Brevet FR2920666A1 — publié le 20090313

Préparations implantables contenant de la globine, procédé pour leur fabrication et utilisations. La présente invention concerne des nouvelles préparations implantables contenant de la globine, un procédé pour leur fabrication, et les utilisations, notamment thérapeutiques, de ces préparations. On a déjà décrit des préparations implantables contenant de la globine et des utilisations de ces préparations. Ainsi les demandes et brevets FR0305700, WO2004/100934 (EP1622596), US6949625 décrivent des préparations contenant de la globine insoluble au pH neutre ou physiologique. Les demandes FR0508392, PCT/FR2006/001880, US Application 2007/0031474 décrivent des préparations implantables contenant un matériau soluble ou non, pouvant être obtenu à partir de globine traitée, notamment par voie chimique, pour devenir au moins partiellement soluble à ce pH. La demande PCT/FR20071000137, non encore publiée, décrit des perfectionnements de préparations contenant de la globine. Toutes ces demandes et brevets sont ici incorporés par référence. La globine mise en oeuvre dans ces documents peut être d'origine hétérologue, par rapport à l'espèce traitée, mais il est de loin préféré qu'elle soit homologue, par exemple en étant préparée à partir de poches de transfusion sanguine, notamment des poches d'érythrocytes périmées. De façon particulièrement préférée, la globine peut être autologue, en provenance de prélèvements sanguins du patient lui-même. Les préparations à pH neutre contenant de la globine insoluble au pH neutre peuvent être préparées sous forme non solide et stérilisée, avec une excellente fluidité, permettant l'injection même à travers les aiguilles hypodermiques les plus fines, par exemple pour le comblement des rides cutanées. La présente invention se propose de fournir des nouvelles préparations contenant de la globine, qui soient particulièrement bien adaptées à certaines utilisations, notamment à des implantations en surface, par exemple, pour recouvrir des plaies cutanées, telles que les plaies chroniques, notamment des diabétiques, ou des implantations pour le comblement de volumes importants, par exemple les alvéoles osseuses après extraction dentaire ou les poches parodontales ou les lacunes importantes, osseuses ou autres. L'invention a pour objet des préparations contenant, notamment, de la globine insoluble à pH neutre et donc physiologique, dans lesquelles la globine a été obtenue à partir de sang total par dépigmentation dans un milieu extrayant ou dissolvant l'hème, mais laissant la globine et les autres constituants de nature protéique dans un état sensiblement non dissout. Ainsi, lors de l'élimination du milieu ayant extrait ou dissout l'hème, on peut obtenir, par exemple par filtration ou centrifugation, un matériau de globine insoluble au pH physiologique contenant aussi de la globine soluble au pH physiologique, et en quantités plus faibles, des protéines plasmatiques, notamment de l'albumine, des alpha, béta et gamma-globulines, des facteurs de la coagulation et des facteurs plaquettaires. Ce matériau protéique dérivé du sang et décoloré, dit �matériau protéique� peut être utilisé sous forme de pâte ou de suspension dans un véhicule physiologiquement acceptable. fl peut aussi être rendu à l'état plus ou moins sec, par exemple par dessiccation ou lyophilisation et se présenter sous forme de poudre, de granules, de gel, de film, d'éponge ou d'implant solide préformé, notamment sous les formes décrites dans les demandes et brevets énumérés ci-dessus. La préparation peut se trouver, notamment, dans un état acide ou dans un état neutre. Le matériau peut être associé à des supports, notamment implantables, par exemple des pansements divers, des fils ou textiles chirurgicaux, notamment les supports décrits dans les demandes et brevets énumérés ci-dessus. Il peut aussi être associé, dans la préparation, à d'autres substances ou principes actifs, notamment ceux décrits dans les demandes et brevets énumérés ci-dessus. Par exemple il peut être associé aux substances actives suivantes : antibiotiques, produits antimicrobiens tels que sels d'argent, colle de fibrine homologue ou autologue, adhésifs chimiques biocompatibles. Il peut être associé, avant ou au moment de son utilisation, à diverses cellules, dont les cellules souches des lignées sanguines ou d'autres organes isolées du même patient ou d'un autre donneur, en vue d'une greffe de ces cellules pour des applications de thérapie cellulaire. Par exemple, la préparation peut contenir des leucocytes, de préférence des leucocytes provenant du sang total à partir duquel la préparation a été obtenue. Enfin la préparation peut comporter des substances auxiliaires, par exemple des agents lubrifiants, notamment celles décrites dans les demandes et brevets énumérés ci-dessus : parmi celles-ci on peut avantageusement citer les suivantes : Hyaluronate de sodium, Gélatine, Cellulose oxydée, Esters de cellulose, Polyethylène glycol, Glycérine ou leurs mélanges, Les supports minéraux constituent aussi une famille de substances auxiliaires utiles, notamment les phosphates de calcium, l'hydroxy-apatite, pour le comblement osseux. De préférence la concentration du susdit matériau protéique dans la préparation, en l'absence d'un éventuel support, est comprise entre 2 ou 2,5% et 100%, la globine formant elle-même, de préférence, la majorité substantielle dudit matériau protéique. De manière particulièrement préférée, le pourcentage de globine insoluble et soluble représente plus de 60% du matériau protéique total. La globine insoluble à pH physiologique représente un support solide sur lequel les cellules peuvent s'attacher et se multiplier, constituant un matériau de comblement qui accélère le processus de cicatrisation des plaies, des organes capables d'auto-régénération ou de cicatrisation, ou de comblement des cavités ou autres espaces vides. L'invention a également pour objet un procédé pour obtenir ces préparations, procédé dans lequel on traite du sang total, de préférence décongelé ou hémolysé, avec, le cas échéant, les éléments ou débris cellulaires en suspension, dans un milieu extrayant ou dissolvant l'hème, mais laissant la globine et les autres constituants de nature protéique dans un état sensiblement non dissout, puis on élimine ce milieu pigmenté pour obtenir la globine, avec d'autres protéines plasmatiques. Dans un mode de mise en oeuvre particulier, les leucocytes sont d'abord séparés du sang, de manière stérile et sont stockés à part, pour échapper au traitement d'extraction de l'hème qui est agressif vis-à-vis de ces cellules. Ces leucocytes peuvent, en final, être remélangés au matériau protéique contenant la globine. L'ensemble donne un matériau de comblement cellularisé, à base de globine comme support insoluble, qui peut avoir de nombreuses applications médicales dans les domaines de la cicatrisation, en favorisant l'élimination des bactéries de la plaie, mais aussi dans le domaine des greffes et de la thérapie cellulaire. De préférence, le milieu d'extraction de l'hème est un milieu acétonique, de préférence acide, par exemple contenant 99 volumes d'acétone et 1 volume d'acide chlorhydrique concentré (12N). Le sang décongelé et hémolysé peut être, de manière préférée, soumis à une oxydation préalable qui permet la transformation de l'hémoglobine en methémoglobine, pour améliorer la décoloration ultérieure. Cette oxydation peut être réalisée par exemple en présence de nitrite de sodium et de glycocolle à pH neutre. Ensuite le sang oxydé est versé lentement et sous agitation forte dans une solution acétonique acide, ce qui entraîne l'extraction immédiate de l'hème et la précipitation simultanée des protéines du sang. Le matériau protéique précipité est de préférence lavé par plusieurs volumes d'acétone avant d'être séché sous vide pour éliminer toute trace résiduelle d'acétone. A ce stade, le matériau protéique est sous forme de poudre acide. La neutralisation de cette poudre peut ensuite être réalisée pour optimiser sa biocompatibilité avec les tissus et plaies à traiter. Le matériau ou poudre acide est remis en solution aqueuse, puis neutralisée de préférence par addition d'une solution alcaline ou tamponnée de type phosphate ou carbonate. Une poudre neutre peut ensuite être obtenue par lyophilisation ou précipitation acétonique. Elle peut être éventuellement remise en suspension par addition d'une solution saline physiologique pour préparer une pâte plus ou moins épaisse. L'ensemble des étapes du procédé peut être mis en oeuvre dans un même environnement stérile, par exemple sous une hotte chimique située dans un laboratoire ou un espace stérile. Par ailleurs, le matériau de globine obtenu, à l'état humide ou séché, de préférence sous forme d'une préparation achévée et conditionnée, peut être stérilisé par rayonnement beta ou gamma à une dose de 5 à 30kGray, si nécessaire sous forme congelée, par exemple en carboglace. Les préparations selon l'invention présentent de grandes qualités d'intégration dans les milieux tissulaires récepteurs. La préparation implantée est facilement colonisée par les cellules localement pertinentes, par exemple fibroblastes, ostéoblastes, chondroblastes, cellules souches, qui peuvent se différencier pour former un nouveau tissu remplaçant progressivement la masse de globine insoluble implantée. Ainsi les préparations selon l'invention peuvent être utilisées pour la cicatrisation des plaies tissulaires chirurgicales, des plaies chroniques, par exemple chez les patients diabétiques et faciliter la formation d'un tissu dermique et épidermique vascularisé. Elles peuvent, notamment, être utilisées pour aider à la cicatrisation ou à la reconstitution de parties d'organes, ou de tissus osseux, par exemple dans les cavités de fractures ouvertes, les alvéoles d'extraction dentaires, convenablement remplies par la préparation, ou dans des poches parodontales. D'une façon générale les préparations selon l'invention sont utilisables dans le cadre du comblement, de la cicatrisation ou la régénération de tissus, notamment de tissus conjonctifs ou osseux. On préfère, en général, dans ce cadre, utiliser des formes sèches, notamment des préparations sous forme de poudre ou de granules, facilitant la pénétration de la préparation implantée par les sérosités du patient. L'invention a donc également pour objet un procédé de traitement ou comblement, notamment pour la cicatrisation, dans lequel on implante, dans ou sur un tissu d'un patient qui en éprouve le besoin, une quantité thérapeutiquement efficace d'une préparation selon l'invention. L'invention a également pour objet l'utilisation dudit matériau protéique pour la réalisation de préparations pour le traitement ou comblement ou la régénération de tissus, notamment pour la cicatrisation de tissus, notamment de tissus conjonctifs ou osseux. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemples non limitatifs. Exemple 1 : Préparation d'une poudre acétonique acide de globine et protéines du sang. 30m1 de sang humain sont prélevés sur une poche de sang de donneur volontaire et immédiatement mis au congélateur à -20°C. Après décongélation, le sang est additionné de 10m1 d'eau distillée pour compléter l'hémolyse des globules rouges. 0,8ml de glycine 1 M, puis 0, 4m1 de nitrite de sodium I M sont ajoutés. Après oxydation de l'hémoglobine en methémoglobine pendant 1h, le sang prend une couleur noire. Si cette oxydation n'est pas réalisée, la décoloration de la poudre finale est moins efficace, ce qui peut gêner son acceptation par le patient. La solution de sang oxydé est alors ajoutée goutte à goutte sous agitation forte dans 400ml d'acétone (10 volumes) contenant 4ml d'acide chlorhydrique 12N concentré. Le pigment noir de l'hème est extrait dans l'acétone, pendant que la globine est immédiatement décolorée et précipitée avec les autres protéines du sang. La suspension est ensuite filtrée à travers une membrane textile rectangulaire de filtration, de porosité voisine de 1 micron, roulée dans la longueur, en forme de boyau et dont les deux côtés sont soudés l'un sur l'autre (Par exemple: Tubes de diamètre interne 20mm, soudés par ultrasons, de toile SEFAR NITEX 03-111). Une extrémité du boyau est reliée à un entonnoir pour introduire la suspension à filtrer, pendant que l'autre extrémité est bouchée par une pince. Le précipité protéique s'accumule dans le boyau, pendant que la solution acétonique pigmentée filtre facilement et peut être éliminée dans un bac de rétention, avant évacuation pour recyclage de l'acétone. A la fin de la filtration, le précipité acide est remis en suspension dans 200m1 d'acétone, puis refiltré sur le même boyau pour éliminer les traces résiduelles de pigments. Le lavage est répété une deuxième fois pour achever la décoloration du précipité protéique acide. Pour améliorer encore sa décoloration, le précipité acide peut être redissout dans 100m1 d'eau distillée stérile, puis la solution obtenue peut être versée à nouveau dans 10 volumes d'acétone acide, pour extraire les dernières traces de pigments et reprécipiter la globine et les protéines plasmatiques. Les opérations de filtration et de lavages acétoniques sont reproduites comme dans le premier traitement. Le précipité acide protéique final est ensuite étalé sur une faible épaisseur, sous un courant d'air dans une hotte stérile à flux laminaire. On obtient en final 4,25g d'une poudre protéique acide, de couleur blanche à ocre clair, contenant la globine et les protéines plasmatiques et plaquettaires, dont en particulier l'albumine, des alpha, bêta, et gamma globulines, des facteurs de coagulation, de multiplication cellulaire et de cicatrisation. Ces diverses protéines peuvent être facilement visualisées par la technique courante d'électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodecyl Sulfate. Exemple 2 : Préparation d'une poudre neutre lyophilisée de globine et protéines du sang. La poudre de l'exemple 1 est préparée selon le procédé décrit. Ensuite la poudre est reprise par 100m1 d'eau distillée stérile, neutralisée à pH 7 par addition de soude 1M, puis lyophilisée. La poudre neutre obtenue est finement divisée et s'écoule facilement. Elle est de couleur blanche à ocre clair. Elle est stérilisée dans son conditionnement final par irradiation béta ou gamma à une dose de 5 à 30kGray. Exemple 3 : Préparation d'une poudre acétonique neutre de globine et protéines du sang. La poudre de l'exemple 1 est préparée selon le procédé décrit. Ensuite la poudre est reprise par 100m1 d'eau distillée stérile, puis neutralisée à pH 7 par addition de soude 1M. La suspension neutre est ensuite versée lentement dans 1000ml (10 volumes) d'acétone sous agitation forte. Toutes les protéines précipitent immédiatement et le précipité est recueilli par filtration sur le même type de boyau filtrant que celui utilisé à l'exemple 1. Le précipité protéique est lavé deux fois par 200m1 d'acétone, récolté après décantation, puis finement divisé avec une spatule et séché en couche mince, sous un courant d'air dans une hotte stérile à flux laminaire. La poudre neutre obtenue est finement divisée et s'écoule facilement. Elle est de couleur blanche à ocre clair. Elle est stérilisée dans son conditionnement final par irradiation béta ou gamma à une dose de 5 à 30kGray. Exemple 4 : Préparation d'une pâte neutre de globine et protéines du sang. La poudre acétonique neutre de l'exemple 3 est préparée, sans être irradiée. 5g de poudre sont repris par 25m1 d'une solution saline physiologique de type PBS ou Ringer et la pâte obtenue est répartie dans son conditionnement final (par exemple en tube souple). La pâte est congelée dans la carboglace à -80°C et irradiée par béta ou gamma-irradition sous forme congelée. Après décongélation, la stérilité des tubes de pâte protéique est vérifiée par les tests microbiologiques. On obtient en final 30g d'une pâte protéique neutre, de couleur ocre clair, contenant la globine et les protéines plasmatiques et plaquettaires, dont en particulier l'albumine, des alpha, béta, et gamma globulines, des facteurs de coagulation, de multiplication cellulaire et de cicatrisation. Ces diverses protéines peuvent être facilement visualisées par la technique courante d'électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de Sodium Dodecyl Sulfate. L'irradiation sous forme congelée n'entraîne pas de modification significative du profil électophorétique des protéines. Exemple 5: Préparation d'une pâte neutre de globine et protéines du sang enrichie en leucocytes du donneur. La poudre acétonique neutre de globine de l'exemple 3 est préparée selon le procédé décrit, à l'exception du traitement initial du sang. Le prélèvement sanguin fraîchement obtenu, peut par exemple être centrifugé à 3000 tours/mn pendant 20mn dans un godet stérile. La couche leucocytaire intermédiaire est aspirée à l'aide d'une pipette. Les leucocytes du prélèvement sont lavés par une solution physiologique tamponnée, de type Ringer ou PBS, puis mis en présence des agents de conservation déjà connus, notamment pour leur congélation à - 80°C. Cette suspension leucocytaire pourra être remélangée en final avec la pâte de globine. La couche plasmatique est ensuite mélangée avec le culot de globules rouges, puis l'ensemble est mis en congélation. Après décongélation la suspension hémolysée peut être traitée selon l'exemple 1. La poudre acétonique neutre de globine est ensuite préparée, selon l'exemple 3. En final, la poudre de globine est stérilisée par irradiation à 30kGray et peut être reprise par un volume minimum de solution physiologique au moment du mélange avec les leucocytes stériles. Le matériau protéique cellularisé, à base de globine peut être utilisé pour des applications de cicatrisation ou de greffes de cellules souches de la lignée sanguine, dans le traitement des hémopathies ou pour des applications de thérapie cellulaire. Exemple 6 : Propriétés cicatrisantes du matériau de globine et protéines du sang porcin. Une préparation de poudre ou de pâte neutre de globine et protéines du sang est préparée à partir de sang de porc, selon l'un quelconque des exemples 2 à 5. Une expérimentation sur des plaies cutanées profondes, rectangulaires de 2x3 cm de côté, créées chez le porc, permet de vérifier l'intérêt de ce matériau protéique homologue dans le processus de cicatrisation. Le volume de la plaie est comblé par le matériau protéique porcin et les plaies sont ensuite recouvertes par un pansement non adhérent de type Tegaderm�. Le corps du porc est ensuite recouvert d'un pansement serré qui protège les plaies de toute contamination externe. Tous les 3 à 4 jours, les plaies sont nettoyées à l'eau physiologique et lorsque une cavité est encore présente, le même matériau protéique de comblement est appliqué, jusqu'à création d'un tissu de granulation qui remplit la plaie initiale. La présence d'une partie soluble dans la poudre permet l'aspiration et le drainage des fluides physiologiques, � exsudats � de la plaie, qui dissolvent la globine soluble, hydratent la poudre de globine insoluble et libèrent les autres constituants importants pour les cellules et le développement du tissu de granulation. L'espace interstitiel ainsi libéré permet une migration et une colonisation cellulaire optimale de l'implant. Ces fluides et les cellules migrent et s'adsorbent sur les granules de globine insoluble et favorisent un comblement rapide par le tissu de granulation. Cet agent de comblement apporte pratiquement la plupart des éléments du caillot sanguin. II est parfaitement toléré et dégradé en moins de deux semaines. II diminue de manière significative la contraction par les berges de la plaie et favorise une cicatrisation harmonieuse en moins de quatre semaines, caractérisée par une épithélialisation complète de bonne qualité. Exemple 7 : Applications médicales du matériau de globine et protéines du sang humain. La poudre obtenue selon l'un quelconque des exemples 1 à 3 est finement divisée et s'écoule facilement, ce qui facilite son application locale sur des plaies externes ou internes, à l'aide de flacons, sachets, ou autres applicateurs classiques, ou par pulvérisation. La pâte des exemples 5 et 6 peut aussi être utilisée au contact de plaies cutanées très sensibles, pour lesquelles un produit sec risquerait d'être un peu plus irritant. L'application de la pâte peut se faire par injection à l'aide de seringues dans des plaies ou cavités internes, ou superficiellement par pression manuelle sur des tubes. Les préparations selon l'invention peuvent être utilisées pour le comblement de rides, d'autres défauts cutanés ou de sphincters déficients. Elles peuvent être utilisées pour la cicatrisation de plaies internes chirurgicales, de parties d'organes, des plaies chroniques des tissus cutanés, par exemple chez les patients diabétiques, ou atteints de troubles artériels ou veineux créant une mauvaise vascularisation locale des membres, ou atteints d'escarres. Le concentré de globine et protéines du sang apporte localement certains facteurs sanguins de cicatrisation, que l'irrigation normale des tissus n'apporte plus chez ces patients. En outre, les particules de globine insoluble favorisent et accélèrent la formation d'un tissu spécifique, conjonctif, dermique ou épidermique vascularisé. La préparation implantée est facilement colonisée par les cellules localement pertinentes telles que les fibroblastes qui peuvent se différencier pour synthétiser des fibrilles collagéniques et former un nouveau tissu remplaçant progressivement le matériau protéique implanté. Ces préparations peuvent aussi être utilisées pour aider à la régénération d'un tissu de granulation sur des plaies profondes de brûlés après excision des tissus nécrotiques. Cette étape est importante avant la greffe de feuillets d'épithélium cultivé in vitro. Ces préparations peuvent aussi être utilisées pour aider à la cicatrisation ou à la reconstitution de tissus osseux ou cartilagineux, par exemple dans les cavités de fractures ouvertes, les alvéoles d'extraction dentaires, convenablement remplies par le matériau, ou dans des poches parodontales. Le matériau protéique facilite la migration, l'attachement et la différentiation des ostéoblastes ou chondrocytes et plus généralement des cellules souches présentes ou ajoutées à la préparation. II permet un comblement et une régénération tissulaire plus rapides. Revendications 1. Préparation contenant, notamment, de la globine insoluble à pH physiologique, dans laquelle la globine a été obtenue à partir de sang total par dépigmentation dans un milieu extrayant ou dissolvant l'hème, mais laissant la globine et les autres constituants de nature protéique dans un état sensiblement non dissout. 2. Préparation selon la revendication 1, contenant un matériau de globine insoluble à pH physiologique, avec de la globine soluble au pH physiologique, et en quantités plus faibles, des protéines plasmatiques, notamment de l'albumine, des facteurs de la coagulation et des facteurs plaquettaires. 3. Préparation selon l'une des revendications 1 et 2, dans un état acide. 15 4. Préparation selon l'une des revendications 1 et 2, dans un état neutre. 5. Préparation selon l'une des revendications 1 à 4, contenant des leucocytes 20 6. Préparation selon la revendication 5, dans laquelle les leucocytes proviennent du sang total à partir duquel la préparation a été obtenue. 7. Préparation selon l'une des revendications 1 à 6, sous forme de pâte ou de suspension dans un véhicule physiologiquement acceptable. 8. Préparations selon l'une des revendications 1 à 6, sous forme de poudre, de granules, de gel, de film, d'éponge ou d'implant solide préformé. 9. Préparation selon l'une des revendications 1 à 8, associée à un support, 30 notamment implantable. 10. Préparation selon l'une des revendications 1 à 9, contenant une ou plusieurs autres substances ou principes actifs. 25 11. Préparation selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant une ou des substances auxiliaires. 12. Préparation selon l'une des revendications 2 à 11, dans laquelle la concentration du susdit matériau dans la préparation, en l'absence d'un éventuel support, est comprise entre 2 ou 2,5% et 100%, 13. Préparation selon la revendication 12, dans laquelle la globine forme la majorité substantielle dudit matériau. 14. Procédé pour obtenir les préparations selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel on traite du sang total, de préférence décongelé ou hémolysé, dans un milieu extrayant ou dissolvant l'hème, mais laissant la globine et les autres constituants de nature protéique dans un état sensiblement non dissout, puis on élimine ce milieu pigmenté pour obtenir la globine, avec d'autres protéines du sang. 15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel le sang total est traité dans un milieu acide. 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel on neutralise ensuite une solution acide du matériau contenant la globine. 17. Procédé selon la revendication 16, dans lequel on réalise une préparation sensiblement solide par lyophilisation ou précipitation en acétone de la suspension obtenue par la neutralisation. 18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17, dans lequel on sépare les leucocytes dudit sang total avant le traitement dans ledit milieu extrayant ou dissolvant l'hème, et, optionnellement, on rajoute les leucocytes séparés dans la préparation. 19. Utilisation d'une préparation selon l'une des revendications 1 à 13 pour la réalisation de préparations pour le traitement, comblement ou régénération de tissus, notamment pour la cicatrisation de tissus, notamment de tissus conjonctifs ou osseux.30