Brevet FR2912154A1 — publié le 20080808

La présente invention concerne des levures génétiquement modifiées pour la production de glycoprotéines possédant des structures glycaniques optimisées et homogènes. Ces levures comprennent une inactivation du gène Ochl, l'intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un premier promoteur, et une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-1-2 mannosidase I, et l'intégration d'une cassette comprenant un deuxième promoteur différent dudit premier promoteur et la séquence codante d'une glycoprotéine exogène. Ces levures permettent de produire de l'EPO avec une glycosylation optimisée et homogène à 98%. La production de glycoprotéines ou glycopeptides présentant des glycanes du type complexe, c'est à dire des structures identiques aux oligosaccharides ajoutés lors des modifications post-traductionnelles chez l'homme, est un objectif recherché depuis quelques années dans l'industrie pharmaceutique. En effet, de nombreuses études ont montré l'importance des oligosaccharides pour optimiser l'activité des glycoprotéines thérapeutiques ou encore pour améliorer leur temps de demi-vie une fois administrées. Par exemple, l'érythropoiétine humaine (HuEPO) est une glycoprotéine de 166 acides aminés contenant trois sites de N-glycosylation aux positions Asn-24, Asn-38 et Asn-83 et un site de O-glycosylation de type mucine à la position Ser-126. L'EPO est un modèle particulièrement pertinent pour l'étude de la N-glycosylation de part ses structures glycosylées représentant 40% de sa masse moléculaire. La molécule d'EPO considérée comme naturelle est la forme urinaire (uHuEPO) (Takeuchi et al 1988, Tsuda 1988 Rahbek-nielsen 1997). L'EPO recombinante (rHuEPO) est actuellement produite dans les cellules CHO (sasaki H et al, takeuchi et al, 1988) ou dans les cellules BHK (nimtz et al 1993). La rHuEPO exprimées dans les lignées cellulaires présentent des structures N-glycaniques différentes des structures retrouvées dans la uHuEPO. Ces différences peuvent avoir une répercussion in vitro (Higuchi et al, 1992 ; Takeuchi et al, 1990) mais semblent plus sensibles in vivo par une perte d'activité drastique pour les formes déglycosylées et une augmentation d'activité corrélée au nombre d'acides sialiques présents sur la structure (Higuchi M et al, 1992). Pour produire des glycoprotéines présentant une N- ou 0-glycosylation optimale, de nombreuses solutions techniques ont été proposées. On peut citer la modification in vitro des structures glycaniques par addition de sucres tel le galactose, le glucose, le fucose ou encore l'acide sialique au moyen de différentes glycosyl-transférases ou par suppression de certains sucres tel le mannose par des mannosidases. Cette technique est Io décrite dans WO 03/031464 (Neose). On peut cependant se demander comment une telle technique peut être mise en oeuvre à grande échelle car cela implique de nombreuses étapes pour une modification séquentielle de plusieurs oligosaccharides donnés présents sur une même glycoprotéine. A chaque étape, un contrôle strict de la réaction doit être effectué et il faut s'assurer d'une production de structures glycaniques 15 homogènes. Or, dans le cas où il faut modifier plusieurs oligosaccharides sur une glycoprotéine, une réaction séquentielle peut aboutir à des modifications non souhaitées et hétérogènes. Cette technique n'est donc pas compatible avec la préparation de biomédicaments. En outre, l'utilisation d'enzymes purifiés pour une production à l'échelle industrielle n'apparaît pas représenter une alternative économique viable. 20 Il en est de même avec les techniques de couplage chimiques, comme celles décrites dans les documents WO 2006/106348 et WO 2005/000862. Ces techniques de couplage chimique impliquent des réactions fastidieuses, des étapes de protection / dé-protection, de multiples contrôles. Dans le cas où il faut modifier plusieurs oligosaccharides sur une 25 glycoprotéine donnée, une réaction séquentielle peut également aboutir à des modifications non souhaitées et hétérogènes. D'autres technologies utilisant des lignées cellulaires de mammifères telles que YB2/0 décrites dans WO 01/77181 (LFB) ou encore CHO génétiquement modifié dans WO 30 03/055993 (Kyowa) ont démontré qu'une une faible fucosylation de la région Fc des anticorps améliore l'activité ADCC d'un facteur 100. Cependant, ces technologies se rapportent spécifiquement à la production d'anticorps. Enfin, il a été proposé de produire des glycoprotéines chez la levure ou les champignons filamenteux par transformation de ces micro-organismes avec des plasmides permettant l'expression de mannosidases et de différentes glycosyl transférases. Cette approche a été décrite dans WO 02/00879 (Glycofi). Cependant, à ce jour, il n'a pas été démontré que ces micro-organismes sont stables dans le temps en fermenteur à haute capacité pour la fabrication de lots cliniques. De même, il n'est pas montré que cette transformation permet de produire des glycoprotéines avec les glycanes souhaités et homogènes. Dans le but de produire de la rHuEPO possédant des structures N-glycaniques permettant d'obtenir l'activité optimale in vivo, nous avons exprimé une rHuEPO dans des levures S.cerevisiae et S.pombe génétiquement modifiées. Ces levures ont montrées une forte expression de la rHuEPO présentant des motifs de N-glycosylation homogènes et bien caractérisés. Dans un second temps, nous sommes partie de ces levures génétiquement modifiées et nous avons incorporées d'autres modifications de sorte à produire des motifs N-glycaniques plus complexes suivant leurs degrés de sialylation. Le système levure est connu pour sa capacité à produire rapidement de grande quantité de protéines mais les levures modifiées décrites ci-après sont capables également de N- glycosyler de façon humanisée et homogène les protéines produites. En outre, ces levures se sont avérées stables en condition de production à grande échelle. Enfin, en cas de mutations conduisant à une réversion génotypique, ces levures sont construites de sorte à permettre une restauration à l'identique, ce qui est requis dans le cadre de la production de lots cliniques. Il s'agit donc du premier exemple illustrant les méthodes d'intégration ciblées dans les locus particuliers qui ont été utilisées pour l'ensemble de l'invention, méthodes permettant un contrôle au nucléotide près de régions génomiques interrompues et sélectionnées, et autorisant par conséquent une restauration de l'interruption en cas de réversion génomique spontanée. Cette méthode est à opposer à celle décrite dans WO 02/00879, consistant à transformer une souche de levure avec une banque de séquences et à sélectionner par la suite le meilleur clone sans aucune caractérisation génomique. En effet, dans WO 02/00879 les intégrations sont aléatoires et les clones sont sélectionnés uniquement sur la base du profil de structures N-glycanniques des protéines produites, ce qui implique en cas de mutation, réversion ou tout autre modification génétique la perte pure et simple du clone d'intérêt. L'avantage de la technologie selon l'invention, est de procurer une sécurité accrue à l'utilisateur, en lui fournissant une garantie de contrôle, de traçabilité des modifications génétiques, et surtout la possibilité de reconstruire un clone qui possédera rigoureusement les mêmes aptitudes. l0 En outre, nous apportons pour la première fois une technologie de "Glycan-on-Demand" à partir de la souche Amélie décrite ci-après. Dans ces conditions l'homogénéité des structures est plus importantes que dans des systèmes CHO qui glycosylent comme les mammifères. En effet, les résultats obtenus (voir spectre EPO), font état d'une structure glycannique du type Man5GlcNAc2 représentant environ 98% des N-glycannes 15 présents sur la protéine. Le système est donc conçu pour forcer la glycosylation afin d'obtenir un motif désiré en très grande proportion. La souche Amélie est le clone servant de base à l'élaboration de toute autre souche destinée à produire des glycannes humanisés, hybrides ou complexes, que l'on souhaite 20 obtenir. L'avantage de cette souche est de constituer un point de départ, qui a été démontré comme étant système stable et homogène produisant 98% de glyprotéines Man5GlcNAc2, pouvant être repris pour des modifications supplémentaires comme l'introduction d'une G1cNAc transférase, d'une fucosyltransférase, d'une galactosyl et/ou sialyl transférase, à la demande, rapidement, selon les structures finales souhaitées. 25 Description de l'invention La construction d'une cassette d'expression s'effectue en intégrant une séquence promotrice en 5' et une séquence terminale en 3' de l'ORF. D'autre part, l'intégration 30 de ces cassettes dans le génome des levures est contrôlée par l'ajout aux extrémités de séquences homologues au locus cible dans le but d'une intégration par recombinaison homologue. Pour chaque souche et pour chaque ORF, les séquences promotrices ainsi que les séquences d'intégration ont été déterminées dans le but d'obtenir une expression stable et optimale des différentes enzymes permettant un glycosylation homogène des glycoprotéines. La construction d'une cassette d'expression se fait en plusieurs étapes successives de PCR, suivant ce modèle général montré à la figure 1 (PCR d'assemblage pour construction des cassettes d'expression des ORFs). Certaines séquences d'ORF ont été partiellement modifiées en intégrant des signaux de localisation sub-cellulaire afin d'exprimer (d'adresser) la protéine dans un compartiment où son activité sera optimale (environnement, présence du donneur et des substrats etc...). Ainsi, dans un premier aspect, la présente invention concerne des levures génétiquement modifiées, capables de produire des glycoprotéines présentant des glycanes homogènes présentant la strucuture Man5GlcNAc2, lesdites levures comprenant les modifications suivantes: a) inactivation du gène Ochl codant pour l'a1,6 mannosyltransférase par insertion par recombinaison homologue d'une séquence hétérologue codant pour un gène de 20 résistance à une antibiotique (la Kanamycine) (souche delta-Ochl), b) Intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase 25 ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-1-2 mannosidase I comprenant une séquence de ciblage dans le réticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription, c) Intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, 30 TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, ledit promoteur en c) étant différent du promoteur en b); une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour glycoprotéine exogène à produire et un terminateur de la transcription. De préférence, les levures décrites ci-dessus ont intégré l'a-1-2 mannosidase I de C. Elegans, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 1. Ces levures se sont montrées capables de produire des glycoprotéines possédant 98% de glycanes Man5GlcNac2 : Man al,6N Man al,3 Amélie Man al, 6 20 25 Man 131,4-G1cNAc (31,4-G1cNAc(31-Asn 15 Man al,3 Avantageusement, la a-1-2 mannosidase I est exprimée sous le contrôle du promoteur pGAP et la glycoprotéine protéine exogène est exprimée sous le contrôle du promoteur pGAL1. Pour la suite de la description il sera fait référence aux abréviations employées dans l'état de la technique Man = mannose, GlcNac = N-acétyl-glucosamine, Gal = galactose, Fuc = fucose et NANA désignant l'acide sialique ou encore le N-acétyl-neuraminique acide. Dans un deuxième aspect, les levures de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% de la structure GlcNacMan5GlcNAc2 : 30 Man al,6 N Man al,6 Man al,37 Man (31,4-G1cNAc (31,4-G1cNAc(31-Asn G1cNAc (31,2-Man al,3 A cet effet, les souches ci-dessus comprennent en outre l'intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour la N-acétyl-glucosaminyl transférase I humaine comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. De préférence, la N-acétyl-glucosaminyl transférase I humaine comprend la séquence SEQ ID No 2 sans la partie cytoplasmique de l'enzyme qui est remplacée par la partie cytoplasmique de Mnn9 pour une localisation golgienne de la protéine. Cette souche est désignée Arielle Arielle doit aussi contenir la cassette Transporteur UDP G1cNAc (décrite plus bas) pour synthétiser ce type de glycanne. Avantageusement, on utilise le promoteur pGAP. Mnn9 At2tcactttctctt2tatc2taccgcctaa2aaa2aaccc2t222ttaac partie cytoplasmique (SEQ 25 ID No 131 La souche Amélie ci-dessus peut comprendre en outre l'intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin 30 bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour la pour le transporteur d'UDP-GlcNAc humain et un terminateur de la transcription. De préférence, le transporteur d'UDP-GlcNAc humain comprend la séquence SEQ ID No 3. De préférence, le promoteur est PGK. Cette souche est désignée ci-après "Agathe". Dans un troisième aspect, les levures de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% de la structure GlcNacMan3GlcNAc2 : G1cNAc (31,2-Man al,3 15 A ce titre, les levures Amélie mentionnées ci-dessus comprennent une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, PhoS, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de 20 lecture comprenant la séquence codante pour une mannosidase II comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription De préférence, la mannosidase II est celle de la souris, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 4. De préférence, le promoteur est TEF. Cette souche est désignée ci-après "Anaïs". 25 Dans un quatrième aspect, les levures de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% de la structure G1cNac2Man3GlcNAc2 : Man al,6 Man (31,4-G1cNAc (31,4-G1cNAc(31-Asn 30 25 G1cNAc 131,2 ù Man a1,6 Man (31,4-G1cNAc (31,4-G1cNAc[31-Asn G1cNAc 131,2 Man a 5 Dans ce cas, les levures Anaïs mentionnées ci-dessus comprennent une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, 10 CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une N-acetyl-glucosaminyl transférase II, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. De préférence, la N-acetyl-glucosaminyl 15 transférase II est humaine, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 5. De préférence, le promoteur est PMA1. Cette souche est désignée ci-après "Alice". Dans un autre mode de réalisation, les levures Alice de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 20 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% de la structure Ga12GlcNac2Man3GlcNAc2 : Gal (31,4-G1cNAc 131,2 Man a1,6 Man (31,4-G1cNAc (31,4-G1cNAc[31-Asn 30 Man a1,3 Gal (31,4-G1cNAc 131,2 35 Dans ce cas, les levures Alice mentionnées ci-dessus comprennent une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression 9 comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, de préférence le promoteur CaMV, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une galactosyl transférase I, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. De préférence, la galactosyl transférase I est humaine, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 6, qui est dépourvue de la séquence de ciblage humaine. Cette souche est désignée Athena. Avantageusement, l'intégration des cassettes d'expression précitées est effectuée dans un marqueur d'auxotrophie sélectionné parmi URA3, ADE1, ADE2, LEU2, LYS2, CYH1, TRP1, ARG3, HIS5, GLU1, MET6, CAN1, CARI et LEMS. De manière encore plus avantageuse, la cassette d'expression de la a-1-2 mannosidase I est intégrée dans le gène URA3, la cassette d'expression de la N-acétyl-glucosaminyl transférase I est intégrée dans le gène ADE1 ou ADE2, la cassette d'expression du transporteur d'UDPG1cNAc est intégrée dans le gène LYS2, la cassette d'expression de l'a-mannosidase II est intégrée dans le gène LEU2, et la cassette d'expression de la N-acetyl-glucosaminyl transférase II est intégrée dans le gène CYH1 ou TRP1. La cassette d'expression de 1'131,4 galactosyltransférase I est intégrée dans GLUI ou MET6. De plus, on utilse de préférence dans les constructions une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi dérivée de la séquence de localisation du gène Mntl qui comprend la séquence SEQ ID No 14 et le terminateur CYC1 comprenant la SEQ ID No 15. Dans un autre mode de réalisation, les levures Alice et Athena, décrites ci-dessus de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% d'une structure choisie parmi G1cNac2Man3GlcNAc2, Ga12GlcNac2Man3GlcNAc2, et G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2, souche Ashley Ga12GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2, Souche Aurel Dans ce cas, les levures mentionnées ci-dessus comprennent une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement ou le promoteur du gène Mntl, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-1,6-fucosyltransférase FUT8, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription, en particulier le terminateur dérivé du gène CYC1. Ces souches peuvent avantageusement contenir la cassette correspondant au transporteur de GDP-fucose décrite plus bas. De préférence, la a-1,6-fucosyltransférase FUT8 est humaine, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 7. En outre, cette souche, doit comprendre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant le promoteur SV40, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour un transporteur de GDP-fucose, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 8. Cette cassette peut être intégré dans TRP1 ou ARG3. Dans un autre mode de réalisation, les levures Ga12GlcNac2Man3GlcNAc2 (Athena) et Gal2GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 (Aurel) décrites ci-dessus de l'invention comportent des modifications supplémentaires en vue de produire des glycoprotéines présentant plus de 75%, voir 80% ou encore 95% ou 98% d'une structure choisie parmi NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 souche Aeron NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 souche Avrel NANA Gal (31,4-G1cNAc 131,2 ù Man al,6 Man (31,4-G1cNAc 131,4- GlcNAc(3l-Asn NANA Gal (31,4-G1cNAc 131,2 Man al,3 10 Dans ce mode de réalisation, les levures mentionnées ci-dessus comprennent une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur parmi ceux cités ci-dessus ou le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'herpès comprenant la séquence SEQ ID 15 No 9. Une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-2,3 sialyltransférase (gène ST3GAL4) et un terminateur de la transcription, en particulier le terminateur dérivé du gène CYC1 comprenant la séquence SEQ ID No 15. De 20 préférence, la sialyltransférase est humaine (NM 006278), notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 10. Comme indiqué ci-dessus, les levures selon l'invention ont intégrées une cassette pour exprimer une glycprotéine ou un glycopeptide exogène. La glycoprotéine peut être 25 choisie parmi les glycoprotéines à usage thérapeutique telles que des cytokines, des interleukines, des hormones de croissance, facteurs de croissance, des enzymes, et des anticorps monoclonaux, protéines vaccinales, récepteurs solubles et tous types de protéines recombinantes. Il peut s'agir d'une séquence codant pour l'EPO, notamment une cassette comprenant la SEQ ID No 11 codant pour une EPO ayant la SEQ ID No 12 30 comprenant l'épitope V5 et un motif poly-HIS en N-terminal pour purification. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 75%, 90%, 95% ou encore 98% de la structure : 35 Man5GlcNAc2, G1cNacMan5GlcNAc2, G1cNacMan3 G1cNAc2, G1cNac2Man3GlcNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 5 G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 Ga12GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 10 L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant de l'EPO à titre de principe actif, ledit EPO présentant plus de 75%, 90%, 95% ou encore 98% de la structure NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 ou NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 15 L'invention se rapporte également à une culture en fermenteur comprenant un milieu de culture de base des milieux de culture pour levures et une levure décrite ci-dessus. Dans encore un autre aspect, l'invention porte sur un procédé de production d'une 20 glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 75%, 90%, 95% ou encore 98%, de la structure : ManS G1cNAc2, G1cNacManS G1cNAc2, G1cNacMan3 G1cNAc2, 25 GlcNac2Man3GlcNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 G1cNac2Man3(Fuc) G1cNAc2 Ga12GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 30 NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 13 comprenant la mise en culture d'une levure décrite dessus dans un fermenteur, et l'extraction de ladite glycoprotéine du milieu de culture. Ce procédé peut comprendre en outre une étape de purification. Enfin, l'invention porte également sur l'utilisation d'une levure décrite ci-dessus pour la production en fermenteur d'une glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 75%, 90%, 95% ou encore 98% de la structure : Man5 G1cNAc2, G1cNacManS G1cNAc2, Io GlcNacMan3GlcNAc2, G1cNac2Man3 G1cNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 15 Ga12GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 Exemple 1 : Création des souches mutées sur le gène Ochl codant pour l'a-1,6 mannosyl transférase (souche delta-Ochl). Le gène de résistance de la kanamycine a été amplifié par PCR et des régions flanquantes homologues au gène Ochl ont été ajoutées en ces deux extrémités (Figurel), régions spécifiques de chaque souche de levure S.cerevisae ou S.pombe. Le gène Ochl est rendu non-fonctionnel par l'insertion de ce gène de résistance à un antibiotique, la Kanamycine. L'intégration du gène dans le génome de la levure se fait par électroporation et le gène d'intérêt s'intègre ensuite par recombinaison homologue. Les régions flanquantes font une quarantaine de bases et permettent l'intégration du gène de la kanamycine au sein du gène Ochl dans le génome de la levure. Les souches ayant intégrées le gène de résistance à la kanamycine sont sélectionnées sur un milieu contenant 50 g/ml de kanamycine. Nous avons ensuite vérifié par PCR l'intégration du gène de résistance à la kanamycine dans le gène Ochl. L'ADN génomique des clones ayant résistés à la présence de kanamycine dans le milieu, a été extrait. Des oligonucléotides ont été choisis de façon à vérifier d'une part la présence du gène de résistance à la kanamycine et d'autre part que ce gène a bien été intégré dans le gène Ochl. L'ADN génomique des souches sauvages a également été testé, nous avons amplifié le gène Ochl de ces souches. Ce gène fait 1100pb. Chez les souches ayant intégrées la cassette kanamycine, l'amplification observée du gène Ochl est plus longue (1500pb). Exemple 2: Tests d'activités 2.1 Activité mannosyltransférase ochl sur les souches de levures mutées Autre niveau de validation : pour chaque gène intégré au génome des souches de levure, un control systématique d'activité enzymatique est réalisé, afin de suivre constamment les fluctuations éventuelles des niveaux d'activité, dû la plupart du temps à des mutations spontanées, et nécessitant alors la sélection de nouveaux clones. L'activité de l'enzyme Ochl peut être mise en évidence par un dosage in vitro. Des études antérieures ont montré que le meilleur accepteur pour le transfert d'un mannose par l'enzyme Ochl est le Man8GlcNAc2. A partir des fractions microsomales des levures (100 g de protéines) ou d'un lysat de protéines totales (200 g), on mesure l'activité de transfert d'un mannose en position alpha-1,6 sur une structure Man8GlcNAc2. Pour cela, le Man8GlcNAc2 couplé à un groupement d'amino-pyridine (M8GN2-AP) est utilisé comme accepteur et le GDP-mannose marqué au [14C]-mannose comme molécule donneuse de mannose radioactif. Les microsomes ou les protéines sont incubés avec le donneur (GDP-mannose radioactif), l'accepteur (Man8GlcNAc2-AP) et du déoxymannojirimycine (inhibiteur de la mannosidase I) dans un milieu tamponné au pH contrôlé. Après 30 minutes d'incubation à 30 C, du chloroforme et du méthanol sont ajoutés au milieu réactionnel afin d'obtenir une proportion de CHC13-MeOH-H2O de 3 :2 :1 (v/v/v). La phase supérieure correspondant à la phase aqueuse, contient le Man8GlcNAc2-AP, le Man9GlcNAc2-AP radioactif et le GDP-[14C]-mannose. Une fois séchés, les échantillons sont repris dans 100 l d'H2O-1% acide acétique et passés sur une colonne de Sep-Pak C18 (waters), conditionnée au préalable, afin de séparer le GDP-mannose du Man9GlcNAc2-AP radioactif formé (le groupement AP permet de retenir ce composé sur les colonne deC18). L'élution par l'H2O-1% acide acétique (20 mL) puis par 20% méthanol-1% acide acétique (4 mL) permet de récupérer les différentes fractions et de les compter au compteur à scintillation. 2.2 Activité mannosidase L'activité mannosidase est mesurée en incubant 4 heures à 37 C 4 mM de p- nitrophenyl-a-D-mannopyranoside avec 100-200 g de protéines (provenant de protéines totales ou fractions subcellulaires) dans 0.1 M de PBS pH 6.5 +/- 120 M DMJ (inhibiteur alpha-1,2-mannosidase I) +/- 12 M SW (inhibiteur spécifique de la mannosidase II). L'absorbance est mesurée à 405 nm. 2.3 Activité N-acétylglucosaminyl transférase L'activité GlcNAcTransférase est mesurée sur des fractions microsomales de levures. 50 g de microsomes (dosage BCA) sont incubés dans 50 L final 25 minutes à 30 C avec 0.01 Ci de donneur (UDP-G1cNAc radioactif), 0.5 mM d'accepteur (3-O-a-D-mannopyranosyl-D-mannopyranoside) dans un milieu 50 mM HEPES, 10 mM MnC12, 0.1% TritonX-100. La réaction est arrêtée par 400 L de 10 mM EDTA puis les échantillons sont passés sur des colonnes de Dowex AG-1X2. L'accepteur radioactif est ensuite élué des colonnes par de l'acide formique 3M et la radioactivité mesurée au compteur à scintillation. Exemple 3 : Cassette d'expression pour l'a-1-2 mannosidase I de C. elegans Schéma explicatif pour la construction des cassettes d'expression : figure 2 10 3.1 Etape 1 : obtention de l'ORF a-mannosidase I : PCR à partir de clones bactériens possédant le plasmide pDONR201 (Open Biosystem) Programme : 15 8 minutes à 94 C 35 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 65 C 2 min à 72 C 10 minutes à 72 C 20 Amplification d'un fragment à 1644 pb AAAGCAGGCatg cctccgatcacacgaacaacttgtcgtgtgtgtcggagttatgtttcttctgactgtctgcatca cagcgttt ttctttcttccgtcaggcggcgctgatctgtatttccgagaagaaaactccgttcacgttagagatgtgcttat cagagaggaaatt 25 cgtcgtaaagagcaagatgagttacggcggaaagccgaagaagccaatcccattccaattccaaaacctgaaat tggagcat cagatgatgcagaaggacgaagaattttcgtgaaacaaatgattaaattcgcatgggacggatatcggaaatat gcctggggg gagaatgaattgaggcccaacagtagatcaggacattcttcatcgatatttgggtatggaaagacgggtgcaac aattattgatg ctattgatacattgtatttggttggattaaaagaagaatataaagaggccagagactggattgctgattttgat ttcaaaacgtctgc gaaaggagatctatcagtttttgaaacaaatatccgattcactggtggcctactctccgcatttgcacttaccg gagacaaaatgtt 30 cttgaagaaagcagaagatgtggcaactattcttcttccggcttttgaaactccttctggaataccaaattcat taattgatgctcaa acaggaagatccaaaacgtatagttgggcaagcggaaaggcaattctctcggaatacggttcaattcaacttga attcgattatc tctccaatctgactggaaatccagtttttgctcaaaaagctgataaaataagagatgttttaactgcaatggag aaaccagaagg actttatccaatttatattactatggataatccaccaagatggggacaacatcttttctcaatgggtgcaatgg ctgacagttggtat gaatatctgctcaaacaatggattgccactggtaaaaaagatgatcgcacgaaaagagaatacgaagaagcgat atttgcaat ggaaaaacgaatgcttttcaaatcggaacagtcgaatctttggtatttcgcaaaaatgaacggaaatcgcatgg aacattcatttg aacatcttgcatgcttttccggtggaatggttgttcttcatgcaatgaatgagaaaaataaaacaatatcagat cattatatgacgtt gggaaaagaaattggtcatacatgtcatgaatcgtacgctagatccacaactggaatcggcccagaatccttcc aattcacatc gagtgtagaggcaaaaacagaacgtcgtcaggattcatattatattcttcgtcctgaagtcgttgagacatggt tctacttgtgga gggctacaaaagacgagaaatatcgacaatgggcttgggatcatgttcaaaatttggaggagtattgtaagggc actgccgga tactctggaatccgaaacgtctacgaatcgagcccggaacaagatgatgtgcagcagtcattcctcttcgctga gctcttcaaat atctgtatttaattttcagtgaagataacattcttccacttgatcaatgggttttcaataccgaagctcatcca ttccgcattcggcat cacgacgagttgatt (SEQ ID No 1) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit QBIOgene et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (plasmide pGLY02.001). 3.2 Etape 2 : assemblage de la cassette d'expression : L'intégration de la cassette d'expression de la mannosidase I va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie URA3 pour les deux souches. L'invalidation de ce gène induit une résistance à un agent toxique, le 5-fluorouracil. Les levures modifiées par cette cassette deviendront donc résistantes à cette drogue mais également auxotrophe pour l'uracile. Cassette d'expression pour S.cerevisiae : - Amplification du promoteur pGAP à partir d'ADN génomique de S.cerevisiae sauvage BS16 (forward) et BS17' (reverse) - Assemblage du promoteur pGAP (produit de PCR) et de l'ORF (pGLY02.001) BS16 (forward) et BS19' (reverse) - Amplification du terminateur CYC1 à partir du plasmide pYES 2.1 BS40b (forward) et BS41 (reverse) - Assemblage de l'ORF (plasmide pGLY02.001) et du terminateur CYC1 (produit de PCR) BS18 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY02.002). - assemblage promoteur-ORF (produit de PCR) et ORF-terminateur (pGLY02.002) 15 avec les régions homologues à URA3 (provenant des amorces) BS42 (forward) BS43 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont 20 été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY02.004). Cassette d'expression pour S.pombe - Amplification du promoteur adhl à partir d'ADN génomique de S.pombe sauvage 25 BS25 et BS26' (reverse) -Assemblage du promoteur adhl (produit de PCR) et de l'ORF (pGLY02.001) BS25 (forward) et BS20 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) 30 ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY02.009). -Assemblage du produit promoteur-ORF (pGLY02.009) avec ORE-CYC1 (produit PCR) BS25 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY02.011). -Amplification de la cassette (pGLY02.011) avec les régions flanquantes homologues à 10 URA3 BS76 (forward) et BS77 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion 15 de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage. 3.3 Etape 3 : transformation des levures -Préparation des levures compétentes : 20 S.cerevisiae Adèle : Protocole : Ensemencer 500 mL de levures à DO=0,1 et les incuber à 30 C jusqu'à 5.5 30 S.pombe Edgar: Protocole : Ensemencer 200 mL de levures à DO=0,5 et les incuber à 30 C jusqu'à DO=1.5. Centrifuger à 3000 rpm pendant 5 min à 20 C. Laver les cellules dans de l'eau froide stérile et centrifuger, laver une seconde fois avec du sorbitol 1 M. Incuber 15 min en ajoutant du DTT pour arriver à 25 mM final (pour augmenter l'électrocompétence). Reprendre en suspension finale dans du sorbitol 1 M froid (densité 1 à 5.109 cells/mL: env. 5 mL). Aliquoter en 40 L et stocker env 10 fioles à -80 C. -Transformation des levures par électroporation : Pour chaque cassette d'expression, l'ADN utilisé pour transformer les levures provient soit d'une digestion du plasmide mentionné avec des enzymes de restriction sélectionnées, soit directement du produit PCR obtenu et purifié après l'assemblage complet. Cassette S.cerevisiae : pGLY02.004 est digéré par les enzymes de restriction BamHI et 15 Smal. Les levures compétentes sont transformées avec 1 g d'ADN: incuber 5 min dans la glace. Donner un pulse à v=1500 V. Ajouter immédiatement 1 mL de sorbitol 1M stéril glacé et transférer les cellules avec une pipette pasteur dans un tube eppendorf puis laisser relaxer au moins 1 heure dans l'infors à 30 C. Étaler les levures sur une boite de 20 milieux de sélection (YPD contenant 10 mM 5-fluorouracile, 5-FU). Les transformants apparaissent dans les 4 à 6 jours. Cassette S.pombe : les levures compétentes sont transformées avec 100 ng d'ADN (produit de PCR): incuber 5 min dans la glace. Les cellules et l'ADN sont transférées 25 dans une cuve à électroporation. Donner un pulse à V=1500V et ajouter immédiatement 0.9 mL de 1M sorbitol froid. Les cellules sont étalées aussi rapidement que possible sur le milieu approprié (YPD contenant 10 mM 5-FU). Les transformants apparaissent dans les 4 à 6 jours. 30 Exemple 4: Souches Amélie et Emma + Cassette d'expression pour la N-acétvl-2lucosaminvl transférase I humaine .1 Etape 1: Obtention de 1'ORF PCR à partir d'un plasmide commercial Biovalley (Human ORF clone V1.1) Programme : 5 minutes à 94 C 30 cycles : 60 sec à 94 C 60 sec à 56 C 2minà72 C 5 minutes à 72 C Amplification d'un fragment 1327 pb sans la partie cytoplasmique de l'enzyme : elle sera remplacée par la partie cytoplasmique de Mnn9 pour une localisation golgienne de la protéine. Région cytoplasmique de Mnn9 : PCR à partir d'ADN génomique de S. cerevisiae sauvage 8 minutes à 95 C 30 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 1 min à 72 C 20 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 51 pb (partie cytoplasmique de mmn9) Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac (SEQ ID No 13) A partir de ces deux amplifications de PCR : 25 Obtention d'un seul fragment : Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacgcagggcttgtgctgtggggcgc tatcctcttt gtggcctggaatgccctgctgctcctcttcttctggacgcgcccagcacctggcaggccaccctcagtcagcgc tctcgatgg cgaccccgccagcctcacccgggaagtgattcgcctggcccaagacgccgaggtggagctggagcggcagcgtg ggctg ctgcagcagatcggggatgccctgtcgagccagcgggggagggtgcccaccgcggcccctcccgcccagccgcg tgtgc 30 ctgtgacccccgcgccggcggtgattcccatcctggtcatcgcctgtgaccgcagcactgttcggcgctgcctg gacaagctg ctgcattatcggccctcggctgagctcttccccatcatcgttagccaggactgcgggcacgaggagacggccca ggccatcg cctcctacggcagcgcggtcacgcacatccggcagcccgacctgagcagcattgcggtgccgccggaccaccgc aagttc 22 cagggctactacaagatcgcgcgccactaccgctgggcgctgggccaggtcttccggcagtttcgcttccccgc ggccgtgg tggtggaggatgacctggaggtggccccggacttcttcgagtactttcgggccacctatccgctgctgaaggcc gacccctcc ctgtggtgcgtctcggcctggaatgacaacggcaaggagcagatggtggacgccagcaggcctgagctgctcta ccgcacc gactttttccctggcctgggctggctgctgttggccgagctctgggctgagctggagcccaagtggccaaaggc cttctggga cgactggatgcggcggccggagcagcggcaggggcgggcctgcatacgccctgagatctcaagaacgatgacct ttggcc gcaagggtgtgagccacgggcagttctttgaccagcacctcaagtttatcaagctgaaccagcagtttgtgcac ttcacccagc tggacctgtcttacctgcagcgggaggcctatgaccgagatttcctcgcccgcgtctacggtgctccccagctg caggtggag aaagtgaggaccaatgaccggaaggagctgggggaggtgcgggtgcagtatacgggcagggacagcttcaaggc tttcgc caaggctctgggtgtcatggatgaccttaagtcgggggttccgagagctggctaccggggtattgtcaccttcc agttccggg gccgccgtgtccacctggcgcccccactgacgtgggagggctatgatcctagctggaattagcacctgcctgtc cttc (SEQ ID No 2) Le produit d'amplification de la PCR d'assemblage a été purifié du gel d'agarose par le kit QIAGEN et a été introduit dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.001). 4.2 Etape 2 : assemblage de la cassette d'expression Cassette d'expression pour S.cerevisiae L'intégration de la cassette d'expression de la G1cNAc transférase I pour la levure S.cerevisiae va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie ADE2. L'invalidation de ce gène induit un changement de couleur des levures qui deviennent rouges et également une auxotrophie pour l'adénine. -Amplification du promoteur adhl à partir d'ADN génomique de S.cerevisiae BS29 (forward) et BS30 (reverse) -Assemblage du promoteur adhl (produit de PCR) et de l'ORF (pGLY03.001): BS29 (forward) et BS59 L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.002). -Assemblage de l'ORF (pGLY03.001) avec le terminateur CYC1 (produit de PCR) : CA005 (forward) BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.011). -Assemblage du promoteur-ORF( pGLY03.002) et de l'ORF-terminateur (produit de PCR) avec les extensions homologues à ADE2 : BS67 (forward) et BS68 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.010). Cassette d'expression pour S.pombe L'intégration de la cassette d'expression de la G1cNAc transférase I pour la levure S.pombe va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie ADE1. L'invalidation de ce gène induit un changement de couleur des levures qui deviennent rouges et également une auxotrophie pour l'adénine. -Amplification du promoteur hCMV à partir du plasmide pCDNA 3.1 BS62 (forward) et BS58 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont 20 été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.004). - Assemblage hCMV-ORF (pGLY03.004) avec le terminateur CYC1 (produit de PCR) 5 BS62 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.005). 10 - Assemblage de la cassette d'expression (pGLY03.005) avec les extensions homologues à ADE1 : BS69 (forward) et BS70 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été 15 introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY03.007). 4.3 Etape 3 : Transformation des levures - Préparation de levures compétentes : Les souches Amélie et Emma ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. 25 - Electroporation des levures S.cerevisiae et S.pombe Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe ont été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Amélie et Emma par électroporation. Les levures sont sélectionnées sur 30 un milieu YNB contenant les acides aminés nécessaires. Exemple 5 : souches Agathe et Egée Cassette d'expression pour le transporteur d'UDP-GlcNAc 5.1 Etape 1 : Obtention de l'ORF PCR à partir de cDNA de pancréas humain Programme : 3 minutes à 94 C 30 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 2minà72 C 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 916 pb atgttcgccaacctaaaatacgtttccctgggaattttggtctttcagactaccagtttggttctaacaatgcg ttattccagaact ttaaaagaagaaggacctcgttatctatcttctacagcagtggttgttgctgaacttttgaagataatggcctg cattttattggtcta caaagacagcaaatgtagtctaagagcactgaatcgagtactacatgatgaaattcttaataaacctatggaaa cacttaaactt gctattccatcagggatctatactcttcagaataatttactgtatgtggcactatcaaatctagatgcagctac ttatcaggtcacgt atcagttgaaaattcttacaacagcattattttctgtgtctatgcttagtaaaaaattgggtgtataccagtgg ctgtccctagtaattt tgatgacaggagttgcttttgtacagtggccctcagattctcagcttgattctaaggaactttcagctggttct caatttgtaggact catggcagttctcacagcatgtttttcaagtggctttgctggggtttactttgagaaaatcttaaaagaaacaa aacaatcagtgtg gataagaaatattcagcttggtttctttggaagtatatttggattaatgggtgtatacatttatgatggagaac tggtatcaaagaatg gattttttcagggatataaccgactgacctggatagtagttgttcttcaggcacttggaggccttgtaatagct gctgttattaagtat gcagataatattttaaaaggatttgcaacctctttatcgataatattatcaacattgatctcctatttttggct tcaagattttgtgccaa ccagtgtctttttccttg agccatccttgtaa (SEO ID No 3) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit QIAGEN et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY04.001). 5.2 Etape 2 : Assemblage de la cassette d'expression : Cassette pour S.cerevisiae et pour S.pombe : L'intégration de la cassette d'expression du transporteur d'UDP-GlcNAc va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie LYS2 pour les deux souches S.cerevisiae et S.pombe. L'invalidation de ce gène induit une résistance à un agent toxique, l'acide alpha-aminoadipique. Les levures modifiées par cette cassette deviendront donc résistantes à cette drogue mais également auxotrophe pour la lysine. -Amplification du promoteur PGK à partir du plasmide pFL61 BS95 (forward) et BS96 (reverse) - Assemblage ORF (pGLY04.001) avec le terminateur CYC1 (produit PCR) CA017 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit QIAGEN et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGlyO4.002). - Assemblage du promoteur PGK (produit de PCR) avec le fragment ORF-terminateur 20 CYC1 (pGLY04.002): BS95 (forward) et BS41 (reverse) -Assemblage de la cassette d'expression avec les extensions homologues à LYS2 S.Cerevisiae : BS97 (forward) et BS98 (reverse) 25 S.Pombe BS99 (forward) BS100 (reverse) Les amplifications PCR ont été extraites et purifiées du gel d'agarose par le kit Qiagen et ont été introduites dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, 30 promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGlyO4.006 pour la cassette S.cerevisiae et pGlyO4.005 pour la cassette S.pombe). .3 Etape 3 : Modification des levures - Préparation de levures compétentes : 5 Les souches Agathe et Egée ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. - Electroporation des levures : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae, S.pombe ont 10 été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Agathe et Egée par électroporation. Les levures sont sélectionnées sur un milieu YNB contenant les acides aminés nécessaires et de l'acide alpha-aminoadipique. Exemple 6: souches Arielle et Erika + Cassette d'expression pour l'a-mannosidase 15 II 6.1 Etape 1 : obtention de l'ORF PCR à partir de cDNA de foie de souris 20 Programme : 3 minutes à 94 C 35 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 4minà72 C 25 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 3453 pb at2aa2ttaa2tc2cca2ttcaccgtgtttggcagcgcgatcttctgcgtcgtaatcttctcactctacctgat gctggacagg ggtcacttggactaccctcggggcccgcgccaggagggctcctttccgcagggccagctttcaatattgcaaga aaagattga 30 ccatttggagcgtttgctcgctgagaacaacgagatcatctcaaatatcagagactcagtcatcaacctgagcg agtctgtgga ggacggcccgcgggggtcaccaggcaacgccagccaaggctccatccacctccactcgccacagttggccctgc aggctg 28 accccagagactgtttgtttgcttcacagagtgggagtcagccccgggatgtgcagatgttggatgtttacgat ctgattccttttg ataatccagatggtggagtttggaagcaaggatttgacattaagtatgaagcggatgagtgggaccatgagccc ctgcaagtg tttgtggtgcctcactcccataatgacccaggttggttgaagactttcaatgactactttagagacaagactca gtatatttttaataa catggtcctaaagctgaaagaagactcaagcaggaagtttatgtggtctgagatctcttaccttgcaaaatggt gggatattatag atattccgaagaaggaagctgttaaaagtttactacagaatggtcagctggaaattgtgaccggtggctgggtt atgcctgatga agccactccacattattttgccttaattgaccaactaattgaagggcaccaatggctggaaaaaaatctaggag tgaaacctcga tcgggctgggccatagatccctttggtcattcacccacaatggcttatcttctaaagcgtgctggattttcaca catgctcatccag agagtccattatgcaatcaaaaaacacttctctttgcataaaacgctggagtttttctggagacagaattggga tcttggatctgct acagacattttgtgccatatgatgcccttctacagctacgacatccctcacacctgtgggcctgatcctaaaat atgctgccagttt gattttaaacggcttcctggaggcagatatggttgtccctggggagttcccccagaagcaatatctcctggaaa tgtccaaagc agggctcagatgctattggatcagtaccggaaaaagtcaaaacttttccgcactaaagttctgctggctccact gggagacgac tttcggttcagtgaatacacagagtgggatctgcagtgcaggaactacgagcaactgttcagttacatgaactc gcagcctcatc tgaaagtgaagatccagtttggaaccttgtcagattatttcgacgcattggagaaagcggtggcagccgagaag aagagtagc cagtctgtgttccctgccctgagtggagacttcttcacgtacgctgacagagacgaccattactggagtggcta cttcacgtcca gacctttctacaaacgaatggacagaataatggaatctcgtataagggctgctgaaattctttaccagttggcc ttgaaacaagct cagaaatacaagataaataaatttctttcatcacctcattacacaacactgacagaagccagaaggaacttagg actatttcagc atcatgatgccatcacaggaaccgcgaaagactgggtggttgtggactatggtaccagactctttcagtcatta aattctttggag aagataattggagattctgcatttcttctcattttaaaggacaaaaagctgtaccagtcagatccttccaaagc cttcttagagatg gatacgaagcaaagttcacaagattctctgccccaaaaaattataatacaactgagcgcacaggagccaaggta ccttgtggtc tacaatccctttgaacaagaacggcattcagtggtgtccatccgggtaaactccgccacagggaaagtgctgtc tgattcggga aaaccggtggaggttcaagtcagtgcagtttggaacgacatgaggacaatttcacaagcagcctatgaggtttc ttttctagctc atataccaccactgggactgaaagtgtttaagatcttagagtcacaaagttcaagctcacacttggctgattat gtcctatataata atgatggactagcagaaaatggaatattccacgtgaagaacatggtggatgctggagatgccataacaatagag aatcccttc ctggcgatttggtttgaccgatctgggctgatggagaaagtgagaaggaaagaagacagtagacagcatgaact gaaggtcc agttcctgtggtacggaaccaccaacaaaagggacaagagcggtgcctacctcttcctgcctgacgggcagggc cagccat atgtttccctaagaccgccctttgtcagagtgacacgtggaaggatctactcagatgtgacctgtttcctcgaa cacgttactcac aaagtccgcctgtacaacattcagggaatagaaggtcagtccatggaagtttctaatattgtaaacatcaggaa tgtgcataacc gtgagattgtaatgagaatttcatctaaaataaacaaccaaaatagatattatactgacctaaatggatatcag attcagcctagaa ggaccatgagcaaattgcctcttcaagccaacgtttacccgatgtgcacaatggcgtatatccaggatgctgag caccggctca cgctgctctctgctcagtctctaggtgcttccagcatggcttctggtcagattgaagtcttcatggatcgaagg ctcatgcaggat gataaccgtggccttgggcaaggcgtccatgacaataagattacagctaatttgtttcgaatcctcctcgagaa gagaagcgct gtgaacatggaagaagaaaagaagagccctgtcagctacccttccctcctcagccacatgacttcgtccttcct caaccatccc tttctccccatggtactaagtggccagctcccctcccctgcctttgagctgctgagtgaatttcctctgctgca gtcctctctacctt gtgatatccatctggtcaacctgcggacaatacaatcaaagatgggcaaaggctattcggatgaggcagccttg atcctccaca ggaaagggtttgattgccagttctccagcagaggcatcgggctaccctgttccactactcagggaaagatgtca gttctgaaac ttttcaacaagtttgctgtggagagtctcgtcccttcctctctgtccttgatgcactcccctccagatgcccag aacatgagtgaag tcagcctgagccccatggagatcagcacgttccgtatccgcttgcgttggacctga (SEQ ID No 4) L'amplification de cet ORF a été obtenu par une PCR nichée (3453 pb) sur d'ADNc de foie de souris puis purifiée par la méthode phénol/chloroforme. Le produit PCR a été introduit dans un vecteur TOPO-XL. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY05.001). 6.2 Etape 2 : assemblage de la cassette d'expression 15 Cassette S. cerevisiae et S. pombe: L'intégration de la cassette d'expression de la mannosidase II va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie LEU2 pour les deux souches. L'invalidation de ce gène induit une résistance à un agent toxique, la trifluoroleucine. Les levures modifiées par cette 20 cassette deviendront donc résistantes à cette drogue mais également auxotrophe pour la leucine. -Amplification du promoteur TEF à partir d'ADN génomique de S.cerevisiae : BS83 (forward) et BS84 (reverse) 25 -assemblage promoteur TEF (produit de PCR) avec l'ORF (produit de PCR) et le terminateur (produit de PCR) Pour S.cerevisiae marqueur LEU2 BS111 (forward) et BS112 (reverse) Pour S.pombe marqueur LEU2 30 BS113 (forward) et BS114 (reverse) Les amplifications PCR ont été extraites et purifiées du gel d'agarose par le kit Qiagen et ont été introduites dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, 20 promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGlyO5.008 pour la cassette S.cerevisiae, pGlyO5.009 pour la cassette S.pombe). 6.3 Etape 3 : modification des levures - Préparation de levures compétentes : Les souches Arielle et Erika ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. -Electroporation des levures Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe ont été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Arielle et Erika par électroporation. Les levures sont sélectionnées sur un milieu YNB contenant les acides aminés nécessaires ainsi que de la tri-fluoroleucine (TFL) pour S.cerevisiae et S.pombe. Exemple 7 : souches Anaïs et Enrique - Cassette d'expression de la N-acetvl-2lucosaminvl transférase II 6.1 Etape 1 : obtention de l'ORF : Double PCR à partir de cDNA humain de rate ù Utilisation de la Taq expand (Roche) Programme : 25 2 minutes à 94 C 35 cycles : 45 sec à 94 C 45 sec à 58 C 1.30 min à 68 C 5 minutes à 68 C 30 Amplification d'un fragment de 1344 pb atgaggttccgcatctacaaacggaaggtgctaatcctgacgctcgtggtggccgcctgcggcttcgtcctctg gagcagca atgggcgacaaaggaagaacgaggccctcgccccaccgttgctggacgccgaacccgcgcggggtgccggcggc cgcg gtggggaccacccctctgtggctgtgggcatccgcagggtctccaacgtgtcggcggcttccctggtcccggcg gtccccca gcccgaggcggacaacctgacgctgcggtaccggtccctggtgtaccagctgaactttgatcagaccctgagga atgtagat aaggctggcacctgggccccccgggagctggtgctggtggtccaggtgcataaccggcccgaatacctcagact gctgctg gactcacttcgaaaagcccagggaattgacaacgtcctcgtcatctttagccatgacttctggtcgaccgagat caatcagctga tcgccggggtgaatttctgtccggttctgcaggtgttctttcctttcagcattcagttgtaccctaacgagttt ccaggtagtgaccctagagattgtcccagagacctgccgaagaatgccgctttgaaattggggtgcatcaatgctgagtatcccgact ccttcggcca ttatagagaggccaaattctcccagaccaaacatcactggtggtggaagctgcattttgtgtgggaaagagtga aaattcttcga gattatgctggccttatacttttcctagaagaggatcactacttagccccagacttttaccatgtcttcaaaaa gatgtggaaactg aagcagcaagagtgccctgaatgtgatgttctctccctggggacctatagtgccagtcgcagtttctatggcat ggctgacaag gtagatgtgaaaacttggaaatccacagagcacaatatgggtctagccttgacccggaatgcctatcagaagct gatcgagtg cacagacactttctgtacttatgatgattataactgggactggactcttcaatacttgactgtatcttgtcttc caaaattctggaaag tgctggttcctcaaattcctaggatctttcatgctggagactgtggtatgcatcacaagaaaacctgtagacca tccactcagagt gcccaaattgagtcactcttaaataataacaaacaatacatgtttccagaaactctaactatcagtgaaaagtt tactgtggtagccatttccccacctagaaaaaatggagggtggggagatattagggaccatgaactctgtaaaagttatagaagact gcagtga (SEQ ID No 5) L'amplification PCR a été purifiée par la méthode phénol/chloroforme et introduite dans le vecteur pTarget (Promega) Des bactéries compétentes (JM109, Promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY08.002). Région cytoplasmique de mmn9 : PCR à partir d'ADN génomique de S. cerevisiae sauvage 8 minutes à 95 C cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 1 min à 72 C 30 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 51 pb (partie cytoplasmique de mmn9) + homologie à GNTII Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacaggttccgcatctac 7.2 Etape 2 : assemblage des cassettes d'expression pour les souches S.cerevisiae et S. pombe. L'intégration de la cassette d'expression de la G1cNAc-transféraseII va être localisée dans le marqueur CYH1 pour S.cerevisiae et TRP1 pou S.pombe. L'invalidation du gène CYH1 induit une résistance à un agent toxique, la cycloheximide. Les levures modifiées par cette cassette deviendront donc résistantes à cette drogue. L'invalidation du gène TRP1 induit une résistance à un agent toxique, l'acide 5-fluoro-anthranilique. Les levures modifiées par cette cassette deviendront donc résistantes à cette drogue mais également auxotrophe pour le tryptophane. - Amplification du promoteur PMA1 CD001 (forward) et CD008 (reverse) -Assemblage de l'ORF (produit PCR) et du terminateur CYC1 (produit PCR) : CD004 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY08.003). - Assemblage Mnn9 (produit de PCR) avec l'ORF-terminateur CYC1 (pGLY08.003) CA005 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY08.004). -Assemblage du promoteur PMA1 (produit de PCR) et de Mnn9-ORF-terminateur (pGLY08.004) CD001 (forward)et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY08.005). - Assemblage du promoteur PMAl (produit de PCR) et de Mnn9-ORF-terminateur (pGLY08.004) avec les extrémités homologues au marqueur TRP1 pour S.pombe : CD009 (forward) CD010 (reverse) l0 L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY08.006). 15 -Assemblage des extrémités homologues au marqueur CYH1 pour S.cerevisiae à partir de pGLY08.005: CD 013 (forward) CDO14 (reverse) 20 7.3 Etape 3 : modification des levures - Préparation de levures compétentes : Les souches Anaïs et Enrique ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. 25 -Electroporation des levures Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe ont été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Anaïs et Enrique par électroporation. Les levures sont ensuite 30 étalées sur un milieu YPD gélosé contenant la drogue de sélection nécessaire. Exemple 8: souches Alice et Elga Cassette d'expression de la galactosyl transférase I 8.1 :Etape 1 : obtention de l'ORF sans la séquence de localisation humaine PCR à partir de cDNA de lymphoblastes humains 2 minutes à 94 C 30 cycles : 45 sec à 94 C 45 sec à 58 C 1.15minà72 C 5 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 1047 pb ccccaactggtcggagtctccacaccgctgcagggcggctcgaacagtgccgccgccatcgggcagtcctccgg ggagc tccggaccggaggggcccggccgccgcctcctctaggcgcctcctcccagccgcgcccgggtggcgactccagc ccagt cgtggattctggccctggccccgctagcaacttgacctcggtcccagtgccccacaccaccgcactgtcgctgc ccgcctgc cctgaggagtccccgctgcttgtgggccccatgctgattgagtttaacatgcctgtggacctggagctcgtggc aaagcagaa cccaaatgtgaagatgggcggccgctatgcccccagggactgcgtctctcctcacaaggtggccatcatcattc cattccgca accggcaggagcacctcaagtactggctatattatttgcacccagtcctgcagcgccagcagctggactatggc atctatgttat caaccaggcgggagacactatattcaatcgtgctaagctcctcaatgttggctttcaagaagccttgaaggact atgactacacc tgctttgtgtttagtgacgtggacctcattccaatgaatgaccataatgcgtacaggtgtttttcacagccacg gcacatttccgttg caatggataagtttggattcagcctaccttatgttcagtattttggaggtgtctctgctctaagtaaacaacag tttctaaccatcaat ggatttcctaataattattggggctggggaggagaagatgatgacatttttaacagattagtttttagaggcat gtctatatctcgcc caaatgctgtggtcgggaggtgtcgcatgatccgccactcaagagacaagaaaaatgaacccaatcctcagagg tttgaccg aattgcacacacaaaggagacaatgctctctgatggtttgaactcactcacctaccaggtgctggatgtacaga gatacccattg tatacccaaatcacagtggacatcgggacaccgagctag (SEQ ID No 6). L'amplification PCR a été purifiée par la méthode phénol/chloroforme et introduite dans le vecteur pTarget (Promega) Des bactéries compétentes (JM109, Promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY11.003). Localisation Mntl : PCR à partir d'ADNg de S.cerevisiae 10 minutes à 94 C 30 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 45sec à 72 C 5 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 246pb - SEQ ID No 14 atggccctctttctcagtaagagactgttgagatttaccgtcattgcaggtgcggttattgttctcctcctaac attgaattccaac agtagaactcagcaatatattccgagttccatctccgctgcatttgattttacctcaggatctatatcccctga acaacaagtcatct ctgaggaaaatgatgctaaaaaattagagcaaagtgctctgaattcagaggcaagcgaagactccgaagcc L'amplification PCR a été purifiée par la méthode phénol/chloroforme et introduite dans le vecteur pTarget (Promega) Des bactéries compétentes (JM109, Promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage. 15 8.2 : Etape 2 : assemblage des cassettes d'expression pour les souches S.cerevisiae et S. pombe. L'intégration de la cassette d'expression de la galactosyl transférase I va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie GLU1 pour la souche S.cerevisiae et Met6 pour la 20 souche S.pombe. Les levures modifiées par ces cassettes deviendront donc auxotrophes pour le glutamate (S.cerevisiae) ou la méthionine (S.pombe). -Amplification du promoteur CaMV à partir du plasmide pMDC : CD035 (forward) 25 CD037 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, Promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY11.001). 30 -Assemblage du promoteur CaMV (pGLY11.001) avec la séquence de localisation Mntl (produit de PCR) : 36 CD035 (forward) et CD028 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, Promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY11.002). - Assemblage du promoteur CaMV-Mntl-homologie ORF (produit PCR) avec l'ORF homologie terminateur CYC1 (produit PCR) CD035 (forward) et CD029 (reverse) Le produit PCR a été introduit dans un vecteur TOPO-XL. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY 11.004). -Assemblage du promoteur CaMV-Mntl-ORF homologie terminateur CYC1 15 (pGLY11.004) avec le terminateur CYC1 (produit PCR) Utilisation de la Taq expand (Roche) CD035(forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (DH5a, Promega) ont été 20 transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY11.005). - Assemblage des cassettes d'intégration : Pour S.cerevisiae, intégration dans la séquence GLU1 25 Utilisation de la Taq expand (Roche) CD044 (forward) et CD045 (reverse) Pour S.pombe, intégration dans la séquence MET6 Utilisation de la Taq expand (Roche) 30 CD038 (forward) et CD039 (reverse) Les produits PCR a été introduit dans un vecteur TOPO-XL. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY11.006 pour S.pombe et pGLY11.007 pour S.cerevisiae). 8.3 Etape 3 : modification des levures - Préparation de levures compétentes : Les souches Alice et Elga ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. - Electroporation des levures Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe ont été digéré par les enzymes de restriction KpnI et Xhol. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Alice et Elga par électroporation. Les levures sont ensuite étalées sur un milieu YPD gélosé contenant la sélection nécessaire. Exemple 9: Souches Anaïs et Enrique Cassette d'expression de l'a-1,6-fucosvltransférase FUT8 : 9.1 Cassette d'expression de FUT8 20 9.1.1 Etape 1 : obtention de l'ORF PCR à partir de cDNA de pancréas et de poumons humains Programme : 3 minutes à 94 C 25 35 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 2minà72 C 10 minutes à 72 C Amplification d'un fragment de 1801 pb 30 caggactccagggaagtgagttgaaaatctgaaaatgcggccatggactggttcctggcgttggattatgctca ttctttttgcc tgggggaccttgctgttttatataggtggtcacttggtacgagataatgaccatcctgatcactctagccgaga actgtccaagat tctggcaaagcttgaacgcttaaaacagcagaatgaagacttgaggcgaatggccgaatctctccggataccag aaggccct attgatcaggggccagctataggaagagtacgcgttttagaagagcagcttgttaaggccaaagaacagattga aaattacaa gaaacagaccagaaatggtctggggaaggatcatgaaatcctgaggaggaggattgaaaatggagctaaagagc tctggttt ttcctacagagtgaattgaagaaattaaagaacttagaaggaaatgaactccaaagacatgcagatgaatttct tttggatttagg acatcatgaaaggtctataatgacggatctatactacctcagtcagacagatggagcaggtgattggcgggaaa aagaggcc aaagatctgacagaactggttcagcggagaataacatatcttcagaatcccaaggactgcagcaaagccaaaaa gctggtgt gtaatatcaacaaaggctgtggctatggctgtcagctccatcatgtggtctactgcttcatgattgcatatggc acccagcgaac actcatcttggaatctcagaattggcgctatgctactggtggatgggagactgtatttaggcctgtaagtgaga catgcacagac agatctggcatctccactggacactggtcaggtgaagtgaaggacaaaaatgttcaagtggtcgagcttcccat tgtagacagt cttcatccccgtcctccatatttacccttggctgtaccagaagacctcgcagatcgacttgtacgagtgcatgg tgaccctgcagt gtggtgggtgtctcagtttgtcaaatacttgatccgcccacagccttggctagaaaaagaaatagaagaagcca ccaagaagc ttggcttcaaacatccagttattggagtccatgtcagacgcacagacaaagtgggaacagaagctgccttccat cccattgaag agtacatggtgcatgttgaagaacattttcagcttcttgcacgcagaatgcaagtggacaaaaaaagagtgtat ttggccacaga tgacccttctttattaaaggaggcaaaaacaaagtaccccaattatgaatttattagtgataactctatttcct ggtcagctggactg cacaatcgatacacagaaaattcacttcgtggagtgatcctggatatacattttctctctcaggcagacttcct agtgtgtactttttc atcccaggtctgtcgagttgcttatgaaattatgcaaacactacatcctgatgcctctgcaaacttccattctt tagatgacatctact attttgggggccagaatgcccacaatcaaattgccatttatgctcaccaaccccgaactgcagatgaaattccc atggaacctg gagatatcattggtgtggctggaaatcattgggatggctattctaaaggtgtcaacaggaaattgggaaggacg ggcctatatc cctcctacaaagttcgagagaagatagaaacggtcaagtaccccacatatcctgaggctgagaaataaagctca gatggaag agataaacgaccaaactcagttcga (SEQ ID No 7) L'amplification PCR (1801 pb à partir d'ADNc de poumon et de pancréas humains) a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit QBIOgene et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage. 9.1.2 Etape 2 : assemblage de la cassette d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe : L'intégration de la cassette d'expression de la FUT8 va être localisée dans le marqueur CAN1 pour la souche S.cerevisiae et dans le marqueur HIS5 pour la souche S.pombe. L'invalidation du gène CAN1 induit une auxotrophie pour la canavanine et l'invalidation du gène HIS5 induit une auxotrophie pour l'histidine. - Amplification du promoteur mntl à partir d'ADN génomique de S.pombe 5 BS86 (forward) et BS87 (reverse) - Assemblage du promoteur mntl (produit de PCR) avec l'ORF (pGLY06.001) BS86 (forward) et BS88 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont 10 été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY06.003). - Assemblage de l'ORF (pGLY06.001) avec le terminateur CYC1 (produit de PCR) CA011 (forward) et BS41 (reverse) 15 L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY06.002). 20 -Assemblage de nmtl-ORF (pGLY06.003) avec ORF-terminateur CYC1 (produit de PCR) BS86 (forward) et BS41 (reverse) - Assemblage des extrémités pour l'intégration dans les marqueurs d'auxotrophie de levures: 25 S.cerevisiae : marqueur CAN1 BS147 (forward) et BS148 (reverse) S. pombe : marqueur HIS5 BS154 (forward) et BS155 (reverse) Les amplifications PCR ont été extraites et purifiées du gel d'agarose par le kit Qiagen 30 et ont été introduites dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR5 et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGlyO6.005 pour la cassette S.cerevisiae, et pGlyO6.005 pour la cassette S.pombe). 9.1.3 Etape 3 : modification des levures -Préparation de levures compétentes : Les souches Anaïs et Enrique ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. 10 -Electroporation des levures Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae, S.pombe et P.pastoris ont été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Anaïs et Enrique par électroporation. Les levures sont étalées en dilution limite sur un milieu YPD gélosé, les marqueurs délétés 15 ne conférents pas de résistance à une drogue. Une fois les clones sortis, des réplicats sur milieu minimum sont établis afin de sélectionner les clones ne pouvant plus pousser sans l'acide aminé nécessaire. 9.2 Cassette d'expression du transporteur de GDP-fucose 20 9.2.1 Obtention de l'ORF : PCR à partir de cDNA de poumons humains Programme : 25 3 minutes à 94 C 35 cycles : 20 sec à 94 C 30 sec à 58 C 2minà72 C 10 minutes à 72 C 30 Amplification d'un fragment de 1136 pb t2accca2ctcctct2ctaccatgaatagggcccctctgaagcggtccaggatcctgcacatggcgctgaccgg ggcctca gacccctctgcagaggcagaggccaacggggagaagccctttctgctgcgggcattgcagatcgcgctggtggt ctccctct actgggtcacctccatctccatggtgttccttaataagtacctgctggacagcccctccctgcggctggacacc cccatcttcgt caccttctaccagtgcctggtgaccacgctgctgtgcaaaggcctcagcgctctggccgcctgctgccctggtg ccgtggact tccccagcttgcgcctggacctcagggtggcccgcagcgtcctgcccctgtcggtggtcttcatcggcatgatc accttcaata acctctgcctcaagtacgtcggtgtggccttctacaatgtgggccgctcactcaccaccgtcttcaacgtgctg ctctcctacctg ctgctcaagcagaccacctccttctatgccctgctcacctgcggtatcatcatcgggggcttctggcttggtgt ggaccaggag ggggcagaaggcaccctgtcgtggctgggcaccgtcttcggcgtgctggctagcctctgtgtctcgctcaacgc catctacac cacgaaggtgctcccggcggtggacggcagcatctggcgcctgactttctacaacaacgtcaacgcctgcatcc tcttcctgc ccctgctcctgctgctcggggagcttcaggccctgcgtgactttgcccagctgggcagtgcccacttctggggg atgatgacg ctgggcggcctgtttggctttgccatcggctacgtgacaggactgcagatcaagttcaccagtccgctgaccca caatgtgtcg ggcacggccaaggcctgtgcccagacagtgctggccgtgctctactacgaggagaccaagagcttcctctggtg gacgagc aacatgatggtgctgggcggctcctccgcctacacctgggtcaggggctgggagatgaagaagactccggagga gcccag ccccaaagacagcgagaagag cgccatgggggtgtgagcaccacag caccctg at (SEQ ID No 8) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit QIAGEN et a été introduite dans un vecteur TOPO2.1. Des bactéries compétentes (TOP10, Invitrogen) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY07.001). 9.2.2 Etape 2 : assemblage de la cassette d'expression pour S.cerevisiae, et S.pombe L'intégration de la cassette d'expression du transporteur de GDP-fucose va être localisée dans le marqueur d'auxotrophie TRP1 pour la souche S.cerevisiae et dans le marqueur ARG3 pour la souche S.pombe. L'invalidation du gène TRP1 induit une résistance à un agent toxique, l'acide 5-fluoro-anthranilique. Les levures modifiées par cette cassette deviendront donc résistantes à cette drogue mais également auxotrophe pour le tryptophane. L'invalidation du gène ARG3 induit une auxotrophie pour l'arginine. -Amplification du promoteur SV40 à partir du pTarget : BS109 (forward) et BS110 (reverse) -Assemblage de l'ORF (pGLY07.001) avec le terminateur CYC1 (produit de PCR) 25 CA013 (forward) et BS41 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY07.002). - Assemblage de la cassette promoteur SV40 (produit de PCR), ORF (produit de PCR) et terminateur CYC1 (produit de PCR) avec les extrémités homologues au marqueur TRP1 pour S.cerevisiae et S.pombe: BS136 (forward) et BS137 (reverse) L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY07.003). -Assemblage de la cassette promoteur SV40 (produit de PCR), ORF (produit de PCR) et terminateur CYC1 (produit de PCR) avec les extrémités homologues au marqueur BS152 (forward) et BS153 (reverse). L'amplification PCR a été extraite et purifiée du gel d'agarose par le kit Qiagen et a été introduite dans un vecteur pTarget. Des bactéries compétentes (JM109, promega) ont été transformées avec ce vecteur. La transformation a été vérifiée par PCR et l'insertion de l'amplification PCR dans le vecteur par séquençage (pGLY07.005). 9.2.3 Etape 3 : modification des levures - Préparation de levures compétentes : Les souches Apoline et Epiphanie ont été préparées comme indiqué ci-dessus afin de les rendre compétentes. 30 -Electroporation des levures Protocole : 20 g des plasmides contenant les cassettes d'expression pour S.cerevisiae et S.pombe ont été digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. La cassette linéarisée a été introduite dans les levures Apoline et Epiphanie par électroporation. Les levures S.cerevisiae sont étalées sur milieu YPD contenant de l'acide 5-fluoro-anthranilique. Les levures S.pombe sont étalées en dilution limite sur un milieu YPD gélosé, le marqueur délété ne conférant pas de résistance à une drogue. Une fois les clones sortis, des réplicats sur milieu minimum sont établis afin de sélectionner les clones ne pouvant plus pousser sans l'acide aminé nécessaire. Exemple 10 : Production d'EPO glvcosvlé de façon homogène 10.1 Amplification de la séquence nucléotidique de l'érythropoiétine humaine (EPO) : L'amplification de la séquence nucléotidique de l'EPO humaine a été obtenue à partir d'ADN complémentaire de rein humain avec les amorces appropriées. 10.2 Clonage de la séquence de l'EPO dans un vecteur d'expression de S.cerevisiae : La séquence nucléotidique de l'huEPO humaine tronquée de son codon STOP (585 paires de bases) est intégrée dans un vecteur d'expression de levure S.cerevisiae. La continuité du cadre de lecture entre la séquence introduite et la séquence du plasmide pSC (épitoge V5 et tag poly-histidine) a été confirmée par séquençage du plasmide obtenu (pSC-EPO). L'expression de la protéine EPO se trouve sous le control du promoteur pGAL1, promoteur inductible par le galactose pour les souches S.cerevisiae. La sélection des levures possédant le plasmide se fait par un retour de la prototrophie pour l'uracile (présence de la séquence URA3 dans le plasmide). Séquence obtenue dans le plasmide d'expression : 1 ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCTGGCTG TGGCTTCTCC TGTCCCTGCT 51 GTCGCTCCCT CTGGGCCTCC CAGTCCTGGG CGCCCCACCA CGCCTCATCT 101 GTGACAGCCG AGTCCTGGAG AGGTACCTCT TGGAGGCCAA GGAGGCCGAG 151 AATATCACGA CGGGCTGTGC TGAACACTGC AGCTTGAATG AGAATATCAC 201 TGTCCCAGAC ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG ATGGAGGTCG 251 GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT 301 GTCCTGCGGG 351 CCTGCAGCTG 401 CTCTGCTTCG 451 GCAGCCTCAG 501 ACTCTTCCGA 551 CAGGGGAGGC 601 CCATTCGAAG 651 GCGTACCGGT GCCAGGCCCT CATGTGGATA GGCTCTGGGA CTGCTCCGCT GTCTACTCCA CTGCAGGACA GTAAGCCTAT CATCATCACC GTTGGTCAAC TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC AGCCTCACCA GCCCAGAAGG AAGCCATCTC CCCTCCAGAT CCGAACAATC ACTGCTGACA CTTTCCGCAA ATTTCCTCCG GGGAAAGCTG AAGCTGTACA GGCGACAGAA AGGGCGAGCT TCGAGGTCAC CCCTAACCCT CTCCTCGGTC TCGATTCTAC ATCACCATTG A (SEQ ID No 11) Séquence protéique de l'EPO séquencée dans le plasmide d'expression (SEQ ID No 12) MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEH CSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPQ LHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRG KLKLYTGEACRTGDRKGELRGHPFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH* Epitope V5 poly-HIS 10.3 Extraction des ARN : Centrifuger les levures 16000g pendant 5 min. Enlever le surnageant et remettre le culot en suspension dans 500 1 de tampon TES (TrisHC1 pH7.5 10mM, EDTAlOmM, SDS 0.5%). Ajouter 200 L de phénol et 200 L de chloroforme puis incuber 20min à 65 C en vortexant 30s toutes les 5min et incuber 1h à -80 C. Centrifuger 20 min à 13200rpm puis récupérer la phase aqueuse et ajouter 335 L de phénol et 67 L de chloroforme. Vortexer et centrifuger 5min à 11000rpm. Récupérer la phase aqueuse et ajouter 300 L de chloroforme. Vortexer et centrifuger 2 min à 13200rpm. Récupérer la phase aqueuse et ajouter 30 L d'acétate de sodium 3M pH5.2 et 600 L d'éthanol absolu. Incuber 1h à -20 C. Centrifuger l5min à 13200rpm.Enlever le surnageant en faisant attention au culot. Laisser sécher, reprendre dans l00 1 d'eau DEPC puis les placer dans un tube contenant l'unité de filtration violet Nucleospin (Nucleospin RNAII). Centrifuger 1min à 11000g. Enlever le filtre et ajouter 350 L d'éthanol 70%. Charger la colonne Nucleospin RNAII. Centrifuger 30sec à 8000g. Placer la colonne dans un nouveau tube, ajouter 350 L de Membrane Desalting Buffer. Centrifuger 1min à 11000g. Déposer 95 L de solution DNase au centre de la colonne puis incuber 15 min à température ambiante. Ajouter 200 L de solution RA2 (inactive la DNase) et centrifuger 30s à 8000g. Ajouter 600 L de solution RA3 au centre de la colonne. Centrifuger 30s à 8000g. Placer la colonne dans un nouveau tube, ajouter 250 L de solution RA3. Centrifuger 2min à 11000g pour sécher la colonne. Placer la colonne dans un tube de 1.5mL et ajouter 50 L d'eau DEPC. Centrifuger 1min à 11000g. Conserver les échantillons à -80 C. PCR 5 g d'ARN au maximum 8 L Random hexamer 50ng/ L 1 L dNTP mix l 0mM l L 10 X 2 L eau DEPC gspl0.L Incuber 5 min à 65 C RT Buffer Ajouter 10 L de mix de transcription: MgC12 25 mM 4 L DTT 0,1 M 2 L RNase Out 40 U/ L l L SuperScript 200 U/ L l L 10.5 Extraction des protéines : Après une centrifugation à 1500g pendant 5 min à 4 C, le culot cellulaire est repris dans 500 L d'H2O stérile puis centrifuger à vitesse maximale pendant 30 secondes à 4 C. 30 Le culot est repris dans 500 L de tampon de lyse 50 mM sodium phosphate pH 7.4, 5% glycérol,l mM PMSF, centrifuger 10 min à 1500g à 4 C. Le culot est ensuite repris dans un volume de tampon de lyse nécessaire pour obtenir une DO comprise entre 50 et 10.4 Transcription inverse: Super Script III First-Strand Synthesis System for RT-lo 15 20 Incuber l0min à 25 C 50min à 50 C 5min à 85 C Récupérer dans la glace et ajouter 1 L de RNaseH. Laisser incuber 20min à 37 C puis 25 conserver les ADNc à -20 C. 5 30 100. Les échantillons sont ensuite vortexer pendant 4x30 secondes avec des billes de verre et une centrifugation de 10 min à vitesse maximale est réalisée pour séparer les billes et les débris cellulaires du surnageant protéique. Un dosage BCA est réalisé sur le surnageant. 10.6 Purification de l'EPO: Les protéines totales sont tout d'abord dialysées contre du tampon Tris HC1 10 mM pH 6.0. Après équilibration d'une colonne échangeuse de cations SP séphadex C50 avec 10 l0 mM Tris-Hcl pH 6.0, les protéines totales dialysées sont chargées sur la colonne. Après rinçage de la colonne avec du tampon Tris HC1 10 mM pH 6.0, les protéines sont éluées avec du tampon Tris HC1 10 mM pH 6.0, 250 mM NaCl. On détermine l'absorbance de chaque fraction à 280 nm ainsi que la quantité de protéines éluées par un dosage de Bradford. Les protéines sont ensuite analysées par électrophorèse SDS-PAGE sur gel 15 acrylamide 12%. 10.7 Détection de la protéine EPO - Western Blot Les protéines totales sont transférées sur une membrane de nitrocellulose afin de procéder à une détection par l'anticorps anti-EPO (R&D systems). Après le transfert, la 20 membrane est saturée par une solution de blocage (TBS, 1% blocking solution Roche) pendant 1 heure. La membrane est ensuite mise en contact avec la solution d'anticorps anti-EPO (dilution 1 :500) pendant 1 heure. Après trois rinçages TBS-Tween 20 0.1%, la membrane est mise en contact avec l'anticorps secondaire anti-souris-HRP afin de procéder à la détection par chimioluminescence (solution de détection Roche). 25 11. Résultats : 11.1 : Validation des clones ayant intégrés la cassette Kanamycine dans le gène Ochl Pour la suppression de l'activité Ochl, la cassette introduite a été intégralement séquencée après son intégration afin de cartographier la région génomique affectée dans 20 le génome de la levure. L'absence de l'activité enzymatique est ensuite réalisée, renforçant le résultat précédent, puis la structure des glycannes est déterminée par spectrométrie de masse. L'analyse sur gel TBE-agarose 1% de la réaction de PCR effectuée partir de l'ADN génomique des clones S.cerevisiae ayant résistés à la présence de kanamycine dans le milieu de culture montre un fragment de 2Kb amplifié avec un couple d'oligonucléotides spécifique de la cassette kanamycine. La taille de ce fragment correspond à a taille théorique de la cassette kanamycine. Le deuxième fragment a été amplifiégrâce à un oligonucléotide interne à la cassette kanamycine et un oligonucléotide externe à la cassette s'hybridant avec la gène Ochl la taille théorique du fragment attendu est 1.5Kb ce qui correspond à la taille du fragment obtenu. Nous pouvons donc conclure que les clones 1, 2, 3 et 4 ont bien intégré la cassette kanamycine et que celle-ci a été intégrée dans le gène Ochl (voir figure 3). Le même type de réaction de PCR a été effectué sur les souches S. pombe ayant résisté à la présence de kanamycine dans le milieu de culture. Ainsi deux clones mutés de chaque souche ont été isolés et testés pour la perte d'activité enzymatique al,6-mannosyltransférase. Test d'activité mannosyltransférase ochl sur les souches de levures mutées Validation de la perte d'activité Ochl dans les mutants Aochl obtenus par recombinaison homologue dans les levures S. cerevisiae et S. pombe: Après la validation par PCR de l'insertion de la cassette d'expression de la kanamycine 25 dans les levures S.cerevisiae sauvages et S.pombe sauvages, les clones positifs à cette insertion sont testés pour leur perte d'activité mannosyltransférase ochl. L'activité ochl a été testée sur les microsomes des levures de S.cerevisiae et S.pombe. La figure 4 montre le test d'activité ochl sur a- la fraction microsomale de la souche sauvage et des clones sélectionnés de S. cerevisiae b- la fraction microsomale de la souche sauvage et 30 des clones sélectionnés de S.pombe. D'après la figure 4, nous pouvons observée une perte d'activité de l'enzyme ochl dans les clones sélectionnés de S.cerevisiae (a) et de S pombe (b). Validation des souches par analyses des N-glycannes : Les protéines totales provenant des deux souches modifiées ont été réduites et alkylées puis digérées par la trypsine. Les polysaccharides libres sont éliminés par passage sur SepPak C18. Les peptides et glycopeptides récupérés sont soumis à la PNGase. Les glycannes sont purifiés sur SepPak C18 puis méthylés avant d'être analysés en spectrométrie de masse en mode Maldi-Tof. La Figure 5 montre le spectre de masse réalisé sur les N-glycannes des souches Adèle et Edgar. Nomenclature des levures : S.cerevisiae Aochl = Adèle 15 S.pombe Aochl = Edgard Les deux souches présentent des N-glycannes de formes oligomannosidiques du Mani au Man 10, des formes plus courtes que dans la souche sauvage de Saccharomyces cerevisiae indiquant la perte des formes polymannosylées sauvages. 20 Les structures prédominantes pour la souche Edgar (AOCH1) sont Man 9 et Man 8, structures classiquement rencontrées chez les mammifères à l'issue du transit de la protéine néosynthétisée dans le réticulum endoplasmique. Ceci suggère un blocage de la glycosylation du à l'impossibilité d'action des mannosyltransférases golgiennes qui ne greffent du mannose que sur des glycannes sur lesquels l'enzyme Ochl a greffé un 25 mannose lié en al,6. 11.2: Validation des clones ayant intégrés la cassette Mannosidase I dans le gène URA3. 30 Les levures Adèle et Edgard positives pour l'insertion de la cassette d'expression de la mannosidase I dans le gène URA3 sont testées pour leur activité biochimique15 mannosidase I. La Figure 6 montre le dosage d'activité mannosidase dans les microsomes de levures S.cerevisiae et S.pombe. L'expérience a été réalisée en triplicat. Nous pouvons observer dans les souches S.cerevisiae et S. pombe sauvages une activité mannosidase non-inhibée par le DMJ. Inversement, les souches sélectionnées présentent une inhibition significative de l'activité mannosidase mesurée lors d'un traitement DMJ. De plus, l'activité mannosidase I mesurée étant présente dans les microsomes de levures, nous pouvons en déduire que cette enzyme est exprimée dans la voie de sécrétion au niveau du réticulum endoplasmique/cis-Golgi, indiquant que le signal de rétention HDEL intégré en C-terminal de la protéine est bien reconnu par le système cellulaire. Nomenclature des levures : S.cerevisiae Adèle + mannosidase I = Amélie S.pombe Edgard + mannosidase I =Emma 11.3 Validation des clones ayant intégrés la cassette N-acétylglucosaminyl transférase (G1cNAc Transférase I) dans les levures modifiées : La Figure 7 montre l'activité GlcNAcTransférase I dans les microsomes des levures 20 sauvages et modifiées. Dans les fractions microsomales des levures Amélie-GlcNacTI et Emma-GlcNacTI, nous observons une augmentation du marquage de l'accepteur par transfert d'un groupement G1cNAc radioactif comparée au marquage observée dans les levures témoins (sauvage et/ou Aochl-MdseI). Ce transfert implique la présence d'une activité 25 N-acétylglucosaminyltransférase dans les levures modifiées par l'expression de la G1cNAcTI. Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Amélie + G1cNAcTI = Agathe 30 S.pombe Emma + G1cNAcTI = Egée 11.4 Validation clones ayant intégrés la cassette du transporteur d'UDP-GlcNAc dans les levures modifiées : L'expression du transporteur d'UDP-GlcNAc a été analysée par RT-PCR sur des cultures de levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN totaux extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques du transporteur d'UDP-GlcNAc (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression du transporteur d'UDP-GlcNAc une expression de l'ARNm de ce transporteur (figure 8). Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Agathe + UDP-G1cNAc transporteur = Arielle S.pombe Egée + UDP-G1cNAc transporteur = Erika 11.5 Validation des clones ayant intégrés la cassette de la mannosidase II dans les 15 levures modifiées : a- Validation par amplification PCR Les clones sélectionnés pour S.cerevisiae et S.pombe ont été testés par PCR pour vérifier la présence des cassettes d'expression de la mannosidase II dans le génome des 20 levures. b- Expression de la mannosidase II L'expression de la mannosidase II a été analysée par RT-PCR sur des cultures de 25 levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques de la mannosidase II (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression de la mannosidase II une expression de l'ARNm de cette protéine. 30 c- Mesure de l'activité de la mannosidase II Les levures Adèle et Edgar positives pour l'insertion de la cassette d'expression de la mannosidase II sont testées pour leur activité biochimique mannosidase II. D'après la figure 9, nous pouvons observer dans les souches S.cerevisiae et S. pombe parentales une activité mannosidase insensible à l'action inhibitrice de la swainsonine. Inversement, les souches sélectionnées présentent une inhibition significative de l'activité mannosidase mesurée lors d'un traitement swainsonine. De plus, l'activité mannosidase II mesurée étant détectée dans les fractions golgiennes de levures, nous pouvons en déduire que cette enzyme est correctement exprimée dans la voie de sécrétion au niveau du système golgien. Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Arielle + Mannosidase II = Anaïs S.pombe Erika + Mannosidase II = Enrique 11.6 Validation des clones ayant intégrés la cassette de la N-acétylglucosaminyl transférase II (G1cNAc transférase II) dans les levures modifiées : a- Validation par amplification PCR Les clones sélectionnés pour S.cerevisiae, et S.pombe ont été testés par PCR pour 20 vérifier la présence des cassettes d'expression de la G1cNAc transférase II dans le génome des levures (résultats non présentés). b- Expression de la G1cNAc transférase II : L'expression de la G1cNAc transférase II a été analysée par RT-PCR sur des cultures 25 de levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques de la G1cNAc transférase II (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression de la G1cNAc transférase II une expression de l'ARNm transcrit (résultats non présentés). Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Anaïs + G1cNAc transférase II = Alice S.pombe Enrique + G1cNAc transférase II = Elga 11.7 Validation des clones ayant intégrés la cassette Galactosyl transférase I : a- Validation par amplification PCR Les clones sélectionnés pour S.cerevisiae, et S.pombe ont été testés par PCR pour vérifier la présence des cassettes d'expression de la Ga1TI dans le génome des levures (résultats non présentés). b- Expression de la Galactosyl transférase I : L'expression de la Ga1TI a été analysée par RT-PCR sur des cultures de levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques de la Ga1TI (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression de la Ga1TI une expression de l'ARNm transcrit (résultats non présentés). c- Activité de la GALTI Après extraction des protéines totales des levures modifiées, 2 g de protéines sont déposées sur une membrane de nitrocellulose. La membrane est ensuite incubée avec la lectine erythrina cristagalli couplée à la biotine, lectine reconnaissant spécifiquement le galactose du motif Gal-(3-1,4-GlcNAc présent sur les glycannes des glycoprotéines. La membrane est mise en contact avec de la steptavidine couplée à la horse radish peroxidase (HRP) afin de procéder à la détection par chimio luminescence (solution de détection Roche). 11.8 Validation des clones ayant intégrés la cassette du transporteur de GDP-fucose : a- Validation par amplification PCR Les clones sélectionnés pour S.cerevisiae, et S.pombe ont été testés par PCR pour vérifier la présence des cassettes d'expression du transporteur de GDP-fucose dans le génome des levures. b- Expression du transporteur de GDP-fucose : L'expression du transporteur de GDP-fucose a été analysée par RT-PCR sur des cultures de levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques du transporteur de GDP-fucose (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression du transporteur de GDP-fucose une expression de l'ARNm transcrit (figure 10). Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Anaïs + GDP-fucose transporteur = Apoline S.pombe Enrique + GDP-fucose transporteur = Epiphanie 11.9 Validation des clones ayant intégrés la cassette de la fucosyltransférase 8 15 (FUT8) : a- Validation par amplification PCR Les clones sélectionnés pour S.cerevisiae, et S.pombe ont été testés par PCR pour vérifier la présence des cassettes d'expression de la FUT8 dans le génome des levures. 20 b-Expression de la FUT8 : L'expression de la FUT8 a été analysée par RT-PCR sur des cultures de levures parentales ou modifiées. Après une étape de reverse transcription sur les ARN extraits, les cDNA ont été analysés par PCR en utilisant des primers spécifiques de la FUT8 25 (PCR nichée). On observe donc dans les levures modifiées par la cassette d'expression de la FUT8 une expression de l'ARNm transcrit (résultats non présentés). Nomenclature des levures modifiées : S.cerevisiae Apoline + FUT8 = Ashley 30 S.pombe Epiphanie + FUT8 = Esther 11.10 Cas particulier de l'expression de l'EPO dans la souche Amélie. La souche Amélie possède la faculté de réaliser exclusivement le N-glycanne Man5GlcNAc2 (Figure 11), structure rencontrée chez les mammifères, qualifiée de glycanne de type simple ; et servant de base à l'élaboration de glycannes plus complexe porteurs de galactose, fucose ou acide sialique. La présence de chaque modification génomique dans cette souche est décrite ci-dessus. Chacune de ces étapes entre dans un package de vérifications consistant à choisir le meilleur clone producteur et à maximiser le pourcentage de chance d'obtenir un clone exploitable. La méthode utilisée permet un contrôle complet de la procédure de modification génétique : la séquence à intégrer est parfaitement connue, tout comme la région génomique cible de la future intégration. Ce dernier site fait par ailleurs l'objet de recherches approfondies quant aux effets d'une éventuelle cassure, c'est pourquoi l'ensemble des cibles est au final choisi pour l'absence d'effets phénotypiques obtenus à l'issue de leur cassure. Toute une procédure de suivi de la stabilité génomique des clones producteurs est opérée : Après chaque production : repiquage régulier des clones sur les milieux drastiques initialement utilisés pour leur sélection, et remise en route de la procédure de validation. Toutes les cassettes d'expression sont clonées ce qui permet en cas de remaniement génomique d'une souche donnée, de procéder à une remise à niveau génétique de l'organisme. Les procédures d'intégration des cassettes sont à présent standardisées et l'on peut imaginer réaliser des souches à la demande afin de réaliser une glycosylation spécifique, commandée par l'utilisateur. La souche Amélie est le clone qui doit servir de base à l'élaboration de toute autre souche destinée à produire des glycannes humanisés, hybrides ou complexes. Le plasmide utilisé pour l'expression de l'EPO dans les levures modifiées contient le promoteur Gall. Ce promoteur est l'un des promoteurs les plus forts connus chez S.cerevisiae, et est couramment utilisé pour les productions de protéines recombinantes. Ce promoteur est induit par le galactose et réprimé par le glucose. En effet, dans une culture de levures S.cerevisiae en glycérol, l'ajout de galactose permet l'induction des gènes GAL d'environ 1000 fois. Si du glucose est ajouté à cette culture en présence de galactose, les gènes GAL ne seront plus induit qu'à 1% du niveau obtenu avec le galactose seul (Johnston, M. (1987) Microbiol. Rev.). La séquence de l'EPO humaine intégrée dans notre plasmide a été modifiée en 5' par ajout d'un épitope V5 ainsi que d'un tag polyhistidine afin de facilité la détection et la purification de la protéine produite. Les levures utilisées pour la production de l'EPO humaine sont tout d'abord mise en culture dans un milieu YNB drop out uracil, 2% glucose jusqu'à atteindre une DO>12. Au bout de 24 à 48 heures de culture, 2% de galactose sont rajoutés à la culture pour induire la production de notre protéine d'intérêt. Les prélèvements d'échantillons ont lieu à 0, 6, 24 et 48 heures d'induction. Expression de l'ARNm de l'EPO dans les levures modifiées: L'analyse par RT-PCR des ARN totaux extraits montre une expression de l'ARN messager de l'EPO dans les clones de levures transformées après une induction par le galactose (figure 12 pistes 1 et 3) contrairement à ce qui est observé dans les levures modifiées sans induction par le galactose (figure 12 pistes 2 et 4). La présence de galactose provoque donc une induction de la transcription du gène EPO. Le séquençage de ce fragment amplifié confirme la production d'un ARNm correct. Purification de la protéine EPO exprimée dans les levures modifiées : Les protéines totales obtenues après induction de l'expression de la protéine rhuEPO par le galactose sont ensuite déposées sur une résine de séphadex C50 équilibrée à pH 6. L'absorbance à 280 nm est déterminée en sortie de colonne (figure 13). Les protéines éluées de la colonne sont analysées par électrophorèse SDS-PAGE sur gel acrylamide 12%. Après migration du gel SDS-PAGE, l'analyse des protéines se fait soit par coloration au bleu de coomassie (figure 14) soit par western blot. Dans ce cas, les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose afin de procéder à une détection par l'anticorps anti-EPO (R&D systems). La figure 15 nous montre la présence d'une protéine à environ 35 kDa. Cette protéine est majoritaire en coloration coomassie et révélée par un anticorps anti-EPO en analyse western blot (tube 29 en sortie de colonne). Tous ces résultats indiquent donc la production de la protéine EPO par les levures 5 génétiquement modifiées. 15 REVENDICATIONS 1. Levures génétiquement modifiées, capables de produire des glycoprotéines présentant des glycanes homogènes présentant la structure Man5GlcNAc2, lesdistes levures comprenant les modifications suivantes: a) inactivation du gène Ochl codant pour l'al,6 mannosyl transférase par insertion par recombinaison homologue d'une séquence hétérologue codant pour un gène de 10 résistance à une antibiotique (souche delta-Ochl), b) Intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase 15 ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-1-2 mannosidase I comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription, c) Intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, 20 TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, ledit promoteur en c) étant différent du promoteur en b), une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour glycoprotéine exogène à produire et un terminateur de la transcription. 25 2. Levures selon la revendication 1, caractérisées en ce que l'a-1-2 mannosidase I est l'a-1-2 mannosidase I de C. Elegans, notamment d'une séquence comprenant la SEQ ID No 1. 30 3. Levures selon la revendication 1 ou 2, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% de la structure GlcNacMan5GlcNAc2, comprenant en outrel'intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour la N-acétyl-glucosaminyl transférase I humaine comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. 4. Levures selon la revendication 3, caractérisées en ce que la N-acétyl-glucosaminyl transférase I humaine comprend la séquence SEQ ID No 2 sans la partie cytoplasmique de l'enzyme qui est remplacée par la partie cytoplasmique de mmn9 (SEQ ID No 13) pour une localisation golgienne de la protéine. 5. Levures selon la revendication 4, caractérisées en ce qu'elle comprennent en outre l'intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour le transporteur d'UDP-GlcNAc humain et un terminateur de la transcription. 6. Levures selon la revendication 5, caractérisées en ce que transporteur d'UDPG1cNAc humain comprend la séquence SEQ ID No 3. 7. Levures selon l'une des revendications 4 à 6, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% de la structure GlcNacMan3GlcNAc2, comprenant en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une mannosidase IIcomprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription 8. Levures selon la revendication 7, caractérisées en ce que la mannosidase II est la 5 mannosidase II de souris et comprend la séquence SEQ ID No 4. 9. Levures selon l'une des revendications 7 à 8, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% de la structure GlcNac4Man3GlcNAc2, comprenant en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une 10 cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une N-acetyl-glucosaminyl transférase II, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou 15 l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. 10. Levures selon la revendication 9, caractérisées en ce que la N-acetyl-glucosaminyl transférase II est humaine, et comprend la séquence SEQ ID No 5. 20 11. Levures selon l'une des revendications 9 à 10, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% de la structure Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2, comprenant en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, 25 CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une galactosyl transférase I, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription. 30 12. Levures selon la revendication 11, caractérisées en ce que la galactosyl transférase I est humaine, et comprend la séquence SEQ ID No 6, qui est dépourvue de la séquence de ciblage humaine. 13. Levures selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisées en ce que le marqueur d'auxotrophie est sélectionné parmi URA3, ADE1, ADE2, LEU2, LYS2, CYH1, TRP1, ARG3, HIS5, GLU1, MET6, CAN1, CARI et LEM3. 14. Levures selon la revendication 13, caractérisées en ce que la cassette d'expression de la a-1-2 mannosidase I est intégrée dans le gène URA3, la cassette d'expression de la N-acétyl-glucosaminyl transférase I est intégrée dans le gène ADE1 ou ADE2, la cassette d'expression du transporteur d'UDP-GlcNAc est intégrée dans le gène LYS2, la cassette d'expression de l'a-mannosidase II est intégrée dans le gène LEU2, et la cassette d'expression de la N-acetyl-glucosaminyl transférase II est intégrée dans le gène CYH1 ou TRP1. 15. Levures selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisées en ce que la séquence de 15 ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi est dérivée de la séquence de localisation du gène Mntl et comprend la séquence SEQ ID No 14. 16. Levures selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisées en ce que le terminateur est dérivé du gène CYC1 et comprend la séquence SEQ ID No 15. 20 17. Levures selon l'une des revendications 3 à 10, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% d'une structure choisie parmi ManS G1cNAc2, G1cNacManS G1cNAc2, 25 GlcNacMan3GlcNAc2, G1cNac2Man3 G1cNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 Ga12GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 30 comprenant en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmipGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement ou le promoteur du gène Mntl, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour une a-1,6-fucosyltransférase FUT8, comprenant une séquence de ciblage dans le reticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi et un terminateur de la transcription dérivé du gène CYC1 comprenant la séquence SEQ ID No 15. 18. Levures selon la revendication 17, caractérisées en ce que la a-1,6-fucosyltransférase FUT8 est humaine et comprend la séquence SEQ ID No 7. 19. Levures selon l'une des revendications 17 et 18 comrpenant en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la séquence SEQ ID No 16-26 respectivement ou le promoteur SV40, une phase ouverte de lecture comprenant la séquence codante pour un transporteur de GDP-fucose, notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 8. 20. Levures selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que la a-1-2 20 mannosidase I est exprimée sous le contrôle du promoteur pGAP et la glycoprotéine protéine exogène est exprimée sous le contrôle du promoteur pGAL1. 21. Levures selon l'une des revendications 11 à 20, capables de produire des glycoprotéines présentant plus de 75% d'une structure choisie parmi 25 NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2 et NANA4Ga14G1cNac4(Fuc)Man3GlcNAc2 caractérisées en ce qu'elles comprennent en outre une intégration par recombinaison homologue dans un marqueur d'auxotrophie d'une cassette d'expression comprenant un promoteur selectionné parmi pGAP, pGAL1, PGK, TEF, PMA1, CaMV, Pho5, actin bonding protein promoter, CYC1 de S. cerevisiae or S. pombe, et ADH2 possédant la 30 séquence SEQ ID No 16-26 respectivement ou le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'herpès comprenant la séquence SEQ ID No 9, une phase ouverte de lecturecomprenant la séquence codante pour une a-2,3 sialyltransférase et le terminateur dérivé du gène CYC1 comprenant la séquence SEQ ID No 15. 22. Levures selon la revendication 21 caractérisées en ce que la sialyltransférase est la 5 ST4GAL4 humaine , notamment une séquence comprenant la SEQ ID No 10. 23. Levures selon l'une des revendications 1 à 22, caractérisées en ce que la glycoprotéine est choisie parmi les glycoprotéines à usage thérapeutique telles que des cytokines, des interleukines, des hormones de croissance, facteurs de croissance, des 10 enzymes, et des anticorps monoclonaux, protéines vaccinales, récepteurs solubles et tous types de protéines recombinantes.. 24. Levures selon la revendication 23, caractérisées en ce que la glycoprotéine est l'EPO, notamment une EPO ayant la SEQ ID No 12 comprenant l'épitope V5 et un 15 motif poly-HIS en N-terminal pour purification. 25. Composition pharmaceutique comprenant une glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 90%, 95% ou encore 98%, par exemple plus de 90%, 95% ou encore 98% d'une structure sélectionnée parmi : 20 GlcNacMan5GlcNAc2, G1cNacMan3GlcNAc2, G1cNac4Man3 G1cNAc2, Gal4G1cNac4Man3 G1cNAc2. G1cNac(Fuc)Man5GlcNAc2, 25 GlcNac(Fuc)Man3GlcNAc2, G1cNac4(Fuc)Man3GlcNAc2, Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2, NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2 ou NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2, ou NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2 ou NANA4Ga14G1cNac4(Fuc)Man3GlcNAc2 30 26. Composition pharmaceutique comprenant de l'EPO à titre de principe actif, ledit EPO présentant plus de 90% de la structure :NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2 ou NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2, ou NANA4Ga14G1cNac4Man3GlcNAc2 ou NANA4Ga14G1cNac4(Fuc)Man3GlcNAc2 27. Culture en fermenteur comprenant un milieu de culture de base des milieux de 5 culture pour levures et une levure selon l'une des revendications 1 à 24. 28. Procédé de production d'une glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 75% d'une structure sélectionnée parmi : Man5 G1cNAc2, 10 GlcNacMan5GlcNAc2, G1cNacMan3 G1cNAc2, G1cNac2Man3 G1cNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 15 G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 Gal2GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 comprenant la mise en culture d'une levure selon l'une des revendications 1 à 24 dans un fermenteur, et l'extraction de ladite glycoprotéine du milieu de culture. 20 29. Utilisation d'une levure selon l'une des revendications 1 à 24 pour la production en fermenteur d'une glycoprotéine possédant des structures glycanniques homogènes à plus de 75% d'une structure sélectionnée parmi : Man5 G1cNAc2, 25 GlcNacMan5GlcNAc2, G1cNacMan3 G1cNAc2, G1cNac2Man3 G1cNAc2. Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3GlcNAc2 30 G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 Gal2GlcNac2Man3(Fuc)G1cNAc2 NANA2Ga12G1cNac2Man3(Fuc)G1cNAc2