Brevet FR2929289A1 — publié le 20091002

Base pour bouillon d'enrichissement pour Listeria en 24 heures L'invention concerne un milieu d'enrichissement permettant une récupération améliorée des souches de Listeria, telles que Listeria monocytogenes, présentes dans des aliments ou autres spécimens. Le milieu est compatible pour une utilisation dans la détection ultérieure des souches de Listeria par des procédures de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) du type utilisant un marquage fluorescent pour détecter des produits de PCR amplifiés, tel que le système BAX� (Qualicon, Wilmington, EtatsùUnis). Généralement, les produits de type milieu pour la récupération des Listeria contiennent de l'esculine à titre de source de carbone. L'esculine est décomposée et utilisée comme source de carbone uniquement par les organismes produisant de la f3ùglucosidase et, par conséquent, l'inclusion d'esculine confère une sélectivité au milieu de récupération. Malheureusement, l'esculine et son produit de décomposition, l'esculétine, sont fluorescents et interfèrent avec les systèmes de détection par fluorescence. Une autre interférence est l'absorbance de la fluorescence par le complexe d'un noir intense que l'esculétine forme avec les ions ferriques présents dans le milieu. Des milieux vendus dans le commerce pour la récupération et l'enrichissement de Listeria spp. qui ne contiennent pas d'esculine et utilisent, à la place, du dextrose à titre de source de carbone sont actuellement disponibles. Toutefois, le dextrose est utile à titre de source de carbone pour de nombreux microùorganismes et, par conséquent, il ne confère aucun degré significatif de sélectivité au milieu. Dans la présente invention, l'esculine est remplacée par le cellobiose, une source de carbone pour la 13ùglucosidase, non fluorescent et ne formant pas de complexe. Le cellobiose est compatible avec les systèmes de détection par fluorescence et le cellobiose confère un degré supplémentaire de sélectivité dans la mesure où seuls les microùorganismes produisant de la Bùglucosidase peuvent l'utiliser à titre de source de carbone. Les cellules de Listeria présentes dans l'environnement, et notamment dans les aliments après transformation, ont tendance à être dans un état lésé ou stressé. Le milieu de l'invention peut contenir d'autres ingrédients comprenant, mais sans limitations, des peptones, un extrait de levure, des niveaux appropriés de chlorure de sodium et/ou des composés de fer tels que le citrate d'ammonium ferrique, pour faciliter la récupération de ces cellules et permettre leur croissance et multiplication rapide pour fournir un niveau suffisant de matrice ADN pour la PCR. Le Tableau 1 fournit un exemple de formulation utilisable à titre du milieu de base de la présente invention. Le milieu de base peut être préparé dans de l'eau déminéralisée à titre de solution de travail ou, pour des raisons pratiques, les ingrédients peuvent être mélangés ensemble pour obtenir une poudre mixte sèche qui peut être stockée à température ambiante à l'abri de la lumière. La poudre est stable dans des conditions normales, sans détérioration de la performance, pendant plus de 2 ans. Les aliments contiennent souvent un niveau élevé de flore annexe. Les contaminants courants peuvent comprendre E. coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, et Bacillus spp. Ces organismes peuvent inhiber la croissance et la réplication de Listeria soit de manière non spécifique, par ledit "effet Jameson", soit par modification de l'environnement (pH, niveaux de nutriments), ou encore par production d'agents qui sont toxiques pour Listeria. Les agents antibactériens qui ont peu d'effet sur Listeria mais réduisent significativement la réplication (bactériostatiques) ou provoquent la mort (bactéricides) de la flore annexe sont des additifs recommandés pour le milieu. Les agents antibactériens tels que l'acriflavine, le chlorure de lithium, l'acide nalidixique, la polymyxine ou leurs mélanges, sont suggérés pour une utilisation dans les milieux sélectifs de Listeria. Les concentrations de ces agents antibactériens ont été spécialement sélectionnées pour provoquer aussi peu de dommages que possible aux cellules de Listeria lésées tout en retenant leur activité toxique contre la flore annexe la plus couramment isolée. De plus, les niveaux d'acriflavine, un colorant antimicrobien très fluorescent, ont été réduits dans la présente invention pour éviter les interférences avec le système de détection par PCR. Du chlorure de lithium peut être inclus dans le milieu de base. Les concentrations des autres agents antibactériens sélectifs sont indiquées dans le Tableau 2. Ces agents peuvent être ajoutés séparément sous formes de composants pulvérulents individuels ou de manière plus pratique, sous la forme d'un supplément lyophilisé qui peut être reconstitué avec de l'eau stérile et ajouté à la base autoclavée. Ils peuvent également être incorporés à la base pour donner un milieu complet qui peut être dissous dans de l'eau déminéralisée et autoclavée. Exemple d'utilisation du milieu de base et du supplément A titre d'exemple de préparation d'un milieu de base, 21,75 g de la formulation du milieu de base présentée dans le Tableau 1 sont dissous dans 500 ml d'eau déminéralisée. Le milieu peut être stérilisé par autoclavage, par exemple, à 121°C pendant environ 15 minutes, ou par tout autre moyen convenable connu dans l'art. Si la stérilisation par la chaleur est utilisée, le milieu est refroidi à moins de 50°C, puis environ 2,5 mg d'acriflavine, 15,0 mg d'acide nalidixique et 5,0 mg (41,5 MU) de polymyxine sont ajoutés dans des conditions aseptiques. Le milieu est ensuite refroidi jusqu'à la température ambiante avant utilisation et peut être stocké à l'abri de la lumière directe. Le milieu est une solution limpide ayant un pH à 25°C de 7,4+0,2. Tableau 1. Exemple de composition du milieu de base Nom du matériau Concentration (g/I) citrate d'ammonium ferrique 0,10 cellobiose 1,00 chlorure de lithium 9,50 peptone (Oxoid, catalogue # LP0049) 4,70 chlorure de sodium 6,25 hydroxyde de sodium 0,25 tryptone (Oxoid, catalogue # LP0042) 17,00 Extrait de levure (Oxoid, catalogue # 4,70 LP0021 La formulation indiquée dans le Tableau 1 est proposée à titre d'exemple seulement. Des ingrédients peuvent être ajoutés, omis ou remplacés comme indiqué dans l'art, du moment que : (i) le milieu de base favorise la croissance d'au moins une ou plusieurs souches de Listeria, (ii) contient du cellobiose et (iii) est dépourvu d'esculine. De la même façon, les concentrations des ingrédients peuvent varier comme indiqué dans l'art. Pour les aliments acides, un tampon phosphate (92mM ; pH 7,6 + 0,1) peut être utilisé avec le milieu. Tableau 2. Exemple de formulation pour un mélange antimicrobien sélectif 10 Nom du matériau Concentration (mg/I) acriflavine, neutre 5,0 Acide nalidixique, sel de sodium 30,0 Sulfate de polymyxine B 10,0 (83 MU) D'autres agents sélectifs, par exemple, le moxalactame, peuvent être ajoutés ou remplacer un ou plusieurs des ingrédients ci dessus, comme indiqué dans l'art, du moment que l'agent permet la récupération sélective des souches de Listeria. 15 Le milieu est généralement destiné à être utilisé sous la forme d'un bouillon liquide à titre de milieu d'enrichissement mais il peut également être utilisé sous la forme d'un milieu solide ou semiùsolide avec ajout de gélose ou autres agents gélifiés, comme indiqué dans l'art. Par exemple, de la gélose peut être ajoutée dans une plage de concentration de 2 à 20 g/litre. 20 Exemple d'utilisation du milieu pour analyser des aliments Un échantillon alimentaire est dilué à 1:10 avec le milieu de la présente invention (une partie d'échantillon alimentaire pour 10 parties de milieu) et le mélange est homogénéisé dans, par exemple, un broyeur de type Stomacher�. Le mélange homogénéisé est incubé pendant environ 24 ù 28 heures à 37°C, puis 500 pl 25 d'échantillons sont soumis à extraction pour obtenir l'acide nucléique et l'acide nucléique est amplifié par tout moyen convenable. Par exemple, le protocole de la trousse BAX� 24E pour lyse cellulaire et PCR a une sensibilité acceptable pour la détection des Listeria. REVENDICATIONS1. Milieu nutritif favorisant la récupération et la croissance d'au moins une souche de Listeria, comprenant du cellobiose et dépourvu d'esculine. 2. Milieu selon la revendication 1 comprenant, en outre, au moins un des ingrédients suivants : chlorure de lithium, acriflavine, acide nalidixique et sulfate de polymyxine B. 10 3. Milieu selon la revendication 1, dans lequel la concentration du cellobiose est d'environ 1 g/litre. 4. Milieu selon la revendication 2, dans lequel l'acriflavine est sélectionnée à une concentration 5. Milieu selon la revendication 1 sous la forme d'un milieu de type bouillon liquide. 6. Milieu selon la revendication 1 comprenant, en outre, de la gélose. 15