Brevet FR2915490A1 — publié le 20081031

FORMATION DE PROTEOLIPOSOMES CONTENANT DES PROTEINES MEMBRANAIRES, A L'AIDE D'UN SYSTEME DE SYNTHESE PROTEIOUE ACELLULAIRE DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne une technologie efficace et originale pour produire des protéines membranaires intégrées dans la couche lipidique de liposomes, se présentant dans leur conformation native et sous forme active. La méthode selon l'invention est basée sur la mise en oeuvre de la technique d'expression des protéines dans un système acellulaire de traduction optimisé. Lors d'une réaction en une étape, une ou plusieurs protéines membranaires recombinantes d'intérêt sont intégrées dans une bicouche lipidique définie, notamment d'origine végétale, pour produire directement des protéoliposomes actifs. Ce procédé peut être mis en oeuvre sur des protéines membranaires d'origine variée, de structure et de fonction diverses. Cette technologie représente un outil rapide et efficace pour produire des protéoliposomes à des fins thérapeutiques ou vaccinales. ETAT DE L'ART ANTERIEUR Un intérêt grandissant pour appliquer les systèmes d'expression protéique aux biotechnologies a récemment émergé, sur la base des résultats du séquençage du génome de différentes espèces. Les applications envisageables, basées sur l'expression des protéines recombinantes, incluent la possibilité de produire rapidement de grandes quantités de protéines solubles en vue d'études structurales et fonctionnelles, d'exprimer des protéines médicament vectorisées et thérapeutiques, ainsi que le développement de microplaques à protéines pour l'étude des interactions protéine-protéine et protéine-médicament. Des systèmes classiques de vecteur eucaryote ou bactérien sont largement utilisés pour la production des protéines recombinantes. Même si ces systèmes représentent des technologies puissantes, ils présentent un caractère limitant au niveau de plusieurs aspects. Par exemple, il est difficile dans ces systèmes d'obtenir des protéines membranaires fonctionnelles, en quantité raisonnable pour des études structurales. Il est même impossible de produire des protéines cytotoxiques. Bien que ces systèmes de surexpression protéique soient largement utilisés, leur optimisation semble incontournable. Cette optimisation apparaît toutefois difficile à 10 mener, sans modifier les fonctions cellulaires de l'organisme vivant hôte. Une alternative très intéressante et attractive pour la production de protéines est l'utilisation de systèmes acellulaires de transcription-traduction (9, 12, 13, 14). Ces systèmes in vitro de synthèse de protéines utilisent essentiellement des réticulocytes de 15 lapin, des lysats de la bactérie Escherichia coli ou des germes de blé. L'un des avantages de ces systèmes in vitro est leur capacité à synthétiser des protéines membranaires cytotoxiques, des protéines régulatrices ou instables, qui ne peuvent pas être exprimées dans des organismes vivants, et donc dans les systèmes in vivo classiques. 20 Par ailleurs, un autre avantage de ces systèmes acellulaires réside dans le fait que ce sont des systèmes complètement ouverts, dans lesquels chaque paramètre de la réaction (tel que le pH, le potentiel redox, la force ionique,...) peut être modifié, en fonction de la protéine cible à produire. En outre et dans ces systèmes, la protéine recombinante résultante représente le produit majeur de la réaction. 25 Actuellement, de nombreux chercheurs ont opté pour ces systèmes de synthèse comme outils pour des études structurales et fonctionnelles. Toutefois, ils ne constituent pas aujourd'hui une méthode de choix pour la production à large échelle de protéines (5, 14). 30 Un nombre important d'études récentes ont décrit des méthodes pour améliorer la production de protéines dans ces systèmes acellulaires. Ainsi, il a été rapporté des études reposant sur l'utilisation d'un lysat d'E. coli amélioré (3), sur des mélanges énergétiques modifiés (1), ou sur des systèmes de nouveaux réacteurs (4). Toutefois, aucune de ces études n'apporte la preuve directe d'une augmentation subséquente de la production de 35 protéines. Outre leur production, le transport des protéines jusqu'à leur site d'action reste également un point très délicat. Parmi les systèmes de délivrance disponibles, les liposomes ont été identifiés comme de bons candidats pour la délivrance dans les cellules de macromolécules, notamment de protéines sous forme de protéoliposomes. Les liposomes présentent l'avantage d'être non cytotoxiques et peuvent délivrer et véhiculer spécifiquement une large gamme de molécules bioactives (protéines, DNA, ribozymes...). Ils protégent également les molécules de la dégradation et leur composition est aisément modifiable (10). Différentes études ont déjà rapporté l'utilisation des liposomes pour le transport de protéines solubles telles que des antigènes ou des toxines, de médicaments ou d'acides nucléiques. Dans le cas des protéines membranaires, la production des protéoliposomes nécessitent une réaction en au moins deux étapes, à savoir la production de la protéine membranaire puis son intégration dans le liposome (8). Dans le cas de protéines ayant tendance à s'agréger, une étape intermédiaire, supplémentaire, de dénaturationrenaturation est nécessaire. Toutefois et à la connaissance du Demandeur, aucune étude n'a tenté de transporter des protéines membranaires à l'aide de liposomes. Comme déjà dit, les protéines membranaires constituent des protéines particulièrement délicates à surproduire sous forme non agrégée et active. Dans le même temps, les protéines membranaires représentent environ 30% des protéines totales d'un organisme et sont appliquées dans des processus biologiques essentiels. Ainsi, la dérégulation de leur activité biologique est une des premières réponses de la cellule aux infections bactériennes et virales, ainsi que dans les cancers et des maladies génétiques. Cependant, les méthodes pour produire des protéines membranaires et des protéoliposomes fonctionnels sont particulièrement délicates à définir, en raison des propriétés biochimiques intrinsèques de ces protéines. Ainsi, une des difficultés majeures dans l'étude des protéines membranaires est d'obtenir des quantités suffisantes des protéines recombinantes, à partir des techniques de surexpression classiques. Les études fonctionnelles et structurales des protéines membranaires sont donc limitées, d'une part par ce faible rendement de production, et d'autre part, par l'obtention de ces protéines majoritairement sous forme insoluble due à leur teneur élevée en acides aminés hydrophobes. Pour réaliser ces études, les protéines membranaires doivent être dénaturées et renaturées, et dans certains cas intégrées dans des liposomes. Or, ces étapes sont limitantes et longues et ne permettent pas d'obtenir des quantités importantes de protéines membranaires sous forme native. Comme preuve des difficultés rencontrées, seule la structure de 120 protéines membranaires a été résolue à ce jour. Il existe donc un besoin persistant d'un système fiable et simple, permettant de produire des protéines membranaires en quantité importante et sous forme active. EXPOSE DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne donc un procédé d'obtention de protéoliposomes contenant des protéines membranaires. Ce procédé se caractérise en ce que les protéoliposomes sont obtenus en synthétisant les protéines membranaires in vitro à l'aide d'un système acellulaire, et en présence de vésicules lipidiques qui sont ajoutées au milieu réactionnel. Les produits directement obtenus à l'issue de ce procédé sont donc des protéoliposomes contenant des protéines membranaires se présentant sous leur forme native et active. On entend par contenant des protéines membranaires le fait que les protéoliposomes contiennent au moins une protéine membranaire. Il est également possible de produire et d'intégrer simultanément plusieurs protéines membranaires recombinantes, de nature différente, dans un même protéoliposome. 25 Les protéines membranaires, ainsi produites et conditionnées, peuvent être de toute origine : en raison des nombreuses applications visées, les protéines membranaires intégrées aux protéoliposomes selon l'invention sont avantageusement d'origine mammifère, voire humaine. Dans le cas où plusieurs protéines membranaires (de nature 30 différente) sont contenues dans chaque protéoliposome, celles-ci peuvent être d'origine différente. De même, il a été montré par le Demandeur que ce système fonctionnait aussi bien pour des protéines membranaires possédant un ou plusieurs domaines transmembranaires, et 35 donc quelle que soit leur structure et leur complexité biochimique.20 En outre, il est possible d'obtenir des protéines membranaires fonctionnelles, et ce quelle que soit leur fonction : canaux, récepteurs, protéines pro- ou anti-apoptotiques,... Comme déjà dit, le procédé selon l'invention permet l'expression de protéines de diverses origines, telles que des protéines membranaires d'eucaryotes et plus particulièrement de mammifères comprenant un ou plusieurs domaines transmembranaires (récepteurs, protéines pro-apoptotiques, enzymes...), des porines d'origine bactériennes mais aussi de plantes ou de mammifères, ou des protéines d'enveloppe de virus. Des formes mutées ou tronquées de ces protéines peuvent aussi également être exprimées par ce système d'expression et être intégrées dans les vésicules lipidiques, à condition qu'elles contiennent au moins un domaine hydrophobe. L'invention résulte d'un choix non évident du Demandeur de sélectionner, d'une part un système de synthèse protéique in vitro, et d'autre part la présentation des protéines membranaires sous forme de protéoliposomes. De manière remarquable, l'invention est réalisée en une seule étape, avec des résultats quantitatifs et qualitatifs très satisfaisants. Ainsi, il a été développé et optimisé un système de surexpression acellulaire pour produire des protéines membranaires permettant à la fois d'améliorer leur synthèse sous forme soluble active, et de les intégrer directement et en une seule étape dans des liposomes pour constituer des protéoliposomes. En pratique, une ou plusieurs protéines membranaires recombinantes sont synthétisées in vitro à l'aide d'un système de synthèse (transcription / traduction) des protéines acellulaire. Ces systèmes sont bien connus de l'homme du métier et sont disponibles commercialement, par exemple le système RTS (Rapid Translation System) 100HY ou 500HY commercialisé par ROCHE APPLIED SCIENCE. Dans de tels systèmes, les protéines d'intérêt sont synthétisées à partir de plasmides dans lesquels sont clonées des séquences codant lesdites protéines ou fragments de protéines. En général, ces séquences correspondent à un ADN complémentaire comprenant une phase de lecture ouverte codant pour une protéine membranaire contenant soit un ou plusieurs domaines transmembranaires en hélice a, soit formant une structure en feuillet 13 de type porine, soit contenant un domaine hydrophobe qui s'associe avec la bicouche lipidique. Un système d'expression protéique acellulaire pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention n'est pas limité à une source particulière et peut inclure des germes de blé, des lysats d'E. coli, des réticulocytes de lapin, ou des ovocytes de Xenopus laevis. De manière appropriée, l'extrait biologique est un lysat d'E. coli. Selon l'invention, des vésicules lipidiques sont ajoutés dans le milieu réactionnel, soit au cours de la synthèse protéique, soit de manière préférentielle avant même que celle-ci ne débute. Cet ajout lipidique se fait préférentiellement à hauteur de quelques milligrammes par ml de milieu réactionnel, généralement entre 0.5 et 10 mg/ml. 10 Il était déjà connu de rajouter dans le milieu réactionnel des agents lipidiques, mais a priori de même nature que le lysat utilisé, à savoir généralement des lipides d' E. coli, et ce dans le but d'augmenter la solubilité des protéines néo-synthétisées. En revanche et à la connaissance du Demandeur, il n'a jamais été décrit ni même suggéré d'y ajouter des 15 vésicules lipidiques dans le but de former des protéoliposomes. Les vésicules lipidiques correspondent à des bicouches lipidiques se présentant sous forme de sphères d'un diamètre d'environ 100 nm, préparées à l'aide de protocoles connus de l'homme du métier et appelées SUV (Small Unilamellar Vesicles) (6, 15). Ces vésicules lipidiques peuvent être traitées à l'aide de détergents, avant leur introduction dans le milieu réactionnel. De manière avantageuse, les vésicules lipidiques mises en oeuvre sont d'origine naturelle, 25 préférentiellement d'origine végétale, notamment issues d'épinards. Dans un mode de réalisation privilégié, les vésicules lipidiques sont obtenues à partir de lipides issues de chloroplastes d'épinards. Il s'agit donc d'un mélange de lipides, essentiellement anioniques et dérivés du diacylglycérol (2). Dans le cadre de l'invention, il a été mis en évidence que les liposomes de thylacoïdes représentaient un matériel universel de choix 30 dans la formation de protéoliposomes en une seule étape. Pour optimiser la réaction, il est possible d'ajouter dans le milieu réactionnel des composés choisis dans la liste suivante, seuls ou en combinaison : détergents (cationiques, anioniques ou zwittérioniques), chaperonnes, couples oxydo-réducteurs, polymères de 35 carbohydrates, inhibiteurs de protéases, lipides naturels ou synthétiques. Ces derniers 20 peuvent tout d'abord être traités avec des détergents ou utilisés directement dans la réaction. Le détergent DDM est notamment préconisé car il favorise l'insertion unidirectionnelle des protéines membranaires dans la bicouche lipidique. A l'issue de ce procédé, les protéoliposomes représentent la population majoritaire du milieu réactionnel. Ces protéoliposomes peuvent être purifiés par tout moyen technique connu, et en particulier par passage sur un gradient discontinu de sucrose. Selon une estimation par coloration à l'argent, les fractions contenant les protéoliposomes recombinants sont pures au minimum à 90%, à l'issue de cette étape. Les protéoliposomes ainsi obtenus contiennent les protéines membranaires dans leur conformation native, sans étape de dénaturation et/ou de renaturation. Cette méthode permet d'obtenir jusqu'à plusieurs centaines de microgrammes de protéines membranaires pures et fonctionnelles par millilitre de milieu réactionnel initial. Selon un autre aspect, l'invention concerne donc également des protéoliposomes contenant des protéines membranaires dans leur conformation native et fonctionnelle, intégrées dans la bicouche lipidique. Il est à noter que, grâce au procédé mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention, on obtient une population très homogène de protéoliposomes. La nature de la bicouche lipidique formant les protéoliposomes est directement liée à celle des vésicules lipidiques ajoutées dans le milieu réactionnel. De manière avantageuse, la bicouche lipidique est donc d'origine naturelle, avantageusement d'origine végétale. Dans un mode de réalisation privilégié, le protéoliposome contient des lipides issus de chloroplastes d'épinards. Les protéoliposomes selon l'invention peuvent faire l'objet de nombreuses applications : - ils peuvent être utilisés directement comme mini-cellules ; - ils peuvent servir pour tester l'activité enzymatique des protéines membranaires intégrées; - ils peuvent être utilisés comme vecteurs pour le relargage ciblé des protéines membranaires à la membrane plasmique ou nucléaire, à la mitochondrie ou à certaines organelles. Ces protéoliposomes peuvent donc servir comme vecteur de transduction des protéines membranaires (protéines membranaires thérapeutiques comme médicament), mais aussi comme vecteur pour la présentation d'antigènes contenant des épitopes natifs pour le développement de vaccins. Il peut également être envisagé de déstructurer le protéoliposome in vitro, éventuellement 5 par élimination des lipides, pour récupérer les protéines membranaires en tant que telles, notamment dans l'objectif d' études structurales ou fonctionnelles. Selon un autre aspect, l'invention propose un kit permettant l'obtention de protéoliposomes contenant une ou plusieurs protéines membranaires d'intérêt. Un tel kit 10 se compose d'au moins : - un système de synthèse des protéines acellulaire, dans lequel va être intégré le ou les gènes codant les protéines membranaires d'intérêt ; - des vésicules lipidiques, préférentiellement d'origine végétale et encore plus préférentiellement obtenues à partir de chloroplastes d'épinards. 15 La présente description met en lumière les différents avantages de la présente invention et le progrès qu'elle amène par rapport à l'art antérieur. En effet, l'obtention de protéines membranaires en quantité suffisante pour des études fonctionnelles et structurales représente un challenge depuis de très nombreuses années. Aucun des systèmes classiques 20 de surexpression ne permettait de répondre à cette problématique. D'autre part, la haute teneur en acides aminés hydrophobes des protéines membranaires résultait dans l'obtention de protéines recombinantes insolubles, nécessitant d'être renaturées puis intégrées en plusieurs étapes dans des lipides pour étudier leur comportement. 25 EXEMPLES DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs. 30 La figure 1 représente l'expression de la protéine virale Env (A) et de la porine du chloroplaste de pois OEP24 (B), en présence ou en absence de vésicules lipidiques. Les multimères de la protéine OEP24 sont indiqués par des flèches. La figure 2 illustre l'analyse des protéoliposomes recombinants. (A) Purification des protéoliposomes sur gradient de sucrose. (B) Analyse par microscopie électronique des protéoliposomes recombinants purifiés. (C) Analyse sur gel SDS-PAGE et coloration au nitrate d'argent des différentes fractions des gradients de sucrose. La figure 3 représente l'expression, en présence ou non de différents additifs, des différentes formes tronquées de la protéine humaine gp91-phox contenant une étiquette histidine en N- (à gauche) ou en C-terminal (à droite). La figure 4 représente les mesures de l'activité des protéoliposomes recombinants contenant une forme tronquée de la gp91-phox à un domaine transmembranaire (A) et à 4 domaines transmembranaires (B). Les mesures des activités enzymatiques diaphorases des protéoliposomes recombinants sont réalisées en présence des substrats tels que l'INT ou le NBT et en présence ou en absence des facteurs cytosoliques. La figure 5 illustre la perméabilité des protéoliposomes contenant la protéine OEP24 au KC1. Les changements de turbidité des protéoliposomes sont mesurés à 400nm en présence de KC1. La figure 6 représente l'activité pro-apoptotique des protéoliposomes recombinants contenant soit la protéine VDAC (LV), soit la protéine Bak (LB), soit les protéines VDAC et Bak (LVB). Les vésicules lipidiques (L) seules servent comme contrôles. L'activité pro-apoptotique des protéoliposomes recombinants est mesurée soit in vitro par étude du relargage du cytochrome c des mitochondries purifiées après interaction avec les protéoliposomes (A), soit in vivo par mesure du clivage des caspases 9 (B) et 7 (C) ou de la protéine PARP (C) après interaction et internalisation des protéoliposomes dans des cellules de carcinome de colon humain HCT116. La figure 7 illustre l'activité des protéoliposomes recombinants contenant les protéines VDAC et/ou Bak (LV, LB et LVB) après internalisation dans des cellules humaines de carcinome de colon contenant la protéine p53wt (HCT116p53+/+) ou possédant une délétion du gène de la p53 (HCT116p53-/-). La survie cellulaire est mesurée 24 heures ou 48 heures après la mise en contact des protéoliposomes avec les cellules. Les liposomes seuls (CL) et la doxorubicine (Dx) servent comme contrôle négatif et positif, respectivement, de l'apoptose induite. La figure 8 représente des images d'immuno fluorescence des protéines membranaires VDAC et Bak exogènes dans des cellules humaines de carcinome de colon (HCT116), après transduction et internalisation des protéoliposomes. Les protéines Bak et VDAC exogènes sont révélées par un anticorps anti-histidine et la co-localisation des protéines avec les mitochondries par coloration avec le Mitotracker. Les protéines VDAC et Bak endogènes sont révélées par des anticorps spécifiques dirigées contre les protéines VDAC1 et Bak. MATERIEL ET METHODES 1- Construction des vecteurs d'expression: Un produit PCR contenant l'ADN complémentaire codant pour la protéine membranaire d'intérêt et comprenant une séquence promotrice et une séquence terminatrice de type T7, un RBS (Ribosome Binding Site) localisé entre 5 et 8 paires de base du premier codon méthionine peut être utilisé comme matrice pour la synthèse protéique. Toutefois, un vecteur d'expression procaryote contenant une région promotrice et une région terminatrice de type T7 ainsi qu'un RBS sera généralement préféré. Il s'agit par exemple des vecteurs pET (Novagen) ou pIVEX (Roche Appplied Science). Dans le cas d'une co-expression de 2 protéines membranaires, chacun des ADN complémentaires codant respectivement pour ces protéines est inséré en tandem comprenant le deuxième ADN complémentaire en aval d'une seconde séquence RBS. La co-expression se fait alors sous un mode monocistronique. Pour chacune des protéines membranaires d'intérêt, une étiquette est introduite en phase soit du côté N-terminal de la protéine, soit du côté C-terminal donnant ainsi 2 constructions par ADN complémentaire. Ces étiquettes peuvent être de n'importe quelle origine (NusA, GST, MBP, etc...), et plus particulièrement une étiquette comprenant 6 ou 8 résidus histidine (6X-His ou 8X-His). La position de ces étiquettes sur la protéine peut avoir une influence importante aussi bien sur l'expression de la protéine que sur sa stabilité et sa solubilité. Chacune des constructions obtenues est vérifiée par une réaction de séquençage, afin de vérifier l'intégrité de la séquence d'ADN ainsi que sa fusion avec les étiquettes. Les ADN complémentaires de VDAC, Bak, OEP24 et gp9l-phox sont amplifiés par la technique de PCR en utilisant des couples d'amorces forward et reverse qui permettent une intégration directe et en phase après coupure par des enzymes de restriction adéquats, dans les vecteurs d'expression pIVEX2.3MCS, pIVEX2.4NdeI (Roche Applied Science) et/ou petl5b, pet30b (Novagen). Les constructions codant pour les formes tronquées de la gp91-phox utilisent la même stratégie de clonage en intégrant les sites de restriction dans les primers comme décrit ci-dessous: 10 Primers forward: 5'GGAATTCCATATGGTTCGAAGACAACTGGACAGG3' pour gp9lph X 90 (SEQ ID 1), 5'GGAATTCCATATGAAAACCATCCGGAGGTCTTAC3' pour gp9lph X 195 (SEQ ID 2), 5'GGAATTCCATATGATCCATGGAGCTGAACGAA3' pour gp9lph X 221 (SEQ ID 3), 5'GGAATTCCATATGGCAGAGAGTTTGGCTGTG3' pour gp9lph X 233 (SEQ ID 4) et 5'GGAATTCCATATGTTTTGGCGATCTCAACAGA3' pour gp9lph X 5' GCGTTACTCGAGGAAGTTTTCCTTGTTGAAAATG3' (SEQ ID 7) pour l'étiquette située du côté C-terminal. Ces primers contiennent un site de restriction XhoI. 2-Préparation des vésicules lipidiques A - Préparations des chloroplastes intacts Les chloroplastes sont préparés suivant la méthode décrite par Douce et Joyard (1982), avec quelques modifications. Les chloroplastes sont extraits à partir des feuilles d'épinard 20 (Spinacia oleracea L.). Les feuilles sont triées, leurs nervures ôtées, puis lavées. Les feuilles ainsi obtenues sont conservées une nuit en chambre froide afin d'épuiser les réserves en amidon présentes dans les plastes. Les feuilles (environ 2 Kg pour 2 L de milieu de broyage : saccharose 0,33 M, pyrophosphate de sodium 30 mM, BSA 1 g/1, pH 7.8) sont hachées dans un broyeur (type Waring Blendor, volume 4 1) pendant 2 à 3 25 secondes à 4 C. Le broyat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze et une toile à bluter de 501um de vide de maille. Le filtrat est centrifugé à 1200 g pendant 10 min à 4 C. Les culots sont délicatement dilués avec du milieu de lavage (saccharose 0,33 M, MOPS/NaOH 20 mM, pH 7,8). Cette suspension, enrichie en chloroplastes, est filtrée sur une toile à bluter de 501um de vide de maille. Afin d'éliminer les contaminants extraplastidiaux et les 30 chloroplastes cassés, la suspension est déposée sur un gradient discontinu de Percoll (Percoll 40 % [v/v], saccharose 0.33 M, MOPS/NaOH 20 mM, pH 7,8 et Percoll 80 % [v/v] saccharose 0,33 M, MOPS/NaOH 20 mM, pH 7,8) et centrifugée à 3000 g pendant 20 min. Les chloroplastes intacts sont localisés à l'interface des couches de Percoll 40 et 80 % [v/v], tandis que le matériel non chloroplastique et les chloroplastes cassés restent 35 au dessus de la couche de Percoll 40 % [v/v]. Pour éliminer le Percoll, les chloroplastes 285 (SEQ ID 5) contiennent un site NdeI du côté 5'. Primers reverse: 5'GCGTTACTCGAGTCATGGAAGAGACAAGTTAGAAG3' (SEQ ID 6) pour l'étiquette située en position N-terminale ou15 intacts sont dilués par 6 à 7 volumes de milieu de lavage et centrifugés à 4000 g pendant 5 min. Le culot est récupéré dans du tampon de lavage puis filtré sur toile à bluter de 50 m de vide de maille puis centrifugé à 3000 g pendant 5 min. B - Purification des thylacoïdes La purification des thylacoïdes s'effectue suivant le protocole décrit par Douce et al. (2) avec quelques modifications. Les chloroplastes intacts sont placés dans un milieu hypotonique (MgC12 4 mM, MOPS/NaOH 10 mM, pH 7,8). Le volume de milieu hypotonique est environ 10 fois supérieur à celui des chloroplastes. La concentration finale en saccharose est ainsi brutalement abaissée à moins de 0,1 M. La suspension de chloroplastes cassés est déposée sur un gradient discontinu de saccharose (saccharose 0,6 M et 0,93 M dans du tampon MgC12 4 mM, MOPS/NaOH 10 mM, pH 7.8) et centrifugée à 72000 g pendant 1 h. Après centrifugation, trois fractions sont ainsi obtenues : une couche supérieure du gradient qui contient les enzymes solubles du chloroplaste (le stroma), un culot vert qui contient essentiellement des thylacoïdes, et l'enveloppe des chloroplastes localisée à l'interface des couches de saccharose 0,6 M et 0,93 M. C- Purification des lipides par chromatoj'raphie sur colonne de silice Les compositions lipidiques de l'enveloppe du chloroplaste et des thylacoïdes étant similaires, ces dernières ont été utilisées car elles sont obtenues en plus grande quantité. Les lipides totaux sont extraits selon la méthode de Bligh & Dyer (1959), avec quelques modifications. Les thylacoïdes sont solubilisés dans du tampon de lavage ou de l'eau distillée, puis la suspension est centrifugée à 1000 g à 4 C pendant 10 min. Le culot est solubilisé dans du CHC13 / MeOH (1/2) auquel est rajouté un tiers de volume en CHC13 et un tiers d'eau distillée. La solution est conservée à 4 C pendant la nuit. La phase organique (verte foncée, contenant les lipides et les pigments) est récupérée puis évaporée à sec sous argon et solubilisée dans du CHC13 pur. Cette solution est déposée, pour éliminer les pigments sur une colonne de gel de silice comme décrit par Dorne et al. (1987). La colonne est au préalable lavée par un volume de CHC13 etbouchée par de laine de quartz. La silice ( D - Formation et purification des vésicules lipidiques Les lipides sont évaporés sous argon et resuspendus dans de l'eau DEPC (diéthylpyrocarbonate) ou Nuclease-free. Les lipides sont soniqués (Branson sonifer 250, cycle 0,5 et amplitude 80) 3 x 1 min pour former une suspension homogène contenant des SUV (Small Unilamellar Vesicle). La suspension est filtrée sur membrane 0.2 m afin d'obtenir une suspension de vésicules lipidiques (liposomes) de taille homogène. 3- Expression des protéines membranaires La synthèse des protéines membranaires s'effectue en système d'expression acellulaire. Ce système est basé sur un lysat d'Echerichia coli comme décrit par Spirin (11) ou Liguori (7). Les réactions s'effectuent soit en format batch (en Eppendorff ou plaques multipuits), soit en cupules (système RTS500HY de Roche Applied Science). Les composés de la réaction sont les suivants : - lysat d'E. coli (RTS system [Roche Appplied Science], RiNA system [Quiagen] 25 ou Expressway system [Invitrogen]) ; - le milieu énergétique ; - l'ensemble des acides aminés sans la méthionine ; - la méthionine ; - les détergents non ioniques ou zwittérioniques ; 30 - les chaperones GroE ou DnaK ; - les polymères de carbohydrates (NV 10 [Novexin]) ; - les inhibiteurs de protéases (e.g Protease Inhibitor Tablet [Roche Applied Science]). Ils sont mélangés en présence de l'ADN plasmidique ou du produit PCR codant pour la protéine membranaire. Les réactions sont incubées sous agitation (de 180rpm à 990rpm) au bain Marie ou dans le Proteomaster (Roche Applied Science) de 12 heures à 48 heures à 20 C. Dans le cas de la formation en une seule étape des protéoliposomes, une fois le mélange réactionnel effectué, les vésicules lipidiques de thylacoïdes sont rajoutés sur le mélange réactionnel volume à volume et à une concentration variant de 0.6mg/ml à l0mg/ml. L'ensemble milieu réactionnel/vésicules lipidiques est ensuite homogénéisé doucement. Dans le cas d'une co-expression de 2 protéines membranaires, les 2 vecteurs d'expression (en rapport équimolaire) ou le vecteur de co-expression en mode monocistronique sous la dépendance d'un promoteur T7, sont ajoutés au volume réactionnel et incubés comme décrit ci-dessus en présence ou non de liposomes. Les réactions sont incubées comme décrites précédemment. 4- Purification des protéoliposomes Les protéoliposomes produits lors de la synthèse acellulaire en batch ou en cupules sont purifiés sur un gradient discontinu de sucrose. Le mélange réactionnel est d'abord centrifugé à 13.000rpm pendant 20 min à 4 C, puis le surnageant est écarté et le culot contenant les protéoliposomes (culot de couleur verte) est resuspendu dans un volume équivalent au volume réactionnel avec du Tris-HC1 50mM, pH 7.2. Les échantillons resuspendus sont déposés entre les couches à 60% de sucrose (de 1 à 6m1 de sucrose) et à 25% de sucrose (de 1 à 6m1 de sucrose). L'ensemble est délicatement recouvert par une couche de sucrose à 10% (de 0.4 à 2m1 de sucrose). Après centrifugation 1 heure à 200.000g à 4 C, des fractions de 0.1 à lml sont collectées à partir du haut du gradient et sont analysées par western blotting, coloration à l'argent et/ou au bleu de Coomassie afin de déterminer la concentration protéique finale et la pureté des protéines membranaires intégrées dans le liposome. L'activité des protéines membranaires contenue dans chacune des fractions est testée soit par réaction enzymatique (cas des formes tronquées de la gp91-phox), soit par analyse de la fonction des protéines après transduction dans des cellules de mammifères (cas des protéines Bak et VDAC). Les fractions contenant un haut degré de pureté des protéoliposomes sont groupées et testées dans des expériences de transduction dans des cellules de mammifères. 5- Transductions cellulaires des protéines membranaires contenues dans les protéoliposomes Les protéoliposomes purifiés sont testés pour leurs capacités à transduire les protéines membranaires recombinantes dans des cellules de mammifères. Les protéoliposomes purifiés sont directement ajoutés à une concentration de 0.6 M à 1.5 M sur lx106 cellules et sont incubés pendant 6, 12 ou 24heures à 37 C, 5% CO2 avant analyse. La localisation cellulaire des protéines membranaires recombinantes exogènes est détectée par immuno fluorescence en utilisant des anticorps spécifiques des protéines membranaires ou un anticorps anti-histidine. Les activités des protéines membranaires recombinantes et plus particulièrement Bak et VDAC sont testées par détermination de la viabilité cellulaire (Tests MTT, Annexin V etc...), par l'activation des protéines impliquées dans l'apoptose (caspases 3, 7, 9, 8, PARP, p53 etc...) après incubation. RESULTATS 1- Expression des protéines membranaires en présence de lipides de thylacoïdes Afin de déterminer l'influence des lipides de thylacoïdes sur la synthèse des protéines membranaires, des réactions d'expression in vitro sont réalisées en présence ou en absence de vésicules lipidiques de thylacoïdes (Figure lA et lB). Des réactions en batch dans un volume final de 251.1l, 50 1 ou l001.11 sont effectuées en présence de vésicules lipidiques (liposomes) à une concentration initiale de 10mg/ml. Le volume des liposomes additionné est au moins égal à celui de la réaction de synthèse (vol/vol). La concentration finale des liposomes dans la réaction de synthèse peut varier de 0.6mg/ml à 5mg/ml. Les liposomes sont ajoutés dans le milieu réactionnel une fois le mélange réactionnel effectué. De manière intéressante, la présence des lipides n'intérfére pas avec la machinerie transcriptionnelle et traductionnelle du système d'expression in vitro (Figure 1). Le système d'expression in vitro basé sur un lysat d'E. coli permet la synthèse de protéines de diverses origines telles que des protéines de l'enveloppe virale (protéine Env, Figure lA), des protéines de plantes (porine OEP24, Figure lB), des protéines membranaires bactériennes (résultats non montrés) ou de mammifères (porine VDAC et protéine proapoptotique mitochondriale BAK, Figure 2C). De plus, l'addition de vésicules lipidiques a un effet positif sur la synthèse de certaines protéines membranaires et sur leurs structures, puisqu'elle permet par exemple, une protection contre la dégradation des protéines membranaires néosynthétisées (protéine Env, Figure lA), la formation de multiméres (porine OEP24, Figures lB et protéines mitochondriales VDAC et BAK, Figure 2C), la co-expression de protéines membranaires (Figure 2C), ou la conservation de la fonction de la protéine (protéines mitochondriales VDAC et BAK, Figures 6 et 7, et gp9l-phox, Figure 4) et cela, même en absence d'additifs tels que chaperones et détergents. 2- Production des protéines membranaires en présence de liposomes et d'additifs Due à la complexité structurale de certaines protéines membranaires, la synthèse sous forme soluble et active de protéines membranaires comprenant plusieurs domaines transmembranaires (tels que domaines en hélice a) nécessite l'addition de composés chimiques qui permettent de maintenir leur conformation native et leur intégration uni-ou bidirectionnelle dans la bicouche lipidique des liposomes. Différentes études sur les protéines membranaires ont démontré que l'utilisation de détergents ioniques, non ioniques ou zwittérioniques est nécessaire pour extraire et/ou resolubiliser les protéines membranaires. Ces détergents sont ensuite éliminés lors des dernières étapes de la formation des protéoliposomes soit par dialyse, par chromatographie d'exclusion, par dilution ou par addition de billes de polystyrène. L'effet de détergents non ioniques (n-dodecyl (3-D-maltoside [DDM], n-octyl R-D-glucopyranoside [R-0G], n-thiooctyl (3-D-glucopyranoside [(3-thioOG], nonylphenylpolyethylene-glycol [NP40], polyoxyethylene-(23)-lauryl-ether [Brij-35], polyoxyethylene-(8)-lauryl-ether [C12E8], polyoxyethylene-sorbitan-monolaurate 20 [Tween 20], n-decyl-(3-Dmaltoside [DM]) et zwittérioniques (3-[(3- cho lamidopropyl)dimethylammonio]- 1 -prop anesulfo nat [CHAPS], Zwittergent 3-14, Lauryldimethylamine Oxide [LDAO]) a été testé sur l'expression, la solubilité et l'intégration des protéines membranaires dans des liposomes de thylacoïdes. Des séries d'expériences ont ainsi été effectuées sur différentes formes tronquées de la protéine humaine gp9l-phox en présence de détergents seuls et/ou en présence de chaperones (DNAK, GroE), d'un couple oxydo-réducteur (GSH/GSSG), d'un polymère de carbohydrate (NV10, Novexin), d'inhibiteurs de protéases (Figure 3). Tous les détergents sont ajoutés dans le milieu réactionnel à une concentration supérieure à leur concentration micellaire critique (CMC) excepté pour le n-dodecyl 13-D-maltoside [DDM] qui est utilisé à une concentration proche de la CMC (0.2mM pour une CMC théorique de 0.12mM). Comme montré sur la figure 3, ces détergents ont des effets variables sur l'expression des protéines membranaires. Par exemple, le CHAPS et le 13-OG ont un effet négatif sur l'expression des formes tronquées de gp9l-phox excepté pour les constructions gp9lph x 221-C pour le R-0G et gp9lph x 221-C, gp9lph x 233-N et 233-C, gp9lph x 285-N pour le CHAPS. Au contraire, les détergents NP40, Thio-OG et DDM stimulent l'expression pour la plupart des formes tronquées de gp91-phhox avec un effet plus important pour les constructions contenant une étiquette hexa-histidine située en N-terminal de la protéine (Figure 3). Ces résultats suggèrent que l'addition de détergents non ioniques est compatible avec la synthèse protéique de protéines membranaires comportant un plusieurs domaines transmembranaires en hélice a et peuvent être ajoutés dans la réaction de synthèse pour la formation de protéoliposomes. Des expériences de synthèse de protéines membranaires comportant un ou plusieurs domaines transmembranaires en hélice a ont été réalisées en présence de détergents et de liposomes pour former des protéoliposomes. Les résultats précédents ont démontré que le détergent DDM à une concentration proche de sa CMC, stimulait majoritairement l'expression et la solubilité des différentes formes tronquées de la protéine gp9l-phox. Le détergent DDM a donc été préférentiellement choisi dans les expériences de formation des protéoliposomes. D'autre part, il a été démontré que grâce à ses propriétés biochimiques, le DDM favorisait l'intégration unidirectionnelle en sens des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques. Les formes tronquées de la protéine gp9lphox contenant un ou plusieurs domaines transmembranaires de la protéine ont été produites en présence du DDM et de vésicules lipidiques. Les protéoliposomes sont ensuite purifiés sur gradient de sucrose et l'activité diaphorase des fractions contenant les protéoliposomes purifiés a été testée en présence de NBT ou de INT. 3- Activité fonctionnelle des protéoliposomes synthétisés dans un système in vitro L'activité enzymatique des protéoéliposomes contenant les différentes formes tronquées de la gp9l-phox a été réalisée en présence de 2 substrats comme accepteurs d'électrons: le NitroBlueTetrazolium (NBT) et l'IodoNitroTetrazolium (INT). A la différence des protéines tronquées solubles gp91-phox, les protéoliposomes possèdent une activité enzymatique NADPH et FAD dépendantes sans l'addition de facteurs cytosoliques et d'acide arachidonique (Figure 4). Par exemple, l'activité diaphorase du protéoliposome contenant la protéine gp9l-phox 221C en présence des 2 co-facteurs possède une activité basale de 7.8 moUmin/mol pour la réduction du NBT et de 5.5 moUmin/mol pour l'INT (Figure 4A et 4B). Ces valeurs sont proches de celles de la protéine soluble et indiquent que le protéoliposome est pleinement fonctionnel. L'incubation de l0nmoles de protéoliposomes recombinants contenant la gp9lphox-221C avec des extraits cytosoliques et de l'acide arachidoninque entraîne une augmentation de l'activité réductase de la protéine par un facteur 7 pour le NBT et 10 pour l'INT (Figure 4A et 4B). Ces résultats indiquent donc que les protéines membranaires recombinantes contenues dans les vésicules lipidiques possèdent des activités enzymatiques basales qui peuvent être stimulées par l'addition de facteurs cytosoliques et d'acide arachidonique. Afin de déterminer l'activité des protéoliposomes contenant la porine OEP24, les tests d'activité sont réalisés par des mesures sur les différences d'absorption à 400nm (Figure 5). Les vésicules lipidiques contenant ou non OEP24 sont tout d'abord équilibrés dans une solution contenant 10 mM de Tris-Hepes, pH 7.0 et 10 mM de KC1. L'absorbance à 400 nm est ensuite mesurée pendant 15 sec puis l'osmoticum (KC1 250 mM final) est rajouté dans le milieu. Les variations dans l'absorbance sont mesurées périodiquement pendant 2 minutes. En présence de KC1, les vésicules lipidiques vides (sans OEP24) présentent une variation dans l'absorption à 400nm due à un choc osmotique. Les protéoliposomes contenant la protéine membranaire OEP24 ne présentent pas de variation de l'absorption à 400nm indiquant que les vésicules lipidiques sont perméables à l'osmoticum ajouté (Figure 5). Ces résultats démontrent que la protéine OEP24 est pleinement active et est intégrée majoritairement en orientation sens dans la bicouche lipidique. Les protéoliposomes contenant les protéines pro-apoptotiques Bak et/ou VDAC sont mis en présence de mitochondries purifiées afin de mesurer le relargage du cytochrome c. Comme montré dans la Figure 6A, les protéoliposomes contenant les protéines VDAC et/ou Bak induisent un relargage massif du cytochrome c dans le surnageant en comparaison avec les liposomes contrôles. Ces résultats indiquent que les protéoliposomes recombinants interagissent directement avec la membrane externe des mitochondries et induisent le relargage du cytochrome c. D'autre part, l'ensemble de ces résultats confirment que la synthèse en une seule étape permet d'obtenir rapidement des préparations de protéoliposomes pleinement fonctionnels contenant des protéines membranaires de diverses complexités en orientation positive. 4- Exemples d'applications thérapeutiques des protéoliposomes formés in vitro Un exemple d'application est illustré dans les Figures 6B, 6C, 6D, 7 et 8. Afin de mesurer l'activité proapoptotique in vivo des protéines VDAC et Bak insérés dans les vésicules lipidiques, des cellules de carcinome de colon humain (HCT116) sont incubées en présence des protéoliposomes recombinants pendant 24 et 48 heures. La localisation des protéines membranaires exogènes est confirmée par immunofluorescence (Figure 8B) et l'activité proapoptotique est mesurée soit par la stimulation de la voie des caspases (Figure 6B, 6C et 6D), soit par mesure de la viabilité cellulaire (Figure 7). L'ensemble de ces résultats indiquent que les protéoliposomes recombinants sont capables de relarguer spécifiquement les protéines membranaires d'intérêt thérapeutique à la membrane externe des mitochondries et d'induire l'apoptose dans les cellules cibles. D'une manière identique, les protéoliposomes sont capables de relarguer les formes tronquées de la gp9lphox à la membrane plasmique (résultats non montrés). En conclusion, la formation en une seule étape de protéoliposomes recombinants comprenant une ou plusieurs protéines membranaires peut représenter une méthode de choix pour le développement de vecteurs pour le relargage de protéines membranaires à visée thérapeutiques ou antigéniques, pour le criblage de drogues chimiques qui interagissent avec les protéines membranaires, pour les études structurales et fonctionnelles des protéines membranaires et pour la mise en place de kits pour la synthèse rapide de protéines membranaires. REFERENCES (1) Calhoun KA, Swartz JR. 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Nature Biotech. 15(7): 647-652. 30 35 21 REVENDICATIONS 1/ Procédé d'obtention de protéoliposomes contenant des protéines membranaires caractérisé en ce que l'on réalise la synthèse des protéines membranaires à l'aide d'un système de synthèse protéique acellulaire, en présence de vésicules lipidiques dans le milieu réactionnel. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les vésicules lipidiques sont d'origine végétale. 3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les vésicules lipidiques contiennent des lipides issus de chloroplastes d'épinards. 4/ Protéoliposome contenant des protéines membranaires dans leur conformation 15 native intégrées dans une bicouche lipidique, obtenu à l'aide du procédé selon l'une des revendications 1 à 3. 5/ Protéoliposome selon la revendication 4, caractérisé en ce que les lipides formant la bicouche lipidique sont d'origine végétale. 6/ Protéoliposome selon la revendication 5, caractérisé en ce que les lipides sont issus de chloroplastes d'épinards. 7/ Protéoliposome selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les 25 protéines membranaires sont des protéines de mammifères, avantageusement d'origine humaine. 8/ Protéoliposome selon l'une des revendications 4 à 7 pour son utilisation comme médicament ou comme vaccin. 9/ Utilisation in vitro de protéoliposome selon l'une des revendications 4 à 7 comme mini-cellule. 20 30/ Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 3 ou pour la synthèse d'un protéoliposome selon l'une des revendications 4 à 7 comprenant un système de synthèse des protéines acellulaire et des vésicules 5 lipidiques.