Brevet FR2912424A1 — publié le 20080815

Le domaine de l'invention est celui de l'analyse microbiologique par voie biochimique, et en particulier de la détection et de l'identification de bactéries. Les bactéries pathogènes, et notamment les bacilles à Gram négatif, tels que les entérobactéries sont responsables chaque année de nombreuses maladies, épidémies... L'espèce E. coli (Escherichia coli) est l'espèce aérobie la plus représentée dans le tube digestif. Toutefois, leur présence dans l'eau est un témoin de contamination fécale, et certaines souches sont pathogènes et responsables de suppurations péritonéales, biliaires, appendiculaires ou génitales. Une détection précoce et spécifique d'E. coli permet de proposer une solution adaptée, en terme de traitement, de décontamination...Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de milieux de détection comprenant des substrats particuliers, spécifiques d'une activité métabolique, dite activité métabolique cible, telle qu'une activité enzymatique, de la bactérie que l'on souhaite détecter : par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Le milieu CPS ID 3 (bioMerieux) utilise un substrat de B-glucuronidase associé à un substrat de lglucosidase et éventuellement à la détection de la tryptophanase pour la détection des souches de l'espèce Escherichia coli. Toutefois, si ce milieu présente une excellente spécificité, l'utilisation d'un substrat de B-glucuronidase pour la détection des E. coli présentent une sensibilité imparfaite du fait de l'existence d'une faible proportion de souches d'E. coli (5-10%) n'exprimant pas cette activité. De plus, certaines souches de Citrobacter peuvent également produire des colonies lglucuronidase positives, de la même couleur que celles d' E. coli. L'invention se propose de résoudre les problèmes de l'état de la technique en présentant un nouveau milieu particulièrement adapté pour identifier les bactéries E coli d'une manière rapide, peu coûteuse et aisée à mettre en oeuvre. D'une manière surprenante, les inventeurs ont montré qu'une combinaison particulière de substrats enzymatiques, à des concentrations adaptées permettait une détection rapide et aisée d' E coli, en particulier à partir d'un échantillon urinaire. Avant d'aller plus avant dans l'exposé de l'invention, les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de l'invention. Par milieu de détection, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microor ganismes. Ce milieu de détection peut soit servir uniquement de milieu de détection, soit de milieu de culture et de détection. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection constitue également le milieu de culture. Le milieu de culture selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : des peptones ou extraits de tissus, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Petri. Au sens de la présente invention, la détection peut être réalisée en milieu liquide, bandelette ou autre support solide Par substrat, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme. Le substrat peut être notamment un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone ou d'azote, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme. Le substrat peut être également un substrat enzymatique, c'est à dire un substrat pouvant être hydrolysé par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat peut notamment comprendre une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Comme substrat chromogène, bien adapté aux supports solides (filtre, gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base de nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase... Le substrat enzymatique peut également être un substrat naturel dont le produit d'hydrolyse est détecté directement ou indirectement. Comme substrat naturel, on peut notamment citer le Tryptophane pour détecter une activité tryptophanase ou desaminase, un acide aminé cyclique (Tryptophane, Phénylalanine, Histidine, Tyrosine) pour détecter une activité désaminase, le Phosphatidyl Inositol pour détecter une activité phospholipase, ... Selon la présente invention, le substrat est préférentiellement choisi parmi les substrats à base d'Indoxyl (3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4-Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Chloro-3-indoxyl, 6-Fluoro-3-indoxyl, 5-Bromo- 4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, ...); d'umbelliférone (4-Méthylumbelliférone, Cyclohexenoesculétine, ...); d'Alizarine; de p-Naphtolbenzéine; de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...); d'Hydroxyquinoline; de Cathécol (Cathécol, Dihydroxyflavone, Hydroxyflavone, ...); de Résorufine; de Chlorophénol Red; de Fluorescéine; d'Aminophénol (para-Aminophénol, Dichloro-aminophénol, ...); de Naphtol (alpha-Naphtol, 2-Naphtol, Naphtol-ASBI, ...) ; d'Aminocoumarine (7-Amino-4-méthyl-coumarine, ...); de Naphtylamide; d'Acridine (Amino-phényl-acridine...); d'Amino-phénoxazine (Aminobenzophénoxazinone, Amino-pentyl-resorufine, ...). A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro3-indolyl-beta- glucuronide, le 6-Chloro- 3- indolyl- beta- glucuronide, 1' Alizarine- beta- glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-betaglucuronide ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 1' Alizarine -beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-betagalactoside ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chi oro- 3-indolylbe ta- Glucoside, le 6- Chloro- 3-indolylbeta-Glucoside, 1'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl-beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels. Par inducteur, on entend un composé induisant une augmentation de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus forte lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 100ng/1 et 10g/l, préférentiellement comprise entre 10mg/1 et 3g/1 est particulièrement adaptée a la présente invention. On peut citer notamment : • pour la beta-glucuronidase, un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta-glucuronide. • pour la beta-galactosidase, un galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside • pour la beta-glucosidase, un hydrate de carbone constitué d'un hydrate de carbone lié en position B au glucose ou hydrate de carbone avec une sous -unité B-glucoside, en particulier le cellobiose, la cellulose, l'amidon, le cellotriose, le trehalose. On peut citer également le Méthyl-B-glucoside, l'Isopropyl-B-thioglucoside, l'Indoxyl-B-glucoside ou le Méthyl-B-thio-glucoside Par inhibiteur, on entend un composé induisant une diminution de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus faible lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée. Sans être limitatif, une concentration comprise entre 100ng/1 et 30g/1, préférentiellement comprise entre lmg/l et 3g/1 est particulièrement adaptée à la présente invention. On peut citer notamment • pour la beta-glucuronidase : D-Glucose, D-Glucaric acid 1,4-lactone • pour beta-galactosidase : 2-Deoxy-galactose, Cellobiose, D-Galactose, DGlucose Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment ou un échantillon d'environnement tel qu'un prélèvement de surface, d'eau, d'air, .... Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales. A ce titre, l'invention concerne un procédé de détection et/ou d'identification d'E. col/ dans un échantillon biologique, préférentiellement urinaire selon lequel a) on ensemence l'échantillon, préférentiellement urinaire susceptible de contenir E. col/ sur un milieu de détection comprenant • un premier substrat choisi parmi un substrat de lita-glucuronidase, betagalactosidase, alpha -galactosidase, d'une enzyme d'acidification du Lactose, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine-aminopeptidase, LLeucine-aminopeptidase, • un deuxième substrat, différent dudit premier substrat, choisi parmi un substrat de beta-glucuronidase, beta-galactosidase, alpha-galactosidase, d'une enzyme d'acidification du Lactose, beta-ribosidase, phosphatase, LAlanine-aminopeptidase, L-Leucine - aminopeptidase pour obtenir des colonies de bactéries b) on identifie les colonies réagissant avec le premier substrat et/ou le deuxième substrat comme étant des colonies d' E. col/ Préférentiellement, lesdits premier et deuxième substrat sont à une concentration adaptée. L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. La détection/identification peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier substrat est à une concentration comprise entre 20 et 1000mg/1 et ledit deuxième substrat est à une concentration comprise entre 20mg/ et 30g/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, ledit premier substrat est un substrat de beta-glucuronidase et le deuxième substrat est un substrat de beta-galactosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucuronidase est choisi parmi le 4- Méthylumbelliférylbeta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chi oro- 3-indolyl-beta -glucuronide, le 5-B r omo- 6-chl or o- 3- in dolyl- beta- glucuronide, le 6Chloro-3-indolyl-beta -glucuronide, l'Alizarine -beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels, à des concentrations comprises préférentiellement entre 20 et 1000 mg/1. Préférentiellement, le substrat de beta-galactosidase est à une faible concentration. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3indolyl beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 1'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500mg/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre un troisième substrat, choisi parmi un substrat de beta-glucosidase, beta-lactosidase, N-acetyl-hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-xylosidase, phospholipase, alphamannosidase, beta-mannosidase, beta-cellobiosidase, alpha-glucosidase, tryptophanase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, de peptidases (beta-Alanine-aminopeptidase, élastase, ... ). Préférentiellement, ledit troisième substrat est un substrat de beta glucosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro- 3-indolylbeta- Glucoside, le 6-Chloro- 3-indolyl- beta- Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl- beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500mg/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre un inducteur. Préférentiellement, l'inducteur est à une concentration comprise entre 100 ng/1 et à 10g/L Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'inducteur est préférentiellement: • pour la beta-glucuronidase, un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta-glucuronide. • pour la beta-galactosidase, un galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside • pour la beta-glucosidase, un hydrate de carbone constitué d'un hydrate de carbone lié en position B au glucose ou hydrate de carbone avec une sous -unité B-glucoside, en particulier le cellobiose, la cellulose, l'amidon, le cellotriose, le trehalose. On peut citer également le Méthyl-B-glucoside, l'Isopropyl-B-thioglucoside, l'Indoxyl-B-glucoside ou le Méthyl-B-thio-glucoside Préférentiellement, l'inducteur est le cellobiose, à une concentration comprise préférentiellement comprise entre 100ng/1 et à l0g/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre un inhibiteur. Préférentiellement, l'inhibiteur est à une concentration comprise entre 100ng et 30g/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'inhibiteur est préférentiellement: • pour la beta-glucuronidase : D-Glucose, D-Glucaric acid 1,41actone • pour beta-galactosidase : 2-Deoxy-galactose, Cellobiose, D-Galactose, D-Glucose Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 : Evaluation de la combinaison du 6-Chloro-3-indolyl-B-glucuronide et 5- B romo- 6- chloro- 3- indolylB-galactoside Au milieu CPS ID 3 (bioMérieux) auquel a été ôté le substrat enzymatique synthé tique de B-glucuronidase, sont ajoutés et combinés différentes concentrations de 6-Chloro- 3-indolyl-B-glucuronide (0-0,1-0,15 et 0,20g/l) et de 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside (0-0,025-0,05 et 0,1g/1). Ces milieux comprennent en outre du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-glucoside à 50mg/1. Ils sont répartis à raison de 20m1 par boîte de Petri. Le milieu Coli ID (bioMérieux) qui associe un substrat de B-glucuronidase (6-Chloro-3-indolyl-B-glucuronide) et un substrat de B-galactosidase (5-Bromo-3-indolyl-B-galactoside), destiné à la détection et la numération des E. coli et des coliformes dans les prélèvements alimentaires, est testé en parallèle. Des micro-organismes fréquemment isolés de prélèvements urinaires et issus de la collection de la demanderesse sont ensemencés sur ces milieux par isolement serai-quantitatif de l0 1 d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 20 heures, puis les colonies formées sont examinées visuellement. La coloration de ces colonies est notée. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-après : Milieu n lb : le 2a : 2b 2c 3a ; 3b : 3c 4 : 4a : 4b : 4c Coli ID [6-Chloro-3-indolyl- 0 : 0 0,1 : 0,1 0,1 0,15 ; 0,15 ; 0,15 0,2 ; 0,2 : 0,2 ; 0,2 0,2 ' e-gl ueuronide] en g/1 [5 -Bromo -6-chloro - 0,05 ; 0,1 0,025 ; 0,05 0,1 0,025 ; 0,05 ; 0,1 0 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,1 NA ' -indolyl-alactosidel en Escherichia coli 206 R; R R; R R R ; R; R R; R; R; R R Escherichia coli 067 Rp ; Rp ; Rp ; Rp ; Rp GB Escherichia coli 037 Rp : R R : R R R : R : R R : R R R R Citrobacter freundii 064 R R : R R ; R R R R B Citrobacter diversus 097 GV : GR GV : GV GR GV ; GV ; GR GV ; GV : GV ; GR B Citrobacter diversus 010 GV : GR GV : GV GR GV ; GV ; GR GV ; GV : GV ; GR B Klebsiellapneumoniae 023 BV : BV BV : BV BV BV ; BV ; BV BV ; BV : BV ; BV B Enterobacter cloacae 059 GR ~ Vi BV GR Vi GV GR ~ Vi BV GV GR ~ Vi B Proteus mirabilis 054 O O O O O O O: O O O O O - Enterococcus faecalis 117 T T T T T T T T T T T T Inh Tableau 1 : Impact de combinaison de 6-Chloro-3-indolyli-glucuronide et de 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl B-galactoside dans le milieu CPS ID 3 sur la coloration des colonies NA = non applicable, - = incolore, Inh = inhibée, R = rose, Rp = rose pâle, GR = gris-rose, GV = gris-vert, GB = gris-bleu, BV = bleu-vert, Vi = violet, O = orange-brun, T = Turquoise Dans le tableau 1, il ressort que seuls les milieux 2c, 3b, 3c, 4b et 4c associant le 6-Chloro-3-indolyl-Bglucuronide au 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl B-galactoside permettent de détecter l'ensemble des souches d' E. coli. Ce n'est pas le cas du milieu Coli ID qui pourtant associe un substrat de B-glucuronidase et un substrat de B-galactosidase. Cependant, sur les milieux 2c, 3c et 4c, la souche d' E. cloacae se distingue moins facilement des souches d' E. coli. De même, la souche de C. freundii produit des colonies de même couleur que les souches d' E coli sur tous les milieux ayant au moins 0,05g/l de 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside. Ainsi, il est possible de déterminer les milieux les plus intéressants pour améliorer la sensibilité de détection des souches d'E. coli sans trop &grader la spécificité. Exemple 2 : Impact du Cellobiose sur un milieu associant 6-Chloro-3-indolyl-B-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro- 3- indolyl- B- gal acto side et 5-Bromo-4chloro- 3-indolyl-B-glucoside Au milieu Trypcase Soja Agar (bioMérieux) sont ajoutés du 6-Chloro-3-indolyl-B-glucuronide à 0,15g/l du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside à 0,08g/l et du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-glucoside à 0,08g/1. Ce milieu est additionné ou non de Cellobiose à 0,5g/1. Ces deux milieux sont répartis à raison de 20m1 par boîte de Petri. Des micro-organismes fréquemment isolés de prélèvements urinaires et issus de la collection de la demanderesse sont ensemencés sur ces milieux par isolement semiquantitatif de l0 1 d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 24 heures, puis les colonies formées sont examinées visuellement. La coloration de ces colonies est notée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-après : Concentration en Cellobiose en mgll Souches 0 ~ 500 Escherichia coli 407 Rose Rose Escherichia coli 067 Rose : Rose Klebsiella pneumoniae 111 Turquoise Turquoise Serratia marcescens 112 Turquoise Turquoise Citrobacter freundii 031 Gris Gris Citrobacter freundii 009 Rose Violet Streptococcus agalactiae 019 Mauve Mauve Enterococcus faecalis 117 Turquoise Turquoise Dans le tableau 2 ci-dessus, il ressort que dans un milieu combinant 6Chloro-3-indolyl-B-glucuronide et 5-Bromo-6-chloro- 3-indolyl B-galactoside, le Cellobiose permet de mieux différencier la souche de Citrobacter 009 des souches d' E coli. Ceci permet de bénéficier du gain de sensibilité pour la détection d' E. coli sans être pénalisé par une dégradation de la spécificité. Tableau 2 :Impact du Cellobiose sur un milieu associant 6 Chloro-3 mdolyl5-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl B-galactoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl B-glucoside sur la coloration des colonies Io Exemple 3 û Test pour définir la concentration desdits premier et deuxième substrats selon l'invention Le test ci dessous peut être mis en oeuvre pour définir la concentration adaptée desdits premier et deuxième substrats selon l'invention, qui est variable en fonction des substrats employés et plus généralement de la formulation du milieu réactionnel. Pour aider a sa compréhension, ce test est mis en oeuvre ci dessous dans le cas d'une combinaison B-glucuronidase, et B-galactosidase, à partir d'un kit de souches de microorganismes, comprenant notamment des souches d' E. coli, incluant des souches n'exprimant pas ou faiblement ou tardivement une activité positive et éventuellement d'autres microorganismes. Ce test peut être mis en oeuvre pour d'autres types de substrats. Deux milieux réactionnels comprenant soit une concentration adaptée en substrat de B-glucuronidase soit pas et substrat de B-glucuronidase sont utilisés pour préparer une gamme en substrat de 13-galactosidase incluant une concentration nulle, au moins une concentration permettant d'obtenir une réaction positive avec les souches d' E. coli exprimant une B-galactosidase, ainsi que des concentrations intermédiaires. Chacun des milieux est aliquoté de façon à ce que chaque souche de microorganisme puisse être ensemencée en culture pure sur chacun des milieux. Après un temps d'incubation adapté, généralement entre 30 minutes et 72 heures, à une température appropriée comprise préférentiellement entre 20 et 50 C, les milieux sont examinés de façon à sélectionner le milieu comprenant une association de substrats de B-galactosidase et de B-glucuronidase permettant de révéler le plus grand nombre de souches d'E. coli tout en les différenciant du plus grand nombre de souches des autres microorganismes. Il peut être nécessaire de répéter l'expérimentation en adaptant les concentrations en chacun des substrats ainsi que le kit de souches. Il peut être avantageux que les milieux réactionnels comprennent en outre des inducteurs et/ou des inhibiteurs de B-galactosidase et/ou de B-glucuronidase. REVENDICATIONS 1) Procédé de détection et/ou d'identification d'E. col/ dans un échantillon urinaire selon lequel a) on ensemence l'échantillon urinaire susceptible de contenir E. col/ sur un milieu de détection comprenant • un premier substrat choisi parmi un substrat de beta-glucuronidase, betagalactosidase, alpha -galactosidase, d'une enzyme d'acidification du Lactose, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine-aminopeptidase, LLeucine-aminopeptidase, • un deuxième substrat, différent dudit premier substrat, choisi parmi un substrat de beta-glucuronidase, beta-galactosidase, alpha-galactosidase, d'une enzyme d'acidification du Lactose, beta-ribosidase, phosphatase, LAlanine-aminopeptidase, L-Leucine - aminopeptidase pour obtenir des colonies de bactéries b) on identifie les colonies réagissant avec le premier substrat et/ou le deuxième substrat comme étant des colonies d' E. col/ 2) Procédé selon la revendication 1 selon lequel le premier substrat est un substrat de betaglucuronidase et le deuxième substrat est un substrat de beta-galactosidase. 3) Procédé selon la revendication 2 selon lequel ledit premier substrat est à une concentration comprise entre 20 et 1000mg/1 et ledit deuxième substrat est à une concentration comprise entre 10mg/ et 30g/1 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel le milieu de détection comprend en outre un troisième substrat, choisi parmi un substrat de betaglucosidase, beta-lactosidase, N-acetyl-hexosaminidase, estérase, sulfatase, betaxylosidase, phospholipase, alpha -mannosidase, beta -mannosidase, beta -cellobiosidase, alpha-glucosidase, tryptophanase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, de peptidases (beta-Alanine-aminopeptidase, élastase, . ). ) Procédé selon la revendication 4 selon lequel ledit troisième substrat est un substrat de beta glucosidase 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon lequel le milieu de détection comprend en outre un inducteur, préférentiellement le cellobiose 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 selon lequel le milieu de détection comprend en outre un inhibiteur...DA1: 20080815