Brevet FR2919785A1 — publié le 20090213

UTILISATION D'UNE GLOBINE, D'UN PROTOMERE DE GLOBINE OU D'UNE HEMOGLOBINE EXTRACELLULAIRE POUR LA PRESERVATION D'ORGANES, DE TISSUS, OU DE CELLULES D'ORGANES OU DE TISSUS, OU DE CULTURE DE CELLULES La présente invention concerne l'utilisation d'au moins une globine, et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native, naturellement extracellulaire, pour la préservation d'organes, de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus, ou de culture de cellules. On a beaucoup étudié les Annélides pour leur hémoglobine extracellulaire (N.B. Terwilliger, Molecular Structure of the extracellular heme proteins., Vol. 13, C.P. Mangum (Ed), 193-229, Springer-Verlag, Berlin (1992) ; J.N. Lamy, B.N. Green, A. Toulmond, J.S. Wall, R.E. Weber and S.N. Vinogradov, Chem. Rev. 96 3113-3124 (1996)). Ces molécules d'hémoglobine extracellulaire sont présentes chez les trois classes d'Annélides : Polychètes, Oligochètes et Achètes et même chez les Vestimentifères devenue récemment la famille des siboniglidae incluse à la classe des Polychètes. Ce sont des biopolymères géants, constitués d'environ 200 chaînes polypeptidiques appartenant à 6 ou 8 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories. La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" portant un site actif et capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa et qui sont très similaires aux chaînes de type a et (3 de vertébrés. La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de "structure" possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des douzièmes. Les premières images obtenues sur des hémoglobines extracellulaires d'Arénicole (J. Roche, M. Bessis and J.P. Thiery, Biochim. Biophys. Acta 41 182-184 (1960); J. Roche, M.T. Bessis and J.P. Thiery, C. R. Soc. Biol. 154 73-80 (1960)) ont révélé des éléments hexagonaux. Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés (O. Levin, J. Mol. Biol. 6 95-101 (1963); J. Roche, Electron microscope studies on high molecular weight erythrocruorins (invertebrate hemoglobins) and chlorocruorins of annelids., D.A. Munday (Ed), 62-80, Pergamon Press, Oxford (1965)) que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six éléments en forme de goutte d'eau (E.F.J. Van Bruggen and R.E. Weber, Biochim. Biophys. Acta 359 210-212 (1974); O.H. Kapp and 2 2919785 A.V. Crewe, Biochim. Biophys. Acta -789 294-301 (1984)), nommés structure globulaire creuse (hollow globular structure) (F. De Haas, F. Zal, V. You, F.H. Lallier, A. Toulmond and J.N. Lamy, J. Mol. Biol. 264 111-120 (1996); F. De Haas, F. Zal, F.H. Lallier, A. Toulmond and J.N. Lamy, Proteins-structure fonction and genetics, 3 241-256 (1996); F. 5 De Haas, N. Boisset, J.C. Taveau, O. Lambert, S.N. Vinogradov and J.N. Lamy, Biophys. J. 70 1973-1984 (1996)) ou "douzième". La molécule native est formée de douze de ces sous-unités (dodécamère), d'une masse moléculaire comprise entre 200 et 250 kDa qui constitue l'unité fonctionnelle de la molécule native. On s'est particulièrement intéressé à Arenicola marina, un Annélide Polychète de 10 l'écosystème intertidal. La structure de son hémoglobine extracellulaire est d'ailleurs déjà connue (F. Zal, B.N. Green, F.H. Lallier, S.N. Vinogradov and A. Toulmond, Eur. J. Biochem. 243 85-92 (1997)). La transplantation d'organe consiste à remplacer un organe malade d'un patient par un organe sain, appelé greffon et provenant d'un donneur. 15 La distribution de l'oxygène à tous les organes et tissus dans le corps humain est assurée par l'hémoglobine présente dans le flux sanguin humain ou animal. Après prélèvement sur le donneur, l'organe n'est plus approvisionné en oxygène et donc, lors du processus de transplantation d'organe, le maintien en vie, le plus longtemps possible, de l'organe hors du corps pendant le temps qui sépare le prélèvement sur le 20 donneur, de l'implantation sur le patient, est indispensable à la réussite de la greffe et implique la mise au point de méthodes de conservation. Dès l'explantation, le greffon est privé de son environnement physiologique et devient alors très sensible. En normothermie (37 C), l'interruption de la vascularisation d'un organe entraîne la nécrose rapide des cellules qui le constituent. La solution de 25 préservation d'organe intervient afin de le protéger. L'un des grands principes de la préservation d'organe consiste à descendre rapidement sa température de 37 C à 4 C. En effet, la diminution de la température des tissus entraîne une diminution du métabolisme cellulaire, sans pour autant l'arrêter (Belzer F.O., Southard J.H. Principles of solid-organ preservation by cold storage. Transplantation 1988; 45(4): 673-676.). L'hypothermie et la 30 composition de la solution de conservation permettent de lutter contre les effets délétères de la privation en oxygènes et nutriments induits par l'arrêt de la circulation sanguine et diffèrent la mort des cellules, responsable de la nécrose des tissus. La solution contribue ainsi, grâce à ses propriétés osmotiques et/ou anti-oxydantes, au maintien de la qualité et de l'intégrité du greffon (morphologie et biochimie). Surtout elle maintient sa viabilité ex vivo : • Lors de la phase de prélèvement, le greffon va être perfusé par la solution de préservation afin de le rincer et le débarrasser du sang du donneur ( solution de rinçage ). L'organe est refroidi suite à la perfusion hypothermique réalisée ex vivo ou in situ selon qu'il s'agit d'un prélèvement sur donneur vivant ou cadavérique. Le lavage sert également à équilibrer l'organe avec les composants de la solution. • La période, depuis le début de l'explantation chez le donneur jusqu'à la fin de l'implantation chez le receveur, est critique : c'est la durée d'ischémie totale. Cette étape est à l'origine des nombreux effets délétères observés. L'ischémie peut se définir comme une insuffisance d'apport sanguin tissulaire, avec perte de trois fonctions importantes du flux sanguin: apport de nutriments, oxygénation et élimination des déchets. On distingue le temps d'ischémie chaude : période où l'organe n'est plus perfusé par le sang du donneur mais pas encore réfrigéré, et le temps d'ischémie froide : période après lavage et réfrigération de l'organe jusqu'à sa revascularisation chez le receveur. Après réchauffement de l'organe et avant perfusion par le sang du receveur, on peut observer une période d'ischémie chaude secondaire. La solution de préservation a un rôle réel de protection du greffon pendant le transport ( solution de stockage ). L'hypothermie est l'élément essentiel de la conservation. Elle réduit le métabolisme tissulaire, c'est-à-dire qu'elle ralentit l'activité enzymatique catalytique nécessaire à la viabilité cellulaire. Le métabolisme serait diminué de 12 à 13 fois lorsque la température passe de 37 C à 0 C (Belzer et Southard, Principles of solid-organ preservation by cold storage.Transplantation 1988; 45(4): 673-676. 1988)). Il est en effet nécessaire de réduire la demande et la consommation du greffon en oxygène et en énergie, car celui-ci se trouve en état d'ischémie. Cela sous entend que le tissu est privé d'oxygène. Donc la synthèse d'énergie sous forme d'ATP n'est plus assurée par la phosphorylation oxydative mais par la glycolyse anaérobie dont le rendement est très inférieur. Le tissu ischémique n'a presque plus de réserve énergétique et se détériore rapidement. Il est donc important de réduire ses besoins grâce à l'hypothermie. La qualité de la conservation à froid (û4 C) conditionnera la réussite de la reperfusion après l'implantation. L'organe est simplement plongé dans la solution maintenue à basse 4 2919785 température par de la glace pilée selon des conditions garanties d'asepsie : conservation statique à froid. Le temps acceptable pour assurer la reprise de fonction ultérieure du greffon varie d'un organe à l'autre. Par exemple, il est d'environ 4-5 heures pour le coeur, 4-6 heures 5 pour le poumon, 6 heures pour l'intestin, 10-16 heures pour le foie, 24-35 heures pour le rein et 12-18 heures pour le pancréas (Thèse de Melle Delphine FORNAS soutenue le 15 juin 2001: Solution de préservation d'organe : descriptif, statut réglementaire et enregistrement en Europe ; Université Claude Bernard û Lyon I ; Faculté de Pharmacie ; Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques). 10 Par conséquent, la mise au point de méthodes de conservation a été particulièrement étudiée. Ainsi, le brevet US 7,220,538 concerne une composition de préservation d'organes ou de cellules, à deux phases, et comprenant une première phase qui comprend un milieu de base nutritif et une deuxième phase qui comprend des nanoparticules contenant une 15 solution ou suspension avec un composant capable de lier ou fournir de l'oxygène qui peut être de l'hémoglobine intracellulaire hémolysée et modifiée chimiquement. Cette solution est maintenue a une température non hypothermique d'environ 20 à 37 C. Le brevet US 6,994,654 concerne une solution de préservation d'organe et tissus qui contient une solution à base d'électrolytes à haute teneur en potassium et un additif 20 qui peut être du PEG-Hémoglobine pour un procédé de fourniture, préservation, transplantation et/ou de chirurgie non hémorragique impliquant un organe ou un tissu. Il est précisé que les molécules transportant l'oxygène, utilisées comme additif, le sont pour une perfusion normothermique . Lorsque la perfusion est hypothermique, il n'y a pas de présence de transporteur d'oxygène car aux températures hypothermiques, 25 l'hémoglobine de vertébrés dont est issue la molécule décrite dans ce brevet n'a pas les mêmes propriété fonctionnelles qu'à 37 C, notamment son affinité vis à vis de l'oxygène car l'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène dépend de la température. La demande de brevet US 2006/0063142 concerne un appareil et un procédé de perfusion d'organe pour le suivi, le maintien et/ou la restauration des organes ainsi que la 30 préservation des organes durant le stockage et/ou le transport. Le procédé comprend la perfusion d'un organe avec un premier fluide médical à une première température (préférentiellement supérieure à 25 C) qui peut contenir un transporteur d'oxygène tel que les globules rouges ou de l'hémoglobine réticulée, après rinçage avec une solution qui peut être du VIASPANTM ou d'autres solutions colloïdales 5 2919785 contenant du dextran ou du HES (hydroxyethyl starch) ou d'autres composés équivalents, puis la perfusion de l'organe avec un deuxième fluide médical qui ne contient pas d'oxygène à une seconde température (préférentiellement comprise entre 4 et 10 C) inférieure à la première. 5 Le brevet US 6,642,045 concerne un système d'assistance métabolique comprenant un organe ou un tissu qui emploie une solution de perfusion qui peut comprendre un transporteur d'oxygène tel que l'hémoglobine, une hémoglobine stabilisée, des conjugués de polyoxyéthylène d'hémoglobine ou une hémoglobine recombinante. La température d'utilisation du système est comprise entre 25 et 37 C. 10 La demande WO 01/01774 concerne une composition pour la préservation d'organes pour la transplantation contenant une PEG-hémoglobine bovine, un ou plusieurs électrolytes essentiels, au moins une protéine soluble, au moins une formulation nutritionnelle et au moins un agent agissant sur le système cardiovasculaire. Dans ces différents documents, l'hémoglobine utilisée est d'origine humaine ou de 15 mammifères et est soit dans les globules rouges, soit dans des liposomes, ou alors elle est réticulée, ou pontée par du polyéthylène glycol (PEG-hémoglobine), pour éviter l'oxydation car il est bien connu que lorsque l'on isole une hémoglobine du globule rouge, celle-ci va s'oxyder du fait de l'absence de l'activité anti-oxydante des enzymes présentes dans le globule rouge. (Savitsky JP, Doczi J, Black j & Arnold JD (1978) A 20 clinical safety trial of stroma-free hemoglobin. Clin Pharmacol Ther 23, 73-80), (Chan WL,Tang NL, Yim CC, Lai FM & Tam MS (2000); New features of renal lesion induced by stroma free haemoglobin, Toxicol Pathol 28, 635-642). L'utilisation de globules rouges nécessite également le contrôle de la pression osmotique. Au-delà de 289 mOsMoles (pression osmotique normale du globule rouge), le globule rouge va se trouver 25 dans un milieu hyperosmotique et aura tendance à perdre l'eau qu'il contient. Ce processus physique pertube les échanges membranaires notamment les échanges sodium/chlore (Hendry EB (1961) Osmolarity of human serum and chemical solution of biological importance. Clin. Chem., 2, 156-164). Egalement, l'utilisation d'une hémoglobine humaine ou de mammifère n'autorise 30 que des températures normothermiques pour la préservation d'organe car en deçà, le fonctionnement du globule rouge est fortement perturbé (Jensen, FB, Wang T., Brahm, J., 2001, Acute and chronic influence of temperature on red blood cell anion exchange, 204, 39-45). Par ailleurs, l'utilisation d'une hémoglobine de vertébrés nécessite de connaître le typage sanguin du donneur et du receveur afin d'éviter une réaction immunologique (Goodnough, Clin Orthop Relat Res. 1998 Dec;(357):89-100). Cependant, l'amélioration de la survie du greffon pendant l'ischémie sur une période plus longue permettra une meilleure étude de l'immunologie et des conditions opératoires, favorisant ainsi la réussite de la greffe. De même, l'amélioration de l'oxygénation du greffon et donc de sa qualité permettra une reprise de fonction plus rapide. Par conséquent. l'un des objets de l'invention est de fournir des globines, et/ou des protomères de globine et/ou des hémoglobines extracellulaires en association avec un milieu de conservation d'organe ou de culture de cellules permettant la constitution d'une composition de préservation d'organes, de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus, ou de culture de cellules. Un autre objet de l'invention est de fournir une composition de préservation d'organes, de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus ne nécessitant pas de typage sanguin. Un autre aspect de l'invention est de fournir une composition de préservation d'organes, de tissus ou de cellules d'organes ou de tissus permettant une utilisation prolongée dans le temps et pouvant fonctionner à une température hypothermique. Un autre aspect de l'invention est de fournir une composition de culture de cellules pouvant fonctionner à une température hypothermique. Un autre objet de l'invention est de fournir une composition comprenant au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire dans un milieu de conservation d'organe permettant la préservation d'organes, de tissus ou de cellules d'organes ou de tissus ou la culture de cellules. Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de conservation d'organes, de tissus ou de cellules d'organes ou de tissus. Un autre aspect de l'invention est de fournir un procédé de perfusion d'organe. Un autre aspect de l'invention est de fournir un procédé de culture de cellules. Par conséquent, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native naturellement extracellulaire d'animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels que Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml, en association avec un milieu de conservation d'organe, ou un milieu de culture de cellules, pour la constitution d'une composition de préservation d'organes, de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus, ou de perfusion d'organe ou de tissus, ou de culture de cellules. Par protomère de globine , on entend le douzième ou le dodécamère de la globine. Par native , on entend une globine, ou un protomère de globine ou une hémoglobine originaire dudit animal invertébré. Par naturellement extracellulaire , on entend une globine ou un protomère de globine ou une hémoglobine qui est naturellement non contenue dans une cellule et peut donc circuler librement dans le système circulatoire sans modification chimique pour la stabiliser et la rendre fonctionnelle. L'hémoglobine extracellulaire de Arenicola marina est un biopolymère géant d'une masse d'environ 3 à 4 millions de daltons et composé d'environ 200 chaînes polypeptidiques de deux types. Les trois quarts sont des chaînes de type globines capables de fixer réversiblement l'oxygène (02) et le quart restant sont des chaînes de structures ( linkers ) qui assurent le maintien de la structure quaternaire et seraient responsable de l'activité anti-oxydante de cette molécule. L'unité fonctionnelle de cette molécule est le docécamère qui a une masse comprise entre 200 et 250 kDa. Par conséquent, l'hémoglobine extracellulaire, ou le protomère de globine ou la globine d'animal invertébré peut être constituée d'une seule chaîne polypeptidique jusqu'à environ plusieurs centaines de chaînes polypeptidiques, soit un poids moléculaire compris d'environ 15 000 Daltons à environ 8 Millions de Daltons. L'utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native extracellulaire permet de mettre en jeu l'activité superoxide dismutase (SOD) intrinsèque (déterminée par la méthode de Flohé & âtting ; Flohé L, Otting F. Methods Enzymol (1984), 105, 93-104) de ladite hémoglobine ou globine ou protomère de globine, procurant ainsi une activité anti-oxydante intrinsèque, et ne nécessitant, par conséquent, aucun anti-oxydant pour fonctionner, contrairement à l'utilisation d'une hémoglobine de mammifères pour laquelle les molécules antioxydantes sont contenues à l'intérieur du globule rouge et ne sont pas liées à l'hémoglobine. D'autre part, la globine ou le protomère de globine ou l'hémoglobine 8 2919785 extracellulaire ne nécessitent pas de cofacteur pour fonctionner contrairement à l'hémoglobine de mammifère, notamment humaine. Par animal invertébré, on entend un animal qui n'a pas de colonne vertébral tel que les méduses, les éponges, les insectes, les crustacés, les mollusques... ou un animal qui 5 appartient à l'embranchement des annélides. La concentration en hémoglobine dans le ver marin Arenicola marina est comprise entre 100 à 170 g/L de sang (Toulmond, A. (1975). Recherches sur la physiologie respiratoire de l'Annélide Polychète Arenicola marina (L.). Thèse de Doctorat d'Etat, Pierre-et-Marie-Curie (Paris VI), Paris) et chez l'homme, elle est d'environ 140 g/L de 10 sang (Données OMS WHO/LEISH/96.40 Appendices Page 57). Par conséquent, les concentrations utilisées dans l'invention sont préférentiellement d'environ 100 fois inférieures aux concentrations physiologiques des invertébrés ou vertébrés. L'utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native extracellulaire évite le contrôle de la pression 15 osmotique nécessaire avec l'utilisation de globules rouges. La globine, le protomère de globine et l'hémoglobine extracellulaire ne possédant pas de typage sanguin permettent également d'éviter tout problème de réaction immunologique rencontré avec l'utilisation de globule rouge de mammifère telle que hémoglobine humaine ou de bovin contenue dans des hématies qui possèdent à leur surface différents types glycanes responsable du 20 typage sanguin. L'hémoglobine extracellulaire de A. marina étant extracellulaire et non glycosilée, A. marina peut être considéré comme un donneur universel. Les organes et tissus sont d'origine animale, notamment humaine, de mammifères, d'oiseaux, de reptiles, de poissons ou d'insectes. Un tissu est un ensemble de cellules identiques ou tout au moins de même origine, 25 participant à une fonction commune. Les tissus se groupent en organes. L'expression milieu de conservation désigne tout milieu capable de protéger les organes et/ou les cellules des effets délétères de l'ischémie reperfusion en satisfaisant les besoins métaboliques minimums des organes et/ou cellules. Les milieux de conservation sont des solutions aqueuses contenant des électrolytes 30 tels que le potassium, le sodium, le magnésium, le calcium, le chlorure, le sulfate, contenant le cas échéant des imperméants tels que le mannitol, le raffinose, le saccharose, le glucose, le fructose, le lactobionate, ou du gluconate, et peuvent également contenir des colloïdes tels que de l'abumine, de l'hydroxyéthyl amidon, du polyéthylène glycol ou du dextran 40. 9 2919785 Les milieux de culture de cellules sont disponibles commercialement et très variés. Par exemple, des milieux disponibles chez Invitrogen, sans être limités à ceux-ci sont les milieux suivants : D-MEM, D-MEM/F-12, MEM, RPMI 1640, ou milieu 199... Des exemples de solutions, sans limiter l'invention à ceux-ci, sont donnés dans le 5 tableau 1 de la thèse de Melle Delphine Fornas (Thèse de Melle Delphine FORNAS soutenue le 15 juin 2001 : Solution de préservation d'organe : descriptif, statut réglementaire et enregistrement en Europe ; Université Claude Bernard û Lyon I ; Faculté de Pharmacie ; Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques). Par culture de cellules, il faut entendre tous type de cellules, notamment les 10 cellules procaryotes et eucaryotes, telles que des micro-organismes libres (bactéries ou levures), des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie,...), qui constituent alors des "cultures primaires". Il faut entendre également des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d"'immortalité en culture"), par exemple les lignées de cellules cancéreuses, de 15 cellules en voie de cancérisation, ou encore des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la globine, et/ou le protomère de globine, et/ou l'hémoglobine native défini ci-dessus est utilisé avec un milieu de conservation d'organe choisi préférentiellement parmi UW (Viaspan ), IGL1 , Celsior , 20 SCOT Maco, BMPS Belzer , Custodiol , ou Plegisol . Tous ces milieux de conservation d'organe sont des produits commerciaux. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la culture de cellules définie ci-dessus correspond à des cellules de vertébrés. Par vertébré, on désigne un mammifère, un reptile, un amphibien, un oiseau ou un 25 poisson. Les cellules de vertébrés correspondent à tous type de cellules appartenant à un animal vertébré et peuvent être, par exemple, sans être limité à celles-ci, des cellules rénales, hépatiques, pancréatiques, cardiaques, pulmonaires, intestinales, de l'estomac, du colon.... 30 Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la culture de cellules définie ci-dessus correspond à des cellules d'invertébrés. Par invertébré on désigne un animal dépourvu de colonne vertébrale, par exemple les insectes, les mollusques, les annélides, les cnidaires, les spongiaires,... Les cellules d'invertébrés correspondent à tous type de cellules appartenant à un animal invertébré et peuvent être, par exemple, sans être limité à celles-ci, des cellules du tissu périvasale/hématopoïétique ou autres. Selon un mode de réalisation préféré, la température des compositions de préservation d'organe ou de cellules d'organes, ou de culture de cellules définies ci-dessus, est comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à environ 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C. Ainsi l'utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native extracellulaire permet de constituer une composition capable de travailler en condition hypothermique, élément essentiel de la conservation, car l'hypothermie réduit le métabolisme tissulaire, c'est-à-dire qu'elle ralentit l'activité enzymatique catalytique nécessaire à la viabilité cellulaire. L'utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine, native extracellulaire, permet également de cultiver des cellules d'invertébrés marins, ce qui actuellement n'est pas possible. En effet, des cultures primaires d'invertébrés marins sont réalisées sur certains types d'invertébrés (certaines sont maintenues plusieurs mois) mais aucune lignée de cellule n'a été établie. (Rinkevich B, Mar Biotechnol (NY). 2005 Sep-Oct;7(5):429-39). Selon un autre mode de réalisation, la température de la composition de perfusion d'organe ou de culture de cellules est comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C. Lors de la perfusion d'un organe, la température de perfusion doit être généralement normothermique, c'est-à-dire proche de la température physiologique. Par conséquent, l'utilisation d'une hémoglobine extracellulaire permet de constituer une composition capable de travailler également en condition normothermique. Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine, native extracellulaire, d'animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels que Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus 11 2919785 préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml ; et un milieu de conservation d'organes. Ladite composition permet de préserver des organes ou des tissus, ou des cellules d'organes ou de tissus, ou la perfusion d'organe ou de tissus. 5 Selon un mode de réalisation préféré, ledit milieu de conservation d'organe est choisi préférentiellement parmi UW (Viaspan ), IGL10, Celsior , SCOT Maco, BMPS Belzer , Custodiol , ou Plegisol", mais n'est pas limité à ces seules solutions colloïdales. Selon un autre aspect, l'invention concerne une composition comprenant au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins hémoglobine, native 10 extracellulaire, d' animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels que Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus 15 préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml ; et un milieu de culture de cellules. Ladite composition permet la culture de cellules de vertébrés ou d'invertébrés. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de conservation d'un organe ou de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus, comprenant les étapes 20 suivantes: • prélèvement dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellulesd'organes ou de tissus; • rinçage dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, à une température comprise d'environ 4 C à 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, avec une composition définie ci-dessus ; • conservation en statique ou en perfusion dynamique dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, à une température comprise d'environ 4 C à 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, pendant un temps déterminé, en fonction dudit organe ou 25 30 dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, dans une composition définie ci-dessus. L'expression temps déterminé, en fonction dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, désigne un temps de conservation qui est spécifique et dépend de l'organe utilisé. Le temps acceptable pour assurer la reprise de fonction ultérieure du greffon varie d'un organe à l'autre. Par exemple, il est d'environ 4-5 heures pour le coeur, 4-6 heures pour le poumon, 6 heures pour l'intestin, 10-16 heures pour le foie, 24-35 heures pour le rein et 12-18 heures pour le pancréas. Toutes ces valeurs sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être trouvées par exemple dans la thèse de Melle Delphine Fornas (Thèse de Melle Delphine Fornas soutenue le 15 juin 2001: Solution de préservation d'organe : descriptif, statut réglementaire et enregistrement en Europe ; Université Claude Bernard ù Lyon I ; Faculté de Pharmacie ; Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques). Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de conservation d'un organe comprenant les étapes suivantes: • prélèvement dudit organe; • rinçage dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, avec une composition définie ci-dessus ; • conservation en statique ou en perfusion dynamique dudit organe à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C, pendant un temps déterminé, en fonction dudit organe, dans une composition définie ci-dessus. L'expression temps déterminé, en fonction dudit organe désigne un temps de conservation qui est spécifique et dépend de l'organe utilisé, comme indiqué ci-dessus. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé de culture de cellules de vertébrés, comprenant les étapes suivantes: • prélèvement desdites cellules sur un vertébré; • mise en culture à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C, pendant un temps déterminé ou non, en fonction des cellules, dans une composition définie ci-dessus ; • récolte des cellules par rinçage et lyse du tapis cellulaire. L'expression temps déterminé, en fonction des cellules désigne un temps de culture qui est spécifique et dépend du type de cellules utilisé, de la lignée cellulaire utilisée. Par exemple, il est en général compris de quelques heures à environ une semaine pour des cultures de cellules telles que des cellules sanguines comme les polynucléaires neutrophiles. Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions (limite de Hayflick). Pour des cultures primaires, culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu, il est en général compris de quelques jours à plusieurs semaines. Cette première culture pourra, par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires", lors de l'atteinte de la confluence de la culture primaire. Enfin, dans le cas de cellules immortelles, ce temps n'est pas déterminé et peut théoriquement être infini. Dans un autre aspect, l'invention concerne un procédé de culture de cellules d'invertébrés, comprenant les étapes suivantes: • prélèvement desdites cellules sur un invertébré; • mise en culture à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, pendant un temps déterminé, en fonction des cellules, dans une composition définie ci- dessus; • récolte des cellules par rinçage et lyse du tapis cellulaire. L'expression temps déterminé, en fonction des cellules désigne un temps de conservation qui est spécifique et dépend du type de cellules utilisé, de la lignée cellulaire utilisée. 14 2919785 DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente la cinétique de dissociation de l'hémoglobine de Arenicola marina (HbAm) dans quatre milieux de conservation d'organes ( carré blanc :UW, cercle 5 noir :IGL1, croix :Celsior, triangle blanc :BMPS Belzer). Le carré gris correspond à la stabilité de l'hémoglobine de Arenicola marina dans un tampon servant à la purification de la molécule. La figure 2 représente les propriétés fonctionnelles de l'hémoglobine de Arenicola marina (HbAm) dans différents milieux de conservation d'organes. 10 Pour chaque milieu, la mesure de la P50 (traits pleins) représentant l'affinité de l'hémoglobine de Arenicola marina pour l'oxygène ainsi que la mesure de la n50 (traits pointillés) représentant la coopérativité sont représentées. La figure 3 représente le pourcentage de lactate déshydrogénase (LDH) libérée dans le surnageant de conservation par les cellules de tubules rénaux de porc LLC PK1 15 (axe des ordonnées) après 2h à 4 C en fonction de la concentration en hémoglobine de Arenicola marina (1,25 mg/ml à 20 mg/ml) dans un milieu de conservation d'organe (ViaSpan , Bristol-Myers-Squibb). Les colonnes en noir représentent les résultats obtenus pour les différentes concentrations d'HbAm, les colonnes en gris représentent les résultats obtenus avec le 20 tampon seul dans le ViaSpan , en l'absence d'HbAm. La figure 4 représente le pourcentage de lactate déshydrogénase détecté (LDH) libérée dans le surnageant de conservation par les cellules de tubules rénaux de porc LLC PK1 (axe des ordonnées) après 24 h à 4 C en fonction de la concentration en hémoglobine de Arenicola marina (0,039 mg/ml à 1,25 mg/ml ; axe des abscisses) dans un milieu de 25 conservation d'organe (ViaSpan , Bristol-Myers-Squibb). Les colonnes en noir représentent les résultats obtenus pour les différentes concentrations d'HbAm. PARTIE EXPERIMENTALE 30 Exemple 1 : Stabilité de l'hémoglobine de Arenicola marina dans différents milieux de conservations d'organes. Ces études ont été réalisées au laboratoire afin d'évaluer la stabilité de HbAm dans différents milieu de conservations d'organes (solutions colloïdales couramment utilisées 15 2919785 lors de transplantation d'organes et fournies par le laboratoire du Pr. T. Hauet). Ces solutions sont UW , IGL1 , Celsior , et BMPS Belzer . Les analyses cinétiques ont été réalisées sur 48h à partir de l'aire sous courbe du chromatogramme et du pourcentage à 414nm des différentes sous-unités (correspondant à 5 l'absorbance de l'hème). Le pourcentage de HbAm au cours du temps suit une loi mono- [HbAm] exponentielle : = exp(ùkdt) où kd est la constante de dissociation de HbAm. [HbAm 110 Ces études ont révélé que dans ces différents milieux de conservations d'organes, l'HbAm est stable, non oxydée et fonctionnelle sur une période d'au moins 48 heures, ce qui est totalement compatible avec la durée de vie des organes en attente de 10 transplantation (figure 1). Les constantes de dissociation et le temps de demi-vie obtenus pour les différentes solutions indiquent que HbAm est stable dans ces différents milieux de conservations d'organes testées sur 48 heures (dissociation Exemple 2 : Fonctionnalité de l'hémoglobine de Arenicola marina dans 20 différents milieu de conservations d'organes. La mesure de la P50 a été effectuée selon la technique de l'hemox (A. Toulmond et al., Biol. Bull. 179 366-373 (1990)) à 4 et sur 48h. La mesure de la n5o a été effectuée sur les courbes de saturation par l'oxygène d'un pigment respiratoire, obtenues à partir de la technique de l'hemox. 25 Les résultats obtenus présentés sur la figure 2 montrent que HbAm est fonctionnelle dans les différents milieux de conservation d'organe testés comme l'indiquent les valeurs de P50 et n50 observée (UW, IGL1, Celsior, Scot Maco, BPMS L'affinité de HbAm pour 02 est forte, comprise entre 1 et 3 et -0,2 dans SCOT Maco. L'affinité est légèrement plus importante dans les différents milieux de 15 16 2919785 conservation d'organe et particulièrement dans SCOT Maco et augmente légèrement sur 48 heures. La coopérativité est quant à elle constante -1,5 entre les différents milieux de conservation ainsi que dans le temps. Exemple 3 : Test d'efficacité de l'hémoglobine de Arenicola marina à une concentration comprise de 1,25mg/ml à 20 mg/ml, dans un modèle in vitro de conservation à froid de cellules rénales 10 1) Conservation à froid de la lignée cellulaire rénale - Matériel biologique Les expériences ont été réalisées sur la lignée cellulaire de tubules rénaux de porcs LLC-PK1 (CL-101, Lot 1928865) (ATCC, LGC-Promochem, Molsheim, France) gracieusement fournie par le Laboratoire Inserm E0324 `Ischémie-reperfusion en 15 transplantation rénale' de Poitiers dirigé par le Pr. G. Mauco. La lignée LLC-PK1 est une lignée de cellules non transformées, établie à partir de cellules épithéliales de tubes contournés proximaux de rein de porc. - Culture des cellules LLCPK1 Les cellules LLC-PK1 sont cultivées en milieu M199 (Ref 31150, Gibco-BrL, 20 Invitrogen Life Technologie) supplémenté avec 3% de sérum de veau foetal (F7524, Lot 085K3397, Sigma-Aldrich), 100 U/mL de pénicilline et 100 g/mL streptomycine (P4333, Sigma-Aldrich) et de 2 mM L-Glutamine (25030, Gibco-BrL). Les cellules sont cultivées à 37 C sous une atmosphère humide contenant 95% d'air et 5% de CO2. - Conservation à froid des cellules LLC-PK1 25 Pour les expériences de conservation à froid, les cellules sont ensemencées en plaque de culture 6 puits (140675, Nunc) à une concentration de 2 x 105 cellules/mL dans 2 mL de milieu de culture pour chaque puits. Après 48 h de culture, le surnageant est éliminé et deux lavages du tapis cellulaire sont réalisés avec un tampon phosphate salin (PBS, 70011, GIBCO-BrL). Les cellules sont ensuite conservées pendant 24 h à 4 C en 30 présence de 1,2 mL d'une solution de conservation commerciale, la solution UW (ViaSpane, Bristol-Myers-Squibb), préalablement additionnée d'HbAm à des concentrations de 0, 1.25, 2.5, 5, 10 ou 20 mg/ml. 5 2) Détection de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) L'impact de l'addition de l'HbAm conservée en Tampon de stockage Hemorgan sur la viabilité des cellules LLC-PK1 conservées pendant 24 h à 4 C dans la solution UW a été étudié. La viabilité cellulaire a été étudiée par détection de la quantité de la LDH présente dans le tapis cellulaire après conservation à froid en comparaison à la quantité de LDH initialement présente dans le tapis avant l'étape de conservation. En effet, la libération de cette enzyme dans le milieu extracellulaire est le reflet de la perméabilisation de la membrane plasmique des cellules et par conséquent de la mort cellulaire. - Mode opératoire Après 24 h de conservation, le surnageant est éliminé, et le tapis de cellules est ensuite rincé 3 fois avec 2 mL de PBS puis les cellules adhérentes sont lysées dans 1,2 mL de PBS contenant 0,1% de Triton X-100 (X100, Sigma-Aldrich). La suspension obtenue après grattage du tapis cellulaire est soniquée pendant 10 sec avec un appareil à ultrasons puis centrifugée à 1 000 g pendant 7 min. La quantité de LDH présente dans le tapis cellulaire est déterminée par un dosage colorimétrique selon lies instructions du fournisseur (TOX7, Sigma-Aldrich). Ce dosage est basé sur la réduction du NAD par la LDH lors de la transformation du pyruvate en lactate. Brièvement, 25 .iL de l'échantillon à doser sont déposés dans une plaque 96 puits avant l'addition de 25 L d'un mélange réactionnel contenant lvolume de substrat (L2402), lvolume de cofacteur (L2527) et lvolume de colorant (L2277). Le mélange est ensuite homogénéisé délicatement et incubé 5 min à température ambiante dans le noir. La réaction est arrêtée par addition de 5 L de HC1 1N. L'absorbance mesurée par photométrie à 490 nm et 630 nm (référence plastique) (ELx800TM, Biotek couplé au logiciel GenS ) est directement proportionnelle à la quantité d'enzyme présente dans l'échantillon. Chaque échantillon est dosé en doublet et une moyenne de la différence de l'absorbance (DO490-DO630) est effectuée. - Résultats Les résultats sont exprimés en pourcentage de la quantité de LDH détectée dans le tapis des cellules conservées à 4 C par rapport à la quantité de LDH détectée dans le tapis avant la période de conservation à froid (cellules à TO). Le pourcentage de libération de LDH est alors calculé selon le rapport : 100 - [(LDH tapis cellulaire) x 100 / (LDH cellules à TO)] (Figure 3 et Tableau II) HbAm MOYENNE ECART-TYPE Tp Am MOYENNE ECART-TYPE UW 1,25q/L 2,5q/L 5glL 10g/L 20g/L 74 -6 -3 -3 -2 -5 9 6 4 8 4 2 UW 25pL 50NL 100NL 200pL 300pL 74 72 69 72 70 62 9 5 6 3 5 4 Tableau II : Pourcentage de libération de LDH obtenu pour les différentes concentrations en HbAm ou en tampon (les résultats correspondent à la moyenne de trois essais). - Conclusion La conservation des cellules LLC-PK1 pendant 24 h à 4 C dans la solution UW (Viaspan) induit une mort cellulaire importante (74%+9). De plus, la présence du Tampon de stockage Hemorgan dans la solution de conservation UW ne modifie pas ou peu la viabilité des cellules rénales. En revanche, la présence d'HbAm lors de la conservation, et ceci dès une concentration de 1,25 g/L de la molécule, protège totalement la viabilité du tapis cellulaire. Exemple 4 : Test d'efficacité de l'hémoglobine de Arenicola marina à une concentration comprise de 0,039mg/ml à 1,25 mg/ml, dans un modèle in vitro de conservation à froid de cellules rénales Le matériel biologique, la culture des cellules et la conservation à froid sont préparés et effectués de la même façon que dans l'exemple 3. - Concentration en HbAm : Les cellules sont conservées pendant 24 h à 4 C en présence de 1,2 mL d'une solution de conservation commerciale, la solution UW (Viaspan , Bristol-Myers-Squibb), préalablement additionnée d'HbAm à des concentrations de 0, 0,039, 0,078, 0,156, 0,312, 0,625 ou 1,25 mg/mL. - Résultats Les résultats sont exprimés en pourcentage de la quantité de LDH détectée dans le tapis des cellules conservées à 4 C par rapport à la quantité de LDH détectée dans le tapis avant la période de conservation à froid (cellules à TO). Le pourcentage de libération de LDH est alors calculé selon le rapport : 100 - [(LDH tapis cellulaire) x 100 / (LDH cellules à TO)1 (Figure 4 et Tableau III) 19 HbAm MOYENNE ECART-TYPE UW cei 0,039g/L C 0,078gIL 0,156g/L 0,312q/_L 0,62591L 1L2591L 76 69 71 62 47 25 7 7 14 6 7 7 12 5 Tableau III : Pourcentage de libération de LDH obtenu pour les différentes concentrations en HbAm (les résultats correspondent à la moyenne de trois essais). - Conclusion La conservation des cellules LLC-PK1 pendant 24 h à 4 C dans la solution UW (ViaSpan , Bristol-Myers-Squibb) induit une mort cellulaire importante (76%17). La libération de LDH des cellules tubulaires rénales est remarquablement diminuée en présence d'HbAm et ceci de manière dose-dépendante. Ainsi, dès 0,625 mg/ml, HbAm protège les cellules rénales (25%+12 versus 76%+7) et à une concentration de 1,25 g/L, HbAm protège totalement les cellules rénales de la mort cellulaire induite par 24 h de conservation à froid (7%15 versus 76%+7). 20 25 30 REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native, naturellement extracellulaire, d'animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels que Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml, en association avec un milieu de conservation d'organe, ou un milieu de culture de cellules, pour la constitution d'une composition de préservation d'organes, de tissus, ou de cellules d'organes ou de tissus, ou de perfusion d'organe ou de tissus, ou de culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes. 2. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native selon la revendication 1, dans laquelle le milieu de conservation d'organe est choisi préférentiellement parmi UW (Viaspan"), IGL1 Celsior , SCOT Maco, BMPS Belzer , Custodio1 , ou Plegisol . 3. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native selon la revendication 1, dans laquelle la culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes correspond à des cellules de vertébrés. 4. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native selon la revendication 1, dans laquelle la culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes correspond à des cellules d'invertébrés. 5. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native selon l'une des revendications 1 ou 2 et 4, dans laquelle la température de la composition de préservation d'organe ou de cellules d'organes, ou de culture de cellules est comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à environ 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C. 6. Utilisation d'au moins une globine et/ou d'au moins un protomère de globine et/ou d'au moins une hémoglobine native selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle la température de la composition de perfusion d'organe ou de culture de cellules est comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C. 7. Composition comprenant au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire d'animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels que Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml ; et un milieu de conservation d'organes. 8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle le milieu de conservation d'organe est choisi préférentiellement parmi UW (Viaspan ), IGL1 , Celsior", SCOT Maco, BMPS Belzer , Custodiol , ou Plegisol . 9. Composition comprenant au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire d'animal invertébré choisi parmi le phylum des annélides et notamment au moins une globine et/ou au moins un protomère de globine et/ou au moins une hémoglobine extracellulaire appartenant à des vers marins tels qu'Arenicola marina, à une concentration, par rapport au volume final, comprise d'environ 0,625 mg/ml à environ 100 mg/ml, préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 20 mg/ml, plus préférentiellement d'environ 0,625 mg/ml à environ 5 mg/ml, en particulier 1,25 mg/ml ; et un milieu de culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes. 10. Procédé de conservation d'un organe ou de tissu, ou de cellules d'organes ou de tissus, comprenant les étapes suivantes:• rinçage dudit organe ou dudit tissu préalablement prélevés, ou desdites cellules d'organes ou de tissus préalablement prélevées, à une température comprise d'environ 4 C à 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, avec une composition définie dans l'une des revendications 1 ou 2 ; • conservation en statique ou en perfusion dynamique dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, à une température comprise d'environ 4 C à 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, pendant un temps déterminé, en fonction dudit organe ou dudit tissu, ou desdites cellules d'organes ou de tissus, dans une composition définie dans l'une des revendications 1 ou 2. 11. Procédé de conservation d'un organe comprenant les étapes suivantes: • rinçage dudit organe ou dudit tissu préalablement prélevés, ou desdites cellules d'organes ou de tissus préalablement prélevées, à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, avec une composition définie dans l'une des revendications 1 ou 2 ; • conservation en statique ou en perfusion dynamique dudit organe à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C, pendant un temps déterminé, en fonction dudit organe, dans une composition définie dans l'une des revendications 1 ou 2. 12. Procédé de culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes de vertébrés, comprenant les étapes suivantes: • mise en culture des cellules, préalablement prélevées sur un vertébré, à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C,préférentiellement d'environ 15 C à environ 37 C, plus préférentiellement d'environ 25 C à environ 37 C, en particulier environ 37 C, pendant un temps déterminé, en fonction des cellules, dans une composition définie dans l'une des revendications 1 et 3 ; • récolte des cellules par rinçage et lyse du tapis cellulaire. 13. Procédé de culture de cellules d'organes ou de tissus d'organes d'invertébrés, comprenant les étapes suivantes: • prélèvement desdites cellules sur un invertébré; • mise en culture à une température comprise d'environ 4 C à environ 37 C, préférentiellement d'environ 4 C à 25 C, plus préférentiellement d'environ 4 C à environ 15 C, en particulier environ 4 C, pendant un temps déterminé, en fonction des cellules, dans une composition définie dans l'une des revendications 1 et 4 ; • récolte des cellules par rinçage et lyse du tapis cellulaire.