Brevet FR2932362A1 — publié le 20091218

La présente invention concerne un procédé de régénération de plantes du genre Népenthès par embryogenèse somatique et par caulogenèse, à partir d'amas de cellules indifférenciées. Les Népenthès sont des plantes carnivores de la famille des Népenthacées. Leur origine géographique principale correspond à la zone des îles de Sumatra et de Bornéo, mais elles sont plus largement localisées dans un triangle formé par Madagascar, le nord-est de l'Inde, et la Nouvelle-Calédonie. Il existe plus d'une centaine d'espèces de Népenthès et de très nombreux hybrides, qui vivent en zone humide dans des altitudes allant 0 et 3200 m. Ce sont des lianes grimpantes de longueur variable (20 cm à 20 m) prenant appui sur un arbre ou couchées sur le sol. Elles ont réussi à s'adapter à des milieux pauvres en azote, grâce à d'astucieux pièges localisés au bout de chacune de leur feuille : des urnes ou ascidies, surmontées d'un opercule. Ces pièges leur permettent de capturer des insectes, constituant ainsi une partie de leur alimentation azotée. Au fond de chaque urne, se trouve une réserve de liquide digestif, dans laquelle les parties molles des insectes sont digérées par des enzymes avant d'être réabsorbées par la plante [11,121. [3] Dans le monde, il existe une forte activité de collectionneurs de plantes attirés par la culture des Népenthes. En effet, grâce à la beauté et à l'originalité de leurs pièges, les Népenthès sont devenues des plantes ornementales très attrayantes. En vue de la demande commerciale, il est donc intéressant de mettre en place un moyen de multiplication efficace et rapide, soit sous forme de vitro plants soit sous forme de semences artificielles. Pour l'étude des populations végétales, les plantes du genre Népenthès constituent un remarquable modèle d'adaptation face à des contraintes exercées par leur milieu. Or, ce genre de plante est sérieusement menacé d'extinction à cause des activités de l'Homme. Certaines espèces comme N. rajah ou N. lowii sont aujourd'hui bien difficiles à observer sur les montagnes de Bornéo. Les Népenthès font donc face à un réel besoin de conservation, que l'on peut combler par le biais de la culture in vitro (embryons somatiques, semences artificielles, vitro plants,...). Et enfin d'un point de vue thérapeutique, les Népenthès pourraient être utilisées en vue de leurs capacités à produire des métabolites secondaires (quinones notamment) ou tout autre molécule organique à usage thérapeutique (en particulier les protéines thérapeutiques). Cette activité de production de substances à usage pharmaceutique pourrait être obtenue par la multiplication en masse de plants préalablement sélectionnés grâce à des techniques d'embryogenèse somatique ou de caulogenèse. Notons que les techniques de transformation génétique (trangenèse) pourraient également être appliquées aux plantes du genre Népenthes afin d'améliorer leurs capacités naturelles à synthétiser des composés secondaires ou des protéines. Or, la régénération d'une plantule à partir d'une cellule est une étape clef dans un protocole de transformation génétique et elle fait actuellement défaut. Actuellement, ce type de plante n'est multiplié que par micropropagation à partir 15 d'entrenceuds ou par germination de graines. D'après les travaux de Khompat et al (2007) [41, la germination de graines et le développement total de plantules de Nepenthes mirabilis n'atteint que 26% sur un milieu MS (Murashige et Skoog (1962)[5') solide contenant 3 à 5 mg/L de BAP (6-benzylaminopurine, cytokinine synthétique). Ces mêmes auteurs ont montré que la 20 micropropagation à partir d'entrenoeud est régie par un équilibre entre le nombre de plantules par expiant et la qualité de la plantule: un test sur différentes concentrations de BAP a montré que plus la concentration hormonale est élevée, plus l'expiant produit des plantules, mais cela au dépend de leur qualité. Elles seront moins vigoureuses et moins développées. En testant différentes concentrations de macroéléments du milieu MS , les 25 faibles concentrations ont donné un taux de multiplication très élevé, accompagné malheureusement d'un phénomène de chlorose. Des tests similaires ont été effectués par les inventeurs et ont donné le même genre de résultats décevants. A la vue de ces observations, la manipulation de graines ne constitue pas un procédé très performant de multiplication de Népenthès. Parallèlement, même si la 30 multiplication par entreneeuds peut apporter une réponse partielle aux besoins liés à la plante, elle présente néanmoins certains désavantages: (1) un compromis doit être trouvé entre le taux de production et la qualité des plantules, (2) cette méthode ne permet pas la production de semences artificielles, (3) cette méthode ne peut être incluse dans un protocole de transformation génétique. Il n'existe à ce jour aucun travail portant sur la régénération directe de Népenthès. Par régénération directe, on entend la formation de la tige feuillée d'une plantule ou la formation d'embryons somatiques, à partir d'une ou plusieurs cellules de l'expiant n'ayant pas subi une dédifférenciation. De nombreux tests ont été menés par les inventeurs sur ce procédé, mais aucun n'a donné des résultats satisfaisants. Une forte synthèse de polyphénols causant le brunissement précoce des expiants rendrait cette plante récalcitrante à la régénération directe. Une étude bibliographique menée sur les plantes considérées comme récalcitrantes en terme de régénération, a montré qu'elles étaient la plupart du temps régénérées par embryogenèse somatique indirecte et/ou par organogenèse indirecte. Par régénération indirecte, on entend la formation de la tige feuillée d'une plantule ou la formation d'embryons somatiques, à partir d'une ou plusieurs cellules de l'expiant ayant subi un processus de dédifférenciation et le plus souvent constituées en cals. La formation d'une tige feuillée à partir de cellules indifférenciées implique que ces cellules indifférenciées doivent être prédisposées à effectuer de la caulogenèse. Pour cela, il est nécessaire d'avoir un taux de cytokinines endogènes élevé, qui va permettre de générer les tiges feuillées et l'activation de la formation de la chlorophylle. Malgré un risque élevé d'obtention de chimères au cours d'une transformation génétique (due à l'origine pluricellulaire des bourgeons), ce procédé constitue un excellent moyen d'obtenir en peu de temps un grand nombre de plantules de bonne qualité et de produire des semences artificielles. L'organogenèse indirecte est une méthode utilisée dans la multiplication, la conservation ou la transformation génétique de plantes récalcitrantes, comme la rose 161, la betterave sucrière [7] ou l'orge [8]. L'utilisation de l'embryogenèse somatique comme méthode de multiplication, de conservation ou comme une méthode de régénération dans un protocole de 30 transformation génétique est courante chez des plantes récalcitrantes, comme le coton [91, la betterave sucrière 001, la vigne le tournesol 1'21 ou la rose 161 C'est un processus permettant de générer des unités bipolaires à partir de cellules somatiques appelées embryons somatiques. Leur organisation est quasi similaire à celle d'un embryon zygotique, exceptions faites de l'absence de suspenseur, de période de dormance et d'enveloppe protectrice présente dans une vraie graine. Leur développement suit un schéma en six étapes: globulaire, ovale, cordiforme, allongée, torpille et cotylédonaire (par ordre d'apparition) 031. Cette technique offre de nombreux avantages: (1) la capacité d'obtenir des structures ayant à la fois un méristème apical et un méristème racinaire, permettant ainsi aux racines de se développer sans l'apport auxines exogènes, (2) la capacité de produire un grand nombre de plantules régénérées de bonne qualité en peu de temps, (3) la capacité d'induire la dormance et d'encapsuler les embryons somatiques dans des billes de matrice gélatineuse, pour produire des semences artificielles, et (4) la capacité de transformer génétiquement Népenthès sans aucun risque de chimère grâce à l'origine unicellulaire de l'embryon (transformation via Agrobacterium tumefaciens, microinjection, électroporation, ou biolistique). Les inventeurs ont trouvé dans un premier temps qu'il était possible de préparer un cal à partir d'expiants. La méthode repose sur l'exposition d'expiants de Népenthès à un milieu contenant des hormones, dont la nature même et la concentration sont déterminantes. La présente invention consiste donc dans un premier temps en un procédé de préparation de cals de cellules indifférenciées du genre Népenthès, comprenant l'exposition d'un expiant de plante du genre Népenthès à un milieu de culture solide et/ou liquide contenant une auxine et/ou une cytokinine. Les inventeurs ont également montré dans un deuxième temps qu'il était possible de régénérer des plantes du genre Népenthès via un processus d'embryogenèse somatique à partir d'un cal. Ceci nécessite 4 étapes: (i) l'initiation d'un cal du genre embryogénique caractérisé par la présence de MPEs (Massifs Pro Embryogéniques : ce sont des amas cellulaires qui ont achevé sous l'action d'auxine, la transition d'un stade de cellule somatique à un stade de cellule embryogénique f'41), (ii) la transition du stade de MPEs au stade d'embryon globulaire, (iii) la maturation des embryons somatiques, et (iiii) la germination des embryons somatiques. La présente invention concerne donc également un procédé de régénération de plante entière du genre Népenthès, comprenant les étapes suivantes : - préparation de cals de cellules indifférenciées de nature embryogénique, - obtention d'embryons somatiques, - maturation des embryons somatiques, et - germination des embryons somatiques. Les inventeurs ont enfin montré dans un troisième temps qu'il était possible de régénérer des plantes du genre Népenthes à partir d'un cal via un processus d'organogenèse indirecte. Ceci nécessite 4 étapes: (i) l'initiation d'un cal du genre organogène dans lequel les cellules sont prédisposées à la caulogenèse, (ii) la mise en 10 place de l'appareil photosynthétique, (iii) le processus de caulogenèse, et (iiii) l'induction du système racinaire adventif. La présente invention concerne donc également un procédé de régénération de plante entière du genre Népenthès, comprenant les étapes suivantes : - préparation de cals de cellules indifférenciées de nature organogénique, 15 - mise en place de l'appareil photosynthétique, - organogenèse de la tige feuillée, et induction du système racinaire adventif. Les figures annexées illustrent l'invention : 20 La figure 1 est un schéma général de cette invention avec ses principales étapes. La figure 2 est une photographie d'un cal globuleux obtenu sur la combinaison hormonale 0,5 mg/L de 2,4-D et 0,2 mg/L de TDZ. La figure 3 est une observation à la loupe binoculaire (x 25) d'un cal globuleux obtenu sur la combinaison hormonale 0,5 mg/L de 2,4-D et 0,2 mg/L de TDZ. 25 La figure 4 est une observation à la loupe binoculaire (x 20) d'un cal friable obtenu sur la combinaison hormonale 0,75 mg/L de 2,4-D et 0,05 mg/L de TDZ. La figure 5 est une observation à la loupe binoculaire (x 35) d'un cal friable obtenu sur la combinaison hormonale 0,75 mg/L de 2,4-D et 0,05 mg/L de TDZ. La figure 6 est une observation au microscope optique (x 400) de MPEs I d'un cal 30 induit sur les doses hormonales 0,75 mg/L de 2,4-D et 0,05 mg/L de TDZ. La figure 7 est une observation au microscope optique (x 400) de MPEs II d'un cal induit sur les doses hormonales 0,75 mg/L de 2,4-D et 0,05 mg/L de TDZ. La figure 8 est une observation au rnicroscope optique (x 100) de MPEs III d'un cal induit sur les doses hormonales 0,75 mg/L de 2,4-D et 0,05 mg/L de TDZ. La figure 9 est une observation à la. loupe binoculaire d'embryons somatiques de N. alata issus d'un cal ayant été induit sur 0,1 mg/L de 2,4-D; E = embryon somatique (barre=2.5 mm). La figure 10 est une observation à la loupe binoculaire (x 25) d'une plantule générée à partir d'un cal induit sur 1 mg/L de 2,4-D et 0,2 mg/L de TDZ. La présente invention décrit dans un premier temps (FIG 1) l'initiation de cal à partir d'expiant à l'aide d'un équilibre hormonal adapté, capable de dévier le programme de différenciation interne vers un simple programme de prolifération cellulaire. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de préparation de cals de cellules indifférenciées du genre Népenthès, comprenant l'exposition d'un explant de plante du genre Népenthès à un milieu de culture solide et/ou liquide comprenant une auxine et/ou une cytokinine Par plante du genre Népenthès, on entend toute plante de toutes les espèces de Nepenthes et tous les hybrides possibles. Par explant, on entend toutes les parties de la plante comme les feuilles, les entrenceuds, les apex caulinaires, les apex racinaires, le collet, les graines, l'hypocotyle, les différentes parties de la fleur (pièces florales mâles et femelles), le pollen ou la tige. Avantageusement, l'expiant utilisé est un expiant racinaire. Les auxines ou les analogues d'auxines comprennent l'acide 3-indole-acétique (IAA), l'acide 3-indole butyrique (IBA), l'acide a-naphtalène acétique (NAA), l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D)., l'acide 4-(2,4-dichlorophenoxy) butyrique, l'acide 2,4,5-trichlorophenoxyacétique (2,4,5-T), l'acide (4-chloro-2-methylphenoxy) acétique (MCPA), picloram, dicamba et toute autre molécule faisant partie de la famille des auxines. Dans un mode de réalisation préféré, l'auxine appartient au groupe constitué du 2,4-D, NAA, IAA, Dicamba, Picloram, et de leurs mélanges. Avantageusement l'auxine est le 2,4-D. Les cytokinines ou les analogues de cytokinines comprennent le groupe des cytokinines puriniques, comme par exemple la kinétine, la zéatine, la zéatine riboside, la zéatine riboside phosphate, la dihydrozéatine, le 6-benzylaminopurine (BAP), le 6-(Benyamin)-9-(2-tetrahydropyranylO-9h-purine (PBA) ou le 6-(y,y-dimethyallyamino) purine (2iP), le groupe des cytokinines phénylurées comme par exemple le thidiazuron (TDZ), et tout autre molécule faisant partir de la famille des cytokinines. Dans un mode de réalisation préféré, la cytokinine appartient au groupe constitué du TDZ, Kinétine, Zéatine, et de leurs mélanges. Avantageusement, la cytokinine est le TDZ. Dans un mode de réalisation avantageux, le milieu auquel l'expiant est exposé (milieu d'induction des cals) est un milieu de base supplémenté de 2,4-D (0,1-1 mg/L) et de TDZ (0-0,2 mg/L). Les différents milieux de base liquides et/ou solides de cette invention sont constitués de différents composés : des micro et macroéléments, des vitamines, une ou plusieurs sources de carbone, un ou plusieurs compléments nutritifs, une ou plusieurs phytohormones (sauf mention contraire), un ou plusieurs antioxydants, un agent gélifiant (dans le cas de milieux solides et double phases). Par micro et macroéléments, on entend tous les milieux minéraux, en ne se limitant pas seulement au MS, N6 ou Gamborg B5. Par vitamines, on entend des molécules nécessaires à certaines réactions chimiques du végétal, en ne se limitant pas seulement à la thiamine (Vitamine B1), au myo-inositol, l'acide nicotinique, la glycine ou encore à la pyridoxine (Vitamine B6). Par source de carbone, on entend tous les types de sucres, en ne se limitant pas seulement au saccharose, au glucose, au fructose, au maltose, au raffinose, au stachyose, au mannitol ou encore au sorbitol. Par compléments nutritifs, on entend des molécules capables d'améliorer la croissance et le développement de la plante, en ne se limitant pas à l'hydrolysat de 25 caséine, à certains acides aminés, ou encore à des micronutriments. Par phytohormones, on entend tous les régulateurs de croissance naturels sous forme libre ou conjuguée. A cela s'ajoutent les analogues synthétiques, les inhibiteurs de la synthèse, de la dégradation, de la conjugaison, du transport, de la réception ou d'action des hormones, les précurseurs des hormones, et tout autre composé ayant un 30 effet hormonal sur la croissance et le développement de la plante. Les phytohormones incluent les auxines, les cytokinines, l'acide abscissique, les gibbérellines et l'éthylène ainsi que leurs conjugués, leurs analogues synthétiques, leurs inhibiteurs, ou encore leurs précurseurs. Par antioxydants, on entend des molécules capables de limiter un stress oxydant, en ne se limitant pas à l'acide ascorbique, à l'acide citrique, au charbon activé ou encore au polyvinylpyrrolidone (PVP). Par agent gélifiant, on entend par exemple l'agar ou le phytagel ou tout autre polymère d'origine naturelle ou synthétique permettant la gélification d'un milieu de culture, afin de sustenter les cultures in vitro à la surface d'un milieu de culture. Dans un mode de réalisation avantageux, le milieu de base a la composition suivante: le milieu minéral de base MS'/2 (dilué 2 fois), Vitamines MS xl (Vitamines du milieu Murashige et Skoog (1962) [51), Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Polyvinylpyrrolidone (PVP) 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L et Phytagel 3 g/L. A ces milieux de base, d'autres molécules peuvent être ajoutées selon l'effet voulu. Pour l'induction des cals, la concentration en auxine et en cytokinine dans le milieu d'induction est de préférence comprise entre 0,01 mg/L et 5 mg/L. En outre, le procédé de préparation des cals selon l'invention est avantageusement réalisé à l'obscurité. Dans le procédé de préparation de cals de cellules indifférenciées selon l'invention, on observe que selon les doses hormonales dans le milieu, différents types de cals sont induits : des cals globuleux (FIG 2 et 3), adaptés à la régénération de plantes entières du genre Népenthès par caulogenèse, c'est-à-dire des cals de nature organogénique, et des cals friables (FIG 4 et 5), adaptés à la régénération de plantes entières du genre Népenthès par embryogenèse somatique, c'est-à-dire des cals de nature embryogénique. Pour obtenir des cals friables ou de nature embryogénique, adaptés à la régénération de plantes entières du genre Népenthès par embryogenèse somatique, le milieu comprend de préférence 0,1-1 mg/L d'auxine (de préférence de 2,4-D) et 0-0,15 mg/L de cytokinine (de préférence de TDZ). Pour l'induction de cal embryogénique, on ajoute de préférence au milieu de base du 2,4-D (0,1-1 mg/L) et du TDZ (0-0,15 mg/L). Les cals issus de ces combinaisons sont friables, et la présence de MPEs à différents stades de maturation a été mise en évidence via des observations microscopiques (FIG 6, 7 et 8). Pour obtenir des cals globuleux ou de nature organogénique, adaptés à la régénération de plantes entières du genre Népenthès par caulogenèse, le milieu comprend de préférence 0,1-1 mg/L d'auxine (de préférence de 2,4-D) et 0-0,2 mg/L de cytokinine (de préférence de TDZ). Bien que la raison n'en soit pas connue, ces deux types de cals peuvent être obtenus pour une même combinaison hormonale sur des expiants racinaires différents. Ces résultats sont reproductibles sur un grand nombre d'expiants. La présente invention décrit dans un deuxième temps comment régénérer Népenthès à partir d'un cal via de l'embryogenèse somatique (FIG 1). La présente invention concerne donc également un procédé de régénération de plante entière du genre Népenthès, comprenant les étapes suivantes - Préparation de cals de cellules indifférenciées de nature embryogénique par 15 le procédé décrit ci-dessus, obtention d'embryons somatiques, - maturation des embryons somatiques, et germination des embryons somatiques. 20 Ce processus se résume donc en 4 étapes: (i) l'induction d'un cal embryogénique à partir d'expiants, de préférence racinaires, exposés à un milieu de base comprenant une auxine et/ou une cytokinine (avantageusement du 2,4-D et du TDZ) (milieu #2A), (ii) la formation d'embryons globulaires, avantageusement sur un milieu de base dépourvu de la combinaison hormonale initiale, auquel on ajoute de préférence de 25 l'ABA, des polyamines et/ou un agent mimant la déshydratation (milieu #2B), (iii) la maturation des embryons, avantageusement sur le milieu de base contenant de préférence de l'ABA, des polyamines et/ou un agent mimant la déshydratation (milieu #2C), et (iiii) la germination des embryons, avantageusement sur un milieu de base dépourvu de phytohormones ou comprenant comme seule phytohormone de l'acide 30 gibbérellique (GA3) (à une concentration de 0,01 mg/L à 10 mg/L, avantageusement 0,1-5 mg/L). La formation des embryons s'effectue sur un milieu de base dans lequel la combinaison hormonale initiale est éliminée car le 2,4-D inactive les gènes activateurs de l'embryogenèse somatique [151. Les inventeurs ont pu observer la formation et la maturation d'embryons (E) sur un milieu dépourvu d'hormone à partir d'un cal induit sur 0,1 mg/L de 2,4-D (FIG 9). Au milieu de formation et de maturation des embryons, on peut également ajouter de l'ABA (à une concentration de 0,01 mg/L à 10 mg/L, avantageusement 0,026-2,6 mg/L) et/ou des polyamines (à une concentration de 1 mg/L à 1 g/L, avantageusement 2-20 mg/L) et/ou un agent mimant une déshydratation comme le Polyéthylène glycol (PEG) (à une concentration de 10 g/L à 200 g/L, avantageusement 100 g/L). Par polyamines, on entend les molécules intervenant comme facteurs de croissance dans la formation et la maturation des embryons, en ne se limitant pas à l'ornithine, la putrescine, la cadaverine, la spermine ou la spermidine. Par agent mimant une déshydratation, on entend notamment toute molécule compliquant l'absorption de l'eau par les tissus végétaux, en ne se limitant pas au PEG. La présente invention décrit dans un troisième temps comment régénérer des Népenthès à partir d'un cal via un processus de caulogenèse (FIG 1). La présente invention concerne donc également un procédé de régénération de plante entière du genre Népenthès, comprenant les étapes suivantes : préparation de cals de cellules indifférenciées de nature organogénique par 20 le procédé décrit ci-dessus, - mise en place de l'appareil photosynthétique, - organogenèse de la tige feuillée, et - induction du système racinaire adventif. Ce processus s'effectue donc en 4 étapes: (i) l'initiation d'un cal organogène en 25 exposant l'expiant racinaire à un milieu contenant des auxines et des cytokinines (milieu #3), (ii) la mise en place de l'appareil photosynthétique, avantageusement par un choix judicieux sur la quantité de la lumière (0-300 �mol/m2/sec) et la qualité de la lumière (blanche ou verte (510-540 nm), bleue (430-460 nm), jaune (580-590 nm), rouge proche (640-660 nm) et/ou rouge lointain (720-740 nm)), (iii) la caulogenèse ou organogenèse 30 de la tige feuillée, avantageusement induite soit par la balance hormonale de départ (milieu #4) soit par un milieu dépourvu d'auxines et enrichi en cytokinines, et (iiii) l'induction du système racinaire adventif, avantageusement sur un milieu enrichi en auxine. Au milieu de base, de préférence celui mentionné ci-dessus, on ajoute donc le milieu d'induction de cal organogène comprenant 0,1-1 mg/L mg/L d'auxine (de préférence de 2,4-D) et 0-0,2 mg/L de cytokinine (de préférence de TDZ) (milieu #3). Avec 1 mg/L de 2,4-D et de 0,2 mg/L TDZ (milieu #4), un cal de type globuleux a été induit au bout de 2 mois. Cette même dose hormonale a généré en quelques semaines une plantule (FIG 10) et permis la mise en place d'appareil photosynthétique sous une faible quantité de lumière (4,2 �mol/m2/sec), en faisant pencher la balance hormonale interne vers les cytokinines . Cette invention est une méthode de régénération de plantes du genre Népenthès comprenant trois points: la callogenèse, qui sert de base aux deux autres étapes alternatives : l'embryogenèse somatique, ou l'organogenèse indirecte de plantes du genre Népenthès. Les amas de cellules indifférenciées obtenus par callogenèse sont capables de générer des plantes entières soit par embryogenèse somatique soit par organogenèse de tiges feuillées. Cette invention est un moyen efficace de multiplier dans un minimum de temps un grand nombre des plantules de bonne qualité sans signe de chlorose, de produire des semences artificielles et de générer des plantules. Elle répond à la fois au besoin écologique, i.e. la multiplication de plantes pour la conservation de ces espèces, au besoin commercial, i.e. la multiplication de plantes pour l'attrait ornemental lié à ce type de plante et au besoin pharmaceutique, i.e. la multiplication de plantes pour la production de molécules naturelles à usage thérapeutique. 1125 EXEMPLE 1 Composition des milieux de culture A. Milieu minéral de base MS (Murashije et Skoog (1962)) et ses vitamines /5! Nom Formule 'Concentration (mg/L) Macroéléments NH4NO3 1650 Ammonium nitrate Potassium Nitrate KNO3 ' 1900 Calcium Chloride CaC1222H2O 440 dihydrate MgSO4, 71-12O 370 Magnesium Sulfate Heptahydrate KH2PO4 170 Potassium phosphate monobasic, anhydrous FeSO4, 71-12O 27,8 Ferrous Sulfate Heptahydrate C 10H 14N2O8Na2, 2H20 37,3 EDTA Microéléments KI 0,83 Potassium Iodide Borie Acid H3BO3 6,2 Manganese Sulfate MnSO4, H2O 6,9 monohydrate ZnSO4, 7H2O 8,6 Zinc Sulfate Molybdic Acid Na2MoO4, 2H2O 0,25 Cupric Acid CuSO4, 5H2O 0,025 Cobalt Chloride CoC12, 6H20 0,025 Vitamines 'C6H12O2 100 Myo-inositol Nicotinic Acid C6H5NO2 0,5 Glycine C2H5N0 2 2,0 Thiamine (Vitamin Bi) C12H17C1N4OS, HC1 0,1 Pyridoxine (Vitamin B6) C8H11NO3, HCl 0,5 Hydrochloride B. Compléments nutririfs Saccharose Hydrolysat de caséine 13 C. Antioxydants Acide ascorbique (Vitamine C) Acide citrique PVP (Polyvinylpyrrolidone) D. Autres molécules Polyamines (Spemine, Spermidine, Putrescine) Polyéthylène glycol (PEG) 10 E. Hormones de croissance Acide 2,4-Dichlorophenoxyacétique (2,4-D) Thidiazuron (TDZ) Acide Abcsissique (ABA) Acide Gibbérélique (GA3) 15 E Agent gélifiant Phytagel G Milieu #1: Milieux d'induction de la callogenèse' 20 MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D MS + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ 25 MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D MS + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ 30 MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D MS + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ5 MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D MS + 1 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ 10 MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS xl, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP l g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 aprés l'autoclavage. H. Milieux #2A: Milieux d'induction de cals embryogéniques' MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS xl, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. 30 I. Milieux #2B: Milieux de formation des embryons somatiques' MS '/2 MS '/2 + 0,026 mg/L ABA 15 20 25 MS + 0,26 mg/L ABA MS '/2 + 2,6 mg/L ABA MS '/2 + 2 mg/L PAs (Polyamines) MS '/2 + 20 mg/L PAs (Polyamines) MS + 100 g/LPEG Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS xl, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. J. Milieux #2C: Milieux de maturation des embryons somatiques MS '/2 MS '/2 + 0,026 mg/L ABA MS '/2 + 0,26 mg/L ABA MS '/2 + 2,6 mg/L ABA MS '+ 2 mg/L PAs (Polyamines) MS '/2 + 20 mg/L PAs (Polyamines) MS '/2 + 100 g/LPEG Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS x 1, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, 20 Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. K. Milieux #2D: Milieux de germination' MS MS '/2 + 0,1-5 mg/L GA3 25 1 Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS x1, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. L. Milieu #3 : Milieu d'induction de cal organogénique ' 30 MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D 15 MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L, TDZ MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,05 mg/L TDZ MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS %2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,1 mg/L TDZ MS'/2+0,1 mg/L2,4-D+0,15 mg/LTDZ MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,15 mg/L TDZ MS '/2 + 0,1 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 0,25 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 0,5 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 0,75 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ Tous ces milieux contiennent: Vitamines MS xl, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. M. Milieu #4: Milieu d'organogenèse indirecte / MS '/2 + 1 mg/L 2,4-D + 0,2 mg/L TDZ Ce milieu contient: Vitamines MS xl, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Saccharose 20 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant l'autoclavage. EXEMPLE 2 Matériel végétal Le matériel végétal correspond aux explants racinaires de Nepenthes alata, cultivés sur un milieu dont la composition est la suivante: MS %2, Vitamines '/2, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, Charbon activé 2 g/L et Phytagel 3 g/L. Ces plantes entières sont cultivées à 23°C sous une photopériode de 16 h de lumière et 8 h d'obscurité. EXEMPLE 3 Conditions de culture Les explants racinaires sont mis à l'obscurité à 23°C le temps de l'induction. Les cals sont ensuite laissés à l'obscurité pour les premières étapes de l'embryogenèse somatique et ensuite mis sous une faible quantité de lumière. Pour l'organogenèse indirecte, les cals sont placés sous une faible quantité de lumière. EXEMPLE 4 INDUCTION DE LA CALLOGENESE chez Nepenthes alata Les explants racinaires sont exposés pendant 2 mois à une balance hormonale de 2,4-D (0-1 mg/L) et de TDZ (0- 0,2 mg/L) établie sur le milieu de base contenant: MS Vitamines MS xl, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L et Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 avant autoclavage. Les explants sont placés à l'obscurité à 23°C. Selon les doses hormonales utilisées, les racines vont réagir de manière différente. En effet, en un mois et demi, on observe soit un simple épaississement de la racine, soit l'induction d'un cal ayant une structure globuleuse gluante (FIG 2 et 3), soit l'induction d'un cal ayant une structure friable (FIG 4 et 5). Ces différentes structures peuvent s'observer sur un même expiant racinaire. Ces hormones synthétiques ont un très fort pouvoir sur les tissus végétaux. Ici, elles ont réussi à dévier les cellules de leur programme de différenciation initial. Maintenant, il s'agit de déterminer quelle(s) combinaison(s) hormonale(s) ou quel(s) type(s) de cal va donner des embryons somatiques ou des bourgeons. D'autres doses avec d'autres hormones ont donné des cals comme l'association de 2,4-D (0,1-2 mg/L) avec la kinétine (0-2 mg/L). 30 Concentration de 2,4-D (mg/1) 0 0.1 0.25 0.5 0.75 1 Globuleux Globuleux Globuleux Epaississement Épaississement Friable Friable Épaississement Epaississement Epaississement 0.05 Epaississement Epaississement Globuleux Globuleux Friable Friable Friable Friable Epaississement Epaississement Epaississement 0.1 Epaississement Globuleux Globuleux Friable Globuleux Globuleux Epaississement Epaississement Epaississement Epaississement Epaississement Epaississement Globuleux Globuleux Friable Globuleux Globuleux Friable Epaississement Epaississement Epaississement 0.2 Epaississement Globuleux Globuleux Globuleux Globuleux Globuleux EXEMPLE 5 INDUCTION D'UN CAL EMBRYOGENIQUE de Nepenthes alata Les expiants racinaires sont exposés pendant 2 mois à une balance hormonale de 2,4-D (0,1-1 mg/L) et de TDZ (0-0,15 mg/L) établie sur le milieu de base contenant : MS Vitamines MS x 1, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L et Phytagel 3 g/L à pH 5,8 aprés autoclavage. Les expiants sont placés à l'obscurité à 23°C. Des observations microscopiques ont démontré que les cals friables induits par ces doses hormonales présentent des structures caractéristiques des cals embryogéniques: les MPEs. Ces MPEs sont d'ailleurs à différents stades de maturation: MPEs I, MPEs II et MPEs III selon les travaux menés par Filinova et al (2000) sur Picea abies [l61(FIG 6, 7 et 8). 0.1515 EXEMPLE 6 FORMATION ET MATURATION DES EMBRYONS SOMATIQUES de Nepenthes alata Le cal embryogénique induit sur le milieu d'induction contenant 0,1 mg/L 2,4-D est placé sur un milieu sans hormone, dont la composition de base est: MS Vitamines MS xl, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L. Les cals sont placés à 23°C. Ce cal a généré des embryons somatiques de N. alata en un mois. Ils sont organisés en grappe et sont à différents stades de maturation vis-à-vis de deux études histologiques menées sur les embryons d'Agapanthus praecox [17] et Coffea arabica [' I (FIG 9). Leur formation et leur maturation peuvent être aidées par la présence d'acide abscissique et/ou de polyamines et/ou de PEG. EXEMPLE 7 GERMINATION DES EMBRYONS de Nepenthes alata Les embryons pourrront être amenés à germination sur un milieu sans hormone: MS '/2, Vitamines MS xl, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L, Phytagel 3 g/L (milieu #2D). EXEMPLE 8 INDUCTION D'UN CAL ORGANOGENE de Nepenthes alata Les explants racinaires sont exposés pendant 2 mois à une balance hormonale de 0,1-1 mg/L de 2,4-D et de 0-0,2 mg/L de TDZ établie sur le milieu de base contenant: le milieu minéral de base MS '/2 , vitamines MS xl, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L et Phytagel 3 g/L, à pH 5,8 aprés autoclavage (milieux #3). Les explants sont placés à l'obscurité à 23°C. Les cals générés par cette combinaison hormonale sont des cals de type globuleux.30 EXEMPLE 9 MISE EN PLACE DE L'APPAREIL PHOTOSYNTHETIQUE Des tests sur l'effet de l'intensité de la lumière ont été menés et ont montré que les cals globuleux sous une quantité moyenne de lumière (68 �mol/m2/sec) ont bruni très rapidement, tandis que les cals placés sous une quantité de lumière très faible (4,2 �mol/m2/sec) ont mis en 4-5 jours leur appareil photosynthétique en place. Ils seraient donc sensibles à l'intensité lumineuse. La mise en place de leur appareil synthétique est un pas de plus vers la capacité à générer des tiges feuillées, puisqu'elle atteste de la présence de cytokinines endogènes activant la synthèse de la chlorophylle. EXEMPLE 10 ORGANOGENESE INDIRECTE de Nepenthes alata Les cals ayant été induits sur le milieu dont la composition est la suivante : le mileir minéral de base MS1/2, vitamines MS *1, Saccharose 20 g/L, Hydrolysat de caséine 0,5 g/L, PVP 1 g/L, Acide ascorbique 100 mg/L, Acide citrique 50 mg/L et Phytagel 3 g/L avec les doses hormonales 1 mg/M de 2,4-D et de 0,2 mg/L de TDZ, ont généré en quelques semaines une plantule sur ce même milieu (milieu #4) (FIG 10). Cette balance hormonale a suffi à faire pencher le programme interne des cellules vers les cytokinines, hormones favorisant la caulogenèse. Néanmoins, on peut aider ce processus en exposant les cals globuleux à des cytokinines exogènes comme la kinétine, la zéatine ou le BAP. REFERENCES [1] Juniper, B. E., Robins, R.J., and Joel, D. M. (1989). 25 The Carnivorous Plant. Academic Press, San Diego, 353 pp. [2] Clarke, C. (1997). Nepenthes qf Borneo. Natural History Publications, Borneo, 207 pp. 30 [3] Site Internet: http://fr.wikipedia.org Consulté le 19/05/08. [4] Khompat, K., Tokhao, W., and Jantasilp, A. (2007). Factors affecting in vitro seed germination and shoot multiplication of pitcher 35 plant (Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce. Songklanakarin Journal of Science and Technology 29 (2): 253-260. [5] Murashige, T., and Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol Plant 15 (3): 473-497. [6] Wang, Y.-X., Wang, X.-F., Ma, Z.-Y., Zhang, G.-Y., Han, G.-Y., and Zhang, Y.-M. (2006). Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration from Two Recalcitrant Genotypes of Gossypium hirsutum L. Agricultural Sciences in China 5 (5): 323-329. [7] Zhang, C.-L. , Chen, D.-F. , Kubalakova, M. , Zhang, J. , Scott, N.W. , Elliott, M.C. , and Slater, A. (2008) Efficient somatic embryogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) breeding fines. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 93 (2): 209-221. [8] Marsoni, M., Bracale, M., Espen, L., Prinsi, B., Negri, A.S., and Vannini, C. (2008). Proteomic analysis of somatic embryogenesis in Vitis vinifera. Plant Cell Reports 27 (2): 347-356. 20 [9] Saji, K.V., and Sujatha, M. (1998). Embryogenesis and plant regeneration in anther culture of sunflower (Helianthus annuus L.). Euphytica 103 (1): 1-7. [1 0] Rout, G R., Samantaray, S., Mottley, J., Yokoya, K., Mandegaran, Z., Sarasan, V., 25 Kandasamy, K., Roberts, A. V., and Das, P. (1998). Histology of in vitro organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa. Biologia 53 (1): 121-126. [Il] Quiroz-Figueira, F., Fuentes-Cerda. C., Rojas Herrera, R., and Loyola-Vargas, V. 30 (2002). Histological studies on the developmental stages and differentiation of two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Cell Reports 20 (12): 1141-1149. 35 [12] Zhang, C.-L., Chen, D.-F., Elliott, M.C., Slater, A. (2004). Efficient procedures for callus induction and adventitious shoot organogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) breeding fines. In Vitro Cellular and Developmental Biology û Plant 40 (5): 475-481. 40 [13] Chauhan, M., and Kothari, S. L. (2004). Optimization of nutrient levels in the medium increases the efficiency of callus induction and plant regeneration in recalcitrant Indian barley (Hordeum vulgare L.) in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40 (5): 520-527. 45 [14] Fehér, A., Pasternak, T. P., and Dudits, D. (2003). Transition of somatic plant cells to an embryogenic state. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74 (3): 201-228.15 [15] Zimmerman, J. L. (1993). Somatic Embryogenesis: A Mode] for Early Development in Higher Plants. The Plant Cel l 5: 1411-1423. [16] Filinova, L. H., Bozhkov, P.V., and Von Arnold, S. (2000). Developmental pathway of somatic embryogenesis in Picea abies as revealed by time-lapse tracking. Journal of Experimental Botany 51 (343): 249-264. [17] Suzuki, S., Oota, M., and Nakano, M. (2002). Embryogenic callus induction from leaf explants of the Liliaceous ornamental plant, Agapanthus praecox ssp. Orientalis (Leighton) Leighton. Histological study and response to selective agents. Scientia horticulturae 95 (2) : 123-132.15 REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de cals de cellules indifférenciées du genre Népenthès, comprenant l'exposition d'un expiant de plante du genre Népenthès à un milieu de culture solide et/ou liquide comprenant une auxine et/ou une cytokinine. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'auxine appartient au groupe constitué du 2,4-D, NAA, IAA, Dicamba, Picloram, et de leurs mélanges. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la cytokinine appartient au groupe constitué du TDZ, Kinétine, Zéatine, et de leurs mélanges. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-3, caractérisé en ce que l'induction de cals est réalisée à l'obscurité. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cals obtenus sont de nature ernbryogénique. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 20 les cals obtenus sont de nature organogénique. 7. Procédé de régénération de plante entière du genre Népenthès, comprenant les étapes suivantes: - Préparation de cals de cellules indifférenciées de nature embryogénique par 25 le procédé selon la revendication 5, - obtention d'embryons somatiques, - maturation des embryons somatiques, et - germination des embryons somatiques. 30 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'obtention et la maturation d'embryons somatiques sont réalisées à l'obscurité sur un milieu solide et/ou liquide dépourvu d'auxines, et éventuellement complémenté d'acide15abscissique et/ou de polyamines, et/ou de polyéthylène glycol. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que la germination des embryons somatiques s'effectue à la lumière sur un milieu solide et /ou liquide dépourvu de phytohormones ou comprenant comme seule phytohormone de l'acide gibbérellique GA3. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications7 à 9, caractérisé en ce que la germination des embryons somatiques s'effectue sous une lumière blanche ou une lumière bleue et/ou verte et/ou jaune et/ou rouge proche et/ou rouge lointain, dont la quantité est comprise entre 1 à 300 �mol/m2/sec. 11. Procédé selon de régénération de plante entière du genre Népenthès comprenant les étapes suivantes: Préparation de cals de cellules indifférenciées de nature organogénique par le procédé selon la revendication 6, - mise en place de l'appareil photosynthétique, organogenèse de la tige feuillée, et - induction du système racinaire adventif. 14. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la mise en place de l'appareil photosynthétique du cal et l'organogenèse de la tige feuillée s'effectuent sur le même milieu solide et/ou liquide de préparation du cal, ou sur un milieu dépourvu d'auxines et enrichi en cytokinines. 15. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la cytokinine appartient aux groupes constitué du TDZ,, de la Kinétine, de la Zéatine, et de leurs mélanges. 30 14. Procédé selon la l'une quelconque des revendications 11-13, caractérisé en ce que la mise en place de l'appareil photosynthétique du cal et l'organogenèse de la tige feuillée s'effectuent sous une lumière blanche ou une lumière bleue et/ou25verte et/ou jaune et/ou rouge proche et/ou rouge lointain, dont la quantité est comprise entre 1 à 300 �mol/m`/sec. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11-14, caractérisé en ce que 5 l'induction du système racinaire adventif s'effectue sur un milieu enrichi en auxine. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'auxine appartient au groupe constitué du 2,4-D, NAA, IAA, Dicamba, Picloram, et de leurs mélanges. 10