Brevet FR2916354A1 — publié le 20081128

Composition pharmaceutique pour inhiber la calcification vasculaire La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique destinée à inhiber la calcification vasculaire. Il a été montré que la calcification des gros vaisseaux et des valvules n'est pas un simple processus passif, accompagnant le développement de l'athérosclérose. La calcification vasculaire résulte essentiellement d'un processus de différenciation des cellules musculaires lisses de l'intima en cellules de type ostéoblastique (osteoblast-like cells en langue lo anglaise). Ces cellules de type ostéoblastique sont capables de secréter divers éléments de la matrice extracellulaire et de déposer des sels de calcium de type hydroxyapatite, de façon très similaire à ce que l'on observe dans l'os sous l'action des ostéoblastes. En effet, ces cellules sont capables de réaliser, comme les ostéoblastes du tissu osseux, un ~s dépôt phosphocalcique extracellulaire, aboutissant, schématiquement, à une ossification de la paroi artérielle. Le risque de mortalité par accident vasculaire aigu est très largement corrélé au degré de calcification des parois des grosses artères, notamment au niveau des valvules. Et d'ailleurs, chez les sujets atteints 20 d'insuffisance rénale et pour lesquels il existe une hyperphosphatémie, des calcifications vasculaires et une athérosclérose accélérée se mettent en place très rapidement. Les facteurs influant sur ce processus de différenciation sont encore mal élucidés. Toutefois, le stress oxydant et diverses molécules tel l'anion 25 phosphate ont été identifiés comme tels. Par conséquent, l'intérêt de trouver des molécules pouvant inhiber ou ralentir ce processus est donc majeur. La vitamine K a déjà été identifiée comme une molécule capable de réduire le processus de calcification artérielle mais non pas de le 30 renverser, cette vitamine K étant majoritairement connue pour son action sur la coagulation sanguine. La vitamine K comporte un groupement quinone et elle est obtenue soit naturellement à partir de végétaux qui la synthétisent, c'est la vitamine K1 ou phylloquinone, soit par synthèse bactérienne, c'est la vitamine K2 ou ménaquinone. On pourra se référer au document EP1728507, lequel décrit l'administration de cette vitamine dans le but de résorber la calcification artérielle. Comme il est décrit dans ce document, la vitamine K à elle seule ne peut renverser le processus de calcification artérielle, et il est nécessaire d'y adjoindre d'autres composés pour cela. Il faut cependant rappeler les effets secondaires de la vitamine K, à savoir un effet hypertenseur et un effet sur la coagulation sanguine. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente w invention est de fournir une composition pharmaceutique qui puisse être une alternative à la vitamine K dont les effets secondaires peuvent être graves, mais aussi qui puisse à elle seule inhiber la calcification artérielle sans composé supplémentaire. Dans le but de résoudre ce problème, la présente invention propose 15 une composition d'oligomères d'acide galacturonique pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la calcification vasculaire. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans l'identification des oligomères d'acide galacturonique, comme étant des molécules à fort potentiel capable d'interagir avec les cellules musculaires lisses pour avoir 20 un effet sur le processus de calcification. Et en l'espèce, l'utilisation d'une composition incluant ces oligomères, permet non seulement d'inhiber au moins partiellement cette calcification mais aussi de la faire régresser. En outre, un seul type de composé est nécessaire, et les oligomères d'acide galacturonique sont susceptibles d'être produits à un coût avantageux à 25 partir de pectines comme on expliquera plus en détail dans la description détaillée. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, les oligomères d'acide galacturonique de ladite composition présentent un degré de polymérisation compris entre 2 et 25 et de 30 préférence entre 5 et 20. Au surplus, lesdits oligomères sont avantageusement substitués avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé de manière à leur conférer des propriétés particulières. De préférence, lesdits oligomères d'acide galacturonique sont acétylés et ils présentent un taux d'acétylation supérieur à 10%, c'est-à- dire que les oligomères présentent en nombre 1 résidu acétate pour 10 résidus d'acide galacturonique. De manière préférée, le taux d'acétylation est compris entre 20 et 30 % pour obtenir une activité biologique optimale. Les oligomères sulfatés d'acide galacturonique présentent un taux de substitution supérieur à 10%. De manière préférée, le taux sera Io compris entre 40 et 60%. En outre, la composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'invention est prévue pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la différenciation des précurseurs de cellules musculaires lisses en cellules de type ostéoblastique ou ostéoblast-like cells en langue anglaise. ~s De la sorte, les précurseurs de cellules musculaires lisses ne se différenciant par en ostéoblastes ou en cellules apparentées et la fixation des sels de calcium ne se produit pas. Par conséquent, la calcification des vaisseaux n'apparaît pas. Par ailleurs, lesdits oligomères d'acide galacturonique sont associés 20 à un excipient physiologiquement acceptable afin de permettre l'administration de ladite composition par voie orale, parentérale ou par tout autre moyen à l'intérieur du corps d'un mammifère. Selon un autre aspect, l'invention concerne une prothèse vasculaire du type stent qui permet de maintenir ouvert les vaisseaux sanguins 25 dans lesquelles elle est introduite, ladite prothèse étant enduite d'une composition d'acide galacturonique conforme à l'invention. Ainsi, la prothèse vasculaire permet non seulement de jouer son rôle mécanique de maintien des vaisseaux, mais aussi de modes d'administration de la composition d'oligomères d'acide galacturonique. 30 Avantageusement, la composition d'oligomères d'acide galacturonique est maintenue dans une matrice permettant la libération progressive de ladite composition dans le système vasculaire de l'individu à l'intérieur de laquelle elle est implantée. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers 5 de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la Figure 1A est une vue de dessus au microscope d'une culture de cellules musculaires lisses incorporant 10-3 mol/I de phosphate ; - la Figure 1B est une vue de dessus au microscope d'une culture 10 de cellules musculaires lisses en présence de 4.103 mol/I de phosphate ; - la Figure 2 est une vue de dessus de six cultures de cellules musculaires lisses colorées au Rouge d'Alizarine ;et, - la Figure 3 montre un histogramme des densités optiques de certaines cultures cellulaires illustrées sur la Figure 2. 15 Les oligomères d'acide galacturonique sont obtenus à un coût avantageux à partir de pectines brutes dont on extrait les polymères d'acide galacturonique. Ces derniers sont tout d'abord dégradés en oligomères par traitement thermique à une pression déterminée. Grâce à un traitement spécifique les oligomères présenteront un degré de 20 polymérisation compris sensiblement entre 5 et 25. Ces oligomères seront ensuite traités par un réactif d'acétylation, et de préférence l'anhydride acétique, afin de pouvoir l'éliminer plus aisément au terme de la réaction. Afin d'obtenir des oligomères d'acide galacturonique sulfatés, on fait réagir de préférence un complexe S03-DMF sur lesdits oligomères 25 dégradés. Modèle expérimental Aussi, afin de pouvoir tester la préparation pharmaceutique conforme à l'invention et incorporant des oligomères d'acide galacturonique, il a été développé un modèle de différenciation de cellules 30 musculaires lisses murines. Ces cellules musculaires lisses (A7r5), lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu concentré en phosphate, subissent une transformation phénotypique, et elles expriment les gènes de protéines de la matrice extracellulaire qui sont capables de générer des dépôts calciques parfaitement visibles et quantifiables par diverses méthodes. Ce modèle est particulièrement intéressant, car il permet de passer au crible, en peu de temps, une pluralité de molécules aptes à promouvoir les cellules de type ostéoblastique ou bien de façon plus intéressante, à inhiber l'apparition de ces cellules. Ainsi, il était aisé de repérer très rapidement les molécules qui permettent d'éviter les dépôts calciques. Les cellules musculaires lisses murines précitées ont été supplémentées par du phosphate inorganique à des concentrations allant de 10-3 mol/1 à 4.10-3 mol/1. La valeur de 10-3 mol/I correspond à une valeur normale, tandis que la valeur de 4.10-3 mol/1 correspond à des valeurs observées chez certains sujets insuffisants rénaux présentant des calcifications artérielles accélérées. La différenciation des cellules A7r5 est étudiée par des critères morphologiques et biochimiques (activité phosphatase alcaline). La capacité de calcification est étudiée comme pour les ostéoblastes MC3T3 par la coloration au Rouge d'Alizarine, ainsi que par la coloration au nitrate d'argent de von Kossa. Exemple 1 Le phosphate est le facteur le plus utilisé pour induire cette différenciation in vitro. II s'agit d'une véritable différenciation, avec activation de gènes normalement non exprimés et notamment des gènes codant pour des protéines et enzymes impliqués dans le processus de calcification, ou des protéines ou autres éléments de la matrice extracellulaire. Les Figures 1A et 1B, montrent l'effet du phosphate sur le processus de différenciation et de calcification de la lignée de cellules musculaires lisses A7r5. En effet, la Figure 1A est une représentation photographique de dessus d'une vue au microscope binoculaire d'une culture de cellules musculaires lisses incorporant 10"3 mol/I de phosphate, tandis que la Figure 1B est une représentation d'une culture de cellules musculaires lisses en présence de phosphate à raison de 4.10-3 mol/I. Les vues ont été prises après 14 jours de culture. Ainsi, la calcification des cellules est évaluée en révélant les sels de calcium au réactif de Von Kossa. li s'agit là, de substituer des cations métalliques lourds de nitrate d'argent aux ions calcium et que l'on visualisera par une réduction en argent métallique noir. En effet, sur la Figure 1B les dépôts calciques sont révélés sous la forme de zones noirâtres, tandis que sur la Figure 1A de telles zones n'apparaissent pas. Exemple 2 to On se référera maintenant à la Figure 2, illustrant l'efficacité de la composition pharmaceutique incluant les oligomères d'acide galacturonique précités. Ainsi, six cultures de cellules musculaires lisses du type précité ont été réalisées. Une première colonne 10 de culture cellulaire incorporant des concentrations progressives en phosphate et 15 une seconde colonne 12 incorporant non seulement les mêmes concentrations progressives en phosphate mais au surplus une composition pharmaceutique incorporant des oligomères d'acide galacturonique à raison de 100 pg par millilitres. Cette composition pharmaceutique contient essentiellement des oligomères d'acide 20 galacturonique dont le degré de polymérisation est majoritairement ou essentiellement compris entre 5 et 20. On notera que les trois rangées de culture cellulaire contiennent une quantité de phosphate dont la concentration est respectivement de, 10-3 mol/I, 3. 10-3 mol/I et 4. 10-3 mol/l. Ici, la coloration est réalisée au Rouge d'Alizarine et non plus au 25 nitrate d'argent afin de pouvoir quantifier en spectrophotométrie la quantité de dépôts calciques. Ainsi, au bout de 14 jours de culture, on observera sur la première colonne 10 de cultures cellulaires, et en partant du haut, que les cultures cellulaires, initialement pâles pour une concentration en phosphate de 10"3 mol/1 deviennent progressivement 30 foncées. En réalité, la première culture cellulaire 14 est légèrement colorée en rose, la deuxième, entourée de traits interrompus pour être plus clairement repérée et incorporant une concentration en phosphate de 3. 10-3 mol/I est sensiblement rouge, tandis que la troisième 16 et dernière est rouge vif. De la sorte, la coloration au Rouge d'Alizarine révèle la calcification induite par le phosphate dans les cellules musculaires lisses A7r5 et montre que l'intensité de la coloration augmente avec la concentration en phosphate. En revanche, on notera que les couleurs des trois autres cultures cellulaires qui incluent non seulement les mêmes quantités progressives de phosphate, mais aussi la composition d'oligomères d'acide galacturonique, sont identiques et aussi pâle que la première culture Io cellulaire témoin, ne contenant pas d'oligomères d'acide galacturonique. Par conséquent, la composition d'oligomères d'acide galacturonique produit indéniablement un effet inhibiteur sur les formations calciques. Exemple 3 Par ailleurs, les densités optiques de trois cultures cellulaires 15 précitées ont été mesurées précisément et reportées dans l'histogramme présenté sur la Figure 3. Ainsi, on a reporté respectivement dans cet histogramme, la densité optique de la première culture cellulaire 14 de la première colonne 10, incorporant uniquement du phosphate à une concentration de 10-3 mol/l, la densité optique de la troisième culture 20 cellulaire 16 de la première colonne incluant uniquement du phosphate à une concentration de 4.10-3 mol/1 et la densité optique de la troisième culture cellulaire 18 de la seconde colonne 12 incorporant elle, à la fois du phosphate à la concentration de 4.10-3 mol/I et la composition d'oligomères d'acide galacturonique. Ainsi, ce qui apparaissait à l'oeil nu 25 sur les cultures cellulaires illustrées sur la Figure 2, est ici clairement établi. La composition d'oligomères d'acide galacturonique a bien un effet inhibiteur marqué sur les formations calciques. La différenciation des cellules musculaires lisses A7r5, et corrélativement leur capacité à générer des calcifications extracellulaires, 30 sont pratiquement totalement inhibées par la composition d'oligomères d'acide galacturonique à la concentration de 100pg/ml. Une inhibition de l'ordre de 50% a aussi été observée à 50pg/ml. Ainsi, l'utilisation de compositions d'oligomères d'acide galacturonique, présentant un degré de polymérisation essentiellement ou majoritairement compris entre 5 et 25, est très prometteuse en termes d'applications thérapeutiques, pour lutter contre les formations calciques artérielles. En outre, et de façon avantageuse, les oligomères d'acide galacturonique conformes à l'invention, sont non substitués ou présentent des substituants et préférentiellement des substituants acétiques. En outre, l'administration parentérale de ces composés permettrait 10 d'obtenir des concentrations circulantes actives. De plus, l'utilisation de prothèses vasculaires ou stents , recouvertes d'une composition biologiquement active incorporant des oligomères d'acide galacturonique substitués ou non est tout naturellement envisageable. Ce genre de prothèses est installé à is l'intérieur des veines de sujets ayant présenté des accidents ischémiques sévères, et la mise en oeuvre de compositions d'oligomères d'acide galacturonique à la surface interne de ces prothèses, permettrait une libération continue et prolongée de la composition. Ainsi, ce type de prothèses vasculaires permettrait alors, chez les sujets à risque, de 20 prévenir les calcifications artérielles et par conséquent les accidents vasculaires aigus. Différentes stratégies sont envisageables, par exemple une liaison forte entre la prothèse et la molécule active, réalisant une forte concentration locale et un effet limité dans l'espace, ou encore une liaison 25 plus ou moins labile, permettant de libérer progressivement la substance active dans le compartiment vasculaire. REVENDICATIONS , 1. Composition d'oligomères d'acide galacturonique pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la calcification vasculaire. 2. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit oligomère présente un degré de polymérisation compris entre 5 et 25. 3. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits oligomères sont en io outre greffés avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé 4. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la différenciation des précurseurs de 1s cellules musculaires lisses en cellules de type ostéoblastique. 5. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits oligomères présentent un taux d'acétylation supérieur à 10%. 6. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une 20 quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits oligomères d'acide galacturonique sont associés à un excipient physiologiquement acceptable. 7. Prothèse vasculaire enduite d'une composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 25 8. Prothèse vasculaire selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite composition d'oligomères d'acide galacturonique est maintenue dans une matrice permettant la libération progressive de ladite composition.