Brevet FR2930645A1 — publié le 20091030

La présente invention est relative à une méthode de sélection in silico de molécules présentant une activité sur les cellules cutanées et susceptibles de rentrer dans-la composition de produits cosmétiques de soin pour la peau et pour des phanères telles que le cheveu et l'ongle, ainsi qu'aux compositions cosmétiques contenant de telles molécules et à leurs utilisations dans le domaine cosmétique. La � poche alternative � du récepteur de la vitamine D a été décrite dans un article de M Mizwicki et al (J Proc Natl Acad Sci USA, 101 : 12876-81, 2004). De plus, il a été montré que les ligands spécifiques de cette � poche alternative � ont des structures particulières et induisent des réponses particulières dites � réponses rapi- des � (Norman AM, Endocrinology, ahead of prirt,doi :10.1210/en.2006-0946). Par ailleurs, il a été établi lors d'études de réplication de cultures de cellules, ainsi que iors d'études de cellules de peaux de perscni es âgées, que les cellules cutanées peu-vent passer dans un état bien particulier qualifié de � sénescent � par les spécialistes en Biologie Cellulaire. Dans cet état, elles ne peuvent plus se reproduire, et elles expriment une enzyme particulière appelée � bêta-galactosidase associée à la sénescence � ou SA bêta-gal, caractérisée par le fait qu'elle est active à pH 6 (Dimri GP et al, Proc Nat Acad Sci USA, 92.: 9363-67, 1995). De plus, on sait que les cellules, notamment les cellules cutanées, peuvent passer à l'état de � cellules sénescentes � lorsqu'elles sont soumises à des stress oxydatifs (Chai- niaux F. et al, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 34 : 1331-9, 2002). On sait aussi que les � cellules sénescentes � ont des effets néfastes sur le tissu environnant, (Funk WD et ai, Exp Cell Res, 258: 270-8, 2000) et qu'il serait très intéressant de disposer de moyens pour éviter leur apparition. Par ailleurs, on sait que la protéine p53 joue un rôle important dans l'expression des protéines nécessaires à la formation de l'enveloppe cornée qui caractérise une bonne différentiation des kératinocytes de peau ou de cheveu (Brenner L et al, Cell Growth Differ, 4 : q93-1004, 1993). Et l'on sait qu'une enveloppe cornée en bon état est nécessaire pour une '-onne hydratation de la couche cornée (stratum corrieum). Il serait donc intéressant de pou-voir disposer de molécules susceptibles de favoriser l'expression de p53 dans les cellules cutanées. Enfin, on sait que l'homéostasie du follicule pileux dépend du récepteur de la Vitamine D, mais non pas de sa liaison avec la Vitamine D dans sa poche classique dite � génomique � (Demay MB et al, J Steroid Biocheni Mol Biol, 103 : 344-6, 208) Or il a maintenant été découvert de façon surprenante que des molécules présentant une affinité in silico pour la � poche alternative � du récepteur de la Vitamine D, permettent d'éviter que les cellules cutanées passent à l'état de � cellules sénescentes �. De plus, il a été découvert de façon également surprenante, que ces molécules présentant une affinité in silico pour la � poche alternative � du récepteur de la Vitamine D, favorisent l'expression de la protéine p53 dans les noyaux cellulaires. Aussi un but de la présente invention est-il de fournir une méthode d'identification de molécules présentant une activité sur les cellules cutanées et susceptibles de rentrer dans la composition de produits cosmétiques de soin de la peau ou des phanères telles que le cheveu. Plus particulièrement, cette méthode permet d'identifier des molécules susceptibles d'éviter la formation de � cellules sénescentes � dans la peau sous l'effet de stress oxydatifs. De même, cette méthode permet aussi d'identifier des molécules susceptibles de favoriser l'expression de la protéine p53. Ce but ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, par une méthode de sélection in silico de molécules présentant une activité sur 'es cellules cutanées utilisable en cosmétique caractérisée par le fait qu'elle consiste à rechercher des ligands de la poche alternative non génomique du récepteur de la Vitamine D. Avantageusement, elle consiste à rechercher des molécules qui ne sont pas ligands de la poche classique génomique du récepteur de la Vitamine D. De préférence, cette méthode consiste à utiliser le calcul du score GOLD. La présente invention est également relative à des compositions cosmétiques qui contiennent une quantité active d'au moins une des molécules sélectionnées par la méthode ci-dessus. Avantageusement, une telle composition cosmétique caractérisée par le fait qu'elle contient une quantité active d'au moins une molécule présentant un score GOLD égal ou supérieur à 50 pour la poche alternative non génomique du récepteur de la Vitamine D De préférence, une telle compositions cosmétiques contient au moins une molécule dont le score GOLD est inférieur à 50 pour la poche classique génomique du récepteur de la Vitamine D. Avantageusement, une composition cosmétique selon la présente invention peut être utilisée pour prévenir la sénescence cutanée, pour le traitement des peaux sèches, comme tonique capillaire. Selon un mode de réalisation de la présente invention, au moins une molécule sélectionnée selon la présente méthode peut être introduite dans un complément alimentaire. Ainsi, la recherche des molécules dont la structure tridimensionnelle permet la formation de liaisons hydrogène ainsi que de liaisons de Van der Waals avec l'intérieur de la po- che � alternative � de la protéine � récepteur de la vitamine D �, de manière que l'affinité globale de ces ligands pour cette zone particulière de la protéine soit au moins supérieure à un certain seuil. On se sert pour cela de la structure de la poche A décrite par Mizwicki MT (déjà cité), du Récepteur de la Vitamine D enregistré à la banque de donnée des protéines PDB sous le code 1 DB1, et de l'algorithme d'amarrage GOLD (Verdonk ML et al, Proteins, 52 : 609-623, 2003). Pour chaque pose d'une molécule ligand dans cette poche, la méthode de calcul de Verdonk permet de calculer un score GOLD à partir des interactions de Van der Waals intramoléculaires et ligand-protéine, des déformations du ligand (angles de torsion), ainsi que des liaisons hydrogène ligand-protéine. D'après ce calcul, le score GOLD est supérieur à 80 pour les ligands de référence du récepteur de la Vitamine D, et on admet qu'il doit être d'au moins 50 pour que l'affinité soit intéressante. Les molécules qui présentent ainsi un score GOLD égal ou supérieur à 50 pour la poche � Alternative � appelée également non-génomique du récepteur de la Vitamine D, peuvent être utilisées pour la réalisation industrielle de compositions cosmétiques destinées à éviter l'apparition de � cellules sénescentes �, ou au traitement des peaux sèches, ou en- core au traitement des follicules pileux. Avantageusement, on préférera les molécules qui présentent un score GOLD égal ou supérieur à 50 pour la poche � Alternative �, et un score GOLD inférieur à 50 pour la poche classique dite génomique du récepteur de la Vitamine D. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, est en particulier relative à des exemples de réalisatior de la présente invention qui permettront à l'homme du métier de mieux comprendre celle-ci. Exemple 1 : Amarrage de molécules dans la poche � Alternative � non-génomique du Récepteur de la Vitamine D (VDR). La méthode d'amarrage GOLD mise au point par Verdonk ML et al (déjà cité) permet l'évaluation du degré d'interaction entre une poche située à l'intérieur de la structure tri-dimensionnelle d'une protéine telle qu'un récepteur et une molécule (ligand potentiel) introduite dans cette poche. Le récepteur de la Vitamine D présente deux poches se recoupant partiellement, la poche génomique identifiée par Rochel N et al (Mol Cell 5, 173-179, 2000) par radiocristallographie et enregistrée dans la base de donnée des protéines sous le code PDB 1 DB1, et la poche alternative non-génomique proposée par Mizwicki ML et al (déjà cité) à partir de l'étude in silico de la structure établie par Rochel. D'après la méthode de Verdonk, pour chaque position d'une molécule donnée dans une poche protéinique, on peut calculer un score GOLD à partir des distances inter-atomes suivant la Formule : Score = SH ext + 1.375 Svdw ext + Svdw int + Sdeform Où : SH ext est la contribution des liaisons hydrogène entre la protéine et le ligand, Svdw ext est la contribution des interactions de Van der Waals entre la protéine et le ligand, Svdw int est la contribution des interactions de Van der Waals intramoléculaires du li- gand, et, Sdeform est la contribution des interactions de déformation (torsion) du ligand. Pour la poche génomique le ligand standard est la la,25(OH)2-vitamin D3 ou 1,25D. Pour la poche non génomique le ligand standard est le Luminestérol ou JN utilisé par Mizwicki pour son étude in silico. On considère qu'un score GOLD inférieur à 50 est l'indication d'une interaction faible entre le ligand potentiel et le récepteur considéré. Suivant la présente invention, on a évalué le score GOLD de deux molécules, le 7-déhydrocholestérol et l'ergostérol. Les résultats sont donnés dans le Tableau I pour les positions trouvées les plus favorables dans la poche alternative (A) non-génomique du VDR. Tableau I Ligand Score Vdw nt Torsion Vdw ex H ext JN 82,15 -10,81 -1,77 63,64 7,22 1-25D 54,97 -11,59 -8,07 52,07 3,03 7-déhydrocholestérol 60,72 -7,58 -3,89 52,50 0,00 Ergostérol 67,61 -3,05 -3,48 53,92 0,00 Les résultats obtenus pour les positions les plus favorables dans la poche génomique 20 (G) du VDR sont donnés au Tableau Il. Tableau Il Ligand Score Vdw int Torsion Vdw ext H ext JN 37,63 -11,74 -4,17 35,29 5,02 1-25D 81,52 -9,63 -7,12 61,88 13,18 7-dehydrocholesterol 34,04 -9,44 -3,81 34,39 0,00 Ergostérol 47,20 -4,91 -5,45 41,86 0,00 On constate que les scores GOLD sont, comme prévu, très supérieurs à 50 pour JN 25 dans la poche A, et pour 1-25D dans la poche G. On constate également de façon prévisible que les scores GOLD pour le 7-déhydrocholestérol et l'ergostérol dans la poche (3 sont nettement inférieurs à 50 . Mais par ailleurs, on constate de façon surprenante que les scores GOLD pour le 7-déhydrocholestérol et l'ergostérol dans la poche � Alternative � non génomique du récepteur de la Vitamine D sont très nettement supérieur à 50 (respectivement de 60,72 et 67,61), ce qui indique une bonne interaction pour ces ligands, et de ce fait une bonne probabilité d'activité biologique. Les molécules présentant un score GOL[) (évalué tel que ci-dessus) supérieur à 50 peuvent ensuite être soumises à des tests biologiques destinés à mettre en évidence leur activité sur les cellules cutanées, tels que ceux qui sont décris aux Exemples 2 et 3, ou tout autre test approprié. Exemple 2 : Prévention de l'apparition de � cellules sénescentes � On utilise la méthode décrite par De Magalhaes JP et al (FEBS Letters 523: 157-62, 2002) pour déterminer l'activité du 7-déhydrocholestérol et de l'ergostérol, identifiés tel qu'à l'Exemple 1 comme présentant un score GOLD supérieur à 50 pour leur liaison dans la poche Alternative non-génomique du récepteur de la Vitamine D. Le 7-déhydrocholestérol utilisé est un échantillon de pureté supérieure à 96% fourni par la société MMP Inc. L'ergostérol utilisé est un produit commercialisé par LGC Promochem (France). Des fibroblastes de derme de la même souche BJ que celle utilisée par Chainiaux F. et al (2002, déjà cité) sont mis en culture par les méthodes classiques. L'absence de cytotoxicité du 7-déhydrocholestérol et de l'ergostérol, sur une durée de 9 jours, est vérifiée dans la gamme 0,25 à 1 pg /ml. Pendant 5 jours les fibroblastes sont exposés 1 fois par jour à une dose d'ultra-violets B de 500 mj/cm2. A la suite de chaque irradiation, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant 0,25 ; 0,5 ; ou 1 pg /ml de 7-déhydrocholestérol, ou bien 0,1 ; 0,25 ; ou 0,5 pg/ml d'ergostérol. Avant chaque nouvelle irradiation, ces milieux sont remplacés par un milieu ne conte- nant pas de 7-déhydrocholestérol ou d'ergostérol ; Après la dernière irradiation, les cellules sont laissées 72 heures en contact avec du milieu supplémenté en 7-déhydrocholestérol ou ergostérol, renouvelé toutes les 24 heures. Au terme de cette dernière période de contact, l'activité bêta-galactosidase à pH6 (bêta-galactosidase associée à la sénescence ou SA bêta-gal) est évaluée suivant la méthode de Dimri G.P. et al (déjà cité), sur au moins 400 cellules pour chaque concentration en 7-déhydrocholesterol ou ergostérol. L'expérience a été réalisée deux fois. Les valeurs moyennes des pourcentages de cellules exprimant la SA bêta-gal sont regroupées dans le Tableau III ci-après: Tableau III Condition SA bêta-gal SA bêta-gal lére expérience 2ème expérience Contrôle sans UV 31,04 41,19 UV et 0 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 38,65 49,19 UV et 0,25 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 27,00 33,19 UV et 0,5 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 26,17 34,13 UV et 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 26,28 35,48 UV et 0 tag /ml d'ergostérol 38,65 44,19 UV et 0,1 tag d'ergostérol 25,13 34,32 UV et 0,25 tag d'ergostérol 24,82 35,78 UV et 0,5 tag d'ergostérol 27,80 31,78 On constate que : les dommages causés par les expositions répétées aux rayons ultra-violets B ont entraîné une augmentation significative des fibroblastes présentant l'activité SA bêta-gal caractéristique des cellules qui ne peuvent plus se reprocluire (qualifiées de � sénescentes �), le traitement des cellules par les deux stérols après les irradiations, a permis une atténuation des dommages causés par les ultra-violets de façon significative dès la concentration de 0,25 pg/ml pour le 7-dehydrocholesterol et 0,1 pg/ml pour l'ergostérol, ce qui se traduit par un nombre de fibroblastes � sénescents � qui reste inférieur à celui des cultures n'ayant subi aucune irradiation. Il apparaît ainsi, que l'utilisation de 7-déhydrocholestérol ou d'ergostérol, deux ligands potentiels de la poche Alternative non génomique du récepteur de la Vitamine D tels qu'à l'Exemple 1, permet d'éviter l'apparition de cellules cutanées sénescentes exprimant la SA bêta-gal. Exemple 3 : Activation de la protéine p53 Pour protéger les cellules cutanées contre les stress oxydatifs, il est intéressant d'activer la protéine p53 (Decraene D et al, J Invest Dermatol, 125: 1026-31, 2005). On a donc recherché si les molécules sélectionnées comme à l'Exemple 1 présen- tent cette propriété. On a évalué pour cela la stimulation de l'expression de la protéine p53 dans les fibroblastes de l'Exemple 2 sous l'influence de 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol ou 0,5 pg/ml d'ergostérol dans le milieu de culture pendant 24 h. Un contrôle positif a été réalisé en irradiant une culture des mêmes cellules par une dose de 150 mj/cm2 d'UVB. Après ces traitements on a extrait les protéines nucléaires des fibroblastes. Puis, on a incubé 5pg de protéines nucléaires dans une microplaque recouverte d'un oligonucléotide portant la séquence d'ADN spécifique susceptible de lier la protéine p53. Enfin, la teneur en protéine p53 liée a été évaluée par colorimétrie au moyen d'un anti-corps spécifique de cette protéine et d'un anticorps conjugué à la peroxydase (test TransAM de Active Motif, Rixensart, Belgique). Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau IV ci-après. On a ainsi trouvé de façon surprenante que le traitement au 7-dehydrocholesterol en l'absence d'UV a augmenté de 19% la teneur des fibroblastes en protéine p53, et que le traitement à l'ergostérol dans les mêmes conditions a augmenté cette teneur de 30%. On a aussi confirmé que les expositions aux ultra-violets, en absence de stérol, ont multiplié par 4 la teneur des fibroblastes en protéine p53. Tableau IV p53 Conditions par rapport au Contrôle à 0 pg/ml de 7- déhydrocholestérol 0 pg/mI de stérol 1 1 pg/ml de 7-déhydrocholestérol 1,19 0,5 pg/ml d'ergostérol 1,30 0 pg/ml de sterol + UV 4,05 Cet exemple permet de mettre en évidence de façon surprenante que le 7-déhydrocholestérol et l'ergostérol, deux ligands potentiels de la poche Alternative non génomique du récepteur de la Vitamine D tels qu'à l'Exemple 1, stimulent la protéine de défense p53 nécessaire à la prévention des dommages causés par les rayonnements ultra-violets tels que l'apparition de � cellules sénescentes � qui ont perdu la capacité de se reproduire et qui ont des effets néfastes sur le tissu environnant. Différentes compositions sont données ci-après à titre d'exemple pour illustrer les différents modes d'action ou d'utilisation du 7-déhydrocholesterol et de l'ergostérol. Composition N°1 : Crème Cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. On procède comme pour la réalisation d'une émulsion classique huile dans eau, c'est-à-dire qu'on mélange sous agitation à 85°C une phase hydrophobe contenant une quantité suffisante de 7-déhydrocholesterol pour l'obtention d'une concentration finale de 0,05% dans le produit, et une phase aqueuse contenant chacune des matières premières destinées à conférer au produit les propriétés d'usage habituelles : stabilité, sécurité, étalement facile, toucher final agréable, etc. On refroidit ensuite sous agitation. Cette crème est appliquée sur le visage, le cou et les mains, de préférence le matin pour préparer la peau aux agressions quotidiennes Composition N°2 : Crème Cosmétique de protection contre les stress de l'exposition au soleil et aux pollutions. On réalise comme ci-dessus une émulsion huile dans eau contenant de l'ergostérol, de l'alpha-tocophérol ainsi que de l'acétate d'alpha-tocophérol ; et lors du refroidissement, à 45°C, on rajoute du phosphate de vitamine C en quantité suffisante pour arriver aux concentrations en poids dans la composition finale de : - ergosterol 0,02 % - alpha-tocophérol 0,05 - acétate d'alpha-tocophérol 0,2 % - phosphate de Vitamine C, sel de Mg 0,2 %. Cette formulation est une crème de jour qui contient en outre une quantité suffisante de filtres anti-UV pour arriver à un facteur de protection SPF de 6 contre l'érythème solaire. Composition N°4 : Crème Cosmétique pour le soin des peaux sèches On réalise comme pour la Composition 1 une émulsion huile dans eau, en mélangeant à 85°sous forte agitation une phase huileuse contenant du 7-déhydrocholestérol en quantité suffisante pour arriver à une concentration finale de 0,04% dans la formulation, et une phase aqueuse contenant notamment du glycérol et de la sérine. Ce produit est destiné à être appliqué sur le visage plus particulièrement le soir après 30 le démaquillage. Composition N°5 : Tonique capillaire anti-chute On réalise une lotion hydroalcoolique contenant 0,02% d'ergostérol à côté des quantités appropriées des matières premières destinées à conférer au cheveu les qualités cos-35 métiques voulues de facilité de coiffage, toucher, brillance, parfum. Cette lotion est à appliquer tous les matins après la douche. Composition N°6 : Complément Alimentaire pour améliorer l'état des peaux sèches On réalise, par les techniques classiques, des comprimés dosés à 10 micro-g d'ergostérol par comprimé, d'une formulation de poudre comprenant 0,1% en poids d'ergostérol Ces comprimés sont à prendre avec un peu d'eau au cours des repas du matin et de milieu de journée, à raison de un à deux comprimés par prise suivant l'état de la peau. REVENDICATIONS1. Méthode de sélection de molécules présentant une activité sur les cellules cuta- nées utilisable en cosmétique caractérisée par le fait que l'on recherche des ligands de la poche alternative non génomique du récepteur de la Vitamine D qui ne soient pas des ligands de la poche génomique du récepteur de la Vitamine D. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'on utilise un algorithme d'amarrage d'une structure moléculaire tridimensionnelle dans une-structure tridimensionnelle de protéine pour évaluer la somme des interactions positives ou négatives, de liaison de Van der Waals ou de liaison hydrogène ou de torsion, entre la molécule et les poches génomique ou non génomique du récepteur de la Vitamine D. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée par le fait que l'on sélectionne des molécules dont la somme des interactions avec le récepteur de la Vitamine D indique à la fois une interaction voisine de celle d'un ligand de référence tel que le Luminesterol ou JN pour la poche non génomique du récepteur de la Vitamine D, et une interaction faible par rapport à celle d'un ligand de référence tel que la 1a,25(OH)2-vitamine D3 ou 1-25D pour sa poche génomique. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée par le fait que l'on réalise ensuite des formulations cosmétiques contenant une ou plusieurs des molécules 25 sélectionnées. 5. Méthode selon la revendication 3, caractérisée par le fait que l'on réalise ensuite des formulations de compléments alimentaires destinés à la voie orale contenant une ou plusieurs des molécules sélectionnées. 30