Brevet FR2928926A1 — publié le 20090925

Polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des [exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes L'invention concerne des polynucléotides et polypeptides chimériques permettant la sécrétion d'un polypeptide d'intérêt en association avec des exosomes, et leur utilisation pour la production de compositions immunogènes à base d'ADN ou d'exosomes ou pour le criblage d'interactions protéiques. La présente invention a pour objet un polypeptide chimérique capable d'être sécrété en association avec des exosomes lorsqu'il est exprimé dans des cellules eucaryotes appropriées, ledit polypeptide chimérique comprenant plusieurs domaines polypeptidiques. La présente invention a également pour objet un polypeptide constitué par l'un de ces domaines, permettant la sécrétion, en association avec des exosomes, d'un peptide ou polypeptide d'intérêt auquel il est associé. L'invention concerne également une vésicule membranaire, en particulier un exosome, qui comporte un polypeptide de l'invention, une composition immunogène à base de tels exosomes et un procédé de production de tels exosomes. L'invention a également pour objet un polynucléotide codant pour un polypeptide de l'invention et une composition immunogène le comprenant, 25 en particulier un vaccin à ADN le comprenant. La présente invention concerne également la mise en oeuvre des propriétés des vésicules membranaires et des compositions immunogènes de l'invention pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une infection par un agent pathogène, un organisme pathogène, un antigène tumoral ou [un 30 antigène cytoplasmique, en particulier pour éliciter ou favoriser in vivo, chez un hôte (humain ou non humain), une réponse humorale et/ou cellulaire contre un virus, une bactérie, un parasite ou une tumeur. La présente invention vise également l'utilisation de vésicules membranaires de l'invention pour produire des anticorps dirigés contre le peptide ou le polypeptide d'intérêt ou dans le cadre d'un procédé de 5 criblage de molécules interagissant avec le peptide ou le polypeptide d'intérêt. Les exosomes se présentent sous la forme de petites sphères limitées par une bicouche lipidique. Ces vésicules membranaires sont sécrétées par différents types de cellules, en particulier par certaines des 10 cellules du système immunitaire, (mastocytes, lymphocytes T et B, cellules dendritiques, notamment cellules de Langerhans). Les exosomes se distinguent d'autres vésicules membranaires sécrétées par les cellules notamment par leur petite taille (de 50 à 100 nm de diamètre) et par leur composition en protéines membranaires (des molécules d'adhésion, de 15 transport, de transduction de signal et des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité entre autres). Les exosomes pourraient notamment correspondre à des vésicules internes des endosomes multivésiculaires (notamment des endosomes tardifs) sécrétées par la cellule lors de la fusion de ces endosomes avec la 20 membrane plasmique ; les endosomes multivésiculaires sont généralement impliqués dans le transport de molécules dans les compartiments lysosomiques (voie de dégradation des protéines) mais, dans certaines cellules telles que les réticulocytes et certaines cellules présentatrices d'antigènes, ils pourraient être dirigés vers la membrane plasmique, avec 25 laquelle ils fusionneraient pour libérer des exosomes dans le milieu extracellulaire. Des études antérieures ont démontré que les exosomes sont capables d'induire des réponses immunes humorales et/ou cellulaires (Delcayre et al., 2002). Les exosomes sont considérés comme des 30 vecteurs d'antigènes capables de stimuler directement in vitro des lymphocytes T de manière antigène spécifique. En effet, les exosomes sécrétés par les cellules dendritiques expriment des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et Il. Les complexes peptides/CMH fonctionnels portés par les exosomes seraient transférés d'une cellule dendritique à une autre qui n'a jamais vu l'antigène dont dérivent les peptides associés aux molécules du CMH. En stimulant de proche en proche les cellules dendritiques naïves, les exosomes sécrétés et présentant à leur surface un peptide antigénique contribueraient à l'amplification de la réponse T CD4 et T CD8 spécifique (Delcayre et Le Pecq, 2006). Par exemple, chargés avec des peptides tumoraux et injectés à des souris, ces exosomes sont capables de promouvoir une forte réponse immunitaire et de faire régresser des tumeurs solides pré-établies (Zitvogel et al., 1998). Les exosomes sont capables de présenter des antigènes exogènes soit sous la forme de protéines entières natives, soit sous la forme de peptides associés aux molécules du CMH I et II (Colino et Snapper 2006). La présentation d'antigène à la surface d'exosomes est similaire à une présentation à la membrane d'une cellule ou d'un virus enveloppé. Toutefois, les exosomes n'étant ni vivants ni infectieux, ils présentent l'avantage de pouvoir être manipulés comme un produit ordinaire et sans précautions de confinement, contrairement à un virus. Les exosomes peuvent donc être utilisés comme présentateurs de peptides ou de polypeptides antigéniques à des fins d'immunisation. Cette technique clite � exosome display � ne requiert pas nécessairement la présentation directe de l'antigène par le CMH (Chaput et al., 2004). Néanmoins le développement de cette technique de vaccination inédite suppose de disposer d'un � outil � moléculaire efficace permettant le ciblage des protéines antigéniques sur les exosomes. Or, à ce jour, un tel � outil � n'a pas été décrit. L'étude des rétrovirus, et plus particulièrement du virus d'immunodéficience humaine (VIH), a révélé leur capacité à détourner la machinerie cellulaire de biogenèse des endosomes multivésiculaires afin de bourgeonner à la membrane plasmique (Pornillos et al., 2002). Ces virus peuvent également utiliser cette machinerie au niveau de la membrane endosomale, son site normal de fonctionnement. En effet, dans les macrophages, le VIH bourgeonne au niveau de la membrane des endosomes multivésiculaires, qui accumulent donc une importante quantité de particules virales (Raposo et al., 2002). Cette découverte, associée à l'étude comparative des exosomes et des particules de VIH a conduit à l'hypothèse des � exosomes chevaux de Troie � (Trojan Exosomes ; Gculd et al., 2003). Dans cette hypothèse, les virus utiliseraient la voie préexistante de biogenèse des exosomes, pour la formation de particules virales. Par ailleurs, le site d'assemblage des virus pourrait avoir une conséquence significative sur la pathogénicité et le développement de l'infection. Dans le cas du VIH, on sait actuellement que les macrophages infectés constituent un important réservoir infectieux. Ces cellules apparaissent, en effet, moins susceptibles à l'apoptose normalement induite par la présence de particules virales (Herbein et al., 2002) ; leur production virale est moins sensible aux drogues antivirales et les virus semblent capables de conserver leur pouvoir infectieux durant de longues périodes. Le fait que le VIH bourgeonne et s'accumule dans les endosomes multivésiculaires de ces cellules pourrait donc avoir d'importantes conséquences sur ce type d'infection. Les rétrovirus sont des virus enveloppés possédant un génome à ARN et dont le cycle de réplication est très particulier puisqu'il fait appel à une transcriptase inverse, qui transcrit le génome ARN viral en ADN bicaténaire, et une intégrase virale, permettant l'insertion de l'ADN double brin dans le génome de la cellule infectée. L'enveloppe des rétrovirus est constituée de la protéine d'enveloppe externe (SU), responsable de la liaison au récepteur de la cellule cible, et la glycoprotéine trans-membranaire (TM), responsable de la fusion entre les membranes virales et cellulaires. Les glycoprotéines d'enveloppe SU et TM sont issues du clivage de la protéine précurseur mature nommée ENV. L'expression du gène env aboutit à la synthèse des glycoprotéines d'enveloppe des rétrovirus, sous forme d'un précurseur protéique qui transite par le Golgi avant d'atteindre la portion de membrane (endosomale ou plasmique), qui servira d'enveloppe virale lors du bourgeonnement des virions. Lors de ce trajet, ce précurseur oligomérique est glycosylé et clivé en glycoprotéines de surface (SU) et transmembranaire (TM). Les protéines SU et TM demeurent associées et sont ancrées dans la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'une hélice hydrophobe transmembranaire de la protéine TM. Les glycoprotéines d'enveloppe (SU et TM) jouent un rôle majeur dans le cycle de multiplication rétrovirale. L'initiation de l'infection se fait par fixation et fusion de la particule virale à la membrane plasmique cellulaire. Cette fixation est engendrée par la liaison de SU à un récepteur spécifique présent sur la surface de la cellule cible. La glycoprotéine TM des rétrovirus présente de multiples facettes dues à l'association de ses domaines externe, transmembranaire et cytoplasmique (CDTM), qui en font la seule protéine des rétrovirus permettant une communication de part et d'autre des membranes du virus et de la cellule infectée (Cann et al., 1992; Delamarre et al., 1996). La protéine TM est impliquée dans le phénomène de pénétration du virus dans la cellule cible, en provoquant la fusion entre les membranes virales et cellulaires. Elle serait aussi impliquée dans la transmission des informations entre milieux extra et intracellulaire. II existe une dépendance structurelle mais aussi fonctionnelle entre les domaines interne et externe, qui se traduit par un transfert d'informations entre ces domaines. Ainsi, le domaine cytoplasmique peut moduler l'activité fusionnante de la protéine TM, activité pourtant portée par la région externe de la molécule. Dans d'autres cas, un signal externe peut être transduit via le CDTM pour déclencher une activation de la cellule. Ceci révèle que le CDTM interagit plus ou moins directement avec des protéines de la machinerie de transduction de signaux de la cellule. Lors de son cheminement intracellulaire, la protéine TM est susceptible d'influer sur le tri, le devenir, le ciblage et le bourgeonnement des particules virales, par interactions avec le cytosquelette, ainsi qu'avec les machineries d'ubiquitination et de bourgeonnement (Cann et al., 1992 ; Delamarre et al.,1996 ; Straub et Levy, 1999) Une étude antérieure suggère que le domaine cytoplasmique de la protéine TM de deux rétrovirus, le virus de la leucémie bovine (BLV, pour � Bovine Leukemia Virus �) et le VIH, permet d'induire l'adressage et la sécrétion d'une protéine recombinante dans les exosomes (De Gassart et al., 2004). Des cellules de la lignée K562 (une lignée cellulaire érythroleucémique d'origine humaine), qui sécrètent des exosomes de façon constitutive, ont été transfectées avec des vecteurs rétroviraux permettant d'exprimer, en système eucaryote, deux types de protéine chimère : (i) une chimère comportant le domaine extracellulaire de la protéine CD8 murine et les domaines transmembranaire et cytoplasmique de la glycoprotéine TM du BLV (chimère TM-BLV/CD8), et (ii) une chimère comportant les domaines extracellulaire et transmembranaire de la protéine CD8 murine et le domaine cytoplasmique de la protéine TM du \/IH (chimère TM-HIV/CD8). Les deux chimères sont exprimées à la fois dans les cellules K562 transfectées et dans les exosomes sécrétés par ces cellules. En particulier, l'expression de la protéine chimère TM-BLV/CD8 dans les cellules de la lignée K562 disparaît rapidement après transit dans le réseau trans-golgien et les compartiments endosomaux tardifs pour se retrouver dans les exosomes sécrétés par ces cellules. Il semble que la chimère comportant le domaine cytoplasmique de la protéine TM du BLV soit plus fortement adressée vers les exosomes que la chimère comportant le domaine cytoplasmique de la protéine TM du VIH. Cependant, comme le prouvent les résultats présentés dans la partie exemple de la présente demande, des exosomes portant la construction chimère TM-BL\//CD8 décrite par De Gassart et al. ne sont produits efficacement que dans les cellules de la lignée K562, et sont peu ou pas produits efficacement dans d'autres types cellulaires tels que les cellules de la lignée HEK293. L'invention concerne des polypeptides particuliers qui se distinguent notamment de ceux décrits dans l'art antérieur et, en particulier de ceux décrits dans De Gassart et al, en ce qu'ils permettent d'adresser de façon beaucoup plus efficace un peptide ou un polypeptide d'intérêt vers des exosomes produits par les cellules de la lignée HEK293 et ainsi, d'amplifier très fortement (de 10 à 100 fois) la production d'exosomes comportant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt. Par ailleurs, contrairement aux constructions décrites dans De Gassart et al, qui ne peuvent être utilisées efficacement que dans des cellules de la lignée K562, ces polypeptides peuvent être adressés à la membrane d'exosomes et sécrétés en association avec des vésicules membranaires, en particulier des exosomes produit(e)s par différents types cellulaires, en particulier des cellules HEK293 ou des lymphocytes T ou des lymphocytes B, et pas uniquement par des cellules de la lignée K562. Ainsi, la présente invention permet notamment de produire des quantités importantes de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, utilisables en immunisation et notamment en vaccination. De telles vésicules membranaires (notamment exosomes) pourraient également être produites in vivo par un hôte humain ou non humain (en particulier un mammifère humain ou non humain ou un oiseau), que l'on souhaite immuniser, et en particulier vacciner, en administrant, à cet hôte, une composition immunogène dont le principe actif est un polynucléotide codant pour un polypeptide de l'invention, en particulier une composition immunogène à base d'ADN, et plus particulièrement un vaccin à ADN, ou une composition immunogène dont le principe actif consiste en des vésicules membranaires (en particulier des exosomes) comportant un polypeptide de l'invention. Un premier objet de la présente invention est un polypeptide chimérique caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en les domaines suivants: - (i) un peptide ou polypeptide d'intérêt ; (ii) un domaine membranaire ayant la capacité de s'ancrer 5 dans la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire; et (iii) un domaine cytoplasmique (CD) d'une protéine membranaire, permettant, dans des cellules eucaryotes, l'adressage dudit polypeptide chimérique vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiment(s) 10 cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation des vésicules membranaires, et en particulier des vésicules formant les exosomes, ou un dérivé muté de ce domaine CD, ce dérivé muté étant défini par la substitution, la délétion et/ou l'insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine CD de référence et ce dérivé muté conservant la susdite capacité 15 d'adressage du domaine CD, le domaine CD ou son dérivé muté comprenant au moins un motif YxxL, dans lequel Y représente un résidu tyrosine, x représente un résidu quelconque et L représente un résidu leucine ; et étant entendu que lorsque le domaine CD et un domaine membranaire 20 dudit polypeptide chimérique sont dérivés d'une même protéine, alors au moins le domaine CD, son dérivé muté ou le domaine membranaire dérivé de la même protéine que le domaine CD est un dérivé muté par substitution et/ou délétion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine original. 25 Ledit polypeptide chimérique est en particulier capable d'être sécrété en association avec des vésicules membranaires, en particulier avec des exosomes, lorsqu'il est exprimé dans des cellules eucaryotes appropriées. L'invention concerne tout polypeptide chimérique dans lequel) il existe au moins un domaine membranaire positionné entre le peptide ou 30 polypeptide d'intérêt et le domaine CD ou son dérivé muté. Selon un mode de réalisation préféré, les domaines (i) à (iii) sont positionnés successivement dans l'ordre suivant, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale dans le polypeptide chimérique de l'invention: peptide ou polypeptide d'intérêt - domaine membranaire - domaine CD ou son dérivé muté. Alternativement, les domaines (i) à (iii) sont positionnés par exemple dans l'ordre suivant : domaine CD ou son dérivé muté - domaine membranaire - peptide ou polypeptide d'intérêt. Le terme � chimérique � désigne ici un polypeptide qui associe plusieurs domaines, d'au moins deux types différents par leur fonction et/ou par leur localisation cellulaire, au moins deux de ces domaines provenant de molécules distinctes, en particulier provenant soit de différentes protéines d'une même espèce ou d'espèces différentes soit d'une même protéine de différentes espèces. Par � domaine � d'une protéine ou d'un polypeptide on entend une région ayant une propriété fonctionnelle pour ladite protéine ou ledit polypeptide. Ainsi, le polypeptide chimérique de l'invention comporte au moins deux types différents de domaines qui sont définis par leur différence de localisation cellulaire, lorsqu'ils sont contenus clans la protéine chimérique: un ou plusieurs domaine(s) membranaire(s), et un domaine cytoplasmique particulier. Le polypeptide chimérique de l'invention comprend nécessairement au moins un domaine membranaire mais il peut en comprendre plusieurs ; le peptide ou polypeptide d'intérêt pouvant comporter zéro, un ou plusieurs domaines membranaires (voir ci-dessous), le polypeptide chimérique de l'invention comporte un ou plusieurs domaines membranaires. Lorsque ledit polypeptide chimérique ne comporte qu'un seul domaine membranaire, celui-ci peut être ou non dérivé de la même entité, en particulier de la même protéine que le peptide ou polypeptide d'intérêt du polypeptide chimérique de l'invention. Un polypeptide chimérique de l'invention peut être le produit d'expression d'un polynucléotide recombinant et peut être exprimé par voie recombinante dans une cellule hôte. Ledit polypeptide chimérique est donc par exemple un polypeptide de fusion. L'expression � vésicule membranaire � désigne au sens de la présente demande toute vésicule composée d'une bicouche lipidique renfermant une fraction cytosolique telle que produite par des cellules eucaryotes. Cette expression inclut notamment les vésicules sécrétées dans l'espace extracellulaire, c'est-à-dire les exosomes. Par �exosomes �, on entend, dans la présente demande, nanovésicules des membranes cellulaires telles que définies ci-dessus. Ces exosomes peuvent être purifiés à partir des surnageants de culture de cellules par centrifugation différentielle, par ultra-filtration ou par adsorption sur un support: ou par tout autre procédé, comme illustré dans les exemples. L'expression � sécrété en association avec des vésicules membranaires, en particulier avec des exosomes � signifie, dans la présente demande, qu'un polypeptide chimérique de l'invention et/ou au moins un de ses produits de dégradation est sécrété dans l'espace extracellulaire, non pas sous forme soluble, mais sous une forme ancrée dans la membrane des vésicules membranaires, en particulier des exosomes. Cet ancrage se fait par l'intermédiaire du ou des domaine(s) membranaire(s) dudit polypeptide chimérique ou du domaine membranaire d'une molécule du CMH (de classe I ou II) à laquelle un produit de dégradation dudit polypeptide chimérique est associé. Dans un polypeptide ainsi ancré dans la membrane d'une vésicule membranaire (en particulier d'un exosome), le peptide ou un polypeptide d'intérêt peut se trouver exposé (en totalité ou en partie) à l'extérieur de ladite vésicule membranaire, inclus (en totalité ou en partie) dans la membrane de ladite vésicule membranaire (c'est le cas lorsque ledit polypeptide ou peptide d'intérêt comporte un ou plusieurs domaines membranaires) et/ou inclus (en totalité ou en partie) dans la fraction cytosolique de ladite vésicule membranaire. La sécrétion d'un peptide ou d'un polypeptide en association avec des vésicules membranaires (en partciulier des exosomes) requiert notamment (1) l'adressage dudit peptide ou d'un polypeptide au(x) lieu(x) de formation des vésicules membranaires et en particulier des exosomes, et (2) le bourgeonnement vésiculaire à partir de la membrane dans laquelle ledit peptide ou polypeptide est ancré. Le terme � adressage � encore appelé � tri �, � aiguillage � ou � routage intracellulaire � fait référence, dans la présente demande, au processus qui permet à un polypeptide, dont la synthèse débute dans le cytosol, d'atteindre les compartiments impliqués dans le bourgeonnement de vésicules rnembranaires, en particulier des vésicules formant les exosomes et/ou d'atteindre les vésicules membranaires, en particulier les vésicules formant les exosomes. L'adressage d'un peptide ou d'un polypeptide au(x) lieu(x) de formation des vésicules membranaires et en particulier au(x) lieu(x) de formation des exosomes peut nécessiter notamment que ledit peptide ou polypeptide comprenne un peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique, comme explicité ci-après, afin que ledit peptide ou polypeptide puisse être inséré dans une membrane cellulaire, la fonction d'ancrage dans la membrane étant assurée par le domaine membranaire. Le terme � sécrétion � désigne, dans le cadre de l'invention, le processus par lequel des vésicules membranaires, alors appelées � exosomes �, sont sécrétées, c'est-à-dire relarguées dans l'espace extracellulaire à partir d'une ou plusieurs cellule(s). Ce processus peut notamment se produire lorsque des endosomes multivésiculaires fusionnent avec la membrane plasmique d'une cellule, relarguant ainsi les vésicules membranaires qu'ils contiennent à l'extérieur de la cellule. Comme illustré dans les exemples ci-après, un test permettant de mettre en évidence les propriétés d'adressage et de sécrétion d'un polypeptide chimérique de l'invention consiste à vérifier que ledit polypeptide chimérique et/ou ses produits de dégradation se retrouvent bien associés avec des vésicules membranaires (en particulier des exosomes) lorsque ledit polypeptide est exprimé clans des cellules eucaryotes appropriées. Une cellule eucaryote � appropriée� est avantageusement une cellule eucaryote comportant des vésicules internes de sécrétion, cultivable, capable d'exocytose, modifiable génétiquement et, préférentiellement, dont les vésicules internes peuvent être sécrétées sous l'effet d'une stimulation externe. Il s'agit en particulier d'une cellule de mammifère et plus particulièrement d'une cellule d'origine humaine ou une cellule ayant pour origine un mammifère non humain. Il peut également s'agir de cultures primaires ou de lignées immortalisées.. De telles cellules eucaryotes � appropriées � incluent notamment les cellules eucaryotes naturellement capables de produire des exosomes, en particulier les mastocytes, lymphocytes T et B et les cellules dendritiques (par exemple les cellules de Langerhans) ou des cellules dérivées de ces types cellulaires, ainsi que les cellules eucaryotes ou les lignées cellulaires eucaryotes modifiées par génie génétique de façon à les rendre capables de sécréter des exosomes. Le terme � résidu �, tel qu'utilisé dans la présente demande fait référence à un résidu d'acide aminé. Ces résidus sont indiqués en utilisant le code abrégé à une lettre (par exemple, Y pour un résidu tyrosine, L pour un résidu leucine et P pour un résidu proline). Le terme � bicouche lipidique �, désigne la structure de base de la membrane plasmique et de toute membrane biologique, c'est-à-dire tout assemblage de lipides amphiphile en un double feuillet (ou double couche) séparant une cellule ou une vésicule de son environnement et délimitant le cytoplasme d'une cellulaire ou d'une vésicule, ou délimitant les organites à l'intérieur du cytoplasme. Ce terme englobe donc toute membrane de la cellule, c'est-à-dire à la fois la membrane plasmique et les membranes des différents compartiments intracellulaires, en particulier celles du réticulum endoplasmique, celles de l'appareil de Golgi, ou encore celle des vésicules membranaires, par exemple celle des exosomes ou des endosomes. Un � domaine membranaire �, désigne, dans la présente demande, tout domaine capable d'interagir avec une bicouche lipidique et en particulier capable de s'ancrer - et ainsi ancrer un polypeptide le comprenant - dans une bicouche lipidique et en particulier dans une membrane cellulaire et dans la membrane d'un exosome. Ce domaine membranaire doit être capable de se lier d'une part à un premier domaine (par exemple un peptide ou un polypeptide d'intérêt) et d'autre part à un deuxième domaine (par exemple un domaine cytoplasrnique). Il peut par exemple comporter 10 à 50 résidus, de préférence 15 à 40 résidus et plus préférablement :20 à 30 résidus. Selon un mode de réalisation particulier, ledit domaine membranaire est un domaine transmembranaire, c'est-à-dire un domaine membranaire traversant entièrement la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire. Un domaine transmembranaire est généralement agencé en hélice a hydrophobes, les protéines transmembranaires à traversées multiples pouvant contenir plusieurs, en particulier 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 ou 10, voire 20 ou plus de 20 hélices a hydrophobes. Il peut également être agencé en feuillet (3. Un ou plusieurs domaines transmembranaires peuvent également adopter une structure en tonneau 13 transmembranaire, généralement composée de 8 à 22 brins R. Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit domaine membranaire peut ne pas traverser entièrement la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire. C'est par exemple le cas du domaine membranaire une protéine membranaire en contact avec un seul des compartiments définis par ladite membrane. Ledit domaine membranaire peut alors être par exemple une hélice hydrophobe parallèle au plan de la membrane ou une boucle hydrophobe. Ledit domaine membranaire peut être dérivé d'une ou de plusieurs 30 protéine(s) membranaire(s), en particulier d'une ou plusieurs protéine(s) transmembranaire(s). Par � protéine membranaire � on entend toute chaîne polypeptidique comportant un ou plusieurs domaine(s) membranaire(s) tel(s) que défini(s) ci-dessus. L'expression � protéine transmembranaire � telle qu'utilisée dans la présente demande désigne toute chaîne polypeptidique qui traverse au moins une fois entièrement une membrane cellulaire, en particulier la membrane plasmique d'une cellule. Cette protéine, qui est en contact avec les deux compartiments définis par la membrane cellulaire qu'elle traverse (par exemple avec l'espace extracellulaire et le cytosol) comporte donc trois types de domaines, chacun en contact avec un environnement de composition différente (par exemple, lorsque la membrane cellulaire traversée est la membrane plasmique), le(s) ectodomaine(s) (ou domaine(s) extracellulaire(s)), le(s) domaine(s) transmembranaire(s), et le(s) domaine(s) cytoplasmique(s) sont respectivement en contact avec le milieu extracellulaire, les lipides de la membrane plasmique, et le cytosol). Selon un mode de réalisation particulier, la protéine transmembranaire traverse une fois une membrane cellulaire. Selon un autre mode de réalisation particulier, la protéine transmernbranaire traverse plusieurs fois, en particulier 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 ou 10 fois, voire 20 fois ou plus une membrane cellulaire. Lesdites protéines membranaires ou transmembranaires peuvent être notamment choisies parmi : des protéines humaines, des protéines d'un animal non humain, des protéines d'un organisme pathogène ou d"un agent pathogène, en particulier des protéines virales, bactériennes, ou des protéines exprimées par un parasite ou une cellule tumorale. Le ou au moins un des domaine(s) membranaire(s) du polypeptide chimérique de l'invention peut être en particulier celui d'une seule et même protéine membranaire ou être un dérivé muté de ce domaine. Ledit dérivé muté est défini par la substitution, la délétion et/ou l'iinsertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine membranaire de référence et conserve la capacité de ce domaine de référence à s'ancrer dans la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire. Ledit dérivé muté peut par exemple être obtenu en remplaçant une partie de la séquence du domaine de référence par une séquence dérivée du domaine membranaire d'une autre protéine membranaire. Le terme � issu d'une protéine particulière � indique, dans la présente demande que le peptide ou polypeptide d'intérêt comprend ou consiste en cette protéine particulière, ou en un fragment de ladite protéine particulière. Un � dérivé muté � d'un domaine membranaire ou cytoplasmique au sens de la présente demande fait référence à tout polypeptide ou peptide modifié par rapport au domaine membranaire ou cytoplasmique original ou de référence, sous réserve que ce dérivé muté conserve la fonction d'insertion, d'ancrage dans une bicouche lipidique normalement attachée au domaine membranaire de référence ou la capacité d'adressage normalement attachée au domaine cytoplasmique de référence. Un tel dérivé muté peut donc correspondre par exemple à un fragment composé de résidus contigus dudit domaine membranaire ou cytoplasmique (ce dérivé étant obtenu notamment par délétion et éventuellement substitution d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence originale) ou, au contraire à un polypeptide de taille plus importante que le domaine membranaire ou cytoplasmique original, en particulier un polypeptide comprenant le domaine membranaire ou cytoplasmique original (ce dérivé étant obtenu notamment par insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence originale). Le � dérivé muté du domaine membranaire � au sens de la présente demande diffère de la séquence originale du domaine membranaire par la substitution d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidu(s), consécutifs ou non, dans la séquence du domaine membranaire original, ces substitutions pouvant être conservatives, semi-conservatives ou non conservatives, et/ou par la délétion et/ou l'insertion d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidus, consécutifs ou non, dans la séquence du domaine original. La séquence dudit dérivé muté du domaine membranaire peut présenter au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec le domaine membranaire de la protéine rnembranaire dont elle dérive, par référence à la séquence complète dudit domaine membranaire. Par � pourcentage d'identité �, on entend, dans la présente demande, le nombre de résidus identiques rapporté au nombre total de résidus du peptide ou polypeptide étudié. Le � pourcentage de similarité �, défini le nombre de résidus identiques ou chimiquement similaires rapporté au nombre total de résidus du peptide ou polypeptide étudié. Le pourcentage d'identité ou de similarité est déterminé en alignant les deux séquences à comparer et en utilisant l'algorithme de Needleman et Wunsch, qui permet un alignement global entre deux séquences. Le pourcentage de similarité ou d'identité est alors calculé sur la totalité de la longueur de ces deux séquences. Par domaine cytoplasmique (CD), on entend, dans la présente demande, un domaine cytoplasmique particulier capable d'être adressé vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, ou vers le(s) compartiment(s) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation des vésicules membranaires, et en particulier des vésicules formant les exosomes dans des cellules eucaryotes; ce domaine peut ainsi être sécrété dans l'espace extracellulaire en association avec des exosomes, lorsqu'il est exprimé dans des cellules eucaryotes appropriées. Ainsi, ce domaine permet, lorsqu'il est intégré à un polypeptide chimérique comprenant un peptide ou un polypeptide d'intérêt, d'adresser ledit polypeptide chimérique vers les vésicules membranaires et/ou vers leurs(s) lieu(x) de formation et en particulier d'adresser ledit polypeptide chimérique à la membrane de vésicules membranaires, de façon à ce que ce ledit polypeptide puisse être sécrété en association avec des vésicules membranaires (en particulier des exosomes) par une cellule, en particulier une cellule eucaryote appropriée. Ce domaine CD comprend au moins un motif YxxL, dans lequel x représente un résidu quelconque. Il peut en particulier comprendre un, deux ou trois motifs YxxL. Alternativement ou de façon complémentaire, le domaine CD comprend au moins un motif équivalent à un motif YxxL, par exemple un motif YxxF. Par exemple, le récepteur de la transférine, qui est une protéine cellulaire, comporte un tel domaine. Ledit domaine CD peut en outre comprendre au moins un, en 10 particulier un, deux, trois ou quatre motif(s) PxxP, dans lequel x représente un résidu quelconque. Parmi les protéines ayant un domaine CD comportant au moins un motif YxxL, on trouve notamment des protéines cellulaires et des protéines virales. Ces protéines virales sont notamment des protéines de virus 15 enveloppés, en particulier les glycoprotéines TM de virus enveloppés tels que définis ci-dessus, ou des protéines d'herpèsvirus, par exemple la protéine LMP2-A, du virus d'Epstein-Barr qui comporte au moins deux motifs YxxL. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine CD est celui 20 d'une protéine TM d'un rétrovirus. Le terme � rétrovirus � couvre ici tout rétrovirus. Ce rétrovirus peut être notamment choisi parmi les deux sous-familles de rétrovirus suivantes, établies sur la base de critères de pathogénicité : - les Oncovirinae (Oncovirus), qui sont des virus transformants et qui 25 incluent notamment le BLV, qui induit, chez les bovins, une prolifération des cellules B pouvant engendrer une leucémie, et le virus de la leucémie-lymphome à cellules T (ou HTLV-1, pour human T cell leukemia virus) ; - les lentivirinae (Lentivirus), qui sont des virus cytopathogènes, et qui incluent notamment les virus de l'immunodéficience humaine VIH-1 et 30 VIH-2. A titre d'exemple, le domaine CD peut être celui d'une protéine TM d'un rétrovirus choisi parmi le virus de la leucémie bovine (BLV), un virus d'immunodéficience humaine (VIH), en particulier un VIH de type 1 ou un VIH de type 2, le virus de la leucémie-lymphome à cellules T (HTLV). en particulier le HTLV-1 ou le HTLV-2, et le virus de singe Mason-Pfizer (MPMV). Selon un mode de réalisation particulier, le domaine CD est celui de la protéine TM du BLV. Ce domaine CD du BLV, qui est composé de 58 résidus, a pour séquence SEQ ID NO.6. Le domaine (iii) du polypeptide chimérique de l'invention correspond alors soit au domaine de séquence SEQ ID NO.6, soit à un dérivé muté du domaine de séquence SEQ ID NO.6. Dans le cas particulier où le domaine (iii) comprend ou consiste en le domaine CD la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO.6, le(s) domaine(s) membranaire(s) dudit polypeptide chimérique de l'invention est(sont) dépourvu(s) du domaine membranaire de la protéine TM du BLV, qui a pour séquence SEQ ID NO.4. Un domaine membranaire du polypeptide chimérique de l'invention peut en revanche correspondre à un dérivé muté du domaine de séquence SEQ ID NO.4, ledit dérivé muté ne comprenant pas la séquence SEQ ID NO.4. Un tel dérivé muté peut être obtenu, par délétion et éventuellement substitution d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence SEQ ID NO.4, comme illustré dans les exemples. Le � dérivé muté du domaine CD � au sens de la présente demande comprend au moins un motif YxxL, dans lequel x représente un résidu quelconque. Il peut en particulier comprendre un, deux ou trois motif(s) YxxL. Ce dérivé muté peut en outre comprendre au moins un, en particulier un, deux, trois ou quatre motif(s) PxxP, dans lequel x représente un résidu quelconque. Ce dérivé muté diffère du domaine cytoplasmique original par la substitution d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidus, consécutifs ou non, dans la séquence du domaine cytoplasmique original, ces substitutions pouvant être conservatives, semi-conservatives ou non conservatives, et/ou par la délétion et/ou l'insertion d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidus, consécutifs ou non, dans la séquence du domaine cytoplasmique original. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine (iii) du polypeptide chimérique de l'invention, en particulier le dérivé muté du domaine CD, est dépourvu de la séquence KCLTSRLLKLLRQ. Ainsi, le dérivé muté du domaine CD peut différer du domaine CD original en ce que sa séquence est dépourvue de la séquence : KCLTSRLLKLLRQ. En outre, ou alternativement, la séquence du dérivé muté du domaine CD peut présenter au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec la séquence du domaine CD original dépourvue de l'enchaînement KCLTSRLLKLLRQ. Il peut également être préférable que le domaine (iii) du polypeptide chimérique de l'invention, et en particulier le dérivé muté du domaine CD soit dépourvu de la séquence PC et/ou de la séquence CP. Selon un mode de réalisation particulier, ledit domaine (iii), en particulier le dérivé muté du domaine CD est notamment dépourvu de la séquence PCP. Ainsi, si le domaine CD original contient une séquence PCP, son dérivé muté peut être obtenu notamment en délétant, dans la séquence du domaine CD original, le résidu cystéine de ladite séquence PCP, ou en le substituant par un autre résidu, de préférence par un résidu non palmitoylable, par exemple un résidu alanine. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine CD ou son dérivé est dépourvu à la fois de la séquence PCP et de l'enchaînement KCLTSRLLKLLRQ. Lorsque le ou un des domaine(s) membranaire(s) et cytoplasmique(s) dérivent d'une même protéine, notamment lorsqu'ils dérivent de la protéine TM du BLV, il peut être préférable d'utiliser, en tant que domaine (iii), un dérivé muté du domaine CD dépourvu de la séquence PCP et/ou dépourvu de la séquence KCLTSRLLKLLRQ. Dans le cas particulier où un des domaines membranaires du polypeptide chimérique de l'invention comprend ou consiste en le domaine transmembranaire de la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO.4, le domaine CD ou son dérivé muté est dépourvu du domaine CD de la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO.6. Le domaine CD ou son dérivé muté peut en revanche correspondre à, ou comprendre un dérivé muté du domaine de séquence SEQ ID NO.6. Comme illustré dans les exemples, un tel dérivé muté peut être obtenu, par exemple, en délétant des résidus situés dans la partie N-terminale de la séquence SEQ ID NO.6, en particulier en délétant la séquence KCLTSRLLKLLRQ et/ou en délétant la séquence POP dans la séquence SEQ ID NO.6, ou en substituant par exemple le résidu cystéine de la séquence PCP un autre résidu, de préférence par un résidu non palmitoylable, par exemple un résidu alanine. A titre d'exemple, le dérivé muté du domaine CD la protéine TM du BLV peut comprendre ou consister en la séquence SEQ ID NO.8, qui correspond à la séquence SEQ ID NO.6 dans laquelle les 13 résidus N-terminaux ont été délétés. A titre d'exemple également, la séquence du dérivé muté de la protéine TM du BLV peut différer de la séquence du domaine CD la protéine TM du BLV par la substitution d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidu(s), consécutifs ou non, et/ou par la délétion et/ou l'insertion d'au moins un résidu, de préférence un, deux, trois, quatre, cinq, voire plus de cinq résidu(s), consécutifs ou non dans la séquence dudit domaine correspondant à la séquence SEQ ID NO.8. Encore à titre d'exemple, la séquence du dérivé muté du domaine CD de la protéine TM du BLV (domaine CD de séquence SEQ ID NO.6) peut présenter au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO.8. La séquence dudit dérivé muté du domaine CD de séquence SEQ ID NO.6 est, de préférence, dépourvue de motif PC (proline û cystéine) et CP (cystéine - proline) et, plus préférablement dépourvue de motif PCP (proline -cystéine - proline). Par exemple, il peut comprendre ou consister en la séquence SEQ ID NO. 10 ou SEQ ID NO.12. Selon un mode de réalisation particulier, le dornaine CD ou son dérivé muté, en particulier le dérivé muté du domaine CD de séquence SEQ ID NO.6, comprend ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences suivantes: PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL; PxxPxäPxxPxnSxYxxLxäPxxPExnYxxLxr,PxxPDYxxL ; PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx ; et PxxPxnPxxPxäSxYxxLxäPxxPExnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx ; dans lesquelles x et xn représentent respectivement un résidu quelconque et un ou plusieurs résidu(s) quelconque(s). Selon un mode de réalisation particulier, ledit dérivé muté du domaine CD de séquence SEQ ID NO.6 comporte 6 à 100 résidus, en particulier 20 à 80, 30 à 70 ou 40 à 60, par exemple 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 résidus. Par � peptide ou polypeptide d'intérêt � on entend tout un enchaînement de plusieurs (au moins deux) résidus successifs, formant la structure d'un peptide ou d'un polypeptide. Un peptide désigne une chaîne de 2 à 20 résidus successifs (en particulier 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, '12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 résidus), en particulier une chaîne de 5 à 10, de 10 à 15 ou de 15 à 20 résidus successifs. Un polypeptide, qui désigne également une protéine ou un fragment d'une protéine, est un enchaînement de plus de 20 (au moins 21) résidus successifs, en particulier une chaîne de 21 à 1000 résidus successifs, de préférence de 21 à 500, 21 à 250 ou 21 à 150 résidus successifs, par exemple 21 à 50, 50 à 100, 100 à 150 résidus successifs. Ledit peptide ou polypeptide d'intérêt peut être en particulier comprendre ou consister en un ou plusieurs domaines d'une protéine soluble, membranaire, transmembranaire et/ou multimérique. Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt comprend ou consiste en un ou plusieurs domaine(s) d'une protéine extracellulaire ou un ou des fragment(s) d'un ou plusieurs de ce(s) domaine(s). Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt comprend ou consiste en un ou plusieurs ectodomaine(s) et/ou un ou plusieurs domaine(s) membranaire(s) et/ou un ou plusieurs domaines(s) cytoplasmique(s) d'une protéine membranaire, en particulier d'une protéine transmembranaire, ou un ou plusieurs fragment(s) d'un ou plusieurs de ce(s) domaine(s). Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt comprend ou consiste en un ou plusieurs domaine(s) d'une protéine cytosolique ou un ou des fragment(s) de ce(s) domaine(s). Par � fragment � d'un domaine on entend, dans la présente demande, une portion composée d'au moins 6 résidus contigus dudit domaine, et en particulier une portion présentant au moins 50%, de préférence au moins 60%, 70%, 80%, ou au moins 90%, voire 100% d'identité avec la séquence complète dudit domaine. Quoi qu'il en soit, un fragment est de taille inférieure à la taille de la protéine dont il dérive. Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt est antigénique, c'est-à-dire qu'il est capable d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre ledit peptide ou polypeptide d'intérêt. Ledit peptide ou polypeptide d'intérêt peut en particulier comprendre ou consister en un ou plusieurs épitope(s) d'une protéine. Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt provient d'un organisme pathogène, par exemple un virus, une bactérie ou un parasite, ou d'un agent pathogène, par exemple une cellule tumorale, une toxine.... Tout composant peptidique d'un tel organisme ou agent pathogène peut être utilisé, qu'il s'agisse ou non d'une protéine de structure. Ledit peptide ou polypeptide d'intérêt peut également provenir d'un antigène tumoral, d'un antigène cytoplasmique, d'une protéine transmembranaire, notamment d'une intégrine ou d'un co-récepteur ou d'une protéine intervenant dans des interactions (en particulier les protéines ICAM, CD4, CD8), d'un récepteur de ligand, notamment d'un récepteur à un seul domaine membranaire, par exemple un récepteur de cytokine (en particulier les récepteurs de la famille HER répondant à l'EGF), notamment d'un récepteur à multiples domaines membranaires, par exemple un récepteur à sept domaines transmembranaires (en particulier le récepteur CXR4 du VIH ou un récepteur de l'acide gamma amino butyrique (GAGA)), ou d'un ligand de récepteur, notamment d'une cytokine ou d'un fragment de ceux-ci. En fonction du type de peptide ou de polypeptide d'intérêt choisi, l'invention pourra être utilisée in vivo, notamment en immunisation, en particulier en vaccination, et/ou in vitro, par exemple pour cribler des molécules interagissant avec ledit peptide ou polypeptide d'intérêt (comme décrit ci-après). Selon un mode de réalisation particulier, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt provient d'une protéine présente à la surface d'un virus, par exemple une protéine responsable de la fixation d'une particule virale à un récepteur situé sur une cellule cible et/ou responsable de la fusion de l'enveloppe virale ou de la membrane plasmique d'une cellule infectée avec la membrane plasmique d'une cellule cible, ou un fragment d'une telle protéine. A titre d'exemple, on peut utiliser, en tant que domaine (i), une protéine de l'enveloppe d'un virus enveloppé ou un fragment de cette protéine. Ce virus enveloppé peut être notamment choisi parmi les familles suivantes : - les Poxviridae, en particulier ceux du genre Orthopoxvirus, qui comprend notamment le virus de la variole et le virus de la vaccine ; - les Herpesviridae, en particulier ceux du genre Herpesvirus, qui comprend notamment les Herpesvirus de types 1 et 2, le virus de la Varicelle, le virus d'Epstein Barr, le Cytomégalovirus, et les Herpesvirus de types 6, 7, 8 ; - les Hepadnaviridae, qui comprennent notamment le virus de l'hépatite B ; - les Orthomyxoviridae, en particulier ceux du genre virus influenza A, B ou C, qui comprend notamment le virus de la grippe aviaire H5N1 ; - les Paramyxoviridae, en particulier ceux du genre Paramyxovirus, qui comprend notamment les virus parainfluenzae et le virus des oreillons, ceux du genre Morbillivirus, qui comprend notamment les virus de la rougeole, et ceux du genre Pneumovirus, qui comprend notamment le virus respiratoire syncytial ; - les Rhabdoviridae, en particulier ceux du genre Lyssavirus, qui comprend notamment le virus de la rage ; - les Filoviridae, qui comprennent notamment le virus de Marburg et le virus Ebola ; - les Togaviridae, en particulier ceux du genre Flavivirus, qui comprend notamment le virus de la fièvre jaune et le virus de l'hépatite C (HCV), ceux du genre Alphavirus et ceux du genre Rubivirus, qui comprend notamment le virus de la rubéole ; - les Coronaviridae, en particulier ceux du genre Coronavirus, qui comprend notamment des virus responsables d'infections respiratoires et digestives telles que le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS); - les Arenaviridae, en particulier ceux du genre Arenavirus, qui comprend notamment le virus de Lassa ; - les Bunyaviridae, en particulier ceux du genre Bunyavirus, 25 Hantavirus, Phlebovirus ; et -les Retroviridae, en particulier ceux du genre Lentivirus qui comprend notamment les virus d'immunodéficience humaine (VIH). Encore à titre d'exemple, le peptide ou polypeptide d'intérêt peut être issu d'une protéine de l'enveloppe d'un virus de la grippe, en particulier de 30 l'hémagglutinine (HA) d'un virus de la grippe, et plus particulièrement de la protéine HA du virus de la grippe aviaire H5N1. Ce peut être l'ectodomaine de cette protéine ou un fragment de cet ectodomaine ou un fragment comprenant ou consistant en un ou plusieurs épitope(s) de cet ectodomaine. D'autres polypeptides antigéniques de ces virus peuvent naturellement être utilisés, tels que la protéine ou un fragment de la polyprotéine GAG du VIH, la protéine ou un fragment de capside du poliovirus ou d'un papillomavirus. A titre d'exemple également, le peptide ou polypeptide d'intérêt peut être issu d'une protéine de l'enveloppe externe de l'un de ces virus. Il peut s'agir de l'enveloppe de l'un de ces virus. Il peut s'agir de l'enveloppe d'un virus d'un coronavirus, en particulier de la protéine Spike d'un coronavirus, et plus particulièrement la protéine Spike d'un coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (coronavirus du SRAS ou SARS-CoV en anglais). Ce peptide ou polypeptide d'intérêt peut en particulier comprendre ou consister en l'ectodomaine de cette protéine ou un fragment comprenant ou consistant en un ou plusieurs épitope(s) de cet ectodomaine. Selon un mode de réalisation préféré, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt se trouve dans sa conformation native dans le polypeptide de l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique de l'invention comprend en outre au moins une molécule de liaison (ou linker). Le terme �linker � désigne tout élément permettant de lier deux domaines successifs. Celui-ci peut-être de longueur et de nature variable. Selon un mode de réalisation particulier, au moins deux domaines successifs du polypeptide de l'invention sont liés de façon covalente, par exemple par l'intermédiaire de liaisons peptidiques. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, ledit linker est un polypeptide ou un peptide. Ce linker polypeptidique peut consister en une séquence de 2 à 50 résidus, de préférence de 2 à 30 résidus, par exemple 2 à 5, 5 à 10, 10 à 20 ou 20 à 30 résidus successifs. Selon un mode de réalisation particulier, la séquence nucléotidique codant pour ledit linker comprend ou consiste en un site de restriction. Par � site de restriction �, on entend une séquence nucléotidique particulière reconnue par une enzyme de restriction de type II comme un site de coupure dans la molécule d'ADN. Ainsi, ce linker peut-être, par exemple, le linker de séquence RSR, codé par la séquence nucléotidique AGGTCTAGA, qui comprend le site de restriction de l'enzyme de restriction Xbal (séquence TCTAGA). Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique 10 de l'invention comporte un (ou plusieurs) peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique. Par � peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique�, on entend une petite séquence polypeptidique continue d'environ 5 à environ 60 résidus, en particulier de 15 à 60 résidus et plus 15 particulièrement de 15 à 30 résidus, qui permet le passage d'une protéine le comportant à travers la membrane du réticulum endoplasmique, le passage de la protéine pouvant être complet ou être partiel, l'arrêt du passage de la protéine dépendant de la présence d'un autre signal (ou d'autres signaux) additionnel(s). Les peptides signaux pour une même 20 destination étant interchangeables d'une protéine à une autre, tout peptide signal permettant l'adressage d'une protéine au réticulum endoplasmique peut- être utilisé dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemple, on peut utiliser en tant que peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique un peptide de 27 25 résidus de séquence SEQ ID NO.:2. A titre d'exemple également, on pourrait également utiliser en tant que peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique le peptide signal d'une protéine membranaire telle que les protéines CD4, CD8 et hémagglutinine (HA), le peptide signal d'un récepteur de cytokine 30 tel que IL1 R1, EGFR1 (HER1), HER2, HER3 ou HER4, ou encore, le peptide signal d'une protéine sécrétée, par exemple, celui d'une cytokine. Ainsi, on peut utiliser un peptide signal choisi parmi : celui de la protéine CD4 humaine (peptide de séquence SEQ ID NO.:49) ou CD4 de souris (peptide de séquence SEQ ID NO.:50), celui de la protéine CD8 alpha de souris (peptide de séquence SEQ ID NO.:51), CD8 alpha bovine (peptide de séquence SEQ ID NO.:52), CD8 alpha humaine (peptide de séquence SEQ ID NO.:53), ou CD8 alpha de rat (peptide de séquence SEQ ID NO.:54), celui des récepteurs ILI RI humain (peptide de séquence SEQ ID NO.:55), EGFR1 (HER1) humain (peptide de séquence SEQ ID NO.:56), HER2 humain (peptide de séquence SEQ ID NO.:57), HER3 humain (peptide de séquence SEQ ID NO.:58) ou HER4 humain (peptide de séquence SEQ ID NO.:59), ou celui des cytokines IL-2 de souris (peptide de séquence SEQ ID NO.:60), IL-6 de souris (peptide de séquence SEQ ID NO.:61), IL-7 humaine (peptide de séquence SEQ ID NO.:62), IL-10 de souris (peptide de séquence SEQ ID NO.:63), ou MIP-1-alpha chimiokine humaine (peptide de séquence SEQ ID NO.:64), celui del' hémagglutinine du virus Influenza B (peptide de séquence SEQ ID NO.:65), celui de l' hémagglutinine des virus Influenza A H1 NI (peptide de séquence SEQ ID NO.:66), Influenza A H2N2 (peptide de séquence SEQ ID NO.:67), Influenza A H3N2 (peptide de séquence SEQ ID NO.:68), Influenza A H4N6 (peptide de séquence SEQ ID NO.:69), Influenza A H5N1 (peptide de séquence SEQ ID NO.:70), Influenza A H6N5 (peptide de séquence SEQ ID NO.:71),, Influenza A H7N7 (peptide de séquence SEQ ID NO.:72), Influenza A H8N4 (peptide de séquence SEQ ID NO.:73), Influenza A H9N2 (peptide de séquence SEQ ID NO.:74), Influenza A H1ON7 (peptide de séquence SEQ ID NO.:75), Influenza A H11 N6 (peptide de séquence SEQ ID NO.:76), Influenza A H12N5 (peptide de séquence SEQ ID NO.:77), ou Influenza A H13N6 (peptide de séquence SEQ ID NO.:78). Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique peut faire partie du peptide ou polypeptide d'intérêt du polypeptide chimérique de l'invention. C'est par exemple le cas lorsque ledit peptide ou polypeptide d'intérêt est une protéine membranaire ou une cytokine. Indépenclamment ou en combinaison avec le mode de réalisation ci-dessus, ledit peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique peut faire partie d'un des domaines membranaires du polypeptide chimérique de l'invention. Cela peut être par exemple le cas lorsque le domaine membranaire ou un des domaines membranaires dudit polypeptide est dérivé d'un récepteur à sept domaines transmembranaires ; il est en effet connu dans l'état de la technique que pour certains récepteurs à sept domaines transmembranaires tels que le récepteur CXCR4, le domaine transmembranaire en position N-terminale fait office de signal d'importation dans le réticulum endoplasmique. Ne pas mettre ça car on le fait parfois pour augmenter le ciblage membranaire Alternativement, selon un autre mode de réalisation, ledit peptide signal d'importation ne fait partie d'aucun des trois domaines (i), (ii) et (iii), et est, par conséquent, ajouté en plus des trois domaines (i), (ii) et (iii) dudit polypeptide chirérique. II peut alors être placé à différentes localisations dans la séquence linéaire du polypeptide chimérique de l'invention, mais se trouve généralement à une extrémité dudit polypeptide et est de préférence en position N-terminale dans ledit polypeptide. Si un deuxième peptide signal d'importation clans le réticulum endoplasmique est ajouté dans le polypeptide chimérique de l'invention, il permet le cas échéant d'augmenter le ciblage membranaire. Sous une forme mature, en particulier lorsqu'il est ancré dans la membrane d'une vésicule membranaire, par exemple d'un exosome, le polypeptide chimérique de l'invention ne comporte généralement pas ou plus de peptide signal N- ou C- terminal d'importation dans le réticulum endoplasmique; après qu'il a rempli sa fonction, le peptide signal N- ou C-terminal peut être est séparé du polypeptide par un clivage protéolytique, par exemple dans le réticulum endoplasmique ou dans le Golgi. Selon un mode de réalisation préféré, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt se trouve dans sa conformation native dans le polypeptide de l'invention. Selon un mode de réalisation particulier, ledit polypeptide chimérique est multimérique et en particulier est sous la forme d'un dimère ou d'un trimère. Ceci peut être le cas, en particulier, lorsque le peptide ou le polypeptide d'intérêt provient d'une protéine qui, sous sa forme native, se dimérise ou se trimérise. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique comprend en outre une séquence tag, qui permet de le purifier. Par exemple, ladite séquence tag peut comprendre ou consister en une pluralité de résidus histidine liés consécutivement, ein particulier une séquence de 6 résidus histidine consécutifs. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique comprend en outre un marqueur permettant de détecter le polypeptide chimérique par ELISA ou en Western Blot. De préférence, ledit marqueur est un épitope reconnu par un anticorps monoclonal spécifique, par exemple un épitope myc. La présente invention a également pour objet un polypeptide permettant la sécrétion d'un peptide ou polypeptide d'intérêt auquel il est associé, en association avec des vésicules membranaires (en particulier des exosomes) lorsqu'il est exprimé dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en un dérivé muté du domaine CD de la protéine TM d'un rétrovirus, ce dérivé muté étant défini par la substitution, la délétion et/ou l'insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine CD de référence et comprenant au moins un motif YxxL, dans lequel Y représente un résidu tyrosine, x représente un résidu quelconque et L représente un résidu leucine et ce dérivé muté conservant la capacité dudit domaine CD à adresser un peptide ou polypeptide d'intérêt vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiment(s) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation des vésicules membranaires, et en particulier des vésicules formant les exosomes. Les définitions données ci-dessus dans le cadre du polypeptide chimérique de l'invention s'appliquent également par analogie à ce 5 polypeptide. Selon un mode de réalisation particulier, ledit dérivé muté est un dérivé muté du domaine CD de la protéine TM du BLV (domaine CD de séquence SEQ ID NO. :6). Ce dérivé muté est tel que défini dans les différents aspects de la présente invention concernant le polypeptide 10 chimérique. Ainsi, ledit dérivé muté, qui est généralement dépourvu de séquence KCLTSRLLKLLRQ et/ou dépourvu de peptide PCP, peut comprendre ou consister en une séquences choisie parmi les séquences suivantes: PxxPExxxPxKPDxDYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxx:LR ; 15 PxxPExäPxKPDxnDYxxLxäPxxPEXnYxxLxä PxxPDYxxLR ; PxxPExxxPxKPDxDYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLRxxxx et Pxx P Exn PxKP Dxn DYxxLxn PxxP EXnYxxLxn PxxP DYxxL Rxxxx, dans lesquelles x et xn représentent respectivement un résidu quelconque et un ou plusieurs résidu (s) quelconque(s). 20 De préférence, le dérivé muté du polypeptide de l'invention a pour séquence SEQ ID NO. 8 ou présente au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO. 8 par référence à la séquence SEQ ID NO. 8 complète. Par exemple, la séquence dudit dérivé muté peut comprendre ou consister en 25 la séquence SEQ ID NO.10 ou SEQ ID NO.12. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide de l'invention est en outre associé ou fusionné à un peptide ou un polypeptide d'intérêt. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide chimérique de l'invention ou d'un polypeptide de l'invention tels 30 que définis ci-dessus, pour adresser un peptide ou polypeptide d'intérêt vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiment(s) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation des vésicules membranaires, et en particulier des vésicules formant les exosomes, et pour permettre ainsi la sécrétion, par des cellules eucaryotes appropriées, dudit peptide ou polypeptide d'intérêt en association avec lesdites vésicules membranaires. La présente invention a également pour objet une vésicule membranaire, et plus précisément un exosome, qui comporte un polypeptide chimérique ou un polypeptide de l'invention tels que définis ci-dessus, et/ou un ou plusieurs produit(s) de dégradation dudit polypeptide chimérique ou dudit polypeptide, ce(s) produit(s) de dégradation étant le cas échéant associé(s) à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de type I et/ou de type II. Le polypeptide chimérique ou le polypeptide de l'invention et/ou leur(s) produit(s) de dégradation est(sont) ancré(s) dans la membrane de ladite vésicule rnembranaire par l'intermédiaire de leur ou d'un de leur(s) domaine(s) membranaire(s) ou par l'intermédiaire du domaine membranaire de la molécule du CMH (de classe I ou II) à laquelle il est(sont) associé(s). Selon un mode de réalisation particulier, ledit produit de dégradation comprend ou consiste en un fragment du peptide ou polypeptide d'intérêt, en particulier en un fragment comprenant ou consistant en un ou plusieurs épitope(s) dudit peptide ou polypeptide d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide ou le polypeptide d'intérêt ou un de ses fragments est exposé, en partie ou en totalité, à la surface, à l'extérieur de la vésicule membranaire. Ainsi, cette vésicule membranaire peut être utilisée notamment pour produire ou sélectionner in vivo ou in vitro des cellules procaryotes ou eucaryotes ou des virus (par exemple des phages) ou des ribosomes interagissant directement ou indirectement avec ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ou leur fragment. Cette vésicule membranaire peut aussi être utilisée pour produire in vivo ou in vitro des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, vaccinants ou non vaccinants, dirigés contre ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ou leur fragment. De tels anticorps peuvent être utilisés notamment en diagnostic ou pour étudier des interactions protéiques, en particulier pour réaliser des criblages à haut débit de molécules telles que des drogues ou des cytokines capables d'interagir avec le peptide ou le polypeptide d'intérêt ou leur fragment. En outre, cette vésicule membranaire peut être utilisée in vivo, en immunisation, pour éliciter ou favoriser, chez un hôte (humain ou non humain), une réponse humorale et/ou cellulaire contre une tumeur, ou contre le virus, la bactérie ou le parasite dont le peptide ou le polypeptide d'intérêt dérive. Selon un mode de réalisation préféré, ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ou son fragment est exposé (en partie ou en totalité) dans sa conformation native à la surface de la vésicule membranaire. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide ou le polypeptide d'intérêt ou son fragment est inclus en partie ou en totalité dans la membrane de la vésicule membranaire de l'invention, et/ou inclus en partie ou en totalité dans la fraction cytosolique de ladite vésicule membranaire. Une composition pharmaceutique ou une composition immunogène, dont le principe actif comprend une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s), en particulier un ou plusieurs exosome(s) tel(s) que défini(s) dans la présente demande ou encore un ou plusieurs polypeptide(s) chimérique(s) de l'invention, un ou plusieurs polypeptide(s) de l'invention tels que définis ci-dessus fait également partie de l'invention. Ladite composition comprend en outre un ou plusieurs véhicule(s), diluant(s), et/ou adjuvant(s) ou une de leurs combinaisons. Dans le cas d'une administration injectable, on peut notamment choisir une formulation dans une solution aqueuse, non aqueuse ou isotonique. Le terme � véhicule � désigne, dans la présente demande, tout support (c'est-à-dire tout ce qui peut transporter au moins un principe actif) qui n'altère pas l'efficacité de l'activité biologique des substances actives de l'invention. De nombreux véhicules sont connus dans l'état de la technique. Les véhicules utilisés peuvent être, par exemple, de l'eau, une solution saline, de l'albumine sérique, une solution Ringer, le polyéthylène glycol, des solvants miscibles dans l'eau, des sucres, des lieurs, des excipients, des pigments, des huiles végétales ou minérales, des polymères solubles dans l'eau, des agents tensioactifs, des agents épaississants ou gélifiants, des agents cosmétiques, des agents de solubilisation, des agents de stabilisation, des agents conservateurs, des agents alcalinisants ou acidifiants ou une de leurs combinaisons. Le terme � diluant � signifie, dans la présente demande, un agent de dilution, et inclut les diluants solubles et les diluants insolubles. On utilise généralement un diluant insoluble quand le principe actif est soluble et un diluant soluble quand le principe actif est insoluble. Un principe actif � insoluble � peut être totalement insoluble en milieu aqueux ou avoir une solubilité limitée (c'est à dire une solubilité inférieure à 110mg/ml dans 250 ml d'eau à un pl-I de 1.0 à 7.5) en milieu aqueux. Des exemples de diluants insolubles incluent la cellulose microcristalline, la cellulose microcristalline silicifiée, l'hydroxyméthylcellulose, le phosphate de dicalcium, le carbonate de calcium, le sulfate de calcium, le carbonate de magnésium, le phosphate de tricalcium, etc. Des exemples de diluants solubles incluent le mannitol, le glucose, le sorbitol, le maltose, les dextrates, les dextrines, le dextrose, etc. Le terme � adjuvant � désigne, dans la présente demande, un produit qui, ajouté au contenu à une composition immunogène, en particulier à un vaccin, accroît l'intensité de la réaction irmunitaire induite chez l'hôte (humain ou non humain) auquel ladite composition est administrée. Un adjuvant peut notamment accroître la quantité d'anticorps spécifiques que ledit mammifère est capable de produire après l'administration de ladite composition et accroît donc l'efficacité de la l'immunisation. Les adjuvants sont notamment utiles quand l'antigène utilisé seul ne provoque qu'une réaction immunitaire trop faible pour procurer une bonne protection, pour réduire la quantité d'antigène à administrer à un hôte, ou encore pour faciliter certains modes d'administration de ladite composition, par exemple dans le cas d'une administration au niveau des muqueuses. Les adjuvants susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention sont en particulier des saponines, du phosphate d'aluminium (alum), des peptidoglycanes, des carbohydrates, des peptides, par exemple le muramyl dipeptide (N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, MDP), des émulsions huile/eau, des polysaccharides, des cytokines, des hormones, l'hémocyanine de patelle, des adjuvants de la famille des dinucléotides CpG non méthylés, des adjuvants de la famille des poly IC, des adjuvants de la famille du monophosphoryl lipide A et des acides nucléiques, en particulier des ADN bactériens ou des ADN codant pour une protéine ayant un effet adjuvant, par exemple un facteur de croissance ou une cytokine, plus particulièrement le GM-CSF ou l'IL4. Selon un mode de réalisation préféré, ledit ou lesdits véhicule(s), diluant(s), et/ou adjuvant(s) ou leur combinaison sont des substances ou une combinaison de substances pharmaceutiquement acceptables, c'est à dire appropriée(s) pour une administration à un hôte (par exemple un humain, un mammifère non humain ou un oiseau) à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. Une telle substance ou combinaison de substance est donc préférentiellement non toxique pour l'hôte auquel elle est administrée. La présente invention a également pour objet un polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide chimérique ou pour un polypeptide selon la présente invention, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code. Le terme � polynucléotide � couvre toute molécule d'ADN ou d'ARN (mono ou bicaténaire). Ce polynucléotide peut être nu ou, alternativement, il peut être inséré dans un vecteur de clonage ou d'expression, de préférence un vecteur approprié pour l'expression dans des cellules eucaryotes. Ce vecteur est, de préférence un plasmide. Ledit polynucléotide peut être notamment assemblé par PCR. Il comporte de préférence 2000 à 50000 nucléotides. Le terme � code � ne signifie pas nécessairement que ledit polynucléotide ne comprend que la partie codante. Ledit polynucléotide peut en effet comprendre en outre des séquences de régulation de l'expression et notamment comprendre un promoteur eucaryote A titre d'exemple, ledit polynucléotide comprend en tant que séquence codant pour le domaine (iii) du polypeptide chimérique de l'invention une séquence comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO. 9 et SEQ ID NO. 11. Selon un mode de réalisation préféré, ledit polynucléotide comprend une séquence codant pour un signal d'importation dans le réticulum endoplasmique. Par exemple, cette séquence peut être la séquence SEQ ID NO.:1 ou une séquence codant pour un peptide de :séquence SEQ ID NO.:49 à SEQ ID NO.:78. Comme indiqué précédemment, le peptide signal codé par cette séquence, lorsqu'il se trouve en position N- ou C-terminale dans le polypeptide codé par ledit polypeptide, peut être clivé lors d'une étape de maturation du polypeptide chimérique, qui a généralement lieu dans le réticulum endoplasmique ou dans le Golgi. Ledit polynucléotide peut être placé sous le contrôle d'éléments de 20 régulation, de clonage ou d'expression. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, ledit polynucléotide est inséré dans un vecteur de clonage ou d'expression, de préférence un vecteur d'expression et plus préférablement un vecteur approprié pour l'expression dans des cellules eucaryotes. Ledit vecteur est de préférence 25 un plasmide. Ledit polynucléotide est en général placé sous le contrôle d'un promoteur eucaryote, de préférence un promoteur eucaryote fort tel qu"un promoteur viral, par exemple le promoteur d'un virus choisi parmi : le virus SV40, le virus du sarcome de Rous, le virus des leucémies murines 30 (MuLV), le virus des leucémies à cellules T de l'homme adulte (HTLV-I), le virus de la leucémie bovine (BLV), le cytomégalovirus, un promoteur hybride dérivé de ces promoteurs viraux ou un promoteur viral contenant des séquences modifiées. Ledit polynucléotide peut en outre comporter une séquence kozak, en particulier Ila séquence nucléotidique ACCATGG, dans laquelle la séquence ATG correspond au codon d'initiation de la séquence codante. Par ailleurs, ledit polynucléotide peut en outre comporter un intron. Selon un mode de réalisation particulier, ledit polynucléotide comprend au moins un linker nucléotidique codant pour un linker polypeptidique tel que défini ci-dessus. Ce linker nucléotidique peut en particulier comprendre ou consister en un site de restriction. Par � site de restriction �, on entend une séquence nucléotidique particulière reconnue par une enzyme de restriction de type Il comme un site de coupure dans le polynucléotide. A titre d'exemple, ce linker nucléotidique peut consister en la séquence nucléotidique AGGTCTAGA, qui comprend le site de restriction de l'enzyme de restriction Xbal (séquence TCTAGA). Selon un mode de réalisation particulier, la séquence dudit polynucléotide est optimisée pour une utilisation chez un hôte, en particulier un être humain, un mammifère non humain et/ou un oiseau. La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage ou d'expression, qui est, de préférence un plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend un insert polynucléotidique constitué par un polynucléotide de l'invention, sous le contrôle d'éléments de régulation, de clonage ou d'expression. L'invention a également pour objet une culture cellulaire sélectionnée parmi le groupe comprenant les cultures cellulaires de bactéries, les cultures cellulaires primaires de cellules eucaryotes animales et les lignées cellulaires, ladite culture cellulaire contenant un polynucléotide de l'invention, un vecteur de clonage ou d'expression de l'invention, ou un polypeptide chimérique de l'invention. La présente invention a également pour objet une composition immunogène comprenant un acide nucléique, en particulier un ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en un polynucléotide de l'invention, et un support, un diluant ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition 5 immunogène comprend en outre un adjuvant tel que défini dans la présente demande. Selon un mode de réalisation particulier, ledit acide nucléique est un ADN. Les compositions immunogènes à base d'ADN ciblent in vivo des cellules de l'hôte à immuniser, en particulier les cellules dendritiques 10 (notamment les cellules de Langerhans), qui sont d'excellents producteurs d'exosomes vaccinants. Ainsi, cette composition immunogène peut permettre d'induire la production, par les propres cellules d'un hôte immunisé avec ladite composition immunogène, d'exosomes porteurs du peptide ou du polypeptide d'intérêt ou d'un fragment de celui-ci. 15 Selon un mode de réalisation particulier, ladite composition immunogène est un vaccin, en particulier un vaccin à ADN. La présente invention a également pour objet une cellule recombinante productrice d'exosomes, en particulier une cellule du système immunitaire et plus particulièrement une cellule du système 20 immunitaire choisie parmi les mastocytes, les lymphocytes, en particulier les lymphocytes B et T, et les cellules dendritiques, en particulier les cellules de Langerhans, caractérisée en ce qu'elle est recombinée avec un ou plusieurs polynucléotide(s) de l'invention, un vecteur de clonage ou d'expression de l'invention ou qu'elle a absorbé une vésicule membranaire 25 de l'invention. En outre, la présente invention concerne également un polypeptide chimérique de l'invention, un polypeptide de l'invention, une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention (en particulier un ou plusieurs exosome(s) de l'invention), un polynucléotide de l'invention ou une 30 composition immunogène de l'invention pour une utilisation comme médicament, en particulier pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une infection bactérienne, virale, parasitaire, ou d'une tumeur. Ils sont notamment destinés à une utilisation en immunisation, en particulier pour éliciter ou favoriser (c'est-à-dire notamment amplifier) in vivo, chez un hôte (humain ou non humain) une réponse humorale et/ou cellulaire contre la tumeur, le virus, la bactérie ou le parasite dont le peptide ou polypeptide d'intérêt dérive. Ils peuvent être notamment utilisés in vivo pour éliciter ou amplifier une réponse T CD4 et/ou T CD8 spécifique dirigée contre le peptide ou le polypeptide d'intérêt et/ ou pour produire des anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux dirigés contre le peptide ou le polypeptide d'intérêt. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide de l'invention (en particulier un polypeptide chimérique de l'invention), d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention (en particulier un ou plusieurs exosome(s) de l'invention), d'un polynucléotide de l'invention ou d'une composition immunogène de l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prophylaxie et/ou au traitement d'une tumeur ou d'une infection par un organisme pathogène ou par un agent pathogène, notamment une infection bactérienne, virale ou parasitaire. Suite à 'administration d'une composition immunogène, dont le principe actif est un polynucléotide de l'invention ou une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention, à un hôte (humain ou non humain), les cellules productrices d'exosomes de cet hôte, en particulier les cellules dendritiques, vont produire des exosomes, comportant un polypeptide chimérique ou un polypeptide de l'invention et/ou un produit de dégradation de ces derniers polypeptides, ce produit de dégradation pouvant s'associer naturellement à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité. Ces vésicules membranaires, en particulier celles sur la surface desquelles le peptide ou le polypeptide d'intérêt ou un fragment est exposé (en partie ou en totalité) vont permettre d'éliciter ou favoriser une réponse immune dirigée contre le peptide ou le polypeptide d'intérêt. Un � hôte � au sens de la présente demande désigne un humain ou un animal non humain. Le terme � animal non humain � tel qu'utilisé dans la présente demande inclut tout mammifère non humain, notamment un rongeur (en particulier une souris, un rat, un hamster ou un lapin), un singe, un camélidé, un chat, un chien, un cheval, un mulet, un bovin, un ovin, un porcin, et inclut également un oiseau, en particulier un poulet. L'expression � infection � telle qu'utilisée dans la présente demande signifie que ledit hôte (humain ou non humain) a été exposé à un organisme pathogène ou un agent pathogène en particulier à un virus enveloppé tel que défini dans la présente demande. En particulier une telle infection est capable d'évoluer vers des signes cliniques de pathologies induites ou accompagnant ladite infection. Le terme � infection � englobe donc également tout signe clinique, symptôme ou maladie apparaissant chez un hôte (humain ou non humain) suite à son exposition à un organisme pathogène ou un agent pathogène. Par exemple, une � infection virale � ou une � infection bactérienne � au sens de la présente demande inclut à la fois les phases les plus précoces de la contamination virale, bactérienne ou parasitaire, les phases intermédiaires, et les phases les plus tardives de la contamination, ainsi que les pathologies diverses qui sont la conséquence de la contamination d'un hôte par un virus, par des bactéries ou par un parasite, il inclut aussi la présence de tout ou partie de génome d'un organisme pathogène. Le terme � prophylaxie � désigne tout degré de retardement dans le moment d'apparition de signes cliniques ou de symptômes de l'infection ou de l'apparition d'une tumeur, ainsi que tout degré d'inhibition de la sévérité des signes cliniques ou symptômes de l'infection ou de la tumeur, y compris, mais sans limitation à, la prévention totale de l'infection ou d'un cancer. Ceci nécessite que les polypeptides de l'invention, le polynucléotide de l'invention, les vésicules membranaires ou les compositions irnmunogènes de l'invention soit administrés à l'hôte susceptible d'être exposé à un organisme pathogène ou un agent pathogène et/ou susceptible de développer une tumeur avant l'apparition de tout signe clinique ou symptôme de la maladie. L'administration prophylactique peut avoir lieu avant que ledit hôte ne soit exposé à l'organisme ou à l'agent pathogène responsable de l'infection, ou au moment de l'exposition. Une telle administration prophylactique sert à empêcher, et/ou réduire la sévérité de n'importe quelle infection subséquente. La prophylaxie au sens de la présente demande couvre également la prévention totale d'une infection ou d'un cancer. Par � traitement �, on entend l'effet thérapeutique que produisent sur un hôte le polypeptide chimérique, le polypeptide, le polynucléotide, les vésicules membranaires ou une des compositions immunogènes de l'invention lorsqu'ils sont administrés audit hôte au moment de l'exposition à un organisme ou un agent pathogène, après l'exposition ou après l'apparition de signes cliniques ou de symptômes de l'infection ou après l'apparition d'une tumeur. Lorsque les substances actives de l'invention sont administrées à un hôte après la contamination par un virus, ils peuvent être administrés pendant la phase de primo-infection, pendant la phase asymptomatique ou encore après l'apparition de signes cliniques ou de symptômes de la maladie. Le terme � traitement � inclut tout effet curatif obtenu grâce à une substance active de l'invention, ainsi que l'amélioration des signes cliniques ou des symptômes observés chez l'hôte (humain ou non humain), de même que l'amélioration de la condition de l'hôte. Ainsi, le terme � traitement � couvre notamment le ralentissement, la diminution, l'interruption, ainsi que l'arrêt d'une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou de la croissance de la tumeur et/ou des conséquences néfastes de l'infection ou de l'apparition de la tumeur; un traitement n'exige pas nécessairement l'élimination complète de tous les signes cliniques de l'infection ou de la tumeur et de tous les symptômes de la maladie, ni même l'élimination complète du virus, des bactéries, des parasites ou des cellules tumorales. Les substances actives de l'invention peuvent donc être administrées à un hôte qui présente des risques d'être exposé à un organisme ou un agent pathogène et de développer une infection ou une tumeur (prophylaxie) ou après l'exposition de l'hôte à un organisme ou un agent pathogène, en particulier après la manifestation des premiers signes cliniques ou symptômes de la maladie, par exemple après que des protéines ou anticorps spécifiques d'un virus, de bactéries, de parasites ou d'une tumeur ont été détectés dans le sang de l'hôte (traitement). L'invention a également pour objet une méthode pour prévenir et/ou traiter une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou une tumeur, ladite méthode comprenant au moins une étape d'administration in vivo, à un hôte le nécessitant, du polypeptide chimérique ou du polypeptide de l'invention, d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention (en particulier un ou plusieurs exosome(s) de l'invention), d'un polynucléotide de l'invention ou d'une composition immunogène de l'invention. Ladite méthode de traitement est, en particulier, appropriée pour et destinée à éliciter ou favoriser, in vivo, chez ledit hôte, une réponse humorale et/ou cellulaire contre la tumeur, le virus, la bactérie ou le parasite dont le peptide ou polypeptide d'intérêt dérive. Les termes � administration � et � administrer � tels qu'utilisés dans la présente demande incluent toute administration, quelle que soit la voie d'administration choisie. Les voies d'administration et les posologies varient en fonction d'une variété de paramètres, par exemple en fonction de l'état de l'hôte, du type d'infection et de la sévérité de l'infection à traiter ou de l'importance de la tumeur. Le polypeptide chimérique ou le polypeptide de l'invention, de même qu'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention (en particulier un ou plusieurs exosome(s) de l'invention), le polynucléotide de l'invention ou une composition immunogène de l'invention sont susceptibles d'être 41 administrés à un hôte humain ou non humain sous forme sèche, solide (en particulier cachet, poudre, gélule, pilule, granule, suppositoire, capsule polymère ou comprimé, et plus précisément comprimé à libération accélérée, comprimé gastrorésistant ou comprimé à libération prolongée), sous forme gélatineuse ou sous la forme d'une solution ou d'une suspension liquide (en particulier sirop, solution injectable, infusible ou buvable, nébulisats, microvésicules, liposomes) ou sous la forme de patch. Ces composés peuvent également se présenter sous la forme de doses sous forme sèche (poudre, lyophilisat, etc.) à reconstituer au moment de l'utilisation en utilisant un diluant approprié. Par ailleurs, ils peuvent être conditionnés pour une administration sous la forme d'une dose unique (monodose) ou multiple (multidose). Afin d'augmenter les effets bénéfiques des compositions immunogènes de l'invention, il est en effet envisageable de procéder à une administration sous la forme de plusieurs administrations successives, répétées à une ou plusieurs occasions, après un intervalle de temps particulier. Ils peuvent en outre être administrés avec un second agent thérapeutique, en particulier un agent antiviral, antibactérien, antiparasitaire ou antitumoral. Dans le cadre d'une utilisation en vaccination, il peut également être préférable d'immuniser un hôte, dans un premier temps avec une composition imrnunogène à base d'un polynucléotide de l'invention, en particulier avec un vaccin à ADN de l'invention, puis, dans un deuxième temps, avec les vésicules membranaires de l'invention, une composition immunogène à base desdites vésicules ou une composition immunogène dont le principe actif est un polypeptide de l'invention, un polypeptide chimérique de l'invention ou un ou plusieurs fragment(s) de ceux-ci (ledit polypeptide, polypeptide chimérique ou leur(s) fragment(s) pouvant être obtenus notamment par purification ou par synthèse chimique). Alternativement, il peut également être préférable d'immuniser un hôte, dans un premier temps avec les vésicules membranaires de l'invention ou une composition immunogène à base desdites vésicules, puis, dans un deuxième temps, avec une composition immunogène à base d'un polynucléotide de l'invention, en particulier avec un vaccin à ADN de l'invention. Les substances actives de l'invention peuvent être formulées pour une administration par voie entérale, parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée), transcutanée (ou transdermique ou percutanée), cutanée, orale, mucosale, en particulier transmuqueusebuccale, nasale, ophtalmique, otologique (dans l'oreille)ä vaginale, rectale, ou encore les voies intragastrique, intracardiaque, intrapéritonéale, intrapulmonaire ou intratrachéale. Les compositions immunogènes à base d'un polynucléotide de l'invention et en particulier les vaccins à ADN de l'invention sont de préférence administré(e)s à un hôte par voie intramusculaire ou sous- cutanée, en utilisant soit une aiguille et une seringue, soit un injecteur dépourvu d'aiguille, en particulier un pistolet à air comprimé capable de propulser, à l'intérieur de cellules d'un hôte, des microbilles d'or, de tungstène ou de platine chargées d'ADN (pistolet � biolistique � ou pistolet à gène), par exemple le pistolet � Helios� Gene Gun Sys'tem� de la société BioRad. La quantité de principe actif administrée à un hôte humain ou non humain est une quantité thérapeutiquement efficace, c'est-à-dire une quantité active, suffisante, à des posologies et pendant des périodes de temps nécessaires, pour obtenir un effet significatif et en particulier apporter un bénéfice significatif à l'hôte dans le cadre d'une administration pour la prophylaxie ou le traitement tel que défini dans la présente demande. Une quantité thérapeutiquement efficace est également une quantité pour laquelle les effets bénéfiques l'emportent sur un quelconque effet toxique ou néfaste du ou des principe(s) actif(s). Une telle quantité peut correspondre à une quantité suffisante pour inhiber la réplication virale, la prolifération bactérienne ou la croissance d'une tumeur de façon significative ou pour faire disparaître, réduire, ou améliorer toute infection existante provoquée l'agent ou l'organisme pathogène. La quantité thérapeutiquement efficace varie en fonction de facteurs tels que l'état d'infection, l'âge, le sexe ou le poids de l'hôte. Les régimes posologiques peuvent être ajustés de façon à obtenir un effet thérapeutique optimum. La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention in vivo de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'administration d'un polypeptide de l'invention (en particulier un polypeptide chimérique de l'invention), d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention (en particulier un ou plusieurs exosome(s) de l'invention), d'un polynucléotide de l'invention ou d'une composition immunogène de l'invention, à un hôte (humain ou non humain). Ce procédé peut être notamment mis en oeuvre dans le cadre d'une méthode pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une tumeur ou d'une infection par un organisme pathogène ou par un agent pathogène, notamment une infection bactérienne, virale ou parasitaire. La présente invention concerne en outre un procédé de production in vitro de vésicules membranaires et en particulier d'exosomes comportant un peptide ou un polypeptide d'intérêt et/ou un produit de dégradation de ce peptide ou un polypeptide d'intérêt, ce produit de dégradation pouvant le cas échéant s'associer à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité. Ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l'introduction, dans une cellule productrice d'exosomes, d'un ou plusieurs polynucléotide(s) de l'invention, qui code(nt) pour un polypeptide comprenant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt, ou la mise en contact d'une cellule productrice d'exosomes avec une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention, qui comporte(nt) un polypeptide comprenant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt et/ou un produit de dégradation de ce polypeptide, ou avec une composition à base de telles vésicules; b) la culture de ladite cellule productrice d'exosomes; c) la récupération des vésicules membranaires et en particulier des exosomes produit(e)s par ladite cellule productrice d'exosomes. Selon un mode de réalisation particulier, la cellule productrice d'exosomes est une cellule de la lignée HEK293, ou une lignée dérivée, ou une cellule du système immunitaire. En particulier, la cellule du système immunitaire peut être choisie parmi les mastocytes, les lymphocytes, en particulier les lymphocytes T et B, et les cellules dendritiques. La cellule du système immunitaire est de préférence une cellule dendritique, par exemple une cellule de Langerhans. Selon un mode de réalisation particulier, l'étape a) consiste en la mise en contact d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention, en particulier d'un ou plusieurs exosome(s) de l'invention, avec une cellule denclritique. Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé comprend en outre une étape intermédiaire entre les étapes a) et b), au cours de laquelle la cellule est sélectionnée et/ou stimulée pour induire et/ou augmenter la sécrétion des exosomes ou pour obtenir des exosomes présentant des qualités définies, en particulier pour induire une spécificité dans la composition des exosomes en certaines protéines cellulaires, par exemple la protéine ICAM. Selon un mode de réalisation particulier, l'introduction, d'un ou plusieurs polynucléotide(s) de l'invention dans une cellule productrice d'exosomes à l'étape a) est réalisée par transfection ou par transduction. Selon un mode de réalisation particulier, l'étape c) est réalisée en purifiant les vésicules membranaires et en particulier les exosomes à partir du surnageant de culture de la cellule productrice d'exosomes par centrifugation différentielle, par ultrafiltration, par adsorption sur un support, ou par tout autre procédé. Les vésicules membranaires et en particulier les exosomes obtenus par ce procédé font également partie de l'invention. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention, ou d'une composition immunogène à base de vésicule(s) membranaire(s) de l'invention pour produire des d'anticorps dirigés contre le peptide ou polypeptide d'intérêt, ces anticorps étant destinés à une utilisation en diagnostic ou en recherche. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un sérum polyclonal dirigé contre un ou plusieurs peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt exprimé(s) à la surface de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'administration, le cas échéant répétée, à un animal non humain, de vésicules membranaires de l'invention, d'une composition immunogène de l'invention ou d'un polynucléotide de l'invention, associés ou non à un adjuvant; et b) la récupération des anticorps formés, capables de reconnaître le ou les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. Selon un mode de réalisation particulier, l'étape a) est suivie d'une étape de sacrifice de l'animal non humain. La présente invention a également pour objet cieux procédés de préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre un ou plusieurs peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) exprimé(s) à la surface de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes. Le premier procédé comprend les étapes suivantes: a) la fusion, avec des cellules de myélome, de cellules spléniques préalablement obtenues chez un hôte (humain ou non humain), par exemple une souris Balb/c, auquel on a administré des vésicules membranaires de l'invention, une composition immunogène de l'invention ou un polynucléotide de l'invention, le cas échéant en association avec un adjuvant et le cas échéant par administration répétée; b) la culture et la sélection des hybridomes dans des conditions permettant la production d'anticorps; c) la récupération des anticorps monoclonaux dirigés contre les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. Le deuxième procédé de préparation d'anticorps monoclonaux comprend les étapes suivantes: a) l'immortalisation de cellules productrices d'anticorps par exemple des lymphocytes ou des lymphoblastes, à partir de cellules hématopoïétiques, plus particulièrement de cellules du sang, préalablement obtenues chez un hôte (humain ou non humain), par exemple une souris Balb/c, auquel on a administré des vésicules membranaires de l'invention une composition immunogène de l'invention ou un polynucléotide de l'invention, le cas échéant en association avec un adjuvant et le cas échéant par administration répétée; b) la culture et la sélection des cellules immortalisées dans des conditions permettant la production d'anticorps; c) la récupération des anticorps monoclonaux dirigés contre les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. L'immortalisation des cellules productrices d'anticorps à l'étape a) peut être réalisée notamment par infection de ces cellules avec un virus immortalisant. Ce virus immortalisant peut être un virus herpétique, par exemple le virus d'Epstein-Barr. Cette immortalisation peut également être effectuée par modification du génome des cellules productrices d'anticorps avec un composant immortalisant. Ce composant immortalisant peut être un composant viral, par exemple d'un virus herpétique, ou un gène cellulaire, par exemple le gène de la télomérase. L'animal non humain auquel on a administré des vésicules membranaires, une composition immunogène ou un polynucléotide de l'invention dans le cadre du procédé de préparation d'un sérum polyclonal ou des procédés de préparation d'anticorps monoclonaux peut être notamment un rongeur (en particulier une souris, par exemple une souris Balb/c, un rat, un hamster ou un lapin), un oiseau, en particulier un poulet, ou un mulet. Selon un mode de réalisation particulier des deux procédés de préparation d'anticorps monoclonaux de l'invention, les cellules spléniques ou les cellules productrices d'anticorps de l'étape a) ont été préalablement obtenues chez un hôte non humain après une étape de sacrifice dudit animal non humain. Si nécessaire, les anticorps monoclonaux ou polyclonaux produits par les procédés de préparation d'anticorps de l'invention peuvent être "humanisés", c'est-à-dire modifiés par génie génétique de façon remplacer au maximum les fragments constants Fc de l'espèce d'origine par des fragments humains. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide chirnérique de l'invention, d'un polypeptide de l'invention, d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) de l'invention ou d'une composition immunogène de l'invention, pour la détection de partenaires spécifiques capables d'interagir avec ledit peptide ou un polypeptide d'intérêt ou avec un fragment dudit peptide ou un polypeptide d'intérêt. La présente demande a également pour objet un procédé de criblage in vitro de molécules ou un procédé de sélection de cellules productrices de molécules interagissant avec un peptide ou un polypeptide d'intérêt ou avec un fragment dudit peptide ou un polypeptide d'intérêt, ledit procédé comprenant : a) la mise en contact de vésicules membranaires de l'invention avec une ou plusieurs molécules susceptibles d'interagir avec ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ; b) la détection d'une éventuelle interaction entre ledit peptide ou 25 polypeptide d'intérêt ou un fragment dudit peptide ou polypeptide d'intérêt et ladite ou lesdites molécules. Les interactions entre ledit peptide ou polypeptide d'intérêt et un éventuel partenaire peuvent être mises en évidence in vitro par toute technique permettant de démontrer des interactions protéiques et en 30 particulier entre une protéine et son ligand, par exemple, par des expériences de coimmunoprécipitation, par exemple par ELISA, par exemple par cytofluorimétrie en flux, par exemple par électrophorèse PAGE-SDS ou par transfert de type �Western� (Western Blot), ainsi que par toute technique de criblage à haut débit permettant de démontrer des interactions protéiques et en particulier entre une protéine et son ligand, par exemple des techniques mesurant des modifications en inositol phosphates, ou en cAMP, ou en calcium, ou des transferts d'énergie (par exemple technique FRET ou BRET) entre molécules ou entre deux domaines de molécules Enfin, la présente invention a également pour objet un kit comprenant un polynucléotide de l'invention et une notice d'utilisation. D'autres caractéristiques et avantages de la présente l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1 : Représentation des différents types de constructions CD8-CDTM étudiées. Construction X2 (séquence SEQ ID NO.79 et SEQ ID NO.80): l'ectodomaine (ED) de CD8 est fusionné avec les domaines transmembranaires (tmD) et cytoplasmique (CD) de la protéine TM du BLV. Cette construction conserve les deux sites de palmitoylation Cys 1 et Cys 2 ainsi que le résidu cystéine régulateur non palmitoylable (Cys 3) de la protéine TM du BLV. Construction X3 (séquence SEQ ID NO.81 et SEQ ID NO.82): ED et une portion de tmD de CD8 sont fusionnés avec une portion tmD du BLV et la totalité de CDTM BLV. TmD du BLV est alors amputée de ses 15 premiers résidus. Cette construction conserve les deux sites de palmitoylation (les résidus cystéine en positions 153 et 158) ainsi que le résidu cystéine régulateur non palmitoylable (le résidu cystéine en position C-terminale ; Cys 3) de la protéine TM du BLV. Construction X4 (séquence SEQ ID NO.83 à SEQ ID NO.86): La majeure partie de CDTM BLV est conservée. Dans cette construction, le domaine transmembranaire du CD8 alpha de souris est lié par un linker de séquence "RSR" au domaine CD de la protéine TM du BLV. Cette construction ne comporte que le résidu cystéine régulateur non palmitoylable (Cys 3) de la protéine TM du BLV. Figure 2 : Récapitulatif des séquences des protéines chimères obtenues à partir de la protéine CD8 alpha de souris et de la protéine TM du BLV. Les résidus soulignés correspondent aux résidus des hélices transmembranaires des protéines CD8 alpha et TM. Les trois résidus cystéine de la protéine TM du BLV qui ont fait l'objet d'une mutation (substitution par un résidu alanine) sont indiqués par Cl, C2 et C3. Les protéines chimères crées correspondent aux constructions X2 (séquence SEQ ID NO.79 et SEQ ID NO.80), X3 (séquence SEQ ID NO.81 et SEQ ID NO.82) et X4 (séquence SEQ ID N0.83 à SEQ ID N0.86). Figure 3 : Préparations des ADN par la méthode STET. Les chiffres 1 à 7 correspondent aux numéros des échantillons des produits STET. � M � représente le marqueur de taille. Les bandes correspondant à l'ADN plasmidique super enroulé sont encadrées. Figure 4: Contrôle de la présence des ADN dans les produits de purification sur colonne. Les bandes correspondant à I"ADN plasmidique super enroulé sont encadrées. A : ADN obtenu par la méthode STET et déposé sur colonne. E et E' : Fractions retenues sur la colonne puis éluées. FT : Fraction non retenue. M : Marqueur de taille. Figure 5: Dosages spectrométriques des aliquotes et ajustement des concentrations des ADN après digestion enzymatique. La double flèche indique que les concentrations ont été réajustées.30 Figure 6 : Contrôle de l'identité des ADN après digestion enzymatique.-Discriminations des mutants de CD8-CDTM. A : discrimination des mutants pX2 AAC et pX2 CCA. B : discrimination des mutants X2 entre eux. Figure 7: Analyse par Western Blot de l'expression des différentes chimères CD8-CDTM. La chimère CD8-CDTM est indiquée par une flèche. Figure 8: Analyse par Western Blot de l'expression des différentes chimères CD8-CDTM après immunoprécipitation. La chimère CD8-CDTM est indiquée par une flèche. Figure 9 : Analyse par Western Blot de l'expression de CD8-CDTM dans les exosomes isolés par ultracentrifugation. Le signal à 55 kDa correspond à la présence de CD8-CDTM. Figure 10: Analyse par Western Blot du contenu en CD8-CDTM des vésicules isolées après sédimentation sur gradient de densité de sucrose, pour les mutants pX4 --C et pX4 --A. 20 Figure 11 : Analyse par Western Blot de l'expression de CD8-CDTM après lyse cellulaire, selon la présence ou non d'inhibiteurs de transport vésiculaire. La chimère CD8-CDTM est indiquée par une flèche. Figure 12 : Analyse par Western Blot de l'expression de CD8-CDTM au 25 sein des exosornes, selon la présence ou non d'inhibiteurs de transport vésiculaire. La chimère CD8-CDTM est indiquée par une flèche. Figure 13: Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des phénotypes généraux û Phénotype A - Cellules HEK293 transfectées avec 30 pX2 CAC. Ce phénotype est retrouvé chez les mutants pX2 conservant la Cys 3 : pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC et pX2 AAC. (Voir partie résultats,15 � localisation par immunofluorescence) Figure 14: Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des phénotypes généraux - Phénotype B - Cellules transfectées avec pX2 CAA. Ce phénotype est retrouvé chez les mutants pX2 ne conservant pas la Cys 3 : pX2 CCA, pX2 ACA, pX2 CAA et pX2 AAA. (Voir partie résultats, � localisation par immunofluorescence) Figure 15 : Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des phénotypes généraux - Phénotype C - Cellules transfectées avec pX3 CCC. Ce phénotype est retrouvé chez les deux mutants pX3 étudiés : pX3 CCC et pX3 ACC. (Voir partie résultats, � localisation par immunofluorescence) Figure 16: Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des phénotypes généraux - Phénotype D - Cellules transfectées avec pX4 --C. Ce phénotype est retrouvé chez les deux mutants pX4 étudiés : pX4 --C et pX4 --A. (Voir partie résultats, � localisation par immunofluorescence) Figure 17: Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des phénotypes généraux - Phénotype E - Cellules transfectées avec pX4 stp. Ce phénotype est retrouvé uniquement chez pX4 stp. (Voir partie résultats, � localisation par immunofluorescence) Figure 18: Analyse par imagerie d'immunofluorescence confocale des zones périnucléaires présentant un fort signal FITC. Cellules transfectées avec pX3 CCC.30 EXEMPLES MATERIEL ET METHODES 1. Préparations des ADN plasmidiques : A. Transformation de bactéries : Des bactéries compétentes DH5a (200p1) sont transformées par choc thermique avec 12,5 ng de chacun des 13 ADN étudiés codant pour les CDTM sauvages ou mutants du virus BLV, ainsi que par un plasmide dépourvu d'insert (pLPCX) faisant office de témoin négatif. Les bactéries sont ensuite étalées sur un milieu LB/Agar contenant 50pg/ml d'ampicilline, à 37°C pendant 16h. Elles sont ensuite conservées à 4°C. A. Pré-culture et culture de bactéries : Une colonie de chaque type de bactéries est ensuite mise en pré-culture dans 3 ml de milieu LB contenant 100 pg/ml d'ampicilline, à 37 °C sous agitation, pendant environ 8 h. Chaque pré-culture servira à inoculer, au 1/200, deux flacons contenant chacun 250 ml de LB/Amp (100 pg/ml). L'incubation se fait à 37 °C, sous agitation, pendant 12 à 16 h. B. Maxipréparation STET : Les cultures obtenues sont centrifugées (GR 412, Jouan) 20 min à une vitesse de 3600 rpm et à une température de 4 °C. Les culots sont repris dans 25 ml de tampon STET (Sucrose 8 %, Triton X100 5%, Tris HCI pH 8 50 mM, EDTA 50 mM) auquel on ajoute 500pI de lysozyme (10 mg/ml ; Sigma) et 250 pl de RNase (2 mg/ml ; Sigma). Les tubes sont alors incubés 10 min à 100 °C puis centrifugés à 16000 rpm pendant 30 min. Les surnageants obtenus sont incubés 45 min à 65 °C en présence de l mg!ml de protéinase K (Amresco). Les surnageants sont prélevés et l'ADN est précipité avec 0,15 volume d'acétate de sodium (AcNa) 3 M pH 6 et 0,6 volume d'isopropanol. Les solutions sont centrifugées (Aventi 30, Beckman) à 4 °C pendant 15 min à 15000 rpm. Les culots obtenus sont lavés avec 10 ml d'Ethanol avant d'être de nouveau centrifugés selon les paramètres précédents. Les acides nucléiques obtenus sont ensuite séchés et repris dans 2 ml de TE 1X et conservés à 4 °C. La présence d'ADN super-enroulé est vérifiée, pour chaque produit de Maxipréparation, par électrophorèse de 0,2 pl et 1 pl des produits par 10 électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 %. C. Purification sur colonne : Les maxipréparations STET permettent l'obtention de quantités importantes de plasmides, mais dont le degré de pureté peut être amélioré. 15 Pour cela nous avons purifié chacun des 14 plasmides en réalisant un double passage sur colonnes AX100 (Kit Nucleobond PC 100, Macherey Nagel). Après précipitation à l'isopropanol, les plasmides purifiés obtenus sont repris dans 500 pl de TE1X et conservé à 4 °C. La présence d'ADN super-enroulé est ensuite vérifiée par 20 électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 %) pour chaque éluat obtenu ainsi que pour la fraction non-retenue sur les colonnes (FT=flow-trough). La concentration en ADN des solutions obtenues est évaluée par spectrophotométrie, à une longueur d'onde de 260 nm. 25 D. Aliquotage et précipitation à l'EtOH : On aliquote chaque type d'ADN par tubes de 50 ou 100 pg, puis on réalise une précipitation avec de l'ethanol (EtOH) et NaCl, sous hotte a flux laminaire, afin de stériliser les plasmides. Les culots obtenus sont repris à raison de 200 pl de TE1X pour 100 pg de plasmides, soit une concentration 30 de 500 ng/pl. La présence d'ADN dans les aliquotes est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8 %. E. Dosages spectrophotométriques des aliquotes obtenus : Les aliquotes sont dosés par spectrophotométrie à une longueur 5 d'onde de 260 nm. Les échantillons sont dilués au 1/50 et sont dosés dans un volume final de 500 pI. F. Digestions enzymatiques : L'identité de chaque plasmide est contrôlée par digestion de 20 ng 10 de chacun d'eux par des enzymes de restriction (New England Biolabs): le couple Hind III/Not I, Xba I, Aat II, Pac I, Sfo I. Les plasmides sont discriminés selon le nombre de bandes obtenus et leur poids moléculaire, après électrophorèse sur gel d'agarose (0,8 %) de chaque produit de digestions. 15 Il. Analyse de l'expression des chimères A. Culture cellulaire : 20 Les cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney cells, cellules embryonnaires de rein humain) sont cultivées dans un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), complémenté par 10 % de sérum de veau foetal (SVF) et 20 pg/ml de gentamicine, à 37 °C sous 5 % de CO2. 25 A. Transfection : En vue des transfections, on ensemence 5.105 celllules dans 2 ml de milieu par puits de 9,6 cm2 (plaques 6 puits). Après incubation une nuit à 37 °C sous 5% de CO2,le milieu est remplacé par du DMEM complet sans antibiotiques. 30 Les cellules sont alors transfectées par un polyplexe formé par la complexation, dans un tampon NaCI (0,15 M), de 6 pl de Jet PEI (Qbiogen) et 3 pg de chaque acide nucléique à tester; Un plasmide exprimant LacZ fait office de témoin positif pour la transfection. Après 24 h d'incubation à 37 °C sous 5 % de CO2, le milieu est éliminé et remplacé par du DMEM complet avec 20 pg/ml de gentamicine. L'expression optimum des plasmides est obtenue 48 h après le début de la transfection. Dans certains cas, afin d'analyser l'importance du transport vésiculaire dans la dégradation et le ciblage de CDTM, nous avons utilisé des inhibiteurs de transport vésiculaire qui sont la bafilomycine et Ly 294002. 32 h après transfection, chaque inhibiteur est ajouté au milieu de culture à une concentration de 0,5 pM pour la bafilomycine et 10 pM pour Ly 294002. B. Extraction protéique : 48 h après transfection les cellules sont lysées par un tampon TNE- NP40 0,5% auquel on ajoute 0,1 mM de PMSF. Après clarification par centrifugation (14000 rpm, 15 min, 4 °C ; Eppendorf 5417R), les lysats sont dosés par spectrophotométrie (à 595 nm) selon la technique de Bradford. Pour chaque échantillon, on prélève 200 pg de protéines que l'on complète par du tampon de lyse pour un volume finale de 30 pl auquel on rajoute 10 pl de tampon d'échantillon 4X (CB 4X : NaOH 200 mM, EDTA 20 mM, SDS 2%, Vert de bromocrésol 0,05%, Glycérol 10%). C. Préparation des exosomes : Avant lyse des cellules, les milieux de cultures sont récupérés et précentrifugés à 10000 rpm pendant 20 min à une température de 4 °C (Aventi 30, Beckman). Les surnageants obtenus sont ensuite ultracentrifugés (Optima LE-80K, rotor Ti 50, Beckman) à 100000 g pendant 2 h à une température de 4 °C. Les culots obtenus sont repris dans 100 pl de CB 1X. Nous avons aussi analysé les exosomes par sédimentation sur gradient de densité de sucrose. Les culots obtenus après ultracentrifugation des milieux de culture sont alors repris dans 100 pl d'une solution de sucrose à 0,25 M. Les vésicules sont ensuite déposées sur un gradient de sucrose préparé avec 8 couches ( de 1,2 ml) de densités différentes (en molarité) : 0,5 / 0,75 / 1 / 1,25 / 1,5 / 1,75 / 2 / 2,5. Les tubes sont alors centrifugés (Optima LE-80K, rotor SW 41, Beckman) à 39 000 rpm pendant 16 h, à une température de 4 °C. Après centrifugation, on prélève le gradient par fraction de 700 pl. Les protéines sont ensuite précipitées par addition d'un même volume de TCA 30 %. Les tubes sont conservés 2h à 4°C puis centrifugés (Eppendorf, 5417R) à une température de 4 °C pendant 20 min à 13000 rpm. Les culots sont repris dans 500 pl d'acétone puis de nouveaux centrifugés comme précédemment. Les culots alors obtenus sont repris dans 80 pl de CB1X puis analysés par migration sur gel d'acrylamide-SDS et Western Blot. D. Western Blot et Immunoprécipitation : Les échantillons protéiques obtenus sont analysées par western blot : après migration et séparation sur gel d'acrylamide (12,5 %), les protéines sont transférées sur membrane hydrophobe PVDF (Immobillon-P, Millipore). La présence des mutants de la protéine TM est révélée par immunomarquage à l'aide des anti-corps suivant : • Anticorps primaire : antisérum de lapin Anti-CDTM BLV (Dilution 1/200). • Anticorps secondaire : Anti-IgG de lapin marqué à la péroxydase (Dilution 1/5000 ; Jackson Immuno Research, JIR) La présence de récepteurs à la transferrine est révélée par immunomarquage à l'aide des anti-corps suivant : • Anticorps primaire : IgG de souris anti-TFr humain (Dilution 1/200 ; Zymed) • Anticorps secondaire : Anti-IgG de souris (Dilution 1/5000 ; JIR) Afin d'accroître sélectivement la concentration de la protéine étudiée, nous avons aussi réalisé des immunoprécipitations sur les lysats protéiques, préalablement à la migration sur gel. Après normalisation des quantités de protéines, l'adsorption du lysat se fait sur de la sepharose 6B, afin d'éliminer les réactions non spécifiques et l'immunoprécipitation est réalisée avec de la protéine sepharose 6A, en présence de 2,5 pg des anticorps suivant : • Anticorps primaires : IgG de souris Anti-CD8 de souris (19/178) (JIR) IgG de rat Anti-CD8 de souris (53/672) (JIR) • Anticorps secondaires : Anti-IgG de souris (JIR) Anti-IgG de rat (JIR) Les culots obtenus sont alors repris dans 70 pi de CB 1,5X. Ill. Localisation par immunofluorescence A. Préparation des lamelles. Les lamelles type coverslips sont stérilisées à l'EtOH absolu, sous hotte à flux laminaire, puis placées dans des puits de 1,9/cm2 (plaques 24 puits) avant d'être � coatées � à la poly-L-Lysine (25 pg/ml, Sigma) pendant 1 h à 37 °C. Après lavage au PBS, les lamelles sont conservées à 4 °C, dans 1 ml de PBS. A. Culture cellulaire et transfection. Les cellules HEK293 sont cultivées et transfectées selon la méthode décrite dans la partie � Analyses de l'expression des chimères �. 24 h après transfection, les cellules sont reprises dans 35 ml de DMEM complet, puis distribuées dans des puits de 1,9 cm2 (plaques 24 puits), contenant les lamelles préalablement stérilisées et � coatées �, à raison de 1 ml de dilution cellulaire par puits. Les cellules ainsi mises en culture sont incubées 24 h à 37 °C, sous 5 % de CO2. B. Fixation et perméabilisation. Les cellules sont ensuite fixées pendant 30 min avec une solution de formaldéhyde (4 %) puis perméabilisées au Triton X-100 (0,2 % final). Après 3 rinçages de 10 min au PBS, les lamelles sont conservées avec 1 ml de PBS, à 4 °C. C. Marquages pour l'immunofluorescence. Les différents anticorps à disposition nous ont permis de tester plusieurs marquages pour la localisation par immunofluorescence: Marquaqes CD8 : N°1 : IgG de souris / anti-CD8 de souris (19/178) (JIR) + Anti-IgG de souris FITC (JIR) N°2 : Ascites de souris / anti-CD8 de souris (19/178) (JIR) + Anti-IgG de souris FITC (JIR) N°3 : IgG de rat / anti-CD8 de souris (53/672) (JIR) + Ariti-IgG de rat FITC 20 (JIR) N°4 : IgG de rat (53/6.7) / anti-CD8 de souris FITC (Pharnningen) Marquages des compartiments infra-cellulaires : N°5 : IgG de souris / anti-CD63 (Lamp3) humain (Zymed) + Anti-IgG de 25 souris Cy3 (Sigma) N°6 : IgG de souris / anti-Lamp1 humain + Anti-IgG de souris Cy3 (Sigma) N°7 : IgG de souris / anti-Tf2 humain (Zymed) + Anti-IgG de souris Cy3 (Sigma) N°8 : IgG de lapin / anti-caveolin (BD) + Anti-IgG de lapin TRITC (JIR) 30 RESULTATS Les connaissances sur le processus de formation des exosomes sont partielles. De même, les fonctions associées au domaine cytoplasmique de Env sont mal caractérisées. La présente étude repose sur l'hypothèse que le modèle du BLV est un bon outil pour étudier les phénomènes de formations des exosomes et des particules virales et que le domaine cytoplasmique de la protéine TM (CDTM) dru BLV est un outil potentiellement intéressant pour le développement de la vaccination par � exosome display �. Pour évaluer ces potentialités et afin de caractériser les fonctions responsables du ciblage de la protéine TM du BLV, et plus particulièrement le rôle des résidus cystéine palmitoylés ou non, nous avons développé plusieurs vecteurs permettant l'expression, au sein de cellules eucaryotes, de protéines transmembranaires chimères comprenant l'ectodomaine de la protéine CD8 de souris et le domaine CDTM (protéines chimères CD8-CDTM). Des chimères CD8-CDTM sauvages ainsi que des chimères CD8-CDTM mutées ont été exprimées. L'ectodomaine CD8 de souris est, dans une cellule humaine, un élément neutre n'interférant pas avec les récepteurs cellulaires. Les chimères utilisées nous assurent donc de l'absence d'interactions entre l'ectodomaine des protéines et les structures cellulaires. En conséquences, ces chimères permettent d'étudier spécifiquement les domaines cytoplasmique et transmembranaire de la protéine TM, en évitant les phénomènes engendrés par l'ectodomaine de la protéine TM et par la protéine SU qui lui est associée. Trois types de constructions ont été utilisés (voir figures 1 et 2). A partir de ces constructions, nous avons développé différents vecteurs d'expression pLPCX permettant l'expression de CD8-CDTM sauvages ou mutées au niveau des résidus cystéine 1, 2 et 3 (schématisé par le sigle : CCC). Les résidus cystéine sont alors remplacés, ou non, par des résidus alanine, qui ne peuvent pas être palmitoylés. Les protéines CD8-CDTM sauvages ou mutés étudiées sont : • 1 : pX2 CCC (phénotype sauvage) • 2 : pX2 ACC • 3 : pX2 CAC • 4 : pX2 AAC • 5 : pX2 CCA • 6 : pX2 ACA • 7 : pX2 CAA • 8 : pX2 AAA • 9 : pX3 CCC (phénotype sauvage) • 10 : pX3 CAC • 11 : pX4 - - C (phénotype sauvage) • 12 : pX4--A • 13 : pX4 stp (pX4 stp est composé uniquement par ED, tmD et une petite partie du CDTM de CD8). Ces constructions nous ont permis d'étudier, au niveau du ciblage de la protéine TM : • les conséquences de la mutation des résidus cystéine. • l'importance de l'intégrité du domaine trans-membranaire de la protéine TM. • l'importance du domaine cytoplasmique de la protéine TM (CDTM) 1. Préparation des ADN plasmidiques : Dans un premier temps, nous avons produit, en grande quantité, chacun de nos 13 ADN ainsi qu'un vecteur sans insert (pLPCX) faisant office de témoin négatif. Après culture de bactéries transformées par nos différents plasmides, les ADN obtenus ont été purifiés successivement par la méthode STET puis sur colonne. L'identité des plasmides obtenus a ensuite été contrôlée par digestion enzymatique. A. Préparations des ADN par la méthode STET : Afin de vérifier l'intégrité des ADN plasmidiques et le rendement des préparations STET, nous avons réalisé une migration de l pl et 0,20p1 de chacun d'eux, sur gel d'agarose (0,8% ; voir figure 3). La non-dégradation des ADN est mise en évidence par la présence de bandes distinctes d'ADN super enroulés de tailles homogènes. B. Contrôle de la présence des ADN dans les produits de 10 purification sur colonne : Les ADN obtenus par la méthode STET sont purifiés sur colonnes, les fractions retenues puis éluées ainsi que les fractions non retenues sont ensuite analysées par électrophorèse sur gel afin de vérifier l'intégrité des ADN purifiés obtenus. Le gel présenté en figure 4 nous indique que l'ADN 15 super-enroulé est bien présent dans les fractions pures éluées des colonnes (E et E') mais indétectable dans les fractions non retenues (FT). C. Dosages spectrométriques des aliquotes et ajustement des concentrations des ADN après digestion enzymatique : 20 Les ADN purifiés sont ensuite dosés au spectrophotomètre. Les concentrations alors obtenues varient, en fonction des aliquotes, entre 149 pg/ml et 584 pg/mI. Après précipitation à l'EtOH, les ADN des aliquotes sont repris dans du TE1X et ajustés à une même concentration . Afin de vérifier les concentrations d'ADN, nous avons linéarisé les 25 plasmides par digestion enzymatique, à l'aide du couple Hind III/Not I, puis nous les avons analysé sur gel d'électrophorèse (voir figure 5, profil supérieur). Il est apparu que l'intensité des bandes obtenues était encore variable. Nous avons donc réajusté les concentrations en fonction des dosages spectrométriques et de l'intensité des bandes obtenues après la 30 digestion (voir figure 5 - profil inférieur). L'obtention de bandes d'intensités égales, en plus d'assurer l'exactitude des concentrations de nos ADN avant leurs transfections dans des cellules, permettra une meilleure lisibilité des électrophorèses après digestions enzymatiques, lors du contrôle de l'identité des plasmides. D. Contrôle de l'identité des ADN après digestion enzymatique. 1) Principe général : Afin de s'assurer de l'identité des 14 ADN préparés, tous sont contrôlés par digestion à l'aide des enzymes de restriction Hind III et Not I, Xba I, Aat II, Pac I ainsi que Sfo I qui doivent résulter en des combinaisons différentes de profils sur gels pour chacun des ADN . La migration sur gel d'agarose (0,8%) des produits de digestions permet la discrimination des ADN en fonction du nombre et de la taille des bandes obtenues, comme indiqué dans le tableau 1 (remarque : les bandes d'une taille inférieure à une centaine de paires de bases ne sont pas visibles sur nos gels d'électrophorèse) : Nombres de bandes théoriques obtenus après cti N" Plasmide 1 Hind IIIrNot I Xba I Aat II 8fb I Pac I 1 pX2 wt TIvI 2 0 2 pX2 1\ ICA 2 S (I) 4 1 (k) 3 pX2 M2 2 3 9 4 1 4 pX2 1\114 2 (a) 3 O 9 (J) 4 0 5 pX2 1\115 2( 3 8 S 0 6 pX2 1\116 2 3 8 (1) 1 pX2 I\117 2 3 9 5 1 8 pX2 1\118 C) 9 pX3 wt TAI 2 b 2 8 0 10 pX3 M15 O , ( 9 4 1 11 pX4wtThl 1 , 8 4 0 12 1,X41y115 1 (`) 2 } (g) 8 0 13 pX4 Stp 1 (d) 2 (h) 8 4 0 Tableau 1 25 30 La digestion des constructions étudiées permet de s'assurer de l'identité de chaque plasmide. La discrimination des grands types de construction CD8-CDTM se fait par l'analyse du nombre et de la taille des bandes obtenus après digestion avec les enzymes Hind III/Not I et Xba I. La discrimination entre les différents mutants des résidus cystéine se fait après digestion par les enzymes Aat II, Pac I et Sfo I. Le nombre de bandes alors obtenus est plus important qu'avec les digestions par Hind III/Not I et Xba I, et la discrimination est réalisée en se basant principalement sur la présence ou non de bandes spécifiques (en gras). Tailles des bandes attendues (en bp) : a) : 7206 / 49 (g) : 6552 / 610 (b) : 6868 / 311 (h) : 6552 / 385 (c) : 7162 (1) : 4285 / 1055 / 801 / 498 / 294 / 186 / 83 / 53 (d) : 6937 (j) : 3423 / 1055 / 862 / 801 / 294 / 186 / 83 / 53 (e):6822/367/66 (k):4276/2538/310/131 (f) : 6812 /367 (I) :4276 / 1839 / 699 / 310 / 13,1 2) Exemple : Pour la discrimination des mutants pX2 AAC et pX2 CCA, les gels obtenons sont représentés en figure 6A. Interprétation : • Digestion par Hind III/ Not I : l'obtention d'une bande unique, à environ 7206 pb, correspond à la présence de constructions X2 ou X4 dans chacun des deux échantillons. • Digestion par Xbal : l'obtention de deux bandes à environ 6822 (ou 6812) et 367 bp correspondent à la présence de constructions X2 ou X3 dans chacun des deux échantillons. En recoupant ces deux résultats nous pouvons affirmer que nous sommes donc bien en présence de deux constructions de type X2. On cherche ensuite à discriminer les mutants X2 entre eux (voir figure 6B): Interprétation : • Digestion par Aatll : - Echantillon 4 : l'obtention d'une 1 bande spécifique avoisinant 3423 pb (rouge) correspond à la présence d'un des plasmides X2 suivant : pX2 CAC, pX2 AAC, pX2 CAA ou pX2 AAA. - Echantillon 5 : l'obtention d'une 1 bande spécifique avoisinant 4285 pb (bleu) correspond à la présence d'un des plasmides X2 suivant : pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CCA ou pX2 ACA. • Digestion par Sfo I : l0 - Echantillon 4: l'obtention d'une bande spécifique avoisinant 2538 pb (rouge) correspond à la présence d'un des plasmides X2 suivant : pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC, pX2 AAC. En recoupant ce résultat avec celui de la digestion par Aat II, nous pouvons alors en déduire que nous sommes en présence d'un des plasmides suivant : pX2 AAC ou pX2 CAC. 15 - Echantillon 5 : l'obtention de 2 bandes spécifiques avoisinant 1839 pb (noir) et 699 (vert) pb correspond à la présence d'un des plasmides X2 suivant : pX2 CCA, pX2 ACA, pX2 CAA, pX2 AAA. En recoupant ce résultat avec celui de la digestion par Aat II, nous pouvons alors en déduire que nous sommes en présence d'un des plasmides suivant : pX2 CCA ou 20 pX2 ACA. • Digestion par Pac I : Nous obtenons pour chaque échantillon, 1 bande de faible intensité correspondant à de l'ADNp non super enroulé ainsi qu'une bande de forte intensité correspondant à nos ADNp super enroulé (bleu) mettant en 25 évidence l'absence de digestion par Pac I, pour ces échantillons. Les échantillons 4 et 5 correspondent respectivement aux mutants pX2 AAC et pX2 CCA. Ce processus a été appliqué à l'identification de tous les plasmides. 30 3) Conclusion : Lors de cette étape de préparation des ADN, nous avons obtenus plusieurs milligrammes de chacun des 14 plasmides purifiés et leurs identités ont toutes été confirmées après contrôle par digestions enzymatiques et analyses sur gels. De plus, tous les ADN ont été ajustés à une même concentration. ll. Analyse de l'expression des chimères : Afin d'évaluer l'expression des ADN, une même quantité de chacun des plasmides a été transfecté au sein de cellules HEK293. Les protéines ainsi exprimées sont analysées par migration sur gel suivie d'un transfert sur membrane PVDF. Les membranes sont ensuite révélées à l'aide d'un sérum de lapin Anti-CDTM et d'un anticorps secondaire Anti-Lapin marqué à la péroxydase. A. Analyse de la présence de CD8-CD Tm au sein des lysats 15 cellulaires : 1) Analyses des lysats bruts : Après 48h de transfection, les cellules sont lysées et les extraits obtenus sont dosés selon la technique de Bradford. Nous avons analysé 20 200pg de protéines brutes, issues de ces lysats, par migration sur gel et western blot révélé avec un anticorps anti-CDTM (voir figure 7). Différents signaux spécifiques sont alors observables selon les échantillons : • Une double bande à 50 kDa (bleu) correspondant à la présence de 25 CD8-CDTM. Les deux bandes correspondent à deux niveaux de glycosylalion de CD8. • Un signal à environ 20 kDa (rouge) d'origine indéterminée. Les échantillons pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC, pX2 AAC, pX4 stp et pLPCX ne présentent pas ces bandes. 30 2) Analyse des lysats après immunoprécipitation par des anticorps anti-CD8 : Afin d'abaisser le seuil de détection de CD8-CDTM au sein des lysats cellulaires, nous avons utilisé une grande quantité d'extrait et concentré les chimères par immunoprécipitation avec des anticorps monoclonaux spécifique d'un épitope conformationnel de l'ectodomaine du CD8. Après 48h de transfection, les cellules sont lysées et les extraits obtenus sont dosés selon la technique de Bradford. Après normalisation des concentrations en protéines, les extrait sont immunoprécipités en présence des anticorps Anti-CD8 et de protéine A sepharose. Les produits obtenus sont analysés par migration sur gel et Western Blot révélés avec un anticorps anti-CDTM (voir figure 8). Différents signaux sont Mors observables selon les échantillons : • Une double bande à 55 kDa (bleu) correspondant à la présence de CD8-CDTM. • Un signal non identifié, retrouvé pour chaque échantillon, à environ 66 kDa. • Un ou plusieurs signaux d'un poids moléculaire supérieur à 66 KDa correspondant probablement à la présence de protéines CD8-CDTM multimérisées. Ici, l'échantillon pX2 AAC présente un signal détectable à 50KDa contrairement à l'analyse effectuée sans immunoprécipitation. En revanche aucun signal n'est détectable pour les échantillons pX2 CCC, pX2 ACC, 25 pX2 CAC, pX4 stp et pLPCX. 3) Récapitulatifs de l'analyse de l'expression de CD8-CDTM au sein de lysats cellulaires : En corrélant les données obtenues par western blot sur les lysats 30 cellulaires avec les caractéristiques de chaque chimère (intégrité de tnnD BLV, présence du troisième résidu de cystéine et nombre de résidus 20 cystéine), nous pouvons établir le tableau 2 ci-dessous. Il apparaît que, en plus du CDTM du BLV, deux facteurs puissent jouer sur la présence des chimères CD8-CDTM. Ces facteurs sont : • La présence ou non de tmD BLV. • La présence ou non du troisième résidu de cystéine (Cys 213). Construction tmD BLV Nbre de Cystéines pX2 CCC Complet 3 Signal CD*" BLV Nul pX2 ACC Complet Nul pX2 CAC Complet 2 Nul pX2 AAC Complet 1 pX.2 ACA pX2 CAA Complet pX2 CCA Complet - Complet 1 --- - pX2 AAA , Complet O + + pX3 CCC pX3 CAC - 15 aa - 15 aa + + + pX4 Absent pX4--A Absent pX4 stp Absent Nul pLpcX Absent Nul Tableau 2. B. Analyse de l'association de CD8,CD TM avec les exosomes : Les différents ADN utilisés ne varient que de quelques nucléotides. II 30 est donc probable que les quantités de CD8-CDTM synthétisées soient équivalentes. Cependant il est apparu, lors de l'analyse de l'expression de CDTM au sein de lysats cellulaires, que certaines chimères ne sont pas détectables 48h après transfection. Cette absence de signal serait le reflet de la disparition de certaines de nos protéines chimériques. Cette disparition pourrait être due soit à une dégradation rapide de ces chimères, soit à leur sécrétion sous forme d'exosomes. Nous avons donc cherché à détecter la présence de CD8-CDTM au sein d'exosomes. 1) Contenu en CD8-CDTM des vésicules isolées par centrifuqation : Après 48h de transfection, les milieux de cultures sont récupérés et centrifugés en vue d'isoler les exosomes. Les culots obtenus sont alors analysés par migration sur gel et Western Blot révélé avec un anticorps anti-CDTM (voir figure 9). On peut visualiser, selon les échantillons, un signal à 55 kDa correspondant à la présence de CD8-CDTM. Ce signal est non détectable pour les échantillons pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC, pX2 AAC, pX4 stp et pLPCX. 2) Contenu en CD8-CDTM après sédimentation des vésicules sur gradient de densité de sucrose : Afin de nous assurer que le signal obtenu après ultracentrifugation des milieux de culture est bien du à la présence des chimères au sein d'exosomes et non pas à la présence de débris cellulaires contenant CD8-CDTM, nous avons analysé les culots d'exosomes obtenus selon la méthode décrite précédemment par sédimentation sur un gradient de densité de sucrose. Les exosomes flottent alors à une densité allant de 1,13 à 1,20 g/ml en fonction des cellules utilisées et de la composition des vésicules. Après la sédimentation par ultracentrifugation, le gradient est prélevé par fractions de 700pl. Les protéines sont précipitées à l'aide de TCA et analysées par migration sur gel puis Western Blois révélés avec un anticorps anti-CDTM et un anticorps anti-récepteur de la transferrine (RTf) permettant de détecter la présence de vésicules cellulaires (endosomes ou exosomes). Cette analyse a été réalisée pour les mutants pX4 ùC et pX4 --A.(voir figure 10). Chez pX4 -- C et pX4 --A, on détecte un signal correspondant à CD8-5 CDTM dans les fractions de densité allant de 1,13 à 1,25 g/ml. Pour ces mêmes densités, nous avons également pu détecter un signal correspondant à RTf. Ces résultats révèlent la présence de CD8-CDTM dans les fractions contenant les exosomes. 10 3) Récapitulatif de l'analyse de l'association des exosomes avec CD8-CDTM : L'association de CD8-CDTM avec les exosomes a été détectée pour tous les mutants contenant CDTM exceptés pour les pX2 possédant Cys 213. Les mutants pX4 --C et pX4 --A apparaissent comme très 15 efficacement ciblés dans les exosomes. Les mutants pX3 et pX2 ne possédant pas Cys 213 sont eux aussi retrouvés dans les exosomes mais dans des proportions moindre que pour les mutants pX4 --C et pX4--A. II apparaît donc que, en plus de la présence du CDTM viral, deux facteurs puissent jouer sur le ciblage des chimères CD8-CDTM dans les 20 exosomes. Ces facteurs sont : • La présence ou non de tmD BLV. • La présence ou non de la Cys 3. 25 C. Influence de l'inhibition du transport vésiculaire sur l'expression des chimères CD8-CDTM L'absence de détection des chimères pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC et pX2 AAC n'étant pas due à une sécrétion exosomale accrue, nous avons cherché à savoir si elle pouvait être due à une dégradation par la voie de tri 30 des protéines des MVBs vers les lysosomes. Pour cela, nous avons utilisé les inhibiteurs de transport vésiculaire que sont la bafilomycine et Ly294002. Ces inhibiteurs permettent de bloquer la voie de dégradation lysosomale, favorisant ainsi la sécrétion de protéines par les exosomes. Les inhibiteurs sont ajoutés aux milieux de cultures 32h après la transfection ; 16h plus tard, les cellules sont lysées et les milieux de cultures sont récupérés puis centrifugés en vue d'isoler les exosomes. Les échantillons obtenus sont alors analysés par migration sur gel et Western Blot révélé avec un anticorps anti-CDTM. Nous avons ainsi analysé l'expression des chimères pX2 CCC, pX2 CCA, pX3 CCC, pX4 -- C, pX4 --A et pX4 stp .(voir figures 11 et 12). II apparaît que, pour ces mutants, le profil des Western Blots des protéines obtenues en présence d'inhibiteurs est le même que lors de l'analyse sans inhibiteur, que cela soit pour les lysats cellulaires ou pour les exosomes. L'absence des chimères pX2 CCC, pX2 ACC, pX2 CAC et pX2 AAC n'est donc apparemment due ni à une sortie exosomale accélérée, ni à une dégradation dans les lysosomes. Il est probable qu'elle soit la conséquence d'une dégradation très précoce au niveau du système de contrôle du repliement au sein du réticulum endoplasmique (RE) et du TGN. lll. Localisation par immunofluorescence : Afin d'apprécier le ciblage membranaire de CD8-CDTM ainsi que sa localisation dans les compartiments cellulaires, nous avons réalisé des observations en microscopie d'immunofluorescence confocale. 48h après transfection, les cellules ont été fixées puis marquées à l'aide de différents anticorps. A. Choix des anticorps : Dans un premier temps, chaque type de marquage (voir Matériels et Méthodes) est testé, avec des dilutions d'anticorps variables, sur des 30 cellules fixées exprimant pX4 -- C ou pLPCX. Après observation sur un microscope à immunofluorescence classique (ZEISS Axiovert 200 M), nous avons testé les différents anticorps à disposition (voir partie � Matériels et Méthodes �) et déterminé leur efficacité ainsi que leurs dilutions optimales. II est apparu que plusieurs anticorps anti-compartiments intra-cellulaires présentaient un signal nul ou aspécifique. Pour l'observation en imagerie confocale, nous n'avons donc pu utiliser que deux types de marquages : • Marquage CD8-CDTM : IgG de rat (53/6.7) Anti-CD8 de souris FITC (Pharmingen, dilution 1/50) • Marquage Lamp3 : IgG de souris Anti-CD63 (Lamp3) humain (Zymed, dilution 1/50) + A,nti- IgG de souris Cy3 (Sigma, dilution 1/500) B. Observations de la répartition de CD8-CDTM Après fixation et marquage des cellules à l'aide de nos différents anticorps, nous avons observé la répartition du marquage issu de CD8-CDTM ainsi que sa colocalisation avec Lamp3 à l'aide d'un microscope confocal (ZEISS LSM 510). Les cellules exprimant pLPCX (témoin négatif) ne présentent pas de signal FITC. Ce témoin nous permet donc de s'assurer que la fluorescence FITC visualisée pour les autres mutants est bien issue de la présence de CD8-CDTM De façon surprenante, malgré une absence de détection par Western Blot, les constructions pX2 comprenant la Cys 3 sont visibles, bien que faiblement, en immunofluorescence. Analyse des phénotypes généraux : Les cellules HEK293 sont transfectées pendant 48h puis fixées. L'observation est réalisée à l'aide d'un microscope confocale ZEISS LSM 510 (objectif X63 à immersion). CD8 : Marquage FITC (vert) révélant la présence des chimères contenant le CD8. Lamp3: Marquage Cy3 (rouge) révélant de la présence de la protéine Lamp3 caractéristique des endosomes tardifs. CD8-CDTM / Lamp3: Superposition des images FITC et Cy3. La nuance jaune obtenu met en évidence la colocalisation de CD8-CDTM avec Lamp3. Après observations, nous avons pu distinguer 5 phénotypes généraux (voir figures 13 à 17) en se basant sur l'aspect (vésiculaire, membranaire ou périnucléaire) et l'intensité du marquage FITC. La colocalisation du marquage FITC d'aspect vésiculaire avec Lamp3 ne rentre pas en ligne de compte pour la détermination de ces phénotypes car elle est avérée chez tous les mutants. De plus cette co-localisation est toujours partielle. Analyse des zones périnucléaires présentant un fort signal FITC : Pour tous les échantillons, excepté pX4 stp, on retrouve de manière plus ou moins constante un signal périnucléaire CD8 homogène important à la périphérie du noyau. Les paramètres d'intensité requis pour la visualisation de la majeure partie de la fluorescence FITC présente dans les cellules entraînent la saturation de cette zone. Un signal ainsi saturé étant peu exploitable, nous avons réalisé des acquisitions de paramèlres d'intensité plus faible, en nous concentrant sur l'analyse de ces zones, notamment pour déterminer la pertinence des colocalisations qu'elles présentent avec Lamp3. CD8-CDTM / Lamp3 [a] : Colocalisation de CD8-CDTM (vert) avec Lamp3 (rouge). Les paramètres d'intensité pour l'acquisition, mêmes faibles, entraînent une saturation du signal périnucléaire et l'apparition de nuances jaunes à ce niveau, mettant en évidence une colocalisation partielle entre ces deux marquages. En raison de la saturation du signal, il est impossible de dire si la colocalisation mise en évidence est réelle ou artéfactuelle. CD8-CDTM [d] : Signal FITC issu de CD8-CDTM. Les paramètres d'intensité ont été abaissés sensiblement afin d'éliminer tout phénomène de saturation du signal. Le signal FITC apparaît diffus, homogène et non ponctué. CD8-CDTM / Lamp3 [d] : Colocalisation de CD8-CDTM (vert) avec Lamp3 (rouge). Les paramètres d'intensité ont été abaissés sensiblement afin d'éliminer tout phénomène de saturation du signal. II en résulte une absence de nuances jaunes mettant en évidence l'absence de colocalisation entre FITC et Lamp3. D'après ces acquisitions, le marquage issu de Lamp3 apparaît en fait comme étant situé à l'intérieur de cette zone périnucléaire mais n'est en tout cas jamais colocalisé avec le marquage FITC (voir figure 18). De plus le marquage issu de CD8-CDTM de ces zones périnucléaires apparaît diffus, homogène et non ponctué, et semble mettre en évidence la présence de CD8-CDTM au sein d'une structure cellulaire. La localisation et l'aspect de ce marquage, ainsi que l'absence de colocalisation réelle avec Lamp3 suggèrent la présence de CD8-CDTM dans l'appareil de Golgi. Ce phénotype est retrouvé, de façon plus ou moins intense, chez tous les mutants, hormis pX4 stp. Chez les mutants pX4 --C et pX4 --A, ce phénotype n'est visible que dans une minorité de cellules, contrairement aux mutants pX2 et pX3 chez qui il est présent de manière constante. Ainsi, l'observation spécifique des zones périnucléaires fortement marquées par FITC nous a permis de mettre en évidence la présence probable de CD8-CDTM au sein du TGN. D'après les données obtenues, nous pouvons établir le tableau récapitulatif ci-dessous (voir tableau 3). Ces observations confirment que, outre le CDTM viral, deux facteurs jouent un rôle sur la stabilité et le ciblage de nos chimères. Ces facteurs sont : • La présence ou non de tmD BLV. • La présence ou non des résidus N-terminaux du CDTM du BLV • La présence ou non de la Cys 3. Localisation du marquage FITC Phénotype Mutants Intensité FITC Vésiculaire Membranaire TGN pX2 CCC + +++ - ++ pX2 ACC + +++ - ++ A pX2 CAC + +++ - ++ pX2 AAC + +++ - ++ pX2 CCA +++ ++++ - ++ B pX2 ACA +++ ++++ - ++ pX2 CAA +++ ++++ - ++ pX2 AAA +++ ++++ .. ++ pX3 CCC ++++++ + +++ +++++ C pX3 CAC ++++++ + +++ +++++ pX4 - C ++++++ ++ ++++ + D ++++++ ++ ++++ + pX4---A E pX4 stp ++++ + +++ _ Tableau 3. 20 CONCLUSION : Au cours de nos analyses, il est apparu que la chimère pX4 stp, composée uniquement de l'ectodomaine et du tmD de CD8, s'accumule dans les cellules HEK293 en étant efficacement ciblée vers la membrane plasmique. 25 De la même façon, les chimères pX4 --C et pX4 --A s'accumulent et se retrouvent dans la membrane plasmique mais dans des proportions plus importantes que pX4 stp. Ces chimères sont très efficacement sécrétées au sein d'exosomes. Les chimères pX3 quant à elles sont très présentes au sein de l'appareil de 30 Golgi, contrairement aux chimères pX4. Leur ciblage au sein de la membrane plasmique et dans les exosomes parait moins efficace que chez 10 15 les chimères pX4 mais demeure important. Les chimères pX2 apparaissent peu stables et sont retrouvées au sein du TGN mais pas dans la membrane plasmique. Les constructions pX2 comportant Cys 3 sont très peu stables dans les 'cellules et ne sont pas détectées clans les exosomes. La substitution de la Cys terminale dans ce type de constructions semble contribuer à un gain de stabilité des protéines chimériques. En effet, les constructions pX2 sans Cys 3 sont détectables dans les cellules et dans les exosomes. Toutes les chimères étudiées présentent, en immunofluorescence, un marquage vésiculaire qui est partiellement colocalisé avec un marqueur des endosomes tardifs.. Cette étude a permis de mettre en évidence l'importance de la présence, ou non, de Cys 3 dans la stabilité et dans le ciblage des chimères CD8-,CDTM. II semble que l'absence de ce résidu cystéine favorise la stabilité et le ciblage membranaire des chimères étudiées ainsi que leur présence dans les exosomes. Ces phénomènes pourraient être indépendants de l'hyperpalmitoylation associée à l'absence de Cys 3. En effet, la construction pX2 AAC, qui est non palmitoylée, est plus stable que les trois mutants pX2 possédant Cys 3 ainsi que Cys 1 et/ou Cys 2, qui sont palmitoylables. Cependant, une implication différentielle de la palmitoylation dans la stabilité et le ciblage de nos chimères ne doit pas être exclue. Cette étude a permis de découvrir l'importance fondamentale de tmD du BLV. En effet, la délétion de tout ou partie de tmD BLV semble accroître sensiblement la stabilité des chimères ainsi que leur ciblage au niveau de la membrane plasmique. Ainsi de façon étonnante, la présence de tmD BLV favoriserait la dégradation précoce des chimères. Cette dégradation pourrait intervenir au niveau du système du contrôle du repliement au sein des compartiments cellulaires que sont le RE et le TGN puisque la voie de dégradation lysosomale ne semble pas en cause. L'absence d'effets d'inhibiteurs de transport vésiculaire sur la stabilité et le ciblage exosomal des chimères CD8-CDTM ainsi que leur colocalisation très partielle avec les endosomes tardifs, même pour les chimères les moins stables, vient soutenir cette hypothèse. L'attrait principal de nos travaux réside dans la découverte d'outils potentiellement efficaces pour le développement d'un mode de vaccination basé sur le concept � exosome display �. En effet, les chimères pX4 --C et surtout pX4 --A semblent disposer d'un � moteur � moléculaire permettant un ciblage très efficace d'antigène peptidique (ici le CD8) vers les exosomes. Ce � moteur � serait donc situé dans le domaine cytoplasmique de la protéine TM du BLV. Afin de préciser la nature exacte de ce moteur dans nos constructions moléculaires avant de procéder à de premiers essais d'immunisation, nous étudions l'effet de 18 types de mutations dans le domaine cytoplasmique de la protéine TM du BLV : - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution des 2 résidus proline du premier motif PxxP (SEQ ID NO.:13 et SEQ ID NO. :14) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution des 2 résidus proline du deuxième motif PxxP (SEQ ID NO.:15 et SEQ ID NO.:16) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution des 2 résidus proline du troisième motif PxxP (SEQ ID NO.:17 et SEQ ID NO. :18) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du premier résidu proline du quatrième motif PxxP (SEQ ID NO.:19 et SEQ ID NO.:20) ; - substitution des 2 résidus proline du quatrième motif PxxP (SEQ ID NO.:21 et SEQ ID NO.:22) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu tyrosine du premier motif YxxL (SEQ ID NO.:23 et SEQ ID NO. :24) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu tyrosine du deuxième motif YxxL (SEQ ID NO.:25 et SEQ ID NO. :26) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu tyrosine du troisième motif YxxL (SEQ ID NO.:27 et SEQ ID NO.:28) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu sérine se trouvant avant le premier motif YxxL (SEQ ID NO.:29 et SEQ ID NO. :30) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu acide glutamique se trouvant avant le deuxième motif YxxL (SEQ ID NO.:31 et SEQ ID NO. :32) ; - délétion des 13 résidus N-terminaux et substitution du résidu acide aspartique se trouvant avant le troisième motif YxxL (SEQ ID NO.:33 et ; SEQ ID NO. :34) ; - séquence tronquée à 6 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 39 résidus C-terminaux (SEQ ID NO.: 35 et SEQ ID NO. :36) ; - séquence tronquée à 15 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 30 résidus C-terminaux (SEQ ID NO. :37 et SEO ID NO.:38); - séquence tronquée à 21 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 24 résidus C-terminaux (SEQ ID NO.: 39 et SEO ID NO.:40) ; - séquence tronquée à 26 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 19 résidus C-terminaux (SEQ ID NO.:41 et SEQ ID NO. :42) ; - séquence tronquée à 31 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 14 résidus C-terminaux (SEQ ID NO.:43 et SEC ID NO. :44) ; -séquence tronquée à 37 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 8 résidus C-terminaux (SEQ ID NO. :45 et SEQ ID NO. :46) ; - séquence tronquée à 41 résidus - délétion des 13 résidus N-terminaux et des 4 résidus C-terminaux (SEQ ID NO. :47 et SEQ ID NO.48). 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"Bovine immunodeficiency virus and analogies with human immunodeficiency virus." Leukemia.;13 Suppl 1:S106-9. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Tenza D, Raposo G, 20 Amigorena S. (1998). "Dendritic cell-derived exosomes elicit potent antitumour immune responses in vivo." Nat. Med. ; 4:594.600. 15 REVENDICATIONS 1. Polypeptide chimérique capable d'être sécrété en association avec des vésicules membranaires, en particulier avec des exosomes, lorsqu'il est exprimé dans des cellules eucaryotes appropriées, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en les domaines suivants: (i) un peptide ou polypeptide d'intérêt (ii) un domaine membranaire ayant la capacité de s'ancrer dans la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire; et (iii) un domaine cytoplasmique (CD) d'une protéine membranaire, permettant l'adressage dudit polypeptide chimérique vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiments) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation de ces vésicules membranaires, ou un dérivé muté de ce domaine CD, ce dérivé muté étant défini par la substitution, la délétion et/ou l'insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine CD de référence et ce dérivé muté conservant la susdite capacité d'adressage du domaine CD, le domaine CD ou son dérivé muté comprenant au moins un motif YxxL, dans lequel Y représente un résidu tyrosine, x représente un résidu quelconque et L représente un résidu leucine ; et étant entendu que lorsque le domaine CD et un domaine membranaire dudit polypeptide chimérique sont dérivés d'une même protéine, alors au moins le domaine CD, son dérivé muté ou le domaine membranaire dérivé de la même protéine que le domaine CD est un dérivé muté par substitution et/ou délétion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine original. 2. Polypeptide chimérique selon la revendication 1, dans lequel ledit domaine membranaire est celui d'une protéine membranaire ou un dérivé muté de ce domaine membranaire, ce dérivé muté étant défini par la substitution, la délétion et/ou l'insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la 81séquence du domaine membranaire de référence et conservant la capacité de ce domaine à s'ancrer dans la bicouche lipidique d'une membrane cellulaire 3. Polypeptide chimérique selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le domaine membranaire et le peptide ou le polypeptide d'intérêt sont dérivés ou non d'une même entité, en particulier d'une même protéine. 4. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les domaines (i) à (iii) sont positionnés successivement dans l'ordre suivant, de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale dans le polypeptide : peptide ou polypeptide d'intérêt - domaine membranaire - domaine cytoplasmique (CD) ou un dérivé muté. 5. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit domaine CD comprend deux ou trois motifs YxxL. 6. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel la séquence du dérivé muté du domaine membranaire présente au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec le domaine membranaire de la protéine membranaire dont elle dérive, par référence à la séquence complète dudit domaine membranaire. 7. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant en outre au moins une molécule de liaison (ou linker), liant deux domaines successifs. 8. Polypeptide chimérique selon la revendication 7, dans lequel ledit linker est un peptide ou un polypeptide. 9. Polypeptide chimérique selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codant pour ledit linker comprend ou consiste en un site de restriction. 10. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le domaine CD ou son dérivé muté est dépourvu de la séquence KCLTSRLLKLLRQ et/ou dépourvu de la séquence PCP. 11. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la séquence du dérivé muté du domaine CD présente au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec la séquence du domaine CD original dépourvue de l'enchaînement KCLTSRLLKLLRQ. 12. -Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la séquence du domaine CD ou de son dérivé muté comprend ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences suivantes: PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL; PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxL ; PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx ; et PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPEXnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx ; dans lesquelles x et xn représentent respectivement un résidu quelconque et un ou plusieurs résidu(s) quelconque(s). 13. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel ledit domaine CD est celui de la protéine transmembranaire (TM) d'un rétrovirus. 14. Polypeptide chimérique selon la revendication 13, dans lequel ledit rétrovirus est choisi parmi le virus de la leucémie bovine (BLV), un virus d'immunodéficience humaine (VIH), en particulier un VIH de type 1 ou un VIH de type 2, le virus de la leucémie-lymphome à cellules T (HTLV), et le virus de singe Mason-Pfizer (MPMV). 15. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel ledit domaine CD est celui de la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO. 6. 16. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel le domaine CD ou son dérivé muté comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO.8, SEQ ID N0.10 ou SEQ ID NO.12. 17. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le domaine CD ou son dérivé muté comprend ou consiste en le domaine CD de la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO.6 et le(s) domaine(s) membranaire(s) est(sont) dépourvu(s) du domaine transmembranaire de la protéine TM du BLV, de séquence SEQ ID NO.4. 18. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le domaine membranaire comprend ou consiste en le domaine transmembranaire de la protéine TM du BLV et le domaine CD ou son dérivé muté est dépourvu de la séquence KCLTSRLLKLLRQ et/ou de la séquence PCP. 19. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel le peptide ou le polypeptide d'intérêt comprend ou consiste en : - un ou plusieurs domaine(s) d'une protéine extracellulaire ou un ou des fragment(s) d'un ou plusieurs de ce(s) domaine(s) ; - un ou plusieurs domaine(s) extracellulaire(s) et/ou un ou plusieurs domaine(s) membranaire et/ou un ou plusieurs domaine(s) cytoplasmique(s) d'une protéine membranaire, en particulier d'une protéine transmembranaire, ou un ou plusieurs fragment(s) de ce(s) domaine(s) ; ou - un ou plusieurs domaine(s) d'une protéine cytosolique ou un ou des fragment(s) de ce(s) domaine(s). 20. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel le peptide ou le polypeptide d'intérêt provient d'un organisme pathogène, d'un agent pathogène, d'un antigènetumoral, d'un antigène cytoplasmique, d'un récepteur de ligand, notamment d'un récepteur à multiples domaines membranaires, par exemple un récepteur à sept domaines transmembranaires, d'un récepteur de cytokines ou d'un ligand de récepteur, notamment d'une cytokine ou d'un fragment de ceux-ci. 21. Polypeptide chimérique selon la revendication 20, dans lequel ledit organisme pathogène est un virus, une bactérie ou un parasite. 22. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, dans lequel le peptide ou le polypeptide d'intérêt est choisi parmi : l'ectodomaine de l'hémagglutinine (HA) d'un virus de la grippe, par exemple l'ectodomaine de la protéine HA du virus de la grippe aviaire H5N1, ou un fragment comprenant ou consistant en un ou plusieurs épitope(s) de cet ectodomaine; et - l'ectodomaine de la protéine Spike d'un coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) ou un fragment comprenant ou consistant en un ou plusieurs épitope(s) de cet ectodomaine. 23. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un peptide signal d'importation dans le réticulum endoplasmique. 24. Polypeptide chimérique selon la revendication 23, dans lequel ledit peptide signal est en position N-terminale dans le polypeptide. 25. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, pour une utilisation comme médicament, en particulier pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une infection bactérienne, virale, parasitaire, ou d'une tumeur. 26. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, pour une utilisation en immunisation, en particulier pour éliciter ou favoriser in vivo, chez un hôte, en particulier chez unmammifère humain, un mammifère non humain ou un oiseau, une réponse humorale et/ou cellulaire contre la tumeur, le virus, la bactérie ou le parasite dont le peptide ou le polypeptide d'intérêt dérive. 27. Polypeptide permettant la sécrétion d'un peptide ou polypeptide d'intérêt auquel il est associé, en association avec des vésicules membranaires, en particulier avec des exosomes, lorsqu'il est exprimé dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en un dérivé muté du domaine cytoplasmique (CD) de la protéine transmembranaire (TM) d'un rétrovirus, ce dérivé muté étant défini par la substitution, la délétion et/ou l'insertion d'un ou plusieurs résidu(s) dans la séquence du domaine CD de référence et comprenant au moins un motif YxxL, dans lequel Y représente un résidu tyrosine, x représente un résidu quelconque et L représente un résidu leucine et ce dérivé muté conservant la capacité dudit domaine CD à adresser un peptide ou polypeptide d'intérêt vers des vésicules membranaires, en particulier vers des vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiment(s) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation de ces vésicules membranaires. 28. Polypeptide selon la revendication 27, caractérisé en ce que le domaine CD est celui de la protéine TM du virus de la leucémie bovine (BLV), de séquence SEQ ID NO.6. 29. Polypeptide selon la revendication 27 ou 28, dans lequel le dérivé muté est dépourvu de séquence KCLTSRLLKLLRQ et/ou est dépourvu de peptide PCP. 30. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, dans lequel la séquence du dérivé muté comprend ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences suivantes: PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxL ; PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPExnYxxLxnPxxPDYxxL ; PxxPxxxxPxxPxSxYxxLxPxxPExYxxLxPxxPDYxxLxxxx ; et PxxPxnPxxPxnSxYxxLxnPxxPExnYxxLxnPxxPDYxxLxxxx ;dans lesquelles x et xä représentent respectivement un résidu quelconque et un ou plusieurs résidu(s) quelconque(s). 31. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, caractérisé en ce que le dérivé muté présente au moins 60 ou 70%, en particulier au moins 80%, 90% ou 95%, de similarité ou d'identité avec la séquence SEQ ID NO.8 par référence respectivement à la séquence SEQ ID NO.8 complète. 32. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 27 à 31, dans lequel la séquence du dérivé muté comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.10 ou SEQ ID NO.12. 33. Vésicule membranaire comportant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 et/ou un ou plusieurs produit(s) de dégradation de ce polypeptide, ce(s) produit(s) de dégradation étant le cas échéant associé(s) à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de type I ou de type II. 34. Vésicule membranaire selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un exosome. 35. Vésicule membranaire selon la revendication 33 ou 34, dans laquelle un produit de dégradation comprend ou consiste en le peptide ou le polypeptide d'intérêt compris dans ledit polypeptide ou en un fragment de celui-ci. 36. Vésicule membranaire selon l'une quelconque des revendications 33 à 35, dans laquelle au moins un peptide ou le polypeptide d'intérêt ou son fragment est exposé, en partie ou en totalité, à l'extérieur de ladite vésicule membranaire. 37. Une composition immunogène dont le principe actif comprend une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) selon l'une quelconque des revendications 33 à 36. 38. Composition immunogène selon la revendication 37, pour une utilisation comme médicament, et en particulier, pour une utilisation en immunisation. 39. Composition immunogène selon la revendication 37 ou 38, pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une infection bactérienne, virale, parasitaire, ou d'une tumeur, en particulier pour éliciter ou favoriser in vivo, chez un hôte, en particulier chez un mammifère humain, un mammifère non humain ou un oiseau, une réponse humorale et/ou cellulaire contre une tumeur, oü contre le virus, la bactérie ou le parasite dont le peptide ou le polypeptide d'intérêt dérive. 40. Un polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 32. 41. Polynucléotide selon la revendication 40, inséré dans un vecteur de clonage ou d'expression, de préférence un vecteur d'expression et plus préférablement un vecteur approprié pour l'expression dans des cellules eucaryotes. 42. Polynucléotide selon la revendication 41, dans lequel ledit vecteur est un plasmide. 43. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 40 à 42, comprenant un promoteur eucaryote, de préférence un promoteur viral, par exemple le promoteur du virus SV40, du virus du sarcome de Rous ou du virus des leucémies murines (MuLV), ou du virus des leucémies à cellules T de l'homme adulte (HTLV-I) ou du virus de la leucémie bovine (BLV) ou du cytomégalovirus ou un promoteur hybride dérivé de ces promoteurs viraux ou un promoteur viral contenant des séquences modifiées. 44. Une composition immunogène comprenant un acide nucléique, en particulier un ADN, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications40 à 43, et un support, un diluant ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 45. Composition immunogène selon la revendication 44, comprenant en outre un adjuvant, en particulier un adjuvant choisi parmi le groupe constitué des saponines, du phosphate d'aluminium (alum), des peptidoglycanes, des carbohydrates, des peptides, par exemple le muramyl dipeptide (N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, MDP), des émulsions huile/eau, des polysaccharides, des cytokines, des hormones, de l'hémocyanine de patelle, des adjuvants de la famille des dinucléotides CpG non méthylés, des adjuvants de la famille des poly IC, des adjuvants de la famille du monophosphoryl lipide A, et des acides nucléiques, en particulier des ADN bactériens ou des ADN codant pour une protéine ayant un effet adjuvant, par exemple un facteur de croissance ou une cytokine, plus particulièrement le GM-CSF ou l'IL4. 46. Composition immunogène selon la revendication 44 ou 45, pour une utilisation comme médicament, en particulier pour la prophylaxie et/ou le traitement d'une infection bactérienne, virale, parasitaire, ou d'une tumeur, notamment pour éliciter ou favoriser in vivo, chez un hôte, en particulier chez un mammifère humain ou non humain ou un oiseau, une réponse humorale et/ou cellulaire contre une tumeur, ou contre le virus, la bactérie ou le parasite dont le domaine (i) dérive. 47. Cellule recombinante productrice d'exosomes, en particulier cellule du système immunitaire et plus particulièrement cellule du système immunitaire choisie parmi les mastocytes, les lymphocytes, en particulier les lymphocytes T et B, et les cellules dendritiques, en particulier les cellules de Langerhans, caractérisée en ce qu'elle est recombinée avec un ou plusieurs polynucléotide(s) selon l'une quelconque des revendications 40 à 43 ou qu'elle a absorbé une vésicule membranaire selon l'une quelconque des revendications 33 à 36. 48. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 27 à 32, pour adresser un peptide ou polypeptide d'intérêt vers les vésicules membranaires, en particulier vers les vésicules formant des exosomes, et/ou vers le(s) compartiment(s) cellulaire(s) impliqué(s) dans la formation de ces vésicules membranaires, dans des cellules eucaryotes appropriées. 49. Utilisation d'une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) selon la revendication 36, pour la détection in vitro de partenaires spécifiques capables d'interagir avec ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ou avec uri fragment dudit peptide ou polypeptide. 50. Procédé de production in vitro de vésicules membranaires et en particulier d'exosomes comportant un peptide ou un polypeptide d'intérêt et/ou un produit de dégradation de ce peptide ou un polypeptide d'intérêt, ce produit de dégradation étant le cas échéant associé à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'introduction, d'un ou plusieurs polynucléotide(s) selon l'une quelconque des revendications 40 à 43, qui code(nt) pour un polypeptide comprenant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt, dans une cellule productrice d'exosomes, en particulier une cellule 293T, ou une cellule du système immunitaire et plus particulièrement une cellule du système immunitaire choisie parmi les mastocytes, les lymphocytes, en particulier les lymphocytes T et B, les cellules dendritiques, en particulier les cellules de Langerhans, ou la mise en contact d'une cellule productrice d'exosomes avec une ou plusieurs vésicule(s) membranaire(s) selon l'une quelconque des revendications 33 à 36, qui comporte(nt) un polypeptide comprenant ledit peptide ou polypeptide d'intérêt et/ou un produit de dégradation de ce polypeptide, b) la culture de ladite cellule productrice d'exosomes; c) la récupération des vésicules membranaires et en particulier des exosomes produit(e)s par ladite cellule productrice d'exosomes. 51. Procédé selon la revendication 50, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape intermédiaire entre les étapes a) et b), au cours de laquelle la cellule est sélectionnée et/ou stimulée pour induire et/ou augmenter la sécrétion des exosomes ou pour induire une spécificité dans la composition des exosomes en certaines protéines cellulaires, par exemple la protéine ICAM. 52. Procédé de préparation d'un sérum polyclonal dirigé contre un ou plusieurs peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt exprimé(s) à la surfâce de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, comprenant les étapes suivantes : a) l'administration, le cas échéant répétée, à un animal non humain, de vésicules membranaires selon l'une quelconque des revendications 33 à 36, d'une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 37 à 39 ou 44 à 46, ou d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 40 à 43, associés ou non à un adjuvant; et b) la récupération des anticorps formés, capables de reconnaître le ou les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. 53. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre un ou plusieurs peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) exprimé(s) à la surface de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, comprenant les étapes suivantes : a) la fusion, avec des cellules de myélome, de cellules spléniques préalablement obtenues chez un hôte (humain ou non humain), par exemple une souris Balb/c, auquel on a administré des vésicules membranaires selon l'une quelconque des revendications 33 à 36, une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 37 à 39 ou 44 à 46 ou un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 40 à 43, le cas échéant en association avec un adjuvant et le cas échéant par administration répétée; b) la culture et la sélection des hybridomes dans des conditionspermettant la production d'anticorps; c) la récupération des anticorps monoclonaux dirigés contre les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. 54. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux dirigés contre un ou plusieurs peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) exprimé(s) à la surface de vésicules membranaires, en particulier d'exosomes, comprenant les étapes suivantes : a) l'immortalisation de cellules productrices d'anticorps, par exemple des lymphocytes ou des lymphoblastes, à partir de cellules hématopoïétiques, plus particulièrement de cellules du sang, préalablement obtenues chez un hôte (humain ou non humain), par exemple une souris Balb/c, auquel on a administré des vésicules membranaires selon l'une quelconque des revendications 33 à 36, une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 37 à 39 ou 44 à 46 ou un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 40 à 43, le cas échéant en association avec un adjuvant et le cas échéant par administration répétée; b) la culture et la sélection des cellules immortalisées dans des conditions permettant la production d'anticorps; c) la récupération des anticorps monoclonaux dirigés contre les peptide(s) ou polypeptide(s) antigénique(s) d'intérêt. 55. Procédé de criblage in vitro de molécules interagissant avec un peptide ou un polypeptide d'intérêt ou avec un fragment dudit peptide ou un polypeptide d'intérêt, ledit procédé comprenant : a) la mise en contact de vésicules membranaires selon la revendication 36 avec une ou plusieurs molécules susceptibles d'interagir avec ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ; b) la détection d'une éventuelle interaction entre ledit peptide ou polypeptide d'intérêt ou un fragment dudit peptide ou polypeptide d'intérêt et ladite ou lesdites molécules.