Brevet FR2922896A1 — publié le 20090501

La présente invention concerne l'identification de bactéries pathogènes du genre Listeria, et plus précisément de l'espèce Listeria monocytogenes. L'isolement et l'identification de la bactérie Listeria monocytogenes est un problème majeur de la surveillance de l'hygiène agro-alimentaire et de la bactériologie médicale. Parmi les bactéries du genre Listeria, seule l'espèce Listeria monocytogenes est connue pour être pathogène pour l'homme. Elle peut engendrer la listériose, parfois mortelle (25 à 30% des cas) chez les personnes immunodéprimées, les enfants en bas âge ou les femmes enceintes. Les autres espèces de Listeria ne sont pas pathogènes ou ne le sont que pour les animaux. C'est le cas notamment de Listeria ivanovii. Même si les risques de listériose humaine ont régressé dans la plupart des pays développés lors des dernières décennies, la société moderne exige de plus en plus de sécurité qui, si elle s'accommode de cas sporadiques, ne peut tolérer les épidémies. Dans le cadre de diagnostic d'affections bactériennes chez l'humain, il est donc important de distinguer nettement Listeria monocytogenes parmi les autres espèces du genre Listeria sp. qui ne sont pas pathogènes. Le genre Listeria sp comprend aujourd'hui six espèces, dont seule Listeria monocytogenes est pathogène pour l'homme. Des germes sont à l'origine d'épidémies sévères chez l'homme, à la suite de contaminations à l'origine alimentaires. Dans les aliments (lait et produits laitiers essentiellement), deux espèces de Listeria sont principalement isolées : Listeria innocua non pathogène et Listeria monocytogenes pathogène. Ces deux espèces ont de nombreux caractères biochimiques communs, il est en conséquence difficile de les différencier. Le test de la beta-hémolyse, par exemple repose sur la détermination d'une activité beta-hémolytique liée à la production par la bactérie d'une substance qui provoque la lyse des hématies (listériolysine). Ce test est exercé sur gélose de sang de mouton ou de cheval, mais la réponse est souvent discrète. Ce test est donc peu fiable et s'il permet de différencier les deux espèces principalement rencontrées, à savoir L. monocytogenes (réponse positive) de L. innocua (réponse négative), il n'est pas spécifique de l'espèce pathogène. Le CAMP-test est un autre test, qui est associé au test de la beta-hémolyse précédemment décrit. Le test est réalisé sur gélose trypticase soja, contenant 5 % d'hématies lavées de mouton. La souche beta-hémolytique de S. aureus CIP 5710 est ensemencée en une strie perpendiculaire aux stries formées par la culture de la souche de Listeria à tester. Le renforcement de l'hémolyse du staphylocoque au contact des deux zones indique une réaction positive. En pratique, le CAMP-test est une technique lourde à mettre en oeuvre, et, comme l'hémolyse, n'est pas toujours très fiable. Il est également possible d'utiliser des milieux de culture ou des milieux d'identification. A ce titre, le brevet EP496680, délivré à la demanderesse, décrit un procédé d'analyse bactériologique pour différencier l'espèce Listeria monocytogenes des autres bactéries du genre Listeria sp. Selon ce procédé, on utilise un milieu réactionnel comprenant un substrat chromogène ou fluorogène susceptible d'être hydrolysé par une enzyme appelée Glycine aminopeptidase. Cette technique très intéressante présente un inconvénient résidant dans le fait que l'espèce Listeria monocytogenes est la seule à ne pas avoir d'activité enzymatique Glycine aminopeptidase. La détection de Listeria monocytogenes est réalisée par une activité négative, ce qui n'est pas aisée, l'utilisation d'un test négatif manquant de spécificité en cas de mutant ou si les autres espèces sont stressées et ne répondent pas avec une activité normale. Il est possible de différencier les espèces Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii, des autres Listeria par la mise en évidence de l'activité phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC). En effet, il a été démontré que la PI-PLC est sécrétée dans le milieu de culture par certaines espèces du genre Listeria telles que Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii (Leimeister-Wchter et al., Mol. Microbiol. (1991) 5(2), pp. 361-366). A ce titre, le milieu Ottaviani Agosti Agar est un milieu chromogène qui utilise d'une part un substrat 13 Glucosidase qui permet la détection de toutes les espèces du genre Listeria et d'autre part la mise en évidence de l'activité PI-PLC de Listeria monocytogenes et Listeria ivanovii par l'apparition d'un halo autour de la colonie. Quelque soit la technique utilisée, il est nécessaire de réaliser systématiquement un test de confirmation de Listeria monocytogenes, mettant généralement en oeuvre un deuxième milieu de culture, pour lequel une étape d'incubation de 24h est nécessaire. On peut citer à ce titre les tests de confirmation ALOAConfirmation (AES), ou CHROMagar Identification listeria (BBL) . Au total, une durée de 48 H est donc nécessaire pour identifier et confirmer la présence de Listeria monocytogenes : utilisation d'un premier milieu de culture, qui nécessite 24H d'incubation, puis la seconde étape de confirmation qui nécessite également une incubation de 24h. Cette durée de 48h est longue, et il est souhaitable de raccourcir cette durée pour proposer un diagnostic fiable aussi rapidement que possible. La présente invention a pour objectif de proposer une méthode de détection qui permet la différenciation de l'espèce Listeria monocytogenes par rapport à toutes les autres espèces de Listeria spp. En particulier, l'invention propose un nouveau test de confirmation, qui est un test biochimique très rapide puisqu'il peut être mis en oeuvre en moins de 6h. Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention. Par test biochimique, on entend un test permettant la mise en oeuvre d'une réaction biochimique mettant en évidence la présence de bactéries. Un tel test peut être notamment mis en oeuvre directement à partir d'un inoculum, sans mettre en oeuvre une étape de croissance. Ce sont alors les enzymes préformées apportées par la suspension bactérienne qui sont détectées. De tels tests sont notamment mis en oeuvre dans la gamme API� ou le système Vitek 2. Ces tests conditionnés sous forme déshydratée sont mis en contact, sous incubation, avec l'échantillon à analyser. La réaction biochimique recherchée est détectée par un changement d'état du test (apparition disparition d'une coloration, d'une fluorescence ). La lecture du test se fait alors visuellement ou à l'aide d'un lecteur, de façon directe ou après l'ajout d'un réactif révélateur. La gamme API� repose sur une méthode probabiliste d'identification numérique, associant une galerie de tests biochimiques, dans des cupules et une base de données. C'est la combinaison judicieuse des tests qui assure la caractérisation d'un groupe de germe et la distinction des espèces entre elles. Le système VITEK 2 est un système d'identification et d'antibiogramme, entièrement automatisé, qui met en oeuvre une carte de 64 micro-puits. En supprimant des étapes manuelles, l'automatisation permet de gagner du temps au laboratoire et garantit une uniformité des procédures d'analyse qui améliore la fiabilité des résultats. L'identification réalisée sur ce système utilise une méthode probabiliste similaire à celle des galeries API. L'automatisation de la lecture permet une lecture cinétique des tests biochimiques mis en oeuvre et permet ainsi une identification en 4 à 8 heure pour les germes Gram positifs courants ainsi que pour Listeria monocytogenes. Le test biochimique selon l'invention est un test de confirmation de la présence de L monocytogenes, comprenant un substrat de PI-PLC et un substrat d'a mannosidase, mais peut comprendre également des sels minéraux, des peptones, des hydrates de carbones, un ou plusieurs composés limitant les variations de pH, un ou plusieurs inducteurs d'enzymes. Par substrat, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme. Le substrat peut être notamment un substrat enzymatique, c'est à dire un substrat pouvant 20 être hydrolysé par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Au sens de la présente invention, ce substrat est notamment un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) ou un substrat d'a mannosidase. Ce substrat peut comprendre notamment une première partie spécifique de l'activité 25 enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... préférentiellement, les substrats utilisés dans la présente invention sont chromogènes. On peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, particulièrement adaptés dans le cas de substrats de phosphatidyl inositol phospholipase 30 C (PI-PLC), les substrats à base de nitrophénol et dérivés, particulièrement adaptés dans le cas de substrats d' aùmannosidase, mais également les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine ou d' alizarine ou de catéchol ou d' aminophénol et de naphtol et leurs dérivés Pour les marqueurs fluorogène, on peut citer les dérivés de coumarines et notamment d'umbelliférone, de naphtol, de résorufine, de fluorescéïne Selon la présente invention, le substrat est préférentiellement choisi parmi les substrats à base : ^ d'Indoxyl (3-Indoxyl,5-Bromo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5ùIodo-3ùindoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 4,6-Dichloro-3-indoxyl, 6,7-Dichloro-3- indoxyl, 4,6,7-Trichloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, NMéthyl-3-indoxyl... ) ^ de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) Préférentiellement, le substrat de PIPLC est un substrat chromogène. Préférentiellement, le substrat de PIPLC est un indolyl-phosphatidyl-myo-inositol, préférentiellement le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate (X-indolyl-phosphatidyl-myo-inositol) Préférentiellement, le substrat d' a mannosidase est un substrat chromogène ou fluorogène. Préférentiellement, le substrat d' a mannosidase est un substrat chromogène. Préférentiellement, le substrat d' a mannosidase est un substrat de mannopyranosidase. Préférentiellement, le substrat de mannopyranosidase est le nitrophenyl-4-aD mannopyranoside. Préférentiellement, la concentration en substrat de PI-PLC est comprise entre 5 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1,5 et 0,5 g/l. Préférentiellement, la concentration en substrat d' a mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/l. Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes. Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le Handbook of Microbiological Media (CRC Press). Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des molécules actives telles que des antibiotiques, des enzymes, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux, un ou plusieurs substrats permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique... Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant... Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment les milieux Palcam et Oxford, milieux sélectifs conventionnels fréquemment utilisés en industrie et cités dans les normes internationales ISO 11290-1 et 11290-2 pour la recherche et dénombrement de Listeria monocytogenes, ou des milieux chromogènes tel que le milieu OAA qui en plus de la détection permet l'identification présomptive de L.monocytogenes Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de liquide cerebrospinal, de placenta, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage , de poisson, un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux. A ce titre, l'invention concerne un test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat d' a mannosidase. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le substrat de PIPLC est un indolylphosphatidyl-myo-inositol, préférentiellement le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le substrat d'alpha mannosidase est un substrat de mannopyranosidase, préférentiellement le nitrophenyl-4-aD mannopyranoside. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le test comprend en outre un activateur de la PIPLC, ou plusieurs tel que notamment l'alpha-glycerophosphate de Magnesium, Serum Albumine bovine. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en substrat de PIPLC est comprise entre 5 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1,5 et 0,5 g/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en substrat d' a mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/l. L'invention concerne également l'utilisation d'un test biochimique tel que décrit précédemment, c'est à dire un test biochimique de confirmation comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment, pour confirmer la présence de L. monocytogenes. Le test selon l'invention est particulièrement adapté pour une utilisation unitaire ou combinée à une série de tests biochimiques de façon à donner lieu à un dispositif d'identification en gamme API� ou système Vitek�. Actuellement l'identification de L monocytogenes sur galerie API ou système Vitek utilise un profil réactionnel établi par la concaténation des réponses positives ou négatives de plusieurs tests biochimiques unitaires. Le test selon l'invention peut avantageusement être intégré à de tels dispositifs de façon à réduire le nombre de tests. L'invention concerne également un procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel pour détecter le genre Listeria, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber d) révéler la présence du genre Listeria e) confirmer la présence de L monocytogenes par un test biochimique selon l'invention, comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment. L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment le milieu OAA (bioMerieux, ref 43641) qui permet la détection des espèces du genre Listeria par coloration bleu des colonies (activité béta-glucosidase). L'invention concerne également un procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un test biochimique ou d'une combinaison de test biochimiques pour détecter le genre Listeria, b) révéler la présence du genre Listeria c) confirmer la présence de L monocytogenes par un test biochimique selon l'invention, comprenant un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat de alpha mannosidase, tel que défini précédemment. Pour détecter le genre Listeria, on peut citer notamment la morphologie et la réaction de Gram auxquels on associe couramment le test à l'esculine, la catalase et des tests de fermentation de sucres tels Xylose, Rhamnose, mannitol, ribose, a Methyl D mannoside.30 Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. A) Test biochimique selon l'invention Un test biochimique selon l'invention, comprend les éléments suivants en g/1 Tampon Tris 37,5 Extrait de peptone 2,5 extrait de levure 0,25 alpha- glycerophosphate de Mg 1,25 Serum Albumine bovine 7,5 X- myo-inositol 1 phosphate 2 4-nitrophenyl-a D- mannopyranoside 2,25 pH = 7 en final . Après dépôt de 20�l de solution dans un support plastique, le test a été déshydraté à une température de 40°C pendant 24H. Le test a été évalué pour l'obtention d'une réaction en 4 à 6H à 37°C +/-2°C après réhydratation avec 50�l d'eau déminéralisée et addition d'une colonie ou réhydraté avec 50�l d'une suspension bactérienne d'opacité équivalente à McF 0,5. B Lecture et interprétation du test Après 4 et 6 H d'incubation du test à 37°C+/-1°C la coloration du test est lue et interprétée selon la grille suivante : Coloration interprétation identification présomptive incolore négatif Listeria sp jaune négatif Bleu turquoise négatif vert positif L.monocytogenes C) Validation du test selon l'invention Le test selon l'invention a été évalué, dans un premier temps à l'aide d'un inoculum de 0,5 McFarland, sur 90 souches pures du genre Listeria préalablement cultivées sur milieu OAA (Ref 43641). Les 6 espèces du genre Listeria sp se répartissaient de la façon suivante : L. monocytogenes (30 souches), L. ivanovii (20) (comprenant 10 souches des sous espèces L. ivanovii spp londoniensis et L. ivanovii spp ivanovii) , L. grayii (10), L. seeligeri (10), L. welshimeri (10), L. innocua (10). Des 4H, 80% des souches de L. monocytogenes présentant un halo sur milieu OAA (25/25) ont révélées une coloration verte positive. Après 6H d'incubation toutes ces souches présentaient la couleur verte attendue. Après 24H la réaction est stable et le reste jusqu'à 72 heures d'incubation à 37�0,2°C.Aucune des 60 souches appartenant aux espèces autre que L monocytogenes n'ont données une coloration verte. Le test présente donc une sensibilité de 100% en 6H et une spécificité de 100% au sein du genre Listeria sp. Les performances du test selon l'invention ont également été évaluées pour un inoculum d'une colonie à partir de souches pures ou de souches issues de matrice alimentaires. Dans ce dernier cas les matrices ont été étudiées après pré enrichissement en bouillon Fraser comme le recommande le protocole court AFNOR(BIO 12-14). Cette étape permet une revivification des souches bactériennes qui peuvent avoir subit un stress lié au traitement de la matrice. Etude sur souches pures Cinquante souches de L. monocytogenes cultivées 24H à 35°C � 2°C sur milieu OAA ont été inoculées à raison d'une colonie dans le test biochimique selon l'invention réhydraté par 50�l d'eau stérile. Le test incubé à 35°C �2 était positif en 4H pour 94% des souches qui présentaient une colonie caractéristique sur milieu OAA (colonie bleue avec halo). Après 6 heures toutes les souches de L. monocytogenes étaient détectées positives (verte) sur le test biochimique selon l'invention. Etude sur matrice La recherche de L. monocytogenes sur 22 matrices alimentaires a été réalisée en suivant le protocole court AFNOR (BIO 12-14) soit : 25g de matrice/stomacher , enrichissement en Fraser 1/2 (24H-30°C) , Après cette phase d'enrichissement 0,1 ml de bouillon Fraser 1/2 sont ensemencés sur milieu OAA. Le milieu est alors incubé 24H à 35� 2°C. Chacun des milieux est vérifié et lorsque qu'une colonie caractéristique présumée L. monocytogenes (bleue avec halo) est observée, celle ci est prélevée pour inoculation du test selon l'invention. Celui ci est préalablement re-hydrater par 50�1 de suspension medium (70 700) . Parmi les 22 matrices testées, 11 présentaient une croissance bactérienne sur milieu OAA après 24H. Six presentaient des colonies caractéristiques de l'espèce L. monocytogenes (bleu avec halo). Le test selon l'invention a confirmé l'appartenance des 6 souches présumées, à l'espèce L. monocytogenes en 4H. L'identification à l'espèce L. monocytogenes des 6 souches a été confirmée par d'autres outils d'identification (galerie API Listeria, cartes Vitek GP et par séquençage 16S). Les 5 autres matrices étaient contaminées par des Listeria spp autres que L. monocytogenes ou d'autres germes. Dans tous ces cas, le test selon l'invention mis en oeuvre sur une colonie de chacune de ces matrices a donné une réponse négative.15 REVENDICATIONS 1) Test biochimique pour confirmer la présence de L. monocytogenes caractérisé en ce qu'il comprend au moins un substrat de phosphatidyl inositol phospholipase C (PIPLC) et au moins un substrat d'alpha mannosidase. 2) Test biochimique selon la revendication 1 selon lequel le substrat de PIPLC est un indolyl-phosphatidyl-myo-inositol. 3) Test biochimique selon la revendication 2 selon lequel l'indolyl-phosphatidyl-myoinositol est le 5 bromo 4 chloro 3 indoxyl myoinositol phosphate. 4) Test biochimique selon la revendication 1 à 3 selon lequel la concentration en substrat de PI-PLC est comprise entre 5 et 0,1 g/l. 5) Test biochimique selon la revendication 1 à 4 selon lequel le substrat d'alpha mannosidase est un substrat de mannopyranosidase. 6) Test biochimique selon la revendication 5 selon lequel le substrat de mannopyranosidase est le p-nitrophenyl-mannopyranoside. 7) Test biochimique selon la revendication 1 à 6 selon lequel la concentration en substrat d' a mannosidase est comprise entre 2 et 0,1 g/1, préférentiellement entre 1 et 0,5 g/l. 8) Utilisation d'un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 pour confirmer la présence de L. monocytogenes.. 9) Procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu réactionnel pour détecter le genre Listeria, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester,c) laisser incuber d) révéler la présence du genre Listeria e) confirmer la présence de Listeria monocytogenes par un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7. 10) Procédé d'identification de Listeria monocytogenes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) disposer d'un test biochimique ou d'une combinaison de test biochimiques pour détecter le genre Listeria, b) révéler la présence du genre Listeria, c) confirmer la présence de Listeria monocytogenes par un test biochimique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.