Brevet FR2920543A1 — publié le 20090306

L'invention concerne un procédé de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. De telles membranes peuvent notamment être des membranes artificielles ou naturelles telles que des épithéliums provenant de tout organisme vivant. L'invention concerne encore un dispositif pour la mise en oeuvre dudit procédé, pour la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. L'invention entre dans le domaine de la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. Les molécules ou substances auxquelles il est fait référence sont généralement extérieures aux organismes vivants. Elles peuvent pénétrer à l'intérieur des organismes vivants par plusieurs voies, par exemple chez l'homme la voie respiratoire, la voie digestive par le biais notamment des muqueuses de l'appareil digestif ou encore par toute voie épithéliale, notamment par absorption cutanée. Dans ce contexte, on qualifie ces molécules ou substances de � xénobiotiques �. De manière pertinente, ces molécules ou substances peuvent, de manière illustrative et non exhaustive, être contenus dans l'air ambiant, peuvent être constitués par des solvants, notamment industriels, ou encore contenus dans des cosmétiques sous toutes leurs formes galéniques ou des médicaments topiques, y compris sous forme de gels ou crèmes. Plus particulièrement, l'expression � molécules ou substances � est employée dans le présent exposé pour définir toute molécule naturelle, synthétique ou semi-synthétique, ainsi qu'un groupement de molécules non forcément identiques, dans une phase liquide, semi-liquide, semi-solide, gaz ou vapeur, ou encore tout agent biologique comme des virus, des toxines, des débris bactériens, des médiateurs cellulaires, des chemokines, des cytokines, ou encore des facteurs de croissance. Il est ainsi entendu que l'invention s'intéresse plus particulièrement à la pénétration ou passage de molécules ou substances, toxiques ou non, au travers de membranes protectrices, notamment des organismes vivants. Ces membranes peuvent principalement être de la peau, naturelle ou artificielle, mais aussi toute membrane pouvant jouer le rôle d'enveloppe protectrice ou d'une voie de pénétration. Une membrane totalement artificielle comme par exemple, celle formée par l'application d'un gant, par exemple en latex, sur la peau, de part sa fonction d'enveloppe protectrice, sera considérée comme une membrane au sens du présent exposé. Nous évoquerons principalement le cas des membranes constituées de peau et de l'absorption cutanée, étant entendu, selon ce qui précède, que d'autres membranes peuvent être sujettes à l'étude de leur perméabilité à des molécules ou substances. Par ailleurs, certaines molécules passent plus rapidement au travers de la peau qu'elles n'investiraient l'organisme par la voie respiratoire ou cutanée. Les expérimentations in vivo de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de la peau sont difficiles et de toute manière limitées par la législation. Par conséquent, les expérimentations ex vivo ou in vitro utilisant des prélèvements chirurgicaux de peau, dans des appareillages adaptés, sont les plus judicieuses. Le plus couramment utilisé de ces appareillages est certainement le dispositif appelé � Cellule de Franz � (Franz T.J, J Invest Dematol, 64:190-195; 1975), qui permet de déterminer la cinétique de passage percutané de molécules ou substances à travers les différentes couches de la peau, telles que l'épiderme ou le derme, ou encore une couche telle que le Stratum Corneum, qui correspond à la couche superficielle de l'épiderme. En outre, un tel dispositif peut aussi permettre d'évaluer l'effet, sur cette cinétique, de différents excipients entrant dans la composition des formes galéniques dans lesquelles les molécules ou substances sont incorporés, y compris en fonction de la quantité des différents excipients utilisés. En fait, comme illustré en figure 1, une cellule de Franz classique se compose d'un compartiment formant un � milieu donneur � et d'un compartiment formant un � milieu récepteur � séparés par exemple par un échantillon de peau ou toute autre membrane. Le milieu donneur contient, généralement et par exemple sous forme gazeuse, le ou les molécules ou substances, c'est-à-dire un échantillon comprenant lesdites molécules ou substances, dont on veut étudier la pénétration percutanée. Le milieu récepteur contient quant à lui un fluide, généralement un liquide, permettant de capter les molécules ou substances, qui, venant du milieu donneur, ont traversé la membrane. Pour une meilleure simulation du derme voire du sang, qui lui sert de modèle, le milieu récepteur est généralement thermostaté pour une régulation de sa température, et agité pour simuler les mouvements de fluides ou de la circulation sanguine. Le milieu récepteur comprend encore un port d'échantillonnage permettant de faire les prélèvements nécessaires pour, après analyse de leur contenu en molécules ou substances, réaliser la cinétique de la pénétration des molécules ou substances au travers de la peau en fonction du temps. Cependant, ce dispositif classique ne tient pas compte de certains facteurs influant la pénétration percutanée de molécules ou substances, ou plutôt, il n'autorise, comme conditions de l'expérience, que les conditions physiques de l'endroit où il est employé, en particulier dans ses paramètres atmosphériques de l'endroit. Des variables, telles que la température, l'humidité relative du milieu extérieur, la pression, ne sont pas contrôlées. Ces paramètres dépendent de l'environnement dans lequel les expériences sont faites. Or, le point de départ du procédé et dispositif selon l'invention est qu'il est apparu que de telles variables pouvaient avoir une forte influence sur la pénétration percutanée par des molécules ou substances, outre d'autres paramètres comme la polarités des molécules pénétrantes, leur concentration, ou encore le type de peau (par exemple saine, malade, grasse, sèche, normale, et selon l'âge et le sexe de l'individu auquel elle appartient...). Ainsi, si certains auteurs ont relatés des expériences de détection et quantification de pénétration percutanée par des molécules ou substances dans des conditions ponctuelles par exemple de température et d'humidité, celles-ci ne peuvent par conséquent donner lieu à des règles générales du fait de la dépendance des résultats de ces variables environnementales. Ainsi, c'est dans le cadre d'une démarche inventive, imbriquée dans le constat mentionné précédemment et soutenue par d'autres expériences, que l'on a imaginé un procédé et un dispositif permettant de contrôler un certain nombre de variables environnementales lors de la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. Ce même constat a également conduit à la construction d'un appareillage pour contrôler les paramètres déterminant le passage de molécules ou substances en forme gazeuse, ou solution, ou émulsion, ou toute autre forme de préparation liquide, ou semi-liquide, à travers différentes membranes biologiques ou artificielles. Ainsi, l'invention concerne un procédé de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on règle la température dans une enceinte fermée définissant un milieu dit � donneur �, contenant des molécules ou substances à étudier, à l'aide de moyens de réglage de la température ; - on règle l'humidité dans ladite enceinte fermée définissant le milieu � donneur � à l'aide de moyens de réglage de l'humidité ; - on place au moins une membrane entre, d'une part 35 l'enceinte définissant le milieu � donneur �, et d'autre part une enceinte définissant un milieu � récepteur �, ladite membrane étant au contact, directement ou au travers d'une enceinte supplémentaire, du contenu de l'enceinte définissant le milieu � donneur �, et également au contact du contenu de l'enceinte définissant le milieu � récepteur � ; - on procède à la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de la membrane disposée selon l'étape précédente. Avantageusement, préalablement à la mise en place de la membrane, l'on pourra régler la pression dans ladite enceinte fermée définissant le milieu � donneur � à l'aide de moyens de réglage de la pression. Selon une autre caractéristique, l'on contrôle les valeurs de température, d'humidité, et, le cas échéant, de pression une fois réglées. Selon une autre particularité de l'invention, l'on place plusieurs membranes entre une enceinte définissant un seul milieu � donneur � d'une part, et plusieurs milieux � récepteur � d'autre part, lesdites membranes étant au contact, directement ou au travers d'enceintes supplémentaires, du contenu dudit même milieu � donneur �, et également du contenu d'autant de milieux � récepteur � que de membranes ainsi disposées, et que l'on procède à la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de plusieurs de ces membranes ainsi disposées. Avantageusement, l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances au travers de la ou des membranes est réalisée par prélèvement, dans le milieu � récepteur �, d'au moins un échantillon dudit milieu � récepteur �, en vue de la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances dans ledit échantillon. L'invention permet encore de réaliser plusieurs prélèvements d'échantillons au cours du temps ainsi que, suite au prélèvement, détecter quantitativement leurs contenus en molécules ou substances, afin de notamment réaliser une cinétique de la pénétration en molécules ou substances au travers de la ou des membranes au cours du temps. Alternativement, l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans la ou les membranes est réalisée par prélèvement de tout ou partie de ladite ou lesdites membranes, et la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances est réalisée dans tout ou partie de ladite ou lesdites membranes prélevés. L'invention permet de réaliser en plus une étape d'études statistiques sur les résultats indépendants de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de plusieurs de ces membranes ainsi disposées. L'invention concerne encore un dispositif pour la mise en oeuvre dudit procédé selon l'invention, de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants, comprenant une enceinte apte à être rendue hermétique définissant un milieu � donneur � et au moins une seconde enceinte apte à être rendue hermétique définissant un milieu � récepteur �, les deux enceintes étant séparées par au moins un échantillon de membrane dont on souhaite détecter et quantifier les caractéristiques de pénétration à certains molécules ou substances, caractérisé en ce que le dispositif comporte au moins des moyens de réglage de la température et au moins des moyens de réglage de l'humidité dans le milieu � donneur �. Avantageusement, le dispositif comporte en plus des moyens de réglage de la pression dans le milieu � donneur �. Selon une particularité de l'invention, le dispositif peut comporter une enceinte supplémentaire de confinement située entre le milieu � donneur � et l'échantillon de membrane. Selon une particularité de l'invention, le dispositif comporte des moyens pour isoler la membrane du contact avec le milieu � donneur �, celui-ci étant notamment en conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression pouvant être obtenues par ledit dispositif. Ces moyens peuvent être constitués par un obturateur mobile, par exemple une soupape. Avantageusement, le dispositif selon l'invention comporte plusieurs enceintes définissant des milieux � récepteur � isolés les uns des autres, de manière à pouvoir traiter en parallèle plusieurs échantillons de membrane soumis aux conditions physiques de l'enceinte de confinement et/ou celle définissant le milieu � donneur �. Les avantages qui découlent de la présente invention consistent, essentiellement, en la maîtrise des paramètres température et humidité dans l'enceinte formant le milieu � donneur �, ainsi que le paramètre pression, par rapport à l'art antérieur. D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre se rapportant à un exemple de réalisation donné à titre indicatif et non limitatif. La compréhension de cette description sera facilitée en se référant aux dessins ci-joints, dans lesquels : la figure 1 est une représentation schématisée en élévation d'une Cellule de Franz conforme à l'état de la 20 technique ; -la figure 2A est une représentation schématisée en coupe longitudinale d'un dispositif selon l'invention ; - la figure 2B est une coupe selon IIB-IIB de la figure 2A ; 25 la figure 2C est une coupe selon 11C-IIC de la figure 2A ; la figure 3 est une représentation en coupe partielle d'un mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention ; la figure 4 est une représentation de trois-quarts 30 face du mode de réalisation de la figure 3. Tel que visible dans les figures des dessins ci-joint, la présente invention concerne le domaine de la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes 35 vivants. Plus particulièrement, l'invention permet d'apporter une solution à la maîtrise de certains paramètres environnementaux lors d'expériences de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes, notamment la peau. On notera que, dans le cadre de cet exposé, ces expériences font toujours intervenir un milieu � donneur � contenant au départ des molécules ou substances, et un milieu � récepteur �, les deux milieux étant confinés dans des enceintes hermétiques séparés par une membrane, notamment de la peau. A propos de la peau, il est apparut que la fixation d'eau dans le Stratum Corneum est fonction de l'humidité relative du milieu extérieur. Pour une humidité relative inférieure ou égale à 60%, la fixation en eau dans le Stratum Corneum est inférieure ou égale à 1o%. Pour une humidité relative d'environ 90%, cette fixation augmente de 50%. Il en résulte un gonflement de la surface cutanée, une séparation des cellules qui facilitent la pénétration. De la même manière, la température du milieu extérieur peut avoir une influence sur la pénétration cutanée. Par exemple, une préparation contenant une molécule ou substance peut devenir plus fluide suite à une élévation de température, favorisant la pénétration dudit molécule ou substance au travers de la barrière cutanée. L'influence de la température et de l'humidité sur la pénétration percutanée a également été démontrée par des études de la pénétration percutanée du propoxur (Meuling et al, 1997), un pesticide, et du butoxyethanol (Jones et al, 2003), un éther glycol utilisé notamment dans les peintures, dans le cadre d'expériences réalisées in vivo sur des volontaires humains. Ces expériences ont clairement montré une corrélation entre l'augmentation de la température et de l'humidité d'une part, et l'augmentation de la pénétration percutanée d'autre part. Ce phénomène peut être retrouvé dans le cas de l'occlusion d'une partie de surface cutanée, par exemple par un pansement, qui induit une augmentation de l'hydratation et de la température de la peau. Pour autant, cette occlusion augmente l'absorption de molécules moyennement lipophiles et a un effet faible sur des molécules très lipophiles (Makki et al, 1996). On voit ainsi que l'étude des paramètres température et humidité est à étudier cas par cas, en fonction des molécules ou substances d'intérêt. La pression étant corrélée mathématiquement et physiquement avec la température, sa variation peut également influencer les expériences de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes. Ainsi la température, l'humidité relative du milieu extérieur, et la pression peuvent avoir une influence sur la pénétration percutanée par des molécules ou substances. L'invention concerne ainsi un procédé de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. On notera que le réglage de la température, de l'humidité, de la pression dans une enceinte de manière à maintenir ces paramètres constants implique au préalable l'isolement de cette enceinte, notamment sous forme d'une clôture hermétique. Si l'enceinte comporte des ouvertures, il est ainsi opportun de prévoir des bouchons ou tout dispositif similaire pour la clore avant tout réglage de paramètres. La présence de capteurs dans l'enceinte définissant le milieu � donneur � permet de visualiser les valeurs des paramètres obtenus, ouvrant la possibilité d'un rétro-contrôle des moyens permettant de les obtenir. Les moyens de réglage de la température peuvent être 30 constitués d'une double enveloppe thermostatée entourant l'enceinte définissant le milieu � donneur �. Les moyens de réglage de l'humidité relative à l'intérieur de l'enceinte définissant le milieu � donneur � peuvent être constitués par une solution saturée en sel placée 35 dans un réservoir à l'intérieur de ladite enceinte. Pour obtenir différentes humidités, une gamme de solutions saturées par différents sels pourra être utilisée. Les moyens de réglage de la pression à l'intérieur de l'enceinte définissant le milieu � donneur � sont conventionnels. Concrètement, la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances au travers de la ou des membranes peut être réalisée par prélèvement, dans le milieu � récepteur �, d'au moins un échantillon dudit milieu � récepteur �, généralement un liquide capteur des molécules ou substances étudiés, en vue de la détection, qualitative, puis quantification, de molécules ou substances dans ledit échantillon. Plus particulièrement, la détection et quantification de molécules ou substances peut être réalisée par des techniques comme la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC), et/ou Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG), et/ou Ultraviolets (UV), et/ou détection fluorimétrique, et/ou spectrométrie de masse (MS), et/ou suivi de radioactivité dans ledit échantillon prélevé, qui, on le rappelle, est néanmoins avantageusement un échantillon liquide, le milieu � récepteur � étant constitué d'un fluide apte à capter les molécules ou substances, et mimant la circulation sanguine. Un liquide est généralement employé. En réalisant plusieurs prélèvements d'échantillons au cours du temps et en détectant qualitativement puis surtout quantitativement leurs contenus en molécules ou substances, on peut ainsi réaliser une cinétique de la pénétration en molécules ou substances au travers de la ou des membranes au cours du temps. Alternativement, l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans la ou les membranes pourra être réalisée par prélèvement de tout ou partie de ladite ou lesdites membranes, et la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances, réalisée dans tout ou partie de ladite ou lesdites membranes prélevés. En effet, certaines molécules ou substances, par exemple contenues dans des cosmétiques, peuvent être retenues au niveau du derme ou de l'épiderme. Avantageusement, dans le cas de l'étude parallèle de plusieurs membranes, le procédé selon l'invention permet de réaliser, sur la base des résultats, indépendants les uns des autres, de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de plusieurs de ces membranes, une ou des étapes d'études statistiques sur les résultats obtenus. La réalisation d'études statistiques permet d'obtenir des résultats finaux plus précis et surtout plus fiables. L'invention concerne encore un dispositif pour la mise en oeuvre du procédé précédemment décrit, de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants. Les dispositifs existants, tels une cellule de Franz classique comme illustrée en figure 1, se composent d'un compartiment A formant un � milieu donneur � A et d'un compartiment B formant un � milieu récepteur � B séparés par exemple par un échantillon de peau C. Le milieu donneur A contient le ou les molécules ou substances dont on veut étudier la pénétration percutanée. Le milieu récepteur B contient quant à lui un fluide D, généralement un liquide, permettant de capter les molécules ou substances, qui, venant du milieu donneur A, ont traversé l'échantillon de peau C. Pour une meilleure simulation du sang, qui lui sert de modèle, le milieu récepteur est généralement thermostaté pour une régulation de sa température à l'aide d'un circuit de régulation E. Le milieu récepteur B comprend encore un port d'échantillonnage F permettant de faire les prélèvements nécessaires pour, après analyse de leur contenu en molécules ou substances, réaliser la cinétique pénétration d'une ou de molécules ou substances au travers de la peau en fonction du temps. Il apparaît clairement qu'un tel dispositif, correspondant à une cellule de Franz conforme à l'état de la technique, ne permet d'effectuer des détection et quantifications que dans les conditions physiques de température, humidité et pression de l'endroit où il est employé. Comme visible sur les figures 2A à 2C, qui représente sous une forme schématisée les détails du dispositif selon l'invention, l'invention a trait, plus particulièrement, à un dispositif 1 de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes 2 protectrices, notamment d'organismes vivants, comprenant une enceinte 3 apte à être rendue hermétique définissant un milieu � donneur � 3, formant une chambre d'exposition, et au moins une seconde enceinte 4 apte à être rendue hermétique définissant au moins un milieu � récepteur � 4, les enceintes 3 et 4 étant séparées par au moins un échantillon de membrane 2 dont on souhaite détecter et quantifier les caractéristiques de pénétration à certains molécules ou substances, caractérisé en ce que le dispositif 1 comporte au moins des moyens de réglage de la température 5, au moins des moyens de réglage de l'humidité 6 dans le milieu � donneur � 3. Selon un mode de réalisation, le dispositif 1 comporte encore au moins des moyens de réglage de la pression 7 dans le milieu � donneur � 3. Selon un mode de réalisation, les moyens de réglage de la température 5 sont constitués par une double enveloppe thermostatée 51 entourant l'enceinte 3 définissant le milieu donneur. Selon un mode de réalisation, les moyens de réglage de l'humidité 6 sont constitués par un réservoir 61 disposé dans l'enceinte 3 définissant le milieu donneur, pouvant contenir par exemple une solution eau-sel saturée, qui permet de créer un pourcentage d'humidité fixe, de 10 à 90%, dans l'enceinte 3. A titre d'exemple, l'emploi d'une solution aqueuse saturée en NaCl permet d'atteindre une humidité relative de 75% dans l'enceinte définissant le milieu � donneur �, correspondant à une humidité retrouvée par exemple sur le continent européen. L'emploi d'une solution saturée en NaOH permet d'obtenir une humidité relative de 25% dans ladite enceinte, correspondant à une humidité retrouvée par exemple sur le continent africain. Ces valeurs sont à peu près équivalentes pour une large gamme de température. Selon un mode de réalisation, les moyens de réglage de la pression 7 sont constitués par un régulateur de pression 71 connecté à l'enceinte 3 définissant le milieu donneur. Afin de pouvoir contrôler de manière optimale les paramètres que sont la température, l'humidité et la pression, des capteurs sont disposés dans l'enceinte définissant le milieu � donneur �. Les relevés des paramètres température, humidité et pression ainsi obtenus dans ladite enceinte se sont révélés stables dans le temps. Selon un mode de réalisation, l'enceinte 3 peut encore comprendre un réservoir 8 pour recevoir un solvant volatil ou une solution comprenant une molécule ou substance volatile, notamment une molécule ou substance dont on veut détecter et quantifier la pénétration dans ou au travers de la membrane 2, la diffusion de ladite molécule ou substance dans l'enceinte 3 étant obtenue de part sa volatilité. Les molécules ou substances dont la détection et quantification de la pénétration au travers d'une membrane est recherchée pourront se trouver sous forme gazeuse dans l'enceinte 3, mais également pulvérisées sous forme liquide, ou encore semi-liquide, c'est-à-dire par exemple sous forme d'un gel ou d'une émulsion à appliquer directement sur la membrane 2 à tester. Selon un mode préféré de réalisation, le dispositif 1 selon l'invention comprend plusieurs enceintes 4, numérotées 41, 42, 43, 44, 45, 46, sur la figure 2A, et donc plusieurs milieux récepteurs isolés les uns des autres, permettant avantageusement d'exposer, au besoin, simultanément et/ou parallèlement plusieurs membranes 2 au même milieu donneur 3, et de réaliser des détection et quantifications indépendantes de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers des membranes 2 testées, et ainsi, par exemple, permettre une étude statistique de la pénétration sur plusieurs membranes 2. On pourra également prévoir des orifices 14 à l'enceinte 3, pour la circulation d'un fluide, notamment gazeux, prévus par exemple à des fins de maintenance ou de circulation de fluide dans l'enceinte 3. Les figures 3 et 4 illustrent un mode particulier de réalisation avec six enceintes 4. Dans le cas de membranes 2 formées par des échantillons de peau, ceux-ci pourront, pour une étude statistique, être prélevés au même endroit sur le corps, par exemple en symétrie gauche/droite sur l'abdomen. Naturellement, dans un mode particulier de réalisation, le dispositif 1 selon l'invention pourra également ne comprendre qu'une seule enceinte 4. Le ou les enceintes 4 formant le milieu � récepteur �, qui peuvent être thermostatées, contiennent un fluide, préférentiellement un liquide, apte à capter des molécules de molécules ou substances qui pourraient traverser la ou les membranes 2. A titre d'exemple, ce fluide peut être constitué en tout ou partie d'albumine, de sérum physiologique comportant des sels et/ou de l'albumine ou même de sang, cette option rendant cependant difficile le dosage des molécules ou substances qui pourraient être captés par le milieu récepteur. Idéalement, la polarité du liquide capteur dans ledit milieu récepteur doit être compatible avec la polarité de la molécule ou substance dont on étudie la pénétration au travers de la membrane. Selon un mode de réalisation, le ou les enceintes 4 comportent encore des moyens d'agitation 9 du fluide contenu dans lesdites enceintes 4, sous forme par exemple d'un agitateur magnétique 9. Ceci permet avantageusement de simuler les mouvements circulatoires du sang chez les organismes vivants, notamment dans le cas où la membrane 2 employée est de la peau. La simulation est encore améliorée par la régulation de température effectuée au niveau de ou des enceintes 4, à l'aide, par exemple et conformément à l'état de la technique, d'un circuit de régulation E de la température. Avantageusement, le dispositif selon l'invention comprend encore des moyens pour isoler la membrane 2 du contact avec les conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression pouvant être obtenus dans l'enceinte 3 dudit dispositif. Ainsi qu'illustré en figures 2A et 2C, ceci est avantageusement obtenu par l'emploi d'un obturateur mobile 10, par exemple une � soupape � constituée d'un piston 10 dont la tête permet d'étanchéifier une ouverture dans l'enceinte 3, plus particulièrement une ouverture en regard de laquelle la membrane 2 est disposée lors du montage de l'ensemble formé par les enceintes 3 et 4 et la membrane 2 entre elles. Cet obturateur mobile 10 permet, en position de fermeture, d'isoler la membrane 2 du contenu en molécule ou substance présent dans le milieu � donneur �, notamment afin de préserver des conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression dans l'enceinte 3 définissant le milieu � donneur � hermétiquement close, et en position d'ouverture, permet le contact entre ladite enceinte 3 définissant le milieu � donneur � et ledit échantillon de membrane 2 placé au contact du milieu � donneur � grâce à l'ouverture de l'obturateur mobile 10. Selon un mode particulier de réalisation, l'obturateur 10 est conçu apte à contenir un fluide, une lotion, une émulsion, qui pourra ainsi être étendu sur la membrane 2 lors d'un contact avec l'obturateur 10, par exemple avant le passage du piston 10 en position d'ouverture. Notamment, l'obturateur 10 peut être constitué par le corps d'une seringue ou similaire, en outre conçu apte à déposer un produit contenant des molécules ou substances sur la membrane 2. D'autres variantes conventionnelles d'un obturateur pourront être utilisées. La figure 3 illustre, par une représentation en coupe partielle, un mode de réalisation d'un dispositif selon l'invention comprenant une enceinte 11 supplémentaire de confinement située entre le milieu � donneur � et l'échantillon de membrane 2. Dans un tel mode de réalisation, le dispositif 1 selon l'invention comporte avantageusement, entre l'enceinte 3 définissant le milieu � donneur � d'une part et l'enceinte 11 supplémentaire de confinement fermé à l'une de ses extrémités par la membrane 2 d'autre part, au moins un obturateur 10 mobile, par exemple une soupape, permettant, en position de fermeture, d'isoler le milieu � donneur � de l'enceinte 11 supplémentaire de confinement, notamment afin de préserver des conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression dans l'enceinte définissant le milieu � donneur � hermétiquement close, et en position d'ouverture, un libre échange entre l'enceinte 11 supplémentaire de confinement et l'enceinte 3 définissant le milieu � donneur �. Comme illustré sur la figure 3, le dispositif 1 selon ce mode de réalisation comporte une double enveloppe thermostatée 51, ainsi qu'un circuit de régulation de température E de l'enceinte formant le milieu � récepteur �, et un port d'échantillonnage F. Une sauterelle 12 permet de disposer la membrane 2 à l'interface entre les enceintes 11 et 4. Il est possible de disposer un agitateur magnétique 9 dans l'enceinte du milieu � récepteur �, couplé à son poste de 25 commande 9 situé sous ladite enceinte. La figure 4 est une représentation de trois-quarts face du même mode de réalisation, dévoilant les multiples enceintes définissant des milieux � récepteur � isolés les uns des autres, de manière à pouvoir traiter en parallèle plusieurs échantillons 30 de membrane soumis aux conditions physiques de l'enceinte de confinement 11, identiques à celles de l'enceinte 3 définissant le milieu � donneur � une fois l'obturateur 10 mobile en position d'ouverture. Cette figure met en évidence deux bouchons 13 de fermeture, 35 notamment d'un réservoir 61, contenant une solution de sel saturée, et d'un réservoir 8, pouvant contenir une solution volatile contenant des molécules ou substances à tester. Conformément au procédé détaillé auparavant, la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances au travers de la ou des membranes peut être réalisée par prélèvement, dans le milieu � récepteur �, d'au moins un échantillon dudit milieu � récepteur �, en vue de la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances dans ledit échantillon. Alternativement, l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans la ou les membranes pourra être réalisée par prélèvement de tout ou partie de ladite ou lesdites membranes, et la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances, réalisée dans tout ou partie de ladite ou lesdites membranes prélevés. Par exemple, certaines molécules ou substances de cosmétiques peuvent rester dans l'épiderme. Cela peut être notamment le cas d'actifs destinés à agir sur la coloration de la peau, notamment par bronzage. On verra alors sans mal l'intérêt d'associer au dispositif 1 un générateur de rayons U.V ou Infrarouge, par exemple pour étudier l'influence de ces rayonnements sur la pénétration percutanée, par exemple d'antioxydants. Selon une autre particularité de l'invention non illustrée, des études in-vivo peuvent encore être réalisées par le dispositif et procédé selon l'invention. On peut en effet utiliser une partie du corps d'un sujet d'examen en tant qu'enceinte 4 définissant le milieu � accepteur �, la membrane 2 alors formée par une partie de la surface cutanée du sujet d'examen étant dans ce cas intimement solidaire de ladite enceinte 4 hermétique selon l'invention, cette enceinte 4 étant constituée par l'espace sous-jacent à la surface cutanée, ladite partie de la surface cutanée formant membrane 2 étant appliquée hermétiquement à l'orifice de l'enceinte 3 formant milieu � donneur �. Concrètement, on pourra par exemple utiliser l'avant-bras d'une personne bien installée sur un fauteuil. La partie interne de l'avant- bras est alors bien fixée à l'enceinte 3 formant milieu � donneur � en assurant une étanchéité complète. Avant de fixer l'avant-bras, une sonde de microdialyse a été insérée au niveau du derme, où un solvant neutre, par exemple un liquide de Ringer, va assurer le lavage au niveau des tissus dermiques et va collecter à l'extérieur des échantillons qui donnent la possibilité de réaliser un dosage en continu à des heures fixes. La circulation du solvant est alors assurée par une pompe électrique. Ainsi, en réalisant plusieurs prélévements à différentes heures fixes, on peut établir une cinétique in-vivo de différents molécules ou substances traversant la peau vers la circulation générale. Le système de dépôt sur la peau de ces molécules ou substances est conforme à celui employé dans les études ex-vivo, comme précédemment décrit. Le dispositif selon l'invention permet ainsi l'étude et le contrôle de l'influence des conditions environnementales, comme la température, l'humidité relative ou la pression, sur la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes protectrices, notamment d'organismes vivants, par exemple la peau. Avantageusement dans son application à la pénétration percutanée, l'invention pourra permettre d'optimiser la pharmacocinétique cutanée de préparations galéniques, médicamenteuses ou cosmétiques, par exemple par choix optimal des adjuvants. Elle peut également permettre une meilleure évaluation des risques professionnels liés à l'exposition cutanée aux produits toxiques, non volatils et volatils. Les secteurs d'applications desdits procédé et dispositif selon l'invention peuvent être les tests dermo-cosmétiques de différentes formes galéniques comme les crèmes, les émulsions, les lotions, en permettant l'étude de l'absorption cutanée à différentes températures et humidités et une meilleure optimisation et adaptation d'une formulation aux situations climatiques réelles. L'invention trouve également son application dans le secteur de la parfumerie, où, outre les avantages cités précédemment, elle peut permettre de simuler des conditions réelles d'application sur le corps, en cas de conditions d'occlusion par des vêtements ou de contact direct avec une atmosphère ventilée, cette dernière situation rendant possible un phénomène de compétition entre la pénétration percutanée et l'évaporation favorisée par la ventilation. L'invention peut également permettre d'évaluer les risques de contamination de la peau suite à son exposition à des contaminants industriels, ou évaluer l'efficacité des crèmes barrières en apposant cette dernière sur la peau testée, ou encore évaluer la perméabilité des articles de protection personnelle comme des gants ou des combinaisons, formant des membranes surprotectrices de la peau. L'invention trouvera également son application dans l'évaluation des risques liés à l'exposition de la peau à la pollution atmosphérique, par exemple les Composés Organiques Volatils (C.O.V), souvent présents dans les milieux de travail industriels, ou autres. Dans le secteur phytosanitaire et des produits à usage domestique, que ce soit les pesticides, insecticides ou insectifuges, par exemple une composition destinée à empêcher les piqûres de moustiques, les détergents ou les peintures, l'invention trouvera encore son application. De manière non exhaustive, l'invention trouvera également son application dans les domaines de la pharmacologie, de la médecine pharmacie-cosmétologie, de la toxicologie, de la médecine du travail.30 REVENDICATIONS 1) Procédé de détection et quantification ex vivo ou in vitro de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes (2) protectrices, notamment d'organismes vivants, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on règle la température dans une enceinte (3) fermée définissant un milieu dit � donneur �, contenant des molécules ou substances à étudier, à l'aide de moyens de réglage de la température (5) ; - on règle l'humidité dans ladite enceinte (3) fermée définissant le milieu � donneur � à l'aide de moyens de réglage 15 de l'humidité (6) ; - on place au moins une membrane (2) entre, d'une part l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur �, et d'autre part une enceinte (4) définissant un milieu � récepteur �, ladite membrane (2) étant au contact, directement ou au travers 20 d'une enceinte (11) supplémentaire, du contenu de l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur �, et également au contact du contenu de l'enceinte (4) définissant le milieu � récepteur � ; - on procède à la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de la 25 membrane (2) disposée selon l'étape précédente. 2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on contrôle, d'une part la température, d'autre part l'humidité, dans l'enceinte (3) fermée définissant un milieu dit � donneur �, contenant des molécules ou substances à étudier. 30 3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que, préalablement à la mise en place de la membrane (2), l'on règle la pression dans ladite enceinte (3) fermée définissant le milieu � donneur � à l'aide de moyens de réglage de la pression (7). 4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en l'on règle et on contrôle la pression dans ladite enceinte fermée (3) définissant le milieu � donneur �. 5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on place plusieurs membranes (2) entre une enceinte (3) définissant un seul milieu � donneur � d'une part, et plusieurs milieux � récepteur � d'autre part, lesdites membranes étant au contact, directement ou au travers d'enceintes (11) supplémentaires, du contenu dudit même milieu � donneur �, et également du contenu d'autant de milieux � récepteur � que de membranes (2) ainsi disposées, et que l'on procède à la détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de plusieurs de ces membranes (2) ainsi disposées. 6) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances au travers de la ou des membranes (2) est réalisée par prélèvement, dans le milieu � récepteur �, d'au moins un échantillon dudit milieu � récepteur �, en vue de la détection, qualitative ou quantitative, de molécules ou substances dans ledit échantillon. 7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la détection de molécules ou substances est réalisée par une détection et quantification par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC), et/ou Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG), et/ou Ultraviolets (UV), et/ou détection fluorimétrique, et/ou spectrométrie de masse (MS), et/ou suivi de radioactivité dans ledit échantillon prélevé. 8) Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que l'on réalise plusieurs prélèvements d'échantillons au cours du temps ainsi que la détection quantitative de leurs contenus en molécules ou substances, afin de notamment réaliser une cinétique de la pénétration en molécules ou substances au travers de la ou des membranes au cours du temps. 9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans la ou les membranes (2) est réalisée par prélèvement de tout ou partie de ladite ou lesdites membranes (2), et la détection et quantification de molécules ou substances est réalisée dans tout ou partie de ladite ou lesdites membranes (2) prélevés. 10) Procédé selon l'une des revendications 6 à 9 en combinaison avec l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on réalise en plus une étape d'études statistiques sur les résultats indépendants de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de plusieurs de ces membranes (2) ainsi disposées. 11) Dispositif (1) pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à Io, de détection et quantification de la pénétration de molécules ou substances dans ou au travers de membranes (2) protectrices, notamment d'organismes vivants, comprenant une enceinte (3) apte à être rendue hermétique définissant un milieu � donneur � et au moins une seconde enceinte (4) apte à être rendue hermétique définissant un milieu � récepteur �, les deux enceintes (3,4) étant séparées par au moins un échantillon de membrane (2) dont on souhaite détecter et quantifier les caractéristiques de pénétration à certains molécules ou substances, caractérisé en ce que le dispositif (1) comporte au moins des moyens de réglage de la température (5) et au moins des moyens de réglage de l'humidité (6) dans le milieu � donneur �. 14) Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comporte en plus des moyens de réglage de la pression 30 (7) dans le milieu � donneur � (3). 15) Dispositif selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une enceinte supplémentaire (11) de confinement située entre le milieu � donneur � (3) et l'échantillon de membrane (2). 35 14) Dispositif selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour isoler lamembrane (2) du contact avec le milieu � donneur �, celui-ci étant notamment en conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression pouvant être obtenues par ledit dispositif (1). 15) Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte, entre l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur � et l'échantillon de membrane (2), au moins un obturateur mobile (10), par exemple une soupape, permettant, en position de fermeture, d'isoler la membrane (2) du contenu en molécule ou substance présent dans le milieu � donneur �, notamment afin de préserver des conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression dans l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur � hermétiquement close, et en position d'ouverture, permettant le contact entre ladite enceinte (3) définissant le milieu � donneur � et ledit échantillon de membrane (2) placé au contact du milieu � donneur � grâce à l'ouverture de l'obturateur mobile (10). 16) Dispositif selon les revendications 13 et 14, caractérisé en ce qu'il comporte, entre l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur � d'une part et l'enceinte supplémentaire (11) de confinement fermé à l'une de ses extrémités par la membrane (2) d'autre part, au moins un obturateur mobile (10), par exemple une soupape, permettant, en position de fermeture, d'isoler le milieu � donneur � de l'enceinte (11) supplémentaire de confinement, notamment afin de préserver des conditions stabilisées de température, d'humidité et de pression dans l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur � hermétiquement close, et en position d'ouverture, un libre échange entre l'enceinte (11) supplémentaire de confinement et l'enceinte (3) définissant le milieu � donneur �. 17) Dispositif selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs enceintes (41,42,43,44,45,46) définissant des milieux � récepteur � isolés les uns des autres, de manière à pouvoir traiter en parallèle plusieurs échantillons de membrane (2) soumis aux conditionsphysiques de l'enceinte (11) de confinement et/ou celle (3) définissant le milieu � donneur �.