Brevet FR2913885A1 — publié le 20080926

UTILISATION DE LA CITRULLINE POUR LE TRAITEMENT DES PATHOLOGIES LIÉES À UNE AUGMENTATION DE LA CARBONYLATION DES PROTÉINES La présente invention a pour objet une nouvelle utilisation de la citrulline, à savoir clans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation de la carbonylation des protéines. Il est clairement établi que les protéines des milieux extra- et intracellulaires sont, l0 in vivo, une cible privilégiée pour les espèces réactives de l'oxygène et les espèces réactives de l'azote. Il a été estimé que les protéines peuvent capter jusqu'à 50 à 70% des espèces radicalaires synthétisées par la cellule. Les dommages observés sont de plusieurs types : oxydation (ou nitration) des chaînes latérales des acides aminés, ou oxydation de la chaîne polypeptidique (dont un cas particulier est la carbonylation) 15 suivie d'une fragmentation et/ou de la formation de liaisons inter- ou intra-chaînes. L'ensemble de ces modifications des protéines peut entraîner des modifications de structures dont les conséquences peuvent être son inactivation, cette dernière pouvant avoir des conséquences dommageables pour la cellule. Par ailleurs, dans l'état actuel des connaissances, il ne semble pas exister de système de réparation des protéines 20 carbonylées. Les composés carbonylés constituent un marqueur intéressant qui accompagne le vieillissement et de nombreuses pathologies. En effet, ces situations physiopathologiques (maladies neurodégénératives, maladies inflammatoires, etc.) qui sont caractérisées par une augmentation des protéines carbonylées au niveau tissulaire. Il est donc essentiel de 25 développer des stratégies visant à diminuer la carbonylation des protéines. La citrulline (ou acide 2-amino-5-(carbamoyl amino)pentanoïque) est un acide a-aminé et a été isolée pour la première fois à partir du melon d'eau. La citrulline est un acide aminé non essentiel que l'organisme produit à partir d'autres nutriments. Par exemple, la citrulline joue un rôle particulièrement important, avec l'ornithine et 30 :.'arginine, dans le cycle de l'urée. Enfin, la citrulline joue un rôle majeur dans :'homéostasie de l'arginine et de monoxyde d'azote. La citrulline est utilisée à ce jour dans le cadre de certaines applications ;pharmaceutiques. Ainsi, la demande de brevet européen 1 495 755 concerne l'utilisation de la citrulline pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies liées à une insuffisance intestinale. Plus particulièrement, les pathologies mentionnées dans cette demande sont les suivantes : le syndrome du grêle court faisant suite à une résection intestinale, la maladie coeliaque, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, l'insuffisance intestinale liée au vieillissement et l'insuffisance intestinale liée à une irradiation. Cependant, cette demande ne mentionne pas la carbonylation des protéines. Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir un moyen de traiter les pathologies liées à l'augmentation de la carbonylation des protéines. La présente invention concerne l'utilisation de L-citrulline de formule (I) suivante : NH2 O H (I) NH2 O ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, pour la préparation d'une composition cosmétique, d'une composition alimentaire ou nutraceutique ou d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des pathologies liées à une augmentation de la carbonylation des protéines ou à une altération des protéines liée à une augmentation de la production de radicaux libres, notamment destinée au traitement des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer ou de Parkinson, au traitement de la rétinopathie, de la polyarthrite rhumatoïde, de l'athérosclérose, de la sclérose latérale amyotrophique, de ]'ischémie cérébrale, au traitement des problèmes de cataracte ou des infections généralisées (sepsis), au traitement des pathologies liées au vieillissement cutané, et plus particulièrement à la sénescence des tissus tels que oeil, muscle et cerveau, et au traitement des pathologies liées au dysfonctionnement des mitochondries, à savoir les myopathies issues des mitochondriopathies. L'expression "carbonylation des protéines" désigne une modification chimique des protéines liée à la production de groupes CO. Cette carbonylation (qui est un cas particulier d'oxydation des protéines) entraîne alors une perte de la fonction de la ?rotéine (voir Nystrêm, The EMBO Journal (2005) 24, 1311-1317 et Dalle-Donne et al., J. Cell. Mol. Med., Vol. 10, n 2, 2006, pp. 389-406). Bien que l'organisme possède un certain nombre de systèmes de défenses anti-radicalaires (glutathion, catalase, SOD etc.), ceux-ci peuvent dans certaines situations être dépassés et se révéler insuffisants. On désigne notamment par "sel pharmaceutiquement acceptable" des sels de citrulline tels que le malate de citrulline, l'a-cétoglutarate de citrulline, le citrate de citrulline ou l'a-cétoisocaproate de citrulline. La présente invention concerne également l'utilisation de L-citrulline telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'une composition pharmaceutique caractérisée en ce que la dose unitaire en L-citrulline est d'environ 2 g à environ 20 g, notamment environ 10 g, pour une posologie d'environ 0,1 g/kg/jour à environ 0,5 g/kg/jour, notamment environ 0,25 g/kg/jour. La présente invention concerne l'utilisation de L-citrulline telle que définie ci-10 dessus, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse. La présente invention concerne l'utilisation de L-citrulline telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. 15 L'administration par voie entérale correspond notamment à une administration par sonde naso-gastrique ou naso-intestinale, par gastrostomie ou jéjunostomie ; :l'administration par voie parentérale correspond notamment à une administration par perfusion intraveineuse centrale, périphérique ou sous-cutanée. Selon un mode de réalisation préféré, la L-citrulline est utilisée dans le cadre de 20 L'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant également un ou plusieurs autres composés destinés au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la 25 nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale. Selon un autre mode de réalisation l'invention concerne des produits comprenant : ù de la L-citrulline ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, ù et au moins un autre composé destiné au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels 30 utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée, ou étalée dans le temps, dans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation de la carbonylation des protéines, lesdites pathologies étant telles que définies ci-dessus. La présente invention concerne également une composition cosmétique comprenant de la L-citrulline répondant à la formule (I) suivante : NH2 (I) NH2 O ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule approprié. to L'expression "véhicule approprié" désigne tout excipient, véhicule ou support cosmétiquement, notamment dermatologiquement, acceptable. De tels supports sont bien connus de l'homme de l'art et résultent également de compositions cosmétiques ou dermatologiques qui ont une portée générale. En exemple, les mélanges, les formules, les encapsulations monolamélaires (micelles), bilamellaires (liposomes), multilamellaires 15 (sphérulites), et tout autre support connus en cosmétique peuvent être employés. La présente invention concerne également une composition cosmétique telle que définie ci-dessus sous la forme d'une crème anti-radicalaire. De préférence, une telle composition cosmétique correspond à un produit anti-âge ou anti-rides. La présente invention concerne également une méthode de traitement cosmétique, 20 comprenant l'administration d'une quantité appropriée d'une composition cosmétique telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également une composition alimentaire ou nutraceutique, comprenant de la L-citrulline répondant à la formule (I) suivante : NHZ 25 O N OH (1) NHZ O ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule approprié. 30 LÉGENDE DES FIGURES La Figure 1 représente la carbonylation des protéines musculaires chez le rat. L'axe des ordonnées correspond à la quantité de protéines carbonylées en mol/g. La colonne "1" correspond aux rats sains ; la colonne "2" correspond aux rats dénutris ; la colonne "3" correspond aux rats renourris avec un régime standard et la colonne "4" correspond aux rats renourris et ayant eu un régime enrichi en citrulline. PARTIE EXPÉRIMENTALE Matériels et Méthodes I - Matériels Tous les réactifs chimiques utilisés proviennent de chez Sigma (Saint-Quentin-Fallavier, France). La L-citrulline a été gracieusement fournie par les Laboratoires 15 Biocodex (Compiègne, France). II - Entretien des animaux Les rats mâles Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, L'arbresles, France) âgés de 19 mois sont placés dans des cages individuelles, en ambiance thermostatée 20 (23 1 C), et soumis à un cycle lumière-obscurité de 12h (obscurité de 8h à 20h). Le responsable du programme est autorisé (n 75.522), par le Ministère de l'Agriculture et de la Forêt, à pratiquer ce type d'expériences. De plus l'utilisation ainsi que l'entretien des animaux de laboratoires sont respectueux de la législation (D2001-486) et sont en accord avec la législation européenne (Journal Officiel de la Communauté Européenne 25 L358 12/18/1986). L'acclimatation des rats est effectuée pendant 2 semaines, au cours desquelles la consommation alimentaire spontanée est mesurée. Ils sont nourris avec un régime standard (A04, UAR, Villemoisson-sur-Orge, France) contenant 17% de protéines, 3% de lipides, 59% de glucides et 21% d'eau, fibres, vitamines et minéraux. La prise 30 alimentaire moyenne, durant cette période est de 34,4 g/ jour. III - Protocole expérimental Après la période d'acclimatation, les rats sont randomisés en 4 groupes : Un groupe contrôle formé de rats (n=10) nourri ad libitum (AL) pendant 12 semaines et 3 autres groupes soumis à une restriction alimentaire durant la même période : nourris avec seulement 50% des ingesta spontanés (soit 17,2 g), avec le régime standard (UAR A04). A la fin de la période de restriction, les animaux (n=10) d'un groupe sont sacrifiés (groupe R) et les rats des deux groupes restants sont renourris pendant une semaine avec 90% des ingesta spontanés (soit 30,9 g), soit avec un régime enrichi en acides aminés non essentiels (groupe AANE : alanine, asparagine, glycine, serine, histidine, et proline apportés de façon équimolaire) ou un régime enrichi en citrulline (5g/kg/j)(groupe citrulline). Les apports des deux groupes sont isoazotés et isocaloriques. La limitation à 90 % des apports spontanés permet d'être certain que les rats consomment l'intégralité des aliments qui leur sont offerts. Evaluation du niveau de carbonylation des protéines Les processus d'oxydation des protéines affectant la structure des acides aminés qui les composent sont complexes et donnent tous lieu à la formation de groupements carbonyles. C'est pourquoi il a été choisi d'évaluer de manière globale l'oxydation des protéines musculaires en quantifiant les dérivés carbonylés à partir d'un échantillon de 300 mg de tibialis anterior. La méthode utilisée est donc une technique non spécifique du type d'acide aminé qui repose sur le dosage spectrophotométrique du complexe formé par la fixation d'un composé appelé dinitrophénylhydrazine (DNPH) sur les groupements carbonyles. Les protéines musculaires sont isolées. Le culot protéique est repris dans 600 l de tampon SET. Les protéines solubilisées sont séparées en deux fractions égales de façon à avoir deux cupules contenant la même quantité de protéines (1-1,5 mg/ml). Une des cupules sert de blanc et l'autre à quantifier les groupements carbonyles. 500 .il de DNPH 12,5 mM sont ajoutés à la cupule de mesure et 500 l d'HCl 2M à la cupule du blanc. Après 15 min d'incubation à température ambiante, les échantillons sont précipités avec 500 l de TCA 30% et centrifugés 10 min à 15000 tpm. Le culot est repris par 1 ml de TCA 10% et centrifugé à nouveau 10 min à 15000 tpm. 4 lavages successifs sont ensuite réalisés à l'éthanoléthylacétate. Le culot final est chauffé pendant 30 min au bain-marie à 50 C. Après une nouvelle centrifugation de 5 min à 15000 tpm, la lecture spectrophotométrique est effectuée sur 800 l de surnageant àà 280 nm (dosage des protéines) et à 380 nm (dosage du DNPH). La teneur en carbonyles est exprimée en nmol/mg de protéines. Résultats Les résultats obtenus sont représentés dans la Figure 1. Il apparaît clairement que le phénomène de dénutrtion-renutrition s'accompagne d'une forte augmentation de la carbonylation des protéines musculaires. En revanche, lorsque l'alimentation est enrichie en citrulline, ce phénomène est complètement aboli. REVENDICATIONS 1. Utilisation de L-citrulline de formule (I) suivante : NH2 O H N NH2 O ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, pour la préparation d'une composition destinée au traitement des pathologies liées à une augmentation de la carbonylation des protéines, notamment destinée au traitement des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer ou de Parkinson, au traitement de la rétinopathie, de la polyarthrite rhumatoïde, de l'athérosclérose, de la sclérose latérale amyotrophique, de l'ischémie cérébrale, au traitement des problèmes de cataracte ou des infections généralisées, au traitement des pathologies liées au vieillissement cutané, et plus particulièrement à la sénescence des tissus tels que oeil, muscle et cerveau, et au traitement des pathologies liées au dysfonctionnement des mitochondries, à savoir les myopathies issues des mitochondriopathies. 2. Utilisation de L-citrulline selon la revendication 1, caractérisée en ce que la composition est une composition cosmétique, une composition alimentaire ou nutraceutique ou une composition pharmaceutique. 3. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 ou 2, pour la préparation d'une composition pharmaceutique caractérisée en ce que la dose unitaire en L-citrulline est d'environ 2 g à environ 20 g, notamment environ 10 g, pour une posologie d'environ 0,1 g/kg/jour à environ 0,5 g/kg/jour, notamment environ 0,25 g/kg/jour. 4. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse. (I) OH 9 2913885 5. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 4, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. 6. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 5, pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant également un ou plusieurs autres composés destinés au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale. 7. Composition cosmétique comprenant de la L-citrulline répondant à la formule (I) suivante : NH2 O N_ - OH NH2 O (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule approprié. 8. Méthode de traitement cosmétique, comprenant l'administration d'une quantité appropriée d'une composition cosmétique selon la revendication 6. 9. Composition alimentaire ou nutraceutique, comprenant de la L-citrulline répondant à la formule (I) suivante : OH (I) NH2 O ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule approprié. 10 2913885 ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule approprié.