Brevet FR2927335A1 — publié le 20090814

La présente invention concerne un hydrolysat de protéines de poisson contenant des molécules immunologiquement apparentées à la famille des gastrines/cholecystokinines et pouvant exercer une activité satiétogène et réguler la prise alimentaire chez l'homme ou l'animal. L'invention concerne encore un procédé d'obtention d'un tel hydrolysat de protéines de poisson ainsi qu'une composition, un produit alimentaire, un complément alimentaire ou encore un médicament comprenant un tel hydrolysat de protéines de poisson. La surcharge pondérale est de plus en plus observée au sein de la population et devient une préoccupation constante. Un tel phénomène est le résultat d'un déséquilibre entre l'apport énergétique moyen et la somme des dépenses énergétiques. En effet, quand l'organisme reçoit plus qu'il ne dépense, il stocke une partie de l'apport énergétique sous forme de graisses dans les adipocytes constitutives du tissu adipeux. Ces cellules grossissent et entraînent alors une surcharge pondérale visible. Elles peuvent ensuite arriver à saturation et se multiplier. On parle alors d'obésité. Dans un tel cas, la surcharge pondérale est directement responsable de problèmes de santé divers tels que des problèmes cardiovasculaires, articulaires ou métaboliques. Les facteurs responsables de la surcharge pondérale sont de deux types: les facteurs génétiques d'une part, le mode de vie et le comportement alimentaire d'autre part. C'est sur le second type de facteur que se penchent actuellement les industries agroalimentaires et nutraceutiques en s'intéressant aux facteurs biologiques qui participent aux phénomènes physiologiques responsables du comportement alimentaire, et plus particulièrement du contrôle de la satiété. Un dérèglement de ce contrôle peut être non seulement la cause d'une surcharge pondérale, mais également celle de maladies sérieuses liées aux troubles de la conduite alimentaire telles que l'obésité, le diabète de type II, les accidents cardiovasculaires, l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypercholestérolémie. Les cholescystokinines, dénommés CCK par la suite, sont une famille de peptides neuroendocriniens. Elles sont sécrétées au niveau de la lumière de l'intestin grêle par des cellules entéroendocrines, ainsi qu'au niveau du système nerveux central, ce qui leur confère également un rôle dans le transfert de l'information entre le tractus gastro-intestinal et le cerveau [1, 2]. Le passage des aliments dans la partie duodénale de l'intestin grêle entraîne la sécrétion des CCK. Cette sécrétion engendre de nombreux processus physiologiques tels que la mobilité intestinale, la contraction de la vésicule biliaire, l'inhibition de la vidange gastrique, la stimulation de la sécrétion pancréatique et l'induction du phénomène de satiété [4]. La libération des CCK est due, en ordre d'importance, à l'action des composés protéiques, lipidiques et glucidiques [6]. De précédents travaux ont montré le fort potentiel satiétogène exercé par certains hydrolysats protéiques chez le rat [7, 8], le porc [5] et l'homme [9]. Les demandeurs ont alors découvert que des hydrolysats de protéines, ou peptidiques, obtenus à partir de l'hydrolyse enzymatique du muscle de certains poissons possédaient des propriétés stimulatrices de la sécrétion de CCK par des cellules entéroendocrines intestinales. L'invention concerne ainsi un hydrolysat de protéines de poisson qui se caractérise en en ce qu'il est obtenu par hydrolyse enzymatique d'au moins une source de protéines choisie parmi le groupe composé des espèces de poissons pélagiques Micromesistius poutassou, Clupea harengus, Scomber scombrus, Sardina pilchardus, Trisopterus esmarki, Trachurus spp., de poissons démersaux Gadus morhua, Pollachius virens, Melanogrammus aeglefinus, Coryphaenoides rupestris, de poissons appartenant à l'ordre des siluriformes, ladite hydrolyse enzymatique étant réalisée par un mélange d'enzymes comprenant des endopeptidases dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis et en ce qu'il présente: -la répartition du profil moléculaire suivant : de 23 à 31 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da, de 31 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 300 et 1 000 Da, de 28 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 1 000 et 3 000 Da, de 6 à 8 O) de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 3 000 et 5 000 Da et de 2 à 4 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 5 000 et 10 000 Da, - une teneur en lipides inférieure à 1 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en glucides inférieure à 0,1 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en protéines supérieure à 80 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en matière minérale comprise entre 10 et 20 %, en pourcentage de produit brut. et en ce qu'il contient des molécules immunologiquement apparentées aux cholescystokinines, ou CCK. L'hydrolysat de protéines selon l'invention permet la stimulation de la sécrétion de CCK endogènes par des cellules intestinales et l'apport de CCK exogènes, pouvant permettre le contrôle de la satiété comme le démontreront les exemples qui suivent. Selon une caractéristique de l'invention ledit hydrolysat de protéines de poisson présente la composition en acides aminés suivante : Acide glutamique 17,4 %, Acide aspartique 11,4 %, Lysine 10,2 %, Leucine 8,4 %, Arginine 6,1 %, Alanine 6,8 %, Valine 4,7 %, Isoleucine 4,2 %, Glycine 5 %, Thréonine 4,5 %, Sérine 4,4 %, Tyrosine 3,2 %, Phénylalanine 3,9 %, Méthionine 2,5 %, Proline 3,6 %, Histidine 1,9 %, Cystine 1 %, Tryptophane 0,8 %, en pourcentage en poids par rapport au poids total d'acides aminés. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ladite source de protéines de poisson se présente sous la forme de la pulpe du filet dudit ou desdits poissons. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ledit mélange d'enzymes comprend, de plus, une endopeptidase dérivée d'Aspergillus oryzae. Selon une caractéristique de l'invention, ledit mélange d'enzymes est choisi parmi le mélange CR1020 ou le mélange Protamex. Le mélange CR 1020 est commercialisé par la société Meatzyme (Chr Winthersvej 36A, 2800 Kgs Lyngby, Denmark). Le mélange Protamex est commercialisé par la société Novozyme (Krogshoejvej 36, DenmarK-2880 Bagsvaerd). La présente invention concerne encore un procédé d'obtention d'un hydrolysat de protéines à partir d'une source de protéines de poisson possédant des propriétés stimulatrices de la sécrétion des CCK au niveau de cellules intestinales et pouvant exercer un effet satiétogène et tel que défini précédemment. Le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend: - le broyage d'au moins une source de protéines choisie parmi le groupe composé des espèces de poissons Micromesistius poutassou, Clupea harengus, Scomber scombrus, Sardina pilchardus, Trisopterus esmarki, Trachurus spp., de poissons démersaux Gadus morhua, Pollachius virens, Melanogrammus aeglefinus, Coryphaenoides rupestris, de poissons appartenant à l'ordre des siluriformes. en présence d'eau, de manière à récupérer la pulpe de poisson, - l'hydrolyse enzymatique de ladite source de protéines à une température comprise entre 40 et 65°C, à un pH situé entre 6 et 9, pendant 1 à 5 heures, après l'ajout d'un mélange d'enzymes comprenant des endopeptidases dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis, de manière à obtenir un mélange réactionnel, - l'arrêt de ladite hydrolyse enzymatique par inactivation desdites enzymes après élévation de la température dudit mélange réactionnel à un niveau non inférieur à 70°C, pendant 8 à 20 minutes. - la séparation de l'hydrolysat de protéines obtenu du reste du mélange réactionnel. L'hydrolyse enzymatique de la pulpe des poissons précités permet l'obtention d'un hydrolysat de protéines de poisson présentant des propriétés stimulatrices de la sécrétion de CCK endogènes et permettant d'apporter des CCK exogènes. L'hydrolyse enzymatique est réalisée à l'aide d'un mélange d'enzymes soigneusement sélectionnées pour permettre d'obtenir un hydrolysat de protéines possédant les propriétés recherchées et précitées. Le procédé, de part la nature des enzymes, la température d'hydrolyse ainsi que l'absence de solvants, respecte les qualités organoleptiques et nutritionnelles des hydrolysats obtenus. Ces hydrolysats peuvent être incorporés dans des produits alimentaires, des compositions nutraceutiques ou des préparations pharmacologiques. Selon un mode de réalisation de l'invention, le broyage de la source de protéines est réalisé en présence d'eau selon un rapport massique source de protéines/eau de 1. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite hydrolyse enzymatique est réalisée selon un ratio enzyme/source de protéines compris entre 0,01 et 2%. Préférentiellement, le ratio enzyme/source de protéines est égal à 0,5 %. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite hydrolyse enzymatique est réalisée à une température de 60°C. Selon un mode de réalisation de l'invention, ladite hydrolyse enzymatique est réalisée à un pH de 7,5. Selon un mode de réalisation de l'invention, la séparation de l'hydrolysat de protéines obtenu du reste du mélange réactionnel est réalisée par centrifugation à une vitesse comprise entre 4000 et 7000 RPM et élimination du culot obtenu. La séparation de l'hydrolysat de protéines obtenu peut être réalisée par filtration dudit mélange réactionnel préalablement à ladite centrifugation. La filtration du milieu réactionnel permet d'éliminer les matières solides. Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit procédé comprend, en outre, la concentration et l'atomisation ou la lyophilisation dudit hydrolysat obtenu. Selon un mode de réalisation de l'invention, l'arrêt de ladite hydrolyse enzymatique est réalisé lorsque le degré d'hydrolyse atteint une valeur maximale de 9 % et préférentiellement entre 8,75 et 8,95 %. Selon un mode de réalisation de l'invention, le pH du mélange réactionnel au 5 cours de l'hydrolyse est contrôlé et maintenu constant par addition d'hydroxyde de sodium à 1 mol.L-I. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ledit mélange d'enzymes comprend, de plus, une endopeptidase dérivée d'Aspergillus oryzae. L'hydrolysat de protéines obtenu après réaction d'hydrolyse en présence d'un 10 mélange de trois enzymes respectivement dérivées de Bacillus amyloliquefaciens, de Bacillus licheniformis et d'Aspergillus oryzae présente les mêmes propriétés et caractéristiques physico-chimiques qu'un hydrolysat de protéines obtenu après réaction d'hydrolyse en présence d'un mélange de deux enzymes respectivement dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis. 15 Selon une caractéristique de l'invention, ledit mélange d'enzymes est choisi parmi le mélange CR1020 ou le mélange Protamex. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'arrêt de ladite hydrolyse enzymatique est réalisé par élévation de la température dudit mélange réactionnel jusqu'à 90°C et maintien de cette température pendant 10 minutes. 20 Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit broyage de ladite source de protéines est réalisé à partir du filet dudit, ou desdits poissons. La présente invention concerne encore un hydrolysat de protéines de poisson obtenu par un procédé tel que décrit précédemment. Un tel hydrolysat de protéines de poisson est caractérisé en en ce qu'il présente les caractéristiques physico-chimiques 25 suivantes: - une répartition du profil moléculaire suivant : de 23 à 31 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da, de 31 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 300 et 1 000 Da, de 28 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 1 000 et 3 000 Da, de 6 à 8 % de molécules dont 30 le poids moléculaire est compris entre 3 000 et 5 000 Da et de 2 à 4 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 5 000 et 10 000 Da, - une teneur en lipides inférieure à 1 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en glucides inférieure à 0,1 %, en pourcentage de produit brut, -une teneur en protéines supérieure à 80 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en matière minérale comprise entre 10 et 20 %, en pourcentage de produit brut. et en ce qu'il comprend des molécules immunologiquement apparentées aux CKK. Selon une caractéristique de l'invention, ledit hydrolysat de protéines de poisson obtenu par ledit procédé présente la composition en acides aminés suivante : Acide glutamique 17,4 %, Acide aspartique 11,4 %, Lysine 10,2 %, Leucine 8,4 %, Arginine 6,1 %, Alanine 6,8 %, Valine 4,7 %, Isoleucine 4,2 %, Glycine 5 %, Thréonine 4,5 %, Sérine 4,4 %, Tyrosine 3, 2 %, Phénylalanine 3,9 %, Méthionine 2,5 %, Proline 3,6 %, Histidine 1,9 %, Cystine 1 %, Tryptophane 0,8 %, en pourcentage en poids par rapport au poids total d'acides aminés. La présente invention concerne encore une composition, un produit alimentaire ainsi qu'un complément alimentaire comprenant un hydrolysat de protéines de poisson tel que décrit précédemment. La présente invention concerne encore un médicament comprenant un hydrolysat de protéines de poisson tel que décrit précédemment, ainsi que l'utilisation d'un tel hydrolysat de protéines de poisson pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'obésité, du diabète de type II, la prévention des accidents cardiovasculaires, l'hypertension, l'athérosclérose. Les formulations nutraceutiques ou pharmaceutiques incorporant un hydrolysat de protéines de poisson selon l'invention, pourront comprendre des ingrédients couramment utilisés dans ce type de formulations tels que des liants, des agents de saveurs, des conservateurs, des colorants, et pourront, dans le cas de compléments alimentaires ou de médicaments, se présenter sous la forme de comprimés, granulés ou gélules. Des formulations selon l'invention pourront également se présenter sous la forme de produits alimentaires tels que des boissons, ou encore sous la forme de suspensions ou de sirops. Les caractéristiques de l'invention mentionnées ci-dessus, ainsi que d'autres, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un exemple de réalisation, ledit exemple se voulant illustratif et non limitatif. La Fig. 1 illustre l'évolution du degré d'hydrolyse de l'hydrolysat de protéines de merlan bleu selon l'invention, La Fig. 2 illustre la répartition des poids moléculaires des fragments protéiques d'un hydrolysat de protéine de merlan bleu selon l'invention, et La Fig. 3 illustre la sécrétion de CCK par les cellules STC-1 en présence ou en l'absence d'un hydrolysat de protéine de merlan bleu selon l'invention. Exemple: Hydrolysat de protéines obtenu à partir de merlan bleu, Micromesistius poutassou Le merlan bleu (Micromesistius poutassou) est pêché en Atlantique Nord au large de Terre-Neuve. Les poissons sont débités en filets lesquels sont ensuite broyés de manière à en obtenir la pulpe. Cette pulpe de poisson constitue une source de protéines pour la production de l'hydrolysat. La pulpe est conservée à -20°C jusqu'à utilisation. Trois kilogrammes de pulpe de merlan bleu préalablement décongelés sont mélangés à de l'eau selon un rapport massique de 1. La température du mélange est portée à 60°C et le pH est ajusté à la valeur de 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium à 1 M, sous agitation. Un mélange composé de trois enzymes, respectivement dérivées de Bacillus amyloliquefaciens, de Bacillus licheniformis et d'Aspergillus oryzae, et commercialisé sous le nom CR 1020 par la société Meat:zyme (Chr Winthersvej 36A, 2800 Kgs Lyngby, Denmark) est alors ajouté dans le mélange réactionnel selon un ratio enzyme/source de protéines de 0,5 %. Durant la réaction d'hydrolyse, le pH est maintenu constant à une valeur de 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium (NaOH) à 1M. La réaction d'hydrolyse des protéines de merlan bleu est menée pendant 2 heures en conditions contrôlées grâce à la méthode bien connue dite pH-STAT. La méthode du pH-STAT est basée sur le maintien constant du pH pendant la réaction d'hydrolyse. L'étendue de l'hydrolyse est ainsi quantifiée par le degré d'hydrolyse (DH) qui est déterminé par le nombre de liaisons peptidiques coupées sur le nombre total de liaisons peptidiques. Le DH est calculé à partir du volume et de la molarité de la base utilisée pour maintenir le pH constant. Tant que le pH reste constant, il existe une relation entre le nombre de liaisons hydrolysées et le volume d'hydroxyde de sodium versé. Pour un système enzymatique donné et à pH constant, la fonctionnalité sera la même d'un hydrolysat à un autre, si la réaction est stoppée chaque fois au même DH. % DH = [(B. NB)/(a . htot . MP)] * 100 Avec : • B la consommation de la base (en ml ou L) • NB la normalité de la base • a la moyenne de dissociation des groupes HN ou COOH • MP la masse de protéines (déterminée par la méthode de Kjeldhal, en g ou kg) • htot le nombre total de liens peptidiques Après 2 heures de réaction d'hydrolyse, le DH final de l'hydrolysat de protéines est de 8.9 % (Fig. 1). L'inactivation des enzymes au terme de la cinétique d'hydrolyse est réalisée par élévation de la température du milieu réactionnel jusqu'à 90°C. Cette température est maintenue durant 10 minutes. L'hydrolysat de protéines de merlan bleu obtenu, dénommé par la suite HMB, est ensuite filtré sur un tamis (grillage de 2 mm/2 mm) de manière à éliminer les matières solides. La fraction récupérée dans le récipient est alors centrifugée pendant 30 minutes +/- 5 minutes, à une vitesse comprise entre 4000 et 7000 RPM. Après élimination du culot, le surnageant est récupéré, lyophilisé et conservé dans un endroit frais et sec, à l'abri de la lumière. Le surnageant peut également être atomisé. Dans une variante de l'invention, il est possible de désactiver les enzymes endogènes par élévation de la température jusqu'à l'ébullition préalablement à l'ajout du mélange des enzymes précitées. Dans une autre variante de l'invention, l'hydrolyse enzymatique est réalisée à partir d'un mélange composé de deux enzymes respectivement dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis et commercialisé sous le nom Protamex par la société Novozyme (Krogshoejvej 36, Denmark-2880 Bagsvaerd). Analyses physico-chimiques de l'hyclrolysat de protéines obtenu à partir de merlan bleu. Une détermination des poids moléculaires des peptides constitutifs de l'hydrolysat de protéines obtenu est réalisée par chromatographie d'exclusion stérique (SEC-HPLC). L'hydrolysat de protéines HMB, sous forme de poudre après lyophilisation est suspendu dans de l'eau ultra pure (20 mg/mL), puis filtré sur une membrane de 0,45 �m et analysé par filtration sur gel avec une colonne Superdex Peptide HR 10/30, commercialisé par la société Pharmacia. La matrice de la colonne est composée d'un gel poreux réticulé (diamètre 13-15�m) d'agarose et de dextran d'un volume total de 24 mL. Son domaine de fractionnement est compris entre 100 et 7000 Da. La colonne est montée sur une chaîne HPLC (commercialisée par la société Dionex) qui est équipée d'une pompe (module Dionex P680). La mesure est réalisée par un détecteur d'Ultra Violet multi longueur d'onde (module Dionex UVD 170 U). L'hydrolysat de protéines est élué par une phase mobile contenant de l'acétonitrile, de l'eau et du TFA. L'élution dure environ 1H à un débit de 0,5mL/min. La répartition des poids moléculaires est calculée à partir des paramètres d'une droite de calibration obtenue après le passage dans la colonne de marqueurs de poids moléculaires connus. Ces marqueurs sont le cytochrome C (12 400 Da), l'aprotinine (6 511 Da), la gastrine I (2 126 Da), la substance P (1 348 Da), la substance P fragment 1-7 (900Da), la glycine (75 Da) et la leupeptine (463 Da). Les données sont collectées grâce au logiciel Chromeleon (Dionex). Les pourcentages des poids moléculaires sont calculés à l'aide d'un logiciel (GPC Cirrus de chez Polymer Laboratories). La longueur d'onde d'acquisition est de 214 nm. La répartition des poids moléculaires en fonction dW/logM est donnée sur la Fig. 2, et la répartition des poids moléculaires par classe de taille est donnée dans le Tableau 1 suivant. Le pourcentage de l'aire sous la courbe correspond au pourcentage de molécules peptidiques. Tableau 1 Classe de Poids Moléculaire (Kda) % de l'aire totale sous la courbe de la Fig.2 0-0,3 23 à 31 0,3-1 31 à 34 1-3 28 à 34 3-5 6à8 5-> 10 2 à 4 La composition en acides aminés de l'hydrolysat de protéines de merlan bleu est donnée dans le Tableau 2 (selon directive européenne 98/64/CE et NF EN ISO 13904-Octobre 2005). Le Tableau 2 représente la répartition des acides aminés dans l'hydrolysat de protéines HMB. Tableau 2 Acide aminé Pourcentage d'acide Acide aminé Pourcentage d'acide aminé aminé Acide glutamique 17,4 Glycine 5 Lysine 10,2 Thréonine 4,5 Acide aspartique 11,4 Sérine 4,4 Leucine 8,4 Tyrosine 3,2 Arginine 6, 1 Phénylalanine 3,9 Alanine 6,8 Méthionine 2,5 Valine 4,7 Proline 3,6 Isoleucine 4,2 Histidine 1,9 Cystine 1 Tryptophane 0,8 La teneur en protéines est supérieure à 80 %, en pourcentage de produit brut (selon NF V18-120-Mars 1997-corrigé KJELDAHL). La teneur en lipides est inférieure à 1%, en pourcentage de produit brut (selon directive européenne 98/64/CE). La valeur énergétique de l'hydrolysat de protéines HMB est d'environ 330 Kcal/100g. La teneur en glucides est inférieure à 0,1 % (déduite à partir des teneurs en protéines et glucides lipides et de la valeur énergétique). Dosage de molécules irnmunologiquement apparentées aux cholescystokinines 15 ÇCCK) dans l'hydrolysat de protéines HMB Les molécules apparentées aux CCK présentes dans l'hydrolysat de protéines HMB ont été dosées par dosage radio immunologique à l'aide du kit GASK-PR, commercialisé par la société CIS Bio International (France) (test réalisé en triplicat). 20 On entend par molécules apparentées aux CCK, toutes molécules capables de se fixer à un anticorps spécifique dirigé contre les 8 acides aminés communs aux gastrines et CCK, le dit anticorps étant l'anticorps utilisé dans le dosage cité ci-dessus. La gastrine 10 CCK, le dit anticorps étant l'anticorps utilisé dans le dosage cité ci-dessus. La gastrine et les CCK possèdent des séquences peptidiques identiques dans la partie C-terminale de leurs séquences peptidiques. L'hydrolysat de protéines contient 5,6 pg de molécules apparentées aux gastrine/CCK par mg de poids sec d'hydrolysat. L'hydrolysat selon l'invention permet ainsi un apport de molécules apparentées aux CCK. Test de culture cellulaire in vitro: effet sur la stimulation de la sécrétion de 10 molécules de CCK L'hydrolysat de protéines HMB a été testé pour sa capacité à stimuler la sécrétion de CCK au niveau de cellules entéroendocrines de type STC1. En effet, la sécrétion de CCK par les cellules endocrines intestinales représente l'un des 15 principaux signaux constituant le phénomène de satiété. Les cellules STC-1 sont des cellules pluri hormonales dérivées de cellules endocrines tumorales issues de l'intestin grêle d'une souris. Les cellules STC1 sont utilisées comme modèle cellulaire pour l'étude des phénomènes induisant la sécrétion spécifique de CCK [10]. Les cellules STC-1 ont été cultivées dans du milieu DMEM contenant 2mM de 20 L-glutamine, 2mM de pénicilline, 50 �M de streptomycine, et 10% de sérum de veau foetal (SVF). Entre 2 et 3 jours avant la réalisation du test, les cellules STC-1 ont été mises en cultures dans des plaques de 24 puits à hauteur de 30 000 à 40 000 cellules par puits. Lorsque les cellules eurent atteint un niveau de confluence d'environ 85%, les puits ont été rincés deux fois avec du tampon d'incubation (4,5 mM KC1, 1,2mM 25 CaC12, 1.2 mM MgC12, 10 mM Glucose, 140 mM NaCl et 20 mM Hepes-Tris, pH 7,4). Les cellules ont ensuite été incubées durant 2 heures en présence de différentes solutions composées soit d'albumine sérique bovine (BSA), soit de l'hydrolysat de protéines HMB à différentes concentrations, soit d'acides aminés libres (cf. Tableau 30 3), soit d'un hydrolysat commercial d'albumine d'oeuf (AEH) ou du tampon d'incubation utilisé comme témoin de culture (contrôle). Les surnageants des cultures ont été centrifugés (5 min, 2000g). Après centrifugation, les surnageants ont été récupérés et conservés à -20°C avant d'en doser le contenu en CCK par dosage radio immunologique gastrine / CCK (GASK-PR, CIS Bio International, France). La quantité de molécules apparentées aux CCK a été systématiquement dosée dans les solutions réalisées avant incubation, de manière à pouvoir être retranchée de la quantité finale dosée dans le surnageant après incubation. Ainsi, il est possible de discerner les molécules apparentées aux molécules de CKK apportées par l'hydrolysat selon l'invention et les CCK sécrétées par les cellules après stimulation par l'hydrolysat. Les résultats sont présentés sur la Fig. 3 et sont exprimés en pM de CCK excrétées par les cellules. Sur la Fig. 3, le signe * désigne des valeurs significativement différentes de la valeur obtenue pour le contrôle (t-test (P Tableau 3 : Composition de la solution en acides aminés libres Acide aminé Quantité (mg/L) Acide aminé Quantité (mg/L) Acide L- glutamique 151 Glycine 128 L-Lysine 88 L-Thréonine 64 Acide L-aspartique 151 L- Sérine 26 L-Leucine 112 L-Tyrosine 06 L-Arginine 277 L-Phénylalanine 91 L- Alanine 96 L-Méthionine 40 L-Valine 80 L-Proline 53 L-Isoleucine 64 L-Histidine 72 L-Cystéine 16 L-Tryptophane 16 Les résultats montrent l'effet significatif de l'hydrolysat de protéines de merlan bleu à différentes concentrations (0,2 ; 0,5 et 1,0 %, rapport masse/volume), sur la sécrétion de molécules CCK dans le milieu extracellulaire par les cellules STC-1 par rapport aux autres solutions testées. La quantité de molécules CCK libérées par les cellules a augmenté de manière significative avec la concentration de l'hydrolysat (Fig. 3). La quantité de molécules de CCK obtenue à partir de l'hydrolysat concentré à 1,0 % fut 30 fois supérieure à celle obtenue avec le témoin de culture (122,03 pM de CCK contre 4,02 pM de CCK, respectivement). Les quantités de CCK obtenues en présence de BSA ou d'acides aminés libres à 1.0 % sont considérablement inférieures 13 à celles obtenues en présence des hydrolysats à la même concentration (31,2 et 8,6 pM, respectivement). Ces résultats indiquent que l'hydrolysat de protéines de merlan bleu contient des molécules capables de stimuler fortement la sécrétion des molécules de CCK par les cellules STC-1. Le potentiel stimulateur des molécules actives est bien plus important que le potentiel stimulateur des molécules contenues dans l'hydrolysat commercial (AEH) qui n'est pas d'origine marine. Les faibles potentiels stimulants des solutions de BSA et d'acides aminés libres indiquent que l'effet stimulateur de la sécrétion des molécules de CCK n'est dû ni d'une part à un � effet protéine �, ni d'autre part à l'action des acides aminés libres présents en grand nombre dans l'hydrolysat de merlan bleu. Cette stimulation apparaît donc comme étant majoritairement due aux molécules peptidiques contenues dans l'hydrolysat de protéines HMB. BIBLIOGRAPHIE [1] Strader AD, Woods SC. Gastrointestinal hormones and food intake. Gastroenterology 2005; 128:175-191 [2] Moran TH, Kinzig KP. Gastrointestinal satiety signais II. Cholecystokinin. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2004; 286:G183-188. [3] Moran TH. Cholecystokinin and satiety: current perspectives. Nutrition 2000; 16:858-865 [4] Chaudhri O, Small C, Bloom S. Gastrointestinal hormones regulating appetite. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2006; 361:1187-209. [5] Cuber JC, Bernard C, Levenez F, Chayvialle JA. 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G90-4.30 REVENDICATIONS 1) Hydrolysat de protéines de poisson caractérisé en en ce qu'il est obtenu par hydrolyse enzymatique d'au moins une source de protéines choisie parmi le groupe composé des espèces de poissons Micromesistius poutassou, Clupea harengus, Scomber scombrus, Sardina pilchardus, Gadus morhua, Pollachius virens, Melanogrammus aeglefinus, Coryphaenoides rupestris, Trisopterus esmarki, Trachurus spp., poissons appartenant à l'ordre des siluriformes, ladite hydrolyse enzymatique étant réalisée par un mélange d'enzymes comprenant des endopeptidases dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis et en ce qu'il présente: -la répartition du profil moléculaire suivant : de 23 à 31 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da, de :31 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 300 et 1 000 Da, de 28 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 1 000 et 3 000 Da, de 6 à 8 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 3 000 et 5 000 Da et de 2 à 4 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 5 000 et 10 000 Da, - une teneur en lipides inférieure à 1 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en glucides inférieure à 0,1 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en protéines supérieure à 80 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en matière minérale comprise entre 10 et 20 %, en pourcentage de produit brut, et en ce qu'il comprend des molécules immunologiquement apparentées aux cholescystokinines (CKK). 2) Hydrolysat de protéines de poisson selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente la composition en acides aminés suivante : Acide glutamique 17,4 %, Acide aspartique 11,4 %, Lysine 10,2 %, Leucine 8,4 %, Arginine 6,1 %, Alanine 6,8 %, Valine 4,7 %, Isoleucine 4,2 %, Glycine 5 %, Thréonine 4,5 %, Sérine 4,4 %, Tyrosine 3,2 %, Phénylalanine 3,9 %, Méthionine 2,5 %, Proline 3,6 %, Histidine 1,9 %, Cystine 1 %, Tryptophane 0,8 %, en pourcentage en poids par rapport au poids total d'acides aminés. 3) Hydrolysat de protéines de poisson selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que ladite source de protéines de poisson comprend la pulpe obtenue à partir du filet dudit ou desdits poissons. 4) Hydrolysat de protéines de poisson selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en en ce que ledit mélange d'enzymes comprend, de plus, une endopeptidase dérivée d'Aspergillus oryzae. 5) Hydrolysat de protéines de poisson selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit mélange d'enzymes est choisi parmi le mélange CR1020 ou le mélange Protamex. 6) Procédé d'obtention d'un hydrolysat de protéines de poissons tel que défini dans les revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend: -le broyage d'au moins une source de protéines choisie parmi le groupe composé des espèces de poissons Micromesistius poutassou, Clupea harengus, Scomber scombrus, Sardina pilchardus, Gadus morhua, Pollachius virens, Melanogrammus aeglefinus, Coryphaenoides rupestris, Trisopterus esmarki, Trachurus spp., poissons appartenant à l'ordre des siluriformes, en présence d'eau, de manière à récupérer la pulpe dudit ou desdits poissons, - l'hydrolyse enzymatique de ladite source de protéines à une température comprise entre 40 et 65°C, à un pH compris entre 6 et 9, pendant 1 à 5 heures, après l'ajout d'un mélange d'enzymes comprenant des endopeptidases dérivées de Bacillus amyloliquefaciens et de Bacillus licheniformis, de manière à obtenir un mélange réactionnel, - l'arrêt de ladite hydrolyse enzymatique par inactivation desdites enzymes après élévation de la température dudit mélange réactionnel à un niveau non inférieur à 70°C, pendant 8 à 20 minutes. - la séparation de l'hydrolysat de protéines obtenu du reste du mélange réactionnel. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit broyage de la source de protéines est réalisé en présence d'eau selon un rapport source de protéines/eau de 1. 8) Procédé selon l'une des revendications 6 à 7, caractérisé en ce que ladite hydrolyse enzymatique est réalisée selon un ratio enzyme/source de protéines compris entre 0,01 et 2%. 9) Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que ledit ratio enzyme/source de protéines est égal à 0,5 %, ladite température d'hydrolyse est égale à 60°C et ledit pH est de 7,5. 10) Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que ladite séparation de l'hydrolysat de protéines du reste du mélange réactionnel est réalisée par centrifugation à une vitesse comprise entre 4000 et 7000 RPM et élimination du culot obtenu. 11) Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, la concentration et l'atomisation ou la lyophilisation dudit hydrolysat de protéines obtenu. 12) Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que ledit arrêt de ladite hydrolyse enzymatique est réalisé lorsque le degré d'hydrolyse atteint 8.9. 13) Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que ledit pH du mélange réactionnel au cours de l'hydrolyse est contrôlé et maintenu constant par addition d'hydroxyde de sodium à 1 mol/L. 14) Procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce que ledit mélange d'enzymes contient, de plus, une endopeptidase dérivée d'Aspergillus oryzae. 15) Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisé en ce que l'arrêt de ladite hydrolyse enzymatique est réalisé par élévation de la température dudit mélange réactionnel à 90°C et maintien de cette température pendant 10 minutes. 16) Procédé selon l'une des revendications 6 à 15, caractérisé en ce que ledit broyage de ladite source de protéines est réalisé à partir du filet dudit, ou desdits poissons. 17) Procédé selon l'une des revendications 6 à 16, caractérisé en ce que ledit mélange d'enzymes est choisi parmi le mélange CR1020 ou le mélange Protamex. 18) Hydrolysat de protéines de poisson, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé tel que décrit dans l'une des revendications 6 à 17 et en en ce qu'il présente: - la répartition du profil moléculaire suivant : de 23 à 31 % de molécules de poids moléculaire inférieur à 300 Da, de 31 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 300 et 1 000 Da, de 28 à 34 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 1 000 et 3 000 Da, de 6 à 8 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 3 000 et 5 000 Da et de 2 à 4 % de molécules dont le poids moléculaire est compris entre 5 000 et 10 000 Da, - une teneur en lipides inférieure à 1 °%, en pourcentage de produit brut, - une teneur en glucides inférieure à 0,1 %, en pourcentage de produit brut,- une teneur en protéines supérieure à 80 %, en pourcentage de produit brut, - une teneur en matière minérale comprise entre 10 et 20 %, en pourcentage de produit brut, et en ce qu'il comprend des molécules immunologiquement apparentées aux 5 cholescystokinines (CKK). 19) Hydrolysat de protéines de poisson selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il présente la composition en acides aminés suivante : Acide glutamique 17,4 %, Acide aspartique 11,4 %, Lysine 10,2 %, Leucine 8,4 %, Arginine 6,1 %, Alanine 6,8 %, Valine 4,7 %, Isoleucine 4,2 %, Glycine 5 %, Thréonine 4,5 %, Sérine 4,4 %, 10 Tyrosine 3,2 %, Phénylalanine 3,9 %, Méthionine 2,5 %, Proline 3,6 %, Histidine 1,9 %, Cystine 1 %, Tryptophane 0,8 %, en pourcentage en poids par rapport au poids total d'acides aminés. 20) Composition, caractérisée en qu'elle comprend un hydrolysat de protéines de poissons tel que défini dans les revendications 1 à 5 et 18 à 19. 15 21) Produit alimentaire caractérisé en qu'il comprend un hydrolysat de protéines de poissons tel que défini dans les revendications 1 à 5 et 18 à 19. 22) Complément alimentaire en qu'il comprend un hydrolysat de protéines de poissons tel que défini dans les revendications 1 à 5 et 18 à 19. 23) Composition pharmaceutique caractérisée en qu'elle comprend un 20 hydrolysat de protéines de poissons tel que défini dans les revendications 1 à 5 et 18 à 19. 24) Utilisation d'un hydrolysat de protéines de poisson tel que défini dans les revendications 1 à 5 et 18 à 19 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de l'obésité, du diabète de type II, l'hypertension, l'athérosclérose ou 25 l'hypercholestérolémie ou la prévention des accidents cardiovasculaires.