Brevet FR2930402A1 — publié le 20091030

PROCEDE DE TRAITEMENT D'UNE PLANTE SUPERIEURE EN VUE DE CONTROLER SA CROISSANCE ET SON ARCHITECTURE Domaine technique L'invention concerne un procédé de traitement en vu de contrôler la croissance et l'architecture des plantes supérieures. Plus précisément, l'invention concerne l'utilisation de strigolactones pour inhiber sélectivement ou globalement la croissance de bourgeons sur une plante d'intérêt, et ainsi le nombre de ramifications. L'inhibition peut être temporaire de manière à contrôler la période de développement de ces bourgeons, ou permanente afin par exemple de favoriser la croissance d'autres ramifications au détriment de celle(s) inhibée(s). L'invention concerne également l'utilisation des strigolactones pour l'identification de gènes et/ou molécules intervenant dans le processus de contrôle de la croissance et de la pousse des bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures. L'invention trouve des applications dans le domaine agricole, pour la culture de plantes, telles que des plantes alimentaires, des légumineuses, des plantes forestières, des plantes ornementales etc., pour lesquelles le contrôle du nombre de ramifications et/ou de la période de ramification peut améliorer le rendement et/ou la qualité de la production (taille du fruit, qualité du bois tec.). Par plantes supérieures, on entend les végétaux pluricellulaires, vasculaires, munis de racines et d'une partie aérienne. Par culture, on entend aussi bien la culture en champ, qu'en plantation pour les forêts, que la culture in vitro, hors sol ou autre. Etat de la technique Les plantes cultivées, que ce soit pour leurs fleurs, leurs fruits, leurs graines ou pour leurs parties végétatives font l'objet de nombreux contrôles et traitements, de manière à obtenir le meilleur rendement possible et la meilleure qualité. Ainsi par exemple, on essaie de maîtriser les périodes de floraison de manière à éviter que les bourgeons floraux soient initiés pendant les périodes de forts risques de gel. De même, lorsqu'on souhaite obtenir des fruits de gros calibre, ou plus généralement des plantes plus vigoureuses, on procède à une taille de la plante de manière à limiter le nombre de ramifications et ainsi le nombre d'organes � puits � que sont les fruits en période de grossissement ou les graines en cours de remplissage. L'utilisation d'engrais permet également d'optimiser les rendements. De tels contrôles et traitements nécessitent une connaissance outre de la plante elle-même, des conditions dans lesquelles elle est cultivée : nature du sol, climat etc., notamment pour savoir quand et comment tailler les plantes. Par ailleurs, la taille est un procédé manuel fastidieux, coûteux nécessitant l'intervention de personnes qualifiées. Exposé de l'invention Dans l'invention, on cherche à fournir un nouveau procédé de traitement des plantes qui permette de contrôler leur croissance, par inhibition totale ou partielle, définitive ou temporaire de la croissance des ramifications, de manière notamment à optimiser le rendement de ces plantes. Pour cela, dans l'invention, on propose de mettre les plantes à traiter en contact de strigolactones de manière à inhiber ou limiter la pousse de tout ou partie des ramifications. Les strigolactones sont des molécules composées d'une lactone tricyclique connectée à un cycle butyrolactone par un pont énol éther. On connaît actuellement de nombreuses strigolactones naturelles et de synthèses. Notamment, dans le document FR2865897 plusieurs strigolactones sont utilisées pour amplifier le développement et/ou la croissance des champignons mycorhiziens à arbuscules de manière à augmenter l'interaction symbiotique entre ces micro-organismes et les plantes hôtes. Les strigolactones sont également connues comme étant des inducteurs de la germination des graines de plantes parasites telles que les Orobanches. Afin d'éliminer de telles plantes des sols agricoles, on traite lesdits sols avec des strigolactones de manière à induire la germination des plantes parasites en l'absence de plantes hôtes, ce qui entraîne leur mort par manque de nutrition. Comme l'ont découvert de manière surprenante les inventeurs, les strigolactones interviennent aussi dans la croissance des plantes supérieures en contrôlant le démarrage des ramifications et correspondraient au signal SMS (Shoot Multiplication Signal) répresseur de la ramification identifié chez plusieurs espèces dicotylédones et monocotylédones par la caractérisation de mutants hyper-ramifiés notamment les mutants rmsl à rms5 de pois (Beveridge 2006). L'invention a donc pour objet un procédé de traitement d'une plante supérieure en vu de contrôler la croissance et l'architecture de la plante, caractérisé en ce qu'on place au contact de la plante une quantité adaptée de strigolactones de manière à inhiber la formation d'au moins une ramification. Les strigolactones utilisées sont aussi bien des strigolactones 15 naturelles telles que tËIp i a:ctoine .es,: N '-Strigo OrQbancI o1 20 ` e;pr ombanchtl G Orobanc iyl acetat Sofa racoI: tetradehyMiros,{+ ol ou que des strigolactones de synthèse, telle que la GR24, ou la molécule ABC, ne comportant que certains cycles (A, B et C) des strigolactones : ABC10 Par inhiber, on entend réprimer définitivement ou temporairement la croissance d'un bourgeon. Ainsi, selon l'invention, on peut supprimer une ramification en inhibant définitivement la croissance du bourgeon correspondant, ou mettre en dormance ledit bourgeon de manière à retarder dans le temps sa croissance. Par ramification, on entend l'excroissance issue du bourgeon axillaire situé à l'aisselle des feuilles, que ce soit une branche, une fleur ou une inflorescence. L'inhibition peut être globale, c'est-à-dire toucher tous les bourgeons axillaires au moment du traitement de la plante, ou ciblée, c'est-à-dire ne toucher que des bourgeons spécifiquement visés par le traitement. Les plantes traitées peuvent aussi bien être cultivées en serres, qu'en champs, in vitro ou même hors sol. Une quantité adaptée s'entend d'une quantité au moins suffisante pour agir sur la croissance et l'architecture de la plante à traiter. Selon le procédé de l'invention, on peut appliquer une solution comportant des strigolactones sur une portion au moins partielle de la partie aérienne de la plante. Par exemple, on peut vaporiser ou déposer la composition sur les bourgeons que l'on souhaite réprimer, ou sur la partie de la plante dont on souhaite contrôler la croissance. Il est autrement possible d'injecter la composition au niveau des bourgeons même, ou des tiges portant les bourgeons à réprimer. Dans un autre exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il est possible de prévoir d'enrichir le sol en strigolactones, de manière à diminuer de manière non sélective le nombre de tiges ou de freiner leur croissance. En effet, les inventeurs ont observé que le signal de répression SMS de la croissance des ramifications migre dans le sens racine û tige, ce qui laisse penser qu'il est véhiculé par la sève brute du xylème (Foo et al. 2001 PI Physiol 126 :203-209). Avantageusement, la concentration en strigolactones dans la composition est au minimum de 1 nM et variera selon qu'on souhaite inhiber définitivement ou temporairement la croissance du bourgeon, la concentration étant en outre fonction de la nature de la plante à traiter. D'une manière générale, la concentration en strigolactones à appliquer variera entre 1 nM et 100 �M, et préférentiellement entre 100 nM et 1000 nM. De même, le nombre de jours de traitement peut varier en fonction de la plante, de son âge au moment du traitement, de l'effet définitif ou non souhaité etc. L'invention a également pour objet l'utilisation de strigolactones pour l'identification de gènes et/ou de molécules intervenant dans le contrôle de la croissance des bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures. Ainsi, on peut utiliser les strigolactones pour identifier les récepteurs aux strigolactones chez les plantes. Le gène RMS4, supposé être impliqué dans la réponse au signal SMS, code une protéine à boîte F. Or, il existe plusieurs exemples de récepteurs à des hormones végétales qui sont des protéines à boîte F : le récepteur à l'auxine TIR1 (Dharmasiri et al. 2005 Nature 435:441-445) ; le récepteur à l'acide jasmonique CO11 (Xie et al. 1998 Science 280:1091-1094). De même, on peut utiliser les strigolactones pour l'identification des composantes de la voie de signalisation par le criblage de mutants résistants aux strigolactones. Les strigolactones naturelles ou synthétiques, telles que GR24, peuvent être utilisées pour cribler des mutants résistants et/ou ne répondant pas à l'application de strigolactones. Les gènes correspondant aux mutants sont alors clonés de manière à identifier de nouvelles protéines de la voie de signalisation (Leyser et al. 1993 Nature., 364:161-164 ; Guzmàn and Ecker 1990 Plant CelI. 6:513-523) Il est également possible d'utiliser des strigolactones pour identifier des composantes de la voie de signalisation par l'identification de gènes dont l'expression est modifiée, c'est-à-dire réprimée ou induite, par l'application de strigolactones (Ulmasov et al. 1997 Science 276:1865-1868 ; Thines et al. 2007 Nature 448:661-665) De même, on peut envisager d'identifier des analogues chimiques plus stables ayant la même activité biologique que les molécules naturelles de strigolactones, ayant par exemple un coût de fabrication moindre. Dans la mesure où les strigolactones ont une action sur plusieurs processus (mycorhization, germination de graines parasites, ramification), on peut identifier et fabriquer des molécules ayant des activités spécifiques aux différents processus par l'identification des motifs essentiels à chaque activité biologique, de manière similaire à l'identification des analogues synthétiques réalisée pour les principales phytohormones comme le NAA, IBA ou 2,4-D (auxines synthétiques), kinétine (cytokinine synthetique). Il est autrement possible d'utiliser les strigolactones pour identifier tout ou partie de ses agonistes ou antagonistes, c'est- à- dire des molécules aptes à moduler positivement ou négativement la réponse aux strigolactones comme cela a été décrit pour l'identification d'agonistes et d'antagonistes de l'auxine (Hayashi et al. 2008 PNAS 105 :5632-5637). Brève description des figures - Les figures 1A et 1B montrent les résultats de l'analyse qualitative et quantitative de la strigolactone majoritaire présente dans les exsudats racinaires chez le pois sauvage et chez les mutants rmsl et rms4. - La figure 2 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la strigolactone synthétique GR24 appliquée sur des mutants de pois ; - La figure 3 représente un graphique en barres illustrant l'effet de différentes strigolactones, synthétiques et naturelle, sur des mutants de pois ; - La figure 4 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la strigolactone synthétique GR24 appliquée sur un pois sauvage ; - Les figures 5A et 5B représentent des graphiques illustrant l'effet de la strigolactone synthétique GR24 en fonction du stade de développement (taille) des bourgeons sur lesquels elle est appliquée - La figure 6 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la strigolactone synthétique GR24 injectée dans des mutants de pois à des concentrations croissantes sur le démarrage du bourgeon situé à une certaine distance au-dessus de la zone d'injection; - Les figures 7A, 7B et 7C représentent des graphiques en barres illustrant l'effet de la décapitation de la plante sur un bourgeon axillaire préalablement inhibé par de la strigolactone (figures 7A et 7B) et de la strigolactone sur des bourgeons axillaires d'une plante décapitée (figure 7C) ; - La figure 8 représente un graphique en barres montrant l'absence d'effet de la strigolactone sur le bourgeon apical chez le pois sauvage ; - La figure 9 représente un graphique en barres illustrant l'effet de la strigolactone synthétique GR24 sur des plantes sauvages et mutantes d'Arabidopsis thaliana. Description détaillée de l'invention On a voulu tester l'effet des strigolactones de synthèse GR24 et des strigolactones naturelles sur les mutants ramosus (rms) hyper-ramifiés du pois (Beveridge 2000 Plant Growth Regulation 32 :193-203). Les mutants rms sont connus comme présentant un nombre de ramifications très supérieur au nombre de ramifications chez le pois sauvage et notamment à tous les noeuds de la plante. Ces mutants rms ont été obtenus dans différents fonds génétiques sauvages (WT) qui présentent des bourgeons axillaires en général dormants. Ces pois WT peuvent cependant ramifier aux deux premiers noeuds de la plante suivant les conditions environnementales et différentes expériences sont également conduites sur les pois sauvages (WT Térèse û Fig 4). D'une manière générale, chez le pois, les deux premières écailles sont considérées comme les deux premiers noeuds, le noeud cotylédonaire étant le noeud 0. La caractérisation détaillée des mutants de pois hyper-ramifiés rms a permis de mettre en évidence l'existence d'un nouveau signal appelé SMS (Beveridge 2006) réprimant la ramification de la plante : - les mutants rmsl et rms5 sont des mutants de biosynthèse du signal SMS. La ramification de ces mutants est réprimée lorsque la tige mutante est greffée sur un porte-greffe sauvage (Morris et al. PI Physiol 126 :1205-1213). Les gènes RMS1 et RMS5 codent tous les deux pour des Carotenoid Cleavage Dioxygenase (Sorefan et al. 2003 Genes Dev 17 :1469-1474 ; Johnson et al. 2006 Plant Physiol 142 :1014-1026) ce qui suggère que le signal SMS est un dérivé de caroténoïdes comme les strigolactones (Matusova et al. 2005 Plant Physiol 139 :920-934). Ces gènes sont conservés chez les plantes et des homologues sont identifiés chez le riz, le pétunia ou le peuplier. Ainsi le gène RMS5 du pois correspond au gène MAX3 d'Arabidopsis et au gène HTD1 du riz (Johnson et al. 2006 Plant Physiol 142 :1014-1026). On peut donc supposer que le signal SMS est conservé chez les plantes. - le mutant rms4 est affecté dans la réception ou dans la voie de signalisation du signal réprimant la ramification : la ramification de ce mutant n'est pas réprimée lorsque la tige mutante est greffée sur un porte-greffe sauvage (Beveridge et al. 1996 Plant Physiol 110 :859-865). Chez la plante Arabidopsis thaliana, un autre gène de la voie de biosynthèse du signal SMS a été identifié, à savoir le gène MAXI. L'enzyme MAXI correspondante (un cytochrome P450) semble intervenir en aval des deux dioxygénases de clivage des caroténoïdes (� Carotenoid Cleavage Dioxygenases �) RMS1/CCD8 et RMS5/CCD7. Les inventeurs ont montré qu'une famille de molécules déjà connue, la famille des strigolactones, pouvait être utilisée pour réprimer la croissance des bourgeons axillaires d'une plante. Ces résultats suggèrent que le signal SMS identifié à l'aide des mutants hyper-ramifiés rms de pois appartiendrait à la famille des strigolactones. Afin de vérifier cette hypothèse, les inventeurs ont recherché et quantifié les strigolactones produites par le pois sauvage ou les mutants. Dans un premier temps, les auteurs ont recherché les strigolactones présentes dans les exsudats racinaires du pois sauvage WT Térèse. Pour cela, ils ont analysé l'extrait acétate d'éthyle des exsudats par spectrométrie de masse haute résolution, sur UPLC/QTOFMS (Ultra-Performance Liquid Chromatography couplé à un Quadrupole Time-Of-Flight). En recherchant les ions parents pouvant générer un ion fils à m/z : 97.0285, correspondant au cycle D, commun à toutes les strigolactones caractérisées, ils ont observé un pic majoritaire sur le chromatogramme. Le spectre obtenu pour ce composé présente les ions m/z 405.1555 et m/z 427.1377 (Figure 1A), correspondant respectivement à la masse théorique d'une molécule de formule brute C21H2508 [M + H]+ et C21H24O8Na [M + Na]+. La formule brute C21 H2408 pourrait correspondre soit à un strigyl acetate soit à un orobanchyl acetate portant un groupement supplémentaire hydroxyl ou epoxy. Cette identité est confirmée par l'ensemble des ions fils observés par MS/MS : les ions m/z 345.1351 [M+ H - CH3000H]+, 248.1058 [M + H û cycle D - CH3000H]+ et 97.0285 [cycle D]+ (Fig. 1A); Cette analyse permet de confirmer la présence d'une nouvelle 30 strigolactone dans les exsudats de pois (Térèse), dont la structure exacte n'est pas encore déterminée. Dans un deuxième temps, les inventeurs ont quantifié l'abondance de cette strigolactone dans les exsudats de pois sauvage issue de Térèse, des mutants rmsl lignée M3T-884 issue de Térèse et rms4 lignée M3T-946 issue 35 de Térèse. Les spectres présentés sur la figure 1B correspondent aux fragmentations de la strigolactone majoritaire avec perte du cycle D + acétate (spectre 404.8 > 247.8) et avec perte des cycles ABC (spectre 404.8 > 96.9). On observe que cette strigolactone, présente dans les exsudats racinaires du sauvage (Térèse), est présente chez le mutant rms4 (lignée M3T-946), mais n'est pas détectable chez le mutant rmsl (lignée M3T-884). Exemple 1 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois 10 et chez des pois sauvages avec application locale de strigolactones pour démontrer l'effet par application directe des strigolactones A] Expérience N °1 Une première expérience est conduite parallèlement sur les mutants 15 rmsl (lignée M3T-884 issue du sauvage WT Térèse) et rms4 (lignée M3T-946 issue du sauvage Térèse). On utilise 9 graines par traitement, qui sont semées en pots (3 plantes par pot) dans un terreau mélangé à des billes d'argile. Le semis est réalisé en serre sous une photopériode de 16h lumière/8h nuit. 20 Le traitement est réalisé 10 jours après le semis (stade 4 feuilles). Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 dissoute dans l'acétone à 0 nM et 100 nM (4% PEG 1450, 25% éthanol, 5 pour 1000 acétone) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 4 (N4), à raison de 10 pl par bourgeon. 25 Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 des plantes sont coupés pour favoriser le démarrage des bourgeons aux noeuds supérieurs. Le graphe de la figure 2 montre les résultats de la croissance du bourgeon au N4 (taille du bourgeon le jour du traitement û taille du bourgeon 30 à 8 jours) obtenus 8 jours après le traitement. Les plantes � non-traitées � correspondent aux plantes dont les bourgeons et/ou ramifications aux noeuds 1 et 2 ont été coupés mais qui n'ont reçu aucun traitement. Le contrôle � 0 nM � correspond aux plantes traitées avec la même solution que pour le traitement � 500 nM � mais sans 35 strigolactones. On constate que la croissance des bourgeons au N4 du mutant rmsl est fortement réprimée avec le traitement à 100 nM, alors que les bourgeons du mutant rms4 ne sont pas réprimés de manière significative, ce qui est en accord avec les résultats attendus avec le signal SMS. L'hormone végétale réprimant la ramification chez les plantes supérieures est vraisemblablement une molécule de la famille des strigolactones. L'application de strigolactone synthétique GR24 directement sur les bourgeons axillaires permet d'inhiber la croissance desdits bourgeons traités chez le mutant rmsl. B] Expérience N°2 Une seconde expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée M3T-884 issue du sauvage WT Térèse) afin de comparer sur ces mutants l'effet de la strigolactone synthétique GR24, d'une molécule synthétique ABC issue de GR24, ne présentant pas le quatrième cycle D caractéristique de la strigolactone, et une strigolactone naturelle, la Sorgolactone. Les plantes utilisées sont obtenues de manière identique aux plantes utilisées pour la première expérience. Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM, 100 nM, et 500 nM (4% PEG 1450, 10% éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 4 (N4), à raison de 10 pl par bourgeon. Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 des plantes sont coupés au moment du traitement. On mesure la taille des bourgeons des noeuds supérieurs (noeud N4) 9 jours après le traitement. Les résultats de la croissance du bourgeon sont illustrés par le graphe de la figure 3. On constate que la GR24 et la sorgolactone ont des effets comparables, la différence observée sur le graphe à 500 nM étant due à un effet statistique du fait du faible nombre de plantes testées (8 ou 9 plantes). Toutes les strigolactones permettent d'inhiber de manière significative la croissance des bourgeons traités dès 100 nM. La molécule ABC parait être beaucoup moins efficace que la GR24 et la sorgolactone.35 C] Expérience N°3 On a cherché à démontrer l'effet des strigolactones sur les plantes de pois sauvages. Pour cela, une troisième expérience est conduite sur des plantes du 5 sauvage WT Térèse. Les plantes utilisées sont obtenues de manière identique aux plantes utilisées pour la première expérience. Le traitement est réalisé 10 jours après le semis (stade 4 à 5 feuilles). Une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et 500 nM (4% PEG, 10% éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette 10 sur les bourgeons au noeud 2 (N2), à raison de 10 pl par bourgeon. Les bourgeons et/ou ramifications au premier noeud N1 des plantes sont coupés au moment du traitement. On mesure la taille des bourgeons au noeud N2, 8 jours après le traitement, les résultats étant repris dans le graphe de la figure 4. 15 On constate que la strigolactone synthétique GR24 agit également sur la croissance des bourgeons traités par application locale chez le pois sauvage. 20 Exemple 2 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois avec application locale de strigolactones à différents stades de développement des bourgeons On a voulu étudier l'effet des strigolactones sur le démarrage des 25 bourgeons axillaires en fonction de la taille et/ou du stade de développement du bourgeon au moment du traitement. A] Expérience N °1 Une première expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée 30 WL5237 issue du sauvage WT Parvus) afin de comparer l'effet des strigolactones synthétiques GR24 en fonction de la taille des bourgeons traitées au moment du traitement. Dans cette expérience, on utilise 20 graines par traitement, qui sont semées en pots (2 plantes par pot de 15 cm de diamètre) dans un terreau 35 mélangé à du sable. Le semis est réalisé en serre en lumière naturelle avec extension de la photopériode de 18h lumière/6h nuit avec des ampoules à incandescence (60W). Le premier jour de traitement, une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et 1000 nM (4% PEG 1450, 10% éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 3 (N3), à raison de 10�l par bourgeon. Le deuxième jour du traitement, une solution contenant la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et 1000 nM (4% PEG 1450, 50% éthanol) est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les mêmes bourgeons, à raison de 10 pl par bourgeon. Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 des plantes sont coupés au moment du traitement. Le premier traitement est réalisé sur des plantes ayant respectivement 9, 10, 11, 12 et 13 jours (les semis ont été échelonnés sur 5 jours). On mesure la taille des bourgeons au noeud N3 le jour du premier traitement (JO) et 3 et 7 jours après. Les résultats obtenus sont illustrés par les graphes de la figure 5A. On constate que tous les bourgeons, qui sont pourtant d'âges différents et ont une taille comprise entre 0.2 et 1 mm le premier jour du traitement, sont tous sensibles au traitement par application directe de GR24. B] Expérience N°2 Une seconde expérience est réalisée sur des mutants rmsl (lignée M3T-884 issue du WT Térèse) afin de comparer l'effet des strigolactones synthétiques GR24 en fonction de la taille des bourgeons au moment du traitement. Les plantes utilisées sont obtenues de manière identique aux plantes utilisées pour les expériences précédentes. Les plantes sont traitées par application d'une solution (4% PEG 1450, 10% éthanol) contenant de la sorgolactone ou de la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM et 500 nM. La solution est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 3 (N3), à raison de 10 pl par bourgeon. Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 35 des plantes sont coupés au moment du traitement. La taille des bourgeons traités est mesurée 9 jours après le traitement. Le graphe de la figure 5B montre l'influence de la taille du bourgeon au moment du traitement (JO) sur l'effet qu'a finalement la strigolactone sur le bourgeon traité. On constate qu'il existe un seuil dans la taille des bourgeons au-delà duquel ils ne sont plus sensibles au traitement par application de strigolactones. Ainsi, dans l'expérience conduite ici sur le pois et sur ce génotype, l'effet des strigolactones est quasiment nul sur des bourgeons traités faisant plus de 4 à 5 mm au moment du traitement. Exemple 3 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois avec injection de strigolactones dans la tige pour démontrer l'action à longue distance et l'effet dose-réponse des strigolactones On a voulu ici montré l'effet de l'injection de strigolactones à différentes concentrations dans les tiges des plantes, au niveau des noeuds situés au-dessus de la zone de piquage. Pour cela, une expérience est conduite sur des mutants rmsl (lignée 20 M3T-988 issue du WT Térèse) obtenus de manière identique aux mutants utilisés dans les expériences précédentes. Les plantes sont traitées par injection de la solution dans la tige au-dessus du noeud N3. Plus précisément, un fil de coton est piqué dans la tige des pantes à l'aide d'une aiguille et trempe dans la solution à tester. Les 25 solutions de GR24 utilisées (à 0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 500 nM) ont été préparées en diluant dans l'eau les solutions de GR24 conservées dans l'acétone à différentes concentrations de manière à avoir le même volume d'acétone (10�L d'acétone dans 20 mL d'eau). Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 30 des plantes sont coupés au moment du traitement. Les plantes � non-traitées � correspondent aux plantes contrôles, dont les ramifications N1 et N2 ont été coupées, mais qui ne sont pas piquées. On mesure la taille des bourgeons au noeud situé à une certaine distance au-dessus de la zone d'injection (N5) 8 jours après le traitement. Le graphe de la figure 6 montre la taille du bourgeon au noeud N5, 8 jours après traitement, en fonction du traitement. On constate que l'injection de GR24 au-dessus du N3 permet de réprimer la croissance du bourgeon situé à une certaine distance de la zone d'injection (N5) dès 10 nM. La strigolactone peut donc agir à distance sur la croissance des bourgeons axillaires, en étant vraisemblablement transportée dans la sève du xylème. Exemple 4 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois traités avant ou après décapitation A] Expérience 1 : Décapitation après traitement Une première expérience est réalisée parallèlement sur des pois sauvages (lignée WT Parvus) et mutants rmsl (lignée WL5237 issue de WT Parvus). Dans cette expérience, on utilise 18 graines par traitement, qui sont semées en pots (2 plantes par pot de 15 cm de diamètre) dans un terreau mélangé à du sable. Le semis est réalisé en serre en lumière naturelle avec extension de la photopériode de 18h lumière/6h nuit avec des ampoules à incandescence (60W). Lors d'une première étape, les plantes sont traitées par deux applications successives à 24 heurs d'intervalle d'une solution (2% PEG 3550, 50% éthanol) contenant de la strigolactone synthétique GR24 à 0 nM ou 1000 nM. La solution est appliquée à l'aide d'une micro-pipette sur les bourgeons au noeud 3 (N3), à raison de 10 pl par bourgeon. Les bourgeons et/ou ramifications aux deux premiers noeuds N1 et N2 des plantes sont coupés au moment du traitement. La taille des bourgeons traités est mesurée 7 jours après le traitement. Le graphe de la figure 7A reprend les résultats obtenus sur les bourgeons au N3. Lors d'une seconde étape, la moitié des plantes mutantes rmsl traitées sont décapitées au dessus du noeud 3, 9 jours après le traitement, l'autre moitié étant laissée intacte. Les bourgeons et/ou ramifications au noeud 3 des plantes traitées à 0 nM (qui n'ont donc pas été réprimés) sont coupés. La taille des bourgeons est mesurée 7 jours après la décapitation. Le graphe de la figure 7B reprend les résultats obtenus sur les bourgeons au N3. On constate que les bourgeons inhibés par la GR24 chez le mutant rmsl sont capables de repartir lorsqu'on décapite la plante, contrairement aux bourgeons traités des plantes non décapitées. B] Expérience 2 : Traitement avec décapitation Une seconde expérience est conduite sur des plantes de pois sauvages WT Torsdag obtenus de façon identique à l'expérience précédente (les plantes sont au stade 6 noeuds). Les bourgeons au noeud N6 des plantes sont traités par quatre applications successives à 24 heures d'intervalle d'une solution (2% PEG 3550, 50% éthanol) contenant de la strigolactone GR24 à 0 nM, 1000 nM ou 10000 nM. Les bourgeons et/ou ramifications sont coupés aux noeuds N1 à N5 au moment du traitement, tandis que chaque plante est décapitée au-dessus du noeud 6 juste avant la première application de la solution GR24. Les bourgeons N6 sont mesurés 7 jours après la première application, les résultats étant montrés à la figure 7C. On constate que la strigolactone, au moins à de fortes concentrations, permet de réprimer le démarrage des bourgeons axillaires qui avait pourtant été induit et favorisé par une décapitation. Exemple 5 : Test chez des mutants d'hyper ramification de pois avec application locale de strigolactones sur le bourgeon apical Une expérience a été menée sur des plantes de pois sauvages WT Parvus, afin d'observer l'effet de la strigolactone sur la tige principale. Les plantes testées ont été obtenues de manière identique aux plantes des 2 expériences précédentes.30 Le traitement est réalisé 25 jours après le semis (environ 7 noeuds sont développés). On applique sur le bourgeon apical de chaque plante 2 pl d'une solution 0,1% silwet à une concentration en GR24 de 0 nM ou 10000 nM. En guise de contrôle, on traite en parallèle des plantes par application sur le bourgeon apical de 1 pg de GA3 (1,44 mM) dans 0,1% silwet pour vérifier que ce traitement utilisant le silwet permet la pénétration des hormones dans les tissus de la plante. On mesure la taille de la tige principale 14 jours après le traitement, les résultats étant repris à la figure 8. On ne constate aucun effet des strigolactones sur la croissance de la tige principale, et ce même à forte concentration. Ces résultats rejoignent les résultats de l'expérience réalisée sur des bourgeons d'âges différents, dans laquelle lorsque le traitement est réalisé sur des bourgeons ayant déjà démarrés, le traitement est inefficace. Ainsi, la strigolactone ne réprime pas la croissance du bourgeon apical et de la tige principale, ni des ramifications ayant déjà démarrées et qui se comportent alors comme une tige à proprement parler. Cette constatation permet d'envisager l'utilisation des strigolactones pour contrôler la croissance d'arbres, tels que le chêne, le bouleau, le hêtre etc., qui sont cultivés pour leur bois, afin de limiter le nombre de ramifications et d'obtenir des troncs ayant une longueur de tronc pratiquement sans noeud importante. Exemple 6: Test chez des mutants d'hyper ramification d'Arabidopsis thaliana et chez des plantes sauvages avec application locale de strigolactones Une expérience similaire à celle pratiquée sur le pois sauvage et mutant dans l'exemple 1 a été réalisée sur Arabidopsis thaliana, afin de démontrer que les strigolactones sont aptes à agir sur différentes espèces de plantes. Les plantes utilisées ici sont issues de lignées WT Columbia, 35 sauvages, mutants maxi (mutant affecté dans une étape de la voie de biosynthèse du signal SMS en aval des deux � Carotenoid Cleavage Dioxygenase � et max2 (correspondant au mutant de réponse du pois rms4). Les plantes ont été semées en barquettes et entreposés à 4 °C pendant deux jours avant le transfert à 22 °C en chambre climatisée. Les plantes ont été arrosées (sub-irrigation) avec de l'eau tous les 2 jours avec un apport en éléments nutritifs tous les 10 jours. La longueur du jour est de 18 heures. À 23 jours, juste avant la floraison, un premier traitement GR24 a été réalisé. Le nombre de plantes traitées varie entre 25 et 41. Au total, les bourgeons des plantes ont été traités par 7 applications tous les 3 jours réparties sur une période de 20 jours : chaque traitement réalisé à l'aide d'une micropipette consiste en l'application de 50 �l d'une solution de GR24 à 0 nM ou 5000 nM dans du Tween20 à 0,1%. L'application se fait sur les bourgeons à l'aisselle des feuilles de la rosette ou à l'aisselle de bourgeons déjà démarrés. On compte le nombre de hampes florales sur les plantes lorsqu'elles ont 48 jours, juste avant la sénescence. Les résultats sont repris à la figure 9. Comme pour le pois, on constate que la strigolactone permet de réprimer les ramifications chez le sauvage d'Arabidopsis ainsi que chez le mutant maxi , mais pas chez le mutant max2. L'effet de la strigolactone sur les ramifications est donc conservé entre les différentes espèces. BIBLIOGRAPHIE Beveridge CA (2000) Long-distance signalling and a mutational analysis of branching in pea. Plant Growth Regulation 32 :193-203 - Beveridge CA (2006) : Axillary bud outgrowth: sending a message. Current Opinion in Plant Biology 9:35û40 Beveridge CA, Ross JJ, Murfet IC.(1996) Branching in pea. Action of genes Rms3 and Rms4. Plant Physiol 110 :859-865 - Beveridge CA, Symons GM, Murfet, IC, Ross JJ, Rameau C (1997) The rmsl mutant of pea has elevated of indole-3-acetic acid levels and reduced root-sap zeatin riboside content but increased branching controlled by graft transmissible signal(s). Plant Physiol 115: 1251-1258. - Booker J, Auldridge M, Wills S, McCarty D, Klee H, Leyser 0 (2004): MAX3/CCD7 is a carotenoid cleavage dioxygenase required for the synthesis of a novel plant signaling molecule. 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Science, 280:1091-1094 REVENDICATIONS1- Procédé de traitement d'une plante supérieure en vu de contrôler la croissance et l'architecture de la plante, caractérisé en ce qu'on place au contact de la plante une quantité adaptée de strigolactones de manière à inhiber la formation d'au moins une ramification. 2- Procédé de traitement selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on applique une solution comportant des strigolactones sur une portion au moins partielle de la partie aérienne de la plante. 3- Procédé de traitement selon la revendication 2, caractérisé en ce que les strigolactones sont appliquées sur des bourgeons axillaires de la plante, de manière à contrôler la croissance des bourgeons ainsi traités. 4- procédé de traitement selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une solution comportant des strigolactones est injectée dans une partie aérienne de la plante de manière à contrôler la croissance de la partie de la plante située au-dessus de la zone d'injection. 5- Procédé de traitement selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la concentration en strigolactones dans la composition 20 est au moins égale à 1 nM. 6- Utilisation de strigolactones pour l'identification de gènes intervenant dans le contrôle de la croissance des bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures. 7- Utilisation de strigolactones pour l'identification de molécules 25 intervenant dans le contrôle de la croissance des bourgeons et/ou ramifications chez les plantes supérieures.