Brevet FR2915392A1 — publié le 20081031

La présente invention concerne le domaine technique du traitement et de la prévention de l'insulino-résistance, notamment dans le cadre du traitement de diabète de type II, et du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. En particulier, l'invention a pour objet, l'utilisation d'un antagoniste de l'angiotensine IV ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention de l'insulino résistance ou du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique, ainsi que les compositions pharmaceutiques comprenant un tel antagoniste ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. L'angiotensine IV est un produit naturel des organismes supérieurs. C'est le peptide 3-8 (Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) de l'angiotensinogène. L'angiotensine IV est produite par l'action successive de différentes enzymes protéolytiques sur le seul précurseur connu l'angiotensinogène. A partir du decapeptide angiotensine II, donc après action de la rénine et de l'enzyme de conversion dans la voie classique, ou d'autres enzymes (kalikréine tissulaire, cathepsines D et G,..., chymase) dans les voies alternatives, ce sont les aminopeptidases A et N (tel qu'illustré Figure 1) qui sont les enzymes déterminantes. Les aminopeptidases A et N sont des enzymes appartenant à la famille des métalloprotéases et existent en de nombreuses isoformes dans les différents tissus. Ces isoformes peuvent présenter des spécificités de substrats, ainsi que des distributions tissulaires particulières. A l'heure actuelle, elles sont plus souvent considérées comme des facteurs, soit qui limitent l'activité locale des hormones normalement dégradées par ces enzymes, soit au contraire qui permettent de les produire(1-4). La dégradation de l'angiotensine IV peut être réalisée par l'aminopeptidase N produite en particulier par les cellules mésangiales rénales chez le rat. La quantité d'angiotensine IV contenue dans le plasma a été mesurée chez l'homme, elle est de l'ordre de 6 à 8 pg/ml et peut augmenter d'un facteur 5 et se maintenir à des taux élevés en réponse à un traitement par un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine II (5). Les récepteurs de l'angiotensine IV ont d'abord été caractérisés comme des sites de liaison spécifique de l'angiotensine IV dans le système nerveux central et différents tissus et cellules, notamment au niveau des reins, du coeur, de la paroi artérielle (6-12). L'identification de l'IRAP (Insulin regulated amino-petidase) comme un récepteur probable de l'angiotensine IV a marqué une étape importante(13) L'IRAP est une protéine membranaire connue également sous d'autres appellations telles que oxytocinase, vp165, P-LAP C'est une protéine membranaire de 165 kD exprimée dans de nombreux types cellulaires recouvrant en grande partie les tissus où des études de liaison avait identifié des récepteurs de l'angiotensine IV. L'IRAP appartient à la famille des aminopeptidases de type M1. La liaison de l'angiotensine IV à l'IRAP se fait pour des concentrations nanomolaires sans doute sur l'apoenzyme. A des concentrations plus élevées, l'angiotensine IV inhibe également l'activité enzymatique de l'IRAP. L'IRAP, comme son nom l'indique, est associée à la réponse à l'insuline. En effet, l'IRAP est très fortement colocalisée dans la cellule avec la protéine GLUT 4 responsable du transport actif de glucose dans les cellules en réponse à l'insuline. Les souris invalidées pour l'IRAP présentent une diminution du transporteur GLUT 4, mais maintiennent une homéostasie glucidique (14). L'IRAP est donc actuellement souvent considérée comme une protéine nécessaire à l'adressage des vésicules intracellulaires vers la membrane plasmique. Sachant que l'angiotensine IV se comporte également comme un inhibiteur 20 de l'activité enzymatique de l'IRAP, deux interprétations majeures des effets biologiques de l'angiotensine IV ont été proposées : 1. les effets de l'angiotensine IV traduiraient l'inhibition de l'activité protéolytique de l'IRAP et les effets observés seraient donc en rapport avec la modification des taux des peptides normalement dégradés par l'IRAP : 25 Angiotensine III, vasopressine, enképhalines, oxytocine, somatostatine, 2. l'angiotensine IV agirait comme une molécule signal qui produit des effets cellulaires par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire et d'un système de transduction. Ce récepteur pourrait être l'IRAP, bien qu'il n'appartienne à aucune famille de récepteurs connus. Mais l'IRAP a la particularité dans sa famille 30 d'aminopeptidases d'avoir la partie intracellulaire la plus importante, susceptible d'interagir entre autres avec le substrat de Akt, AS160. Néanmoins, des résultats plus anciens sur des lignées de cellules rénales d'opposum montrent une sensibilité de la liaison de l'angiotensine IV à son récepteur, caractéristique des récepteurs à 7 segments transmembranaires couplés à des protéines G (15). Ce résultat n'a pas été confirmé dans d'autres types cellulaires. A ce jour, plusieurs effets biologiques de l'angiotensine IV ont été mis en évidence. A forte concentration, supérieure au pM, l'angiotensine IV peut se lier aux récepteurs AT1 de l'angiotensine II et produire des effets semblables à ceux de l'angiotensine II. Ces effets sont alors bloqués par des antagonistes des récepteurs AT1 de l'angiotensine II. Il a également été décrit des effets de l'angiotensine IV qui pourraient mettre en jeu les récepteurs AT2 de l'angiotensine II, mais, comme pour les récepteurs AT1, ceux-ci n'apparaissent qu'à des doses d'angiotensine IV supérieures au pM. Les effets propres de l'angiotensine IV se définissent donc soit comme des effets identiques à ceux obtenus avec l'angiotensine II, mais insensibles aux antagonistes des récepteurs AT1 et des récepteurs AT2 de l'angiotensine II, soit comme des effets différents de ceux obtenus par l'angiotensine II. Dans le système nerveux central, l'angiotensine IV administrée par voie intracérébrale a démontré sa capacité à améliorer les performances d'apprentissage et de mémorisation chez le rat. (16-2o) Des données plus récentes qui ont besoin d'être confirmées suggèrent que l'angiotensine IV pourrait jouer un rôle protecteur dans l'accident vasculaire cérébral par un effet vasodilatateur dans les zones périphériques de la zone ischémiée (21;22) susceptible d'être prévenu par la co-administration d'un antagoniste des récepteurs AT2 de l'angiotensine II, tel que le PD 123319 ou le divalinal. Dans les tissus et cellules du système cardio-vasculaire, les effets vasculaires directs de l'angiotensine IV ont été étudiés par comparaison avec ceux de l'angiotensine II ou III et avec les antagonistes des récepteurs AT1 et AT2 de l'angiotensine II. Chez l'animal (rat, chien), mais également chez l'homme, l'angiotensine IV à des doses équimolaires à celle de l'angiotensine II n'entraîne pas de modifications de la pression artérielle, ni de la fréquence cardiaque (23). Sur des lits vasculaires particuliers isolés, l'angiotensine IV à fortes doses peut présenter des effets vasoconstricteurs qui sont alors dépendants de la mise en jeu de récepteurs AT1. Ces effets vasoconstricteurs pourraient également passer par une inhibition de la dégradation de l'endothéline par l'IRAP. Des effets vasodilatateurs de l'angiotensine IV, indépendamment des récepteurs de l'angiotensine II, plus difficiles à mettre en évidence, ont été décrits dans les lits vasculaires mésentérique, cochléaire, cérébraux ainsi que rénal. Les données concernant l'implication des cellules endothéliales dans cet effet sont contradictoires. Dans des cellules musculaires lisses en culture, l'angiotensine IV, comme l'angiotensine II, mais indépendamment des récepteurs AT1 de l'angiotensine II et par un mécanisme bloqué par le divalinal (cf infra), stimule le facteur de transcription NFkB et l'expression de gènes qui en sont dépendants(24). Dans le coeur, l'angiotensine IV dispose de sites de liaison spécifique sur les fibroblastes dont elle peut stimuler la prolifération (25;26). Des récepteurs à l'angiotensine IV sont trouvés dans les cellules endothéliales vasculaires ainsi que dans les cellules endothéliales pulmonaires. Dans les premières, l'angiotensine IV pourrait, comme l'angiotensine II, stimuler l'expression du PAI-1 par un mécanisme indépendant des récepteurs AT1 ou AT2 de l'angiotensine II. Dans les secondes, elle modifie la phosphorylation du facteur de transcription 4EBP1.(11;27- 30) Des récepteurs pour l'angiotensine IV ont, également, été décrits dans le rein (12;15;31-41) L'angiotensine IV pourrait y avoir des effets natriurétiques. Elle stimule également la prolifération des cellules mésangiales. L'identification de sites de liaison pour l'angiotensine IV a rapidement été suivie des études de type relation structure activité pour l'inhibition de la liaison de l'angiotensine IV. Les relations structure-activité qui ont été établies se sont appuyées sur l'inhibition de la liaison de l'angiotensine IV soit à des préparations tissulaires ou cellulaires du récepteur, soit sur des cellules surexprimant l'IRAP. Sur le plan fonctionnel, les tests initiaux ont reposé sur la reproduction ou le blocage des effets de l'angiotensine IV dans le système nerveux central et dans les autres situations ou des effets spécifiques de l'angiotensine IV étaient observés. A partir de l'identification de l'IRAP comme un récepteur probable de l'angiotensine IV, les relations structure activité se sont intéressées également à l'inhibition de l'activité aminopeptidase (20;42-52) Les propriétés de plusieurs peptides dérivés de la structure de l'angiotensine IV ont alors été étudiés. Dans la perspective des effets de l'angiotensine IV qui s'opposent aux délétères de l'angiotensine II et surtout pour ses effets sur la mémoire et les processus d'apprentissage, ce sont surtout des ligands agonistes qui ont été recherchés(19'53-55) Le Divalinal [ N-vai-(cH2-NH)-Tyr-val(cH2-NH)-His-Pro-Phe] est également apparu comme un antagoniste de l'angiotensine IV inhibant certains de ses effets. Les effets du divalinal sur ceux produits par l'angiotensine IV sont toutefois très divers puisque l'on retrouve aussi bien de la potentialisation, que de l'inhibition ou une absence d'interactions. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs se sont plus particulièrement intéressés aux effets de l'angiotensine IV dans des cellules musculaires lisses vasculaires en comparaison avec ceux de l'angiotensine II sur l'expression d'un certain nombre de gènes codant pour des protéines impliquées dans un système rénine angiotensine local ainsi que sur la réponse à l'insuline. Ils ont montré que l'angiotensine IV exerçaient des effets opposés à ceux de l'angiotensine II sur l'expression d'un certain nombre de gènes dont l'angiotensinogène et les récepteurs AT1 (AT1R) à des concentrations nanomolaires et par des mécanismes indépendants de ceux mis en jeu par l'angiotensine II. En utilisant la technique de capture du 3Hdéoxyglucose induite par l'insuline, les inventeurs ont également démontré que l'angiotensine IV, dans ces mêmes cellules se comporte comme un inhibiteur puissant (ED50 de l'ordre de llnM) de la capture de glucose induite par l'insuline. Cet effet de l'angiotensine IV n'est pas bloqué par les antagonistes de l'angiotensine II sur ses récepteurs AT1, ni par les antagonistes de l'angiotensine II sur ses récepteurs AT2. Ces résultats démontrent donc l'existence d'un processus physiologique par lequel l'angiotensine IV endogène régule positivement l'expression de l'angiotensinogène et des récepteurs AT1, mais négativement la sensibilité des cellules à l'insuline et l'expression de l'IRAP. Une hyperstimulation de ce système est donc susceptible de participer à la genèse de l'insulino-résistance et donc à celle du diabète de type 2. L'activation de la capacité de l'expression de l'angiotensinogène et donc de la production d'angiotensine II ainsi que l'activation de l'expression des récepteurs AT1 de l'angiotensine II et donc de la sensibilité des cellules musculaires lisses par l'angiotensine IV contribuent à cet effet car l'angiotensine II dans ce type cellulaire inhibe également la réponse à l'insuline en terme de capture du glucose. Les inventeurs ont enfin démontré que des antagonistes de l'angiotensine IV, capables de diminuer l'activité biologique de l'angiotensine IV, soit en modifiant son ED50, soit en diminuant son effet maximal pouvaient être utilisés pour traiter ou prévenir l'insulino résistance, notamment dans le cadre du traitement de diabète de type II ou le risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. Ainsi, l'invention concerne l'utilisation d'un antagoniste de l'angiotensine IV ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du diabète de type II, de l'insulino résistance ou du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. L'invention a également pour objet, les compositions pharmaceutiques comprenant un antagoniste de l'angiotensine IV, ou d'un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans le cadre de l'invention, on entend par antagoniste de l'angiotensine IV , un composé capable de se lier à un récepteur de l'angiotensine IV et d'empêcher la liaison de l'angiotensine IV à ce récepteur et ainsi d'entraîner une diminution de l'activité biologique de l'angiotensine IV via ce récepteur. Cette diminution de l'activité biologique peut, par exemple, se manifester par une augmentation de son ED50, soit par une diminution de son effet maximal. En particulier, l'antagoniste de l'angiotensine IV diminue des effets biologiques de l'angiotensine IV produits selon un mécanisme indépendant des récepteurs AT1 et AT2 de l'angiotensine II. Une telle activité peut, par exemple, être mise en évidence en étudiant l'expression de gènes du système rénine angiotensine dans des cellules musculaires lisses en cultures primaires humaines, par exemple selon le test décrit dans la suite de la description. De façon avantageuse, l'antagoniste entraîne une augmentation d'au moins un facteur 10 de l'ED50 de l'angiotensine IV ou une diminution d'au moins 50% de son effet maximal obtenu en faisant varier la concentration de l'angiotensine IV sur un tel test. A titre d'exemple de tels antagonistes, on peut citer le divalinal de formule o H, N H'N' N OH (1) et le composé AL-11: H-132hVal-Tyr-Ile-His-Pro-R3hPhe-OH de formule (2) : préparé selon les méthodes classiques de synthèse peptidique. 5 H N COOH OH N/NH (2) Le Divalinal peut, par exemple, être synthétisé suivant la méthode décrite par M.F. Sardinia et al., dans Peptides 1994, 15(8), 1399-1406. La synthèse de l'AL-11 peut être réalisée par synthèse peptidique en phase 10 solide en utilisant des acides aminés protégés en N-terminal par N-9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) et une résine 2-chlorotrityl chlorure (1,5 mmol/g). Les groupements protecteurs des chaînes latérales sont : Tyr(t-Bu) and His(Trt). Le groupement protecteur Fmoc est éliminé avec une solution à 20% de pipéridine dans du DMF (2x5 min.). Le couplage des acides aminés est réalisé 15 dans un mélange DMF/CH2Cl2 (lv:lv) en présence de 0-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetraméthyluronium tetrafluoroborate (TBTU 3 eq.) et de diisopropylethylamine (DIPEA 6 eq.). Le peptide est séparé de la résine par un traitement avec un mélange triéthylsilane/H20/acide trifiuoroacétique (95:2,5:2,5) pendant 2 heures puis purifié par RP-HPLC sur un appareil Gilson contrôlé avec le 20 logiciel Unipoint, et avec une colonne préparative C18, SUPELCO Discovery BIO Wide Pore (25 cm x 21.2 mm, 10 pm). La phase mobile est constituée d'un HAN mélange eau/acétonitrile contenant 0,1% de TFA. L'élution se fait avec un gradient d'acétonitrile de 3 à 97% sur 20 minutes à 20m1/minute. La structure du composé a été confirmée par spectrométrie de masse. Les antagonistes utilisés dans le cadre de l'invention peuvent se trouver sous la forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable. En tant que sels pharmaceutiquement acceptables, on peut citer les sels avec des acides ou des bases, organiques ou minéraux, physiologiquement acceptables. En tant qu'acide approprié, on peut citer les chlorhydrates, les bromhydrates, les sulfates, les hydrogénosulfates, les dihydrogénophosphates, les maléates, les fumarates, les 2-naphtalènesulfonates, le paratoluènesulfonates. En tant que sels avec une base, on peut citer les sels de sodium, potassium, avec une amine physiologiquement acceptable ... Ces sels sont préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention contiennent une dose efficace d'un antagoniste de l'angiotensine IV, qui peut se trouver sous la forme d'un sel, d'un solvat ou d'un hydrate pharmaceutiquement acceptable, en combinaison avec au moins excipient convenable. Le ou les excipients, ainsi que le véhicule de la composition, est choisi selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité. Une administration par voie orale ou injectable est préférée. Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, topique, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale ou intraoculaire, l'antagoniste de l'angiotensine IV, éventuellement sous forme de sel, solvat ou hydrate, peut être administré sous formes unitaires d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour la prophylaxie ou le traitement de l'insulino résistance ou du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent, notamment, les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intranasale, les formes d'administration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse et les formes d'administration rectale. Afin d'obtenir l'effet prophylactique ou thérapeutique désiré, chaque dosé unitaire peut contenir de 0,1 à 500 mg, d'antagoniste de l'angiotensine IV en combinaison avec un support pharmaceutique. Cette dose unitaire peut être administrée 1 à 5 fois par jour de façon à administrer un dosage journalier permettant d'obtenir l'effet souhaité. Lorsqu'on prépare une composition solide sous forme de comprimés, on mélange l'ingrédient actif principal avec un véhicule pharmaceutique, tel que la gélatine, l'amidon, le lactose, le stéarate de magnésium, le talc, la gomme arabique ou analogues. On peut enrober les comprimés de saccharose, d'un dérivé cellulosique, ou d'autres matières appropriées ou encore on peut les traiter de telle sorte qu'ils aient une activité prolongée ou retardée et qu'ils libèrent d'une façon continue une quantité prédéterminée de principe actif. On obtient une préparation en gélules en mélangeant l'ingrédient actif avec un diluant et en versant le mélange obtenu dans des gélules molles ou dures. Les compositions pharmaceutiques contenant un l'antagoniste de l'angiotensine IV peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau. Une préparation sous forme de sirop ou d'élixir ou pour l'administration sous forme de gouttes peut contenir l'ingrédient actif conjointement avec un édulcorant, acalorique de préférence, du méthylparaben et du propylparaben comme antiseptique, ainsi qu'un agent donnant du goût et un colorant approprié. Les poudres ou les granules dispersibles dans l'eau peuvent contenir l'ingrédient actif en mélange avec des agents de dispersion ou des agents mouillants, ou des agents de mise en suspension, comme la polyvinylpyrrolidone, de même qu'avec des édulcorants ou des correcteurs de goût. Pour une administration rectale, on recourt à des suppositoires qui sont préparés avec des liants fondant à la température rectale, par exemple du beurre de cacao ou des polyéthylèneglycols. Pour une administration parentérale, on utilise des suspensions aqueuses, des solutions salines isotoniques ou des solutions stériles et injectables qui contiennent des agents de dispersion et/ou des mouillants pharmacologiquement compatibles, par exemple le propylèneglycol ou le butylèneglycol. Le principe actif peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement ave un ou plusieurs supports ou additifs, ou bien avec des matrices telles qu'un polymère ou une cyclodextrine (patch, formes à libération prolongée). Les compositions de la présente invention peuvent contenir, à côté de l'antagoniste de l'angiotensine IV, par exemple des principes actifs qui peuvent être utiles dans le traitement ou la prévention de l'insulino résistance ou du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. Ainsi, la présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant plusieurs principes actifs en association, dont l'un est un antagoniste de l'angiotensine IV ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable. L'activité antagoniste des composés testés a été mise en évidence selon des tests biologiques dans lesquels l'angiotensine IV produit des effets spécifiques et sélectifs. La spécificité des effets de l'angiotensine IV sur l'expression des gènes du système rénine angiotensine dans des cellules en culture (cellules musculaires lisses en cultures primaires humaines, lignées de cellules de rats) répond à ces critères. Les inventeurs ont démontré pour différents gènes : angiotensinogène, récepteurs AT1, IRAP, aminopeptidases N, que l'angiotensine IV à des concentrations nanomolaires exerce des effets opposés à ceux de l'angiotensine II. Ces effets de l'angiotensine IV ne sont modifiés, ni par les antagonistes de l'angiotensine II sur ses récepteurs AT1, ni par les antagonistes de l'angiotensine II sur ses récepteurs AT2, ni par leur association. Un tel test est donc spécifique car seule l'angiotensine IV produit cet effet stimulateur contrairement à l'angiotensine II qui inhibe l'expression de ces gènes. Cet effet peut être recherché aussi bien au niveau des ARN messagers que des protéines correspondantes. L'inhibition de ces effets de l'angiotensine IV par des composés candidats est 30, la base du modèle. Ces modèles cellulaires permettent une approche de criblage ainsi que des approches quantitatives. L'angiotensine IV est utilisée à une concentration de 100 nM à laquelle sa liaison aux récepteurs de l'angiotensine II est minimale. L'activité thérapeutique des composés testés a été mise en évidence, grâce à un test qui repose sur la restauration de la sensibilité à l'insuline de cellules traitées par l'angiotensine IV. L'angiotensine IV inhibe la capture de glucose induite par l'insuline dans les cellules musculaires lisses vasculaires par un mécanisme indépendant des récepteurs AT1 et AT2 de l'angiotensine II. Les inventeurs ont montré que ce mécanisme passait par une phosphorylation dépendant de la voie des MAP-kinases des sérines 312 et 616 de l'IRS1 aboutissant à une inhibition de l'activation de la voie P85AKT, de la translocation de Glut4 et de la capture de glucose. L'inhibition par les composés testés des effets de l'angiotensine IV met en évidence leur potentiel thérapeutique. Les inventeurs ont utilisé des cultures primaires et des lignées de cellules musculaires lisses vasculaires de différentes espèces (Homme, rat, souris), toutes lignées cellulaires où l'angiotensine IV exerce des effets stimulants de l'expression de l'angiotensinogène et des récepteurs AT1 de l'angiotensine II peuvent être utilisées. Les cellules musculaires lisses à confluence sont placées dans un milieu de culture sans sérum (Human vascular smooth muscle medium 2 de chez promocell, ou tout autre milieu équivalent), afin de bloquer leur multiplication et de les synchroniser. Après 24 heures d'habituation dans ce milieu de culture, le milieu est remplacé par du milieu frais auquel sont ajoutées les différentes substances tests suivant l'ordre adapté au protocole expérimental. Les mesures sont réalisées après 24 heures de traitement dans le cas des analyses d'expression de l'angiotensinogène et des récepteurs AT1. Les antagonistes sont appliqués aux cellules 30 minutes avant l'angiotensine IV. Les cellules sont mises en présence de 100pU/ml d'insuline pour la mesure de la capture de glucose. Les inventeurs ont ainsi pu montrer que l'angiotensine IV exerce des effets puissants opposés, à ceux de l'angiotensine II, indépendants des récepteurs AT1 stimulant de l'expression de l'angiotensinogène et des récepteurs AT1 alors qu'il réduit l'expression de l'IRAP. La Figure 2 présente la relation concentration/réponse de l'angiotensine II (Ang II) et de l'angiotensine IV, sur les taux d'ARNm de l'angiotensinogène (AGT)(courbe A) et des récepteurs AT1 (AT1R)(courbe B). Les résultats sont la moyenne de doubles déterminations réalisées dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines provenant de 6 patients. La courbe C montre que les effets de 100 nM d'angiotensine II sont bloqués par un antagoniste AT1, qui, par contre ne bloque pas les effets de 100 nM d'angiotensine IV. L'ED50 (Dose qui donne 50% de l'effet maximum) de l'angiotensine IV dans les modèles analysés et pour les effets sur les différents gènes est toujours de l'ordre de 10 à 20 nM (courbe A et B de la Figure 2). Ces effets de l'angiotensine IV ne sont pas bloqués par un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine II contrairement à ceux induits par l'angiotensine II elle-même (Figure 2 courbe C). La Figure 3 met en évidence l'inhibition de la réponse en angiotensinogène à 100 nM l'angiotensine IV par le divalinal et le composé AL-11 à doses croissantes, administrées 30 minutes avant l'angiotensine IV. La Figure 4 met en évidence, l'inhibition par des doses croissantes d'angiotensine IV de la capture de désoxyglucose induite par l'insuline dans des cellules musculaires lisses vasculaires humaines. Les résultats sont la moyenne de double détermination sur des cellules provenant de 6 patients différents. Des résultats similaires sont obtenus sur une lignée de cellules musculaires lisses vasculaires de rat. Les inventeurs ont également démontré, que les effets d'inhibition de l'angiotensine IV sur la capture de glucose induite par l'insuline peuvent être prévenus par des composés qui présentent sur le test précédent, une activité antagoniste. La Figure 5 met en évidence la réversion obtenue avec deux antagonistes de l'AT IV (le divalinal et le composé AL-11) de l'inhibition par l'angiotensine IV de la capture de glucose induite par l'insuline dans des cellules musculaires lisses vasculaires humaines. Les résultats sont la moyenne de double détermination dans des cellules provenant de 5 patients différents. Ces résultats montrent également que le divalinal se comporte dans les conditions expérimentales utilisées (prétraitement et non application simultanée) comme un plus faible dépresseur de la réponse maximale de l'angiotensine IV, que le composé AL-11 qui est beaucoup plus puissant pour prévenir aussi bien les réponse sur les gènes de l'AGT et des récepteurs AT1, comme mis en évidence sur la Figure 3 que sur la réponse à l'insuline. La LW-hémorphin-7 est apparue sans activité sur ces différents tests. Références bibliographiques 1. Banegas I, Prieto I, Vives F et al. Brain aminopeptidases and hypertension. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst.2006;7:129-134. 2. Carl-McGrath S, Lendeckel U, Ebert M et al. Ectopeptidases in tumour biology: a review. Histol Histopatho/. 2006;21:1339-1353. 3. Walling LL. Recycling or regulation? The role of amino-terminal modifying enzymes. Curr Opin Plant Bio% 2006;9:227-233. 4. Tsujimoto M, Hattori A. The oxytocinase subfamily of M1 aminopeptidases. Biochim Biophys Acta. 2005;1751:9-18. 5. Shibasaki Y, Mori Y, Tsutumi Y et al. Differential kinetics of circulating angiotensin IV and II after treatment with angiotensin II type 1 receptor antagonist and their plasma levels in patients with chronic renal failure. Clin Nephro% 1999;51:83-91. 6. Hanesworth JM, Sardinia MF, Krebs LT et al. Elucidation of a specific binding site for angiotensin II(3-8), angiotensin IV, in mammalian heart membranes. J Pharmaco/ Exp Ther. 1993;266:1036-1042. 7. Hall KL, Hanesworth JM, Bail AE et al. Identification and characterization of a novel angiotensin binding site in cultured vascular smooth muscle cells that is specific for the hexapeptide (3-8) fragment of angiotensin II, angiotensin IV. Regul Pept. 1993;44:225-232. 8. Jarvis MF, Gessner GW, Ly CQ. The angiotensin hexapeptide 3-8 fragment potently inhibits [125I]angiotensin II binding to non-AT1 or -AT2 recognition sites in bovine adrenal cortex. Eur J Pharmaco/. 1992;219:319-322. 9. Swanson GN, Hanesworth JM, Sardinia MF et al. Discovery of a distinct binding site for angiotensin II (3-8), a putative angiotensin IV receptor. Regu/ Pept. 1992;40:409-419. 10. Czekalski S, Chansel D, Vandermeersch S et al. Evidence for angiotensin IV receptors in human collecting duct cells. Kidneylnt. 1996;50:1125-1131. 11. Riva L, Galzin AM. Pharmacological characterization of a specific binding site for angiotensin IV in cultured porcine aortic endothelial cells. EurJ Pharmaco% 1996;305:193-199. 12. Coleman JK, Krebs LT, Hamilton TA et al. Autoradiographic identification of kidney angiotensin IV binding sites and angiotensin IV-induced renal cortical blood flow changes in rats. Peptides. 1998;19:269-277. 13. Albiston AL, McDowall SG, Matsacos D et al. Evidence that the angiotensin IV (AT(4)) receptor is the enzyme insulin-regulated aminopeptidase. J Biot Chem. 2001;276:48623-48626. 13 14. Keller SR, Davis AC, Clairmont KB. Mice deficient in the insulin-regulated membrane aminopeptidase show substantial decreases in glucose transporter GLUT4 levels but maintain normal glucose homeostasis. J Biot Chem. 2002;277:17677-17686. 15. Dulin N, Madhun ZT, Chang CH et al. Angiotensin IV receptors and signaling in opossum kidney cells. Am J Physio% 1995;269:F644-F652. 16. Braszko JJ, Walesiuk A, Wielgat P. Cognitive effects attributed to angiotensin II may result from its conversion to angiotensin IV. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2006;7:168-174. 17. Chai SY, Fernando R, Peck G et al. The angiotensin IV/AT4 receptor. Ce// Mol Life Sci. 2004;61:2728-2737. 18. Albiston AL, Fernando R, Ye S et al. Alzheimer's, angiotensin IV and an aminopeptidase. Bio! Pharm Bull. 2004;27:765-767. 19. Wright JW, Harding JW. The brain angiotensin system and extracellular matrix molecules in neural plasticity, learning, and memory. Prog Neurobiol. 2004;72:263-293. 20. Lee 3, Albiston AL, Allen AM et al. Effect of I.C.V. injection of AT4 receptor ligands, NLE1-angiotensin IV and LW-hemorphin 7, on spatial learning in rats. Neuroscience. 2004;124:341-349. 21. Faure S, Chapot R, Tallet D et al. Cerebroprotective effect of angiotensin IV in experimental ischemic stroke in the rat mediated by AT(4) receptors. J Physio/ Pharmaco% 2006;57:329-342. 22. Faure S, Javellaud J, Achard JM et al. Vasoconstrictive effect of angiotensin IV in isolated rat basilar artery independent of AT1 and AT2 receptors. J Vasc Res. 2006;43:19-26. 23. Abrahamsen CT, Pullen MA, Schnackenberg CG et al. Effects of angiotensins II and IV on blood pressure, renal function, and PAI-1 expression in the heart and kidney of the rat. Pharmaco/ogy. 2002;66:26-30. 24. Esteban V, Ruperez M, Sanchez-Lopez E et al. Angiotensin IV activates the nuclear transcription factor-kappaB and related proinflammatory genes in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2005;96:965-973. 25. Wang L, Eberhard M, Erne P. Stimulation of DNA and RNA synthesis in cultured rabbit cardiac fibroblasts by angiotensin IV. Clin Sci (tond). 1995;88:557-562. 26. Wang L, Eberhard M, Kohler E et al. A specific binding site for angiotensin II(3-8), angiotensin IV, in rabbit cardiac fibroblasts. J Recept Signa/ Transduct Res. 1995;15:517-527. 27. Lu J, Zhang J, Block ER et al. Angiotensin IV enhances phosphorylation of 4EBP1 by multiple signaling events in lung endothelial cells. Mo/ Ce// Biochem. 2005;275:181-188. 28. Kerins DM, Hao Q, Vaughan DE. Angiotensin induction of PAI-1 expression in endothelial cells is mediated by the hexapeptide angiotensin IV. J Clin Invest. 1995;96:2515-2520. 29. Bernier SG, Servant G, Boudreau M et al. Characterization of a binding site for angiotensin IV on bovine aortic endothelial cells. EurJ Pharmaco% 1995;291:191-200. 30. Hall KL, Venkateswaran S, Hanesworth 3M et al. Characterization of a functional angiotensin IV receptor on coronary microvascular endothelial cells. Regul Pept. 1995;58:107-115. 31. Nanda RK. Biphasic actions of angiotensin IV on renal blood flow in the rat. Pegu/ Pept. 2006;136:23-29. 32. Li XC, Campbell DJ, Ohishi M et al. AT1 receptor-activated signaling mediates angiotensin IV-induced renal cortical vasoconstriction in rats. Am J Physio/ Renal Physio% 2006;290:F1024-F1033. 33. Hamilton TA, Nanda RK, Harding 3W et al. A role for the angiotensin IV/AT4 system in mediating natriuresis in the rat. Peptides. 2001;22:935-944. 34. Chansel D, Vandermeersch S, Oko A et al. Effects of angiotensin IV and angiotensin-(1-7) on basal and angiotensin II-stimulated cytosolic Ca2+ in mesangial cells. EurJ Pharmaco% 2001;414:165-175. 35. Handa RK. Characterization and signaling of the AT(4) receptor in human proximal tubule epithelial (HK-2) celas. JAm Soc Nephro/. 2001;12:440-449. 36. Handa RK, Harding 3W, Simasko SM. Characterization and function of the bovine kidney epithelial angiotensin receptor subtype 4 using angiotensin IV and divalinal angiotensin IV as receptor ligands. J Pharmaco/ Exp Ther. 1999;291:1242-1249. 37. Gesualdo L, Ranieri E, Monno R et al. Angiotensin IV stimulates plasminogen activator inhibitor-1 expression in proximal tubular epithelial cells. Kidneylnt.. 1999;56:461-470. 38. Grove KL, Deschepper CF. High sait intake differentially regulates kidney angiotensin IV AT4 receptors in Wistar-Kyoto and spontaneously hypertensive rats. Life Sc/. 1999;64:1811-1818. 39. Kramar EA, Krishnan R, Harding JW et al. Rote of nitric oxide in angiotensin IV-induced increases in cerebral blood flow. Regu/Pept. 1998;74:185-192. 40. Handa RK, Krebs LT, Harding 3W et al. Angiotensin IV AT4-receptor system in the rat kidney. Am J Physio% 1998;274:F290-F299. 41. Ardaillou R, Chansel D. [Angiotensin IV, a new component of the reninangiotensin system, which acts on kidney cells]. BullAcadNat/Med. 1996;180:475-486. 42. Axen A, Lindeberg G, Demaegdt H et al. Cyclic insulin-regulated aminopeptidase (IRAP)/AT4 receptor ligands. JPeptSd 2006;12:705-713. 43. Lew RA, Mustafa T, Ye S et al. Angiotensin AT4 ligands are potent, competitive inhibitors of insulin regulated aminopeptidase (IRAP). J Neurochem. 2003;86:344-350. 44. Lee J, Mustafa T, McDowall SG et al. Structure-activity study of LW-hemorphin-7: angiotensin AT4 receptor ligand and inhibitor of insulinregulated aminopeptidase. J Pharmaco/ Exp Ther. 2003;305:205-211. 45. Lee J, Chai SY, Mendelsohn FA et al. Potentiation of cholinergic transmission in the rat hippocampus by angiotensin IV and LVV-hemorphin-7. Neuropharmaco/ogy. 2001;40:618-623. 46. Krishnan R, Hanesworth JM, Wright JW et al. Structure-binding studies of the adrenal AT4 receptor: analysis of position two- and three-modified angiotensin IV analogs. Peptides. 1999;20:915-920. 47. Moeller I, Albiston AL, Lew RA et al. A globin fragment, LW-hemorphin-7, induces [3H]thymidine incorporation in a neuronal cell line via the AT4 receptor. J Neurochem. 1999;73:301-308. 48. Garreau I, Chansel D, Vandermeersch S et al. Hemorphins inhibit angiotensin IV binding and interact with aminopeptidase N. Peptides. 1998;19:1339-1348. 49. Moeller I, Chai SY, Smith I et al. Haemorphin peptides may be endogenous ligands for brain angiotensin AT4 receptors. C/in Exp Pharmaco/ Physio/ Suppl. 1998;25:S68-S71. 50. Moeller I, Lew RA, Mendelsohn FA et al. The globin fragment LW-hemorphin-7 is an endogenous ligand for the AT4 receptor in the brain. J Neurochem. 1997;68:2530-2537. 51. Sardinia MF, Hanesworth 3M, Krishnan F et al. AT4 receptor structure-binding relationship: N-terminal-modified angiotensin IV analogues. Peptides. 1994;15:1399-1406. 52. Sardinia MF, Hanesworth JM, Krebs LT et al. AT4 receptor binding characteristics: D-amino acid- and glycine-substituted peptides. Peptides 1993;14:949-954. 53. Goto Y, Hattori A, Ishii Y et al. Enzymatic properties of human aminopeptidase A. Regulation of its enzymatic activity by calcium and angiotensin IV. J Biol Chem. 2006;281:23503-23513. 54. Gard PR. Angiotensin as a target for the treatment of Alzheimer's disease, anxiety and depression. Expert Opin Ther Targets. 2004;8:7-14. 55. Poljak A, McLean CA, Sachdev P et al. Quantification of hemorphins in Alzheimer's disease brains. JNeurosci Res. 2004;75:704-714.5 REVENDICATIONS 1 - Utilisation d'un antagoniste de l'angiotensine IV pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du diabète de type II, de l'insulino résistance ou du risque cardio-vasculaire du syndrome métabolique. 2 - Utilisation selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'antagoniste de l'angiotensine IV diminue des effets biologiques de l'angiotensine IV produits selon un mécanisme indépendant des récepteurs AT1 et AT2 de l'angiotensine IL 3 - Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'antagoniste de l'angiotensine IV diminue les effets de l'angiotensine IV dans des cellules musculaires lisses vasculaires sur l'expression de l'angiotensinogène. 4 - Utilisation selon la revendication 3 caractérisée en ce que l'antagoniste entraîne une augmentation de l'ED50 de l'angiotensine ou une diminution de son effet maximal sur l'expression de l'angiotensinogène et/ou des récepteurs AT1, dans des cellules musculaires lisses vasculaires. 5 - Utilisation selon la revendication 4 caractérisée en ce que l'antagoniste entraîne une augmentation d'au moins un facteur 10 de l'ED50 de l'angiotensine IV ou une diminution d'au moins 50% de son effet maximal sur l'expression de l'angiotensinogène et/ou des récepteurs AT1. 6 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'antagoniste est un composé peptidique. 7 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'antagoniste est le Divalinal ou le composé AL-11 de formule (2): H N COOH N NH OH (2) 8 - Composition pharmaceutique comprenant un antagoniste de l'angiotensine IV, en combinaison avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. 9 - Composition selon la revendication 8 caractérisée en ce que l'antagoniste de l'angiotensine IV diminue des effets biologiques de l'angiotensine IV produits selon un mécanisme indépendant des récepteurs AT1 et AT2 de l'angiotensine II. 10 - Composition selon la revendication 8 ou 9 caractérisée en ce que l'antagoniste de l'angiotensine IV diminue les effets de l'angiotensine IV dans des cellules musculaires lisses vasculaires sur l'expression de l'angiotensinogène. 11 - Composition selon la revendication 10 caractérisée en ce que l'antagoniste entraîne une augmentation de l'ED50 de l'angiotensine ou une diminution de son effet maximal sur l'expression de l'angiotensinogène et/ou des récepteurs AT1, dans des cellules musculaires lisses vasculaires. 12 - Composition selon la revendication 11 caractérisée en ce que l'antagoniste entraîne une augmentation d'au moins un facteur 10 de l'ED50 de l'angiotensine IV ou une diminution d'au moins 50% de son effet maximal sur l'expression de l'angiotensinogène et/ou des récepteurs AT1. 13 - Composition selon l'une des revendications 8 à 12 caractérisée en ce que l'antagoniste est un composé peptidique. 14 - Composition selon l'une des revendications 8 à 13 caractérisée en ce que l'antagoniste est le Divalinal ou le composé AL-11 de formule (2): H N COOH y---\--- OH N~/NH v (2) 15 - Composition selon l'une des revendications 8 à 14 caractérisée en ce qu'elle est sous une forme adaptée à une administration par voie orale ou injectable. 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