Brevet FR2927080A1 — publié le 20090807

- i- La présente invention a pour objet un cristal du domaine CC2-LZ de NEMO d'une taille et d'une qualité suffisante pour permettre d'obtenir des données structurelles par cristallographie par diffraction des rayons X. L'invention concerne en particulier l'utilisation des données cristallographiques et de la structure tridimensionnelle du domaine CC2- LZ de NEMO pour identifier, modéliser et concevoir des composés modulateurs de la voie de signalisation NF-KB. io La voie NF-KB est activée en réponse à divers stimuli extracellulaires tels que le LPS bactérien, des cytokines proinflammmatoires comme l'IL-1 et le TNFa (M. S. Hayden and S. Ghosh, Signaling to NF-kappaB, Genes Dev 18 (2004), no.18, 2195-2224). Les signaux sont généralement transmis depuis les récepteurs cellulaires jusqu'au complexe IKK, un régulateur pivot 15 de la voie de signalisation NF-KB. Le complexe IKK est composé de deux kinases IKKa et IKK(i et d'une protéine régulatrice NEMO (NF-KB essential modulator) (S. Yamaoka et al., Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation, Cell 93 (1998), no. 7, 1231-1240). NEMO joue un rôle crucial en 20 intégrant les signaux provenant de divers stimuli et en induisant l'activation du complexe IKK. La protéine NEMO est constituée dans sa portion N-terminale d'un domaine de liaison au complexe IKK et dans sa portion C-terminale d'un 25 domaine d'oligomérisation (Figure 1). Notons que les protéines NEMO murine (SEQ ID N0.1) et humaine (SEQ ID NO2) ont une grande homologie de séquence à l'exception d'une insertion de 7 acides aminés dans la protéine humaine juste en amont d'un domaine spécifique, CC2. 2927080 -2- L'activation du complexe IKK passe par un mécanisme lié à la capacité de la protéine NEMO de s'oligomériser par trans-activation via une kinase IKKK ou par trans-autoactivation via la dimérisation des kinases IKKs. A l'heure actuelle, le mécanisme d'activation du complexe IKK via NEMO 5 n'est pas entièrement élucidé, bien que de nombreux rapports montrent que l'oligomérisation et la fixation aux polyubiquitines K-63 impliquant le domaine minimal CC2-LZ de NEMO jouent un rôle essentiel (J. L. Poyet et al., Activation of the IkappaB kinases by RIP via Ikkgamma/NEMO-mediated oligomerization, J Biol Chem 275 (2000), no.48, 37966-37977) (F. io Agou et al., Inhibition of NF-kappab activation by peptides targeting NF- kappaB essential modulator (NEMO) oligomerization, J Biol Chem 279 (2004), no.52, 54248-54257) (C. K. Ea et al., Activation of IKK by TNFalpha requires site-specific ubiquitination of RIP1 and polyubiquitin binding by NEMO, Mol Cell 22 (2006), no.2, 245-257) (C. J. Wu, et al., Sensing of lys 15 63-linked polyubiquitination by NEMO is a key event in NF-kappaB activation, Nat Cell Biol 8 (2006), no.4, 398-406). En effet, toutes les mutations localisées dans le CC2-LZ perturbant l'oligomérisation de NEMO ou la liaison aux chaînes de polyubiquitines K-63 (polyUb K-63) inhibent l'activité IKK après stimulation par des cytokines (E. Vinolo et al., A point 20 mutation in NEMO associated with anhidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency pathology results in destabilization of the oligomer and reduces lipopolysaccharide- and tumor necrosis factor-mediated NF-kappaB activation, J Biol Chem 281 (2006), no.10, 6334-6348). 25 Le domaine minimal d'oligomérisation CC2-LZ de NEMO (aa 251-337 chez la souris, aa 258-344 chez l'homme) est composé de deux motifs successifs, un motif coiled-coil CC2 (aa 251-290 chez la souris, aa 258-297 chez l'homme) et un motif leucine zipper LZ (aa 293-337 chez la souris, aa 300-344 chez l'homme). On peut observer des variations de un à deux 30 acides aminés aux extrémités du domaine CC2-LZ en fonction du logiciel utilisé pour la prédiction des structures CC2 et LZ. 2927080 -3- Une fois activé, le complexe IKK phosphoryle des protéines IKB, déclenchant ainsi la dégradation de ces dernières par le protéasome 26S et libérant alors les facteurs de transcription NF-KB qui sont séquestrés dans le cytoplasme par les protéines IxB. Le facteur de transcription NF-KB 5 migre alors dans le noyau et régule l'expression de gènes impliqués dans l'inflammation, l'immunité, l'apoptose et la survie cellulaire. L'activation constitutive de la voie NF-xB est impliquée dans l'oncogenèse. Elle est observée dans diverses tumeurs solides et leucémies, ainsi que dans des maladies autoimmunes et inflammatoires (D. S. Basseres and A. S. io Baldwin, Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression, Oncogene 25 (2006), no.51, 6817-6830) (M. S. Hayden et al., NF-kappaB and the immune response, Oncogene 25 (2006), no.51, 6758-6780) (J. (noue et al., NF-kappaB activation in development and progression of cancer, Cancer Sci 98 (2007), 15 no.3, 268-274). Ainsi, le complexe IKK est apparu comme une cible très intéressante pour le développement de composés anti-inflammatoires et anti-tumorales (M. A. Calzado et al., NF-kappaB inhibitors for the treatment of inflammatory diseases and cancer, Curr Med Chem 14 (2007), no.3, 367-376) (T. D. Gilmore and M. Herscovitch, Inhibitors of NF-kappaB 20 signaling: 785 and counting, Oncogene 25 (2006), no.51, 6887-6899) (F. D'Acquisto et al., Inhibition of nuclear factor kappa B (NF-kB): An emerging theme in anti-inflammatory therapies, Mol Interv 2 (2002), no.1, 22-35). La conception de composés ciblant NEMO plutôt que des kinases permet de supprimer sélectivement l'activité IKK stimuli-dépendante et de diminuer 25 ainsi la cytotoxicité desdits composés. Dans un effort pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la régulation de la voie de signalisation NF-KB, la structure cristalline du complexe IKK, et en particulier de la protéine régulatrice NEMO, est étudiée. Par ailleurs, 30 la connaissance de la structure tridimensionnelle est un atout essentiel pour établir les sites d'interaction avec les ligands résultant d'un criblage réel. Cette structure tridimensionnelle est également une source d'information dans l'approche par criblage virtuel ou modélisation in silico. Le processus de cristallisation de NEMO a été étudié, sans succès, par D.Gopaul et al., M.Delepierre et F.Cordier (non publiés). On peut citer en particulier les tentatives infructueuses de cristallisation du domaine CC2-LZ doté du motif de doigt de zinc (aa 251-412 de NEMO) ou sans ce motif (aa 251-388 de NEMO). Ces travaux pour obtenir des cristaux de la protéine NEMO et du domaine CC2-LZ en particulier ont donc été jusqu'alors sans succès. i0 La présente invention a donc pour but de proposer une nouvelle stratégie pour obtenir la cristallisation du domaine CC2-LZ de la protéine NEMO. Cette stratégie alternative est fondée sur une augmentation de la rigidité du domaine minimal d'oligomérisation de NEMO. La structure cristalline a été 15 résolue par cristallographie par diffraction des rayons X avec une résolution de 3.25 A. La présente invention concerne également les méthodes de cristallisation du domaine CC2-LZ. Les cristaux de CC2-LZ ainsi que l'information qui en 20 dérive peuvent être analysés dans le but d'identifier ou de concevoir des composés qui entrent en interaction avec CC2-LZ. La présente invention porte donc sur un cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère dont le domaine peptidique CC2-LZ a la séquence 25 d'acides aminés SEQ ID NO.3 et dont les variants peptidiques dérivent de ladite séquence d'acides aminés. La présente invention porte également sur un cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère dont le domaine peptidique CC2-LZ a la 30 séquence d'acides aminés SEQ ID NO.4 et dont les variants peptidiques dérivent de ladite séquence d'acides aminés. -5- Par � séquence d'acides aminés �, il doit être compris une séquence peptidique isolée du contexte naturel. II s'agit notamment de séquences isolées, synthétisées chimiquement et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique. On entend par � variants � les séquences d'acides aminés des peptides décrits supra comprenant des substitutions conservatrices ou des mutations ponctuelles conservatrices et ayant essentiellement les mêmes propriétés que les peptides, respectivement, codés par les séquences SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4, soit la capacité de s'oligomériser et de se fixer aux polyubiquitines K-63. La présente invention porte, en outre, sur un cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère dont les paramètres de la maille sont les suivants : 15 - a=b=63.5 � 5 A ; - c=437.5 � 5 A ; et - a=(3=y=90°; et le cristal a un groupe d'espace P43212. 20 Conformément à l'acception usuelle dans le cadre de l'invention, l'expression � paramètre de la maille � désigne les paramètres a, b et c de la maille cristalline correspondant aux longueurs des vecteurs non coplanaires de base (a, b, c), et les angles a, R et y qui se forment entre les vecteurs (a, b, c). L'angle a est l'angle entre les vecteurs b et c, f3 celui 25 entre les vecteurs a et c, et y celui entre les vecteurs a et c. On entend par maille cristalline le parallélépipède construit par les vecteurs (a, b, c). Les opérations de symétrie qui laissent globalement invariant un cristal, objet infini formé par la répétition d'un motif fini, constituent des groupes. 30 Quand le cristal est à trois dimensions, on parle alors de � groupes d'espace �. -6- Il doit être entendu que le cristal du domaine CC2-LZ selon la présente invention n'est pas limité au domaine CC2-LZ natif. En effet, le cristal selon l'invention comprend des mutants de CC2-LZ natif. Ces mutants sont obtenus par addition, délétion ou substitution d'au moins un acide aminé dans la séquence polypeptidique de CC2-LZ natif et ont substantiellement la même structure tridimensionnelle que celle du domaine CC2-LZ natif. On entend par � ayant substantiellement la même structure tridimensionnelle � le fait d'avoir un ensemble de coordonnées de structure io atomique issues d'un cristal qui présentent une déviation moyenne inférieure ou égale à 5 A, de préférence à 2 A, lorsqu'on les superpose aux coordonnées de structure atomique de CC2-LZ natif de laquelle le mutant est dérivé lorsqu'au moins 50% à environ 100% des atomes de carbone alpha de CC2-LZ natif sont inclus dans la superposition. 15 L'invention porte, de manière préférée, sur un co-cristal, comprenant le domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère et au moins une ankyrine ou un fragment de celle-ci capable de stabiliser le complexe formé avec le domaine CC2-LZ, dont les paramètres de la maille sont les suivantes : 20 - a=b=63.5�5A; - c=437.5 � 5 A ; et - a=R=y=90°; et dont le co-cristal a un groupe d'espace P43212. 25 Dans le contexte de l'invention on entend par � co-cristal � un cristal du domaine CC2-LZ en association avec un ou plusieurs composés, tels qu'en particulier les ankyrines. On entend par � ankyrine � des protéines modulaires de tailles variables 30 impliquées dans de multiples interactions protéine : protéine. Les ankyrines sont des protéines génétiquement conservées puisqu'on les retrouve chez les bactéries, les plantes, les champignons et les animaux et dont la structure est fondée à partir d'unités structurales répétitives d'environ 33 acides aminés. Un � fragment d'ankyrine � selon l'invention est capable de se lier et de stabiliser le complexe formé avec le domaine CC2-LZ de NEMO. De préférence, l'invention concerne un co-cristal du domaine CC2-LZ d'une protéine NEMO de mammifère et d'une ankyrine 1D5 (SEQ ID NO.5). L'invention porte également sur un co-cristal du domaine CC2-LZ d'une io protéine NEMO de mammifère et d'une ankyrine 2A1 ou 2F6 telle que décrite par Wyler et al. (Inhibition of NF-kappaB activation with designed ankyrin-repeat proteins targeting the ubiquitin-binding/oligomerization domain of NEMO, Protein Sci 16 (2007), no.9, 2013-2022). 15 En effet, afin de faciliter la cristallogenèse, le domaine CC2-LZ est complexé à une ankyrine 1 D5, qui se lie au CC2-LZ avec une forte affinité et rigidifie le domaine peptidique. Le profil de diffraction obtenu à partir des cristaux de CC2-LZ complexé à l'ankyrine 1 D5 est utilisé pour déterminer la structure tridimensionnelle du CC2-LZ par remplacement moléculaire. 20 De préférence, l'ankyrine ou le fragment d'ankyrine est complexé au motif LZ du domaine CC2-LZ afin de, plus spécifiquement, le stabiliser. En effet, le motif LZ est plus flexible et thermodynamiquement plus instable que le motif CC2 du domaine CC2-LZ. 25 Le co-cristal du domaine CC2-LZ de NEMO avec une protéine d'ankyrine peut être obtenu par un procédé de cristallisation comprenant les étapes suivantes : - incubation d'au moins une ankyrine ou d'un fragment d'ankyrine et du domaine CC2-LZ ; 30 - co-cristallisation du complexe protéique ankyrine ou fragment d'ankyrine/CC2-LZ par culture des cristaux par diffusion de vapeur. -8- Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de cristallisation de CC2-LZ correspond au procédé tel que décrit dans l'exemple 1. De préférence, l'invention porte sur le cristal et le co-cristal de CC2-LZ 5 selon l'invention possédant les coordonnées cristallographiques décrites dans le tableau 1. De manière préférée, le cristal et le co-cristal du domaine CC2-LZ selon l'invention sont respectivement définis par leur structure tridimensionnelle io obtenue par diffraction des rayons X laquelle est représentée figure 2. La structure tridimensionnelle du CC2-LZ forme un dimère allongé composé de deux hélices a parallèles qui s'associent entre elles pour former une structure coiled-coil (Figure 2). Le dimère de CC2-LZ interagit is avec deux molécules d'ankyrines 1D5, chaque ankyrine formant des contacts avec les hélices a sur les deux chaînes LZ. Trois résidus situés entre le motif CC2 et le motif LZ (aa 291-293, numérotation de souris) forment un pseudo coiled-coil. Le domaine de liaison aux chaînes de polyubiquitines K-63, qui est décrit dans Ea et al., est composé de 67 20 acides aminés (259-325 numérotation humaine, 252-318 numérotation souris) correspondant à la région C-terminale du CC2 et la région N-terminale du LZ. Par recoupement des données issues de la structure tridimensionnelle, de la mutagenèse dirigée et de l'alignement de séquences du CC2-LZ, la région formant le site de fixation aux ubiquitines 25 a été déterminée entre les acides aminés 293 et 323 dans la séquence polypeptidique murine de NEMO (aa 300-330 numérotation humaine). La structure tridimensionnelle du cristal et du co-cristal de CC2-LZ selon l'invention est obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : 30 - l'obtention d'un cristal ou d'un co-cristal de la protéine CC2-LZ ; l'exposition du cristal aux rayons X ; -9- la collecte des données de diffraction des rayons X ; l'utilisation de ces données pour calculer la carte de densité électronique dudit cristal ; la construction et l'affinement du modèle à partir de la carte de 5 densité électronique. Avantageusement, le procédé de détermination de la structure tridimensionnelle de CC2-LZ correspond au procédé tel que décrit dans l'exemple 1. L'invention s'étend également d'une part au cristal de la protéine murine de CC2-LZ comprenant la mutation AIa316Pro (A316P) ou la mutation Phe305Ala (F305A), et d'autre part au cristal de la protéine humaine de CC2-LZ comprenant également la mutation Ala323Pro (A323P) ou la mutation Phe312Ala (F312A). 15 Les différentes mutations obtenues par mutagenèse dirigée dans la protéine CC2-LZ humaine sont représentées Figure 3. La mutation Glu296Ala (E296A, position 289 chez la souris) est localisée à l'extrémité C-terminale du CC2 et est en dehors du site d'interaction aux ubiquitines (position aa 20 259-325, numérotation humaine et aa 252-318, numérotation souris). Les mutations Phe312Ala (F312A, position 305 chez la souris) et GIu315Ala (E315A, position 308 chez la souris) sont localisées dans le site de fixation aux ubiquitines. Les mutations GIu315Ala et Ala323Pro (A323P, position 316 chez la souris) sont respectivement impliquées dans deux pathologies 25 humaines, la dysplasie ectodermique anhydrotique avec immunodéficience (EDA-ID) (R. Doffinger et al., Genetic heterogeneity of mendelian susceptibility to mycobacterial infection, Microbes Infect 2 (2000), no.13, 1553-1557) et l'incontinentia pigmenti (IP) (A. Smahi et al., Genomic rearrangement in nemo impairs NF-kappaB activation and is a cause of 30 incontinentia pigmenti. The international incontinentia pigmenti (IP) consortium, Nature 405 (2000), no.6785, 466-472). La double mutation -10- Leu329AIa Leu336Ala (L329A L336A, respectivement positions 322 et 329 chez la souris) est située dans le domaine leucine zipper du CC2-LZ. Les capacités, de la protéine NEMO sauvage et des protéines NEMO mutantes définies supra, à restaurer l'activation de la voie NF-xB en réponse à la cytokine pro-inflammatoire TNF-a sont comparées et illustrées Figure 4. Pour ce faire, des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) déficients en NEMO sont co-transfectés de façon transitoire d'une part par le plasmide codant pour le gène rapporteur Igx-luciférase, et d'autre part par les plasmides codant pour les différentes protéines, puis stimulés par du TNFa pendant 24 h. La protéine sauvage restaure complètement la voie NF-KB, alors que, l'activation TNFa-dépendante de la voie NF-KB est affectée à des degrés divers par les protéines mutantes. Les mutations A323P et F312A engendrent les deux plus fortes inhibitions, soit respectivement 95% et 78% d'inhibition. Pour la mutation A323P qui est à l'origine d'une forme sévère d'incontinentia pigmenti, un défaut de dimérisation de NEMO est à l'origine de l'inactivation de la voie NF-KB, résultat similaire à celui obtenu par Sebban-Benin et al. (Identification of TRAF6-dependent NEMO polyubiquitination sites through analysis of a new NEMO mutation causing incontinentia pigmenti, Hum Mol Genet 16 (2007), no.23, 2805-2815). La protéine du domaine CC2-LZ de NEMO mutée en position F312A montre un profil d'élution, en filtration sur gel, identique à celui de la protéine CC2-LZ sauvage, indiquant que cette mutation n'affecte pas la stabilité du dimère mais modifie l'activation de la voie NF-KB (Figure 4). L'étude de ce mutant démontre pour la première fois que le défaut d'activation n'est pas dû à un défaut de dimérisation du site d'interaction aux ubiquitines mais à un défaut d'interaction avec les chaînes de polyubiquitines K63 comme montré par Ea et al. Par conséquent, ces résultats soulignent la possibilité d'inhiber la voie -11- NF-kB soit en altérant la dimérisation de NEMO soit en inhibant l'interaction de NEMO avec les chaînes de polyubiquitines. La présente invention permet d'une part la validation structurale par mutagenèse dirigée d'une conformation active de NEMO et d'autre part la détermination des résidus critiques pour l'oligomérisation de la protéine et par voie de conséquence pour l'activation du complexe IKK ainsi que ceux impliqués dans la fixation aux polyubiquitines K-63. La structure tridimensionnelle à haute résolution du CC2-LZ peut être utilisée pour la conception in silico ou criblage in silico d'inhibiteurs de NEMO. L'invention concerne de manière préférée une méthode d'identification et de conception de composés capables de se lier au domaine CC2-LZ de NEMO sur la base de données cristallographiques obtenues dans ladite invention. Des peptides mimant la séquence du CC2 ou du LZ sont montrés comme pouvant perturber l'oligomérisation de NEMO et ainsi supprimer l'activation de la voie NF-KB dans des cellules en culture. Avantageusement, l'invention porte sur l'élaboration et l'identification de composés interférant avec l'oligomérisation du CC2-LZ inhibant la fixation aux polyubiquitines K-63. Dans le contexte de l'invention on entend par � composés � les modulateurs inhibant la dimérisation du domaine CC2-LZ de NEMO ou inhibant l'interaction du domaine CC2-LZ de NEMO avec les chaînes polyubiquitines. Les données cristallographiques du domaine de NEMO ont donc permis de concevoir des peptides de haute affinité pour cette protéine. Les interactions CC2-LZ : CC2-LZ permettant de former in vivo des complexes actifs de NEMO mettent en jeu de nombreuses liaisons non covalentes. La déstabilisation de ces complexes par des petites molécules étant très difficile à mettre en évidence dans un contexte de criblage à haut débit, il est - 12 - nécessaire d'identifier une sonde peptidique mimant cette interaction, sur une portion réduite du peptide, et avec une affinité plus importante. Une telle sonde peptidique peut ensuite être marquée par un groupement fluorescent, et son association à CC2-LZ mise en évidence par une mesure de polarisation de fluorescence. Ce système permet de mettre en place dans un deuxième temps des campagnes de criblage à haut débit. Afin d'avoir une approche rationnelle et efficace pour créer cette sonde peptidique, la connaissance de la structure tridimensionnelle du domaine CC2-LZ est absolument indispensable. D'ores et déjà deux peptides appelés P8RD et lo PH4 ont été conçus sur ce principe (Figure 5). Les sondes peptidiques selon l'invention sont de préférence le peptide PH4 et le peptide P8RD ayant les séquences en acides aminés respectives SEQ ID NO.6 et SEQ ID NO.7. 15 Le P8RD présente une affinité de 60 nM alors que le peptide PH4 a une affinité de 170 nM. Ces mesures sont effectuées à pH 7 et à température ambiante dans un tampon stringent correspondant à 20 mM Tris-Acétate-MES contenant 200 mM de chlorure de potassium et 0.5% Tween 20. Elles 20 sont effectuées par polarisation de fluorescence à l'aide de peptides couplés en N-terminal avec des fluorophores Fluorescéine ou Cy5. Pour former les sondes peptidiques de l'invention, les peptides peuvent être couplés à toutes sortes de fluorophores. 25 La présente invention porte enfin sur une méthode d'identification de modulateurs de la dimérisation de NEMO ou de l'interaction de NEMO avec les chaînes polyubiquitines entre une sonde peptidique selon l'invention et le domaine CC2-LZ de NEMO. Cette méthode de criblage à haut débit ou criblage HTS (High Throughput Screening) comprend les étapes 30 suivantes : 5 10 -13- la mise en contact dudit peptide et dudit domaine CC2-LZ de NEMO ; l'ajout du composé à tester ; la mesure de la polarisation de fluorescence en présence du composé à tester comme modulateur de la dimérisation de NEMO ou de l'interaction de NEMO avec les chaînes polyubiquitines entre un peptide et le domaine CC2-LZ de NEMO ; la comparaison de ladite mesure en l'absence du composé à tester. Enfin, l'invention s'étend aux modulateurs identifiés à partir de la méthode d'identification supra. De préférence ces modulateurs inhibent la dimérisation du domaine CC2-LZ de NEMO ou inhibent l'interaction du 15 domaine CC2-LZ de NEMO avec les chaînes polyubiquitines. Les relations structure-activité de ces peptides ainsi que la structure tridimensionnelle de la cible CC2-LZ de NEMO vont nous permettre de concevoir d'autres peptides avec des affinités du nM en privilégiant la zone 20 d'interaction de NEMO pour l'ubiquitine et/ou les chaînes de polyubiquitines ayant des ramifications de toute nature (K63, K48, K6, N-terminale). La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les figures et exemples suivants : Figure 1 : Représentation de la protéine NEMO. Figure 2 : Structure tridimensionnelle du domaine CC2-LZ de NEMO complexé avec deux molécules d'ankyrines. Les deux sous-unités du CC2-LZ sont en gris foncé tandis que les ankyrines sont en gris clair. Figure 3: Localisation dans le domaine CC2-LZ humain des différentes mutations obtenues par mutagenèse dirigée. Le 25 30 10 15 - 14 - domaine de fixation aux polyubiquitines est représenté en blanc. La numérotation utilisée pour les acides aminés correspond à celle de la protéine humaine. Figure 4 : Effet des différentes mutations sur l'activation de la voie NF-iB. La numérotation des mutations correspond à celle de la protéine humaine du CC2-LZ. Figure 5: Séquences des peptides PH4 et P8RD qui ont été conçus en tenant compte de la structure cristallographique du domaine CC2-LZ. Les résidus soulignés et appartenant au N-cap ou au C-cap ont pour effet de stabiliser thermodynamiquement l'extrémité des hélices a en N-et en C-terminales. Tableau 1 : Coordonnées cristallographiques du cristal du domaine CC2-LZ murin. EXEMPLE 1 : Structure cristalloqraphique du domaine CC2-LZ 1.1 Construction des plasmides, expression et purification des protéines 20 ankyrine 1D5 et CC2-LZ L'évolution de l'ankyrine 1 D5 est réalisée par ribosome display en utilisant la bibliothèque N2C DARPin (designed ankyrin repeat protein) (H. K. Binz et al., High-affinity binders selected from designed ankyrin repeat protein 25 libraries, Nat Biotechnol 22 (2004), no.5, 575-582) pour la sélection. Les résultats de cette étude ainsi que les acides aminés de l'ankyrine 1D5 qui différent du modèle initial sont décrits dans la publication de Wyler et al. Le cDNA de l'ankyrine 1D5 est cloné dans le vecteur pQE30 (Qiagen) en phase avec une étiquette histidine située du côté N-terminal. Le plasmide 30 pQE30-1 D5 est introduit dans une souche d'E. ce XL-1 blue et l'expression de la protéine 1D5 est induite par ajout d'IPTG 1 mM au milieu - 15 - de culture pendant 3-3.5 heures à 37°C. Les bactéries sont récupérées par sédimentation, lavées en tampon Tris/HCI 50 mM pH 8 et lysées par sonication dans un tampon Tris/HCI 50 mM pH8, NaCl 0.5M (tamponA) en présence d'inhibiteurs de protéases (Complete free EDTA, Roche). L'extrait soluble est récupéré après centrifugation et chargé sur une colonne de nickel pré-équilibrée avec le tampon A. La protéine 1D5 est éluée en utilisant un gradient linéaire d'imidazole. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées puis dialysées contre un tampon 20 mM Tris/HCI pH 7,6, 50 mM KCI en utilisant des sacs de dialyse dont le seuil de coupure est de 6-8 kDa (Spectra/Por). La protéine est concentrée par ultrafiltration dans des tubes Amicon (Millipore) avec un seuil de coupure de 5 kDa. Le domaine CC2-LZ (SEQ ID NO.3) (aa 251-337 de NEMO murin) est cloné dans le plasmide pET28 en phase avec une étiquette histidine située du côté N-terminal. Ce domaine correspond aux résidus 258-344 de NEMO humain (SEQ ID NO.4). La protéine est exprimée dans une souche d'E. coli, BL21-gold (DE3), et purifiée sur une colonne de nickel comme décrit pour la purification de l'ankyrine 1D5. La protéine CC2-LZ est ensuite purifiée sur une colonne échangeuse de cations, Poros 20-HS (Perseptive Biosystem). La colonne est pré-équilibrée dans le tampon 50 mM MES pH 7.1, 50 mM KCI et les protéines sont éluées par un gradient linéaire de KCI. Les fractions d'intérêt sont rassemblées et dialysées contre un tampon 20mM Tris/HCI pH 8.0, 100 mM KCI, puis concentrées par ultrafiltration. La pureté de la protéine est estimée supérieure à 98% d'après l'analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes et coloration par du bleu de Coomassie. La concentration en protéine est déterminée par la méthode du Bradford et par mesure de l'absorption à 280 nm en utilisant un coefficient d'absorption de 2312 M-'cm-1 pour le CC2-LZ et 1490 M-'cm-1 pour l'1 D5. Les protéines 1D5 et CC2-LZ sont incubées ensemble pendant 30 min dans la glace et le complexe est purifié sur une colonne Superdex 200 HR 5 2927080 -16- (Pharmacia) équilibrée dans un tampon 20 mM Tris/HCI pH 8, 100 mM KCI. La stoechiométrie de liaison dans le complexe est de 1:1. Le complexe est concentré par ultrafiltration afin d'obtenir une concentration en protéines de 10-13 mg/ml. 1.2 Conditions de cristallisation du complexe protéique ankyrine 1 D5 I CC2-LZ Des cristaux ont poussé de façon reproductible dans deux conditions 10 différentes (Jena Bioscience ref :3A4 et 8B5). La solution réservoir 3A4 contient : 10% PEG 40000, 5% isopropanol,100 mM Na Hepes pH 7.5, et la solution 8B5 contient : 5% MPD (2-methyl-2,4-pentadiol), 5% éthanol, 100 mM Na Hepes pH7.5. Les cristaux ont poussé sous diffusion de vapeur dans des gouttelettes suspendues ensemencées avec des micro cristaux 15 (microseeding). 1 pl du complexe protéique est ajouté à 1 pi de la solution réservoir et équilibré sous diffusion de vapeur à 18-20°C pendant plus de 36 heures. Des micros cristaux (0.1 pl) obtenus à partir de fragment de cristaux sont introduits dans la goutte. Après l'ensemencement, les cristaux poussent en quelques jours pour atteindre une taille de 300x150x20pm. 20 Pour la protection cryogénique, les cristaux sont plongés pendant 30 secondes dans la solution réservoir contenant en plus du PEG 4000 et 20%C de glycérol pour le 3A4 ou 30% MPD pour le 8B5. Les cristaux sont montés sur des boucles de nylon et congelés très rapidement avant la collecte des données. 25 1.3 Analyse du complexe protéique ankyrine 1 D5 I CC2-LZ Les données de diffraction aux rayons X (1=0.9794 A) sont enregistrées à l'aide du faisceau de rayonnement PX06SA au SLS (Source de Lumière 30 Synchrotron Suisse) et d'un détecteur à pixels hybrides Pilatus 6M (distance cristal-détecteur, 640 mm et oscillations 0,5° par pas à 100°K). 5 -17- Les jeux de données sont traités avec la chaîne de programme XDS. Les cristaux appartiennent tous au même groupe d'espace P43212 avec les paramètres de la maille cristalline suivant : a = b = 63. 5 A et c = 437.5 A. 1.4 Détermination et affinement de la structure cristallographique du domaine CC2-LZ de NEMO La structure a été résolue par remplacement moléculaire en utilisant le 10 programme AmoRe utilisant le modèle atomique de l'ankyrine 2JAB (Zhand et ai, à paraître) et un modèle théorique pour les hélices de NEMO. Les données entre 15 et 3.5 A de résolution ont été utilisées pour ces calculs. Après analyse de la carte de densité électronique une construction manuelle du modèle a été entreprise en utilisant O. Un affinement avec 15 TLS a été réalisé en utilisant le programme Refmac. Le modèle a été affiné en maintenant des contraintes de symétrie non cristallographiques pour l'ankyrine (chaîne C et D) et pour les hélices de NEMO (résidus 251 à 290, région N-terminale et résidus 294 à 337, région C-terminale). Le modèle final contient 26 molécules de solvant et une molécule de glycérol, avec 20 une résolution Rcryst/Rfree de 20.8%/26.1% à 3,5 A. Les données stéréochimiques et les facteurs R sont présentés dans le tableau 1. La qualité stéréochimique du modèle a été analysée avec PRO-CHECK. 25 305 -18- Jeux de données et affinement : a Valeurs entre parenthèses sont indiquées pour l'enveloppe de résolution externe : 3.43û3.25 A. bRsym = S II-(I)IIS (I) , où I est l'intensité de mesure de chaque réflexion et (I) est l'intensité moyenne de cette réflexion. c (rmsd) Ecart quadratique moyen. Paramètres du cristal Paramètres de la maille (A) Groupe d'espace Données de diffractions Température (K) Gamme de résolution (A) Réflexions observées (1)0 (1)) Réflexions uniques (10 (1)) Taux de remplissage (%) 20-3.25 0.208 Rfree 0.261 rmsdc des longueurs de liaison (A) 0.013 rmsd des angles de liaison (°) 1.573 Diagramme de Ramachandran (%) Résidus dans la conformation "Most favored" 91.8 Résidus dans la conformation "Additionally allowed" 8.0 Résidus dans la conformation "Generously allowed" 0.2 Résidus dans la conformation "Disallowed" 0.0 Rsymb I/ (I) Monomères par unité asymétrique Occupation du solvant (%) Coefficient de Matthews (A3/Da) Affinement Résolution (A) Rfactor a=b=63.5 c=437.5 P43212 100 30-3.25 280,552 (15,169) 28,729 (2,134) 99.1 (99.4) 0.140 (0.449) 5.5 (1.7) 2 73.3 4.6 - 19- EXEMPLE 2 : Validation structurale par mutagenèse dirigée d'une conformation active de NEMO 2.1 Construction des plasmides et mutagenèse dirigée Le cDNA codant pour le domaine CC2-LZ humain de NEMO appelé Tax CC2-LZ et allant de la Met 215 au Glu 362 (numérotation humaine) est obtenu par PCR en utilisant les deux amorces nucléotidiques suivantes: NEMO 1 SEQ ID NO.8 (5'-CCCCATATGGAGCGCCAGGCCGCCTC) et NEMO 2 SEQ ID NO.9 (5'-TGAGGAAGCGGATGTCGAGTAGCTCGAGGGG). Ce cDNA est introduit entre les sites de restriction Ndel et Xhol d'un vecteur d'expression bactérien, pET-28b (Novagen) pour générer le vecteur pET-NEMO. L'étiquette FLAG correspondant à la séquence DYKDDDDK est introduite 1s dans un vecteur d'expression de mammifère pcDNA3 entre les sites de restriction Hindlll et EcoRl pour créer le plasmide pcFLAG. Le cDNA codant pour la forme humaine de NEMO est amplifié par PCR avec les deux amorces nucléotidiques suivantes, NEMO 3 SEQ ID NO.10 (5'- GGGGAATTCTAATAGGCACCTCTGGAAGAG) et NEMO 4 SEQ ID 20 NO.11 (5'- CATGGAGTGCATTGAGTAGCTCGAGGGG) puis introduit dans le plasmide pcFLAG entre les sites de restriction EcoRI et Xhol pour créer le plasmide pcNEMO-WT. Les mutations ponctuelles GIu296Ala, Phe312Ala, Glu315Ala, Ala323Pro et le double mutant Leu329AIa Leu336Ala sont introduites d'une part dans le 25 vecteur bactérien pET-NEMO-WT et d'autre part dans le vecteur de mammifère pcDNA3/NEMO-WT en utilisant la technique de mutagenèse dirigée dont le protocole est décrit dans le kit � Quikchange II Site-Directed Mutagenesis � de chez Stratagene. 30 2927080 -20- 2.2 Complémentation fonctionnelle dans des fibroblastes embryonnaires de souris Des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) déficients en NEMO sont 5 cultivés en boites de culture cellulaire et transfectés transitoirement avec un mélange contenant : 0.2 .ig d'un plasmide pEF1 codant pour la R-galactosidase, 0.5 �g d'un plasmide contenant le gène rapporteur Igkluciférase et 2 �g des plasmides exprimant les différents variants de NEMO. Vingt quatre heures après la transfection, les cellules sont activées avec du 10 TNFa (20 nglml) pendant 24 h. Les cellules sont alors récupérées puis lysées dans 110 �l de tampon 25 mM TrislPhosphate pH 7,8, 8 mM MgCl2, 1% Triton, 1 mM dithiothréitol, 15% glycérol auquel est ajouté un cocktail de protéases (Roche). Le lysat cellulaire est centrifugé à 13 000 rpm pendant 20 min à 4°C. L'activité du gène rapporteur est mesurée. 2.3 Expressions et purifications de la protéine sauvage et du mutant F312A La purification a est réalisée en utilisant un appareil AKTA Purifier 100 (Amersham Pharmacia Biotech). La purification des différentes protéines est faite à partir d'une culture de 3 litres de bactéries BL21-Gold D3 (Stratagene) transformées avec les différents plasmides pET 28 et en présence de kanamycine (50 �g/ml). L'expression des protéines est induite avec 1 mM d'IPTG à 37°C pendant 4 heures. Après centrifugation 20 min à 6000 g à 4°C, les bactéries sont lavées dans un tampon Tris/HCI 100 mM pH 8 contenant 10 mM MgCl2. Les culots bactériens sont congelés à -20°C. Les culots sont ensuite resuspendus dans un tampon d'extraction (Tris/HCI 50 mM pH 8, KCI 20 mM et glycérol 5%) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Complete EDTA-free, Roche) à raison de 2 ml/g de bactéries puis broyées à l'aide d'une French Press sous une pression de 1500 psi. Le lysat bactérien subit 3 fois 10 secondes de sonication à 90 W permettant ainsi de diminuer la viscosité du milieu par fragmentation de l'ADN. Le lysat est alors -21- dilué 2,5 fois dans un tampon Tris/HCI 50 mM pH8, NaCI 1M puis centrifugé à 10 000 g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant est ensuite déposé sur une colonne d'affinité Ni-NTA Superflow de 20 ml (Qiagen) préalablement équilibrée dans le tampon précédent. Après un lavage sur toute une nuit de la colonne pour éliminer toutes les protéines non accrochées ainsi que l'ADN, les protéines sont éluées par un gradient linéaire (0-500 mM) d'imidazole (ACS, Merck) dans le tampon d'équilibration de la colonne. Les fractions contenant la protéine d'intérêt sont rassemblées et dialysées contre un tampon HEPES 20 mM pH 7,5, KCI 50 mM, EDTA 1 mM. Le dialysat dont le pH est amené à 6 avec du MES 1M est chargé sur une colonne échangeuse de cations Poros 20-HS (Perseptive Biosystem) préalablement équilibrée dans un tampon MES 50 mM pH6, KCI 50 mM. L'élution est effectuée par un gradient linéaire de KCI (50 mM-1 M). Les fractions protéiques sont réunies puis concentrées par ultrafiltration (Amicon-Ultra avec un seuil de coupure de 10 000) et dialysées contre un tampon Tris/HCI 20 mM pH 8, KCI 100 mM. Les protéines sont conservées aliquotées à - 80°C. La pureté des différentes protéines est estimée >98% d'après l'analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes et coloration par du bleu de Coomassie. La concentration en protéine est déterminée par mesure de l'absorbance à 280 nm en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 5960 M-'cm-1. 2.4 Filtration sur gel de la protéine sauvage et du mutant F312A Les expériences de filtration sur gel sont réalisées à 4°C sur une colonne Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Biosciences). La colonne est équilibrée dans un tampon Tris/HCI 50 mM pH7,5, NaCl 200 mM, DTE 0,2 mM à 4°C avec un débit de 0,5m1/min. Un échantillon de volume constant (200�I), à une concentration de 0.3 .iM est injecté sur la colonne à un débit de 0,5m1/min. Les protéines sont diluées dans le tampon d'équilibration de la colonne et laissées à 4°C pendant 2 heures avant l'injection afin de les -22 - laisser s'équilibrer. Pour détecter l'élution des protéines, un spectrofluorimètre RF-10 AXL (Shimadzu) est branché en ligne sur l'appareil AKTA. La fluorescence intrinsèque est enregistrée en mesurant l'émission de fluorescence des résidus tyrosines à 310 nm après excitation à 280 nm.5 -23- Tableau 1 : Chains A & B = Nemo CC2LZ with numbering corresponding to entry 088522 Nemo aa = M251 to L336 chain A starts at 242 and chain B at 247 chains C& D = ankyrin 1D5 (aa 12 to 136) (extra aa from the his tag) REMARK Written by 0 version 11.0.5 REMARK Fri Nov 9 11:30:17 2007 CRYST1 63.499 63.499 437.472 90.00 90.00 90.00 ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000 ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000 ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000 SCALE1 0.015748 0. 000000 0.000000 0.00000 SCALE2 0.000000 0.015748 0.000000 0.00000 SCALE3 0. 000000 0.000000 0.002286 0.00000 ATOM 1 N VAL A 242 56.460 37.782 235.855 1.00 91.30 ATOM 2 CA VAL A 242 57.909 38.147 235.886 1.00 90.83 ATOM 3 CB VAL A 242 58.315 39.047 234.639 1.00 90.87 ATOM 4 CG1 VAL A 242 59.704 38.671 234.120 1.00 90.25 ATOM 5 CG2 VAL A 242 57.284 38.950 233.503 1.00 90.33 ATOM 6 C VAL A 242 58.376 38.794 237.240 1.00 90.98 ATOM 7 0 VAL A 242 59.397 39.509 237.240 1.00 91.19 ATOM 8 N PRO A 243 57.655 38.548 238.390 1.00 90.67 ATOM 9 CA PRO A 243 58.202 39.037 239.689 1.00 90.27 ATOM 10 CB PRO A 243 57.126 38.653 240.723 1.00 90.07 ATOM 11 CG PRO A 243 56.375 37.540 240.096 1.00 90.45 ATOM 12 CD PRO A 243 56.371 37.842 238.596 1.00 90.65 ATOM 13 C PRO A 243 59.499 38.312 240.017 1.00 89.62 ATOM 14 0 PRO A 243 59.553 37.077 239.966 1.00 89.75 ATOM 15 N ARG A 244 60.541 39.067 240.341 1.00 88.70 ATOM 16 CA ARG A 244 61.872 38.470 240.464 1.00 87.55 ATOM 17 CB ARG A 244 62.947 39.465 239.995 1.00 87.84 ATOM 18 CG ARG A 244 63.014 39.608 238.442 1.00 88.81 ATOM 19 CD ARG A 244 63.118 41.070 237.958 1.00 90.11 ATOM 20 NE ARG A 244 63.866 41.926 238.892 1.00 90.83 ATOM 21 CZ ARG A 244 64.326 43.151 238.622 1.00 90.77 ATOM 22 NH1 ARG A 244 64.139 43.706 237.425 1.00 90.57 ATOM 23 NH2 ARG A 244 64.988 43.819 239.559 1.00 90.60 ATOM 24 C ARG A 244 62.142 37.865 241.857 1.00 86.31 ATOM 25 0 ARG A 244 63.298 37.625 242.226 1.00 86.43 ATOM 26 N GLY A 245 61.057 37.604 242.605 1.00 84.69 ATOM 27 CA GLY A 245 61.092 36.869 243.883 1.00 82.05 ATOM 28 C GLY A 245 61.335 37.747 245.101 1.00 80.21 ATOM 29 0 GLY A 245 62.456 37.794 245.628 1.00 80.36 ATOM 30 N SER A 246 60.286 38.426 245.565 1.00 77.76 ATOM 31 CA SER A 246 60.425 39.428 246.624 1.00 75.11 ATOM 32 CB SER A 246 59.634 40.689 246.220 1.00 75.41 ATOM 33 OG SER A 246 59.738 41.711 247.201 1.00 75.87 ATOM 34 C SER A 246 60.011 38.954 248.029 1.00 72.89 ATOM 35 0 SER A 246 59.422 39.727 248. 773 1.00 72.73 ATOM 36 N HIS A 247 60.322 37.708 248.392 1.00 70.26 ATOM 37 CA HIS A 247 59.913 37.120 249.697 1.00 68.09 ATOM 38 CB HIS A 247 60.277 35.641 249.762 1.00 67.82 ATOM 39 CG HIS A 247 59.186 34.734 249.301 1.00 67.04 -24- ATOM 40 ND1 HIS A 247 58.145 34.350 250.118 1.00 66.33 7 ATOM 41 CE1 HIS A 247 57.331 33.558 249.446 1.00 66.01 6 ATOM 42 NE2 HIS A 247 57.810 33.409 248.224 1.00 66.25 7 ATOM 43 CD2 HIS A 247 58.969 34.136 248.107 1.00 66.19 6 ATOM 44 C HIS A 247 60.439 37.801 250.974 1.00 66.82 6 ATOM 45 0 HIS A 247 61.560 38.276 251.027 1.00 66.82 8 ATOM 46 N MET A 248 59.632 37.847 252.018 1.00 65.13 7 ATOM 47 CA MET A 248 60.064 38.545 253.196 1.00 63.85 6 ATOM 48 CB MET A 248 58.872 39.115 253.929 1.00 63. 42 6 ATOM 49 CG MET A 248 58.207 40.253 253.206 1.00 61.36 6 ATOM 50 SD MET A 248 58.774 41.914 253.596 1.00 57.47 16 ATOM 51 CE MET A 248 60.164 41. 666 254.723 1.00 57.52 6 ATOM 52 C MET A 248 60.801 37.570 254.070 1.00 64.18 6 ATOM 53 0 MET A 248 61.670 37.954 254.840 1.00 64.07 8 ATOM 54 N ALA A 249 60.452 36.294 253.928 1.00 64.58 7 ATOM 55 CA ALA A 249 61.043 35.208 254.706 1.00 64.98 6 ATON 56 CB ALA A 249 59.958 34.470 255.465 1.00 64. 98 6 ATOM 57 C ALA A 249 61.812 34.241 253.811 1.00 65.59 6 ATOM 58 0 ALA A 249 62.166 34.563 252.674 1.00 65.95 8 ATOM 59 N SER A 250 62.059 33.042 254.310 1.00 66.12 7 ATOM 60 CA SER A 250 62.839 32.087 253.553 1.00 66. 93 6 ATOM 61 CB SER A 250 63.744 31.314 254.508 1.00 66.77 6 ATOM 62 0G SER A 250 64.646 30.481 253.810 1.00 65.76 8 ATOM 63 C SER A 250 61.970 31.123 252.738 1.00 67.78 6 ATOM 64 0 SER A 250 61.227 30.342 253.310 1.00 68.10 8 ATOM 65 N MET A 251 62.056 31.178 251.410 1.00 68.65 7 ATOM 66 CA MET A 251 61.516 30.102 250.572 1.00 69.76 6 ATOM 67 CB MET A 251 60.218 30.531 249.884 1.00 69.79 6 ATOM 68 CG MET A 251 59.165 31.143 250.777 1.00 70. 09 6 ATOM 69 SD MET A 251 58.290 29.962 251.810 1.00 71.12 16 ATOM 70 CE MET A 251 57.647 28.875 250.577 1.00 71.11 6 ATOM 71 C MET A 251 62.540 29. 722 249.506 1.00 70.50 6 ATOM 72 0 MET A 251 62.395 30.116 248.350 1.00 70.57 8 ATOM 73 N GLN A 252 63.564 28.951 249.872 1.00 71.84 7 ATOM 74 CA GLN A 252 64.688 28.819 248.959 1.00 72.21 6 ATOM 75 CB GLN A 252 65.925 28.261 249.676 1.00 72.09 6 ATOM 76 CG GLN A 252 67.098 28.095 248.749 1.00 71. 00 6 ATOM 77 CD GLN A 252 68.311 28.812 249.232 1.00 69.60 6 ATOM 78 0E1 GLN A 252 69.065 28.298 250.045 1.00 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49.037 199.033 1.00 58.37 8 ATOM 1148 CG2 THR B 290 49.080 50.600 200.509 1.00 58.09 6 ATOM 1149 C THR B 290 45.477 49.968 199.519 1.00 57.49 6 ATOM 1150 0 THR B 290 45.314 50.181 198.326 1.00 57.68 8 ATOM 1151 N VAL B 291 44.666 49.246 200.219 1.00 56.42 7 ATOM 1152 CA VAL B 291 43.718 48.486 199.483 1.00 55.71 6 ATOM 1153 CB VAL B 291 43.220 47.261 200.256 1.00 55.56 6 ATOM 1154 CG1 VAL B 291 41.969 46.707 199.600 1.00 55.43 6 ATOM 1155 CG2 VAL B 291 44.306 46.204 200.310 1.00 54.82 6 ATOM 1156 C VAL B 291 42.552 49.347 199.060 1.00 55.33 6 ATOM 1157 0 VAL B 291 42.378 49.641 197.868 1.00 55.71 8 ATOM 1158 N PRO B 292 41.720 49.732 200.028 1.00 54.73 7 ATOM 1159 CA PRO B 292 40.521 50.486 199.688 1.00 54.28 6 8 ZZ'S6 00'1 6Sb'88T 0�Z'TS 80�'5� 66Z g dSV 0 SUI WOZK 9 ZI'Sf 00'1 696'681 665'T� T86'S� 66Z g dSV D 61ZT WOZK SS 8 90'TS 00'1 69Z'S61 80�'86 ��L'S� 66Z g dSV ZQO SIZT WOZK 8 88'66 00'T 8ZZ'161 08S'L6 OLZ'95 66Z g dSV 1GO ZIZI WOZK 9 �L'86 00'1 LEO'Z61 586'86 Z68'S8 66Z g dSV JO TUT NOV 9 �8'96 00'T L86'161 LL8'66 S69'S� g dSV Z66Z OUT NOZK g0 9 ZO'96 00'1 90Z'06T 0T1'OS 616'9� 66Z g dSV KO 60Z1 WOZK OS L 6Z'9t 00'1 S66'06T ZOT'OS ZZ8'L8 66Z g dSV N 8021 WO,LK 8 �0'L6 00'1 055'881 9S5'OS O68'8� 86Z g K'IK 0 LOZT NOZK 9 T8'96 00'T IIS'68T Z61'OS T69'8� 86Z g K`IK D 9O1 WOZK 9 06'96 00'1 085'061 0�8'86 6L6'06 86Z g K`IK g0 SOU WOZK 9 �0'L6 00'1 T�6'681 �6T'OS 091'06 86Z g K'IK KD 60Z1 WOZK Sb L LS'L6 00'1 098'061 OZZ'TS Z56'06 86Z g K'IK N �OZT WOZK 8 19'86 00'1 SL9'68T 6Z8'ZS �0�'65 L6Z E N'ID 0 ZOZ1 WOZK 9 66'86 00'1 ZL9'06T 996'ZS S86'6E L6Z g N'IO D 10ZT WOZK L 8�'SS 00'1 L19'S61 �L6'6S 66�'66 L6Z g N'ID ZEN OOZ1 WOZK 8 Z8'SS 00'1 916'161 696'65 Z59'66 L6Z g N'IO TEO 6611 NOJ,K 017 9 10'6S 00'1 Z6�'Z61 Z08'6S �88'�6 L6Z g N'ID GD 8611 WOZK 9 Z8'OS 00'T SZZ'Z61 S68'6S ZLS'Z6 L6Z g NID 00 L611 WOSK 9 56'86 00'1 TL8'161 8SS'�S Z68'T6 L6Z E N'ID gO 9611 NOZK 9 08'86 00'1 98L'161 8S6'SS 66�'06 L6Z g N'ID VD G611 WO,LK L 89'86 00'1 590'561 L00'SS 268'6� L6Z g N'ID N 6611 NOZK S� 8 66'66 00'1 86Z'Z61 199'ZS �9L'L8 96Z g K'IK 0 5611 WOZK 9 00'66 00'1 LOZ'S61 6Z9'ZS SLS'8� 96Z g KZK 0 2611 WOZK 9 06'86 00'1 OZS'S61 661'�� 600'8� 96Z g K'IK g0 1611 WOZK 9 ZO'66 00'1 1SS'661 60T'ZS 661'88 96Z g VTK KD 0611 WO,LK L 85'66 00'1 OZO'S61 SZ1'1S 880'68 96Z g K'IK N 6811 WOZK 0� 8 09'66 00'1 961'�61 �06'66 956'85 S6Z E SKI 0 8811 WOZK 9 8L'66 00'1 68Z'661 T90'OS ZLS'6� S6Z g SKI D L811 WOZK L 9I'9S 00'1 86L'S61 LOZ'S6 6S9'SS S6Z g SA'I ZN 9811 WOZK 9 6Z'6S 00'1 696'561 685'96 IVI'9� S6Z E SKI EO 5811 NO1K 9 6L'ZS 00'1 068'561 Z�9'96 OS9'L� 56Z E SKI GD 6811 NOZK SZ 9 L5'OS 00'1 89S'S61 0�0'86 SO1'8� S6Z g SKI 00 �811 WOZK 9 �8'66 00'1 S86'S61 98Z'86 S�S'65 S6Z g SA'I E3 Z811 W01V 9 66'66 00'1 916'661 8�0'66 16Z'06 56 Z g SX'I KO 1811 WO,LK L LZ'OS 00'1 SZ6'S6I 899'66 Z86'I6 56Z g S~'I N 0811 WOIK 8 9S'IS 00'1 665'561 T1S'OS �L6'16 66Z g OEZ 0 6L11 WOZK OZ 9 10'15 00'1 985'661 Z55'OS 6SZ'Z6 66Z g IIEZ 0 8L11 NOIX 9 6L'S5 00'T 6T9'S61 9Z6'OS 18S'96 66Z g IlHI ZQO LLII NOIX 9 I6'�S 00'1 OL8'561 981'66 S�6'S6 66Z g IlH7 TQO 9L1T NO,LK 9 OZ'ZS 00'1 LZ�'S61 509'66 1Z8'S6 66Z g IIE'I JO SLII WOZK 9 6ZùES 00'1 Z69'S61 189'66 16�'66 66Z g IlHI gO 6LI1 NOIX SI 9 Z6'TS 00'1 99I'S61 ZL8'OS 0�5'�6 66Z g IIE'I KO �L11 NOIX L �0'ZS 00'1 60�'961 60L'1S L�Z'�6 66Z E IIE`I N ZLTI NOZK 8 99'ZS 00'T 96�'S61 Z66'ZS 619'16 �6Z g IKA 0 I L I T WOZK 9 1L'ZS 00'1 155'961 099'ZS 50�'Z6 �6 Z g IKA D 0L11 NOIX 9 9S'�S 00'1 OLZ'L61 �96'S� 68�'�6 �6Z g ZKA ZOO 691T NOIX Oi 9 �9'ZS 00'1 �OS'86T ZOS'SS 0�5'66 �6Z g 'IKA 100 8911 NOIX 9 55'�5 00'1 �1Z'861 9LZ'6S 60Z'S6 � 6 Z g IKA g0 L911 WOZK 9 SO'�S 00'1 SOL'L61 Z55'�S Z90'Z6 �6Z g 'IVA KO 9911 NOZK L 6�'�S 00'1 ZOL'861 SZE'ZS �9L'16 �6Z g 'IKA N 5911 NOIX 8 6Z'�S 00'1 SL9'L61 Z6S'1S T16'6� Z6Z g O2Id 0 6911 NOIX S 9 ZL'ES 00'1 865'861 65S'IS SOL'06 Z6Z g O2Id D 5911 NOIX 9 L6'6S 00'1 LL6'10Z 956'66 �6L'I6 Z6Z g O2id QO Z911 NOIX 9 6Z'6S 00'1 900'ZOZ 660'OS 5ZS'06 Z6Z g O2id JO 1911 NOIX 9 8�'65 00'1 810'10Z OZT'1S S61'06 Z6Z g O2Id ED 0911 NOIX _j7.7_ 08OLZ6Z REVENDICATIONS 1. Domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO.3 ou une séquence variante de celle-ci, caractérisé en ce qu'il est sous une forme cristalline. io 2. Domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère ayant la séquence en acides aminés SEQ ID NO.4 ou une séquence variante de celle-ci, caractérisé en ce qu'il est sous une forme cristalline. 3. Co-cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère et d'au moins is une ankyrine ou un fragment de celle-ci capable de stabiliser un complexe avec le domaine CC2-LZ de NEMO, caractérisé en ce que le co-cristal possède les paramètres de maille suivants : a=b=63.5 � 5 A ; c=437.5�5A; 20 -a=p=y=90°; et en ce que le co-cristal a un groupe d'espace P43212. 4. Co-cristal selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend une ankyrine 1D5. 5. Co-cristal selon l'une des revendications 3 et 4, caractérisé en ce qu'il possède les coordonnées cristallographiques décrites dans le tableau 1. 6. Co-cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère selon l'une des 30 revendications 3 à 5, caractérisé par sa structure tridimensionnelle obtenue 25 30- 87 - par diffraction des rayons X, ladite structure tridimensionnelle étant représentée figure 2. 7. Cristal du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère, caractérisé par sa s structure tridimensionnelle obtenue par diffraction des rayons X représentée figure 3. 8. Cristal selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine CC2-LZ comprend la mutation AIa316Pro (A316P) ou la mutation Phe305Ala 10 (F305A). 9. Cristal selon la revendication 2, caractérisé en ce que la protéine CC2-LZ comprend la mutation Ala323Pro (A323P) ou la mutation Phe312Ala (F312A). 15 10. Procédé de cristallisation du domaine CC2-LZ de NEMO de mammifère, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes suivantes : -incubation d'au moins une ankyrine ou d'un fragment d'ankyrine 20 capable de stabiliser le complexe formé avec le domaine CC2-LZ ; -co-cristallisation du complexe protéique ankyrine ou d'un fragment d'ankyrine/CC2-LZ par culture des cristaux par diffusion de vapeur. 11. Cristal produit par le procédé selon la revendication 10. 12. Procédé de détermination de la structure tridimensionnelle du cristal ou du co-cristal du domaine CC2-LZ de NEMO selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le procédé comprend les étapes suivantes : -obtention d'un cristal ou d'un co-cristal de la protéine CC2-LZ ; exposition du cristal aux rayons X ; collecte des données de diffraction aux rayons X ;-88- utilisation de ces données pour calculer la carte de densité électronique dudit cristal ; construction et affinement du modèle à partir de la carte de densité électronique.5