Brevet FR2919804A1 — publié le 20090213

COMPOSITION ET VACCIN THÉRAPEUTIQUE ANTI-TUMORAL La présente invention est relative à une composition induisant chez un hôte une réponse cytotoxique à visée anti-tumorale, ainsi qu'à un vaccin thérapeutique anti-tumoral contenant cette composition. La réponse immunitaire naturelle contre les antigènes tumoraux est relativement peu efficace et différents mécanismes d'échappement des tumeurs à la réponse immunitaire antitumorale ont été identifiés. Les approches vaccinales classiques génèrent des réponses humorales qui s'avèrent insuffisantes. Des stratégies visant à développer une réponse cytotoxique à base de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), notamment à base de cellules dendritiques ont été étudiées. Le principe consiste à détruire de manière spécifique les cellules cancéreuses d'un patient en stimulant ses propres défenses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) très efficaces pour engendrer des effecteurs cytotoxiques spécifiques des cellules tumorales. Elles sont capables de phagocyter des cellules apoptotiques ou corps apoptotiques provenant de cellules tumorales, puis de présenter en association avec des molécules du CMH de classe I et Il les antigènes tumoraux aux lymphocytes T. Ainsi, la cellule dendritique est apte à amorcer la prolifération et la génération d'un clone de lymphocytes T cytolytiques spécifiques. Au terme de cette réaction, les lymphocytes tueurs ainsi différenciés quittent le compartiment lymphoïde pour circuler dans l'organisme et se fixer dans la tumeur. La reconnaissance des antigènes exprimés par une tumeur induit alors un signal de lyse et entraîne la destruction des cellules tumorales. Plusieurs stratégies de vaccins anti-cancer ciblant les cellules dendritiques ont été étudiés (Eymard JC, Bernard J, Bull Cancer. 2003, 90(8-9):734-43). Certaines sont basées sur la manipulation des cellules dendritiques in vitro, et d'autres sur la stimulation des cellules dendritiques in vivo. Dans le premier cas, les cellules dendritiques sont différenciées à partir de cellules sanguines prélevées chez le patient : elles sont mises en culture et maturées, pulsées c'est-à-dire stimulées ex vivo par des peptides tumoraux, des lysats tumoraux, des cellules tumorales apoptotiques, ou des protéines de choc thermique extraites de tumeurs autologues et enfin réinjectées au patient. Dans le deuxième cas, la stimulation des cellules dendritiques s'effectue après injection au patient de peptides, protéines, cellules tumorales irradiées ou encore de virus contenant le peptide antigénique ciblant les cellules dendritiques. Cependant, la réponse cytotoxique obtenue s'accompagne rarement d'efficacité clinique. L'activation de la cellule dendritique conditionne sa capacité à activer efficacement le lymphocyte T cytolytique. Le niveau 15 d'activation des cellules dendritiques semble être un point délicat dans cette stratégie vaccinale. L'utilisation de cellules dendritiques ex vivo pour l'obtention d'un vaccin anti-tumoral soulève un certain nombres de questions sur : l'état de maturation des cellules dendritiques, le nombre de cellules à injecter, la 20 voie, le site et la fréquence d'injection permettant de produire des cellules dendritiques capables de migrer vers les organes lymphoïdes secondaires et d'induire une réponse T cytotoxique efficace (Banchereau J, Schuler-Thurner B, Palucka AK, Schuler G. [Dendritic cells as vectors for therapy] Cell. 2001, 10, 106(3) : 271-4.). 25 L'activation des cellules dendritiques in vivo est quant à elle limitée par le pouvoir immunogène réduit des antigènes tumoraux et la difficulté à activer les cellules dendritiques à un niveau suffisant. L'utilisation des globules rouges comme véhicules permettant le transport d'antigènes, encapsulés dans les globules rouges ou liés à leur 30 surface, et délivrés aux CPA a été envisagée dans plusieurs publications. Les réponses immunitaires déclenchées ont été investiguées in vitro et in vivo. Hamidi et al. ont récemment décrit l'encapsulation de BSA (bovine serum albumin) comme modèle d'antigène dans des globules rouges 35 humains LHamidi M et al., Drug Deliv., 2007 ; 14(5):295-300 et Int J Pharm., 2007, 29, 338(1-2),: 70-8). Les auteurs suggèrent l'utilisation de globules rouges comme vecteur pour la présentation d'antigènes aux CPA du système réticulo-endothélial (RES). Dans une revue publiée par Hamidi et al. U. Control. Release, 2007, 118(2): 145-60), les auteurs indiquent qu'un certain nombre de stratégies ont été étudiées pour favoriser un ciblage du RES, ciblage favorisé par un vieillissement des globules rouges entraînant leur captation pour lyse. D'autres voies sont mentionnées, comme l'exposition de globules rouges à des agents stabilisants, notamment des agents de réticulation, le revêtement des globules rouges par des anticorps anti-RH, de type IgG pour cibler la rate ou de type IgM pour cibler le foie, le choc thermique, l'exposition à des agents oxydants, des enzymes ou des antibiotiques. Une réponse immunitaire humorale peut être obtenue in vivo après immunisation par des globules rouges chargés d'antigènes. L'étude menée par Murray et colt a permis de détecter chez la souris des immunoglobulines IgG après injection par voie intraveineuse de globules rouges murins chargés par l'un des quatre antigènes suivants : KLH (keyhole limpet haemocyanin), BSA (bovine serum albumin), CTB (choiera toxin b subunit) et ADA (bovine adenosine deaminase). La détection d'IgG1 et d'IgG3, isotypes d'immunoglobulines majoritaires au cours d'une réponse Th2 et d'IgG2, isotypes d'immunoglobulines marqueur d'une réponse Th1, suggérerait l'implication des deux types de réponses immunitaires, humorale et cellulaire (Murray AM et al., Vaccine., 2006 28, 24(35-36) : 6129-39). Une autre formulation d'antigènes utilisés avec des globules rouges a été testée par Dominici et al. La protéine Tat du virus HIV-1 a été ancrée à la surface des globules rouges de souris par le biais du couplage avidine / biotine. L'immunisation de souris par voie intrapéritonéale avec cette formulation d'antigènes internalisée par les cellules dendritiques, déclenche in vivo une réponse immunitaire à médiation humorale. La caractérisation isotypique des immunoglobulines détectées indique l'induction des réponses Th1 et Th2. L'activité cytotoxique anti-Tat a été montrée in vitro par la technique conventionnelle de relargage au chrome pour les souris traitées avec les globules rouges couplés aux antigènes (Dominici S et al., Vaccine., 2003 16, 21(17-18) : 2073-81). Une réponse cellulaire a été mise en évidence in vitro par Corinti et al. avec des antigènes à la surface de globules rouges humains. La phagocytose des globules rouges présentant les antigènes par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains a été montrée ainsi que l'induction de réponses CD4+ et CD8+. La maturation des cellules ~o dendritiques en présence d'interféron gamma favorise par ailleurs la réponse immunitaire de type I (Corinti S. et al., Leukoc. Biol. 2002, 71(4) : 652-8). Boberg et al. ont injecté en intrapéritonéal chez la souris un vaccin constitué de peptides dérivés de la protéase du HIV-1 ancrés à la surface 15 de globules rouges murins par le système avidine / biotine. Ils ont modifiés chimiquement les globules rouges dans l'optique de favoriser leur reconnaissance par les CPA mais une faible réaction immunitaire est obtenue. Ils concluent que la faible quantité d'antigènes délivrés du fait de la limite de charge des globules rouges en peptides antigéniques et du volume 20 sanguin injecté n'est pas compensée par la modification chimique des véhicules censés favoriser la reconnaissance antigénique par les CPA (Boberg A. et al., Infect. Agents Cancer. , 2007, 182 : 9). La présente invention a pour objectif de fournir des compositions et vaccins utiles dans le traitement des cancers, selon une approche 25 d'immunothérapie. La présente invention a donc pour objet une composition induisant chez un hôte une réponse cellulaire cytotoxique dirigée contre des cellules tumorales, comprenant des globules rouges renfermant un antigène tumoral. 30 De préférence, ces globules rouges sont conçus, choisis ou modifiés pour favoriser leur phagocytose par les CPA et tout particulièrement par les cellules dendritiques. Notamment, ces globules rouges sont conçus, choisis ou modifiés pour favoriser leur phagocytose dans la rate et le foie. Selon un premier mode de réalisation, les globules rouges 35 renferment un antigène tumoral et sont sous forme d'un complexe immun avec une immunoglobuline reconnaissant un épitope à la surface des globules rouges, de manière à favoriser leur phagocytose notamment par les cellules dendritiques. La composition permet aussi de favoriser la phagocytose par les macrophages. De préférence, l'immunoglobuline est une immunoglobuline G. La formation du complexe immun implique des globules rouges et au moins un anticorps de préférence de sous-type IgG. Les cellules dendritiques possèdent à leur surface des récepteurs pour la partie constante Fc des immunoglobulines G (IgG). Ces récepteurs sont capables de déclencher la phagocytose ou internalisation des complexes immuns antigène-IgG ainsi formés et de promouvoir la présentation antigénique par les molécules du CMH de classe I et II conduisant à la génération de lymphocytes CD4+ helper et surtout de lymphocytes CD8+ cytotoxiques (A. Regnault et al., J. Exp. Med., Janvier 1999, 189(2): 371-80). Comme anticorps qui conviennent, on peut citer les anticorps anti-Rhésus, les anticorps anti-glycophorine A et les anticorps anti-CRI (CRI = récepteur complément de type 1). Les anticorps anti-glycophorine A (A. Bigbee et al., Mol. Immunol., décembre 1983, 20(12): 1353-62) représentent une modalité préférée. De préférence, les globules rouges d'origine humaine utilisés pour former un complexe immun sont des globules rouges hétérologues provenant d'un donneur. Selon un deuxième mode de réalisation, les globules rouges renferment un antigène tumoral et sont modifiés thermiquement ou chimiquement, de manière à favoriser leur phagocytose notamment par les cellules dendritiques. La composition permet aussi de favoriser la phagocytose par les macrophages. Le traitement thermique est notamment effectué dans les conditions suivantes : chauffage des globules rouges d'environ 15 minutes à environ 90 minutes, de préférence d'environ 25 à environ 50 minutes, à une température comprise entre environ 42 et environ 55 C, de préférence entre environ 47 et environ 51 C. Typiquement, on chauffe les globules rouges environ 30 minutes entre environ 48 et environ 50 C, par exemple à environ 48 C. 5 Le traitement chimique est réalisé à l'aide d'agents modifiant la surface des globules rouges et notamment d'agents pontants ou réticulants tels que le Bis(Sulfosuccinimidyl) subérate (BS3), le glutaraldéhyde et la neuraminidase. Dans un mode de réalisation particulier, on combine au moins deux ~o modes d'adressage et par exemple, la composition comprend alors des globules rouges qui sont sous forme d'un complexe immun et sont traités thermiquement ou chimiquement, de manière à favoriser leur capture au niveau de la rate et/ou du foie et la phagocytose par les CPA, notamment par les cellules dendritiques. 15 Dans un troisième mode de réalisation, les globules rouges renfermant l'antigène tumoral sont xénogéniques. L'injection de globules rouges xénogéniques chez l'homme conduit à la fixation des anticorps naturels du patient sur les globules rouges injectés. Le complexe immun ainsi formé favorise la phagocytose par les CPA, notamment par les cellules 20 dendritiques. De préférence, ces globules rouges sont d'origine porcine. Dans un mode de réalisation particulier, les globules rouges xénogéniques sont modifiés thermiquement ou chimiquement de manière à favoriser leur phagocytose. La composition selon l'invention comprend un ou plusieurs antigènes 25 tumoraux. Lorsqu'il y a plusieurs antigènes tumoraux, ceux-ci sont de préférence choisis pour induire une réponse immune contre un type de tumeur ou de cellules tumorales. La composition comprend de préférence au moins deux antigènes tumoraux représentatifs de la tumeur à traiter. L'objectif est de générer 30 plusieurs clones de lymphocytes T cytotoxiques reconnaissants chacun un peptide antigénique spécifique pour développer une réponse immune plus efficace. Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend au moins deux populations de globules rouges, chacune encapsulant un 35 antigène différent. Les antigènes les plus connus, pouvant être utilisés ici, sont indiqués dans les tableaux ci-dessous, où ils sont classés par catégorie.5 Antigènes uniques : Gène/protéine Tumeur alpha-actinin-4 Carcinome du poumon ARTC1 mélanome BCR-ABL protéine fusion (b3a2) leucémie myéloide chronique B-RAF mélanome CA:~P-5 carcinome colorectal, gastrique et de l'endomètre CASP-8 carcinome des cellules squameuses de la tête et du cou beta-catenin mélanome Cdc27 mélanome CDK4 mélanome CDKN2A mélanome COA-1 carcinome colorectal dek-can protéine fusion leucémie myéloide EFTUD2 mélanome Elongation factor 2 i Carcinome des cellules squameuses du poumon ETV6-AML1 protéine fusion Leucémie lymphoblastique aigue FN1 mélanome GPNMB mélanome LDLR-fucosylitransferaseAS mélanome protéine fusion HLA.-A2d Carcinome cellules rénales HLA-Al 1d mélanome hsp70-2 Carcinome cellules rénales KIAAO205 Tumeur de la vessie MART2 mélanome ME.1 carcinome du poumon "non à petites cellules" MUTA-1f mélanome MUNI-2 mélanome 7 MUM-3 mélanome neo-PAP mélanome Myosin~ class 1 mélanome NFYC carcinome des cellules squameuses du poumon OGT carcinome colorectal OS-9 mélanome pml-RARalpha-protéine fusion Leucémie promyélocytique PRIDX5 mélanome PTPRK mélanome K-ras Adénocarcinome pancréatique N-ras mélanome RBAF600 mélanome SIRT2 mélanome SNRPDI mélanome SYT-SSX1 or -SSX2 protéine sarcome fusion Triosephosphate Isomerase mélanome Antigènes communs à plusieurs tumeurs : a) Antigènes spécifiques de tumeur Gènes BAGE-1 GAGE-1,2,8 GAGE-3,4,5,6,7 GnTVf HERV-K-MEL KK-LC-1 KM-HN-1 LAGE-1 MAGE-A1 MAGE-A2 MAGE-A3 MAGE-A4 MAGE-A6 MAGE-A9 9 b) Antiqènes de différenciation Gène / protéine Tumeur CEA Carcinome de l'intestin gp100 I PmeI17 mélanome Kallikrein 4 prostate mammaglobin-A cancer du sein Melan-A I MART-1 mélanome NY-BR-1 Cancer du sein OAI mélanome PSA carcinome de la prostate RAB38 I NY-MEL-1 mélanome TRP-1 I gp75 mélanome TRP-2 mélanome tyrosinase mélanome MAGE-Al 0 MAGE-Al2 MAGE-C2 mucin k NA-88 NY-ESO-1 I LAGE-2 SAGE Sp17 SSX-2 SSX-4 TRAG-3 TRP2-INT2g5 c) Antigènes surexprimés Gène Expression tissulaire adipophilin adipocytes, macrophages AIM-2 Ubiquitaire (bas niveau) BING-4 Ubiquitaire (bas niveau) CPSF Ubiquitaire (bas niveau) cyclin D1 Ubiquitaire (bas niveau) Ep-CAM Cellules épithéliales EphA3 nombreux FGF5 Cerveau, reins G250 l MN / CAIX Estomac, foie, pancréas HER-21 neu Ubiquitaire (bas niveau) IL13Ralpha2 Intestinal carboxyl foie, intestin, reins esterase alpha-foetoprotein foie M-CSF Foie, reins mdm-2 ubiquitaire (cerveau, muscle, poumons)) MMP-2 ubiquitaire MUC1 Epithélium glandulaire p53 Ubiquitaire (bas niveau) PBF ovaires, pancréas, rate, foie PRAME Testicules, ovaires, endomètre, surrénales PSMA prostate,SNC, foie RAGE-1 rétine RNF43 RU2AS testicules, reins,vessie secernin ubiquitaire 10 SOXIO Ubiquitaire (bas niveau) STEAPI prostate survivin ubiquitaire Telomerase testicules, thymus, moelle osseuse, ganglions lymphatiques WT1 testicules, ovaires, moelle osseuse, rate Van der Bruggen et al. ont généré une base de données référençant l'ensemble des antigènes tumoraux humains reconnus par les lymphocytes T et susceptible d'utilisation dans des approches d'immunothérapie du cancer selon l'invention : http://www.cancerimmunity.orq/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm. Afin de générer une réponse immune efficace, il est nécessaire que les cellules dendritiques soit actives et matures, qu'elles produisent des cytokines et chemokines et expriment des molécules de co-stimulation nécessaires au recrutement et à l'activation des lymphocytes T. Différents types d'adjuvants peuvent être utilisés pour stimuler les CPA et notamment les cellules dendritiques. Des ARN ou des ADN bactériens ou viraux, les protéines de choc thermique (en anglais heat shock proteins HSP), les sucres, les complexes immuns, et les cytokines sont différents facteurs qui induisent la maturation des CPA et notamment des cellules dendritiques via la stimulation de récepteurs spécifiques (Ton like receptor TLR, récepteur du mannose). Les macrophages et les cellules dendritiques n'expriment pas toutes les mêmes récepteurs à leur surface. Le choix de l'adjuvant se porte donc sur une molécule capable de générer une réponse imrnune cytotoxique chez l'homme et dont le récepteur se trouve à la surface des cellules capturant les globules rouges de l'invention, et en particulier donc à la surface des cellules dendritiques. Selon un mode de réalisation, l'adjuvant est une molécule encapsulée à l'intérieur de globules rouges ou attachée à la surface de globules rouges. De préférence, ce sont les globules rouges renfermant l'antigène. En variante, l'adjuvant est encapsulé dans, ou attaché à la surface d'autres globules rouges, traités séparément. Ces globules rouges peuvent aussi être modifiés ou choisis pour favoriser leur phagocytose par les CPA, notamment par les cellules dendritiques. Ils peuvent ainsi être comme précédemment décrit sous forme de complexe immun, ou modifiés thermiquement ou chimiquement, ou encore être xénogéniques Selon un autre mode de réalisation, l'adjuvant est une composition adjuvante séparée, pouvant être administrée simultanément ou séparément des globules rouges comportant l'antigène. Il va de soi que dès lors que l'adjuvant peut se trouver dans une composition séparée (composition de globules rouges ou composition adjuvante), l'adjuvant peut être administré concomitamment avec les globules rouges comportant l'antigène, en administration séparée ou sous forme de mélange, ou séparément, par exemple après l'administration des globules rouges comportant l'antigène, notamment à quelques heures ou jours d'intervalle. Parmi les adjuvants utilisables, on peut citer en tout premier lieu les adjuvants préférés ci-dessous : - Les ligands des TLRs (Toll-like receptors), notamment les imidazoquinolones, telles que de préférence : imidazoquinoline, e.g. imidazoquinoline CL097, imiquimod, resiquimod ; les oligodésoxynucléotides CpG; les LPS (lipopolysaccharide); l'acide polycytidylique-inosinique (poly (I :C)); -Les cytokines, notamment : interféron alpha, IL-2 (interleukine 2), IFNy (interferon gamma), GM-CSF (Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor), IL-12 (interleukine 12), TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha). Parmi les autres adjuvants utilisables, on peut mentionner notamment : -Les constituants bactériens, notamment BCG (Bacille de Calmette 35 Guérin), MDP (Muramyl dipeptide), TDM (Thréalose dymicolate), LPS (lipopolysaccharicle), MPL (monophosphoryl lipide A) - Les adjuvants minéraux, notamment : hydroxyde d'aluminium, phosphate d'aluminium, phosphate de potassium et phosphate de calcium - Les toxines bactériennes, notamment : CT (toxine cholérique de Vibrio cholerae), CTB (toxine cholérique de Vibrio cholerae), PT (toxine pertussique de Bordetella pertussis) LT (lyphotoxine thermolabile d'Escherichia coli) - KLH, Keyhole limpet hemocyanin. Les techniques permettant d'encapsuler des principes actifs dans des globules rouges sont connues et la technique de base par lyserescellement, qui est préférée ici, est décrite dans les brevets EP-A-101 341 et EP-A-679 101, auxquels l'homme du métier pourra se référer. Selon cette technique, on alimente en continu le compartiment primaire d'un élément de dialyse (par exemple boudin de dialyse ou cartouche de dialyse) avec une suspension de globules rouges, tandis que le compartiment secondaire contient une solution aqueuse hypotonique par rapport à la suspension de globules rouges afin de lyser les globules rouges ; ensuite dans une unité de rescellement, on induit le rescellement des globules rouges en présence de l'antigène tumoral par augmentation de la pression osmotique et/ou oncotique, puis Ibn recueille une suspension de globules rouges contenant l'antigène tumoral. Parmi les variantes décrites jusqu'à présent, on préfère la méthode décrite dans la demande de brevet français n 0408667 qui permet d'encapsuler l'antigène tumoral de manière performante, reproductible, sûre et stable. Cette méthode comprend les étapes suivantes : 1 - mise en suspension d'un culot globulaire dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon de globules rouges de ce même culot globulaire, les étapes 1 et 2 pouvant être réalisées dans un ordre quelconque (y compris en parallèle), 3 - procédure de lyse et d'internalisation de l'antigène tumoral, à l'intérieur d'une même enceinte, à une température constamment maintenue entre + 1 et + 8 C, comprenant le passage de la suspension de globules rouges à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et 8 C, dans une cartouche de dialyse ; les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée précédemment ; et 4 - procédure de rescellement conduite dans une deuxième enceinte à l'intérieur de laquelle la température est comprise entre + 30 et + 40 C, et en présence d'une solution hypertonique. Par internalisation , on entend pénétration de l'antigène tumoral à l'intérieur des globules rouges. Notamment, pour la dialyse, le culot globulaire est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8 C, de préférence entre + 2 et + 6 C, typiquement aux alentours de + 4 C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %. La fragilité osmotique est avantageusement mesurée sur les globules rouges juste avant l'étape de lyse. Les globules rouges ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est rapidement exploitée, c'est-à-dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes. Concernant la manière d'opérer la procédure de lyse-rescellement, avec mesure et prise en compte de la fragilité osmotique, l'homme du métier pourra se référer pour plus de détails à la demande de brevet français n 0408667. Suivant une caractéristique de l'invention, la composition selon l'invention comprend au final une suspension de globules rouges à un taux d'hématocrite compris entre environ 40 et environ 70%, de préférence entre environ 45 et environ 55%, mieux d'environ 50%. II est de préférence conditionné sous un volume d'environ 10 à environ 250 ml. Le conditionnement est de préférence en poche de sang du type adapté pour une transfusion sanguine. La quantité d'antigène tumoral encapsulée correspondant à la prescription médicale est de préférence contenue intégralement dans la poche de sang. La présente invention a aussi pour objet un vaccin thérapeutique antitumoral, comprenant une quantité efficace d'une ou plusieurs compositions selon l'invention. Ainsi le vaccin peut comprendre une composition selon l'invention, elle-même contenant une population de globules rouges encapsulant un ou plusieurs antigènes tumoraux, en présence ou non d'adjuvant encapsulé ou non, ou au moins deux compositions selon l'invention avec des populations différentes de globules rouges encapsulant un ou plusieurs antigènes tumoraux, en présence d'adjuvant encapsulé ou non. L'invention a aussi pour objet une méthode destinée à induire chez un patient une réponse cellulaire cytotoxique contre des cellules tumorales ou une tumeur. Cette méthode comprend l'administration à ce patient d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention, notamment par voie intraveineuse, par injection ou perfusion, de préférence par perfusion. Cette méthode vise notamment à induire une activation des cellules dendritiques du patient et une réponse cellulaire cytotoxique CD8+. Comme décrit plus haut une réponse CD4+ helper et CD8+ cytotoxique spécifique est obtenue. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement anticancéreux destinée à induire chez un patient une réponse cellulaire cytotoxique comme décrit ci-dessus, contre des cellules tumorales ou une tumeur. Cette méthode comprend l'administration à ce patient d'une quantité efficace d'un vaccin antitumoral selon l'invention, notamment par voie intraveineuse, par injection ou perfusion, de préférence par perfusion. Suivant une caractéristique de l'invention, on administre d'environ 10 à environ 250 ml d'une suspension de globules rouges à un taux d'hématocrite compris entre environ 40 et environ 70%, de préférence entre environ 45 et environ 55%, mieux d'environ 50%. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une composition selon l'invention, pour la préparation d'un vaccin thérapeutique anti-tumoral. L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une composition selon 10 l'invention, pour induire chez un hôte une réponse cellulaire cytotoxique médiée par les cellules dendritiques et dirigée contre des cellules tumorales ou une tumeur. La présente invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se 15 référant aux dessins annexés. Figure 1 : Mesure de la phagocytose des globules rouges chargés en antigène et traités avec l'anticorps anti-TER 119 par les cellules dendritiques de la rate in vitro. Figure 2 : Mesure de la phagocytose des globules rouges 20 chargés en antigène et traités avec l'anticorps anti-TER 119 ou traités thermiquement par les macrophages et les cellules dendritiques de la rate in vivo. Exemple 1. Méthode d'encapsulation de l'ovalbumine en 25 globules rouges murins, humains et en globules rouges de porc L'ovalbumine (protéine de 45 kda, ovalbumine de l'oeuf de poulet). est encapsulée dans des globules rouges murins (souris OFI) par la méthode de dialyse hypotonique en boudin de dialyse. La suspension de globules rouges est lavée plusieurs fois avant d'être amenée à hématocrite 30 70% pour la dialyse. La dialyse est effectuée en boudin de dialyse dans un tampon de lyse de faible osmolarité pendant environ 1 heure. Les globules rouges sont ensuite rescellés grâce à une solution de forte osmolarité pendant 30 minutes. Après quelques lavages le produit fini est repris dans un tampon, le Sag-mannitol, et l'hématocrite est amené à 50%. 35 Exemple 2. Traitement thermique sur les globules rouges, suivi de l'encapsulation de l'ovalbumine Les globules rouges sont lavés plusieurs fois avant d'être amenés à hématocrite 10%. Ils sont ensuite chauffés 30 minutes à 48 C. La suspension de globules rouges est lavée plusieurs fois avant d'être amenée à hématocrite 70% pour la dialyse. La dialyse est effectuée en boudin de dialyse dans un tampon de lyse de faible osmolarité pendant environ 30 minutes. Les globulesrouges sont ensuite rescellés grâce à une solution de forte osmolarité pendant 30 minutes. Après quelques lavages le produit fini est repris dans un tampon permettant de lui conférer des qualités injectables, le Sag-mannitol et l'hématocrite est amené à 50%. Exemple 3. Traitement anticorps sur les globules rouges renfermant de l'ovalbumine La suspension de globules rouges encapsulant l'ovalbumine est lavée plusieurs fois avant d'être amenée à 109 cellules/ml pour l'essai in vivo et 108 cellules/ml pour l'essai in vitro. Elle est incubée avec l'anticorps anti-TER119 (10 pg /ml pour l'essai in vitro et 23 pg /ml pour l'essai in vivo) pendant 1 heure à 4 C. Après quelques lavages le produit fini est repris dans un tampon permettant de lui conférer des qualités injectables et l'hématocrite est amené à 50%. Exemple 4. Traitement chimique par le Bis(Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) sur les globules rouges renfermant de l'ovalbumine : La suspension de globules rouges encapsulant l'ovalbumine est lavée plusieurs fois avant d'être amenée à 1,7 106 cellules/pl avec du PBS et d'être mises en contact avec un volume d'une solution tamponnée de BS3 2 mM (la solution de BS3 contient du glucose et du tampon phosphate pH 7,4) pour obtenir une concentration finale en BS3 de 1 mM. Les cellules sont incubées 30 min à température ambiante. La réaction est quenchée par addition d'un volume de Tris-HCI 20 mM. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante, le mélange est centrifugé à 800g pendant 5 min, 4 C. Puis les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS glucosé (centrifugation à 800 g) et une fois avec du SAG-BSA 6% (centrifugation à 1000 g) pendant 10 min avant de constituer les produits finis. Exemple 5. Mesure de la phagocytose des globules rouges renfermant l'ovalbumine par les cellules dendritiques in vitro L'effet des différents traitements (thermique et anticorps) sur l'efficacité de Ira phagocytose des globules rouges précédemment obtenus, par les cellules dendritiques, est mesuré in vitro. Les globules rouges sont marqués avec un marqueur fluorescent, le CFSE (ester de carboxyfluorescéine succinimidyl), pendant 20 min à 4 C. Le CFSE est un colorant non fluorescent qui diffuse à travers la membrane des cellules. Une fois à l'intérieur de la cellule, la molécule devient fluorescente suite à son clivage par des estérases intracellulaires. Les cellules dendritiques sont isolées de la rate de souris C57BI/6 à l'aide de billes magnétiques. Ces billes sont porteuses d'anticorps reconnaissant le marqueur CD11 c ce qui permet d'isoler la fraction de cellules dendritiques CD11 c+. Les globules rouges marqués ou non au CFSE sont ensuite incubés avec les cellules dendritiques (10x106 cellules/ml) à un ratio de 20 :1 dans un volume final de 200pl/puits de plaques de culture 96 puits à fond rond pendant 4 heures à 37 C et 5% de CO2. Après 4 heures de culture, les globules rouges non ingérés par les cellules dendritiques sont lysés avec du NH4CI, et plusieurs lavages sont effectués. L'acquisition du fluorochrome CFSE par les cellules dendritiques est ensuite mesurée par cytométrie en flux (R. Segura et al., J. Immunol, Janvier 2006, 176(1) : 441-50). Trois populations de globules rouges ont été testées : (A) globules rouges chargés en ovalbumine et non marqués avec le fluorochrome CFSE (B) globules rouges chargés en ovalbumine et marqués avec le CFSE 35 (C) globules rouges chargés en ovalbumine, traités avec l'anticorps anti-TER 119 et marqués avec le CFSE. Résultats Tableau 1 : pourcentage de cellules dendritiques ayant phagocyté des globules rouges fluorescents: Population de globules rouges % de cellules dendritiques (A) 4% (B) 27% (C) 36% Les globules rouges murins chargés avec de l'ovalbumine et traités avec l'anticorps anti-TER 119 ont été plus efficacement phagocytés par les cellules dendritiques isolées de la rate que les globules rouges non traités in vitro après 4 heures de co-culture (Figure 1, respectivement C et B). 36% des cellules dendritiques ont phagocyté les globules rouges porteurs de l'anticorps, contre 27% seulement en l'absence d'anticorps. La phagocytose des globules rouges traités avec l'anticorps a aussi été observée par une population n'exprimant pas le marqueur de cellules dendritiques CD11c (10,9% figure 1, C). Exemple 6. Mesure de la phagocytose de globules rouges renfermant l'ovalbumine, in vivo sur souris Trois lots de 74x107 globules rouges de souris OFI chargés en ovalbumine et traités ou non par la chaleur et/ou l'anticorps anti-TER 119 sont préparés comme décrit plus haut. Ces lots se répartissent de la manière suivante : Lot 1 : pas de traitement chaleur ou anticorps (figure 2, A et D) Lot 2 : traités thermiquement (figure 2, B et E) Lot 3 : traités avec l'anticorps anti-TER 119 (figure 2, C et F). Chaque lot est marqué avec le CFSE et injecté par voie intraveineuse dans des souris C57BI/6. 3 heures après l'injection, le sang, la rate et le foie des souris sont prélevés. Le pourcentage de globules rouges fluorescents circulants dans le sang des souris est mesuré par cytométrie en flux. La fluorescence incorporée dans les macrophages de la rate exprimant le marqueur F4/80 (figure 2, A, B, C), dans les macrophages du foie exprimant le marqueur F4/80 et dans les cellules dendritiques de la rate exprimant le marqueur CD11 c (figure 2, D, E, F) est mesurée par cytométrie en flux. Résultats Tableau 2 : pourcentage de macrophages ou de cellules dendritiques de la rate ayant phagocyté des globules rouges fluorescents 3 heures après injection à la souris : Lots Macrophages Cellules dendritiques 1 28% 5% 2 68% 19% 3 81% 22% 3 heures après injection, les globules rouges murins chargés avec de l'ovalbumine et traités thermiquement ou avec l'anticorps anti-TER 119 ne sont pratiquement plus présents dans le sang de la souris (1,6% et 1%), 15 alors qu'il reste des globules rouges chargés avec de l'ovalbumine et non traités dans le sang de la souris (4,6%). Les globules rouges traités thermiquement ou avec l'anticorps anti-TER 119 sont phagocytés par les macrophages F4/80 et cellules dendritiques CD11 c de la rate (Figure 2). 20 Les globules rouges traités avec l'anticorps anti-TER 119 ont été plus efficacement phagocytés par les macrophages F4/80 de la rate que les globules rouges traités thermiquement ou que les globules rouges non traités (Figure 2, A, B, C). 81% des macrophages de la rate ont phagocyté les globules rouges traités avec l'anticorps, contre 68% de macrophages 25 ayant phagocyté les globules rouges traités thermiquement et seulement 28% dans le lot non traité (tableau 2). Les globules rouges traités thermiquement ou avec l'anticorps ont également été plus efficacement phagocytés par les cellules dendritiques CD11c de la rate que les globules rouges non traités (figure 2). 30 Respectivement 22% et 19% de cellules dendritiques ont phagocyté les globules rouges traités avec l'anticorps et les globules rouges traités thermiquement, contre seulement 5% dans le cas des globules rouges non traités (tableau 2). La phagocytose des globules rouges traités avec l'anticorps a aussi été observée par une population de la rate n'exprimant pas le marqueur des cellules dendritiques CD11c ou des macrophage F4/80 (11,9% et 12,8%, figure 2). Tableau 3 : pourcentage de macrophages du foie ayant phagocyté 10 des globules rouges fluorescents 3 heures après injection à la souris Lots Macrophages 1 24% 2 40% 3 50% Les globules rouges traités thermiquement ou avec l'anticorps anti-TER 119 sont phagocytés par les macrophages F4/80 du foie. 15 Les globules rouges traités avec l'anticorps anti-TER 119 ont été plus efficacement phagocytés par les macrophages F4/80 du foie que les globules rouges traités thermiquement ou que les globules rouges non traités. 50% des macrophages du foie ont phagocytés les globules rouges traités avec l'anticorps, contre 40% de macrophages ayant phagocyté les 20 globules rouges traités thermiquement et seulement 24% dans le lot non traité. En conclusion, la liaison de l'anticorps aux globules rouges et le traitement thermique ont permis un adressage efficace des globules rouges au niveau de la rate et du foie et une augmentation significative du 25 pourcentage de cellules dendritiques et de macrophages capables de phagocyter ces globules rouges. REVENDICATIONS 1. Composition induisant chez un hôte une réponse cellulaire cytotoxique dirigée contre des cellules tumorales caractérisée en ce qu'elle comprend des globules rouges renfermant un antigène tumoral. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les globules rouges (1) renferment un antigène tumoral et (2) sont sous forme d'un complexe immun avec une immunoglobuline reconnaissant un épitope à la surface des globules rouges, de manière à favoriser leur phagocytose 15 par les cellules dendritiques. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les globules rouges forment un complexe immun avec un anticorps anti-rhésus ou anti-glycophorine A ou anti-CR1. 4. Composition selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle 20 l'immunoglobuline est une IgG. 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les globules rouges (1) renferment un antigène tumoral et (2) sont traités thermiquement ou chimiquement, de manière à favoriser leur phagocytose par les cellules dendritiques. 25 6. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les globules rouges sous forme d'un complexe immun sont traités thermiquement ou chimiquement. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1, 2 ; 5 ou 6, caractérisée en ce que les globules rouges sont des globules rouges 30 xénogéniques. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant d'activation de la maturation des cellules dendritiques. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que 35 l'adjuvant est présent dans les globules rouges, à leur surface et/ou en dehors des globules rouges. 225 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'adjuvant est choisi parmi : - les ligands des TLRs (Toll-like receptors) ; - ou les cytokines. 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que les ligands des TLRs sont choisis parmi les imidazoquinolines appartenant au groupe constitué par l'imidazoquinoline, l'imiquimod, le resiquimod, les oligodésoxynucléotides CpG, les LPS (lipopolysaccharides) ou l'acide polycytidylique-inosinique. 12. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que les 15 cytokines sont choisies dans le groupe constitué par l'interféron alpha, l'IL-2 (interleukine 2), l'IFNy (interferon gamma), le GM-CSF (Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor), l'IL-12 (interleukine 12) ou le TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha). 13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, 20 comportant au moins deux antigènes représentatifs de la tumeur à traiter. 14 Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'antigène tumoral est choisi dans le groupe constitué par les antigènes suivants : alpha-actinin-4 ; ARTC1 ; BCR-ABL fusion protein (b3a2) ; B-RAF ; CASP-5 25 ; CASP-8 ; beta-catenin ; Cdc27 ; CDK4 ; CDKN2A ; COA-1 ; dek-can fusion protein ; EFTUD2 ; Elongation factor 2 ; ETV6-AML1 fusion protein ; FN1 GPNMB ; LDLR-fucosyltransferaseAS fusion protein ; HLA-A2d ; HLA-A11 d ; hsp70-2 ; KIAAO205 ; MART2 ; ME1 ; MUM-1f ; MUM-2 ; MUM-3 ; neo-PAP ; Myosin class I ; NFYC ; OGT ; OS-9 ; pml-RARalpha fusion protein 30 PRDX5 ; PTPRK ; K-ras ; N-ras ; RBAF600 ; SIRT2 ; SNRPD1 ; SYT-SSX1 or -SSX2 fusion protein ; Triosephosphate Isomerase ; BAGE-1 ; GAGE-1,2,8 ; GAGE-3,4,5,6,7 ; GnTVf; HERV-K-MEL ; KK-LC-1 ; KM-HN-1 LAGE-1 ; MAGE-Al ; MAGE-A2 ; MAGE-A3 ; MAGE-A4 ; MAGEA6 MAGE-A9 ; MAGE-AlO; MAGE-Al2 ; MAGE-C2 ; mucin k ; NA-88 ; NY- 35 ESO-1 / LAGE-2 ; SAGE ; Sp17 ; SSX-2 ; SSX-4 ; TRAG-3 ; TRP2-INT2g ; CEA ; gp100 / Pmel17 ; Kallikrein 4 ; mammaglobin-A ; Melan-A / MART-1 ; NY-BR-1 ; OAI ; PSA ; RAB38 / NY-MEL-1 ; TRP-1 / gp75 ; TRP-2 ; tyrosinase ; adipophilin ; AIM-2 ; BING-4 ; CPSF ; cyclin Dl ; Ep-CAM EphA3 ; FGF5 ; G250 / MN / CAIX ; HER-2 I neu ; IL13Ralpha2 ; Intestinal carboxyl esterase ; alpha-foetoprotein ; M-CSF ; mdm-2 ; MMP-2 ; MUC1 p53 ; PBF ; PRAME ; PSMA ; RAGE-1 ; RNF43 ; RU2AS ; secernin 1 SOXIO ; STEAPI ; survivin ; Telomerase ; WT1. 15 Vaccin thérapeutique anti-tumoral, comprenant une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 16 Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour la préparation d'un vaccin thérapeutique antitumoral.15