Brevet FR2928737A1 — publié le 20090918

Biopuce SPR Multiplex ciblant l'oncologie et la neurodégénérescence. Ou Biopuce de criblage dédiée aux gènes, peptides et anticorps thérapeutiques. DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte aux tests diagnostics et/ou thérapeutiques en oncologie et sur les maladies neurodégénératives. Le ciblage moléculaire par des vecteurs peptidiques ou des siRNA ouvre à une nouvelle conception de l'interdépendance qu'il y a entre outils diagnostiques et thérapeutiques qui maintenant vont de paire et ouvre la voie du pharmacodiagnostic. La présente invention met en évidence un microarray mixte .nudeotide/peptide par détection SPR (surface plasma resonance). L'innovation réside aussi dans l'utilisation des propriétés 3D des protéines et plus spécifiquement des domaines fonctionnelles des protéines et des anticorps pour mettre en évidence les interactions protéiques protéiques ou protéines ADN de cascades métaboliques spécifiques (� biochemical pathways �). Ainsi l'objectif de ces microarrays est de mettre le site fonctionnel libre au dessus de la surface de fixation des extrémités du peptide à la surface du microarray afin qu'il puisse dans des conditions proches de l'in vivo interagir avec la protéine du milieu que l'on passe dans les canaux (milieu équivalent à du sérum physiologique avec une protéine purifiée ou milieu complexe d'extraits nucléaires ou autre compartiment cellulaire ou de sérum) Le systeme inclut un sensor microarray Anticorps/DNA SPR et un bras réfléchissant avec un processeur signal, la description du sensor incluant un prisme, un microarray 25 chip et un échantillon cellulaire. Comparer des profils protéiques entre deux échantillons ou plusieurs ou entre extraits cellulaires dans le cancer par exemple versus controls ou encore entre cellules indifférenciées versus différentiées permet de déterminer des différences entre profils 30 d'expression protéiques. Deux échantillons peuvent être comparés dans un même run et en parallèle dans les approches I{PLC et spectrométrie de masse mais cette approche est insuffisante pour détecter l'ensemble des anomalies qui caractérisent un phénotype cancéreux par exemple d'un phénotype sain. L'identité et le niveau d'expression des gènes ne sont pas le reflet de la quantité de 5 protéines actives dans une cellule et les séquences de ces gènes ne permettent pas de déduire ce que seront les modifications post transcriptionnelles et traductionnelles qui définiront le plus souvent l'activité et la fonction des protéines et des complexes protéiques. L'invention consiste donc a avoir une approche mixte avec des tests multiplex qui 10 permettent en analysant toutes les données d'avoir non seulement des contrôles indirects des différents résultats mais une vue d'ensemble sur la nanophysiologie c'est-à-dire les cascades métaboliques qui permettent de trouver les causes des pathologies multifactorielles comme par exemple en oncologie. 15 DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART Les maladies neurodégénératives liées à l'âge et les cancers impliquent tous les deux une modification du processus physiologique de la mort cellulaire programmée ou apoptose. La mort neuronale est anormalement accélérée au cours des maladies 20 neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer, Huntington, Parkinson etc... En revanche, le processus de cancérisation correspond à un blocage de l'apoptose conduisant à une multiplication incontrôlée des cellules. Le lien entre ces deux processus est actuellement devenu un champ d'investigation majeur de recherche sur le vieillissement. 25 Le contrôle de l'équilibre entre division cellulaire (mitose), différenciation et mort cellulaire programmée (apoptose), est fondamental au cours de processus physiologiques normaux, comme le développement embryonnaire, la régénération des tissus et le vieillissement. Comparer des profils protéiques entre deux échantillons ou plusieurs ou entre extraits cellulaires dans le cancer par exemple versus convois ou encore entre cellules indifférenciées versus différentiées permet de déterminer des différences entre profils d'expression protéiques. Deux échantillons peuvent être comparés dans un même mn et en parallèle dans les approches HPLC et spectrométrie de masse mais cette approche est insuffisante pour détecter l'ensemble des anomalies qui caractérisent un phénotype cancéreux par exemple d'un phénotype sain. L'identité et le niveau d'expression des gènes ne sont pas le reflet de la quantité de protéines actives dans une cellule et les séquences de ces gènes ne permettent pas de déduire ce que seront les modifications post transcriptionnelles et traductionnelles qui définiront le plus souvent l'activité et la fonction des protéines et des complexes protéiques. L'invention consiste donc a avoir une approche mixte avec des tests multiplex qui permettent en analysant toutes les données d'avoir non seulement des contrôles indirects des différents résultats mais une vue d'ensemble sur la nanophysiologie c'est-à-dire les cascades métaboliques qui permettent de trouver les causes des pathologies multifactorielles comme par exemple en oncologie: L'élution des complexes ligand récepteur ou ADN protéine a chaque passage permettra d'analyser de façon comparative les courbes de dissociation et les cinétiques de dissociation entre extraits cellulaires cancéreux et extraits cellulaires contrôles mais aussi de purifier la protéine éluée afin par spectrométrie de masse de l'analyser voir de la séquencer et de la même manière après élution de récupérer la séquence nucléotidique qui serait en interaction avec telle autre ADN ou telle protéine et de la caractériser dans un deuxième temps par séquençage. Passer sur des biopuces mixtes le sérum du patient mais aussi un extrait cellulaire de la tumeur et ensuite un extrait uniquement des noyaux cellulaires puis des cytoplasmes cellulaires puis des membranes cellulaires permettra de voir suivant chaque spécimen de fluide testé, l'information différentielle avec des fluides contrôles des mêmes compartiments cellulaires, les modifications posttranscriptionnelles et posttraductionnelles. Pour augmenter le rendement d'une telle approche, on peut automatiser avec un robot le passage des différents fluides mais aussi le passage des sensorchips ou le nombre de canaux et d'emplacements de fixation des séquences peptidiques et nucléotidiques sur la plaque d'or du 2258-11/01/2007 -4- sensorchip. Une variante de l'invention consiste à améliorer la spécificité de sensorschips en faisant des lamelles d'or discontinues entre les sites de fixation voir même des damiers ou chaque micro ou nanosurface cané d'or serait le site d'une unique fixation d'un anticorps ou d'une séquence nucléotidique, voir peptidique, diminuant ainsi les effets parasites de proximité des sites sur un même film d'or génant l'analyse de chaque onde évanescente générée par le système de surface plasmionique. Une autre variante de l'invention pour les interactions simples c'est-à-dire ligand recepteur unique ou ADN proteine (ou peptide) ou anticorps monoclonal antigène c'est-à-dire avec un set de peptides ou nucléotides (qui ne necessitent pas de dimérisation comme le font les récepteurs tyrosines kinases) s'étudieront aussi avec un système de quantum dot associé a une nanobille utilisant le phénomène du FRET comme décrit par Kim Hak Sung ou bien avec une variante dans le cadre multiplex de notre invention : c'est-à-dire dans cet exemple 1 : une nanobille non fixée magnétique (Fe4Fe2O3 fente, 200nm avec un moment magnétique : 125.10 puissance-14 Am2), la taille du quantum dot CdS, CdSe,orCdTe de 10 ou 20nm(7nS) detenmine le range d'absorption et 12 couleurs différentes sont exploitables, l'acide carboxylique permet l'interaction entre quantum et bille magnétique et amine reactive NHS ester et le radical NH2 permet la fixation de l'ensemble sur la surface plane hydrophobique et résiliente avec en dessous un champ magnétique appliqué qui crée une pression pour que la nanobille avec son quantum se pose sur cette surface (dans laquelle est pris en sandwich une fine lame d'or) le temps de l'interaction entre ligand et récepteur. Le signal objectivant l'interaction se fera grâce à l'oscillation à 180° dû au champ magnétique appliqué (1.8 Tesla 309 Hz) ce qui permet d'observer une différence de clignotement de lumière émise par le quantum dot qui oscille avec tout le système moins vite quand il y a interaction et donc surcharge du complexe que quand il n'y a pas interaction. Les nanobilles s'orientant dans le champ nord sud et ayant l'ancrage du groupement thiol du quantum 2 5 dot au pôle sud Le détecteur doit avoir une sensibilité qui puisse discriminer par exemple une différence d'oscillation de 2.185ms et 2.059 ms. Une variation de phase de 14° pour l'émission de la fluorescence. L'excitation lumineuse hV engendre une émission a travers le prisme du type SPR avec une émission de l'onde évanescente grâce à la lame d'or (QD-MP pairs). Une autre variante d'un système de bille paramagnétique avec quantum dot peut être avec une détection 30 2258-11/01/2007 20 25 électrochimique directe (publication Martin Panera) On soumet le quantum dot (AU67)avec ADN] et 1'ADN2 hybridé à la bille paramagnétique à une pulsation voltamétrique différentielle qui donne en voltamétrie la mesure de la conjugaison, de l'interaction. La conjugaison se fait sur une électrode magnétique graphite epoxy. Aurelien Crut et Christophe Escudé (Nucleic Acid reseach 2005) détecte des molécules d'ADN simple brin par liaison à des quantum dots multicouleurs. Les autres solutions de biopuces sont décrites dans mes brevets précédents dont le 2006FR000510 avec les applications aux peptides et anticorps impliqués dans le cancer du sein mais ce nouveai r brevet donne des solutions supplémentaires pour répondre a l'hétérogénéité de certains cancers comme justement celui du cancer du sein. Un microanay avec une couche de microspheres comprenant un materiel avec une couleur latente qui peut se reveler et portant des sondes biologiques permet aussi l'analyse dinteractions il est associé a une cytométrie de flux pour faire les tests multiplex (W02005016515). Les nanocristaux (zinc sulfid capped cadmium selenide) incorporés aux microspheres (Nature Biotech 19,631-635 (2001)11 est réecrit et fait l'objet d'une nouvelle invention non plus avec des microspheres mais des nanospheres de 200nm et pour certaines applications de 500 nm.Avec le' quantum dot non plus intégré dans le polymem de polystyrene de la mic iosphere mais sur le pole sud de la nanosphere metallique. Mais l'essentiel de cette invention est d'obtenir le maximum d'informations sur les interactions moleculaires d'une cascade métabolique en utilisant la méthode de détection SPR (surface plasmon resonance) car la complexité des phénotypes demande des methodes it eratives rapides qui puissent s'automatise. Deux brevets donnent déjà le début d'une solution JP 2006050949 et W003091713. Le premier permet d'obtenir des profils cinetiques de nombreuses proteines kinases en detectant la phosphorylation des substrats pep idigues. L'activité pmteine kinase s'étudie par SPR avec un peptide qui contient deux ou plus residues amino acides fixé à la partie phosphorylée de chaque peptide immobi isé.Un complexe polyamine zinc modifié avec la biotine agit en detectant la phosphorylation. 2258-11/01/2007 Le deuxieme brevet permet de calculer l'activité catalytique d'une enzyme par SPR Les machines de mnicnofluidique type biacore permettent une premiere approche et ce sont les biochips mixtes de notre invention qui pemettent une nouvelle application en clinique. Il s'agit de sensorchips dédiés à la cancérologie dans ce deuxieme exemple, la deuxieme nouveauté étant d'avoir un collecteur qui recupere la proteine éluée ou l'ADN afin de l'analyser respectivement par spectr ometrie de masse et séquençage. Exemple2 : Interactions peptidiques et nucléotidiques via des anticorps polyclonaux, monoclonaux et des séquences nucléotidiques dans une application SPR au diagnostic en oncologie. Etude des types de liaison, des cinétiques de dissociation et séquençage des peptides et des oligonucléotides élués pour déterminer de nouveaux marqueurs. Le principe de la technique SPR est d'envoyer sur une interface un faisceau lumineux (800 nm) qui aura certes onde réfléchie mais aussi une onde transmise(évanescente) perpendiculaire a l'axe de l'interface qui contiendra une pellicule d'or créant une excitation électronique qui modifie le champ electrommagnetique.en créant cette surface qui est une veine liquide, la paroi contenant les particules d'or fixera sur ces particules une protéine ou un ADN. Le faisceau lumineux incident émit de façon perpendiculaire a un coté du prisme vient toucher l'interface contenant la paroi d'or.Quand la proteine ou l'ADN fixé sur l'or interagit aec un ADN ou un peptide qui passe dans le fluide dans le microcapillaire alors ca modifie l'onde perpendiculaire transmise (onde évanescente) et ca modifie aussi l'angle de reflexion de l'onde réfléchie.Cet angle va nous donner l'unite de Ru et le profil comparatif des courbes.L' onde évanescente qui est uen composante electmmagnétique de la lumiere stimule les électrons qui rentrent en résonance avec les photons du faiscEiu de lumière blanche incident et c'est la résonance plasmionique de surface. Ces courbes caractérisées par une ascendance correspondant a la fixation donc a l'interaction avec l'ADN ou le peptide du fluide puis un plateau tant qu'on injecte des molécules puis au ne baisse bn.rtale qui correspond a la dissociation des deux molécules qui n'ont pas de liaison covalente mais suivent la loi d'action de masse. Le système d'accroche sur la lame d'or de 5mm( mais l'épaisseur de la monocouche d'or est de 45nanometres.) d'épaisseur est soit a la st eptavidine avec une liaison an..biotine soit type CM5 carboxymethyllysine avec gel dextran ou CM3 etc.. . 2258-11/01/2007 25 30 - 7 En revanche si la molécule fixée est plus grosse que 500nm on n'aura pas de réaction ! Le prisme est fait dnc d'or :45nm puis d'une couche d'auto-assemblage de 2nm puis des biomolécules de 5nm puis de la couche de tampon et d'eau. Les ligands purs eux peuvent atteindre de 183 a 900 000 Dalton. La préparation des sensor chips (microfluidique) concerne trois anticorps (un polyclonal et deux monoclonaux et une séquence nucléotidique un sensorchip mixte AC et avec CDNA ou DNA un sensoithip mixte avec Anticorps et avec SiRNA ou RNA La circulation dans les canaux d'une plaque ne pouvant suivre au mieux que deux chemins ne lais que deux alternatives : Deux systèmes de fluidiques séparables avec pour chacun un anticorps monoclonal et un témoin Un deuxième chip avec un anticorps et un témoin et un DNA (ou siRNA) et un témoin La quantité de fluides à passer sur ces canaux sera plus importante que si on avait utilisé seulement une circulation unique des quatre canaux en commencent par un témoin unique et donc commun aux quatre canaux l'optimisation qui suivra se fera avec 12 puis 96 jusqu'à 364. Suivant que les ADN et anticorps seront avec amorces biotinylées et marquage à la streptavidine ou pas, le choix se portera sur une chip avec CM5 ou une chip à streptavidine. Pour le cDNA 1'élution se fera par chauffage sans que cela détériore quoique ce soit Pour les interactions ente séquences nucléotidiques : on utilise 30 Mimes d'ARN totaux Pour les fluides à tester en regard des anticorps, les courtes étalons sont plus délicates à faire Il faudrait prendre un patient malade (cancer avéré) comme référence, les extraits cellulaires étant des fluides complexes, on commence par des fluides artificiels. Pour greffer les anticorps, il faudrait au départ fournir 100 microlitres environ à 100 mic og/ml afin d'étudier les profils d'immobilisation suivant différents PIS, l'expérience sur des IgM a 2258-11/01/2007 30 -8-montré que la dilution dans le tampon d'acétate de sodium doit être adaptée fonction de chaque anticorps et que le PH qui donne la meilleure fixation varie entre 4 et 5,5 Cette étape de PH scotting doit être faite avant immobilisation des anticorps sans activer la surface des sensor chips (un profil de Ru élévé et crénelé). La concentration finale d'anticorps sera de 50 rnicrogammes par ml quand on procède à l'immobilisation et les besoins sont de 1 ml pour chaque anticorps à immobiliser sur sensorchip. Le greffage se fera avec le carboxylmethyl lysine et gel de dextan pour un sensorchip et à la st eptavidine pour un second sensorchip. On utilisera trois fluides contrôles plus ou moins spécifiques ; 15 à 20 injections par anticorps, une analyse de 5 à 10 points par fluide. Chaque injection de 3 minutes se fera avec 10 à 20 microlitres par minutes. Les besoins en fluide sont de 30 microlitres d'extraits cellulaires et 30 microlitres de volume mort donc pour deux sensorehips 150 nùcrolites sont suffisants pour les expérimentations et 230 microlitres seront utiles si on doit utiliser trois sensomhips différents, les fluides sont mélangés 50% à du tampon( 10mM NaCI), les ligands purs peuvent être dans un range de 183 daltons à 900000 daltons. Pour une étude de binding il faut saturer toute la surface du sensorrhips, saturer tous les ligands permet avec une courre d'association d'arriver à un plateau pour calculer la constante d'association et les cinétiques. L'étude d'un fluide pour un patient pour analyser l'interaction avec une protéine demande un test d'environ dix minutes, de plus dix jours de mise au point seront utiles pour résoudre les différents 2 0 points précités. L'objectif est d'étudier à chaque fois et en comparaison avec2des témoins : un extrait nucléaire, un extrait cytoplasmique, un extrait membranaire. Il faut avoir plus d'un nanomolaire d'antigène dans les fluides pour esperer un résultat Le deuxième appareil du type Biacore mais avec collecteur permet de récupérer les produits d'interactions et donc d'isoler les protéines purifiées pour analyse par spectrométrie de masse ainsi l' interpretation des résultats d'interactions ne se ferait pas seulement sur les comparaisons de courbes et Ru mais avec certitude après analyse des protéines éluées. 2258-11/01/2007 -9- L'étude des protéines éluées peut même devenir serai quantitative et elle se fera comme je l'ai décrit dans mes brevets précédents par séparation 2D Page permettant une cartographie des proteines suivant letu• pi et leur poids moléculaire puis spectrométrie de masse Maldi puis nanolcMS et MSMS et aussi avec Agilent 3D permettant des resultats autornatisables tres sensibles et tres rapides. Les anticorps étudiés et les séquences oligonucléotidiques étant seront les suivantes (en complernents de celles deja citées dans le brevet 2006FR000510 et le brevet correspondant du clonage du gène (07092006) : Les sites fonctionnels des DNA correspondant aux anticorps suivant associés à ces anticorps dans 10 un même sensorrhip mais en complementaires croisés par rapport aux cascades métaboliques. Deux a deux puis quatre par quatre puis 12 par .l2 etc... Antistat3 anticerb2 Antichlatrine antihistatine 15 antiG6P'lransférase antiNDF heregulin antihistone 4 antiBRCAI cf. FIGURE 2. antihistone 3 anti INT2 antihistone 2.5 et 2.3A . anti RAS antiblcl2 antimyc antip53 anticlk 1 etc. . .cf brevet et demande 0607859. 20 La relation structure fonction doit être utilisée pour positionner côte à côte les gènes et I ou protéines qui sont proches sur le même chromosome. Plus spécifiquement on utilise des domaines fonctionnels spécifiques accrochés au support nylon par exemple quand on regarde à la fois une séquence d'ADN et le domaine fonctionnel de la protéine qui va s'y � accrocher �. (FIGURE 4 - 5 - et 6 - ). 25 Exemples de domaines d'intérêt : Scop domaine Exemple 1: p53 tumor suppie_ssor factor like transcription factor et fragment de DNA binding domain chain A (ref 1T4W et 2F8X dans wwwresb.org/pdb). Exemple 2 : RbC terminal domain et E2Fl - DP 1 heterodimer (2Aze) FIGURE 2 30 Exemple3 : AN EH1 peptide lié au domaine WD40 (groucho TLE) ref...2CE8 2258-11/01/2007 -10- Exemple 4 : WRPW peptide lié a GROUCHO- TLE WD40 ref.2 CE9 Exemple 5 RBPocket lié à E7 LXCXE motif 1 GUX. Exemple 6 : Skp 1-Fbw7 CyclinEdegNcomplex (ref .2OVR) avec un polymere : S phase kinase kinase associated protein(fiagment residus 1-147 chainA et un polymère2 : Fbox / WD repeat protein7 fixé (mais avec la partie N terminal residus 263 à 707 libre et éloigné des sites de fixation du support afin de pouvoir interagir) sur le spot voisin afin d'interagir avec le trnisieme polymere s'il est dans le milieu testé qui est le polymere 3 : cyclinE terminal degmn (fragment N terminal Chain C). Exemple 7 : AP2 Clalhrin adaptor alpha appendage du complexe avec le peptide Epsin DPW. (Ref 1KYD). un polymère fixé avec la présentation libre au dessus de la surface et pro à interagir qui est 1a molécule alpha adaptin C fragment : C terminal appendage (EAR) residus 701-938 chaîne A(partie non fixée) et un deuxième polymère fixé sur le spot d'à coté avec comme partie libre (non fixée) le fragment du résidu 341 à 345 chaîne P(avec une mutation T345K par exemple)de • la molécule � EH domain binding mitotic phosphoprotein� qui elle serait attachée par les résidus 1 à 210 delachaineP. Reste les exemples d'hdacl et �2 et pkc epsilon liv L'intérêt de cette nouvelle méthode est aussi de déterminer les autres peptide ou DNA des complexes protéiques d'intérêt' qui sont encore inconnus alors qu'ils jouent un rôle discriminant dans la définition des phénotypes pathologiques versus contrôles. 2258-11/01/2007 SENSOR SPR MULTIPLEX suite Détails de l'exemple 2 : Collecter le fluide après passage en microfluidique sur le sensorchip peut se faire de différentes manières Prenons l'exemple de l'étude d'une interaction anticorps protéine pour récupérer la protéine d'intérêt et aussi étudier le KD et les cinétiques. soit dans un tube et avec un dernier lavage dans les canaux qui permettent l'élution de la protéine avec donc un tampon glycine acide entre 2 e 3 de PH et alors même si on récupère de faibles quantités une digestion en solution est toujours possible et très sensible. soit directement sur une plaque prête à l'analyse en spectrométrie de masse si le tampon est 15 adapté à la spectrométrie Maldi Tof où il peut rester acide. Pour tester l'échantillon en nanoLC ESI MS ou MSMS, il ne faut pas un PH acide avec Glycine donc une étape supplémentaire sera toujours obligatoire pour re-concentrer l'échantillon via le kit de purification Amersham ou un simple séchage en centrifugation à température ambiante ou médium par speedvac et le resuspendre dans le tampon adéquat., 20 Les étapes de digestion à la trypsine dans un second temps peuvent se faire avec les protocoles connus de l'homme de métier et disponible sur internet et plus spécifiquement on utilise une digestion à la trypsine sur l'échantillon protéique en solution c'est faisable et adapté car on va récupérer un seul type de protéine qu'in pourra ensuite analyser et même séquencer de novo. 25 En général on ne récupère que 50% du fluide qu'on injecte donc avec notre approche on peut optimiser cette quantité. En augmentant la concentration (en utisant un sensorchipavec un temoin et les trois autres puits fixant le même anticorps avec un seul passage sur les quatre canaux (puits), en injectant plus longtemps , en utilisant un système de microfluidique plus court et plus proche de la lame d'or et du prisme afin d'optimiser la réaction SPR. -11- 10 -12- Si l'échantillon est en grande quantité on peut faire un Edelman pour le séquençage. Pour optimiser la quantité de protéine qui a interagit avec l'anticorps et ainsi pouvoir faire des analyses plus exhaustives par spectrométrie de masse on peut utiliser un sensorchip et un système IFC (cartouche du système microfluidique) différent. C'est-à-dire des canaux de microfluidique plus courts et plus proche de la réaction d'SPR e donc de la lame d'or sur lequel est fixé l'anticorps (surface de 2mm2 par exemple). Avant de passer le dernier liquide de lavage pour récuperer l'analyte on doit passer de solutions de lavages pour éliminer tout ce qui n'est pas fixé sur l'anticorps et qui parasiterait la solution pour l'analyte final à séquencer. Ces difféentes solutions de lavages suivant l'objectif et le type de molécules fixées sur la lame d'or doivent être distinguées de la solution qui sert à équilibrer l'IFC et à faire les premiers lavages après injection du fluide d'intérêt. Exemple pour la calmoduline le tampon compatible va être à 50 millimolaire NH4HCO3 et 2 Millimolaire CaCl2 alors que la solution de récupération sera à 0,5% de TFA (trifluoroacétique acide) alors que pour une IgM ou une lgG comme la Beta2globuline on utilisera un tampon NaCl puis un tampon HBS de course et un tampon de récupération à PH2,5 de glycine. Annexe , il est apparu intéressant de connaître en parallèle la quantité d'ARN codant pour les antigènes étudiés en phase 1. La solution d'analyser ces ARN par 25 SPR a été émise (fixation d'un ADN complémentaire cible en tant que ligand et injection d'un extrait nucléo-protéique en tant qu'analyte). Cet abord est soumis à plusieurs critiques : (1) peu voire absence d'analyse de ce type décrite dans la littérature. Il est probable que la très faible stabilité de l'ARN exclut ces protocoles.(2) absence de techniques de ce type en SPR. Dans l'hvoothèse d'un travail de ce type, cela nécessiterait un investissement très important compatible avec un projet de faisabilité. (3) 30 : dans l'hypothèse où une interaction puisse être mise en évidence, ce type de protocole ne pourra jamais être quantitatif et corrélé avec le taux de protéines pour des raisons de contrôles de qualité du matériel et de standard. C'est pourquoi nous proposons dans le projet cette phase 2. Io 15 20 -13- Annexe 2 : Les' SensorChips sont des lames recouvertes d'or contenant 4 cellules, chacune utilisable pour la fixation d'un-type de molécule. Des systèmes de microfluidique permettent de faire passer l'échantillon successivement dans les différentes cellules. Comme le projet est ici en phase de faisabilité, il est souhaitable de ne pas injecter le même extrait cellulaire successivement sur chaque cellule (ce qui permettrait avec un même échantillon de tester deux voire 3 anticorps différents). Pour des raisons techniques (en particulier, nécessité de garder des cellules de référence), les 3 anticorps seront fixés sur 2 SensorChips (voir schéma). II faut noter qu'en cas de succès, ces SensorChips seront utilisables pour les projets ultérieurs et ne nécessiteront pas d'investissements supplémentaires (possibilité de faire plusieurs centaines d'injections sur une même cellule). '20 SensorChip 1 : SensorChip 2 : Réf 3 Ac 3 Rien 25 30 Matériel fourni Phase 1 : Il est prévu de tester 3 anticorps : 2 monoclonaux (IgG) et 1 polyclonal (IgG). Les concentrations nécessaires pour l'immobilisation de ces anticorps sont de 200pg/mL à raison de 100�L minimum par anticorps. Les extraits cellulaires sont : 3 contrôles non pathologiques 1 patient malade Les volumes d'extraits cellulaires doivent permettre la détection d'un signal et la réalisation de plusieurs injections afin de mettre au point les conditions optimales de régénération. Une injection nécessite environ 50-100pL à une concentration minimale de l'ordre de la nanomole. A priori ceci impliquerait au mieux environ 500pL d'extraits cellulaires pour commencer les tests. II semble logique que ceux-ci soient fait sur patient malade en premier. Cependant, pour déterminer plus précisément les volumes d'extraits, il faudrait connaître : la concentration protéique totale la concentration en antigène (ordre de grandeur) Les extraits seront fournis non purifiés. Le protocole de préparation de ces échantillons doit nous être transmis. Il est par ailleurs souhaitable de fournir 5 ml de tampon afin d'évaluer les interférences éventuelles liées à celui-ci. Phase 2 : Le but étant de comparer en parallèle l'expression des protéines étudiées en SPR et leur ARNm, il faut partir du même extrait. Pour que cette phase puisse être mise en place il est nécessaire que les 4 échantillons (les 3 contrôles non pathologiques et le patient) soient aliquotés en 2 échantillons l'un pour protéines (phase 1), l'autre pour ARN (phase2). Dans l'hypothèse où l'expérimentation portera sur 3 gènes, en tenant compte des mises aux point, des quantités d'ARN total de l'ordre de 3 à 5 pg doivent suffire. Pour des raisons de qualité et de contrôle des résultats, les échantillons doivent être fournis sous forme originale (tissus ou cellules), la plate-forme se chargeant de la purification. Le rendement d'extraction de l'ARN variant largement d'un type cellulaire à un autre, il faudra adapter le volume de chaque échantillon à ce rendement. -14- '25 30 5 Io 15 20 30 -15 - Appareil d'analyse par SPR : Biacore 3000, accessoires et logiciels d'analyse Principe : la résonance plasmonique de surface (SPR) utilise les changements de propriétés physiques induites par la formation des complexes moléculaires permettant ainsi d'étudier les interactions moléculaires sans marquage préalable. Cette méthode consiste à fixer un des deux interactants sur une surface d'or (1mm2) située à l'intérieur d'une cellule. Après cette immobilisation, le deuxième partenaire passe dans la cellule et peut interagir avec la molécule fixée. L'interaction moléculaire est objectivée par le changement d'angle de réflexion d'une lumière monochromatique Cette méthode présente de nombreux avantages tels que : - l'absence de marquage des partenaires de l'interaction, - la possibilité de suivre en temps réel l'association et la dissociation des molécules, et donc de déterminer les paramètres de liaison cinétiques (kon, k0) ou à l'équilibre (KD, KA), - la possibilité d'étudier des interactions complexes (détermination de l'ordre d'interaction entre plusieurs molécules, études entre molécules membranaires et circulantes par exemple) - sà très grande reproductibilité Bioanalyser Agilent : Contrôle des ARN (si option phase 2) Lightcycler : Appareil de QPCR (si option phase 2) Les différentes éta • es de l'ob'ectif 1 Phase 1 : Le projet se déroulera en 3 temps : - Fixation des anticorps sur les cellules de la SensorChip : les 3 anticorps seront immobilisés sur 2 SensorChips (cf Annexe 2). Cette fixation se fera selon un protocole établi par la plate-forme. Les anticorps n'étant pas biotinylés, les SensorChips retenues sont les CM5 (CarboxyMéthyl Dextran) Etude de l'interaction entre l'antigène et l'anticorps (chaque anticorps nécessite les mêmes étapes) : 15 20 25 30 -1G- o Tests d'optimisation des conditions expérimentales : le but est ici (1) de visualiser un signal SPR montrant une interaction entre l'anticorps et l'antigène, (2) de mettre au point les conditions de lavage afin d'éliminer les protéines ayant interagi et ceci sans détériorer la cellule greffée. Cette étape devrait nécessiter entre 10 et 30 injections de l'extrait du patient malade. o Test sur les 3 autres sujets (contrôles normaux) : 10 injections par sujet (5 dilutions en duplicate) devraient suffire. o Mise en place d'une méthode de récupération des analytes fixés : 12 injections au total to o Application du protocole pour récupérer les analytes en quantité suffisante pour analyse en spectrométrie de masse : prévoir un pool pour chaque analyte de 10 injections chacune. L'analyse par spectrométrie de masse peut faire l'objet d'un contrat à négocier avec la plate-forme de spectrométrie de masse de Lille Il (G. Briand). Dans le cas contraire, la société Imagenium est libre de faire réaliser cette analyse dans le laboratoire de son choix. Seule cette analyse permettra d'établir la spécificité de la liaison antigène-anticorps. Phase 2 : Cette phase est optionnelle mais peut apporter des informations importantes dans l'expression des gènes codant pour les protéines testées par SPR. Les échantillons à tester (les 3 contrôles non pathologiques et le patient malade) sont fournis à l'état de tissus ou cellules dans un milieu stabilisateur d'ARN (Type RNAlater). La phase présentera les étapes suivantes (pour chaque échantillon): -Préparation de l'ARN suivant les protocoles habituels de la plate-forme (Qiagen ou Macherey-Nagel) - Caractérisation des ARN obtenus : o Quantification, absence de contaminants par spectrométrie sur Nanodrop o Vérification de la qualité (Bioanalyser Agilent) o Design des amorces de PCR quantitative à partir des bases de données, contrôle de spécificité, structure,... Mise au point de la PCR sur des échantillons adaptés (ARN test ou autre) - Choix du bon gène domestique de contrôle (18S, GAPDH,...) - PCR quantitative proprement dite - Interprétation des résultats Résùltats attendus: Phase 1 : La phase 1 a pour but d'établir la possibilité d'observer une liaison entre des anticorps spécifiques et leur antigène contenu dans un milieu cellulaire hétérogène. La mise en évidence d'un signal permettra d'affirmer une interaction entre l'anticorps et un antigène contenu dans l'extrait cellulaire. II est fort probable que ce soit l'antigène spécifique de i0 l'anticorps mais il peut y avoir des réactions croisées avec d'autres molécules contenues dans l'extrait, ou un manque de spécificité ou d'affinité. Le taux d'expression peut aussi être trop faible,... Dans l'hypothèse où un tel signal est observé dans les mises au point, on pourra : Vérifier la spécificité et l'aspect quantitatif du signal en variant les concentrations 15 en extrait (obtention d'une saturation) - Vérifier l'identité de la molécule ayant interagi avec l'anticorps par récupération de celle-ci après SPR et analyse en spectrométrie de masse Dans l'hypothèse où les résultats cités ci-dessus sont corrects, il sera possible d'envisager les projets ultérieurs d'étude d'affinité et épidémiologiques Phase 2 : 25 L'étude de l'expression des ARN messagers codant pour les protéines étudiées dans la phase 1 permettra : • de rapporter l'expression de ces gènes à la quantité de protéines produites. On pourra en déduire un éventuel mécanisme d'expression des oncogènes. • de déterminer la méthode la plus adaptée pour poursuivre l'étude. -1;- 20 30 5 Io 15 -18- 1 Methode utilisant une biopuce SPR multiplex pour objectiver les interactions proteines ADN de complexes metaboliques grace a leurs domaines fonctionnels. 2 Methode utilisant une biopuce SPR multiplex pour accrocher par interaction biochimique des peptides therapeutiques 3 Methode utilisant une biopuce SPR multiplex pour accrocher par interaction biochimique des sondes ADN therapeutiques 4 Methode utilisant une biopuce SPR multiplex pour accrocher par interaction biochimique des siRNA thérapeutiques methode de fixation des domaines proteiques ou geniques ou anticorps en presentant le domaine fonctionnel permettant l'interaction audessus du support. 20 19 REVENDICATIONS 1) Procédé pour la comparaison de profils peptidiques, anticorps ou nucléotidiques (ARN, ADN) entre deux échantillons d'extraits cellulaires caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une biopuce de type microarray mixte nucléotides /peptides utilisa.nt les séquences 1 à 150, en ce qu'il comprend l'injection successive dans les canaux microfluidiques de chacun des échantillons et pour chacun de ces échantillons, une détection de type SPR (plasmion resonance surface) au niveau des nanosurfaces d'or sur lesquelles sont fixés les anticorps, les peptides ou les nucléotides puis la comparaison des résultats des deux détections SPR. 2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que des peptides thérapeutiques sont accrochés aux nanosurfaces d'or par interaction biochimique. 3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que des siRNA thérapeutiques sont accrochés aux nanosurfaces d'or par interaction biochimique. 4) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que des sondes ADN thérapeutiques sont accrochés aux nanosurfaces d'or par interaction biochimique. 5) Biopuce pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 à 4 caractérisée en ce qu'elle comprend des nanosurfaces d'or en damier constituant chacune un site de fixation d'anticorps ou d'une séquence nucléotidique ou peptidique.25