Brevet FR2925067A1 — publié le 20090619

VECTEURS VACCINAUX DERIVES DE LEPORIPDXVIRUS La présente invention est relative à de nouveaux vecteurs vaccinaux dérivés des Leporipoxvirus et notamment du virus de la myxomatose. Le genre des Leporipoxvirus appartient à la famille de Poxviridae. Ce genre, dont l'espèce type est le virus de la myxomatose (VM), regroupe des poxvirus spécifiques des Léporidés. Le virus de la myxomatose, également dénommé Myxoma virus, est l'agent responsable de la myxomatose, une maladie infectieuse majeure chez le lapin européen, et endémique en Europe. Les Poxviridae ont un cycle réplicatif intracytoplasmique au cours duquel différentes formes virales sont successivement observées : les IMV (virions intracellulaires matures), les IEV (virions intracellulaires enveloppés) et les EEV (virions extracellulaires enveloppés). Les IMV sont formés dans le cytoplasme des cellules infectées, et possèdent une seule membrane. Ils représentent la très grande majorité de la progénie virale et sont libérés lors de la lyse de la cellule hôte. Une petite partie des IMV acquiert une double enveloppe supplémentaire dérivée de l'appareil de Golgi ou des endosomes, constituant les formes virales IEV. Les IEV migrent à la surface cellulaire et fusionnent avec la membrane cellulaire. Ils perdent ainsi leur enveloppe la plus externe et libèrent des EEV dans le milieu extracellulaire. Les poxvirus recombinés ont montré leur efficacité en tant que vecteurs de vaccination par leur capacité à produire une réponse immunitaire contre des antigènes étrangers. Leur cycle réplicatif exclusivement cytoplasmique permet d'éviter les complications éventuelles résultant de l'intégration d'ADN viral dans le génome de la cellule infectée. Ils sont capables d'intégrer de grands fragments d'ADN étranger (plus de 25 kpb) par recombinaison homologue. Ils sont en plus capables d'exprimer correctement les protéines d'intérêt et d'induire une bonne réponse immunitaire. Les Leporipoxvirus présentent en outre l'avantage de posséder un spectre d'hôtes très étroit in vivo ce qui leur confère une sécurité d'emploi non négligeable. D'autre part, bien que non-réplicatifs in vitro dans certains types cellulaires (bovins, ovins, félins), ils permettent néanmoins l'expression de transgènes. Ils présentent donc un grand intérêt pour l'obtention de vecteurs vaccinaux, non seulement chez les Léporidés, mais également chez d'autres espèces animales. Classiquement chez les poxvirus, les transgènes sont insérés dans des zones intergéniques, ou dans des zones contenant des gènes non essentiels à la réplication virale. La majorité des sites d'insertion qui ont été mis en évidence se situent à proximité des terminaisons génomiques, où sont localisés des gènes non essentiels au cycle viral (MACKETT et al., J Virol, 49, 857-864, 1984; PERKUS et al., Virology, 180, 406-410, 1991). Dans le cas des Leporipoxvirus, des vecteurs vaccinaux exprimant des antigènes étrangers ont également été obtenus. BERTAGNOLI et al. (J Virol, 70, 5061-5066, 1996), et la Demande FR 2736358 décrivent l'obtention de vecteurs vaccinaux dérivés de Myxoma virus recombinants, qui permettent de protéger des lapins à la fois contre la myxomatose et la Maladie hémorragique virale du lapin. Pour construire ces vecteurs, un gène codant pour la protéine de capside VP60 du virus de la Maladie hémorragique virale a été inséré dans le génome du Myxoma virus au niveau de gènes non-essentiels, en l'occurrence soit le gène codant pour la thymidine kinase (TK), soit les gènes codant pour les facteurs de virulence MGF (myxoma growth factor) et M11L. Plus récemment, l'utilisation de virus myxomateux atténués recombinés capables de produire la protéine de capside du virus de la calicivirose féline a montré une bonne efficacité vaccinale chez le chat (MCCABE et al., Vaccine, 20, 2454-2462, 2002; MCCABE and SPIBEY, Vaccine, 23, 5380-5388, 2005). Dans ces vecteurs, le transgène codant pour la protéine de capside a été inséré au niveau des gènes codant pour les facteurs de virulence MGF et M11L. De même, la Demande PCT WO 02072852 décrit l'utilisation de Leporipoxvirus recombinants pour l'obtention de vecteurs vaccinaux utilisables chez des animaux autres que les Léporidés, notamment chez des oiseaux, des félins, des canins, des porcins, des ovins, des bovins, des équins, ainsi que chez l'homme. Il est indiqué que dans ces vecteurs, le transgène exprimant l'antigène vaccinal d'intérêt peut être inséré au niveau du gène codant pour la thymidine kinase, ou au niveau de l'un des gènes codant pour les facteurs de virulence M11L, SERP-1, -2 et -3 ou MGF. La majorité des vaccins fondés sur des vecteurs poxviraux produit des antigènes cytoplasmiques, qui sont sécrétés ou exprimés à la surface des cellules infectées. Récemment, il a été proposé d'exprimer des antigènes vaccinaux à la surface des particules virales, dans le but d'améliorer la réponse immunitaire. Cette approche a déjà été utilisée dans le cas de vecteurs vaccinaux dérivés de divers virus, par exemple le poliovirus (MANDL et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 8216-8221, 1998), le virus de l'hépatite B (ULRICH et al., Adv Virus Res, 50, 141-182, 1998), ou le virus de l'hépatite A (KUSOV et al., Antiviral Res, 73, 101-111, 2007). En ce qui concerne les poxvirus, les seuls vecteurs de ce type décrits à ce jour ont été obtenus à partir de virus de la vaccine recombinants dans lequel les antigènes vaccinaux d'intérêt sont fusionnés à la protéine d'enveloppe B5R des virions EEV (KATZ and MOSS, AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 1497-1500, 1997; BARCHICHAT and KATZ, Virus Res, 90, 243-251, 2002; KWAK et al., Virology, 322, 337-348, 2004). Cette approche n'avait pas pu être envisagée jusqu'à présent dans le cas des Leporipoxvirus, car ceux-ci ne possèdent pas d'homologue de la protéine B5R. Les Inventeurs ont maintenant identifié deux protéines d'enveloppe des Leporipoxvirus auxquelles il est possible de fusionner un antigène d'intérêt, sans que cette fusion altère les fonctions de ces protéines dans la morphogénèse virale. Il s'agit des protéines dénommées M071L et MO22L chez le virus de la myxomatose (CAMERON et al., Virology, 264, 298-35 318, 1999). M071L (GenBank : NP 051785, GI:9633707) est une protéine de 324 aa codée par un gène tardif ; elle présente une masse moléculaire d'environ 36,8 kDa ; elle est intégrée à la membrane des IMV dont elle constitue la composante antigénique immunodominante. Son homologue chez un autre Leporipoxvirus, le virus du fibrome du lapin (WILLER et al., Virology, 264, 319-343, 1999), est dénommée gp071L (NP 051960, GI:9633880). Son homologue chez le virus de la vaccine est la protéine H3L, qui est impliquée dans la maturation des particules virales (DA FONSECA et al., J. Virol., 74, 7518-7528, 2000). M071L présente 90% d'identité et 94 % de similarité de séquence avec gp071L et 35% d'identité et 61% de similarité avec H3L. MO22L (GenBank NP 051736, GI:9633658) est la protéine majoritairement présente sur l'enveloppe des formes virales EEV. C'est une protéine de 371 aa qui présente une masse moléculaire d'environ 41,5 kDa. Son homologue chez le virus du fibrome du lapin est dénommée gp022L (NP 051911, GI:9633833). Son homologue chez le virus de la vaccine est la protéine F13L, qui est impliquée dans la formation de la membrane des IEV (HUSAIN and MOSS, J Virol, 75, 7528-7542, 2001). MO22L présente 92% d'identité et 95 % de similarité de séquence avec gp022L et 55% d'identité et 71% de similarité avec F13L. La séquence de la protéine M071L du virus de la myxomatose (identique à la séquence GenBank NP 051785) est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; la séquence de la protéine MO22L du virus de la myxomatose (identique à la séquence GenBank NP 051736) est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Les Inventeurs ont constaté que lorsqu'une séquence codant pour une protéine exogène était fusionnée à la séquence codant pour M071L, de manière à obtenir une protéine chimérique comprenant ladite protéine exogène fusionnée à l'extrémité C-terminale de M071L, cette protéine chimérique était exprimée de manière comparable à la protéine M071L native. En outre, cette fusion C-terminale n'interfère pas avec la fonction de la protéine M071L dans la morphogénèse virale, et chez les Myxoma virus modifiés exprimant la protéine chimérique, celle-ci est localisée comme la protéine M071L native, au niveau de la membrane des IMV. La protéine exogène est présentée à la surface des IMV et peut également induire une réponse immunitaire. Les Inventeurs ont également constaté, qu'en revanche, lorsque la protéine exogène était fusionnée à l'extrémité N-terminale de M071L il n'était pas possible d'obtenir un virus recombinant exprimant la protéine fusionnée, suggérant une modification létale de la protéine M071L. Dans le cas de MO22L, les Inventeurs ont constaté que la fusion d'une protéine exogène à son extrémité C-terminale produisait une proteine chimérique non-fonctionnelle, et aboutissait à l'absence de formation de particules virales. En revanche, lorsque la protéine exogène est fusionnée à l'extrémité N-terminale de MO22L, la protéine chimérique obtenue conserve, chez les Myxoma virus modifiés exprimant cette protéine, la fonction et la localisation de la protéine MO22L native, et permet la présentation de la protéine exogène à la surface des EEV et l'induction d'une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre cette protéine exogène. En outre les Inventeurs ont observé que les Myxoma virus modifiés exprimant les protéines chimériques décrites ci-dessus, bien qu'ils présentent une morphologie et une capacité de réplication comparables à celles de la souche sauvage dont ils sont issus, ont un pouvoir pathogène considérablement atténué. La présente invention a en conséquence pour objet un Leporipoxvirus modifié, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d'enveloppe chimérique choisie parmi : a) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant - une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M071L définie par la séquence SEQ ID NO: 1; - une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité C-terminale de ladite région A ; b) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant : - une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine MO22L définie par la séquence SEQ ID NO: 2 ; - une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité N-terminale de ladite région A, directement, ou éventuellement par l'intermédiaire d'un lieur peptidique de quelques acides aminés. Sauf indication contraire, les pourcentages d'identité et de similarité auxquels il est fait référence ici sont calculés l'aide du programme BLASTP, en utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée par la séquence complète de la protéine. La protéine exogène d'intérêt est exprimée à la surface des IMV dans le cas des Leporipoxvirus exprimant une protéine chimérique telle que définie en a) ci-dessus, et à la surface des EEV dans le cas des Leporipoxvirus exprimant une protéine chimérique telle que définie en b) ci-dessus. Selon un mode de réalisation préféré d'un Leporipoxvirus modifié conforme à l'invention, il exprime une protéine chimérique telle que définie en a) ci-dessus, et une protéine chimérique telle que définie en b) ci-dessus. Ces deux protéines chimériques peuvent contenir la même protéine d'intérêt ou deux protéines d'intérêt différentes. La présente invention englobe également tout Leporipoxvirus modifié exprimant une protéine chimérique comprenant une protéine de membrane d'IMV de Leporipoxvirus, fusionnée avec une protéine exogène d'intérêt. La protéine exogène d'intérêt peut être n'importe quelle protéine contre laquelle on souhaite induire une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire. Sa taille peut varier de quelques acides aminés à quelques centaines d'acides aminés. Il peut s'agir notamment d'une protéine antigénique dérivée d'un pathogène viral, bactérien, ou parasitaire, ou d'un fragment antigénique de ladite protéine, ou bien d'une protéine recombinante associant divers fragments antigéniques, issus d'un même antigène ou d'antigènes différents. Des Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention peuvent être obtenus à partir de Leporipoxvirus sauvages, ou de Leporipoxvirus atténués. Il peut s'agir notamment de virus de la myxomatose ou de virus du fibrome du lapin. A titre d'exemples non limitatifs de souches de virus de la myxomatose à partir desquelles peuvent être construits des virus modifiés conformes à l'invention, on citera : la souche LAUSANNE(ATCC VR-115), la souche Moses (ATCC VR-116), les souches décrites dans la Demande FR 2736358, et notamment les souches LEON 162 (L162) : CNCM I-1595 ; HONGROIS (HG): CNCM I-1593 ; FINISTERE (F9) : CNCM I-1596 ; R 801 : CNCM I-1598 ; TOULOUSE 1 (Tl) : CNCM I-1592 , ainsi que la souche atténuée SG 33 (CNCM I- 1594). A titre d'exemples non limitatifs de souches de virus du fibrome du lapin à partir desquelles peuvent être construits des virus modifiés conformes à l'invention, on citera : la souche Original A (souche Boerlage)(ATCC VR-112), la souche Patuxent (ATCC VR-113), la souche Kasza (ATCC VR-364). Les Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention peuvent être produits par les techniques classiques utilisées pour la production des poxvirus recombinants, qui mettent en œuvre une recombinaison homologue entre le génome d'un poxvirus dans lequel on souhaite insérer une séquence d'intérêt, et un vecteur de transfert, contenant la séquence que l'on souhaite insérer, encadrée par des séquences du génome du poxvirus flanquant le site où doit avoir lieu l'insertion. La recombinaison homologue intervient dans des cellules-hôtes infectées par le poxvirus choisi, et transfectées par le vecteur de transfert. La présente invention a également pour objet des outils permettant la production des Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention, et notamment : un polynucléotide codant pour une protéine d'enveloppe chimérique, telle que définie ci- dessus, une cassette d'expression contenant ledit polynucléotide, sous contrôle d'un promoteur approprié, et un vecteur recombinant contenant ladite cassette d'expression. Préférentiellement, le promoteur utilisé dans les cassettes d'expression conformes à l'invention, le promoteur est celui du gène codant pour la protéine d'enveloppe à laquelle est fusionnée la protéine exogène d'intérêt. Ces cassettes d'expression peuvent également comprendre un gène marqueur facilitant la sélection des virus recombinants. Il peut s'agir par exemple d'un gène conférant un avantage sélectif aux virus recombinants, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, tel que l'acide mycophénolique ou la généticine, ou d'un gène permettant la visualisation des plages de lyse contenant le virus recombinant, tels que le gène LacZ, le gène gus, ou un gène codant pour une protéine fluorescente. Des cellules hôtes utilisables pour la production des modifiés conformes à l'invention sont celles habituellement utilisées pour la production de Leporipoxvirus ; il s'agit notamment de cellules de lapin, normales ou tumorales, de cellules de singe, normales ou tumorales, de cellules avaires, normales ou tumorales, ou de cellules tumorales humaines Les Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention sont utilisables pour l'obtention de vaccins, non seulement chez les léporidés, mais aussi chez d'autres espèces animales, incluant les oiseaux et les mammifères, et notamment les ovins, les bovins, les porcins, les équins, les canins, les félins, et les primates, en particulier l'homme. Lesdits vaccins peuvent être formulés pour une utilisation par voie parentérale, par exemple par voie intradermique, intramusculaire, ou sous-cutanée, par voie orale, ou par voie muqueuse, par exemple intra-nasale. La quantité de virus modifiés par dose vaccinale est choisie de manière à permettre un niveau d'expression de la protéine exogène d'intérêt suffisant pour induire une réponse immunitaire contre cette protéine. Elle peut dépendre notamment de la nature de ladite protéine exogène, de l'espèce et de l'âge du sujet à vacciner, du type de réponse immunitaire (cellulaire ou humorale) que l'on souhaite privilégier. Habituellement, elle sera comprise entre 103 et 109 ufp (unités formant plage) par dose vaccinale. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant la construction de Leporipoxvirus modifiés conformes à l'invention, et leur utilisation vaccinale. EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DE VIRUS MYXOMATEUX RECOMBINES EXPRIMANT UNE PROTEINE EXOGENE EN FUSION AVEC MO22L OU M071L Trois virus recombinés issus du virus de souche Toulouse 1 ont été construits. Deux produisent la protéine MO22L fusionnée soit avec la GFP (Green Fluorescent Protein) soit avec l'ectodomaine de la protéine M2 (M2e) (GenBank : AY340089) du virus influenza A aviaire dans sa partie amino-terminale (T1-N-gfp-MO22L et Tl-N-M2e-MO22L). Le troisième produit la protéine M071L fusionnée avec M2e dans sa partie carboxy-terminale (Tl-CM2e-M071L). Matériel et Méthodes: 1. Cellules et virus : Les virus myxomateux de souche Toulouse 1 (Tl), ainsi que les virus modifiés sont propagés sur cellules RK13 en milieu constitué de DMEM (Dubelcco's Minimal Eagle Medium, Gibco�) additionné de pénicilline à 100 UI/ml final et streptomycine à 100 pg/ml, supplémenté avec 2% de sérum de veau foetal (SVF). La sélection des virus recombinés gpt+ a été réalisée dans le milieu de sélection MX-HAT constitué de DMEM 5% SVF supplémenté en acide Mycophénolique 25pg/mL (Sigma�), en Xanthine 250pg/mL (Sigma�), en Hypoxanthine 15pg/mL, en Aminoptérine 0,176pg/mL et en Thymidine 4pg/mL. 2. Construction des plasmides de transfert: 2.1- Plasmide de transfert pour la fusion N-gfp-MO22L : Les amorces utilisées pour construire ce plasmide sont listées dans le Tableau I ci-dessous. 5 Tableau I Nom de l'amorce Séquence 5'--->3' Utilisation F-GFP-MO22L ggaagatctatgctatcacttttttct Amplification de MO22L (SEQ ID NO: 3) R-GFP-MO22L ttctgcagtagtaattgcactgcgt Amplification de MO22L (SEQ ID NO: 4) F-pMO22L ctagctagcgtggacaatgtatcatgc Amplification de la zone contenant le (SEQ ID NO: 5) promoteur de MO22L R-pMO22L ctagctagcgcatttaatacatgaa Amplification de la zone contenant le (SEQ ID NO: 6) promoteur de MO22L La séquence en amont du gène MO22L, contenant le promoteur naturel de MO22L a été amplifiée avec les amorces F-pMO22L et RpMO22L et clonée dans le plasmide pCR2 (Invitrogen) aboutissant au plasmide pCR2-promMO22L. Le gène MO22L a été 10 amplifié par PCR grâce aux amorces F-GFPMO22L et R-GFP-MO22L et cloné en fusion amino-terminale avec la GFP (Green Fluorescent Protein) dans le plasmide pEGFP-F (Clontech) aboutissant au plasmide pGFPMO22L. Le fragment GFP-MO22L a été sorti du pGFPMO22L par double digestion NheI et BamHI, suivi d'un traitement 15 avec le fragment de Klenow de l'ADN polymerase I (Invitrogen) afin de produire de part et d'autres des extrémités bouts francs. Parallèlement, le plasmide pCR2-promMO22L a été ouvert par EcoRV puis déphosphorylé par la � Shrimp Alkaline Phosphatase � (Promega). Le fragment GFP-MO22L a été cloné dans le 20 pCR2promMO22L aboutissant au plasmide pPROM-GFP-MO22L. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 1. 2.2- Plasmide de transfert pour les fusions N-M2e-MO22L et C-M2e-M071L : Les amorces utilisées sont répertoriées dans le 25 tableau II ci-dessous. 11 Tableau II Nom Séquence des amorces M071 L- M2e- M2e MO22L F-gpt-Xho I CCCTCGAGAACCCACCCGCTTTTTATAG (SEQ ID NO: 7) R-gpt-EcoR I CGGAATTCAGTGCCAGGCGTTGAAAA (SEQ ID NO: 8) F-M 022 L-Nco CAGCCATGGTATCACTTTTTTCTAAGCCACC (SEQ ID NO: 9) F-MO23R-Xho TACTCGAGTACCCGTTTTTCTTTCTTCTGGTTCTGG (SEQ ID NO: 10) R-MO22L-Apa CTGGGCCCGCTAAGGGAGCGTATGTGGA (SEQ ID NO: 11) R-MO23R-Pst IAACTGCAGTATACACGTGCGAGGACAGG (SEQ ID NO: 12) F-MO70R-Nco CAGCCATGGTGTTGTGGTTTCAGGCATC (SEQ ID NO: 13) F-M071 L-Nde CAGCAGCATATGCGGGCGGGTACGACTTTAG (SEQ ID NO: 14) R-MO70R-CGGAATTCTTGGCGGGTACGTTAATC (SEQ ID NO: 15) EcoR I R-M071 L Pst I AACTGCAGCCACGATGTACGTGATTAACGTACCCGCCAAGAA (SEQ ID NO: 16) T5-prom-EcoR TTGGAATTCTTTAATTTTAATAACTAAATGTCCCTGCTGACTG 1 AAGTTGAAACTCÇGACTCGTA (SEQ ID NO: 17) P1-EcoR I TTGGAATTCTTTAATTTTAATAAC (SEQ ID NO: 18) T6-Nco I AGACGCCATGGATCTGTCGGAGGAGTCGTTGCACTTGCATTC CCAACCGTTACGAGTCGGAGT (SEQ ID NO: 19) P2-Nco I AGACGCCATGGATCTGTCGGAGGAG (SEQ ID NO: 20) T5-prom-CGGAATTCTTAATAAATCACTCGCTCTTTTTCATGTATTAAATG MO22L TCCCTGCTGACTGAAGTTGAAACTCCGACTCGTAACG (SEQ ID NO: 21) P1-prom-CGGAATTCTTAATAAATCACTC (SEQ ID NO: 22) MO22L Le soulignage simple indique les sites de restriction, le soulignage en vague indique la zone d'hybridation des amorces longues entre elles. La séquence du gène de sélection gpt sous la dépendance du promoteur mixte précoce-tardif p7/5 a été obtenue par PCR avec la Taq Expand High Fidelity (Roche) sur le plasmide pRB-gpt avec les amorces F-gpt-Xho I et R-gpt-EcoR I. Le produit de PCR (750 pb) a été inséré directement dans le vecteur commercial pGEM�-T (Promega) pour donner le vecteur pGEMT-gpt. 2.2.1-Construction de la fusion carboxy-terminale M071L-M2e (plasmide pGEMTM070R-gpt-M2e-MO71L) La boîte de recombinaison gauche a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 3' du gène M070R (500 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-MO70RNco I et R-MO70R-EcoR I. La boîte de recombinaison droite a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 5' du gène M071L (,---450 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-MO71LNde I et R-M071L-Pst I. La séquence correspondant à l'ectodomaine de M2 a été obtenue et amplifiée par PCR 0120 pb) grâce à deux couples d'amorces : un couple d'amorces longues chevauchantes, T5-promEcoR I et T6-Nco I, et un couple d'amorces courtes correspondant à l'extrémité 5' de chaque amorce longue, Pl-EcoR I et P2-Nco I. Les produits de PCR digérés par les enzymes de restriction adéquates ont été insérés de manière séquentielle dans le vecteur pGEMT-gpt digéré par ces mêmes enzymes. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 2A. Les sites de restriction utilisés sont indiqués à gauche des flèches blanches. A droite sont indiqués les gènes ou fragments de gène insérés dans le vecteur précédent grâce aux mêmes enzymes 2.2.2- Construction de la fusion amino-terminale M2e-MO22L (plasmide pGEMTMO22L-gpt-M2e-MO23R) La boîte de recombinaison gauche a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 3' du gène MO22L (500 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-MO22LNco I et R-MO22L-Apa I. La boîte de recombinaison droite a été obtenue par amplification par PCR de la séquence 5' du gène MO23R (-,--400 pb) de la souche Tl du virus myxomateux avec les amorces F-MO23R- Xho I et R-MO23R-Pst I. La séquence correspondant à l'ectodomaine de M2 a été obtenue et amplifiée par PCR (,-,120 pb) grâce à deux couples d'amorces : un couple d'amorces longues chevauchantes, T5-prom-MO22L et T6-Nco I, et un couple d'amorces courtes correspondant à l'extrémité 5' de chaque amorce longue, Pl- promMO22L et P2-Nco I. Les produits de PCR digérés par les enzymes de restriction adéquates ont été insérés de manière séquentielle dans le vecteur pGEMT-gpt digéré par les mêmes enzymes. Ces étapes de construction sont schématisées sur la Figure 2B. 3. Isolement des virus recombinés : Les cellules RK13 ont été infectées 48h après mises en culture par du virus Tl à une MOI de 0,05. Après 2h d'adsorption à 37°C, l'inoculum est retiré et les cellules rincées 3 fois avec de l'OptiMEM. Les cellules ainsi infectées, sont ensuite transfectées grâce au mélange 10 pg d'ADN plasmidique (chacun des plasmides de transfert susnommés) et 20 pg de lipofectamine (Invitrogen) déposé sur ces cellules pendant 5h. Les cellules sont ensuite rincées 3 fois et remises dans du milieu DMEM plus PS, 2% SVF en culture à 37°C, 5% CO2 jusqu'à l'obtention d'un effet cytopathique de l'ordre de 80-90%. Ces mélanges de recombinaison, constitué du lysat cellulaire contenant du virus sauvage et du virus recombiné subissent trois cycles de congélation/décongélation. Pour la fusion gfp-MO22L, dix BP100 contenant chacune 9.106 cellules RK13 de 48h sont infectées avec le mélange de recombinaison. Après 48h, le milieu liquide est remplacé par du milieu solide (MEME + PS, agarose low melting point 1%, hepes 25 mM final, NaHCO3 3% final, 2% SVF). Après 48h à 37°C, 5% CO, 2les plages de lyse contenant les virus recombinés, sont identifiées après observation en microscopie à fluorescence et isolées. Pour les fusions M2e-MO71L et M2eMO22L, les cellules RK13 sont prétraitées pendant 5h30 avec le milieu de sélection avant l'application des mélanges de recombinaison, puis les inoculums sont remplacés par un volume adéquat de milieu de sélection, avant l'application du milieu solide (complémenté en MPA, Xanthine et HAT). La purification des virus recombinés est ensuite effectuée par plusieurs passages/isolements en dilution limite : une plage mère de virus recombiné est isolée, subie trois cycles de congélation/décongélation et étalée à différentes dilutions permettant d'isoler une plage fille qui subira à nouveau ce même protocole. Les virus ainsi obtenus sont ensuite amplifiés et titrés. Résultats : Expression des protéines de fusion L'observation en microscopie à fluorescence de cellules RK13 transfectées avec le plasmide pGFP-MO22L montre que la protéine de fusion est bien exprimée, et sa localisation intracellulaire semble être similaire à celle précédemment décrite pour la protéine F13L qui est l'homologue de MO22L chez le virus de la vaccine en condition de transfection (HUSAIN et al., Virology, 308, 233-242, 2003). Il apparaît donc que la fusion amino-terminale n'altère pas la production et la stabilité de la protéine MO22L. D'autre part, les virus Tl-N-gfp-MO22L, Tl-N-M2e-MO22L et Tl-C-M2e-MO71L forment des plages de lyse en cellules RK13 comparables à celles formées par le virus sauvage Ti, ce qui indique que ces fusions n'altèrent ni la viabilité ni la prolifération virale in vitro. L'observation de plages de lyse obtenues après infection par le virus Tl-N-gfp-MO22L au microscope à fluorescence montre d'autre part que la protéine de fusion est exprimée dans la totalité des plages. EXEMPLE 2 : PROPRIETES IMMUNOGENES DE VIRUS MYXOMATEUX RECOMBINES EXPRIMANT UNE PROTEINE EXOGENE EN FUSION AVEC MO22L OU M071L Les virus recombinés obtenus à l'Exemple 1 ont été testés in vivo (lapins, souris et ovins), d'une part pour explorer le pouvoir pathogène pour l'espèce cible du VM (lapins) et d'autre part pour vérifier la mise en place d'une réponse immunitaire contre les produits des transgènes chez l'espèce cible et des espèces non cibles du VM. Matériel et Méthodes: 1. Immunisation et suivi clinique chez l'espèce cible: Des lots de quatre lapins mâles New Zealand de 10 semaines ont été inoculés à l'oreille par voie intradermique avec 5.103 ufp (unité formant plage) de chacun des virus recombinés dilués dans de l'OptiMEM sans PS ni SVF. Des prises de sang sur tube sec ont été effectuées à JO, J10, J20 et J30 post-infection et les sérums extraits. Un groupe contrôle de quatre animaux a été inoculé de la même façon avec la même dose de virus Tl (virus parental). Un suivi clinique a été effectué par observation régulière des lapins présence de lésions évocatrices, évaluation de l'état général. 3. Immunisation et suivi clinique chez les espèces non-cibles : - Des lots de quatre souris mâles de 8 semaines de type BalbC ont été infectés par voie intrapéritonéale avec 5.106 ufp de virus Tl-N-M2e-MO22L ou Tl-C-M2e-M071L à raison de deux injections à 21 jours d'intervalle. Un lot de deux souris non-infectées a servi de témoin. Les souris ont été surveillées (présence de lésions, évaluation de l'état général) régulièrement jusqu'à 42 jours post-inoculation, puis sacrifiées et saignées pour extraire les sérums. - Deux brebis adultes ont été inoculées par voie intradermique avec 5.10' ufp de virus Tl-Ngfp-MO22L à JO, J8 et J24, puis par voie intramusculaire à J90. Une surveillance clinique a été effectuée par observation régulière (présence de lésions évocatrices, évaluation de l'état général) durant 7 jours après chaque inoculation et des prises de sang ont été réalisées sur tubes EDTA pour extraction des cellules mononuclées périphériques du sang (PBMCs) à JO et J110 post-inoculation. 4. Analyse des sérums : - La présence d'anticorps anti-GFP dans les sérums des lapins inoculés avec le virus T1-NgfpMO22L a été testée par immunofluorescence. Les cellules RK13 ont été transfectées avec 2 pg de plasmide pEGFP-F (clontech) à l'aide de 3 pl de Fugen6 (Roche). Après 48h de mise en culture à 37°C, 5% CO2, les cellules sont fixées avec de la paraformaldhèdyde 4% dans du PBS. Une détection de la GFP par immunofluorescence est ensuite réalisée. Les cellules sont perméabilisées avec du Triton X100 0,1% dans du PBS. Après rinçages, 300 pl des sérums différemment dilués (1/100 ; 1/300) dans du PBS Tween sont déposés sur les cellules. Le tout est incubé 1h à 37°C. 3 rinçages avec du PBS Tween sont effectués. L'anticorps secondaire anti-IgG de lapins biotinylé (Sigma) dilué au 1/200 dans du PBS Tween est déposé dans les cupules et incubé 1h à 37°C. La révélation est effectuée grâce à de l'extravidin couplée au TRITC (Sigma) 300 pl d'extravidin couplée au TRITC diluée au 1/200 dans du PBS sont déposés dans chaque cupule et laissé incubé 30 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite rincées trois fois avec du PBS avant d'être montées entre lame et lamelle avec du PBSglycérol (50%-50%) pour l'observation. - La présence d'anticorps anti-M2e dans les sérums de lapins et de souris inoculés avec les virus Tl-N-M2e-MO22L ou Tl-C-M2e-M071L a été testée par immunofluorescence. Les cellules RK13 ont été infectées par du virus influenza de type H7N1 aviaire (MOI de 0,3) ou par du virus influenza de type HlNl humain (MOI de 0,1) puis fixées 8 h p.i. La détection de la protéine M2 suit le protocole précédemment cité, les sérums de lapins et de souris étant dilués respectivement au 1/200éme et 1/100éme. Les anticorps secondaires anti-IgG de souris et anti-IgG de lapins couplés FITC ont été utilisés à la dilution 1/200éme. 5. Analyse de la réponse cellulaire chez les ovins : La réponse cellulaire contre le produit du transgène fusionné a été explorée chez les deux ovins inoculés avec le virus Tl-N-gfp-MO22L. le principe est de mesurer par cytométrie de flux la lymphoprolifération après restimulation par la gfp des PBMCs isolés et cultivés en présence d'un fluorochrome (CFSE). -Isolement des PBMCs Le sang est collecté sur tube EDTA, puis dilué (1 :2) avec du PBS. Le mélange est chargé sur un gradient de densité (FicollPaque plus, Amersham) puis centrifugé à 800g pendant 20 minutes. Les PBMCs (cellules mononuclées périphériques du sang) sont collectées, lavées dans du PBS et récupérées par centrifugation à 870 g pendant 10 minutes à 4°C. Les PBMCs sont cultivés à 37°C sous atmosphère 5% CO2. Le milieu de culture RPMIc est constitué de RPMI 1640 Glutamax, 25 mM Hepes (Gibco- BRL), auquel est ajouté 10 % de sérum de veau foetal (SVF), 1 % de pyruvate de sodium (Gibco-BRL), 1 % d'acides aminés non essentiels (Gibco-BRL), 1 % de (3-mercapto-éthanol (Gibco-BRL), 100 unités/ml de pénicilline ainsi que 100 pg/ml de streptomycine. Test de lymphoprolifération Après isolement, les PBMCs sont marqués au CFSE (Molecular Probes). Les cellules sont reprises dans du PBS à une concentration de 107 cellules/ml. Une solution 2X (2.5 pM) de CFSE dans du PBS est ajoutée volume à volume aux cellules. Le tout est incubé 10 minutes à l'abri de la lumière. Puis du SVF est ajouté volume à volume pour neutraliser le marquage. Le mélange est mis à incuber pendant 3 minutes. Puis le tube est complété avec du RPMIc et centrifugé à 300 g pendant 10 minutes à 4°C. Le lavage est répété dans un nouveau tube. La concentration cellulaire est ajustée à 6.106 cellules/ml avec du RPMIc. Les cellules sont mises en culture en plaques P24 à raison de 3.106 cellules par puits sous 1ml. Des quantités variables de protéine rGFP (Clonetech) (10 à 0.1 pg) sont ajoutées aux cellules. Les cellules sont ainsi mises en culture à 37°C, sous atmosphère 5 % CO2. Après 6 jours d'incubation, les cellules sont récoltées, laver dans du tampon FACS (PBS, 2.5 mM EDTA, 0.5 % BSA) et marquées avec des anticorps anti-CD2 couplés au A647 et anti-CD4 couplés à la phycoérytrine (Sérotec). La viabilité est déterminée grâce à l'ajout d'iodure de propidium à 1 pg/ml juste avant l'acquisition (BD Biosciences Pharmingen). L'acquisition est réalisée avec un FACScalibur (Becton Dickinson). L'analyse est réalisée avec le logiciel Flowjo. Résultats : 1- Les MV recombinés sont non pathogènes : Chez les lapins infectés avec le virus parental Tl, on observe une évolution normale de la maladie avec une mort dans les dix à quinze jours. Chez les lapins infectés avec les virus recombinés, on observe une légère inflammation localisée au niveau du point d'inoculation. Dans les 20 jours post-infection, tous les lapins ont conservé un très bon état général. Quelques myxomes secondaires de petite taille sur les paupières ont parfois été observés, mais aucune surinfection bactérienne respiratoire n'a été constatée. Concernant les espèces non-cibles (souris et ovins) aucun signe clinique local ou général n'a été observé. L'ensemble de ces données montre l'innocuité des virus recombinés, bien qu'ils aient été construits à partir d'une souche pathogène. 2- Production d'anticorps contre les antigènes fusionnés avec MO22L ou M071L. Chez une espèce cible : Les sérums de lapins infectés avec le virus Tl-N-gfp-MO22L ont été prélevés à JO, J10, J20 et J30 post-infection. La présence d'anticorps anti-GFP a été testée en immunofluorescence sur des cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-F permettant une expression transitoire de la protéine GFP en cellules eucaryotes. La GFP émettant dans le vert, la détection a été réalisée grâce à un fluorochrome rouge, le TRITC. On peut ainsi ainsi vérifier la présence d'anticorps anti-GFP par colocalisation de la fluorescence naturelle de la GFP et de l `immunomarquage . Les résultats obtenus avec le sérum d'un lapin prélevé à J30 post-infection avec le virus Tl-N-gfp-MO22L sont illustrés par la Figure 3. Les panneaux de gauche (A, C et E) montrent la localisation de la GFP. Les panneaux de droite (B, D, et F) montrent le marquage obtenu à l'aide de différents sérums : le sérum polyclonal anti-virus myxomateux (B), le sérum du lapin 40451 prélevé à J30 postinfection dilué au 1/100 (D), et ce même sérum dilué au 1/300 (F). De même, la présence d'anticorps anti-M2e a été vérifiée pour les sérums des lapins infectés avec les virus Tl--NM2e-MO22L et Tl-C-M2e- M071L prélevés à JO et J30. Pour cela des cellules RK13 préalablement infectées par un virus influenza (H1N1) ont été soumises à un test d'immunofluorescence. Les résultats sont illustrés par la Figure 4A : Sérums de lapins infectés à JO (Tl-N-M2e-MO22L en 1 et T1-C-M2e-M071L en 2) et à J30 (Tl-N-M2e-MO22L en 3 et Tl-C-M2e-M071L en 4) La fluorescence spécifique observée avec les sérums récoltés à J30 sur les lapins infectés signale la production d'anticorps anti-M2e. contre le produit du transgène fusionné par les lapins infectés. Chez une espèce non-cible : Afin de vérifier si les virus recombinés étaient capables d'induire une réponse sérologique contre le produit du transgène chez une espèce non-cible, des immunisé des souris ont été immunisées avec l'un ou l'autre des virus exprimant M2e en fusion. Les sérums ont été prélevés 42 jours après inoculation et testés par immunofluorescence. Les résultats sont illustrés par la Figure 4B : Sérum de souris non infectées (1) et infectées par le virus Tl-N-M2e-MO22L (2) ou le virus T1-C-M2e-M071L (3) On observe une fluorescence spécifique avec les sérums des souris inoculées par les virus Tl-N-M2e-MO22L ou Tl-C-20 M2e-M071L, signalant la production d'anticorps anti-M2e. 3. Induction d'une réponse cellulaire contre un antigène fusionné avec MO22L. Afin de vérifier si une réponse immunitaire spécifique à médiation cellulaire pouvait être induite contre une 25 protéine antigénique fusionnée à une protéine d'enveloppe du VM, une expérience de stimulation-marquage de PBMCs de moutons a été effectuée. La prolifération des PBMCs de moutons inoculés avec le virus T1-Ngfp-MO22L a été mesurée par cytométrie de flux après restimulation avec la GFP et marquage des sous-populations de 30 lymphocytes T (CD2+ et CD4+). Les résultats sont illustrés par la Figure 5. Panel A (brebis témoin) : en 1, cellules restimulées avec du milieu de culture ; en 2, cellules restimulées avec 3 pg de GFP Panel B (brebis inoculée avec Tl-Ngfp-MO22L): en 1, 2 et 3, cellules restimulées avec respectivement 10, 3 et 1 pg de GFP; en 4, cellules restimulées avec du VM, et en 5 cellules restimulées avec du milieu de culture. Pour chacun des cadrans, l'axe des abscisses mesure l'intensité de la fluorescence verte (CFSE) et l'axe des ordonnées l'intensité de la fluorescence rouge (marquage CD4). Dans le coin de chaque cadran est indiqué le pourcentage de cellules de ce cadran vis- à- vis de la population totale CD2+ (ensemble des lymphocytes T). On observe qu'aucune dilution de fluorescence pour la population de lymphocytes T du témoin n'a lieu après les restimulations (maximum d'intensité de fluorescence en 1 et 2). En revanche, la fluorescence décroît significativement lorsque les lymphocytes T de la brebis inoculée sont re-stimulés par la GFP et ceci quelle que soit la dose appliquée (panel B, 1, 2 et 3). Ceci est plus marqué pour les lymphocytes CD4+ (cadrans supérieurs) que pour les lymphocytes CD8+ (cadrans inférieurs). Cette décroissance de fluorescence après stimulation par la GFP signale une lymphoprolifération, témoin d'une réponse cellulaire chez les animaux inoculés. Conclusion : Les résultats ci-dessus illustrent la capacité de Leporipoxvirus exprimant un antigène protéique exogène fusionné à une protéine d'enveloppe d'IMV ou d'EEV à induire une réponse immunitaire aussi bien humorale que cellulaire contre cet antigène exogène, y compris chez des espèces non-cibles des Leporipoxvirus. En outre, l'inoculation de ces Leporipoxvirus n'induit aucun effet secondaire, notamment chez les espèces non- cible, ce qui conforte leur innocuité. Ces Leporipoxvirus constituent donc des vecteurs vaccinaux non réplicatifs, particulièrement intéressants pour l'utilisation chez des espèces autres que les léporidés. REVENDICATIONS 1) Leporipoxvirus modifié, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine d'enveloppe chimérique choisie parmi : a) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant : - une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine M071L définie par la séquence SEQ ID NO: 1 ; - une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité C-terminale de ladite région A ; b) une protéine d'enveloppe chimérique comprenant : - une région A constituée par une protéine possédant au moins 85%, de préférence au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité, ou au moins 90%, de préférence au moins 92%, et de manière tout à fait préférée au moins 96% de similarité de séquence avec la protéine MO22L définie par la séquence SEQ ID NO: 2 ; - une région B constituée par une protéine exogène d'intérêt, ladite région B étant fusionnée à l'extrémité N-terminale de ladite région A. 2) Leporipoxvirus modifié selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il exprime une protéine chimérique telle que définie en a) dans ladite revendication 1, et une protéine chimérique telle que définie en b) dans ladite revendication 1. 3) Leporipoxvirus modifié selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir du virus de la myxomatose ou du virus du fibrome du lapin. 4) Polynucléotide codant pour une protéine d'enveloppe chimérique telle que définie en a) ou en b) dans la revendication 1. 5) Cassette d'expression comprenant un polynucléotide 35 selon la revendication 4. 6) Vecteur recombinant comprenant une cassette d'expression selon la revendication 5. 7) Leporipoxvirus modifié selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'utilisation en tant que vaccin.