Brevet FR2933305A1 — publié le 20100108

COMPOSITION OSTEOGENIQUE COMPRENANT UN FACTEUR DE CROISSANCE, UN SEL SOLUBLE DE CATION ET UNE MATRICE ORGANIQUE La présente invention concerne le domaine des formulations ostéogéniques et plus particulièrement des formulations de protéines ostéogéniques appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs. Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un � cysteine knot � (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.). Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par Israel et al. (Israel DI, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles. Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération et la différentiation. Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE� aux Etats-Unis et de InductOs� en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non-union. Dans le cas d'InFUSE� pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres. La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP-1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMP-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter. Il reste cependant essentiel de trouver une formulation permettant d'améliorer la performance de ces facteurs de croissance BMPs afin de pouvoir, par exemple, diminuer les quantités à administrer. Cette problématique est commune à de nombreuses formulations de facteurs de croissance puisque ces protéines sont en général utilisées à des doses dépassant de plusieurs ordres de grandeur les doses physiologiques. Il est du mérite de la demanderesse d'avoir trouvé une formulation des facteurs de croissance ostéogéniques permettant d'améliorer leur activité par addition d'une solution d'un sel soluble d'un cation au moins divalent à la matrice contenant les facteurs de croissance. D'une façon surprenante, cette nouvelle formulation permet de produire le même effet ostéogénique avec des quantités moindres de facteurs de croissance. L'invention concerne une composition ostéogénique comprenant au 15 moins : • un facteur de croissance ostéogénique, • un sel soluble de cation au moins divalent • une matrice organique. 20 Dans un mode de réalisation la composition est sous forme de lyophilisat. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation au moins divalent est un sel soluble de cation divalent, choisi parmi les cations du calcium, du magnésium ou du zinc. 25 Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, 30 l'aspartate. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est un sel de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, 35 le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est un sel de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation est un sel soluble de cation multivalent. On entend par cations multivalents, des espèces portant plus de 15 deux charges positives connues, le fer, l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine. On entend par facteur de croissance ostéogéniques ou BMP seuls ou en combinaison une BMP choisie dans le groupe des BMPs (Bone 20 Morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives. Plus particulièrement les protéines ostéogéniques sont choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5. Les BMP utilisées sont des BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA). Dans un mode de réalisation, la matrice organique est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel purifié, stérilisé de préférence réticulé. 35 En effet les polymères naturels comme le collagène sont des composants de la matrice extracellulaire qui favorisent l'attachement, la 25 30 migration et la différentiation cellulaire. Ils présentent l'avantage d'être extrêmement biocompatibles et sont dégradés par des mécanismes de digestion enzymatique. Les matrices à base de collagène sont obtenues à partir de collagène fibrillaire de type I ou IV extraits à partir de tendon ou d'os de boeuf ou de porc. Ces collagènes sont d'abord purifiés avant d'être réticulés puis stérilisés. Elle peuvent également être obtenues par extraction acide d'os autologue, conduisant à la perte de la majorité des composants minéralisés mais à la préservation des protéines collagéniques on non-collagéniques, incluant les facteurs de croissance. Ces matrices déminéralisées peuvent également être préparées sous forme inactive après extraction avec des agents chaotropiques. Ces matrices sont essentiellement composées de collagène de Type I insoluble et hautement réticulé. Des matériaux mixtes peuvent également être utilisés, par exemple une matrice qui associe le collagène et des particules inorganiques et qui peuvent se présenter sous la forme d'un matériau composite aux propriétés mécaniques renforcées ou encore sous la forme d'un � putty � ou la collagène joue un rôle de liant. Les matériaux inorganiques utilisables comprennent essentiellement des céramiques à base de phosphate de calcium telles que l'hydroxyapatite (HA), le phosphate de calcium tricalcique (TOP), le phosphate de calcium biphasique (BCP) ou le phosphate de calcium amorphe (ACP) qui présentent comme principal intérêt une composition chimique très proche de celle de l'os. Ces matériaux possèdent de bonnes propriétés mécaniques et sont immunologiquement inertes. Ces matériaux peuvent se présenter sous différentes formes comme des poudres, des granulats ou des blocs. Ces matériaux présentent des vitesses de dégradation très différentes en fonction de leurs compositions ainsi l'hydroxyapatite se dégrade très lentement (plusieurs mois) alors que le phosphate de calcium tricalcique se dégrade plus rapidement (plusieurs semaines). C'est dans ce but que les phosphates de calcium biphasiques ont été développés car ils présentent des vitesses de résorption intermédiaires. Ces matériaux inorganiques sont connus pour être principalement ostéoconducteurs. On entend par lyophilisat le produit ou la composition résultant d'une opération de lyophilisation. La lyophilisation est une technique de sublimation de l'eau permettant une déshydratation de la composition. Cette technique est couramment utilisée pour la conservation et la stabilisation des protéines. La réhydratation d'un lyophilisat est très rapide et permet l'obtention aisée d'une formulation prête à l'emploi, ladite formulation pouvant ête réhydratée avant l'implantation ou implantée sous sa forme déshydratée, la réhydratation intervenant alors, après implantation, par le contact avec les fluides biologiques. En outre, il est possible d'ajouter à ces facteurs de croissance ostéogéniques, d'autres protéines et en particulier des facteurs de croissance angiogéniques tel que le PDGF, le VEGF ou le FGF. L'invention concerne donc une composition selon l'invention caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF. Les compositions ostéogéniques selon l'invention sont utilisées par implantation, par exemple, pour combler des défauts osseux, pour effectuer des fusions vertébrales ou des réparations maxillo-faciales ou pour le traitement de l'absence de consolidation des fractures (pseudarthrose). Dans ces différentes utilisations thérapeutiques, la taille de la 30 matrice et la quantité de facteur de croissance ostéogénique sont fonction du volume du site à combler. Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance ostéogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 35 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 2 mg, alors que les doses couramment admises dans la littérature sont comprises entre 8 et 12 mg. S'agissant des utilisations en réparation maxillo-faciale ou dans le 5 traitement de la pseudarthrose, par exemple, les doses administrées seront de l'ordre de la dizaine de pg. Dans un mode de réalisation, les solutions de cation divalent ont des concentrations comprises entre 0,01 et 1 M, de préférence entre 0,05 et 10 0,2 M. Dans un mode de réalisation, pour un implant vertébral les doses de facteur de croissance angiogénique seront comprises entre 0,05 mg et 8 mg, de préférence entre 0,1 mg et 4 mg, encore de préférence entre 0,1 mg et 15 2 mg. L'invention concerne également le procédé de préparation des compositions selon l'invention qui comprend au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une matrice organique, 20 b) on imprègne ladite matrice d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, c) on additionne à la matrice obtenue à l'étape b) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent d) on procède éventuellement à la lyophilisation de la matrice 25 obtenue à l'étape c). Dans un mode de réalisation à l'étape c), la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent. 30 Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. 35 Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de magnésium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. Dans un mode de réalisation les sels solubles de cation divalent sont des sels de zinc dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. Dans un mode de réalisation le sel soluble de cation divalent est le chlorure de calcium. Dans un mode de réalisation à l'étape c), on imprègne la matrice d'une solution d'un sel soluble de cation multivalent. Dans un mode de réalisation les cations multivalents sont choisis 20 dans le groupe consitué par les cations multivalents du fer, de l'aluminium, des polymères cationiques tels que la polylysine, la spermine, la protamine, la fibrine Dans un mode de réalisation à l'étape a), on imprègne également 25 la matrice d'une solution d'un facteur de croissance non ostéogénique. L'invention concerne également l'utilisation de la composition selon l'invention comme implant osseux. 30 Dans un mode de réalisation ladite composition pourra être utilisée en combinaison avec un dispositif prothétique du type prothèse vertébrale ou cage de fusion vertébrale. Elle concerne également les méthodes thérapeutiques et 35 chirurgicales utilisant ladite composition dans la reconstruction osseuse.15 L'invention est illustrée par les exemples suivants. Exemple 1 : Préparation des implants éponge de collagène / 5 rhBMP-2 Implant 1 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,05 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La 10 solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant utilisation. La dose de BMP-2 est de 2 pg. Implant 2 : Il est préparé comme l'implant 1 avec 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml. La dose de BMP-2 est de 20 pg. Exemple 2 : Préparation des implants éponge de collagène / rhBMP-2 avec chlorure de calcium Implant 3 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml sont 20 introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 pl d'une solution de chlorure de calcium à une concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est prête à l'emploi après 15 minutes. 25 La dose de BMP-2 est de 20 pg. Exemple 3 : Préparation des implants éponge de collagène / rhBMP-2 avec chlorure de calcium, lyophilisés 30 Implant 4 : 40 pl d'une solution de rhBMP-2 0,05 mg/ml à 0,5 mg/ml sont introduits stérilement, dans une éponge de collagène réticulée de 200 mm3 stérile de type Helistat (Integra LifeSciences, Plainsboro, New Jersey). La solution est laissée à incuber pendant 30 minutes dans l'éponge de collagène avant de rajouter 100 pl d'une solution de chlorure de calcium à une 35 concentration de 18,3 mg/ml. L'éponge est alors ensuite congelée et lyophilisée stérilement. La dose de BMP-2 est de 2 pg. 15 Implant 5 : Il est préparé comme l'implant 4 avec 40 pl d'une solution de rhBMP-2 à 0,5 mg/ml. La dose de BMP-2 est de 20 pg. Exemple 4 : Evaluation du pouvoir ostéoinductif des différentes formulations L'objectif de cette étude est de démontrer le pouvoir ostéoinductif des différentes formulations dans un modèle de formation ectopique d'os chez le rat. Des rats mâles de 150 à 250 g (Sprague Dawley OFA û SD, Charles River Laboratories France, B.P. 109, 69592 l'Arbresle) sont utilisés pour cette étude. Un traitement analgésique (buprenorphine, Temgesic�, Pfizer, France) est administré avant l'intervention chirurgicale. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un mélange 02 isoflurane (1-4%). La fourrure est éliminée par rasage sur une large zone dorsale. La peau de cette zone dorsale est désinfectée à l'aide d'une solution de povidone iodine (Vetedine� solution, Vetoquinol, France). Des incisions paravertébrales d'environ 1 cm sont effectuées afin de dégager les muscles dorsaux paravertébraux droit et gauche. L'accès aux muscles est effectué par incision transfaciale. Chacun des implants est placé dans une poche de telle manière qu'aucune compression sur celles-ci ne puisse être exercée. Quatre implants sont implantés par rat (deux implants par site). L'ouverture des implants est ensuite suturée au moyen d'un fil polypropylène (Prolene 4/0, Ethicon, France). La peau est refermée au moyen d'une suture non-absorbable. Les rats sont ensuite replacés dans leurs cages respectives et gardés en observation durant leur rétablissement. A 21 jours, les animaux sont anesthésiés par une injection de tiletamine-zolazepam (ZOLETIL�25-50 mg/kg, IM, VIRBAC, France). Les animaux sont ensuite euthanasiés par injection d'une dose de pentobarbital (DOLETHAL�, VETOQUINOL, France). Une observation macroscopique de chaque site est ensuite réalisée, tout signe d'intolérance locale (inflammation, nécrose, hémorrhagie) et la présence de tissu osseux et/ou cartilagineux est enregistrée et côtée selon le barème suivant : 0: absence, 1 : faible, 2 : modéré, 3 : marqué, 4 : important. Chacun des implants est retiré de son site d'implantation et des photographies macroscopiques sont prises. La taille et le poids des implants sont ensuite déterminés. Chaque implant est ensuite conservé dans une solution de formol à 10% tamponnée. Résultats : Cette expérience in vivo permet de mesurer l'effet ostéoinducteur de la BMP-2 en plaçant l'implant dans un muscle du dos d'un rat. Ce site non osseux est dit ectopique. Les observations macroscopiques des explants nous permettent d'évaluer la présence des tissus osseux et de déterminer la masse des implants. Implant Présence de tissus osseux Masse des implants (mg) Implant 1 Implants non retrouvés Implant 2 3.6 38 Implant 3 4 75 Implant 4 3.2 26 Implant 5 3.3 171 Une dose de 2 pg de BMP-2 dans une éponge à collagène (Implant 1) n'a pas un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on puisse retrouver les implants collagéniques au bout de 21 jours. Une dose de 20 pg de BMP-2 dans une éponge à collagène 20 (Implant 2) a un pouvoir ostéoinducteur suffisant pour qu'on obtienne au bout de 21 jours des implants ossifiés avec un poids moyen de 38 mg. Pour la même dose de BMP-2 de 20 pg, l'ajout de sels de calcium dans l'éponge de collagène contenant la BMP-2 permet d'augmenter l'activité 25 ostéogénique de la BMP-2. La masse moyenne des implants 3 est deux fois plus importante que celle des implants 2 avec un score d'ossification équivalent. Egalement pour la dose de BMP-2 de 20 pg, la lyophilisation 30 permet d'accroître l'effet du sel de calcium sur l'activité ostéogénique de la BMP-2 (Implant 5). La masse moyenne des implants lyophilisés contenant de la BMP-2 et du CaCl2 est environ quatre fois supérieure à celle des implants contenant seulement de la BMP-2 (implant 2). En outre, le score osseux est équivalent entre ces implants. Pour une dose de BMP-2 de 2 pg, la BMP-2 en présence de CaCl2 lyophilisé dans l'éponge à collagène (Implant 4) permet de générer des implants ossifiés contrairement à la BMP-2 seule à la même dose. 10 La nouvelle formulation pouvant réduire fortement les doses de BMP-2 à administrer sans réduire l'activité ostéogénique.5 REVENDICATIONS1 Composition ostéogénique comprenant au moins : • un facteur de croissance ostéogénique, • un sel soluble de cation au moins divalent • une matrice organique. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que 10 ladite composition est sous forme de lyophilisat. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe des BMPs (Bone morphogenetic Proteins) 15 thérapeutiquement actives. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le facteur de croissance ostéogénique est choisi dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la 20 BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des facteurs de croissance angiogéniques choisis dans le groupe constitué par le PDGF, le 25 VEGF ou le FGF. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le cation est un cation divalent choisi dans le groupe constitué par les cations du calcium, du magnésium ou du zinc. 30 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, 35 l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce le cation est un cation multivalent choisi dans le groupe constitué par les cations du fer, de l'aluminium ou des polymères cationiques choisis parmi la polylysine, la spermine, la protamine et la fibrine, seuls ou en combinaison. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la matrice est choisie parmi les matrices à base de collagène naturel. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la matrice organique comprend en outre des particules inorganiques. 20 12. Procédé de préparation des compositions selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 comprenant au moins les étapes suivantes : a) on dispose d'une matrice organique, b) on imprègne ladite matrice d'une solution comprenant un facteur de croissance ostéogénique, 25 c) on additionne à la matrice obtenue à l'étape b) une solution d'un sel soluble de cation au moins divalent d) on procède éventuellement à la lyophilisation de la matrice obtenue à l'étape c). 30 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'à l'étape a), on imprègne également la matrice d'une solution d'un facteur de croissance angiogénique choisi dans le groupe constitué par le PDGF, le VEGF ou le FGF.15 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisé en ce qu'à l'étape c) la solution de sel soluble de cation au moins divalent est une solution de cation divalent. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisé en ce qu'à l'étape c) le sel soluble de cation divalent est un sel de calcium dont le contre-ion est choisi parmi le chlorure, le D-gluconate, l'oxalate, l'hydroxyde, le formate, le D-saccharate, le phosphate, le carbonate, l'acétate, le sulfate, le L-ascorbate, le L-tartrate, le L-lactate, le glutamate, l'aspartate. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 caractérisé en ce qu'à l'étape c) le sel soluble de cation divalent est du chlorure de calcium. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisé en ce qu'à l'étape c) on imprègne la matrice d'une solution d'un sel soluble de cation multivalent. 18. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 11 comme implant osseux.