Brevet FR2930949A1 — publié le 20091113

Moyens de détermination de la viabilité d'une bactérie dans un milieu L'invention a pour objet des moyens, méthode et kit, pour 5 déterminer la viabilité d'une bactérie dans un milieu quelconque, environnemental ou biologique. Pour de nombreuses applications, qu'elles soient alimentaires ou médicales, la détection de bactéries 10 potentiellement pathogènes ou seulement témoins d'une contamination est une nécessité. Les méthodes moléculaires constituent des moyens de détection de grande sensibilité. En revanche, par rapport aux 15 méthodes traditionnelles de culture, les méthodes de détection moléculaire ne permettent pas de déterminer si les bactéries détectées sont vivantes ou mcrtes. Or, c'est la mise en évidence de bactéries vivantes qui est généralement recherchée (ou à l'opposé de bactéries mortes quand on veut vérifier 20 l'efficacité d'une technique de décontamination ou l'efficacité d'un antibiotique). Différentes méthodes de détermination de la viabilité de bactéries ont été proposées comme la mise en évidence de 25 l'intégrité cellulaire ou la recherche d'activités métaboliques. Ces techniques manquent toutefois de sensibilité et sont en plus non spécifiques. A l'opposé, les techniques basées sur la détection 30 d'acides nucléiques sont hautement spécifiques et sensibles et autorisent en outre des déterminations quantitatives, notamment par l'utilisation de techniques en temps réel. Elles ne permettent pas cependant de différencier les cibles vivantes des cibles mortes et donc ne peuvent remplacer actuellement les techniques de culture pour détecter les bactéries viables. Plusieurs études ont suggéré que les ARN messagers (ARNm), par leur caractère bien plus labile que l'ADN, pourraient être de bons candidats pour la mise en évidence de la viabilité bactérienne. Les connaissances sur le sujet demeurent cependant vagues à cause de nombreux paramètres susceptibles de moduler la cinétique de la disparition des ARNm après la mort cellulaire. Ces paramètres sont notamment le type de traitement bactéricide (chaleur, chlore, éthanol, drogues..) et son intensité, les conditions de stockage après traitement et l'état physiologique des bactéries avant le traitement. De plus, différentes études ont montré que la disparition des cibles ARN était liée à la cible elle-même, certains ARN disparaissant très rapidement tandis que d'autres persistent plus longtemps. Les ARN ribosomaux ont été les plus étudiés et sont apparus comme les cibles les plus persistantes, laissant supposer que même les ARN ne seraient pas de bonnes cibles pour tester la viabilité bactérienne. Mais des résultats contradictoires ont aussi été publiés, notamment avec des traitements très puissants. Les études de viabilité portent essentiellement sur Escherichia coli. Il s'agit d'une bactérie responsable de diarrhées infectieuses, d'infections invasives communautaires et nosocomiales. Elle constitue aussi un marqueur d'une éventuelle contamination fécale de l'eau. En effet, au dessus d'un certain seuil, sa présence rend l'eau non potable. Une autre bactérie constitue un agent d'infection nosocomiale très fréquent et un contaminant de l'eau, à savoir Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie n'a toutefois pas fait l'objet à ce jour d'études de viabilité. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amené à tester plusieurs cibles ARN en PCR quantitative temps réel après transcription inverse sur diverses bactéries pathogènes, dans différentes conditions physiologiques : en fin de phase exponentielle de croissance, après mise au repos par conservation à 4°C dans l'obscurité pendant 3 semaines et après un traitement létal à la chaleur (65°C pendant 30 minutes). Après avoir testé de nombreuses cibles ARN sur ces bactéries, il s'est avéré que certaines avaient des comportements très différents qui ont permis d'identifier des ARN persistants et des ARN labiles. Les inventeurs ont exploité ces résultats en établissant un rapport entre le niveau de disparition d'une cible résistante et celui d'une cible labile, ces niveaux étant évalués par rapport à des contrôles positifs. Ils ont alors constaté qu'un tel rapport était indicatif de l'état mort ou vivant de la bactérie. L'invention a donc pour but, selon l'un de ses aspects, de fournir une méthode permettant de déterminer la viabilité de bactéries pathogènes dans des échantillons ou des prélèvements d'origine quelconque, basée sur le choix d'ARN cibles persistants et d'ARN cibles labiles dans une bactérie donnée. Selon un autre aspect, elle vise à fournir un kit pour la mise en oeuvre de cette méthode. Selon encore un autre aspect:, l'invention vise à mettre à profit les avantages de cette méthode et de ce kit notamment pour évaluer un état de contamination de l'eau, d'un aliment ou d'un produit biologique. La méthode selon l'invention de détermination de la viabilité de bactéries pathogènes dans un milieu à analyser, après un traitement létal de ces bactéries, est caractérisée par : - l'amplification par PCR d'au moins 2 ARN cibles, à savoir au moins un ARN cible persistant et au moins une ARN cible labile, - l'évaluation du changement de niveau de ces ARN par rapport au niveau des bactéries vivantes correspondantes constituant les contrôles positifs, - l'utilisation du rapport entre les niveaux de disparition d'ARN cible persistant et d'ARN cible labile, comme indicateur de viabilité. La mise en oeuvre de ces dispositions permet de coupler la détection des bactéries et l'évaluation de leur viabilité. La réaction de PCR est avar..tageusement une RQ-PCR, ce qui 20 permet une détection rapide et quantitative de petites quantités de bactéries. Elle comprend avantageusement l'amplification de fragments de 50 à 200 pb, préférentiellement de 90 à 180 pb, à l'aide 25 d'amorces spécifiques des cibles. Ces amorces sont constituées de 15 à 30 pb, préférentiellement de 18 à 22 pb. Selon la technologie d'amplification utilisée, des sondes spécifiques des cibles sont mises en oeuvre. Elles comportent plus particulièrement de 20 à 35 pb, préférentiellement de 25 à 30 30 pb, leur température d'hybridation étant supérieure de 10°C à celle des amorces. Ces scndes sont marquées à leurs extrémités, respectivement, par un fluorochrome et un quencher. 10 15 Le niveau de disparition d'un ARN cible ou F.C. (pour � fold change �) est évalué à l'a=_de de la formule : F.C. = 2-(Ct cible traitée- Ct cible contrôle+)' où Ct= cycles de seuil Par transcrit persistant, on entend conformément à l'invention, un transcrit avec un F.C. minimum de (-1,75 logm) 24 h après un traitement létal. Par transcrit labile, on entend un transcrit avec un F.C. maximum de (-2,65 loglo) 24 h après un traitement létal. Dans un mode de réalisation de l'invention, les bactéries sont du genre Pseudomonas. L'invention vise en particulier la détermination de la viabilité de l'espèce de P. aeruginosa dans le milieu à analyser. Pour cette détection, l'ARN cible persistant est choisi 20 dans le groupe comprenant : - groEL - rpmE - 23S 25 et l'ARN cible labile est choisi dans le groupe comprenant : - rplP - rplV - rplE 30 - rpsD Comme illustré dans les exemples, la bactérie P. aeruginosa détectée est morte si le rapport entre le F.C. de l'une au moins des cibles persistantes et celui de l'une au moins des cibles sensibles est égal ou supérieur à 10, de préférence est égal ou supérieur à 20. L'invention vise en particulier l'utilisation du rapport de 23S/rplP pour déterminer la viabilité de P. aeruginosa. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les bactéries sont du genre Escherichia. Il s'agit en particulier d'E. coli. La détection de cette bactérie comprend l'utilisation comme ARN cible persistant d'un ARNr choisi dans le groupe comprenant : - 23S - rplE - 16S et comme ARN cible labile : - groEL. La bactérie de E. coli détectée est morte si le rapport entre le F.C. de l'une au moins des cibles persistantes et celui de ladite cible labile est égal ou supérieur à 15, de préférence à 40. La bactérie de E. coli détectée est morte si le rapport entre le F.C. de l'une au moins des cibles persistantes et celui de ladite cible labile est égal ou supérieur à 16, de préférence à 40. Selon une disposition préférée de l'invention, le rapport des F.C. 23S/groEL est utilisé pour déterminer la viabilité de E. coll. L'invention vise également un kit pour la mise en oeuvre de la méthode de détermination de viabilité de bactéries définie ci-dessus. Un kit selon l'invention comprend : - des amorces spécifiques des transcrits persistants et des amorces spécifiques des transcrits labiles à cibler, et le cas échéant - des sondes spécifiques des fragments à amplifier dont la température d'hybridation est supérieure de 10°C à celle des amorces. De préférence, pour évaluer la viabilité P. aeruginosa, le kit comprend : - un couple d'amorces pour cibler groEL en utilisant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°1 : (sens/SYBR) : CGGCTTCAACGCTGCTAC et SEQ ID N°2 : (antisens/SYB) : TTCCACGATCTCGGCAAC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler groEL en appliquant la technologie TaqMan, répondant respectivement, aux séquences SEQ ID N°3 à 5 suivantes : SEQ ID N°3 : (sens/TaqMan) : CCAGGTAGGCACCATCTCC SEQ ID N°4 : (antisens/TagMan) : TCACGCCTTCTTTACCGACT SEQ ID N°5 : (Sonde/TaqMan) : CAGATCATTGCCGAAGCCATGGAAA et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplE, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°6 : (sens/SYBR) . GTAAGTCCATCGCAGGCTTCAAG et SEQ ID N°7 : (antisens/SYBR) : ACAGCAGACGATCCAGGAACTC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplP, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°8 et SEQ ID N°9 suivantes : SEQ ID N°8 : (sens/SYBR) : CGAAGTTCCGCAAACAAATGACC SEQ ID N°9 : (antisens/SYER) : CGATCTGACGAGCAGTAAGGC 5 10 15 20 25 30 et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rplP selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°10 à 12 suivantes : SEQ ID N°10 (sens/TaqMan) : CCGCCTTACTGCTCGTCA SEQ ID N°11 : (antisens/TaqMan) : CCCACCCTTACCTTTACCC SEQ ID N°12 : (sonde/TaqMan) : AAGATCTGGATCCGCGTATTCCCTGAC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplV, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14 suivantes : SEQ ID N°13 : (sens/SYBR) : CGCCGATGTGGATGACCTGAAG SEQ ID N°14 (antisens/SYBR) : CGCAACCTTGACCGTGATATGG et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rplV selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°15 à 17 suivantes : SEQ ID N°15 : (sens/TaqMan; : CCGATGTGGATGACCTGAA SEQ ID N°16 (antisens/TaqMan) : TGACCGTGATATGGCAAGAC SEQ ID N°17 : (sonde/TaqMan) : GTCAACGAAGGTCGTTCGCTCAAGC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rpmE, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 suivantes : SEQ ID N°18 : (sens/SYBR) : GACATCCATCCGACTTACGAAGC SEQ ID N°19 : (antisens/SYBR) : GGTGTAGAACGGGTGGCATTC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rpmE selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°20 à 22 suivantes : SEQ ID N°20 : (sens/TaqMan) : CGGACATCCATCCGACTTAC SEQ ID N°21 : (antisens/TaqMan) : TCTGCTTGCCGGTGTAGAA SEQ ID N°22 : (sonde/TaqMan) . GAAGCTATCGAAGCTACCTGCAGCTDC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rpsD, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24 suivantes : SEQ ID N°23 : (sens/SYBR) : GACCGTCAACATCCCTTCCTACC SEQ ID N°24 : (antisens/SYBR) : GAGTTCCAGAGCCTGAGCGATAC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rpsD selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°25 à 27 suivantes : SEQ ID N°25 : (sens/TaqMan) : CCGTCAACATCCCTTCCTAC SEQ ID N°26 : (antisens/TagMan) : TTCCAGAGCCTGAGCGATAC SEQ ID N°27 : (sonde/TaqMan) : CAAGTGAAGGCCGGTGACGTCGTAG et/ou - un couple d'amorces pour cibler 23S rRNA, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°28 et SEQ ID N°29 suivantes : SEQ ID N°28 : (sens/SYBR) : AGCGACTTATATTCAGTGGCAAGC SEQ ID N°29 : (antisens/SYBR) : TCCTCCAGTCAGTGTTACCTAACC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler 23S rRNA selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°30 à 32 suivantes : SEQ ID N°30 : (sens/TaqMan) : GGGCTCAAACCACACACC SEQ ID N°31 : (antisens/TagMan) : GCTTCTCAACTCACCTTCACAG SEQ ID N°32 : (sonde/TaqMan) . GTAAGTGACGCGGTAGAGGAGCGTTCTGTA. Un kit préféré pour évaluer la viabilité de E. coli dans un milieu comprenant . - un couple d'amorces pour cibler groEL, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°33 et SEQ ID N°34 SEQ ID N°33 : (sens/SYBR) : ACCGTGGCTACCTGTCTCCT et SEQ ID N°34 : (antisens/SYBR) : CGCTTCGCCTTCTACATCTT et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplE, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°35 et SEQ ID N°36 SEQ ID N°35 : (sens/SYBR) : GAACGCATGTGGGAGTTCTT et SEQ ID N°36 : (antisens/SYBR) : CGACCGTCGAAAGACTTAGC et/ou - un couple d'amorces pour cibler l'ARN 16S, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°37 et SEQ ID N°38 SEQ ID N°37 : (sens/SYBR) : TGTAGCGGTGAAATGCGTAG et SEQ ID N°38 : (antisens/SYBR) : AGGGCACAACCTCCAAGTC. Les moyens, méthode et kit, de l'invention sont avantageusement mis en oeuvre pour détecter et déterminer la viabilité de microorganismes pathogènes dans tout prélèvement ou échantillon d'un milieu susceptible d'être contaminé, ayant subi un traitement de décontamination dont l'efficacité doit être vérifiée. Leur utilisation est ainsi particulièrement avantageuse dans un milieu environnemental (eau, air, aliment, terre, de poussière ou autres) ou biologique (c.-à-d. provenant d'un organisme vivant). D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement : la figure 1 : le schéma du protocole mis en oeuvre selon l'invention pour vérifier la viabilité de bactéries dans un échantillon ou prélèvement à analyser la figure 2A : l'ensemble des F.C. calculés pour 48 transcrits immédiatement et 24 heures après inactivation par traitement de 30 minutes à 65°C de P. aeruginosa non affamée ; dans la figure 2B, les traits verticaux en pointillés représentent les limites, permettant de faire la distinction entre transcrits labiles, transcrits intermédiaires et transcrits persistants les lignes horizontales séparent ces 3 groupes ; les figures 3A et 3B : une représentation visuelle de l'ensemble des résultats obtenus pour les transcrits d'intérêt. Matériels et méthodes. Le schéma du protocole mis en oeuvre est illustré par la figure 1. Après stérilisation par filtration sur membrane à pores de 0,22 pm, l'eau d'Evian� est dopée avec environ 106 Unités Formant des Colonies (UFC) / ml de bactéries P. aeruginosa ou E. coli en fin de phase exponentielle de croissance. Une partie de l'eau dopée est affamée pendant 3 semaines, tandis que l'autre partie est utilisée immédiatement. Des aliquotes de 1,2 ml sont préparées pour favoriser l'échange de température entre le bain sec et les échantillons. Des triplicatas sont réalisés pour la condition � traitée � et le contrôle positif. Les aliquotes � traitées � sont chauffées à 65°C pendant 30 minutes alors que les contrôles positifs sont gardés à la température ambiante. Chaque aliquote est ensuite refroidie rapidement sur la glace, puis gardé à température ambiante jusqu'à l'analyse. Immédiatement. et 24 heures après, 100 pl d'aliquote sont ensemencés sur gélose au sang et 100 pl sont ensemencés sur gélose R2A. 1 ml restant est utilisé pour l'extraction d'ARN total. Chaque transcrit est analysé par transcription inverse et réaction de polymérisation en chaîne (RQ-PCR) en temps réel, puis les résultats sont interprétés en utilisant la formule suivante où � F.C. � représente le changement de niveau c'est- à-dire, le niveau de disparition de la cible ARN : F.C. 2-(Ct cible traitée- Ct cible contrôle+) où Ct = cycles de seuil 12 Souches bactériennes et conditions de culture On rapporte ci-après les résultats obtenus avec les souches bactériennes P. aeruginosa CIP 100720 et E. coli CIP 106878 (Institut Pasteur). Préparation des bactéries Une colonie est mélangée dans 10 ml de milieu Luriabertani liquide et incubée durant la nuit en agitateur à 30°C pour P. aeruginosa et à 37°C pour E. coll. 10 Pour la quantification des bactéries dans les eaux dopées et la vérification de l'efficacité du traitement létal, 100 pl de chaque échantillon (après dilutions sérielles pour les contrôles positifs) sont ensemencés sur gélose au sang, puis 15 incubés 24 à 48 heures avant dénombrement des colonies. En parallèle, 100 pl sont étalés sur gélose R2A, puis incubés 7 jours à 22°C avant dénombrement des colonies. Inactivation à la chaleur 20 Les échantillons d'eaux dopées sont aliquotés par 1,2 ml dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et incubés dans un bain sec à 65°C pendant 30 minutes avant d'être transférés sur de la glace pendant 2 minutes pour un refroidissement rapide. Ils sont ensuite conservés à température ambiante jusqu'à 25 étalement sur gélose et extraction de l'ARN. Jeûne des bactéries Pour la condition � affamée �, les échantillons d'eaux dopées sont laissés à 4°C, dans le noir et en l'absence de 30 tout nutriment durant 3 semaines.5 Extraction et purification de l'ARN - Elimination de l'ADN contaminant Les bactéries sont lysées dans 100 pl de tampon Tris EDTA pH 8, contenant 600 ag/ml de Lysozyme, pendant 5 à 10 minutes. L'extraction et la purification des ARNs totaux sont ensuite réalisées sur colonne de silice avec les MiniKit RNeasy Qiagen� en suivant le protocole du fabricant, incluant un premier traitement à la DNAse I de Qiagen pendant 15 minutes. L'ARN ainsi purifié est élué dans un volume final de 40 pl d'eau dépourvue de RNase, fournie dans le kit. Afin d'éliminer toute contamination par de l'ADN génomique, les échantillons d'ARNs totaux ainsi obtenus sont soumis à une deuxième digestion par la DNase RQ1 de Promega. 8 pl d'échantillon sont mélangés avec 1 U de DNase et 1 pl de tampon 10X (fourni en kit avec la DNase), puis incubés à 37°C pendant 30 minutes. La réaction est enfin inactivée par l'ajout de 1 pl de solution d'arrêt (" Solution Stop ") fournie avec la DNase et une incubation de 10 minutes à 65°C. Synthèse des ADNc Les ADNc sont synthétisés à partir de l'ARN total par transcription inverse. La réaction est réalisée avec la Reverse Transcriptase M-MLV (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), et des amorces aléatoires, en suivant les instructions du fabricant. 5 p1 de l'échantillon d'ARN sont soumis à une transcription inverse dans un volume final de 20 pl contenant 10 mM de dNTPs, 100 pg/ml d'amorces aléatoires, 2 pl de DTT, 4 pl de 5X buffer et 1 pl de RNase Out (Invitrogen). Le mélange réactionnel est incubé à 37°C pendant 50 minutes, puis la réaction est terminée par une incubation de 15 minutes à 70°C. PCR temps réel Des amorces et des sondes spécifiques ont été conçues à l'aide du programme Primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/) à partir des séquences de chaque cible, puis comparées à la base de données EMBL/GenBank. afin de vérifier leur spécificité. Les noms, les fonctions des gènes ciblés, ainsi que les catégories fonctionnelles auxquelles ils appartiennent sont décrits dans le tableau 1 ci--après. Tableau 1 Gène fonction COG Catégorie 23S rRNA ARN Ribosomique / rplV Protéine ribosomique 1.22 J Traduction, structure et biogenèse des ribosomes rpml', Protéine ribosomique L31 J Traduction, structure et biogenèse des ribosomes rpsD Protéine ribosomique S4 J Traduction, structure et biogenèse des ribosomes groIl. Chaperonne GroF?7. (famille I-ISP60) O Modifications post-transcriptionnelles, renouvellement protéique, chaperonnes Des amorces de 18 à 22 paires de bases ont été sélectionnées pour amplifier des fragments de 90 à 180 paires de bases et synthétisées. Pour les 8 gènes retenus dans le cadre de ces expériences, des sondes TaqMan spécifiques de 25 à 30 paires de bases ont été choisies avec une température d'hybridation supérieure de 10"C à celle des amorces. Ces sondes ont été synthétisées et marquées par le fluorochrome FAM et le quencher TARMA par Operon. Les séquences de ces amorces et sondes sont données dans le tableau 2 ci-après. P. acre'nosa rplN' sens / TaqMan C:CGiVI�iil�iGAI�iACCI�iiA A antisens / TaqMan TGACCGI�;iVI'A"I�IGCAAG AC Sonde / Tay Man GTCAACG AAGGTCG'I"I'CG C'ICAAGC P. ,ien�inosa ipml? sens / SYBR G \CXI�:(i:\'I�:CGACITACGAAGC antisens / SYBR GG'l'GTAGAACGGG'l�RiCATIC pmC sens / TaqNlan C( G ACA'I'CC ATCCG AC1T A C antisens / TaqNlan TC"1�iCTI�iCCGGI�i1'NGA. \ Sonde / TaqMan G \ \ GC'I' \'I'CG \ AGCTACC 'GCAGC'I'GC P. aer/einoxa rpsl) sens / SYBR G .1 CC(il�_iA C LACC antisens / SYBR G.\ GT"1�_iCAGAGCCTGAGCGATAC P. aen�inata rpsl) sens / TaqNlan CCGI'CAACA'I�iiCC'f'l�:CTAC P. aerlreou grold. sens / TaqMan (iCAGGTAGGCi \ antisens / TaqMan TC. \ CG(ji'l'l�;'l'ITACCGA( Sonde / TaqMan CAGA"I'CA'ITGCCG.\AGCCATGGAAA P. iierugilosa rpll sens / TaqMan antisens / TaqMan CCCACCCITACCTITAOEiC Sonde / Tay Man A AG A'I'CI�i G XI� :CG CGTA l''I'CCCI�.; AC 17 Tableau 2 Bactérie cible Amorce ou sonde Séquence (5' - 3') P. aeri�iliosa groH, sens / SYBR CGGCITCAACGCFGCTAC antisens / SYBR 'l''ICCACGA'I'Cil�.XiGCA AC P. aeniiiinosii qol\' sens / SYBR (iGC(iGAI'Gil�iGXl�;.\CCI�iAAG antisens / SYBR CGC:\ ACCTI�iACCUI'GATAI�iG P. aerziiliooi rpII' sens / SYBR GTAAGICCAICGCAGGCTICAAG antisens / SYBR ACAGCAGACGAICCAGGAACI�: P. nerie,inosa rp!P sens / SYBR CG AAG'l"1�.:CGCAAACAAAl'GACC antisens / SYBR C(iXI�I'GACGAGCAG'l'AAGGC Longueur température Concentration' amplicon hybridation 151 62°C 0.5 IoNl 0.5 �NI 89 60°C 0.5 iiNl 0.5�\I 0.2 �NI 102 62°C 0.3 IaNl 0.3 123 62°C 0.5 ttNl 148 60°C 0.5 !ANI 0.5 �i11 136 62°C 0.5 !ANI 0.2 FINI 0.5 !ANI 126 60°C 0.5 oNl 0.5 p.Nl 0.5�M 126 62°C 0.2 !ANI 0.5 tiNl 138 60°C 0.5 'ANI 0.5 i\l 100 62°C 0.5 !ANI 0.2 ttNl 0.5 IaNl 0.5 �NI 95 60°C 0.5 !ANI antisens / TagNlan 'RfCCAGAGCCI`GAGGGA1'.AC P. aeortino.ra Sonde / l'agNlan C-A.AGI'GAAGGCCGG'CGA(G'l'CGI'AG 149 62°C 23S rRNA sens / SYBR AGCGACI"I'ATNflCAG'I'GGCAAGC P. aeru,ginosa antisens / SYBR "I'CCTCCAGTCAG'1'G1ÏACCTAACC 90 60°C 23S rRNA sens /'I'agMan GGGC1'CAAACCACACACC antisens / TagMan GC'1"l'C'l'CA.AC'I'C;ACC, I"I'CAI,AG Sonde /'1'ae1Nlan GI'A.A0'l'GACGCGG'l'AGAGGAGCGITC'l'GT.A 1? �NI E. sis gro1:L sens / SYBR ACCGTOGCl'ACCt'G'l'C1'CC'.'1' 188 60°C 0.3 �NI antisens / SYBR CGCVl C( CCI'CI'ACXl'C1 F 0.3 �NI 1:. roui rpll sens / SYBR G \A CGCA'1'G'1'000AGT`I'Cl"I' 95 62°C 0.3 �NI antisens / SYBR CGACCG'l'CCÀ \ \GAC'I"l'AGC 0.3 �NI Fi. col' 16S rRNA sens / SYBR TGI'AGCGGTGAAATGCG'I AG 159 64°C 0.3 �Al antisens / SYBR AGGGCACAACCTCCAAG'l'C 0.3 �N1 �Concentration finale utilisée dans le mélange réactionnel de KIR Les conditions de PCR ont été optimisées pour chaque couple d'amorces et sondes en modifiant leur concentration finale et la température d'hybridation, afin d'éviter la formation de dimères et les amplifications non spécifiques. Les concentrations finales, ainsi que les températures d'hybridation utilisées pour les programmes d'amplification, sont également données dans le tableau 2 ci-dessus. Les PCRs en temps réel sont réalisées dans un LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics, Meylan, France) pour les analyses concernant P. aeruginosa et dans un Smart Cycler II (Cepheid, Maurens-Scopont, France) pour les analyses concernant E. coli. Ce dernier appareil permet de travailler avec des protocoles différents pour chaque tube au :ours d'une même session, ce qui entraîne un gain de temps lors de l'optimisation des 0.5 �NI 0.5 ,.AI protocoles. Chaque PCR est réalisée dans un volume final de 20 pl. Les contrôles contenant de l'eau à la place de l'échantillon d'ADN, les blancs d'extractions, ou l'ARN n'ayant pas subi d.e transcription inverse, ont été réalisés systématiquement. Les analyses par la technologie SYBR green sont réalisées avec le kit Light Cycler FastStart DNA Master Mix SYBR green I (Roche Diagnostics, Meylan, France). L'amplification est réalisée avec le programme suivant [95°C - 10 min] (activation de la Taq polymérase), puis 40 x [95°C - 10 sec ; X°C - 4 sec (voir tableau 2) ; 72°C - 5 sec] (amplification), puis [95°C - 0 sec ; 65°C - 10 sec ; augmentation à 95°C en 0,1°C/sec] pour l'analyse des courbes de fusion. Les analyses par la technologie TaqMan sont réalisées avec le kit FastStart DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics) et avec le programme suivant : [95°C - 10 min] (activation de la Taq polymérase), puis 40 x [95°C - 10 sec ; 60°C - 10 sec ; 72°C - 10 sec] (amplification). Pour les analyses concernant E. coli, la Taq polymérase est systématiquement prédigérée par la DNase RQ1 (Promega) en raison de problèmes de contamination de l'enzyme par de l'ADN d'E. coli. Analyse des résultats Tous les résultats de PCR en temps réel sont analysés par calcul du changement de niveau, ou F.C. pour � fold change � pour chaque transcrit entre les cellules tuées et les contrôles positifs correspondants. Dans les études transcriptomiques classiques, le F.C. est habituellement calculé en utilisant la formule mathématique suivante . F. C E-[(Ct cible-Ct réf) traité - (Ct cible - Ct réf) contrôle +] avec : • E = Efficacité de la PCR • "réf" est habituellement un gène de ménage, censé représenter la quantité de cellules vivantes dans l'échantillon pour normaliser le résultat. 10 Or, il s'agit selon l'invention de connaître le niveau de disparition de l'ARN dans les bactéries mortes par rapport aux bactéries vivantes. Dans les bactéries mortes l'ARN correspondant aux gènes de ménage est lui aussi censé subir 15 une dégradation et ne peut donc pas servir de réfèrent pour normaliser les résultats. Il sera alors admis que, dans un même échantillon, le nombre total de bactéries avant et après le traitement mortel 20 reste toujours inchangé et peut constituer la "référence". Ainsi, la formule précédente devient : F. c . = E (Ct cible traitée- Ct cible contrôle +). 25 L'efficacité de la réaction a été vérifiée pour chaque couple d'amorces et sonde avant leur utilisation. De manière générale, on considère que E = 2. Ainsi, pour évaluer le caractère labile ou persistant de chaque transcrit, les résultats ont été interprétés en utilisant la formule finale : 30 F c = 2 -(Ct cible `raitée- Ct contrôle cible)5 . Résultats Inactivation de P. aeruginosa et E. coli par traitement à 65°C pendant 30 minutes Dans les eaux dopées par P. aeruginosa et E. coli, environ 106 à 10' Unités Formant des Colonies (UFC) / ml ont été quantifiées par dénombrement des colonies sur gélose. Pour chaque échantillon traité à 65°C, aucune colonie n'a été observée sur gélose au sang 48 heures après ensemencement, ni sur gélose R2A 7 jours après ensemencement. Les bactéries traitées à 65°C peuvent donc être considérées comme inactivées. Comportement hétérogène des différents transcrits après mort bactérienne par traitement thermique Pour P. aeruginosa, 48 transcrits correspondant aux gènes core, ainsi que les messagers des gènes spoT, sodB et groEL (impliqués dans la réponse au stress) et les ARNs ribosomaux 16S et 23S ont été analysés par RT-PCR immédiatement et 24 heures après le traitement thermique. Les résultats donnés ont été obtenus à partir de 3 aliquotes pour chaque échantillon. Immédiatement après le traitement létal, on observe différents niveaux de disparition F.C., allant de 1,7.10-1 (soit une diminution de -0,78 loglo) à 3,0.1073 (soit une diminution de -2,52 loglo)• Les ARNs ribosomaux se classent parmi les transcrits les plus persistants. La tendance générale est confirmée et amplifiée 24 heures après le traitement, avec des F.C. allant de -1,28 logo à -3,19 log10. 21 Mais de manière surprenante, aucun transcrit n'a complètement disparu 24 heures après la mort des bactéries. Au final, parmi les 48 transcrits testés, 12 sont considérés comme des transcrits labiles avec un F.C. maximum de -2,65 loglo (choisi arbitrairement) et 11 transcrits sont considérés comme des cibles persistantes, avec un F.C. minimum de -1,75 loglc. L'ensemble de ces résultats est représenté dans la figure 2. En fonction de la reproductibilité des résultats et après observation des Ct obtenus pour les contrôles positifs, 9 cibles ont été sélectionnées au total pour l'étape suivante . rp1P, rp1V, rplE et rpsD comme transcrits labiles, et obg, groEL, rpmE, 23S rRNA et 16S rRNA comme transcrits persistants. Le tableau 3 ci-dessous représente les F.C. calculés pour les 9 transcrits d'intérêt, entre les bactéries tuées depuis 24 heures par traitement thermique et les contrôles positifs correspondants, pour P. aeruginosa et E. coli en conditions "non affamée" et "affamée". - NSPA = P. aeruginosa condition � non affamée � - SPA = P. aeruginosa condition � affamée � - NSEC = E. coli condition � non affamée � - SEC = E. coli condition � affamée � Pour confirmer ces résultats par des analyses plus spécifiques, des sondes TaqMan ainsi que de nouveaux couples d'amorces ont été élaborés pour les 9 transcrits sélectionnés. Les résultats de RT-PCR en temps réel obtenus alors corrèlent avec ceux obtenus précédemment avec la technologie SYBR green. Pour les transcrits labiles, 24 heures après le traitement létal, le F.C. moyen est de -2,84 loglo en analyse SYBR green et de -2,83 1og10 en analyse TaqMan, le transcrit le plus labile étant l'ARNm rplP. Pour les transcrits persistants, le F.C. moyen est de --,43 logo en SYBR green (le plus persistant étant l'ARNr 23S) et de -1,13 1og10 en TagMan, le plus persistant étant l'ARNm groEL. Les résultats détaillés obtenus avec la technologie TaqMan sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 Gène Changement de niveau P. aeruginosa E. coi Non Affamée Non Affamée af famée affamée rplP -3,23 -2,19 -2,88 -1,79 rplV -2,84 -1,88 -2,79 -1,16 rplE -2,80 -1,93 -2,07 -1,74 rpsD -2,62 -1,56 -2,73 -2,16 obg -2,28 -1,09 -2,58 -2,76 16S rRNA -1,42 -1,42 -1,66 -1,92 groEL -0,79 -1,04 -3,09 -3,12 rpmE -1,31 -0,70 -2,20 -2,52 23S rRNA -1,29 -0,77 -0,64 -1,57 Effet du jeûne sur le niveau de persistance des transcrits après le traitement létal chez P. aeruginosa 15 Comme avant le jeûne, 106 à 10' UFC / ml ont été quantifiées dans les échantillons d'eaux dopées avec P. aeruginosa et affamées durant 3 semaines. Après un traitement de 30 minutes à 65°C de ces échantillons � affamés �, aucune colonie n'a pu être observée sur gélose au sang, ni sur gélose 20 R2A, ce qui montre que les bactéries ont été efficacement inactivées par le traitement. Ce résultat suggère également que le jeûne n'augmente pas la résistance des bactéries au traitement thermique. 25 Les résultats obtenus par RT-PCR en temps réel en utilisant la technologie TaqMan montrent que rpsD et l6S rRNA10 se détachent de leurs groupes respectifs (labiles et persistants) et montrent des niveaux de disparition intermédiaires. Les ARNm rplP, rplV et rplE restent dans le groupe des transcrits labiles avec un F.C. moyen de 2,21 loglo, tandis que le groupe des transcrits persistants conserve les ARNm obg, groEL, rpmE et l'ARNr 23S, avec un F.C. moyen de 1,13 loglo, comme pour l'échantillon non affamé. Normalisation des résultats obtenus pour les transcrits labiles Les transcrits persistants se comportant de manière constante en condit=ion non affamée et en condition affamée, certains d'entre eux ont été utilisés comme molécules de référence afin de normaliser les résultats obtenus pour les transcrits labiles, tout comme les gènes de ménage sont utilisés dans les études transcriptomiques classiques. Pour la condition physiologique � affamée � (plus proche de la condition environnementale réelle) et après le traitement létal, des rapports ont été calculés entre les F.C. des transcrits persistants et les F.C. des transcrits labiles. Le meilleur rapport est obtenu pour 23S rRNA/rplP avec une valeur de 20. Les résultats détaillés sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous Tableau 4 Gène P. aeruginosa - affamée E. cols' - affamée 23S / cible groEL / cible rpmE / cible 23S / cible rplE / cible 16S / cible rplP 20 15 18 rplV 14 10 12 rplE 14 11 12 rpsD 5 4 4 groEL 42 24 16 Une représentation visuelle est donnée dans la figure 3A qui représente les résultats obtenus pour P. aeruginosa en condition non affamée (NSPA) et affamée (SPA), ainsi que les résultats normalisés, par calcul des rapports entre les F.C. des transcrits labiles et les F.C. des transcrits persistants, pour les deux conditions physiologiques. Comparaison entre P. aeruginosa et E. cols' Les mêmes experiences que précédemment ont été reproduites, dans les mêmes conditions, avec E. cols'. 15 Les 9 transcrits sélectionnés pour P. aeruginosa ont également été analysés par RT-PCR avec des amorces spécifiques à E. cols' et les résultats ont été exploités, comme décrit plus haut, en calculant les F.C. pour chaque transcrit entre 20 les bactéries tuées depuis 24 heures et les contrôles positifs correspondants. Pour la population d'E. cols' non affamée, rplP, rplV et rpsD restent parmi les transcrits les plus labiles, comme cela a été décrit plus haut pour P. aeruginosa. Dans le groupe des transcrits persistants décrit pour P. 25 aeruginosa, les ARNr 16S et 23S restent parmi les plus persistants chez E. co1i. groEL apparaît comme la cible la plus labile après la mort d'E. coli par traitement thermique. Les résultats obtenus avec la population affamée d'E. coli présentent de fortes divergences avec ceux obtenus avec la population non affamée. rplV devient le transcrit le plus persistant et rpmE et obg deviennent parmi les transcrits labiles. L'ensemble de ces résultats est représenté dans le tableau 3 ci-dessus et la figure 3B qui représente les résultats obtenus pour P. aeruginosa (PA) et E. coli (EC) dans les conditions non affamée (NS) et: affamée (S). Les ARNr 23S et 16S sont les transcrits restant les plus persistants dans les deux conditions physiologiques "affamée" et "non affamée" et, parmi les ARNm, rplE est le seul montrant un caractère plutôt persistant dans les deux cas. Ainsi, les rapports destinés à établir un test de viabilité pour E. coli sont calculés entre 23S, rplE ou 16S et groEL. Le meilleur rapport étant: obtenu pour 23S/groEL. Ces calculs sont présentés dans le tableau 4 ci-dessus. REVENDICATIONS1. Méthode de détermination de la viabilité de bactéries 5 pathogènes dans un milieu à ana-_yser, après traitement létal de ces bactéries, caractérisée par : - l'amplification par PCR d'au moins 2 ARN cibles, à savoir au moins un ARN cible persistant et au moins une ARN cible labile, - l'évaluation du changement de niveau de ces ARN par rapport au niveau des bactéries vivantes correspondantes constituant les contrôles positifs, - l'utilisation du rapport entre les niveaux de disparition d'ARN cible persistant et d'ARN cible labile, comme indicateur de viabilité. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le niveau de disparition d'un ARN cible, ou F.C., est 20 évalué, par rapport à un contrôle positif, à l'aide de la formule . F. C . = 2-(Ct cible traitée- Ct cible cor.trôle+) , où Ct= cycles de seuil. 25 3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les bactéries sont du genre Pseudomonas ou du genre Escherichia. 4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce 30 que pour la détermination de la viabilité de l'espèce P. aeruginosa, l'ARN cible persistant est choisi dans le groupe comprenant : - groEL 10 15- rpmE - 23S et l'ARN cible labile est choisi dans le groupe 5 comprenant . - rplP - rplV - rplE - rpsD 10 5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que la bactérie est morte si le rapport entre le F.C. de l'une au moins des cibles persistantes et de l'une au moins des cibles sensibles est égal ou supérieur à 10, de préférence est 15 égal ou supérieur à 20. 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce qu'on utilise le rapport des niveaux de disparition de 23S/rplP comme indicateur de viabilité. 7. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que pour la détermination de la viabilité de l'espèce E. coli, l'ARN cible persistant est choisi dans le groupe comprenant : - 23S - rplE - 16S et l'ARN cible labile est l'ARNm de groEL. 30 8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que la bactérie est morte si le rapport entre l'une au moins des cibles persistantes et la cible labile est égal ou supérieur à 15, de préférence à 40. 28 20 25 9. Méthode selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'on utilise le rapport des niveaux de disparition de 23S/groEL comme indicateur de viabilité. 10. Kit pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend : des amorces spécifiques des transcrits persistants et 10 des amorces spécifiques des transcrits labiles à cibler, et le cas échéant - des sondes spécifiques des fragments amplifiés dont la température d'hybridation est supérieure de 10°C à celle des amorces. 11. Kit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer la viabilité de P. aeruginosa : - un couple d'amorces pour cibler groEL en utilisant la technologie SYBR, de séquences respectivement, 20 SEQ ID N°1 : (sens/SYBR) : CGGCTTCAACGCTGCTAC et SEQ ID N°2 : (antisens/SYBR) : TTCCACGATCTCGGCAAC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler groEL en appliquant la technologie TaqMan, répondant 25 respectivement, aux séquences SEQ ID N°3 à 5 suivantes : SEQ ID N°3 : (sens/TaqMan) : CCAGGTAGGCACCATCTCC SEQ ID N°4 : (antisens/TagMan) : TCACGCCTTCTTTACCGACT SEQ ID N°5 : (sonde/TaqMan) : CAGATCATTGCCGAAGCCATGGAAA et/ou 30 - un couple d'amorces pour cibler rplE, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°6 : (sens/SYBR) : GTAAGTCCATCGCAGGCTTCAAG et SEQ ID N°7 : (antisens/SYBR) : ACAGCAGACGATCCAGGAACTC 15 5 15 20 25 30et/ou un couple d'amorces pour cibler rplP, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°8 et SEQ ID N°9 suivantes : SEQ ID N°8 : (sens/SYBR) : CGAAGTTCCGCAAACAAATGACC SEQ ID N°9 : (antisens/SYBR) : CGATCTGACGAGCAGTAAGGC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rplP selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°10 à 12 suivantes SEQ ID N°10 : (sens/TaqMan) : CCGCCTTACTGCTCGTCA SEQ ID N°11 : (antisens/TaqMan) : CCCACCCTTACCTTTACCC SEQ ID N°12 : (sonde/TaqMan AAGATCTGGATCCGCGTATTCCCTGAC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplV, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°13 et SEQ ID N°14 suivantes : SEQ ID N°13 : (sens/SYBR) : CGCCGATGTGGATGACCTGAAG SEQ ID N°14 : (antisens/SYBR) : CGCAACCTTGACCGTGATATGG et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rplV selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°15 à 17 suivantes : SEQ ID N°15 : (sens/TaqMan) : CCGATGTGGATGACCTGAA SEQ ID N°16 : (antisens/TaqMan) : TGACCGTGATATGGCAAGAC SEQ ID N°17 : (sonde/TaqMan) : GTCAACGAAGGTCGTTCGCTCAAGC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rpmE, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19 suivantes : SEQ ID N°18 : (sens/SYBR) : GACATCCATCCGACTTACGAAGC SEQ ID N°19 : (antisens/SYBR) : GGTGTAGAACGGGTGGCATTC 10 15 20 25 30et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rpmE selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°20 à 22 suivantes : SEQ ID N°20 : (sens/TaqMan) : CGGACATCCATCCGACTTAC SEQ ID N°21 : (antisens/TacNan) : TCTGCTTGCCGGTGTAGAA SEQ ID N°22 : (Sonde/TagMar..) : GAAGCTATCGAAGCTACCTGCAGCTGC et/ou - un couple d'amorces pour cibler rpsD, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24 suivantes : SEQ ID N°23 : (sens/SYBR) : GACCGTCAACATCCCTTCCTACC SEQ ID N°24 : (antisens/SYBR) : GAGTTCCAGAGCCTGAGCGATAC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler rpsD selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°25 à 27 suivantes : SEQ ID N°25 : (sens/TaqMan : CCGTCAACATCCCTTCCTAC SEQ ID N°26 : (antisens/TaqMan) : TTCCAGAGCCTGAGCGATAC SEQ ID N°27 : (sonde/TaqMan) : CAAGTGAAGGCCGGTGACGTCGTAG et/ou - un couple d'amorces pour cibler 23S rRNA, en appliquant la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°28 et SEQ ID N°29 suivantes : SEQ ID N°28 : (sens/SYBR) : AGCGACTTATATTCAGTGGCAAGC SEQ ID N°29 : (antisens/SY3R) : TCCTCCAGTCAGTGTTACCTAACC et/ou - un couple d'amorces et une sonde pour cibler 23S rRNA selon la technologie TaqMan, de séquences, respectivement, SEQ ID N°30 à 32 suivantes : SEQ ID N°30 : (sens/TaqMan) : GGGCTCAAACCACACACC 31SEQ ID N°31 : (antisens/TacMan) : GCTTCTCAACTCACCTTCACAG SEQ ID N°32 : (sonde/TagMan) . GTAAGTGACGCGGTAGAGGAGCGTTCTGTA. 12. Kit selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend, pour évaluer la viabilité de E. coli : - un couple d'amorces pour cibler groEL, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°33 et SEQ ID N°34 SEQ ID N°33 (sens/SYBR) : ACCGTGGCTACCTGTCTCCT et SEQ ID N°34 : (antisens/SYBR) : CGCTTCGCCTTCTACATCTT et/ou - un couple d'amorces pour cibler rplE, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°35 et SEQ ID N°36 SEQ ID N°35 : (sens/SYBR) : GAACGCATGTGGGAGTTCTT et SEQ ID N°36 : (antisens/SYBR) : CGACCGTCGAAAGACTTAGC et/ou - un couple d'amorces pour cibler l'ARN 16S, selon la technologie SYBR, de séquences, respectivement, SEQ ID N°37 et SEQ ID N°38 SEQ ID N°37 (sens/SYBR) : TGTAGCGGTGAAATGCGTAG et SEQ ID N°38 (antisens/SYBR) : AGGGCACAACCTCCAAGTC 13. Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, et du kit selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, pour déterminer la viabilité des bactéries dans un milieu environnemental ou biologique. 14. Application selon la revendication 13, caractérisée en ce que le milieu est l'eau.