Brevet FR2928004A3 — publié le 20090828

FR 2928004 A3 20090828 FR 0951268 A 20090227 La présente invention concerne un kit d'analyse pour le prélèvement et la préparation d'un échantillon biologique avec des cellules, pour la détermination de la concentration intracellulaire d'au moins un micronutriment, ainsi que son utilisation. Dans tous les pays industrialisés, le choix des denrées alimentaires est varié et suffisant. Malgré un approvisionnement suffisant en aliments, il peut arriver dans certains cas des phénomènes de carences en certains nutriments et micronutriments. Il est important de ne pas envisager un changement d'alimentation seulement après l'apparition de certains signes pathologiques mais de veiller déjà prophyllactiquement à ce qu'il n'apparaisse pas d'états pathologiques induits par des carences dans l'alimentation. Une alimentation de grande qualité, riche en composants nutritionnels essentiels, est dans tous les épisodes de la vie une source importante de santé, de beauté et de bien-être. De nombreuses études scientifiques de ces dernières années renvoient à l'importance pour la conservation de la santé d'un apport optimal de micronutriments, comme par exemple de substances végétales secondaires, d'acides gras mono- et polyinsaturés, ainsi que de vitamines. Malgré la prospérité dans les pays industrialisés, la situation particulière chez l'individu peut donner une image de sous-alimentation en micronutriments. Les facteurs de risque pour une alimentation carencielle sont : une faible prise de nourriture, volontaire ou involontaire, des pertes de nutriments par stockage et préparation, des habitudes d'une alimentation peu variée, une forte consommation de stimulants (alcool, nicotine) et des affections du tractus gastro-intestinal ou des maladies entraînant des besoins accrus en nutriments, ainsi que des médicaments qui restreignent l'approvisionnement en vitamines. Dans des études qui ont vérifié l'approvisionnement en vitamines de personnes en surpoids, on a constaté qu'un apport élevé en calories n'impliquait pas automatiquement un apport suffisant en micronutriments. Les raisons pour une tendance à la sous-alimentation malgré une offre riche en denrées alimentaires et une grande quantité des denrées peuvent être entre autres • un ensemble de facteurs de style de vie désavantageux (styles fast-living, fast-food ou lazylife), • des habitudes alimentaires unilatérales par la constante disponibilité des aliments préférés, • un manque de connaissances de la composition d'une alimentation saine, • une persuasion pseudo-rationnelle de l'effet de différents aliments. Des modifications du comportement alimentaire dans le but d'une optimisation de la composition de l'alimentation en cas de soupçon de déficits en micronutriments sont toujours un processus d'entraînement de longue haleine. Dans certaines phases de la vie, dans lesquelles, pour des raisons diverses, une alimentation optimale n'est que difficilement réalisable, des compléments diététiques peuvent constituer un soutien judicieux. Pour l'appréciation de l'état en vitamines, on effectue habituellement des examens de sang. Les valeurs obtenues donnent, certes, des indications sur l'apport général du corps en vitamines, mais expriment mal dans quelle mesure les cellules ou les tissus sont approvisionnés en micronutriments. Cela varie d'un individu à l'autre et dépend de l'état physique général. Pour pouvoir appréhender la situation individuelle d'approvisionnement de chacun, il faut analyser l'état d'alimentation. Outre l'examen clinique, le médecin dispose de questionnaires qui saisissent l'apport en nutriments, de scores et de valeurs de laboratoire. Des méthodes plus modernes sont l'analyse de l'impédance bioélectrique et l'analyse des vitamines dans le sang. Le taux de vitamines dans les tissus et dans le sang est longtemps maintenu stable par une redistribution par le corps lui-même. Pour cette raison, des carences ne se font sentir qu'à un stade tardif. Un procédé pour la détermination du profil d'approvisionnement en au moins un micronutriment dans un échantillon biologique est décrit dans le document W02003/069338 de la demanderesse. De l'échantillon biologique, en particulier après la détermination du nombre et/ou de la quantité des cellules qui y sont contenues, des protéines de la cellule, en particulier des protéines de la membrane cellulaire, sont libérées par lyse des cellules, le cas échéant après leur isolation, et ainsi, le cas échéant après dénaturation, les micronutriments sont obtenus à partir du lysat et leur proportion dans l'échantillon, en particulier leur poids, est mesuré comme critère pour leur concentration intracellulaire. Un procédé similaire est décrit dans le document W02006/066804 de la demanderesse. Il s'agit d'un procédé de préparation d'un échantillon pour une détermination ultérieure, qualitative ou quantitative, d'un ou de plusieurs composants intracellulaires d'un échantillon biologique. L'échantillon biologique est obtenu par une méthode non-invasive à partir d'une surface organique, il est enrichi si nécessaire, transmis le cas échéant à un laboratoire, il est lysé et réduit chimiquement par au moins un agent de réduction, et l'identification et/ou la détermination de la concentration des analytes est effectuée depuis l'échantillon, en particulier depuis des cellules épithéliales d'une muqueuse, dans un essai immunologique compétitif, le cas échéant moyennant l'utilisation d'une technologie de chimioluminescence directe. Dans des études, on a démontré que les tissus de la muqueuse buccale étaient appropriés pour refléter les programmes de supplémentation et illustrer les effets d'une thérapie. L'objectif de la présente invention est par suite de mettre à disposition un kit pour le prélèvement et la préparation d'échantillons pour une analyse du profil en micronutriments. L'objectif de l'invention est atteint de façon autonome par un kit d'analyse pour le prélèvement et la préparation d'un échantillon biologique avec des cellules, pour la détermination de la concentration intracellulaire d'au moins un micronutriment, contenant un dispositif de prise d'échantillon, choisi parmi un groupe comprenant une spatule, une brosse, un bâtonnet, un capillaire, au moins un récipient à échantillon avec au moins un réactif, choisi parmi un groupe comprenant l'eau, une solution saline tamponnée, une solution de phosphate, une solution de NaCl à 0,9 %, et le cas échéant un thermoconteneur pour loger le récipient à échantillon, en particulier pour refroidir le récipient à échantillon avec les cellules. Selon la présente invention, le kit d'analyse comprend du chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine comme solution de stabilisation. Avec le procédé non invasif selon l'invention, les profils de micronutriments dans la cellule, le lieu de l'action, sont déterminés directement. La muqueuse buccale est prédisposée comme tissu idéal pour l'obtention de cellules parce qu'elle présente un taux de renouvellement élevé. La muqueuse de la joue est renouvelée régulièrement tous les sept jours environ. L'analyse de micronutriments dans la muqueuse de la joue offre pour cette raison l'avantage qu'elle reflète l'état d'approvisionnement concret, actuel et individuel du passé. Lors de l'utilisation du kit selon l'invention à la détermination de l'approvisionnement en micronutriments, le terme de passé désigne concrètement un espace de temps d'une semaine environ. C'est la durée dont les cellules ont besoin pour migrer des cellules basales qui sont encore alimentées par le sang jusqu'à la couche supérieure de la muqueuse. Ensuite, les cellules sont prélevées par un simple brossage avec une brosse à dents spéciale, respectivement par grattage avec une spatule. Comme la méthode s'effectue de manière non-invasive, on ne connaît pas de risques. L'avantage est que des fluctuations à court terme dans l'apport des vitamines ou des micronutriments juste avant la prise d'échantillon ne se répercutent pas défavorablement sur la précision de la mesure. En même temps, un renouvellement à cadence de 7 jours est suffisamment rapide pour délivrer un état à jour. Après le nettoyage des cellules ou juste après le prélèvement des cellules par un dispositif de prélèvement, comme par exemple une brosse à dents, celles-ci sont protégées d'une décomposition inspécifique au moyen de la solution de stabilisant. Le chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine convient à la stabilisation des cellules. À cause de la multitude de possibilités d'influencement, respectivement des possibilités de régulation physiologiques à la base, des besoins accrus en vitamines et en micronutriments peuvent être facilement déterminés au niveau de la cellule. Dans le sang, la teneur en de nombreuses vitamines et en de nombreux micronutriments est régulée avec le but d'assurer le plus longtemps possible des valeurs stables et constantes. Dans les cellules, les vitamines et les micronutriments sont consommés de façon variable selon les conditions extérieures. Une consommation accrue ou une pénurie locale ou partielle peuvent être détectées par le kit selon l'invention. En outre, différentes bases génétiques se répercutent ici directement sur l'absorption cellulaire des micronutriments depuis le sang (= dimension de disponibilité). Différentes dépendances du temps et de la dose dans l'approvisionnement cellulaire peuvent être détectées. On peut établir un profil d'approvisionnement sur un espace de temps, par exemple en cas de différentes maladies passées ou en cas de styles de vie particuliers. On peut également établir un état d'alimentation momentané. Le kit d'analyse peut comprendre une pipette pour prélever des aliquotes de l'échantillon et, le cas échéant, les mettre à disposition pour des analyses futures et/ou différentes. Le kit d'analyse peut aussi contenir des étiquettes et une notice d'utilisation pour permettre d'identifier les échantillons de manière sûre. La concentration de la solution de stabilisation est choisie dans un intervalle avec une limite inférieure de 1 mM, de préférence de 2 mM, de façon particulièrement préférée de 3 mM, et une limite supérieure de 10 mM, de préférence de 8 mM, de façon particulièrement préférée de 7 mM, pour empêcher à coup sûr la décomposition des analytes. Le réactif de stabilisation chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine est dissout dans une solution de dihydrogénophosphate de potassium et est stocké entre - 80 °C et la température ambiante, sachant qu'il est très avantageux de le stocker entre -20 °C et +4 °C, pour en améliorer la conservation globale. La concentration de la solution de dihydrogénophosphate de potassium est choisie dans un intervalle avec une limite inférieure de 0,1 M, de préférence de 0,2 M, de façon particulièrement préférée de 0,5 M, et une limite supérieure de 1 M, de préférence de 0,8 M, de façon particulièrement préférée de 0,7 M Dans un perfectionnement, il est prévu qu'un récipient supplémentaire à échantillon soit contenu, avec un tampon de lavage choisi parmi un groupe comprenant l'eau, une solution tamponnée de sel, une solution de NaCl à 0,9 %, pour prélever des cellules de la muqueuse jugale, respectivement pour laver les cellules. Un récipient à échantillon supplémentaire sert à la réception de l'échantillon biologique après son prélèvement. Il est avantageux que tous les composants qui sont nécessaires à la préparation de l'échantillon, en particulier des cellules, soient déjà contenues dans le kit d'analyse et que l'échantillon biologique puisse ainsi être préparé pour la détermination du profil de micronutriments avec une dépense de travail minimale. Pour l'expédition des échantillons sous réfrigération dans le récipient à échantillon, un thermoconteneur peut être inclus dans le kit. Ce thermoconteneur peut être une boîte isolante ou similaire, dans laquelle on peut transporter par exemple de la glace ou de la carboglace. Le kit d'analyse peut être utilisé comme produit médical et/ou comme poste d'analyse in vitro, car il permet de déterminer le profil d'approvisionnement en micronutriments chez les sujets examinés. Le kit peut également être utilisé à la détermination d'au moins un micronutriment, en particulier d'un micronutriment à potentiel antioxydant. Le kit peut être utilisé aussi à la détermination d'un profil de micronutriments, comprenant des micronutriments à effet antioxydant et, le cas échéant, d'autres micronutriments. Le kit d'analyse convient également à la détermination des micronutriments, qui englobent la vitamine C, la vitamine E, le 5-carotène et le lycopène. La concentration en vitamines à effet antioxydant dans les cellules donne une vue satisfaisante de l'état d'alimentation et est moins affectée par des fluctuations à court terme que la détermination des vitamines dans le sang. Les paramètres de mesure choisis représentent l'ensemble de la palette d'action des vitamines à effet antioxydant et des micronutriments. Ainsi, la vitamine C est un marqueur pour les vitamines hydrosolubles, la vitamine E pour les liposolubles, le 5-carotène en général pour la consommation de fruits et de légumes et le lycopène pour la proportion de composants végétaux secondaires dans l'alimentation. Le kit d'analyse convient aussi à la détermination d'un autre profil de micronutriments comprenant la coenzyme Q10, le glutathion, la vitamine D, le magnésium, le zinc, le sélénium, les acides gras oméga 3 / oméga 6, l'acide folique, l'homocystéine. Des déficits constatés peuvent être influencés favorablement dans le cadre d'une thérapie alimentaire ciblée ou par des mélanges de micronutriments. Toutes les données concernant les intervalles de valeurs dans les descriptions objectives doivent être comprises de telle sorte que ceux-ci comprennent en même temps des domaines quelconques et tous les domaines partiels, par exemple la donnée de 1 à 10 doit être comprise de telle sorte que tous les intervalles partiels, partant de la limite inférieure 1 et de la limite supérieure 10 sont compris, c'est-à-dire que tous les intervalles partiels commencent à une limite inférieure de 1 ou plus et finissent à une limite supérieure de 10 ou moins, par exemple 1 à 1,7 ou 3,2 à 8,1 ou 5,5 à 10. Prélèvement des échantillons La bouche et les espaces interdentaires sont rincés plusieurs fois énergiquement à l'eau du robinet pour éliminer de la cavité buccale les restes de nourriture. La brosse à dents ou la spatule, le bâtonnet ou le capillaire du kit d'analyse sont humectés à l'eau et une face intérieure de la joue est brossée plusieurs fois (environ 25 fois) à pression moyenne de haut en bas. Quelques cellules se détachent et sont recueillies à l'aide de la brosse. De préférence, on brosse directement l'une après l'autre les joues des deux côtés et la brosse à dent n'a pas besoin d'être rincée entre-temps. Le cas échéant, le processus de brossage, respectivement le grattage de la muqueuse de la joue peut être répété. Une fois la brosse à dent est venue en contact avec le stabilisateur, elle doit être jetée et ne doit plus arriver en contact avec les muqueuses, car le réactif stabilisateur a sur les muqueuses un effet irritant. Les cellules de la brosse à dents sont amenées en contact direct avec l'agent stabilisateur. De préférence, la solution de stabilisateur est préparée dans un récipient à échantillon de 50 ml dans le kit d'analyse dans lequel les cellules sont lavées. Pour limiter le volume et pour enrichir les cellules, le réactif stabilisateur avec les cellules peut être centrifugé. Selon une variante d'utilisation du kit de l'invention, la brosse à dents est rincée avec les cellules prélevées dans la solution de rinçage du kit d'analyse, laquelle est de l'eau, une solution de sel tamponnée, une solution de NaCl à 0,9 % et être dégagée par la solution de rinçage au bord du récipient à échantillon. Ensuite, on brosse plusieurs fois la face intérieure de l'autre joue pour prélever des cellules de la muqueuse buccale et on rince également la brosse soigneusement dans la solution de rinçage. En outre, la cavité buccale peut être rincée avec un peu de solution de rinçage, moyennant quoi les différentes cellules à la face intérieure de la joue sont mieux détachées et sont transférées dans le liquide. Le liquide est craché dans le récipient à échantillon prévu pour cela. Par la turbidité de la solution de rinçage, on peut constater d'avance que de la matière cellulaire a été prélevée. Le cas échéant, le processus de brossage, respectivement le raclage de la muqueuse de la joue peut être répété. La solution de rinçage avec les cellules est transférée dans un autre récipient à échantillon et est centrifugée au moins une minute entre 300 g et 1500 g, de préférence à 500 g. Le liquide surnageant est jeté et il se forme un sédiment de cellules bien visible. L'étape de centrifugation peut être répétée le cas échéant, au moins une fois. Ensuite, le sédiment de cellules est lavé, de préférence avec un tampon de lavage comme de l'eau, une solution de sel tamponnée, une solution de NaCl à 0,9 %, les cellules étant mises en suspension. L'étape de centrifugation est répétée et le liquide surnageant est décanté, respectivement éliminé le plus complètement possible, comme par exemple en laissant goutter la solution ou en l'aspirant avec une pipette. Ensuite, le pellet de cellules est remis en suspension dans la solution de stabilisateur, laquelle est contenue de préférence dans une cuve de réaction de 1,7 ml. La solution de stabilisateur contient du chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)- phosphine à raison de 10 mM dans une solution 0,1 M de dihydrogénophosphate de potassium. En variante, la solution de stabilisateur contient du chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine à raison de 3 mM dans une solution 0,5 M de dihydrogénophosphate de potassium. Selon une autre variante d'utilisation du kit de l'invention, les cellules sont suspendues dans une solution de stabilisation contenant 1 mM de chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine dans une solution 1 M de dihydrogénophosphate de potassium. Les cellules sont brassées dans la solution de stabilisateur et la suspension de cellules est renvoyée complètement dans la cuve de réaction et est dotée des étiquettes du kit. Après le prélèvement de l'échantillon, l'échantillon biologique est stocké de préférence entre -18 °C et - 22 °C. La cuve de réaction avec la suspension de cellules et d'autres étiquettes sont expédiées au laboratoire d'analyse dans un sachet d'expédition, de préférence sur de la carboglace. Dans le laboratoire d'analyse, la cuve de réaction avec les cellules peut être stockée plusieurs mois entre -18 et -80 °C. Le cas échéant, un détergent est contenu, destiné à la lyse des cellules, pour libérer les micronutriments intracellulaires et les rendre accessibles à une analyse. La désagrégation des cellules peut s'effectuer par des méthodes chimiques (eau, lessive, tampon de lyse avec NP- 40, SDS, Triton X-100, sels de guanidinium) et/ou mécaniques (ultrasons, -80 °C), moyennant quoi l'accessibilité des analytes est rendue possible ou est facilitée, et des modifications des analytes, susceptibles d'influencer l'analyse, peuvent néanmoins être minimisées. De préférence, cette étape du procédé ne s'effectue qu'après l'expédition dans le laboratoire d'analyse. Dans le laboratoire d'analyse, les vitamines sont extraites de l'intérieur des cellules et déterminées à l'aide d'un procédé par chromatographie en phase liquide à hautes performances (HPLC). Ce faisant, selon une variante d'utilisation du kit de l'invention, le réseau antioxydant est reproduit, avec les vitamines C et E, le 5-carotène et le lycopène. Le kit d'analyse selon l'invention convient particulièrement bien à la préparation d'échantillons biologiques qui contiennent des micronutriments à effet antioxydant. Naturellement, le kit d'analyse peut être aussi utilisé à la préparation d'échantillons biologiques dans lesquels s'effectue la détermination d'autres micronutriments. Une autre utilisation préférée du kit d'analyse selon l'invention est constituée par la combinaison de la détermination de micronutriments à potentiel antioxydant, comme par exemple la vitamine C, la vitamines E, etc. avec divers autres micronutriments, comme par exemple des sels minéraux et des oligo-éléments comme le magnésium, le sélénium, le zinc ou les acides gras oméga 3/6, la coenzyme Q10, le glutathion, l'homocystéine etc. Pour tenir compte des différents rendements en cellules, les teneurs déterminées en vitamines, respectivement en micronutriments, sont rapportées au contenu en ADN, respectivement au nombre des cellules. Les exemples de réalisation montrent des modes et variantes possibles de réalisation du kit d'analyse. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ces modes et variantes de réalisation spécialement exposées, mais au contraire, diverses combinaisons des différentes variantes et modes de réalisation les unes avec les autres sont aussi possibles et peuvent être réalisées sur la base de l'enseignement de la présente invention et en présence du savoir-faire de l'homme du métier travaillant dans ce domaine technique. Par conséquence, la présente invention concerne également toute combinaison de certains détails de l'invention représentés et décrits dans le présent texte. L'objectif qui est à la base des différentes solutions proposées par la présente invention se comprend à la lumière de la présente description. REVENDICATIONS 1. Kit d'analyse pour le prélèvement et la préparation d'un échantillon biologique avec des cellules pour la détermination de la concentration intracellulaire d'au moins un micronutriment, contenant un dispositif de prise d'échantillon, choisi parmi un groupe comprenant une spatule, une brosse, un bâtonnet, un capillaire, le cas échéant au moins un récipient à échantillon avec au moins un réactif, choisi parmi un groupe comprenant de l'eau, une solution de sel tamponnée, une solution de phosphate, une solution à 0,9 % de NaCl et, le cas échéant, un thermoconteneur pour la réception du récipient à échantillon, en particulier pour refroidir le récipient à échantillon avec les cellules, caractérisé en ce que du chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)- phosphine est contenu comme réactif de stabilisation. 2. Kit d'analyse selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration du réactif de stabilisation est choisie dans un intervalle avec une limite inférieure de 1 mM, de préférence de 2 mM, de façon particulièrement préférée de 3 mM, et une limite supérieure de 10 mM, de préférence de 8 mM, de façon particulièrement préférée de 7 mM. 3. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le chlorhydrate de tris-(2-carboxy-éthyl)-phosphine est contenu dans une solution de dihydrogénophosphate de potassium. 4. Kit d'analyse selon la revendication 3, caractérisé en ce que la concentration de la solution de dihydrogénophosphate de potassium est choisie dans un intervalle avec une limite inférieure de 0,1 mM, de préférence de 0,2 mM, de façon particulièrement préféréede 0,5 mM, et une limite supérieure de 1 M, de préférence de 0,8 M, de façon particulièrement préférée de 0,7 M. 5. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'un autre récipient à échantillon avec un tampon de lavage choisi parmi un groupe comprenant l'eau, une solution de sel tamponnée, une solution de phosphate, une solution de NaCl à 0,9 %, est contenu. 6. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'un récipient à échantillon supplémentaire pour la réception des échantillons biologiques est contenu. 7. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'une pipette est contenue. 20 8. Kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que des étiquettes et une notice d'utilisation sont contenues. 9. Utilisation du kit d'analyse selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 8 comme produit médical, respectivement comme poste de diagnostic in vitro. 10. Utilisation du kit d'analyse selon l'une 30 quelconque des revendications 1 à 8 à la détermination d'au moins un micronutriment, en particulier d'un micronutriment à potentiel antioxydant. 11. Utilisation du kit d'analyse selon l'une 35 quelconque des revendications 1 à 8 à la détermination d'un profil de micronutriments, comprenant des15micronutriments à effet antioxydant et, le cas échéant, d'autres micronutriments. 12. Utilisation du kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à la détermination du profil de micronutriments comprenant la vitamine C, la vitamine E, le 5-carotène, le lycopène. 13. Utilisation du kit d'analyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 à la détermination d'un autre profil de micronutriments comprenant la coenzyme Q10, le glutathion, la vitamine D, le magnésium, le zinc, le sélénium, les acides gras oméga 3/6, l'acide folique, l'homocystéine.