Brevet FR2915378A1 — publié le 20081031

-1- La présente invention se situe dans le domaine cosmétique et pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. La présente invention concerne l'utilisation dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif issu du soja (Glycine max L.) ; le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger les mitochondries et à activer l'aconitase. De préférence, le principe actif provient de l'hydrolyse de protéines de soja et contient principalement des polypeptides et des peptides. Il peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre principe actif. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané. Ledit principe actif, protecteur des mitochondries et activateur de l'aconitase, peut également être utilisé pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à prévenir ou lutter contre les pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux ; par exemple certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type II ou encore certaines pathologies du vieillissement. Le terme phanères selon l'invention englobe l'ensemble des annexes kératiniques présentes à la surface du corps, en particulier les poils, les cils, les sourcils, les ongles et les cheveux. Les mitochondries sont les organites des cellules eucaryotes spécialisées dans la production d'énergie. Elles sont dotées de leur propre ADN (ADNmt). L'énergie produite par la chaîne respiratoire est stockée sous forme d'ATP. Dans certaines conditions de stress cellulaire, les électrons, libérés par la chaîne respiratoire de phosphorylation oxydative, produisent des radicaux libres qui peuvent endommager les structures mitochondriales. Ces facteurs de stress peuvent être intrinsèques ou d'origine extérieure. Parmi ces derniers, on peut citer : les rayonnements UV, les toxines, les radiations, les oxydants alimentaires. Ainsi, on a pu montrer un déclin progressif des fonctions mitochondriales avec l'âge, probablement lié à l'accumulation de mutations sur l'ADNmt (K. Singh, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1019, 2004). Ces mutations de l'ADNmt peuvent être induites par des expositions répétées aux rayonnements UV, et seraient même un témoin du photo-vieillissement (M. Berneburg et al., J. of Invest. Dermatol. 122(5), 2004). Les mitochondries jouent également un rôle central dans l'apoptose. Les dégradations mitochondriales peuvent ainsi être un facteur déclenchant de la cascade réactionnelle -2- conduisant à l'apoptose dans de nombreux types cellulaires (G. Kroemer et al., FASEB J. 9:1277-87, 1995). Dans les mitochondries, des mécanismes naturels de réparation ont été identifiés. L'aconitase (aconitate hydratase ou Iron Regulatory Protein ; EC 4.2.1.3) s'est ainsi révélée être indispensable au maintien de l'intégrité de l'ADNmt, indépendamment de son activité catalytique. L'aconitase a tout d'abord été identifiée comme une enzyme mitochondriale impliquée dans le cycle de Krebs ; elle catalyse la conversion stéréospécifique du citrate en isocitrate et participe ainsi à la production d'énergie de la cellule. Elle possède un site actif comportant un agrégat fer-soufre (4Fe-4S) à géométrie pseudocubique. Récemment, l'équipe du D` Butow (X. J. Chen et al., Science 307, 2005) a pu montrer que l'aconitase jouait un rôle clé dans la préservation de l'intégrité de l'ADN mitochondrial. Elle interagirait avec l'ADN à l'intérieur de régions régulatrices suggérant un rôle dans le compactage du génome mitochondrial à la manière d'une protéine de la famille de HSP 70. Le passage de la forme liant l'ADN à la forme active de l'enzyme serait basé sur l'assemblage ou le désassemblage du cluster fer-soufre. Grâce à sa double fonctionnalité, l'aconitase établit un lien direct entre l'activité génératrice d'énergie de la mitochondrie et la conservation de l'ADNmt. L'aconitase pourrait ainsi constituer une cible thérapeutique pour prévenir ou lutter contre les pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux, par exemple, le diabète de type II, certaines affections neuromusculaires, certaines pathologies du vieillissement. La recherche de composés pouvant stimuler ou protéger les mitochondries est une préoccupation de la recherche médicale et de la cosmétique. Concernant la peau, ces nouveaux composés pourraient être utiles pour prévenir ou lutter contre les signes du vieillissement cutané, mais aussi pour protéger ou réparer la peau après des brûlures, des expositions à des rayonnements UV ou des radiations, ou des expositions à des toxines ou à des polluants. Afin de protéger les mitochondries et de lutter contre les pathologies associées ou les effets du vieillissement cutané, il a été proposé des solutions telles que l'apport de substances impliquées dans le métabolisme énergétique, et plus particulièrement d'intermédiaires ou de cofacteurs du cycle de Krebs tels que le fumarate, le L-malate, l'acétyl CoA (WO 02064129) ou encore le traitement de la peau par des substances capables de diminuer les radicaux libres, telles que la vitamine C (US 2004/0086526) ou la L-ergothionéine (WO 9836748). Mais, à la connaissance de la demanderesse, l'usage de principes actifs issus de l'hydrolyse du soja, -3- capables d'activer l'aconitase, dans le but de protéger les mitochondries et de lutter contre les pathologies associées et/ou les effets du vieillissement cutané, n'a jamais été décrit. La présente invention a pour principal objectif l'utilisation d'un principe actif issu de l'hydrolyse du soja, capable de protéger la peau des agressions extérieures et de lutter contre le vieillissement cutané. Ledit principe actif pourra être utilisé seul ou en association avec au moins un autre principe actif. Les inventeurs ont en effet mis en évidence une activité thérapeutique, et plus particulièrement dermatologique et cosmétique, d'un principe actif de nature peptidique, issu de l'hydrolyse du soja, capable d'activer l'aconitase. Il a notamment été mis en évidence que ce principe actif, lorsqu'il est appliqué sur la peau, favorise de façon importante l'activité mitochondriale, démontrée par une activité accrue de l'enzyme. Les propriétés nouvellement identifiées de ce principe actif protecteur des mitochondries permet ainsi d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques et cosmétiques. On entend par principe actif protecteur des mitochondries ou capable de protéger les mitochondries , toute substance d'origine végétale, et plus particulièrement issue du soja (Glycine max L.), capable de limiter les altérations fonctionnelles ou structurales des mitochondries de cellules ou de tissus soumis à un stress physico- chimique ou environnemental. On entend par principe actif capable d'activer l'aconitase , toute substance d'origine végétale, et plus particulièrement issue du soja (Glycine max L.), capable d'augmenter l'aconitase cytoplasmique ou mitochondriale, soit par l'activation de la synthèse protéique de l'aconitase (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique de l'aconitase), soit par l'augmentation de l'activité enzymatique de l'aconitase, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine aconitase ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager. Préférentiellement, le principe actif capable d'activer l'aconitase selon l'invention est un extrait de nature peptidique et provient de l'hydrolyse des protéines du soja (Glycine max L.). On entend par de nature peptidique , un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des polypeptides. Le terme peptide désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées ; le terme polypeptide désignant un peptide de taille plus importante. -4- Par l'expression biologiquement actif , on entend qui possède une activité in vivo ou in vitro caractéristique de l'activité du principe actif selon l'invention . Le terme "hydrolysat ou issu de l'hydrolyse" désigne toute substance ou mélange de substances, ou préparation isolée, obtenue après hydrolyse de matière végétale. 5 Le principe actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments peptidiques biologiquement actifs. De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir des 10 fragments peptidiques biologiquement actifs au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible d'utiliser certains extraits hydrolysés sans en 15 purifier les fragments peptidiques correspondant aux peptides biologiquement actifs selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés. Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière. ou une partie spécifique de la plante (feuille, grain, etc.). 20 Plus particulièrement selon l'invention, on utilise une des nombreuses plantes de la famille des Fabacées, du genre glycine ; le soja ou le tourteau de soja et préférentiellement de l'espèce Glycine max L. Dans une première étape, la plante est broyée à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique 25 (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone). On réalise ensuite l'extraction des protéines de la plante suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié; le broyat de plante est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0.01 - 20 ro) ; en effet il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de purifications ultérieures 30 étaient facilitées par ce moyen. La concentration des substances de type phénoliques interagissant avec les protéines se trouve ainsi réduite. -5- La fraction soluble est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration, cette solution brute constituant alors une première forme de l'extrait contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides. Les protéines sont ensuite précipitées en faisant varier la force ionique en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant organique tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme plus purifiée de l'hydrolysat. L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide toujours en présence de polyvinylpolypyrrolidone. Après une étape de filtration, l'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium) ou un solvant organique (alcool, acétone). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant. La fraction protéique isolée selon l'invention est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des polypeptides et des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). Pour les mêmes raisons que précédemment lors de cette étape d'hydrolyse ménagée une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu réactionnel. Après filtration la solution obtenue constitue l'hydrolysat actif. L'hydrolysat actif peut être encore purifié afin de sélectionner les poids moléculaires et la nature des peptides générés. Le fractionnement peut s'effectuer avantageusement par ultrafiltration et/ ou par une méthode de type chromatographique. L'une quelconque des formes plus ou moins purifiées de l'hydrolysat est alors solubilisée dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration. L'hydrolysat végétal obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés de nature protéique et peptidiques. On entend par composés de nature peptidique, les fragments -6- de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans le mélange. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat végétal actif a un pH compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6., un extrait sec titrant entre 1 à 8 g/1 et de manière préférée entre 2 et 5 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1 et sa teneur en sucres est de 0,5 à 2,5 g/l. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, classiquement utilisés par l'homme du métier, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbés sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur cosmétiquement ou phannaceutiquement acceptable. Il est bien entendu que le principe actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec au moins un autre principe actif, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique. Les compositions selon l'invention pourront être appliquées par toute voie appropriée, notamment orale, parentérale ou topique externe, et leur formulation sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques. Avantageusement, les compositions selon l'invention sont destinées à une administration par voie topique cutanée. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, d'émulsions huile-dans-eau ou eau-dans-huile, d'émulsions multiples, de solutions, de suspensions, de gels, de laits, de lotions, de sticks ou encore de poudres, adaptés à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères. -7- Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, anti-oxydants, colorants, conservateurs, parfums. Bien entendu, l'homme de métier veillera à choisir les éventuels composés complémentaires, actifs ou non-actifs, et/ou leur quantité, de telle sorte que les propriétés avantageuses du mélange ne soient pas altérées par l'adjonction envisagée. La composition utilisable selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après-shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, etc. La composition cosmétique selon l'invention peut être utilisée notamment dans les traitements mettant en oeuvre une application qui est suivie ou non suivie d'un rinçage, ou encore sous forme de shampooing. Elle peut également se présenter sous forme de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux. Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent en outre divers principes actifs destinés, notamment, à la prévention et/ou au traitement des désordres liés au photo-vieillissement. Ainsi, la composition selon l'invention peut associer, au principe actif capable d'activer l'aconitase selon l'invention, d'autres principes actifs favorisant son action. Par exemple, il peut être ajouté des principes actifs ayant une action anti-radicalaire ou antioxydante, choisis parmi la vitamine C, la vitamine E ou le coenzyme Q10 ou les extraits poly-phénoliques de plantes. Par principes actifs anti-radicalaires, on entend tout composé capable de piéger les radicaux libres. Ces principes actifs sont capables de bloquer les réactions en chaînes des radicaux libres avant les étapes ultimes de dégradation des constituants biologiques de la peau et ont de ce fait une activité antioxydante. La composition selon l'invention peut encore associer, au principe actif activateur de l'aconitase, des principes actifs stimulant les synthèses des macromolécules dermiques (lam.inine, fibronectine, collagène), par exemple le peptide de collagène commercialisé sous le nom Collaxyl par la société Vincience. La composition selon l'invention peut également associer, au principe actif activateur de l'aconitase, des principes actifs stimulant le métabolisme énergétique, comme le principe actif commercialisé sous la dénomination GP4G par la société Vincience. -8- Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut être une composition solaire, c'est-à-dire une composition aidant à la protection contre le rayonnement solaire. Ainsi, il peut être avantageusement ajouté, à la composition selon l'invention, des actifs aidant à la protection solaire tel que, par exemple, des filtres solaires. Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général, et plus particulièrement aux êtres humains. La quantité efficace de principe actif selon l'invention correspond à la quantité nécessaire permettant d'obtenir le résultat recherché, à savoir : activer l'aconitase, protéger les mitochondries et ainsi protéger la peau des agressions extérieures et lutter contre le vieillissement cutané. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif issu du soja est présent dans les compositions de l'invention à une concentration comprise 0,0001 % à 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la composition finale. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick, ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau. Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des principes auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc. Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, -9- correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Par ses activités particulières, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique. En particulier, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique destinée à lutter de manière préventive et/ou curative contre les manifestations du vieillissement cutané et, plus spécifiquement, afin de lutter contre et/ou de prévenir le vieillissement photo-induit (photo-vieillissement). Par manifestations cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d'élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV). Le principe actif selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra de lutter, en particulier, contre la perte d'élasticité et de fermeté de la peau. Le principe actif selon l'invention permet de protéger la peau et les phanères contre tous types d'agressions extérieures. L'utilisation du principe actif, ou d'une composition le contenant, va permettre à la peau et aux phanères d'être protégés et de mieux résister aux stress environnementaux. On entend, par l'expression agression extérieure , les agressions que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les UV, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums. Par pollution, on entend aussi bien la pollution extérieure , due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution intérieure qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier-peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldehyde), ou bien encore la fumée de cigarette. -10- Le principe actif selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, en tant que principe actif photo-protecteur et, plus particulièrement, en tant que principe actif photo-protecteur dit secondaire . On distingue, en effet, les principes actifs photo-protecteurs primaires des principes actifs photo-protecteurs secondaires. Les principes actifs photo-protecteurs primaires sont des substances qui exercent un pouvoir physique : ils sont en mesure d'absorber les rayonnements UV et de les restituer sous forme de chaleur afin de protéger la peau. Les principes actifs photo-protecteurs secondaires sont des substances qui ont généralement un effet biologique ; ce sont, par exemple, les principes actifs capables de limiter les dommages causés à l'ADN et aux membranes par la pénétration des rayonnements UV dans la peau. L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à prévenir les dommages causés à la peau par une exposition au soleil ou une exposition à des rayonnements ionisants lors de radiothérapies. L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger les mitochondries, en particulier sur les zones du corps exposées aux rayonnements UV. L'invention se rapporte encore à l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger la peau des dommages causés par les radicaux libres. L'invention consiste encore en une composition pharmaceutique caractérisée en ce que le principe actif selon l'invention est formulé pour atténuer une pathologie liée à des dysfonctionnements mitochondriaux, par exemple, certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type II, certaines pathologies du vieillissement. Des modes particuliers de réalisation de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif -11-Exemple 1 : Préparation de principe actif à partir de tourteau de sofa (Glycine max L.) Les tourteaux sont les résidus solides obtenus après extraction de l'huile des graines de soja. Ils représentent de 50 à 75 % de la masse des graines. Le principe actif est obtenu à partir d'un extrait de plantes de l'espèce Glycine max L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Glycine. Dans une première étape, 1 kg de tourteau de soja est broyé dans un broyeur à céréale la farine obtenue est délipidée par l'action d'un solvant organique, l'hexane. Après filtration et séchage sous vide la poudre obtenue est mise en suspension dans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10) pH 10, contenant 1 % de polyvinylpolypyrrolidone ( Polyclar V ISP). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 4 et 80 C) ; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat qui contient les fractions solubles du soja est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier laforce ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants glucidiques solubles, les lipides et les acides nucléiques le milieu est amené à pH 3,5. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait protéique brut contenant : - Protéines : 75 % Glucides : 20 % Lipides : 5 % Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant. L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques en présence de 0,5 % de PVPP (Polyclar V) et d'endopeptidases à cystéine (papaïne, ficine). Après réaction l'hydrolysat est filtré sur plaque puis sur cartouche stérilisante (0,21am). On obtient alors un hydrolysat de couleur claire titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec qui est alors dilué de telle sorte que la concentration en composés de nature peptidique déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 -12- g/1. L'analyse physico-chimique de l'hydrolysat végétal, qui constitue le principe actif, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, l'extrait sec titre entre 1 à 8 g/1 et de manière préférée entre 2 et 5 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 à 2 g/1 et sa teneur en sucres entre 0,5 à 2,5 g/1. Exemple 2 : Préparation de principe actif à partir de soja (Glycine max L.) Une variante du protocole de l'exemple 1 consiste à réaliser la même séquence d'hydrolyses enzymatiques ménagées et sélectives mais en présence de 0,5 % de PVPP. On obtient alors un hydrolysat de couleur claire titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec après filtration stérilisante On procède ensuite à une ultrafiltration de la solution sur une cartouche de filtration Millipore Helicon (cut off 1 kDa). Les hauts poids moléculaires contenus dans le retentât sont écartés le filtrat est conservé. La concentration en composés de nature peptidique est déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement: entre 0,5 et 2 g/l. L'analyse physico-chimique de l'hydrolysat végétal, qui constitue le principe actif, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, l'extrait sec titre entre 1 à 8 g/1 et de manière préférée entre 2 et 5 g/l, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/1 et préférentiellement entre 0,5 à 2 g/1 et sa teneur en sucres entre 0,5 à 2,5 g/1. Une autre variante consiste à effectuer une purification du principe actif, obtenu selon l'exemple 1 ou 2, par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne TSK gel (TosoHaas) avec un tampon phosphate Ph7. Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet activateur du principe actif selon l'exemple 1 sur l'activité enzymatique de l'aconitase Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur l'activité enzymatique de l'aconitase. Pour cela l'activité enzymatique totale (cytoplasmique et mitochondriale) et l'activité enzymatique mitochondriale de l'aconitase ont été mesurées. Protocole : Des fibroblastes humains normaux sont traités avec une solution à 1 %, du principe actif selon l'exemple 1, pendant 48 heures, puis soumis à une irradiation par des UVB à 100mJ/cm2. Après l'irradiation, les cellules sont traitées dans les mêmes conditions -13- pendant encore 24 heures. Des contrôles négatifs sont réalisés dans les mêmes conditions mais en l'absence de principe actif selon l'exemple 1. Pour évaluer l'activité enzymatique de l'aconitase, les fibroblastes sont ensuite récoltés et centrifugés dans du tampon PBS. Une partie des cellules est ensuite traitée pour réaliser le 5 dosage de l'activité enzymatique totale, une autre partie est utilisée pour isoler la fraction mitochondriale selon le protocole suivant : Les cellules sont lysées à l'aide d'un homogénéisateur de type Dounce et l'homogénat est centrifugé à froid, à 10000 g pendant 10 minutes. Le culot, riche en mitochondries, est lavé avec du tampon TES (10 mM Tris, 1 mM EGTA, 0,25 M sucrose) et resuspendu dans du 10 tampon 0,2 mM citrate trisodique avant d'être utilisé pour le dosage enzymatique. Le dosage de l'activité enzymatique de l'aconitase est réalisé à l'aide du Kit OXIS Bioxytech Aconitase-340 assay (Oxys International), selon le principe suivant : l'aconitase provoque l'isomérisation du citrate en isocitrate. L'isocitrate est ensuite transformé en alphaketoglutarate par l'enzyme isocitrate déshydrogénase. cette deuxième réaction s'accompagne 15 de la transformation de NADP+ en NADPH. C'est la formation de NADPH qui est quantifiée par spectrophotométrie à 340 nm. Dans les conditions expérimentales choisies, la vitesse de formation du NADPH est proportionnelle à la quantité d'aconitase. L'analyse de la cinétique d'apparition du NADPH permet de calculer la concentration en aconitase de l'échantillon (en mU/ml). 20 Résultats : Les dosages de l'activité enzymatique totale de l'aconitase montrent une augmentation de plus de 55 % de l'activité dans les cellules traitées par le principe actif selon l'exemple 1 comparées aux cellules contrôle non traitées. Lorsque les cellules sont irradiées par les UVB, on observe au contraire une diminution de plus de 30 % de cette activité. Le traitement, préalable et postérieur à l'irradiation UVB, par le principe actif selon l'exemple 1, 25 permet de limiter la diminution observée dans les cellules contrôle non traitées. Les dosages de l'activité enzymatique de l'aconitase mitochondriale montrent des résultats comparables. Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 stimule fortement l'activité enzymatique des aconitases cytoplasmiques et mitochondriales des cellules cutanées. L'action du principe 30 actif selon l'exemple 1 protège les cellules et les mitochondries vis à vis d'un stress par les UVB. -14- Exemple 4 : Evaluation de l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolets (UVB) Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 vis-à-vis de fibroblastes dermiques soumis à un stress par des rayonnements UVB. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT. Protocole : Les fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 % du principe actif selon l'exemple 1, pendant 24 heures, irradiés par des UVB (de 25 à 100 mJ/cm2) puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration de principe actif selon l'exemple 1. Des contrôles non traités et non irradiés et des contrôles non traités mais irradiés sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (344, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure). Ce composé est absorbé par les cellules vivantes puis métabolisé par les enzymes mitochondriales en un composé bleu violet, le formazan, qui sera dosé par spectrophotométrie à 540 nm. La densité optique (D.O.) est alors directement proportionnelle à l'activité enzymatique mitochondriale ainsi qu'au nombre de cellules vivantes. Résultats : L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre, d'une part, que le principe actif selon l'exemple 1, indépendamment de tout rayonnement UVB, augmente la viabilité cellulaire et d'autre part, que les irradiations par les UVB ont eu un effet cytotoxique dose-dépendant sur les fibroblastes humains, mais que cet effet cytotoxique ne se manifeste pas en présence de 1 % de principe actif selon l'exemple 1. Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 augmente la viabilité cellulaire et d'autre part, protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cytotoxiques des rayonnements UVB. Exemple 5 : Evaluation de l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 sur les cellules cutanées soumises à un stress oxydatif Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 vis-à-vis de fibroblastes dermiques soumis à un stress oxydatif provoqué par de l'eau oxygénée (H2O2) à 4 mM ou 5 mM. Pour cela, des tests de viabilité cellulaire ont été réalisés par la technique au MTT. -15- Protocole : Les fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 % du principe actif selon l'exemple 1, pendant 24 heures, soumis à un stress oxydatif provoqué par de l'H2O2 à 4 mM ou 5 mM, pendant 30 minutes puis cultivés encore 24 heures en présence de la même concentration de principe actif selon l'exemple 1. Des contrôles non traités par le principe actif ni par de l'H2O2 et des contrôles de traitement avec le principe actif seul sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont incubées dans une solution contenant 0,1 mg/ml de MTT (344, 5-diméthylthiazol-2-yl]-2, 5-diphényltétrazolium, bromure), selon le protocole décrit dans l'exemple 4. Résultats : L'évaluation de la viabilité cellulaire par la technique du MTT montre, d'une part, que le principe actif selon l'exemple 1, indépendamment d'un stress oxydatif, augmente la viabilité cellulaire, et d'autre part, qu'un stress oxydatif provoqué par de l'H2O2 à 4 mM ou 5 mM pendant 30 minutes, a eu un effet cytotoxique dose-dépendant sur les fibroblastes humains, mais que cet effet cytotoxique ne se manifeste pas en présence de 1 % de principe actif selon l'exemple 1. Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 augmente la viabilité cellulaire et protège efficacement les cellules cutanées contre les effets cytotoxiques d'un stress oxydatif. Exemple 6 : Evaluation de l'effet cytoprotecteur du principe actif selon l'exemple 1 sur les cellules cutanées soumises à des rayonnements ultraviolets (UVB) Une étude de l'effet cytoprotecteur du principe actif selon l'exemple 1 a été réalisée en évaluant les dommages provoqués au niveau de l'ADN. Cette étude a été réalisée grâce au test des comètes (ou Single Cell Gel Electrophoresis ), une technique micro-électrophorétique courte et sensible qui permet de visualiser et de quantifier les cassures de l'ADN sur des cellules individuelles. Protocole : Des fibroblastes humains primaires sont ensemencés dans des boîtes de diamètres 100. Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence, elles sont traitées avec une solution à 1 % de principe actif selon l'exemple 1, pendant 24 heures. Les cellules sont ensuite soumises à une irradiation UVB à 100 mJ/cm2, puis cultivées en présence du principe actif pendant encore 24 heures. Des boîtes non traitées par le principe actif servent de contrôle. Une suspension cellulaire à 100 000 cellules/ml est ensuite réalisée, 500 l sont prélevés, inclus dans une solution d'agarose et coulés entre lame et lamelle. Les cellules sont lysées à froid. L'ADN est ensuite dénaturé par un tampon alcalin puis soumis à une courte -16-électrophorèse (250 mA pendant 30 minutes) et mis en évidence par une coloration à l'iodure de propidium. Les lames sont alors observées au microscope à fluorescence. Une cellule altérée voit son ADN s'étirer vers l'anode proportionnellement au nombre de cassures présentes dans l'ADN et forme une comète . L'ADN fortement dégradé se trouve dans la queue de la comète. Une cellule intacte reste ronde et son ADN est alors compacté au niveau de la tête de la comète. L'évaluation des cassures de l'ADN s'effectue à l'aide d'un logiciel analyseur d'image qui permet de déterminer le pourcentage de dégradation de l'ADN, par l'évaluation quantitative du Tail Moment , un paramètre se définissant comme le produit de la longueur de la comète par le pourcentage d'ADN dans sa partie distale. Résultats : Les résultats obtenus montrent que les cellules soumises à une irradiation UVB, en l'absence du principe actif selon l'exemple 1 (contrôle UVB), présentent le Tail Moment le plus important, c'est-à-dire la condition où l'ADN est le plus endommagé. Au contraire, les cellules traitées avec le principe actif selon l'exemple 1, ont un Tail Moment , c'est à dire des dommages à l'ADN, diminué de 25 %. Conclusion : Le principe actif selon l'exemple 1 joue un rôle important dans la protection de l'ADN des cellules cutanées soumises à une irradiation par les UVB. Exemple 7 : Préparation de compositions 1 - Crème protection solaire: Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp Pemulen TRI Acrylates/C10-30 Alkyl Acrylale 0,40 Crosspolymer Glycerine Glycerin 3,00 Nipastat Sodium Sodium Methylparaben (and) Sodium 0,15 Ethylparaben (and) Sodium Butyl paraben (and) Sodium Propylparaben (and) Sodium Isobutylparaben PHASE B Parsol MCX Ethylhexyl Methoxycinnamate 7,50 Eusolex 4360 Benzophenone-3 3,00 Parsol 1789 Butyl Methoxydibenzoylmethane 2,00 -17- Noms commerciaux Noms INCI % massique Myritol 318 Caprylic/Capric Triglyceride 4,00 Emulgade SEV Hydrogenated Palm Glycerides (and) 5,00 Ceteareth-20 (and) Ceteareth-12 (and) Cetearyl Alcohol Propylparaben Propylparaben 0,15 Nacol 16-98 Cetyl Alcohol 1,00 PHASE C TEA Triethanolamine 0,20 PHASE D Principe actif selon l'exemple 1 3 Parfum Parfum (Fragrance) qsp Colorant qsp Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément entre 70 C et 75 C. La phase B est émulsionnée dans la phase A sous agitation. La phase C est ajoutée, à 45 C, en augmentant l'agitation. La phase D est ensuite additionnée lorsque la température se 5 situe en dessous de 40 C. Le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25 C sous vive agitation. 2 ûLait après-soleil : Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE A Montanov L C 14-22 Alcohols (and) C 12-20 3,00 Alkyl Glucoside Waglinol 2559 Cetearyl Isononanoate 4,00 Tegosoft TN C12-15 Alkyl Benzoate 3,00 Huile de Noyaux d'Abricot Prunus Armeniaca (Apricot) Kernel 2,00 Oil Huile d'Avocat Persea Gratissima (Avocado) Oil 1,00 Abil 350 Dimethicone 1,00 PHASE B Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp -18- Noms commerciaux Noms INCI % massique PHASE C Simulgel EG Sodium Acrylate/Acryloyldimethyl 0,4 Taurate Copolymer (and) Isohexadecane (and) Polysorbate 80 Copolymer (and) Polysorbate 80 PHASE D Phenonip Phenoxyethanol (and) 0,30 Methylparaben (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Ethylparaben and Propylparaben and Buthylparaben Germall 115 Imidazolidinyl Urea 0,20 PHASE E Principe actif selon l'exemple l 0,1 Préparer la phase A sous agitation. Incorporer la gomme xanthane progressivement, sous agitation défloculeuse. Les phases C et D seront incorporées une fois le gel terminé. La phase E, préparée préalablement jusqu'à parfaite dissolution de la DHA, sera rajoutée ensuite. Ajuster le pH si nécessaire à 4 - 4,5. Colorer et parfumer. 3 ûCrème anti-âge : Noms commerciaux Noms INCI % massique Phase A Montanov 68 Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl Glucoside 6,00 Squalane Squalane 3,00 Cetiol SB 45 Butyrospermum Parkii ( Shea Butter) 2,00 Waglinol 250 Cetearyl Ethylhexanoate 3,00 -19- Noms commerciaux Noms INCI % massique Amerchol L- 101 Minerai Oil (and) Lanolin Alcohol 2,00 Abil 350 Dimethicone 1,50 BHT BHT 0,01 Coenzyme Q10 Ubiquinone 0,10 Phase B Huile d'Avocat Persea Gratissima (Avocado) Oil 1,25 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) 0,75 Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Phase C Eau déminéralisée Aqua (Water) qsp Butylene Glycol Butylene Glycol 2,00 Glucam El0 Methyl Gluceth-l0 1, 00 Allantoin Allantoin 0,15 Carbopol Ultrez 10 Carbomer 0,20 Phase D TEA I Triethanolamine 0,18 Phase E Principe actif selon l'exemple 1 0,5 GP4G Water (and) Artemia Extract 1,50 Collaxyl Water (and) Butylene Glycol (and) Hexapeptide- 3,00 9 Phase F Parfum Parfum (Fragrance) qsp Colorant qsp5 -20- Préparer et fondre la phase A à 65-70 C. Chauffer la phase C à 65-70 C. La phase B est ajoutée à la phase A juste avant d'émulsionner A dans B. A environ 45 C, le carbomer est neutralisé par addition de la phase D. La phase E est ensuite additionnée sous légère agitation et le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25 C. La phase F est alors additionnée si souhaité. 4 ûCrème protectrice de jour : Noms commerciaux Noms INCI % massique Phase A Emulium Delta Cetyl alcohol (and) Glyceryl Stearate (and) 4,00 PEG-75 Stearate (and) Ceteth-20 (and) Steareth-20 Lanette O Cetearyl Alcohol 1,50 D C 200 Fluid/100cs Dimethicone 1,00 DUB 810C Coco Caprylate/Caprate 1,00 DPPG Propylene Glycol Dipelargonate 3,00 DUB DPHCC Dipentaerythrityl Hexacaprylate/Hexacaprate 1,50 Cegesoft PS6 Vegetable Oil 1,00 Vitamine E Tocopherol 0,30 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and) 0,70 Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben Phase B Eau déminéralisée Aqua qsp 100 Glycerine Glycerin 2,00 Carbopol EDT 2020 Acrylates/C 10-3OAlkyl Acrylate 0,15 Crosspolymer Keltrol BT Xanthan Gum 0,30 Phase C -21- Sodium Hydroxide (sol.à Sodium Hydroxide 0,30 10%) Phase D Eau déminéralisée Aqua 5,00 Stay-C 50 Sodium Ascorbyl Phosphate 0,50 Phase E Butylene Glycol Butylene Glycol 2,00 Dekaben CP Chlorphenesin 0,20 Phase F GP4G Water (and) Artemia Extract F 1,00 Principe actif selon l'exemple 1 5 Préparer la phase A et chauffer à 75 C sous agitation. Préparer la phase B en dispersant le carbopol, puis la gomme xanthane sous agitation. Laisser reposer. Chauffer à 75 C. A température, émulsionner A dans B sous agitation rotor-stator. Neutraliser avec la phase C sous agitation rapide. Après refroidissement à 40 C, additionner la phase D, puis la phase E. Le refroidissement est poursuivi sous agitation légère et la phase F rajoutée. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un principe actif, issu de l'hydrolyse du soja (Glycine max L.), dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une 5 composition pharmaceutique, caractérisée en ce que le principe actif, ou la composition le contenant, est destiné à activer l'aconitase et protéger les mitochondries. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif, est de nature peptidique et provient de l'hydrolyse des protéines du soja (Glycine max L.). 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif, contient au moins 0,1 et 5 g/1, et préférentiellement, au moins 0,5 à 2 g/1 de composés de nature peptidique. 15 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif est utilisé en une quantité représentant de 0,0001 % à 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,05 % à 5 % du poids total de la composition. 20 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces 25 solvants. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition contient en outre, au moins un principe actif antioxydant et/ou au moins un 10 30-23- principe actif stimulant la synthèse de la matrice extracellulaire, et/ou au moins un principe actif stimulant le métabolisme cellulaire énergétique. 8. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque 5 des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger la peau et: les phanères contre tous les types d'agressions extérieures. 9. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque 10 des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à protéger les mitochondries. 10. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une 15 composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les dommages causés à la peau et aux phanères par les rayonnements UV. 11. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une 20 composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les dommages causés à la peau et aux phanères par les radicaux libres. 12. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une 25 composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement. 13. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à 30 prévenir ou à lutter contre les dysfonctionnements mitochondriaux. 14. Procédé de traitement cosmétique destiné à stimuler les défenses et à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures, caractérisé en ce que l'on applique topiquement-24- sur la peau ou les phanères à traiter une composition telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.