Brevet FR2930036A1 — publié le 20091016

L'invention concerne le diagnostic et le suivi d'une hypertension artérielle pulmonaire. Etat de la technique : L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une pathologie rare responsable de la survenue d'une décompensation cardiaque droite pouvant aboutir au décès. L'HTAP est définie par la mise en évidence par cathétérisme droit d'une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure ou égale à 25mmHg au repos ou à 30mmHg à l'effort en l'absence d'élévation de la pression capillaire pulmonaire (Rubin, 1997). La survenue d'une HTAP est la conséquence d'une obstruction chronique des petites artères pulmonaires secondaire à la prolifération de cellules endothéliales, de cellules musculaires lisses vasculaires et de fibroblastes (Dorfmuller et al, 2003). En particulier, au cours de l'HTAP sévère, il se forme une couche de myofibroblastes et de matrice extra-cellulaire qui se localise entre l'endothélium et la limitante élastique interne, appelée neo-intima, qui est caractéristique de cette affection. L'HTAP peut survenir dans l'évolution de pathologies à composante auto-immune que sont les connectivites, en particulier la sclérodermie systémique (Hachulla et al, 2005), le syndrome de Sharp et le lupus érythémateux systémique. De plus, au cours de l'HTAP idiopathique, on trouve de temps à autres des stigmates d'auto-immunité, à savoir des anticorps anti-nucléaires ou des anticorps anti-thyroglobuline. La présence d'anticorps anti-cellules endothéliales (Tamby et al, 2005) et d'anticorps antifibroblastes (Tamby et al, 2006) a été rapportée au cours de l'HTAP idiopathique ou associée à la sclérodermie systémique. Cependant la valeur prédictive de ces anticorps dans la survenue de l'HTAP n'a pas été étudiée et le rôle potentiel des phénomènes auto-immuns dans la pathogénie de l'HTAP idiopathique reste incertain (Mouthon et al, 2005). Dans la plupart des cas, l'HTAP est dépistée lorsque le patient présente une dyspnée de stade III ou IV. Lorsque le patient est suivi pour une maladie chronique comme la sclérodermie systémique, l'HTAP est dépistée par une échographie cardiaque annuelle. Cependant, un test simple et fiable de dépistage d'une HTAP fait toujours défaut, et serait précieux pour un diagnostic le plus précoce possible, qui permettrait de mettre en place rapidement des stratégies thérapeutiques pour améliorer l'état du patient et ses chances de survie. Résumé de l'invention : L'invention fournit maintenant un procédé in vitro de détection d'une HTAP, ou d'un risque de développer une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-Ténascine C (TN-C) dans un échantillon biologique provenant d'un patient, la présence d'anticorps anti-TN-C étant indicatrice d'une HTAP ou d'un risque de développer une HTAP. De préférence, la présence d'anticorps anti-Ténascine C dans l'échantillon biologique est comparée à une valeur contrôle, la présence d'anticorps anti-Ténascine C en une quantité supérieure à la valeur contrôle étant indicatrice d'une HTAP ou d'un risque de développer une HTAP. Un autre objet de l'invention est un procédé in vitro de pronostic ou de suivi d'une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-TN-C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, à différents temps, l'augmentation de la quantité d'anticorps anti-TN-C au cours du temps étant indicatif d'une aggravation de l' HTAP. Un autre objet de l'invention est un procédé in vitro d'évaluation de l'efficacité d'un traitement envers une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-TN-C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, à différents temps avant, au cours ou après le traitement, la diminution de la quantité d'anticorps anti-TN-C au cours du temps étant indicatif d'une amélioration de 1HTAP. Description détaillée de l'invention : La TN-C est exprimée à l'intérieur et autour des vaisseaux sanguins dans le poumon foetal (Rettig et al, 1994), mais elle n' est plus exprimée ensuite dans les artères pulmonaires adultes normales (Jones et al, 1996). Par ailleurs, la perte de signalisation via BMPRII, à l'origine d'un défaut de cellules T régulatrices pouvant prédisposer à la survenue d'une HTAP (Nicolls et al, 2005), peut également induire l'expression de la TN-C in vivo et sur des cellules vasculaires en culture (Ihida-Stansbury et al, 2006). Sur cette base, les inventeurs ont émis l'hypothèse que des patients ayant une HTAP pourraient développer une réponse immune dirigée contre la TN-C. Aussi ont-ils décidé de rechercher des anticorps anti-TN-C dans le sérum de patients atteints d'HTAP. Les inventeurs ont ainsi pu mettre en évidence une corrélation entre la survenue d'une HTAP et la production d'anticorps anti-TN-C. Sur cette base, ils proposent un procédé in vitro de diagnostic ou de pronostic d'une HTAP, ou d'un risque de développer une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-TN-C dans un échantillon biologique provenant d'un patient. Les anticorps anti-TN-C détectés sont de préférence des immunoglobulines G (IgG). Définitions La Ténascine C (ou TN-C) est une glycoprotéine de la matrice extracellulaire. Elle est également connue sous le nom de hexabrachion ou cytotactine. Une séquence de la TN-C humaine est rapportée en annexe (SEQ ID n°l). Le terme "échantillon biologique" se réfère à tout échantillon biologique provenant d'un patient. Des exemples d'échantillons incluent des liquides biologiques, des biopsies tissulaires. De manière préférentielle, l'échantillon peut être du sang, du sérum, de la salive, de l'urine, du sperme. De manière davantage préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou de sérum. Le terme "patient" se réfère à tout sujet susceptible d'être testé. De préférence il s'agit d'un humain, mais le terme inclut tout autre mammifère, tel que des chiens, chats, rongeurs, bétail, chevaux, singes etc. Le patient peut être testé quel que soit son sexe ou son âge. Le patient peut être un sujet à risque, être asymptomatique ou présenter des signes précoces ou avancés d'une HTAP. Par exemple le patient peut être un sujet prédisposé à développer une HTAP, en particulier un sujet portant une ou plusieurs mutations dans le gène codant pour BMPRII. Le terme "diagnostic" signifie l'identification de la pathologie ou l'évaluation de l'état de sévérité de la pathologie. Le terme �pronostic� signifie l'évaluation du risque d'aggravation, et de ses conséquences. Le terme � valeur contrôle � se réfère à une valeur basale correspondant à la moyenne des valeurs obtenues avec l'échantillon biologique de sujets sains, non affectés par une HTAP ou une maladie susceptible d'entraîner une HTAP. Il peut s'agir d'une valeur statistique de référence. Pour évaluer l'évolution de la pathologie, il peut être utile de tester un patient et de contrôler l'effet d'un traitement ou l'évolution de la pathologie, en testant de nouveau le patient, par exemple à plusieurs mois d'intervalle. Dans ce cas, les résultats du second test sont comparés aux résultats du premier test, ainsi que souvent à la valeur dite � contrôle �. Une quantité d'anticorps anti-TN-C � supérieure à la valeur contrôle � signifie généralement une augmentation statistiquement significative, par exemple d'au moins deux déviations standards au dessus de la moyenne des densités optiques des réactivités IgG de l'ensemble des sujets sains. Par "antigène de capture", on entend un antigène, de préférence fixé sur une phase solide, 10 qui est capable de retenir l'anticorps anti-TN-C présent dans un échantillon biologique, par liaison affine. L'antigène de capture peut être marqué. Le terme "marqué" se réfère aussi bien à un marquage direct (par le biais d'enzymes, radioisotopes, fluorochromes, composés luminescents, etc...) qu'à un marquage indirect (par exemple, par le biais d'anticorps eux-mêmes marqués de manière directe ou à l'aide de 15 réactifs d'une "paire d'affinité " marquée, telle que, mais non exclusivement, la paire avidine marquée-biotine, etc..). Dosage des anticorps : L'échantillon biologique est de préférence un échantillon de sérum, dilué au 1/100ème, ou 20 plus, par exemple au 1/200ème ou 1/400ème De manière avantageuse, la quantité d'anticorps anti-TN-C peut être déterminée par un immunoessai. 25 L'échantillon biologique peut être éventuellement traité dans une étape préalable, ou mis directement en présence d'au moins un antigène de capture. Le procédé selon l'invention peut être réalisé selon divers formats bien connus de l'homme du métier: en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en 30 méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'antigène de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, telles que celles commercialisées par la société Nunc, Danemark. On peut également utiliser des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques, telles que celles fournies par Dynal ou Merck-Eurolab (France) (sous la marque EstaporTM), ou encore des tubes à essai en polystyrène ou polypropylène, etc. Un format d'immunoessai de détection des anticorps par compétition est également possible. D'autres modalités d'immunoessai sont encore envisageables et bien connues de l'homme du métier. Dosages ELISA, radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend la mise en 15 contact d'un échantillon biologique avec une protéine comprenant le fragment d'acides aminés 181 à 290 de la séquence TN-C humaine telle que représentée en SEQ ID NO :1. Dans un exemple particulier, l'antigène de capture, qui peut être une protéine comprenant le fragment d'acides aminés 181 à 290 de la séquence TN-C humaine, peut être couplé à 20 une glutathion S transférase (GST), avant d'être déposé sur une microplaque. Des échantillons de sérum à tester, préalablement dilués au 1/100ème, sont mis à incuber sur la microplaque. Après lavage, des anticorps anti-Fc y humain marqués (par exemple avec une phosphatase alcaline) sont ajoutés, les complexes étant révélés (par exemple par ajout d'un substrat de la phosphatase dont le clivage peut être détecté par lecture de 25 l'absorbante). Patients visés : Les patients visés sont ceux susceptibles de développer une HTAP. Il peut s'agir d'un patient qui souffre d'une connectivite, telle qu'une sclérodermie 30 systémique, d'un syndrome de Sharp (qui est une connectivite mixte), d'un lupus érythémateux systémique. Le patient peut également souffrir d'une HTAP idiopathique ou familiale.10 Plus généralement, tout patient atteint d'une maladie vasculaire pulmonaire peut être avantageusement soumis au procédé de détection d'une HTAP tel que défini dans l'invention. Par ailleurs, 1'HTAP détectée peut être aussi une hypertension porto-pulmonaire (c'est-à- dire une HTAP associée à une hypertension portale), ou être associée à une cardiopathie congénitale, ou à une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), ou encore être une hypertension pulmonaire post-embolique, compliquant l'évolution d'une bronchite chronique obstructive ou d'une cardiopathie cyanogène. D'autres patients visés sont ceux exposés à certains médicaments coupe-faim comme la fenfluramine dont la prescription peut contribuer à la survenue d'une HTAP. D'autres personnes susceptibles de bénéficier de ce type de test sont celles porteuses d'une mutation dans le gène codant pour BMPRII et qui éventuellement ne présentent pas HTAP détectable à l'échographie, de façon à dépister les individus susceptibles de développer ultérieurement une HTAP. Evaluation de l'efficacité d'un traitement Un autre objet de l'invention est un procédé in vitro d'évaluation de l'efficacité d'un traitement envers une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-TN-C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, à différents temps avant, au cours ou après le traitement, la diminution de la quantité d'anticorps anti-TN-C au cours du temps étant indicatif d'une amélioration de 1'HTAP. Le traitement classique actuel de 1'HTAP associe un traitement symptomatique et un traitement vasodilatateur. Le traitement symptomatique associe des anti-coagulants, une oxygénothérapie et des diurétiques. Le traitement vasodilatateur repose sur les molécules suivantes : bloqueurs de canaux calcium, époprosténol (prostacycline) prescrit par voie intraveineuse en perfusion continue, les inhibiteurs des récepteurs de l'endothéline, sélectifs ou non, en particulier le bosentan, le sytaxentan et l'ambrysentan, les inhibiteurs des phosphodiestérases de type 5 en particulier le sildénafil, l'ensemble de ces médicaments étant administrés par voie orale, et l'iloprost inhalé, analogue de la prostacycline administré par voie inhalée. Ces traitements peuvent être éventuellement combinés. En cas d'échec de ces thérapeutiques, une transplantation pulmonaire ou coeur-poumons peut être proposée. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures : La figure 1 est un graphe montrant la détection des anticorps anti-TN-C par dosage ELISA. Les IgG sériques des patients atteints d'HTAP idiopathique, des patients atteints de sclérodermie systémique et des sujets sains appariés pour le sexe et l'âge, ont été testées vis à vis d'un fragment de TN-C recombinante, à une dilution de 1/100ème. Les limites inférieure et supérieure de la zone en pointillé représentent les seuils définis par deux et trois fois l'écart-type au dessus de la moyenne des densités optiques obtenues chez les sujets sains. Les différences significatives entre les groupes de malades et les sujets sains sont estimées à l'aide d'un test de rang de Mann Whitney et sont indiquées par : *: p La figure 2 représente des courbes de survie selon Kaplan et Meier en fonction de la présence ou de l'absence d'anticorps anti-TN-C. En abscisse, le temps en mois ; en ordonnée, la survie cumulée en pourcentage. Exemple : Détection d'anticorps anti-Ténascine C chez des patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire. Matériels et méthodes : 25 Patients L'HTAP a été dépistée par la mise en évidence par échographie cardiaque trans-thoracique d'une pression artérielle pulmonaire systolique supérieure à 40mmHg. Dans tous les cas, 1HTAP a été confirmée par la réalisation d'un cathétérisme droit et la mise en évidence 30 d'une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure ou égale à 25 mmHg au repos et à 30 mmHg à l'effort. Par convention, 1HTAP était qualifiée d'idiopathique si le patient ne montrait aucune pathologie associée, 1HTAP pouvant alors correspondre à une HTAP sporadique, familiale ou associée à une exposition à la fenfluramine. 91 patients ont été20 inclus dans l'étude comprenant 66 (72,5%) patients ayant une HTAP idiopathique (IPAH) et 25 patients ayant une sclérodermie systémique répondant aux critères de l'American College of Rheumatology (ACR) et/ou aux critères de LeRoy et Medsger (Masi et al, 1980 ; LeRoy et al, 2001). Tous les patients ayant une sclérodermie systémique diffuse sans HTAP avaient une atteinte interstitielle pulmonaire mise en évidence par un scanner thoracique haute résolution et une capacité vitale inférieure à 80% de la valeur prédite et/ou un coefficient de transfert du monoxyde de carbone (DLCO) inférieure à 75% de la valeur prédite. Aucun des patients ne recevait des corticoïdes ou d'immunosuppresseurs au moment des prélèvements, aucun d'entre eux n'avait de tumeur solide ou une autre connectivite associée. 46 sujets sains appariés pour le sexe et l'âge ont été utilisés comme contrôles. Dosage ELISA La Ténascine C (TN-C) a été obtenue auprès de la société Abnova (Abnova Corporation, Taipei City, Taïwan). L'antigène utilisé était constitué du fragment 181 à 290 de la TN-C (SEQ ID n°l), couplé à un motif GST. La TN-C a été diluée dans un tampon de bicarbonate et déposée sur des plaques 96 puits (Maxisorb, NalgeNunc Int. Rochester, NY, USA) à une concentration finale de 4�g/mL à 4°C. Les sérums de patients et de sujets sains ont été dilués au 1/100ème dans un tampon phosphate (PBS) à 1% d'albumine et incubés une heure à 37°C. Après un lavage, des anticorps de lapin anti-Fcy humain conjugués à de la phosphatase alcaline (Dakocytomation, Golstrup, Denmark), ont été ajoutés et incubés pendant une heure à température ambiante. Les réactivités ont été révélées par ajout de p-nitrophenylphosphate à 0,05M dans un tampon de carbonate de magnésium (pH 9,8) et l'absorbance à 405nm a été déterminée en utilisant un lecteur de plaques ELISA (Fusion, Packard BioScience, Meriden, CT, USA). Afin de tenir compte de la variabilité entre les puits, la densité optique d'un sérum de référence était arbitrairement définie comme 100% de l'activité anti-TN C. Les résultats des échantillons testés ont été calculés à partir de la moyenne de l'absorbance de puits dupliqués et exprimée comme un pourcentage de cette valeur de référence. Tous les échantillons ont été testés en double. Analyses statistiques Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel Systat (version 11.0 Systat Software Inc, Point Richmond, CA, USA). Un test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer les densités optiques relatives des différents groupes. Des valeurs de P inférieures à 0,05 étaient considérées comme statistiquement significatives. La survie a été calculée par la méthode de Kaplan et Meier (Kaplan and Meier, 1958). Résultats : Les réactivités des IgG des patients atteints d'HTAP idiopathique, des patients atteints de sclérodermie systémique avec ou sans HTAP et des sujets contrôles vis à vis de la TN-C ont été étudiés par ELISA. En utilisant un seuil défini par deux déviations standard au- dessus de la moyenne des densités optiques des réactivités IgG de l'ensemble des sujets sains, 36/66 (54,5%) patients ayant une HTAP idiopathique et 2/25 (8%) des patients sclérodermiques avaient des IgG anti-TN-C. Aucun des sujets sains n'avait d'IgG anti-TNC (Figure 1). Lorsque le seuil était déplacé à trois déviations standard au dessus de la moyenne des réactivités IgG des individus sains, 12/66 (18,1%) des patients ayant une HTAP idiopathique avait des IgG anti-TN C et aucun patient sclérodermique n'avait d'IgG anti-TN C. Les réactivités des IgG sériques des anticorps anti-TN C de patients ayant une HTAP idiopathique étaient significativement plus élevées que celles des patients sclérodermiques (p L'apparition d'une réponse immune dirigée contre la TN C pourrait résulter des mêmes mécanismes que ceux conduisant à l'induction de l'expression de la TN C et à la prolifération des cellules musculaires lisses. La présence d'anticorps anti-TN C serait donc corrélée à l'apparition d'un remodelage vasculaire, constituant un marqueur de la survenue d'une HTAP. Références bibliographiques - Dorfinuller et al, 2003, Eur Respir J, 22(2) :358-63 - Hachulla et al, 2005, Arthritis Rheum 52(12) :3792-3800 - Ihida-Stansbury et al, 2006, Am J Physiol Lung Cell Mol Physio1291(4):L694-702 - Jones et al, 1996, Circ Res 79(6) :1131-42 - Kaplan and Meier, 1958, J Am Stat Assoc 53:457-81 - LeRoy et al, 2001, J Rheumato128(7):1573-76 - Masi et al, 1980, Arthr Rheum 23 :581-90 - Mouthon et al, 2005, Eur Respir J 26(6) :986-8 - Nicolls et al, 2005, Eur Respir J 26(6) :1110-8 - Rettig et al, 1994, J Cell Sci;107 (Pt 2):487-97 - Rubin, 1997, N Engl J Med, 336(2) :111-7 - Tamby et al, 2005, Thorax 60(9):765-72 - Tamby et al, 2006, Eur Respir J 28(4):799-807 Revendications1. Procédé in vitro de détection d'une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), ou d'un risque de développer une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-Ténascine C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, la présence d'anticorps anti-Ténascine C étant indicatrice d'une HTAP ou d'un risque de développer une HTAP. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon de sang ou de sérum. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la présence d'anticorps anti-Ténascine C dans l'échantillon biologique est comparée à une valeur contrôle, la présence d'anticorps anti-Ténascine C en une quantité supérieure à la valeur contrôle étant indicatrice d'une HTAP ou d'un risque de développer une HTAP. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la quantité d'anticorps anti-Ténascine C est déterminée par un immunoessai. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l'immunoessai est un dosage ELISA. 6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique avec une protéine comprenant le fragment d'acides aminés 25 181 à 290 de la séquence Ténascine C humaine telle que représentée en SEQ ID NO :1. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le patient est un humain. 30 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le patient souffre d'une sclérodermie systémique.20 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le patient souffre d'un syndrome de Sharp. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le patient souffre d'un lupus érythémateux systémique. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le patient souffre d'une HTAP idiopathique. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel 1'HTAP est associée à une hypertension portale, à une cardiopathie congénitale, ou à une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), ou est une hypertension pulmonaire post-embolique. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le patient est un sujet prédisposé à développer une HTAP. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le sujet est porteur d'une ou plusieurs mutation(s) dans le gène codant pour BMPRII. 15. Procédé in vitro de pronostic ou de suivi d'une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d' anticorps anti-Ténascine C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, à différents temps, l'augmentation de la quantité d'anticorps anti-Ténascine C au cours du temps étant indicatif d'une aggravation de l' HTAP. 16. Procédé in vitro d'évaluation de l'efficacité d'un traitement envers une HTAP, comprenant la détermination de la présence et/ou de la quantité d'anticorps anti-Ténascine C dans un échantillon biologique provenant d'un patient, à différents temps avant, au cours ou après le traitement, la diminution de la quantité d'anticorps anti-Ténascine C au cours du temps étant indicatif d'une amélioration de 1'HTAP.