Brevet FR2916353A1 — publié le 20081128

Composition pharmaceutique destinée à préserver le collaqène La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique destinée à inhiber la dégradation du collagène. Le collagène est le composé essentiel des fibrilles et fibres du tissu conjonctif. En outre, le collagène de type I est une protéine majeure de la matrice protéique calcifiée qu'est l'os. Or, dans certaines pathologies le collagène est dégradé de façon anormale par certaines enzymes par exemple les cathépsines K, B et L ou une collagénase. Pour assurer le renouvellement constant du tissu osseux et lui conférer sa résistance mécanique, il est d'un côté perpétuellement dégradé par les ostéoclastes et de l'autre reformé par les ostéoblastes. Les ostéoclastes participent à la résorption osseuse, d'une part en diminuant le pH au contact de la matrice osseuse, et d'autre part en sécrétant les enzymes protéolytiques du type précité, qui elles-mêmes provoquent la dégradation de la trame osseuse et en particulier du collagène. Une dégradation anormale du collagène se produit lorsqu'il existe un déséquilibre entre les deux phénomènes précités ; cette dégradation conduisant à un affaiblissement de la masse osseuse. C'est notamment le cas de l'ostéoporose. Aussi, il a été imaginé de fournir des produits permettant d'inhiber l'action de la collagénase. On pourra notamment se référer au brevet japonais JP7196598, lequel décrit l'acide 3-[2-(N-methylcarbamoyl)ethylthio]-5-ethylhexanohydroxamique comme exemple de dérivé permettant cette inhibition. Cependant, une tel composé est relativement complexe à synthétiser et par conséquent coûteux ; et au surplus il entraîne nécessairement des effets secondaires sur l'organisme. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir un composé moins coûteux et dont l'activité confère moins d'effets secondaires. Dans le but de résoudre ce problème, la présente invention propose une composition d'oligomères d'acide galacturonique présentant un degré de polymérisation compris sensiblement entre 5 et 25 pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la dégradation du collagène. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans l'utilisation d'une composition d'oligomères d'acide galacturonique ou oligosaccharides, afin de prévenir la dégradation du collagène. Ces oligomères d'acide galacturonique présentent l'avantage de pouvoir être préparés à des coûts très avantageux à partir de pectine comme on l'expliquera ci-après dans lo la description détaillée. Le collagène présente des acides aminés modifiés et notamment de l'hydroxyproline et de l'hydroxylysine. Ces acides aminés hydroxylés y sont présents dans une proportion importante. Les oligomères d'acide galacturonique interagissent avec ces acides aminés via des liaisons 15 hydrogènes. Ces oligomères s'associent au collagène pour réduire la dégradation de la matrice osseuse par les ostéoclastes. Cette dégradation bien que physiologiquement utile pour le maintien de l'homéostasie calcique ou de l'intégrité osseuse puisqu'elle est compensée par l'activité des ostéoblastes, peut être à sens unique comme par exemple dans le 20 cas de l'ostéoporose. Aussi, la composition d'oligomères d'acide galacturonique conforme à l'invention permet de traiter efficacement l'ostéoporose sans effet secondaire particulier. Au surplus, lesdits oligomères sont de préférence substitués avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, 25 Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé. Avantageusement, lesdits oligomères acétylés d'acide galacturonique présentent un taux d'acétylation supérieur à 10%, c'est-à-dire que les oligomères présentent en nombre 1 résidu acétate pour 10 résidus d'acide galacturonique. De manière préférée, le taux d'acétylation 30 est compris entre 20 et 30 % pour obtenir une meilleure protection du collagène. Lesdits oligomères sulfatés d'acide galacturonique présentent un taux de substitution supérieur à 10%. De manière préférée, le taux sera compris entre 40 et 60%. En outre, la composition d'oligomères d'acide galacturonique substituée ou non est adaptée pour inhiber la dégradation du collagène de type I, lequel représente environ 90 % du collagène du corps humain. Par ailleurs, le collagène est aussi impliqué au cours de la cancérogenèse dans l'invasion métastasique où les cellules tumorales le dégradent. Aussi, la composition d'oligomères conforme à l'invention est-elle utilisée pour inhiber le développement de métastases chez un sujet atteint d'une tumeur cancéreuse, la composition proposée ayant un caractère inhibiteur vis à vis des cathepsines, enzymes reconnues pour favoriser le développement de métastases. De plus, le développement des tumeurs cancéreuses s'accompagne 15 d'une activité pro-• angiogénique importante mettant en jeu le collagène également. Par conséquent, la composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'invention, est utilisée pour inhiber les capacités angiogéniques de cellules tumorales. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la 20 lecture de la description faite ci-après d'exemples de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la Figure 1A est une représentation photographique d'une plaque d'électrophorèse en vue de dessus illustrant l'effet de la concentration en 25 composition d'oligomères conforme à l'invention sur l'effet protecteur sur le collagène vis-à-vis de la cathépsine K ; - la Figure 1B est une représentation photographique d'une plaque d'électrophorèse en vue de dessus montrant l'effet du degré de polymérisation sur les capacités inhibitrices de la composition 30 d'oligomères conforme à l'invention ; -la Figure 2A, 2B, et 2C représentent trois plaques d'électrophorèse montrant respectivement l'effet inhibiteur de la composition d'oligomères conforme à l'invention sur le collagène respectivement vis-à-vis des cathépsines L et B et aussi vis-à-vis d'une collagènase bactérienne ; - la Figure 3 représente un histogramme montrant l'effet de la composition d'oligomères d'acide galacturonique sur le pourcentage de résorption osseuse en fonction de la concentration en oligomères ; et, - la Figure 4 représente un histogramme montrant l'effet du degré de polymérisation des oligomères de la composition, sur la résorption osseuse. Les oligomères d'acide galacturonique sont obtenus à un coût lo avantageux à partir de pectines brutes dont on extrait les polymères d'acide galacturonique. Ces derniers sont tout d'abord dégradés en oligomères par traitement thermique à une pression déterminée. Grâce à un traitement spécifique les oligomères présenteront un degré de polymérisation compris sensiblement entre 5 et 25. Ces oligomères seront 15 ensuite selon les cas traités par un réactif d'acétylation, et de préférence l'anhydride acétique, afin de pouvoir l'éliminer plus aisément au terme de la réaction. Afin d'obtenir des oligomères d'acide galacturonique sulfatés, on fait réagir de préférence un complexe S03-DMF sur lesdits oligomères. 20 Pour une utilisation comme médicament destiné à inhiber la dégradation du collagène, les oligomères d'acide galacturonique précités sont associés à un excipient physiologiquement acceptable. L'effet protecteur des oligomères d'acide galacturonique ou oligogalacturonanes (oGal) sur le collagène a été mis en évidence en 25 évaluant le niveau de dégradation enzymatique du collagène en présence ou non de ces oligomères. La dégradation enzymatique du collagène intervient en présence de différents enzymes dont les cathépsines K, B et L ou une collagénase bactérienne. Ensuite, ont été mis en évidence, les capacités inhibitrices des 30 oligomères d'acide galacturonique sur la dégradation du collagène au cours de la résorption osseuse ostéoclastique. Exemple 1 L'évaluation de la dégradation du collagène de type I par la cathépsine K a été réalisée par électrophorèse en gel d'acrylamide suivie d'une coloration au bleu de Coomassie. La Figure 1A, est une représentation photographique montrant la plaque d'électrophorèse en vue de dessus, avec plusieurs colonnes de migration de collagène non dégradé ou dégradé visualisé par des bandes et illustrant les caractéristiques de la préparation pharmaceutique conforme à l'invention. w Quatre préparations pharmaceutiques ont été mises en oeuvre avec du collagène de type I et elles correspondent à quatre concentrations différentes d'oligomères d'acide galacturonique et respectivement 12.5, 25, 50 et 100pg/mL. L'enzyme utilisée est la cathépsine K et afin de réaliser un essai de contrôle, un inhibiteur de cette enzyme E-64 y a été 15 associé. Ainsi, la première colonne de migration 10 correspond à un témoin, puisque l'échantillon déposé ne comporte ni enzyme, ni inhibiteur. La deuxième colonne de migration 12 correspond à un échantillon ne comportant que l'enzyme et la troisième colonne de migration 14 comprend à la fois l'enzyme et son inhibiteur. Les quatre autres colonnes 20 de migration 16, 18, 20, 22 correspondent à quatre échantillons comportant respectivement l'enzyme et 12.5, 25, 50 et 100 pg/ml d'oligomères d'acide galacturonique. La colonne 10 et la colonne 22 sont tout à fait comparables. La colonne 12 caractérise le collagène dégradé par la cathépsine. Par 25 comparaison avec la colonne 12, les colonnes 16, 18 et 20 montrent une réduction du nombre et de l'intensité des bandes de petite taille correspondant au collagène dégradé. Ce résultat traduit un effet inhibiteur des oligomères d'acide galacturonique vis-à-vis de la dégradation du collagène de type I. Cet effet inhibiteur est croissant en fonction de la 30 concentration en oligomères dans la préparation pharmaceutique. Par ailleurs, sur la Figure 1B est reportée la représentation photographique d'une plaque d'électrophorèse en vue de dessus montrant l'impact du degré de polymérisation des oligomères d'acide galacturonique sur l'efficacité de l'inhibition. Les oligomères des préparations pharmaceutiques ici testées sont à une concentration de 100 pg/mI. Leur degré de polymérisation est de deux pour l'échantillon de la cinquième colonne 26, de trois pour celui de la sixième colonne 28, de cinq pour celui de la septième colonne 30, de huit pour celui de la huitième colonne 32; le degré de polymérisation des oligomères est compris entre 11 et 16 pour l'échantillon de la neuvième colonne 34 et il est compris entre 5 et 25 pour celui de la dernière colonne 36. La colonne 24 correspond au monomère d'acide galacturonique. Ainsi, si l'on compare les résultats sur cette plaque d'électrophorèse de la Figure 1B, on constate que l'effet inhibiteur des oligomères d'acide galacturonique devient significatif à partir de la septième colonne 30, laquelle correspond à un oligomère présentant cinq 15 unités ose. On observera que cette septième colonne 30 présente un nombre de bandes comparable à celui des colonnes 20 et 21 de la plaque d'électrophorèse représentée à la Figure 1A. Pour les autres oligomères testés, les résultats sont comparables à ceux de la colonne 30. Exemple 2 20 Les autres enzymes de dégradation du collagène de type I citées ci-dessus, les cathépsines B et L ainsi que la collagénase bactérienne ont été testées de la même manière avec des préparations pharmaceutiques comprenant des oligomères d'acide galacturonique respectivement dans des concentrations de 25, 50 et 100 pg/mI. 25 Les Figures 2A, 2B et 2C représentent trois plaques d'électrophorèse correspondant respectivement à trois séries d'essais avec chacune des enzymes précitées, la Figure 2A avec la cathépsine B, la Figure 2B avec la cathépsine L et la Figure 2C avec la collagénase bactérienne. 30 Ainsi, on observe que les trois colonnes de migration des échantillons comprenant la préparation pharmaceutique qui inclut des oligomères d'acide galacturonique présentent moins de gros fragments que dans la première colonne correspondant au collagène pur non dégradé. Il en est ainsi de la première plaque d'électrophorèse correspondant à la Figure 2A sur laquelle les colonnes 38, 40, 42 correspondent respectivement à des concentrations en oligomères de 25, 50 et 100 pg/mI. Cela apparaît également sur la plaque d'électrophorèse correspondant à la Figure 2B où les colonnes respectivement référencées 44 à 48 sont comparables au témoin collagène non dégradé. La figure 2C révèle une réduction du nombre et de l'intensité des bandes de dégradation du collagène par la collagénase bactérienne lorsque celle ci-est associée à des oligomères. En outre, ces bandes sont d'une intensité plus faible en fonction de la concentration en oligomères. Cela témoigne également de l'efficacité des oligomères d'acide galacturonique pour préserver le collagène de type I vis-à-vis des trois enzymes précitées. 15 On observera que l'effet protecteur des oligomères d'acide galacturonique illustré dans l'exemple 1 est plus marqué vis-àvis de la cathéspine K que vis-à-vis des autres enzymes décrites à l'exemple 2. Par ailleurs, il a été vérifié que la préparation pharmaceutique incluant les oligomères d'acide galacturonique n'avait aucun effet 20 particulier sur les enzymes précitées. Par conséquent, ces oligomères agissent directement sur le collagène pour le préserver de la dégradation. En outre, il a été montré que sur d'autres types de protéines, les oligomères d'acide galacturonique décrits ici n'avaient aucun effet protecteur vis-à-vis des enzymes. 25 Exemple 3 L'effet protecteur d'une composition pharmaceutique selon l'invention incluant des oligomères d'acide galacturonique, a aussi été mis en évidence sur le collagène dans le cas de la résorption osseuse ostéoclastique. 30 L'os est un tissu collagénique particulier car il est minéralisé. Cependant sa structure, en renouvellement constant, est le fruit d'un équilibre entre la dégradation par les ostéoclastes et la formation par les ostéoblastes. Mais il arrive que cet équilibre soit rompu ce qui peut conduire à une perte osseuse importante, c'est le cas de l'ostéoporose, des métastases osseuses ostéolytiques ou des affections bactériennes ostéolytiques. Ainsi, une composition pharmaceutique incluant les oligomères précités, est capable de réduire la dégradation osseuse et conduit à un rétablissement de la balance dans les cas d'hyper-résorption. La résorption osseuse se faisant par une déminéralisation de la matrice due à une acidification, suivie d'une dégradation des chaînes de collagène de to type I par la cathépsine K, les oligomères d'acide galacturonique inhibent cette deuxième phase. On se référera à la Figure 3, laquelle présente un histogramme montrant le pourcentage de résorption osseuse du à la composition pharmaceutique incorporant respectivement 50, 100 et 200 pg/ml ~s d'oligomères d'acide galacturonique (oGal). Ainsi, ces préparations pharmaceutiques induisent-elles une réduction importante et significative de la résorption osseuse comparée à l'échantillon contrôle non traité. Cela est corrélé avec les observations faites sur l'étude de la collagénolyse par la cathépsine K, principale enzyme impliquée dans la résorption osseuse. 20 De la même façon que pour l'inhibition de la collagénolyse, on observe sur la Figure 4 que le degré de polymérisation (dp) minimal permettant une inhibition significative de la résorption osseuse est de 5. En outre, cet effet inhibiteur s'accroît avec le degré de polymérisation. Ainsi, il semble que les oligomères d'acide galacturonique masquent des sites de clivages 25 du collagène, tout comme dans les exemples précédents. Par conséquent, une taille minimale de l'oligomère est requise pour obtenir cet effet. Par ailleurs, il a aussi été vérifié que l'effet protecteur des oligogalacturonanes, ou oligomères précités, n'était pas lié à une 30 augmentation de l'apoptose des ostéoclastes. En raison de la capacité des compositions pharmaceutiques incorporant des oligomères d'acide galacturonique, (oGal) pour inhiber la dégradation du collagène médiée par les cathepsines ou les métalloprotéases, leur capacité à inhiber d'autres processus cellulaires faisant intervenir une collagénolyse a été envisagée. Et notamment, il a été envisagé de les appliquer à deux domaines pathologiques extrêmement important pour l'homme. Tout d'abord, l'inhibition de l'invasion métastasique des cancers et ensuite l'inhibition de l'angiogénèse. S'agissant de l'invasion métastasique, une étape clef du développement du cancer, nécessite l'acquisition par les cellules to tumorales de la capacité à dégrader le collagène, grâce à la sécrétion de métalloprotéases et de cathepsines. Les oligomères d'acide galacturonique, par leur capacité à interférer avec le collagène, sont de puissants inhibiteurs de l'invasion métastatique. En effet, ces oligomères sont capables de protéger le collagène de la dégradation par diverses 15 enzymes. Une autre étape importante pour l'invasion métastatique à distance de la tumeur primaire est l'acquisition par la cellule tumorale d'une capacité angiogénique, c'est à dire la capacité à former des vaisseaux sanguins permettant le drainage des cellules tumorales dans le flux 20 circulatoire. Dans ce processus, la collagénolyse médiée par les cathepsines prend une place capitale. Les oligomères précités (oGal), par leur capacité à bloquer la collagénolyse, sont de puissants antiangiogéniques. REVENDICATIONS 1. Composition d'oligomères d'acide galacturonique présentant un degré de polymérisation compris sensiblement entre 5 et 25 pour une 5 utilisation comme médicament destiné à inhiber la dégradation du collagène. 2. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits oligomères sont en outre greffés avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, ~o Acyl, Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé 3. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1 ou 2 pour inhiber la dégradation du collagène de type I. 4. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour traiter l'ostéoporose. 15 5. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour inhiber la prolifération des métastases d'un sujet atteint d'une tumeur cancéreuse. 6. Composition d'oligomères acétylés d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour inhiber les 20 capacités angiogéniques de cellules tumorales. 7. Composition d'oligomères acétylés d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits oligomères présentent un taux d'acétylation supérieur à 10%. 8. Composition d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que lesdits oligomères acétylés d'acide galacturonique sont associés à un excipient physiologiquement acceptable.