Brevet FR2918663A1 — publié le 20090116

Le virus de l'hépatite B (VHB) est un petit virus enveloppé double brin de la famille des Hepadnaviridae, qui provoque une infection hépatique non cytopathique persistante. C'est le seul virus à ADN parmi tous les virus du foie humain. La membrane du virus de l'hépatite B est composée de 25 % de lipides et de 75 % de glycoprotéines. Le composant principal des glycoprotéines est l'antigène de surface de l'hépatite B (H.bsAg). La région de coeur de la particule du VHB contient l'antigène d'enveloppe de l'hépatite B (HbeAg). Le HBeAg est une protéine sécrétoire, qui peut traverser le placenta humain, en passant de la mère au foetus au cours du stade précoce, en déclenchant une tolérance des cellules T cytotoxiques au HbeAg, en raison du caractère immature du système immun des nourrissons. Le système immun chez l'homme ne peut lutter contre le VHB, et provoque une réplication du VHB à grande échelle. Le HBeAg est lui aussi considéré comme un tolérogène. En conséquence, il est possible d'utiliser les niveaux de HBsAg et de HBeAg en tant que marqueurs de l'hépatite, pour évaluer la réplication et la sécrétion du VHB. L'Organisation Mondiale de la Santé a indiqué que près de deux milliards de personnes présentent des signes d'infection passée ou actuelle par le VHB, qui a une grande prévalence et un fort taux d'incidence. C'est la transmission verticale qui est la voie principale d'infection par le VHB. 11e virus peut provoquer une hépatite aiguë, une hépatite chronique et une cirrhose du foie, en se développant même jusqu'à un cancer du foie. Près de 90 % des pe.rson- nes de sexe masculin de plus de 30 ans à Taiwan ont déjà été infectés par le VHB. Quinze à 20 % d'entre eux deviennent des porteurs permanents, et peuvent mourir en raison de séquelles, parmi lesquelles la cirrhose du foie et le cancer du foie. Ainsi, Taiwan est une zone hyperendémique d'infection et de cancer du foie, provoqués par le VHB. L'infection à VHB est étroitement apparentée aux maladies hépatiques et au cancer du foie, comme on l'a dit ci-dessus. Un traitement antiviral, par interférence et inhibition de la réplication virale, et élimination de l'infection chronique, représente l'objectif principal des études concernées. Les traitements utilisant l'interféron, les médicaments antiviraux ou des vaccins, présentent depuis peu des effets avantageux. Cependant, les porteurs chroniques de l'hépatite B ne peuvent être entièrement guéris ; c'est la principale raison des maladies hépatiques et de la grande mortalité associées au VHB. En conséquence, il est actuellement très impor- tant de mettre au point des médicaments antiviraux inhi- bant le VHB. Antrodia camphorata est aussi appelé Chang-Zhi, Niu Chang-Zhi, champignon du camphre rouge, etc. Il s'agit d'un champignon pérenne appartenant à l'ordre des Aphyl- lophorales, famille des polyporacées. Il s'agit d'une espèce endémique à Taiwan, qui pousse sur le parenchyme ligneux du coeur intérieur pourri de Cinnamomum kanehirae Hay. Cinnamomum kanehirai Hay présente une rare distribution, et a subi des surcoupes illégales, de sorte que la croissance d'Antrodia camphorata à l'intérieur de l'arbre à l'état sauvage s'est raréfiée. Le prix d'Antrodia camphorata est très élevé, en raison de la très faible vitesse de croissance de l'Antrodia camphorata naturel, qui ne pousse qu'entre juin et octobre. Les sporophores d'Antrodia camphorata sont pérennes, sessiles, durs et ligneux, et exhalent une forte odeur de sassafras (arôme de camphre). Ils se présentent sous différentes formes : en plaques, en cloche, angulés, ou en tour. Ils ont une couleur rougeâtre et sont plats quand ils sont jeunes, en étant fixés à la surface du bois. Puis les bords de l'extrémité frontale vont subir une légère inclinaison et un bouclage, et s'étendre dans l'espace ambiant. La couleur vire au rouge brun passé ou al brun jaune crème, avec des ostioles tout autour. A ce stade, ils présentent un très grand intérêt médical. En médecine Taiwanaise traditionnelle, Antrodia camphorata est habituellement utilisé en tant que médicament anticancéreux, hépato-protecteur et antidote. Antrodia camphorata, tout comme d'une manière générale les champignons comestibles et à usage médical, présente une forte teneur en de nombreux nutriments, parmi les-quels les polysaccharides (tels que le (3-glucosanne), les triterpénoïdes, la superoxyde-d=_smutase (SOD), l'adénosine, les protéines (immunoglobulines), les vitamines (telles que la vitamine B, l'acide nicotinique), les oligo-éléments (tels que le calcium, le phosphore et le germanium, etc.), les acides nucléiques, l'agglutinine, les acides aminés, les stéroïdes, les lignines et les agents stabilisant la pression sanguine (tels que l'acide dérivé d'Antrodia) et analogues. On pense que ces principes physiologiquement actifs présentent des effets tels qu'une activité antitumorale, une augmentation des activités immunomodulatrices, un effet anti- allergique, un effet antibactérien, un effet antihypertenseur, hypoglycémiant, hypocholestérolémiant, et analogues. Les triterpénoïdes représentent le composant le plus étudié, parmi les nombreuses compositions d'Antro- dia camphorata. On appelle en résumé "triterpénoïdes" des composés naturels qui contiennent 30 atomes de carbone en structure pentacyclique ou hexacyclique. Le goût amer d'Antrodia camphorata est dû au composant triterpénoïdes. Trois nouveaux triterpénoïdes de type ergostane (antcine A, antcine B, antcine C) ont été isolés par Cherng et al. à partir des sporophores d'Antrodia camphorata (Cherng, I.H., et Chiang, H.C. 1.995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Trois nouveaux composés, l'acide zhankuique A, l'acide zhankuique B et l'acide zhankuique, ont été extraits des sporophores d'Antrodia camphorata avec de l'éthanol par Chen et al. (Chen, C.H., et Yang, S.W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, -a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661). En outre, Cherng et al. ont aussi trouvé trois autres nouveaux triterpénoïdes, provenant des sporophores d'Antrodia camphorata, qui sont une lactone sesquiterpénique et deux composés biphénylés, le 4,7-d:iméthoxy-5-méthy-1,3-benzodioxole et le 2,2',5,5'-tétraméthoxy-3,4,3',4'-biméthylènedioxy-6,6'-diméthylbi-phényle (Chiang, H.C., Wu, D.P., Cherng, I.W., et Ueng, C.H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616). En 1996, quatre nouveaux triterpénoïdes de type ergostane (les antcines E et F et les antcinates de méthyle G et H) ont été isolés par Cherng et al. par les mêmes méthodes analytiques (Cherng, I. H., Wu, D. P., et Chiang, H. C. 1996. Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41:263-267). Et deux stéroïdes de type ergostane, les acides zhankuiques D et E, ainsi que trois lanosta-triterpènes, l'acide 15 alpha-acétyl-déhydrosulfurér..ique, l'acide déhydroéburicoïque, l'acide déhydrosulfurénique, ont été isolés par Yang et ai. (Yang, S. W., Shen, Y. C., et Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea-a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392). Bien que des extraits d'Antrodia camphorata aient été dits présenter les effets ci-dessus, grâce aux expé- riences déjà effectuées, et bien que les composants aient été analysés ultérieurement, des expériences plus poussées sont nécessaires pour identifier plus précisé-ment la composition qui va inhiber une infection à VHB, et pour traiter les maladies hépatiques liées au VHB. La découverte d'une composition effectivement active per-mettrait aux composants naturels d'extraits d'Antrodia camphorata de contribuer fortement aux bons effets avantageux d'un traitement de maladies hépatiques apparentées au VHB, parmi lesquelles l'hépatite aiguë, l'hépa.- tite chronique, la cirrhose du foie et le cancer du foie. Pour identifier quels sont les composés inhibant urne infection à VHB et provenant d'extraits d' Antrodîa camphorata, on a isolé et purifié dans le cadre de la présente invention le composé de formule (1) dans laquelle X et Y peuvent être des atomes d'oxygène ou de soufre, R1r R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène, le groupe méthyle ou (CH2) tt--CH3, et m = 1 à 12 ; n = 1 à 12. Un composé préféré de formule générale (1) est la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone, telle que représentée par la formule (2), avec :La formule brute C-24H38O4. Ce composé a une masse moléculaire de 390 et se présente sous forme d'une poudre jaune pâle. (1) Les cyclohexénones ayant les structures correspondant aux formules (1) et (2) sont purifiées par extrac- taon, aqueuse ou à l'aide d'un solvant organique, d'Ar.-trodia camphorata. Les solvants organiques utilisés comprennent, trais sans limitation, les alcools tels que le méthanol, l'éthanol ou le propanol, les esters tels que l'acétate d'éthyle, les alcanes tels que l'hexane, ou les alcanes halogénés tels que le chlorométhane, le chloréthane. Parmi eux, on préfère les alcools, et en particulier l'éthanol. Les cyclohexénones de la présente invention sont utilisées pour inhiber une infection à VHB, et ils peu- vent en outre être utilisés dans des compositions pharmaceutiques pour traiter des maladies hépatiques liées à l'hépatite B, pour renforcer les effets thérapeutiques en présence d'une hépatite aiguë, d'une hépatite chronique, d'une cirrhose du foie et d'un cancer du foie. On en conclut qu'un traitement appliqué à une lignée de cellules HepG2 2.2.15 produisant des particules de VHB infectieuses, par la formule (1) ou la for-mule (2) de l'invention, non seulement va inhiber Le taux de survie relative de la lignée de cellules d'hépa- tome, mais encore diminuer la réplication et la sécrétion du HbsAg et du HbeAg. En outre, la substance naturelle de ce composé extrait d'Antrodia camphorata peut être utilisée pour traiter des maladies hépatiques liées à l'hépatite B. (2) Par ailleurs, les composés de formule (1) et/ou de formule (2) de la présente invention peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques destinées au traitement de maladies hépatiques liées à l'hépatite B, dans le but d'inhiber la réplication et la sécrétion du VHB, et aussi pour soulager l'infection en présence d'une hépatite aiguë ou d'une hépatite chronique, l'objectif étant aussi de diminuer le taux d'incidence de la transformation de porteurs en malades de la cirrhose du foie, ou encore le taux de mortalité du cancer hépatique. Les compositions pharmaceutiques comprennent non seulement les composés de formule (1) et/ou de formule (2), mais aussi des supports acceptables d'un point de vue pharmaceutique. Des exemples de ces supports com- prennent mais sans limitation les excipients tels que l'eau, les charges telles que le saccharose ou l'amidon, les liants tels que les dérivés de la cellulose, les diluants, les désintégrants, les renforçateurs d'absorption ou les édulcorants. Les compositions pharmaceuti- ques peuvent être fabriquées par mélange des composés de formule (1) et/ou de formule (2) avec au moins l'un des supports, grâce à des procédés classiques connus dans le domaine de la galénique, et qui peuvent être formulés, mais sans limitation, sous forme de poudres, de compri- més, de gélules, de pastilles, de granulés, ou d'autres formulations liquides L'invention sera mieux comprise en regard de la description ci-après et des dessins annexés, qui présentent des exemples de réalisation de l'invention, dessins dans lesquels : la Figure 1 présente les effets de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyi-dodéca-2,6, 10--triényl)-cyclohex-2-énone, purifiée dans l'Exemple 1 de la présente invention, sur les taux de survie des cellules HepG2 2.2.1. (A) : 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6- méthyl-5- (3,7,11-triméthyl-dodéca-2, 6, 10-triényl) - cyclohex-2-énone ; (B) extraits bruts d'Antrodia camphorata. Les traits verticaux représentent l'écart type de trois essais indépendants. la Figure 2 représente les effets de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl--dodéca-2,6, 10-triényl) -cyclohex-2-énone purifiée de l'Exemple 1 de la présente invention sur la synthèse du HbsAg. (A) . 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone ; (B) extraits bruts d'Antrodia camphorata. Les traits verticaux représentant l'écart type de trois essais indépendants. la Figure 3 représente les effets de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl) --cyclohex-2-énone purifiée de l'Exemple 1 de la présente invention sur la synthèse du HbeAg. (A) . 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyldodéca-2,6,10-triényl) -cyclohex-2-énone ; (B) extraits bruts d'Antrodia camphorata. Les traits verticaux représentent l'écart type de trois essais indépendants. Les mycéliums, les sporophores, ou des mélanges des deux, provenant d'Antrodia camphorata, sont d'abord extraits avec de l'eau ou des solvants organiques pour donner l'extrait aqueux ou l'extrait dans un solvant organique d'Antrodia camphorata, par utilisation de pro-cédés bien connus dans la technique.. Les solvants organiques comprennent mais sans limitation les alcools tels que le méthanol, l'éthanol ou le propanol ; les esters tels que l'acétate d'éthyle ; les alcanes tels que l'hexane ; ou les alcanes halogénés tels que Le chlorométhane et le chloréthane. Parmi eux, on préfère les alcools, et en particulier l'éthanol. Les extraits d'Antrodia camphorata, obtenus avec de l'eau ou un solvant organique, ont été soumis à une chromatographie en phase liquide hautes performances (CLHP) pour isolement et purification. Chaque fraction a été récupérée et soumise à un essai de réplication du VHB. Les fractions actives ayant des effets d'inhibition du VHB ont été analysées pour déterminer leur composition, et soumises à des essais supplémentaires, grâce à des tests biologiques apparentés tels que les effets cytotoxiques sur la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.15 et la détection des niveau de HbsAg et de HbeAg. L'approche ci-dessus a conduit à l'indentification de composés de formule (1) et de formule (2) à même d'inhiber la réplication du VHB. Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5- (3 , 7 , 11-triméthyl-dodéca-2 , 6 , 10-triényl) -cyclohex-2-énone de formule (2) est expliqué ci-dessous à titre d'exemple de la présente invention. Les effets cytotoxiques de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone sur le HepG2 2.2.15, et les effets d'inhibition de la réplication du VHB, ont été évalués par utilisation de l'essai MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazole-2-yl)-2,5-diphény=L-tétrazolium), conformément au modèle de criblage des médicaments anticancéreux du National Cancer Institute (NCI), pour analyser les taux de survie sur la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.15, et par utilisation de l'analyse enzymo-immunologique semi-quantitative pour détecter les niveaux de HbsAg et de HbeAg. Ces essais ont montré que la cyclohexénone d'Antrodia camphorata peut être utilisée pour diminuer les taux de survie de la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.15, pour inhiber efficacement la synthèse du HbsAg et du HbeAg, et aussi pour atteindre les objectifs consistant à inhi- ber la réplication et la sécrétion du VHB. Les exemples sont décrits en détail ci-dessous : Exemple 1 Isolement de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5- (3,7, 11-triméthyl-dodéca-2, 6, 10-triényl) -cyclohex-2-énone On place dans un ballon 100 g de mycéliums, de sporophores, ou d'un mélange des deux, provenant d'Antrodia camphorata. On place dans le ballon une quantité appro- priée d'eau et d'alcool (solution alcoolique à 70-100 %), et on agite à 20-25 C pendant au moins 1 heure. On filtre la solution sur un filtre et une membrane filtrante de 0,45 m, et le filtrat est recueilli sous forme d'un extrait. Le filtrat d'Antrodia camphorata est soumis à une analyse par chromatographie en phase liquide hautes performances (CLHP). La séparation est effectuée sur une colonne RP18, la phase mobile étant constituée de méthanol (A) et d'acide acétique à 0,1-0,5 % (B), les candi- tions du gradient étant les suivantes : 0-10 minutes dans 95 %-20 % de B, 10-20 minutes dans 20 %-10 % de B, 20-35 minutes dans 10 %-10 % de B, 35-40 minutes dans 10 %-95 % de B, le débit étant de 1 ml/min. L'effluent de la colonne est suivi par un détecteur UV-visible. Les fractions recueillies à 25-30 minutes sont pré-levées et concentrées pour donner sous forme d'une poudre jaune pâle le produit 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclo- hex-2-énone. L'analyse de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-rnéthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone met en évidence la formule brute C24H38O4, dont la masse moléculaire est de 390, avec un point de fusion de 48 C à 52 C. Une étude des spectres RMN donne les résultats suivants : RHIN-1H (CDC13), 5(ppm) = 1, 51, 1, 67, 1, 71, 1, 75, 1, 94, 2,03, 2,07, 2,22, 2,25, 3,68, 4,05, 5,07, et 5,14 ; RMN-13C (CDC13), ()(ppm) = 12,31, 16,1, 16,12, 17,67, 25,67, 26,44, 26,74, 27,00, 39,71, 39,81, 4,027, 43,34, 59,22, 60,59, 120,97, 123,84, 124,30, 131,32, 135,35, 135,92, 138,05, 160,45, et 197,12. Exemple 2 Essais cytotoxiques in vitro effectués sur la lignées de cellules d'hépatome avec des cyclohexénones d'Antrodia camphorata On a évalué les effets inhibiteurs de cellules d'hépatome, présentés par les cyclohexénones d'Antrodia camphorata de l'Exemple 1, conformément, au modèle de criblage des médicaments anticancéreux du National Cari- car Institute (NCI). Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6,1. 0-triényl)-cyclohex-2-énone de l'Exemple 1 a été placé dans des milieux de culture de la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.15, pour tester les taux de survie. La surv=:.e des cellules a été analysée à l'aide de l'essai MTT. La lignée de cellules HepG2 2.2.15 a été obtenue à partir d'un hépatome humain, qui peut secréter le VHB infectieux. L'essai MTT est habituellement utilisé pour analy- ser la prolifération cellulaire, le taux de survie des cellules vlables et la cytotoxicité. Le MTT (bromure de 3-[4,5-diméthylthiazole-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium) est un colorant jaune, qui peut être converti en formazan pourpre insoluble dans l'eau, après clivage réductif de son noyau tétrazolium sous l'effet de la succinatetétrazolium-réductase dans les mitochondries de cellules. La quantité de formazan formé es:: utilisée pour détecter le nombre des cellules viables et calculer les taux de survie. Les cellules HepG2 2.2.1 ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM, Gibco Co., Etats-Unis) contenant 12 acides aminés essentiels, de la glutamine, 8 vitamines, et supplémenté par 10 % de sérum de foetus de veau et 200 ug/ml de l'antibiotique G418, la culture étant effectuée pendant 24 heures. Les cellules ampli-fiées ont été lavées une fois avec du PBS, traitées avec lx trypsine-EDTA et centrifugées à 1200 tr/min pendant 5 minutes. On a prélevé le surnageant, et le culot cellu-faire a été remis en suspension dans 10 ml de milieu frais, tout en secouant dans des conditions ménagées. Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits, à raison de 5 000 cellules par puits. Les cellules traitées par les extraits bruts d'Antrodia campho- rata, la préparation utilisant du DMSO (extraits éthanoliques totaux, sans purification), ont reçu le nom de "groupe témoin" ; et le "groupe expérimental" a compres les cellules traitées avec la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10--triényl)-cyclo- hex-2-énone. Les deux substrats ont été ajoutés aux concentrations de 0,1, 1 et 10 g/ml. Rien n'a été ajouté au groupe témoin à blanc. Les cellules ont été cultivées à 37 C, avec 5 % de CO2 pendant 22 heures. On a ajouté 2,5 mg/ml de solution de MTT à chaque puits, et on a incubé pendant 2 heures à l'obscurité. Après avoir prélevé avec précaution le MTT, on a dissous les cris-taux foncés ainsi obtenus, dans 50 pl de DMSO. On a mesuré les absorbances à 570 nm à l'aide d'un lecteur ELISA, et on les a comparées à celles du groupe blanc, pour calculer les taux de survie. Les résultats soit présentés sur la Figure 1. La Figure 1 présente les effets, sur le taux de survie de cellules HepG2 2.2.1, de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dcdéca-2,6,10-t: riényl)-cyclohex-2-énone purifiée de l'Exemple 1 de la présente invention. Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6--méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone a pu diminuer efficacement les taux de survie des cellules HepG2 2.2.1 par comparaison aux extraits bruts d'Antrodia camphorata dans le groupe témoin, et les taux de survie cellulaire, de 10 g/ml de cyclohexénone d'Antrodia camphorata, ont pu être infé- rieurs à 81 Il a donc été montré que le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone peut inhiber la prolifération de la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.1. Exemple 3 Essais in vitro portant sur la sécrétion du HbsAg et du HbeAg dans la lignée de cellules d'hépatome, avec les cyclohexénones d'Antrodia camphorata On a dans cet exemple étudié les effets, sur la synthèse du HbsAg et du HbeAg, des cyclohexénones d'Antrodia camphorata purifiés dans l'Exemple 1. Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyldodéca-2,6,10-triényl) -cyclohex-2-énone de l'Exemple 1 a été placé dans les milieux de culture de la lignée de cellules d'hépatome HepG2 2.2.1 pour déterminer la synthèse du HbsAg et du HbeAg, par l'analyse par immuno- sorption à liaison enzymatique semi-quantitative (ELISA.). Ces deux marqueurs ont été utilisés pour évaluer l'efficacité de la cyclohexénone pour ce qui est d'inhiber le VHB. La cellule HepG2 2.2.1 a été formée par transfection des cellules Hep G2 à l'aide d'ADN ccm- plet du VHB, et elle a été sélectionnée pour sa résis-:ance à l'antibiotique G418 et à l'expression du HbsAg, du HbeAg, du nucléocapside et du virion (Sells, M. A., Chen, M. L. et Acs, G. 1987. Production of hepatitis B virus part:icles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 : 1005-1009). Les cellules HepG2 2.2.1 ont été cultivées dans un milieu essentiel minimal (MEM, Gibco Co., Etats-Unis) contenant 12 acides aminés essentiels, de la glutamine, 8 vitamines, et supplémenté par 10 % de sérum de foetus de veau et 200 pg/ml de l'antibiotique G418, la culture étant effectuée pendant 24 heures. Les cellules ampli-fiées ont été lavées une fois avec du PBS, traitées avec lx trypsine-EDTA et centrifugées à 1200 tr/min pendant 5 minutes. On a prélevé le surnageant, et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 10 ml de milieu frais, tout en secouant dans des conditions ménagées. Les cellules ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits, à raison de 5 000 cellules par puits. Les cellules traitées par les extraits bruts d'Antrodia camphorata, la préparation utilisant du DMSO (extraits éthanoliques totaux, sans purification), ont reçu le nom de "groupe témoin" ; et le "groupe expérimental" a compris les cellules traitées avec la 4-hydroxy--2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone. Les deux substrats ont été ajoutés aux concentrations de 0,1, 1 et 10 g/ml. Rien n'a été ajouté au groupe témoin à blanc. Les cellules ont été cultivées à 37 C, avec 5 % de CO2 pendant 22 heures. On a évalué, sur des quantités appropriées des milieux de culture, les niveaux de HbsAg et de HbeAg par utilisation du kit ELISA contenant des anticorps monoclonaux anti-HbsAg et anti-HbeAg (General biologicals corp., Taiwan, ROC). L'analyse se fondait sur la formation de complexes sandwich anticorps-antigène-anticorps/enzyme, avec coloration avec la solution de développement chromogène 0-phénylènediamine (OPD), et les résultats ont été exprimés sous forme d'unités d'absorbance à 450 nm. Les échantillons dont l'absorbance était supérieure à la valeur de coupure ont été considérés comme positifs pour le HbsAg et le HBeAg. La valeur de coupure est égale à D.O. (blanc) + 0,025. Les résultats sont présentés sur les Figures 2 et 3. La Figure 2 présente les effets de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10--triényl)-cyclohex-2-énone purifiée de l'Exemple 1 de la présente invention sur la synthèse du HbsAg. Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone a pu inhiber efficacement la synthèse du HbsAg par comparaison aux extraits bruts d'Antrodia camphorata dans le groupe témoin, et les niveaux de HbsAg ont diminué quand la quantité de cyclohexénone augmentait. La synthèse du HbsAg a diminué à une valeur inférieure à 60 % après traitement avec 0,1 g/ml de la cyclohexénone d'Antrodia camphorata. La diminution du HbsAg a pu atteindre 28 % après traitement avec 10 pg/ml de la cyclohexénone d'Antrodia camphorata, concentration pour laquelle on a observé l'effet inhibiteur le meilleur. En conséquence, il a été montré que le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone a pu effectivement diminuer la synthèse du HbsAg, et qu'elle présente aussi un effet inhibiteur de la propagation du VHB. La Figure 3 présente les effets de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone purifiée de l'Exemple 1 de la présente invention sur la synthèse du HbeAg. Ge composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone a pu efficacement inhiber la synthèse du HbeAg par comparaison avec les extraits bruts d'Antrodia camphorata du groupe témoin. La synthèse du HbeAg est tombée en dessous de 84 % après traitement avec 0,1 pg/ml de la cyclohexénone d'Antrodia camphorata. La diminution du HbeAg a pu atteindre 57 % après traitement avec 1 pg/ml de la cyclohexénone d'Antrodia camphorata, et c'est là que l'on a observé l'effet inhibiteur le meilleur. En consé- quence, il a été montré que le composé 4-hydroxy-2,3-d:iméthoxy-6-méthyl-5- (3, 7, 11-triméthyl-dodéca-2, 6, 10-t:riényl)-cyclohex-2-énone a pu efficacement diminuer la synthèse du HbeAg. Par ailleurs, les effets inhibiteurs de la synthèse du HbsAg et du HbeAg que présente la cyclohexénone d'Antrodia camphorata sont plus importants que dans l'essai de cytotoxicité des cellules HepG2 2.2.1. Il s'agit là de la toxicité vis-à-vis des cellules, provoquée par les effets inhibiteurs du composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10--driényl)-cyclohex-2-énone sur la synthèse du HbsAg et du HbeAg. En résumé, le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6, 10--triényl)-cyclohex-2-énone isolé d'Antrodia camphorata selon la pré-sente invention peut être utilisé pour inhiber efficace-ment le taux de survie de la cellule d'hépatome humain HepG2 2.2.1, et il peut inhiber la synthèse du HbsAg et du HBeAg. Ces composés peuvent donc inhiber la duplication et la sécrétion du VHB et peuvent être utilisés dans le traitement des maladies hépatiques liées au VH3. En outre, il peut être incorporé dans des compositions pharmaceutiques. Les compositions pharmaceutiques comprennent non seulement le principe actif 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5- (3, 7, 11-triméthyl -dodéca-2, 6,10-triényl)-cyclohex-2-énone, mais aussi les supports acceptables d'un point de vue pharmaceutique. On peut citer à titre d'exemples de ces supports, mais sans limitation, les excipients tels que l'eau, les charges telles que le saccharose ou l'amidon, les liants tels que les dérivés de la cellulose, les diluants, les désintégrants, les renforçateurs d'absorption ou les édulcorants. La composition de la présente inventicn peut être fabriquée par mélange du composé cyclohexénone d'Antrodia camphorata avec au moins l'un des supports, au moyen des procédés classiques connus dans le domaine galénique, et qui peuvent être formulés sous forme de poudre, de comprimés, de gélules, de pastilles, de granulés ou d'autres formulations liquides, mais sans limitation.10 REVENDICATIONS 1. Cyclohexénone d'Antrodia camphorata, utilisée pour inhiber le VHB, ayant la formule suivante : dans laquelle X et Y sont des atomes d'oxygène ou de soufre, R1, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène, le groupe méthyle, ou (CH2)m-CH3, et m vaut 1 à 12, n vaut 1 à 12. 2. Cyclohexénone selon la revendication 1, carac- térisée en ce qu'elle est isolée d'extraits dans un solvant organique d'Antrodia camphorata. 3. Cyclohexénone selon la revendication 2, caractérisée en ce que les solvants organiques sont choisis dans l'ensemble consistant en les alcools, les esters, les alcanes et les alcanes halogénés. 4. Cyclohexénone selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'alcool est l'éthanol. 5. Cyclohexénone selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est isolée d'extraits aqueux d'Antrodia camphorata. 6. Cyclohexénone selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'il s'agit de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5-(3,7,11-triméthyl-dodéca-2.,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone. 7. Cyclohexénone selon la revendication 1, caractérisée en ce que le composé inhibe le VHB par l'intermédiaire d'une diminution de la synthèse du HbsAg et du HbeAg. 8. Cyclohexénone selon la revendication 7, carac- térisée en ce que sa concentration préférée, pour ce quiest de diminuer le HbsAg, est de 10 g/ml. 9. Cyclohexénone selon la revendication 7, caractérisée en ce que sa concentration préférée, pour ce qui est de diminuer le HbeAg, est de 1 g/ml. 10. Cyclohexénone selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle inhibe le VHB par l'intermédiaire d'une diminution de la synthèse du HbsAg et du HbeAg. 11. Cyclohexénone selon la revendication 10, caractérisée en ce que sa concentration préférée, pour ce qui est de diminuer le HbsAg, est de 10 g/ml. 12. Cyclohexénone selon la revendication 10, caractérisée en ce que sa concentration préférée, pour ce qui est de diminuer le HbeAg est de 1 g/ml. 13. Composition pharmaceutique utilisée pour trai- ter les maladies provoquées par le VHB, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une quantité efficace de la cyclohexénone selon la revendication 1, et un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. 14. Composition pharmaceutique utilisée pour trai- ter les maladies provoquées par le VHB, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une quantité efficace de la cyclohexénone selon la revendication 6 et un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. 15. Composition pharmaceutique selon la revendica- fion 13, caractérisée en ce que les maladies provoquées par le VHB comprennent l'hépatite aiguë,. l'hépatite chronique, la cirrhose du foie et le cancer du foie. 16. Composition pharmaceutique selon la revendication 14, caractérisée en ce que les maladies provoquées Dar le VHB comprennent l'hépatite aiguë, l'hépatite chro- nique, la cirrhose du foie et le cancer du fcie.