Brevet FR2914186A1 — publié le 20081003

B08-1101FR DIANA NATURALS CEVA Universitat de Barcelona Faculty of Biology Università degli studi di Milano, DISTAM - Sezione Nutrizione Utilisation du phloroglucinol et/ou ses polymères dans le traitement de processus inflammatoires Invention de : BESNARD Matthieu MEGARD Denis INISAN Claude ROUSSEAU Isabelle LERAT Yannick GRANDIEU Patricia MITJAVILA Maria Theresa SIMONETTI Paolo PRIORITE D'UNE DEMANDE DE BREVET EP N 07300903.7 DEPOSEE LE 28 MARS 2007 Utilisation du phloroglucinol et/ou ses polymères dans le traitement de processus inflammatoires La présente invention concerne le phloroglucinol et/ou ses polymères pour leur utilisation en tant que produit médicinal destiné à être utilisé dans le traitement de 5 processus inflammatoires. Le phloroglucinol (1,3,5-tri-hydroxybenzène) a pour formule (1). oH Formule 1 L'utilisation de dérivés du phloroglucinol (comportant des substituants en position 2 du cycle) pour leur capacité à moduler l'adhésion cellulaire et la fixation liée aux sélectines dans les traitements des désordres inflammatoires est connue d'après le 10 document W02007/0391 12. Le document JP 4108729 décrit des dérivés du phloroglucinol (comportant des substituants en positions 2, 4 et 6 du cycle) pour leur utilisation dans les désordres d'origine allergique. 15 La demanderesse a découvert de façon surprenante que le phloroglucinol et/ou ses polymères peuvent être utilisés en tant que médicament pour le traitement de processus inflammatoires, ce qui constitue l'objet de l'invention. Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation de ces composés dans une composition pharmaceutique destinée au traitement de processus inflammatoires. 20 Les processus inflammatoires sont au moins impliqués dans l'arthrite, l'allergie et l'athérosclérose. D'autres objets apparaîtront à la lecture de la description et des exemples et dessins ci-après. Sur ces dessins : la figure 1 est une représentation de l'expression de molécules d'adhésion 25 cellulaire (A : sélectine P ; B : VCAM-1 ; C : ICAM-1) dans l'endothélium (1 - groupe témoin ; 2 -phloroglucinol). Les granules fluorescents plus denses sont des précipités d'anticorps secondaires. La figure 2 est une représentation du pourcentage d'occupation (en %) de la lumière aortique par les plaques d'athérome chez des souris déficientes ApoE-/- en fonction de l'alimentation de ces souris. L'objet de l'invention est l'utilisation du phloroglucinol et/ou de ses polymères pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de processus inflammatoires conduisant au moins à l'arthrite, à l'allergie et à l'athérosclérose. Il existe divers types de polymères de phloroglucinol qui peuvent être distingués par le nombre de motifs monomères et leurs types de liaisons : - les fucols composés de monomères phloroglucinol liés par des liaisons aryle-aryle ; - les phloréthols composés de monomères phloroglucinol liés par des liaisons aryle-éther en position para, ortho ou méta ; - les fucophloréthols, constitués de monomères phloroglucinol reliés par des liaisons aryle-aryle et aryle-éthyle. - les hydroxyfucophloréthols, consistant en fucophloréthols comportant un ou plusieurs groupes hydroxy supplémentaires. D'autres polymères sont moins répandus, tels que les fuhalols, les hydroxyfuhalols, les déhydroxyfuhalols, les isofuhalols, les pseudofuhalols, les carmalols, les eckols et les polymères de phloroglucinol sulfatés. L'inflammation est la réponse complexe, à la fois systémique et locale, de l'hôte à une infection ou une lésion. Du point de vue clinique, les caractères principaux de l'inflammation sont chaleur, rougeur (érythème), tuméfaction (oedème) et douleur, conduisant à une perte de fonction. La réponse de l'hôte tente de limiter l'étendue du dommage, à s'opposer à l'infection et à promouvoir la guérison et le rétablissement de la fonction. L'inflammation comporte deux composantes principales - cellulaire et exudative. La composante cellulaire implique la migration des globules blancs des vaisseaux sanguins vers le tissu inflammé. Les globules blancs, ou leucocytes, jouent un rôle important dans l'inflammation ; ils passent par extravasation des capillaires vers le tissu et agissent en tant que phagocytes, en absorbant les bactéries et les débris cellulaires. Ils peuvent également aider en circonscrivant une infection et en empêchant sa propagation. La composante exudative implique le mouvement de fluide, habituellement contenant de nombreuses protéines importantes telles que la fibrine et les immunoglobulines (anticorps). Les vaisseaux sanguins sont dilatés en amont d'une infection (ce qui provoque rougeur et chaleur) et sont contractés en aval, tandis que la perméabilité des capillaires menant au tissu affecté est accrue, ce qui conduit à une perte nette de plasma sanguin dans le tissu - donnant naissance à l' oedème ou à la tuméfaction. La tuméfaction distend les tissus, comprime les extrémités nerveuses, et provoque ainsi la douleur. L'inflammation peut être reconnue par l'oxyde nitrique. Si l'inflammation du site affecté persiste, les cytokines IL-1 et TNF libérées vont inciter les cellules épithéliales afin qu'elles activent les récepteurs VCAM-1 (molécule d'adhésion aux cellules vasculaires 1), ICAM-1 (molécule d'adhésion intercellulaire 1), la sélectine E et la sélective L pour diverses cellules immunitaires. L'activation des récepteurs augmente l'extravasation des neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes T cytotoxiques et lymphocytes T auxiliaires activés, et des lymphocytes T et B mémoire vers le site infecté. Si l'agent nocif persiste, une inflammation chronique s'ensuivra. Ce processus, caractérisé par une inflammation persistant pendant plusieurs jours, mois ou même années, peut conduire à la formation d'une plaie chronique. L'inflammation chronique se caractérise par une présence dominante de macrophages dans les tissus lésés, qui migrent par extravasation par les mêmes méthodes indiquées plus haut (ICAM-1, VCAM-1). Ces cellules sont de puissants agents de défense de l'organisme, mais les toxines qu'ils libèrent (incluant des espèces oxygénées réactives) sont nocives pour les propres tissus de l'organisme, ainsi que pour des agents envahisseurs. C'est pourquoi l'inflammation chronique s'accompagne presque toujours d'une destruction des tissus. L'athérogenèse consiste en un développement de plaques d'athéromes. L'athérosclérose est une maladie progressive qui peut commencer durant l'enfance. Elle est caractérisée par une modification de l'intima, une région de la paroi vasculaire située entre l'endothélium et l'adventice. La première étape de l'athérosclérose est la présence de dépôts gras sous l'endothélium. Les lipoprotéines de basse densité (LDL) du plasma entraînent un risque de maladie cardiovasculaire quand elles envahissent l'endothélium et se retrouvent oxydées par les radicaux libres dans l'endothélium ou les vaisseaux sanguins adjacents. Alors s'installe une inflammation chronique. La sténose et le durcissement des artères qui en résultent ont des conséquences dramatiques. En effet, la circulation sanguine est réduite, et les cellules peuvent être privées d'oxygène ou présenter une accumulation de déchets métaboliques toxiques. Ensuite, la résistance au flux sanguin augmente mécaniquement, ainsi que la pression sanguine, puis le flux sanguin devient turbulent. Le coeur a alors plus d'effort à fournir pour pomper le sang. Ceci conduit souvent à des attaques et autres dysfonctionnements cardiaques. Les compositions pharmaceutiques comprenant du phloroglucinol et/ou ses polymères selon l'invention peuvent être administrées à des sujets humains par les voies normales, par exemple par voie orale. Le phloroglucinol est disponible chez Merck, n 107069, n CAS 108-73-6. De préférence, les compositions pharmaceutiques selon l'invention contiennent un ou des polymères de phloroglucinol choisis parmi les fucols, les phloréthols, les fucophloréthols, les hydroxyfucophloréthols, les fuhalols, les hydroxyfuhalols, les déhydroxyfuhalols, les isofuhalols, les pseudofuhalols, les carmalols, les eckols et les polymères de phloroglucinol sulfatés. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles ou intégrées dans une matrice alimentaire. La dose et le temps d'administration varient en fonction des voies d'administration, de la gravité de la maladie, du poids corporel, etc. Les compositions peuvent être administrées à un adulte en une dose journalière unique ou par doses fragmentées. Selon ce mode d'administration, les compositions selon invention peuvent être fournies sous l'une quelconque des formes normalement utilisées dans des produits pharmaceutiques. Les compositions peuvent être fournies en particulier sous la forme de poudres, granules, comprimés, pilules, gélules, etc. . Les compositions pharmaceutiques peuvent être préparées d'une façon classique, au moyen de véhicules traditionnels pour des préparations. À savoir, dans le cas de fabrication de préparations orales, on ajoute au composant actif des excipients ou véhicules, et si nécessaire des liants, des désintégrants, des lubrifiants et des colorants sont encore ajoutés, et on met ensuite ce mélange sous forme de comprimés, granules, poudres, gélules, etc. Le médicament comprenant une composition à base de phloroglucinol et/ou ses polymères selon l'invention est indiqué pour des processus inflammatoires et peut donc être utilisé pour la prévention de processus inflammatoires, notamment dans le cas de l'arthrite, de l'allergie et de l'athérosclérose. L'invention est illustrée à l'aide des exemples ci-après, qui ne sont pas limitatifs. Exemple 1: Evaluation de l'inflammation par étude in vivo sur des rats sains Des rats sains ont reçu (inclus dans une ration alimentaire semi-synthétique) 43 mg de phloroglucinol (Merck, n 107069, n CAS 108-73-6) par kg de poids corporel pendant 4 semaines. Les résultats ont été comparés à un groupe témoin. A la fin de la période d'alimentation, les rats ont été anesthésiés à l'isofluorane et saignés. On a utilisé de l'héparine en tant qu'anticoagulant pour la collecte du sang. Après avoir centrifugé le sang à 1 770 g pendant 15 minutes, à 4 C, on a obtenu le plasma. L'aorte thoracique a été excisée et découpée en segments comme décrit précédemment (Lépez et coll., 2001). On a ensuite contrôlé l'évolution du poids corporel de ces rats sains. Evolution du poids corporel de rats sains (en grammes) au cours du traitement. Semaine Sema 0 1 2 3 4 Contrôle 199 8 198 6 242 5 273 6 299 8 Phloroglucinol 193 11 186 9 220 7 248 6 270 6 Les données sont des moyennes erreurs-types ; n = 8 a) Modulation de la production de superoxyde (02-) et d'oxyde nitrique (NO) par l'aorte ex vivo Oz- et NO sont deux radicaux libres qui exercent des fonctions régulatrices et inflammatoires dans le tissu vasculaire. La production d'O2- par des segments d'aorte a été analysée à partir des quatre groupes de rats en présence d'un cofacteur ressemblant à NADPH et de coelentérazine (Tarpey et coll., 1999). On a mesuré la production de NO de base dans d'autres segments par résonance paramagnétique électronique (RPE) (Lépez et coll., 2004), en utilisant Fe et de l'acide diéthyldithiocarbamique (DETC) comme agents de piégeage qui transforment NO en le complexe Fe-DETC-NO. L'expression de eNOS a été également évaluée dans l'aorte de rat par analyse western blot. Production de superoxyde et d'oxyde nitrique par l'aorte de rat après administration de doses journalières de phloroglucinol pendant 4 semaines Production de superoxyde Production d'oxyde nitrique (unités de luminescence/ (unités de RPE/mg de tissu) mg de tissu) Témoin 1 198 21 452 21 Phloroglucinol 1 156 24 559 35* Les données sont les moyennes ETM, n = 8. Les différences des groupes traités par rapport au témoin sont indiquées par * P Concentration de nitrites dans le plasma de rats après administration pendant 4 semaines de doses journalières d'extraits Nitrites dans le plasma (mmoles/L) Témoin 2,86 0,24 Phloroglucinol 3,06 0,18 Les données sont des moyennes ETM, n = 8. 20 La concentration des nitrites n'est pas modifiée par l'addition de phloroglucino 1.5 Exemple 2 : Marqueurs de l'inflammation a) Expériences sur des souris ApoE-/- Après sevrage, deux groupes de souris ApoE-/- mâles (Charles River, France) ont été alimentés à partir de l'âge de 4 semaines avec des rations alimentaires semipurifiées contenant 0,15 % de cholestérol, 5 % de lipides et 43 mg/kg/jour de phloroglucinol, qui ont été préparées dans notre laboratoire. Les rations alimentaires ont été préparées chaque semaine et conservées à -20 C afin d'empêcher l'oxydation, et l'aliment a été fourni et retiré chaque jour. On a noté chaque semaine le poids corporel. Evolution du poids corporel (en grammes) de souris déficientes en ApoE au cours du traitement. Les données sont des moyennes ETM, n = 14 Semaine 0 1 2 3 4 5 Contrôle 16 f 0.52 18 f 0.44 20 0.43 22 f 0.51 23 f 0.40 23 0.43 Phloroglucinol 15 0.61 17 0.50 19 0.36 21 0.41 23 0.43 24 0.50 Semaine 6 7 8 9 10 11 Contrôle 24 0.51 24 0.55 25 0.50 26 0.45 26 0.57 26 0.61 Phloroglucinol 25 0.61 26 0.58 26 0.70 27 0.67 27 0.83 28 0.64 Le traitement chez les souris ApoE-/- n'a présenté aucun signe de toxicité après aucune de ces longues durées de traitement. L'évolution du poids corporel était normale. Ces résultats diffèrent de ceux observés chez des rats sains, mais les souris ApoE-/- ne sont pas saines et leur augmentation de poids corporel est plus faible que chez les souris Swiss saines. Les doses de phloroglucinol ingérées étaient d'environ 40 mg/kg de poids corporel. A l'âge de 16 semaines, les souris ont été anesthésiées à l'uréthane sodique (1,5 mg/kg i.p.) et saignées par ponction cardiaque à l'aide d'héparine en tant que coagulant. Le plasma a été obtenu après centrifugation à 1 770 g pendant 15 minutes, à 4 C, et une partie aliquote a été congelée à -80 C. Les modes opératoires et le traitement des souris étaient en conformité avec les directives de l'Union Européenne. b) Immunofluorescence Les coupes (10 m) en série de la racine aortique ont été lavées dans une solution de chlorure de sodium tamponnée au phosphate (STP) et glycine 20 mM, et bloquées avec de l'albumine de sérum bovin (ASB) à 1 % dans STP 10 mM. En outre, deux témoins négatifs étaient présents dans toutes les séries de coloration. Enfin, le calibrage d'un analyseur d'image Olympus, pour la totalité de l'étude, a été maintenu au même réglage initial. On a utilisé les anticorps polyclonaux primaires suivants : sélectine P dirigée contre souris (IgG de lapin, 5 g/mL) acquis auprès de Chemicon, Immunostains, anti-VCAM-1 murine (IgG2a de rat, k ; 10 g/mL) acquis auprès de eBioscience et anti-ICAM-1 murine (IgG de chèvre, 2 g/mL) acquis auprès de R&D Systems. Ils ont été visualisés après incubation avec les anticorps secondaires correspondants [anticorps d'âne anti-IgG de lapin marqué 647 (1/500), anticorps d'âne anti-IgG de rat marqué 488 et anticorps d'âne anti-IgG de chèvre marqué 546) acquis auprès de Molecular Probes. La protéine chimiotactique de monocyte 1 (MCP-1) joue un rôle dans le recrutement de monocytes vers les sites de lésion et d'infection. Les chimiokines constituent une famille de cytokines pro-inflammatoires inductibles par activation, ou petites protéines signal sécrétées. Les chimiokines induisent une chimiotaxie dirigée dans les cellules répondeuses proches, d'où le nom de cytokines chimiotactiques. La sélectine P et les molécules d'adhésion aux cellules vasculaires (VCAM) et les molécules d'adhésion intercellulaire (ICAM) sont impliquées dans le roulement et, respectivement, la migration des monocytes dans l'espace sub-endothélial. Les monocytes dans l'espace subendothélial deviennent des macrophages. Lorsque les macrophages phagocytent les LDL oxydés, ils deviennent des cellules spumeuses qui déclenchent le processus d'athérosclérose. Dosage de MCP-1, sélectine P, VCAM et ICAM dans la racine aortique de souris ApoE_i MCP-1 Sélectine P VCAM-1 ICAM-1 Contrôle 185 0.9 148 22 184 21 160+5 Phloroglucinol 178 2* 86 14* 163 1 135 f 29 Les données sont les moyennes ETM, n= 3-4. Les différences des groupes traités 30 par rapport au témoin sont indiquées par * P La fluorescence a été évaluée seulement au niveau de l'endothélium de toutes les souris. Une diminution des molécules précédentes est donc considérée comme un effet bénéfique/préventif contre le développement de l'athérosclérose. L'analyse confocale au moyen d'anticorps spécifiques pour les molécules d'adhésion cellulaire (Figure 1) indique que les concentrations de sélectine P, VCAM-1 et ICAM-1 ont été réduites par les traitements. Ces molécules sont impliquées dans le roulement et l'extravasation des macrophages vers l'espace endothélial. Exemple 3 : étude de l'occupation de plaques d'athérome dans des aortes de souris ApoE-/- Les souris ApoE-/- développent spontanément de l'athérosclérose. Elles sont donc un bon modèle pour mesurer le développement de plaques d'athérome ainsi que les paramètres impliqués dans leur formation. Deux groupes de souris ApoE-/- mâles (Charles River, France) ont été alimentés à partir de l'âge de 4 semaines et pendant 12 semaines avec des rations alimentaires semi-purifiées contenant 0,15 % de cholestérol (afin de favoriser le développement de l'athérosclérose) et 43 mg/kg/jour de phloroglucinol, qui ont été préparées dans notre laboratoire. Les rations alimentaires ont été préparées chaque semaine et conservées à -20 C afin d'empêcher l'oxydation. Les résultats ont été comparés à ceux d'un groupe témoin. A la fin de la période d'alimentation, les aortes thoraciques des souris ont été prélevées et coupées en segments. Les zones de lésion ont été estimées après coupure longitudinale de ces aortes. Les modes opératoires et le traitement des souris étaient en conformité avec les directives de l'Union Européenne. Les résultats de la figure 2 montrent une nette diminution de la taille et/ou de la quantité des plaques d'athérome dans les souris ayant été nourries avec du phloroglucinol par rapport à celles nourries par une alimentation témoin.30 REVENDICATIONS 1. Phloroglucinol et/ou ses polymères, pour leur utilisation dans le traitement de processus inflammatoires. 2. Phloroglucinol et/ou ses polymères selon la revendication 1, pour leur utilisation dans le traitement de l'allergie. 3. Phloroglucinol et/ou ses polymères selon la revendication 1, pour leur utilisation dans le traitement de l'arthrite. 4. Phloroglucinol et/ou ses polymères selon la revendication 1, pour leur utilisation dans le traitement de l'athérosclérose. 5. Composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable, le composé phloroglucinol et/ou ses polymères selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5, dans laquelle le ou les polymères sont choisis parmi les fucols, les phloréthols, les fucophloréthols, les hydroxyfucophloréthols, les fuhalols, les hydroxyfuhalols, les déhydroxyfuhalols, les isofuhalols, les pseudofuhalols, les carmalols, les eckols et les polymères de phloroglucinol sulfatés.20