la forme de plantes ou variétés hybrides. Parmi les racines de plantes du genre Populus on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de peupliers : Populus nigra, Populus alba, Populus trichocarpa, Populus deltoides, Populus simonii, Populus tremula, Populus io yunnannensis, Populus canescens et Populus lasiocarpa, ainsi que les hybrides de peupliers, y compris les hybrides de peupliers qui se sont fixés à l'état sauvage et les hybrides de peupliers qui forment des cultivars créés artificiellement par l'homme. Parmi les racines de plantes du genre Cistus, on peut utiliser les racines 15 provenant des espèces suivantes de cistes : Cistus albidus, Cistus crispus, Cistus creticus, Cistus incanus, Cistus monseliensis, Cistus ladaniferus, Cistus laurifolius, Cistus populifolius, Cistus salvifolius, Cistus clusii, Cistus inflatus et Cistus pouzolzii. Parmi les racines de plantes du genre Qercus, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de chênes : Quercus rubra, Quercus agrifolia, 20 Quercus alba, Quercus coccifera, Quercus faginea, Quercus nigra, Quercus robur, (=pedonculata) Quercus petraea, Quercus ilex, Quercus libani, Quercus pyrenaica et Quercus pubescens. Parmi les racines de plantes du genre Corylus, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de noisetiers : Corylus maxima, Corylus colurna, 25 Corylus chinensis, Corylus americana, Corylus avellana, Corylus cornuta, Corylus ferox, Corylus heterophylla, Corylus jacquemontii, Corylus sieboldiana et Corylus tibetica. Parmi les racines de plantes du genre Tilla, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de tilleuls : Tilla platyphyllos, Tilla americana, Tilla 30 amurensis, Tilla chinensis, Tilla cordata, Tilla dasystyla, Tilla xeuchlora, Tilla xeuropacea, Tilla xflavescens, Tilla henryana, Tilla insularis, Tilla intonsa, Tilla japonica, Tilla kiusiana, Tilla mandshurica et Tilla maximaowicziana. Parmi les racines de plantes du genre Salix, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de saules : Salix caprea et Salix viminalis. 2929489 s Parmi les racines de plantes du genre Ostrya, on peut utiliser les racines du charme-houblon (Ostrya carpinifolia). Parmi les racines de plantes du genre Daucus, on peut utiliser les racines provenant de n'importe laquelle des espèces de carottes couramment trouvées 5 dans le commerce pour l'alimentation humaine ou des animaux d'élevage. Préférentiellement, on utilise des racines provenant de plantes choisies parmi le peuplier, le ciste et la carotte, comme cela est illustré dans les exemples. De manière générale, le procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum selon l'invention est réalisé dans des conditions dites axéniques, c'est à io dire dans des conditions contrôlées dans lesquelles le milieu de culture de l'étape a) ne comprend pas de micro-organismes indésirables, par exemple des micro-organismes résultant d'une contamination indésirable des racines de plantes utilisées ou bien d'une contamination indésirable du milieu de culture mis en oeuvre. Tout d'abord, comme pour toute culture cellulaire, on utilise un milieu de 15 culture stérile. La stérilité des racines ou bien des fragments de tissu de Tuber magnatum utilisés peut être obtenue selon des techniques conventionnelles bien connues de l'homme du métier, tels que l'élimination des micro-organismes par une ou plusieurs étapes de lavage, et/ou des étapes préalables d'incubation dans un tampon salin, 20 par exemple un milieu de culture, comprenant des antibiotiques. On peut par exemple utiliser un milieu liquide ou solide comprenant un ou plusieurs antibiotiques choisis parmi le cefotaxime sodique, la carbenciline disodique, la vancomycine, l'ampiciline sodique, le claforan, le sulfate de streptomycine ou la tetracycline, par exemple à une concentration pouvant aller de 100 à 500 pg/mL 25 Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, on réalise une décontamination préalable des racines de plante et le ou les fragment(s) de tissu de Tuber magnatum ne sont pas décontaminés, de telle sorte que les fragments de tissu de Tuber magnatum sont susceptibles de contenir des cellules d'une ou plusieurs espèces bactériennes qui sont présentes naturellement dans 30 l'environnement de ce champignon lorsqu'il est retrouvé en pleine terre. Dans d'autres modes de réalisation du procédé de l'invention, ledit procédé est réalisé dans des conditions totalement axéniques, avec décontamination préalable à la fois (i) du ou des fragment(s) de Tuber magnatum et (ii) des racines de plante, et utilisation d'un milieu de culture stérile. Selon un aspect particulier de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber. Dans un premier mode de réalisation de cet aspect particulier du procédé, l'étape a) de culture est réalisée avec des fragments de tissu de Tuber magnatum qui n'ont pas subi d'étape de décontamination par élimination des micro-organismes associés. Dans un second mode de réalisation de cet aspect particulier du procédé, io l'étape a) de culture est réalisée dans des conditions axéniques et des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber sont ajoutées au milieu de culture au début de l'étape a). De manière générale, les bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, et particulièrement les bactéries associées à Tuber 15 magnatum, peuvent être choisies parmi les bactéries décrites par Barbieri et al. (2007, Environmental Microbiology, Vol. 9 (n°9) : 2234-2246). Préférentiellement, on ajoute des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia. A titre illustratif, on peut utiliser une ou plusieurs souches de Stenotrophomonas maltophilia choisies dans le groupe constitué des souches 20 déposées à l'ATCC et référencées sous les n° BAA-902, 13637D-5, 13270, 13636, 13637, 13843, 14535, 15099, 17445, 17666, 17671, 17672, 17673, 17674, 17675, 17676, 17677, 17678, 17679 et 17806. Des illustrations de mise en oeuvre du procédé de l'invention dans lesquels on met en culture à l'étape a) les fragments de tissu de Tuber magnatum et les 25 racines de plante en présence de bactéries associées aux champignons du genre Tuber, et plus particulièrement en présence de bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia sont décrites dans les exemples. Lorsque le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions axéniques avec ajout de bactéries exogènes naturellement associées aux champignon du 30 genre Tuber, on ajoute au début de l'étape a) la quantité de bactéries appropriée pour obtenir une concentration finale d'au moins 10 et d'au plus 109 cellules bactériennes par mL de milieu de culture au moment de leur ajout. Les exemples montrent qu'à l'étape a), la croissance des bactéries est très modérée. Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la présence de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber favorise le développement et la croissance du mycélium de Tuber magnatum. Ainsi, dans des modes de réalisation préférés du procédé de l'invention, on cultive in vitro une combinaison ternaire de (i) fragment(s) de tissu de Tuber magnatum, (ii) des racines de plante et (iii) des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, et plus particulièrement des bactéries associées à Tuber magnatum. Préférentiellement, l'étape a) de culture in vitro est réalisée à une 10 température allant de 10°C à 30°C et de manière tout à fait préférée allant de 15°C à 25°C. Préférentiellement, l'étape a) de culture in vitro est réalisée à l'obscurité. Le milieu de culture utilisé à l'étape a) peut être tout type de milieu de culture approprié, connu de l'homme du métier. 15 A titre illustratif, on utilise du milieu minimum, aussi désigné � Milieu M � dont la composition est décrite notamment par Bécart et al. (1988, New Phytol., Vol. 108 : 211-218). Préférentiellement, on utilise un milieu de culture comprenant un agent gélifiant. 20 On peut par exemple utiliser de la gélose comme agent gélifiant, afin de réaliser un milieu gélosé. On peut aussi utiliser un agent gélifiant choisi parmi l'agar et le phytogel. On peut par exemple utiliser l'agent gélifiant commercialisé sous la désignation Phytagel� par la société Sigma-Aldrich. La quantité d'agent gélifiant présent dans le milieu de culture peut être 25 facilement adaptée par l'homme du métier. La quantité d'agent gélifiant dépend de l'agent gélifiant utilisé et de la viscosité finale désirée pour le milieu de culture utilisé à l'étape a) du procédé. De manière générale, le milieu de culture utilisé à l'étape a) peut comprendre une quantité d'agent gélifiant d'au moins 3 pour cent en poids, par rapport au poids 30 total du milieu de culture, de préférence d'au moins 5 pour cent en poids, par rapport au poids total du milieu de culture. Généralement, la quantité d'agent gélifiant est d'au plus 15 pour cent en poids, de préférence d'au plus 10 pour cent en poids, par rapport au poids total du milieu de culture. L'étape a) peut être réalisée dans des types variés de conteneurs ou boîtes de culture. L'étape a) est classiquement réalisée dans des boîtes de Petri. Le mycélium, associé ou non aux racines de plantes, est collecté à l'étape b) à un moment où l'homme du métier estime que la quantité de mycélium produit est suffisante pour l'utilisation qui est visée, par exemple pour réaliser une ou plusieurs sous-cultures de mycélium par repiquage ou bien pour réaliser une mycorhization de plantes. A titre illustratif, le mycélium peut être récupéré à l'étape b) lorsque sa taille à la fin de l'étape a) atteint 50 millimètres ou plus, par exemple 80 millimètres ou plus. io En général, pour collecter la quantité de mycélium suffisante pour réaliser des sous-cultures ou des mycorhizations, la durée de l'étape a) du procédé est d'environ au moins trois semaines, par exemple d'environ au moins quatre, cinq ou six semaines. La durée de l'étape a) peut être supérieure à six semaines mais cela n'est en général pas nécessaire puisque la quantité de mycélium produit est 15 suffisante pour réaliser des sous-cultures. Pour une production massive d'inoculum, en vue d'une mycorhization contrôlée, les cultures peuvent être entretenues pendant plusieurs mois, par exemple pendant une durée de deux mois ou plus et pouvant aller jusqu'à douze mois. Comme cela est illustré dans les exemples, le mycélium qui est collecté à 20 l'étape b) peut ensuite être utilisé pour réaliser des sous-cultures. Ainsi, grâce au procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum qui est décrit ci-dessus, on obtient du mycélium dont la culture peut ensuite être poursuivie sur une longue période de temps, sans nécessiter à nouveau le recours à l'utilisation de fragments de tissu de Tuber magnatum, autres que le mycélium qui 25 est collecté à l'étape b). Dans des modes de réalisation préférés, le procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprend une étape de repiquage du mycélium collecté à l'étape b), en présence de racines de plantes, afin de réaliser un ou plusieurs sous-cultures de mycélium de Tuber magnatum en présence de nouvelles racines de 30 plantes (ROC ou hairy roots). Dans d'autres modes de réalisation préférés, le mycélium de Tuber magnatum collecté à l'étape b) est ultérieurement utilisé dans un procédé de mycorhization de plantes. La réalisation de sous-cultures de mycélium ou la réalisation d'un procédé de mycorhization nécessite une étape de repiquage du mycélium collecté à l'étape b) du procédé ci-dessus, par transfert dans un milieu de culture approprié. En conséquence, dans certains modes de réalisation, le procédé selon l'invention comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture. Dans les modes de réalisation du procédé dans lesquels on réalise des sous-cultures, ledit procédé comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) ; Le mycélium peut-être cultivé, ou � sous-cultivé � in vitro à l'étape d) pendant plusieurs semaines, tant que le milieu de culture contient suffisamment de nutriments permettant le maintien ou la croissance du mycélium, sans perte de viabilité. De manière générale, on a montré dans les exemples que du mycélium collecté à l'étape b) du procédé pouvait être repiqué et cultivé in vitro pendant au moins six semaines. De manière générale, le milieu de culture utilisé à l'étape d) peut être le même que le milieu de culture utilisé à l'étape a). Dans certains modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en l'absence de racines de plante et sans ajout de bactéries exogènes. Lorsque aucun ajout de bactéries exogènes n'est effectué aux étapes c) et d), des bactéries peuvent néanmoins être présentes. En effet, dans les modes de réalisation de l'étape a) dans lesquels des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber sont présentes dans le milieu de culture, ces bactéries colonisent le mycélium en croissance et peuvent être transférées avec le mycélium collecté à l'étape b) pour les étapes suivantes de procédé. Dans certains autres modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en l'absence de racines de plante mais on ajoute des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, en particulier des bactéries naturellement associées aux Tuber magnatum, telle que Stenotrophomonas maltophilia. Dans ce cas, les bactéries sont ajoutées dans la même gamme de quantité que pour l'étape a) du procédé. Dans encore d'autres modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en présence de racines de plante. On peut utiliser l'un quelconque des types de racines de plante qui peut être mis en oeuvre pour réaliser l'étape a) du procédé. Ainsi, dans certains modes de réalisation des étapes c) et d), le milieu de culture comprend (i) du mycélium de Tuber magnatum, (ii) des racines de plante et (iii) des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, en particulier des bactéries associées aux Tuber magnatum. Il résulte de l'exposé qui précède que la présente invention concerne aussi un procédé de repiquage de mycélium de Tuber magnatum, ou de réalisation d'une sous-culture de mycélium de Tuber magnatum, qui comprend les étapes suivantes : A) placer dans un milieu de culture du mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape b) du procédé d'obtention décrit ci-dessus, et B) cultiver dans ledit milieu de culture le mycélium incubé à l'étape A). Les caractéristiques des étapes A) et B) du procédé ci-dessus sont identiques aux caractéristiques des étapes c) et d) du procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum décrit précédemment. La présente invention est également relative à un mycélium de Tuber magnatum qui a été collecté à l'étape b) du procédé d'obtention décrit ci-dessus. La présente invention concerne aussi un mycélium de Tuber magnatum qui a été obtenu à la fin de l'étape d) du procédé d'obtention décrit ci-dessus. L'invention a aussi pour objet un mycélium de Tuber magnatum qui a été obtenu à la fin de l'étape B) du procédé de repiquage décrit ci-dessus. Le mycélium de Tuber magnatum qui peut être obtenu (i) soit à l'étape a) du procédé d'obtention ci-dessus, (ii) soit à l'étape d) du procédé d'obtention ci-dessus, (iii) soit à l'étape B) du procédé de repiquage ci-dessus, peut être ensuite utilisé pour la mycorhization de plantes en vue de produire des truffes blanches prêtes à être consommées. On peut utiliser des techniques de mycorhization conventionnelles bien connues de l'homme du métier qui ont déjà été appliquées à des espèces de champignons autres que Tuber magnatum. Ainsi, la présente invention est également relative à un procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules ou de boutures avec un mycélium de Tuber magnatum, en interaction ou non avec des racines de plantes, obtenu - par le procédé d'obtention décrit ci-dessus, - par le procédé de repiquage décrit ci-dessus, ou - avec un mycélium de Tuber magnatum tel que décrit ci-dessus; b) culture in vitro des plantules inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes. Pour la production d'inoculum et la réalisation du procédé de mycorhization ci-dessus, l'homme du métier peut se référer à de nombreuses publications ou ouvrages les décrivant, par exemple à l'article de Bokor (1954, Erdészeti Kutatàsok, Budapest, Vol. 11, pp. 27-45), à l'article de Le Tacon et Valdenaire (1980, Revue Forestière Française, Vol. XXXII, n°3, pp. 1664-1668), à l'article de Le Tacon et al. (1983, Annales des Sciences Forestières, vol.40, n°2, pp. 165-176), à l'article de Boutekrabt et al. (1990, Agronomie, Vol. 2, pp. 127-132), à l'article de Garbaye et Churin (1997, Forest Ecology and Management, Vol. 98, pp. 221-228), à l'article de Bécard et Piché (1989, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 55, pp. 2320-2325), à l'article de Mortier et al. (1989, Agric. Ecosyst. Environ., Vol. 28, pp. 351-354), ou encore à l'article de Wenkart et al. (2001, Plant Cell Reports, Vol. 20, pp. 369-373). Pour la mise en oeuvre du procédé de mycorhization ci-dessus, on utilise de préférence des plantules d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus, le cas échéant sous la forme de plantes ou variétés hybrides. De manière tout à fait préférée, on utilise des plantules ou boutures choisies parmi Salix, Ostrya, Populus, Quercus et Cistus. Dans certains modes de réalisation du procédé de mycorhization ci-dessus, celui comprend une étape c) de repiquage en terre des plantules mycorhizées obtenues à l'étape b). De manière générale, des truffes blanches, prêtes à être consommées sont obtenues après une durée d'au moins environ trois ans, parfois d'au moins environ six ans, suivant l'étape c) de repiquage en pleine terre. La présente invention est également illustrée par les exemples de réalisation ci-après. EXEMPLES Exemple 1 : Procédé de production de mvcléium de Tuber mapnatum 1-Travaux préliminaires : A) Production de racines d'une plante hôte de Tuber maqnatum, transformées par A . rhizogenes : Le peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba, clone INRA 5 717-1 B4 A1) Transformation de boutures de Peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba) INRA 717-1 B4 par différentes souches d'A. rhizogenes. Quatre souches bactériennes ont été testées (souches fournies par Yves Dessaux, DR CNRS, Gif/Yvette. Ces souches appartiennent au domaine public et sont 10 largement exploitées dans le milieu scientifique). Il s'agit des souches : - 15834 : Souche à mannopine et agropine - 8196 : Souche à mannopine - 2659 : Souche à mannopine 15 - 1724 : Souche à mannopine Dans un premier temps, une production classique de racines transformées par A. rhizogenes a été réalisée. Cela nécessite la mise en contact des souches bactériennes avec des tissus blessés de Peuplier (hybride Populus tremula X 20 Populus alba) : fragments de feuilles et tiges issues de boutures produites en conditions axéniques au laboratoire INRA de l'UMR 1136. Des excellents résultats de transformation ont été obtenus avec les souches 15834 (100%) et 1724 (75%). De ces travaux, une sélection d'un clone racinaire a été réalisée. Il est issu 25 de la transformation du Peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba INRA 717-1 B4) par la souche 15834 d'A. rhizogenes. La transformation et l'entretien des racines transformées (� hairy roots � ou � Root Organ Cultures � -ROC-) se fait sur le milieu minimum, milieu M (Bécard et al. 1988, New Phytol. 108:211-218) 30 Il est important de noter que les racines transformées par la souche 15834 d'Agrobacterium rhizogenes ne sont pas des Organismes Génétiquement Modifiés (OGM). Il s'agit seulement d'une transformation naturelle générée en conditions contrôlées et axéniques. 35 2-Mise en culture de Tuber mapnatum Mise en contact de morceaux de carpophore de T. magnatum (1 cm3 environ) avec des racines (hairy roots) de ciste (Cistus incanus) et/ou de peuplier (Populus tremula x Populus alba) le 11 janvier 2006 sur milieu M (voir composition milieu minimum, dit � milieu M �). D'autres espèces hôtes ou éventuellement non hôtes pourrait être exploitées pour la synthèse de racines transformées dans la perspective de produire du mycélium de Tuber magnatum. 1. Matériel biologique : Racines de peuplier (Populus tremula x Populus alba, clone INRA 717-1E4) transformées par la souche 15834 d'A. rhizogenes. Racines de Ciste (Cistus incanus) transformées par Agrobacterium rhizogenes. Morceaux de carpophores de truffe blanche (Tuber magnatum) identifiés comme appartenant à la souche Tm(520). 2. Initiation de la culture du mycelium de truffe (Tuber magnatum) Après 2 à 3 semaines de culture à 25°C dans l'obscurité, on constate un développement du champignon, sous forme mycélienne, à partir des morceaux de carpophore en présence de racines transformées de Cistus, mais surtout en présence de racines de Peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes. Cette initiation de la croissance est induite sans même qu'il y ait contact entre les racines transformées et le morceau de carpophore, suggérant une induction de la croissance par des composés d'origine racinaire (présents dans les exsudats de racines transformées). Dès cette première étape de culture, un troisième � partenaire � biologique est identifiable : On note la présence récurrente d'une (ou plusieurs espèces) bactérienne(s). Le typage moléculaire (région 16S de l'ADN) de cultures bactériennes, isolées à partir de cette 1 ère expérience, révèle qu'il s'agit d'une souche de Stenotrophomonas maltophilia. Cette bactérie pourrait être également impliquée dans la croissance mycélienne. Exemple 2 : Procédé de repiquage, ou de éalisation de sous-cultures, du mycélium de tuber magnatum Repiquage de l'ensemble du système (racine + mycelium + bactérie(s)) dans un milieu identique à celui utilisé à l'exemple 1. On note une très bonne croissance et une excellente reprise, indiquant la possibilité de réaliser des � sous-cultures � de cette première culture mycélienne de Tuber magnatum. A partir de cette nouvelle boîte, un nouveau repiquage est réalisé le 9/02/2007. Une bonne reprise de croissance de T. magnatum est observée. Cette fois, seul le mycelium (avec éventuellement la ou les espèces bactériennes) a été prélevé et mis en contact de racines transformées de peuplier, fraîchement repiquées. On observe une très bonne croissance dans la totalité des boîtes de culture. La Figure 1 illustre la croissance du mycélium de Tuber magnatum en fonction du temps de culture. io On peut noter que toutes les sous-cultures sont réalisées en présence de nouvelles racine de Peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba), transformées par A. rhizogenes, en croissance. Le mycelium seul ne pousse presque plus en absence de racine. On observe simplement quelques hyphes fongiques très dispersées en � recherche � du partenaire végétal, suivi d'un 15 ralentissement rapide de la croissance. Les racines, les exsudats racinaires ou les métabolites issus de ces racines semblent être indispensables à la croissance du champignon. Le rôle positif (et donc la présence) de certaines bactéries, comme Stenotrophomonas maltophilia pourrait également être déterminant. Il faut noter que dans cette interaction, au moins tripartite, le développement bactérien est très 20 modéré, éventuellement régulé par les autres éléments présents dans le milieu. Exemple 3 : Tvpage moléculaire de la spécificité de la culture de mycélium de Tuber magnatum On a vérifié, par typage moléculaire, la spécificité de la culture mycélienne 25 (Tuber magnatum). On a réalisé une extraction des ADN et on a réalisé le séquençage des ADNs extraits. On a confirmé le maintien de Tuber magnatum en culture axénique par la comparaison avec les bases de données du NCBI (http:/,www.ncbi.nlm.nih.gov/) 30 des séquences de la région ITS de l'ADNr amplifliées à partir de l'ADN extrait du mycélium néoformé en présence de hairy roots (Ciste et peuplier) et des morceaux de carpophore de Tuber magnatum, initialement fournis (Tm 520) : 98 à 100% d'homologie après correction des séquences brutes. 35 Exemple 4 : Procédé de production de mvcléium de Tuber magnatum Mise en contact de différents morceaux de carpophore de Tuber magnatum (issus de différentes truffes û carpophores -) avec des racines de ciste (Cistus incanus) transformées par A. rhizogenes. Mise en interaction des racines transformées et des morceaux de carpophores sur 5 milieu M, le 9/02/2007. - Tm(614) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(616) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(616) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(618) + /- Cistus incanus (hairy root) 10 - Tm(620) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(631) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(645) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(650) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(653) + /- Cistus incanus (hairy root) 15 - Tm(659) + /- Cistus incanus (hairy root) Les expériences ont été réalisées à partir de morceaux de truffe blanche (Tuber magnatum) issus de 9 carpophores différents prélevés en pleine terre. Quelques expériences d'interactions ont également été réalisées entre les 20 racines de peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes et T. magnatum. Tout d'abord, on constate que la croissance de Tuber magnatum est initiée très rapidement en présence de racines de peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes. La croissance du champignon est 25 manifestement plus importante dans ces conditions qu'en présence de racines de Cistus incanus transformées par A. rhizogenes. Dans l'expérience consistant à comparer la croissance de Tuber magnatum, à partir de morceaux de carpophores, en présence et en absence de racine de Cistus incanus transformées par A. rhizogenes, on constate que pour 60% (6/10) 30 des boîtes contenant les deux partenaires biologiques (racines et champignon) la croissance de Tuber magnatum est stimulée. En absence de racine, aucune croissance mycélienne de Tuber magnatum n'est observable à partir de morceaux de carpophores dans nos conditions de croissance (milieu M, 25°C et obscurité). La Figure 2 illustre cette stimulation de la croissance mycélienne de Tuber 35 magnatum en présence ou en l'absence de racines de Cistus incanus transformées par A. Rhizogenes, six semaines après l'incubation des morceaux de carpophores de T. magnatum avec les racines transformées de Cistus incanus. Exemple 5 : Procédé de réalisation de sous-cultures de mycélium de Tuber 5 mapnatum en présence de racines de Daucus carota Il est important de souligner que des racines de carotte (clone DC1), transformées par A. rhizogenes (fournies par le Pr. G. Bécard), stimulent également la croissance de Tuber magnatum, à partir des cultures de T. magnatum obtenues en interaction avec les racines transformées de Cistus ou Populus (souche T 10 magnatum. Tm520). La stimulation de croissance de Tuber magnatum est moins importante qu'avec les racines de Populus ou Cistus. Cependant, ces résultats démontrent que des racines transformées de plantes non hôtes ont un effet positif sur la croissance mycélienne de ce champignon (voir figures 3 à 6). 15 Les figures 3 à 6 montrent la souche Tm520 de Tuber magnatum en interaction ou non avec des hairy roots (racines transformées par A. rhizogenes) de diverses plantes, respectivement Populus (figure 4), Daucus carota (figure 5) et Cistus (figure 6). 20 Exemple 6 : Procédé de mycorhization avec le mycélium de Tuber maanatum. Plusieurs procédés de mycorhization contrôlée du peuplier par T. magnatum on été mis au point. Quel que soit le procédé, on met en interaction des boutures de peuplier (hybride 717-1 B4 Populus tremula X Populus alba) avec le mycélium de 25 Tuber magnatum issu des cultures axéniques de T. magnatum en interaction avec les hairy roots (ROC) de peuplier. Différents systèmes ont été développés. Selon une première alternative de procédé, des cultures axéniques en tube ont été réalisées. Des fragments de boutures stériles de peuplier sont déposés sur du milieu M coulé stérilement dans des tubes de verre. Après développement du 30 système racinaire (2 semaines), un expiant de gélose contenant une forte densité de mycélium de T. magantum (issu d'une culture axénique ROC x T. magnatum) est déposé dans le fond du tube. Selon une seconde alternative de procédé, des mycorhizations de racines de peupliers ont été réalisées sur boîtes de Pétri carrées (Figure 7). Un milieu gélosé 35 (milieu M contenant seulement lg/l de saccharose) est déposé sur la moitié inférieure de la boîte et deux morceaux de tige de peuplier (boutures) sont introduits dans le milieu pour générer de nouvelles boutures. Les boîtes sont incubées à une température de 20 à 25°C avec une alternance jour/nuit (12h/12h). Les parties inférieures des boîtes sont protégées de la lumière par des pochettes plastiques noires ou de l'aluminium. Après initiation des bourgeons (partie supérieure de la boîte) et des racines (dans le milieu gélosé, en partie inférieure), un expiant gélosé d'au moins 2 à 3 cm2 et contenant du mycelium de T. magnatum (issu d'une culture axénique ROC x T. magnatum) est déposé sur la partie gélosée colonisée par les racines. Les premiers résultats ont montré une initiation de la croissance de T. io magnatum en présence des racines de boutures de peuplier. Après plusieurs semaines, ou mois, de contact, la formation de manchons fongiques (similaires à des ectomycorrhizes) est observable sur certaines extrémités racinaires. REVENDICATIONS1. Procédé pour l'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a). 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les fragments de 10 tissu de Tuber magnatum sont choisis parmi des fragments de carpophore, des fragments de mycorhize et des fragments de mycélium. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les racines de plantes consistent en des racines transformées par Agrobacterium 15 rhizogenes. 4. procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les racines proviennent de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Ables, Coty/us, Castanea, Tilla, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les racines proviennent de plantes choisies parmi le peuplier, le ciste et la carotte. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que 25 l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de 30 culture comprend des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée à l'obscurité. 20 2929489\ 22 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture. 5 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) ; 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'à l'étape d) le mycélium est cultivé pendant une durée allant jusqu'à 6 semaines ou plus 12. Mycélium de Tuber magnatum caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 11. 13. Procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules avec un mycélium de Tuber magnatum selon la revendication 12; b) culture in vitro des plantules inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape c) de repiquage en terre des plantules mycorhizées obtenues à l'étape b).25