Brevet FR2929851A1 — publié le 20091016

-1- Molécules inhibant une voie métabolique impliquant la protéine tyrosine kinase Syk et procédé d'identification de ces molécules La présente invention est relative à des molécules organiques capables d'inhiber la liaison d'un anticorps ou fragment d'anticorps avec la protéine tyrosine kinase Syk humaine, à l'utilisation de ces molécules pour la fabrication de médicaments pour la prévention ou le traitement de pathologies déperdantes de voies métaboliques impliquant Syk, ainsi qu'à un procédé d'identification de telles molécules. La Protéine Tyrosine Kinase (PKT) Syk (� Spleen tyrosine kinase �) est une protéine cytoplasmique qui est un médiateur clé de la signalisation dépendante d'immunorécepteurs dans des cellules impliquées dans l'inflammation telles que les lymphocytes B, les mastocytes, les macrophages et les neutrophiles. Au niveau des mastocytes et des basophiles, la réticulation du récepteur FcERI (récepteur à haute affinté des Immunoglobulines E) avec les IgE et les ant gènes induit la phosphorylation des motifs ITAM (� Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif �) de FcERI de manière à former un site de liaison pour Syk qui est alors activé. La protéine Syk activé phosphoryle à son tour de nombreux substrats, parmi lesquels les protéines adaptatrices LAT (� linker for activation of T cells �), SLP-76 (� Src homology 2 (SH2) domain-containing leukocyte protein of 76 kD �) et Vav, conduisant à l'activation de plusieurs cascades de signalisation, telles que celles de PLC-y (phospholipase Cy), PI3K (� phosphatidylinositol 3-kinase �), Erk (� extracellular signal-regulated kinase �), JNK (� c-jun N-terminal kinase �) et p38 (voir figure 9). Ces cascades mènent finalement à la dégranulation, la synthèse et la libération de médiateurs lipidiques, et à la production et à la sécrétion de cytokines, chimiokines et facteurs de croissance 1,2 par les mastocytes et les basophiles . La protéine Syk est par conséquent reconnue comme une cible pharmaceutique potertielle, notamment pour le traitement de réactions d'hypersensibilité de type I incluant la rhinite allergique, l'urticaire, l'asthme et l'anaphylaxie en raison de sa position critique en amont des complexes immuno-récepteurs de signalisation qui régulent la réponse inflammatoire dans les leucocytes. Le 3 fait que la protéine Syk régule positivement la signalisation FcERI , suggère en particulier qu'elle pourrait être une excellente cible pour le traitement des troubles allergiques. De plus, en raison de son rôle central dans la signalisation FcERI-dépendante, le fait d'interagir pharmaceutiquement avec Syk pourrait s'avérer plus avantageux que l'utilisation classique d'antihistaminiques ou d'agonistes du récepteur du leucotriène qui inhibent un seule étape avale des cascades comp exes qui contribuent aux symptômes aigus et chroniques associés avec les affections allergiques. Des inhibiteurs pharmacologiques de l'activité kinase de Syk présentant un potentiel thérapeutique, 35 tels que notamment des oligonucléotides anti-sens spécifiques de Syk sous forme d'aérosol et des -2- petites molécules qui interfèrent avec l'activité de Syk telles que ER-27139, BAY-613606, le 1, 4 picéatannol et R112 ont déjà été développés . Cependant, si l'on considère les multiples types de cellules qui expriment Syk, des effets secondaires potentiels liés à une exposition systémique du système immunitaire à des médicaments ciblant le domaine kinase de Syk doivent être pris en considération. En effet, la protéine Syk est largement distribuée dans différents types' cellulaires, il est par conséquent essentiel de prendre en considération les effets indésirables de son inhibition sur des fonctions physiologiques variées telles que la différenciation, l'adhésion et la prolifération 5,6 cellulaire . Les inventeurs ont identifié des inhibiteurs de la protéine Syk qui agissent en empêchant son interaction avec ses partenaires cellulaires naturels plutôt qu'en ciblant son site catalytique, en part+culier le composé C-13 et les composés 1 à 87 présentés dans le tableau 1. Un objet de la présente invention est la molécule C-13 (méthyl 2-{5-[(3-benzyl-4-oxo-2-thioxo-1,3-thiazolidin-5-ylidene)méthyl]-2-furyl} benzoate) ayant pour formule (C-13) en tant que médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez l'homme ou l'animal. La présente invention a également pour objet des molécules organiques équivalentes sur le plan 20 fonctionnel à la molécule C-13, se liant à la protéine tyrosine kinase Syk et en particulier des molécules capable d'inhiber d'au moins 5%, de préférence d'au moins 10%, par exemple d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 % in vitro la liaison (i) du fragment d'anticorps G4G11 (SEQ ID N°2), ou (ii) du fragment d'anticorps G4E4 (SEQ ID N°3), ou 25 (iii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins l'un des résidus 65 à 74 cle la séquence en acides aminés de la protéine tyrosine kinase Syk humaine représentée par la séquence SEQ ID N°1, ou (iv) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk 30 humaine et inhibant d'au moins 10'% la liaison des fragments d'anticorps G4G11 ou G4E4 avec la protéine tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N°1) à la protéine tyrosine kinase Syk humaine ou à l'une de ses variantes chez l'animal, par exemp e la protéine tyrosine kinase Syk murine dont la séquence est illustrée à la figure 8B (SEQ ID N°4), en tant que médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez l'homme ou l'animal. Par � molécule équivalente sur le plan fonctionnel � on entend une molécule, par exemple une molécule organique de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Da, capable de conduire au même effet in vitre en milieu intra ou extra cellulaire ou in vivo, éventuellement avec une intensité différente, qu'une molécule donnée. En particulier dans le cadre de la présente invention, on entend par � molécule équivalente sur le plan fonctionnel à la molécule C-13 �, une molécule capable de produire le même effet in vitro en milieu intra ou extra cellulaire ou 'n vivo, éventuellement avec une intensité différente, sur la protéine tyrosine kinase humaine telle que représentée par séquence SEQ ID N°1 (figure 8A) que la molécule C-13. En particulier il s'agit de molécules inhibant la liaison de Syk avec une autre protéine se produisant au niveau de le région de Syk comprenant ses domaines SH2. Plus particulièrement encore ces molécules n'affectent pas l'activité enzymatique kinase de Syk. Il s'agit par exemple de molécules capables d'inhiber l'interaction de la protéine tyrosine kinase Syk avec le fragment d'anticorps G4G11 (SEQ ID N°2), le fragment d'anticorps G4E4 (SEQ ID N°3), ou un anticorps ou fragment d'anticorps se liant au même épitope que le fragment d'anticorps G4G11 ou G4E4 sur la protéine Syk humaine (SEQ ID N°1). Par � pourcentage d'inhibition � de la liaison d'un anticorps ou fragment d'anticorps à la protéine Syk, on entend en particulier le ratio [(A - B) / (A x 100)], où A correspond à l'intensité d'un signal proportionnel à la quantité d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps lié à la protéine Syk en l'absence d'une molécule selon l'invent on et B à l'intensité du même signal en présence d'une molécule selon l'invention dans les mêmes conditions. L'inhibition de la liaison d'un anticorps ou fragment d'anticorps à la protéine Syk peut notamment être mise en évidence in vitro par un essai de déplacement de l'anticorps basé sur la technique ELISA tel que décrit par exemple dans la demande internationale WO 2005106481. Cet essai peut être réalisé par exemple selon le protocole décrit dans l'exemple 3-2) ci-après. Par � variantes de Syk chez l'animal � on entend des gènes de différentes espèces animales, par exemple de la souris, du rat, du chien, du chat ou d'un autre mammifère, codant pour une protéine présentant une forte homologie ou identité de séquence et de fonction avec la protéine Syk: humaine telle que représentée par la séquence SEQ ID N°1 (voir figure 8A), par exemp e une protéine présentant une homologie ou une identité de séquence d'au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% avec la séquence SEQ ID N°1 de la protéine Syk humaine, présentant la même activité tyrosine kinase et impliquée dans les mêmes cascades fonctionnelles que cette dernière, en particulier dans la cascade fonctionnelle conduisant à la dégranulation des mastocytes. II peut notamment s'agir de gènes orthologues c'est-à-dire de gènes présents dans des organismes différents, ayant évolué à partir d'un même gène ancestral suite à des événements de spéciation. -4- La présente invention a également pour objet les sels pharmaceutiquement acceptables, et le cas échéant, les stéréoisomères et racémates de C-13 ou des molécules équivalentes selon l'invention. Par � sels pharmaceutiquement acceptables � on entend les sels d'addition acides ou de bases, inorganiques et organiques, relativement non toxiques qui conservent l'activité biologique des molécules selon l'invention. Des exemples de sels pharmaceutiquement acceptables sont notamment décrits dans S. M. Berge et: al., � Pharmaceutical Salts �, J. Pharm. Sci, 1977, 66:p.1- 40 19 . Les sels d'addition pharmaceutiquement acceptables de molécules selon l'invention peuvent être par exemple des sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate. oxalate, valérate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, méthanesulfonates, éthane-sulfanates. benzènesulfonates, p-toluènesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. D'autres sels pharmaceutiquement acceptables pouvant être appropriés incluent des sels de métaux, par exemple les sels pharmaceutiquement acceptables de métaux alcalins ou alcalino-terreux, tels que les sels de sodium, potassium, calcium ou magnésium. Ces sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être préparés in situ pendant l'isolement final et la purification des molécules. Alternativement, les sels d'addition acides ou de base peuvent être préparés en faisant réagir séparément la molécule purifiée sous sa forme acide ou basique avec respectivement une base ou un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Par exemple, un sel d'addition acide pharmaceutiquement acceptable peut être préparé en 'gisant réagir une molécule selon l'invention avec un acide organique ou inorganique convenable (tel que par exemple l'acide hydrobromique, hydrochlorique, sulfurique, nitrique, phosphorique, succinique, maléique, formique, acétique, propionique, fumarique, citrique, tartarique, lactique, benzoïque, salicylique, glutamique, aspartique, p-toluène-sulfonique, benzène-sulfonique, méthane-sulfonique, éthane-sulfonique, hexanoïque ou naphthalène-sulfonique tel que l'acide 2-naphthalène sulfonique), éventuellement dans un solvant approprié tel qu'un solvant organique. L'n sel d'addition de base peut, lorsqu'un groupement acide approprié est présent, être préparé en faisant réagir une molécule selon l'invention avec une base organique ou inorganique appropriée (par exemple le triéthyl-amine, l'éthanol-amine, le triéthanol-amine, la choline, l'arginine, la lysine ou l'histidine), éventuellement dans un solvant approprié tel qu'un solvant organique. Les sels ainsi générés peuvent ensuite être isolés par cristallisation et filtration. Dans certaines mises en oeuvre, les sels pharmaceutiquement acceptables sont préférés dans la mesure où ils confèrent une meilleure stabilité ou solubilité aux molécules selon l'invention facilitant leur formulation. -5- Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, les molécules organiques selon l'invention se lient à la protéine tyrosine kinase Syk au niveau d'un site localisé en dehors de son domaine catalytique. De préférence également, les molécules organiques selon l'invention ont un poids moléculaire 5 compris entre 50 et 2500 Dalton, par exemple entre 50 et 2000 Da, entre 50 et 1500 Da ou entre 50 et 1000 Da. Selon une mise en oeuvre particulière, les molécules selon l'invention sont capables d'inhiber d'au moins 5%, de préférence d'au moins 1C%, la liaison d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins deux, de 10 préférence au moins 3, 4 ou 5, par exemple 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 des résidus 65 à 74 de la séquence en acides aminés de la protéine tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N°1), à la protéine tyrosine kinase Syk humaine. Selon une mise en oeuvre préférée, l'anticorps ou fragment d'anticorps se lie à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau du même épitope que le fragment d'articorps G4G11 ou que le fragment d'anticorps G4E4 sur la protéine tyrosine kinase Syk humaine dont la 15 séquence est illustrée par la SEQ ID N°1. Selon une autre mise en oeuvre particulière, les molécules selon l'invention sont capables d'inhiber d'au moins 5%, de préférence d'au moins 10%, la liaison d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk et inhibant d'au moins 15%, de préférence d'au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70 ou 80 % la liaison des fragments d'anticorps G4G11 ou G4E4 avec la protéine 20 tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N°1), à la protéine tyrosine kinase Syk humaine. De préférence, les molécules selon l'invention se lient à la protéine Syk humaine au niveau d'une poche tridimensionnelle comprenant le résidu Arginine situé en position 68 et les deux résidus acide glutamique situés en positions 121 et 155 de la protéine Syk dont la séquence est illustrée par la SEQ ID N° 1. De préférence encore, la poche tridimensionnelle comprend également le 25 résidu Sérine situé en position 9, le résidu Glutamine situé en position 43, le résidu Phényla anine situé en position 51, le résidu Isoleucine situé en position 66, les résidus Glutamate situés en position 67 et 69, le résidu Leucine situé ien position 70, le résidu Asparagine situé en position 71, le résidu Glycine situé en position 72, le résidu Thréonine situé en position 73, le résidu Tyrosine situé en position 74 et le résidu Alanine situé en position 75 de la protéine Syk humaine dent la 30 séquence est illustrée par la SEQ ID N°1. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule selon l'invention pour la fabrication d'un médicament pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez l'homme ou l'animal. -6- Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, les molécules ou sels selon l'invention sont utilisées pour la fabrication de médicament pour la prévention ou le traitement de réactions d'hypersensibilité de type I. Par � hypersensibilité � on entend une réponse immunitaire inappropriée et excessive à un allergène, par exemple le pollen, la poussière, des poils d'animaux ou certains aliments, les effets allant de la réaction allergique modérée (éruption cutanée, rhinite, conjonctivite...) à des réactions systémiques sévères pouvant mener au choc anaphylactique et pouvant dans certains cas être fatales. Les réactions d'hypersensibilité à effet immédiat et retardé sont classifiées dans les types I et IV respectivement de la classification établie par Gell et Coombs (Gell PGH, Coombs RRA, eds. 39 Clinical Aspects of Immunology. lst ed. Oxford, England: Blackwell; 1963 ). Selon cette classification I� c hypersensibilité de type I � (ou � atopique � ou � anaphylactique �) est une réaction allergique immédiate liée à l'exposition à un antigène spécifique ou allergène, par exemple par ingestion, inhalation, injection ou contact direct, et au déclenchement de la sécrétion d'Immunoglobulines E (IgE) par les cellules plasmatiques. Les IgE se lient aux récepteurs Fc présent à la surface des mastocytes tissulaires et des basophiles sanguins. Une exposition ultérieure des mastocytes et basophiles ainsi sensibilisés au même allergène conduit à la dégranulation des cellules présentant l'IgE correspondante et à la libération de médiateurs tels que l'histamine, le leukotriène ou les prostaglandines qui agissent sur les tissus environnant, conduisant en particulier à une vasodilatation et à la contraction des muscles lisses. Les réactions peuvent être locales ou systémiques E: les symptômes varient de l'irritation modérée à la mort soudaine par choc anaphylactique. A titre d'exemple de pathologies causées par l'hypersersibilité de type I, on peut citer l'asthme allergique, la conjonctivite allergique, la rhinite allergique (ou rhume des foins), l'anaphylaxie, l'angioedème, l'urticaire, l'éosinophilie, des allergies aux antibiotiques tels que la pénicilline ou la céphalosporine. L' � hypersensibilité de type II � ou � réponse immunitaire dépendante des anticorps � est une réaction nécessitant généralement de quelques heures à une journée, liée aux interactions entre des anticorps (IgG, IgM) et un antigène au niveau de la surface des cellules du patient présentant cet antigène, conduisant à la destruction de ces cellules et à la prolifération des lymphocytes B produisant les anticorps contre l'antigène. L�( hypersensibilité de type III � ou � maladie du complexe immun � est une réaction se développant sur plusieurs heures, jours ou semaines, liée à la présence en quantités similaires d'anticorps et d'antigènes conduisant à la formation de complexes immuns ne pouvant être évacués circulant dans les vaisseaux, à leur dépôt au niveau des parois de ces derniers et conduisant à des réponses inflammatoires locales ou générales. L'� hypersensibilité de type IV � ou � immunité à médiation cellulaire � ou � réaction d'hypersensibilité retardée � est une réaction immunitaire nécessitant généralement deux à trois jours pour se développer et non liée à une réponse anticorps mais à la formation d'un complexe entre des cellules présentant un antigène du complexe majeur d'histocompatibilité I ou Il et des lymphocytes T conduisant à la libération de lymphokines et/ou à la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T. -7- De préférence, les molécules ou sels selon l'invention sont utilisées pour la fabrication de médicaments pour la prévention ou le traitement de réactions d'hypersensibilité de type 1 qui inhibent la dégranulation des mastocytes dépendante des IgE. De préférence encore, les molécules selon l'invention sont capables d'inhiber de 50% in vitro la dégranulation des mastocytes à une concentraticn (CI50) comprise entre 1ng/ml et 1 mg/ml, par exemple à une concentration comprise entre 1 ng/ml et 500 pg/ml, entre 1 ng/ml et 250 pg/ml, entre 1 ng/ml et 100 pg/rnl, entre 1 ng/ml et 50 pg/ml, entre 1 ng/ml et 10 dag/ml, entre 1 ng/ml et 5 pg/ml ou entre 1 ng/ml et 2 pg/ml. De préférence également, une quantité comprise entre 1 nM et 1 mM, par exemple entre .I nM et 100 nM, entre 10 nM et 100 nM ou entre 1 nM et 10 nM, d'une molécule selon l'invention est capable d'inhiber de 50% in vitro la dégranulation des mastocytes. De préférence encore, la voie métabolique impliquant Syk sur laquelle agissent les molécules ou sels selon l'invention est une voie d'activation des mastocytes ou des basophiles. De préférence encore, la pathologie sur laquelle agissent les molécules ou sels selon l'invention est l'asthme allergique, la conjonctivite allergique, la rhinite allergique, l'anaphylaxie, l'angioedème, l'urticaire, l'éosinophilie ou une allergie à un antibiotique. Selon une mise en ceuvre préférée, les molécules ou sels selon l'invention n'ont pas d'effet sur les voies métaboliques impliquant la protéine Syk humaine (SEQ ID N° 1) autres que celles conduisant à la dégranulation des mastocytes et/ou aux réactions d'hypersensibilité de type I. De préférence encore, les molécules ou sels selon l'invention n'ont pas d'effet sur la réponse anticorps faisant suite à une immunisation par un antigène thymo-dépendant ou sur le recrutement Syk-dépendant des neutrophiles. La protéine tyrosine kinase Syk est également présente à la surface de lymphocytes B, lymphocytes T, neutrophiles, éosinophiles, cellules NK, plaquettes, érythrocytes, ostéoclastes, cellules épithéliales ou de cellules cancéreuses. Selon une mise en oeuvre alternative, la voie métabolique impliquant Syk sur laquelle agissent les molécules ou sels selon l'invention est une voie d'activation des lymphocytes B, des lymphocytes T, des neutrophiles, des éosinophiles, des cellules NK, des plaquettes, des érythrocytes, des ostéoclastes, des cellules épithéliales ou de cellules cancéreuses. Selon cette mise en oeuvre, la pathologie sur laquelle agissent les molécules ou sels selon l'invention peut alors être la polyarthrite rhumatoïde, une maladie auto-immune, une inflammation ou un cancer. Selon une mise en oeuvre particulière, les molécules ou sels selon l'invention peuvent être utilisés en combinaison avec une autre molécule térapeutique. Il peut s'agir par exemple d'une molécule thérapeutique également utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk ou au contraire d'une molécule thérapeutique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie non dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk. Selon une mise en oeuvre préférée, les molécules ou sels selon l'invention sont utilisés en -8- combinaison avec une molécule utilisée pour le traitement de l'allergie ou de l'hypersensibilité de type I ou pour le traitement des symptômes y étant associés. De préférence encore, les molécules ou sels selon l'invention sont utilisés en combinaison avec l'épinéphrine (ou adrénaline), un antihistaminique H1, par exemple diphénhydramine, méclizine, fluphénazine, perphénazine, prochlorpérazine, trifluopérazine, acrivastine, astémizole, cétirizine, lévocétirizine, fexofenadine, loratadine, desloratadine, mizolastine, azélastine, lévocabastine, olopatadine, cromoglicate, nédocromil, un an i-inflammatoire non stéroïdien (AINS) ou un anti-inflammatoire stéroïdien, par exemple cortisone, hydrocortisone (ou cortisol), acétate de cortisone, prednisone, predn solone, méthylprednisolone, dexaméthasone, bétaméthasone, triamcinolone, béclométasone, fludrocortisone, acétate de désoxycorticostérone ou aldostérone. Selon une autre mise en oeuvre préférée, les molécules ou sels selon l'invention sont utilisés en combinaison avec un traitement de désensibilisation allergique (ou vaccination anti-allergique), c'est-à-dire un traitement basé sur l'administration régulière à doses croissantes d'un allergène. Les molécules ou sels selon l'invention peuvent être administrées par n'importe quelle voie 15 d'administration, en particulier par les voies orale, sublinguale, nasale, oculaire, locale, intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, par aérosol ou par inhalation. Les molécules ou sels selon l'invention peuvent notamment être administrées à des patients humains adultes, enfants ou nouveau-nés. Les molécules ou sels selon l'invention peuvent également être administrées à des patients animaux, en particulier à des mammifères tels que le 20 chien, le chat, le rat, la souris. En particulier, les molécules ou sels selon l'invention sont administrées à un patient humain à des doses qui sont déterminées notamment en fonction de la pathologie du patient, de ses antécédents et de son âge, par exemple des doses comprises entre 0,1 mg/kg et 200mg/kg. La présente invention a également pour objet une méthode thérapeutique pour le traitement ou la 25 prévention d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez un patient humain ou animal comprenant l'administration d'une molécule selon l'invention au patient à des doses, intervalles et durées déterminées notamment en fonction de la pathologie du patient, de ses antécédents et de son âge. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, les molécules selon l'invention sont choisies 30 parmi l'ensemble de molécules constitué par C-13, les molécules N°1 à 87 présentées dans le tableau N°1 et les mo"écules ayant l'une des formules (I), (II), (III) ou (IV) suivantes : -9- OH - R2 R1 (I) où O R3 - R1 est un groupement aromatique substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non comprenant au moins un atome S, O ou N ; - R2 est un groupement aromatique substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, une chaîne carbonée saturée ou non, comprenant un groupement amine, une chaîne carbonée saturée ou non comprenant un groupement aromatique substitué ou non ou une chaîne carbonée saturée ou non comprenant un hétérocycle substitué ou non comprerant au moins un atome S, O ou N ; R3 est un groupement phényle, 2-pyridinyle, 3-pyridinyle ou 4-pyridinyle, substitué ou non ; R5 c (H) s R8 R7 0 N N R4 où n = 0 ou 1 ; n' = 0 ou 1 ; R4 est une chaîne carbonée saturée ou non comprenant 1 à 5 atomes de carbone, 20 substituée ou non par un groupement aromatique ; R5 est un groupement aromatique substitué ou non ou un groupement amine substitué ou non ; R6 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy, un groupement alkyle ou un halogène ; 25 - R7 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy, un groupement alkyle cu un halogène ; R8 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy, un groupement alkyle ou un halogène ; -10- o où 1.0 m=0,1ou2; R9 est un atome d'hydrogène et R10 est un groupement phényle substitué ou non, ou R9 et R10 font partie d'un même hétérocycle substitué ou non, ou R9 et R10 font partie d'un même groupement aromatique substitué ou non; R11 est un atome hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement alkyle ; 15 - R12 est un atome hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement alkyle ; R13 est un atome hydrogène ou un groupement alkyle ou alkoxy; R14 est un atome hydrogène ou un groupement alkyle ou alkoxy ; R15 20 R17 o R16 où A est un atome d'oxygène ou de Soufre ; R15 est une chaîne carbonée saturée ou non comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, substituée ou non par un groupement aromatique substitué ou non, par un hétérocycle substitué ou non ou par un groupement amine faisant partie d'un hétérocycle substitué ou non ; R16 est un atome d'hydrogène, un halogène ou un groupement alkoxy ; R17 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement acétoxy. Selon une mise en oeuvre particulière, le groupement R1 des molécules de formule (I) est choisi 10 parmi les groupements suivants : o un groupement phényle non substitué ou substitué par un atome F ou CI, par un groupement méthyle ou éthyle, par un groupement N,N-diméthyl-sulfonamide ou par deux groupements choisis parmi les groupements méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy et éthoxy, r 15 o un groupement i i /°\ ou i o~ ~ -11- ou 20 25 o un groupement furane non substitué ou substitué par un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy, o un groupement thiophène non substitué ou substitué par un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy; o un groupement où R21 et R22 sont des atomes de carbone faisant chacun partie d'une claîne alkyle comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien faisant tous deux partie le groupement R2 des molécules de formules (I) est choisi parmi les groupements suivants : R21 N R22_j -12- o ou un groupement R24 où R23 et R24 sont des atomes de carbone faisant chacun partie d'une chaîne alkyle comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien faisant tous deux partie avec l'atome d'azote auquel ils sont liés d'un même hétérocycle saturé ou non comprenant également un atome d'oxygène ou un second atome d'azote, avec l'atome d'azote auquel ils sont liés d'un même hétérocycle saturé ou non comprenant également un atome d'oxygène ou un second atome d'azote, R23 ou N / o 1 o ou un groupement o ou ou ou et le groupement R3 des molécules de formules (I) est choisi parmi les groupements suivants : o un groupement 2-pyridinyle, 3-pyridinyle ou 4-pyridinyle non substitué, o un groupement phényle non substitué ou substitué par un groupement benzoxy, et/ou par un groupement hydroxy, et/ou par un groupement méthyle, et/ou par un groupement éthyle, et/ou par un groupement propyle, et/ou par un ou deux atomes Br, F ou CI, et/ou par un à trois groupements hydroxy, méthoxy ou éthoxy. Selon une autre mise en oeuvre particulière, le groupement R4 des molécules de formule (III est une chaîne carbonée saturée ou insatLrée comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone ; le groupement R5 est un groupement phényle ou un groupement amine secondaire substitué par un groupement phényle substitué ou non, ou par un groupement o -13- le groupement R6 des molécules de formule (II) est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy; le groupement R7 des molécules de formule (II) est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, 5 méthoxy ou éthoxy ; et le groupement R8 des molécules de formule (II) est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy. Selon une autre mise en oeuvre particulière, le groupement R9 des molécules de formule (III) est un atome d'hydrogène et le groupement R10 est un groupement phényle substitué ou non, ou les groupements R9 et 10 R10 font partie d'un même hétérocycle substitué ou non comprenant 2 atomes d'azote et 4 atomes de carbone ; le groupement R11 des molécules de formule (III) est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hyc'roxy, méthoxy ou éthoxy ; le groupement R12 des molécules de formule (III) est un atome hydrogène ou un 15 groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy; le groupement R13 des molécules de formule (III) est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; et le groupement R14 des molécules de formule (III) est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy. le groupement R16 des molécules de formule (IV) est un atome d'hydrogène ou de chlore cu un 25 groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy et le groupement R17 des molécules de formule (IV) est un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy, éthoxy, acétoxy, méthoxycarbonyle ou éthoxycarbonyle. Par chaîne carbonée, on entend une chaîne organique ayant pour squelette un enchaînement linéaire ou cyclique, ramifié ou non, d'atomes de carbone contigus, reliés par des liaisons 30 covalentes. Une chaîne carbonée au sens de la présente invention peut par exemple être un enchaînement linéaire d'un à vingt, de préférence de 1 à 12, de 1 à 10, de 1 à 6, de 1 à 5 ou de 1 à 20 Selon une autre mise en oeuvre particulière, le groupement R15 des molécules de formule (IV) est un groupement N----' /N ou -14- 4 atomes de carbone. Il peut notamment s'agir d'un groupement alkyle, c'est-à-dire dérivé d'un alcane (molécule hydrocarbonée saturée linéaire ou ramifiée) par perte d'un atome d'hycrogène, par exemple un groupement méthyle, un groupement éthyle, un groupement propyle linéaire ou ramifié ou un groupement butyle linéaire ou ramifié ou d'une chaîne hydrocarbonée irsaturée linéaire ou ramifiée, par exemple un groupement éthényle ou éthynyle. Il est entendu que les électrons de la couche externe (au nombre de 4) de chaque atome de carbone formant le squelette de la chaîne carbonée ne participant pas à une liaison covalente avec un autre atome de carbone ou avec un hétéroatome, participent à une liaison covalente avec un atome d'hydrogène. Par hétéroatome, on entend un atome différent du carbone ou de l'hydrogène et non métallique. par exemple l'oxygène, l'azote, le soufre, le phosphore ou les halogènes. Par groupement aromatique ou aryle, on entend un système cyclique insaturé respectant la règle d'aromaticité de Hückel. Il peut s'agir par exemple d'un groupement phényle (groupement dérivé d'un noyau benzénique). Par hétérocycle on entend un système cyclique dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone sont remplacés par un hétéroatome comme par exemple l'oxygène, l'azote ou le soufre. I peut notamment s'agir hétérocycles aromatiques, tels que le pyrrole, le thiophène, le furane et la pyridine ou d'hétérocycles saturés, tels que les sucres, ou oses. Un hétérocycle selon l'invention comprend par exemple 2 à 8 atomes de carbone et 1 à 4 hétéroatomes, de préférence il comprend 2, 3, 4 ou 5 atomes de carbone et 1, 2, 3 ou 4 hétéroatomes. Chaque atome faisant partie d'une chaîne carbonée, d'un groupement aromatique, d'un cycle ou d'un hétérocycle au sens de la présente invention peut être substitué par le biais d'une liaison covalente par un ou plusieurs halogènes, par exemple le Fluor, le Chlore, l'Iode ou le Brome, et/ou par un ou plusieurs groupements organiques, par exemple un ou plusieurs groupements aromatiques (tel qu'un groupement phényle), cycliques, hétérocycliques (tel qu'un groupement furane ou thiophène), alkyles (tel qu'un groupement méthyle, un groupement éthyle, un groupement propyle linéaire ou ramifié ou un groupement butyle linéaire ou ramifié), alkoxy (tel qu'un groupement méthoxy (OCH3) ou éthoxy (OCH2CH3)), carboxyle (tel qu'un groupement carboxy (COOH)), carbonyle (tel qu'un groupement acétoxy (OCOCH3) ou méthoxycarbonyle (COOCH3) ou éthoxycarbonyle (COOCH2CH3)), amines primaires, secondaires ou tertiaires, amide (tel qu'un groupement acétamide) ou sulfonamide (tel qu'un groupement N,N-dimÉthylsulfonamide). Il est entendu qu'un cycle ou hétérocycle saturé, insaturé ou aromatique peut être fusionné avec un autre cycle, par exemple par l'intermédiaire d'une liaison simple ou double Entre deux atomes de carbone. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une molécule selon l'invention ainsi qu'un excipient acceptable sur le plan pharmacologique. Selon une mise en oeuvre la composition pharmaceutique selon l'invention comprend également une autre molécule thérapeutique. Il peut s'agir par exemple d'une molécule thérapeutique -15- également utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk ou au contraire d'une molécule thérapeutique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie non dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk. Selon une autre mise en oeuvre particulière, la composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisée en cornbinaison avec une ou plusieurs autres compositions pharmaceutiques Il peut s'agir par exemple de compositions pharmaceutiques également utilisées pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk ou au contraire de compositions pharmaceutiques utilisées pour la prévention ou le traitement d'une pathologie non dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk. Selon cette mise en oeuvre, la composition pharmaceutique selon l'invention et la ou les autres compositions pharmaceutiques peuvent être administrée simultanément ou en alternance, par la même voie d'administration ou par des voies différentes. La présente invention a également pour objet un procédé pour l'identification d'une molécule organique de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Dalton se liant à la protéine tyrosine kinase Syk et capable d'inhiber d'au moins 5 %, de préférence d'au moins 10%, par exemple d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 % in vitro la liaison (i) du fragment d'anticorps G4G11 (SEQ ID N°2), ou (ii) du fragment d'anticorps G4E4 (SEQ ID N°3), ou (iii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins l'un des résidus 65 à 74 de la séquence en acides aminés de la protéine tyrosine kinase Syk humaine représentée par la séquence SEQ ID N°1, ou (ivi d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine et inhibant d'au moins 10% la liaison du fragment d'anticorps G4G11 ou G4E4 avec la protéine tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N°1), à la protéine tyrosine kinase Syk humaine ou à l'une de ses variantes chez l'animal, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le criblage à partir d'une banque de molécules organiques candidates de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Da de celles susceptibles de se lier à la protéine Syk au niveau de la poche tridimensionnelle de liaison sur la protéine Syk d'une molécule choisies parmi les molécules de formule C-13, I, II, III, IV ou 1 à 87 telles qu'illustrées ci- dessus ; b) la sélection parmi les molécules identifiées en a) de celles capables d'inhiber d'au moins 5%, de préférence d'au moins 10%, par exemple d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ou 85 % in vitro la liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps (i), (ii), (iii) ou (iv) à la protéine Syk. -16- Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la molécule de l'étape a) choisies parmi les molécules de formule C-13, I, Il, III, IV ou 1 à 87 est la molécule C-13, la molécule (59) ou la molécule (61). Selon une mise en oeuvre préférée, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire préalable à l'étape a) d'identification de la poche tridimensionnelle de liaison sur la protéine Syk de la molécule choisies parmi les molécules de formule C-13, I, Il, III, IV ou 1 à 87. Cette étape préalable peut notamment être réalisée par un � docking in silico �. Par � docking in silico � ou � amarrage moléculaire � ou � docking virtuel �, on entend le recours à un outil de bioinformatique pour prédire et modéliser le positionnement d'un ligand au sein d'une macromolécule. En particulier, les outils de Docking in silico permettent de calculer la probabilité qu'un composé chimique donné puisse s'amarrer avec une protéine active cible, par exemple au niveau d'une poche de liaison tridimensionnelle préalablement identifiée. Selon une mise en oeuvre préférée, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire c) de sélection parmi les molécules identifiées en b) de celles capables d' nhiber 1(5 de 50% in vitro la dégranulation des mastocytes à une concentration (CI50) comprise entre l ng/ml et 1mg/ml, par exemple à une concentration comprise entre 1 ng/ml et 500 pg/ml, entre 1 ng/ml et 250 pg/ml, entre 1 ng/ml et 100 pg/ml, entre 1 ng/ml et 50 pg/ml, entre 1 ng/ml et 10 pg/ml, entre 1 ng/ml et 5 pg/ml ou entre 1 ng/ml et 2 pg/ml. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée des utilisations et procédés décrits ci-dessus, 20 la molécule selon l'invention est choisie, parmi le groupe constitué par la molécule C-13 et les molécules N°1 à 87 présentées dans le tableau 1. Ces molécules ont été identifiées par les inventeurs dans le cadre d'un projet faisant suite à une 7 précédente étude (Dauvillier et al., 2002 ), au cours de laquelle ils ont exprimé des fragments d'anticorps scFv (� single chain variable domain �) (ou � anticorps intracellulaires ) ou 25 � intracorps �), G4G11 (SEQ ID N° 2) et G4E4 (SEQ ID N° 3) dans une lignée mastocytaire. Cette étude a démontré les effets inhibiteurs de ces � anticorps intracellulaires � ou � intracorps � :sur la libération de médiateurs allergiques induite par la stimulation du Fc�RI au niveau de la membrane des rnastocytes. Les fragments d'anticorps scFv G4G11 et G4E4 ont été isolés à partir d'une banque combinatoire criblée contre une protéine recombinante contenant les domaines SH2 de 30 Syk et la région inter-domaine A qui les sépare, c'est-à-dire une portion de la protéine Syk ne 8 comprenant pas le domaine kinase de Syk . Le procédé ADA (� antibody displacement assay �) est un procédé développé par les inventeurs et décrit dans WO2005106481, qui permet notamment l'identification d'un ligand capable de moduler sélectivement une cascade fonctionnelle impliquant une cible, comprenant une 35 première étape d'identification d'un anticorps intracellulaire capable de se lier à la cible et de -17- moduler la cascade fonctionnelle en question, une seconde étape de criblage à part r d'une banque de petites molécules organiques, des ligands modulateurs de la liaison entre la cible et l'anticorps intracellulaire pouvant être effectuée in vitro dans un essai extracellulaire, et une troisième étape d'identification à partir des ligands modulateurs obtenus à l'étape 2, ce ceux capables de moduler la cascade fonctionnelle dans la cellule. Les inventeurs ont émis l'hypothèse selon laquelle les fragments d'anticorps G4G11 et G4E4 se lient au niveau d'une région de Syk interagissant avec un ou des partenaires essentiels de la cascade fonctionnelle conduisant à la dégranulation. Prenant en considération les limites de l'utilisation d'anticorps intracellulaires en thérapie, telles que le transfert efficace du gène ercodant 9 l'anticorps dans les cellules cibles , les inventeurs ont cherché à isoler des molécules organiques qui agissent comme des mimes fonctionnels de l'intracorps G4G11 et pouvant être utilisées plus aisément en thérapie. Pour ce faire, ils ont utilisé le procédé ADA pour cribler une banque de 3000 petites molécules organiques et identifier des inhibiteurs potentiels de la réponse allergique. Parmi les 3000 petites molécules organiques testées, les inventeurs ont identifié la petite molécule C-13 (méthyl 2-{5-[(3-benzyl-4-oxo-2-thioxo-1,3-thiazolidin-5-ylidene)méthyl]-2-furyl} benzcate) et ont mis en évidence sa capacité de modulation de l'interaction du fragment d'anticorps G4G11 ou G4E4 avec Syk in vitro et d'inhibition de 'a dégranulation des mastocytes induite par FccRl in vitro. Les inventeurs ont notamment mis en évidence le fait que le composé C-13 inhibe le choc anaphylactique lorsqu'il est administré oralement et possède des propriétés anti-allergiques prometteuses, illustrant le fort potentiel thérapeutique de candidats médicaments isolés en utilisant l'approche décrite ici. Les inventeurs ont également mis en évidence le fait que C-13 se lie à Syk au niveau d'une cavité nouvellement identifiée située entre les cieux domaines SH2 et l'interdomaine A de Syk (Fig 1). La poche de liaison de C-13 forme une zone d'interaction unique qui est spécifique à Syk, et ne correspond pas à un site de liaison connu de ligands physiologiques de Syk tels que le peptide ITAM doublement phosphorylé au niveau de résidus tyrosine (Fig. 1A). Les résultats obtenus suggèrent que C-13 inhibe l'interaction de Syk avec certains de ses substrats macromoléculaires, soit directement de part le fait que C-13 cccupe une surface au niveau de laquelle un partenaire de Syk pourrait établir un contact direct, et/ou par un effet allostérique. Les études biochimiques réalisées sur des mastocytes ont en effet montré que C-13 inhibe la phosphorylation FccRl-dépendante du substrat SLP-76 au niveau de résidus tyrosine qui contribue à sa fonction d'adaptateur pour la liaison et/ou la stabilisation de Btk, PLC-y et Vav au complexe de 22, 28-30 signalisation macromoléculaire formé avec LAT (Fig.2). Ceci affecte la phosphorylat on et l'activité catalytique de Btk et le renouvellement de PLC-y à proximité de Syk et/ou Btk peur sa phosphorylation complète qui est requise pour le maintient du flux de calcium et de l'exocytcse 31- -18- 35 . En effet, C-13 a inhibé les réponses mastocytaires précoce (libération de 8-hexosaminidase) et tardive (sécrétion de TNF-a) induites par l'aggrégation au niveau des récepteurs FcsRl avec une C150 estimée à 2 pM (Fig. 3). De façon importante, l'administration orale d'une dose unique de C-13 a inhibé l'anaphylaxie passive systémique (PSA) induite par IgE avec une CI50 estimée à 110 mg/kg (Fig. 4), confirmant les propriété anti-a lergiques prometteuses de ce composé. En revanche, une administration orale unique de 100 mg/kg de C-13 n'a pas affecté le recrutement Syk-dépendant des neutrophiles induit par le thioglycolatte dans la cavité péritonéale en présence de la toxine de Bordetella pertussis (Fig. 5A). De plus, les inventeurs ont montré que malgré le fait que la prolifération in vitro BCR- dépendante des lymphocytes B était inhibée de façon dose-dépendante par C-13 (Fig. 5B), les réponses anticorps de souris immunisées avec un antigène thymo-dépendant n'ont pas été affectées par l'administration orale de 150mg/kg de C-13 (Fig. 5C). Par conséquent, la molécule C-13 n'affecte pas certaines réponses dépendantes de Syk mais non dépendantes des mastocytes in vivo à des doses et durées d'administration auxquelles elle peut inhiber une réponse allergique sévère. Prenant en considération l'absence d'effet toxique apparent suivant l'administration orale ou locale de C-13 sur une période allant d'une heure à 12 jours, C-13 peut être considéré comme le potentiel premier membre d'une nouvelle famille d'inhibiteurs de Syk pouvant être administrés oralement et de molécules pharmacologiquement actives ayant un effet anti-inflammatoire. L'approche de criblage de molécules pharmaceutiques décrite ici constitue une plateforme générique dans laquelle l'utilisation initiale d'anticorps permet de mettre en évidence les domaines de la molécule cible ayant un potentiel thérapeutique, facilitant ainsi la conception de molécules chimiques (à travers un criblage in silico et/ou in vitro) capable d'agir en tant que mimes fonctionnels de l'anticorps, et en tant qu'inhibiteurs potentiels d'interactions protéines-protéines. De plus, les inventeurs ont mis en évidence le fait que ces petites molécules peuvent induire la réponse souhaitée dans des modèles cellulaires et animaux, ceci venant en appui du concept en faveur du remplacement de larges macromolécules difficiles à administrer par des petites molecules organiques pouvant être administrées oralement. Le site probable de liaison à Syk a été prédit in silico, guidé par la localisation de l'épitoge de G4G11. Une poche candidate située à côté de l'épitope de G4G11, au niveau de l'interface située entre les deux domaines SH2 et le lieur inter-domaine de Syk et comprenant les résidus Ser 9, Gln 43, Phe 51, Ile 66, Glu 67, Arg 68, Glu 69, Leu 70, Asn 71, Gly 72, Thr 73, Tyr 74, Ala 75, Glu 121 et Glu 155 a ainsi été identifiée (Fig. 1C). Des expériences de mutagenèse dirigée ont permis de confirmer que les résidus Arg 68, Glu 121 et Glu 155 de la protéine Syk humaine (SEQ ID N° 1) contribuent significativement à l'interaction avec C-13, la mutation de ces résidus suppr mant l'inhibition causée par C-13, tandis que la liaison du scFv G4GI1 est maintenue (Fig. 1A, 1C). Ces -19- résultats tendent à confirmer l'hypothèse selon laquelle la cavité (ou poche) de liaison de C-13 sur Syk est localisée dans un voisinage proche du site de liaison de l'intracorps G4G11. Les inventeurs ort ensuite effectué un � docking � virtuel sur une banque de molécules afin d'identifier des molécules candidates présentant les meilleures propriétés de liaison au niveau de cette poche tridimensionnelle, et ont testé la capacité de ces molécules candidates à inhiber la liaison du scFv G4G11 avec Syk. Ces molécules sont présentées dans le tableau 1 (voir exemple 2). La capacité de ces molécules à inhiber la dégranulation des mastocytes in vitro a également été testée. Avec les molécules N° 59 et 61 en particulier la concentration inhibant de 50% in vitro la dégranulation des rnastocytes est de l'ordre de 5pM (voir figure 6). Les résultats présentés dans la partie expérimentale et en particulier dans le tableau 1 mettent en évidence le fait que les molécules ou sels selon l'invention inhibent les réactions d'hypersensibilité de type I, et en particulier la dégranulation des mastocytes dépendante des IgE, et sont aussi capables d'interférer in vivo avec l'anaphylaxie passive cutanée et systémique chez des souris BALB/c. Brève description des figures Figure 1. Liaison de C-13 à Syk in vitro. A. Structure chimique de C-13. Structure 3D de la poche prédite et validée peur C-13 (ou � Compound 13 �) comprenant les résidus Ser 9, Gln 43, Phe 51, Arg 68, Glu 121 et Glu 155 (représentation mesh); l'épitope G4G11 comprend les résidus 65 à 74 de la protéine Syk humaine représentée par SEQ ID N°1. B. Liaison du fragment scFv G4311 à Syk mesurée en utilisant la méthodologie ADA en présence de C-13 (a). Liaison de C-13 à Syk mesurée en utilisant la spectroscopie par fluorescence (o) (Kd = 4,8 � 0.2 pM. C. Liaison de G4G11 aux mutants Syk avec la méthodologie ADA. Inhibition significative avec C-13 versus DMF : **P Figure 2. C-13 inhibe l'activation de mastocytes induite par FccRI. A. Les immunoblots réalisées sur des lysats de cellules RBL-2H3 ont été analysées par des immunoblots avec les ant+corps indiqués. Les activités kinase in vitro des immunoblots Syk, Btk et Lyn ont été examinées. B. Les lysats de cellules RBL-2H3 et C. BMMCs ont été soumis à une électrophorèse et les protéines ont été analysées par immunoblot. Ces données sont représentatives d'au moins deux expériences. Figure 3. C-13 inhibe la libération de calcium et la dégranulation FccRI-dépendantes. A. Analyse par FACS du flux de calcium IgE-dépendant dans des cellules RBL-2H3. B. Libération de R-hexosaminidase dans des cellules RBL.-2H3 sensibilisées par IgE/DNP. C. Libération de (3-hexosaminidase et, D. titration de TNF-a dans des cellules BMMCs sensibilisées par IgE/DNP; C-13: 3 pM. E. Analyse par FACS de l'expression de surface de FccRl dans des cellules RBL-2H3. (0=0,25% DMF). Inhibition significative avec C-13 versus DMF : **P Figure 5. Effets in vivo et in vitro de C-13 sur les neutrophiles et les lymphocytes B. A. Recrutement de neutrophiles dans la cavité péritonéale après injection de thioglycollate ou du véhicule en présence de la toxine Bordetella Pertussis (lorsqu'indiqué) (n=4). B. Prolifération in vitro de lymphocytes B induite par anti-IgM. C. Concentration du sérum en immunoglobulines 12 jours après immunisation par TNP-KLH (n=4). Figure 6. Effet des molécules N°59 (ref. Chembridge 7501888) et 61 (ref. Chembridge 7722851) sur la dégranulation des cellules RBL-2H3. Le niveau de libération de la [3-hexosaminidase dans des cellules RBL-2H3 sensibilisées par IgE/DNP a été mesurée en présence A. de la molécule N°59 et B. de la Molécule N°61 à des concentrations allant de 0 à 40 pM. Figure 7. Séquences en acides aminés des intracorps scFv A. G4G11 (SEQ ID N° 2) et B. G4E4 (SEQ ID N° 3). Figure 8. Séquence en acides aminés de la protéine Syk A. humaine (SEQ ID N° 1) correspondant au n° accession NP_003168 (NCBI) et B. murine correspondant au numéro d'accession NP_035648 (NCBI). Les résidus identifiés comme faisant partie de la poche tridimensionnelle de liaison de C-13 sur la protéine Syk humaine (A) et leurs équivalents sur la protéine Syk murine (B) sont indiqué en gras et soulignés. Figure 9. Représentation schématique des voies métaboliques impliquant la protéine ty-osine kinase Syk au niveau des mastocytes. Figure 10. Test de toxicité de C-13 sur les cellules BMMC. Les cellules BMMC ont été incubées à 37°C en présence de 2.5 pM ou 5 pM de C-13, de DMF à 0.25% ou de Staurosporine. Les pourcentages de cellules BMMC vivantes après 3 heures et après 5jours ont été mis en évidence par un double marquage à l'Annexine-V et Iodure de Propidium. La viabilité des cellules BMMC incubées en présence de 2.5 pM ou 5 plVl de C-13 ou de DMF à 0.25% n'a pas été affectée de façon notoire après 3 heures (78%, 74% et 79% respectivement) ou cinq jours (62, 56 et 57%, respectivement). En revanche, la viabilité des cellules of BMMC traitées dans les mâmes conditions avec la Staurosporine était réduite à un niveau de 16% après seulement 3 heures. Exemples Exemple 1 ù Identification de la molécule C-13 pouvant potentiellement être administrée oralement pour prévenir le choc anaphylactique. 1) Identification du composé 13 (C-13) et de sa cavité de liaison sur Syk Les inventeurs ont développé la méthodologie ADA (Antigen Displacement Assay) pour identifier des petites molécules capables de déplacer l'association du scFv G4G11 avec Syk. PEirmi les membres d'une banque de 3000 molécules chimiques, 15 petites molécules se sont montrées capables de rentrer en compétition avec la liaison du scFv G4G11 à Syk, et parmi ces composés, celui dénommé ci-après C-13 (Fig. 1A) fit preuve du meilleur potentiel d'inhibition avec ure CI50 estimée à 4 pM (Fig. 1B). Ce résultat est en accord avec la valeur de 4,8 pM obtenue par la mesure de l'affinité in vitro de C-13 pour Syk (Fig. 1B). Pour comprendre le mécanisme d'action de C-13, les inventeurs ont dans un premier temps identifié le site de liaison de G4G11 en utilisant la 16 méthode SPOT . Un épitope localisé au niveau du domaine SH2 N-terminal de Syk, comprenant les acides aminés 65-74 et conservé à 100% dans les séquences de souris, de rat et humaines, a été identifié. Sur la base de ces informations et de la structure 3D connue du complexe peptidique formé par les 17 domaines SH2 de Syk et les motifs ITAM , les inventeurs ont utilisé des approches informatiques pour chercher un site de liaison putatif pour C-13. Une poche candidate comprenant les résidus Ser 9, Gln 43, Phe 51, lle 66, Glu 67, Arg 68, Glu 69, Leu 70, Asn 71, Gly 72, Thr 73, Tyr '74, Ala 75, Glu 121 et Glu 155 de la protéine Syk humaine (voir Figure 8A, SEQ ID N°1) et située à proximité de l'épitope de G4G11 a été identifiée (Fig. 1C). Une analyse structurelle a indiqué que les résidus Ser 9, Gln 43, Phe 51, Arg 68, Glu 121 et Glu 155 pourraient être impliqués cans la liaison du ligand, et pouvaient être mutés sans nuire à la structure 3D de la protéine. Pour valider plus avant la poche ces six acides aminés ont été individuellement mutés et les mutants Syk ont été soumis à l'essai ADA. Les résidus Arg 68, Glu 121 et Glu 155 se sont montrés comme contribuant significativement à l'interaction avec la petite molécule, étant donné que leur mutation abrogeait l'inhibition causée par C-13, tandis que la liaison du scFv G4G11 était maintenue (Fig. 1C). Ces données ont confirmé le fait que la cavité de liaison de C-13 sur Syk est localisée dans un voisinage proche du site de liaison de G4G11. 2) Activation des mastocytes induite par FcERI Afin d'examiner les similarités fonctionnelles avec G4G11, les inventeurs ont exploré les effets biologiques de C-13 sur l'activation des mastocytes. L'incubation de cellules RBL-2H3 avec: C-13 n'a pas affecté la phosphorylation et l'activité kinase induite par FcERI de Syk (Fig. 2A) et, en -21- -22- conséquence, le niveau global de phosphorylation tyrosine de l'ensemble des protéines cellulaires connues comme étant principalement dépendantes de Syk était normal (Fig. 2B, C). Similairement à I'intracorps G4G11, C-13 a inhibé la phosphorylation et l'activité kinase induite par FccR de Btk (Fig. 2A) et la phosphorylation de PLC-yl et PLC-y2, les deux isoformes de PLC-y exprimés dans les mastocytes (Fig. 2A, C). La PTK Lyn phosphoryle à la fois Syk et Btk menant à leur activation 18 complète et à la phosphorylation subséquente de PLC-y . Etant donné que C-13 n'a pas affecté l'activation de Lyn FccRI-dépendante (Fig. 2A), il peut être conclut que la réduction du niveau de phosphorylation de Btk et PLC-y pourrait être due à un défaut par rapport à leur localisation correcte au voisinage des PTK amont. 3) Analyse des cascades de signalisation dépendantes de Fyn et Lyn Dans les mastocytes, la cascade de signalisation Fyn/Gab2/P13K conduit à l'activation de PI3K et à la génération de PI-3,4,5-P3 qui recrute un certain nombre de protéines contenant un domaine 19 d'homologie de la pleckstrine (PH), incluant Btk et PLC-y au niveau de la membrane plasmique . L'analyse de la phosphorylation d'Akt, un marqueur de l'activité PI3K, a indiqué que C-13 n'affectait pas la cascade dépendante de Fyn (Fig. 2B, C), suggérant que le niveau de phosphorylation réduit de Btk et PLC-y n'était pas du à un défaut au niveau de leur localisation membranaire, connue comme étant un facteur essentiel pour l'augmentation des flux de calcium . Le recrutement de Btk et PLC-y au niveau de la membrane requiert également la cascade de signalisation canonique Lyn/Syk/LAT/SLP-76. La phosphorylation de LAT par Syk condu t à la 21 20 translocation de SLF'-76 vers le complexe organisé par LAT , où SLP-76 se co-localise avec Syk 22 23 . Cette localisation permet à Syk de phosphoryler des tyrosines N-terminales de SLP-76 qui deviennent des sites de liaison pour Vav, Nck et Btk. LAT et SLP-76 (au travers de son domaine riche en proline recrutant PLC-y) coopèrent pour localiser PLC-y au niveau de ce complexe 24 25 membranaire, permettant la phosphorylation et l'activation de PLC-y par Btk et/ou Syk . L'utilisation d'anticorps phospho-spécifiques a montré que C-13 inhibe la phosphorylation de SLP-76, niais accroît la phosphorylation de LAT de manière dose-dépendante (Fig. 2A). Les inventeurs ont émis l'hypothèse selon laquelle l'inhibition de la phosphorylation de SLP-76 pourrait permette à une plus grande quantité de LAT d'interagir avec Syk, causant ainsi une augmentation de son niveau de phosphorylation. Ces résultats démontrent que la réduction de la phosphorylation de SLP-76 n'était pas due à un défaut au niveau de son recrutement vers LAT, et a résulté en un défaut de la co-localisation de Btk et dans une moindre mesure de celle de Vav avec SLP-76 (Fig. 2A). Néanmoins, la phosphorylation de Vav connu comme étant indépendante de son recrutement 26 vers SLP-76 n'a pas été inhibée (Fig. 2A). 4) Activation de MAPK -23 - L'association de SLP-76 avec Vav et/ou Nck contribue à une activation optimale des MAP kinases 27 dans les mastocytes . Les inventeurs ont mis en évidence le fait que C-13 affecte légèrement l'activation des MAP kinases (évaluée au travers de leur niveau de phosphorylation) : une forte concentration de C-13 diminue le niveau de phosphorylation de ERK1/2, tandis que les niveaux de phosphorylation de p38 et JNK restent normaux (Fig. 2B, C). 5) Flux de calcium et dégranulation La liaison de Btk et Vav à SLP-76 est critique pour la régulation de l'activité de PLC-y au niveau de 27, 28 la membrane, la mobilisation du calcium et l'exocytose des granules . Les inventeurs ont mis en évidence le fait que l'association de PLC-y avec LAT était inhibée par C-13 de façon dose- dépendante (Fig. 2A). De façon cohérente avec le défaut au niveau de la phosphorylation de PLC-yl et PLC-y2, les mastocytes ont montré une amplitude du flux de calcium réduite en réporse à la liaison de FcERI (Fig. 3A), et les réponses allergiques précoce et tardive induite par FcERI dans des cellules BMMC (� bone marrow derived mast cell �) et dans la lignées cellulaire RBL-2H3 sont également affaiblies de façon dose-dépendante, basée sur la mesure de la libération de (3- hexosaminidase et la sécrétion de TNF-a (Fig. 3B, C, D). Les résultats ont également montré que C-13 n'a pas d'effet toxique sur les mastocytes. En effet, ni la dégranulation induite par ionornycine (fig. 3B), ni la viabilité des cellules BMMC (voir figure 10) n'ont été affectées de façon détectable par le traitement avec C-13. De plus, les défauts observés au niveau de l'activation des mastocytes ne sont pas dus à un niveau réduit d'expression de surface de FcERI, l'analyse par cytométrie de flux ayant indiqué que les cellules incubées avec C-13 expriment des niveaux de FcERI similaires à ceux des cellules contrôles (Fig. 3E). 6) Anaphylaxie passive systémique (PSA) et cutanée (PCA) Pour finir, pour étendre ces observations sur les fonctions des mastocytes in vivo, les inventeurs ont testé les effets de C-13 sur l'anaphylaxie passive systémique (PSA) et cutanée (PCA) induite chez des souris BALB/c par l'administration de molécules IgE DNP-spécifiques suivi d'une stimulation intraveineuse avec l'haptène DNP-KLH. Cela mime l'anaphylaxie systémique comme démontré par les changements immédiats au niveau cardio-pulmonaire et l'augmentation de la perméabilité vasculaire. L'intensité de l'anaphylaxie systémique a été déterminée par la mesure à la fois de la baisse de la température corporelle et de l'augmentation de la perméabilité vasculaire suivant l'administration de l'antigène. Après l'administration orale de C-13 (et avant la stimulation avec l'antigène), les animaux sont apparus sains avec aucun signe manifeste de toxicité. L'administration d'une dose orale unique de 100 mg/kg de C-13 a inhibé l'hypothermie et accéléré le rétablissement des animaux (Fig. 4A). A partir de la quantification de l'extravasation di. bleu d'Evans, il a été déterminé que C-13 inhibe l'augmentation de la perméabilité vasculaire avec une CI50 estimée à 110 mg/kg (Fig. 4B et 4C). C-13 a également montré un effet inhibiteur sur la PCA avec une CI50 estimée à 25 pM (Fig. 4D). -24- Exemple 2 ù Identification à partir de la poche de liaison de C-13 d'autres inhibiteurs potentiels de la dégranulation des mastocytes. En partant de la poche de liaison identifiée dans l'exemple 1-1), un crible par � docking � virtuel a été conduit sur un ensemble de 350000 molécules présentes dans la chimiothèque de ChemBridge Corporation (San Diego, USA) afin d'identifier les 1000 molécules présentant les meilleures propriétés de liaison dans cette poche. Le procédé ADA a ensuite été appliqué à chacune de ces 1000 molécules pour mesurer leur capacité d'inhibition de la liaison du scFv G4G11 avec Syk. Les 87 molécules présentant le 10 meilleur taux d'inhibition (entre 11 et 86,5 %) sont présentées dans le tableau 1. Ces 87 molécules ont également été testées in vitro pour évaluer leur capacité à inhiber la dégranulation de cellules RBL-2H3 (voir tableau 1). Les deux molécules présentant le meilleur potentiel (molécules N° 59 et 61) ont été testées à différentes concentrations sur des cellules RBL-2H3 afin d'évaluer plus finement la concentration inhibant de 50% in vitro la dégranulation (voir 15 figure 6). Tableau 1 : C-13 et les 87 molécules identifiées à partir de C-13 et du fraqment d'anticorps G4G11 - Ref CB : Référence ChemBridge ; - Rang : rang de chaque molécule sur la liste des 1000 meilleures molécules après c'ocking in silico ; 20 Inhib. ln vit.: % moyen d'inhibition obtenu avec chaque molécule pour le déplacement de la liaison du scFv G4G11 avec Syk in vitro dans le procédé ADA; C150 dégran. : concentration inhibant de 50% la dégranulation des mastocytes ; N° : numéro attribué par les inventeurs ; Gp : groupes auxquels appartiennent les molécules. -25- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° Gp ln vit. degran. O' J 6197026 méthyl 2-{5- 81% 1 pgIm I C- - 023 H17 N 04 S2 [(3-benzyl-4- 13 oxo-2- thioxo-1,3- thiazolidin- 5-ylidene) méthyl]-2- furyl} benzoate rJ . 6752784 4-(4-chloro 611 86,5 >10pg/ml 1 (I) benzoyl)-3- hydroxy-5- (3-phénoxy phényl)-1-(3- pyridinyl méthyl)-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one C29 H21 CI N2 04 eI 6670340 5-(2,4- 792 81 >10pg/ml 2 (I) `N diméthoxy }~ phényl)-3- e hydroxy-1-[3- ~. (1H- imidazol-1- yl)propyl]-4- (2-thiényl carbonyl)- 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- one C23 H23 N3 05 S / N I Q caca, 6422575 acide {4- 706 81 >10pg/ml 3 C24 H20 Br N 06 sa, bromo-2-[3 (éthoxy carbonyl)-2- méthyl-5- oxo-4, 5- dihydro-1 H- indéno[1,2- b]pyridin-4- yl]phénoxy} acétique -26- Structure Ref. CI3 Nom Rang In .. I deragran. N, ('P In v v itit ÇT) _ 3-hydroxy-5- J (3-méthoxy "' : phényl)-4-(4- méthyl benzoyl)-1- [3-(4- C26 H80 N2 05 6882059 morpholinyl) 243 79,5 >10pg/ml 4 ;I) propyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one tic H H 4-benzoyl-5- (2,5- diméthoxy phényl)-3- hydroxy-1-[3- (1H- H,~-° imidazol-1- yI)propyl]- 7111786 1,5-dihydro- 557 77,5 >10pg/ml 5 (1) 2H-pyrrol-2- one C25 H25 N3 05 o éthyl 4-[3- ° GH3 benzoyl-2- " (2,4 ° ° diméthoxy cH phényl)-4- H,c- o hydroxy-5- oxo-2,5- C28 H25 N 07 6203863 dihydro-1 H- 423 73,5 >10pg/ml 6 (I) pyrrol-1-yl] benzoate ° 4-(2,5- ° . H3G H° diméthyl benzoyl)-3- H hydroxy-5- c'`' (2-méthoxy phényl)-1-[2- ° (4- morpholinyl) 775 72 >10pg/ml 7 (1) éthyl]-1,5- dihydro-2H- C26 H30 N2 05 7347627 pyrrol-2-one -27- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° In vit. degran. Gp / ° 7489416 5-(3-bromo- 648 71 >10pg/ml 8 (I i 4-hydroxy-5- méthoxy phényl)-3- hydroxy-1- (2- phényléthyl)- 4-(2-thiényl carbonyl)- 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- one C24 H20 Br N 05 S E•a 4-(4-fluoro 3 hydr oylydo ) --5- a hénylnoxy p hényl)-1-(3- pyridinyl méthyl)-1,5- dihydro-2H- C29 H21 F N2 04 6719738 pyrrol-2-one 977 71 >10pg/ml 9 (I) éthyl2-[3-(4- "O~ 0 fluorobenzoy 1)-4-hydroxy- F 2-(4-méthyl tio phényl)-5- oxo-2,5- dihydro-1 H- pyrrol-1-yl]- 4-méthyl-1,3- thiazole-5- C25 H21 F N2 05 S 6650234 carboxylate 946 71 --10pg/ml 10 (I) H3C rl HO p ~.~ 1/ ~~ 5-(2,5- diméthoxy o CH, phényl)-3- hydroxy-4- (4-méthyl H C,.0 benzoyl)-1- (3-pyridinyl méthyl)-1,5- dihydro-2H- C26 H24 N2 05 6652639 pyrrol-2-one 829 70,5 >10pg/ml 11 (I) -28- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 In vit. degran. G N / éthyl 2-[3- " benzoyl-4- hydroxy-2- ,' (4-méthoxy phényl)-5- oxo-2, 5- dihydro-1 H- ``'` pyrrol-1-yl]- C25 H22 N2 06 S 6673225 4-méthyl-1,3- 301 69 >10pg/ml 12 (l) thiazole-5- carboxylate a. i 3-[2-(2,4- ti diméthoxy phényl)-2- oxoéthyl]-3- C29 H25 N 05 6800873 hydroxy-1- 250 67,5 >10pg/ml 13 (1-naphthyl méthyl)-1,3- dihydro-2H- Widal-2-one 0 ° 3-hydroxy-4- (4-méthoxy- 2-méthyl ° benzoyl)-1- [2-(4- ° J morpholinyl) C24 H27 Ni,. 05 6879058 éthyl]-5-(3- 758 67,5 >10pg/ml 14 (I) pyridinyl)- 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- one rlû, 2-méthoxy- _ N-(4-{4- j méthyl-5-[(2- oxo-2- C25 H22 Ni 03 S 6282824 phényléthyl) 905 67,5 >10pg/ml 15 (II) thio]-4H- 1,2,4-triazol- 3-yl}phényl) benzamide -29- Structure Ref. CB Nom Rang In .. degran. N° Gp In v v itit O t10 C24 H20 N2 05 "y 6750319 méthyl2-[3- 850 67 >10pg/ml 16 (II ~ benzoyl-4- ~, hydroxy-2- S (4-méthyl phényl)-5- oxo-2,5- dihydro-1 H- pyrrol-1-yl]- 4-méthyl-1,3- thiazole-5- carboxylate C28 H32 N2 02 6474819 4-[(4-benzyl- 954 63 >10pg/ml 17 - 1-pipéridinyl) méthyl]-N-(2- méthoxy-5- méthylphényl ) benzamide 0 Î R 4-{[N-[(4- ~ ~ méthoxy phényl) i sulfonyl]-N- i C24 H25 N3 05 S 6498669 (2-phényl 808 63 >10pg/ml 18 (III) éthyl)glycyl] amino} benzamide --(1 `n .~ 4-(4-fluoro :. 1 benzoyl)-3- hydro (4-isoprop propyl phényl)-1-[3- (4- 6651552 morpholinyl) 100 60 >10pg/ml 19 (I) oropyl]-1, 5- dihydro-2H- pyrrol-2-one C27 H31 F N2 O4 -30- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° '3P ln vit. degran. H,e 6453860 N,N'-1,5- 145 60 >10pg/ml 20 - C28 H26 N2 04 naphthalène diylbis[2-(3- méthyl phénoxy) acétamide] i O F i7 N-[4-({[4- o 6853966 (acétyl 11 58 >10pg/ml 21 ~~ °ÿ amino) o" f phényl] H sulfonyl} C23 H23 N3 06 S amino)-2,5- diméthoxy phényl] benzamide iitc o FIio CiL 7,7-diméthyl- o 1-(4-méthyl phényl)-2,5- dioxo-N- (2,2,6,6- tetraméthyl- 4- pipéridinyl)- 1,2,5,6,7,8- C28 H37 N3 03 6866968 hexahydro-3- 255 57,5 >10pg/ml 22 _ quinoline carboxamide 1 ~ C25 H23 N3 03 S 7938324 acide 4- 795 57 >10pg/ml 23 (benzyl{[1- phényl-3-(2- thiényl)-1 H- pyrazol-4- yl]méthyl} amino)-4-oxo butanoïque -31- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° Gp ln vit. degran. 4-(4-fluoro benzoyl)-3- hYdroxY-5- (3-méthoxy phényl)-1-[3- (4- C25 H27 F N2 05 6905988 morpholinyl) 843 57 >10pg/ml 24 (I) propylj-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one M' 4-(4-chloro 1 benzoyl)-3- hydroxy-1-[3- (4- 1 morpholinyl) 'j %t (3,4,5- ~;~ triméthoxy Hy~ phényl)-1,5- 249 56,5 >10pg/ml 25 (I) C27 H31 Cl N2 07 dihydro-2H- 6885782 pyrrol-2-one rfj~ 4-benzoyl-3- hydroxy-5- (4-isopropyl phényl)-1-[2- (4- C26 H30 N2 04 6663684 morpholinyl) 530 56,5 >10pg/ml 26 (I) éthyl]-1,5- dihydro-2 H- pyrrol-2-one \ 4-(4-chloro benzoyl)-5- (3,4- o "\ diméthoxy / phényl)-3- hydroxy-1-[2- (4- H,o 6672500 morpholinyl) 194 55 >10pg/ml 27 (I) C25 H27 Cl N2 06 éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one -32- Structure Ref. CE3 Nom Rang In .. I deragran. N° Gp In v vitit G", o 0 0 7721949 1-[2-(diéthyl 139 54 >10pg/ml 28 (I) F~ / amino)éthyl]- 026 H32 N2 05 tom' 5-(2, 5- diméthoxy phényl)-3- hydroxy-4- (4-méthyl benzoyl)-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ~,ly ~ù ,ri 7966545 2-fluoro-N- 773 53,5 -10pg/ml 29 N--, [(5-{[(4-oxo- 3,4-dihydro- 2- quinazolinyl) méthyl]thio}- 4-phényl-4H- 1,2,4-triazol- 3-yl)méthyl] benzamide C25 H19 F N6 02 S ;, ü i 7437580 2-{[4-(1,3- 222 51 >10pg/ml 30 [P N dioxo-1,3- M dihydro-2H- isoindol-2- yl)butanoyl] amino}-N- (tetrahydro- 2-furanyl méthyl)-5,6- dihydro-4H- cyclopenta[b] thiophène-3- carboxamide C25 H27 N3 05 S ` 1 •-~ 6654239 5-(3,4- 343 50 >10pg/ml 31 ;I) N diméthoxy phényl)-4-(4- fluoro benzoyl)-3- hydroxy-1-[2- (4- morpholinyl) éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one 025 H27 F N2 06 -33- Structure Ref. CE3 Nom Rang inhib. 1050 Na Cep ln vit. degran. 4-({4- " hyd roxy-1-[2- (4- f é F, f 6670570 morpholinyl) 926 50 >10pg/mI 32 (1) Hl°ù i éthyl]-5-oxo- oe-s 2-phényl-2,5- ° h dihydro-1 H- 025 H29 N3 06 S pyrrol-3-yl} carbonyl)- N,N-diméthyl benzène sulfonamide 5-(2,4- ° diméthoxy °'~phényl)-4-(4- ° fluorobenzoy I)-3-hydroxy- 1-[2-(4- )' morpholinyl) C25 H27 F N2 06 6670673 éthyl]-1,5- 742 50 >10pg/ml 33 (I) dihydro-2H- pyrrol-2-one f °fI 3-hydroxy-5- H,° (4-méthoxy phényl)-4-(4- méthyl benzoyl)-1- [244- 'ç 6670747 morpholinyl) 413 50 >10pg/ml 34 (I) C25 H26 N2 05 éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ° (3,4- a diméthoxy ° phényl)-4-(2- furoyl)-3- hydroxy-1-[2- ce. (4- 1 morpholinyl) ~4 éthyl]-1,5- C23 H26 N2 O7 dihydro-2H- 50 >10pg/ml 35 (I) 6671401 pyrrol-2-one 954 -34- Structure Ref. CE3 Nom Rang inhib. . I deragran. N° Gp ln vit ° 4-(4-chloro benzoyl)-5- " (3,4- a / diméthoxy -- _-° phényl)-3- ° hydroxy-1-[2- ca (4- / morpholinyl) éthylj-1,5- dihydro-2H- C25 H27 CI N2 06 6672500 pyrrol-2-one 194 50 >10pg/mI 36 (1) aiJ ° éthyl2-[3- W0~ ,~ w 5 benzoyl-4- i (4-mét ox phényl)-5- oxo-2,5- dihydro-1 H- pyrrol-1-yl]- 4-méthyl-1,3- thiazole-5- C25 H22 N2 06 S 6673225 carboxylate 124 50 >10pg/mf 37 (f;_ -\° 5-(3,4- "\, diméthoxy phényl)-3- hydroxy-1-[2- (4- ° morpholinyl) N,c éthyl]-4-(2- thiényl carbonyi)- 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- C23 H26 N2 p6 S 6677533 one 409 50 >10pg/ml 38 (f) rte° 4-(4-chloro benzoyl)-3- _, hydroxy-5- (4-méthoxy ° phényl)-1-[2- i (morpholinyl) ° éthyl]-1,5- dihydro-2H- C24 H25 CI N2 05 6683618 pyrrol-2-one 808 50 >10pg/mf 39 (1) -35- Structure Ref. CB Nom Rang inh vit. IC50 N° G p In vit. degran. C27 H31 N3 5r 6417902 N-[2-(4- 897 49,5 >10pg/ml 40 (III) ° benzyl-1- 03 S piperazinyl)- 2-oxoéthyl]- N-(3,5- diméthyl phényl) benzène sulfonamide Ci 1d,- °-mé I thyl-2- °-r (4-méthyl phényl)-2- oxoéthyl 2- (3-chloro-4- • ~-, méthyl phényl)-1,3- C26 H20 CI N 05 6437157 dioxo-5- 871 49,5 >10pg/ml 41 - isoindoline carboxylate He CH3 H o Nù2--[(3,4- N Î diméthoxy s` o o phényl) ti, sulfonyl]- N--1--(2- méthoxy-5- méthylphényl )-Nù2---(4- C25 H28 N2 06 S 6465972 méthylphényl 926 49 >10pg/ml 42 (III) )glycinamide 5-(2,5- H diméthoxy 'Q phényl)-4-(4- -- `-N / fluoro benzoyl)-3- � � c hydroxy-1-[3- (4- C26 H29 F N2 06 7723671 morpholinyl) 34 j 48,5 >10pg/ml 43 (I) propyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one -36- Structure Ref. CI3 Nom Rang inhib. IC50 N° 0P In vit. degran. 00 6648363 4-(4- 465 48,5 >10pg/ml 44 ( ) o chlorobenzo = yl)-5-(2- a f ~> -3-hydrxyox 1 -hydy- C24 H24 Ci F N2 04 1-[3-(4- morpholinyl) propyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one F 6656195 4-(4-fluoro 613 48,5 >10pg/ml 45 i C26 H29 F N2 04 benzoyl)-3- (h hydroxy-5- (4-isopropyl phényl)-1-[2- (4- morpholinyl) éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one } o N, 7778331 4-{[2-(4- 998 48 >10pg/ml 46 _ Ij morpholinyl) C23 H39 N4 05 S éthyl]amino}- 3-(4- morpholinyl sulfonyl)-N- phénylbenza mide ä 6994060 2-chloro-N- 623 47,5 >10pg/ml 47 (II) _ NûN {4-[4-méthyl- / N 1 5-({2-oxo-2- ,l f ä- ch: [(tetrahydro- C23 HP4 Cl N5 03 S 2-furanyl méthyl) amino] éthyl}thio)- 4H-1,2,4- triazol-3-yl] phényl} benzamide -37- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 Na Gp In vit. degran. N-[2-(4- i,° benzyl-1- ~.° ° piperazinyl)- / ° yl]- 2- 4- N-(3(3,4 C28 H33 N3 03 S 6458830 diméthyl 837 47 >10pg/ml 48 (III) phényl)-4- méthyl benzène sulfonamide roc ais ° acide 2-[(4- {[(4-isopropyl phénoxy) acétyl]amino }-3-méthyl C26 H26 N2 05 7524107 benzoyl) 789 46,5 -10pg/ml 49 amino] benzoïque Hàc 4-({2-(3,4- ° dichloro phényl)-1-[3- im,c ,wf` (diméthyl amino)propyl 1t ]-4-hydroxy- 5-oxo-2,5- C24 H27 Cl2 N3 05 S 6661524 dihydro-1 H- 428 46,5 >10pg/ml 50 (I) pyrrol-3-yl} carbonyl)- N,N-diméthyl benzène sulfonamide 4-(1,3- i~` benzodioxol- 5-yl / tt carbonyl)-1- [3-(diéthyl ° amino)propyl ]-3-hydroxy- 5-(3- C24 H27 N3 05 7739436 pyridinyl)- 976 46 >10pg/ml 51 (I) 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- one -38- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° Gp In vit. degran. o r, 67 6881804 1-[2- 230 46 >10pg/ml 52 (I) 1 (diméthyl ~+~° / amino)éthyl]- ° 3-hydroxy-4- H,o (5-méthyl-2- C23 H28 N2 07 furoyl)-5- (3,4,5- triméthoxy phényl)-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ~c H4 3-hydroxy-5- (3-méthoxy I ti phényl)-4-(5- H,c (, )--o méthyl-2- furoyl)-1-[2- (4 C23 H26 N2 06 6907921 morpholinyl) 609 45,5 >10pg/ml 53 (I) éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one éthyl4- ({[(5,6-di-2- C22 H18 N4 05 S 7495334 furyl-1,2,4- 380 43 -5pg/ml 54 triazin-3- yl)thio]acétyl} amino) benzoate weh I I N 7509862 éthyl 5- 170 42,5 -5pg/ml 55 ;e cyano-4-(2- C28 H25 N3 05 S furyl)-6-({2- [(3-méthoxy phényl) amino]-2- oxoéthyl} thio)-2- phényl-1,4- dihydro-3- pyridine carboxylate -3 9- Structure Ref. CE3 Nom Rang inh vit. IC50 N° Gp In vit. degran. • 5-(2,3- diméthoxy phényl)-4- K (2,5-diméthyl o,-cHâ benzoyl)-3- \ hydroxy-1-[3- . -0 morpholinyl) propyl]-1,5- dihydro-2H- C28 H34 N2 06 7325385 pyrrol-2-one 65 42 -10pg/ml 56 (I~ (J 3-(6-amino- o 5-cyano-3- v phényl-1,4- N I dihydro HN' t7 NH; pyrano[2,3- c]pyrazol-4- yl)phényl 2- C24 H16 N4 04 6669449 furoate 140 42 >10pg/ml ' 57 1,4-bis [(mésityloxy) acétyl] C26 H34 N2 04 7348779 pipérazine 209 40 -10pg/ml 58 N-(4-chloro ~y phényl)-2- \ ry {[4-(2- /~ phényl éthyl)-5- (3'4'5 triméthoxy phényl)-4H- 1,2,4-triazol- 3-yI]thio} C27 H27 Cl N4 04 S 1 7501888 acétamide 544 40 -2pg/ml 59 -40- Structure Ref. CAB Nom Rang inh vit. IC50 N` Gp In vit. degran. 0 C26 -'" I 6946138 acide ([3- 298 40 >10pg/ml 60 H20 06 (éthoxy carbonyl)-2- phényl-1- benzofuran- 5-yl]oxy} (phényl) acétique C26 H23 CI N4 04 S 7722851 (4-chloro 638 39,5 --2pg/ml 61 (IV) phényl)-5- oxo-3-(3- pyridinyl méthyl)-2- ' thioxo-4- imidazolidin yI]acétyl} amino) benzoate C26 H24 N2 07 7517583 5,5'-oxybis 912 38,5 >10pg/ml 62 [2-(tétra hydro-2- furanyl méthyl)-1 H- isoindole- 1,3(2H)- dione] {, ~` 6634701 7-acétyl-6-[3- 934 38,5 -5pg/ml 63 ,~ N4 03 S (benzyloxy) phényl]-3- (méthylthio)- 6,7-dihydro [1,2,4] triazino[5,6- d][3,1] benzoxazepi ne C26 H22 -41- Structure Ref. CE3 Nom Rang Inhib. IC50 N° Gp In vit. degran. N`'N 7726450 3-hydroxy-1- 472 37,5 >10pg/ml 64 (I) ° f \r [3-(1 H- Czs H22 Na 0s imidazol-1- yI)propyl]-4- [(7-méthoxy- benzofuran- 2-yl) carbonyl]-5- (2-pyridinyl)- 1,5-dihydro- 2 H-pyrrol-2- one ° 4-{[4- l hydroxy-1-[3- ~~ j (4- N morpholinyl) propyl]-5- o pyridinyl)- ° %N 2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-3- ° yl]carbonyl}- C25 H30 N4 06 S 6662088 N,N-diméthyl 156 37 >10pg/ml 65 (I) benzène sulfonamide i N-{1-[4-allyl- o 5-({2-[(3- te, méthoxy phényl) amino]-2- oxoéthyl} C23 H25 N5 03 S 775219.3 thio)-4H- 248 35 -5pg/ml 66 i_- 1,2,4-triazol- 3-yl]éthyl} benzamide N-(2- J \ hydroxy-1,1- diméthyléthyl )-5-{4-[(3- ;. xy hydrophényl) (benzène amino]-1- phthalazinyl} -2-méthyl C25 H26 Na 04 S _7238569 1 sulfonamide 749 32 >10pg/ml 67 -42- Structure Ref. CB Nom Rang in it. IC50 N° GP . degran. ln vit. vit ° 0 7724000 4-(1, 3- 303 30 -10pg/ml 68 (I) " benzodioxol- ° 5- C25 H25 F N2 06 ylcarbonyl)- 5-(2- fluorophényl) -3-hydroxy- 1-[3-(4- morpholinyl) propyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ? 7443270 N-(2,4- 895 30 -5pg/mI 69 ~ diméthoxyph *H 4 ényl)-2-{[3- i (2- °~ furylméthyl)- C23 H21 N3 05 S 4-oxo-3,4- dihydro-2- quinazolinyl] thio} acétamide ",c ., oùcH, "méthyl-3- hydroxy-7- 608 30 >10pg/ml 70 a,c 7245019 quinolinyl) "méthyl]-3- méthoxy-N- (2-méthoxy phényl) benzamide ,/.•~, H24 N_: 04 _C26 / \ o\ 6909597 4-(4- 790 29 >10pg/ml 71 ( ) -- i, chlorobenzo yl)-3- hydroxy-5- (3-méthoxy phényl)-1-[2- (4- morpholinyl) éthyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ° H° / \ C24 H25 CI N2 05 -43- Structure Ref. CB Nom Rang inhib. IC50 N° Gp In vit. degran. 3T ~3 --- 2-(4-méthoxy phénoxy)-N- [2-méthyl-5- C26 H25 N3 04 7661882 (3-méthyl-4- 941 28 -10pg/ml 72 __ oxo-3,4- dihydro-1- phthalazinyl) benzyl] acétamide N-{4-[({[4-(4- C25 H26 N2 05 7667791 méthoxy 797 28 >10pg/ml 73 __ phényl) tétrahydro- 2H-pyran-4- yl] méthyl} amino) carbonyl] phényl}-2- furamide w 4-benzoyl-5- (2,3- `i° diméthoxy w 1 0~.°~ phényl)-3- C26 H30 N2 06 6891745 (4- roxy-1-[3- 115 27,5 >10pg/ml 74 (I' morpholinyl) propyl]-1,5- dihydro-2H- pyrrol-2-one ~. isopropyl3- .,f' ' ({[(4-allyl-5- {[(3-méthyl C26 H29 N5 04 S 7783660 benzoyl) 266 27 -5pg/mI 75 (II) amino] méthyl}-4H- 1,2,4-triazol- 3-yl) thio]acétyl} amino) benzoate -44- Structure Ref. CE3 Nom Rang inhib. IC50 N° Gp ln vit. degran. t/ 0 N 2-{5-[1-(4- o N~ /N ~--.. morpholinyl) NH cyclohexyl]- 1 H-tétrazol- C24 H30 NS 03 7653478 1-yI}éthyl 1- 365 27 >10pg/ml 76 naphthyl carbamate h méth I4- ,- r G ({[3-(1,3- _C27 H23 N3 07 7723330 benzodioxol- 965 26 >10pg/ml 77 (IV) 5-ylméthyl)- 2,5-dioxo-1- phényl-4- imidazol idinyl]acétyl} amino) benzoate I 4-(3,4- ''Ç': ° dihydro- aw 2(1H)- isoquinolinyl méthyl)-N-[2- (1- C28 H29 N3 02 7199725 pyrrolidinyl 987 25 >10pg/ml 78 carbonyl) phényl] benzamide 6 N a 9-{3-chl thyl 4-[(4-méthy benzyl)oxy] NyC phényl}-10- éthyl- 3,4,6,7,9,10- hexahydro- 1,8(2H,5H)- C29 H30 CI N 03 6987235 acridine 680 25 >10pg/ml 79 dione -45- Structure Ref. CB Nom Rang inhib .. I deragran. N° In vit Gp e 7140931 éthyl 1-(4- 14 24,5 >10pg/ml 80 ,te . {[(3,4- C25 H32 N2 05 S diméthyl phényl) (méthyl sulfonyl) amino] méthyl} benzoyl)-4- piperidine carboxylate H,C !~ !1 y~o 7787455 méthyl 4-{[N- 407 20 >10pg/ml 81 (III; C23 o s` o +,C' (3-méthoxy H22 ~ phényl)-N- N2 06 S (phényl sulfonyl) glycyl] amino} benzoate ùO'e N-{[5-({2-[(4- Ç-:"\ bromo-2,3- N-- diméthyl phényl) amino]-2- IÎ ~/ oxoéthyl} thio)-4-éthyl- 4H-1,2,4- C22 H23 Br Cl N5 02 S 7660465 triazol-3- 881 20 -7pg/ml 82 (II) yl]méthyl}-4- chloro benzamide 4-(2,3- Q~ dihydro-1,4- benzodioxin- 6-yl carbonyl)-3- hyd roxy-1-[3- (4- 1 `•.~° morpholinyl) propyl]-5-(4- pyridinyl)- C25 H27 N3 06 7661751 1,5-dihydro- 951 19 -10pg/ml 83 (I) 2H-pyrrol-2- one -46- Structure Ref. CES Nom Rang In it.. I dera gra n. N° Gp vit In vit.. ~,.~.~ } 7722914 N-(4-ethoxy 806 19 -7pg/ml 84 (IV) phényl)-2-{1- (4-méthoxy phényl)-3-[2- (4- morpholinyl) éthyl]-5-oxo- 2-thioxo-4- imidazol idinyl}acétam ide C26 H32 N4 05 S Hs`äQ o - 774504G 5-(3-bromo 313 18 -10pg/ml 85 (I 1 phényl)-3- -r' hydroxy-4- Ho [(7-méthoxy- :,- 1-benzo ~-~ furan-2-yl) N2 06 carbonyl]-1- [2-(4- morpholinyl) éthyl]-1,5- dihydro-2 H- pyrrol-2-one C26 H25 Br ° /'°'= 7735385 1-[3-(diéthyl 21 17 -10pg/ml 86 (I; ° ° amino)propyl C26 H29 N3 05 ]-3-hydroxy- éthoxy-1- mét benzofuran- 2-yI) carbonyl]-5- (2-pyridinyl)- 1,5-dihydro- 2H-pyrrol-2- one ~` 1-(4-{[(4,6- 361 11 -5pg/mI 87 diméthyl-2- pyrimidinyl) thio]acétyl}- C27 H28 N6 0 S 7756003) 1- piperazinyl)- 4-(4-méthyl phényl) phthalazine Exemple 3 û Matériels et méthodes. 1) Produits chimiques et anticorps. Une banque chimique de 3000 molécules (un sous-ensemble varié) a été acquise auprès de ChemBridge, Inc. (San Diego, CA). Des stocks de solutions de petites molécules ont été préparés à raison de 10 mM dans du DMSO (diméthylsulfoxyde), sauf pour C-13 (méthyl 2-{5-[(3-benzyl-4-oxo-2-thioxo-1,3-thiazolidin-5-ylidène)méthyl]-2-furyl} benzoate, ChernBridge numéro ID 6197026) préparé dans du DMF (dirnéthylformamide). Sauf indication contraire, tous les réactifs proviennent de Sigma. L'haptène dinitrophényl (DNP) a été acquis auprès de Calbiochem. La Sépharose GammaBind G et tous les anticorps secondaires proviennent de GE Health Amersham Biosciences. Les anticorps anti-Syk, anti-Lyn, anti-Btk, anti-PLC-yl, anti-PLC-y2, anti-LAT, anti-SLP-76, anti-p38, anti-JNK, anti-Vav, anti-Aktl et 9E10 conjugé à HRP ont été acquis auprès de Santa Cruz Biotechnology. Les anticorps anti-phospho-p44/42 MAP Kinase, anti-p44/42 MAP Kinase, anti-phospho-p38, antiphospho-JNK, anti-phospho-Aktl ont été acquis auprès de Cell Signaling. Les anticorps antiphospho-LAT et anti-phospho-PLC-y1 proviennent de Biosource et les anticorps anti-phospho- SLP-76 de BD Pharmingen. L'anticorps monoclonal 4G10 anti-phosphotyrosine a été acquis auprès de Upstate Eliotechnology. 2) Procédé ADA : test de criblage de molécules à haut débit de type ELISA, basé sur le déplacement d'un anticorps (WO 2005106481). La protéine de fusion GST:Syk 6-242 8 recombinante comprenant les résidus 6 à 242 de la protéine tyrosine kinase Syk murine illustrée 20 à la figure 8B (SEQ ID N°4) a été immobilisée sur une plaque ELISA à une concentration finale de -1 10 pg ml . Pour le criblage de la banque de molécules chimiques, les petites molécules, diluées dans du PBS à une concentration finale de 10 pM ont été ajoutées dans les puits pendant une heure à température ambiante, avant ajout du fragment scFv G4G11 à une concentration finale de 100 nM pour une heure supplémentaire. La liaison de G4G11 à Syk a été évaluée en ajoutant 25 l'anticorps monoclonal 9E10 conjugué à HRP qui détecte la séquence d'acides aminés EQKLISEEDLN de la protéine c-myc humaine localisée à l'extrémité C-terminale du fragment scFv. Pour générer des mutants de Syk, la mutagenèse dirigée a été utilisée sur la protéine GST:Syk 6-242 et la liaison de G4G11 aux mutants a été évaluée en présence de 5 pM de C-13. 3) Cellules, conditions de culture et essais fonctionnels. L'anticorps monoclonal IgE de souris 30 2682-I anti-DNP a été utilisée comme surnageant de culture des hybridomes contenant 1 pg/ml d'IgE. Des cellules de la moelle épinière. fémorale ont été prélevées et cultivées dans un milieu Opti-MEM (Gibco) additionné de 10% de sérum foetal bovin et 4% de surnageant de transfectants X63 secrétant l'IL-3 rnurine. Des cellules basophiles leucémiques de rat RBL-2H3 (ATCC) ont été maintenues en culture monocouche dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum foetal 35 bovin (Gibco). Les mesures de la libération de R-hexosaminidase par les cellules RBL-2H3 ont été ' effectuées comme précédemment décrit , à l'exception du fait qu'après 12-16 h d'incubation avec l'IgE anti-DNP (0,5pg/ml), les cellules ont été incubées 90 min à 37°C dans du milieu RPMI -47- -48- additionné avec les concentrations indiquées de C-13 ou de DMF (0,25%). Les cellules ont été stimulées pendant 45 min avec du DNP-BSA (50 ng ml ) ou de l'ionomycine (1.5 pM). Les cellules BMMC ont été incubées pendant une heure à 37°C avec l'IgE anti-DNP (100ng/ml). Elles ont ensuite été incubées avec C-13 (3 pM', ou du DMF (0,3%) pendant 3 heures à 37°C, et stimulées avec des concentrations variées de DNP-BSA. Le niveau de libération de la R-hexosamiridase a été mesuré 10 min plus tard et la titration de TNF-a a été réalisée par un essai de cytotox cité sur Io des cellules L929 comme précédemment décrit , 3 heures après la stimulation. Les résultats illustrés sur la figure 3 sont représentatii`s de trois expériences indépendantes. 4) Immunoprécipitations, essais kinase in vitro et immunodétection. Toutes les expériences 7 ont été réalisées tel que précédemment décrit , à l'exception du fait qu'avant la stimulation avec le DNP-BSA (50 ng ml , 3 min), les cellules RBL-2H3 ont été incubées pendant 90 min à 37 dans du milieu RPMI additionné avec les concentrations indiquées de C-13 ou DMF. Les cellules ont été solubilisées dans du tampon de lyse modifié DOC (1% NP-40, 0.25% déoxycholate de sodium, 0.1% SDS dans du tampon PBS additionné d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases) et la concentration protéique a été déterminée (Essai Protéine BCA, PIERCE). Pour les immunoprécipitations, des lysats de cellules non stimulées et stimulées avec IgE/DNP ont été incubées avec des complexes préformés d'anticorps et de Sépharose GammaBind G, et l' activité kinase in vitro des irnmunoprécipitats Syk, Btk and Lyn ont a été examinée. Avant la séparation par gel SDS-PAGE, les lysats ou immunoprécipitats ont été préparés par l'addition de tampon d'échantillon SDS (60 mM Tris, pH 6.8, 2.3% SDS, 10% glycérol, 0.01% bleu de bromophénol). Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell), et détectées par des anticorps appropriés et le système de chimioluminescence amélioré (ExactaCruz, Santa Cruz Biotechnology). 5) Analyse par cytométrie de flux du niveau de mobilisation du calcium et de l'expression 25 membranaire de FcERI. La concentration intracellulaire en calcium libre a été déterminée en 6 chargeant au préalable 1x10 cellules avec 5 mM de Fluo-3 AM (Molecular Probes, Invitrogen) en présence de 0.2% de Pluronic F-127 pendant 30 min à température ambiante. Préalablement à la stimulation avec du DNP-BSA ou de l'ionomycine, les cellules ont été traitées pendant 90 min à 37°C dans un milieu RPMI additionné avec C-13 ou DMF (0,25%), et la concentration 30 intracellulaire en calcium libre a été mesurée avec un cytomètre de flux (Beckton Dickinson) Pour l'évaluation de l'expression en surface de FccRl, les cellules ont été incubées pendant 2 h à 37°C avec l'IgE anti-DNP. L'IgE lié à la membrane a été détectée en utilisant des Ig biotinylées antisouris, puis de la streptavidine conjuguée au Fitc. 6) Induction de l'anaphylaxie. Des souris femelles BALB/c (âgées de 6-8 semaines) ont été 35 acquises auprès de Charles River et conservées à l'animalerie de l'IRCM dans des conditions sans germes pathogènes. Les protocoles pour l'anaphylaxie passive systémique (PSA) et l'anaphylaxie -49- 11 passive cutanée (PCA) IgE-dépendantes ont été menés comme précédemment décrit Brièvement, les souris ont reçu par injection intraveineuse 100 big d'IgE (SPE-7, Sigma) dans 200 pl de PBS pour la PSA, ou par injection intradermale 25 ng d'IgE 10 pl de PBS pour la PCA, et ont été stimulées 24h plus tard par injection intraveineuse de 1 mg de DNP-KLH dans 2% Je bleu d'Evans. C-13, une molécule chimique non pertinente ou le véhicule ont été administrées 1 heure avant la stimulation, soit par voie orale (PSA) dans 200 pl de carboxyméthylcellulose à 1%, ou localement au niveau de l'oreille par injection intra-dermale(PCA) dans un mélange d'acétone/huile d'olive (4:1). Les animaux ont été sacrifiés 20 min après la stimulation. Les oreilles ont été prélevées, hachées et le bleu d'Evans a été extrait après incubation une nuit dans du formamide à 80°C. Pour les mesures de températures dans la PSA, C-13 (100mg/kg) ou le véhicule ont été administrés oralement, 3 heures avant la stimulation réalisée en l'absence de bleu d'Evans. La température a été mesurée à l'aide d'un thermomètre électronique avec une sonde rectale (YSI, Yellow Springs, OH) avant la stimulation et durant 60 minutes après, avant le sacrifice. L'absorbance a été mesurée à 610 nm. Les expériences ont été réalisées avec 4-5 souris par condition. Les données illustrées dans la figure 4 sont représentatives de trois expériences différentes. 7) Etudes structurales. Les poches tridimensionnelles susceptibles d'être des cibles 12 13 pharmaceutiques ont été prédites en utilisant Q-SiteFinder et ICM . Le docking de la molécule 14 15 C-13 a été réalisé en utilisant LigandFit et Surflex . Les 20 premières positions ont été analysées et une position consensus est présentée à la Fig. 1A. Les images ont été générées avec PyMol. 8) Péritonite (Fig. 5). Le recrutement péritonéal Syk-dépendant des neutrophiles a été induis: chez 36 des souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines comme décrit dans par injection intraveineuse de 4pg de toxine Bordetella pertuissis (don du Dr D. Raze, Inserm, Lille, France) et 2 heures plus tard par injection intrapéritonéale de 4% de thioglycollate dans de l'eau stérile. Un lavage péritonéal a été réalisé avec 5ml de PBS 4 heures plus tard et le nombre total de neutrophiles a été déterminé après marquage avec anti•-Gr1 conjugué à APC (Becton-Dickinson) et analyse par cytométrie de flux. C-13 (100 mg/kg) dans CMC ou le véhicule seul a été administré oralemert une heure avant l'injection de la toxine Bordetella pertuissis. 9) Purification et prolifération in vitro dies Lymphocytes B. Les lymphocytes B spléniques ont été purifiés à partir de souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines sur des billes magnétiques par sélection négative utilisant des micro billes revêtues de CD43 et des colonnes LS (Miltenyi Bietec) 37 comme précédemment décrit . Après deux heures d'incubation avec des concentrations variables de C-13 ou du véhicule, 50.000 cellules ont été cultivées pendant 48 heures dans des plaquas de 96 puits en présence ou en absence de 10 erg/ml de fragment F(ab')2 d'âne anti-IgM de souris (Jacson Immunoresearch). Du bleu d'Alamar (Serotec) a été ajouté aux cultures 24 avant la -50- mesure des formes réduites versus oxydées du réactif à 570 et 620 nm, conformément aux instructions du fabriquant. 38 10) Production d'anticorps (Fig. 5C). Cette expérience a été réalisée comme décrit dans . Des souris BALB/c femelles âgées de 8 semaines ont reçu une administration orale de C-13 (150 mg/kg) dans 1% CMC ou le véhicule seul, été ont été immunisées 3 heures plus tard par une injection intrapéritonéale de 10 pg de trinitophényl-hémocyanine de patelle (TNP-KLP) dans du Rehydragel alum (Reheiss). Le sérum e été collecté avant immunisation et au jour 12. Les niveaux d'immunoglobulines spécifiques des antigènes ont été mesurés par ELISA avec 10 pg/ml de TNPOVA lié aux plaques (Biosearch technologies) en tant qu'agent de capture. Les niveaux d'IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 et IgA ont été mesurés à partir d'échantillons dilués au 1:5000 en utilisant des anticorps de chèvre conjugués à la péroydase et isotype spécifiques (Southern Biotechnology), tandis que les niveaux d'IgE ont été mesurés à partir d'échantillons dilués au 1:50 en utilisant des anticorps de rat anti-IgE de souris biotinylés (Becton Dickinson) et de la spreptavidine conjuguée à la péroxydase (R&D Systems). Après incubation avec le substrat. TMB, la densité optique (OD) a été mesurée à 450nm. 11) Analyses statistiques. Les données numériques moyennes sont exprimées en tant que moyennes � écarts-types (SD). Le test t de Student a été utilisé pour déterminer la signif cation statistique des différences entre groupes. 12) Test de toxicité de C-13 sur les cellules BMMC. Afin d'évaluer l'éventuel effet toxique de C- 13 sur les mastocytes, les cellules BMMC ont été incubées durant 5 jours à 37°C en préserce de 2.5 pM ou 5 pM de C-13, ou de DMF à 0.25% (correspondant à la concentration de DMF utilisée avec 5 pM de C-13) dans les mêmes conditions que pour les tests fonctionnels. Un couble marquage à l'Annexine-V et Iodure de Propidium a permis de mettre en évidence le niveau de viabilité des cellules BMMC après 3 heures et après 5 jours. La viabilité des cellules of E.MMC traitées dans les mêmes conditions avec la Staurosporine a été mesurée dans les mêmes conditions. Références 1. 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Molécule se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'une poche tridimensionnelle comprenant le résidu Arginine situé en position 68 et les deux résidus acide glutamique situés en positions 121 et 155 de la protéine Syk humaine dont la séquence est illustrée par la SEQ ID N°1, et capable d'inhiber d'au moins 10% in vitro la liaison (i) du fragment d'anticorps G4G11 (SEQ ID N°2), ou (ii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins l'un des résidus 65 à 74 de la séquence en acides aminés de la protéine tyrosine kinase Syk humaine représentée par la séquence SEQ ID N°1, ou (iii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine et inhibant d'au moins 10% la liaison du fragment d'anticorps G4G11 avec la protéine tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N°1), à la protéine tyrosine kinase Syk humaine ou à l'une de ses variantes chez l'animal, pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez l'homme ou l'animal, où ladite molécule est la molécule C-13 ayant pour formule ou une molécule organique de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Dalton équivalente sur le plan fonctionnel à la molécule C-13, choisie parmi les molécules ayant l'une des formules suivantes o OH Nù R2 R1 o (1) où R1 est un groupement aromatique substitué ou non, ou un hétérocycle substitué ou non comprenant au moins un atome S, O ou N ; FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles) - 55 - R3-56- R2 est un groupement aromatique substitué ou non, un hétérocycle substitué ou non, une chaîne carbonée saturée ou non, comprenant un groupement amine, une chaîne carbonée saturée ou non comprenant un groupement aromatique substitué ou non ou une chaîne carbonée saturée ou non comprenant un hétérocycle substitué ou non comprenant au moins un atome S, O ou N ; R3 est un groupement phényle, 2-pyridinyle, 3-pyridinyle ou 4-pyridinyle, substitué ou non où n = 0 ou 1 ; n' = 0 ou 1 ; R4 est une chaîne carbonée saturée ou non comprenant 1 à 5 atomes de carbone. substituée ou non par un groupement aromatique ; R5 est un groupement aromatique substitué ou non ou un groupement amine substitué ou non ; R6 est un atome d'hydrogène. un groupement alkoxy, un groupement alkyle ou un halogène R7 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy, un groupement alkyle ou un halogène ; R8 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy, un groupement alkyle ou un halogène ; ou 0 R11 C R12 Iv~ta Il (CH2)m o R10 R13 R14 (III) où - m=O,lou2; FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 10111;2008 Revendications (modifications non visibles) ou- 57 - R9 est un atome d'hydrogène et R10 est un groupement phényle substitué ou non, ou R9 et R10 font partie d'un même hétérocycle substitué ou non, ou R9 et RIO font partie d'un même groupement aromatique substitué ou non; R11 est un atome hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement alkyle ; R12 est un atome hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement alkyle ; R13 est un atome hydrogène ou un groupement alkyle ou alkoxy; R14 est un atome hydrogène ou un groupement alkyle ou alkoxy ; R15 R17 où R16 A est un atome d'oxygène ou de Soufre ; R15 est une chaîne carbonée saturée ou non comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, substituée ou non par un groupement aromatique substitué ou non, par un hétérocycle substitué ou non ou par un groupement amine faisant partie d'un hétérocycle substitué ou non ; R16 est un atome d'hydrogène, un halogène ou un groupement alkoxy ; R17 est un atome d'hydrogène, un groupement alkoxy ou un groupement acétoxy ; CH 3 ou HO ou 3 FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles)- 58 - CH 3 (22) ou ou (23) CH3 OU OU HO (57) OU ou /ùù (63) H3CùS ou ou (60) D 7' -gr''''-'' CH Cl (79) (66) 3 FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 1011112008 Revendications (modifications non visibles)- 59 - ouou (69) CH3 OU OU (21) (46) (67) OU OU CH3 (17) OH (49) OU OU 0ù CH3 (70) (78) FR 08 01959 - N!Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 101112008 Revendications (modifications non visibles)- 60 - (30) ou ou q CH3 H 3 (41) ou ou `Nz, N 3 (54) (55) ou H FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10111/2008 Revendications (modifications non visibles)- 61 - S' `t1 0 N N 0 NH (76) ci ou ou H3C N )Ç_CH3 CH3 (20) ou ou un stéréo-isomère, racémate ou sel pharmacologiquement acceptable de C-13 ou de ladite molécule équivalente. 2. Molécule selon la revendication 1 où ladite molécule se lie à la protéine tyrosine kinase Syk au niveau d'un site localisé en dehors de son domaine catalytique. 3. Molécule selon la revendication 1 ou 2, où ledit anticorps ou fragment d'anticorps se lie à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins 5 des résidus 65 à 74 de la séquence en acides aminée de la protéine Syk humaine illustrée par la SEQ ID N°1. FR 08 01959 - NiRef B7504- CAiSR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles)- 62 - 4. Molécule selon la revendication 1, 2 ou 3 où ladite poche tridimensionnelle comprend également le résidu Sérine situé en position 9, le résidu Glutamine situé en position 43, le résidu Phénylalanine situé en position 51, le résidu Isoleucine situé en position 66, les résidus Glutamate situés en position 67 et 69, le résidu Leucine situé en position 70, le résidu Asparagine situé en position 71, le résidu Glycine situé en position 72. le résidu Thréonine situé en position 73. le résidu Tyrosine situé en position 74 et le résidu Alanine situé en position 75 de la protéine Syk humaine dont la séquence est illustrée par la SEQ ID N°1. 5. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 où ladite molécule est utilisée pour la prévention ou le traitement de réactions d'hypersensibilité de type I. 6. Molécule selon la revendication 5 où ladite molécule inhibe la dégranulation des mastocytes dépendante des IgE. 7. Molécule selon la revendication 6 où ladite molécule est capable d'inhiber de 50% in vitro la dégranulation des mastocytes à une concentration (CI50) comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml. 8. Molécule selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 où ladite voie métabolique impliquant Syk est une voie d'activation des mastocytes ou des basophiles. 9. Molécule selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 où ladite pathologie est l'asthme allergique, la conjonctivite allergique, la rhinite allergique, l'anaphylaxie, l'angioedéme, l'urticaire, l'éosinophilie ou une allergie à un antibiotique. 10. Molécule selon l'une quelconque des revendications 5 à 9 où ladite molécule n'a pas d'effets sur les voies métaboliques impliquant la protéine Syk humaine (SEQ ID N° 1) autres que celles conduisant à la dégranulation des mastocytes et/ou aux réactions d'hypersensibilité de type I. 11. Molécule selon la revendication 10 où ladite molécule n'a pas d'effets sur la réponse anticorps faisant suite à une immunisation par un antigène thymo-dépendant ou sur le recrutement Sykdépendant des neutrophiles. 12. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 où ladite voie métabolique impliquant Syk est une voie d'activation des lymphocytes B, des lymphocytes T, des neutrophiles, des éosinophiles, des cellules NK, des plaquettes, des érythrocytes, des ostéoclastes, des cellules épithéliales ou de cellules cancéreuses. 13. Molécule selon la revendication 12 où ladite pathologie est la polyarthrite rhumatoïde, une maladie auto-immune. l'inflammation ou un cancer. FR 08 01959 - N/Ref : 87504- CA/SR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles)- 63 - 14. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 où ladite molécule est utilisée en combinaison avec une autre molécule thérapeutique. 15. Molécule selon la revendication 14 où ladite autre molécule thérapeutique est également une molécule utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk. 16. Molécule selon la revendication 14 où ladite autre molécule thérapeutique est une molécule utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie non dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk. 17. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 où ladite molécule est destiné à être administré par voie orale, sublinguale, nasale, oculaire, locale, intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, par aérosol ou par inhalation. 18. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 où ladite molécule est destiné à être administré à des patients humains adultes, enfants ou nouveau-nés. 19. Molécule selon l'une quelconque des revendication 1 à 18 où ladite molécule est destiné à être administrée à des doses comprises entre 0,01 mg/kg et 200mg/kg. 20. Molécule selon la revendication 19 où ladite molécule équivalente est choisie parmi les molécules ayant l'une des formules suivantes : • la formule (I) où - R1 est o un groupement phényle non substitué ou substitué par un atome F ou Cl, par un groupement méthyle ou éthyle, par un groupement N,N-diméthyl-sulfonamide ou par deux groupements choisis parmi les groupements méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy et éthoxy, ou FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11 /2008 Revendications (modifications non visibles)-64- o ou un groupement furane non substitué ou substitué par un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy, o ou un groupement thiophène non substitué ou substitué par un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R2 est f- R21 o un groupement t1 R22) où R21 et R22 sont des atomes de carbone faisant chacun partie d'une chaîne alkyle comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien faisant tous deux partie avec l'atome d'azote auquel ils sont liés d'un même hétérocycle saturé ou non comprenant également un atome d'oxygène ou un second atome d'azote, o ou un groupement P23 rai R24 où R23 et R24 sont des atomes de carbone faisant chacun partie d'une chaîne alkyle comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien faisant tous deux partie avec l'atome d'azote auquel ils sont liés d'un même hétérocycle saturé ou non comprenant également un atome d'oxygène ou un second atome d'azote, ou r o ou FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles)- 65 - et R3 est o un groupement 2-pyridinyle, 3-pyridinyle ou 4-pyridinyle non substitué, o ou un groupement phényle non substitué ou substitué par un groupement benzoxy, et/ou par un groupement hydroxy, et/ou par un groupement méthyle, et/ou par un groupement éthyle, et/ou par un groupement propyle, et/ou par un ou deux atomes Br, F ou CI, et/ou par un à trois groupements hydroxy, méthoxy ou éthoxy. • la formule (II) où R4 est une chaîne carbonée saturée ou insaturée comprenant 1, 2 ou 3 atomes de carbone ; R5 est un groupement phényle ou un groupement amine secondaire substitué par un groupement phényle substitué ou non, ou par un groupement \ v J R6 est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R7 est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R8 est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy. méthoxy ou éthoxy. • la formule (III) où R9 est un atonie d'hydrogène et le groupement R10 est un groupement phényle substitué ou non, ou les groupements R9 et RIO font partie d'un même hétérocycle substitué ou non comprenant 2 atomes d'azote et 4 atomes de carbone ; R11 est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R12 est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R13 est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; R14 est un atome hydrogène ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy ; ou • la formule (IV) où FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11 /2008 Revendications (modifications non visibles) ou ou- 66 - A est un atome d'Oxygène ou de Soufre ; N ou \/ ^ ^ ' ` J ou R15 est un groupement R16 est un atome d'hydrogène ou de chlore ou un groupement méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy ou éthoxy; R17 est un méthyle, éthyle, hydroxy, méthoxy, éthoxy, acétoxy, méthoxycarbonyle ou éthoxycarbonyle. 21. Molécule selon la revendication 20 où ladite molécule équivalente est choisie parmi les molécules suivantes : (1) (2) H3C ou r�ù CH3 ci N3C..-p (5) ou FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/5R Notifications en date du 10111/2008 Revendications (modifications non visibles)-67- ou ou (8) (9) Cl., CH3 OU OU CH CH3 ~f IY 0-' CH3 H3C 0 (10) CH3 o--4. ou ou CH3 H3C OU OU CH3 H3C FR 08 01959 - N/Ref : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/11/2008 Revendications (modifications non visibles)-68- (25) CH3 Cl_ (27) o H3C OU OU CH3 O (28) H3 ou OU (33) O r H3C FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 101112008 Revendications (modifications non visibles)- 69 - ou o ou H3C (34) H3c CH3 (35) H3c CH3 (37) ou CI- f' H3C Ô (39) 1 H3c ou ou Cl (38) ou _o N' cl F (43) (44) ou CH3 FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 10111'2008 Revendications (modifications non visibles) ou- 70 - H3C, N CH3 CI H3C CH3 } ou ou HO •_ Nr'r ''CH3 H3 -N ou ou (53) H3C (56) (52) CH3 ou ou (64) (65) FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 10/1112008 Revendications (modifications non visibles)- 71 - N r N---j HO . \ N (71) 0 H3C H3C (18) (40) FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 10111:2008 Revendications (modifications non visibles)- 72 - ,,CH3 0 H3C (42) (48) (äNH H 3C 1 N Cl N N O S HN '--e''''' (82) H3C H3C Br H Cl (61) FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 1011112008 Revendications (modifications non visibles) (77)- 73 - ou ou H H r,0 3 H3C (84) (75) 22. Composition comprenant une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 et un excipient acceptable sur le plan pharmacologique pour la prévention ou le traitement d'une pathologie dépendante d'une voie métabolique impliquant Syk chez l'homme ou l'animal. 23. Composition selon la revendication 22 où ladite composition comprend également une autre molécule thérapeutique. 24. Procédé pour l'identification d'une molécule organique de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Dalton se liant à la protéine tyrosine kinase Syk et capable d'inhiber d'au moins 10% in vitro la liaison (i) du fragment d'anticorps G4G11 (SEQ ID N'2), ou (ii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine au niveau d'un épitope comprenant au moins l'un des résidus 65 à 74 de la séquence en acides aminés de la protéine tyrosine kinase Syk humaine représentée par la séquence SEQ ID N°1, ou (iii) d'un anticorps ou fragment d'anticorps se liant à la protéine tyrosine kinase Syk humaine et inhibant d'au moins 10% la liaison du fragment d'anticorps G4G11 avec la protéine tyrosine kinase Syk humaine (SEQ ID N'1), à la protéine tyrosine kinase Syk humaine ou à l'une de ses variantes chez ranimai, comprenant au moins les étapes suivantes : a) le criblage à partir d'une banque de molécules organiques candidates de poids moléculaire compris entre 50 et 2500 Da de celles susceptibles de se lier à ladite protéine Syk au niveau de la poche tridimensionnelle de liaison sur ladite protéine Syk d'une molécule choisies parmi les molécules de formule C-13,1, Il, II, IV ou 1 à 87 définies ci-dessus ; FR 08 01959 - NIRef B7504- CA/SR Notifications en date du 1011112008 Revendications (modifications non visibles)- 74 - b) la sélection parmi les molécules identifiées en a) de celles capables d'inhiber d'au moins 10% in vitro la liaison de l'anticorps ou fragment d'anticorps (i) ou (ii) à la protéine Syk. 25. Procédé selon la revendication 24 où la molécule de l'étape a) est la molécule C-13, la molécule (59) ou la molécule (61). 26. Procédé selon la revendication 24 ou 25 comprenant une étape supplémentaire préalable à l'étape a) d'identification de la poche tridimensionnelle de liaison sur la protéine Syk de la molécule choisies parmi les molécules de formule C-13, I, II, I1, IV ou 1 à 87. 27. Procédé selon la revendication 26 où ladite étape préalable est réalisée par la mise en oeuvre d'un docking in silico. 28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 24 à 27 comprenant une étape supplémentaire c) de sélection parmi les molécules identifiées en b) de celles capables d'inhiber de 50% in vitro la dégranulation des mastocytes à une concentration (CI50) comprise entre 1 ng/mI et 1 mg/ml. FR 08 01959 - NiRef : B7504- CA/SR Notifications en date du 1011112008 Revendications (modifications non visibles)