Brevet FR2930446A1 — publié le 20091030

La présente invention est relative à l'utilisation d'une composition contenant de l'ergostérol ou un extrait naturel de microorganisme, ou végétal, ou animal, en comprenant, pour protéger les cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultraviolets. II est connu du document WO-99/13858-A d'utiliser de l'ergostérol pour stimuler la prolifération des cellules cutanées, du document FR-2829390-A d'utiliser des extraits du champignon shiitake pour améliorer la barrière cutanée, et du document JP-2003267873-A d'utiliser un dérivé d'ergostérol pour éclaircir la peau. De plus l'ergostérol est utilisé en nutrition humaine comme un précurseur de la Vitamine D. Par ailleurs, l'exposition répétée de la peau aux rayonnements ultraviolets en-traîne des dommages dans les cellules de la peau et des muqueuses, en particulier dans les cellules appelées fibroblastes qul sont responsables du renouvellement des macromolécules constituant la matrice ext acellulaire du derme (Goukassian D. et al, The FASEB J., 14 :1325-34,2000). Ces dommages sont naturellement réparés ; mais, quand ce n'est pas le cas, cela peut avoir des conséquences sur le bon fonctionnement des cellules (Goukassian D.A. et Gilchrest B.A., Rejuvenation Res.7 ;3) :175-85,2004). De plus, on sait depuis longtemps que les cellules de la peau exposée au soleil perdent plus vite leur capacité de se reproduire lorsqu'on les introduit en culture in vitro (Gilchrest B.A., J Gerontol., 35(4) :537-41,1980). Les cellules qui ne peuvent plus se reproduire sont appelées �cellules sénescentes � par les spécialistes en Biologie Cellulaire, et sont caractérisées par la forte expression d'une bêta-galactosidase active à pH 6. On trouve plus de cellules exprimant cette bêta-galactosidase aussi bien parmi les kératinocytes ou fibroblastes de la peau de personnes âgées, que dans les cultures de cellules vieillies par repiquages successifs (Dimri G.P. et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 :9363-67,1995), ou dans les cultures ayant subi des stress ultra-violets répétés (Chainiaux F. et al, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 34(11) :1331-9,2002). De plus, il a été récemment montré (Debacq-Chainiaux F. et al, J. Cell. Sci. 118(Pt4) :743-58, 2005) que les fibroblastes perdent avec l'âge une partie de leur capacité de réparation des dommages causés par les rayonnements ultra-violets (UV) (Goukassian D. et al, 2000, déjà cité). Enfin il apparaît que les � cellules sénescentes � in vivo ont des effets néfastes sur le tissu environnant (Funk W.D. et al,Exp Oeil Res.258 :270-8, 2000) et qu'il parait important de disposer de moyens pour éviter leur apparition. II apparaît donc qu'il serait très intéressant de pouvoir disposer de moyens pour éviter l'apparition de � cellules sénescentes � qui ont perdu la capacité de se repro- duire, et qui ont des effets néfastes sur les tissus environnants. Aussi, un but de la présente invention est-il de fournir un moyen pour protéger les cellules cutanées contre l'apparition des � cellules sénescentes � qui sont la conséquence d'un stress oxydatif tel que l'exposition aux rayonnements ultraviolets. Ce but, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, est atteint par l'utilisation d'une composition contenant de l'ergostérol, un dérivé d'ergostérol ou un extrait naturel de microorganismes, végétal ou animal en comprenant, pour protéger les cellules de la peau et des muqueuses contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultraviolets. Avantageusement, l'ergostérol est sous la forme d'un dérivé hydrosoluble tel qu'un ester de l'acide phosphorique ou de l'acide succinique. De préférence, l'ergostérol utilisé est contenu dans un extrait de levure telle que Saccharomyces cerevisiae. Avantageusement, l'ergostérol utilisé est contenu dans un extrait de champi- gnon. De préférence, la composition selon la présente invention comprend aussi au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, du resvératrol, du gallate d'épigallocatéchine, de la genistéine, de la daidzéine, de la formononétine, de l'équol, un extrait de thé vert. Avantageusement, elle comprend de 0,00001 à 95 %, et de préférence de 0,001 à 1 % en poids, en poids d'ergostérol. Selon la présente invention, cette composition est destinée à une application sur la peau ou les muqueuses ou à être ingérée. De préférence, la composition stimule l'activité de la protéine p53 dans les cel- lules de la peau ou des muqueuses. La description qui va suivre el qui ne présente aucun caractère limitatif, est en particulier relative à des exemples de réalisation de la présente invention qui per-mettront à l'homme du métier de mieux comprendre celle-ci. Or, il a maintenant été trouvé de façon tout à fait inattendue et surprenante, que si le milieu de culture des fibroblastes sournis à des expositions aux ultra-violets répétées, est supplémenté, avant les irradiations, par l'ajout d'ergostérol, on diminue de façon très significative le nombre de cellules qui passent à l'état sénescent caractérisé par l'apparition de l'activité bêta-galactosidase qui lui est associée (� Senescence Associated bêta-galactosidase � ou � SA bêta-gal �). L'ergostérol utilisé est avantageusement contenu dans un extrait de levure telle que Saccharomyces cerevisiae. Exemple 1 : Atténuation par l'ergostérol des dommages causés à des fibroblastes en culture, par des expositions répétées à un rayonnement ultraviolet. L'ergostérol utilisé est un produit commercialisé par LGC Promochem (France). Des fibroblastes de derme de la même souche BJ que celle utilisée par Chainiaux F. et al (2002, déjà cité) sont mis en culture par les méthodes classiques. L'absence de cytotoxicité de l'ergostérol sur une durée de 24 heures, est vérifiée dans la gamme 0,1 à 0,5 pg /ml. Pendant 5 jours les fibroblastes sont exposés 1 fois par jour à une dose d'ultra-violets B de 200 mj/cm2. 24 heures avant le premier traitement aux UV, et à la suite de chaque irradia- tion, le milieu de culture est remplacé par du milieu contenant (0,1), (0,25), et (0,5) pg /ml d'ergostérol. Avant chaque nouvelle irradiation, ces milieux sont remplacés par un milieu ne contenant pas d'ergostérol. Après la dernière irradiation, les cellules sont laissées 72 heures en contact avec du milieu supplémenté en ergosterol, renouvelé toutes les 24h. Au terme de cette dernière période de contact, l'activité bêta-galactosidase à pH6 (bêta-galactosidase associée à la sénescence ou SA bêta-gal) est évaluée suivant la méthode de Dimri G.P. et al (déjà cité), sur au moins 400 cellules pour chaque concentration en ergostérol. L'expérience a été réalisée deux fois. Les valeurs moyennes des pourcentages de cellules exprimant la SA bêta-gal sont regroupées dans le Tableau 1 ci-après: Tableau I Condition SA bêta-gal SA bêta-gal lère expérience 2ème expérience Contrôle sans UV 31,04 41,19 UV et 0 pg/ml d'ergostérol 38,65 49,19 UV et 0,1 pg/ml d'ergostérol 25,13 34,32 UV et 0,25 pg/ml d'ergostérol 24,82 35,78 UV et 0,5 pg/ml d'ergostérol 27,80 31,78 On constate que : les dommages causés par les expositions répétées aux rayons ultra-violets B ont entraîné une augmentation significative des fibroblastes présentant l'activité SA bêta-gal caractéristique des cellules qui ne peuvent plus se reproduire (qualifiées de � sénescentes �), le traitement des cellules par l'ergostérol avant et après les irradiations, a permis une atténuation des dommages causés par les ultra-violets dès la concentration de 0,1 pg/mI, ce qui se traduit par un nombre de fibroblastes � sénescents � qui reste inférieur à celui des cultures n'ayant subi aucune irradiation. Il apparaît ainsi, que l'utilisation d'ergostérol, permet bien selon l'invention d'atténuer les dommages cellulaires causés par l'exposition aux rayonnements ultra- violets. Exemple 2 : Pour protéger les cellules contre les stress oxydatifs, il est intéressant d'activer la protéine p53 (cf. de Magalhaes J.P. et aI, Expert Gerontol. 39(9) : 1379-89, 2004). On a évalué la stimulation de l'expression de la protéine p53 dans les fibroblastes de l'Exemple 1 sous l'influence de 0,5 pg/ml d'ergostérol dans le milieu de culture pendant 24 heures. Un contrôle positif a été réalisé en irradiant une culture des mêmes cellules par une dose de 150 mJ/cm2 d'UVB. Après ces traitements, on a extrait les protéines nucléaires des fibroblastes. Puis on a incubé 5pg de protéines nucléaires dans une microplaque recouverte d'un oligonucléotide portant la séquence d'ADN spécifique susceptible de lier la pro- téine p53. Enfin, la teneur en protéine p53 liée a été évaluée par colorimétrie au moyen d'un anti-corps spécifique de cette protéine et d'un anticorps conjugué à la peroxydase (test TransAM de Active Motif, Rixensart, Belgique). Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau Il ci-dessous: Tableau Il On a ainsi trouvé de façon surprenante que le traitement à l'ergostérol en l'absence d'UV a augmenté de 30% la teneur en protéine p53 dans le noyau des fibro-10 blastes. On a aussi confirmé que les expositions aux ultra-violets, en absence d'ergostérol, ont multiplié par 4 la teneur en protéine p53 dans le noyau des fibroblastes. Cet exemple permet de mettre en évidence de façon surprenante que 15 l'ergostérol stimule la protéine de défense p53 nécessaire à la prévention des dommages causés par les rayonnements ultra-violets tels que l'apparition de � cellules sénescentes � qui ont perdu la capacité de se reproduire et qui ont des effets néfastes sur les tissus environnants. Différentes compositions sont données ci-après à titre d'exemple pour illustrer 20 les différents modes d'action ou d'utilisation de l'ergostérol. Composition N°1 : Crème cosmétique de! protection contre les stress oxydatifs. On procède comme pour la réalisation d'une émulsion classique huile dans eau, c'est-à-dire qu'on mélange sous agitation à 85°C une phase hydrophobe conte- 25 nant 0,05 % d'ergostérol et une phase aqueuse contenant chacune des matières premières destinées à conférer au produit les propriétés d'usage habituelles : stabilité, sécurité, étalement facile, toucher final agréable, etc. On refroidit ensuite sous agitation. p53 Conditions par rapport au contrôle Contrôle à Opg/ml d'ergostérol 1 0,5 pg/ml d'ergostérol 1,3 Opg/ml d'ergostérol + UV 45 La proportion de phase hydrophobe par rapport à la phase aqueuse est telle que la proportion finale en ergostérol est de 0,04% en poids. Cette crème est appliquée sur le visage, le cou et les mains, de préférence le matin pour que le principe stimulant les défenses naturelles ait le temps de pénétrer jusqu'aux cellules vivantes, afin d'être en contact en milieu de journée quand les intensités d'irradiation UV solaires sont à leur maximum. Composition N°2 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs. On réalise comme ci-dessus une émulsion huile dans eau contenant de l'ergostérol, de l'alpha-tocophérol ainsi que de l'acétate d'alpha-tocophérol ; lors du refroidissement à 45°C, on rajoute du phosphate de vitamine C en quantité suffisante pour arriver aux concentrations en poids dans la composition finale de : - ergostérol 0,02 % - alpha-tocophérol 0,05 % - acétate d'alpha-tocophérol 0,2 % - phosphate de Vitamine C, sel de Mg 0,2 Cette formulation est une crème de jour. Composition N°3 : Crème cosmétique de protection contre les stress oxydatifs et de protection filtrante. On réalise comme pour la Composition N°1, une émulsion huile dans eau avec un ajout d'oxyde de titane suffisant pour obtenir un facteur de protection SPF égal à 6, puis on ajoute un extrait alcoolique sec de Saccharomyces cerevisiae sous agitation à 45°C en quantité suffisante pour arriver à 2 % d'extrait en poids dans la préparation finale. Le produit est destiné à être appliqué le matin sur les zones de peau non couvertes, et, si possible, l'application doit être renouvelée en milieu de journée. Composition N°4: Gel cosmétique de protection contre les stress oxydatifs, pour peaux sensibles. On réalise un gel acrylique hydroalcoolique titré à 0,01 % en poids d'ergostérol et contenant en outre 2 % en poids d'extrait hydroglycolique de Glycyrrhiza glabra.35 Composition N°5 : Complément alimentaire pour protéger la peau avant toute exposition au soleil ou aux pollutions. On réalise par les techniques classiques des comprimés dosés à 10 pg d'ergostérol par comprimé, d'une formulation de poudre comprenant 0,1% en poids d'ergostérol Ces comprimés sont à prendre avec un peu d'eau au cours des repas du matin et de milieu de journée, à raison de un à deux comprimés par prise suivant l'intensité et la durée d'exposition attendue. Composition N°6 : Complément alimentaire pour protéger la peau avant toute exposition au soleil ou aux pollutions. On réalise des capsules de gélatine contenant 100 mg d'un extrait sec de Saccharomyces cerevisiae comprenant environ 2 % en poids d'ergostérol. Ces capsules sont à prendre comme les comprimés de la composition N°5. Composition N°7 : Complément alimentaire pour préparer la peau à l'exposition au soleil. On réalise des capsules contenant 60 mg d'une formulation de poudre à 2 % en poids d'ergostérol, 15 mg d'extrait de thé vert et 25 mg de vitamine C par capsule. La dose quotidienne conseillée est de 2 à 4 capsules par jour en deux prises le matin et en milieu de journée avec un peu d'eau au moment du repas. Composition N°8 : Boisson pour protéger la peau lors des expositions au soleil. On réalise une boisson à base de lait de soja contenant 0,01 % en poids d'ergostérol. Cette boisson est présentée en doses de 100 ml. Il est conseillé d'en boire une dose le matin et une dose en milieu de journée au moment des repas. REVENDICATIONS1. Utilisation d'une composition contenam un ergostérol, un dérivé d'ergostérol ou un extrait de microorganisme, de végétal ou d'animal le comprenant, pour protéger les cellules contre les conséquences d'un stress oxydatif tel qu'une exposition aux rayonnements ultra- violets. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ergostérol est sous la forme d'un dérivé hydrosoluble tel qu'un ester de l'acide phosphorique ou de l'acide succinique. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ergostérol utilisé est contenu dans un extrait de levure telle que Saccharomyces cerevisiae . 4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait que l'ergostérol utilisé est contenu dans un extrait de champignon. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée par le fait qu'elle comprend aussi au moins un antioxydant tel que la vitamine E, la vitamine C, un caroténoïde, un flavonoïde, un isoflavonoïde, un polyphénol, une procyanidine, du resvératrol, du gallate d'épigallocatéchine, de la genistéine, de la daidzéine, de la formononétine, de l'équol, un extrait de thé vert. 6. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,00001 à 95 % en poids d'ergostérol. 7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée par le fait qu'elle comprend de 0,001 à 1 % en poids d'ergostérol. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition est destinée à une application sur la peau ou les muqueuses. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition est destinée à être ingérée. 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée par le fait que la composition stimule l'activité de la protéine p53 dans les cellules de la peau ou des muqueuses.