Brevet FR2919611A1 — publié le 20090206

NOUVEL EPITOPE DU BNP(1-32) ET ANTICORPS DIRIGES CONTRE CET EPITOPE L'invention concerne le domaine des peptides natriurétiques cérébraux humains et le diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque chez l'homme. Plus particulièrement, l'invention concerne un nouvel épitope présent dans la molécule de BNP(1-32), les anticorps dirigés contre cet épitope, en particulier l'anticorps monoclonal 20G7, une méthode de dosage immunologique du BNP(1-32) et du proBNP (1-108) ainsi que de leurs fragments respectifs utilisant un tel anticorps, et io des trousses de réactifs pour réaliser de tels dosages. L'insuffisance cardiaque (Congestive Heart Failure) est un syndrome clinique fréquent, en particulier chez les personnes âgées. Il se présente habituellement sous la forme d'un déclenchement insidieux de symptômes non-spécifiques tels que la toux à l'effort, la fatigue, et l'apparition d'cedèmes '5 périphériques. Le diagnostic et l'appréciation de la sévérité de l'atteinte (graduée en stades I à IV NYHA selon l'Association de Cardiologie de New York) reposent sur l'interprétation combinée des signes cliniques et des résultats de certains tests et examens (échocardiographie, la scintigraphie, le test d'effort, etc..). En raison de la gravité de l'insuffisance cardiaque et, aussi, des coûts 20 élevés de sa prise en charge, un diagnostic précoce de ce syndrome est, évidemment, hautement souhaitable : il contribuerait à la mise en oeuvre des traitements appropriés afin d'éviter ou retarder la progression rapide du syndrome vers l'insuffisance cardiaque sévère. Identifier les personnes à risque d'insuffisance cardiaque et/ou de pronostic défavorable ou de complications 25 ultérieures est donc une nécessité. Cela permettrait également de proposer les mêmes outils pour le suivi thérapeutique (rapide, facile et peu onéreux) des patients placés sous traitement. Aujourd'hui de telles méthodes de diagnostic, de pronostic et de suivi de l'insuffisance cardiaque existent et sont décrites ci-après, mais ne s'avèrent pas totalement satisfaisantes ni totalement informatives. 30 Les syndromes coronariens aigus (SCA) représentent également un problème de santé majeur de nos jours. Ils regroupent les maladies cardiaques suivantes : l'infarctus du myocarde à onde Q, l'infarctus du myocarde avec ou sans élévation du segment ST, le syndrome de menace ou angor instable. 2 Le diagnostic, le pronostic et le suivi des SCA revêtent aussi une très grande importance pour la communauté médicale. Le dosage des peptides natriurétiques (BNP(1-32), NT-proBNP(1-76), et proBNP(1-108)) se révèle d'un grand intérêt dans ces applications. II en est de même dans les cas de dyspnée (maladie caractérisée par une difficulté à respirer), d'accidents vasculaires cérébraux (AVC) (encore appelés Attaque Cérébrale ou Apoplexie ), d'insuffisance rénale et de diabète parfois associés à ces pathologies. On a recherché depuis longtemps des marqueurs présymptomatiques to prédictifs de l'insuffisance cardiaque. A cet égard, on a mis en évidence le fait que les cardiomyocytes fabriquent et sécrètent des peptides à activité natriurétique : un peptide d'origine auriculaire, l'ANP (Atrial Natriuretic Peptide) découvert chez le rat par de Bold et al. Life Science 1981, vol. 28(1) : 89-94, et un peptide natriurétique d'origine auriculo-ventriculaire dénommé BNP (Brain Natriuretic 15 Peptide) découvert par les inventeurs du brevet EP 418 308 et par Sudoh et al. (1988) Nature 332: 78-81 chez le porc, et chez l'homme. Le précurseur du BNP, le préproBNP(1-134), est la forme de stockage de la molécule à l'intérieur des cardiomyocytes. Celui-ci est clivé pendant et/ou après sa sécrétion pour libérer un peptide signal et le proBNP(1-108). Le proBNP(1-108) 20 consiste en un polypeptide de 108 acides aminés, de séquence: H I PLGSPGSASDLETSGLQEQRN HLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKS REVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKV LRRH108 (SEQ ID NO : 1). II est clivé, avant et/ou pendant sa sécrétion, entre les acides aminés Arg76 25 et Ser77 en, d'une part, le BNP, également désigné BNP(77-108) ou BNP-32, ou encore BNP(1-32) (désignation qui sera adoptée par la suite), et la partie N-terminale de la prohormone, le BNP(1-76), encore désigné fragment N-terminal du proBNP ou NT-proBNP(1-76) (désignation qui sera adoptée par la suite). Le BNP(1-32), forme vasoactive de la molécule, consiste en un peptide de 30 32 acides aminés, de séquence : S~ PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH32 (SEQ ID NO : 2) 17 acides aminés forment une boucle fermée par une liaison disulfide entre les deux résidus de cystéine oxydés (C10 et C26), cette boucle étant encadrée en amont par 9 acides aminés (qui constituent la partie N-terminale), et en aval par 6 acides aminés (qui constituent la partie C-terminale). L'intégrité de la boucle est importante pour l'obtention d'une bonne activité biologique. Onze résidus sur les 17 de la boucle sont d'ailleurs conservés dans les s deux autres peptides natriurétiques, que sont l'ANP (A-type natriuretic peptide) et le CNP (C-type natriuretic peptide). Le NT-proBNP(1-76) est constitué des 76 acides aminés N-terminaux du proBNP(1-108) et présente la séquence suivante : Hi PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKS io REVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76 (SEQ ID NO : 3). De manière intéressante, ces trois polypeptides, proBNP(1-108), NT-proBNP(1-76) et BNP(1-32), s'avèrent de bons marqueurs de l'insuffisance cardiaque, de sorte que différents dosages avec des combinaisons d'anticorps bien précises ont été mis au point. 15 En effet, le prol3NP(1-108) ayant été reconnu comme circulant dans le sang depuis les travaux initiaux de Tateyama et al. (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications 185: 760-767), divers essais immunologiques de détection du proBNP(1-108) ont été proposés. Ainsi la demande de brevet WO 99/13331 décrit un essai sandwich du proBNP(1-108) à l'aide d'un anticorps 20 reconnaissant la partie 1-76 du proBNP(1-108) et d'un anticorps anti-BNP(1-32). Ce format d'essai manque de sensibilité en raison de la fixation, sur la phase solide (anticorps de capture), de sous-produits du proBNP(1-108) clivé présentant l'épitope reconnu par l'anticorps de capture, à savoir : le NT-BNP(1-76) et les produits issus de son clivage progressif. 25 La demande WO 2004/14952 décrit la détection du proBNP(1-108) à l'aide, d'une part, d'un anticorps reconnaissant un épitope de séquence RAPRSP, situé à la charnière du NT-proBNP(1-76) et du BNP(1-32) (également nommé anticorps charnière 76), et, d'autre part, d'un anticorps anti-BNP(1-32), de sorte que dans ce format, le dosage est spécifique de la prohormone uniquement: il n'y a pas de 30 réactivité croisée avec les deux formes NT-proBNP(1-76) et du BNP(1-32). Quant au dosage du NT-proBNP(1-76), la demande WO 93/24531 décrit une méthode de diagnostic in vitro de l'insuffisance cardiaque reposant sur la détection du NT-proBNP(1-76). Toutefois, la méthode décrite dans la demande WO 93/24531 ne parait pas simple à mettre en oeuvre sur le NT-proBNP(1-76) en échantillons sanguins. En effet, les seuls exemples montrés sont réalisés, non sur des sérums humains, mais sur des gammes étalons obtenues à l'aide d'un peptide synthétique, le peptide NT-proBNP(47-64). Pour pallier cet inconvénient, un système automatisé hautement sophistiqué s'est avéré, depuis, nécessaire. Enfin, plusieurs dosages du BNP(1-32), ont été mis au point à l'aide d'anticorps divers. Par exemple, le brevet JP 2 676 114 B2 décrit deux anticorps monoclonaux (KY-hBNPI et KY-hBNPII) reconnaissant la structure cyclique du BNP(1-32), sans autre précision. ~o Par ailleurs, la demande de brevet EP 542 255 décrit un anticorps monoclonal reconnaissant l'histidine H32, ultime acide aminé de l'épitope C-terminal K27VLRRH32 du BNP(1-32). D'autres épitopes présents sur le BNP(1-32) sont connus: 3 épitopes de séquence 1SPKMVQGSGC10 (SEQ ID NO : 22), 5VQGSGCFGR13 (SEQ ID NO: 21), et 15MDRISSSSGLG25 (SEQ ID NO: 23) sont 15 aussi décrits comme étant hautement immunogènes dans la demande WO 97/32900 et le brevet US 6,162,902. Ces derniers décrivent aussi des anticorps monospécifiques dirigés contre ces épitopes. La société HyTest (Turku, Finlande) a mis sur le marché en 2005 divers anticorps spécifiques du BNP(1-32), dont les anticorps monoclonaux 24C5 et 20 26E2. Comme décrit l'article Seferian et al. (2007) Clinical Chemistry 53 :5, 866-873, certains de ces anticorps anti-BNP(1-32) ciblent la région 1-10, 11-22, 17-23 ou 26-32 du BNP(1-32). Parmi les 17 anticorps obtenus par immunisation de souris Balb/c à l'aide du peptide 11FGRKMDRISSSS22 (SEQ IDNO: 61) du BNP(1-32), seul l'anticorps monoclonal 24C5, est décrit. Toutefois, son épitope n'est pas 25 précisément caractérisé : il est seulement indiqué qu'il est dirigé contre la séquence d'acides aminés 11 à 22 du BNP(1-32) susdite. La demande de brevet WO 2006/88700 décrit un autre épitope présent sur le BNP(1-32) : il a la séquence d'acides aminés Rt3(K14)(M15)D16R17118 (SEQ ID NO: 24), incluse dans les acides aminés 13-20 qui font partie de la structure 30 cyclique du BNP(1..32) humain. Cette demande décrit aussi un anticorps monoclonal, désigné 3-631-436, qui reconnaît spécifiquement cet épitope. Les 4 acides aminés R13, D16, R17, et 118 sont décrits comme étant fonctionnellement importants pour la liaison de l'anticorps 3-631-436 à cet épitope. Les acides aminés situés en amont de cet épitope (tels que la Phénylalanine F11 et la Glycine G12) ne sont pas évoqués. L'un des inconvénients de l'hormone BNP(1-32) est qu'elle est instable dans le plasma et dans le sérum. En effet, des enzymes, type protéases, semblent cliver le BNP(1-32). Par exemple, Shimizu et aI. (2002) Clinica Chimica Acta 316: 129-135 rapportent que la partie N-terminal du BNP(1-32), plus particulièrement la liaison Pro2-Lys3 serait clivée par des protéases, ainsi que la liaison Arg30-Arg31 en position C-terminale. !Boerrigter et al. (2007) Am. J. Physiol. Regul. lntegr. Comp. Physiol. 292: R897-90 ainsi qu'Hawkridge et al (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 'o 102:17442-7 ont particulièrement décrit la dégradation en position N-terminale du BNP(1-32). De même, certaines coupures de liaison dues à des endopeptidases ont été rapportées (Davidson & Struthers (1994) J. Hypertension 13: 329-336). Ainsi le dosage du BNP(1-32) nécessite-t-il des précautions particulières (Davidson et 15 al. (1995) Circulation 91:12767 ; Gobinet-Georges et al. (2000) Clin. Chem. Lab. Med. 38:519-23), et implique un choix judicieux d'anticorps. Récemment, plusieurs équipes ont montré que les peptides natriurétiques pouvaient circuler sous forme glycosylée et/ou tronquée (Shellenberger (2006) Arch. Biochem. Biophys. 451: 160-6 ; Liang et a/. (2007) Journal of the American 20 College of Cardiology 49: 1071-8 ; Lam et al. (2007) Journal of the American College of Cardiology 49: 1193-292). Il existe toujours un besoin, dans le cadre du diagnostic précoce de l'insuffisance cardiaque, des SCA, des dyspnées, et d'autres maladies cardiovasculaires ainsi que des AVC et les pathologies associées telles que le 25 diabète et l'insuffisance rénale, d'améliorer les réactifs et méthodes de détection du BNP(1-32), du proBNP(1-108), notamment en prenant en compte le problème de l'instabilité du BNP(1-32). Description de l'invention Au coeur de la présente invention se trouve la découverte totalement inattendue, faite par les inventeurs, d'un épitope insoupçonné et inconnu existant dans la molécule de BNP(1-32) humain et d'un anticorps monoclonal spécifique qui le reconnaît. Contrairement à toute attente, ils ont découvert que la séquence F1IGRKMDR17 (SEQ IID NO: 51) du BNP(1-32) constitue un épitope d'intérêt pour générer des anticorps reconnaissant la structure cyclique (acides aminés 10-26) du BNP(1-32) et ils ont obtenu un anticorps monoclonal, dénommé 20G7, reconnaissant spécifiquement ledit épitope F11G12RK14MDR17 (SEQ ID NO: 51). io En d'autres termes, l'anticorps 20G7 est un anticorps monoclonal spécifique de l'épitope F11GRKMDR17 (SEQ ID NO: 51) du BNP(1-32). La présente invention fournit aussi une méthode d'immunoessai en vue de la détection du BNP(1-32) et du proBNP(1-108) ainsi que les fragments circulants de ceux-ci utilisant l'anticorps monoclonal 20G7 et des réactifs contenant cet 15 anticorps. Les inventeurs se sont en effet aperçus que, lorsqu'ils synthétisaient des peptides situés dans la région cyclique (acides aminés 10-26) du BNP(1-32) humain, et immmunisaient des souris avec ceux-ci, certains anticorps obtenus ne réagissaient avec de tels peptides que si ces derniers comportaient les résidus 20 Phénylalanine F11, Lysine K14 et Arginine R17 et que I'Isoleucine 118, particulièrement importante dans l'épitope décrit dans la demande internationale W02006/88700, n'appartenait pas à l'épitope selon la présente invention. Par exemple, les inventeurs ont immunisé des souris avec le peptide TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 4) et d'autres avec le peptide 25 SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 5). Ils ont constaté que la réponse immune contre le BNP(1-32) était beaucoup plus élevée chez les souris immunisées avec le peptide TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 4) que chez les souris immunisées avec le peptide SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 5). Il est à noter que dans les deux cas, les cystéines sont 30 présentées sous forme oxydée via un pont disulfure intrachaîne. Après réalisation de fusions lymphocytaires de cellules de rate de souris immunisées avec des cellules de myélome, les inventeurs ont ainsi pu produire différents clones hybrides. Ils ont obtenu en particulier un anticorps monoclonal, 7 dénommé 20G7-15/03/2007 (ci-après dénommé 20G7 pour raisons de commodité), qui ne reconnaît les peptides du BNP(1-32) que s'ils contiennent les résidus Phénylalanine F11, Lysine K14 et Arginine R17. En effet, ces acides aminés F11, K14 et R17, s'avèrent importants pour la liaison optimale de l'anticorps monoclonal 20G7 au BNP(1-32) et au proBNP(1-108) ainsi qu'à leurs fragments respectifs. L'hybridome sécrétant l'anticorps monoclonal 20G7-15/03/2007 (20G7) a été déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex to 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont observé avec l'anticorps 20G7 que, dès que les résidus F11, K14 et R17 étaient substitués par une alanine soit individuellement, soit conjointement, la réactivité antigénique du peptide, par rapport à celle du peptide naturel SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL 15 (SEQ ID NO: 6), en était considérablement affectée, alors que la substitution des autres acides aminés de l'épitope n'avait pratiquement aucune influence sur la réactivité antigénique du peptide. Aussi, une étude approfondie de l'anticorps 20G7 a montré qu'il reconnaît l'épitope F11GRKMDR17 (SEQ ID NO: 51), mais ne reconnaît pas la séquence A11GRKMDRI7 (SEQ ID NO: 62) ni la séquence 20 GRKMDR17I18 (SEQ ID NO: 52), ni la séquence C10F11GRKMD (SEQ ID NO: 50). L'anticorps monoclonal 20G7 reconnaît donc la séquence épitopique F1IGRKMDRI7 (SEC! ID NO: 51) du BNP(1-32), mais ne reconnaît substantiellement pas les épitopes de la demande WO 97/32900 (VQGSGCFGR (SEQ ID NO: 21), SPKMVQGSGC (SEQ ID NO: 22), et MDRISSSSGLG (SEQ ID 25 NO: 23)) vus plus haut, ni l'épitope R(K)(M)DRI (SEQ ID NO: 24) de la demande WO2006/88700. 8 Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide porteur d'un épitope du BNP(1-32) humain, répondant à la formule (I) : ai-(R1)-(G)(C)FGRKMDR(I)(S)-(R2)-a2 (I) où •- a1 peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, amine primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle ; a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle ; - R, et R2, identiques ou différents, représentent un acide aminé quelconque, ou io une chaîne peptidique de 2 à 15 acides aminés, sous réserve que (R1)-(G)(C)FGRKMDR(I)(S)-(R2) ne comprenne pas de portion du BNP(1-32) humain de plus de 11 acides ;aminés incluant la séquence GCFGRKMDRIS (SEQ ID NO: 63). On entend par épitoge ou site épitopique une séquence d'acides 15 aminés qui est reconnue par au moins un anticorps et permet une liaison spécifique de l'anticorps à cette séquence d'acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré, R, et R2 peuvent être couplés à des molécules supports, des réactifs ou des molécules de marquage. Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide tel que défini ci-20 dessus, répond à la formule (Il) : a1-FGRKMDR-a2 (II) où al et a2 sont tels que définis ci-dessus. La présente invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation de ligands dirigés contre le BNP(1-32) 25 humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR (SEQ ID NO: 51). Par fragment du proBNP(1-108) selon l'invention, on entend tout fragment de taille inférieure au proBNP(1-108), dont notamment le BNP(1-32). Par exemple, le fragment proBNP(3-108), comme décrit dans Lam et al. (2007) J. Am. 30 Coll. Cardiol. 49:119:3-1202, et généré par un clivage par une dipeptidase. Le terme fragment du proBNP(1-108) selon l'invention inclut également tout polypeptide ayant fait l'objet d'au moins une modification post-traductionnelle du proBNP(1-108), du type phosphorylation, glycosylation, ou autre. Par exemple, Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51:160-6, ont montré que le proBNP(1-108) était une glycoprotéine totalement ou partiellement 0-glycosylée. Par fragment du BNP(1-32) selon l'invention, on entend tout fragment de taille inférieure au BNP(1-32). Là encore, la dégradation du BNP(1-32) a déjà été rapportée dans la littérature : par exemple, le fragment BNP(3-32) a été décrit par Lam et al (supra) et par Hawkridge et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:17442-7). Les expressions proBNP(1-108) et le BNP(1-32) , ainsi que fragment du proBNP(1-108) et fragment du NP(1-32) incluent également tout polypeptide ayant fait l'objet d'au moins une modification post-traductionnelle, du type phosphorylation, glycosylation, ou autre. Par exemple, Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51:160-6, ont montré que le proBNP(1-108) était une glycoprotéine totalement ou partiellement 0-glycosylée. On désigne par ligands dirigés contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR toute molécule ayant la capacité de se lier de manière spécifique au BNP(1-32) humain au proBNP(1-108) humain ou à leurs fragments. Le terme spécifique , quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison d'un ligand à une cible, signifie que le ligand interagit avec la cible sans interaction substantielle avec une autre cible ne présentant pas de ressemblance structurale avec la cible. Lorsqu'on parle de reconnaissance spécifique de l'épitope FGRKMDR, cela signifie que l'interaction du ligand avec une cible comprenant l'épitope n'implique essentiellement pas de déterminants antigéniques, notamment des acides aminés, autres que ceux de l'épitope. En particulier, cela signifie que le ligand est capable de lier une séquence d'acides aminés de la séquence du BNP(1-32) et/ou du proBNP(1-108) ainsi que de leurs fragments respectifs comprenant les acides aminés comprenant l'épitope FGRKMDR, mais est incapable de lier une séquence d'acides aminés de la séquence du BNP(1-32) et/ou du proBNP(1-108) qui ne comprend pas l'épitope FGRKMDR dans sa totalité. Par ailleurs, un acide aminé présent dans un épitope sera dit critique dès lors que sa substitution par une alanine entraîne une chute d'au moins 50% de l'antigénicité dudit épitope, définition selon Laune et al. (2002) Journal of 10 lmmunological Methocis 267:53-70. En outre, un acide aminé présent dans un épitope sera dit essentiel dès lors que sa substitution par une alanine entraîne une diminution d'au moins 80% de l'antigénicité dudit épitope. De préférence, un ligand reconnaissant spécifiquement l'épitope FGRKMDR selon l'invention, n'interagit essentiellement pas avec des peptides ayant pour séquence VQGSGCFGR (SEQ ID NO: 21), SPKMVQGSGC (SEQ ID NO: 22), MDRISSSSGLG (SEQ ID NO: 23), RKMDRI (SEQ ID NO: 24) et RKMDRISS (SEQ ID NO: 25). ta Par l'expression n'interagit essentiellement pas avec des peptides ayant pour séquence VQGSGCFGR, SPKMVQGSGC, MDRISSSSGLG, RKMDRI et RKMDRISS , on entend que le ligand présente une réaction croisée, avec l'une ou l'autre de ces séquences de moins de 20%, de manière préférée de moins de 10%, de manière davantage préférée de moins de 5%, et de manière 15 particulièrement préférée de moins de 2%. Dans le cadre de la reconnaissance spécifique d'une cible des constantes d'association supérieures à 106 M"1 sont préférées, des constantes d'association supérieures à 108 M-1 sont davantage préférées, et des constantes d'association supérieures à 1010 M"1 sont tout particulièrement préférées. 20 De préférence également, les résidus F11, K14 et R17 sont essentiels à la liaison d'un ligand selon l'invention à l'épitope, puisque leur substitution par une alanine se caractérise par une perte de liaison de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 25 Paris Cedex 15, Fiance) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746 au peptide épitopique de 82%, 95% et 85%, respectivement. De préférence, le ligand est sélectionné dans le groupe constitué d'un anticorps ou d'un fragment de cet anticorps reconnaissant l'épitope, d'un aptamère, et d'un polypeptide reconnaissant spécifiquement l'épitope susceptible 30 d'être obtenu par phage-display. Comme on l'entend ici le terme anticorps se réfère à tout anticorps polyclonal ou monoclonal. A titre d'exemple de fragments d'anticorps reconnaissant l'épitope on peut citer les fragments scFv, Fab, Fab', F(ab')2, ainsi que les anticorps simple chaine de camélidés. Les aptamères sont bien connus de l'homme du métier. Il s'agit de composés de nature nucléotidique, notamment ribonucléotidique ou désoxyribonucléotidique, ou peptidique présentant la capacité de se lier de manière spécifique à une cible, notamment une cible protéique. Les aptamères de nature nucléotidique et leur obtention sont notamment décrit par Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22 et Bock et al. (1992) Nature 355:564-6. Les aptamères de nature peptidique et leur obtention sont notamment décrit par Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30. On désigne par phage display une technique de sélection de ligand polypeptidiques exprimés sur la capside d'un bactériophage et codé par une séquence nucléique insérée dans le gène codant la capside. Cette technique est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Scott & Smith (1990) Science 249:386-390, et Marks et al. (1991) J. Mol. Biot. 222:581-597. De préférence, le polypeptide susceptible d'être obtenu par phage display est un polypeptide de type scFv (Fragment variable simple chaîne). Cette technique est notamment décrite par Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Les ligands peuvent également être obtenus par synthèse chimique ou par génie génétique. De préférence, les polypeptides tels que définis ci-dessus sont utilisés pour la préparation d'anticorps, notamment d'anticorps monoclonaux. A ce titre, l'invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un hybridome sécrétant un anticorps monoclonal dirigé contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR. Ainsi, l'invention concerne aussi un procédé de préparation d'hybridome sécréteur d'anticorps monoclonal dirigé contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR, dans lequel : - on immunise un animal, tel qu'une souris, un lapin, un rat, avec un polypeptide tel que défini ci-dessus ; -on prélève des lymphocytes sécréteurs d'immunoglobulines de cet animal, -et on procède à une fusion des lymphocytes avec des cellules de myélome, telle que des cellules de myélome Sp2 (ATCC CRL-1581) ; pour obtenir un hybridome. La présente invention concerne également un hybridome susceptible d'être 5 obtenu par le procédé de préparation d'hybridome défini ci-dessus. Plus particulièrement, la présente invention concerne l'hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. ~o D'une manière générale, la méthodologie pour obtenir des hybridomes et des anticorps monoclonaux peut suivre la méthode classique de fusion lymphocytaire et culture d'hybridomes décrite par Kêhler & Milstein (1975) Nature 256:495-497. D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues (e.g. Harlow et al, ed. 1988 Antibodies : a laboratory 15 manual ). Par ailleurs, des techniques alternatives à cette technique usuelle existent. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique cloné à partir d'un hybridome. La présente invention concerne également un ligand spécifique d'un 20 épitope de séquence FGRKMDR. De préférence, le ligand est sélectionné dans le groupe constitué d'un anticorps ou d'un fragment de cet anticorps reconnaissant l'épitope, d'un aptamère, et d'un polypeptide reconnaissant spécifiquement l'épitope obtenu par phage-display. 25 Plus préférablement, le ligand est constitué d'un anticorps reconnaissant spécifiquement un épitope de séquence FGRKMDR, ou d'un fragment de cet anticorps reconnaissant spécifiquement l'épitope. De manière encore plus préférée, le ligand est constitué d'un anticorps monoclonal, notamment un anticorps monoclonal produit par un hybridome tel que défini ci-dessus. 30 Ainsi, l'invention concerne tout particulièrement un ligand tel que défini ci-dessus constitué de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. Par ailleurs, les ligands tels que définis ci-dessus peuvent être couplés à des molécules supports, des réactifs ou des molécules de marquage. La présente invention concerne également d'un ligand tel que défini ci- dessus, pour détecter, dans un échantillon biologique, le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR. De fait, la présente invention concerne aussi un procédé de détection, dans un échantillon biologique, du BNP(1-32) humain ou du proBNP(1-108) humain to ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR, comprenant : 1) la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un ligand tel que défini ci-dessus, de préférence dans des conditions permettant la formation de complexes antigène-ligand, et 15 2) la détection des complexes éventuellement formés. Dans le contexte de l'invention, un échantillon biologique ou encore un échantillon de fluicle biologique est de préférence constitué par un liquide biologique, tel que du sang, plasma, sérum, de l'urine, du liquide céphalorachidien, de la salive,etc...Comme on l'entend ici, le terme échantillon 20 biologique recouvre tout aussi bien l'échantillon tel que prélevé, que l'échantillon ayant subi divers traitements, notamment pour le rendre apte à être utilisé dans les procédés et méthodes selon l'invention. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de détection ci-dessus comprend au moins une étape additionnelle de mise en contact de l'échantillon 25 biologique avec au moins un ligand additionnel spécifique du BNP(1-32) humain ou du proBNP(1-108) humain ainsi que de leurs fragments respectifs et présentant une spécificité différente de celle du ligand selon l'invention. De préférence, le ligand additionnel est un anticorps. La présente invention concerne également une méthode de diagnostic, de 30 pronostic, de stratification du risque, ou de suivi thérapeutique, d'au moins une pathologie cardiaque et/ou vasculaire chez un individu, comprenant les étapes de : 1) mise en contact d'un l'échantillon biologique de l'individu avec au moins un ligand tel que défini ci-dessus, de préférence dans des conditions permettant la formation de complexes antigène-ligand, 2) détection des complexes éventuellement formés, et 3) établissement à partir du résultat de la détection de l'étape 2) d'un diagnostic, d'un pronostic, d'un risque, ou de l'évolution de la pathologie chez l'individu Dans un mode de réalisation particulier, la méthode définie ci-dessus comprend au moins une étape additionnelle de mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un ligand additionnel spécifique du BNP(1-32) humain ou d'un dérivé du proBNP(1-108) humain, et présentant une spécificité différente io de celle du ligand selon l'invention. De préférence, le ligand additionnel est un anticorps. De préférence, la pathologie est choisie parmi le groupe constitué : - d'une insuffisance cardiaque, - d'un syndrome coronaire aigu, 15 - d'un accident vasculaire cérébral, - d'une insuffisance rénale, - d'une dyspnée, - d'une hypertension, - d'une rupture de plaque d'athérome, 20 - d'une persistance du canal artériel chez le nouveau-né prématuré, et/ou - du diabète. Par insuffisance cardiaque , on entend l'état pathologique dans lequel une anomalie de la fonction cardiaque est responsable de l'incapacité du coeur à pomper le sang de façon suffisante pour répondre aux besoins métaboliques de 25 l'organisme et/ou dans lequel le coeur pourvoit aux besoins mais avec des pressions de remplissage anormalement élevées. Il peut notamment s'agir d'une insuffisance ventriculaire droite et/ou gauche. Par Syndromes Coronaires Aigus , on distingue notamment deux catégories : 30 - l'insuffisance coronarienne aigüe accompagnée d'un sus-décalage [i.e. élévation] persistant du segment ST témoignant de la constitution d'un infarctus transmural avec onde Q correspondant généralement à une occlusion coronaire aigue totale, et l'insuffisance coronarienne aigüe sans sus-décalage [i.e. sans élévation] du segment ST correspondant aux infarctus sans onde Q, appelés également angors instables qui correspondent à des ruptures de plaques et des thromboses incomplètes et nécessitent une prise en charge différente. Par dyspnée , on entend l'état pathologique caractérisé par une difficulté à respirer s'accompagnant d'une sensation de gêne ou d'oppression. C'est un symptôme extrêmement fréquent, qui peut répondre à de multiples causes. Seule une approche méthodique permet une prise en charge appropriée. Par Accident Vasculaire Cérébral ou AVC ou Attaque Cérébrale Io ou Apoplexie (stroke en anglais), selon la définition de l'Office Mondial de la Santé, on entend l'état pathologique caractérisé par le développement rapide de signes cliniques localisés ou globaux de dysfonctionnement cérébral accompagné de symptômes durant: plus de 24 heures, pouvant conduire à la mort, sans autre cause apparente qu'une origine vasculaire. Le procédé et la méthode ci-dessus peuvent être réalisés selon divers formats bien connus de l'homme du métier : en phase solide ou en phase homogène ; en un temps ou en deux temps ; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, par exemple. On utilisera de préférence, la méthode sandwich en phase solide entre 20 deux ligands (de préférence des anticorps), l'un de capture et l'autre de détection. Ce type d'immunoessai est particulièrement bien connu de l'homme du métier. Par exemple, l'article Seferian et al. (2007) Clin. Chem. 53:866-873 donne un exemple d'immunoessai sandwich (ou essai immunométrique à 2 sites) pour doser le BNP(1-32) et le proBNP(1-108), au moyen à chaque fois d'une paire d'anticorps 25 (un anticorps immobilisé en phase solide et un anticorps marqué en détection). Par ligand de capture , on entend un ligand qui est capable de fixer l'antigène BNP(1-32) et/ou proBNP(1-108), ainsi que leurs fragments respectifs, présents dans l'échantillon biologique. La présence de l'antigène dans l'échantillon biologique est révélée par des 30 moyens de détection, notamment un ligand de détection . Ce dernier, marqué, est capable de se lier à l'antigène capturé, en reconnaissant un site épitopique, différent de celui reconnu par le ligand de capture. Le terme marqué se réfère aussi bien à un marquage direct qu'à un marquage indirect (par exemple, par le biais d'autres ligands eux-mêmes marqués de manière directe ou à l'aide de réactifs d'une paire d'affinité marquée, telle que, mais non exclusivement, la paire avidine marquée-biotine, etc..). En technique sandwich, le ligand de capture est de préférence choisi de manière à ce qu'il reconnaisse spécifiquement un épitope, sur l'antigène naturel du patient, tandis que le ligand de détection est choisi de préférence de manière à ce qu'il reconnaisse spécifiquement un autre épitope, sur l'antigène naturel du patient. De préférence, le ligand de capture est immobilisé sur une phase solide. On io peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, telles que celles commercialisées par la société Nunc, (Danemark. On peut également utiliser des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques, telles que celles fournies par Dynal, Merck-Eurolab (Frange) (sous la marque EstaporTM), Polymer Laboratories, ou 15 encore des tubes à essai en polystyrène ou polypropylène, des puces ( chips ) en verre, plastique ou silicium, etc... Des dosages IELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. Ainsi, divers type de marquage des ligands, 20 notamment des anticorps, sont envisageables (radioactifs, enzymatiques, fluorescents...). La détection peut également recourir à de nouvelles techniques basées sur l'accumulation de masse, comme la technique de résonance plasmonique de surface (SPR), par détection piézo-électrique, mais aussi par spectrométrie de 25 masse, ou toutes autres méthodes définies comme permettant d'étudier une interaction de type ligand ù antigène en l'absence d'un second ligand marqué. Un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci-dessus consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus immobilisé sur une phase solide en combinaison avec au moins un anticorps, monoclonal ou polyclonal, 30 dirigé contre la portion N-terminale du BNP(1-32), présent sous forme marquée. Un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci-dessus consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus immobilisé sur une phase solide en combinaison avec au moins un anticorps, monoclonal ou polyclonal, dirigé contre la portion C-terminale du BNP(1-32), comme par exemple l'anticorps 50B7, (spécifique du peptide 26-32 du BNP(1-32)), disponible chez HyTest, présent sous forme marquée. Alternativement, selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou de procédé ci-dessus, on pourra utiliser un ligand tel que défini ci-dessus, sous forme marquée en combinaison avec au moins un anticorps, monoclonal ou polycllonal, dirigé contre la portion Nterminale ou la portion C-terminale du BNP(1-32), présent sous forme immobilisé sur une phase solide. Un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci- to dessus, consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus immobilisé sur une phase solide en combinaison avec au moins un anticorps, monoclonal ou polyclonal, dirigé contre la portion N-terminale du proBNP(1-108), comme par exemple l'anticorps 16F3 (spécifique du peptide 13-20 du NT-proBNP), disponible chez HyTest, présent sous forme marquée. 15 Alternativement, un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci-dessus consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus sous forme marquée en combinaison avec au moins un anticorps, monoclonal ou polyclonal, dirigé contre la portion N-terminale du proBNP(1-108), comme par exemple l'anticorps 16F3 (spécifique du peptide 13-20 du NT-proBNP), disponible 20 chez HyTest, présenit sous forme immobilisée sur une phase solide. Un autre mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci-dessus consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus immobilisé sur une phase solide en combinaison avec un anticorps, monoclonal, dirigé contre la séquence RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) du proBNP(1-108) (comme celui décrit 25 dans la demande de brevet W02004/14952, ou celui décrit dans Giuliani et al. (2006) Clin. Chem.52:1054-1061), présent sous forme marquée. Alternativement, un mode de mise en oeuvre préféré de la méthode ou du procédé ci-dessus, consiste en l'emploi d'un ligand tel que défini ci-dessus sous forme marquée en combinaison avec un anticorps, monoclonal, dirigé contre la 30 séquence RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) du proBNP(1-108) (comme celui décrit dans la demande de brevet W02004/14952, ou celui décrit dans Giuliani et al. (2006) Clin. Chem.52:1054-1061) présent sous forme immobilisée sur une phase solide. La présente invention concerne également un étalon pluriépitopique répondant à la formule générale (III) suivante : t1- E1 ù L1 ù E2 [ù Lk-1 ù Ek]n ù t2 (III) dans laquelle : - n est un entier de O à 8; - k est un entier de 3àn ~2 lorsque n >0; - E1, E2, et Ek, sont différents les uns des autres, l'un représentent la séquence peptidique FGRKMDR, et les autres une séquence de 3 à 15 acides aminés choisie dans la séquence du proBNP(1-108) humain ; to - t1 représente un atome d'hydrogène, un groupement acétyle, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés N-a acétylée, un groupement biotinyle ou biocytinyle, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés portant un reste biotinyle ou biocytinyle, ou une chaîne aminoalkyl(C1-C1D)carbonyle linéaire ; ~s - t2 représente un radical hydroxyle, un radical amino, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés portant un groupement amino terminal, ou une chaîne aminoalkyl(C1-C10)carbonyle linéaire ou ramifiée ; - L1 et Lk, identiques ou différents, représentent un groupement de liaison de 20 chaînes peptidiques. De préférence, l'étalon pluriépitopique ci-dessus, répond à la formule générale (IV) suivante : t1-E1ûL1ûE2ûL2ûE3ût2 (IV) dans laquelle E1, E2, E3, L1, L2, t1 et t2 sont tels que définis ci-dessus. 25 De préférence également, l'étalon pluriépitopique ci-dessus, répond à la formule générale (V) suivante : t1-E1ûL1ûE2ût2 (V) dans laquelle E1, E2, L1, t1 et t2 sont tels que définis ci-dessus. De préférence, L1 et L2 représentent : 30 -NH-(CH2)5-CO-. Ce groupement, peut notamment dériver de l'agent de couplage nommé acide amino hexanoïque Lorsque E1, E2 et E3 sont présents, l'étalon est dit triépitopique, lorsque seuls E1 et E2 sont présents alors l'étalon est dit biépitopique. Les étalons (ou calibrateurs) ci-dessus sont utiles pour établir des courbes d'étalonnage pour les dosages du BNP(1-32), du proBNP(1-108) et/ou d'un de leurs fragments susviisés. Un avantage de ces étalons réside notamment dans leur stabilité. De préférence, un étalon biépitopique selon l'invention, lorsqu'il est utilisé pour le dosage du BNP(1-32), comprend l'épitope FGRKMDR selon l'invention et un autre épitope, différent, qui est choisi dans la séquence d'acides aminés 77-105 du proBNP(1-108). to De préférence, un étalon biépitopique selon l'invention, lorsqu'il est utilisé pour le dosage du proBNP(1-108), comprend l'épitope FGRKMDR selon l'invention et un autre épitope, différent, qui est choisi dans la séquence d'acides aminés 1-76 du proBNP(1-108), afin d'assurer la spécificité au proBNP(1-108). De préférence, un étalon triépitopique selon l'invention, utilisé pour le 15 dosage du BNP(1-32), comprend l'épitope FGRKMDR selon l'invention et deux autres épitopes, différents, qui sont choisis dans la séquence d'acides aminés 77-108 du proBNP(1-108). De préférence, un étalon triépitopique selon l'invention, utilisé pour le dosage du proBNP(1-108), comprend l'épitope FGRKMDR selon l'invention et 20 deux autres épitopes, différents, qui sont choisis dans la séquence d'acides aminés 1-108 du proBNP(1-108). De préférence, les séquences différentes de FGRKMDR sont sélectionnées dans le groupe constitué de PRSPKMVQG (SEQ ID NO: 56), APRSPKMV (SEQ ID NO: 57), SGLGCKLV (SEQ 1D NO: 58), SPKMVQGSG (SEQ ID NO: 59) et 25 YTLRAPRSPKMVG (SEQ ID NO: 60). En outre, la présente invention concerne également un kit de détection du BNP(1-32) humain ou du proBNP(1-108) humain ainsi que de leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR, comprenant au moins : - un ligand tel que défini ci-dessus ; et 30 - un étalon pluriépitopique tel que défini ci-dessus et/ou un polypeptide tel que défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, le kit ci-dessus comprend également un échantillon biologique témoins positif. De préférence, le kit selon l'invention comprend au moins l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM I- 3746. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 montre la réactivité de l'anticorps 20G7 avec des pentadécapeptides représentant la séquence du BNP(1-32). La Figure 2 montre !l'importance de chaque résidu dans la liaison à l'anticorps 20G7. La Figure 3 représente une gamme étalon du BNP(1-32) détecté par l'anticorps i o 20G7. La Figure 4 représente une gamme étalon du proBNP(1-108) recombinant détecté par l'anticorps 20G7. 15 La Figure 5 montre, en dosage du BNP(1-32), la corrélation entre les valeurs obtenues selon le format de l'immunoessai BNP(1-32) (Triage BNP) et les valeurs obtenues avec l'anticorps 20G7 selon l'invention (protocole du 8.2.) sur des patients insuffisants cardiaques. 20 La Figure 6 montre, en dosage du proBNP(1-108), la corrélation entre les valeurs obtenues selon le format de l'immunoessai proBNP(1-108) utilisant l'anticorps 20G7 selon l'invention (protocole du ≈12.4.2.) et les valeurs obtenues par l'immunoessai Triage BNP sur 48 sujets volontaires sains. 25 La Figure 7 montre, en dosage du proBNP(1-108), la corrélation entre les valeurs obtenues selon le format de l'immunoessai proBNP(1-108) utilisant l'anticorps 20G7 selon l'invention (protocole du ≈12.4.2.) et les valeurs obtenues par l'immunoessai Triage BNP sur 15 plasmas de patients diagnostiqués pour un SCA. 30 La Figure 8 montre la corrélation entre le dosage du proBNP(1-108) glycosylé et le dosage du proBNP(1-108) non glycosylé par immunoessai utilisant l'anticorps charnière 76 immobilisé et l'anticorps 20G7 selon l'invention en révélation. 215 EXEMPLES Exemple 1 - Synthèse de peptides Matériels et méthodes : Les peptides synthétiques sont produits par les techniques standards bien connues de l'homme du métier. On peut citer, comme exemple, la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse vu sa facilité de mise en oeuvre (Merrifield, io (1963); R.C.Sheppard (1971) ; Atherton et a/. (1989)). Comme synthétiseur automatique, on peut utiliser les synthétiseurs "Pioneer" de Perspective, ou le synthétiseur "433A" de ABI. Les peptides peuvent également être obtenus par synthèse en phase homogène. Les synthèses ci-après ont été réalisées sur un synthétiseur Pioneer, en 15 utilisant la chimie Fmoc (9-fluorénylméthyloxy carbonyl) : à chaque étape les réactifs (c'est à dire l'acide aminé protégé et les activateurs de couplage (TBTU(2-(1 H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate)/ HOBt (N-hydroxybenzotriazol)) sont ajoutés en excès (dans un rapport moles de réactifs/moles de groupes substituables sur la résine = 5). A la fin de la 20 synthèse, le peptide est séparé de la résine par une solution d'acide trifluoroacétique (réactif K). Le peptide est ensuite précipité dans une solution d'éther refroidie, lyophilisé, puis purifié par HPLC. Les inventeurs ont ainsi procédé à la synthèse des peptides contenant les séquences d'acides aminés suivantes : 25 SEQ ID NO: 4 : Ac-TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVLCys-CONH2, SEQ ID NO: 5: Ac-SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL-CysCONH2 SEQ ID NO: 6 : Ac-SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL-CysCONH2 SEQ ID NO: 7 : Ac-SGCFGRKMDRIATSTAIGCKVL-CysCONH2 SEQ ID NO: 8 : Ac-FGRKMDR-CONH2 30 SEQ ID NO: 9 : Ac-GRKMDR-CONH2 SEQ ID NO: 10 : Ac-FGRKMD-CONH2 SEQ ID NO: 11 : Ac-RKMDRI-CONH2 22 Exemple 2 ù Préparation d'immunogènes : couplage d'un peptide à une protéine porteuse pour immunisation En vue d'immuniser des souris avec ces peptides, il est nécessaire de les coupler à une protéine porteuse telle que la KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin), la thyroglobuline, la BSA (Bovine Serum Albumin, via différentes fonctions (thiol, amine, aldéhyde...) cle façon à rendre le peptide plus immunogène. L'agent de couplage utilisé pour lier le peptide à la protéine peut être hétéro- ou homobifonctionel. Les réactifs les plus couramment utilisés sont le BS3, le sSMCC, le Io SPDP, le glutaraldéhyde... La technique de couplage utilisée repose sur l'utilisation du s-SMCC (Pierce, #22322) molécule bifonctionnelle possédant une fonction ester NHS et un groupe maléimide, comme agent chimique de couplage, et de la KLH (Pierce, #77600) comme protéine porteuse. 15 2-a. Activation de la KLH : Méthode : 20 mg de KLH sont solubilisés en 2 ml de tampon phosphate saline (20 mM en phosphate, 0,9 M ,en NaCI pH 7,2) pour obtenir une concentration finale de 10 20 mg/ml (prendre soin de ne pas vortexer). Parallèlement, 4 mg de s-SMCC sont solubilisés avec 400 pl d'H20 PPI pour obtenir une concentration finale de 10 mg/ml. Ensuite les 2 ml de KLH (20 mg) sont mélangés à 200 pl de sSMCC (2 mg), et le mélange est incubé 1 heure à température ambiante (20 C) sous agitation lente (20 tours.min"'). 25 2-b. Dessalage de la KLH activée : Méthode : Une colonne PD10 Sephadex TM G-25m (Ge healthcare, USA, ref 17-0851-01) est équilibrée avec du tampon phosphate saline (20 mM en phosphate, NaCl 0,9M 30 pH 7,2, EDTA 100mM). Les 2 ml de KLH activée sont déposés sur la colonne, puis l'élution est commencée avec 3,5 ml de tampon PBS 20mM additionné de NaCl 0,9 M pH 7,.2 et de EDTA 100 mM ; des fractions de 500p1 sont récupérées. La densité optique (DO) est mesurée à 280 nm sur chaque fraction diluée au 24 1125ème, puis les fractions contenant la KLH activée sont identifiées et mesurées en utilisant la loi de Beer-Lambert : DO = CCI : où DO est la densité Optique, s = 1,499, C est la concentration et I = 1 cm, la concentration de la KLH activée peut être déterminée, et est ramenée à 7,4 mg/ml en tampon phosphate saline. 2-c. Couplage du peptide à la KLH activée Méthode : to 10 mg de peptide lyophilisé sont solubilisés dans 1 ml d'H20 milli-Q dégazée au sonicateur pour obtenir une concentration finale de 10 mg/ml, et sont mélangés avec 7,4 mg de KLH activée (soit 1 ml de la solution obtenue en 2-b.). Ce mélange est mis à incuber 2 heures à température ambiante (20 C) sous agitation lente (20t.min"1). Ensuite, une solution de cystéine à 5 mg/ml dans du is tampon PBS 20 mM + NaCl 0,9 M pH 7,2, est introduite pour obtenir une concentration finale de 1 mM dans la solution peptide/KLH, et l'ensemble est mis à incuber 20 minutes à température ambiante (20 C) sous agitation lente (20t.min''). 2-d. Caractérisation du peptide couplé 20 Méthode : La concentration du peptide couplé est alors déterminée par la technique de Bradford (Bradford M., Anal. Biochem., 1976;72:248-54), de la manière suivante : une gamme étalon de 50 à 1000 pg/mL de KLH est réalisée pour déterminer à partir de la DO à 595 nm la concentration en KLH de notre 25 échantillon. Pour réaliser cette gamme étalon et ce dosage, 50 pL de chaque point de la gamme ou de l'échantillon sont dilués dans 1,5 mL de bleu de Coomassie (Bio-Rad, #1856210). La concentration étant déterminée, du PBS est ajouté au peptide couplé à la KLH pour ramener la concentration du peptide couplé à 1 mg/mL. 30 25 Exemple 3 - Immunisations de souris et production d'anticorps monoclonaux 3-a) Immunisations de souris : Pour la production d'anticorps monoclonaux, dix souris (femelles de souche Balblc, de 5 semaines, ref SIFE055, Charles River, MA, Etats-Unis) ont été immunisées à l'aide de l'un des peptides suivants : Ac-TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL-Cys-CONH2, (SEQ ID NO: 4) w Ac- SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL-CysCONH2 (SEQ ID NO: 5), couplés à la KLH selon l'exemple 2 (5 souris pour chaque peptide). A la première injection, une émulsion de 100 pg de peptide couplé à la KLH (à 1 mg/ml) dilué au %2 dans l'adjuvant de Freund complet (Sigma, # F-5881) est réalisée, et 200 pL de cette dernière émulsion (soit 100 .g de peptide) sont 15 injectés par voie sous-cutanée à chaque souris. Trois rappels sont réalisés à 20 jours d'intervalle en injectant à chaque souris par voie sous-cutanée, puis par voie péritonéale, 200 pL d'une émulsion de peptide couplé à la KLH (soit 100 pg de peptide) avec de l'adjuvant de Freund incomplet (Sigma, #F-5506). Vingt jours après ce dernier rappel, et après évaluation du titre en anticorps 20 obtenu en ELISA (selon l'exemple 4 décrit ci-dessous), la souris la plus réactive contre le BNP(1-32) est retenue, pour subir une hyperimmunisation, suivant le protocole suivant : -injection par voie sous-cutanée de 200 pL de peptide-KLH à 1 mg/mL dilués au 1/20ème en PBS 25- 45 minutes d'attente injection de 200 pL de peptide-KLH à 1 mg1mL dilués au 1/20ème en PBS par voie sous-cutanée en un point différent de la première injection 45 minutes d'attente injection de 200 pL de peptide-KLH à 1 mg/mL dilués au 1/10ème en PBS 30 par voie sous-cutanée en un point différent des précédentes injections 30 minutes d'attente injection de 100 pL de prométhazine (Phenergan à 2,5 %, solution injectable, UCB) diluée à 1 mg/mL en PBS par voie intrapéritonéale. 15 minutes d'attente injection de 200 pl de peptide-KLH à 1 mg/mL dilué au 3110èmes en PBS par voie intrapéritonéale en un point différent des précédentes injections. Suite à ces immunisations, la souris S2 immunisée avec le peptide de SEQ ID NO: 1 s'est révélée productrice d'antisérum très réactif vis à vis du BNP(1-32) lors de la mise en oeuvre du protocole de détection d'anticorps décrit dans l'exemple 4 ci-après. Les lymphocytes de la rate de cette souris ont fait ensuite l'objet de fusions lymphocytaires réalisées selon le protocole décrit ci-après en 3b. 3-b) Production d'anticorps monoclonaux : Une fusion lymphocytaire de cellules de rate de la souris immunisée S2 avec des cellules de myélome SP2 (ATCC CRL-1581) est réalisée selon le protocole bien connu de Kéhler et Milstein (1975) Nature 56:495- 497. Les inventeurs ont ainsi pu produire différents clones hybrides. Ils ont obtenu en particulier un anticorps monoclonal, désigné 20G7-15/0312007 (ci-après désigné 20G7 pour raisons de commodité). L'hybridome sécrétant l'anticorps monoclonal 20G7-15/03/2007 (20G7) a été déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. II va de soi que d'autres protocoles d'obtention d'anticorps monoclonaux bien connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. Exemple 4 - Détection des anticorps anti-BNP(1-32) pour évaluer la réponse 25 des souris en cours d'immunisation 4.1 Matériels : Les réactifs suivants ont été utilisés: - microplaque 96 puits Maxisorp à fond plat (Nunc, Danemark) 30 - tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, pastilles Gibco ref 18912-014 (Invitrogen) - BNP(1-32) : peptide synthétique (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, # B-5900) ou - proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. Coli, HyTest, Finlande) 35 - Tween 20 (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, #P1379) - anticorps secondaire de lapin anti-IgG de souris couplé à la peroxydase, (Sigma, Etats-Unis #A9044) - H202 (0,04% dans 0,1 M tampon citrate, pH 4) - OPD (ortho-phénylènediamine, Sigma, Etats-Unis, #P8412) -acide sulfurique (H2SO4, 4N) - sérums de souris immunisées dans l'exemple 3. 4.2 Méthode et Principe : Un test ELISA sur support solide a été mis en place pour détecter la io présence d'anticorps anti-BNP(1-32) dans un échantillon de sérum de souris. De l'antigène est immobilisé par adsorption dans les cupules d'une microplaque à 96 puits. Après saturation et blocage des sites libres résiduels, les sérums immuns sont mis à incuber et les anticorps ( Ac ) éventuellement présents se lient à l'antigène ( Ag ) et forment un complexe Ag-Ac. Ce complexe est détecté à 15 l'aide d'un immunoconjugué (anticorps anti-IgG de souris) couplé à une enzyme, ici la HRP (horse raclish peroxidase) qui transforme un substrat incolore en un produit coloré témoin de la présence de l'anticorps recherché. La formation du produit coloré final est quantifiée par lecture de la Densité Optique à 490 nm (DO). La DO obtenue indique, selon cette technique bien connue de l'homme du métier, 20 la présence (DO élevée) ou l'absence d'anticorps (DO basse) dans un échantillon de sérum de souris testé. Il existe de nombreuses variantes du test (capture de l'antigène, dosage par compétition ....) bien connues de l'homme du métier. 1) Immobilisation de l'antigène sur la microplaque : 25 Chacun des antigènes, BNP(1-32) ou proBNP(1-108), est solubilisé à la concentration finale d,e 0,5 pg/mL en PBS puis immobilisé, à raison de 100 pL par puits, sur une microplaque Maxisorp par incubation d'une nuit à 4 C. Après 3 lavages en PBS-Tween 20 (PBS-T) à 0,1%, la microplaque est saturée avec une solution (100 pL/puits) de PBS-T 0,1% contenant du lait (V2-écrémé) à 1% puis 30 mise à incuber pendant 1 heure à 37 C. 2) Détection immunologique des anticorps produits par les souris: La microplaque est lavée 3 fois en PBS-T 0,1 %. Puis, chaque sérum de souris précédemment immunisée est dilué de 10 en 10 en PBS-T 0,1% contenant du lait (1/2 écrémé) à 0,1%, puis déposé à raison de 100 pL par puits et mis à incuber pendant 2 heures à 37 C. La microplaque est lavée de nouveau trois fois en PBS-T à 0,1 %, puis mise à incuber pendant 1 heure à 37 C en présence du conjugué couplé à la peroxydase dilué au 1130008 en PBS-T 0,1% contenant du lait (1/2 écrémé) à 0,1% à raison de 100 pL par puits. Enfin, la microplaque est lavée trois fois avec du PBS- T 0,1%, puis le substrat de la peroxydase est déposé à raison de 100 pL/puits. La microplaque estplacée dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. La réaction enzymatique est arrêtée io par ajout de 50 pL d'acide sulfurique (H2SO4, 4 N) par puits, puis la DO à 490 nm est mesurée dans chaque puits. C'est en mettant en œuvre cette technique de détection d'anticorps, que les inventeurs ont repéré que le sérum de la souris S2 (immunisée avec le peptide SEQ ID NO: 1) était très réactif avec le BNP(1-32), et le proBNP(1-108). Suite à la is fusion lymphocytaire réalisée ensuite entre des lymphocytes de cette souris hyperimmune et le myélome Sp2, c'est également grâce à la mise en oeuvre de cette même technique qu'un hybridome producteur d'un anticorps monoclonal d'intérêt a pu être repéré : l'hybridome 20G7, producteur de l'anticorps monoclonal 20G7. 20 Exemple 5 - Caractérisation épitopique de l'anticorps monoclonal 20G7 5.1 Matériels : Appareils et réactifs sont tous répertoriés dans C. Granier, S. Villard, D. 25 Laune (Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook Third Edition (Volume 1), Chapter 62, Julio Celis Editor, Elsevier, 2005). 5.2 Méthode: 30 En vue de caractériser l'épitope de l'anticorps monoclonal 20G7, la technique Spot ou epitope mapping (i.e. cartographie épitopique) a été utilisée. Celle-ci, décrite par Frank (Tetrahedron, 1992; 48: 9217-32), permet la synthèse rapide sur membrane de nitrocellulose d'un grand nombre de peptides de séquences prédéfïnies sur un support fonctionnalisé (aminopolyéthylèneglycol- cellulose) et de tester leurs réactivités vis-à-vis d'un ligand soluble, dans le présent cas l'anticorps 20G7. 5.2.1 Synthèse des peptides Tout le processus de synthèse des peptides (activation des acides aminés, réaction chimique...) est décrit en détails dans Molina et al (Pept Res. 1996, Vol 9: p 151-5), ainsi que dans C. Granier, S. Villard, D. Laune (Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook Third Edition (Volume 1), Chapter 62, Julio Celis Editor, to Elsevier, 2005). La séquence du BNP(1-32) a été entièrement synthétisée sous forme de pentadécapeptides chevauchants (SEQ ID NO: 12 à 20), décalés de 2 acides aminés : SEQ ID NO: 12 SPKMVQGSGCFGRKM 15 SEQ ID NO: 13 KMVQGSGCFGRKMDR SEQ ID NO: 14 VQGSGCFGRKMDRIS SEQ ID NO: 15 GSGCFGRKMDRISSS SEQ ID NO: 16 GCFGRKMDRISSSSG SEQ ID NO: 17 FGRKMDRISSSSGLG 20 SEQ ID NO: 18 RKMDRISSSSGLGCK SEQ ID NO: 19 MDRISSSSGLGCKVL SEQ ID NO: 20 RISSSSGLGCKVLRR Les autres peptides suivants ont aussi été synthétisés : 25 SEQ ID NO: 21 VQGSGCFGR SEQ ID NO: 22 SPKMVQGSGC SEQ ID NO: 23 MDRISSSSGLG SEQ ID NO: 24 RKMDRI SEQ ID NO: 25 RKMDRISS 30 La séquence du BNP(1-32) a été également synthétisée sous forme de décapeptides chevauchants (SEQ ID NO: 26 à 48), décalés de 1 acide aminé : SEQ ID NO: 26 SPKMVQGSGC SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 SEQ IDNO:31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35 ~o SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40 15 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 20 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 PKMVQGSGCF KMVQGSGCFG NIVQGSGCFGR VQGSGCFGRK QGSGCFGRKM GSGCFGRKMD SGCFGRKMDR GCFGRKMDRI CFGRKMDRIS FGRKMDRISS GRKMDRISSS RKMDRISSSS KMDRISSSSG MDRISSSSGL DRISSSSGLG RISSSSGLGC ISSSSGLGCK SSSSGLGCKV SSSGLGCKVL SSGLGCKVLR SGLGCKVLRR GLGCKVLRRH aminé, a également été Une sélection d'heptapeptides, décalés d'un acide 25 synthétisée (SEQ ID NO: 49 à 53) SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 30 SEQ ID NO: 53 GCFGRKM CFGRKMD FGRKMDR GRKMDRI RKMDRIS 5.2.2 Test immunologique Le test d'immunoréactivité suivi a été décrit en détails dans l'article Laune et al (J. Immunol. Methods, 2002, Vol 267(1), p 53-70). Brièvement le principe est le suivant. La membrane est réhydratée par 3 bains de TBS (Tris Buffered Saline) pH 7,0) de 10 minutes chacun, puis saturée par incubation en présence de 15 ml tampon de saturation ( Blocking Buffer , Roche) à 10 % et saccharose à 5 % en TBS - Tween 20 (TBS-T) à 0,1 % pendant une nuit sous agitation à température ambiante. Après 3 lavages de la membrane avec du TBS-T à 0,1 % pendant 10 minutes, la membrane est mise à incuber pendant 1 heure 30 minutes à 37 C sous agitation en présence de l'anticorps à tester (ici le 20G7) et du conjugué couplé à la phosphatase alcaline dilués en tampon de saturation. Après 2 lavages io de la membrane en TIBS-T 0,1 % puis 2 lavages en CBS (Citrate buffered saline), chacun bain étant de 10 minutes, le substrat de la phosphatase alcaline est ajouté et la membrane incubée à température ambiante de 1 à 30 minutes en fonction de la rapidité d'apparition du signal. 15 5.2.3 Résultats Dans le cas présent, la séquence du BNP(1-32) a été entièrement synthétisée sous forrne de pentadécapeptides chevauchants (SEQ ID NO: 12 à 20), décalés de 2 acides aminés. Tel qu'illustré dans la figure 1, lorsque ces peptides sont mis en contact avec l'anticorps 20G7 purifié, seuls 5 peptides 20 successifs réagissent avec l'anticorps et ont pour séquence commune F GRKMDR (Figure 1) : SEQ ID NO: 10 KMVQGSGCFGRKMDR SEQ IDNO:11 VQGSGCFGRKMDRIS SEQ IDNO:12 GSGCFGRKMDRISSS 25 SEQ IDNO:13 GCFGRKMDRISSSSG SEQ IDNO:14 FGRKMDRISSSSGLG Pour s'assurer que seul ce motif participe réellement à la liaison de l'anticorps au BNP(1-32), ont également été synthétisés des peptides de tailles 30 plus courtes (des décapeptides (SEQ ID NO: 26 à 48) ainsi que des heptapeptides (SEQ ID NO: 49 à 53)), avec un décalage de seulement un acide aminé, pour confirmer et valider l'épitope. Dans chaque expérience, la séquence commune des peptides reconnus par le 20G7 était F GRKMDR (pour les décapeptides, SEQ ID NO: 33 à 36, et pour les heptapeptides, SEQ ID NO: 51). Afin de déterminer les résidus critiques et essentiels à la reconnaissance de l'épitope, chaque résidu de la séquence minimale F1IGRKMDR17 a été substitué successivement par une alanine (A) pour évaluer leur implication individuelle selon la méthode Alascan bien connue et décrite (Laune et al, supra). Tel que représenté sur la figure 2, la liaison est diminuée de 85%, 94% et 82% lorsque, respectivement, les résidus F11, K14 et R17 sont substitués par une alanine, ce qui indique que ces résidus sont essentiels. to Ces acides aminés en position 11, 14 et 17 sont essentiels à la reconnaissance de l'épitope par l'anticorps monoclonal 20G7. Ces données sont des moyennes de plusieurs (n = 4) répétitions d'expériences. Il est donc clair, pour cette raison, que l'épitope F1IGRKMDR17i avec les acides aminés Fil, K14 et R17 essentiels, selon l'invention, est différent de celui reconnu dans la demande 1s WO2006/88700 qui décrit un autre épitope (R13(K14)(M15)D16R17118) dont les acides aminés importants, sont R13, D16, R17 et 118. Pour mieux comprendre la contribution de ces résidus à la liaison à l'anticorps 20G7, les acides aminés FI1, K14 et R17 ont été substitués par des acides aminés présentant des propriétés biochimiques proches. Par exemple, la 20 F11 a été également substituée par d'autres acides aminés aromatiques (tryptophane et tyrosine). La reconnaissance de la séquence composée de ces peptides homologues par l'anticorps 20G7 s'avère inchangée, sous-entendant que c'est le caractère aromatique en position 11 qui est essentiel à la liaison de l'anticorps. Quant à la K14 et R17i tous deux ont été substitués par une arginine et 25 une lysine pour étudier l'influence de la chaîne latérale de l'acide aminé ainsi que de la présence de la charge positive. Et là encore, la substitution s'avère effectivement conservatrice, car la liaison de 20G7 est conservée, soulignant ainsi l'importance de la charge positive. Il n'en est pas de même avec l'anticorps 24C5 de HyTest, qui présente des 30 résidus essentiels différents. Via la technique Spot, les séquences peptidiques VQGSGCFGR, SPKMVQGSGC, MDRISSSSGLG, R13KMDRI18 et R13KMDRISS20 (SEQ ID NO: 21 à SEQ NO : 25), du E3NP(1-32) humain, également synthétisées sur membrane, ont été testées avec l'anticorps 20G7. Du fait de l'absence des résidus essentiels à la liaison du 20G7, celui-ci ne se lie absolument pas à ces peptides, de sorte que le 20G7 présente une réaction croisée de moins de 2% avec ces peptides. Exemple 6 - Caractérisation épitopique d'autres anticorps monoclonaux anti-BNP(1-32) - Comparaison avec l'anticorps 20G7 6.1. Matériels, Méthodes et protocoles : Les mêmes membranes de cellulose et les mêmes conditions de réactivité que celles décrites dans l'exemple 5 sont utilisées pour l'étude de ces anticorps. 6.2. Résultats : Les inventeurs ont ainsi obtenu une série d'anticorps monoclonaux caractérisés suivants : 20G7, 11A8, et 17F10. Tel que rapporté dans le tableau 2, les deux anticorps monoclonaux 11A8 et 17F10 ont le même épitope que le monoclonal 20G7 de la présente invention, F11GRKMDR17, mais possèdent un acide aminé critique supplémentaire par rapport au 20G7. Tableau 1 - Caractéristiques des anticorps monoclonaux Anticorps monoclonal Immunogène Epitope Résidus critiques 20G7 SEQ ID NO: 4 F11GRKMDR17 F, K et R 11A8 SEQ ID NO: 4 F11GRKMDRI7 F, G, K et R 17F10 SEQ ID NO: 4 F11GRKMDR17 F, K, D et R Exemple 7 - Caractérisation de l'interaction antigène-anticorps des d'anticorps monoclonaux par la technologie de Résonance de Plasmonique 25 de Surface 7.1. Matériels : - Analyseur BlAcore 2000 & 3000 (Pharmacia, Uppsala, Suède) - BNP(1-32) (peptide synthétique, Sigma, Etats-Unis, # B-5900) 30 -proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. Coli, HyTest, Finlande) - anticorps anti fragment Fc (Sigma, Etats-Unis) • 2919611 34 - anticorps monoclonaux 20G7, 11A8, 17F10 (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) - Tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4 5 7.2. Méthode : 7.2.1. Principe : L'analyseur BlAcore 2000 & 3000, (dont le principe repose sur la technologie de Résonance Plasmonique de Surface (SPR)) a été utilisé pour définir la cinétique et l'affinité de l'interaction de l'anticorps monoclonal 20G7 et lo d'autres anticorps monoclonaux avec le BNP(1-32) ou le proBNP(1-108). Les inventeurs ont suivi les instructions du fabricant. La technique de Résonance Plasmonique de Surface SPR (Biacore , Pharmacia) a entièrement été décrite dans l'article de Ferrières et al. (2000, FEBS Letters, 479(3) :99-105). Un anticorps monoclonal est immobilisé sur un 15 biocapteur ou surface solide à l'aide d'un anticorps anti fragment Fc, alors que l'antigène soluble (BNP(1-32) ou proBNP(1-108) à concentrations croissantes (0,001256 à 0, 125 pglml) circule à flux constant à la surface du biocapteur à température ambiante. L'angle dans lequel le signal SPR est détecté est directement proportionnel à l'indice de réfraction du milieu dans lequel l'onde 20 évanescente se propage. Les variations d'indice de réfraction sont exprimées en Unités de Résonance (RU, avec 1000 unités de résonance correspondant à 1 ng de protéines fixées par mm2 de surface active). La quantification des interactions et de l'affinité entre l'antigène et l'anticorps monoclonal s'évalue par le calcul des constantes de vitesse d'association (ka) et de dissociation (kd) selon un traitement global des données et le logiciel du fabricant BlAevaluation (BlAcore , Pharmacia, Uppsala, Suède). La constante de dissociation à l'équilibre (KD=kd/ka) en mol/I reflète l'affinité de l'antigène BNP(1-32) ou proBNP(1-108) pour l'anticorps monoclonal. 7.2.2. Résultats : Le Tableau 2 illustre les caractéristiques des interactions des anticorps anti-BNP monoclonaux (incluant le 20G7) avec les deux antigènes recombinants BNP(1-32) et proBNP(1-108). Tableau 2 - Interactions de divers anticorps anti-BNP monoclonaux avec les antigènes BNP(1-32) pet proBNP(1-108). BNP ka (M"1 s-1) kd (s-1) KA (M'1) KD (M) 20G7 1,40 106 2,3810-4 5,90109 1,70 10-10 11A8 8,58105 2,2310-3 3,85108 2,5910-9 17F10 5,84105 2,8210-4 2,07109 4,83 10-10 ProBNP ka (M-1 s-1) kd (s-1) KA (M-1) KD (M) 20G7 1,02 106 1,74 10-4 5,90 109 1,69 10-10 11A8 7,63 105 1,19 10-3 6,43 108 1,56 10-9 17F10 9,34105 2,15104 4,35109 2,3010-10 Le tableau 2 résume les différentes caractéristiques (valeurs de la constante de vitesse d'association (ka) et de la constante de dissociation (kd) permettant le calcul de la constante de dissociation à l'équilibre (KD en M) de l'interaction du BNP(1-32) ou du proBNP(1-108) avec les anticorps monoclonaux. to Ces résultats d'interaction renforcent les données obtenues avec le dosage du BNP(1-32) et du prol3NP(1-108), dans la mesure où l'anticorps monoclonal 20G7 possède une excellente constante d'association (ka) et une faible constante de dissociation (kd), lui permettant d'être caractérisé par une excellente constante d'affinité identique de 1,70"90 M pour le BNP(1-32) et le proBNP(1-108) (Tableau 15 2). Des exemples sont également fournis pour d'autres monoclonaux (11A8 et 17F10) dont les constantes d'affinité sont de l'ordre du nanomolaire (2 x 10-10 à 9,35 x 10.10 M, Tableau 2). 20 Exemple 8 - Dosage du BNP à l'aide de l'anticorps monoclonal 20G7 8.1. Matériels : - microplaque 96 puits Maxisorp à fond plat (Nunc, Danemark) - tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, pastilles Gibco ref 18912-014 25 (Invitrogen) - BNP(1-32) peptide synthétique (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, # B-5900) - proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. Coli, HyTest, Finlande) - Tween 20 (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, #P1379) - anticorps polyclonal de lapin L21016 obtenu en immunisant des lapins avec un immunogène ciblant la région 1-10 du BNP(1-32) et ayant comme épitope la 5 séquence SIPKMV5 (SEQ ID NO: 54) du BNP(1-32) - anticorps monoclonal 20G7 (Bio-Rad) - anticorps monoclonaux 24C5 et 26E2 (HyTest, Turku, Finalnde) - conjugué d'anticorps de lapin anti-IgG de souris couplé à la péroxydase, (Sigma, Etats-Unis #A9044). - H2O2 à 0,04% en tarnpon citrate 0,1 M, pH 4) - OPD (ortho-phénylènediamine, Sigma, Etats-Unis, #P8412) - acide sulfurique (H2SO4, 4N) 8.2. Méthode et principe : 15 Tout d'abord une gamme étalon de 20 à 10 000 pg/ml de BNP(1-32) est préparée en tamponl:sérum à partir de BNP(1-32) synthétique. Le dosage repose sur le principe du sandwich ELISA sur microplaque utilisant en capture sur phase solide un anticorps polyclonal de lapin L21016 (Bio-Rad), ayant comme épitope la séquence S1PKMV5 du BNP(1-32) fixé par 20 adsorption passive à raison de 100 pI de solution à 5 pg/mI par puits. 100 pI de solution d'anticorps monoclonal (anticorps 20G7, 2405 ou 26E2), en solution à 0,5 pg/ml en tampon PBS Tween 20 (PBS-T) à 0,1%, contenant du lait (1/2 écrémé) à 0,1%, sont utilisés comme réactifs de détection. L'intensité de la réponse du 20G7 est donc comparée à celle des anticorps monoclonaux 24C5 25 et 26E2. Le tableau 3 résume les résultats du dosage analytique du BNP(1-32), exprimés en densité optique (DO) à 490 nm, obtenus par ces anticorps en présence des concentrations étalons de BNP(1-32). 30 Tableau 3 - Valeurs de DO obtenues en dosage analytique du BNP(1-32) avec différents anticorps BNP(1-32) (pglml) 20G7 24 C5 26 E2 10000 3,752 0,077 0,048 5000 3,056 0,068 0,041 2500 1,950 0,067 0,035 1250 1,111 0,056 0, 031 625 0,625 0,059 0,029 312,5 0,404 0,063 0,027 156,25 0,180 0,071 0,032 78 0,099 0,052 0,055 39 0,066 0,055 0,032 20 0,031 0,068 0,034 0 0,024 0,071 0,022 II est très remarquable de noter que les deux anticorps 24C5 et 26E2 ont un comportement tout à fait distinct de l'anticorps 20G7 de la présente invention. Ainsi, ces résultats confirment bien que dans ce dernier format d'essai, le 20G7 est beaucoup plus approprié que les anticorps 24C5 et 26E2 pour permettre un dosage du BNP(1-32). io La gamme étalon représentée dans la figure 3, obtenue avec l'anticorps monoclonal 20G7 est linéaire de 20 à 10 000 pg/ml (r2 = 0,96 ). Les deux anticorps commerciaux 24C5 et 26E2 sont peu ou pas efficaces pour la détection du BNP(1-32), même pour les concentrations élevées de l'analyte (Tableau 3). Exemple 9 - Etudle de complémentarité d'anticorps monoclonaux en sandwich EL1SA 9.1. Matériels : 20 - microplaque 96 puits Maxisorp à fond plat (Nunc, Danemark) sensibilisée par l'anticorps polyclonal de lapin L21016 (Bio-Rad) reconnaissant la séquence S1PKMV5 (SEQ ID NO: 54) du BNP(1-32), - tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, pastilles Gibco ref 18912-014 (Invitrogen) 15 - Tween 20 (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, #P1379) - BNP(1-32) peptide synthétique, (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, # B-5900) -proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. Coli, HyTest, Finlande) - anticorps 20G7 (dirigé contre l'épitope FIIGRKMDR17 (SEQ ID NO: 51)), préparé à des concentrations diverses : de 0,001 à 1 pg/ml, -anticorps monoclonal 50B7 (HyTest, Finlande) qui reconnaît la partie C-terminale du BNP(1-32) en concentration unique : 0,5 pg/ml - anticorps secondaire de lapin anti-IgG de souris couplé à la peroxydase, (Sigma, Etats-Unis #A9044) to - H2O2 à 0,04% (en tampon citrate 0,1 M, pH 4, Sigma, Etats-Unis) - OPD (ortho-phénylènediamine, Sigma, Etats-Unis, #P8412) - acide sulfurique (H2SO4, 4N, Sigma, Etats-Unis) 9.2. Méthode : is 9.2.1. Principe: Le dosage repose sur le principe du sandwich ELISA sur microplaque utilisant en capture sur phase solide l'anticorps polyclonal de lapin L21016 (Bio-Rad) ayant comme épitope la séquence SIPKMV5 (SEQ ID NO: 54) du BNP(1-32) 20 fixé par adsorption passive (voir exemple 8), et une combinaison de 2 anticorps monoclonaux (l'anticorps 20G7 dirigé contre l'épitope FIIGRKMDR17 (SEQ ID NO: 51) et l'anticorps monoclonal 50B7 (HyTest, Finlande) ciblant la partie C-terminale du BNP(1-32)) pour la détection. Toutefois l'anticorps 20G7 est utilisé à concentrations variables alors que l'anticorps monoclonal 50B7 est utilisé à 25 concentration constante de 0.5 pg/ml. La complémentarité épitopique des anticorps 20G7 et 50B7 est étudiée pour des concentrations de l'anticorps 20G7 variables. Ce format permet d'évaluer la coopérativité des cieux anticorps monoclonaux pour améliorer la détection du BNP(1-32). 30 9.2.2. Protocole : Dans chaque puits de microplaque, dans lequel l'anticorps polyclonal L21016 est adsorbé, 100 pl de solution de BNP(1-32) à 5 ng/ml sont ajoutés, et mis à incuber pendant 2 heures à 37 C. La microplaque est lavée 3 fois en PBS-T à 0,1 %, puis 100 pl d'un mélange contenant l'anticorps 50B7 et une des dilutions de l'anticorps 20G7 sont répartis. L'ensemble est mis à incuber pendant 2 heures à 37 C. Après 3 lavages avec du PBS-T à 0,1 %, le conjugué peroxydase - anticorps de lapin anti-IgG de souris (dilué au 113000ème en PBS-T à (3,1% et contenant du lait (1/2 écrémé) à 0,1%), à raison de 100 pL par puits, est mis à incuber pendant 1 heure à 37 C. Enfin, après 3 lavages au PBS-T à 0,1%, la solution d'H2O2 + OPD est déposée à raison de 100 pUpuits. La microplaque est placée dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. La réaction io enzymatique est arrêtée par ajout de 50 pL d'acide sulfurique (H2SO4, 4 N) par puits, puis la DO à 490 nm est mesurée dans chaque puits. 9.2.3. Résultats Le Tableau 4 montre les résultats du dosage analytique du BNP à l'aide des 15 anticorps monoclonaux 20G7 et 50B7 exprimés en densité optique à 490 nm. Tableau 4 - Coopérativité des deux anticorps monoclonaux pour la détection du BNP(1-32) Gamme Densité Optique 20G7 (pg/ml) 490 nm 0,5 3, 792 0,1 3,753 0,05 3,747 0,01 3,531 0,005 3,272 0,001 1,948 0 1,296 20 On constate une synergie entre les deux anticorps. En d'autres termes, on constate que les contributions des deux anticorps s'additionnent : en l'absence d'apport de 20G7 le signal (DO) est limité à 1,296, et plus on ajoute de 20G7, plus le signal (DO) résultant augmente. 25 L'utilisation conjointe de l'anticorps monoclonal 20G7, ciblant l'épitope selon l'invention F1IGRKMDRI7 (SEQ ID NO: 51) (situé dans la boucle du BNP(1-32)) et 40 de l'anticorps monoclonal 50B7, ciblant la région C-terminale du BNP(1-32), améliore significativement la détection du BNP(1-32). Elle démontre l'apport cumulatif ou coopératif des deux anticorps monoclonaux utilisés en détection. Une telle complémentarité peut être également envisagée entre l'anticorps monoclonal 20G7 et d'autres anticorps reconnaissant un épitope situé à d'autres endroits de la séquence du BNP(1-32) (en position N-terminale, en position C-terminale, principalement). Le nombre d'anticorps utilisés peut également être supérieur à deux pour autant que l'on ne rencontre pas de problème de gêne stérique. i0 Exemple 10 - Dosage du proBNP(1-108) à l'aide de l'anticorps monoclonal 20G7 10.1. Matériels : 15 - BNP(1-32) peptide synthétique, (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, # B-5900) - proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. Coli, HyTest, Finlande) - microplaque 96 puits Maxisorp à fond plat (Nunc, Danemark) sensibilisée par anticorps monoclonal (anticorps charnière 76, par exemple, de Bio-Rad) 20 reconnaissant la séquence charnière du proBNP(1-108) : épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) (Giuliani et al., Clin. Chem., 52:6, 1054-1061, 2006) -anticorps monoclonal 20G7 (Bio-Rad) couplé à la peroxydase - anticorps monoclonal 24C5 (HyTest, Finlande) couplé à la peroxydase - anticorps monoclonal 26E2 (HyTest, Finlande) couplé à la peroxydase 25 - tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, pastilles Gibco ref 18912-014 (Invitrogen) - Tween 20 (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, #P1379) 10.2. Méthode : 30 10.2.1. Principe du dosage analytique du proBNP(1-108) : Tout d'abord une gamme étalon de 20 à 10 000 pg/ml de proBNP(1-108) est préparée en tampon PBS-T à 0,1% à partir de proBNP(1-108) recombinant . Le dosage repose sur le principe du sandwich ELISA sur microplaque utilisant en capture sur phase solide un anticorps monoclonal (anticorps charnière 76, par exemple de Bio-Rad) et reconnaissant la séquence charnière du proBNP(1-108) : épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) fixé par adsorption passive à raison de 100 pl de solution à 0,5pg/mI par puits. 100 pl de solution d'anticorps monoclonal à 0,5 pg/ml (anticorps 20G7, 24C5 ou 26E2) couplé à la peroxydase, en solution en tampon PBS-T à 0,1% (contenant du lait 1/2 écrémé à 0,1%),sont utilisés comme anticorps de détection. Hormis ce point technique, le protocole est identique à celui de l'ELISA de l'exemple 8. Les caractéristiques de révélation du 20G7 sont donc comparées à celles des anticorps monoclonaux 24C5 et 26E2. to Le tableau 5 rapporte les résultats du dosage analytique du proBNP(1-108), exprimés en densité optique, obtenus à l'aide de ces anticorps en présence des concentrations étalons de proBNP(1-108). 10.3. Résultats : 15 Tableau 5 - Dosage analytique du proBNP(1-108) avec différents anticorps 10000 >4 0,220 0,158 5000 3,845 0,117 0,041 2500 3,272 0,069 0,031 1250 1,955 0,068 0,024 625 0,997 0,070 0,024 312,5 0,512 0,035 0,028 156,25 0,264 0,055 0,027 78 0,126 0,056 0,033 39 0,092 0,056 0,028 20 0,069 0,052 0,028 0 0,045 0,044 0,024 II est très remarquable de noter que l'anticorps 20G7 de la présente invention détecte non seulement le BNP(1-32) mais aussi le proBNP(1-108). Par 20 ailleurs, ici aussi les deux anticorps de HyTest ont un comportement tout à fait distinct de l'anticorps 20G7. Cela confirme l'intérêt majeur de l'anticorps 20G7 pour le dosage du BNP(1-32) et du proBNP(1-108). La figure 4 illustre la gamme étalon linéaire obtenue avec l'anticorps ProBNP(1-108) 20G7 24 C5 26 E2 (pglrnl) (Hytest) (Hytest) monoclonal 20G7 de 20 à 10 000 pg/ml de proBNP (r2 = 0,99, Figure 2), alors que les deux anticorps cornmerciaux de Hytest sont peu ou pas efficaces pour détecter le proBNP(1-108), même dans les concentrations élevées de proBNP(1-108) (Tableau 5). Exemple 11 - Dosages du proBNP(1-108) et du BNP(1-32) à l'aide d'autres anticorps monoclonaux obtenus par les inventeurs. Le tableau 6 illustre les résultats générés, selon les deux protocoles ELISA to des exemples 6 et 7, avec les anticorps monoclonaux I1A8 et 17F10. Ces anticorps monoclonaux marqués utilisés en révélation présentent une bonne aptitude à détecter le BNP(1-32) et proBNP(1-108) lorsqu'un polyclonal de lapin (L21016) ciblant la région'SPKMV5 est utilisé en capture. Le tableau 6 rapporte les résultats des dosages analytiques du proBNP(1- 15 108) et du BNP(1-32), exprimés en densité optique, obtenus par ces anticorps en présence des concentrations étalons de proBNP(1-108) et de BNP(1-32), respectivement. Tableau 6 - Dosage analytique du proBNP(1-108) et du BNP(1-32) avec différents 20 anticorps monoclonaux proBNP(1-108) BNP(1-32) BNP(1-32) ou 1 7F10 11A8 17F10 11A8 ProBNP(1- 108) (pglml) 10000 3,769 3,734 3,717 3,693 5000 3,808 3,779 2,712 2,534 2500 3,453 3,024 1,495 1,481 1250 2,118 1, 406 0,828 0,871 625 0,937 0,618 0,341 0,389 312,5 0,489 0,259 0,172 0,211 156 0,242 0,130 0,095 0,123 78 0,139 0,088 0,070 0,114 39 0,125 0,087 0,059 0,097 20 0,100 0,078 0,059 0,071 0 0,076 0,063 0,059 0,0685 Il est très remarquable de noter que les anticorps 17F10 et 11A8 de la présente invention détectent non seulement le BNP(1-32) mais aussi le proBNP(1-108). Exemple 12 - Dosage du BNP(1-32) et dosage du proBNP(1-108) chez des insuffisants cardiaques et des sujets normaux 12.1. Echantillons : - 25 plasmas EDTA d'insuffisants cardiaques, appartenant à l'une des classes w NYHA (New York Heart Association) I à IV, ayant signé un formulaire de consentement volontaire, et provenant du Service de Cardiologie de l'hôpital Arnaud de Villeneuve, Montpellier, France. - 48 plasmas EDTA de sujets normaux (volontaires sains, ProMedex, NY, USA). 15 12.2. Matériels et Méthodes pour le dosage du BNP(1-32) Les matériels et méthodes utilisés sont identiques à ceux décrits ci-dessus en 8.2. pour le BNP(1-32). 12.3. Matériels et Méthodes pour le dosage du proBNP(1-108) 20 Un autre dosage du proBNP(1-108) a été également réalisé, selon le protocole identique au précédent, mais avec l'anticorps 20G7 couplé à la peroxydase et avec un anticorps monoclonal (anticorps charnière 76, de Bio-Rad) reconnaissant la séquence charnière du proBNP(1-108) : épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) (Giuliani et al., Clin. Chem., 52:6, 1054-1061, 2006). Ce dosage 25 a entièrement été décrit dans cette récente publication. 12.4. Protocoles 12.4.1. Dosage du BNP(1-32) 48 plasmas de sujets sains et 25 plasmas d'insuffisants cardiaques ont été 30 dosés. La concentration de BNP(1-32), obtenue avec le format d'immunoessai décrit en 8.2., employant le 20G7 sous forme marquée et l'anticorps polyclonal de lapin L21016 (Bio-Rad) en phase solide, a été comparée à celle déterminée par un dosage commercial du BNP(1-32) (Triage BNP, Biosite, Etats-Unis). 12.4.2. Dosage du proBNP(1-108) La concentration de proBNP(1-108), déterminée par un immunoessai employant, immobilisé en phase solide, l'anticorps monoclonal charnière 76 reconnaissant la séquence RAPRSP (SEQ ID NO: 55) (Giuliani et al., supra) et, en révélation, l'anticorps monoclonal 20G7-peroxydase, a été comparée à celle obtenue par un dosage commercial du BNP (1-32) (Triage BNP, Biosite, Etats-Unis). io 12.5 Résultats 12.5.1. Résultats du dosaqe du BNP(1-32) Les valeurs de BNP(1-32) obtenues sur des plasmas de patients insuffisants cardiaques, à l'aide du dosage du BNP(1-32) exposé ci-dessus en 8.2, s'avèrent corrélées (r2 = 0,76) à celles du dosage Triage BNP. 15 On voit dès loirs très clairement que l'anticorps 20G7 selon l'invention est tout à fait approprié au dosage du BNP(1-32) chez des insuffisants cardiaques (Figure 5). Les résultats de cette étude (figure 5) concernant la comparaison des formats de dosage (dosage du BNP(1-32) par Triage BNP et dosage du BNP(1-20 32) utilisant l'anticorps 20G7 selon l'invention, démontrent que le format intégrant le 20G7 est capable de détecter en plus grandequantité la forme BNP(1-32) dans le plasma humain de patients insuffisants cardiaques (Figure 5). Cette même expérience a été reproduite avec les anticorps 24C5 et 26E2 (Hytest) sous forme marquée et aucune corrélation n'a pu être mise en évidence. 25 12.5.2. Résultats du dosaqe du proBNP(1-108) chez des sujets sains Les valeurs de proBNP(1-108) obtenues sur des plasmas de sujets sains, à l'aide du dosage du proBNP(1-108) utilisant l'anticorps monoclonal charnière 76, en phase solide et le conjugué anticorps 20G7-peroxydase en révélation, 30 s'avèrent hautement corrélées (r2 = 0,925) à celles du dosage Triage BNP (Figure 6). Les inventeurs ont aussi réalisé des dosages de BNP(1-32) et proBNP(1-108), à l'aide d'immunoessais utilisant l'anticorps 20G7 selon l'invention, sur des 45 échantillons de sujets atteints d'AVC, de dyspnée, ou d'insuffisance rénale, essais qui ont montré l'utilité des analytes BNP(1-32) et proBNP(1-108) comme marqueurs de ces pathologies. Exemple 13 - Dosage du proBNP(1-108) chez des patients présentant un syndrome coronarien aigu 13.1. Echantillons : -15 plasmas EDTA de patients à syndrome coronaire aigu avec ou sans sus io décalage du segment ST, ayant signé un formulaire de consentement volontaire, et provenant de l'Hôpital Central de Nancy, Nancy, France) ont été testés. 13.2. Matériels et Méthodes Les matériels et méthodes utilisés pour le dosage du proBNP(1-108) sont 15 identiques à ceux décrits ci-dessus dans Giuliani et al. (Clin. Chem., 52 : 6, 1054-1061, 2006) et utilisent, immobilisé en phase solide l'anticorps monoclonal (anticorps charnière 76, Bio-Rad) reconnaissant la séquence épitopique RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) et, en révélation, l'anticorps 20G7 couplé à la péroxydase. 20 13.3. Protocole Les plasmas E:DTA humains ont été dosés. La concentration de proBNP(1-108) obtenue avec le dosage ci-dessus a été comparée à celle obtenue par le dosage du BNP (Dosage Triage BNP). 25 12.4 Résultats A l'aide du closage exposé ci-dessus, des valeurs de proBNP(1-108) obtenues à partir de plasmas de patients souffrant d'un syndrome coronarien aigu (r2 = 0,89) s'avèrent fortement corrélées à celles du dosage Triage BNP. 30 On voit très clairement que le dosage sandwich utilisant l'anticorps 20G7 selon l'invention (couplé à la péroxydase) permet de mesurer des concentrations de proBNP(1-108) proportionnelles au niveau de BNP(1-32). Ces résultats confirment une fois de plus l'utilité du dosage du proBNP(1-108) comme 46 marqueur, en particulier comme marqueur de syndrome coronaire aigu (Figure 7) . Exemple 14 - Dosage du proBNP(1-108) sous sa forme glycosylée à l'aide de l'anticorps monoclonal 2007 14.1. Matériels :- proBNP(1-108) (protéine recombinante produite chez E. colt pour la forme non-glycosyllée, et à partir des cellules HEK293 reprogrammées pour la forme glycosylée, HyTest, Finlande), - microplaque à 96 Maxisorprm à fond plat (Nunc, Danemark) to -tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4, pastilles Gibco ref 18912-014 (Invitrogen) - Tween 20 (Sigma-Aldrich, Etats-Unis, #P1379) -anticorps monoclonal reconnaissant la séquence charnière du proBNP(1-108) : épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) (Giuliani et al., Clin. Chem., 52 : 6, 1054-15 1061, 2006) - anticorps monoclonal 20G7 (Bio-Rad) couplé à la peroxydase. 14.2. Méthode : 14.2.1. Principe du dosage analytique du proBNP glycosylé : 20 Une gamme étalon de 20 à 10 000 pg/ml de proBNP(1-108) glycosylé est préparée en en tampon PBS-T à 0,1 %. Pareillement une gamme étalon de 20 à 10 000 pg/ml de proE3NP(1-108) non glycosylé, est préparée en en tampon PBS-T à 0,1%. Le dosage repose sur le principe du sandwich ELISA sur microplaque 25 utilisant en capture sur phase solide l'anticorps monoclonal (anticorps charnière 76, Bio-Rad) reconnaissant la séquence épitopique RAPR76SnP (SEQ ID NO: 55) du proBNP(1-108), fixé par adsorption passive à raison de 100 pl de solution à 0,5 pg/ml par puits. 100 pl de solution d'anticorps monoclonal 20G7 selon l'invention couplé à la 30 peroxydase à 0,5 pg/ml, en solution PBS-T à 0,1%, contenant du lait (1/2 écrémé) 1% , sont utilisés comme réactifs de détection. Le reste du protocole est identique à celui de l'ELISA de l'exemple 10. Les caractéristiques de révélation de l'anticorps 20G7 sont donc comparées pour les deux formes glycosylée et non- glycosylée du proBNP(1-108). 14.3. Résultats : Les résultats représentés dans le tableau 7 et la figure 8 correspondent aux dosages du proBNP(1-108) glycosylé et du proBNP(1-108) non glycosylé par immunoessai utilisant l'anticorps charnière 76 immobilisé et l'anticorps 20G7 en révélation. Tableau 7 - valeurs cle densité optique à 490 nm pour le dosage de chaque forme ~o de proBNP(1-108) testée. Gamme proBNP proBNP(1-108) proBNP(1-108) (pg/ml) Non glycosylé Glycosylé 10000 4 3,833 5000 3,807 3,801 2500 3,829 3,023 1250 3,256 1,679 625 1,816 0,925 312,5 0,989 0,465 156 0,510 0,268 78 0,221 0,130 39 0,109 0,087 20 0,063 0,041 9 0,037 0, 028 0 0,021 0,023 L'utilisation du 20G7 permet la détection du proBNP(1-108) aussi bien sous la forme non glycosylée que la forme glycosylée. Le ratio signal sur bruit de fond 15 est légèrement plus important pour le proBNP non glycosylé que pour sa forme glycosylée (on obtient respectivement un ratio signal/bruit de fond de 3 et 1,8 à 20 pglml). Exemple 15 - Immunoréactivité du proBNP(1-108) sous sa forme glycosylée 20 et implication sur le dosage du proBNP(1-108) avec l'anticorps charnière 76. 15.1. Matériels : - Analyseur ProteOn XPR36 (technologie de Surface Plasmon resonance, SPR, 47 Bio-Rad, Etats Unis) - proBNP(1-108) (protéine recombinante, HyTest, Finlande) sous forme glycosylée et sous forme non glycosylée (13 à 200 nM). - anticorps anti fragment Fc (Sigma, Etats-Unis) - anticorps monoclonal charnière 76 (Bio-Rad) reconnaissant l'épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) et utilisé à 30 pg/ml en PBS-T à 0,1% - Tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) pH 7,4 15.2. Méthode : w 15.2.1. Principe : L'analyseur ProteOn XPR36, (dont le principe repose sur la technologie de Résonance Plasmonique de Surface (SPR)) a été utilisé pour définir la cinétique et l'affinité de l'interaction de l'anticorps monoclonal 20G7 et d'autres anticorps monoclonaux avec le BNP ou le proBNP. Les inventeurs ont suivi les instructions is du fabricant. Un anticorps monoclonal est immobilisé sur un biocapteur (surface solide) à l'aide d'un anticorps anti fragment Fc, alors que l'antigène soluble proBNP(1-108), glycosylé ou non, à concentrations croissantes (13 à 200 nM) circule à flux constant à la surface du biocapteur à température ambiante. L'angle dans lequel le signal SPR est détecté est directement proportionnel à l'indice de 20 réfraction du milieu dans lequel l'onde évanescente se propage. Les variations d'indice de réfraction sont exprimées en Unités de Résonance (RU, avec 1000 unités de résonance correspondant à 1 ng de protéines fixées par mm2 de surface active). La quantification des interactions et de l'affinité entre l'antigène et l'anticorps monoclonal s'évalue par le calcul des constantes de vitesse 25 d'association (ka) et de dissociation (kd) selon un traitement global des données à l'aide du logiciel de l'appareil (Bio-Rad). La constante de dissociation à I équilibre (KD=kd/ka) en mol/i reflète l'affinité de l'antigène proBNP(1-108) glycosylé ou non pour l'anticorps monoclonal. 30 15.2.2. Résultats : Le Tableau 8 illustre les caractéristiques de l'interaction de l'anticorps anticharnière (anticorps charnière 76 d'épitope RAPR76S77P (SEQ ID NO: 55) Bio-Rad) avec le proBNP(1-108), glycosylé et non glycosylé. Bien que la constante d'affinité entre l'anticorps anti-charnière et le proBNP(1-108) non glycosylé soit plus importante (1,73.10-10) que celle avec le proBNP(1-108) glycosylé (2,35.10'8), l'anticorps ciblant la région charnière du proBNP(1-108) reconnait avec une forte affinité les formes glycosylée et non glycosylée. Tableau 8 - Réactivité de l'anticorps charnière 76 vis-à-vis du proBNP(1-108) glycosylé et non glycosylé Anticorps charnière 76 ka kd KD = kd/ka (M-1s 1) (s-1) M 1,12.106 1,94.104 1,73.10-10 1,17.105 2,72.10"3 2,35.10$ Exemple 16- Etalons biépitopiques et étalons triépitopiques i0 16.1. La structure de tous les étalons biépitopiques et triépitopiques selon l'invention peut-être linéaire ou ramifiée pourvu qu'elle préserve l'immunoréactivité des épitopes incorporés. Les protocoles de synthèse utilisables pour fabriquer de tels étalons sont 15 ceux de la chimie organique des peptides bien connus de l'homme du métier (voir à cet égard l'exemple Synthèse des peptides dans l'exemple 1). Pour les épitopes E2 et E3, les séquences peptidiques linéaires selon l'invention peuvent être choisies, à titre d'exemple non limitatif, dans le groupe constitué par les séquences suivantes : 20 SEQ ID NO: 56 : PRSPKMVQG SEQ ID NO: 57 : APRSPKMV SEQ ID NO: 58 : SGLGCKLV SEQ ID NO: 59 : SF'KMVQGSG SEQ ID NO: 60 : YTLRAPRSPKMVG 25 16.2. Exemples d'épitopes selon l'invention synthétisés Les inventeurs ont synthétisé les étalons suivants : proBNP(1-108) non glycosylé proBNP(1-108) glycosylé 50 16.2.1. Etalons biépitopiques : YTLRAPRSPKMVO-NH-(CH2)5-COûFGRKMDR FGRKMDR - NH-(CH;a)5-CO - SGLGCKLV 16.2.2. Etalons triépitopiques : YTLRAP RSPKMVG-NH-(CH2)5-COûFG RKM DR-N H-(C H2)5-CO-SGLGCKLV Le groupe de liaison de formule -NH-(CH2)5-CO- est dérivé d'un agent de couplage bien connu, l'acide amino-hexanoïque (AHX), et qui permet de coupler de façon covalente deux séquences peptidiques entre elles. Tableau récapitulatif des séquences SEQ ID NO: SEQUENCES 1 HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKS REVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRR H 2 SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH 3 HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKS REVATEGI RGH RKMVLYTLRAPR 4 TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL 6 SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL 7 SGCFGRKMDRIATSTAIGCKVL 8 FGRKMDR 9 GRKMDR FGRKM D 11 RKMDRI 12 SPKMVQGSGCFGRKM 13 KMVQGSGCFGRKMDR 14 VQGSGCFGRKMDRIS GSGCFGRKMDRISSS 16 GCFGRKMDRISSSSG 17 FGRKMDRISSSSGLG 18 RKMDFtISSSSGLGCK 19 MDRISSSSGLGCKVL RISSSSGLGCKVLRR 21 VQGSGCFGR 22 SPKMVQGSGC 23 MDRISSSSGLG 24 RKMDRI RKMDRISS 26 SPKMVQGSGC 27 PKMVQGSGCF 28 KMVQGSGCFG 29 MVQGSGCFGR VQGSGCFGRK 31 QGSGCFGRKM 32 GSGCFGRKMD 33 SGCFGRKMDR 34 GCFGRKMDRI CFGRKMDRIS 36 FGRKMDRISS 37 GRKMIDRISSS 38 RKMDRISSSS 39 KMDRISSSSG MDRISSSSGL 41 DRISSSSGLG 42 RISSSSGLGC 43 ISSSSGLGCK 44 SSSSGLGCKV SSSGLGCKVL REVENDICATIONS 1. Polypeptide porteur d'un épitope du BNP(1-32) humain, répondant à la formule (I) : al-(Ri)-(G)(C)FGRKMDR(I)(S)-(R2)-a2 (I) où - al peut être H ou représenter une fonction ou un groupement chimique choisi parmi une fonction thiol, alcool, aminoxy, amine primaire ou secondaire, un groupement amino-carboxyle, un groupement biotinyle et un groupement acétyle ; to - a2 peut représenter une fonction OH, NH2 ou un groupement alcoxyle ; - RI et R2, identiques ou différents, représentent un acide aminé quelconque, ou une chaîne peptidique de 2 à 15 acides aminés, sous réserve que (Rl)-(G)(C)FGRKMDR(I)(S)-(R2) ne comprenne pas de portion du BNP(1-32) humain de plus de 11 acides aminés incluant la séquence GCFGRKMDRIS. 15 2. Polypeptide selon la revendication 1, répondant à la formule (Il) : al-FGRKMDR-a2 (II) où al et a2 sont tels que définis dans la revendication 1. 20 3. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation de ligands dirigés contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR. 4. Utilisation selon la revendication 3, pour la préparation d'anticorps. 5. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'un hybridome sécrétant un anticorps monoclonal dirigé contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR. 6. Procédé de préparation d'hybridome sécréteur d'anticorps monoclonal dirigé contre le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR, dans lequel on 25 30 20procède, avec des cellules de myélome, à une fusion de lymphocytes sécréteurs d'immunoglobuline prélevé chez un animal ayant été préalablement immunisé avec un polypeptide selon la revendication 1 ou 2, pour obtenir un hybridome. 7. Hybridome susceptible d'être obtenu par le procédé défini dans la revendication 6. 8. Hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris io Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. 9. Ligand spécifique d'un épitope de séquence FGRKMDR, sélectionné dans le groupe constitué d'un anticorps ou d'un fragment de cet anticorps reconnaissant l'épitope, d'un aptamère, et d'un polypeptide reconnaissant spécifiquement 15 l'épitope susceptible d'être obtenu par phage-display. 10. Ligand selon la revendication 9, constitué d'un anticorps reconnaissant spécifiquement un épitope de séquence FGRKMDR, ou d'un fragment de cet anticorps reconnaissant spécifiquement l'épitope. 11. Ligand selon la revendication 10, dans lequel l'anticorps est un anticorps monoclonal. 12. Ligand selon la revendication 11, dans lequel l'anticorps monoclonal est 25 produit par l'hybridome selon la revendication 7 ou 8. 13. Ligand selon l'une des revendications 9 à 12, constitué de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome déposé le 13 avril 2007 à la CNCM (Collection Nationale de Cellules de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur 3o Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3746. 14. Utilisation d'un ligand selon l'une des revendications 9 à 13, pour détecter,dans un échantillon biologique, le BNP(1-32) humain ou le proBNP(1-108) humain ainsi que leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR. 15. Procédé de détection, dans un échantillon biologique, du BNP(1-32) humain 5 ou d'un dérivé du proBNP(1-108) humain comprenant la séquence FGRKMDR, comprenant : 1) la mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un ligand tel que défini dans l'une des revendications 10 à 13 dans des conditions permettant la formation de complexes antigène-ligand, et io 2) la détection des complexes éventuellement formés. 16. Procédé selon la revendication 15, comprenant au moins une étape additionnelle de mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un ligand additionnel spécifique du BNP(1-32) humain, du proBNP(1-108) humain, ou 15 de leurs fragments respectifs, et présentant une spécificité différente de celle du ligand tel que défini dans l'une des revendications 9 à 13. 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le ligand additionnel est un anticorps. 20 18. Méthode de diagnostic, de pronostic, de stratification du risque, ou de suivi thérapeutique, d'au moins une pathologie cardiaque et/ou vasculaire chez un individu, comprenant les étapes de : 1) mise en contact d'un l'échantillon biologique de l'individu avec au moins un 25 ligand tel que défini dans l'une des revendications 9 à 13 dans des conditions permettant la formation de complexes antigène-ligand, 2) détection des complexes éventuellement formés, et 3) établissement à partir du résultat de la détection de l'étape 2) d'un diagnostic, d'un pronostic, d'un risque, ou de l'évolution de la pathologie chez l'individu 30 19. Méthode selon la revendication 18, comprenant au moins une étape additionnelle de mise en contact de l'échantillon biologique avec au moins un ligand additionnel spécifique du BNP(1-32) humain, du proBNP(1-108) humain, oude leurs fragments respectifs, et présentant une spécificité différente de celle du ligand tel que défini dans l'une des revendications 9 à 13. 20. Méthode selon la revendication 18 ou 19, dans lequel le ligand additionnel est 5 un anticorps. 21. Méthode selon l'une des revendications 18 à 20, dans laquelle la pathologie est choisie parmi le groupe constitué : - d'une insuffisance cardiaque, to - d'un syndrome coronaire aigu, - d'un accident vasculaire cérébral, - d'une insuffisance rénale, - d'une dyspnée, - d'une hypertension, 15 - d'une rupture de plaque d'athérome, - d'une persistance du canal artériel chez le nouveau-né prématuré, et/ou - du diabète. 22. Etalon pluriépitopique répondant à la formule générale (III) suivante : 20 tl- El û LI û E2 [û Ekin û t2 (III) dans laquelle : - n est un entier de O à 8; - kestunentier de3àn+2lorsque n>0; - El, E2, et Ek, sont différents les uns des autres, l'un représentent la séquence 25 peptidique FGRKMDR, et les autres une séquence de 3 à 15 acides aminés choisie dans la séquence du proBNP(1-108) humain ; - tl représente un atome d'hydrogène, un groupement acétyle, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés N-a acétylée, un groupement biotinyle ou biocytinyle, une séquence 3o peptidique de 1 à 10 acides aminés portant un reste biotinyle ou biocytinyle, ou une chaîne aminoalkyl(C1-C1o)carbonyle linéaire ; - t2 représente un radical hydroxyle, un radical amino, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés, une séquence peptidique de 1 à 10 acides aminés portant ioun groupement amino terminal, ou une chaîne aminoalkyl(C1-C10)carbonyle linéaire ou ramifiée ; - LI et Lk, identiques ou différents, représentent un groupement de liaison de chaînes peptidiques. 23. Etalon pluriépitopique selon la revendication 22, répondant à la formule générale (IV) suivante : t~- El ù L~ ù E2 ù t2 (V) dans laquelle El, E2, LI, t1 et t2 sont tels que définis dans la revendication 22. 24. Etalon pluriépitopique selon la revendication 22 ou 23, dans lequel LI et L2 représentent : -NH-(CH2)5-CO-. 15 25. Kit de détection du BNP(1-32) humain ou du proBNP(1-108) humain ainsi que de leurs fragments respectifs comprenant la séquence FGRKMDR, comprenant au moins : - un ligand tel que défini dans l'une des revendications 9 à 13 ; et - un étalon pluriépitopique tel que défini dans l'une des revendications 22 à 24.