Brevet FR2918074A1 — publié le 20090102

La présente invention est relative au domaine de la purification virale, en particulier à un procédé d'obtention de virus à partir d'une suspension virale liquide. On connait dans le domaine pharmaceutique, et notamment dans le domaine des vaccins des procédés de purification de suspensions virales. Ainsi, le brevet FR2201079, décrit notamment un procédé de purification de virus à partir d'une suspension virale que l'on introduit dans un rotor de centrifugeuse de type zonal lorsqu'il est à l'arrêt ; après mise en rotation lente du rotor (entre 2000 et 5000 tours par minute), on introduit au moins 2 coussins de liquide de densité différente à la périphérie du rotor ; puis après que le rotor soit rempli par le liquide à traiter, on l'accélère à une vitesse suffisante pour séparer les virus des impuretés, et enfin, après avoir ramené la vitesse du rotor entre 2000 et 5000 tours par minute, on introduit par la périphérie un liquide de densité égale ou supérieure au contenu du rotor, pour décharger le rotor par son conduit central ; et on recueille ensuite les fractions contenant le virus débarrassé des impuretés. Lors de la rotation, les coussins de densité différente se transforment par diffusion en gradient non linéaire. La méthode décrite dans ce brevet qui est une méthode discontinue présente cependant l'inconvénient de ne permettre de traiter que des volumes constants et limités de suspension virale, et donc d'obliger à concentrer la suspension virale à purifier auparavant et/ou à reproduire plusieurs fois les mêmes opérations pour traiter un volume important de liquide. Le fait d'utiliser une telle méthode complique également les tentatives d'avoir un procédé s'effectuant entièrement dans des conditions stériles. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de virus à partir d'une suspension virale liquide, selon lequel la suspension virale est soumise à une ultracentrifugation sur gradient de densité, caractérisé en ce que, l'ultracentrifugation est effectuée en continu, le gradient de densité est un gradient discontinu comprenant au moins 2 paliers. -2-Ainsi, il est possible d'intégrer cette étape de purification dans un procédé de fabrication en ligne, ce qui permet de réduire les risques de contamination, et permet une automatisation intéressante d'un point de vue industriel. Selon une caractéristique particulière du procédé de l'invention, la force centrifuge à laquelle est soumise la suspension virale à l'entrée de l'ultracentrifugeuse est comprise entre 36 000 et 60 000 g, et celle existant en périphérie est comprise entre 90 000 et 120 000 g. Ainsi, les virus peuvent de façon optimale, pénétrer dans la couche de gradient de densité, alors que les éléments non-désirés de la suspension virale, traversent directement l'ultracentrifugeuse, et sont éliminés, sans pouvoir pénétrer dans le gradient, ou bien pénètrent dans le gradient, mais migrent peu. Selon une autre caractéristique particulière du procédé selon l'invention, le gradient de densité est un gradient de saccharose en paliers, obtenu en superposant au moins 2 couches de saccharose de densité différente, et une couche de solution tampon. On obtient ainsi au moins 2 paliers bien différenciés correspondant à des sauts de densité qui permettent une bonne séparation des constituants de la 20 suspension virale. De nombreux avantages de l'invention apparaitront à la lecture de la description détaillée ci-après, en référence aux figures qui représentent de façon schématique un dispositif permettant sa mise en oeuvre. 25 La figure 1 représente, de façon schématique, un dispositif de mise en oeuvre de l'invention, à l'arrêt. La figure 2 représente, de façon schématique, un dispositif de mise en oeuvre de l'invention, en fonctionnement. 30 Un exemple de dispositif d'ultracentrifugation qui convient particulièrement bien à la mise en oeuvre de l'invention est un dispositif tel que celui décrit dans la demande de brevet US 2005/0215410. -3- Ainsi que cela apparait sur les figures, un tel dispositif est principalement constitué d'un rotor comprenant une enveloppe externe cylindrique 1 constituant une cuve pourvue d'un noyau central 2. La cuve est pourvue dans sa partie inférieure d'une entrée 3 du liquide à traiter, et dans sa partie supérieure d'une sortie 4. Pour des raisons de simplification, les moyens d'entrainement ainsi que les moyens de fixation des différentes parties du dispositif n'ont pas été représentés. Le volume disponible entre l'enveloppe externe 1 et le noyau 2 est occupé par un gradient de densité, constitué selon l'invention par au moins 2 couches, 5 et 6, de densité différente, et d'une couche 7 de solution tampon. A l'arrêt, les couches du gradient de densité sont superposées à l'horizontale, ainsi que cela est représenté à la figure 1, la couche de plus forte densité se trouvant au-dessous et la couche de tampon se trouvant sur le dessus. Durant la mise en oeuvre du dispositif, ainsi que cela est représenté sur la Figure 2, les couches de densité différente s'organisent de manière concentrique autour du noyau, la couche de plus forte densité étant la plus éloignée du noyau, alors que la suspension virale à traiter qui entre par l'entrée 3 circule dans la zone proche du noyau, avant d'être évacuée par la sortie 4. Selon l'invention, la suspension virale que l'on traite est une suspension liquide qui contient des virus vivants ou non. Il peut s'agir de virus utilisés dans la fabrication des vaccins, et notamment des virus de la grippe, de la rougeole, des oreillons, de l'herpès, de la fièvre jaune, de la rage, de la polio ou tout autre virus présentant des caractères lui permettant d'être utilisés pour la prévention de maladies. Ces virus peuvent avoir été produits par culture sur des cellules, ou sur des organes, ou comme cela est par exemple le cas avec le virus de la grippe sur des oeufs. Dans le cas de la production de virus sur cellules, les principaux éléments à éliminer seront les protéines et l'ADN cellulaire. Dans le cas de la production sur oeufs, un des éléments qu'il convient d'éliminer est l'ovalbumine. En effet, les normes établies par les autorités de santé en Europe fixent un seuil limite de 1 g d'ovalbumine par dose de vaccin administré. Bien entendu, les industriels s'attachent à descendre bien en-dessous du seuil autorisé ; il est donc important de pouvoir disposer d'un procédé simple et efficace, permettant de réduire au maximum les impuretés provenant de la production des virus. -4- Le procédé selon l'invention est d'un intérêt très particulier, et a montré une grande efficacité, dans le cas où la suspension virale à traiter est constituée par du liquide allantoïque comprenant du virus de la grippe qu'il convient de séparer de l'ovalbumine provenant des oeufs utilisés pour la propagation virale. Le procédé selon l'invention s'effectue en une seule étape d'ultracentrifugation zonale. A cette fin, la cuve d'ultracentrifugation utilisée est une cuve cylindrique dont les parois sont de préférence en titane ; elle est pourvue en son centre, d'un noyau cylindrique muni de rainures permettant l'écoulement de liquide ; ce noyau est avantageusement en NorylTM. Le volume disponible entre le noyau et les parois extérieures est, selon l'invention, suffisant pour introduire un produit permettant un Radient de densité à au moins 2 paliers. Ainsi, on a remarqué qu'en utilisant un système d'ultracentrifugation de type KII avec un noyau K10, on obtenait un volume de 8 litres convenant parfaitement à l'invention. Afin d'assurer la purification par gradient de densité, la cuve de l'ultracentrifugeuse est chargée à l'arrêt par au moins 3 couches de densité différente. Ce gradient de densité peut être obtenu en utilisant différents produits tels que le saccharose, le chlorure de césium, le tartrate ou le bromure de potassium par exemple ; on a obtenu de particulièrement bons résultats avec le saccharose. On peut donc avoir 3 couches dont 2 sont constituées par du saccharose à des concentrations différentes, et une des couches par une solution tampon. En fonction de la nature de la suspension virale à purifier, il est possible de prévoir plus de couches, ce qui permettra d'avoir plus de paliers de différentes densités. Le chargement est effectué en introduisant tout d'abord le liquide tampon, puis les coussins par ordre de densité croissante ; ce chargement se fait à l'arrêt. Lorsque tout a été chargé, le rotor est accéléré à sa vitesse maximale, soit entre 35000 et 40500 rpm. Pendant l'accélération, on introduit la suspension virale à traiter par l'entrée 3. Le liquide à traiter s'écoule alors, ainsi que cela est représenté sur la Figure 2 le long du noyau 2 ; à cet endroit, il est soumis à une force centrifuge comprise entre 36000 et 60000 g, alors que l'accélération à proximité de la paroi externe est comprise entre 90000 et 120 000 g; malgré la relative faible force centrifuge à laquelle est soumise le liquide à traiter à son entrée dans l'ultracentrifugeuse, le virus peut pénétrer à l'intérieur du gradient, et -5- l'on n'observe pas ce qui était craint, une perte trop importante de virus. Certaines des protéines ou des particules non désirées pénètrent aussi à l'intérieur du gradient ; cependant, les paliers de densité différente vont constituer des obstacles infranchissables pour certains des éléments présents au départ dans la suspension virale. Les virus étant des particules lourdes, ils vont eux migrer jusqu'à leur point d'isodensité qui est proche de l'extrémité du gradient. Selon l'invention, on obtient une très bonne séparation virus/ovalbumine. On a ainsi obtenu une élimination de 99% de l'ovalbumine grâce à une seule étape d'ultracentrifugation. Après que tout le volume de suspension virale ait été traité, on récupère le liquide du gradient de densité par fractions de différentes densité, que l'on traite, afin d'isoler les virus des fractions les plus denses. On peut ensuite inactiver ou traiter les virus de la manière habituelle. La présente invention permet de façon surprenante de conserver les paliers du gradient de densité malgré la forte accélération et la durée de cette accélération. Les inventeurs avaient en effet craint qu'un volume aussi important qu'un volume de 8 1 ne conduise à une instabilité du gradient, et que l'on ait en outre une perte virale importante à cause d'une vitesse de rotation à l'entrée du dispositif réduite par rapport à ce qui est habituellement pratiqué dans l'art antérieur. Exemple : Purification de virus de la grippe à partir de liquide allantoïque d' oeufs. On dispose d'un système d'ultracentrifugation de type KII ayant en son centre un noyau K10 fournis par Alfa Wasserman. On introduit dans le rotor à l'arrêt successivement : un peu plus de 8 1 de tampon citrate 125 mM, 3,4 1 d'une solution de saccharose à 34%, qui déplace une partie du tampon citrate, 1,6 1 d'une solution de saccharose à 55%, qui déplace également une partie du tampon citrate. -6- Puis on met le rotor en accélération jusqu'à une vitesse de 35 000 rpm, et on introduit le liquide allantoïque à traiter, soit 60 litres, avec un débit de 10 litres/heure. Ce liquide allantoïque a été auparavant clarifié et concentré afin d'éliminer une partie des contaminants ; il contient du virus de la grippe que l'on souhaite isoler pour l'introduire dans un vaccin. L'ultracentrifugation est effectuée pendant une durée de 6 heures puis on rince pendant 1 heure en remplaçant le liquide allantoique par du tampon citrate 125 mM. Cette phase de rinçage permet non seulement d'éliminer les impuretés à l'entrée du gradient, mais aussi et surtout accorde un temps supplémentaire au virus pour migrer dans sa zone d'isodensité. Après que tout le liquide à traiter ait été ultracentrifugé, on arrête la rotation, et on récolte le gradient en 32 fractions de 250 ml. Ces fractions sont ensuite analysées en indice de réfraction, en densité optique, et en dosage d'albumine notamment. On observe que l'on obtient une très bonne résolution de la séparation virus/albumine. On conserve les fractions comprenant entre 47 % et 35 % de saccharose, qui sont les fractions comprenant le maximum de virus, et le minimum d'ovalbumine. Ces fractions sont ensuite rassemblées, et standardisées par dilution à des valeurs constantes de densité optique indicatrices de la teneur en protéine virale avant d'être fractionnées puis inactivées et filtrées pour obtenir une suspension de particules virales splittées inactivées. On observe que les virus purifiés selon la méthode de la présente invention sont, avant fragmentation, des virus intègres, et que la concentration en ovalbumine dans les fractions récoltées est suffisamment faible pour une utilisation ultérieure de ces virus dans des doses vaccinales, respectant les spécifications de la Pharmacopée Européenne qui exige une quantité d'ovalbumine inférieure à 1 g/dose. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de virus à partir d'une suspension virale liquide, selon lequel la suspension virale est soumise à une ultracentrifugation sur gradient de densité, caractérisé en ce que, l'ultracentrifugation est effectuée en continu, le gradient de densité est un gradient discontinu comprenant au moins 2 paliers. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la force centrifuge à laquelle est soumise la suspension virale liquide à l'entrée de l'ultracentrifugeuse est d'une valeur comprise entre 36 000 et 60 000g. 3. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la force centrifuge à laquelle est soumise la suspension virale à l'extrémité du gradient de densité est d'une valeur comprise entre 90 000 et 120 000g. 4. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gradient de densité est un gradient de saccharose, obtenu en superposant au moins 2 couches de saccharose de densité différente, et une couche de solution tampon. 5. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le volume disponible pour la circulation du liquide et le gradient de densité à l'intérieur de l'ultracentrifugeuse est d'environ 8 1. 6. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le débit de la suspension virale dans l'ultracentrifugeuse est d'environ 10 litres /heure. 7. Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la suspension virale liquide à traiter comprend du virus de la grippe et de l'ovalbumine en suspension dans du liquide allantoique concentré. 10 15-8- 8. Procédé selon une des revendications précédentes, selon lequel : après que toute la suspension virale ait été traitée, on récupère le saccharose présent dans l'ultracentrifugeuse par fractions de gradient croissant ou décroissant, - on conserve les fractions les plus denses comprenant le virus. 9. Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon une des revendications précédentes, comprenant au moins: un rotor capable d'atteindre une vitesse de rotation d'au moins 35000 tours/ minute, comprenant une cuve cylindrique à paroi en titane, et un noyau interne nervuré en NorylTM, une entrée de la suspension virale à traiter, une sortie du liquide traité, caractérisé en ce que : le gradient de densité est constitué par au moins 2 couches de saccharose de densité différente, et d'une couche constituée par une solution tampon, et en ce que le volume disponible pour le gradient de densité et la circulation du liquide à traiter est d'environ 8 litres.