Brevet FR2920878A1 — publié le 20090313

PROCEDE DE TOXICOLOGIE PREDICTIVE OU DE TEST D'EFFICACil- PAR MESURE DE MOBILITE D'ORGANITES La présente invention concerne, de façon générale, 5 le domaine de la toxicologie, notamment celui de la pharmaco-toxicologie, et en particulier celui de la toxicologie prédictive. Plus précisément, l'invention concerne, selon un premier de ses aspects, un procédé pour tester l'effet, 10 sur un organisme animal ou humain, d'une substance exogène pour cet organisme animal ou humain. Par tester l'effet d'une substance on entend tester son efficacité ou sa toxicité. De manière connue, les dysfonctions mitochondriales 15 sont étudiées dans le contexte de la pharmacotoxicologie, principalement en utilisant des tests in vitro qui visen-r une des fonctions des mitochondries. Ces tests sont utilisés pour évaluer la toxicité systémique aigüe et comportent surtout les mesures de la 20 phosphorylation oxydative dans les divers complexes mitochondriaux utilisant des biopsies de tissu, ou des mitochondries isolées de cellules (Ishikawa T. et al., � Effects of therapeutic agents on cellular respiration as an indication of metabolic activity �, Human Exp. 25 Toxicol., Mars 2006, 25(3) :135-140), ou des particules submitochondriales (Karl E. Gustavson et al., � Comparisons of human-cell-based and submitochondrial particle bioassay responses to the MEIC compounds in reference to human toxicity data �, Toxicology, Vol. 177, 30 Numéros 2-3, 15 août 2002, pages 131-142), ou les mesures de l'ATP cellulaire (Kerkela R. et al., � Cardiotoxicit of the cancer therapeutic agent imatinib mesylate �, Nat. Med., Août 2006, 12(8) :908-16), ou l'évaluation de la viabilité cellulaire en utilisant le test MTT (Seok SH et 35 al., � Arsenite-induced apoptosis is prevented by antioxydants in zebrafish liver tell line �, Toxicol. In Vitro, Août 2007, 21(5) :870-7), ou encore, plus récemment, la mesure de la consommation d'oxygène en utilisant des sondes fluorescentes ou phosphorescentes (Wall Y. et al., � Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes �, Nat. Protoc., 2006, 1(6) :2563-72). La découverte du fait que le maintien du potentiel membranaire mitochondrial est essentiel pour le fonctionnement normal de la mitochondrie a abouti au développement de systèmes prédictifs de tests sur mitochondries isolées ou en milieu cellulaire pour détecter les effets de nouvelles entités chimiques (Arracher DE., � Drug-associated mitochondrial toxicity and its detection �, Curr. Med. Chem., 2005, 12(16) :1829-39). Cependant, la toxicité reste aujourd'hui la principale cause d'échec d'un médicament lors des essais cliniques. 35 à 45% des molécules sont écartées à cause d'une toxicité non suspectée, lors des phases d'essai clinique. En outre, la toxicité est aussi un problème majeur pour les médicaments après leur mise sur le marché. 20% des 548 molécules approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) entre 1975 et 1998 soit ont été retirées du marché, soit se sont vu imposer des changements significatifs d'étiquetage à cause de l'apparition d'effets indésirables inattendus. Ces faits soulèvent la question de l'efficacité de l'évaluation de la toxicité systémique aigüe en tant que moyen de prédiction de toxicité chronique ou de toxicité caractéristique qui sont responsables d'une proportion importante d'effets indésirables chez l'homme. La toxicite chronique résulte souvent d'une combinaison de différentes dysfonctions mitochondriales et est ainsi médiocrement modélisée par l'étude d'une seule de ces dysfonctions. Dans ce contexte, la présente invention a pour but de proposer un procédé exempt de l'une au moins des limitations précédemment évoquées, et en particulier qui permet une évaluation de l'efficacité ou de la toxicité de substances exogènes, améliorée par rapport aux procédés connus. A cette fin, le procédé de l'invention, pour tester l'effet, sur un organisme animal ou humain, d'une substance exogène pour cet organisme, est essentiellement caractérisé en ce qu'il comprend un marquage d'au moins un organite contenu dans des cellules extraites dudit organisme, une mise en contact des cellules avec la substance exogène, et une détermination de la mobilité d'au moins un organite marqué, contenu dans les cellules mises en contac-: avec la substance exogène. L'invention consiste donc en une mesure dynamique dans le temps de caractéristiques phénotypiques d'un organite dans la cellule. Par caractéristiques phénotypiques on entend que la mesure de la mobilité d'un organite résulte de différents mécanismes moléculaires affectant la fonction de cet organite. Ainsi, mesurer la mobilité seule revient à mesurer simultanément tous les effets moléculaires y contribuant. La mobilité mitochondriale par exemple résulte du contrôle de la bioénergétique de la mitochondrie mais aussi de l'homéostasie du calcium dans la cellule, de la teneur en ATP cellulaire, du niveau de phosphorylation dans la cellule, de l'intégrité du système microtubulaire dans le cytoplasme, et de l'interaction directe de la mitochondrie avec les moteurs moléculaires. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, un organite est la mitochondrie. De préférence, on marque plusieurs organites et on 30 détermine la mobilité de ces organites marqués. Lesdits organites sont par exemple choisis parmi les mitochondries, les vésicules, et/ou les lysosomes. Le marquage d'au moins un organite peut se faire à l'aide d'un fluorochrome spécifique de l'organite à 35 marquer, ou par transfection d'un gène rapporteur fluorescent ou luminescent dans l'organite à marquer, ou encore par microinjection dans les cellules d'une substance fluorescente ou luminescente qui est prélevée spécifiquement dans la cellule par l'organite à marquer. De manière avantageuse, le marquage de la mitochondrie se fait par mise en contact des cellules avec de la calcéine et du cobalt. Selon une version particulière de l'invention, la détermination de mobilité comprend un suivi, dans le temps et dans l'espace, d'au moins un signal issu du marquage, et une mesure d'au moins une variable choisie parmi l'intensité d'un signal, la forme d'un signal, le déplacement d'un signal dans une cellule, et/ou un rapport d'intensités entre deux signaux. A titre d'exemple, le suivi et la mesure sont réalisés à l'aide d'un microscope à fluorescence, couplé à une caméra à dispositif à couplage de charge (caméra CCD). Le suivi et la mesure sont tout préférentiellement réalisées en trois dimensions. Le dispositif de suivi et de mesure peut donc être notamment un microscope à fluorescence équipé d'un plateau motorisé permettant la visualisation d'un échantillon en trois dimensions. La caméra CCD permet la capture de trames haute résolution à haute fréquence. La technique d'imagerie à haut contenu mise en oeuvre dans l'invention permet d'observer les organites dans leur milieu naturel : la cellule. Cette technique permet d'éviter les artefacts expérimentaux et donc les risques d'erreur, par rapport à une technique utilisant des organites isolés. La détermination de mobilité comprend en outre préférentiellement un enregistrement et un traitement des variables mesurées, dans une base de données. Ainsi, selon l'invention, on peut utiliser un dispositif d'enregistrement et de traitement consistant en un ordinateur dans lequel un logiciel peut enregistrer, combiner et analyser les images qui sont vues à travers le microscope. Le contenu de la base de données peut être analysé pour décrire les différents comportements d'un échantillonnage d'organites marqués, à l'intérieur de chaque image, selon au moins une variable mesurée. Une image correspond en général à une cellule extraite de l'organisme étudié. Plusieurs cellules d'un même échantillon sont mises en image et les organites marqués qu'elles contiennent sont suivis. Plusieurs échantillons d'un même type cellulaire sont en général étudiés. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le traitement des variables mesurées consiste en au moins une typologie choisie parmi la typologie du transport mitochondrial dans la cellule, la comparaison des typologies de transport d'au moins deux organites de types différents, la typologie du flux de calcium mitochondrial dans la cellule, et/ou la comparaison des typologies de flux de calcium cytoplasmique et mitochondrial. Par exemple, les changements de typologie du transport mitochondrial dans les cellules sont corrélés à des modifications du niveau de calcium cellulaire, à une déplétion en ATP cellulaire, à une interaction des mitochondries avec des ATPases moteurs spécifiques, à une certaine bioénergétique des mitochondries, ou encore à un certain niveau de phosphorylation des protéines. L'analyse du transport mitochondrial représente donc une mesure intégrative qui peut être interprétée comme une résultante de l'ensemble des effets listés juste ci- dessus. Cette analyse présente donc une haute valeur prédictive. En conséquence, les modifications de typologie du transport mitochondrial indiquent le développement d'une maladie chronique telle que les maladies neurodégénératives, les myopathies, le SIDA, un cancer, les maladies du métabolisme, et le vieillissement. Elles indiquent également la réponse à un xénobiotique qui induit une réponse toxique dans l'organe étudié eL modélisé par l'invention. Selon l'invention, la substance exogène étudiée peut être choisie parmi un médicament autorisé, des substances chimiques ou biologiques entrant dans la composition de médicaments, des substances chimiques entrant dans la composition de produits issus de l'industrie chimique, des substances chimiques entrant dans la composition de fertilisants et autres produits phytochimiques, des substances chimiques entrant dans la composition d'aliments, de nutraceutiques, ou de compléments alimentaires, des substances chimiques entrant dans la composition de produits cosmétiques, ou des substances chimiques entrant dans la composition de contaminants environnementaux. L'effet d'une substance exogène peut être comparé à celui de molécules de référence par exemple ayant entraînées une toxicité chronique connue ou étant identifiées comme médicaments sûrs. L'organisme concerné par l'invention est plus particulièrement un organisme humain. Les différents types de cellules pouvant être utilisées dans l'invention sont des cellules primaires humaines telles que des fibroblastes, des myoblastes et des hépatocytes, des lignées humaines telles que HepG2, HEK293 et NT2, ou la lignée stéroidogénique AN4R. On utilise de préférence des cellules humaines non transformées, ce qui permet d'obtenir des résultats plus facilement transposables à l'homme. Les cellules sont plus particulièrement choisies parmi des fibroblastes, des cellules sanguines, des lymphocytes, des cellules dendritiques, des cellules hépatiques, des cellules musculaires, des cellules de rein, des cellules nerveuses, des cellules de substitut de peau, et/ou des cellules de coculture. Le procédé selon l'invention prend en compte les fonctions globales de la mitochondrie notamment, et pas seulement sa viabilité ou la synthèse d'ADN mitochondrial, comme le font les procédés actuellement disponibles. Ce procédé offre une technique plus sensible à faible dose et totalement compatible avec les produits 5 pharmaceutiques d'origine biologique. L'invention concerne, selon un deuxième de ses aspects, l'utilisation du procédé selon l'invention, pour la sélection de médicaments avant leur mise sur le marché, ou pour le tri de médicaments mis sur le marché. 10 Cette utilisation permet une réduction considérable des coûts de développement de molécules pour l'industrie pharmaceutique. En particulier, l'invention propose d'améliorer le développement de médicaments pour les pathologies virales 15 (SIDA, hépatite C), les cancers, le contrôle des risques cardio-vasculaires, la maîtrise des pathologies métaboliques (diabète par exemple), les myopathies (FSHD, BPC:O), et les dégénérescences nerveuses (Alzheimer, Parkinson, Huntington, rétinopathies). 20 L'invention trouve des applications dans de nombreux domaines, en plus de celui de l'industrie pharmaceutique, tels que celui de la cosmétique, celui de l'agroalimentaire, celui de la production d'additifs, celui de l'agriculture, celui de l'environnement, celui 25 de la chimie en général. Par exemple, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre pour évaluer l'impact, sur la santé humaine, de produits chimiques entrant dans la composition de produits courants. 30 A titre d'illustration non limitative de l'invention, la figure 1 en annexe représente une évaluation de pharmaco-toxicité pour différentes substances, par l'intermédiaire d'une mesure de mobilité mitochondriale. 35 L'évaluation a été réalisée sur des cultures primaires de fibroblastes humains. L'axe des ordonnées représente la mobilité exprimée en micromètres par minute (pm/min). Chaque colonne de la figure correspond à une substance testée : - colonne b : AMP-PNP ; - colonne c : cytochalasine ; - colonne d : BAPTA ; -colonne e : taxol ; et - colonne : nocodazol. La colonne a correspond à un témoin négatif. Cette figure confirme l'intérêt de la mesure de mobilité en tant que mesure intégrative, en ce qu'on en conclut que la mobilité mitochondriale est dépendante au moins de l'ensemble des phénomènes cellulaires suivants : - la phosphorylation par l'intermédiaire de l'ATP (les kinases dépendantes de l'ATP sont bloquées par l'AMP-PNP) ; - la polymérisation du réseau d'actine (bloquée par la cytochalasine) ; - la présence de calcium intracellulaire libre (bloquée par le BAPTA) ; et -l'intégrité du réseau de microtubules (perturbée par le taxol et le nocodazol). Il est à noter que la perturbation de la mobilité mitochondriale est plus importante sous l'effet du nocodazol qui déstabilise le réseau de microtubules, que sous l'effet du taxol qui stabilise ce réseau. Cependant, à forte dose, le taxol bloque aussi la mobilité mitochondriale (non montré). REVENDICATIONS 1. Procédé pour tester l'effet, sur un organisme 5 animal ou humain, d'une substance exogène pour cet organisme, caractérisé en ce qu'il comprend : -un marquage d'au moins un organite contenu dans des cellules extraites dudit organisme, - une mise en contact des cellules avec la substance 10 exogène, et - une détermination de la mobilité d'au moins un organite marqué, contenu dans les cellules mises en contact avec la substance exogène. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un 15 organite est la mitochondrie. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on marque plusieurs organites et on détermine la mobilité de ces organites marqués. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel 20 lesdits organites sont choisis parmi les mitochondries, les vésicules, et/ou les lysosomes. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le marquage d'au moins un organite se fait à l'aide d'un fluorochrome spécifique de l'organite 25 à :parquer, ou par transfection d'un gène rapporteur fluorescent ou luminescent dans l'organite à marquer, ou par microinjection dans les cellules d'une substance fluorescente ou luminescente qui est prélevée spécifiquement dans la cellule par l'organite à marquer. 30 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel le marquage de la mitochondrie se fait par mise en contact des cellules avec de la calcéine et du cobalt. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 35 1 à 6, dans lequel la détermination de mobilité comprend un suivi, dans le temps et dans l'espace, d'au moins un signal issu du marquage, et une mesure d'au moins une variable choisie parmi l'intensité d'un signal, la forme d'an signal, le déplacement d'un signal dans une cellule, et/ou un rapport d'intensités entre deux signaux. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la détermination de mobilité comprend en outre un enregistrement et un traitement des variables mesurées, dans une base de données. 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le suivi et la mesure sont réalisés à l'aide d'un microscope à fluorescence, couplé à une caméra à 10 dispositif à couplage de charge. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, dans lequel le suivi et la mesure sont réalisées en trois dimensions. 11. Procédé selon l'une quelconque des 15 revendications 8 à 10, dans lequel le traitement des variables mesurées consiste en au moins une typologie choisie parmi la typologie du transport mitochondrial dans la cellule, la comparaison des typologies de transport d'au moins deux organites de types différents, 20 la typologie du flux de calcium mitochondrial dans la cellule, et/ou la comparaison des typologies de flux de calcium cytoplasmique et mitochondrial. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la substance exogène 25 est choisie parmi un médicament autorisé, des substances chimiques ou biologiques entrant dans la composition de médicaments, des substances chimiques entrant dans la composition de produits issus de l'industrie chimique, des substances chimiques entrant dans la composition de 30 fertilisants et autres produits phytochimiques, des substances chimiques entrant dans la composition d'aliments, de nutraceutiques, ou de compléments alimentaires, des substances chimiques entrant dans la composition de produits cosmétiques, ou des substances 35 chimiques entrant dans la composition de contaminants environnementaux. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel l'organisme est un organisme humain. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel les cellules sont choisies parmi des fibroblastes, des cellules sanguines, des lymphocytes, des cellules dendritiques, des cellules hépatiques, des cellules musculaires, des cellules de rein, des cellules nerveuses, des cellules de substitut de peau, et/ou des cellules de coculture. 15. Utilisation du procédé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14, pour la sélection de médicaments avant leur mise sur le marché, ou pour le tri de médicaments mis sur le marché.