Brevet FR2931485A1 — publié le 20091127

Vaccin antitumoral comprenant; des cellules tumorales modifiées La présente invention se situe dans le domaine de la vaccination anti-tumorale préventive ou thérapeutique. Des observations récentes ont amoindri les doutes relatifs à l'existence d'une réponse immunitaire efficace capable de guérir le cancer au niveau clinique. Néanmoins, les antigènes tumoraux (ou � Tumor associated antigens � ou � TAA �) se sont avéré être dans le meilleur des cas des immunogènes faibles. Les vaccins à base de cellules tumorales sont une alternative intéressante à l'immunisation avec des peptides ou de l'ADNc. A l'heure actuelle, ils comprennent généralement des cellules apoptotiques ou des extraits de cellules. En fait, certains des premiers essais cliniques ont utilisé des cellules tumorales autologues irradiées pour promouvoir la réponse immunitaire antitumorale (1). Mais les cellules apoptotiques ou les extraits de cellules se sont avéré ne pas être des immunogènes forts et conduisent à une activation déficiente du système immunitaire contre les cellules tumorales. Les cellules vivantes devraient être de meilleurs immunogènes que les cellules mourantes, mais ces cellules tumorales doivent être éliminées rapidement et efficacement par le système immunitaire hôte, qui en sus doit être largement activé, conduisant à l'immunisation tumorale. Les efforts sont maintenant principalement dirigés vers le développement par génie génétique de cellules effectrices, par exemple des cellules dendritiques (DC). Une autre possibilité, bien que moins explorée, consiste en l'altération de cellules tumorales pour les rendre fortement immunogènes. Un exemple serait d'augmenter le nombre de cellules tumorales subissant l'apoptose pour induire une réponse immunitaire satisfaisante. La kinase ERK5 (� Extracellular-regulated kinase 5 �) ou MAPK7 (� mitogen-activated protein kinase 7�) ; (2, 3), présente chez les lymphocytes T normaux et leucémiques (4), partage le motif d'activation TEY (Thr-Glu-Tyr) avec d'autres kinases ERK. Ses autres caractéristiques structurales sont en revanche uniques, tel que le large domaine régulateur C-terminal qui contrôle son transport nucléo-cytoplasmique (5). ERK5 relaie la signalisation liée à la survie et à la prolifération dépendante de ErbB (6), Ras (7), du sérum (8), de IGF-II (9), Bcr-Abl (10) et IL-6 (11). Différents groupes ont décrit l'implication de la cascade ERK5 dans des cellules tumorales. Il a par exemple été mis en évidence que ERK5 joue un rôle significatif dans la prolifération des cellules du cancer du sein (6, 8). Un lien a également été établi entre la surexpression de la kinase MEK5 qui active ERK5 et le développement de métastases osseuses conduisant à un pronostic peu favorable pour le cancer de la prostate chez l'homme (12). ERK5 est également nécessaire à la chimiorésistance dans des cellules de cancer du sein (13) et elle relaie la survie cellulaire dans des cellules pulmonaires cancéreuses (9). ERK5 est également exprimée dans des cellules de myélome, où son inhibition bloque la prolifération et facilite l'apoptose induite par la dexaméthasone (11). L'expression de ERK5 est également -2- essentielle à la survie de cellules leucémiques exprimant Bcr/Abl (10). Par ailleurs, toutes les cellules de lymphomes de Hodgkin expriment une voie métabolique ERK5 constitutionnellement active (14). Enfin, l'expression des miARN (ou � micro ARN � ou � miR �) -143 et -145, dont il a précédemment été montré que les niveaux d'expression étaient réduits dans des cellules de cancers du colon et dans différentes lignées de cellules tumorales est également réduite dans la plupart des lymphocytes B malins, dont les cellules de leucémies chroniques lymphoïdes (LCL), de lymphomes de type B, de lignées de lymphocytes B transformés avec le virus d'Epstein-Barr (EBV) et de lignées de cellules de lymphome de Burkitt. Tous les échantillons testés issus de 13 patients atteints d'une LCL et de huit patients sur neuf atteints d'un lymphome de type B ont montré un niveau très faible niveaux d'expression des miR -143 et - 145. Les niveaux d'expression des miR -143 et -145 sont également faibles dans des lignées de cellules humaines de lymphome du Burkitt et sont inversement corrélés avec la prolifération des cellules de lignées de lymphocytes B transformés avec le virus d'Epstein-Barr (EBV). De plus l'introduction de miR -143 précurseur ou mature dans des cellules de Raji conduit à une inhibition significative dose-dépendante de la croissance, et ERK5 a été identifié comme étant l'une des cibles de miR-143, confirmant les résultats obtenus avec des cellules humaines de cancer du colon (35). ln vivo, l'invalidation des gènes ERK5 ou MEK5 affecte à la fois l'angiogenèse embryonnaire et le développement cardiaque et conduit à la mort de l'embryon après 11,5 jours (15-17). L'importance de la fonction de ERK5 dans les cellules endothéliales est confirmée par la délétion ciblée de ERK5 chez des souris adultes, qui perturbe l'intégrité vasculaire et conduit à la mort par le biais d'une défaillance endothél ale (18). ERK5 est également requis pour la néovascularisation associée aux tumeurs. Chez des souris ERK5-flox/flox porteuses du transgène Mxl-Cre, la délétion du gène hôte ERK5 réduit le volume des xénogreffes tumorales et conduit à une diminution significative de la densité vasculaire (19). Ainsi, ERK5 joue un rôle central dans divers procédés liés à la tumorigenèse : transduction de signaux oncogéniques intracellulaires, angiogenèse associée aux tumeurs, et dans certains cas invasion/métastases. De façon intéressante, des cellules MEF ERK5-/- subissent l'apoptose dans des conditions basales et des cellules MEF ERK5+/- sont aussi sensibilisées à l'apoptose induite par le sorbitol, suggérant qu'une faible réduction des niveaux de ERK5 a des effets significatifs (20), fait également observé par les inventeurs (21). Ces observations suggèrent que ERK5 joue un rôle important dans l'oncogenèse, dont le mécanisme demeure peu caractérisé. Les résultats obtenus récemment par les inventeurs (21) montrent que ERK5 relaie l'activation du facteur de transcription anti-apoptotique NF-KB chez des lymphocytes T leucémiques humains et murins. Le knockdown de ERK5 par � shERK5 �, un ARN court en épingle à cheveux (ou � shARN � ou � short hairpin RNA �), réduit la viabilité cellulaire et sensibilise les cellules à l'apoptose induite par l'intermédiaire des récepteurs de mort. Les inventeurs ont également mis en évidence dans leurs précédents travaux que des -3- cellules de la lignée EL4 de lymphocytes T issues d'un lymphome murin exprimant shERK5 (cellules EL4-shERK5), prolifèrent in vitro mais n'induisent pas de tumeurs sous-cutanées in vivo chez la souris. Ces données suggèrent que ERK5 est essentiel à la survie des lymphocytes T leucémiques humains et murins et par conséquent représente une cible prometteuse pour une intervention thérapeutique dans ce type de malignité. Le système immunitaire est un système intégré complexe mettant en jeu des cellules produites au niveau de la moelle osseuse, en particulier les lymphocytes B, T et NK, les cellules dendritiques, les cellules de Langerhans, les monocytes, les macrophages, les neutrophiles, mastocytes, basophiles et éosinophiles. On distingue la réponse immunitaire � innée � ou � naturelle � présentant notamment comme caractéristiques le fait d'être immédiate et non antigène-spécifique, de la réponse � adaptative � ou � acquise �, présentant notamment comme caractéristiques le fait d'être retardée et antigène-spécifique. La réponse adaptative présente en outre comme caractéristique contrairement à la réponse innée le fait que le déclenchement d'une réaction contre une seconde agression par un même antigène (réponse secondaire) sera plus efficace et plus rapide que la réponse primaire. Les cellules tueuses naturelles (ou NK), qui jouent un rôle critique dans l'immunité anti-tumorale innée, tuent spontanément des cellules ayant un comportement aberrant, par exemple des cellules tumorales, tout en épargnant les cellules saines. En particulier, les cellules NK tuent les cellules tumorales ayant échappé au contrôle des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) en diminuant le niveau d'expression des protéines du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I (CMH-I). L'activation ou l'inhibition des cellules NK est régulée de manière fine par l'intégration de signaux provenant soit de récepteurs inhibiteurs, soit de récepteurs activateurs. L'ensemble de ces signaux contrôle l'activité lytique des cellules NK qui libèrent des perforines et des granzymes ou expriment des ligands de récepteurs de mort, entraînant la mort par apoptose des cellules cibles. Les récepteurs inhibiteurs ou � KIR � sont spécifiques de molécules du CMH de classe I. ln vivo, les cellules NK peuvent être recrutées localement par le biais de l'inoculation de cellules tumorales, de préférence de celles dépourvues d'une expression du CMH-1 appropriée (22). Leur versatilité en fait des cibles attractives à exploiter dans des approches cliniques du cancer (23, 24). Les cellules NK peuvent être particulièrement bénéfiques dans des cancers transmis par le sang, tels que les leucémies et lymphomes, en raison de l'abondance des cellules NK au niveau du sang périphérique et de la rate. De plus, de nouvelles données suggèrent que l'immunothérapie basée sur les cellules NK pourrait être utilisée en combinaison avec la transplantation de cellules souches (ou � SCT �). Des études cliniques pilotes ont montré que le transfert adoptif cellules NK dérivées du donneur consolide la prise de greffe chez des patients atteints de leucémies aiguës myéloïdes (ou � LAM �) après transplantation avec des cellules SCT haplo-identiques (25, 26). -4- Les inventeurs ont maintenant mis en évidence d'une part le fait que sous certaines conditions de cultures, des cellules tumorales modifiées in vitro ou ex vivo pour présenter un phénotype ERK5 négatif présentent également un phénotype CMH-I négatif, et d'autre part le fait des cellules tumorales présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif peuvent être utilisées en tant que vaccin vivant antitumorail. En effet, ils ont montré que l'administration de cellules tumorales présentant un phénotype E.RK5 négatif et CMH-I négatif à des souris, induit une réponse immunitaire innée mettant en oeuvre les cellules NK à l'encontre non seulement des cellules tumorales modifiées administrées mais également à l'encontre des cellules tumorales � endogènes � présentant un phénotype CMH-I positif. Cela peut être expliqué par le fait que les cellules NK une fois activées par les cellules tumorales administrées, sont capables de lyser des cellules tumorales CMH-1 positives du fait de l'activation de récepteurs activateurs tels que CD94/NKG2C, NKG2D, KIR2DS. Les antigènes MIC-A, MIC-B (deux molécules du CMH-I induites par le stress et interagissant directement avec le récepteur activateur NKGi2D) et hsp7O exprimés par les cellules tumorales � endogènes � (ou � wt � ou � sauvages �) vont alors être reconnus par les cellules NK activées et être à même de déclencher la lyse des cellules tumorales en dépit du fait qu'elles présentent un phénotype CMH-I positif. De plus, il est probable que la présentation par les cellules dendritiques des antigènes issus de la lyse des cellules cancéreuses par les cellules NK, active également une réponse immunitaire adaptative impliquant les lymphocytes T cytotoxiques (CTL). De plus les inventeurs ont mis en évidence chez la souris le fait que l'emploi de cellules tumorales cumulant les phénotypes ERK5 négatif et CMH-I négatif présentait un avantage en terme d'efficacité de l'action anti-tumorale sur l'emploi de cellules présentant uniquement un phénotype CMH-I négatif (voir exemple 1, tableau 1), suggérant que l'effet anti-tumoral n'est pas lié uniquement au phénotype CMH-1 négatif et que le phénotype ERK5 négatif permet d'obtenir un effet anti-tumoral supplémentaire. Les résultats présentés ici montrent notamment que des cellules tumorales modifiées in vitro ou ex vivo pour présenter un phénotype ERK5 négatif présentent un niveau élevé d'expression de Fas et un faible niveau d'expression de la protéine anti-apoptotique c-FLIP (Fig. 12, 16, 17). Ces cellules sont par conséquent d'excellentes cibles pour les cellules exprimant FasL, telles que les cellules NK et les lymphocytes T cytotoxiques. De plus, l'expression de c-FLIP est régulée par NF-xB, dont il a été montré que l'activation est régulée par ERK5 (21). Enfin, les inventeurs ont mis en évidence le fait que des cellules tumorales cumulant les phénotypes ERK5 négatif et CMH-I négatif scnt rapidement éliminées de l'organisme (en moins de trois jours chez la souris). Ces cellules sont par conséquent adaptées à un usage en thérapie. -5- Les inventeurs se sont intéressés plus particulièrement à la promotion de la réponse immunitaire pouvant être induite chez la souris par les cellules tumorales EL4 modifiées pour exprimer l'ARN court � shERK5 � qui permet par un mécanisme d'interférence de réduire le niveau d'expression de la protéine ERK5 dans la cellule. Ils ont montré que ces cellules cancéreuses � atténuées � modifiées de manière à présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif sont à même de protéger des souris de la leucémie. Les inventeurs ont également mis en évidence le fait que les cellules EL4-shERK5 sont éliminées trois jours après injection, autrement dit bien avant le temps nécessaire au déclenchement d'une réponse immunitaire adaptative. Les inventeurs ont supposé que le système immunitaire inné, et en particulier les cellules NK, était impliqué dans cette réponse. Les résultats obtenus ont confirmé cette hypothèse, montrant que les cellules NK éliminent efficacement les cellules EL4-shERK5 in vivo principalement en raison de la forte diminution du niveau d'expression du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I) par ces cellules et de leur sensibilité accrue aux récepteurs de mort. Les inventeurs ont émis l'hypothèse selon laquelle une telle activation du système immunitaire pourrait être à même d'induire une réponse immunitaire à l'encontre des tumeurs causées par des cellules de type sauvage (ou � wt �). Cette hypothèse a été confirmée par des expérimentations à court terme et à long terme. En contraste avec les cellules Yac-1 dérivées d'un lymphome induit par le virus M-MLV, les cellules EL4 sont dérivées d'un lymphome induit chez une souris C57BL par le 9,10-diméthyl-1,2-benzanthracène. La réponse immunitaire induite par les cellules EL4-shERK5 a protégé les souris contre des leucémies induites par des rétrovirus. De plus, les cellules EL4-shERK5 ont protégé les souris plus efficacement que les cellules Yac-1 qui présentent également un niveau d'expression du CMH-1 fortement diminué. Les cellules EL4-shERK5 présentent en outre un niveau d'activation de NF-KB diminué, ce qui les rend très sensibles à l'apoptose induite par les récepteurs de mort (21). Ceci pourrait expliquer pourquoi ces cellules sont de meilleures cibles pour les cellules NK que les cellules Yac-1, et induisent une réponse immunitaire anti-tumorale aussi efficace. Dans ce contexte, les cellules NK jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire anti-tumorale à l'encontre des cancers du sang, en raison de la présence prédominante de cellules NK au niveau du sang périphérique et de la rate (23). En conséquence, les inventeurs ont préparé des cellules qui induisent une réponse immunitaire à l'encontre de lymphocytes leucémiques. Dans leurs travaux, les inventeurs ont notamment montré qu'il était possible de vacciner des souris et de les protéger contre le développement de leucémies induites par des rétrovirus en utilisant des cellules tumorales modifiées de manière à ce qu'elles présentent un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. Des peptides dérivés de virus, des anticorps neutralisants ou des cellules immunitaires sensibilisées par un antigène ont été utilisés dans des études antérieures immédiatement après infection pour bloquer la réplication virale et prévenir le développement d'une leucémie (32-34). Dans cette étude, des souris ont été vaccinées avec -6- des cellules tumorales modifiées pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif non chargées avec des antigènes spécifiques, mais modifiées de manière à en faire des cibles des cellules NK. De plus, le protocole de vaccination a débuté deux mois après l'infection. Pour induire une leucémie, le virus M-MuLV doit infecter les souris dans les trois premiers jours après leur naissance. Il est en général considéré que cela empêche la génération d'une réponse immunitaire efficace à l'encontre du virus. Par conséquent, le protocole mis en oeuvre par les inventeurs a permis à la maladie de progresser durant ses premières étapes et par conséquent l'inhibition de la réponse immunitaire à l'encontre du virus devrait être effective chez ces souris. En raison du fait que les cellules EL4 ne sont pas dérivées du virus M-MuLV et ne sont probablement pas infectées par ce virus, il n'était pas prévisible qu'elles puissent induire une réponse immunitaire contre le virus. Par ailleurs, la réplication virale n'est pas requise à ce stade pour induire une leucémie. Par conséquent, les cellules exprimant shERK5 devraient induire une réponse immunitaire contre la tumeur et ne jouent aucun rôle dans l'infection virale. Les cellules tumorales modifiées pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif mises au point par les inventeurs sont susceptibles d'activer une réponse immunitaire à l'encontre d'une variété de tumeurs. Les résultats présentés ici montrent que les cellules NK jouent un rôle essentiel dans les premières étapes du processus de vaccination. Des résultats récents ont mis en évidence le rôle important joué par les cellules NK dans la réponse immunitaire adaptative. Le rôle des cellules NK pourrait impliquer un effet lié aux cellules dendritiques (DC) ou directement aux cellules NK. La présente invention est relative à une cellule animale tumorale vivante présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. En particulier, la présente invention est relative à une cellule animale tumorale vivante comprenant un ou plusieurs agent(s) d'origine exogène capable(s) dans des conditions de culture appropriées de réduire : - le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 endogène, par exemple la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 1 ou de l'un de ses équivalents chez l'animal, et - le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire, de sorte que la cellule présente un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. La présente invention est également relative à une cellule animale tumorale vivante présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif, comprenant un ou plusieurs agent(s) d'origine 35 exogène capable(s) dans des conditions de culture appropriées de réduire : -7- le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 endogène (par exemple la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 1 dans le cas d'une cellule tumorale humaine ou l'un de ses équivalents chez l'animal dans le cas d'une cellule tumorale animale), et/ou - le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. De préférence, les cellules selon l'invention se présentent sous forme isolée ou en culture. Par � cellule présentant un phénotype ERK5 négatif �, on entend une cellule présentant une réduction d'au moins 10%, de préférence de 25% à 90%, par exemple de 25% à 50% ou de 50% à 75%, du niveau d'expression ou de la quantité de protéine ERK5 présente dans la cellule par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence de l'agent exogène dans des conditions de culture identiques. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 n'est pas égale à 100%. De préférence encore, elle est comprise entre 25% et 50%, entre 45% et 55% ou entre 50 et 75%. De préférence, pour un type de cellule tumorale donné, le pourcentage de réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 est tel que les cellules peuvent être maintenues en culture pendant un durée d'au moins un, de préférence deux, trois ou six mois. Par � cellule présentant un phénotvpe CMH-I négatif �, on entend une cellule présentant une réduction de 25% à 100%, de préférence de 50% à 100%, de préférence encore de 75% à 95%, par exemple de 85% à 95%, du niveau d'expression global ou de la quantité globale au niveau de la membrane cellulaire des protéines du CMH-I par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. De préférence, pour un type de cellule tumorale donné, le pourcentage de réduction du niveau d'expression global ou de la quantité globale au niveau de la membrane cellulaire des protéines du CMH-I est tel que les cellules peuvent être maintenues en culture pendant un durée d'au moins un, de préférence deux, trois ou six mois. Par � agent d'origine exogène � on entend un agent non présent dans la cellule à l'état naturel. Par � réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 endogène�, on entend une réduction d'au moins 10%, de préférence de 25% à 90%, par exemple de 25% à 50% ou de 50% à 75%, du niveau d'expression ou de la quantité de protéine ERK5 présente dans une cellule par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité dans la cellule en l'absence de l'agent exogène dans des conditions de culture identiques. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 n'est pas égale à 100%. De préférence encore, elle est comprise entre 25% et 50%, entre 45% et 55% ou entre 50 et 75%. -8- Par � réduction du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-I �, on entend une réduction de 25% à 100%, de préférence de 50% à 100%, de préférence encore de 75% à 95 %, par exemple de 85% à 95%, du niveau d'expression ou de la quantité de l'ensemble des protéines membranaires d'une cellule faisant partie des protéines du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I) par rapport à leur niveau d'expression ou à leur quantité au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. La mesure du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans une cellule selon l'invention peut être réalisée par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, par 10 exemple par la détection par Western Blot d'anticorps spécifiques de ERK5. La mesure du niveau d'expression global ou de la quantité globale de protéines du CMH-I au niveau membranaire peut être réalisée par différentes techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par la détection par cytométrie de flux de type FACS (� Fluorescenceactivated cell sorting � / tri de cellules par fluorescence), d'anticorps marqués spécifiques de 15 protéines du CMH-I. Par � équivalents chez l'animal � de la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 1, on entend des protéines de différentes espèces animales, par exemple de la souris, du rat, du chien, du chat ou d'un autre mammifère, présentant une forte homologie ou identité de séquence et de fonction avec la protéine ERK5 humaine telle que représentée par la 20 séquence SEQ ID N°1 (voir figure 8), par exemple une protéine présentant une homologie ou une identité de séquence d'au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% avec la séquence SEQ ID N°1 de la protéine ERK5 humaine ou une protéine codée par un gène présentant une homologie ou une identité de séquence d'au moins 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% avec la séquence du gène codant pour la protéine ERK5 humaine (Gere ID ENTREZ : 5598, HGNC :6880, localisation : 25 17p11.2), et présentant la même activité MAP kinase et impliquée dans les mêmes cascades fonctionnelles que cette dernière. II peut notamment s'agir de protéines codées par des gènes orthologues vis-à-vis du gène codant pour lei protéine ERK5 humaine, c'est-à-dire des gènes présents dans des organismes différents, ayant évolué à partir d'un même gène ancestral suite à des événements de spéciation. 30 Les conditions de culture appropriées permettant d'obtenir des cellules présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif sont déterminées notamment en fonction du type de cellules tumorales et de l'agent ou des agents utilisés. En particulier, dans le cas de l'emploi d'un seul agent consistant en un vecteur d'expression d'une molécule de type shARN ciblant ERK5 dans des lymphocytes T ou B murins, les inventeurs ont constaté qu'une durée d'au 35 moins deux mois était nécessaire pour que les cellules présentent un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. -9- De préférence la cellule selon l'invention est une cellule mammifère, par exemple une cellule de rat, souris, chien ou chat. De manière particulièrement préférée, il s'agit d'une cellule humaine. La réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule et du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire peut être obtenue par différents agents, tels que par exemple une petite molécule organique ayant un poids moléculaire compris entre 100 et 2500 Da, un peptide, un anticorps intracellulaire ou une molécule d'acide nucléique. Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, un seul agent, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la protéine ERK5, est utilisé pour obtenir la réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule et du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. Selon une autre mise en oeuvre préférée de l'invention, une combinaison de deux ou plus agents peut être utilisée pour obtenir cette réduction. Selon une mise oeuvre particulière, un premier agent exogène, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la protéine ERK5, est utilisé pour réduire le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5, et un second, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse de la protéine adénovirale gp19K ou un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la R2-microglobuline, est utilisé pour réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. Cette mise en oeuvre est particulièrement préférée dans le cas ou les cellules tumorales sont des cellules primaires prélevées sur un patient atteint d'un cancer et modifiées pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif, et destinées à être administrées au même patient dans un but thérapeutique. En effet comme explicité plus haut, le temps nécessaire à l'expression du phénotype CMH-I négatif par des cellules tumorales transformées uniquement par un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la protéine ERK5 (au moins deux mois pour des lymphocytes T ou B murins) peut dans certains cas s'avérer peu compatible avec un usage thérapeutique. Selon une mise en oeuvre préféré, la réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule et du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire est causée au moins en partie par un mécanisme post-transcriptionnel. Selon cette mise en oeuvre, l'agent d'origine exogène comprend de préférence une molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprenant une séquence de 15 à 25, par exemple 18 à 24, résidus nucléotidiques présentant un niveau d'homologie d'au moins 85%, par exemple d'au moins 90%, d'au moins 95%, ou de 100% avec une portion de la séquence nucléotidique du gène ou de l'ADNc encodant la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 2, ou de l'un de ses équivalents chez l'animal. -.l0- Par � niveau d'homologie �, on entend plus particulièrement le pourcentage d'identité entre deux séquences ADN ou ARN, de complémentarité entre deux séquences ADN ou ARN ou encore d'équivalence ou de complémentarité entre une séquence ADN et une séquence ARN ou inversement entre une séquence ARN et une séquence ADN. La molécule d'acide nucléique d'origine exogène est de préférence une molécule de type ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, ou une molécule d'ADN comprenant une séquence dont la transcription génère une molécule d'ARN de type shARN, ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule. De préférence, la molécule d'acide nucléique d'origine exogène est n'est pas une molécule d'ARN double brin de plus de 26 paires de bases. Par molécule � shARN � ou � ARN court en épingle à cheveux � (ou � short hairpin RNA �), on entend un brin d'ARN qui comprend une séquence sens (i) comprenant de préférence de 15 à 25 nucléotides, homologue à une séquence d'un ADN ou ARN cible et une séquence antisens (ii) complémentaire à la séquence (i), les séquences (i) et (ii) étant ou non séparées par une séquence (iii) comprenant au moins 2, par exemple de 2 à 100, de 2 à 50, de 3 à 40 ou de 10 à 40 nucléotides. En raison de la complémentarité des séquences sens (i) et antisens (ii), ces molécules d'ARN tendent à se replier sur elles-mêmes pour prendre la forme d'un ARN bicaténaire en épingle à cheveux comprenant une boucle constituée par la séquence (iii). De manière classique, l'expression d'une molécule "shARN" est sous le contrôle d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase, par exemple par l'ARN polymérase II ou III, de préférence, par l'ARN polymérase III, par exemple le promoteur U6 ou H1. Un miARN (ou � micro ARN � ou � miRNA � ou � micro RNA � ou � miR �), est un ARN simple-brin d'une longueur généralement comprise entre 21 à 24 nucléotides, encodé par un gène (ne codant pas pour une protéine) qui dans un premier temps est transcrit en une molécule pri-ARN (transcript primaire), qui est ensuite transformée par l'intervention de nucléase Drosha et la protéine de liaison à l'ARN double-brin Pasha pour générer un ARN court en épingle à cheveux d'environ 70 nucléotides (pre-miARN). Le miARN est ensuite généré par l'action de l'endonucléase Dicer sur le pre-miARN au niveau du cytoplasme. Les génomes de la plupart des organismes pluricellulaires comprennent généralement plusieurs centaines de gènes de microARN. Les miRNA sont des répresseurs post-transcriptionnels : en s'appariant à des ARN messagers, ils guident leur dégradation, ou la répression de leur traduction en protéine. En particulier, il a été mis en évidence que le � miARN 143 � (numéro d'accession GenBank : AJ535834) réduit l'expression de la protéine ERK5 (35). Par siARN (ou � ARN court interférent � ou � siRNA � ou � small interfering RNA � ou � short interfering RNA � ou � silencing RNA �), on entend un ARN double brin court, d'une longueur de 15 à 25, de préférence, de 18 à 24 paires de bases, présentant une homologie d'au moins 85% avec une séquence d'un ADN ou ARN cible. Ces molécules sont normalement capables - 'I 1 - de provoquer un mécanisme d'interférence ARN dans les cellules de mammifères sans déclencher la réponse interféron non spécifique. Par � ARN antisens�, on entend plus particulièrement une molécule d'ARN comprenant une séquence d'au moins 15, de préférence d'au moins 20 ou 25, par exemple de 20 à 500, de 20 à 5 200, de 25 à 150 ou de 25 à 100 nucléotides, présentant une complémentarité d'au moins 85% avec la molécule d'ARNm obtenu suite à la transcription d'un gène cible. Par � ARN sens�, on entend plus particulièrement une molécule d'ARN comprenant une séquence d'au moins 15, de préférence d'au moins 20 ou 25, par exemple de 20 à 500, de 20 à 200, de 25 à 150 ou de 25 à 100 nucléotides présentant une identité d'au moins 85% avec la 10 molécule d'ARNm obtenu suite à la transcription d'un gène cible. Par � ribozyme �, on entend plus particulièrement un ribozyme comprenant au moins une séquence d'au moins 15, de préférence d'au moins 20 ou 25, par exemple de 20 à 500, de 20 à 200, de 25 à 150 ou de 25 à 100 nucléotides présentant une complémentarité d'au moins 85% avec la molécule d'ARNm obtenu suite à la transcription d'un gène cible et capable de cliver cet 15 ARNm. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la réduction du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule et du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire est causée au moins en partie par un mécanisme d'interférence ARN. Selon une variante préférée de cette mise en oeuvre, la 20 molécule d'acide nucléique d'origine exogène est une molécule shARN. . Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprend une molécule d'ADN comprenant l'une des séquences SEQ ID N° 3, 4 ou 5 sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule, et dont la transcription génère une molécule shARN. La molécule d'acide nucléique d'origine exogène est de préférence introduite dans la cellule par 25 l'intermédiaire d'un vecteur plasmidique ou viral. II peut en particulier s'agir d'un vecteur intégratif, notamment un vecteur lentiviral ou rétroviral, ou d'un vecteur non intégratif, notamment un vecteur adénoviral. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la molécule d'acide nucléique d'origine exogène est introduite dans la cellule par l'intermédiaire d'un vecteur viral non intégratif tel qu'un vecteur adénoviral ou adéno-associé. Selon une autre 30 mise en oeuvre préférée, la molécule d'acide nucléique d'origine exogène est introduite dans la cellule par l'intermédiaire d'un vecteur non viral, en particulier un vecteur à base de nanoparticules, en particulier des nanosphères de silice mésoporeuses auxquelles sont liées de manière covalente des dendrimères de polyarnidoamine (ou � PAMAM �) et complexés avec un plasmide ADN (36). 35 Selon une mise en oeuvre préférée, la cellule tumorale selon l'invention est un lymphocyte, un leucocyte, une cellule de cancer du sein ou de la prostate, ou une cellule métastatique. -'12- Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la cellule selon l'invention est une cellule tumorale primaire extraite d'un patient atteint d'une tumeur, modifiée par l'ajout de l'agent d'origine exogène et maintenue en culture dans des conditions et pendant une durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. Selon cette mise en oeuvre, un second agent exogène, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse de la protéine adénovirale gp19K ou un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la (32-microglobuline, est de préférence également utilisé pour réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. Selon une autre mise en oeuvre particulièrement préférée, la cellule selon l'invention est une cellule d'une lignée de cellules tumorales, modifiée par l'ajout de l'agent d'origine exogène et maintenue en culture dans des conditions et pendant une durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. La présente invention a également pour objet une lignée de cellules tumorales obtenue à partir d'une cellule selon l'invention. La présente invention a également pour objet une cellule selon l'invention en tant que vaccin ou médicament. La présente invention a également pour objet: une méthode pour traiter ou prévenir un cancer chez un patient comprenant la préparation de cellules tumorales selon l'invention et leur administration au patient à des doses, fréquences et pendant une durée déterminées en fonction de sa pathologie, ses antécédents et son âge. Les cellules selon l'invention peuvent être utilisées en thérapie, en particulier pour prévenir ou traiter un cancer ou le développement de métastases chez un patient humain ou animal. En particulier, les cellules selon l'invention peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament ou vaccin destiné à prévenir ou traiter un cancer ou le développement de 25 métastases chez un patient humain ou animal. La vaccination est un technique correspondant en l'inoculation dans l'organisme d'un germe, par exemple une bactérie ou un virus affaibli ou tué. Cette inoculation a pour conséquence le développement d'une réponse immunitaire !spécifique dans l'organisme. Classiquement, les vaccins sont utilisés de façon préventive, on parle alors de � vaccination préventive � ou 30 � prophylactique �. La réponse immunitaire spécifique déclenchée par de tels vaccins induit la présence de cellules mémoires (Lymphocytes B et T) dans l'organisme, qui permettent une réaction immunitaire rapide et efficace lors d'une nouvelle infection. Plus récemment, de nouveaux vaccins ont été mis à l'étude pour soigner un individu déjà malade. On parle alors de � vaccination thérapeutique �. En utilisant les mêmes principes d'injection d'un germe affaibli ou 35 tué, le but recherché n'est pas ici de développer une mémoire à long terme, mais de stimuler le système immunitaire. Ce type d'approche est étudié en particulier pour traiter des maladies où -13- le système immunitaire est fortement touché, en particulier pour traiter les cancers ou les maladies auto-immunes. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, les cellules selon l'invention sont utilisées pour fabriquer un vaccin thérapeutique destiné à traiter un cancer ou le développement de métastases chez un patient humain ou animal. Le médicament ou vaccin contient de préférence les cellules selon l'invention sous forme vivante. De préférence, le patient est un patient humain nouveau-né, enfant ou adulte. Selon une mise en oeuvre préférée, le médicament ou vaccin comprend des cellules tumorales primaires extraites du patient devant être traité, modifiées par l'ajout de l'agent exogène et maintenues en culture dans des conditions et pendant un durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif. Selon une autre mise en oeuvre préférée, le médicament ou vaccin comprend des cellules tumorales allogéniques provenant d'une lignée cellulaire. Selon cette mise en oeuvre, les cellules tumorales utilisées pour la fabrication du médicament ou vaccin peuvent être des cellules tumorales du même type ou d'un type différent que celles qui sont responsables du cancer dont le patient est atteint. Selon une mise en oeuvre préférée, le médicament ou vaccin est utilisé pour prévenir ou traiter un cancer au niveau duquel un grand nombre de cellules NK peuvent être mobilisées, en particulier un cancer du sang ou de la moelle osseuse. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, le médicament ou vaccin est utilisé pour prévenir ou traiter le développement d'une leucémie, d'un lymphome, d'un myélome, d'un cancer du sein ou d'un cancer de la prostate. Une leucémie est un cancer affectant les cellules du sang caractérisée par une prolifération anormale et excessive de précurseurs des globules blancs, bloqués à un stade de différenciation, qui finissent par envahir complètement la moelle osseuse puis le sang. Les cellules leucémiques peuvent également envahir d'autres organes comme les ganglions lymphatiques, la rate, le foie ou le système nerveux central. Les leucémies aiguës sont caractérisées par la prolifération rapide de cellules immatures du sang, anormales histologiquement et inefficaces. Elles apparaissent chez l'enfant et le jeune adulte, un traitement immédiat doit être effectué pour éviter la diffusion de ces cellules à tout le sang ainsi qu'aux organes. Les leucémies chroniques sont caractérisées par des cellules cancéreuses plus matures, bien que toujours anormales pet passant dans le sang, et par une évolution se faisant sur des mois à des années. Les leucémies chroniques apparaissent principalement chez les personnes âgées. Ce type de leucémie peut être traité plus tardivement. Le médicament ou vaccin selon l'invention peut être utilisé pour traiter les différents types de leucémies, en particulier la leucémie aiguë lymphoïde (LAL), la leucémie lymphoïde chronique -14- (LLC), la leucémie aiguë myéloïde (LAM) ou la leucémie myéloïde chronique (LMC) aux différents stades de leur évolution. Un lymphome est un cancer du système lymphatique. Le système lymphatique comprend la moelle osseuse, la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques et les vaisseaux sanguins et assure la défense de l'organisme. Les lymphomes se distinguent des leucémies de par le fait qu'il s'agit de tumeurs se développant dans les aires lymphoïdes secondaires. Le médicament ou vaccin selon l'invention peut être utilisé pour traiter les différents types de lymphomes, en particulier les lymphomes de phénotype B, les lymphomes de phénotype T et NK et les lymphomes Non Hodgkiniens distingués par la classification de l'OMS. De plus, le médicament ou vaccin selon l'invention peut être utilisé pour traiter les différents types de lymphomes Hodgkiniens ou Non Hodgkiniens aux différents stades de leur évolution, en particulier aux quatre stades distingués par la classification dite de Ann Arbor (Stade I : atteinte d'un seul groupe ganglionnaire ou d'un seul organe ; Stade II : atteinte de plus d'une aire ganglionnaire d'un même côté du diaphragme (partie inférieure ou partie supérieure du corps) ; Stade III : adénopathies multiples des deux côtés du diaphragme (partie inférieure et partie supérieure du corps) ; Stade IV : atteinte diffuse d'un ou plusieurs viscères et de la moelle osseuse). Un myélome est cancer de la moelle osseuse touchant les plasmocytes (c'est-à-dire les lymphocytes B activés), et entraînant la synthèse d'une immunoglobuline anormale. Le � Myélome Multiple des Os � ou � maladie cle Kahler � se caractérise par le développement dans le squelette de multiples tumeurs ostéolytiques à plasmocytes (plasmocytomes) sécrétant dans 80% des cas une immunoglobuline, soit de type G (2/3 des cas), soit du type A (1/3 des cas), et qui vont progressivement détruire l'os adjacent. Le médicament ou vaccin selon l'invention peut être utilisé pour traiter les différents types de myélomes, en particulier les myélomes multiples des os. De plus, le médicament ou vaccin selon l'invention peut être utilisé pour traiter les différents types de myélomes aux différents stades de leur évolution, en particulier aux trois stades distingués par la classification de Durie-Salmon (stade I : faible masse tumorale, inférieure à 600 milliards de cellules malignes/m2 ; stade II : masse tumorale intermédiaire, entre 600 et 1 200 milliards de cellules malignes/m2 ; stade III : forte masse tumorale, supérieure à 1 200 milliards de cellules malignes/m2), ainsi qu'aux différents stades de sous-classification fonction de l'état de la fonction rénale (stade A : fonction rénale correcte, créatininémie inférieure à 20 mg/I ou 180 pmol/l ; stade B : fonction rénale détériorée, créatininémie supérieure à 20 mg/1 ou 180 Nmol/l), et du type de lésions osseuses (0 = pas de lésions osseuses ; 1 ostéoporose ; 2 = lésions de lyse osseuse ; 3 = lésions osseuses majeures et fractures). Selon une autre mise en oeuvre préférée, le médicament ou vaccin est utilisé pour prévenir ou traiter le développement de métastases. -15- Selon une autre mise en oeuvre préférée, les cellules tumorales utilisées pour la fabrication du médicament ou vaccin selon l'invention sont des lymphocytes, en particulier les lymphocytes B ou T. Le vaccin ou médicament selon l'invention peut être administré à des doses, fréquences et pendant des durées déterminées en fonction de la pathologie du patient, de ses antécédents et de son âge. Le vaccin ou médicament selon l'invention peut être administré au patient dès le diagnostic du cancer et jusqu'à sa guérison. Il peut en particulier être administré aux différents stades d'évolution du cancer. De préférence, le vaccin ou médicament selon l'invention est administré à un patient humain à des doses comprenant au moins 1 000 000, de préférence entre 1 000 000 et 50 000 000, par exemple entre 5 000 000 et 20 000 000, cellules selon l'invention, et à des fréquences journalières, hebdomadaires, bimensuelles ou mensuelles. Le vaccin ou médicament selon l'invention peut par exemple être administré au patient par voie intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée. De préférence, le vaccin ou médicament selon l'invention est administré localement au niveau des cellules tumorales � endogènes � du patient ou de l'organe du patient atteint par le cancer ou dans le système sanguin. Selon une mise en oeuvre préférée, le vaccin ou médicament selon l'invention est destiné à être administré au patient en combinaison avec une transplantation allogénique de moelle osseuse ou de cellules souches hématopoïétique. Le système HLA (� human leucocyte ani:igen �) qui correspond au Complexe majeur d'histocompatibilité humain, permet au corps et à son système immunitaire de reconnaître le Soi (ensemble des tissus, etc.), du non-Soi (virus, bactéries, greffes). Chaque individu possède un typage HLA qui lui est propre et qui se retrouve à la surface de ses cellules. Ainsi, toute cellule qui ne présente pas les marqueurs HLA du Soi à sa surface est attaquée par le système immunitaire. Le typage HLA d'un individu est déterminé par les différents allèles qui représentent les 6 gènes A, B, C, DR, DQ et [)P gouvernant l'histocompatibilité. Ces gènes sont tous présents sur le chromosome n°6 et comptent de nombreux allèles. En effet, 268 allèles ont été dénombrés pour le gène A, 517 pour le gène B, 129 pour le gène C, 333 pour le gène DR, 53 pour le gène DQ et 109 pour le gène DP. En raison du grand nombre d'allèles pour chacun de ces gènes, le nombre de combinaisons possibles est extrêmement important. La transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques en provenance d'un membre d'une même fratrie présentant un typage HLA identique peut guérir la leucémie, cependant 75% des patients n'ont pas un frère ou une soeur présentant un typage HLA identique. Dans ce cas, on peut avoir recours à un donneur volontaire présentant un typage HLA le plus proche possible de celui du receveur afin d'éviter que les cellules du donneur ne déclenchent une réaction de rejet. Dans le cadre de la transplantation de moelle osseuse, le système immunitaire du receveur est très affaibli ou inexistant et ne sera donc normalement -116- pas à l'origine d'une réaction de rejet. Les cellules greffées du donneur en revanche, qui doivent produire le nouveau système immunitaire du malade, peuvent attaquer les tissus du receveur, perçus comme � non-Soi �. On parle alors de la maladie du greffon contre l'hôte (ou � GvH disease � ou � Graft versus Host disease �). Un choix alternatif est le recours à des cellules souches provenant de membres de la famille présentant un haplotype (moitié du génotype d'un individu provenant soit du père soit de la mère) identique et un haplotype différent de celui du receveur. On parle alors de transplantation haplo-identique. Les transplantations haplo-identiques doivent en conséquence être extensivement déplétées en lymphocytes T pour prévenir les réactions fatales de rejet GvH. L'effet anti-leucémique de ce type de greffe ne peut donc pas reposer sur les lymphocytes T du donneur, mais uniquement sur le déclenchement d'une réaction alloréactive dépendante des cellules NK du donneur et basée sur la reconnaissance du � non soi �. Les cellules NK alloréactives vont se localiser au niveau de sites lympho-hématopoïéitiques et attaquer les cellules lympho-hématopoïéitiques du receveur, y compris les cellules leucémiques, tout en épargnant les autres organes sains. En sus de l'élimination des cellules leucémiques, le fait que les cellules NK tuent les lymphocytes T du receveur permet de prévenir une réaction de rejet de type hôte contre greffon (ou � HvG � ou � host versus graft �) et d'autre part le fait que les cellules NK tuent les cellules dendritiques clu receveur permet de prévenir l'activation des cellules T du donneur et par conséquent prévient une réaction de rejet de type GvH. Cette approche ne peut cependant pas être utilisée dans tous les cas dans la mesure où environ 30% de la population est résistante à l'effet des cellules NK alloréactives. L'utilisation de cellules tumorales selon l'invention et/ou de cellules NK activées in vitro ou ex vivo par des cellules tumorales selon l'invention en combinaison avec une greffe de moelle osseuse ou des cellules souches, plus particulièrement en l'absence d'un donneur présentant un typage HLA identique, peut permettre de rendre plus efficaces l'action des cellules NK in vivo. Selon une autre mise en oeuvre préférée, le vaccin ou médicament selon l'invention est destiné à être administré en combinaison avec un autre traitement anti-cancéreux, par exemple un 30 traitement par chimiothérapie ou par radiothérapie. En particulier, le vaccin ou médicament selon l'invention peut être destiné à être administré en combinaison avec un traitement visant à renforcer la réponse immunitaire acquise, par exemple en combinaison avec la transplantation de cellules dendritiques chargées avec des antigènes tumoraux. 35 Selon une autre mise en oeuvre préférée, le vaccin ou médicament selon l'invention est destiné à être administré en combinaison avec l'administration de cellules NK activées, c'est à dire des cellules NK préalablement mises en contact avec des cellules tumorales et dont il a été mis en -17- évidence qu'elles sont capables de provoquer leur lyse ou leur apoptose, en particulier des cellules NK mises en contact avec des cellules tumorales présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. Par � administration en combinaison �, on entend une administration du vaccin ou médicament selon l'invention se déroulant de manière simultanée ou différée dans le temps avec un autre traitement anti-cancéreux. La présente invention a également pour objet une composition thérapeutique ou vaccinale comprenant une cellule selon l'invention ainsi qu'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Selon une mise en oeuvre particulière, la composition thérapeutique ou vaccinale selon l'invention comprend également une molécule thérapeutique anti-tumorale. Selon une autre mise en oeuvre particulière, la composition thérapeutique ou vaccinale selon l'invention comprend également des cellules NK activées. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un agent capable de conférer un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif à une cellule tumorale humaine ou animale pour la fabrication d'un médicament ou vaccin cellulaire vivant destiné à prévenir ou traiter un cancer chez un patient humain ou animal. 20 Selon une mise en oeuvre préférée l'agent utilisé pour la fabrication du médicament ou vaccin cellulaire selon l'invention est capable de réduire d'au moins 10%, de préférence de 25 à 90%, par exemple de 25 à 50% ou de 50 à 75%, le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule tumorale par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence de l'agent 25 dans des conditions de culture identiques, et de réduire de 50 à 100%, de préférence de 75 à 95 %, par exemple de 85 à 95%, le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau de la membrane de la cellule tumorale par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence de l'agent dans des 30 conditions de culture identiques. Selon une mise en oeuvre préférée, l'agent selon l'invention comprend une molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprenant une séquence de 15 à 25, par exemple 18 à 24, résidus nucléotidiques présentant un niveau d'homologie d'au moins 85%, par exemple d'au moins 90%, d'au moins 95%, ou de 100% avec une portion de la séquence nucléotidique du 35 gène ou de l'ADNc encodant la protéine ERI'3 humaine représentée par la séquence SEQ ID15 -18- N° 2, ou de l'un de ses équivalents chez l'animal. La molécule d'acide nucléique d'origine exogène est de préférence une molécule de type ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, ou une molécule d'ADN comprenant une séquence dont la transcription génère une molécule d'ARN de type shARN, ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule. Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, la molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprend une molécule d'ADN comprenant l'une des séquences SEQ ID N° 3, 4 ou 5 sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule, et dont la transcription génère une molécule shARN. Selon une mise en oeuvre préférée, l'agent comprenant la molécule d'acide nucléique d'origine exogène est un vecteur plasmidique ou viral, de préférence encore un vecteur viral intégratif, par exemple un vecteur lentiviral ou rétroviral, et de manière particulièrement préférée, un vecteur viral non intégratif, par exemple un vecteur adénoviral. Selon une autre mise en oeuvre préférée, l'agent comprenant la molécule d'acide nucléique d'origine exogène est un vecteur à base de nanoparticules, en particulier un agent dans lequel la molécule d'acide nucléique est comprise dans un plasmide ADN complexé à des nanosphères de silice mésoporeuses auxquelles sont liées de manière covalente des dendrimères de polyamidoamine (ou � PAMAM �). La présente invention a également pour objet une cellule animale tumorale vivante présentant 20 un phénotype CMH-I négatif en tant que médicament ou vaccin. Selon une mise en oeuvre préférée, la cellule tumorale présente également un phénotype ERK5 négatif. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro ou ex vivo pour obtenir une cellule tumorale présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif et selon lequel : 25 a) un ou plusieurs agent(s) exogène(s) capable(s) dans des conditions de culture appropriées de réduire le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 endogène et le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire, est (sont) introduit(s) dans une cellule tumorale animale isolée ou en culture, 30 b) la cellule tumorale est cultivée dans des conditions et pendant une durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. Selon une mise oeuvre particulièrement préférée du procédé selon l'invention, l'étape a) comprend l'administration d'un seul agent exogène, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la protéine ERK5, capable dans des 35 conditions de culture appropriées de réduire le niveau d'expression ou la quantité de la protéine -19- ERK5 et de réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. Selon une autre mise oeuvre particulièrement préférée du procédé selon l'invention, l'étape a) comprend l'administration d'un premier agent exogène, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la protéine ERK5, capable dans des conditions de culture appropriées de réduire le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5, et d'un second agent exogène, par exemple un vecteur dirigeant la synthèse de la protéine adénovirale gp19K ou un vecteur dirigeant la synthèse d'une molécule d'ARN interférant ciblant la 32-microglobuline, capable dans des conditions de culture appropriées de réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire. Les conditions de culture appropriées permettant d'obtenir des cellules présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif sont déterminées notamment en fonction du type de cellules tumorales et de l'agent ou des agents utilisés. En particulier, dans le cas de l'emploi d'un seul agent consistant en un vecteur d'expression d'une molécule de type shARN ciblant ERK5 dans des lymphocytes T ou B murins, les inventeurs ont constaté qu'une durée d'au moins deux mois était nécessaire pour que les cellules présentent un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. Selon une mise en oeuvre préférée, les conditions et la durée selon l'étape b) du procédé selon 20 l'invention permettent d'obtenir une réduction d'au moins 10%, de préférence de 25 à 90%, par exemple de 25 à 50% ou de 50 à 75%, du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 présente dans la cellule par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques, et 25 une réduction de 50 à 100%, de préférence de 75 à 95 %, par exemple de 85 à 95%, du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau de la membrane cellulaire par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. 30 Selon une mise en oeuvre particulièrement préférée, les conditions et durées de cultures sont choisies de manière à ce que la réduction de l'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 dans la cellule tumorale obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention ne soit pas égale à 100%. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, la cellule tumorale mentionnée 35 à l'étape a) est une cellule primaire provenant d'un patient atteint d'un cancer. -20- Selon une mise en oeuvre préférée alternative du procédé selon l'invention, la cellule tumorale mentionnée à l'étape a) est une cellule provenant d'une lignée de cellules tumorales. La présente invention a également pour objet un procédé in vitro ou ex vivo d'obtention de cellules NK activées comprenant a) la mise en contact in vitro ou ex vivo de cellules NK vivantes avec des cellules tumorales vivantes présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif dans des conditions et pendant un durée suffisante pour induire l'activation des cellules NK ; b) la récupération des cellules NK activées. Par � cellules NK activées �, on entend plus particulièrement des cellules NK exprimant les granzymes A et B et FasL. Les conditions et la durée de culture mentionnée à l'étape a) du procédé selon l'invention sont déterminées notamment en fonction du types de cellules tumorales utilisées. De préférence, les cellules NK (E) et les cellules tumorales selon l'invention (T) sont mises en présence selon un ratio E :T d'au moins 1 :1, de préférence d'au moins 5:1, par exemple un ratio compris entre 5:1 et 35:1 ou entre 5:1 et 15:1, pendant une durée de plusieurs heures, de préférence d'au moins 5, 7 ou 10 heures, par exemple pendant une durée comprise entre 5 et 15 heures ou entre 7 et 10 heures. Les cellules NK obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peuvent notamment être purifiés par FACS et conservées dans des conditions adéquates, par exemple congelées ou maintenues en culture jusqu'à leur utilisation. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé selon l'invention, les cellules tumorales vivantes présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif sont des cellules selon l'invention ou des cellules obtenues par la mise en oeuvre du procédé pour obtenir des cellules ERK5 et CMH-I négative mentionné plus haut. Selon une mise en oeuvre particulière du procédé selon l'invention, les cellules NK mentionnées à l'étapes a) sont des cellules NK primaires prélevées chez un patient atteint d'un cancer. Selon une autre mise en oeuvre particulière, les cellules NK mentionnées à l'étapes a) sont prélevées chez un donneur sain. Selon encore une autre mise en oeuvre, les cellules NK mentionnées à l'étapes a) sont issues d'une lignées de cellules NK Les cellules NK activées susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peuvent être utilisées pour la fabrication d'un médicament ou vaccin pour prévenir ou traiter un cancer. Selon une mise en oeuvre particulière, le médicament ou vaccin selon l'invention comprend également des cellules tumorales selon l'invention. Selon une autre mise en oeuvre préférée, le vaccin ou médicament selon l'invention comprend également des cellules -21 - dendritiques chargées avec des antigènes tumoraux. En effet, la greffe combinée de cellules NK activées par les cellules tumorales selon l'invention et de cellules dendritiques chargées avec des antigènes tumoraux renforce l'effet antitumoral. Figures. Figure 1. Clairance péritonéale de cellules EL4-shERK5 trois jours après injection. Un million de cellules respectivement EL4-wt, EL4-shERK5-A, EL4-shERK5-B ou EL4-shluc, marquées au CFSE (ester de 5,6-Carboxyfluorescéine diacétate succinimidyle) ont été injectées dans le péritoine de souris syngéniques C57/B6. Trois jours plus tard, les cellules péritonéales ont été récupérées et la survie des cellules injectées a été estimée par cytométrie de flux de type FACS (� Fluorescence-activated cell sorting � / tri de cellules par fluorescence). Les résultats montrent que trois jours après injection les cellules EL4-wt et EL4-shluc subsistent dans le péritoine, tandis que les cellules EL4-shERK5 sont éliminées. Figure 2. Expression de surface du CmH-I des cellules EL4-shERK5. A) Des cellules EL4- shERK5-A, EL4-shERK5-B et EL4-shluc ont été cultivées en présence ou en absence d'un antibiotique de sélection (puromycine). Les cellules ont été marquées avec des anticorps antiH2kb et le niveau d'expression du CMH-1 a été analysé par cytométrie de flux de type FACS. Les cellules EL4-wt et RMAS sont utilisées en tant que contrôle respectivement positif et négatif pour l'expression de surface du CMH-I. Les résultats montrent que les cellules EL4- shERK5-A et EL4-shERK5-B montrent une perte de l'expression de surface du CMH-I en présence de l'antibiotique. B) L'expression de ERK5 par les différentes lignées cellulaires décrites en A) a été analysée par immunoblot. Les anticorps pour Vav et ERK2 ont été utilisés en tant que contrôle. Les résultats montrent que les cellules EL4-shERK5-A et EL4-shERK5-B montrent une perte de l'expression de ERK5 en présence de l'antibiotique Figure 3. Implication des cellules NK dans l'élimination des cellules EL4-shERK5. A) Des splénocytes totaux, des cellules NK purifiées ou des splénocytes exempt de cellules NK ont été incubés avec des cellules cibles EL4-shERKS chargées au 51Cr à différents ratios. Au bout de quatre heures les surnageants ont été collectés et l'activité cytolytique a été mesurée en fonction de la libération de 51Cr. 100% des cellules EL4-shERK5 sont lysées en présence des cellules NK purifiées à des ratios cellules NK : cellules cibles de 35 :1 et 75 :1. B) Des cellules NK purifiées ont été incubées avec des cellules EL4-shERK5 ou Yac-1 marquées au 51Cr pendant quatre heures à différents ratios. L'activité cytolytique a été mesurée. Un nombre nettement plus important de cellules cibles EL4-shERK5 que de cellules cibles Yac-1 sont lysées par les cellules NK. Les résultats mettent en évidence le fait que les cellules NK sont responsables de l'élimination des cellules EL4-shERK5, et que le phénotype ERK5 négatif des cellules cibles conduit à un effet additionnel par rapport au phénotype CMH-I négatif seul. -:22- Figure 4. L'activation constitutive de ERK5 induit un gène rapporteur sous contrôle d'un promoteur sensible au CMH-I. A) Dix million de cellules Jurkat (cellules tumorales humaines) ont été transfectées avec 5 pg de plasmides c'expression respectivement de ERK5, MEK5D ou de ERK5 et MEK5D, 2.5 pg du gène rapporteur sous contrôle d'un promoteur d'un gène du CMH-I : PD-1, et 1 pg du plasmide d'expression de la 13-galactosidase (contrôle). Quarante-huit heures plus tard, les activités luciférase et galactosidase ont été mesurées et les résultats exprimés sous la forme du ratio luciférase galactosidase (activité luciférase relative). Les résultats montrent que la surexpression de ERK5 couplée avec un gène MEK5 constitutionnellement actif active le gène rapporteur sous le contrôle du promoteur CMH-I. B) L'expérience a été répétée avec des plasmides d'expression respectivement de ERK5 et MEK5D, ERK5KM (un mutant inactif de ERK5), ERK5 AEF (un mutant non activable de ERK5) ou shERK5. Les résultats mettent en évidence le fait que ERK5 induit l'activation d'un promoteur du CMH-I. De plus le bocage de l'activité de ERK5 par l'emploi d'un mutant inactif (ERK5KM) ou le fait de diminuer son expression avec shERK5, diminue le niveau d'expression basal de ce promoteur. ERK5 contrôle donc la transcription de gènes du CMH-I. Figure 5. Recrutement des cellules NK dans le péritoine après injection de cellules EL4-shERK5 chez la souris. 5 x 105 cellules EL4-shERK5 ou EL4-shluc ou du PBS ont été injectées dans le péritoine de souris syngéniques. Trois jours plus tard, les populations de cellules du péritoine ont été analysées par cytométrie de flux (FACSCalibur). A) Pourcentage de lymphocytes dans le péritoine. B) Pourcentage de cellules NK au niveau du péritoine. C) Pourcentage de cellules NK parmi la population de lymphocytes au niveau du péritoine. Les résultats mettent en évidence le fait qu'après injection de cellules EL4-shERK5, les cellules NK sont recrutées dans le péritoine. Figure 6. Survie des cellules EL4 de type sauvage (wt) après co-injection avec des cellules EL4-shERK5. 2,5 X 105 cellules EL4-shluc, EL4-shERK5 ou un mélange de 2,5 X 105 cellules EL4-shluc et de 2,5 X 105 cellules EL4-shERK5, chargées au CFSE ont été injectées dans le péritoine de souris syngéniques. Le pourcentage de cellules CFSE+ après un lavage péritonéal trois jours plus tard est indiqué. Les cellules EL4-shERK5 sont totalement éliminées tandis que la survie des cellules EL4-shluc est nettement diminuée après co-injection avec des cellules EL4-shERK5. Figure 7. Immunisation avec des cellules EL4-shERK5. Des souris ont été immunisées pendant deux ou six semaines avec 2.5 x 105 cellules EL4-shERK5 puis ont reçu une injection sous-cutanée de 2.5 x 105 cellules EL4-wt. La taille des tumeurs a été mesurée après 12, 14, et 16 jours. Les résultats montrent que le développement de tumeurs sous-cutanées à partir des cellules EL4-wt débute plus tardivement et que le volume des tumeurs est fortement diminué chez les souris immunisées pendant deux ou six semaines avec les cellules EL4-shERK5. L'immunisation avec des cellules EL4-shERK5 protège donc contre des tumeurs sous-cutanées induites par des cellules EL4 de type sauvage (wt). -23- Figure 8. Protéine humaine ERK5. Séquence en acides aminés de la protéine ERK5 humaine (N° d'accession : AAA81381, Zhou et al., 1995) (SEQ ID N° 1) et séquence nucléotidique de l'ADNc codant la protéine ERK5 humaine (N° d'accession : U25278, Zhou et al., 1995, séquence codante : nucléotides 84 à 2531) (SEQ ID N° 2). Figure 9. Séquences nucléotidiques (1), (2) et (3) utilisées pour la préparation de vecteurs d'expression de molécules � shERK5 � (SEQ I D 3, 4 et 5). Figure 10. Des cellules L1210-shERK5 et shLuc ont été chargées avec différentes concentrations de CFSE puis ont été injectées dans le péritoine de souris syngéniques Balb/c préalablement traitées avec du sérum de lapin (contrôle) ou avec de l'antisérum anti-asialo GM1. 48 heures plus tard, les cellules du péritoine ont été analysées par FACS. Les cellules shLuc ne sont pas éliminées, tandis que les cellules shERK5 sont éliminées au niveau du péritoine des souris contrôle mais pas au niveau du péritoine des souris ayant reçu un traitement avec l'antisérum anti-asialo GM1 visant à éliminer les cellules NK. Figure 11. Des cellules L1210-shERK5 ont été chargées avec de la 3H-thymidyne et incubées en présence ou en absence de cellules NK (A) syngéniques Balb/c ou (B) allogéniques C57/B6, et des cellules L1210-shLuc ont été chargées avec de la 3H-thymidyne et incubées en présence ou en absence de cellules NK syngéniques Balb/c (C). Les résultats mettent en évidence le fait que les deux types de cellules NK (syngéniques Balb/c et allogéniques C57/B6) reconnaissent les cellules L1210-shERK5 comme étrangères et les éliminent avec une efficacité similaire. Les cellules L1210-shLuc en revanche ne sont pas reconnues comme étrangères, ces cellules expriment le CMH-I et ne sont pas éliminées. E:T = ratio cellules effectrices (NK) / cellules cibles (L1210-shERK5). Figure 12. Des cellules L1210-shERK5 ont été chargées avec de la 3H-thymidyne et incubées avec des cellules NK syngéniques Balb/c en présence ou en absence (A) d'EGTA (qui bloque la mort cellulaire induite par les granzymes) ou (B) d'un anticorps anti-FasL (qui bloque la mort cellulaire induite par Fas). Les résultats montrent que la quantité de cellules L1210-shERK5 éliminées par les cellules NK est diminuée en présence de d'EGTA ou de l'anticorps anti-FasL, et mettent ainsi en évidence l'importance des mécanismes mettant en oeuvre les granzymes et Fas dans l'élimination des cellules shERK5 par les cellules NK. Figure 13. Le niveau d'expression du CMH-I a été analysé par FACS avec un anticorps anti-H2Kd dans des cellules L1210-shLuc ou shERK5. Les lignes en pointillés correspondent aux cellules marquées avec un IgG contrôle. Les résultats mettent en évidence le fait que les cellules shERK5 perdent l'expression du MHC-I au niveau de la membrane plasmique. Figure 14. Des souris syngéniques Balb/c ont reçus des injections de PBS, de cellules L1210-35 shLuc ou de cellules L1210-shERK5 au niveau du le péritoine. 48 heures plus tard, les cellules du péritoine ont été récupérées et les cellules NK ont été quantifiées avec l'anticorps anti- - 24 - CD49b. Les résultats présentés montrent que (B) le nombre ainsi que (A) la proportion de cellules NK au niveau péritonéal sont plus irnportants chez les souris ayant reçu les cellules shERK5, mettant ainsi en évidence le fait que les cellules NK sont recrutées au niveau du péritoine par les cellules shERK5. Figure 15. Des souris syngéniques Balb/c ont reçus des injection de PBS, de cellules L1210-shLuc ou de cellules L1210-shERK5 au niveau du le péritoine. 48 heures plus tard, les cellules du péritoine ont été récupérées et le nombre cle cellules NK (CD49b+) exprimant les granzymes A et B a été analysé par FACS. Les résultats présentés montrent les cellules NK recrutées par les cellules L1210-shERK5 sont positives pour les granzymes et présentent par conséquent un phénotype activé. Figure 16. Des cellules L1210-shLuc ou des cellules L1210-shERK5 ont été incubées pendant une heure avec des lymphocytes cytotoxiques BM3.3 activés ou non par un traitement PMA/ionomycine, marquées avec un anticorps anti-Fas, et analysées par FACS. Les résultats montrent que les lymphocytes T activés induisent une forte augmentation du niveau d'expression du récepteur de mort Fas dans les cellules L1210-shERK5. Ce phénomène contribue à expliciter le fait que ces cellules soient très sensibles à des attaques par des lymphocytes cytotoxiques en général. Figure 17. L'expression des deux isoformes L et S de la protéine anti-apoptotique c-FLIP a été analysée par immunoblot dans les cellules L1210-shLuc et L1210-shERK5. Les résultats montrent que les cellules shERK5 présentent: des niveaux diminués des deux isoformes de la protéine c-FLIP. (Q-actine : contrôle) Figure 18. L'ARN de cellules L1210-shLuc (contrôle) et L1210-shERK5 a été isolé et soumis à la qPCR avec des amorçes spécifiques de la béta2-microgobluline. Les résultats montrent que les cellules L1210-shERK5 présentent une forte réduction du niveau de béta2-microglobuline, une protéine essentielle pour la stabilisation des molécules du CMH-I au niveau de la membrane plasmique, ce qui contribue à expliquer pourquoi les cellules L1210-shERK5 expriment très faiblement les protéine du CMFI-1 au niveau de la membrane plasmique. Partie expérimentale 30 Exemple 1 Les inventeurs ont récemment montré que des cellules EL4 exprimant un shERK5 (EL4-shERK5) ne parvenaient pas à induire des tumeurs sous-cutanées chez des souris syngéniques (21). Ces cellules ne sont pas parvenu non plus à induire des tumeurs lorsque injectées dans le péritoine, où elles ont été éliminées en moins de 72 h après l'injection (Fig. 1). 35 Des cellules EL4 exprimant un ARN court en épingle à cheveux (shRNA) visant la luciférase (EL4-shLuc) ont été récupérées à des niveaux similaires à ceux des cellules de type sauvages - 25 - (wt), en accord avec les résultats précédemment obtenus par les inventeurs avec des tumeurs sous-cutanées (21). Cette courte durée de clairance des cellules cancéreuses suggère que la réponse immunitaire innée, c'est-à-dire les cellules NK, est à l'origine de la réponse immunitaire contre ces cellules. De la même manière, les cellules EL4-shERK5, mais pas les cellules EL4- shLuc, ont diminué l'expression de surface du CMH-1 (Fig. 2A). Les cellules EL4-shERK5 ont exprimé des niveaux CMH-I similaires à ceux de cellules RMA-S considérées comme CMH-I négatives (29). Ceci permet d'expliquer pourquoi les cellules NK ont reconnu les cellules EL4-shERK5 comme � étrangères �. La baisse du niveau d'expression du CMH-I a été observée après plusieurs semaines dans des sélections par antibiotiques. Pour déterminer si cet effet était réversible, les inventeurs ont incubé des cellules EL4-shERK5 en l'absence de l'antibiotique utilisé pour la sélection. Après plusieurs semaines ces cellules ont commencé à recouvrer des niveaux normaux de la protéine ERK5 (Fig. 2B), et elles ont recouvré en revanche l'expression du CMH-I (Fig. 2A). Lorsque les inventeurs ont utilisé le même protocole avec des cellules exprimant shLuc, les inventeurs n'ont pas observé de changement au niveau de l'expression du CMH-I ou de ERK5. Les inventeurs ont ensuite utilisé des cellules EL4-shERK5 comme cibles de trois populations d'effecteurs différentes : les splénocytes totaux, les cellules NK purifiées et les splénocytes desquels les cellules NK ont été ôtés (Fig. 3). Les cellules NK purifiés se sont montrées la population la plus efficiente pour tuer les cellules ERK5-déficientes. A l'inverse, l'élimination des cellules NK a fortement diminué l'activité cytotoxique des splénocytes envers les cellules ERK5-déficientes. De façon intéressante, ces cellules se sont montrées être de meilleures cibles pour les cellules NK que d'autres cellules syngéniques MCH-I-déficientes, par exemple les cellules RMA-S ou Yac-1 (Fig. 3B et données non présentées). Ceci reflète très probablement le rôle de ERK5 dans l'activation de NF-KB activation, qui bloquerait l'apoptose après l'engagement des récepteurs de mort (21). En résumé, les cellules NK ont été responsables de l'éradication des cellules EL4-shERK5 in vitro (Fig. 3). Ces résultats ont été confirmés avec un autre type de cellules tumorales, les cellules L1210 issues d'un lymphome murin de type B (Fig. 10). Les inventeurs ont montré que l'expression du CMH-I régulée par ERK5 implique probablement une régulation transcriptionnelle, car la surexpression de ERK5 couplée avec un gène MEK5 constitutionnellement actif dans des cellules Jurkat (cellules tumorales humaines) a activé un gène rapporteur sous le contrôle du promoteur CMH-1 dérivé du gène de classe I (Fig. 4, (27)). A l'inverse, la transfection de chaque protéine séparément n'a pas permis d'activer le promoteur. ln vivo, les cellules NK peuvent être recrutées localement par inoculation de cellules tumorales, de préférence celles n'ayant pas une expression du CMH-I appropriée (22). Pour cette raison, les inventeurs ont injecté des cellules EL4-wt et shERK5 dans le péritoine de souris syngéniques et ont recherché trois jours p us tard la présence de cellules NK (Fig 5). La quantité de lymphocytes totaux n'a pas augmenté de façon notable suite à l'inoculation des - 26 - cellules EL4-shERK5 (Fig. 5A). En revanche, le nombre de cellules NK était significativement plus élevé chez les souris inoculées avec les cellules shERK5 que chez les souris inoculées avec les cellules de contrôle (Fig. 5B). De plus, le pourcentage de cellules NK a augmenté chez la population de lymphocytes péritonéaux des souris ayant reçu les injections de cellules EL4- shERK5 (Fig. 5C). Aucun changement n'a été observé chez ces différentes populations lorsque les cellules EL4-shLuc ont été injectées. Les résultats obtenus par les inventeurs suggèrent fortement que les cellules NK ont éliminé les cellules EL4-shERK5 in vivo. Des résultats récents ont mis en lumière le rôle important joué par les cellules NK au niveau de l'immunosurveillance tumorale (30). Les inventeurs ont cherché à savoir si une injection préalable, ou vaccination, avec des cellules EL4-shERK5 affecterait la progression tumorale induite par des cellules EL4-wt. La co-injection de cellules EL4-shERK5 et wt a réduit de façon significative la survie des cellules wt au niveau du péritoine (Fig. 6), suggérant que les cellules EL4-shERK5 ont induit une réponse immunitaire également dirigée contre les cellules EL4-wt. Afin d'explorer plus loin cette hypothèse, des souris syngéniques ont été vaccinées avec des cellules EL4-shERK5 qui ont conduit à une réduction significative du développement tumoral initié par des cellules EL4-wt chez 80% des souris et a totalement prévenu le développement de tumeurs chez 20% d'entre elles (Fig. 7). Enfin, les inventeurs ont cherché à savoir si le développement tumoral pouvait être inhibé chez un modèle plus pertinent dans lequel les leucémies de cellules T sont induites par l'infection de souriceaux nouveaux-nés avec la souche Moloney du virus murin de la leucémie (M-MuLV). Des cellules T leucémiques de la lignée Yac-1 dérivée d'une souris C57/B6 infectée avec MMuLV ont été injectées aux animaux utilisés en tant que contrôle. Les cellules Yac-1, comme les cellules EL4-shERK5, n'expriment pas le CMH-1 de surface et ne forment pas de tumeurs in vivo dans notre système. Les souris nouvellement nées ont été inoculées intra-péritonéalement avec le virus M-MuLV qui a induit des lymphomes T avec une latence de 3-4 mois comme décrit précédemment (31). A compter de 60 jours après infection, les souris ont reçu des injections de 150000 cellules Yac-1 ou EL4-shERK5 chaque mois pendant deux mois puis toutes les deux semaines. Les souris ont régulièrement été examinées par palpation sous anesthésie pour la détection d'élargissements d'organes, et saignées pour déterminer leur hématocrite. Les résultats présentés dans le tableau 1 montrent que les souris ont été protégées de la leucémie par les cellules EL4-shERK5, et dans une moindre proportion, par les cellules Yac-1. Tableau 1. Des cellules modifiées avec shERK5 protègent les souris des leucémies induites par le virus M-MuLV. Des souriceaux nouveau-nés ont été infectés avec le virus MMuLV. Deux mois plus tard, les souris ont été séparées en trois groupes. Le premier groupe n'a reçu aucun traitement. Le second groupe a reçu des injections de cellules Yac-1 et le troisième -27- groupe a reçu des injections de cellules EL4-shERK5. Le nombre de souris ayant survécu après cinq mois est indiqué. Traitement Nombre total de souris Nombre de souris ayant survécu après cinq mois aucun 9 3 (33,33%) Yac-1 10 6 (60%) EL4-shERK5 7 7 (100%) Exemple 2 Les inventeurs ont réalisé une seconde série d'expériences avec un autre type de cellules tumorales murine, les cellules L1210 issues d'un lymphome murin de type B. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 et les figures 10 à 18. Les résultats présentés dans le tableau 2 mettent en évidence le fait que les cellules L1210 10 transfectées avec un vecteur d'expression d'un shARN ciblant ERK5 (� cellules L1210-shERK5 �) n'induisent pas de tumeurs in vivo chez la souris. Tableau 2 : Deux groupes de souris ont reçu respectivement une injection de cellules L1210 transfectées avec un vecteur d'expression d'un shARN ciblant ERK5 (� cellules L1210-shERK5 �) ou de cellules L1210 transfectées avec le vecteur d'expression shLuc utilisé comme 15 contrôle (� cellules L1210-shLuc �). Le volume tumoral a été mesuré après 8, 11 et 13 jours. Vecteur de volume (mm3) à volume (mm3) à volume (mm3) à sensibilisation à TO TO + 8 jours TO + 11 jours TO + 13 jours L1210-shluc 225 448,45 506,88 L1210-shluc 62,21 31,9 302,69 L1210-shluc 4 166,6 343 ,75 L1210-shluc 231,04 530 671,55 L1210-shERK5 4 15,75 13,5 L1210-shERK5 4 32 62,5 L1210-shERK5 0,5 4 4 L1210-shERK5 4 4 4 -;28- Les inventeurs ont également mis en évidence le fait que des cellules cellules L1210-shERK5 sont éliminées au niveau du péritoine de souris non traitées mais pas au niveau du péritoine des souris ayant reçu un traitement préalable visant à éliminer les cellules NK. Les cellules L1210-shLuc ne sont en revanche pas éliminées du péritoine (Fig. 10). Ils ont également mis en évidence le fait que des cellules NK syngéniques et allogéniques reconnaissent toutes deux les cellules L1210-shERK5 comme étrangères et les éliminent avec une efficacité similaire (Fig. 11). L'utilisation d'un anticorps anti-H2Kd (protéine appartenant au MHC-I) pour évaluer par FACS le niveau d'expression du CMH-I dans des cellules L1210-shLuc ou shERK5 a montré que les cellules shERK5 perdent l'expression du MHC-I au niveau de la membrane plasmique (Fig. 13). La quantification des cellules NK avec un anticorps anti-CD49b (protéine exprimée à la surface des cellules NK) parmi les cellules clu péritoine de souris récupérées 48 heures après l'injection péritonéale de cellules L1210-shLuc ou shERK5 montre que le nombre ainsi que la proportion de cellules NK au niveau péritonéal sont plus importants chez les souris ayant reçu les cellules shERK5, mettant ainsi en évidence le fait que les cellules NK sont recrutées au niveau du péritoine par les cellules shERK5 (Fig 14). Les inventeurs ont ensuite répété cette expérience en quantifiant également par FACS les cellules NK (CD49b+) exprimant les granzymes A et B, et on ainsi montré que les cellules NK recrutées par les cellules L1210-shERK5 sont positives pour les granzymes et présentent par conséquent un phénotype activé (Fig. 15). Les inventeurs ont également montré que l'incubation des cellules L1210-shERK5 en présence de cellules NK syngéniques et d'EGTA (qui bloque la mort cellulaire induite par les granzymes) ou d'un anticorps anti-FasL (qui bloque la mort cellulaire induite par Fas), conduit à une diminution importante de la quantité de cellules L1210-shERK5 éliminées par les cellules NK, mettant ainsi en évidence l'importance des mécanismes mettant en oeuvre les granzymes et Fas dans l'élimination des cellules shERK5 par les cellules NK (Fig. 12). L'incubation de cellules L1210-shLuc ou shERK5 avec des lymphocytes cytotoxiques BM3.3 activés ou non par un traitement PMA/ionomycine, et marquées avec un anticorps anti-Fas a permis de mettre en évidence le fait que les lymphocytes T activés (par le traitement PMA/ionomycine ) induisent une forte augmentation du niveau d'expression du récepteur de mort Fas dans les cellules L1210-shERK5, ce qui contribue à expliciter le fait que ces cellules soient très sensibles à des attaques par des lymphocytes cytotoxiques en général (Fig. 16). Les inventeurs ont également montré que les cellules shERK5 présentent des niveaux diminués des deux isoformes L et S de la protéine anti-apoptotique c-FLIP (Fig. 17). Enfin, les inventeurs ont montré que les cellules L1210-shERK5 présentent une forte réductioq du niveau de l'ARN de la béta2-microglobuline, une protéine essentielle pour la stabilisation des molécules du CMH-I au niveau de la membrane plasmique, ce qui contribue à expliquer pourquoi les cellules L1210-shERK5 expriment très faiblement les protéine du CMH-I au niveau de la membrane plasmique (Fig. 18). Exemple 3 - Matériel et Méthodes 1) Réactifs et anticorps Les anticorps anti-H2Kb-FITC, anti-H2Kd-PE et anti-NK1.1-APC viennent de BD Pharmingen. Les anticorps contre ERK5 et la 13-Actin viennent de Cell Signalling Technology. Les IgG d'âne anti-lapin et les IgG de mouton anti-souris ont été obtenues auprès de Amersham. Le 5(6)-carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE) vient de Sigma-Aldrich. 2) Culture cellulaire Les lignées de lymphocytes T EL4, de lymphocytes B L1210, de cellules Yac-1, RMA-S, Jurkat et les cellules primaires murines ont été cultivées dans du RPMI 1640 û Gultamax (GIBCO) 10 additionné de 5% FBS et 50 pM 2-ME. 3) Plasmides Les vecteurs d'expression d'ERK5, d'un mutant MEK5 mutant constitutionnellement actif (S313D/T317D, dénommé MEK5DD) et de la 13-galactosidase, ont été précédemment décrits (21). Les vecteurs rétroviraux pSiren-retroQ-puro (BD Biosciences) pour shERK5 et le contrôle 15 shLuc ont été précédemment décrits (21). Le construit du promoteur CMH classe I utilisé ici est dérivé du gène de porc de classe I PD1 (27) et a été obtenu du Dr Dinah Singer (NCl/NIH). 4) Transfection transitoire et qénération de lignées cellulaires stables Les cellules Jurkat en phase de croissance logarithmique ont été transfectées avec la quantité indiquée de plasmide par électroporation (21). Dans chaque expérimentation, les cellules ont 20 été transfectées avec la même quantité totale d'ADN en supplémentant avec le vecteur vide. Les cellules ont été incubées pendant 10 min à température ambiante avec le mélange d'ADN et électroporées à 260 mV, 960 pF dans 400 pI de RPMI 1640. Des lignées cellulaires stables ont été générées comme précédemment décrit (21). Brièvement, les cellules ont été étalées à 1.5 X 106 cellules/ml. Un ml de surnageant de cellules 293T exprimant le vecteur rétroviral 25 pSIREN pour shERK5 ou le plasmide contrôle a été ajouté après étalement. Trois jours plus tard, les cellules ont été cultivées avec.5 pg/ml de puromycine (Sigma-Aldrich). Après une semaine, les cellules ayant survécu ont été isolées et conservées sur le milieu de sélection jusqu'à leur utilisation. 5) Dosaqe rapporteur 30 Dans chaque expérimentation, les cellules ont été transfectées avec un plasmide rapporteur (3-galactosidase (21). Les cellules transfectées (1 x 106) ont été récoltées après 2 jours et lavées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été lysées dans 100 pI de tampon de lyse avec luciférase (Promega, Charbonnières, France) et les dosages par la luciférase (40 pI) ont été réalisés en suivant les instructions du fabricant (Promega, Charbonnières, France) en utilisant 35 un luminomètre Berthold. Pour le dosage de la (3-galactosidase, 40 pI de lysats ont été ajoutés -29- - 30 - à 200 pl de tampon de dosage [3-galactosidase (50 mM de tampon phosphate pH 7,4; ONPG 200 pg; 1 mM MgCl2; 50 mM [3-Mercaptoethanol) et l'absorbance a été mesurée à 400 nm. Les résultats sont exprimés sous la forme d'unités luciférase normalisées par rapport à l'activité [3-galactosidase correspondante. Le niveau d'expression des protéines transfectées a été contrôlé de façon routinière par analyse d'immunoblots. 6) Marquage CFSE et clairance périotonéale Les cellules ont été marquées avec le CFSE comme suit. Un pl d'une solution en stock (5mM) a été diluée dans 10 ml de PBS. Cinq millions de cellules ont été lavées une fois dans du PBS et resuspendues dans 1 ml de la solution CFSE/PBS. Après incubation 2 min à température ambiente, les cellules ont été lavées une fois dans 10 ml de PBS et resuspendues à la concentration indiquée. Les quantités indiquées de cellules ont été injectées de façon intrapéritonéal dans 150 pl de PBS. Les souris ont été sacrifiées trois jours plus tard et les cellules péritonéales ont été collectées, lavées dans du PBS et analysées sur un cytomètre de flux FACSCalibur (Becton Dickinson). 7) Mesure de l'activité cytotoxique Des cellules NK spléniques ont été isolées par sélection positive en utilisant des billes magnétiques anti-DX5 (Miltenyi Biotec, Allemagne) conformément aux instructions du fabriquant. Brièvement, des suspensions de mono-cellules viables ont été incubées (1 heure à 37°C) sur des plaques de culture tissulaire en polystyrène. Les cellules spléniques non adhérentes (10' cellules) ont été incubées (15 minutes, 4°C) avec des billes magnétiques anti-DX5, lavées deux fois et chargées (5 X 10' cellules) sur une colonne 25 LD. La pureté des cellules DX5+ collectées était typiquement de 98% (données non présentées). L'activité cytotoxique directe des cellules NK a été éva'uée en marquant les cellules cibles au Na251CrO4 pendant une heure (cellules EL4) ou à la 3H-thymidyne durant une nuit (cellules L1210). Dix mille cellules cibles ont été mélangées avec les cellules effectrices aux ratios indiqués pendant 4 heures à 37°C dans des plaques de 96 puits en V dans un volume final de 200 microlitres. La libération spontanée du 51Cr (représentatif de la lyse des cellules) a été déterminée en incubant les cellules cibles dans le milieu seul. La libération maximale a été déterminée en ajoutant 2.5% de Triton X-100. Pour les expériences avec la 3H-thymidyne (dont le % de libération est représentatif de la fragmentation ADN), les cellules ont été perméabilisées avec 25 �l d'une solution contenant 2% de Triton X-100, 80 mM de Tris/HCI pH 7,5 et 8mM d'EDTA et incubées pendant 15 minutes à 37 °C. Les plaques ont été centrifugées durant 15 minutes à 400xg et 50 �l de surnageant ont été ajoutés à 2 ml de liquide de scintillation (GE healthcare). La libération spontanée a été déterminée comme étant le nombre de coups par minute (ou � cpm �) en absence de cellules effectrices et le marquage total a été obtenu en mesurant directement les cellules cibles. Le pourcentage de lyse spécifique ou de fragmentation ADN est égal à : [(cpm échantillon û cpm spontané)/(cpm maximal ûcpm spontané)] X 100. - 31 - La libération spontanée était toujours inférieure à 10% dans le cas du 51Cr (cellules EL4), et à 20% avec la 3H-thymidyne. Toutes les expérimentations ont été réalisées trois fois. 8) Progression tumorale in vivo Pour la formation de tumeurs sous-cutanées, des cellules EL4 ont été lavées dans du PBS et resuspendues à 1.5 X 106 cellules/ml. Un total de 2.5 X105 cellules a été injecté en sous-cutané au niveau du flanc de souris C57B/6 pour le pré-traitement avec les cellules EL4-shERK5 et pour l'inoculation avec les cellules EL4-shLUC. Le développement tumoral a été analysé tous les deux jours. Les tumeurs ont été mesurées, et le volume a été calculé suivant la formule V= longueur X (poids)2/2. Pour les expérimentations de leucémie induite par M-MuLV, des souriceaux ont été infectés deux jours après leur naissance avec M-MuLV comme dérit précédemment (28). Deux mois plus tard les souris ont reçu une injection en i.p. de 2.5 X 105 cellules Yac-1 ou EL4-shERK5, ou du PBS toutes les deux semaines. La progession de la leucémie a été suivie par palpation et/ou mesure de l'hématocrite. Toutes les expérimentations impliquant des animaux ont été réalisées en suivant les lignes directrices et réglementations du Centre Nationale de la Recherche Scientifique. 9) Cytométrie de flux Des cellules péritonéales, spléniques (3 X '106) ou des lignées de cellules (2 X105) ont été marquées pendant 20 minutes à température ambiante avec les anticorps FITC-, PE- ou APC-conjugués indiqués dans 200 pl de PBS. Enfin, les cellules ont été lavées et analysées sur un cytomètre de flux FACSCalibur (Becton Dickinson) en utilisant le logiciel CellQuest (Becton Dickinson). 10) Immunoblot Les cellules ont été lavées dans du PBS et lysées dans le tampon SDS-Laemmli. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE 10% sur des mini-gels et traitées pour l'analyse par immunoblot comme précédemment décrit (21). 11) Analyses statistiques L'analyse statistique de la différence entre les moyennes des échantillons par paires a été réalisée en utilisant le test t par paire. Les résultats sont fournis sous forme d'intervalle de confiance (p). Toutes les expérimentations décrites dans les figures ont été réalisées au moins trois fois avec des résultats similaires. Références 1. Berd, D., H. C. Maguire, Jr., P. McCue, and M. J. Mastrangelo. 1990. Treatment of metastatic melanoma with an autologous tumor-tell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. J Clin Oncol 8:1858-1867. 2. Lee, J. D., R. J. Ulevitch, and J. Han. 1995. Primary structure of BMK1: a new mammalian map kinase. Biochem Biophys Res Commun 213:715-724. 3. Zhou, G., Z. Q. Bao, and J. E. Dixon. 1995. Components of a new human protein kinase signal transduction pathway. J Biot Chem 270:12665-12669. 4. Garaude, J., S. Kaminski, S. Cherni, R. A. Hipskind, and M. Villalba. 2005. The Role of ERK5 in T-Cell Signalling. Scand J Immune! 62:515-520. 5. Buschbeck, M., and A. Ullrich. 2005. The Unique C-terminal Tail of the Mitogen-activated Protein Kinase ERK5 Regulates Its Activation and Nuclear Shuttling. J Biol Chem 280:2659-2667. 6. Esparis-Ogando, A., E. Diaz-Rodriguez, J. C. Montero, L. Yuste, P. Crespo, and A. Pandiella. 2002. Erk5 participates in neuregulin signal transduction and is constitutively active in breast cancer tells overexpressing ErbB2. Mol Cell Biot 22:270-285. 7. English, J. M., G. Pearson, T. Hockenberry, L. Shivakumar, M. A. White, and M. H. Cobb. 1999. Contribution of the ERK5/MEK5 pathway to Ras/Raf signaling and growth control. Journal of Biological Chemistry 274:31588-31592. 8. Mulloy, R., S. Salinas, A. Philips, and R. A. Hipskind. 2003. Activation of cyclin D1 expression by the ERK5 cascade. Oncogene 22:5387-5398. 9. Linnerth, N. M., M. Baldwin, C. Campbell, M. Brown, H. McGowan, and R. A. Moorehead. 2005. IGF-II induces CREB phosphorylation and tell survival in human lung cancer cells. Oncogene 24:7310-7319. 10. Buschbeck, M., S. Hofbauer, L. D. Croce, G. Keri, and A. Ullrich. 2005. Abl-kinase-sensitive levels of ERK5 and its intrinsic basal activity contribute to leukaemia tell survival. EMBO Rep 6:63-69. 11. Carvajal-Vergara, X., S. Tabera, J. C. Montero, A. Esparis-Ogando, R. Lopez-Perez, G. Mateo, N. Gutierrez, M. Parmo-Cabanas, J. Teixido, J. F. San Miguel, and A. Pandiella. 2005. Multifunctional rote of Erk5 in multiple myeloma. Blood 105:4492-4499. 12. Mehta, P. B., B. L. Jenkins, L. McCarthy, L. Thilak, C. N. Robson, D. E. Neal, and H. Y. Leung. 2003. MEK5 overexpression is associated with metastatic prostate cancer, and stimulates proliferation, MMP-9 expression and invasion. Oncogene :22:1381-1389. 13. Weldon, C. B., A. B. Scandurro, K. W. Rolfe, J. L. Clayton, S. Elliott, N. N. Butler, L.1. Melnik, J. Alam, J. A. McLachlan, B. M. Jaffe, B. S. Beckman, and M. E. Burow. 2002. Identification of mitogenactivated protein kinase kinase as a chemoresistant pathway in MCF-7 cells by using gene expression microarray. Surgery 132:293-301. 14. Nagel, S., C. Burek, L. Venturini, M. Scherr, H. Quentmeier, C. Meyer, A. Rosenwald, H. G. Drexler, and R. A. Macleod. 2006. Comprehensive analysis of homeobox genes in hodgkin lymphoma tell lines identifies dysregulated expression of HOXB9 mediated via ERK5 signaling and BMI1. Blood. 15. Sohn, S. J., B. K. Sarvis, D. Cado, and A. Winoto. 2002. ERK5 MAPK regulates embryonic angiogenesis and acts as a hypoxia-sensitive repressor of vascular endothelial growth factor expression. J Biot Chem 277:43344-43351. 16. Regan, C. P., W. Li, D. M. Boucher, S. Spatz, M. S. Su, and K. Kuida. 2002. Erk5 null mice display multiple extraembryonic vascular and embryonic cardiovascular defects. Proc Nat/ Acad Sci U S A 99:9248-9253. 17. Wang, X., A. J. Merritt, J. Seyfried, C. Guo, E. S. Papadakis, K. G. Finegan, M. Kayahara, J. Dixon, R. P. Boot-Handford, E. J. Cartwright, U. Mayer, and C. Tournier. 2005. Targeted deletion of mek5 causes early embryonic death and defects in the extracellular signal-regulated kinase 5/myocyte enhancer factor 2 tell survival pathway. Mol Cell Biol 25:336-345. 18. Hayashi, M., S. W. Kim, K. Imanaka-Yoshida, T. Yoshida, E. D. Abel, B. Eliceiri, Y. Yang, R. J. Ulevitch, and J. D. Lee. 2004. Targeted deletion of BMK1/ERK5 in adult mice perturbs vascular integrity and leads to endothelial failure. J Clin Invest 113:1138-1148. - 32 - - :33 - 19. Hayashi, M., C. Fearns, B. Eliceiri, Y. Yang, and J. D. Lee. 2005. Big mitogen-activated protein kinase 1/extracellular signal-regulated kinase 5 signaling pathway is essential for tumor-associated angiogenesis. Cancer Res 65:7699-7706. 20. Wang, X., K. G. Finegan, A. C. Robinson, L. Knowles, R. Khosravi-Far, K. A. Hinchliffe, R. P. Boot-Handford, and C. Tournier. 2006. Activation of extracellular signal-regulated protein kinase 5 downregulates FasL upon osmotic stress. Ce /l Death Differ. 21. Garaude, J., S. Cherni, S. Kaminski, E. Delepine, C. Chable-Bessia, M. Benkirane, J. Borges, A. Pandiella, M. A. Iniguez, M. Fresno, R. A. Hipskind, and M. Villalba. 2006. ERK5 activates NF-kappaB in leukemic T cells and is essential for their growth in vivo. J Immunol 177:7607-7617. 22. Glas, R., L. Franksson, C. Une, M. L. Eloranta, C. Ohlen, A. Orn, and K. Karre. 2000. Recruitment and activation of natural killer (NK) cells in vivo determined by the target cell phenotype. An adaptive component of NK cell-mediated responses. J Exp Med 191:129-138. 23. Hallett, W. H., and W. J. Murphy. 2006. Positive and negative regulation of Natural Killer cells: Therapeutic implications. Semin Cancer Biol '16:367-382. 24. Wodnar-Filipowicz, A., and C. P. Kalberer. 2006. Function of natural killer cells in immune defence against human leukaemia. Swiss Med Wkly 136:359-364. 25. Passweg, J. R., A. Tichelli, S. Meyer-Monard, D. Heim, M. Stern, T. Kuhne, G. Favre, and A. Gratwohl. 2004. Purified donor NK-lymphocyte infusion to consolidate engraftment after haploidentical stem cell transplantation. Leukemia 18:1835-1838. 26. Miller, J. S., Y. Soignier, A. Panoskaltsis-Mortari, S. A. McNearney, G. H. Yun, S. K. Fautsch, D. McKenna, C. Le, T. E. Defor, L. J. Burns, P. J. Orchard, B. R. Blazar, J. E. Wagner, A. Slungaard, D. J. Weisdorf, I. J. Okazaki, and P. B. McGlave. 2005. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood 105:3051-3057. 27. Howcroft, T. K., J. D. Weissman, A. Gegonne, and D. S. Singer. 2005. A T lymphocyte-specific transcription complex containing RUNX1 activates MHC class I expression. J Immunol 174:2106-2115. 28. Audit, M., J. Dejardin, B. Hohl, C. Sidobre, T. J. Hope, M. Mougel, and M. Sitbon. 1999. Introduction of a cisacting mutation in the capsid-coding gene of moloney murine leukemia virus extends its leukemogenic properties. J Viro173:10472-10479. 29. Gays, F., M. Unnikrishnan, S. Shrestha, K. P. Fraser, A. R. Brown, C. M. Tristram, Z. M. Chrzanowska-Lightowlers, and C. G. Brooks. 2000. The 'nouse tumor cell fines EL4 and RMA display mosaic expression of NK-related and certain other surface molecules and appear to have a common origin. J Immunol 164:5094-5102. 30. Suck, G. 2006. Novel approaches using natural killer cells in cancer therapy. Semin Cancer Biot 16:412-418. 31. Fan, H. 1997. Leukemogenesis by Moloney murine leukemia virus: a multistep process. Trends Microbiol 5:74-82. 32. Kawabata, H., A. Niwa, S. Tsuji-Kawahara, H. IJenishi, N. Iwanami, H. Matsukuma, H. Abe, N. Tabata, H. Matsumura, and M. Miyazawa. 2006. Pep:ide-induced immune protection of CD8+ T cell-deficient mice against Friend retrovirus-induced disease. /nt Immunol 18:183-198. 33. Messer, R. J., U. Dittmer, K. E. Peterson, and K. J. Hasenkrug. 2004. Essential rote for virusneutralizing antibodies in sterilizing immunity against Friend retrovirus infection. Proc Nat/ Acad Sci USA 101:12260-12265. 34. Reuter, T., M. Heldmann, S. Schimmer, K. Schepers, and U. Dittmer. 2004. Protection of mice against Friend retrovirus infection by vaccination with antigen-loaded, spleen-derived dendritic cells. Vaccine 22:2686-2689. 35. Akao, Y., Nakagawa Y., Kitade Y., Kinoshita T., and Naoe T. 2007. Downregulation of microRNAs-143 and -145 in B-cell malignancies. Cancer Sci 98:1914-1920. 36. Radu D.R., Lai C-Y., Jeftinija K., Rowe E.W , Jeftinja S. and Lin V.S-Y. 2004. A Polyamidoamine Dendrimer-Capped Mesoporous Silica Nonosphere-Based Gene Transfection Reagent. J. Am. Chem. Soc.126:13216-13217. Revendications1. Cellule animale tumorale vivante isolée ou en culture présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif, comprenant un agent d'origine exogène capable de réduire : le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 endogène d'au moins 10% par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques, et éventuellement le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau membranaire de 25 à 100% par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. 2. Cellule selon la revendication 1 comprenant un second agent d'origine exogène capable de réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire de 25 à 100% par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. 3. Cellule selon la revendication 1 ou 2, présentant une réduction de 25 à 90% du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 présente dans la cellule par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques, et une réduction de 50 à 100% du niveau d'expression global ou de la quantité globale au niveau membranaire des protéines du CMH-1 par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. 4. Cellule selon la revendication 1, 2 ou 3 où ladite cellule est une cellule humaine. 5. Cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 où ladite réduction du niveau d'expression de la protéine ERK5 est causée au moins en partie par un mécanisme posttranscriptionnel. 6. Cellule selon la revendication 5, où ledit agent d'origine exogène comprend une molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprenant une séquence de 15 à 25 résidus nucléotidiques présentant un niveau d'homologie d'au moins 85% avec une portion de la séquence nucléotidique du gène ou de l'ADNc encodant la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 2, ou de l'un de ses équivalents chez l'animal. FR 08 02809 - N/Ref : 87435-CA/SR Notification d'irrégularités en date du 10/10/2008 Notification de non-unité en date du 10/1012008 Revendications (modifications non visibles) - 34 -- 35 - 7. Cellule selon la revendication 6 où ladite molécule d'acide nucléique d'origine exogène est une molécule de type miARN, siARN, ARN antisens, ARN sens ou ribozyme, ou une molécule d'ADN comprenant une séquence dont la transcription génère une molécule d'ARN de type shARN, ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule. 8. Cellule selon la revendication 7, où ledit mécanisme post-transcriptionnel est un mécanisme d'interférence ARN. 9. Cellule selon la revendication 8 où ladite molécule d'acide nucléique d'origine exogène comprend une molécule d'ADN comprenant l'une des séquences SEQ ID N° 3, 4 ou 5 sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule, et dont la transcription génère une molécule shARN. 10. Cellule selon l'une quelconques des revendications 7 à 9, où ladite molécule d'acide nucléique d'origine exogène est introduite dans la cellule par l'intermédiaire d'un vecteur lentiviral, rétroviral, adénoviral, adéno-associé, ou à base de nanoparticules. 11. Cellule selon l'une quelconque des revendication 1 à 10, où ladite cellule tumorale est un lymphocyte, un leucocyte, une cellule de cancer du sein ou de la prostate, ou une cellule métastatique. 12. Cellule selon l'une quelconque des revendication 1 à 11, où ladite cellule est une cellule tumorale primaire extraite d'un patient atteint d'une tumeur, modifiée par l'ajout dudit agent d'origine exogène et maintenue en culture dans des conditions et pendant une durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. 13. Lignée de cellules tumorales selon l'une quelconque des revendication 1 à 12. 14. Cellule animale tumorale vivante présentant un phénotype CMH-1 négatif et ERK5 négatif en tant que médicament ou vaccin. 15. Cellule tumorale selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 en tant que médicament ou vaccin. 16. Cellules tumorales selon la revendication 15 où ledit médicament ou vaccin est destiné à prévenir ou traiter un cancer ou le développement de métastases chez un patient humain ou animal. 17. Cellules tumorales selon la revendication 16 où lesdites cellules tumorales sont des cellules primaires extraites dudit patient, modifiées par l'ajout dudit agent exogène et maintenues en FR 08 02809 - N/Ref : B7435-CA/SR Notification d'irrégularités en date du 10/10/2008 Notification de non-unité en date du 10/10/2008 Revendications (modifications non visibles)- 36 - culture dans des conditions et pendant un durée suffisantes pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. 18. Cellules tumorales selon la revendication 16 où lesdites cellules tumorales sont des cellules allogéniques provenant d'une lignée cellulaire. 19. Cellules tumorales selon la revendication 18 où lesdites cellules tumorales sont des cellules tumorales du même type que celles qui sont responsables du cancer dont ledit patient est atteint. 20. Cellules tumorales selon la revendication 18 où lesdites cellules tumorales sont des cellules tumorales d'un type différent de celles qui sont responsables du cancer dont ledit patient est atteint. 21. Cellules tumorales selon la revendication 20 où ledit cancer est une leucémie, un lymphome, un myélome, un cancer du sein ou un cancer de la prostate. 22. Cellules tumorales selon la revendication 21 où lesdites cellules tumorales sont des lymphocytes B ou T. 23. Cellules tumorales selon la revendication 21 ou 22 où ledit vaccin ou médicament est destiné à être administré en combinaison avec une transplantation allogénique de moelle osseuse ou de cellules du sang. 24. Cellules tumorales selon l'une quelconque des revendications 16 à 23 où ledit vaccin ou médicament est destiné à être administré en combinaison avec un autre traitement anticancéreux. 25. Cellules tumorales selon l'une quelconque des revendications 16 à 24 où ledit vaccin ou médicament est destiné à être administré en combinaison avec l'administration de cellules NK activées. 26. Cellules tumorales selon l'une quelconque des revendications 16 à 25 où ledit vaccin ou médicament est destiné à être administré localement au niveau des cellules endogènes tumorales du patient, de l'organe dudit patient atteint par ledit cancer ou dans le système sanguin. 27. Médicament ou vaccin cellulaire vivant comprenant un agent capable de conférer un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif à une cellule tumorale humaine ou animale pour prévenir ou traiter un cancer chez un patient, où ledit agent est capable de FR 08 02809 - N/Ref : B7435-CA/SR Notification d'irrégularités en date du 1011012008 Notification de non-unité en date du 10/10/2008 Revendications (modifications non visibles)- 37 - de réduire d'au moins 10% le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 dans ladite cellule tumorale par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques, et réduire de 25 à 100% le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-I au niveau de la membrane de ladite cellule tumorale par rapport à leur niveau d'expression global ou leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent dans des conditions de culture identiques. 28. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 27 où ledit agent est capable de de réduire de 25 à 90% le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 dans ladite cellule tumorale par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent dans des conditions de culture identiques, et réduire de 50 à 100% le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau de la membrane de ladite cellule tumorale par rapport à leur niveau d'expression global ou leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent dans des conditions de culture identiques. 29. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 27 ou 28, où ledit agent comprend une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence de 15 à 25 résidus nucléotidiques présentant un niveau d'homologie d'au moins 85% avec une portion de la séquence nucléotidique du gène ou de l'ADNc encodant la protéine ERK5 humaine représentée par la séquence SEQ ID N° 2, ou de l'un de ses équivalents chez l'animal. 30. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 29 où ladite molécule d'acide nucléique est une molécule de type ARN antisens, ARN sens, miARN ou siARN ou ribozyme, ou une molécule d'ADN comprenant une séquence dont la transcription génère une molécule d'ARN de type shARN, ARN antisens, ARN sens, miARN, siARN ou ribozyme, sous le contrôle d'un promoteur actif dans ladite cellule. 31. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 30 où ladite molécule d'acide nucléique comprend une molécule d'ADN comprenant l'une des séquences SEQ ID N° 3, 4 ou 5 sous le contrôle d'un promoteur actif dans la cellule, et dont la transcription génère une molécule shARN. 32. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 29, 30 ou 31, où ledit agent est vecteur plasmidique ou viral. FR 08 02809 - N/Ref : B7435-CA/SR Notification d'irrégularités en date du 10/10/2008 Notification de non-unité en date du 10/10/2008 Revendications (modifications non visibles)-38- 33. Médicament ou vaccin cellulaire vivant selon la revendication 32, où ledit vecteur viral est un vecteur lentiviral, rétroviral ou adénoviral. 34. Procédé in vitro ou ex vivo pour obtenir une cellule présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-I négatif selon lequel : a) un agent exogène capable de réduire d'au moins 10% le niveau d'expression ou la quantité de la protéine ERK5 endogène et de 25% à 100% le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire, est introduit une cellule tumorale animale isolée ou en culture, b) la cellule tumorale est cultivée dans des conditions et pendant une durée suffisante pour présenter un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif. 35. Procédé selon la revendication 34 selon lequel l'étape a) comprend également l'introduction dans ladite cellule tumorale d'un second agent d'origine exogène capable dans des conditions de culture appropriées de réduire le niveau d'expression global ou la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau membranaire. 36. Procédé selon la revendication 34 ou 35 dans lequel les conditions et la durée selon l'étape b) permettent d'obtenir une réduction de 25 à 90% du niveau d'expression ou de la quantité de la protéine ERK5 présente dans ladite cellule par rapport à son niveau d'expression ou à sa quantité en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques, et une réduction de 50 à 100% du niveau d'expression global ou de la quantité globale des protéines du CMH-1 au niveau de la membrane par rapport à leur niveau d'expression global ou à leur quantité globale au niveau membranaire en l'absence dudit agent exogène dans des conditions de culture identiques. 37. Procédé selon la revendication 34, 35 ou 36 où la cellule tumorale mentionnée à l'étape a) est une cellule primaire provenant d'un patient atteint d'un cancer. 38. Procédé selon la revendication 34, 35 ou 36 où la cellule tumorale mentionnée à l'étape a) est une cellule provenant d'une lignée de cellules tumorales. 39. Procédé in vitro ou ex vivo d'obtention de cellules NK activées comprenant a) une étape de mise en contact in vitro ou ex vivo de cellules NK vivantes avec des cellules tumorales vivantes présentant un phénotype ERK5 négatif et CMH-1 négatif dans des conditions et pendant un durée suffisante pour induire l'activation des cellules NK ; b) une étape de récupération des cellules NK activées. FR 08 02809 - N/Ref : B7435-CA/SR Notification d'irrégularités en date du 10/10/2008 Notification de non-unité en date du 10/10/2008 Revendications (modifications non visibles)- 39 - 40. Procédé selon la revendication 39 où lesdites cellules NK mentionnées à l'étapes a) sont des cellules NK primaires prélevées chez un patient atteint d'un cancer. 41. Médicament ou vaccin comprenant des cellules NK activées susceptibles d'être obtenues par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 39 ou 40 pour prévenir ou traiter un cancer. 42. Médicament ou vaccin selon la revendication 41, où ledit médicament ou vaccin comprend également des cellules tumorales selon l'une quelconque des revendications 1 à 12. 43. Composition thérapeutique ou vaccinale comprenant des cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou des cellules d'une lignée de cellules selon la revendication 13, ainsi qu'un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. 44. Composition thérapeutique ou vaccinale selon la revendication 43 comprenant également une molécule thérapeutique anti-tumorale. 45. Composition thérapeutique ou vaccinale selon la revendication 43 ou 44 comprenant également des cellules NK activées. FR 08 02809 - N/Ref : 87435-CANSR Notification d'irrégularités en date du 10/10/2008 Notification de non-unité en date du 10/10/2008 Revendications (modifications non visibles)