Brevet FR2913984A3 — publié le 20080926

FR 2913984 A3 20080926 FR 0754860 A 20070504 PRODUCTION D'ARTEMISININE A L'AIDE D'ENDIVE (Cichorium intybus) La présente invention concerne la production du médicament antimalarique, l'artémisinine, dans l'endive (Cichorium intybus). Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de production d'un ou de plusieurs composés intermédiaires se trouvant en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de l'artémisinine dans un plant d'endive ((Cichorium intybus), en l'occurrence un plant d'endive (Cichorium intybus) transgénique. La présente invention concerne aussi l'utilisation de l'endive (Cichorium intybus) pour produire de l'artémisinine. La malaria est une importante cause de décès dans beaucoup de pays en voie de développement. Suite au réchauffement de la Terre, l'aire de répartition de cette maladie ne cesse toutefois de s'étendre en direction de l'Europe du Sud et même de l'Europe centrale. On s'attend dès lors à ce que cette maladie devienne aussi un problème pour les pays plus développés. La maladie est principalement provoquée par le parasite Plasmodium falciparum (P. falciparum). Les moustiques sont une importante source de contamination par ce parasite. Cela parce que le développement de P. falciparum dans ces moustiques est une phase importante du cycle de croissance du parasite. Si des personnes sont piquées par un moustique qui porte en soi le parasite, elles courent un grand risque d'être infectées par P. falciparum par le biais de la piqûre du moustique. Si cette infection s'étend, c'est-à-dire si le parasite est en mesure de se multiplier dans le sang, le risque d'être atteint de la malaria est particulièrement grand. Pour le moment, l'un des principaux médicaments pour lutter contre la malaria est l'artémisinine ou ses dérivés dont on montre la structure chimique ci-dessous. Formule de la structure chimique de l'artémisinine L'artémisinine est un composé présent dans la nature que l'on isole des parties aériennes de la plante Artemisia annua 10 (A. annua). Mais comme les concentrations d'artémisinine dans cette plante sont basses, l'artémisinine est un médicament antimalarique relativement cher, ce qui est notamment un problème pour les pays en voie de développement où cette maladie se rencontre fréquemment. 15 Pour synthétiser l'artémisinine d'A. annua, on transforme en premier lieu le farnésyldiphosphate (FDP), un composé présent de manière générale dans les plantes, en amorpha-4, lldiène à l'aide de l'enzyme amorphadiènesynthase. Ensuite, l'amorpha-4,ll-diène est converti en acide 20 artémisinique et/ou en acide dihydroartémisinique au cours d'une série d'étapes chimiques et enzymatiques (voir ci-dessous). Une oxydation de l'acide dihydroartémisinique fournit finalement l'artémisinine.5 Formules de la structure chimique de l'acide artémisinique (à 5 gauche) et de l'acide dihydroartémisinique (à droite) On connaît la séquence du gène qui code l'amorphadiènesynthase d'A. annua, et elle est illustrée par exemple à la figure 10 du brevet européen numéro EP 1 108 041 10 au nom de The Institute for Oneworld Health. Le document EP 1 108 041 indique par ailleurs que la production naturelle d'artémisinine dans A. annua peut être accrue en transformant cette plante avec un gène recombinant de l'amorphadiènesynthase d'A. annua. 15 Le document EP 1 108 041 décrit aussi à l'exemple 5 la production d'amorpha-4,11-diène dans des plants de tabac transgéniques transformés avec le gène de l'amorphadiènesynthase d'A. annua. On sait donc que des plants (de tabac) transgéniques qui, 20 à l'état naturel, ne convertissent pas le farnésyldiphosphate (FDP) en amorpha-4,11-diène, peuvent être modifiés génétiquement de telle sorte que l'on obtienne cette activité de la première étape de la synthèse de l'artémisinine. Mais ainsi qu'on l'a déjà indiqué, la synthèse totale de 25 l'artémisinine comprend une série d'étapes (enzymatiques) additionnelles dont le document EP 1 108 041 ne précise pas qu'elles peuvent être exécutées - au moins partiellement - par d'autres plantes qu'A. annua. Un but de la présente invention est dès lors de procurer 30 la production d'artémisinine dans d'autres plantes qu'A. annua, lesquelles plantes sont en mesure d'exécuter au moins une partie de la suite de la voie de synthèse aval de l'artémisinine à partir d'amorpha-4,11-diène. A cet effet, la présente invention procure un procédé de production d'un ou de plusieurs composés intermédiaires se trouvant en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de l'artémisinine, consistant à : (a) réaliser un plant d'endive (Cichorium intybus) produisant de l'amorpha-4,11-diène ; (b) faire pousser ledit plant d'endive (Cichorium intybus), et (c) isoler dans ledit plant d'endive (Cichorium intybus) un ou plusieurs des composés intermédiaires se trouvant en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de l'artémisinine. La présente invention est basée sur la découverte surprenante qu'un plant d'endive contient à l'état naturel les activités de conversion nécessaires, telles que des enzymes, pour poursuivre la conversion de l'amorpha-4,11-diène dans les produits intermédiaires en aval sur la voie de synthèse de l'artémisinine. Cette découverte est d'autant plus surprenante que l'amorpha-4,11-diène n'est pas un composant présent à l'état 25 naturel dans un plant d'endive. En plus de l'existence des activités de conversion aval nécessaires, l'endive (Cichorium intybus) est une source exceptionnellement bonne de ces produits intermédiaires parce que cette plante ne contient guère de graisses qui 30 peuvent interférer lors de l'isolation ultérieure des produits intermédiaires dans la plante. Cela simplifie non seulement la purification des produits intermédiaires, mais la qualité du médicament antimalarique artémisinine finalement obtenu est aussi améliorée. Dans une forme de réalisation préférée de la présente invention, les composés intermédiaires de la voie de synthèse de l'artémisinine sont choisis dans le groupe composé de l'acide artémisinique et de l'acide dihydroartémisinique, l'acide dihydroartémisinique étant préféré. Ces composés peuvent être convertis en artémisinine par le biais de conversions chimiques relativement simples. L'acide artémisinique peut être converti par le biais d'une réaction de réduction (enzymatique) en acide dihydroartémisinique. En oxydant ensuite l'acide dihydroartémisinique, on obtient de l'artémisinine. De préférence, le plant d'endive (Cichorium intybus) produisant l'amorpha-4,11-diène est un plant d'endive (Cichorium intybus) transgénique, bien que l'on puisse également obtenir l'introduction de l'activité de conversion du farnésyldiphosphate (FDP) en amorpha-4,11-diène au moyen de procédés de croisement et de culture plus traditionnels et d'une purification ultérieure. Ces procédés peuvent être utilisés par exemple pour insérer un phénotype de l'activité de l'amorphadiènesynthase dans le plant d'endive. De préférence, on obtient selon la présente invention un plant d'endive transgénique en le transformant avec un gène, fonctionnellement lié à des séquences de transcription et de traduction appropriées, codant l'enzyme amorphadiènesynthase. De préférence, ce gène provient d'A. annua. Les procédés de réalisation d'une telle construction qui procure l'expression de l'amorphadiènesynthase dans l'endive (Cichorium intybus), sont connus de manière générale. C'est ainsi par exemple que le gène peut être placé sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CAMV) et que l'on peut utiliser le terminateur de la transcription de la nopaline synthase (queue nos) comme signal de terminaison. Un marqueur de sélection tel que la kanamycine peut être intégré dans la construction pour sélectionner des transformants positifs. Les procédés de transformation de l'endive (Cichorium 5 intybus) sont connus de manière générale, par exemple de par le document PCT/EPOO/02130. Comme on l'a déjà signalé, l'endive (Cichorium intybus) est une source particulièrement appropriée de produits intermédiaires de la voie de synthèse de l'artémisinine. C'est 10 pourquoi la présente invention concerne aussi l'utilisation de l'endive pour produire de l'artémisinine. Cette utilisation peut consister de préférence en l'isolation des produits intermédiaires en aval de l'amorpha-4,11-diène et en une oxydation (chimique) ultérieure 15 en artémisinine. L'isolation d'artémisinine dans le présent plant d'endive lui-même est également envisagée. La présente invention concerne aussi un procédé de production d'artémisinine consistant à : (a) procurer un plant d'endive (Cichorium intybus)produisant de l'amorpha-4,11-diène ; (b) faire pousser ledit plant d'endive (Cichorium intybus) ; (c) isoler dans ledit plant d'endive (Cichorium intybus)un ou plusieurs composés intermédiaires se trouvent en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de l'artémisinine, et (d) poursuivre la modification des composés intermédiaires en artémisinine. Dans le présent procédé, les composés intermédiaires de 30 la voie de synthèse de l'artémisinine sont choisis de préférence dans le groupe composé de l'acide artémisinique et de l'acide dihydroartémisinique, le composé intermédiaire acide dihydroartémisinique étant le plus préféré. 20 25 De préférence, le présent plant d'endive (Cichorium intybus) produisant l'amorpha-4,11-diène est un plant d'endive transgénique. De préférence, le plant d'endive produisant l'amorpha-4,11-diène comprend un gène, fonctionnellement lié à des séquences de transcription et de traduction appropriées, codant l'enzyme amorphadiènesynthase, de préférence provenant d'A. annua. De préférence, la modification consiste en une oxydation 10 de l'acide dihydroartémisinique en artémisinine. La présente invention sera décrite plus avant à l'aide des exemples suivants. Exemples leY exemple : Mise en évidence d'une activité de conversion de l'amorpha-4,11-diène dans l'endive On a préparé un extrait enzymatique d'endive selon le 20 procédé qui est décrit par De Kraker et al., Plant Physiol. ; 125 : 1930-1940. L'incubation de cet extrait avec de l'amorpha-4,11-diène en présence de NADP+ à un pH de 10 procure la formation d'acide artémisinique et d'acide dihydroartémisinique. 25 Il est démontré par là que l'endive (Cichorium intybus) possède à l'état naturel les activités nécessaires pour poursuivre la conversion de l'amorpha-4,11-diène vers les produits en aval sur la voie de synthèse de l' artémisinine. 30 2e exemple : Conversion de l'amorpha-4,11-diène par des cultures de cellules d'endive (Cichorium intybus) 15 Des cultures de cellules d'endive (Cichorium intybus) ont été incubées pendant une semaine avec de l'amorpha-4,11-diène. Après une semaine, les produits réactionnels ont été extraits du milieu de culture, ce pour quoi il a été fait usage de pentane/éther. Les produits réactionnels ont été caractérisés à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse. Une conversion efficace de l'amorpha-4,11-diène en l'alcool correspondant (artémisinol) a pu être détectée. Cette expérience démontre que les cellules d'endive possèdent à l'état naturel l'activité nécessaire pour poursuivre la conversion de l'amorpha-4,11-diène en un produit en aval sur la voie de synthèse de l'artémisinine. 3e exemple : Transformation de l'endive avec le gène de l'amorphadiènesynthase On a transformé de l'endive (Cichorium intybus) comme décrit dans le document PCT/EP00/02130 (Bouwmeester et al., 1999b) avec une construction contenant le gène de l'amorphadiènesynthase sous le contrôle de séquences de transcription et de traduction appropriées. Après régénération, les plants transgéniques ont été testés pour rechercher la présence d'une activité de synthèse d'amorpha- 4,11-diène. A cet effet, 100 mg de tissu, broyés dans de l'azote liquide, ont été extraits dans un tampon d'extraction de 1 ml dans un microtube d'Eppendorf de 2 ml, un bâtonnet en plastique ayant été utilisé pour poursuivre l'homogénéisation du tissu. Le tampon d'extraction contenait 50 mM de Mopso (pH 6,8), 20 % (v/v) de glycérol, 50 mM d'ascorbate de sodium, 50 mM de NaHSO3, 1 de PVP-40, 10 mM de MgC12 et 5 mM de DTT. Après extraction, les échantillons ont été centrifugés durant 20 min (20 000 g, 4 C). 0,5 ml du surnageant ont été dilués 2 fois avec un tampon qui contenait 15 mM de Mopso (pH 7,0), 10 % (v/v) de glycérol, 1 mM d'ascorbate de sodium, 10 mM de MgC12 et 2 mM de DTT complété par 6 mM d'orthovanadate de sodium. Après addition de 20 JCM de 3H-FPP et de 1 ml de pentane pour terminer, les microtubes ont été prudemment mélangés et incubés à 30 C pendant 1 heure. Les incubations ont été ensuite extraites et analysées à l'aide de la radiochromatographie en phase gazeuse et de la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectrométre de masse. La présence d'acide artémisinique, d'acide dihydroartémisinique et d'artémisinine dans le mélange incubé a pu être établie. Cet exemple démontre que l'endive transgénique exprimant l'amorphadiènesynthase est en mesure de synthétiser in vivo l'acide artémisinique, l'acide dihydroartémisinique et l' artémisinine. Le rendement estimé d'artémisinine et/ou de l'un de ses composés intermédiaires est d'au moins 40 kg/ha d'endive, ce qui procure une source relativement bon marché du médicament antimalarique, l' artémisinine. REVENDICATIONS 1. Procédé de production d'un ou de plusieurs composés intermédiaires se trouvant en aval de l'amorpha-4,11-diène 5 sur la voie de synthèse de l'artémisinine consistant à : (a) réaliser un plant d'endive (Cichorium intybus) produisant de l'amorpha-4,11-diène par transgenèse ; (b) faire pousser ledit plant d'endive (Cichorium 10 intybus), et (c) isoler dans ledit plant d'endive (Cichorium intybus) un ou plusieurs des composés intermédiaires se trouvant en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de 15 l'artémisinine. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les composés intermédiaires de la voie de synthèse de l'artémisinine sont choisis dans le groupe composé de l'acide 20 artémisinique et de l'acide dihydroartémisinique. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel le composé intermédiaire est l'acide dihydroartémisinique. 25 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le plant d'endive produisant de l'amorpha-4,11-diène comprend un gène, fonctionnellement lié à des séquences de transcription et de traduction appropriées, codant l'enzyme amorphadiènesynthase. 30 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel le gène provient d'A. annua. 6. Utilisation d'un plant d'endive (Cichorium intybus) produisant de l'amorpha-4,11-diène obtenu par transgenèse pour produire de l'artémisinine. 7. Procédé de production d'artémisinine consistant à : (a) réaliser un plant d'endive (Cichorium intybus) produisant de l'amorpha-4,11-diène par transgenèse ; (b) faire pousser ledit plant d'endive (Cichorium intybus) ; (c) isoler dans ledit plant d'endive (Cichorium intybus) un ou plusieurs composés intermédiaires se trouvent en aval de l'amorpha-4,11-diène sur la voie de synthèse de l'artémisinine, et (d) poursuivre la modification des composés intermédiaires en artémisinine. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel les composés intermédiaires de la voie de synthèse de l'artémisinine sont choisis dans le groupe composé de l'acide artémisinique et de l'acide dihydroartémisinique. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le 25 composé intermédiaire est l'acide dihydroartémisinique. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le plant d'endive (Cichorium intybus) produisant de l'amorpha-4,11-diène est un plant d'endive 30 transgénique. 11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le plant d'endive produisant l'amorpha-4,11-diène comprend un gène, fonctionnellement lié à des séquences de transcriptionet de traduction appropriées, codant l'enzyme amorphadiènesynthase. 12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel le 5 gène provient d'A. annua. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, dans lequel la modification consiste en une oxydation de l'acide dihydroartémisinique en artémisinine.