Brevet FR2921669A1 — publié le 20090403

MILIEU DE CULTURE DE MICROORGANISMES COMPRENANT UN INHIBITEUR DE BACTERIOCINES Le domaine de l'invention est celui de l'analyse de microorganismes cibles dans un échantillon complexe. Plus particulièrement, la présente invention concerne la détection et le dénombrement de bactéries telles les bactéries des genres Staphylococcus, Listeria, Salmonella, E.coli 0157:H7, par l'utilisation d'un milieu de culture contenant les nutriments indispensables à la croissance des microorganismes, le ou les substrats permettant la détection, le ou les inhibiteurs limitant la croissance des microorganismes non ciblés et au moins un inhibiteur de bactériocines, lesdites bactériocines étant présentes dans l'échantillon soit de façon naturelle, soit comme additif, en particulier dans des échantillons d'origine alimentaire. La qualité et la sécurité sont les soucis majeurs de l'industrie agro-alimentaire, au niveau mondial. Dans les matières premières et les produits finis, il doit être possible de détecter, identifier et quantifier la flore microbienne et de garantir ainsi la valeur des produits, de leur fabrication jusqu'à leur consommation. Ceci est également vrai pour les plats cuisinés élaborés, en particulier les viandes et les poissons en sauces qui répondent à la demande des consommateurs. Il est important de distinguer, d'une part les indicateurs-qualité du produit, reflet d'un taux de contamination global par une flore d'altération à laquelle appartiennent les entérobactéries comme Escherichia coli, les staphylocoques à coagulase positive, les Pseudomonas, les Bacillus, les levures, les moisissures etc, et d'autre part la détection des pathogènes tels Listeria monocytogenes, les bactéries du genre Salmonella ou Escherichia coli 0157:H7. A ce titre, l'analyse microbiologique est primordiale en terme de santé publique et en terme économique pour cette industrie. La mise au point de tests de détection de microorganismes cibles dans un échantillon répond à des contraintes fortes et nécessite de trouver un compromis entre la sensibilité, définie comme le pouvoir de mettre en évidence l'espèce recherchée, lorsque celle-ci est présente en faible quantité dans un échantillon à tester, et la sélectivité, définie comme le pouvoir de détecter l'espèce recherchée dans l'échantillon contenant également d'autres espèces. La combinaison des composants assurant la sensibilité, avec ceux assurant la sélectivité, permet d'obtenir un test spécifique.35 Le critère de sensibilité impose fréquemment le recours à une composition permettant de cultiver les microorganismes cibles, afin de les rendre détectables. La sensibilité peut ainsi être apportée par l'incorporation dans le milieu de culture d'une molécule-marqueur impliquée dans le métabolisme des microorganismes cibles ; cette interaction produisant un signal mesurable. On citera à titre d'exemple les inventions de la demanderesse décrites dans le brevet EP-B- 1 390 524 ou dans la demande WO-A-2007/000530. D'autre part, selon que l'on souhaite détecter et dénombrer un genre spécifique ou la totalité des germes viables, on utilisera un milieu sélectif ou non. L'un des problèmes rencontrés est l'existence de faux-positifs. Cette situation est observée, par exemple, lorsque l'échantillon à traiter provient d'une source complexe comme un échantillon clinique ou comme un produit alimentaire qui renferme une flore commensale dont le métabolisme est proche de celui des microorganismes cibles. Ce problème a été résolu par l'incorporation de cocktails d'agents anti-microbiens dans les milieux de culture pour s'opposer à la croissance et à la détection de microorganismes non ciblés. Par exemple, pour limiter la croissance des bactéries à Gram positif, on utilisera des détergents ou équivalents (comme les sels biliaires, le laurylsulfate de sodium, l'acide cholique ou ses dérivés, le Tergitol 7, etc), des colorants comme le cristal violet qui inhibe en particulier la croissance des staphylocoques mais aussi des entérocoques, en fonction de la concentration à laquelle il est utilisé, comme l'indique le brevet FR- 2 826 019, ou des antibiotiques spécifiques des Gram positifs tels la pénicilline, la vancomycine, la teicoplanine et les antibiotiques de la famille des MLS (Macrolides, Lincosamides et Streptogramines). Les bactériocines, qui sont des toxines produites par certaines souches bactériennes, peuvent être associées aux antibiotiques comme l'indique le brevet EP-B-O 768 376. Un autre problème rencontré est l'existence de faux-négatifs ou le risque de sous-numération du microorganisme d'intérêt. En premier lieu, l'interférence entre différentes souches de microorganismes présentes conjointement dans l'échantillon, telle qu'elle a été décrite précédemment pour les faux positifs, peut être à l'origine d'une sous-numération. En second lieu, h pousse des microorganismes d'intérêt peut être limitée par les antibactériens présents, soit dans l'échantillon dans le but d'améliorer sa conservation, soit dans le milieu de culture dans le but d'éviter les faux-positifs. En troisième lieu, la sous-numération peut être liée au fait que les cellules microbiennes présentes dans l'échantillon ont subi un stress, ont été blessées ou détériorées, par exemple par un processus de préparation lorsque l'échantillon est une matrice alimentaire. A ce titre, le brevet US-5,296,370 et la demande WO-A-98/23726 proposent des milieux de culture permettant de régénérer les pathogènes d'intérêt. Enfin, le phénomène de sous-numération peut être la conséquence de la présence de bactériocines dans l'échantillon. Les bactériocines (par exemple la nisine, la pédiocine A ou la lacticine) sont des substances protéiques produites par les bactéries elles-mêmes et qui présentent une activité antibactérienne seulement dirigée contre des espèces d'origine proche. On les trouve de façon naturelle en faible concentration dans le lait et les fromages mais elles sont aussi connues et acceptées comme conservateurs alimentaires, en particulier en complément dans les produits laitiers. Produites par exemple par certaines souches de Lactococcus lactis ou Streptococcus lactis, elles présentent un large spectre vis à vis des organismes à Gram positif, mais aussi à Gram négatif. La nisine est la bactériocine la plus couramment utilisée dans l'industrie agroalimentaire. Elle est utilisée seule ou en association potentiellement synergique comme proposé par le brevet EP-B-O 382 814. Alternativement, ce peut être une souche bactérienne qui est ajoutée au produit alimentaire dans le but de produire in situ des bactériocines, selon l'invention décrite dans la demande WO-A-04/02244. Or, il a été observé que l'utilisation de la nisine comme conservateur dans la viande s'avère moins efficace que dans les produits laitiers. Il a été mis en évidence que la viande contient de façon naturelle du glutathion et proposé que ce composé inactive la nisine et s'oppose ainsi à son action conservatrice (Stergiou et al., 2006 ; J Food Prot, 69 : 951-956; Jay, JM et al., in Modern Food Microbiology 7th edition ; Springer Science 2005). Ces études expliquent l'effet limité des bactériocines mais n'ont pas eu pour conséquence l'abandon de leur utilisation comme conservateur dans les plats élaborés à base de viande. Pour contourner cette limite, Coyne et al. (WO-A-2005/018322) proposent d'encapsuler la nisine et de préserver ainsi son efficacité. Or, dans le cadre des contrôles-qualité qui sont d'une importance capitale pour l'industrie alimentaire, les bactériocines peuvent interférer avec la détection de pathogènes et avoir pour conséquence une sous-numération ou absence de numération de ceux-ci, alors qu'ils sont présents dans l'échantillon. Le risque est donc de libérer un produit potentiellement contaminé ou impropre à la consommation. La présente invention propose de pallier les inconvénients liés aux bactériocines présentes de façon naturelle ou supplémentaire dans les échantillons, de contourner la sous- numération de certains pathogènes ou indicateurs qualités et d'éviter l'effet aléatoire de la réponse du contrôle microbiologique dans les fromages, en utilisant un milieu réactionnel contenant au moins un inhibiteur de bactériocines. Un milieu réactionnel est ici défini comme un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes, à savoir des acides aminés ou hydrolysats de protéines, des minéraux, des vitamines et d'une manière générale, tous les nutriments et toutes les sources métaboliques connus par l'homme du métier pour permettre la pousse microbienne. Les inventeurs ont en effet démontré que l'addition d'au moins un inhibiteur de bactériocines dans un milieu de culture, par exemple sur une base de milieu type Chapman ou Columbia permet des numérations parfaitement corrélées et une meilleure détection de souches à croissance difficile ou tardive. Plus particulièrement, l'invention concerne un milieu de culture pour 15 microorganismes comprenant : • au moins un substrat, naturel ou synthétique, de fermentation ou d'activité enzymatique, et • au moins un inhibiteur des bactériocines. 20 De façon préférentielle, l'inhibiteur de bactériocines est le glutathion. Au sens de la présente invention, le substrat est choisi parmi tout substrat pouvant être hydrolysé en un produit qui permet la détection, directe ou indirecte, d'une activité enzymatique spécifique du microorganisme recherché. Dans le cas de la détection directe, 25 le substrat comprend une première partie spécifique de l'activité enzymatique et un deuxième partie faisant office de marqueur, qui peut être chromogène ou fluorescente. Le substrat peut être également un substrat métabolique, tel qu'une source de carbone ou d'azote, dont le produit de dégradation fait varier le pH, variation détectable gràce à un indicateur de pH. L'indicateur de pH est une substance chimique dont la couleur 30 varie en fonction de modifications du pH associées à la croissance microbienne. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Dans un second mode de réalisation, l'indicateur de pH est un fluorophore (par exemple la 4- méthylumbelliferone, les dérivés de 1'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine). 35 Le milieu de culture, objet de l'invention, peut être sous forme de poudre, sous forme de gel ou sous forme liquide, prêtes à l'emploi, c'est-à-dire prêtes pour l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Pétri. Dans le cas d'un milieu gélifié, l'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Enfin, le milieu peut être conditionné dans une bouteille, une cartouche ou une carte spécifiques d'un appareil automatisé de bactériologie (on citera à titre d'exemple la carte Vitek�, la carte Tempo� et la bouteille BacT/ALERT�). Le milieu de culture et la méthode de dénombrement précis, objets de l'invention, sont utilisés pour des échantillons d'origine alimentaire, environnementale ou clinique. L'échantillon est défini comme une petite partie ou petite quantité isolée d'une entité pour l'analyse. Parmi les échantillons d' origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'oeufs, de fruits, de légumes, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). A titre d'illustration, on citera le large éventail de produits alimentaires prêts-à-consommer testés par Kelly et al. pour la présence de souches productrices de bactériocines (Kelly et al., 1996 ; Int J Food Microbiol, 33 : 209-218) ; on se reportera également aux exemples 2 et 3 développés infra. Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés comprenant les exemples pré-cités. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment que des farines animales. On mentionnera aussi les échantillons liés à l'environnement tels les prélèvements de surface, d'eau, d'air. Les échantillons d'origine clinique peuvent correspondre à des prélèvements de sang total, de sérum, de plasma, d'urine, de fécès, de liquide céphalo-rachidien, des prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaie, d'organe, de tissu ou de cellules isolées etc. Si l'on prend l'exemple d'un prélèvement de selles, celui-ci peut contenir des lactobacilles dont la pousse inhibe la croissance des bactéries des genres Staphylococcus et Listeria, en libérant des bactériocines. L'invention concerne également un procédé de détection et/ou numération de bactéries cibles comprenant les étapes consistant à : • mettre en contact un échantillon dans lequel on souhaite mettre en évidence des desdites bactéries cibles et susceptible de contenir des bactériocines avec un milieu de culture selon l'invention, apte à la croissance desdites bactéries et comprenant au moins un inhibiteur des bactériocines en quantité adaptée à l'inhibition, soit compris entre 0.01 g/1 et 10 g/1; • incuber l'ensemble à une température favorisant la multiplication bactérienne, comprise entre 20 et 44°C, pour produire des colonies bactériennes de taille suffisante pour effectuer leur dénombrement. Cette incubation est réalisée sur une durée comprise entre 16 et 96h, préférentiellement comprise entre 22 et 48h et plus préférentiellement inférieure à 48h. L'invention concerne enfin l'utilisation in vitro d'au moins un inhibiteur de bactériocines dans un milieu de culture destiné à la croissance, à la détection, à l'identification et/ou à la numération de microorganismes d'intérêt potentiellement présents dans un échantillon, et en particulier des bactéries à Gram positif. De façon avantageuse, l'inhibiteur est le glutathion, utilisé à une concentration comprise entre 0.5 et 10 g/l. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 : Effet du Glutathion sur la croissance de Staphylococcus aureus en milieu type Chapman Une gamme de concentration de Glutathion a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 0,05 ; 0,15 ; 0,5 ; 1,5 et 5 g/1 de Glutathion. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland afin d'obtenir un taux de contamination attendu autour de 10' Unités Formant Colonies (UFC). Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés en nombre de UFC. Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-dessous : TABLEAU I Glutathion à 0 g/I à 0,05 g/I à 0,15 g/I à 0,5 g/I à 1,5 g/I à 5 g/I souches nbre UFCnbre UFCnbre UFCnbre UFCnbre nbre UFC UFC Staphylococcus 18 14 5 20 4900 ininterprétable aureus 97 04 026 Staphylococcus 4900 4900 4900 4900 4900 ininterprétable aureus 87 12 082 Staphylococcus Exemple 2: Effet du Glutathion sur l'énumération de Staphylococcus aureus isolé d'un produit alimentaire contenant des bactériocines Une gamme de concentration de Glutathion a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 0,05 ; 0, 15 ; 0,5 ; 1,5 et 5 g/1 de Glutathion. L'échantillon alimentaire testé est un fromage, un reblochon au lait cru, contenant un taux élevé de S. aureus difficilement détectable du fait de la présence de bactériocines dans le produit. La matrice alimentaire est broyée dans un diluant. 1 ml du broyat est mélangé à 3 ml de milieu de culture. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés en nombre de UFC/g d'aliment. Parallèlement, la méthode de référence ISO 6888-2 a été réalisée. Elle consiste à mélanger 1 ml de broyat à 20 ml de milieu gélosé Baird-Parker RPF. Les conditions d'incubation sont de 24 h à 37°C. Les résultats sont également exprimés en nombre d' UFC/g. Les résultats sont présentés dans le tableau II ci-dessous : TABLEAU II Glutathion Produit testé à0g/I nbre UFC/g à 0,05 g/I nbre UFC/g à 0,15 g/I nbre UFC/g à 0,5 g/I nbre UFC/g à1,5g/I nbre UFC/g Milieu Baird Parker RPF Reblochon 540 310 100 410 49000 57000 Les concentrations faibles en Glutathion montrent qu'en milieu liquide la numération en S. aureus est très inférieure à la numération obtenue avec la méthode de référence. En milieu liquide, l'action des bactériocines est très importante. La dilution du produit alimentaire est très faible en milieu liquide comparativement à la méthode de référence ISO 6888-2 où 1 ml est mélangé à 20 ml de milieu gélosé. D'après ce tableau, il est possible de remarquer qu'en présence de Glutathion à 1,5 g/1 la numération obtenue sur le milieu est pratiquement identique à celle observée avec la méthode de référence. Exemple 3: Effet du Glutathion sur l'énumération de Staphylococcus aureus isolé 25 d'autres produits alimentaires. Deux milieux de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar et contenant respectivement 0 et 1,5 g/1 de Glutathion ont été comparés. Comme précédemment, l'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les échantillons alimentaires testés sont : un fromage de chèvre frais et un fromage de vache au lait cru (morbier). La matrice alimentaire est broyée dans un diluant. 1 ml du broyat est mélangé à 3 ml de milieu de culture. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés en nombre de UFC/g d'aliment. Parallèlement, la méthode de référence telle que décrite dans l'exemple 2, permet d'estimer la contamination réelle du produit alimentaire en staphylocoques à coagulase positive. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-dessous : TABLEAU III Glutathion Produit testé à 0 g/I nbre UFC/g à 0,05 g/I nbre UFC/g Milieu Baird Parker RPF Fromage de chèvre frais 43 210 250 Morbier 210 1600 1100 Comme dans l'exemple 2, la présence de Glutathion dans ce milieu permet d'obtenir une numération concordante avec celle observée sur la méthode de référence alors que le milieu sans Glutathion montre une sous-numération importante (environ de 1 Log) des Staphylococcus aureus.20 REVENDICATIONS 1. Milieu de culture de microorganismes, comprenant : • au moins un substrat spécifique, naturel ou synthétique, permettant la détection d'au moins une activité enzymatique ou métabolique desdits microorganismes, • au moins un inhibiteur de bactériocines. 2. Milieu selon la revendication 1 caractérisé par le fait que l'inhibiteur de bactériocines est le glutathion. 3. Milieu selon les revendications 1 ou 2, comportant en outre un indicateur de pH permettant de révéler la consommation du substrat, ledit indicateur de pH étant préférentiellement un chromophore ou un fluorophore. 4. Milieu selon les revendications 1 ou 2, dans lequel le substrat comprend une première partie spécifique de l'activité enzymatique ou métabolique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur chromogène. 20 5. Milieu selon les revendications 1 ou 2, dans lequel le substrat comprend une première partie spécifique de l'activité enzymatique ou métabolique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur fluorescent. 6. Procédé de détection et/ou numération de microorganismes comprenant les étapes 25 consistant à : • mettre en contact un échantillon dans lequel on souhaite mettre en évidence lesdits microorganismes et susceptible de contenir des bactériocines avec un milieu réactionnel apte à la croissance desdits microorganismes et comprenant au moins un inhibiteur des bactériocines en quantité adaptée à l'inhibition et 30 comprise entre 0,1 et 10 g/1, • incuber l'ensemble, à une température favorisant la multiplication bactérienne, comprise entre 20 et 44°C, et selon une durée adaptée pour produire des colonies bactériennes de taille suffisante pour effectuer leur dénombrement.15 7. Utilisation in vitro d'un inhibiteur de bactériocines dans un milieu de culture pour favoriser la croissance, la détection, l'identification et/ou la numération de microorganismes. 8. Utilisation in vitro d'un inhibiteur de bactériocines selon la revendication précédente caractérisée en ce que ledit inhibiteur est le glutathion, à une concentration comprise entre 0.5 et 10 g/1.