Brevet FR2928270A1 — publié le 20090911

Formulation et méthode pour la prévention ou le traitement des métastases osseuses et autres maladies de l'os L'invention est relative à des formulations et médicaments pour le traitement des métastases osseuses et autres maladies de l'os. Elle est aussi relative à des méthodes de prévention et de traitement. Les bisphosphonates sont des analogues synthétiques du pyrophosphate (structure P-O-P) dans lesquels l'atome d'oxygène central est remplacé par un atome de carbone. Leur structure chimique peut être représentée par la formule suivante : OH R' 0H [ I 1 pùCùP 0 1 OH 3 OH 10 Les bisphosphonates peuvent être classés en deux catégories. La première catégorie comprend les composés dits de première génération ne contenant pas d'atome d'azote dans leurs chaînes latérales R' et R2. Cette catégorie comprend notamment l'étidronate, le clodronate et le tiludronate. 15 La deuxième catégorie comprend les composés dits de deuxième et troisième générations contenant un ou plusieurs atomes d'azote dans l'une de leurs chaînes latérales R' ou R2. Ceux de la seconde génération comportent une chaîne latérale aliphatique portant un atome d'azote ou un groupe NH2 terminal. Il convient de citer le pamidronate, l'alendronate, l'ibandronate et le neridronate. Ceux de la troisième 20 génération portent un noyau hétérocyclique contenant un atome d'azote. Il convient de citer le risedronate et le zolédronate (noyau imidazole). Cette classification en première, deuxième et troisième génération est parfaitement connue de l'homme du métier. A titre illustratif, on mentionnera T. Yuasa et al., Current Medical Chemistry 2007, 14 : 2126-2135 et Selvaggi et al., Crit. Rev. Oncol. 25 Hematol. 2005, 56(3) : 365-378 ; V. Stresing et al., Cancer Letters 2007, 257: 16-35 ; R. Graham G. Russell et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007, 1117 : 209-257. Les métastases osseuses sont fréquentes dans les cas de cancer avancé. Elles sont les plus fréquentes dans les myélomes multiples, les cancers du sein et de la prostate, mais sont présentes aussi dans les cas de mélanome et de cancer de la vessie, 30 du poumon et du rein. Les bisphosphonates se sont imposés dans le traitement thérapeutique des patients atteints de cancer des os. Clodronate, pamidronate, zolédronate et ibandronate sont ainsi utilisés. Les bisphosphonates peuvent être cependant toxiques à hautes doses. Ils peuvent être en outre sujet à une élimination rénale importante. Par exemple, pour le zolédronate, cette élimination par les reins génère une toxicité rénale telle que les doses employées en clinique humaine doivent être sérieusement encadrées et peuvent se trouver en deçà des doses efficaces pour le traitement des métastases osseuses. Ainsi, les doses cliniques de zolédronate sont-elles 10 à 40 fois inférieures aux doses efficaces déterminées chez l'animal (J. Green, Oncologist 2004, 9 : 3-13). L. Rossi et al. (Journal of Drug Targeting, février 2005, 13(2) : 99-111) décrit l'encapsulation du clodronate dans des érythrocytes et son emploi pour la déplétion des macrophages. Les auteurs décrivent un traitement des érythrocytes à l'aide de ZnCl2 et de BS3, en présence d'éthanolamine et de sérum albumine bovine. Les auteurs mettent en évidence chez la souris une déplétion des macrophages spléniques. L'étude ne concerne ni n'envisage l'emploi des érythrocytes comme vecteur de bisphosphonates dans les applications osseuses. L'invention a donc pour objectif de proposer une solution permettant de délivrer des bisphosphonates au niveau de la moelle osseuse en limitant l'élimination rénale et sans connaître les problèmes de toxicité qui limitent actuellement l'efficacité de ces principes actifs. Elle a aussi pour objectif de proposer une telle solution qui permette d'accroître la biodisponibilité des bisphosphonates au niveau de la moelle osseuse. Elle a encore pour objectif de proposer une telle solution qui permette de diminuer la quantité de bisphosphonate administrée pour un traitement donné et par rapport à la forme libre. Elle a encore pour objectif de proposer une telle solution qui permette d'augmenter la dose administrable, sans connaître les problèmes limitants de toxicité de la forme libre. L'invention a ainsi pour objet une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme médicament permettant de cibler la moelle osseuse et d'apporter à cette moelle osseuse le bisphosphonate en limitant voire en supprimant tout risque toxique, notamment toxicité rénale. L'invention a aussi pour objet une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme véhicule permettant d'apporter un bisphosphonate dans la moelle osseuse, notamment pour le traitement ou la prévention des maladies de l'os telles que les métastases osseuses. Par définition le terme bisphosphonate englobe l'ensemble des bisphosphonates, leurs sels et dérivés, et notamment les bisphosphonates de première, deuxième et troisième génération et leurs sels et dérivés. Ce terme englobe donc les diphosphonates, les acides biphosphoniques et les acides diphosphoniques. Des exemples non limitatifs de bisphosphonates incluent : étidronate, clodronate, tiludronate, pamidronate, notamment disodique, alendronate, incadronate, ibandronate, neridronate, risedronate et zolédronate. De préférence, l'invention met en oeuvre les bisphosphonates contenant au moins un atome d'azote, par exemple ceux de deuxième et troisième générations. Sont notamment retenus : pamidronate, alendronate, ibandronate et neridronate pour la deuxième génération. Ceux de la troisième génération portent un noyau hétérocyclique contenant un atome d'azote. Il convient de citer le risedronate et le zolédronate (noyau imidazole). L'invention concerne notamment une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme médicament pour la prévention et le traitement des pathologies de l'os et de la moelle osseuse pour lesquelles les bisphosphonates peuvent être indiqués. Elle permet d'apporter des doses optimisées pour le traitement de la pathologie visée, dans la mesure où le protocole de traitement n'est plus limité par la toxicité attachée à la forme libre du bisphosphonate. Ainsi, l'utilisation peut concerner la prévention ou le traitement des métastases osseuses, de l'hypercalcémie maligne, de la maladie de Paget et de l'ostéoporose. L'invention est plus particulièrement une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme médicament pour la prévention et le traitement des métastases osseuses. L'invention concerne aussi un médicament contenant une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation pour la prévention et le traitement de ces maladies de l'os ou de la moelle, et en particulier des métastases osseuses. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et au traitement de ces maladies de l'os ou de la moelle, et en particulier des métastases osseuses. L'invention concerne aussi une suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme véhicule permettant d'apporter un bisphosphonate dans la moelle osseuse, pour le traitement ou la prévention des métastases osseuses. De préférence, l'encapsulation du bisphosphonate est réalisée par une procédure dite de lyse-rescellement. Le bisphosphonate est généralement préparé en solution tamponnée, par exemple PBS, à pH 7,2 à 7,6, de préférence à 7,4. Suivant une caractéristique de cette procédure, on réalise d'abord la lyse des érythrocytes en soumettant ceux-ci à des conditions hypotoniques. Les érythrocytes gonflent, ouvrant les pores. Le bisphosphonate est alors ajouté et pénètre à l'intérieur des érythrocytes. De préférence, une solution de biphosphonate est ajoutée progressivement, puis le mélange est laissé à incuber par exemple de 10 à 60 minutes, typiquement environ 30 minutes. On rétablit ensuite des conditions isotoniques et les pores sont ainsi rescellés ou refermés, de sorte que les érythrocytes encapsulent le bisphosphonate de manière stable. Suivant une caractéristique avantageuse de l'invention, les érythrocytes sont traités avec un agent chimique dans des conditions favorisant le ciblage de la moelle osseuse. Cet agent chimique favorise la reconnaissance par les cellules phagocytaires (macrophages et cellules dendritiques) de la moelle osseuse. Le traitement chimique est réalisé sur les érythrocytes encapsulant le bisphosphonate. Un agent chimique préféré et compatible avec une utilisation en clinique humaine est le Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (abrégé en BS3 ou BS3; CAS 82436-77-9). On emploie avantageusement une solution de cet agent. L'invention a aussi pour objet une suspension d'érythrocytes, ou un médicament comprenant une telle suspension, comprenant des érythrocytes encapsulant le bisphosphonate et dont la membrane a été traitée pour favoriser la reconnaissance par les cellules phagocytaires de la moelle osseuse à l'aide d'un tel agent chimique, de préférence le BS3. Le BS3 est de préférence utilisé seul, à l'exclusion de tout autre agent chimique ou biologique, tel que ZnCl2. Suivant un premier mode de réalisation, le bisphosphonate est de première génération. Suivant un deuxième mode de réalisation, le bisphosphonate est de deuxième génération. Suivant un troisième mode de réalisation, le bisphosphonate est de troisième génération. Des exemples non limitatifs de bisphosphonates incluent : étidronate, clodronate, tiludronate, pamidronate, notamment disodique, alendronate, incadronate, ibandronate, neridronate, risedronate et zolédronate. Suivant un mode de réalisation, le bisphosphonate est choisi parmi : étidronate, tiludronate, pamidronate, notamment disodique, alendronate, incadronate, ibandronate, neridronate, risedronate et zolédronate. Suivant une caractéristique du procédé de traitement au BS3, la suspension d'érythrocytes encapsulant le bisphosphonate est mise en contact avec le BS3 pendant une durée appropriée qui peut être comprise notamment entre environ 10 min et environ 1 heure. Cette durée est avantageusement comprise entre environ 15 min et environ 45 min, de préférence entre environ 20 et environ 40 min, typiquement de l'ordre de 30 min. Suivant une autre caractéristique du procédé de traitement au BS3, cette incubation est de préférence réalisée à température ambiante, notamment entre 18 et 25°C. Suivant une autre caractéristique du procédé de traitement au BS3, la suspension d'érythrocytes renfermant le bisphosphonate est préalablement lavée à l'aide d'un tampon approprié, e.g. du PBS. Suivant une autre caractéristique, la suspension d'érythrocytes traitée au BS3 est amenée à une concentration comprise entre environ 0,5 106 et environ 5 106 cellules/pl, typiquement entre environ 1 106 et environ 3 106 cellules/pl, avant d'être mise en contact avec la solution de BS3. Suivant une autre caractéristique, on emploie une solution de BS3 pour obtenir une concentration finale en BS3 comprise entre environ 0,1 et environ 6 mM, de préférence entre environ 0,5 et environ 3 mM, typiquement d'environ 1 mM dans la suspension. On peut notamment employer une solution de BS3 d'environ 2 mM. On emploie de préférence une solution tamponnée de BS3, contenant de préférence du glucose et du tampon phosphate, pour obtenir la concentration finale désirée en BS3, notamment d'environ 1 mM. Suivant une caractéristique, la solution tamponnée de BS3 est avantageusement à pH compris entre environ 7,2 et environ 7,6, de préférence pH d'environ 7,4. Suivant une autre caractéristique, la solution tamponnée de BS3 a une osmolarité comprise entre environ 280 et environ 320 mOsm. L'incubation peut être stoppée à l'aide d'un agent tel que le Tris-HCI, puis le mélange est centrifugé, les cellules lavées et remises en suspension dans un tampon approprié, tel que le SAG-BSA. Le mélange est laissé à incuber avant centrifugation pendant quelques minutes, notamment de 1 à 10 minutes, à température ambiante. La suspension peut être prête à l'emploi et avoir un hématocrite adapté pour être administrée sans dilution. Elle peut aussi être conditionnée de manière à devoir être diluée avant administration. Selon l'invention, l'hématocrite de la suspension prête à l'emploi est avantageusement compris entre environ 40 et environ 70%, de préférence entre environ 45 et environ 55%, mieux d'environ 50%. Sous sa forme à diluer, l'hématocrite peut être supérieur, notamment compris entre environ 60 et environ 90%. La suspension est de préférence conditionnée sous un volume d'environ 10 à environ 250 ml. Le conditionnement est de préférence en poche de sang du type adapté pour une transfusion sanguine. La quantité de bisphosphonate encapsulée correspondant à la prescription médicale est de préférence contenue intégralement dans la poche de sang. Par exemple, la suspension correspondant à une dose, par exemple une poche de sang, comprend de 1 à 40 mg de bisphosphonate, notamment de 2 à 10 mg. Suivant une caractéristique de l'invention, les érythrocytes à administrer sont en suspension dans une solution saline pharmaceutiquement acceptable (par exemple milieu standard pour hématies, notamment solution contenant du NaCl et un ou plusieurs ingrédients choisis parmi glucose, dextrose, adénine et mannitol ; e.g. SAG-mannitol ou ADsol). Cette solution est apte à assurer la conservation des érythrocytes, et peut en outre inclure un additif de conservation, tel que la L-carnitine. L'invention a ainsi pour objet une méthode pour prévenir ou traiter les métastases osseuses ou autres maladies de l'os. Cette méthode comprend l'administration au patient d'une formulation ou d'un médicament selon l'invention. Conformément à l'invention, l'administration de la formulation ou médicament se fait par injection intraveineuse ou intra-artérielle et de préférence par perfusion à partir d'une poche de sang ou analogue. L'administration est typiquement réalisée par voie intraveineuse dans le bras ou par cathéter central. On administre notamment d'environ 10 à environ 250 ml de formulation (une dose) selon l'invention. A partir de 50 ml, on préfère employer la perfusion. Un traitement comprend l'administration d'une dose ou de plusieurs doses selon le protocole décidé. Celui-ci peut prévoir plusieurs administrations à une fréquence mensuelle, bimensuelle, trimestrielle, semestrielle ou annuelle, sur la durée préconisée de traitement. Les techniques permettant d'encapsuler des principes actifs dans des globules rouges sont connues et la technique de base par lyse-rescellement, qui est préférée ici, est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EP-A-679 101, auxquels l'homme du métier pourra se référer. Selon cette technique, on alimente en continu le compartiment primaire d'un élément de dialyse (par exemple boudin de dialyse ou cartouche de dialyse) avec une suspension d'érythrocytes, tandis que le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension d'érythrocytes afin de lyser ceux-ci ; ensuite dans une unité de rescellement, on induit le rescellement des érythrocytes en présence du bisphosphonate par augmentation de la pression osmotique et/ou oncotique, puis l'on recueille une suspension d'érythrocytes contenant le bisphosphonate. Conformément à une caractéristique de l'invention, on préfère effectuer la lyse d'une suspension d'érythrocytes contenant déjà le bisphosphonate à encapsuler. La suspension d'érythrocytes encapsulant le bisphosphonate est notamment susceptible d'être obtenue par le procédé suivant, qui est aussi un objet de l'invention: 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 °C, 2 - procédure de lyse, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 °C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8 °C, dans un boudin ou dans une cartouche de dialyse (la cartouche est préférée) ; 3 û procédure d'encapsulation par ajout, de préférence progressif, d'une solution de bisphosphonate dans la suspension lysée, à température maintenue entre + 1 et + 8°C, de préférence période d'incubation notamment de 10 à 60 min, typiquement d'environ 30 min ; et 4 - procédure de rescellement conduite en présence d'une solution hypertonique, à une température plus élevée, notamment comprise entre + 30 et + 42 °C. En variante préférée, on peut s'inspirer de la méthode décrite dans WO-A-2006/016247 qui permet d'encapsuler le bisphosphonate de manière performante, reproductible, sûre et stable. La suspension d'érythrocytes encapsulant le bisphosphonate est alors susceptible d'être obtenue par le procédé suivant, qui est aussi un objet de l'invention : 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8°C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque (y compris en parallèle), 3 - procédure de lyse, notamment à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8°C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8°C, dans un boudin ou une cartouche de dialyse (la cartouche est préférée); les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et 4 û procédure d'encapsulation par ajout, de préférence progressif, d'une solution de bisphosphonate dans la suspension lysée, à température maintenue entre + 1 et + 8°C, de préférence période d'incubation notamment de 10 à 60 min, typiquement d'environ 30 min ; et -procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte en présence d'une solution hypertonique, à une température plus élevée, notamment comprise entre + 5 30 et + 42 °C. Par � internalisation �, on entend pénétration du bisphosphonate à l'intérieur des érythrocytes. Notamment, pour la dialyse, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8°C, de préférence entre + 2 et + 6°C, typiquement aux alentours de + 4°C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %. Lorsqu'elle est mesurée, la fragilité osmotique est avantageusement mesurée sur les érythrocytes juste avant l'étape de lyse, en présence ou en l'absence de bisphosphonate dans la suspension. Les érythrocytes ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes. Concernant la manière d'opérer la procédure de lyse-rescellement, avec mesure et prise en compte de la fragilité osmotique, l'homme du métier pourra se référer pour plus de détails à WO-A-2006/016247. Ce document est incorporé ici par référence. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs. I - Exemple 1 : méthode d'encapsulation de zolédronate en qlobules rouges 30 murins et humains la û Matériel : Pour la dialyse : cartouche de dialyse (Gambro 280 fibres) Dosages : Le dosage du zolédronate dans les globules rouges est effectué par 35 chromatographie liquide haute performance HPLC après préparation des échantillons selon le procédé suivant. Les GR encapsulant le zolédronate sont lysés avec 2,5 volumes d'eau, puis le zolédronate est extrait par précipitation des protéines et membranes à l'acide trichloroacétique 12%. Les GR (avant encapsulation), les produits finis GRùZol et GR-LR traités ou non au BS3, ainsi que leurs surnageants à JO et à J1 sont dosés afin d'estimer la quantité de zolédronate qui a été encapsulée. Afin d'améliorer le temps de rétention du zolédronate sur le support C18, on utilise le composé hydrogéno-sulfate de tétrabutyle ammonium comme agent d'appariement d'ions. Instrument : Shimadzu UFLC Colonne : Gemini C18 5p 110A 250 x 4,6 mm ID Température : 40°C Volume d'injection : 40p1 Détection UV : 220 nm Débit : 0,7 ml/min Phase mobile A : 8 mM K2HPO4 ù (1,39 g/L), 2 mM Na2HPO4 ù (0.,1 g/L), 7 mM tetrabutylammonium hydrogen sulfate ù (2,7 g/L) Phase mobile B : Methanol lb ù Méthode : Les globules rouges sont centrifugés, puis lavés trois fois en PBS. L'hématocrite de la suspension est amené à 70% avec du PBS avant de démarrer la dialyse. Les GR sont dialysés à un débit de 2 ml/min contre un tampon de lyse à faible osmolarité (contre-flux à 15 ml/min). Les GR lysés en sortie de colonne sont divisés en deux volumes égaux. Sur l'un des volumes de globules rouges dialysés, la solution de Zometa� (0,8 mg/ml d'acide zoledronique) est ajoutée de manière progressive (en dix fois) jusqu'à atteindre une concentration finale de 0,4 mg/ml. Comme contrôle, l'autre volume de globules rouges dialysés est dilué avec un volume de PBS ajouté de manière progressive. Les deux suspensions sont incubées pendant 30 minutes à 4-8°C. Les globules rouges sont rescellés grâce à l'ajout d'une solution de forte osmolarité (0,1 volume) et une incubation de 30 minutes à 37°C. Les cellules rescellées sont lavées trois fois en PBS glucosé. Les suspensions sont amenées à hématocrite 50% avec soit du SAG-mannitol supplémenté ou non en BSA (6%) ou du PBS glucosé ou encore conservées directement à fort hématocrite (80%) pour constituer les produits finis GR-Zol (zolédronate) et GR-LR (contrôle lysé-rescellé sans zolédronate). II - Exemple 2 : traitement chimique par le Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) sur les qlobules rouges renfermant le zolédronate La suspension de globules rouges renfermant le zolédronate est obtenue comme décrit dans l'exemple 1. Cette suspension est lavée plusieurs fois avant d'être diluée à 1,7 106 cellules/pl puis mise en contact avec une solution de BS3 2 mM contenant du tampon phosphate pH 7, 4 50 mM et du glucose 0,09% pour obtenir une concentration finale en BS3 1 mM. Les globules rouges sont incubés 30 minutes à température ambiante, puis la réaction est stoppée par l'addition d'un volume de Tris 20 mM, NaCl 140 mM. Après une centrifugation de 5 minutes, les globules rouges sont lavés une fois avec du PBS glucosé, puis une fois avec du Sag-Mannitol supplémenté ou non en BSA (6%). Les globules rouges sont amenés à hématocrite 50% dans SAG-mannitol supplémenté ou non en BSA (6%) ou du PBS glucosé ou encore conservés directement à fort hématocrite (80%). III û Résultats pour les exemples 1 et 2 : a) Encapsulations en GR humains Les tableaux suivants dressent le bilan de 4 expériences d'encapsulation de Zométa� réalisées avec des globules rouges humains (poche de concentré de GR). Les données cellulaires (tableau 1) obtenues sur l'analyse des produits finis GRZol à J1 démontrent que les GR chargés conservent des caractéristiques cellulaires proches des GR de poche et ne subissent pas de dommages particuliers. Tableau 1 : Données cellulaires relatives aux globules rouges humains (à J1) Expérience Traitement Milieu de VGM Hémoglobine CCMH Rendement conservation (pm3) Extracellulaire (g/dl) Cellulaire (g/dl) 1 - PBS 87 0,81 25,5 - glucosé 2 - SAG- 83 1,49 26,9 76,50 (Yo Mannitol 3 - PBS 80 0,69 28,8 78,00 (Yo glucosé 4 BS3 1 mM SAG- 84 1,17 28,1 58,00 Mannitol Les concentrations corpusculaires en hémoglobines (CCMH) restent satisfaisantes avec des valeurs supérieures à 25 g/dl. Ceci témoigne d'une faible perte du contenu intra-25 érythrocytaire pendant le procédé. L'hémoglobine extracellulaire est inférieure à 2 g/dl, les produits finis obtenus sont donc de qualité injectable. Le rendement pour le groupe BS3 1 mM engendre une perte cellulaire de 17%. Cependant les rendements cellulaires globaux des produits finis sont tous compatibles avec une production industrielle (> 55%). Le processus de dialyse conduit à une diminution du volume globulaire moyen (VGM) des globules rouges GR-Zol (80-88 pm3) par rapport aux globules rouges de la poche (97pm3). Les données relatives à l'encapsulation du zolédronate sont rassemblées dans le tableau 2. Tableau 2 Données relatives à l'encapsulation du zolédronate (à J1) Exp Hématocrite Milieu de Zolédronate Zolédronate Zolédronate Rendement de conservation dosé intracellulaire extracellulaire d'incorporation Conservation (pg/ml) (%) (%) (%) 4°C 1 50 % PBS 54,3 68 32 23 glucosé 2 50 % SAG- 66,2 83 17 33,6 Mannitol 3 80 % PBS 69,5 83 17 35,5 glucosé 4 50 % SAG- 56,1 71 29 24,5 Mannitol Le zolédronate a une taille critique pour l'encapsulation dans les GR et le critère le plus important à observer est la quantité du composé encapsulée dans les GR à J1 comparativement à la proportion extracellulaire. Trois expériences ont été réalisées sans traitement particulier des membranes erythrocytaires et les résultats montrent une encapsulation satisfaisante du zolédronate à J1 (de 68% à 83% du zolédronate dans le produit fini est encapsulé dans les GR). Avec le traitement BS3, l'encapsulation est de 71%. Le tableau 3 présente des données relatives à la stabilité des globules rouges humains renfermant le zolédronate. Le jour de la production (JO) et le lendemain (J1), l'hémoglobine extracellulaire, l'hématocrite des suspensions et les quantités de zolédronate intra- et extra-cellulaire sont mesurés. Expé- Milieu Zol Extra- Zol Hb Hb Hématocrite Rendement rience cellulaire Extra- Extra- Extra- JO(%) d'hématocrite JO (%) cellulaire cellulaire cellulaire J1(%) (%) J1 (%) JO J1 (g/dl) (g/dl) 1 PBS 13 32 0,30 0,81 49,4 47,8 96,76 (Yo Glucosé 2 SAG- 13 17 0,45 1,49 50,0 48,4 96,80 (Yo Mannitol 4 SAG- 16 29 0,26 1,17 51,1 49,5 96,87 % Mannitol Une augmentation du zolédronate extracellulaire entre JO et J1 est observée. Ceci peut être corrélé à l'hémoglobine extracellulaire qui augmente entre JO et J1, ainsi qu'à la perte cellulaire (rendement d'hématocrite). Le relargage de zolédronate dans le milieu extracellulaire provient donc essentiellement de l'éclatement de globules rouges qui auraient mal rescellé après la dialyse et non d'une fuite passive ou active à travers la membrane erythrocytaire. Les résultats montrent une bonne conservation dans les différentes conditions. b) Encapsulations en GR murins Le tableau suivant dresse le bilan de 3 expériences d'encapsulation de Zométa� réalisées avec des globules rouges murins (sang total). Tout comme pour les GR humains, les GR-Zol conservent des caractéristiques cellulaires proches du sang total. Tableau 4 Données cellulaires relatives aux globules rouges murins (à J1) Expérience Traitement VGM (pm3) Hémoglobine Fragilité CCMH (g/dl) Extracellulaire osmotique (g/dl) (g/I) 5 BS31mM 43 1,99 1,67 32,2 6 - 46 3,38 1,47 26,7 7 BS31mM 43 2 - 31,5 Les concentrations corpusculaires en hémoglobines (CCMH) sont très satisfaisantes. L'hémoglobine extracellulaire est plus élevée que dans le cas des GR humains, les globules de souris étant plus fragiles. Le processus de dialyse conduit à un volume globulaire moyen des globules rouges GR-Zol (43-46 pm3) homogène d'une expérience à l'autre. Le tableau 5 présente des données relatives à l'encapsulation du zolédronate dans des GR murins (mesure à J1). La suspension finale est une suspension concentrée à hématocrite 80%. Tableau 5 Données relatives à l'encapsulation du zolédronate (GR murins) (J1) Expérience Traitement Zolédronate Zolédronate Zolédronate Rendement dosé (pg/ml) intracellulaire extracellulaire d'incorporation (%) (%) (0 %) 11 BS3 1 mM 55,7 92 8 28 12 - 79,8 70 30 30 13 BS3 1 mM 55,1 78 22 24 Les résultats montrent une encapsulation satisfaisante à Ji. V û Exemple 3 : Validation du criblage de la moelle osseuse par le traitement au BS3 : Le fluorochrome FITC-Dextran (70 kDa) a été encapsulé dans des globules rouges 10 murins (souris OF1) par la méthode de dialyse hypotonique en colonne. Le sang est préalablement centrifugé, puis lavé trois fois en PBS. L'hématocrite est amené à 70% en présence de FITC-Dextran, ajouté à une concentration finale de 8 mg/ml, avant de démarrer la dialyse. Les GR sont dialysés à un débit de 2 ml/min contre un tampon de lyse à faible osmolarité (contre-flux à 15 ml/min). Les GR lysés en sortie de colonne sont 15 rescellés grâce à l'ajout d'une solution de forte osmolarité et une incubation de 30 minutes à 37°C. Après deux lavages en PBS glucosé, les GR sont dilués à 1,7 106 cellules/pl avant d'être mis en contact avec une solution de BS3 10 mM contenant du tampon phosphate pH 7,4 50 mM et du glucose 0,09%. Les GR sont incubés 30 minutes à température ambiante, puis la réaction est stoppée par l'addition d'un volume de Tris 20 20 mM, NaCl 140 mM. Après une centrifugation de 5 minutes, les GR sont lavés une fois avec du PBS glucosé, puis une fois avec du Sag-Mannitol supplémenté en BSA (6%). Les globules rouges sont amenés à hématocrite 50% pour constituer le produit fini qui est injecté à J1 chez la souris. La souris est sacrifiée 1h30 après injection, puis la moelle osseuse isolée à partir des fémurs est placée dans du Tissue-Tek pour une congélation à 25 l'azote. Des coupes cryostat de 10pm sont réalisées pour une analyse immunohistochimique. Après fixation dans l'acétone, un double marquage est réalisé mettant en évidence le FITC (DAB marron) et les macrophages F4/80 (new fuschin, rouge). 135 L'observation des coupes au microscope montre une co-localisation des macrophages et du dextran. L'observation confirme l'incorporation du dextran par les macrophages par phagocytose des globules rouges. L'analyse en cytométrie en flux (FC500 Beckman Coulter) donne les informations 5 suivantes. Tableau 6 : pourcentage de cellules fluorescentes dans la moelle osseuse 1 h30 après l'injection des GR par intraveineuse dans les souris. Traitements Nombre de cellules fluorescentes totales GR-Dextran 5,3% GR-Dextran-BS3 7,4% 10 L'analyse par cytométrie en flux montre que 1 h30 après injection, environ 7 et 5 0/0 des cellules de la moelle osseuse sont fluorescentes dans le cas du traitement BS3 et du non traité. Le tableau 7 montre le pourcentage de cellules phagocytaires qui ont phagocyté des globules rouges traités ou non traités. 15 Traitements Macrophages F4/80 Cellules dendritiques GR-Dextran 5,2% 7,9% GR-Dextran-BS3 9,5% 16,3% Le traitement BS3 induit une captation par phagocytose plus rapide et plus importante des GR dans la moelle osseuse qu'en absence de traitement. 20 Conclusions ^ Le Zolédronate peut être encapsulé dans les GR de manière stable, membrane traitée ou non au BS3. 25 ^ Les quantités encapsulées sont largement compatibles avec les quantités utilisées en clinique. Les expériences d'encapsulation (avec le traitement BS3 1 mM) ont montré que l'on obtenait des produits finis contenant 56,1 pg/ml de zolédronate. Il faudrait donc perfuser environ 71 ml de GR-Zol à l'homme pour avoir l'équivalent de 4 mg. 30 ^ Le traitement au BS3 1 mM permet de cibler les cellules de la moelle osseuse Tout ceci valide l'utilisation des GR comme véhicule de zolédronate pour cibler la moelle osseuse et dans le cadre de métastases osseuses ou autre maladies de l'os.5 Revendications 1. Suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme médicament pour la prévention et le traitement des métastases osseuses. 2. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 1, dans laquelle les érythrocytes encapsulant le bisphosphonate ont subi un traitement chimique avec un agent de manière à favoriser le ciblage de la moelle osseuse. 3. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 2, dans laquelle le traitement chimique est réalisé à l'aide d'une solution de Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3). 4. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 3, dans laquelle la suspension d'érythrocytes encapsulant le bisphosphonate est mise en contact avec le BS3 pendant une durée comprise entre 10 min et 1 heure, notamment entre 15 min et 45 min, de préférence entre 20 et 40 min, typiquement de l'ordre de 30 min. 5. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle l'incubation avec le BS3 est à température ambiante. 6. Suspension d'érythrocytes selon l'une des revendications 3 à 5, dans laquelle, avant incubation avec le BS3, la suspension d'érythrocytes renfermant le bisphosphonate est lavée à l'aide d'un tampon approprié, de préférence du PBS. 7. Suspension d'érythrocytes selon l'une des revendications 3 à 6, dans laquelle la suspension d'érythrocytes encapsulant le bisphosphonate est amenée à une concentration comprise 0,5 106 et 5 106 cellules/pl, de préférence entre 1 106 et 3 106 cellules/pl, avant d'être mise en contact avec la solution de BS3. 8. Suspension d'érythrocytes selon l'une des revendications 3 à 7, dans laquelle on emploie une solution de BS3 pour obtenir une concentration finale en BS3 comprise entre 0,1 et 6 mM, de préférence entre 0,5 et 3 mM, mieux encore d'environ 1 mM dans la suspension. 9. Suspension d'érythrocytes selon l'une des revendications 3 à 8, dans laquelle on emploie une solution tamponnée de BS3 ayant une osmolarité comprise entre 280 et 320 mOsm et un pH compris entre 7,2 et 7,6, de préférence de 7,4. 10. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 9, dans laquelle, la solution de BS3 comprend du glucose et du tampon phosphate. 11. Suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate dans laquelle ces érythrocytes ont subi un traitement chimique avec un agent de manière à favoriser le ciblage de la moelle osseuse 12. Suspension d'érythrocytes encapsulant un bisphosphonate pour utilisation comme véhicule permettant d'apporter un bisphosphonate dans la moelle osseuse, notamment pour le traitement ou la prévention des métastases osseuses. 13. Suspension d'érythrocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle le bisphosphonate est de deuxième ou troisième génération. 14. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 13, dans laquelle le bisphosphonate est choisi parmi : pamidronate, notamment disodique, alendronate, incadronate, ibandronate, neridronate, risedronate et zolédronate. 15. Suspension d'érythrocytes selon la revendication 13, dans laquelle le 10 bisphosphonate est le zolédronate.