Brevet FR2934492A1 — publié le 20100205

La présente invention est relative au domaine des médicaments pour le traitement du cancer. Plus précisément, la présente invention a pour objet l'association médicamenteuse d'un ligand de TLR3 et d'un agent de chimiothérapie ou de radiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de � l'apoptose � permettant d'obtenir un effet synergique dans le cadre du traitement d'un cancer. Les traitements de lutte contre le cancer font l'objet d'une recherche active. La demande WO2006/014653 a mis en évidence que le récepteur TLR3 (de l'anglais � Toll Like Receptor 3 �) est une cible thérapeutique dans le traitement du cancer. Comme mentionné dans la demande WO2006/014653, la famille des TLRs comprend des récepteurs protéiques fortement conservés, nommés TLR1 à TLR10. Ces TLRs humains sont des protéines transmembranaires de type 1 comportant un domaine extracellulaire récepteur du � signal de danger � et composé de nombreux motifs LRRs (de l'anglais � Leucine-Rich Repeats �), un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire contenant un Death Domain permettant la transduction du signal d'activation. Bien que les TLRs des mammifères présentent un grand nombre de caractéristiques communes et des mécanismes de transduction du signal conservés, leurs fonctions biologiques sont très différentes. Quand un TLR est activé, il sélectionne une molécule nommée adaptateur pour propager le signal par l'intermédiaire de son � Death Domain �. Cinq adaptateurs sont connus dans la famille des TLRs : MyD88, TIRAP (également nommé MAL), TRIF, TRAM et SARM. Les différentes fonctions biologiques sont fortement liées au fait que ces 5 différents adaptateurs sont associés dans des combinaisons variées avec les TLRs et sont les médiateurs de différents modes de signalisation. De plus, les TLRs sont exprimés de manières différentes dans les cellules hématopoïétiques et non hématopoïétiques. Par conséquent, la réponse d'un ligand TLR dépend d'une part du mode de signalisation du TLR et d'autre part de la nature des cellules dans lesquelles le TLR est exprimé. La séquence des TLR humains 1 à 10 est décrite dans la demande brevet W001/90151, bien que la séquence de ces protéines soit nommée différemment par 'rapport à la nomenclature publique. La séquence nucléotidique et la séquence d'acide aminé du TLR3 sont accessibles dans � GenBank � respectivement sous les numéros NM003265 et NP003256. L'expression des récepteurs TLR par les cellules cancéreuses humaines a conduit à l'étude des effets de leurs ligands sur la croissance tumorale. En particulier, les effets de l'activation de TLR3 sur des lignées de cancer du sein (Salaun B et al.: TLR3 can directly trigger apoptosis in human cancer cells, J Immunol 2006, 176:4894-4901), de mélanome (Salaun et al.: Tolllike receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy?, Clin Cancer Res 2007, 13:4565-4574), de myélome ()ego et al.: Pathogenassociated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors, Leukemia 2006, 20:1130-1137), d'hépatome (Khvalevsky et al.: TLR3 signaling in a hepatoma tell line is skewed towards apoptosis, J Cell Biochem 2007, 100:1301-1312), du cancer du rein à cellules claires (Morikawa et al.: Identification of Toll-like receptor 3 as a potential therapeutic target in clear cell renal tell carcinoma, Clin Cancer Res 2007, 13:5703-5709), de cancer de la prostate (.Paone et al.: Toll-like receptor 3 triggers apoptosis of human prostate cancer cells through a PKCûa dependent mechanism, Carcinogenesis 2008), du gliome et du mésothéliome (observations non publiées) ont été analysés. Plusieurs ligands de TLR3 sont connus, notamment les ARN double brin viraux et synthétiques, tels que l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly(I:C)), l'acide polyadénilique-polyuridilique (poly(A:U)) et la forme modifiée (polyI:polyC12U) (Carter et al.: Comparative studies of ampligen (mismatched double-stranded RNA) and interferons, J Biol Response Mod 1985, 4:613-620) qui sont des ligands de haut poids moléculaire et de taille hétérogène (Alexopoulou et al.: Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3, Nature 2001, 413:732-738). Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence que les ligands de TLR3 qui agissent par la caspase 8, et donc par la voie extrinsèque de l'apoptose, conduisent, en combinaison avec des agents agissant par la voie intrinsèque, à un effet synergique, notamment sur l'apoptose des cellules de NSCLC. Les résultats présentés ci-après montrent des résultats de synergie obtenus avec différents agents, soit de radiothérapie, soit de chimiothérapie, et appartenant à des classes distinctes d'agents de chimiothérapie et ce de façon très reproductible. L'effet synergique mis en évidence dans le cadre de la présente invention n'était nullement évident, compte tenu du fait que : - le rôle essentiel de la voie extrinsèque de l'apoptose pour induire la mort des cellules cancéreuses par l'activation de TLR3 n'avait pas été formellement démontré, - de nombreux TLRs (y compris TLR3) sont capables d'activer la transcription de facteurs de survie dans de nombreux types cellulaires (Jego et al.: Pathogen-associated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors, Leukemia 2006, 20:1130-1137 ; .Hasan et al.: TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancer-associated human papillomavirus type 16, J Immunol 2007, 178:3186-3197; Bsibsi et al.: Identification of soluble CD14 as an endogenous agonist for Toll-like receptor 2 on human astrocytes by genome- scale functional screening of glial cell derived proteins, Glia 2007, 55:473- 482). des revues scientifiques récentes émettent des doutes sur la possibilité de combiner des ligands de TLR avec la chimiothérapie ou la radiothérapie pour traiter les cancers (Kelly et al.: TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer, Cancer Res 2006, 66:3859-3868 ; .Huang et al.: Listeria monocytogenes promotes tumor growth via tumor cell toll-litre receptor 2 signaling, Cancer Res 2007, 67:4346-4352; Chen et al.: Regulation of IKKbeta by miR-199a affects NF-kappaB activity in ovarian cancer cells, Oncogene 2008). Dans ce contexte, l'invention concerne un médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer. De façon avantageuse, le médicament selon l'invention comprend une administration successive (i) d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose (ii) puis d'un ligand de TLR3 dans le traitement du cancer. Plus précisément, ce médicament est destiné au traitement du cancer pulmonaire épidermoïde, de l'adénocarcinome du colon, du mésothéliome, du gliome, de l'adénocarcinome du sein, du mélanome, du cancer du rein à cellules claires, du cancer de la prostate, de l'hépatocarcinome ou du myélome multiple. L'agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose peut être un agent de chimiothérapie ou de radiothérapie, l'utilisation d'un agent de chimiothérapie étant préférée. Selon un mode de réalisation préféré qui conduit à un effet synergique important, l'agent de chimiothérapie est un agent alkylant dérivé du platine, par exemple choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine. Selon un autre mode de réalisation préféré qui conduit à un effet synergique important, l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la topoisomérase 2, par exemple choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine. De manière avantageuse, le ligand de TLR3 utilisé en combinaison avec les agents de chimiothérapie ci-dessus est un agoniste de TLR3, et notamment un ARN double brin synthétique, tel que le poly(I :C). La présente invention a donc pour objet, selon un mode de réalisation particulier, un médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ARN double brin synthétique, ligand de TLR3 et en particulier agoniste, tel que le poly(I :C), et (ii) un agent alkylant dérivé du platine, par exemple choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine, ou un inhibiteur de la topoisomérase 2, par exemple choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le médicament se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique unique combinant, dans une même formulation, (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie activant la voie intrinsèque de l'apoptose. L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un ligand de TLR3 et d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose pour la préparation d'un médicament tel que défini ci-dessus. Les méthodes de traitement correspondant à l'administration d'un tel médicament font également partie intégrante de l'invention. Définitions Le terme � ligand � désigne toute molécule capable de se lier 10 spécifiquement à une autre molécule ou à un récepteur. Le terme � ligand � inclut à la fois les agonistes et antagonistes. Un ligand peut être, par exemple, une petite molécule organique, un anticorps ou fragment d'anticorps, un oligonucléotide ou un oligonucléotide modifié, un polypeptide, un ADN ou un ARN. A partir des séquences d'acide 15 nucléique et d'acide aminé du TLR3, l'homme du métier est capable de produire un anticorps reconnaissant la protéine, un oligonucléotide ou un oligonucléotide modifié, un polypeptide, un ADN ou un ARN selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Notamment, les ligands de TLR3 du type ARN synthétique double brin, tels que décrits en pages 20 à 26 20 de la demande de brevet WO2006/054177 sont préférés dans le cadre de l'invention. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer les dsRNA synthétiques poly(A:U), poly(I:C) commercialisés par la société Invivogen. Le terme � agoniste � désigne un ligand capable de se lier à un récepteur et de l'activer. Pour plus de détails sur les agonistes de TLR3 qui 25 peuvent être utilisés, dans le cadre de l'invention, on pourra se référer à la demande de brevet WO2006/054177, incorporée par référence. Les agonistes de TLR3 peuvent être identifiés par la démonstration de leur liaison directe ou indirecte au récepteur (par exemple par des techniques biochimiques, de microscopie ou de cytométrie de flux), et par la 30 démonstration de leur capacité à activer dans des cellules exprimant le TLR3 fonctionnel au moins une des fonctions biologiques déclenchées par TLR3 : production de cytokines inflammatoires, d'interféron de type 1, d'activation de NF-kB et des MAPK p38 et JNK (Uematsu et al.: Toll-like receptors and Type I interferons, J Biol Chem 2007, 282:15319-15323). Le terme � antagoniste � désigne un ligand capable de se lier à un récepteur et d'empêcher son activation. De manière alternative, un antagoniste peut se lier à un agoniste du récepteur et ainsi l'empêcher de se lier à un récepteur. Les antagonistes de TLR3 ainsi définis sont capables de bloquer l'activation d'au moins une des fonctions biologiques déclenchées par un agoniste de TLR3. Le terme � apoptose � désigne la mort programmée de cellules. Par � agent activant la voie intrinsèque de l'apoptose �, on entend les agents qui activent directement ou indirectement la voie de l'apoptose dépendant de la mitochondrie, comme il peut être établi en démontrant le rôle protecteur de la surexpression combinée des molécules Bd-2 et Bcl-XL (Galluzzi et al.: Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis, Apoptosis 2007, 12:803-813). Par � agent de chimiothérapie �, on désigne toute molécule chimique utilisée dans le traitement du cancer. A titre d'exemple d'agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, on peut citer les agents alkylants dérivés du platine, les inhibiteurs de la topoisomérase 2, les agents anti-métabolites tels que la gemcitabine et la 5-fluorouracile, les inhibiteurs de la dépolymérisation des microtubules tels que le paclitaxel et le docétaxel. Dans le cadre de l'invention, les agents alkylants dérivés du platine et les inhibiteurs de la topoisomérase 2 qui conduisent à des effets synergiques 25 plus marqués sont préférés. Par � agent aikylant dérivé du platine�, on entend les molécules capables de se fixer à l'ADN de manière covalente par l'intermédiaire d'un atome de platine. A titre d'exemple, on peut citer l'oxaliplatine, le cisplatine, le carboplatine. 30 Par � inhibiteur de la topoisomérase 2 �, on entend une molécule capable d'empêcher la fonction de l'enzyme topoisomérase 2 qui change la topologie de la molécule d'ADN et contrôle la torsion et l'enroulement des deux brins de la molécule. On met en évidence l'activité topoisomérase par l'apparition de complexe de haut poids moléculaire formé à partir d'anneaux d'ADN double brin en présence de l'enzyme et d'ATP. Ces complexes sont révélés par un ralentissement de vitesse de migration de l'ADN dans un gel ou directement visualisés par microscopie électronique (Goto et al.: Cloning of yeast TOP1, the gene encoding DNA topoisomerase I, and construction of mutants defective in both DNA topoisomerase I and DNA topoisomerase II, Proc Natl Acad Sci U S A 1985, 82:7178-7182). A titre d'exemple d'inhibiteur de la topoisomérase 2, on peut citer l'étoposide, le ténoposide, la doxorubicine et l'adriamycine Le terme � cancer � désigne toute condition pathologique qui est typiquement caractérisée par une croissance déréglée des cellules. A titre d'exemple de cancer, on peut citer les carcinomes, lymphomes, blastomes, sarcomes et leucémies, et plus précisément le cancer pulmonaire épidermoïde, l'adénocarcinome du colon, le mésothéliome, le gliome, l'adénocarcinome du sein, le mélanome, le cancer du rein à cellules claires, le cancer de la prostate, l'hépatocarcinome et le myélome multiple. Le terme � traitement � désigne toute mesure thérapeutique prophylactique ou suppressive d'une maladie ou désordre conduisant à un effet clinique souhaitable ou à tout effet bénéfique, incluant notamment la suppression ou la diminution de un ou plusieurs symptômes, la régression, le ralentissement ou la cessation de la progression du cancer ou du désordre qui y est associé. Par � quantité thérapeutiquement efficace �, on désigne toute quantité 25 d'une composition qui améliore un ou plusieurs des paramètres caractéristiques du cancer. Les deux traitements, celui avec le ligand de TLR3 et celui avec l'agent de chimiothérapie ou de radiothérapie, peuvent être simultanés séquencés, successifs, étalés dans le temps. Lorsque deux principes actifs sont 30 administrés, les deux principes actifs, à savoir le ligand de TLR3 et l'agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, utilisés en combinaison dans le cadre de l'invention, peuvent être administrés séparément, chacun dans une composition pharmaceutique distincte, l'administration pouvant être simultanée ou étalée dans le temps, ou administrés conjointement dans une composition pharmaceutique unique, l'administration étant alors simultanée. Différents ordres d'administration ou de traitement peuvent être prévus dans le cadre d'une administration étalée dans le temps. Le ligand de TLR3 peut être administré avant (par exemple, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines avant), de manière concomitante, ou après (par exemple, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 heure, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures, 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines, 4 semaines, 5 semaines, 6 semaines, 8 semaines, ou 12 semaines après) l'administration de l'agent de chimiothérapie ou l'irradiation. De préférence, l'étalement dans le temps de l'administration du ligand de TLR3 et de l'agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose sera celui qui permet la plus forte synergie entre l'activation des voies extrinsèques et intrinsèques de l'apoptose des cellules cancéreuses, respectivement. En particulier, la présente invention a également pour objet l'ordre d'administration des deux agents qui commence par l'administration de l'agent de chimiothérapie ou de radiothérapie qui entraîne des dommages de l'ADN, et qui se poursuit par celle du ligand de TLR3 qui entrave le processus de réparation de l'ADN. Cette séquence d'administration augmente significativement la synergie de l'activité pro-apoptotique des 2 agents. La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques contenant avec des excipients convenables, séparément ou sous une formulation unique, une dose efficace d'un ligand de TLR3, et d'un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, le ou les principes actifs choisis parmi les ligands de TLR3, et les agents de chimiothérapie agissant sous la voie intrinsèque de l'apoptose, peuvent être administrés sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement des troubles ou des cancers ci-dessus. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Pour l'application topique, on peut utiliser les principes actifs dans des crèmes, pommades, solutions, lotions ou collyres. Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, chaque dose unitaire peut contenir de 0,1 à 10000 mg, de principe actif en combinaison avec un support pharmaceutique. Cette dose unitaire peut être administrée 1 à 5 fois par jour de façon à administrer un dosage journalier permettant d'obtenir l'effet souhaité. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Les compositions pharmaceutiques peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement ave un ou plusieurs supports ou additifs, ou bien avec des matrices telles qu'un polymère ou une cyclodextrine (patch, formes à libération prolongée). Dans le cas où l'agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose est un agent de radiothérapie, ce dernier pourra être tout type de radiation utilisée pour traiter le cancer. On peut citer les radiations ionisantes qui entrainent la destruction de cellules tumorales ou endommagent l'ADN dans la zone à traiter, et notamment les rayons X ou gammas ou type de brachythérapie, irradiation, interstitielle ou intracavitaire bien connue de l'homme du métier. Les dosages habituels pourront être utilisés. Le traitement associant un agent de chiomiothérapie et un ligand de TLR3 peut également être complété par une radiothérapie. Le traitement par radiothérapie peut être effectué avant, pendant ou après l'administration de la composition pharmaceutique, un espacement de 1 minute à 96 heures pouvant être prévu entre la radiothérapie et l'administration de la composition. La partie expérimentale qui suit, en référence aux figures annexées, permet d'illustrer l'invention, et n'a aucun caractère limitatif. Les Figures 1A et 1B représentent les variations de pourcentages de cellules de la lignée NCIH-1703 vivantes en fin de culture en présence de combinaisons de différentes concentrations d'étoposide et de Poly(I :C) par rapport à la culture non traitée. La Figure 2 montre le % de cellules NCIH-H1703 marquées par l'Annexin V en fin de culture après traitement avec le Poly(I :C) déterminé en cytométrie de flux. Les Figures 3A et 3B représentent des isobologrammes mettant en évidence l'action synergique de Poly(I :C) avec le cispiatine et l'étoposide. Les Figures 4A et 4B montrent le % de cellules marquées par l'Annexin V en fin de culture après traitement avec le Poly(I :C), l'étoposide et une combinaison des deux. La Figure 5 montre le % de cellules NCI-H292 mortes après traitement 20 avec le Poly(I :C), après irradiation (2Gy) et après une combinaison des deux. Matériels et Méthodes 25 Réactifs Le Poly(I:C) a été acheté chez Invivogen (San Diego, CA, USA), la trypsine (5% Trypsine EDTA) et le DPBS lx chez Invitrogen (Cergy Pontoise, France). Les agents de chimiothérapie représentant différentes classes ont été utilisés : agents alkylants (Cispiatine (Cisplatin, Dako), Oxaliplatine 30 (Eloxatine, Sanofi-Aventis)) ; inhibiteurs de topoisomérase 2 (Etoposide (Etoposide, Merck); Doxorubicine (Adriblastine, Pfizer)) ; antimétabolite (5-Fluoro-Uracil (Fluouracile, Teva)) ; stabilisateurs des microtubules de la famille des taxanes (Paclitaxel (Taxol, Bristol Meyers), Docetaxel (Taxotere, Aventis)). Cellules et Conditions générales de culture cellulaire Les cellules NCI-H292 et NCI-H1703 sont des lignées de cancer pulmonaire épidermoïde obtenues auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection). Les cellules sont cultivées en boites de 100 mm de diamètre dans un milieu complet RPMI 1640 avec glutabio (Laboratoires Eurobio, Les Ulis, France) supplémenté par 10 % de sérum de veau foetal (SVF) (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et contenant 100 U/ml de pénicilline (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 0,1 mg/ml de streptomycine (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 1 mM de Sodium-pyruvate (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), 10 pM d'HEPES (Institut de Biotechnologies Jacques Boy, Reims, France). Ces cellules sont maintenues à 37° C dans une atmosphère à 5% de CO2. Interférence avec 1ARN (RNAi) Les duplexes de siRNA (small interfering RNA) contrôle (Dharmacon) et spécifiques de caspase 8 et de caspase 9 (Qiagen) utilisés sont les suivants : 1) contrôle : on-targetplus sicontrol non-targeting siRNA #3 ; caspase 8 sens 5'-r(GAG UCU GUG CCC AAA UCA A)dTdT-3', caspase 8 anti-sens 5'-r(UUG AUU UGG GCA CAG ACU C)dTdT-3' ; caspase 9 sens 5'-r(GAG UGG CUC CUG GUA CGU U)dTdT-3', caspase 9 anti-sens 5'-r(AAC GUA CCA GGA GCC ACU C)dTdT-3'. Les siRNAs ont été transfectés par l'agent de transfection HiPerFect (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, les cellules NCI-H1703 ou NCI-H292 sont cultivées en boîte de 100 mm puis sont décollées par la trypsine et déposées dans des puits de plaques 24 puits à raison de 50 000 cellules par puits dans 400 pl de milieu, et incubées à 37°C pendant la préparation des mix. Pour cela, et pour un puits d'une plaque 24 puits : les duplexes de siRNAs sont dilués dans 100 pl de milieu de culture sans sérum ni antibiotiques, 3 pl de HiPerFect sont ajoutés, puis la solution est vortexée et incubée 5-10 min à température ambiante. Les 100 pl de mix sont ensuite ajoutés goutte à goutte sur les cellules et le tout est homogénéisé en remuant la plaque. Le milieu de culture est changé le lendemain. La concentration finale en siRNA est de 5 nM, et le traitement par le poly(I:C) est débuté 72 h après transfection. Pour ces conditions, l'efficacité des siRNAs caspase 8 et caspase 9 pour diminuer respectivement le niveau d'expression des protéines caspase 8 et de caspase 9 a été mesurée par Western blot, et atteint environ 85 % pour le siRNA caspase 8 et 75 % pour le siRNA caspase 9. Conditions de cultures des combinaisons chimiothérapie + Po/y(I:C) Les cellules ont été ensemencées en plaque 96 puits à raison de 5 000 cellules pour 100 pl de milieu complet par puits. Les différents agents de chimiothérapie ont été ajoutés aux concentrations finales décroissantes de 1 mM, 200 uM, 40 uM, ou 8 uM (pour l'oxaliplatine et le 5-FU) ou de 100 uM, 20 uM, 40 uM, et 0,8 uM (pour le cisplatine, le gemcitabine, l'étoposide, la doxorubicine, le paclitaxel et le docetaxel). Après 2h d'incubation à 37°C, les milieux de culture ont été aspirés et remplacés par 100 pl de milieu complet contenant des concentrations décroissantes de Poly(I:C) (100 ug/mI, 20Jg/ml, 4pg/ml, 0,8pg/ml), et les cellules ont été remises en culture pendant 70h. Chaque condition de traitement a été réalisée en duplicata. Les résultats sont exprimés en nombre relatif de cellules viables par rapport aux cultures témoins non traitées. Analyse du nombre de cellules vivantes L'analyse a été réalisée à l'aide du kit CellTiter 96� AQueous One solution Cell proliferation Assay (Promega, Charbonnière, France) suivant les indications du fabricant. Brièvement, 20 pl de MTS ont été ajoutés au milieu de culture de chaque puits. Les cellules ont été placées pendant 2h dans l'incubateur à 37°C. L'analyse de l'absorbance à 490 nm s'est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre (Multiskan� Ex ; Thermo Fisher Scientific). Une seconde mesure à 690 nm a permis l'exclusion de l'absorbance non spécifique. La Densité Optique de base (blanc) représente la moyenne de 3 puits contenant le milieu de culture seul et a été soustraite des valeurs enregistrées. Chaque valeur correspond à la moyenne des DO des duplicatas. Les résultats sont exprimés en valeurs relatives des DO par rapport aux cultures témoins non traitées. Marquage Annexin V-FITC/Iodure de Propidium Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits à raison de 3,5.104 cellules par puits. Après 48h, le milieu de culture est remplacé aux différents temps par du milieu de culture seul ou contenant 100 pg/ml de Poly(I:C). Le surnageant est récupéré et les cellules sont rincées au DPBS (de l'anglais � Dulbecco's Phosphate Buffered Saline �). Comme précédemment, le surnageant est récupéré et les cellules sont traitées à la trypsine. Une fois les cellules détachées, l'action de la trypsine est arrêtée avec du milieu de culture. L'ensemble est récupéré et mélangé aux surnageants précédemment récupérés. Les cellules sont centrifugées (1400 tour/min, 5 min) et le surnageant est éliminé. Le marquage Annexin V-FITC/Iodure de propidium s'effectue à l'aide d'un kit Annexin V-FITC kit (AbCys SA, Paris, France) suivant les indications du fabricant. Brièvement, les cellules sont remises en suspension dans 100 pl de tampon de liaison, puis incubées pendant 10 à 15 minutes à température ambiante et à l'abri de la lumière avec 2,5 pl d'Annexin V. Un volume suffisant d'iodure de propidium est rajouté pour obtenir une concentration finale à 1 pg/ml. Les échantillons sont analysés avec un cytomètre de flux FACScablibur (BD Bioscience, San Jose, CA., USA) et les données traitées à l'aide du logiciel FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA, USA). Analyse mathématique des effets de la combinaison de la chimiothérapie et du Poly(I :C) sur la survie cellulaire Les IC50s (Concentration. Inhibitrice 50%) de chacune des molécules utilisées seules ou en combinaison ont été déterminées, et définies comme les doses nécessaires pour obtenir 50% de cellules en moins que le contrôle non traité en fin de culture. Les IC50s représentent les moyennes de toutes les expériences réalisées. Pour déterminer mathématiquement la nature de l'interaction entre les deux molécules, deux méthodes complémentaires ont été utilisées : le calcul de l'index de combinaison (CI) (Chou et al. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors, Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55) et la construction de l'isobologramme (Steel et al. Exploitable mechanisms in combined radiotherapy-chemotherapy: the concept of additivity, Int J Radiat Oncol Biol Phys 1979, 5:85-91). L'unité d'IC50 des chimiothérapies a été homogénéisée au ug/ml. L'ensemble de ces IC50s permet de calculer les CIs (Index de Combinaison), définis par l'équation (IC5Ochimiothérapie/poly(I:C) / ICSOchimiothérapie) + (ICSOpoly(I:C)/chimiothérapie / IC50poly(I:C)) + ((IC5Ochimiothérapie/poly(I:C) X ICSOpoly(I:C)/chimiothérapie) / (IC5Ochimiothérapie X IC5Opoly(I:C))), oÛ ICSOchimiothérapie et IC5Opoly(I:C) représentent respectivement les IC50s de la chimiothérapie et du poly(I :C) utilisés seuls, et IC5Ochimiothérapie/poly(I:C) et IC50poly(I:C)/chimiothérapie représentent respectivement les IC50s de la chimiothérapie et du poly(I :C) utilisés en combinaison. La moyenne de l'ensemble des CIs est calculée afin d'obtenir le CI moyen déterminant la nature de l'interaction entre les 2 molécules, selon sa valeur : CI : 0,1 ù 0,9 = synergie ; CI = 0,9 ù 1,1 = additivité ; CI = 1,1 ù 10 = antagonisme. Interprétation des valeurs de CI (Chou et al.1984) 0,3 ù 0,7 synergie 0,7 ù 0,85 synergie modérée 0,85 ù 0,9 synergie faible 0,9 ù 1,1 additivité 1,1ù 1,2 antagonisme faible 1,2 ù 1,45 antagonisme modéré 1,45 ù 3,3 antagonisme Pour construire les isobologrammes, l'abscisse et l'ordonnée représentent respectivement les IC50s du poly(I:C) et de l'agent de chimiothérapie. Sur l'abscisse est reportée l'IC50 du poly(I:C) utilisé seul, et sur l'ordonnée celle de la molécule de chimiothérapie utilisée seule. Une droite relie ces deux20 points : elle représente la droite d'additivité théorique. Sur le graphe sont reportées les IC50chimiothérapie/poly(I:C) et IC50poly(I:C)/chimiothérapie• Ces points sont reliés et constituent une courbe ayant pour extrémités les croisements entre la droite d'additivité et les axes des abscisses/ordonnée. Si la courbe est confondue avec, ou très proche de la droite d'additivité, on identifie une additivité entre le poly(I:C) et l'agent de chimiothérapie. Si la courbe est au dessous ou au dessus, les deux molécules agissent respectivement en synergie ou en antagonisme. Conditions de cultures des combinaisons radiothérapie + Poly(I:C) Les cellules sont ensemencées la veille dans des boites de T25 (25 cm2) à raison de 1.106 cellules/boites. Après 24h, le milieu de culture est remplacé par un milieu de culture simple ou contenant du poly(I :C) (10pg/ml). Une heure après le changement de milieu, les cellules reçoivent différentes doses d'irradiations (2, 5, 10 Gy). Après 24h, les cellules sont marquées à l'aide d'un kit Annexin V-FITC/Iodure de Propidium comme décrit précédemment. Résultats L 'étoposide et le Po/y(I:C) ont un effet complémentaire in vitro sur la réduction du nombre de cellules vivantes de cancer du poumon. Les variations de pourcentages de cellules de la lignée NCIH-1703 vivantes en fin de culture en présence de combinaisons de différentes concentrations d'étoposide et de Poly(I :C) par rapport à la culture non traitée sont présentées sur les Figures 1A et 1B. Les Figures 1A et 1B représentent respectivement le pourcentage de cellules vivantes en fin de culture en fonction de (A) la concentration d'étoposide ou de (B) celle du Poly(I :C). Chaque Figure est représentative de 6 expériences réalisées indépendamment. On observe que l'effet d'une concentration intermédiaire de Poly(I :C) seul (p.ex. 4pg/ml) qui réduit le nombre de cellules vivantes de -35% est multiplié par 2 (réduction de X70%) par une pré-incubation pendant 2h avec 20NM d'étoposide (Figure 1A). Réciproquement, l'étoposide seul à la concentration de 4pM entraîne une perte d'environ 25% de cellules viables, et cette réduction s'élève à -60% après addition de 60 pg/ml de Poly(I :C) (Figure 1B). Le Po/y(1 :C) induit l'apoptose des cellules de lignées cancéreuses en activant la voie extrinsèque En relation avec le mécanisme de réduction du nombre de cellules vivantes, le % de cellules marquées par l'Annexin V en fin de culture après traitement avec le Poly(I :C) a été déterminé en cytométrie de flux. La Figure 2 met en évidence l'effet de la transfection des siRNAs caspase 8 et caspase 9 sur le pourcentage de cellules Annexin V positives induites par le traitement au poly(I:C). 72h après transfection des siRNA contrôle (sictrl), caspase 8 (sicasp8), caspase 9 (sicasp9) ou caspase 8 + caspase 9 (sicasp8+9), les cellules NCI-H1703 sont traitées ou non avec 100 pg/ml de poly(I:C) pendant 24h. Le pourcentage de cellules Annexin V positives est mesuré par cytométrie de flux. Les résultats présentés sont la moyenne de 3 expériences réalisées indépendamment. Barre d'erreur, +/- SE. La Figure 2 montre que �1/3 des cellules NCI-H1703 sont en apoptose 24h après exposition au ligand de TLR3 (contre 11% dans les puits contrôle). L'inhibition de l'expression de la caspase 8 (par transfection d'un siRNA spécifique) diminue très significativement le % de cellules apoptotiques (.20%), tandis que la suppression de l'expression de la caspase 9 n'a pas d'effet significatif sur l'apoptose. Des résultats similaires ont été obtenus avec la lignée NCI-H292. Il apparaît donc que le Poly(I :C) induit l'apoptose des lignées de cancer du poumon analysées, et que cette apoptose survient par activation de la voie extrinsèque de l'apoptose. Le Po/y(I:C) a un effet synergique avec de nombreux agents de chimiothérapie La comparaison de l'IC50 du Poly(I:C) utilisé seul ou en combinaison avec différentes molécules représentant les quatre classes principales d'agents de chimiothérapie permet de calculer un index de combinaison (CI) qui selon sa valeur renseigne une synergie (CI 1). Les valeurs des CI calculés pour les différents agents de chimiothérapie, présentées dans le Tableau 1 ci-après, montrent une forte synergie sur les lignées NCI-H1703 et NCI-H292 avec les agents alkylants dérivés du platine (cisplatine et oxaliplatine) et les inhibiteurs de la topoisomérase 2 (étoposide et doxorubicine). En ce qui concerne le 5- fluorouracile, le paclitaxel et le docetaxel, on observe une synergie modérée. Tableau 1 NCI-H 1703 Poiy(I:C) IC50 19,9 pg/ml (+/- 3,23 pg/ml) Agents alkylants dérivés du platine (n=5) IC50 1,1 uM +/- 0,13 uM CI 0,62 +/- 0,03 (n=3) IC50 170,0 uM +/- 67,57 uM CI 0,67 +/- 0,177 (n=5) 3,4 uM +/- 0,8 uM 0,50 +/- 0,08 (n=3) 123,3 uM +/- 43,33 uM 0,63 +/- 0,19 Cisplatine Oxaliplatine NCI-H292 14,3 uM (+/- 2,09 pg/ml) Inhibiteur de topoisomérase 2 (n=6) (n=3) Etoposide IC50 32,67 uM +/- 10,56 uM 18,67 uM +/- 6,96 uM CI 0,59 +/- 0,06 0,68 +/- 0,11 Doxorubicine (n=3) (n=3) IC50 3,73 uM +/- 2,14 uM 1,03 uM +/- 0,3 uM CI 0,72 +/- 0,06 0,62 +/- 0,08 Agent anti-métabolite 5-fluorouracile IC50 CI (n=3) 133uM+/-12uM 0,78 +/- 0,09 Inhibiteurs de la dépolymérisation des microtubules (n=3) (n=3) Paclitaxel IC50 0,12 uM +/- 0,09 uM 0,21 uM +/- 0,14 uM CI 0,83 +/- 0,012 0,71 +/- 0,0064 Docetaxel (n=3) IC50 10,6uM+/- 9,7 uM CI 0,68 +/- 0,2 L'analyse par isobologramme illustre la synergie de la combinaison du Po/y(I:C) avec le cisplatine et l'étoposide sur la lignée NCI-H292H-1703 Les IC50 du cisplatine, de l'étoposide et du Poly(I :C) utilisés seuls avec les cellules de la lignée NCI-H292 sont respectivement de 3,4 uM (+/- 0,8 uM), 18,67 uM (+/- 6,96 uM) et 14,3 pg/ml (+/- 2,09 pg/ml) (Tableau 1). Les isobologrammes, qui représentent la moyenne de 6 expériences réalisées indépendamment, montrent que l'on diminue de 50% le nombre de cellules NCI-H292 vivantes en fin de culture en combinant le cispiatine à la concentration de -0,5mM avec le Poly(I :C) à la concentration de N0,5pg/ml (Figure 3A), ou l'étoposide à la concentration de -8mM avec le Poly(I :C) à la concentration de N2pg/mI (Figure 3B). Les isobologrammes illustrent l'action synergique de Poly(I :C) avec le cisplatine et l'étoposide. Des résultats semblables ont été obtenus pour la lignée NCI-H1703. Les activités pro-apoptotiques du Poly(I :C) et du cisplatine ou de l'étoposide sur les lignées de NSCLC s'additionnent Le Poly(I :C) induit l'apoptose des lignées de NSCLC NCIH-1703 et NCIH-292. Pour savoir si l'accentuation de la diminution du nombre de cellules vivantes après traitement avec la combinaison Poly(I :C) et cisplatine ou étoposide résultait au moins partiellement d'une augmentation de l'apoptose, les cellules ont été marquées avec l'Annexin V après 24h de culture comme renseigné dans le matériel et Méthodes. Les concentrations de Poly(I :C) et des agents de chimiothérapie ont été ajustées pour correspondre aux IC50 de chaque lignée. On observe pour les 2 lignées qu'une brève (2h) exposition des cellules au cispiatine avant l'addition du ligand de TLR3 augmente le pourcentage de cellules apoptotiques, mais cette augmentation n'est statistiquement significative que pour la lignée NCIH-292 (Figure 4A). Concernant l'étoposide, un effet additif significatif est observé pour les 2 lignées (Figure 4B). Il apparaît donc que l'addition des effets pro- apoptotiques des agents de chimiothérapie et du Poly(I :C) après 24h participe à la forte synergie observée quant aux nombre de cellules vivantes après 72h fin de culture. Effet synergique avec /a radiothérapie Considérant que TLR3 active la voie extrinsèque de l'apoptose, l'activité proapoptotique de la combinaison du Poly(I :C) avec l'irradiation (qui active la voie intrinsèque de l'apoptose) a été analysée. La Figure 5 montre qu'après 24h d'exposition à une irradiation de 2Gy, les cellules NCI-H292 ne présentent pas d'augmentation significative de la mort par rapport aux cellules non irradiées. La concentration de 10pg/ml de Poly(I :C) utilisé seul entraine une mort de 45% des cellules. La combinaison de l'irradiation par 2Gy avec 10pg/ml de Poly(I :C) entraine la mort de 55% des cellules, ce qui montre qu'il existe une synergie des 2 traitements pour entrainer la mort cellulaire. Par conséquent, l'ensemble de ces résultats établissent que l'activation de la voie extrinsèque de l'apoptose par un ligand de TLR3 dans les cellules cancéreuses humaines entraine une apoptose qui est augmentée par la combinaison avec un activateur de la voie intrinsèque de l'apoptose, avec observation d'un effet synergique.20 REVENDICATIONS1 - Médicament comprenant séparément ou ensemble (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose, pour une administration, simultanée ou étalée dans le temps dans le traitement du cancer. 2 - Médicament selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est destiné à une administration successive (i) d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose (ii) puis d'un ligand de TLR3 dans le traitement du cancer. 3 - Médicament selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est destiné au traitement du cancer pulmonaire épidermoïde, de l'adénocarcinome du colon, du mésothéliome, du gliome, de l'adénocarcinome du sein, du mélanome, du cancer du rein à cellules claires, du cancer de la prostate, de l'hépatocarcinome ou du myélome multiple. 4 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose est un agent de chimiothérapie. 5 - Médicament selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'agent de chimiothérapie est un agent alkylant dérivé du platine. 6 - Médicament selon la revendication 5 caractérisé en ce que l'agent alkylant dérivé du platine est choisi parmi le cisplatine et l'oxaliplatine. 7 - Médicament selon la revendication 4 caractérisé en ce que l'agent de chimiothérapie est un inhibiteur de la topoisomérase 2. 8 - Médicament selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'inhibiteur de la topoisomérase 2 est choisi parmi l'étoposide et la doxorubicine. 9 - Médicament selon l'une des revendications 4 à 8 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique unique combinant, dans une même formulation, (i) un ligand de TLR3 et (ii) un agent de chimiothérapie agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose. 10 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l'agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose est un agent de radiothérapie. 11 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est un ARN synthétique double brin. 12 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est un agoniste de TLR3. 13 - Médicament selon l'une des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le ligand de TLR3 est le poly(I:C). 14 - Utilisation d'un ligand de TLR3 et d'un agent agissant sur la voie intrinsèque de l'apoptose pour la préparation d'un médicament selon l'une des revendications 1 à 13.10