Brevet FR2920640A1 — publié le 20090313

Procédé d'amélioration de la résistance des végétaux au stress et produits correspondants. 1. Domaine de l'invention L'invention concerne le domaine de la résistance des plantes aux stress environnementaux naturels, biotiques ou abiotiques, ou artificiels. Plus précisément, l'invention concerne un procédé d'amélioration de la croissance de la partie aérienne et des racines et/ou de l'activité photosynthétique des plantes susceptibles d'être soumises à de tels stress. Les différents stress concernés incluent, mais ne se limitent pas : (i) aux stress naturels abiotiques dus à la sécheresse, à la température, à la teneur en sels des sols, aux radiations ultraviolettes, à l'hypoxie et/ou l'anoxie, à l'excès d'humidité, aux carences en nutriments minéraux ou organiques (ii) aux stress biotiques dus aux infections de pathogènes bactériens, viraux, parasitaires ou aux organismes nuisibles (insectes, nématodes...) (iii) aux stress générés par la pollution xénobiotique d'origine industrielle ou agricole. L'invention trouvera notamment, mais non exclusivement, son application dans l'amélioration des procédés dits de phytoremédiation visant à décontaminer des sols pollués par divers types de polluants, atmosphériques ou non, organiques ou métaux lourds, consistant à cultiver sur les sols en question des plantes permettant de fixer ou de dégrader tout ou partie de ces polluants. La production endogène d'espèces oxygénées réactives et instables, telles que l'ozone, (03), l'anion superoxyde (02), l'oxygène singulet, le peroxyde d'hydrogène (H2O2), le radical hydroxyl (OH), l'oxydes d'azote (NO), et/ou le peroxynitrite (NO3), ... est un processus inéluctable de la vie en aérobiose. Le métabolisme cellulaire est protégé par divers systèmes de défenses faisant intervenir des molécules anti-oxydantes (acide ascorbique, tocophénol, gluthation, caraténoïdes...), des enzymes (superoxyde dismutase, catalase, peroxydases...), et/ou des oligo-éléments indispensables aux activités enzymatiques (cuivre, zinc, sélénium). Certaines de ces espèces réactives de l'oxygène sont reconnues comme des � médiateurs endogènes � de fonctions biologiques vitales des cellules végétales (croissance cellulaire, photosynthèse, apoptose...). Cependant, il résulte de tout dérèglement cellulaire conduisant à la production en excès de ces composés, un stress oxydatif endogène toxique entraînant des lésions irréversibles sur tous les types de macromolécules (protéines par dénaturation, lipides par peroxydation, acides nucléiques par cassures ou mutations, glucides par oxydation et autres molécules du chloroplaste) pouvant se révéler dommageable, voire fatal à la plante. Le stress oxydatif est un phénomène aspécifique, résultat cellulaire de 10 nombreux stress environnementaux externes à la cellule et non oxydatifs, tels que notamment le froid, la sécheresse, la salinité. Le froid baisse la fluidité des membranes lipidiques ce qui entrave la mobilité de la plastoquinone ainsi que la réactivité des enzymes impliquées dans la phase obscure de la photosynthèse. Il en résulte une augmentation de la 15 concentration endogène en espèces réactives oxygénées et un déséquilibre avec les systèmes de défenses antioxydants. Augmenter la résistance au froid de certains végétaux permettrait de les cultiver à des latitudes septentrionales et de mieux nourrir certaines populations notamment en diversifiant leur nourriture. 20 La sécheresse induit la fermeture des stomates des plantes ce qui diminue la concentration en CO2 et donc le rendement photosynthétique. Les stress hydriques et osmotiques sont particulièrement étudiés du fait de leurs conséquences sur les plantes dotées d'une valeur agronomique. Ce sont des stress de plus en plus fréquents et dont l'importance augmente avec l'accroissement de 25 la démographie mondiale. Ainsi, actuellement, seul 20% des millions de kilomètres carrés du globe sont cultivables et cette surface diminue significativement chaque année du fait notamment du développement des cultures intensives, et du réchauffement climatique. Augmenter la résistance des plantes aux stress environnementaux que sont 30 la sécheresse et la salinité des sols pourrait donc permettre leur culture dans des régions du globe sujettes à d'éventuelles élévations des températures, et donc à un assèchement et à une salinisation des sols. Les effets du réchauffement climatique sur l'agriculture seraient ainsi largement réduits. 2. Art Antérieur Les stratégies visant à améliorer la résistance des plantes aux stress fondées soit sur les techniques traditionnelles d'amélioration des plantes par croisement soit sur les techniques plus récentes de génie génétique présentent l'inconvénient d'être spécifiques de la plante et du stress. Elles posent par ailleurs des problèmes scientifiques difficiles et non encore élucidés dans leur intégralité. Leur développement et leur mise en oeuvre requièrent du temps, du personnel qualifié et sont donc très coûteux. Les essais en champ sont jusqu'ici peu nombreux surtout pour ceux concernant les essais sur les plantes transgéniques. De plus, les techniques de génie génétique consistant notamment en l'insertion de gènes de bactéries ou de plantes modèles halophiles dans le génome de certaines espèces cultivées (tomates, riz, blé..) impliquent le recours aux OGMs dont l'acceptabilité sociétale n'est pas encore admise. La présente invention non-spécifique du couple plante/stress présente donc les avantages d'être applicable à différentes plantes soumises à différents types de stress environnementaux. Elle fait intervenir des composés non toxiques pour l'environnement, biodégradables, aisément disponibles dans le commerce à faible coût et en grande quantité. Le procédé permet d'augmenter les mécanismes physiologiques de défenses aux stress environnementaux et est facile à mettre en oeuvre à grande échelle et économiquement avantageux. Notamment l'invention se révélera particulièrement utile pour la réhabilitation de sols contaminés par les pesticides inducteurs du stress oxydatif et inhibiteur de la photosynthèse, telles que notamment les triazines. Les triazines sont des hétérocycles comportant trois atomes d'azotes et dont certains sont utilisés comme herbicides (atrazine, simazine et terbuthylazine), notamment dans les cultures de maïs. Ces composés représentent une source de pollution majeure à l'échelle du globe. A titre d'exemple, en France, bien que leur utilisation soit proscrite depuis le 30 juin 2003, et suite à des décennies d'utilisation, on retrouve ces produits et leurs produits de dégradation dans l'environnement (sols, cours d'eau, nappes phréatiques, réserves d'eau potable...) à des taux jusqu'à dix fois plus élevés que le seuil anciennement autorisé (0,1 mg/L). Sont particulièrement pollués certains sites de stockage, de production ou d'épandage accidentel des produits. Leur utilisation n'est pas proscrite partout puisque l'atrazine est encore massivement utilisé notamment aux Etats-Unis et dans les pays en voie de développement. L'atrazine (2- chloro -4- éthylamino -6-isopropylamine-1,3,5-triazine) est une molécule qui inhibe la photosynthèse (plus précisément le photosystème II), c'est-à-dire la transformation de l'énergie lumineuse en énergie électrochimique, générant inévitablement un excès d'espèces activées de l'oxygène responsable de dommages cellulaires graves. De plus, l'atrazine se fixe sur la protéine Dl, protéine impliquée dans la photosynthèse, et de ce fait bloque cette dernière en affectant grièvement les fonctions essentielles de la plante. Certains mécanismes d'adaptation biologiques permettent aux plantes de se protéger des agressions causées par les triazines. Parmi eux, notons la résistance induite par la mutation génétique naturelle du gène psbA codant pour la protéine Dl. Cette mutation prévient la fixation de l'atrazine, et de ce fait, améliore la résistance de la plante aux polluants. La résistance à l'atrazine peut aussi résulter d'une adaptation biochimique de la plante. Ainsi le sorgho peut �s'immuniser � contre l'atrazine en luttant contre les radicaux libres par l'augmentation de son activité enzymatique liée aux Glutathion-S-transférases. Par ailleurs, les plantes transgéniques incorporant un set de gènes bactériens codant pour la dégradation de l'atrazine peuvent croître en utilisant les polluants organiques comme source de carbone et d'énergie entraînant la décontamination du site. En France, et dans certains autres pays d'Europe, le recours à la culture de 30 ces plantes transgéniques en plein champ est particulièrement circonscrit du fait notamment du moratoire de fait sur les organismes génétiquement modifiés et de la réticence sociétale importante. On connaît de nombreuses techniques permettant la décontamination et la réhabilitation des sols et sites pollués telles que l'excavation suivie du traitement hors site, le traitement thermique sur site, le lavage des sols, la volatilisation... Parallèlement à ces techniques physico-chimiques, les méthodes biologiques, plus douces, comme la phytoremédiation, se développent pour différents types de polluants, notamment métalliques et organiques. Ces techniques consistent à faire croître certaines plantes capables de résister et fixer dans leurs tissus les polluants à traiter. Ainsi, la technique décrite dans la demande de brevet W02005/025769 consiste en l'amélioration de l'efficacité de la technique de phytoremédiation du fait de l'ajout de glucides aux plantes cultivées sur le site à décontaminer. Il est par ailleurs connu que l'ajout de polyamines aux plantes améliorent aussi la résistance des plantes aux différents stress environnementaux naturels (choc thermique, stress osmotique, infections bactériennes..) ou liés à l'activité humaine (pollutions xénobiotiques). Certains mécanismes physiologiques en jeu ont pu être élucidés tels que la stabilisation des acides nucléiques, l'induction de certaines synthèses d'acides nucléiques et de protéines, notamment au cours de la division cellulaire, la stabilisation des membranes cellulaires et l'augmentation de leur perméabilité à certaines substances. En tout état de cause, ces procédés restent d'une efficacité sujette à optimisation notamment au regard des vitesses de dépollution des sites ou au regard des seuils résiduels de polluants restant sur le site après traitement. 3. Objectifs de l'invention L'objectif de la présente invention est de proposer un procédé d'amélioration de la résistance au stress des plantes, efficace et simple à mettre en oeuvre. Notamment, un des objectifs de la présente invention est de présenter un tel procédé permettant une efficacité accrue des procédés usuels de phytoremédiation. L'invention a encore pour objectif d'aboutir à un procédé techniquement 5 amélioré tout en restant économiquement intéressant. 4. Exposé de l'invention Ces objectifs, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints grâce à l'invention qui concerne un procédé destiné à l'amélioration de la résistance d'une plante à au moins un type de stress, ledit procédé est caractérisé 10 en ce qu'il comprend au moins une étape consistant à cultiver au moins une plante en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau et assimilable par ladite plante et d'au moins une molécule de la famille des polyamines ou d'une substance contenant ladite molécule de la famille des polyamines. Le procédé selon l'invention pourra notamment être mis en oeuvre pour 15 améliorer la résistante des plantes à différents stress environnementaux qu'ils soient d'origine naturelle tels que le stress thermique, le stress hydrique, le stress osmotique, ou qu'ils soient issus de l'activité humaine tels que la présence d'un polluant de nature métallique ou organique. Selon cette variante intéressante, le procédé de l'invention propose de 20 façon originale de faire croître des plantes sur des sols, en présence d'au moins un glucide, et d'au moins une polyamine, stimulant ainsi la croissance des plantes tout en renforçant les mécanismes de résistances aux stress. Il est recommandé d'apporter ces activateurs plusieurs fois lors du traitement. Selon la nature de la plante sélectionnée et du stress rencontré, de nombreux glucides assimilables par 25 la plante peuvent être utilisés, seuls ou en mélange, pour la mise en oeuvre de l'invention. Pourront notamment être utilisés un mono-saccharide, un disaccharide, un tri-saccharide, ou un mélange de ceux-ci, ou des résidus de l'industrie sucrière. Selon une variante de l'invention et/ou le glucose et/ou le saccharose 30 seront utilisés. Selon une variante préférée, le glucide sera du saccharose. De façon similaire, selon la nature de la plante sélectionnée et du stress rencontré, différentes polyamines peuvent être apportées à la plante. Ainsi selon une variante de l'invention, la polyamine utilisée sera d'origine biologique et sera choisie dans le groupe incluant la putrescine, la spermidine, la spermine, la cadavérine ou par une composition incluant au moins un de ces composés et/ou sera choisie dans le groupe constitué par la diéthylène triamine, la triéthylène tétramine, la tétraéthylène pentamine, la tétrahydrofurfuryl amine, ou une composition incluant au moins l'un de ses composés. Selon une variante préférée entre toutes, la polyamine d'origine biologique 10 sera la putrescine. Les quantités en sucres et polyamines apportées à la plante varieront en fonction de nombreux facteurs liés entre autres à la nature du sol, aux conditions climatiques, à la nature de la plante, à la nature du stress. A titre indicatif, on pourra utiliser un mélange comprenant un ratio molaire 15 de 5 à 10 en glucide(s) et polyamine(s). A titre indicatif, on utilisera une concentration en glucide comprise entre 10 à 90 millimolaire dans l'eau d'arrosage et une concentration en polyamine comprise entre 3 à 6 millimollaire dans l'eau d'arrosage. Plusieurs moyens peuvent être mis en en oeuvre pour réaliser l'invention. 20 Selon un mode de réalisation, le glucide et la polyamine seront appliqués simultanément à la plante, par exemple, par enrobage des graines, ou sous forme liquide ou solide au cours de la croissance de la plante. Selon un mode de réalisation, une composition active comprenant au moins un glucide et au moins une polyamine pourra être administrée directement 25 aux racines et/ou aux feuillages des plantes. L'invention concerne également tout produit pour la mise en oeuvre d'un tel procédé incluant un mélange d'au moins un glucide exogène et d'au moins une polyamine. Selon une variante de l'invention, le produit actif contiendra un glucide 30 choisi dans le groupe constitué par un mono-saccharide, un disaccharide, un tri-saccharide, notamment du glucose ou du saccharose, ou une composition incluant au moins l'un de ces composés et une polyamine choisie dans le groupe constitué par la putrescine, la spermidine, la spermine, la cadavérine, la diéthylène triamine, la triéthylène tétramine, la tétraéthylène pentamine, la tétrahydrofurfuryl amine, ou une composition incluant au moins l'un de ces composés. Selon une variante préférentielle, le produit actif consiste en un mélange de saccharose et de putrescine. Selon une variante préférée, le produit consistera en un mélange aqueux ou solide d'un ratio molaire de 5 à 10 en (glucides)/(polyamines). Selon une variante intéressante de l'invention, ledit produit constitue un produit d'enrobage pour graines. Selon une autre variante, ledit produit constitue un produit à diluer dans un liquide d'arrosage des plantes. 6. Liste des figures L'invention, ainsi que les différents avantages qu'elle rprésente, apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel, donné à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins selon lesquels : - la figure 1 montre des photographies de plantules cultivées en présence d'atrazine (1 �M), sans aucun additif, en présence de 3% de saccharose et, selon la présente invention en présence de 3% de saccharose et de 3 à 6 mM de putrescine) ; - la figure 2 montre comparativement l'effet du traitement simple au saccharose et l'effet de l'invention sur le développement de la biomasse (% 25 poids frais) ; - la figure 3 décrit comparativement l'effet du traitement simple au saccharose et l'effet de l'invention sur l'activité photosynthétique (�g de chlorophylle produite / plantule) ; -la figure 4 illustre comparativement l'effet du traitement simple au 30 saccharose et l'effet de l'invention sur le développement de la racine principale (cm) ; - la figure 5 quantifie comparativement l'effet du traitement simple au saccharose et l'effet de l'invention sur le développement des primordiums racinaires de la plante ; - les figures 6 à 9 sont des photographies montrant différentes phases du processus cellulaire de mise en place d'un primordium racinaire, à l'origine du système racinaire secondaire. 7. Description d'un mode de réalisation de l'invention Les inventeurs ont mené à bien des expériences mettant en évidence que l'addition de polyamines et de glucides exogènes solubles dans l'eau au milieu de culture de la plante Arabidopsis thaliana permettait de conférer à celle-ci une tolérance accrue à l'atrazine même à des concentrations élevées. Dans ce cadre, un mélange de saccharose et de putrescine ont été testés. Des graines de l'arabette des dames (Arabidopsis thaliana, écotype Wassilewskija) ont été stérilisées, rincées à l'éthanol absolu, séchées pendant une nuit puis cultivées dans des boîtes de Pétri sur un milieu de culture Murashige and Skoog (ajusté à un pH de 5,7) gélosé (0,8%), en présence d'atrazine à raison d'une concentration molaire de 1 �M. Pour un premier témoin, ni glucide, ni polyamine n'ont été ajoutés au milieu de culture. Pour un second témoin, seul du saccharose, à raison de 3% ce qui correspond à une concentration de 87 millimolaire, a été ajouté à celui-ci. Enfin, pour un test selon la présente invention, du saccharose, à raison de 3 % et de la putrescine, à raison de 3 à 6 mM, ont été ajoutés au milieu de culture. Les boîtes de Petri ont été stockées pendant 48 h à 4°C puis transférées à 22°C sous une photopériode de 16 heures par jour à 4500 lux. Les paramètres caractérisant la croissance des plantes ont été répertoriés après 15 jours d'incubation : la biomasse (% poids frais) et la chlorophylle (�g/plantule) produites ont été déterminées; le développement de la racines principale (cm) et du système racinaire secondaire (primordiums / plantules) ont été enregistrés. Comme on peut le voir sur la partie droite de la figure 1, en présence 1 �M d'atrazine, les plantules sont incapables de développer l'appareil photosynthétique, leur développement s'arrête après l'imbibition de la graine et le démarrage de la germination stricto sensu. La présence d'un substrat d'un sucre (saccharose) permet de lever l'effet inhibiteur de l'atrazine, comme le démontre la taille des plantules sur la partie gauche de cette même figure. Enfin, l'utilisation, selon la présente invention, de saccharose et de putrescine stimule de manière spectaculaire la résistance et la remédiation de l'atrazine, comme l'indique la taille des plantules au milieu de la figure 1. La figure 1, qui compare le développement racinaire des plantules cultivées selon l'invention et selon les deux témoins, montre une stimulation de ce système racinaire améliorée de 75% par le traitement proposé par la présente invention (3% de saccharose et 2 à 6 mM de putrescine), par rapport au traitement consistant à apporter simplement 3% de saccharose au milieu de culture. La figure 2 montre quant à elle, une augmentation de 75 % du développement de la biomasse (% poids frais) après un traitement selon l'invention par rapport au traitement avec le seul ajout du saccharose. La figure 3 montre quant à elle une augmentation de 70 % de l'activité photosynthétique potentielle (�g de chlorophylle produite / plantule) après un traitement selon l'invention par rapport au traitement avec le seul ajout du saccharose. La figure 4 montre quant à elle une amélioration de 100 % du développement de la racine principale (cm) des plantules après un traitement selon l'invention par rapport au traitement avec le seul ajout du saccharose. La figure 5 montre quant à elle que le nombre des primordiums racinaires, et donc de racines secondaires, augmente d'un facteur 8 environ chez les plantules après un traitement selon l'invention par rapport au traitement avec le seul ajout du saccharose. Selon le processus de mise en place d'un primordium racinaire, les cellules du péricycle subissent d'abord une série de divisions anticlinales, perpendiculaires à l'axe de la racine, comme indiqué sur la figure 6. Ces cellules subissent ensuite des divisions périclinales, parallèle à l'axe de la racine, comme indiqué sur la figure 7 ce qui permet d'augmenter la masse cellulaire (voir figure 8). Enfin, l'organe formé commence à prendre la forme d'une racine et perce les tissus qui le couvrent pour s'allonger et former une racine fonctionnelle, comme indiqué sur la figure 9. REVENDICATIONS 1. Procédé destiné à l'amélioration de la résistance d'une plante à au moins un type de stress environnemental, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape consistant à cultiver au moins une plante en présence d'au moins un glucide exogène soluble dans l'eau et assimilable par ladite plante et en présence d'au moins une molécule de la famille des polyamines ou d'une substance contenant ladite molécule de la famille des polyamines en quantité suffisante pour induire ladite résistance. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit stress est dans le groupe constitué par les stress abiotiques, les stress biotiques, le stress thermique, le stress hydrique, une carence en nutriment, le stress osmotique, le stress chimique généré par un polluant métallique ou organique dans le sol sur lequel est cultivé la plante. 3. Procédé selon les revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que ledit stress environnemental induit un stress oxydatif et/ou inhibe la photosynthèse. 4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit stress environnemental est un herbicide. 5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que ledit polluant est une triazine. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ladite polyamine exogène soluble dans l'eau est d'origine biologique. 7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite polyamine 30 d'origine biologique est choisie dans le groupe constitué de la putrescine, la spermidine, la spermine, la cadavérine ou par une composition incluant au moins25un de ces composés. 8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que ladite polyamine exogène d'origine biologique est la putrescine. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que ladite polyamine exogène soluble dans l'eau est choisie dans le groupe constitué par la diéthylène triamine, la triéthylène tétramine, la tétraéthylène pentamine, la tétrahydrofurfuryl amine, ou une composition incluant au moins l'un de ses composés. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que ledit glucide exogène soluble dans l'eau est un mono-saccharide, un disaccharide, ou un tri-saccharide. 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que ledit glucide exogène soluble dans l'eau est du glucose ou du saccharose. 12. Procédé selon l'une des quelconques revendications 1 à 11 caractérisé en 20 ce que ledit glucide et ladite polyamine sont apportés à ladite plante selon un ratio molaire (glucide)/(polyamine) de 5 à 10. 13. Procédé selon l'une des quelconques revendications 1 à 12 caractérisé en ce que ledit glucide est utilisé à raison d'une concentration dans l'eau d'arrosage 25 comprise entre 10 à 90 mM. 14. Procédé selon l'une des quelconques revendications 1 à 13 caractérisé en ce que ladite polyamine est utilisée à raison d'une concentration dans l'eau d'arrosage comprise entre 0,5 à 6 mM. 13 30 15. Procédé selon l'une des quelconques revendications 1 à 14 caractérisé en ce que ledit glucide et ladite polyamine sont appliqués à la dite plante simultanément. 16. Produit destiné à la mise en oeuvre du procédé de l'une des quelconques revendications 1 à 15 caractérisé en ce qu'il est constitué d'un mélange d'au moins un glucide exogène et d'au moins une polyamine. 17. Produit selon la revendication 16 caractérisé en ce que ledit glucide est choisi dans le groupe constitué par un mono-saccharide, un disaccharide, un trisaccharide ou une composition incluant au moins l'un de ces composés et ladite polyamine est choisie dans le groupe constitué par la spermidine, la spermine, la cadavérine, la putrescine, la diéthylène triamine, la triéthylene tétramine, la tétraéthylène pentamine, la tétrahydrofurfuryl amine, ou une composition incluant au moins l'un de ces composés 18. Produit selon la revendication 17 caractérisé en ce que ledit mélange comprend du saccharose et de la putrescine. 19. Produit selon l'un des quelconques revendications 16 à 20 caractérisé en ce que le mélange consiste en un mélange aqueux dudit glucide et de ladite polyamine selon un ratio molaire (glucide)/(polyamine) de 5 à 10. 20. Produit selon l'une quelconque des revendications 16 à 19 caractérisé en ce qu'il constitue un produit d'enrobage pour graines. 21. Produit selon l'une quelconque des revendications 16 à 19 caractérisé en ce qu'il constitue un produit à diluer dans un liquide d'arrosage des plantes.