Brevet FR2915207A1 — publié le 20081024

Polynucléotides et polypeptides impliqués dans le paludisme gestationnel, et applications biologiques. La présente invention est relative à de nouveaux antigènes impliqués dans le paludisme gestationnel et plus particulièrement à des séquences polynucléotidiques et polypeptidiques, des conjugués, des vecteurs de clonages comportant lesdites séquences en vue de la réalisation de compositions immunogènes et vaccins, d'anticorps et à leurs utilisation pour le traitement du paludisme gestationnel. L'invention vise également des méthodes et des kits de diagnostic. Le paludisme, appelé également malaria, est transmis principalement par le parasite Plasmodium falciparum, inoculé lors de la piqûre d'un moustique, l'anophèle. Une fois introduit dans le sang, le parasite pénètre dans le foie où il mâture avant de circuler à nouveau dans le sang, d'infecter les globules rouges (érythrocytes) et de se multiplier. gestationnel (appelé également paludisme paludisme associé à la grossesse) est observé enceinte. En effet, chez la femme enceinte placenta contient de nombreux érythrocytes a des effets néfastes sur la croissance du perturbe les échanges entre la mère et le foetus, entraînant une diminution du poids de l'enfant à la naissance. Dans les zones d'Afrique où le paludisme est 30 endémique, 3 à 5% des décès des nourrissons à la naissance peuvent être imputés au paludisme gestationnel. En outre, il présente également un réel danger pour la mère. Le paludisme placentaire ou chez la femme impaludée, le infectés. Ceci foetus, puisqu'il La sévérité clinique du paludisme due à Plasmodium falciparum est liée en partie à des altérations des érythrocytes infectés. Ces altérations sont induites par les protéines du parasite qui sont exportées à la surface des érythrocytes durant la phase de développement dans le sang. Certaines de ces protéines de surface, codées par les parasites, confèrent des nouvelles propriétés de cytoadhérence aux érythrocytes, ayant pour conséquence leur soustraction à la circulation sanguine. En effet, les érythrocytes sont alors capables de se fixer à la paroi interne des vaisseaux sanguins, empêchant par la même l'acheminement de l'érythrocyte vers les organes épurateurs du système immunitaire, dont l'un des rôles est de détruire les cellules reconnues comme anormales. Les protéines de surface exprimées par les parasites peuvent également subir une variation antigénique, phénomène qui est supposé contribuer au fait que les parasites échappent au système immunitaire. Dans les zones où le paludisme est endémique, les adultes sont souvent résistants aux infections dues à Plasmodium falciparum. Ceci résulte de l'acquisition progressive d'une immunité vis-à-vis d'un large répertoire d'antigènes variants de surface (VSA) du parasite. En dépit de l'acquisition de cette immunité à l'âge adulte, la prévalence du paludisme augmente lors de la grossesse, spécialement parmi les femmes primigestes. Les femmes enceintes de leur premier enfant manquent d'anticorps dirigés contre les VSA exprimés par les parasites adhérant aux tissus placentaires, ce qui suggère que ces parasites expriment des nouveaux VSA (VSAPAM) auxquels ces femmes n'ont jamais été exposées auparavant. Les parasites du paludisme gestationnel (PAM) présentent un tropisme placentaire et adhèrent à la chondroïtine sulfate A (CSA) exprimée à la surface de la couche de syncytiotrophoblastes. Les femmes deviennent par la suite résistantes au paludisme car elles acquièrent des anticorps spécifiques contre les VSApm qui inhibent la liaison du parasite à la CSA durant les grossesses suivantes. Ces observations ont conduit les inventeurs à étudier la mise au point d'un vaccin contre cette forme du paludisme. L'étude d'isolats frais, collectés directement à partir de 10 placentas de femmes à l'accouchement, a permis aux inventeurs d'identifier et d'isoler de nouveaux gènes présentant une spécificité pour les parasites au tropisme placentaire. La présente invention se rapporte donc à de nouveaux 15 polynucléotides et polypeptides impliqués dans le paludisme gestationnel, ainsi qu'à leurs applications biologiques en tant que séquences codant pour des antigènes. Il s'agit plus particulièrement de polynucléotides isolés ou 20 purifiés comprenant une séquence choisie parmi le groupe consistant en : (a) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO. 1, (b) Une sous-séquence de (a) avec une longueur minimum de 25 30 acides nucléiques, à l'exception de la séquence SEQ ID NO. 1. SEQ ID NO. 1 correspond à la séquence nucléotidique de la protéine hypothétique PFI1785w , décrite lors du séquençage 30 complet du génome du clone 3D7 de P. falciparum. Cependant, aucune fonction n'a été associée à cette protéine hypothétique.5 De préférence, les polynucléotides visés par l'invention ont une séquence choisie parmi le groupe consistant en : (a) SEQ ID NO. 3, (b) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec (a), 5 (c) Une sous-séquence de (a) avec une longueur minimum de 30 acides nucléiques. SEQ ID NO. 3 correspond au fragment de séquence nucléotidique étudié par les inventeurs et mis en oeuvre lors de la 10 réalisation d'un mode particulier de l'invention (voir l'exemple 1). Cette séquence code pour une protéine désignée sous l'appellation NP561 par les inventeurs. L'invention vise également les polypeptides correspondant aux 15 polynucléotides susmentionnés et plus particulièrement, les polypeptides isolés ou purifiés codés par les polynucléotides ci-avant, ainsi que les polypeptides isolés ou purifiés comprenant une séquence choisie parmi le groupe consistant en : 20 (a) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO. 2, (b) Une sous-séquence de (a) ou (b) avec une longueur minimum de 10 acides aminés, à l'exception de la séquence SEQ ID NO. 2. 25 La séquence SEQ ID NO.2 correspond donc à la séquence peptidique de la protéine hypothétique PFI1785w , tandis que la séquence SEQ ID NO. 4 décrite ci-après correspond à celle de la protéine NP561. De préférence, les polypeptides ont une séquence choisie parmi le groupe consistant en : (a) SEQ ID NO. 4, (b) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec (a), 30 (c) Une sous-séquence de (a) ou (b) avec une longueur minimum de 10 acides aminés. L'invention couvre également les polypeptides recombinants ou 5 chimériques comportant au moins un polypeptide selon l'invention. Par polypeptides selon l'invention , on entend les polypeptides mentionnés ci-dessus, éventuellement sous une 10 forme recombinante ou chimérique, y compris la séquence SEQ ID NO. 2. De même, par polynucléotides selon l'invention , on entend les polynucléotides mentionnés ci-dessus, y compris la 15 séquence SEQ ID NO. 1. Les polypeptides et les polynucléotides selon l'invention sont particulièrement adéquats pour une utilisation comme médicaments. En effet, les polypeptides selon l'invention 20 constituent des antigènes du paludisme gestationnel. De même, les polynucléotides codent pour des protéines antigéniques de ce paludisme spécifique. A ce titre, ils peuvent être utilisés comme tels ou sous une forme modifiée en tant que vaccin. 25 Une modification appropriée des polypeptides selon l'invention est la réalisation de conjugués. Ceux-ci comportent au moins un polypeptide selon l'invention, lié(s) à un support. Les conjugués peuvent être obtenus par couplage via une 30 liaison covalente entre un polypeptide et un support physiologiquement acceptable, non toxique, naturel ou synthétique, susceptible par exemple d'accroître le caractère immunogène dudit polypeptide. Concernant les conjugués, on citera à titre d'exemple, la demande WO 2006/124712, qui décrit des méthodes de préparation de conjugués comportant une pluralité de peptides antigéniques de P. falciparum liés à une protéine support améliorant l'immunogénicité desdits antigènes. Les supports préférés selon l'invention sont choisis parmi les particules virales, des lipides, par exemple des lipides de type C16-C18, les polylysines, les poly(DL-alanine)-poly(- Lysine)s, la nitrocellulose, les microparticules de polystyrène, les microparticules de billes de latex, les polymères biodégradables, les microparticules de polyphosphoglycanes, les protéines supports telles que l'OPMC (outer membrane protein complex of Neisseria meningitidis) ou l'OPMC amélioré, la BSA (bovine serum albumin), le TT (tetanus toxoid), l'ovalbumine, la KLH (keyhole limpet hemocyanin), la THY (bovine thyroglobulin), l'HbSAg et l'HBcAg du virus de l'hépatite B, les protéines capsides rotavirus, la protéine L1 du virus papillome humain, la VLP (virus like particle) de type 6, 11 et 16, le tuberculin PPD (purified protein derivative)... L'invention vise également un vecteur de clonage ou d'expression comprenant au moins une séquence polynucléotidique selon l'invention. Les vecteurs visés par l'invention peuvent être des phages, des plasmides, des cosmides, des virus. Le vecteur selon l'invention peut comporter avantageusement un promoteur et/ou un élément de régulation de l'expression dans la cellule hôte. En particulier, les vecteurs pourront comporter des séquences capables d'augmenter l'immunogénicité des polynucléotides et polypeptides selon l'invention, par exemple des séquences CpG, le gène du GMCSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) ou des gènes des cytokines ou de chemokines. Les cellules hôtes transformées (ou recombinantes) comprenant au moins un polynucléotide ou vecteur selon l'invention entrent également dans le champ de l'invention. Ces cellules peuvent être choisies parmi les bactéries, les levures, les cellules d'insectes ou de mammifères. Les conjugués et les vecteurs de clonage selon l'invention peuvent être avantageusement utilisés comme médicaments, notamment dans des compositions immunogènes ou des vaccins. En effet, le vecteur de clonage peut être utilisé comme médicament dans le cadre d'une vaccination par ADN. Il est en effet connu que l'injection d'ADN (nu ou inséré dans un vecteur) dans l'organisme peut permettre l'expression des protéines correspondantes et conduire à une réponse immunitaire. Dans ce cas, les polynucléotides selon l'invention peuvent être avantageusement insérés dans un plasmide de type DNA-CSP, Nyvac pf7, VR1020, VR1012... L'invention propose en effet des compositions immunogènes, pharmaceutiques ou des vaccins contre le paludisme gestationnel comprenant au moins un élément choisi parmi les polynucléotides, les polypeptides, les conjugués ou les vecteurs selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Les compositions immunogènes et les vaccins peuvent avantageusement être utilisés pour immuniser des animaux aux fins d'obtention d'anticorps, ou pour immuniser des êtres humains dans le cadre d'une thérapie préventive du paludisme gestationnel. Selon un mode de réalisation préférentiel, la composition ou le vaccin peut être adjuvé par un ou plusieurs adjuvants utilisés en combinaison. Des adjuvants classiques tels que le Montanide et/ou l'Alum peuvent être utilisés. Cependant, d'autres adjuvants tels que QS21, SBAS2, MF59, mLT, PHL, CpG DNA, phosphate de calcium, sulfate de calcium déshydraté, PLG, CT, LTB, CT/LT, AS02A sont également appropriés. Les compositions immunogènes et vaccins selon l'invention peuvent comporter en outre au moins un antigène spécifique de P. falciparum choisi parmi var2csa, antigènes des stades préérythrocytaires (CSP, TRAP, LSA-1, LSA-3, SALSA, STARP, EXP-1), érythrocytaires asexués (MSP-1, MSP-3, AMA-1, EBA-175, GLURP, MSP-2, MSP-4, MSP-5, RAP-2, RESA, SERA, PfEMP-1, toxine GPI synthétique) ou sexués (PfS25). De préférence, la composition immunogène ou le vaccin peut être formulé pour être administré par voie intradermique ou intramusculaire. Dans ce cas, une posologie avantageuse est de 1 à 100pg d'immunogène par injection, de préférence 5 à 50pg. L'invention propose également des anticorps monoclonaux, polyclonaux ou des anti-sera reconnaissant spécifiquement au moins un des polypeptides et/ou des conjugués selon l'invention. Avantageusement, ces anticorps seront des anticorps recombinants, humanisés ou chimérisés, en particulier lorsque ceux-ci seront utilisés comme médicaments, dans le cadre, par exemple, d'une immunothérapie passive du paludisme gestationnel. L'invention couvre en particulier l'utilisation d'au moins un élément choisi parmi les polynucléotides, les polypeptides, les conjugués, les vecteurs, les anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du paludisme placentaire. Elle propose également des méthodes de diagnostic in vitro du 5 paludisme placentaire chez une femme susceptible d'être infectée par P. falciparum. Selon une première méthode, celle-ci comprend les étapes suivantes : 10 a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez la femme susceptible d'être infectée, avec un anticorps selon l'invention, afin de permettre la formation de complexe immuns ; et, 15 b) la détection desdits complexes immuns potentiellement formés. Un kit de diagnostic pouvant avantageusement être utilisé dans le cadre de la méthode ci-avant, est également proposé. Il 20 comprend les éléments suivants : - au moins un anticorps selon l'invention, - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps, et, 25 - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite liaison, ces réactifs pouvant porter un marqueur susceptible d'être reconnu par un second réactif de détection. 30 Selon une méthode alternative, la méthode de diagnostic comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez la femme susceptible d'être infectée, avec au moins un élément choisi parmi les polypeptides, les conjugués selon l'invention, afin de permettre la formation de complexe immuns avec les anticorps éventuellement présents dans ledit tissu et/ou ledit fluide biologique; et, b) la détection desdits complexes immuns potentiellement formés. Enfin, l'invention couvre également les séquences polynucléotidiques et polypeptidiques des protéines PFA0700c (SEQ ID No. 5 et 6), PF140757 (SEQ ID No. 7 et 8), PFB0105c (SEQ ID No. 9 et 10), PF10_0351 (SEQ ID No. 11 et 12) et PF10 0350 (SEQ ID No. 13 et 14), leurs séquences homologues et leurs applications comme médicament dans le traitement du paludisme gestationnel. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description faite ci-après en référence aux dessins annexés. La figure 1 est relative aux caractéristiques de transcription des isolats placentaires. Les points indiquent le log2 du ratio des log de l'expression (M) et de l'intensité moyenne (A) pour chaque groupe d'isolats en comparaison avec le contrôle (souche 3D7). Seules les données statistiquement significatives selon la correction de Bonferroni sont indiquées. Un unique gène var dominant (var2csa) a été détecté dans les isolats placentaires de tous les groupes examinés (points rouges). Les gènes surexprimé ou sous régulés sont indiqués en noir quand la même différence est présente dans les trois groupes, en vert quand celle-ci est présente dans 2 groupes sur 3 (2/3) et en bleu quand celle-ci est présente dans 1 groupe sur 3 (1/3). La figure 2 présente les niveaux de transcription des gènes identifiés dans P. falciparum. Sont indiqués, sur le panneau de droite, les niveaux de transcription par 22 parasites isolés de placentas de femmes présentant un paludisme gestationnel (PW), 9 parasites issus d'enfants asymptomatiques (C) de moyenne d'âge 12 ans et 4 parasites de femmes symptomatiques non enceintes (NPW) vivant dans la même région. Sur le panneau de gauche, sont indiqués les niveaux de transcription des souches in vitro de P. falciparum 3D7 (losanges noirs), FCR3 (triangles rouges), Hb3 (losanges jaunes) et NF54 (carrés verts). Chacune de ces 4 souches a été utilisée après sélection ou non sélection par la liaison CSA en utilisant de la CSA soluble (3D7), des cellules BeWo (FCR3 et Hb3) ou des IgGs anti-VAR2CSA (NF54). La figure 3 illustre la reconnaissance par test ELISA, de NP561 par des sera d'individus exposés au paludisme. Le test ELISA a été mené sur des plaques couvertes par les protéines NP561, DBL5ùE de VAR2CSA et GLURP. Les niveaux d'IgG, exprimés en densité optique, sont présentés pour des hommes Ghanéens exposés (n=30) et des femmes enceintes (n=30). Les lignes hautes, basses et au milieu des bâtons correspondent au 75ième centile, 25ième centile et 50ième centile (médiane) respectivement. Les marques supérieures et inférieures s'étendent jusqu'au 90leme et au 101eme centile. Les concentrations plasmatiques d'IgG anti-VAR2CSA et anti-NP561 sont significativement plus élevées chez la femme enceinte. La figure 4 décrit la réactivité détectée par immunoblot, d'IgG anti-NP561 de lapin vis-à-vis de lysats SDS d'érythrocytes infectés par P. falciparum (PI : isolat placentaire, Ch : isolat d'enfant). Les flèches indiquent la taille attendue de la protéine correspondant à PFI1785w. La figure 5 présente une analyse par cytométrie en flux et microscopie confocale d'érythrocytes marqués avec l'IgG anti-NP561 ou avec un anticorps de contrôle non pertinent. (A) Marquage de globules rouges non infectés avec l'IgG anti-NP561 et contrôle du PBS-FCS sur les parasites placentaires. (B) Marquage des parasites placentaires avec l'IgG anti-NP561 (ligne verte) et comparaison avec le contrôle négatif (PBS contenant 10% de FCS). (C) Microscopie confocale d'un érythrocyte placentaire infecté marqué avec un anticorps anti- NP561. Exemple 1 : Identification de nouveaux gènes présentant une spécificité pour le tropisme placentaire Matériels et méthodes Patients, collecte d'échantillons et conservation. Les échantillons ont été collectés en Novembre 2003 à Guediawaye, dans la banlieue de Dakar, Sénégal. Les directives sur les expérimentations humaines des gouvernements français et sénégalais ont été suivies. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique du Ministère de la Santé, Sénégal. La nature du projet a été expliquée aux femmes et leur consentement éclairé a été obtenu par oral. Des femmes enceintes ont été admises pour l'accouchement et celles dont les tests par frottis épais sanguin et/ou par immuno-chromatographie étaient positifs pour P.falciparum, ont été enrôlées. Des femmes non enceintes qui présentaient de la fièvre et dont le frottis sanguin était positif pour P.falciparum, ont également été enrôlées en tant que contrôle. Les données cliniques ont été enregistrées et 10mL de sang périphérique ont été collectés dans de l'héparine sodique. Les globules rouges du sang périphérique ont été lavés 3 fois et incubés dans un milieu RPMI à 37 C dans une cloche à bougie (atmosphère microaérophile) pendant 18-20h permettant la maturation des stades anneaux en trophozoïtes. A l'accouchement, un frottis sanguin épais a été préparé pour un examen microscopique à partir d'appositions réalisées sur le placenta. Les érythrocytes infectés par P.falciparum ont été isolés des placentas positifs par perfusion desdits placentas avec 0,1% d'héparine sodique dans du PBS (solution saline de tampon phosphate). Les parasites ont été conservés dans du Trizol (Invitrogen) et entreposé à -80 C ou ont été déposés sur papier Whatman, séchés et entreposés à température ambiante, jusqu'aux extractions d'ARN et d'ADN. Le plasma a été séparé du sang périphérique et entreposé à -20 C jusqu'à utilisation. Durant la même période, des échantillons de sang veineux ont été collectés à partir d'enfants infectés ne présentant pas de symptômes, et ceci dans le cadre d'une étude transversale menée en parallèle dans les environs de Thiès, au Sénégal. Les échantillons ont été collectés selon les mêmes protocoles ci-avant décrits. Tests de cytoadhésion. De la CSA bovine (Sigma) et des protéoglycanes à chondroïtine sulfate (CSPG) humaines ont été déposés sous forme de tâches circulaires dans des boîtes de Pétri de type Falcon (Becton Dickinson) et le niveau d'adhésion à la CSA et au CSPG des parasites placentaires a été quantifié selon le nombre d'érythrocytes infectés observé par millimètre carré, estimé par l'examen de 20 champs au microscope fort grossissement (20 fois). Culture des parasites et sélection de phénotypes particuliers. Les souches de P.falciparum ont été cultivées selon les protocoles précédemment décrits (Trager et Jensen, 1976). La souche 3D7 a été synchronisée au sorbitol 4 fois avec un intervalle de 8 heures afin d'obtenir des stades de développement particulièrement bien synchronisées. Les souches FCR3 et HB3 ont été sélectionnées en fonction de leur adhésion au CD36 ou aux cellules Bewo. La souche NF54 a été sélectionnée à l'aide d'anticorps spécifiques de la protéine PfEMP1 codée par le gène var2csa. La souche 3D7 a également été sélectionnée selon son adhésion à la CSA immobilisée. Après sélection, les parasites ont été cultivés durant 5 à 6 cycles pour générer une densité de parasites suffisante. L'enrichissement en cellules matures est effectué par purification Macs telle que décrit précédemment (Staalsoe et al., 1999). Les parasites sont autorisés à contaminer une nouvelle fois de nouveaux globules rouges et sont ensuite récupérés à 18, 36 et 44h après l'invasion. La reconnaissance sexospécifique des parasites sélectionnés a été mesurée par cytométrie en flux en utilisant des échantillons de plasma issus de femmes enceintes et d'hommes adultes originaires de zone endémique, ainsi que des échantillons de volontaires danois non immuns (contrôle). Extractions ADN et ARN totaux. L'ADN génomique a été extrait des dépôts sur papier Whatman à l'aide de la procédure Chelex (Plowe et al., 1995). L'ARN total issu d'érythrocytes infectés de placenta et de sang périphérique mature, contenant des parasites aux stades trophozoïtes/schizontes, a été préparé avec du Trizol. La qualité de l'ARN a été vérifiée avec le Bioanalyseur Agilent 2100. Génotypage msp-2. Les parasites ont été génotypés par analyse du domaine central de msp-2. L'amplification par PCR a été menée comme décrit précédemment (Jafary et al., 2004) en utilisant les amorces fw (SEQ ID No. 15) :5'-GAAGGTAATTAAAACATTGTC-3' (5' étant marqué à la fluorescéine) et rv (SEQ ID No. 16) : 5'-GACACCTCGTCGTTGTAGGGAG-3'. Les produits d'amplification sont passés à l'analyseur ABI Prism 310 Genetic (Perkin Elmer Applied Biosystems) pour énumérer et quantifier les fragments fluorescents. Biopuces. Les biopuces utilisées dans cette étude sont décrites dans Ralph et al., 2005. En résumé, la bibliothèque d'oligonucléotides comporte 8870 70-mers provenant du Malaria Oligo Set (Qiagen-Operon) et des oligonucléotides personnalisés, couvrant la plupart des gènes de P.falciparum. Des échantillons d'ARN de 18 femmes ont été assemblés en trois groupes et le contrôle (3D7) constitué d'un mélange de différents stades de développement des parasites a été préparé (tableau 1). L'intégrité des transcrits d'ARN de chaque échantillon a été vérifiée avec le Bioanalyseur Agilent 2100. Le marquage et l'hybridation des échantillons d'ARN ont été réalisés selon des protocoles décrits précédemment (Ralph et al., 2005). Tableau 1 % anneaux % trophozoïtes % schizontes nombre d'isolats groupe 1 25 3 groupe 2 25 70 7 groupe 3 95 8 contrôle 10 45 45 Données relatives aux isolats placentaires et 3D7 examinées par biopuces : 20 pourcentage de l'état de développement de chaque parasite en fonction du groupe d'ARN Pour chaque ensemble de parasites placentaires, une inversion des marqueurs (dye-swap) a été réalisée sur deux répétitions 25 techniques et deux répétitions biologiques afin de compenser l'effet des marqueurs et pour vérifier la reproductibilité technique et biologique, fournissant ainsi quatre lames hybridées. Chaque répétition biologique a été analysée séparément en utilisant la fonction R (The R project) et le 30 kit Bioconductor package (Gentleman et al., 2004) comme décrit précédemment (Ralph et al., 2005). Après normalisation, un test t de Student apparié a été utilisé pour vérifier les points exprimés différentiellement et les valeurs de p ont ensuite été corrigées à l'aide de la méthode Bonferroni avec une erreur de type 1 de 0,05. Tous les loge des ratios des intensités de fluorescence sont présentés de la manière suivante : ensemble des parasites placentaires versus ensemble contrôle 3D7. Elaboration des amorces et rt-PCR quantitative en temps réel. Les gènes qui ont été exprimés différentiellement in vivo sont comparés à l'expression d'un contrôle (souche in vitro 3D7), ce contrôle étant composé d'un mélange de parasites différents stades de développement mimant la distribution des isolats. Pour les 19 gènes sélectionnés en premier lieu en fonction du taux des produits de transcription (tableau 2), des sondes pour PCR en temps réel spécifiques des gènes ont été élaborées à partir des séquences de la lignée 3D7. L'efficacité de l'amplification spécifique par les amorces a été testée sur des dilutions en série d'ADNg de 3 isolats de laboratoire (3D7, FCR3 et HB3) et 3 isolats de terrains différents. La spécificité a ensuite été confirmée par analyse de la courbe de dénaturation thermique et électrophorèse sur gel d'agarose. Les sondes spécifiques de var2csa précédemment décrites ont été utilisées (Tuikue Ndam et al., 2005). Tableau 2 Fréquence 1/ 3 2/ 3 3/3 Sur/sous régulation sur sous sur sous sur sous _ Oligos 178 243 25 29 43 21 Gènes 146 217 18 28 19 16 Protéine 94 138 7 18 7 8 hypothétique Nombre total de gènes qui sont exprimés différentiellement dans des isolats de parasites in vivo en comparaison avec le contrôle in vitro 3D7 composé de mélange similaire de parasites à différents stades de développement. Le nombre d'oligonucléotides utilisés et le nombre de gènes codant pour des protéines hypothétiques sont également indiqués. Pour la PCR en temps réel, l'extraction d'ARN en trizol est suivie par un traitement de 15 min par la DNase 1 (Sigma) à 37 C. L'absence de contaminant ADN dans la préparation a été vérifiée à l'aide de 40 cycles de PCR en temps réel en utilisant des amorces spécifique d'un gène domestique conservé (fructose-biphosphate aldolase). L'ARN libre d'ADN a été transcrit par transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires avec l'enzyme Superscript II (Invitrogen) à 25 C pendant 10 min, puis à 42 C pendant 50 min suivi d'un cycle à 70 C pendant 15 min. La PCR quantitative en temps réel a été réalisée sur de l'ADNc en utilisant le système Rotorgene thermocycler (Corbett Research) (Salanti et al., 2003). Les réactions ont été faites dans des volumes de 20 pL en utilisant Quantitect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) et 0,5 mM d'amorces (Salanti et al., 2003). L'analyse quantitative du niveau de gène a été effectuée à l'aide du logiciel Rotorgene version 4.6. Les taux des produits de transcription ont été comparés à l'aide des valeurs de ACtcalculées en utilisant le niveau de transcription du gène fructose-biphosphate aldolase comme contrôle endogène. Les différences entre les groupes d'échantillons étudiés par rt-PCR en temps réel ont été vérifiées par un test non paramétrique (test de la somme des rangs de deux échantillons de Mann-Whitney ou test des rangs appliqués au cas d'échantillons appariés de Wilcoxon). Les corrélations ont été vérifiées par le test de la somme des rangs de Spearman. La limite significative est était P=0,05. Le logiciel STATA (version 7.0, STATA Corporation) a été utilisé. Protéines recombinantes et immunisation. La protéine prédite par PlasmoDB codée par le gène PFI1785w du génome du clone 3D7 de P. falciparum, a été sélectionnée pour être exprimée en tant que protéine soluble. Le produit de ce gène est une protéine de 332 acides aminés avec un domaine transmembranaire s'étendant de l'acide aminé 41 à l'acide aminé 69 et un motif pexel localisé entre les acides aminés 86 et 92. Après exclusion du domaine transmembranaire, la séquence allant de la paire de bases 391 à la paire de bases 967 est amplifiée à partir de l'ADNg de 3D7 en utilisant les amorces suivantes, qui incluent les sites de restriction EcoRl et Not1 en 5' et en 3' respectivement : Fw (SEQ ID No. 17) : cggaattcCAATCAAGATATAATAGATCA ; Rv (SEQ ID No. 18): atttgcggccgcCGGTTTTACCCTTATAATG. L'insert est cloné dans le plasmide pGEX-4T-1 (Amersham Biosciences, Danemark) pour la production de protéine recombinante glutathion S-transférase-marquée dans la souche Escherichia coli BL21. La même séquence est également sous-clonée dans les sites de restriction Notl et EcoRl du vecteur pBAD-TOPO conçu au laboratoire (Barfod et al., 2006) et les protéines recombinantes sont produites dans des cellules d'insectes infectées avec le baculovirus et sont ensuite purifiées comme décrit précédemment (Salanti et al., 2004). La protéine recombinante purifiée appelée NP561, correspondant environ à 70% de la taille complète de la protéine PFI1785w, a été utilisée comme immunogène dans cette étude. Des anticorps de lapin spécifiques ont été induits comme décrit précédemment (Salanti et al., 2004) et purifiée par affinité à l'aide de colonne où a été fixée le recombinant NP561. En bref, NP561 a été couplée de manière covalente via des groupes amines primaires à une colonne HiTrapTM NHS-activé sépharose et les anticorps de lapin ont été purifiés selon les instructions du fabricant. Dosage d'anticorps plasmatiques vis-à-vis de NP561 par test ELISA. Les niveaux plasmatiques d'IgG spécifiques de P. falciparum ont été mesurés par test ELISA utilisant les protéines recombinantes VAR2CSA et NP561 comme antigènes. La protéine recombinante GLURP a été utilisée comme antigène de contrôle. Les niveaux d'anticorps sont exprimés en valeur de densité optique (OD). Caractérisation des anticorps par immunodétection par 20 transfert électrophorétique (Immunoblot). Les échantillons utilisés dans cette étude ont été collectés à l'hôpital de district de Korogwe, en Tanzanie, en Juin 2006, en suivant les mêmes protocoles que ceux décrit ci-avant. Après maturation des parasites isolés du sang périphérique 25 d'enfants, les érythrocytes infectés par des parasites de stades schizontes ou trophozoites tardifs sont enrichis par purification sur colonne magnétique (Macs) (Staalsoe et al., 1999). Des extraits protéiques d'érythrocytes infectés ont été préparés dans du PBS comportant 2% de SDS et un inhibiteur 30 complet de protéases (Roche, Bâle, Suisse). Les protéines issues des isolats ont été révélées à l'aide de gels pré- coulés NuPAGE à gradient 4-12% en SDS (Invitrogen, Tàstrup, Danemark) avec un tampon de migration NuPAGE MOPS SDS (Invitrogen) en utilisant des marqueurs colorés de poids moléculaires à large spectre (BioRad, Herlev, Danemark). Après électrotransfert à sec sur membrane polyvinylidène difluorure (PVDF) en présence d'un tampon comportant 20% de méthanol, 25mM de Tris et 192 mM de glycine à un pH de 8,4, les membranes sont bloquées avec 5% de lait demi-écrémé en poudre diluée dans un tampon TBS-T. Les membranes sont incubées avec les anticorps de lapin dirigés contre NP561 ou contre une protéine PfEMP1 VAR4, obtenue avant et après purification par affinité, cette incubation étant suivie par une deuxième incubation avec un deuxième anticorps conjugué à la peroxydase et dirigé contre les IgG de lapin (Sigma, MO, USA) et révélé à l'aide d'une solution de 3-amino-9-éthylcarbazole. Dosage d'immunofluorescence et cytométrie de flux. Les anticorps polyclonaux dirigés contre NP561 sont purifiés par affinité à partir de sérums de lapins hyperimmuns et d'un groupe d'échantillons de plasma issus de femmes souffrant d'infection placentaire et leur réactivité a été testée sur la surface d'érythrocytes infectés matures issus d'isolats d'enfant et d'isolats placentaires de Tanzanie. La réactivité des anticorps avec la surface d'érythrocytes infectés en phase liquide a été ensuite vérifiée par microscopie confocale, à l'aide d'un microscope LSM5 (Carl Zeiss Microlmagining, Inc.) (Salanti et al., 2004). Les anticorps purifiés ont également été étudiés par cytométrie en flux (Staalsoe et al., 1999) en fonction de la réactivité des IgG avec la surface d'érythrocytes infectés intacts et non-immobilisés, isolés à partir de placenta et de sang périphérique d'un enfant de Tanzanie.30 Résultats Identification de gènes transcrits différentiellement dans les parasites PAM et comparaison avec le contrôle 3D7. Afin d'évaluer l'équilibre dynamique des niveaux d'expression des ARNm de P. falciparum infectant des femmes enceintes, des parasites ont été collectés à partir de placentas de femmes accouchant au Sénégal, comme décrit précédemment (Tuikue Ndam et al., 2005). Des examens microscopiques ont montré la prédominance de globules rouges infectés par des stades tardifs dans tous les isolats, avec des stades anneaux précoces représentant généralement moins de 5% de la population totale. A cause de la distribution variable des stades tardifs (trophozoites et schizontes) dans les différents isolats, les échantillons ont été séparés en trois groupes comme indiqués dans le tableau 1. L'ARN total a été isolé individuellement de chaque échantillon. Les ARN correspondant à tous les échantillons d'un même groupe ont été regroupés en mélangeant des quantités égales d'ARN. De manière similaire, les ARN issus de différents stades de développement de la souche 3D7 ont été regroupés pour mimer la distribution des stades dans les isolats placentaires. Les groupements d'échantillons d'ARN ont été marqués par fluorescence et soumis à hybridation avec un réseau d'oligonucléotides haute densité (Ralph et al., 2005). Pour chaque groupement de parasites placentaires, une inversion des marqueurs est réalisée. La méthode de Bonferroni, la plus stringente, a montré que 183 gènes étaient surexprimés dans les parasites placentaires et 261 gènes étaient sous-exprimés. Parmi les gènes surexprimés dans les parasites PAM, 99 appartiennent au groupe 1, 67 au groupe 2 et 85 au groupe 3. La majorité de ces gènes (108 sur 183) correspond à des protéines hypothétiques. 20 d'entre eux comportent un motif pexel. En dépit des différences de distribution des stades tardifs de développement des parasites entre les 3 groupes d'échantillons d'ARN, certains gènes présentent de manière constante le même profil d'expression différentielle dans les trois groupes (surexprimés N = 18 ; sous-exprimés N = 16). Ces gènes étaient généralement ceux présentant les transcrits les plus abondants, détectés à la fois dans les échantillons analysés et dans le contrôle 3D7. Pour certains transcrits, l'expression différentielle a été détectée dans deux des trois groupes (surexprimés N = 20 ; sous-exprimés N = 30). Cependant, la présente analyse a démontré que bien que d'autres gènes var aient été également détectés (notamment varCS2), var2csa était le transcrit prédominant surexprimé dans les trois groupes. Comme exemplifié par la transcription spécifique et cohérente de var2csa, les gènes qui sont surexprimés dans plus d'un groupe, sont plus susceptibles d'être associés avec des éléments biologiques avantageux présents spécifiquement dans les parasites étudiés. Ces gènes (surexprimés N = 38 ; sous-exprimés N = 46) sont présentés dans le tableau 2. Pour un grand nombre de gènes identifiés (PAM-surexprimés N = 153 ; 3D7-surexprimés N = 234), une différence significative a seulement été observé pour un groupe (Fig. 1). La plupart des différences observées dans cette catégorie rend peut être compte d'un regroupement des expressions entre les différents stades de développement, favorisé par le contrôle utilisé, étant donné que de nombreux gènes surexprimés dans le PAM ont été trouvés dans le groupe 1 (prédominance de trophozoites) alors que la plupart des gènes surexprimés dans 3D7 ont été identifiés dans le groupe 3 (schizontes), leur profil d'expression pouvant aussi présenter une certaine spécificité aux procédés biologiques in vivo et in vitro. Par exemple, la surexpression spécifique par des parasites placentaires de gènes codant pour des antigènes asexués tels que AMA1, MSP1, MSP3, MSP5, MSP6, EBA140 qui sont supposés être impliqués dans l'invasion des globules rouges, tombe dans cette catégorie. Validation des résultats sur biopuces par PCR en temps réel Afin de confirmer la pertinence des résultats sur biopuces, la quantification relative des ARN correspondant aux 19 gènes exprimés différentiellement avec des variations de niveau tels qu'estimés par le réseau d'oligonucléotides, a été effectuée. Les gènes ont été choisis à partir de l'abondance de leur transcrits, qui varie de forte à faible. Des critères additionnels comprennent : i) être surexprimé de manière constante sur 2 des 3 groupes, ii) comporter au moins un motif TM, pexel et/ou séquence 15 signal, iii) être également présent dans une autre analyse par biopuce utilisant des isolats du laboratoire sélectionnés pour leur phénotype spécifique. Les gènes surexprimés dans les parasites PAM ont été 20 hiérarchisés (voir tableau 2). Une PCR en temps réel a été réalisée sur des cDNA synthétisés à partir des ARN totaux de chaque groupe d'échantillons et à partir de chaque échantillon individuel de parasite compris dans le groupe. Dans l'ensemble, la PCR en temps réel a confirmé les données 25 obtenues sur les biopuces, puisqu'une bonne corrélation entre les résultats a été obtenue. Test de corrélation de Spearman après transformation logarithmique des données : r=0,78, p Pour tous les gènes se regroupant dans la première catégorie sauf var2csa, la transcription spécifique ne peut être associée avec des propriétés de liaison à la CSA présentées par les lignées parasites sélectionnées in vitro au laboratoire (Fig. 2, panneau de droite). Cependant, un gène, PFI1785w, codant pour une protéine hypothétique présente un profil clairement spécifique de PAM, similaire à celui de var2csa. De manière surprenante, aucune différence n'a été observée dans les différentes lignées in vitro adaptées au laboratoire sélectionnées pour leurs phénotypes spécifiques de liaison, contrairement à var2csa (Fig. 2, panneau de droite). PFI1785w code pour une protéine de 39,4 kD dont il est prédit qu'elle exprime une molécule unique comportant un domaine TM et une séquence pexel qui dirige la protéine vers l'export. Il est également prédit que la protéine a une expression de surface avec un domaine N-terminal court. La surexpression spécifique de ce gène par des isolats placentaires et non par des parasites non-PAM, ni par des lignées de laboratoire in vitro sélectionnées pour leur adhérence à la CSA, soulève un intérêt particulier pour une caractérisation plus poussée. D'un autre côté, un profil spécifique clair et opposé a été observé pour PF10 0350, qui est fortement transcrit dans des parasites non-PAM par rapport aux parasites placentaires. Le produit de ce gène est prédit comme ayant une expression de surface, puisqu'il possède un domaine transmembranaire, mais aucun motif pexel qui vise un ciblage à la surface des globules rouges. Discussion De nombreuses études ont permis de prouver le caractère unique des propriétés antigéniques et de liaison des érythrocytes infectés par P. falciparum issus de placentas. Une étude antérieure des antigènes variants de surface du parasite a désigné les variants PfEMP1 comme le médiateur majeur des propriétés de variation antigénique et d'adhésion des érythrocytes infectés. En particulier, Tuikue Ndam et al., 2005 a démontré que VAR2CSA PfEMP1 est responsable de la liaison à la CSA des érythrocytes infectés provenant du placenta. La présente étude a identifié des différences dans l'expression des gènes en comparaison avec les parasites de la souche contrôle de laboratoire 3D7, en utilisant une analyse par biopuce de l'intégralité du génome des parasites placentaires P. falciparum. Cette approche a démontré la surexpression d'un large nombre de gènes par les parasites placentaires, qui au côté de var2csa, comporte des gènes considérés comme susceptibles de coder pour des protéines de surface pouvant jouer un rôle dans le processus biologique associé au tropisme placentaire des parasites. Pour cette première étude complète du génome des parasites placentaires fraichement collectés in vivo, les erreurs potentielles dues à la sélection des parasites par l'hôte, aux stades de développement des parasites et à l'expression de l'ARN, ont été minimisées grâce à (1) l'échantillonnage de patients du même groupe ethnique, vivant dans la même zone géographique et ayant le même type de maladie (infection placentaire), (2) le regroupement d'échantillons selon une distribution relative au stade de développement du parasite, l'analyse de parasites homogènes étant plus riche d'informations en regard des propriétés communément partagées. Ceci a permis l'identification de gènes impliqués dans des processus biologiques communs à tous les parasites se liant à la CSA et se développant préférentiellement dans le placenta. La fenêtre des gènes transcrits différentiellement est réduite dramatiquement à 38 et 46 gènes surexprimés ou réprimés respectivement dans les parasites placentaires lorsqu'un critère additionnel (des observations similaires dans au moins deux des trois groupes testés) est considéré. Comme var2csa pour lequel la surexpression était visible dans les trois groupes d'échantillons, le processus biologique peut être commun à des stades contigus de développement du parasite et ce malgré les différences dans l'expression des gènes selon ces stades, comme indiqué par Daily et al., 2005. Ceci suggère que ces gènes identifiés dans plus d'un unique groupe sont susceptibles d'être les plus pertinents pour contrôler le tropisme placentaire en général (tableau 2). Les transcrits représentant différentes protéines hypothétiques sont différentiellement abondants dans les isolats et dans les cultures in vitro de parasites 3D7. Des études plus poussées sur la localisation du produit de ces gènes et l'identification de ceux ciblés par les réponses immunitaires méritent une attention particulière. Plusieurs de ces protéines possèdent des motifs prédits pour contrôler leur exportation en dehors du parasite et dans le globule rouge (Marti et al., 2004). On citera à titre d'exemple, les gènes PFI1785w, PFA0700c, PF14_0757 et PF10 0351 (tableau 2). Il est intéressant de noter que la transcription de certain de ces gènes dans les isolats collectés sur des sujets infectés diffère également selon l'évolution de la maladie, suggérant qu'ils jouent un rôle potentiel dans le développement clinique du paludisme (Fig. 2). Exemple 2 : Etude du gène PFI1785w Caractérisation immunologique du produit du gène PFI1785w Une partie de la protéine codée par PFI1785w a été exprimée dans des cellules d'insecte sf9 infectées par un baculovirus recombinant comportant la séquence du gène PFI1785w, et le produit (NP561) a été purifié en tant que protéine avec une queue histidine sécrétée. NP561 a été reconnu dans des tests ELISA par des échantillons de sérum provenant d'individus vivant dans des zones endémiques (Ghana). Les sérums de femmes enceintes infectées présentent un niveau significativement plus élevé d'anticorps dirigés contre NP561 comparés aux sérums d'hommes de la même région du Ghana (p = 0,04). La reconnaissance d'une autre protéine recombinante de parasite (GLURP) a également été mesurée et aucune différence significative n'a été observée entre les deux types de sérums vis-à-vis de cette protéine (Fig. 3). L'expression de PFI1785w est associée au phénotype PAM Afin de déterminer la localisation de PFI1785w dans les érythrocytes matures infectés par des schizontes, des antisérums de lapin spécifiques dirigés contre NP561 (sous forme de protéine recombinante exprimée en système baculovirus) ont été préparés. Ils ont été utilisés dans des analyses d'immunoblot et des dosages par immunofluorescence (IFA). Des contrôles ont été effectués à partir d'antisérums de lapin dirigés contre d'autres PfEMP1 caractérisées précédemment, contre des érythrocytes non infectés, des érythrocytes infectés avec des souches de laboratoires et des érythrocytes frais infectés issus d'enfants. Une bande protéique d'environ 40 kD, correspondant à la taille attendue, a été détectée spécifiquement par immunoblot sur des lysats de parasites placentaires (Fig. 4). Par cytométrie en flux, les anticorps de lapin spécifiques de NP561 recombinant ont été capables de marquer spécifiquement la surface de globules rouges parasités issus de placenta mais pas celle des globules rouges infectés par des souches de parasites de laboratoire ou celle des érythrocytes infectés provenant d'enfants (Fig. 5). La localisation en surface de la protéine correspondant à PFI1785w est clairement démontrée par microscopie confocale après IFA. La protéine est localisée spécifiquement à la surface des érythrocytes infectés issus de placenta. Discussion PFI1785w présente un profil clairement défini, similaire à celui de var2csa, suggérant sa spécificité à PAM. Cependant, aucune preuve d'une éventuelle relation à un phénotype de liaison à la CSA n'a été observée dans les lignées de parasite sélectionnées in vitro biologiquement pour une liaison à la CSA. Bien que les propriétés de liaison à la CSA représentent un phénotype spécifique majeur des parasites PAM, il semble toutefois que toutes les caractéristiques des parasites responsables de PAM ne puissent être reproduites dans des lignées de parasites adaptées au laboratoire. Malgré l'avis largement accepté de l'importance de la cytoadhésion dans le développement des formes sévères de la maladie, il existe encore de nombreux aspects de ce processus complexe qui restent mal compris. Les travaux complémentaires pour caractériser PFI1785w ont révélé que la protéine codée par ce gène est exprimée par les isolats placentaires comme cela est démontré par les analyses par western blot. Par comparaison à VAR2CSA, la protéine recombinante correspondante (NP561) est mieux reconnue par les échantillons de sérum de femmes enceintes vivant dans les zones endémiques du paludisme suggérant que le produit de ce gène est ciblé par la réponse immune, bien que sa relation au genre soit moins importante. De plus, des anticorps spécifiques dirigés contre NP561 marquent de manière spécifique la surface des parasites PAM comme cela est démontré par la cytométrie en flux et l'IFA. Ceci prouve une implication évidente de cette protéine parasitaire dans le mécanisme de PAM. PFI1785w est un gène ayant une copie unique qui code pour une petite protéine dont il est prédit qu'elle exprime une unique molécule à la surface des érythrocytes. Ce nouvel antigène immunoréactif identifié présente des preuves intéressantes de son implication dans le mécanisme régissant le tropisme placentaire de P. falciparum, et par là même apparaît comme un nouvel antigène prioritaire pour des évaluations futures visant à l'élaboration d'un vaccin efficace contre le PAM. De manière similaire à PFI1785w, PFD1120c, PF10 0350 et PFLO260c sont fortement transcrits dans les isolats non-PAM, ce qui évoque une implication possible de ces gènes dans le processus biologique conduisant à des infections de type non- PAM. PF10 0350 et PF10 0351 sont contigus et dans la même orientation sur le chromosome 10. Il est intéressant de noter que l'un est sur-régulé tandis que l'autre est sous-régulé dans les échantillons placentaires. Puisqu'il y a seulement 1,3kb entre le codon stop de PF10 0350 et le codon start de PF10 0351, il peut être supposé que la fixation de la zone activatrice sur la région promotrice de PF10 0351 interfère avec l'amplificateur de la région 5' de PF10 0350. De plus, PF10_0351 appartient à la famille des paralogues de MSP3 (protéine 3 de surface du mérozoïte). Il a été montré que H103, la protéine codée par PF10_0351, est exprimée à la surface des mérozoïtes (Pearce et al., 2005). La surexpression de cette protéine dans les parasites placentaires peut indiquer que H103 agit comme un facteur de virulence. Dans la présente étude, les différences entre les parasites in vivo et les cultures in vitro de parasites sont clairement mises en évidence par la transcription de gènes tels que PFC0110w (Clag 3.2), PF10 0344 (protéine riche en glutamate) et PF140010 (antigène relatif à la protéine de liaison à la glycophorine). PFC0120w qui code pour un membre différent de la famille CLAG (gène asexué lié à la cytoadhérence), clag 3.1, est cependant sous-régulé dans les parasites placentaires, ceci indiquant probablement que ce dernier n'est pas impliqué dans la pathogénie in vivo des parasites PAM. Bien que la sous-famille des gènes clag (clag3) ait été décrite comme jouant un rôle possible dans la liaison aux érythrocytes lors du processus d'invasion, des études récentes démontrent que les transcrits de clag 3.2, contrairement à ceux de clag 3.1, ne peuvent être détectés dans certaines souches adaptées au laboratoire, telles que les parasites Dd2, ce qui est en accord avec cette étude. La PCR quantitative en temps réel du sous-groupe des 19 gènes identifiés par puces à ADN et réalisée à partir de parasites issus d'individus présentant des formes cliniques différentes de l'infection par le paludisme, démontre de nombreuses différences entre les parasites provenant d'enfants asymptomatiques et ceux provenant de femmes enceintes et non enceintes présentant des symptômes. Ces gènes sont : PFC0110w (clag 3.2), PF10 0344 (glurp), PFB0105c, PF10 0351 et PFI1445w. Ceci implique des différences entre les parasites infectant les enfants asymptomatiques et ceux infectant les individus présentant des symptômes. Ceci peut être en relation avec la forme clinique qui diffère entre ces individus, suggérant un rôle possible de ces protéines comme facteur de virulence, comme cela a été démontré pour clag et glurp. Pour certains gènes analysés, aucune différence n'a été observée entre les isolats, mais des différences existent avec la lignée 3D7. En particulier, on citera PF14 0010 codant pour un antigène relatif à la protéine de liaison à la glycophorine, qui a été détecté dans les 3 groupes d'échantillons. Des travaux antérieurs ont montré des modifications dans l'expression des protéines exprimées en surface de P. falciparum lorsque le parasite est maintenu en culture sur le long terme ou sous la pression d'une sélection biologique ou immune. Ceci est peut être également applicable aux facteurs de virulence putatifs. Le profil d'expression des gènes qui n'ont été détectés que dans un seul groupe d'échantillons peut potentiellement traduire une spécificité des isolats PAM, bien que ces gènes puissent aussi être spécifiques de certains des stades de développement. La surexpression par les parasites placentaires des gènes codant pour de multiples antigènes asexués (tels que AMA1, MSP1, MSP3, MSP5, MSP6, EBA140, qui sont supposés être impliqués dans l'invasion des globules rouges) est cohérent avec les différences entre les processus biologiques ayant lieu dans un environnement in vivo, qui est riche en cellules immunes et en facteurs, et dans l'environnement in vitro de la souche 3D7. Exemple 3 : Etude des gènes PFA0700c, PF14_0757, PFB0105c, 25 PF10 0351 et PF10 0350 Caractérisation immunologique des produits des gènes Une partie des protéines codées par PFA0700c, PF14_0757, PFB0105c, PF10 0351 et PF10 0350 a été exprimée dans un 30 baculovirus, transfectée dans des cellulesd'insectes et purifiée en tant que protéine avec une queue histidine sécrétée. Les protéines ont été reconnues dans des tests ELISA par des échantillons de sérum provenant d'individus vivant dans des zones endémiques (Ghana). Les sérums de femmes enceintes infectées présentent un niveau significativement plus élevé d'anticorps dirigés contre ces protéines comparés aux sérums d'hommes de la même région du Ghana (p = 0,04). La reconnaissance d'une autre protéine recombinante de parasite (GLURP) a également été mesurée et aucune différence significative n'a été observée entre les deux types de sérums (Fig. 3). L'expression de PFA0700c, PF14_0757, PFB0105c, PF10_0351 et 10 PF10 0350 est associée au phénotype PAM Afin de déterminer la localisation de PFA0700c, PF14 0757, PFB0105c, PF10_0351 et PF10_0350 dans les érythrocytes matures infectés par des schizontes, des antisérums de lapin spécifiques dirigés contre ces protéines (sous forme de 15 protéine recombinante exprimée en système baculovirus) ont été préparés. Ils ont été utilisés dans des analyses d'immunoblot et dans des marquages par immunofluorescence (IFA). Des contrôles ont été effectués à partir d'antisérums de lapin dirigés contre d'autres protéines de surface telles que PfEMP1 20 caractérisées précédemment, contre des érythrocytes non infectés, des érythrocytes infectés avec des souches de laboratoires et des érythrocytes frais infectés issus d'enfants. Des bandes protéiques d'environ 13kD, 25kD, 35kD, 65kD et 82kD correspondant aux tailles respectives attendues, 25 ont été détectées spécifiquement par immunoblot sur des lysats de parasites placentaires. Par cytométrie en flux, les anticorps de lapin spécifiques de ces protéines recombinantes ont été capables de marquer spécifiquement la surface de globules rouges parasités issus de placenta mais pas celle des 30 globules rouges infectés par des souches de parasites de laboratoire ou celle des érythrocytes infectés provenant d'enfants. La localisation en surface des protéines correspondant à PFA0700c, PF14_0757, PFB0105c, PF10_0351 et PF10 0350 a été vérifiée par microscopie confocale après IFA. Les anticorps spécifiques de chacune des protéines ci-dessus ont été utilisés en immunoprécipitation sur des lysats de globules rouges parasités et déséquestrés de placentas. Les complexes protéiques ont été dissociés et analysés par spectrométrie de masse. La combinaison de toutes ces méthodes nous a permis de confirmer l'expression, l'exportation à la surface du globule rouge parasité et l'antigénicité de nouvelles protéines parasitaire impliquées dans la pathogenèse du paludisme gestationnel. Ces protéines constituent des cibles thérapeutiques et vaccinales de grand intérêt. Exemple 4 : Préparation d'un anticorps dirigé contre la protéine NP561 Des lapins sont immunisés à l'aide de l'adjuvant incomplet/complet de Freund. Cet adjuvant aide à induire la production d'anticorps réactifs dirigés contre NP561. Les niveaux d'IgGs specifique de NP561 sont détectés par test ELISA et augmentent au fur et à mesure des immunisations et atteignent un maximum au bout de 5 immunisations (Barfod et al., 2006). Les anticorps polyclonaux dirigés contre NP561 sont purifiés par affinité à partir des séra de lapins hyperimmuns.25 Références Trager W, Jensen JB (1976) Human malaria parasites in continuous culture. Science 193: 673-675. Staalsoe T, Giha HA, Dodoo D, Theander TG, Hviid L (1999) Detection of antibodies to variant antigens on Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by flow cytometry. Cytometry 35: 329-336. Plowe CV, Djimde A, Bouare M, Doumbo 0, Wellems TE (1995) Pyrimethamine and proguanil resistance-conferring mutations in Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase: polymerase chain reaction methods for surveillance in Africa. Am J Trop Med Hyg 52: 565-568. Jafari S, Le Bras J, Bouchaud 0, Durand R (2004) Plasmodium falciparum clonal population dynamics during malaria treatment. 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Polynucléotide isolé ou purifié comprenant une séquence choisie parmi le groupe consistant en : (a) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO. 1, (b) Une sous-séquence de (a) avec une longueur minimum de 30 acides nucléiques, à l'exception de la séquence SEQ ID NO. 1. 2. Polynucléotide isolé ou purifié selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence est choisie parmi le groupe consistant en : (a) SEQ ID NO. 3, (b) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec (a), (c) Une sous-séquence de (a) ou (b) avec une longueur minimum de 30 acides nucléiques. 3. Polynucléotide selon la revendication 1 ou 2, ou SEQ ID NO. 1 pour une utilisation comme médicament. 4. Polypeptide isolé ou purifié caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon la revendication 1 ou 2. 5. Polypeptide isolé ou purifié comprenant une séquence choisie parmi le groupe consistant en : (a) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO. 2, (b) Une sous-séquence de (a) avec une longueur minimum de 10 acides aminés, à l'exception de la séquence SEQ ID NO. 2. 6. Polypeptide isolé ou purifié selon la revendication 5, caractérisé en ce que la séquence est choisie parmi le groupe consistant en : (a) SEQ ID NO. 4, (b) Une séquence ayant au moins 80% d'identité avec (a), (c) Une sous-séquence de (a) ou (b) avec une longueur minimum de 10 acides aminés. 7. Polypeptide recombinant ou chimérique caractérisé en ce qu'il comporte au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, SEQ ID NO. 2. 8. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 4 à 7 ou SEQ ID NO. 2 pour une utilisation comme médicament. 9. Conjugué comportant au moins un polypeptide selon l'une quelconques des revendications 4 à 7, et/ou SEQ ID NO. 2, lié(s) à un support. 20 10.Vecteur de clonage ou d'expression comprenant au moins une séquence polynucléotidique selon la revendication 1 ou 2. 11. Conjugué selon la revendication 9, ou vecteur de clonage 25 selon la revendication 10, pour une utilisation comme médicament. 12. Composition immunogène comprenant au moins un élément choisi parmi les polynucléotides selon la revendication 1 30 ou 2, SEQ ID No.1, les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, SEQ ID No.2, les conjugués selon la revendication 9, les vecteurs selon la revendication 10, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable.15 13.Vaccin contre le paludisme gestationnel, comprenant au moins un élément choisi parmi les polynucléotides selon la revendication 1 ou 2, SEQ ID No.l, les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, SEQ ID No.2, les conjugués selon la revendication 9, les vecteurs selon la revendication 10, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. 14.Composition immunogène selon la revendication 12 ou vaccin selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comporte en outre au moins un antigène de P. falciparum choisi parmi var2csa, les antigènes des stades préérythrocytaires, érythrocytaires asexués ou sexués. 15. Cellule hôte comprenant au moins un polynucléotide selon la revendication 1 ou 2, SEQ ID No. 1 et/ou au moins un vecteur selon la revendication 10. 16.Anticorps monoclonal ou polyclonal reconnaissant spécifiquement au moins un élément choisi les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, des conjugués selon la revendication 9. 17.Anticorps selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est purifié et recombinant, pour une utilisation comme médicament. 18.Utilisation d'au moins un élément choisi parmi les polynucléotides selon la revendication 1 ou 2, SEQ ID No. 1, les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, SEQ ID No. 2, les conjugués selon la revendication 9, les vecteurs selon la revendication 11, les anticorps selon la revendication 16 pour lafabrication d'un médicament destiné au traitement du paludisme placentaire. 19. Méthode de diagnostic in vitro du paludisme placentaire chez une femme susceptible d'être infectée par P. falciparum comprenant les étapes suivantes : c) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez la femme susceptible d'être infectée, avec un anticorps selon la revendication 16, afin de permettre la formation de complexe immuns ; et, d) la détection desdits complexes immuns potentiellement formés. 20.Méthode de diagnostic in vitro du paludisme placentaire chez une femme susceptible d'être infectée par P. falciparum comprenant les étapes suivantes : c) la mise en contact, dans des conditions permettant une réaction immunologique, d'un tissu et/ou d'un fluide biologique prélevé chez la femme susceptible d'être infectée, avec au moins un élément choisi parmi les polypeptides selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, SEQ ID No. 2, les conjugués selon la revendication 9, afin de permettre la formation de complexe immuns avec les anticorps éventuellement présents dans ledit tissu et/ou ledit fluide biologique; et, d) la détection desdits complexes immuns potentiellement formés. 21.Kit pour le diagnostic in vitro du paludisme placentaire comprenant les éléments suivants : au moins un anticorps selon la revendication 16,- des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à une réaction de liaison entre un échantillon à tester et au moins un desdits anticorps, et, - des réactifs permettant la détection de complexes antigènes-anticorps produits par ladite liaison, ces réactifs pouvant porter un marqueur susceptible d'être reconnu par un second réactif de détection.