Brevet FR2935003A1 — publié le 20100219

La présente invention constitue un progrès majeur dans le domaine de la santé publique, puisqu'elle a pour but d'améliorer les tests de détection de la fraîcheur de la chair animale actuellement proposés en procurant une méthode plus simple, plus fiable et moins coûteuse. Parmi tous les animaux comestibles, les poissons et autres organismes aquatiques sont les plus périssables et perdent leur fraîcheur très rapidement après leur mort. C'est pourquoi le besoin de méthodes d'évaluation de la fraîcheur de ces organismes est particulièrement important. De plus, la qualité des poissons en conserve (saumon, sardines, thon) et surgelés dépend largement de la fraîcheur du poisson utilisé. La plupart du temps, le mot � qualité � se réfère à l'aspect esthétique et à la fraîcheur ou au degré d'altération que le poisson a subi. Les méthodes d'évaluation de la qualité du poisson frais se divisent en deux catégories : sensorielles et instrumentales. Les méthodes sensorielles sont basées sur des critères visuels (apparence générale du poisson, des yeux, des pupilles, des écailles) et olfactifs. Pour être fiables, ces méthodes sont malheureusement chères et longues (particulièrement lorsque l'on fait appel à plusieurs spécialistes entrainés) et difficiles à calibrer. D'autre part, l'évaluation de la fraîcheur du poisson peut rarement être déterminée seulement à l'oeil, car le poisson est souvent vendu congelé ou transformé (conserves, filets, panés...). En conséquence, des méthodes instrumentales sont nécessaires pour contrôler de façon plus fiable, plus rapide et moins coûteuse, la fraîcheur du poisson, que ce soit à la criée ou sur les étalages. Des recherches extensives ont été menées depuis une trentaine d'année pour développer ces méthodes instrumentales. Ainsi, plusieurs indicateurs biochimiques de fraîcheur du poisson ont été proposés. Il s'agit par exemple du dosage de l'ammoniac (formé par la dégradation bactérienne ou désamination des protéines, peptides et acides aminés), des amines biogènes (issues de la décarboxylation des acides aminés, par exemple l'histidine, l'ornithine, la lysine et la tyrosine), ou encore de la triméthylamine (TMA) (issue de la dégradation bactérienne de l'oxyde de triméthylamine). Ces dernières années, une attention considérable a été portée sur la dégradation des nucléotides comme l'ATP. En effet, immédiatement après la mort, l'ATP présent dans les cellules musculaires de poisson est dégradé en xanthine / hypoxanthine selon le schéma suivant (Mendes R, Eur Food Res Technol 2001 ; 212: 141-146): ATP -ADP -AMP-IMP -IR -Hx -X Dans ce schéma, l'ATP est l'adénosine triphosphate, l'ADP est l'adénosine diphosphate, l'AMP est l'adénosine monophosphate, l'IMP est l'inosine monophosphate, l'IR est l'inosine, Hx est l'hypoxanthine, et X est la xanthine. L'IMP est un des principaux facteurs contribuant au bon goût du poisson frais. Au contraire, l'accumulation de Hx et/ou X pendant le stockage est responsable de l'odeur nauséabonde du poisson pas frais. La teneur en IMP augmente à partir de 5 heures après la mort du poisson, et ce jusqu'à 25 heures après, puis diminue, tandis que les concentrations en Hx et en IR augmentent de façon proportionnelle. Il est reconnu depuis de nombreuses années que la détermination simultanée de l'IMP, inosine, et hypoxanthine fournit une mesure quantitative et objective de la fraîcheur du poisson ou autres produits de la mer périssables, en particulier grâce au calcul d'une valeur K (indice de fraîcheur) définie à partir de ces concentrations comme étant : [IR] + [Hx] K_ [ATP] + [ADP] + [AMP] + [IMP] + [IR] + [Hx] valeur qui peut être simplifiée dans le cas du poisson, car l'ATP, l'AMP et l'ADP sont présents en quantités négligeables dès 24 heures après la mort (US 5,288,613), 25 en la formule : K [IR] + [Hx] [IMP] + [IR] + [Hx] L'analyse des différents nucléotides par HPLC trouvés dans des muscles de poisson à différents degrés de fraîcheur a montré que la détérioration de la qualité du poisson était associée à une augmentation de la valeur K (Uchiyama et al ; Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, Vol.36, 977 (1970)). Ainsi, pour un indice K défini tel que ci-dessus, une faible valeur du facteur K correspond à un poisson frais, et il est communément reconnu qu'un poisson ayant une valeur de K inférieure à 0,2 est très frais, tandis que le poisson ayant un facteur K compris entre 0,2 et 0,4 est correctement frais. L'augmentation de la valeur K dépend de l'espèce de poisson et, pour une même espèce, de la température. De plus, au cours de ces dernières années, la valeur K a également été reconnue comme étant un indicateur pertinent de la fraîcheur de la viande de boeuf, de porc, d'agneau, de mouton, et de volaille (Saito K et al., Meat Science 75 (2007) ; 265-272). Les méthodes actuellement développées pour doser l'IMP, l'IR et l'Hx et calculer un indice K sont essentiellement enzymatiques, et, dans ce cas, sont basées sur l'utilisation des trois enzymes connues pour générer l'IR, l'Hx et la xanthine, qui sont nommément: - la 5' Nucléotidase (5'NT, EC 3.1.3.5), ou la phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1) qui catalysent la transformation de l'IMP en IR, - la Purine Nucléoside Phosphorylase (PNP, EC 2.4.2.1) qui catalyse la transformation de l'IR en Hx en générant du peroxyde d'hydrogène H2O2 , - la Xanthine Oxydase (XO, EC1.1.3.22 ; EC1.17.3.2) qui catalyse la transformation de l'Hx en X en générant du peroxyde d'hydrogène H2O2. Les techniques de détection des métabolites formés suite à l'action de ces 25 enzymes ont évolué depuis quelques années, et différentes méthodes de dosages ont été proposées, notamment, à titre d'exemple : Fujii et al. décrit une méthode pour estimer la fraîcheur du poisson basée sur la détermination des concentrations en IMP, IR et Hx par réactions enzymatiques. Cette méthode nécessite l'ajout des enzymes recombinantes PNP et 5'NT et la détection des métabolites est réalisée à l'aide d'un spectrophotomètre UV (Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, vol 39, 69-84 (1973)). Une autre technologie (US 5,288,613) consiste à contrôler la consommation de l'oxygène grâce à une électrode à oxygène Clark (KV-101, Oriental Electric Co. Ltd). Cependant, cette technique a une faible sensibilité et nécessite un contrôle strict du pH et de l'oxygène consommé. D'autre part, Karube et al (J. Agric. Food Chem. 32, 314-319, 1984) décrit un système enzymatique basé sur une double membrane consistant en une membrane contenant la 5'NT, et une autre membrane contenant les enzymes PNP et XO couplées à une électrode à oxygène. Une petite colonne de résine échangeuse d'anion est nécessaire pour séparer les trois métabolites (IMP, IR et Hx) dans trois tampons différents, ce qui rend la technologie très compliquée. Ohashi et al (US 4, 650, 752) propose une méthode enzymatique pour déterminer K utilisant de nombreuses enzymes solubles (phosphatase alcaline, 5'NT, XO, kinase de l'acide adénylique, désaminase de l'AMP, et désaminase de l'adénosine). L'emploi de toutes ces enzymes, associé à la mesure du radical superoxyde 02- par électrode, rend cette technologie très chère et peu sensible. Luong et al (US 5, 288, 613) a également proposé une méthode enzymatique utilisant les actions combinées de 5'NT, PNP et XO en mesurant, grâce à une électrode ampérométrique (platine vs argent par exemple), la quantité d'acide urique et de peroxyde d'hydrogène formé lorsque se dégradent les composés IMP, IR, et Hx. Malgré la multitude de techniques de détection et du fort besoin industriel, une seule méthode est commercialisée actuellement, il s'agit de TRANSIA FRESH TESTER� ù Transia. Cette méthode consiste à doser IMP, Hx et IR à l'aide d'une bandelette enzymatique colorigénique. Le contenu enzymatique des bandelettes n'est pas communiqué. Cette technique, subjective et peu sensible, est basée sur l'interprétation visuelle des différents niveaux de couleur par l'opérateur. Elle nécessite en outre une certaine technicité de la part de l'opérateur, et le temps de préparation de l'échantillon (1g de chair de poisson) est long. Pour toutes ces raisons, cet outil est en fait peu utilisé. Ainsi, il existe un besoin urgent d'une méthode simple, peu coûteuse, sensible et quantitative pour évaluer la fraîcheur du poisson, ainsi que la fraîcheur de la chair d'autres animaux, dans des situations variées, notamment � sur le terrain �. La présente invention répond à ce besoin, en procurant une méthode ultrasensible, non invasive et rapide, pour mesurer la concentration en IMP, IR et Hx et ainsi déterminer un indice de fraîcheur (K) caractérisant la qualité d'une chair animale, notamment du poisson. Cette méthode, basée de préférence sur la bioluminescence, permet d'utiliser des luminomètres portables capables de fournir à l'utilisateur des données précises et traçables sur le terrain. Description des figures La figure 1 montre la formation de NADH (suivi de l'absorbance à 340nm) catalysé par l'enzyme XDH du lait (30 mU/mL) en présence de concentrations variées de Hx (ronds noirs) ou d'IR (carrés blancs), lmM NAD, 2mM DTT et 100mM de KH2PO4, en présence de l'enzyme PNP recombinante (lOmU/mL) pour les réactions avec l'IR. La figure 2 montre la formation de NADH (suivi de l'absorbance à 340nm) 20 catalysé par l'IMPDH recombinante (20mU/mL) en présence de concentrations variées de IMP, lmM NAD, 2mM DTT et 100mM de KH2PO4. La figure 3 montre les changements en teneur de l'IMP, l'IR et l'Hx dans les extraits de filet de truite en fonction du temps passé sur glace mesurés par HPLC au bout de 2h ( ), 26h ( ), 92h (-o-o-) et 123h (-•-•-). 25 La figure 4 montre les résultats de dosage de l'IMP, et de [Hx+IR] selon la méthode de l'invention, à 0, 2 et 6 jours après que le poisson soit mort et mis sur glace, en suivant la formation de NADH (suivi de l'absorbance à 340nm). La figure 5 montre les changements de la valeur de K détectés par HPLC (ronds noirs) et par la méthode de l'invention (ronds blancs) en fonction du temps (en jours) après la mort du poisson, pour deux truites différentes (truite 1 : figure 5a, truite 2 : figure 5b). La figure 6a montre l'émission de lumière catalysée par la luciférase bactérienne (0,2mg/ml) en fonction de la concentration en hypoxanthine (ronds blanc), en inosine (ronds noirs), et en [Hx+ IR] (carrés noirs). La figure 6b montre l'émission de lumière catalysée par la luciférase bactérienne (0,2mg/ml) en fonction de la concentration en IMP. La figure 7 montre la cinétique de production de la lumière (par seconde) catalysé par la luciférase bactérienne (0,2mg/ml) suite à l'ajout de XDH (5mU/ml) à 0 min et de l'IMPDH (25mU/ml) à 9 min, permettant la détection de [Hx + IR] d'une part, et de l'IMP d'autre part, dans le même échantillon contenant les concentrations indiquées de nucléotides, lmM NAD, 2mM DTT, 201_tM FMN, 0,005% decanal et 100mM KH2PO4, (pH7,3), PNP (25mU/ml), FMN-réductase (lOmU/ml) et luciférase bactérienne (0,2mg/ml) à température ambiante. L'émission de la lumière est mesurée pendant 1 seconde. La figure 8 montre les résultats de dosage de l'IMP (8a), de [Hx+IR] (8b) et de la valeur K (8c) selon la méthode de l'invention dans un extrait de poisson gardé sur glace pendant 2h, 1 jour et 20h, 3 jours et 4h, 4 jours et 4h, 5 jours et 20h, 7 jours et 5h, 8 jours et 4h et 10 jours et 3h en mesurant par luminescence 30 secondes après l'ajout de XDH (l5mU/mL) et de l'IMPDH (26mU/mL) en présence de lmM de NAD, 2mM de DTT, 201_tM de FMN, 0,005% de décanal, 100mM de KH2PO4 (pH7,3), PNP (1lmU/ml), FMN-reductase (10mU/ml) et luciférase bactérienne (0,2mg/ml). L'émission de la lumière est mesurée pendant lseconde. Description de l'invention Les présents inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode de détermination du degré de fraîcheur d'une chair animale basée sur le dosage de l'IMP (Inosine Monophosphate), de l'inosine (IR) et de l'hypoxanthine (Hx), et utilisant, pour la première fois : 1) l'activité de l'enzyme Xanthine Déhydrogénase (XDH, EC 1.17.1.4, synonyme de EC1.1.1.204), 2) l'activité de l'enzyme Inosine Monophosphate Déhydrogénase (IMPDH, EC1.1.1.205), et 3) la mesure de NADH comme indicateur commun des concentrations des trois métabolites IMP, Hx et IR dans la chair animale. Negishi S. et Karube I. (1989) ont déjà proposé d'utiliser l'enzyme IMPDH de la bactérie E. Coli pour doser l'IMP et utiliser des bandelettes contenant de l'IMPDH ainsi que des bandelettes contenant les enzymes PNP et XO pour mesurer la valeur K. Cependant, la concentration d'IMP est mesurée par colorimétrie grâce à la réduction du MTT ou de l'INT en présence de diaphorase. Or la réaction de réduction du MTT par la diaphorase induit, en présence du DTT essentiel à l'activité de l'IMPDH, une coloration non spécifique, source d'un très fort bruit de fond. Cette méthode n'est donc pas fiable et très peu sensible. De façon alternative, les présents inventeurs proposent de doser la quantité de NADH formée comme indicateur unique des concentrations des trois métabolites IMP, Hx et IR dans la chair animale. L'avantage principal de l'utilisation du NADH comme marqueur commun de la dégradation de Hx, IR et IMP, réside dans le fait que l'on peut détecter le NADH par bioluminescence. La bioluminescence est la production et l'émission de lumière par un organisme vivant résultant d'une réaction chimique au cours de laquelle l'énergie chimique est convertie en énergie lumineuse. La bioluminescence peut être générée par des organismes symbiotiques hébergés au sein d'un organisme plus grand. Le composé chimique à l'origine de la luminescence est la luciférine. Celle-ci émet de la lumière en s'oxydant grâce à l'intervention de l'enzyme luciférase. La réaction chimique peut avoir lieu à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule. En particulier, il est possible de mesurer la bioluminescence émise par la luciférase bactérienne en présence de NADH de façon très précise en ajoutant au milieu réactionnel de la Flavine Mono Nucléotide (FMN), de la FMN-réductase, et un aldéhyde aliphatique (Golden S, Biochem J, 1980 ; 188, 799-805). Cette technique est bien connue, très sensible et très peu chère. De plus, il est à noter que, parmi plusieurs alternatives enzymatiques de dosage de l'IMP (par exemple nucléotidase + PNP + XDH ou phosphatase alcaline + PNP + XDH), seule l'enzyme IMPDH s'avère compatible avec le dosage par la luminescence. En effet, la luciférase bactérienne émet de la lumière en présence de FMN réduit. Cependant, cette dernière est dégradée par la phosphatase alcaline et par des phosphatases qui contaminent souvent les préparations commerciales de 5'-nucléotidase. Ceci explique sans doute pourquoi, malgré sa praticité et sa sensibilité, aucune méthode de détermination de la fraîcheur d'une chair animale actuellement 10 commercialisée n'utilise la bioluminescence comme méthode de détection. En conséquence, la présente demande vise, en premier lieu, l'utilisation de l'enzyme Xanthine Déshydrogénase (XDH ; EC 1.17.1.4) pour déterminer le degré de fraîcheur d'une viande, ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé. 15 De manière préférée, ladite viande est de la viande de boeuf, de porc, de veau, d'agneau, de mouton, de cheval, de volaille, ou de cerf. De manière encore plus préférée, la présente demande vise l'utilisation de l'enzyme XDH pour déterminer le degré de fraîcheur de la chair d'un poisson et, notamment d'un poisson comestible (par exemple truite, saumon, thon, dorade, bar, 20 sardine, lieu, capitaine, Saint-Pierre, espadon, omble, baudroie, raie, etc....). La Xanthine Déhydrognéase (XDH) et la Xanthine Oxidase (XO) sont des formes distinctes inter convertibles d'une même enzyme connue sous le nom de Xanthine Oxidoréductase (XOR). En particulier, elles se distinguent par le fait que XDH a pour substrat préférentiel le NAD (Nicotinamide adénine dinucléotide), 25 tandis que la XO ne peut pas réagir avec le NAD, et utilise exclusivement l'02 comme substrat (Enroth C. PNAS 2000 ; vol.97 ; N°20 ; 10723-10728). La XOR des mammifères, notamment celle présente dans le lait de vache, est synthétisée dans l'organisme comme déhydrogénase (XDH), mais est convertie en sa forme XO, lors de sa purification, suite à une protéolyse (irréversible) ou suite à l'oxydation de 30 groupes thiols (réversible). En effet, la protéolyse (par trypsine ou chymotrypsine) constitue une des étapes obligatoires de la production industrielle de XOR à partir du lait de vache. Ainsi, la XOR actuellement commercialisée est irréversiblement convertie en sa forme XO et par conséquence ne peut pas réduire le NAD pour oxyder la Xanthine ou l'Hypoxanthine. En revanche, une purification à partir de lait utilisant des inhibiteurs de protéases et/ou des agents réducteurs (DTT) permet d'obtenir principalement de la XDH, laquelle catalyse la réduction de NAD. L'homme du métier sera à même d'identifier une XDH utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer la XDH de vache (numéro d'accession NP_776397, SEQ ID NO :1), la XDH humaine (numéro d'accession NP000370, SEQ ID NO :2), la XDH de rat (numéro d'accession NP058850, SEQ ID NO :3), la XDH de souris (numéro d'accession AAI41184, SEQ ID NO :4), ou encore la XDH de poule (numéro d'accession NP990458 , SEQ ID NO :5). Par ailleurs, la Xanthine Déhydrogénase utilisée peut être celle de la bactérie Rhodobacter Capsulatus (numéro d'accession AJ001013, base de donnée EMBL, ou encore O54050RHOCA), qui est codée par deux sous-unités, respectivement XDHa (SEQ ID NO :6) et XDHb (SEQ ID NO :7) et ne peut pas se transformer en XO (Leimkühler S, et al, J. Biol. Chem., Vol. 278, 23, 20802-20811, 6 juin 2003). De préférence, la XDH utilisée est la XDH de vache (SEQ ID NO :1), de 20 poule (SEQ ID NO :5) ou de la bactérie Rhodobacter Capsulatus (SEQ ID NO :6 et 7). De préférence, la XDH utilisée n'a pas subi de protéolyse (e.g., par la trypsine ou la chymotrypsine) et/ou ne comprend pas de groupes thiols oxydés. L'homme du métier sera à même de déterminer simplement et au regard de ses connaissances 25 générales un protocole de purification d'une enzyme XDH n'ayant pas subi de protéolyse (e.g. en présence d'inhibiteurs de protéases) et/ou ne comprenant pas de groupes thiols oxydés (e.g. en présence d'agents réducteurs) Les présents inventeurs utilisent préférentiellement l'enzyme XDH native purifiée, à partir du lait de vache, en utilisant des agents réducteurs (e.g. DTT) et des inhibiteurs de protéase (e.g. PMSF, EDTA). Cependant, dans le cadre de la présente invention, l'enzyme peut également être recombinante. Avantageusement, la préparation de XDH utilisée présente un rapport d'activité XO/XDH inférieur à 20%, de préférence inférieur à 15% et, de manière particulièrement préférée, inférieur à 10%. Les activités de XO et de XDH peuvent être déterminées simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales et, à titre d'exemple, à l'aide du protocole décrit dans les exemples (cf. 1.1). La XO catalyse la transformation de l'Hypoxanthine en acide urique, en 10 présence d'02, qui est réduit en H2O2. L'enzyme XDH catalyse elle aussi la transformation de l'Hypoxanthine en acide urique, mais en présence du NAD+, qui est réduit en NADH (Harris CM., The Journal of Biological Chemistry, 1997 ; vol 272 ; n°45 ; p28335-28341) selon la réaction : 15 Hypoxanthine + NAD+ - Xanthine + NADH - acide urique + NADH Les présents inventeurs ont pu montrer que, lors de cette réaction, la concentration de NADH formé est linéairement proportionnelle à celle de l'Hypoxanthine (figure 1). De même, les inventeurs ont démontré qu'un mélange réactionnel 20 comprenant différentes concentrations d'inosine, l'enzyme PNP, et du PO43- en plus de l'enzyme XDH et du NAD, il est possible d'évaluer très précisément la concentration initiale en Inosine, à partir de la quantité de NADH formée suite aux réactions IR - Hx - X - Acide Urique (figure 1). Les réactions sont alors les suivantes : 25 Inosine + PO43- - Hypoxanthine + 1-phosphoribose, et Hypoxanthine + NAD+ - Xanthine + NADH - acide urique + NADH L'enzyme PNP utilisée peut être l'enzyme PNP humaine (numéro d'accession P00491, SEQ ID NO :13), ou bovine (numéro d'accession NP001007819, SEQ ID NO :14). D'autre part, la méthode proposée par les présents inventeurs utilise l'enzyme 5 IMPDH (EC 1.1.1.205) pour déterminer le degré de fraîcheur de la chair d'un animal mort. En effet, il est possible de mesurer la concentration en IMP à l'aide du même métabolite NADH grâce à la réaction NAD-dépendante utilisant l'enzyme IMPDH (EC 1.1.1.205) (figure 2). La réaction est la suivante : 10 IMP + NAD+- XMP + NADH L'IMPDH est une enzyme bien connue pour son rôle dans la biosynthèse du nucléotide guanidine. Elle joue donc un rôle dans la prolifération des cellules, en particulier des cellules tumorales. C'est pourquoi de nombreux inhibiteurs de l'IMPDH ont été développés et utilisés comme agents de chimiothérapie (Hedstrom 15 L, Current Med Chem 1999, 6 :545-560). De plus, l'enzyme IMPDH humaine est beaucoup moins rapide que l'enzyme IMPDH bactérienne, ce qui est éventuellement dû à des différences de conformation du site actif enzymatique (Hedstrom L, Current Opinion in Chemical Biology 2006, 10 :520-525). L'homme du métier sera à même d'identifier une IMPDH utilisable dans le 20 cadre de la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer l'IMPDH 1 humaine (NP000874), qui existe sous trois isoformes (la séquence de l'isoforme a est donnée par la SEQ ID NO :9), l'IMPDH2 humaine (numéro d'accession NP000875, SEQ ID NO :8), l'IMPDH bovine (numéro d'accession AAI04603, SEQ ID NO :10), l'IMPDH de souris (numéro d'accession NP 035960.2, SEQ ID NO :Il), ou 25 l'IMPDH de poule (numéro d'accession NP001025772, SEQ ID NO :12). De préférence, l'IMPDH utilisée dans l'invention est une IMPDH de mammifère, et, de manière encore plus préférée, l'IMPDH humaine (SEQ ID NO :8 et 9). Enfin, contrairement à la 5'NT utilisée précédemment dans certains kits de détermination de la fraîcheur du poisson, qui est non spécifique et déphosphoryle plusieurs nucléotides monophosphates, l'IMPDH catalyse une réaction irréversible et spécifique de l'IMP, donc plus quantitative. Cette enzyme sous sa forme native est rare, ce qui explique pourquoi elle n'a pas été utilisée pour les dosages de l'IMP auparavant. Les présents inventeurs utilisent donc l'enzyme IMPDH, de préférence humaine, sous forme recombinante. En effet, les présents inventeurs ont cloné la forme humaine de cette enzyme, l'ont produite dans E.Coli, et ont optimisé son procédé de purification afin de produire une enzyme ayant une activité spécifique très forte (150mU/mg), et ce en grande quantité (10-20mg par litre de culture). Ceci constitue un avantage certain en termes de coût par rapport à la 5'NT précédemment utilisée. Dans un second temps, la présente invention expose une méthode de détermination du degré de fraîcheur d'une viande, ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé comprenant les étapes de détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine dans au moins un échantillon de ladite viande, ou de la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé, et de calcul d'un indice de fraîcheur (K) à partir desdites concentrations, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une des étapes suivantes: a) détermination de ladite concentration en hypoxanthine par la mise en contact d'un échantillon de ladite viande, ou de ladite chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec au moins l'enzyme XDH (EC 1.17.1.4), et/ou b) détermination de ladite concentration en inosine monophosphate par la mise en contact d'un échantillon de ladite viande, ou de ladite chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec au moins l'enzyme Inosine monophosphate déhydrogénase (IMPDH, EC 1.1.1.205). Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce que l'étape a) comprend en outre la mise en contact dudit échantillon avec l'enzyme Purine Nucléoside Phosphorylase (PNP, EC 2.4.2.1) et en ce qu'elle permet la détermination de la concentration cumulée d'inosine et d'hypoxanthine dans ledit échantillon. Les enzymes XDH, IMPDH, et PNP utilisées sont telles que décrites 5 précédemment. Le � degré de fraîcheur � peut être défini, dans la présente invention, comme une estimation du temps qui sépare la mort de l'animal dont est issu l'échantillon de son utilisation par un consommateur, et/ou du moment où le test selon l'invention est réalisé. Plus ce temps est long, moins la chair de l'animal est fraiche, et donc plus le 10 degré de fraîcheur est faible. Ce paramètre peut varier également en fonction des conditions de conservation de l'animal ou de sa chair après sa mort. Ainsi, deux animaux morts et testés en même temps mais conservés par exemple l'un dans de la glace, et l'autre à température ambiante, auront un degré de fraîcheur nettement différent. Ainsi, de façon préférée, le � degré de fraîcheur � au sens de l'invention est 15 l'indice d'une plus ou moins bonne qualité de la chair ou de l'animal en terme d'aptitude à la consommation (couleur, goût et odeur agréables, pas d'infection microbienne). Plus le degré de fraîcheur est élevé, plus l'animal ou sa chair est fraiche, et meilleure à consommer. Ce degré de fraîcheur est mesuré selon l'invention par un � indice de 20 fraîcheur � calculé à partir des concentrations en Hypoxanthine, Inosine et/ou Inosine Monophosphate présentes dans un échantillon de viande ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé. L'indice de fraîcheur peut être défini de plusieurs façons, et la signification de cet indice varie en fonction de sa formule (US 5,288,613, Saito K et al., Meat Science 75 (2007) ; 265-272). 25 Dans un aspect préféré de l'invention, cet indice de fraîcheur correspond à l'indice K= [IR] + [Hx] précédemment décrit (par exemple [IMP] + [IR] + [Hx] dans US 5, 288, 613). Cependant, l'homme du métier comprend aisément que les indices dérivés de K, par exemple 1/K, 1-K, etc..., utilisant au moins les concentrations en Hypoxanthine, Inosine et/ou Inosine Monophosphate, sont également compris dans la présente demande. L'homme du métier peut aisément déduire de la définition de l'indice de fraîcheur sa signification en termes d'aptitude à la consommation. Dans le cas où l'animal est un crustacé ou un mollusque céphalopode (seiche, calmar, poulpe, etc.), l'AMP (Adénosine Mono Phosphate) est le nucléotide dominant (Mendes R, Eur Food Res Technol, 2001 û 212 :141-146), mais la présence d'IMP a été démontrée post-mortem (Pacheco-Aguilar R, Food Chemistry 2008 ; 106, 253-259). Le dosage des trois métabolites Hx, Ir et IMP est donc avantageusement complété dans ce cas par le dosage de l'AMP. Ce dosage peut être effectué en ajoutant l'enzyme AMP désaminase sur l'échantillon de l'animal. Ainsi, la détermination du degré de fraîcheur d'un crustacé ou d'un mollusque comprend avantageusement l'étape de mise en contact d'un échantillon de chair dudit crustacé ou dudit mollusque avec les enzymes IMPDH, XDH et PNP selon la méthode de l'invention, d'une part, et, d'autre part, l'étape de mise en contact d'un échantillon de chair dudit crustacé ou dudit mollusque avec l'enzyme AMP désaminase (par exemple l'AMP désaminase bactérienne, numéro d'accession AAB62313). La méthode selon l'invention comprend une étape préalable de prélèvement dudit au moins échantillon dans la viande, ou la chair de poisson, de crustacé ou de mollusque. Ladite viande ou la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé peut avoir été chauffée ou, à l'inverse, congelée, ou avoir subi des transformations pour son conditionnement (broyage par exemple). Cependant, de manière préférée, ladite viande ou la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé n'a pas subi d'étape de lyse (par chauffage ou par lyse alcaline). En particulier, contrairement aux techniques précédemment proposées, il n'est pas utile, pour réaliser la présente invention, de traiter ladite viande ou la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé avec un acide permettant de libérer les principaux composants cellulaires (acide trichloroacétique (TCA) par exemple). De plus, ladite viande ou la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé n'a pas été chauffée. L'échantillon de viande ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé mort peut être sous forme solide (fragment de chair) ou liquide. De manière préférée, l'échantillon est sous forme liquide. En effet, pour réaliser la présente invention, toute fraction liquide extractible 5 de la viande ou de la chair de poisson, de mollusque ou de crustacé mort peut être utilisée. De manière encore plus préférée, l'échantillon de viande ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé mort est un faible volume du liquide naturellement présent dans ladite viande ou dans la chair dudit poisson, dudit 10 mollusque ou dudit crustacé après sa mort (autrement appelé � jus �, par exemple jus de viande, de poisson, de mollusque ou de crustacé). Par exemple, l'échantillon est typiquement de 21.1L pour la détection par spectrophotométrie, et de 0,21.1L pour la détection par bioluminescence. De manière avantageuse, l'échantillon de poisson est prélevé avec une 15 seringue ou un capillaire mis directement au contact de la chair de poisson non traitée. De façon alternative, le prélèvement du � jus � de poisson peut être réalisé au moyen d'une matière absorbante ù un coton-tige, un papier filtre, une membrane cellulose, etc.- mises en contact direct avec la chair de poisson. Un échantillon de viande, de mollusque et de crustacé peut être obtenu par les 20 mêmes méthodes. En particulier, le prélèvement du jus de viande, de mollusque ou de crustacé peut être également réalisé en mettant en contact leur chair avec une seringue, un capillaire ou une matière absorbante. Selon la méthode de l'invention, la mise en contact d'un échantillon de viande, ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec au moins l'enzyme 25 XDH permet de déterminer la concentration initiale en hypoxanthine (Hx) et/ou en inosine (IR) dans ledit échantillon, et, a fortiori, dans ladite viande, ou dans la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé. De plus, la mise en contact d'un échantillon de viande, ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec l'enzyme IMPDH permet de déterminer la 30 concentration initiale en ino sine monophosphate (IMP) dans ledit échantillon et, a fortiori, dans ladite viande, ou dans la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé. Enfin, la mise en contact d'un échantillon de viande, ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec l'enzyme PNP et l'enzyme XDH permet de déterminer la concentration cumulée en inosine (IR) et en hypoxanthine (Hx) dans ledit échantillon et, a fortiori, dans ladite viande, ou dans la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé. Ainsi, la mise en contact de l'échantillon de viande, ou de chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec l'enzyme XDH seule d'une part, et les enzymes XDH et PNP d'autre part, permet de déterminer la concentration initiale en inosine (IR) dans ledit échantillon et, a fortiori, dans ladite viande, ou dans la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé. De manière préférée, ledit échantillon est un échantillon de poisson, et, de manière encore plus préférée, un échantillon de poisson comestible. Avantageusement, les étapes a) et b) sont réalisées sur un seul échantillon de ladite viande, ou de ladite chair de poisson, de mollusque ou de crustacé. De plus, lesdites étapes a) et b) ne sont pas réalisées simultanément, mais avec un intervalle d'environ 10 minutes, de préférence avec un intervalle d'environ 5 minutes. Au sens de l'invention, � environ � signifie à plus ou moins une minute du temps indiqué. De plus, l'ordre des étapes a) et b) n'est pas imposé et peut être inversé. De préférence, les étapes a) et b) comprennent en outre la mise en contact dudit au moins un échantillon de viande, ou de la chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+), de préférence à une concentration comprise entre 0.lmM et 100 mM, à titre d'exemple entre 0,5mM et l OmM, et de manière encore plus préférée entre 0.5mM et 2mM. Dans une autre variante préférée de l'invention, la détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine est effectuée par dosage du nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite (NADH) formé lors de la dégradation de l'IMP en XMP, de l'IR en Hx, et de l'Hx en acide urique, suite à la réduction du NAD incorporé. La quantification de NADH peut être réalisée par les techniques habituelles connues de l'homme du métier, en particulier par spectrophotométrie en lumière 5 visible ou en UV, de préférence à 340nm. Dans un mode de réalisation préféré, le NADH produit est dosé par bioluminescence, à l'aide d'une luciférase bactérienne, par exemple une luciférase de photobactérie (en particulier la luciférase de la bactérie Photobacterium phosphoreum), et de la FMN-réductase, et ces mesures permettent de calculer un 10 indice de fraîcheur de la viande ou de la chair animale, de préférence K= [IR] + [Hx] [IR] + [Hx] + [IMP] Dans un troisième aspect, la présente demande concerne plus particulièrement une méthode de détermination du degré de fraîcheur d'une viande ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé impliquant la mesure de la concentration 15 en Hx, IR et IMP dans un échantillon de ladite viande, ou dans la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé et le calcul d'un indice de fraîcheur à partir desdites concentrations, et comprenant au moins les étapes consistant à: a) prélever un échantillon de ladite viande, ou de la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé, 20 b) mettre en contact l'échantillon obtenu en a) avec les enzymes PNP et XDH, en présence de NAD et de PO43-, et mesurer la quantité dl de NADH formée, c) mettre en contact l'échantillon obtenu en a) avec l'enzyme IMPDH, en présence de NAD, et mesurer la quantité d2 de NADH formée, d) calculer un indice de fraîcheur, de préférence K = dl dl+d2 25 L'échantillon est de préférence un échantillon de poisson comestible. De préférence, le NAD ajouté aux étapes b) et c) a une concentration comprise entre 0.lmM et 100 mM, et, à titre d'exemple entre 0,5mM et 10mM, et de manière encore plus préférée entre 0.5mM et 2mM. De préférence, le PO43- ajouté aux étapes b) et c) a une concentration 5 comprise entre 50mM et 150mM, et, de manière encore plus préférée a une concentration de 100mM. Dans un mode de réalisation préféré, la mesure du NADH formée aux étapes b) et c) se fait par bioluminescence. Dans un autre mode de réalisation préféré, les étapes b) et c) sont réalisées sur 10 le même échantillon à environ 10 minutes d'intervalle, de préférence à environ 5 minutes d'intervalle. De plus, l'ordre des étapes b) et c) n'est pas imposé et peut être inversé. Enfin, les présents inventeurs proposent un kit pour la mise en oeuvre de la méthode décrite précédemment, et destiné à la de détection du degré de fraîcheur 15 d'une viande, ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé, comprenant des moyens de détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les enzymes XDH et IMPDH, de préférence immobilisées ou solubles, natives ou recombinantes. Avantageusement, le kit comprend également les réactifs 20 nécessaires à la détection du NADH par bioluminescence. Exemples 1) Utilisation de XDH pour mesurer les concentrations en Hx et IR 1.1) Purification de XDH L'enzyme XDH est purifiée à partir de lait de vache ultrafrais non pasteurisé. 25 Du (3-mercaptoéthanol (concentration finale 10mM), de 1'EDTA (lmM), du salicylate de sodium (1,25mM), du KH2PO4 (0,1M, pH 7,5) et l'inhibiteur de protéases PMSF (lmM) sont ajoutés dans le lait sur place, à la crémerie, pour stabiliser l'enzyme. Le lait est battu en chauffant de 4°C à 42°C pendant 90minutes, puis on ajoute du détergeant Triton X-100 (concentration finale, 1%), afin de permettre la dissociation de XDH des globules membranaires du lait. L'incubation à 42°C est maintenue pendant 15 minutes. Les protéines précipitées par l'ammonium sulfate (200g/L) sont jetées, et la XDH contenue dans le surnageant est précipitée par l'ajout de sulfate d'ammonium (70g/L). Le précipité marron est repris dans 0,1M de KH2PO4, 10mMDTT et 0,1% de Triton X-100, aliquoté et reprécipité par l'ajout d'un volume équivalent de sulfate d'ammonium saturé. L'enzyme XDH est gardée sous forme de précipitat à 4°C et resuspendue dans 0,1M de KH2PO4, 10mM DTT , 1 à 2 heures avant chaque utilisation. L'activité de la XDH est mesurée en suivant la formation de NADH à 340nm en présence de 1mM de Xanthine, 1mM de NAD, 100mM de KH2PO4 à pH 7,5. L'activité de XO est mesurée en suivant la formation de l'acide urique à 293nm en présence de 1mM de Xanthine, et 100mM de KH2PO4 à pH 7,5 en absence de NAD. Pour chaque lot, le rapport d'activité XO/XDH est analysé. Seuls les lots ayant une activité de XO inférieure à 10% sont utilisés. 1.2) Dosage de l'hypoxanthine par dosage du NADH formé en présence de l'enzyme 15 XDH L'enzyme XDH (EC1.17.1.4) catalyse la réaction (Harris CM., The Journal of Biological Chemistry, 1997 ; vol 272 ; n°45 ; p28335-28341): Hypoxanthine + NAD+ - Xanthine + NADH. - acide urique + NADH Dans un premier temps, nous avons évalué la quantité de NADH formée dans 20 un mélange réactionnel contenant différentes concentrations de Hx, entre 5 et 2501_tM, 1mM de NAD et 2mM de DTT et 30mU/mL de XDH purifiée de lait. La quantité de NADH formée au cours de la réaction est déterminée en mesurant l'absorbance du milieu réactionnel dans des plaques de 96 puits conventionnelles, à 340nm. 25 Les résultats obtenus montrent que la quantité de NADH formée est linéairement proportionnelle à la quantité d'Hypoxanthine présente dans le milieu réactionnel (figure 1, ronds). 1.3) Dosage de l'inosine par dosage du NADH formé en présence des enzymes PNP et XDH De la même façon que précédemment, nous avons évalué la quantité de NADH formée dans un mélange réactionnel contenant différentes concentrations d'IR (entre 5 et 250�M) lmM de NAD, 100mM de KH2PO4 et 2mM de DTT, 30mU/mL de XDH purifiée de lait et lOmU/mL d'enzyme PNP recombinante (EC 2.4.2.1). La PNP recombinante a été produite par une méthode classique de production de protéine recombinante. Plus particulièrement, l'ADNc de la PNP humaine (nombre d'accession Swiss Prot P00491, SEQIDNO13) est amplifié par RT-PCR à partir de l'ARN total extrait de culture cellulaire Huh-7 en présence de Trizol. Le produit d'amplification obtenu avec les amorces GAG AAC GGA TAC ACC TAT GAA GAT TAT AAG (sens) et AC TGG CTT TGT CAG GGA GTG GAA TGC (anti-sens) est cloné dans le vecteur pHat2 sous contrôle du promoteur T7 avec le gène de résistance à l'Ampicilline. La protéine est produite dans des cellules BL21 en présence de lmM d'IPTG pendant 6 à 7 heures à 37°C. La purification de la PNP est facilitée par sa forte expression sous forme soluble. Les débris non solubles sont séparés du lysat bactérien par une centrifugation à 10000g, 15 minutes, à 4°C. La PNP est ensuite précipitée en ajoutant du sulfate d'ammonium (35% de saturation), puis dialysée et purifiée sur DEAE-Sépharose avec un gradient de 10mM KH2PO4, pH 8,0 et de 100mM KH2PO4, 500mM KC1. L'activité spécifique de l'enzyme purifiée est supérieure à 40U/mg, avec un rendement supérieur à 15 mg par litre de culture. L'enzyme PNP catalyse la réaction : Inosine + PO43- - Hypoxanthine + 1-phosphoribose L'hypoxanthine formée dans le milieu est ensuite transformée en xanthine par la 25 XDH, puis en acide urique, selon la réaction précédemment décrite (1.2). La mesure de l'absorbance à 340nm du milieu réactionnel montre que la formation de NADH en présence des deux enzymes PNP et de XDH est linéairement proportionnelle à la quantité initiale d'Inosine (figure 1, carrés). Ainsi, nous pouvons conclure de ces résultats que la mesure du NADH formé dans 30 un milieu réactionnel contenant un extrait d'un échantillon de poisson et l'enzyme XDH permet d'estimer, de façon indirecte, la quantité initiale d'Hx dans l'extrait de poisson. De plus, la mesure du NADH formé dans un milieu réactionnel contenant un autre extrait du même échantillon de poisson et les enzymes XDH et PNP permet d'estimer, de façon indirecte, la somme des quantités d'Hx et d'IR présentes dans l'extrait de poisson. 2) Utilisation d'IMPDH pour mesurer les concentrations en IMP 2.1) Production de l'IMPDH humaine recombinante Le procédé d'amplification et de clonage de l'ADNc de l'IMPDH humaine (P12268) est similaire à celui de la PNP. Les amorces sont GCC GAC TAC CTG ATT AGT GGG (sens) et GA AAA GCC GCT TCT CAT ACG AAT GGA GG (antisens). La protéine est produite dans les cellules BL21 en présence de 0,lmM d'IPTG pendant 16h à 20°C. L'IMPDH est précipitée en ajoutant du sulfate d'ammonium (50% de saturation), puis dialysée et purifiée sur DEAE-Sépharose dans les conditions proches de celles décrites pour la PNP. L'activité spécifique de l'enzyme purifiée (IMPDH) est mesurée en suivant la formation de NADH à 340nm en présence de 1mM IMP, lmM NAD, 100mM KH2PO4, 2mM DTT à temperature ambiante. Cette activité est supérieure à 150mg/ml, et le rendement est > l lmg/L. 2.2) Dosage de l'IMP par dosage du NADH formé en présence de l'enzyme IMPDH Il est connu que l'enzyme IMPDH (EC 1.1.1.205) catalyse la réaction (Heldstrom L, Current Opinion in Chem Biology 2006 ; 10 :520-525) : IMP + NAD+- XMP + NADH De la même façon que précédemment, différentes concentrations d'IMP (entre 5 et 2501_tM) ont été mises en présence de lmM de NAD+, 2mM de DTT, 100mM de KH2PO4 et de 20mU/mL d'IMPDH recombinante dans des puits de plaque 96 puits. La mesure de l'absorbance à 340nm du milieu réactionnel montre que la formation de NADH en présence d'IMPDH est linéairement proportionnelle à la quantité initiale d'IMP dans l'échantillon (figure 2). Ainsi, nous pouvons conclure de ces résultats que la mesure du NADH formé dans un milieu réactionnel contenant un extrait d'un échantillon de poisson et l'enzyme IMPDH permettra d'estimer la quantité d'IMP initialement présente dans l'extrait de poisson. 3) Calcul de l'indice de fraîcheur à partir de la mesure de NADH Nous avons ensuite testé si la quantité de NADH formée à partir d'un échantillon de poisson mis en présence des trois enzymes IMPDH, XDH et/ou PNP était un indicateur précis, et fiable de la concentration en IMP, IR et Hx dans cet échantillon. Dans un premier temps, les truites d'élevage sacrifiées par l'éleveur sont mises immédiatement dans un bac en polystyrène fermé rempli de glace. Les échantillons de muscles dorsaux (400 ù 500mg) sont prélevés après différents temps (2h, 92h, et 123h), puis mis dans des tubes de 2mL, et chauffés à 95°C pendant 5 minutes, puis centrifugés à 10000g pendant 5 minutes. Les surnageants obtenus suite à cette centrifugation constituent les échantillons de poisson utilisables dans la méthode de l'invention. 3.1) Calcul de l'indice de fraîcheur du poisson par HPLC Pour les analyses par HPLC, 1001.1L de surnageant sont déprotéinés en ajoutant de l'acide trichloroacétique (TCA, 10%) et centrifugés à 10000rpm, pendant 20 5 minutes. Le TCA est ensuite enlevé par 3 lavages à l'éther saturé en eau. Ces échantillons ont ensuite été analysés par HPLC pour déterminer leur teneur en Hx, IMP et IR (figure 3). Les extraits déprotéinés sont analysés par chromatographie en paire d'ions à l'aide de la machine HPLC Agilent 1100. La colonne Eclipse Plus C18 (Agilent) est 25 maintenue à 20°C, le volume d'injection est de 101.1L et la détection UV se fait à deux longueurs d'onde : 254nm et 280nm. La chromatographie en paire d'ion en présence de tétrabutyl d'ammonium (10mM) permet la séparation simultanée de composés de polaruté très différents tels que les nucléotides (1'IMP par exemple), les nucléosides (l'inosine par exemple), et les bases hétérocycliques (l'hypoxanthine par exemple) (Di pierro D, Analytical Biochemistry 1995, 231, 407-412). Les pics correspondant à l'IMP, l'IR et l'Hx sont identifiés par leur temps d'élution et le rapport R (rapport entre l'absorbance à 254 et à 280nm). Les aires des pics (S) étant proportionnelles à la quantité des substances détectées, les concentrations relatives sont mesurées à l'aide du logiciel Agilent ChemStation. Les valeurs S[Hx], S[IMP], et S[IR] servent à calculer l'indice de fraîcheur SIR] + S[Hx] du poisson K c Les valeurs de K., à différents degrés de fraîcheur de poisson sont représentées sur la figure 5 (ronds noirs). On retrouve bien que, pour un K défini ainsi, plus le poisson attend dans la glace, plus le facteur K augmente. 3.2) Calcul de l'indice de fraîcheur du poisson par mesure de NADH En parallèle, 2�L des extraits non déprotéinés ont été utilisés pour réaliser les réactions enzymatiques suivantes : 1) ajout de XDH (30mU/mL) et PNP (lOmU/mL) + lmM de NAD+, 2mM de DTT, 100mM de KH2PO4 2) ajout de IMPDH (20mU/mL) + lmM de NAD+, 2mM de DTT, 100mM de KH2PO4 La mesure de l'absorbance à 340nm dans ces différentes situations dépend, 20 d'après les précédents exemples, de la concentration en Hx, IR et IMP dans les échantillons de poisson. La formation de NADH est suivie spectrophotométriquement à 340nm pendant 30 minutes pour XDH et PNP (donnant la valeur DO[IR+Hx]), et pendant 80 minutes pour l'IMPDH donnant la valeur DO[IMP]). 25 Les valeurs des DO correspondant aux plateaux atteints sont utilisées pour les calculs de KENZ. S[IMP] + S[IR] + S[Hx] DO[IR + Hx] KENZ DO[IR + Hx] + DO[IMP] Les figures 4a et 4b comparent les valeurs de KHPEC (en noir) et KENZ (en blanc) obtenues pour deux truites (1 et 2) à différents degrés de fraîcheur de la truite (temps en abscisse). Le coefficient de corrélation de Pearson entre KHPEC et KENZ est de 0,9951 pour la truite 1 et de 0,9945 pour la truite 2. De façon remarquable, les deux valeurs sont très proches, et ce quel que soit le degré de fraîcheur du poisson, indiquant que les résultats obtenus à partir de la méthode enzymatique sont aussi précis que ceux obtenus à partir de la technique HPLC, considérée jusqu'ici comme la plus fiable. 4) Dosage par bioluminescence de l'hvpoxanthine, de l'inosine et de l'IMP La mesure du NADH peut être avantageusement réalisée par des techniques de luminescence, notamment en ajoutant dans le milieu réactionnel où se forme NADH de la FMN-réductase et de la luciférase bactérienne (Golden S, Biochem J, 1980 ; 188, 799-805). 4.1) Production de la FMN-réductase recombinante L'ADNc de la FMN-réductase d'E.Coli (YP859445) est amplifié par PCR à partir de l'ADN total extrait de E.Coli K-12 avec des amorces ACA ACC TTA AGC TGT AAA GTG ACC (sens) et GAT AAA TGC AAA CGC ATC GCC (antisens). Le procédé de clonage dans le vecteur pHAT2 et les conditions d'expression sont similaires à celles pour la PNP et l'IMPDH recombinantes. L'activité spécifique est supérieure à 90mU/mg. 4.2) Production de la luciférase de Photobacterium phosphoreum La luciférase bactérienne est purifiée à partir de bactéries Photobacterium phosphoreum cultivées à 24°C pendant 24h. L'extrait bactérien est obtenu par la lyse de bactéries fraichement récoltées dans l'eau distillée. Les protéines précipitées par l'ajout de sulfate d'ammonium (40% de saturation) sont jetées, et la luciférase est précipitée par l'ajout de sulfate d'ammonium (65% de saturation). La luciférase reprise dans 0,1M KH2PO4 (pH7,3) est purifiée par filtration sur gel sur G-75 Sépharose et dialysée contre 0,1M KH2PO4 (pH7,3), 1mM (3-mercapto-ethanol pendant la nuit. L'activité de la luciférase purifiée est mesurée dans 20�M FMN, 0,005% décanal, 0,1M KH2PO4 (pH7,3), 0,1%BSA, et 100�M NADH. 4.3) Mesure de Hx, IR et IMP via dosage, par bioluminescence, du NADH formé Dans un premier temps, il a été démontré que les valeurs de luminescence associées à la formation de NADH dans les réactions mettant en présence IMP, IR et Hx avec IMPDH, XDH et/ou PNP étaient linéairement proportionnelles aux concentrations de IMP, IR et Hx initialement présentes (figures 6a et 6b). Pour le dosage de l'hypoxanthine, la réaction est effectuée en présence de XDH (5mU/ml) ; pour le dosage de l'inosine, XDH et PNP sont présents respectivement à 5mU/ml et 25mU/ml. Les deux réactions sont effectuées à température ambiante en présence de lmM NAD, 2mM DTT, 20 �M de FMN, 0,005% de décanal, 100mMH2PO4 (pH7,3), de FMN-réductase (l4mU/ml) et de luciférase bactérienne (0,2mg/ml). L'émission de la lumière est mesurée pendant 1 sec, 3 min après l'ajout de l'enzyme XDH. Pour le dosage de l'IMP, la réaction est effectuée en présence de lmM NAD, 2mM DTT, 20�M FMN, 0,005% decanal, 100mMH2PO4 (pH7,3), IMPDH (26mU/ml), FMN-réductase (10mU/ml) et de luciférase bactérienne (0,2mg/ml) à température ambiante. L'émission de la lumière est mesurée pendant 1 seconde, 5min après l'ajout de l'IMPDH. Dans un second temps, il a été étudié si les mesures en IR et en Hx d'une part, et en IMP d'autre part, pouvaient être réalisées successivement dans le même échantillon. La figure 7 montre la cinétique du développement du signal lumineux suite à l'ajout de XDH et IMPDH successivement dans le même milieu réactionnel contenant PNP. Pour cela, des mélanges réactionnels contenant IMP et Hx, ainsi que les métabolites nécessaires à la réaction (1mM de NAD+, 2mM de DTT, 100mM de KH2PO4), et enfin de la PNP (25mU/ml), de la FMN-réductase (l4mU/mL) et de la luciférase (O,2mg/mL) ont été ajoutés, ainsi que l'enzyme XDH, au temps initial, suivi, 9 minutes après, de l'enzyme IMPDH. Les résultats, présentés sur la figure 7, montrent que la luminescence associée à la formation du NADH par l'action de la XDH sur l'Hx est maximale 2 minutes après la mise avec l'enzyme, puis décroit rapidement pour revenir à son état basal au bout de 5 minutes. De même, l'ajout de l'IMPDH induit une luminescence maximale environ 2 minutes après son ajout, puis décroit au bout de 5 minutes. Ces résultats montrent pour la première fois que : 1) Il est possible de mesurer par bioluminescence les concentrations en 10 hypoxanthine, en inosine et en IMP dans un échantillon. 2) Il est possible de mesurer, d'une part, la concentration en IMP et, d'autre part, la somme des concentrations en Hx et IR dans le même échantillon, en faisant réagir successivement les deux déshydrogénases, à un intervalle de temps d'au moins 5 minutes. 15 3) Il est important de mesurer la luminescence du milieu réactionnel à un temps fixe par rapport à l'ajout de l'enzyme, temps compris entre 30 secondes et 2 minutes. 5) Mesure de l'indice de fraîcheur à partir de la mesure de la luminescence 5.1) Mesure par bioluminescence des concentrations en IMP et Hx+IR présents dans la chair de poisson 20 Des échantillons de filet de truite ont été traités de la même façon que dans l'exemple 3, à différents temps de passage sur la glace (2h, 1 jour et 2Oh, 3 jours et 4h, 5 jours et 2Oh, 7 jours et 5h, 8 jours 4h, 10 jours et 3h). Un échantillon de truite (0,21.tL) a été mis en présence de PNP (1lmU/mL), de luciférase bactérienne (O,2mg/ml), et de FMN-reductase (lOmU/ml). L'enzyme 25 XDH (15 mU/mL) est rajoutée, puis la luminescence est mesurée au bout de 3Os (valeur LIR+Hx)• 5 minutes plus tard, l'IMPDH est rajoutée (26mU/mL), et la luminescence est mesurée au bout de 3Os (valeur LJMp). Les résultats sont présentés sur la figure 8a et 8b. Les valeurs mesurées par luminescence et par HPLC sont très proches, que ce soit pour l'IMP ou pour l'HX+IR. Ces valeurs de luminescence permettent de calculer l'indice : KLUNt (LIR+Hx) / (LIR+Hx+ LIMP) Pour ces mêmes échantillons, les valeurs de [IMP], [Hx] et [IR] ont été déterminées par HPLC, et l'indice KHPLc a été déterminé comme précédemment. Les valeurs de K. et K.LC à différents degrés de fraicheur sont montrées sur la figure 8c. De façon remarquable, les résultats de dosage de l'IMP et de la somme ([Hx]+[IR]) par luminescence et par HPLC sont très proches (les coefficients de corrélation de Pearson sont de 0,9778 pour l'IMP et 0,9635 pour Hx+IR). De même, les valeurs de K mesurées à partir des données de luminescence (KLUM) sont très proches de KHPLC (corrélation de Pearson: 0,9868). Ces résultats démontrent que la méthode de détermination par bioluminescence des concentrations en IMP, Hx et IR, et de la valeur KLUM, avec la technique de l'invention est aussi fiable que la technique HPLC. Cependant, de manière très avantageuse, la technique de l'invention est plus sensible (0,2�L d'extrait sont suffisants pour les lectures en luminescence, et 2�L sont nécessaires pour les lectures par spectrophotométrie). Elle est également plus rapide que la détermination de K par HPLC (10 minutes par échantillon par luminescence ou spectrophotométrie, au lieu de 1h30 pour l'HPLC). En outre, elle est moins couteuse, plus pratique, et plus accessible. REVENDICATIONS1. Utilisation de l'enzyme Xanthine Déhydrogénase (XDH, EC 1.17.1.4) pour déterminer le degré de fraîcheur d'une viande, ou de la chair d'un poisson, d'un 5 mollusque ou d'un crustacé. 2. L'utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle utilise une préparation de XDH présentant un rapport d'activité XO (Xanthine Oxydase ; EC 1.1.3.22 ou EC 1.17.3.2) / XDH inférieur à 20%, de préférence inférieur à 15%. 3. Méthode de détermination du degré de fraîcheur d'une viande, ou de la chair 10 d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé comprenant les étapes de détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine dans au moins un échantillon de ladite viande, ou de la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé, et de calcul d'un indice de fraîcheur (K) à partir desdites concentrations, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une des étapes 15 suivantes: a) détermination de ladite concentration en hypoxanthine par la mise en contact d'un échantillon de ladite viande, ou de ladite chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec au moins l'enzyme XDH (EC 1.17.1.4), et/ou b) détermination de ladite concentration en inosine monophosphate par la 20 mise en contact d'un échantillon de ladite viande, ou de ladite chair de poisson, de mollusque ou de crustacé avec au moins l'enzyme Inosine monophosphate déhydrogénase (IMPDH, EC 1.1.1.205). 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'étape a) comprend en outre la mise en contact dudit échantillon avec l'enzyme Purine Nucléoside 25 Phosphorylase (PNP, EC 2.4.2.1) et en ce qu'elle permet la détermination de la concentration cumulée d'inosine et d'hypoxanthine dans ledit échantillon. 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que les étapes a) et b) sont réalisées sur un seul échantillon de ladite viande, ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé et ce que lesdites étapes a) et b) ne sont pas réalisées simultanément, mais de préférence avec un intervalle d'environ 10 minutes. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que l'indice de fraîcheur K est calculé selon la formule suivante : K= [IR] + [Hx] [IR] + [Hx] + [IMP] 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que les étapes a) et b) comprennent en outre la mise en contact dudit au moins un échantillon de ladite viande, ou de la chair dudit poisson, dudit mollusque ou dudit crustacé avec du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+), de préférence à une concentration comprise entre 0.1 mM et 100 mM. 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine est effectuée par dosage du nicotinamide adénine dinucléotide sous forme réduite (NADH) formé. 9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit NADH formé est dosé par bioluminescence. 10. Kit de détermination du degré de fraîcheur d'une viande, ou de la chair d'un poisson, d'un mollusque ou d'un crustacé pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, comprenant des moyens de détermination des concentrations en inosine monophosphate, en hypoxanthine et en inosine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les enzymes XDH et IMPDH, de préférence immobilisées ou solubles, natives ou recombinantes.25