Brevet FR2919054A1 — publié le 20090123

Procédé de dépôt d'une suspension cellulaire sur une plaque d'analyse. La présente invention concerne un procédé de dépôt d'une suspension cellulaire sur une plaque d'analyse au moyen d'une pipette de prélèvement comprenant une étape de prélèvement d'un volume de suspension cellulaire. Afin de permettre une analyse biologique efficace de cellules prélevées, par exemple par frottis, il est primordial que la suspension cellulaire disposée sur la plaque d'analyse présente un étalement cellulaire en couche mince d'excellente qualité, homogène et sans amas. A cet effet, il est connu de mélanger la suspension cellulaire, contenant les cellules prélevées et un liquide de conservation cellulaire, à un liquide de mélange afin de diluer les cellules dans une suspension cellulaire de volume plus important. On obtient ainsi un meilleur étalement cellulaire. De plus, le mélange permet une remise en suspension des cellules afin d'obtenir une répartition homo-gène des cellules dans la suspension. On connaît l'utilisation d'un puits de mélange dans lequel on verse la sus-pension cellulaire et le liquide de mélange afin de mélanger ces deux liquides. Cependant, dans un tel puits, les cellules peuvent adhérer à la paroi du puits ou rester dans le fond de celui-ci, ce qui entraîne des pertes cellulaires potentielle-ment gênantes pour l'analyse ultérieure. De plus, l'utilisation d'un tel puits jetable entraîne des achats de matériels supplémentaires, ce qui pose des problèmes de coûts et d'élimination des déchets. Dans certains systèmes, le dépôt sur la plaque d'analyse se fait par décantation de la suspension cellulaire dans une chambre de décantation disposée au-dessus de la plaque d'analyse. Le liquide de conservation cellulaire est progressi- vement absorbé autour de la plaque d'analyse et les cellules se déposent sur la plaque d'analyse. Un tel système est par exemple décrit dans le document EP-1 045 249. II n'est pas possible d'effectuer le mélange directement dans la chambre de décantation car le liquide de mélange est progressivement absorbé, ce qui empêche la remise en suspension, faute de liquide. De plus, certaines cellules commencent à se déposer sur et à adhérer à la plaque d'analyse avant même que la remise en suspension se fasse, ce qui ne permet pas d'obtenir un dépôt homo-gène. 2 L'un des objectifs de l'invention est de pallier ces inconvénients en proposant un procédé de dépôt d'une suspension cellulaire sur une plaque d'analyse permettant d'obtenir un étalement cellulaire d'excellente qualité, homogène et sans amas. A cet effet, l'invention concerne un procédé de dépôt d'une suspension cellulaire sur une plaque d'analyse au moyen d'une pipette de prélèvement comprenant une étape de prélèvement d'un volume de suspension cellulaire, comprenant au moins les étapes successives suivantes : - prélever au moyen de la pipette un premier volume de liquide de mélange, - prévoir un premier volume d'air sous le premier volume de liquide de mélange, -prélever un deuxième volume de liquide de mélange, séparé du premier volume de liquide de mélange par le premier volume d'air, le procédé comprenant en outre les étapes suivantes après le prélèvement du volume de suspension cellulaire sous le deuxième volume de liquide de mélange : -permettre le passage de la suspension cellulaire à la surface du deuxième volume de liquide de mélange du fait de la différence de densité entre la suspension cellulaire et le liquide de mélange, - imprimer un mouvement de va et vient aux liquides présents dans la pipette de sorte que le premier volume d'air est comblé et que le premier et le deuxième volumes de liquide de mélange et le volume de suspension cellulaire se mélangent assurant ainsi la formation d'une suspension cellulaire diluée homo-gène dans la pipette, - déposer la suspension cellulaire obtenue sur la plaque d'analyse. Selon d'autres caractéristiques du procédé de l'invention : -il comprend en outre les étapes suivantes, avant le prélèvement du premier volume de liquide de mélange : - prélever un volume de liquide de rinçage, - prévoir un deuxième volume d'air, ledit volume d'air étant agencé pour empêcher le mélange du volume de liquide de rinçage et du premier volume de liquide de mélange lors du mouvement de va et vient imprimé dans la pipette, le liquide de rinçage entraînant les cellules adhérant à la paroi de la pipette pendant le dépôt de la suspension cellulaire sur la plaque d'analyse et étant déposé avec la suspension cellulaire ; - le rapport entre le premier volume d'air et le premier volume de liquide de mélange est sensiblement compris entre 1/10 et 1/3 ; - le rapport entre le premier volume de liquide de mélange et le deuxième volume de liquide de mélange est sensiblement compris entre 1/3 et 1 ; - le volume de suspension cellulaire prélevée est sensiblement compris entre 50 l et 150 l ; - le volume de liquide de rinçage est sensiblement compris entre 100 l et 200 pi; - le deuxième volume d'air est sensiblement compris entre 50 pi et 150 pl ; - les prélèvements de liquides et d'air ainsi que le mouvement de va et vient imprimé dans la pipette sont assurés par un dispositif de pompage ; et - l'étape de dépôt sur la plaque d'analyse consiste à vider la pipette dans une chambre de décantation disposée au-dessus de la plaque d'analyse. D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit, donnée à titre d'exemple et faite en référence aux dessins annexés dans lesquels : - la Fig. 1 est une représentation schématique en coupe d'une pipette dans laquelle les différents prélèvements prévus par le procédé ont été effectués, - la Fig. 2 est une représentation schématique en coupe de la pipette de la Fig. 1 lors du mélange prévu par le procédé, - la Fig. 3 est une représentation schématique de la pipette de la Fig. 1 dis- posée au-dessus d'une chambre de décantation lors du dépôt de la suspension cellulaire sur une plaque d'analyse. La pipette 1 représentée sur les figures est par exemple une pipette jetable connue en soi et dont l'aspiration est commandée par un dispositif de pompage, également connu et non représenté. Le dispositif de pompage permet un prélè- vement de liquide précis dont le volume peut être parfaitement sélectionné. Au cours d'une première étape du procédé, un volume VI d'un liquide de rinçage 2 est prélevé au moyen de la pipette 1. Le liquide de rinçage est par exemple de l'eau distillée ou du sérum physiologique, et permet d'entraîner les 4 cellules adhérant à la paroi de la pipette 1, comme cela sera décrit ultérieurement. Le volume V1 est par exemple sensiblement compris entre 100 pl et 200 pl. Selon un mode de réalisation, le volume V1 est sensiblement égal à 150 pl. Un volume V2 d'air est prévu dans la pipette 1 sous le liquide de rinçage 2. Ce volume V2 est par exemple sensiblement compris entre 50 pl et 150 pi. La fonction de ce volume d'air sera décrite ultérieurement. Sous le volume V2 d'air, un premier volume V3 d'un liquide de mélange 3 est prélevé au moyen de la pipette 1. Le liquide de mélange est par exemple de l'eau distillée ou du sérum physiologique. Le premier volume V3 de liquide de mé- lange 3 est par exemple sensiblement compris entre 100 pl et 200 pl. Selon un mode de réalisation, le volume V3 est sensiblement égal à 150 pl. Un volume V4 d'air est prévu dans la pipette 1 sous le premier volume V3 de liquide de mélange 3. Le rapport entre le premier volume V4 d'air et le premier volume V3 de liquide de mélange 3 est lié à la hauteur du déplacement du va et vient lors du pompage qui doit dépasser la hauteur du volume d'air et être sensiblement compris entre 1/10 et 1/3. Ainsi ce volume V4 est par exemple sensible-ment compris entre 10 pl et 30 pl. Selon un mode de réalisation, le volume V4 est sensiblement égal à 20 pl. Sous le volume V4 d'air, un deuxième volume V5 du liquide de mélange 3 est prélevé, séparé du premier volume V3 par le volume V4 d'air. Le rapport entre le premier volume V3 de liquide de mélange 3 et le deuxième volume V5 de liquide de mélange 3 est sensiblement compris entre 1/3 et 1. Ainsi, le deuxième volume V5 de liquide de mélange 3 est par exemple sensiblement compris entre50 pl et 200 pl. Selon un mode de réalisation, le deuxième volume V5 est sen- siblement égal à 130 pl. Ensuite, un volume V6 d'une suspension cellulaire 4 est prélevé sous le deuxième volume V5 de liquide de mélange 3. La suspension cellulaire 4 contient les cellules 5 à analyser et un liquide de conservation de ces cellules. Les cellules 5 sont par exemple obtenues de façon connue par frottis, grattage, recueil de li- guide ou ponction à l'aiguille. Le volume V6 est par exemple sensiblement compris entre 50 pl et 150 pl. Selon un mode de réalisation, le volume V6 est sensiblement égal à 70 pl. La différence de densité entre le liquide de mélange 3 et le liquide de la suspension cellulaire 4 fait que la suspension cellulaire 4 remonte dans le 5 deuxième volume V5 de liquide de mélange 3 et vient se placer sous le volume V4 d'air. La suspension cellulaire 4 est ainsi entourée de liquide de mélange 3. Au moyen du dispositif de pompage, un mouvement de va et vient est imprimé aux liquides présents dans la pipette 1, comme représenté par les flèches F de la Fig. 2. On prévoit par exemple d'effectuer trois mouvements verticaux, alter- nativement dans un sens et dans l'autre, dans la pipette 1. Ce mouvement de va et vient a pour effet de faire éclater la bulle d'air de volume V4, du fait de petite valeur de celui-ci. Ainsi, le premier et le deuxième volumes V3 et V5 de liquide de mélange 3 sont mélangés avec le volume V6 de suspension cellulaire 4, comme représenté sur la Fig. 2. On obtient ainsi une suspension cellulaire 6 diluée dans le liquide de mélange 3. Les cellules 5 sont réparties de façon homogène dans la suspension 6 grâce à la position de la suspension cellulaire 4 prélevée entre les deux volumes de liquide de mélange 3 avant le mouvement de va et vient. Du fait du volume V2 important d'air entre le premier volume V3 de liquide de mélange 3 et le volume V1 de liquide de rinçage 2, le mouvement de va et vient n'a pas pour effet de mettre en contact la suspension cellulaire 6 diluée avec le liquide de rinçage 2. Ainsi, comme représenté sur la Fig. 2, la suspension cellulaire diluée 6 ne se mélange pas au liquide de rinçage 2 lors du mouvement de va et vient. L'étape suivante du procédé consiste à vider la pipette 1 dans une chambre de décantation 7 disposée au-dessus d'une plaque d'analyse 8, comme représenté sur la Fig. 3. Un matériau absorbant 9 est disposé autour sur la plaque d'analyse autour de la zone de dépôt de sorte à être en communication fluidique avec la suspension cellulaire 6 versée dans la chambre de décantation 7 et à ab- sorber le liquide de cette suspension 6 au cours de la décantation. L'absorption du liquide de la suspension 6 permet d'obtenir le dépôt cellulaire sur la plaque d'analyse 8, de façon connue. Grâce à la dilution de la suspension cellulaire pré- levée 4 et à la remise en suspension dans le liquide de mélange 3, le dépôt cellulaire obtenu sur la plaque d'analyse 8 est homogène et dépourvu d'amas. Lorsque la suspension cellulaire diluée 6 est vidée dans la chambre de décantation 6, le liquide de rinçage 2 descend dans la pipette 1, comme représenté par la flèche F' de la Fig. 3, et entraîne avec lui les cellules 5 qui ont adhéré à la paroi interne de la pipette 1. Ces cellules 5 sont ainsi également versées dans la chambre de décantation 7. On évite ainsi toute perte cellulaire qui pourrait nuire à la qualité de l'analyse cellulaire ultérieure. Le procédé selon l'invention permet d'éviter l'achat de matériels supplé- mentaires en utilisant la pipette 1 de prélèvement pour effectuer le mélange et la remise en suspension de la suspension cellulaire 4. Le procédé est donc particulièrement économique et simple à mettre en oeuvre, tout en permettant d'obtenir un étalement cellulaire en couche mince d'excellente qualité, homogène et sans amas sur la plaque d'analyse 8. REVENDICATIONS 1.- Procédé de dilution, de remise en suspension et de dépôt d'une sus-pension cellulaire sur une plaque d'analyse (8) au moyen d'une pipette de prélèvement (1) comprenant une étape de prélèvement d'un volume (V6) de suspen- sion cellulaire (4), caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes préalables successives suivantes : - prélever au moyen de la pipette (1) un premier volume (V3) de liquide de mélange (3), - prévoir un premier volume (V4) d'air sous le premier volume (V3) de li-10 quide de mélange (3), - prélever un deuxième volume (V5) de liquide de mélange (3), séparé du premier volume (V3) de liquide de mélange (3) par le premier volume (V4) d'air, le procédé comprenant en outre les étapes suivantes après le prélèvement du volume (V6) de suspension cellulaire (4) sous le deuxième volume (V5) de li- 15 quide de mélange (3) : - permettre le passage de la suspension cellulaire (4) â la surface du deuxième volume (V5) de liquide de mélange (3) du fait de la différence de densité entre la suspension cellulaire (4) et le liquide de mélange (3), - imprimer un mouvement de va et vient aux liquides présents dans la pi- 20 pette (1) de sorte que le premier volume (V4) d'air est comblé et que le premier et le deuxième volumes (V3, V5) de liquide de mélange (3) et le volume (V6) de sus-pension cellulaire (4) se mélangent assurant ainsi la formation d'une suspension cellulaire diluée (6) homogène dans la pipette (1), - déposer la suspension cellulaire (6) obtenue sur la plaque d'analyse (8). 25 2.- Procédé de dépôt selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes, avant le prélèvement du premier volume (V3) de liquide de mélange (3) : - prélever un volume (V1) de liquide de rinçage (2), - prévoir un deuxième volume (V2) d'air, ledit volume (V2) d'air étant agen- 30 cé pour empêcher le mélange du volume (VI) de liquide de rinçage (2) et du premier volume (V3) de liquide de mélange (3) lors du mouvement de va et vient imprimé dans la pipette (1),le liquide de rinçage (2) entraînant les cellules (5) adhérant à la paroi de la pipette (1) pendant le dépôt de la suspension cellulaire (6) sur la plaque d'analyse (8) et étant déposé avec la suspension cellulaire (6). 3.- Procédé de dépôt selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le 5 rapport entre le premier volume (V4) d'air et le premier volume (V3) de liquide de mélange (3) est sensiblement compris entre 1/10 et 1/3. 4.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le rapport entre le premier volume (V3) de liquide de mélange (3) et le deuxième volume (V5) de liquide de mélange (3) est sensiblement corn- 10 pris entre 1 /3 et 1. 5.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le volume (V6) de suspension cellulaire (4) prélevée est sensiblement compris entre 50 pl et 150 O. 6.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, ca-15 ractérisé en ce que le volume (V1) de liquide de rinçage (2) est sensiblement compris entre 100 l et 200 ul. 7.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le deuxième volume (V2) d'air est sensiblement compris entre 50 pl et 150 l. 20 8.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les prélèvements de liquides et d'air ainsi que le mouvement de va et vient imprimé dans la pipette (1) sont assurés par un dispositif de pompage. 9.- Procédé de dépôt selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ca-25 ractérisé en ce que l'étape de dépôt sur la plaque d'analyse (8) consiste à vider la pipette (1) dans une chambre de décantation (7) disposée au-dessus de la plaque d'analyse (8).