Brevet FR2922024A1 — publié le 20090410

METHODE D'AJUSTEMENT DE LA CALIBRATION DE TESTS DIAGNOSTIQUES La présente invention concerne une méthode directe ou indirecte d'ajustement de la calibration préétablie sur des réactifs destinés à réaliser des tests diagnostiques dans le domaine de la biologie médicale et plus particulièrement celui de l'hémostase. L'hémostase est considérée comme un ensemble de mécanismes physiologiques qui concourent à la prévention et à l'arrêt des saignements. L'hémostase est souvent comparée à une balance, car la fluidité du sang est maintenue grâce à un équilibre entre activateurs et inhibiteurs du processus de coagulation. Toute rupture de cet équilibre fera pencher la balance vers un processus pathologique : la thrombose, résultant de la formation d'un caillot pouvant provenir d'un déficit en inhibiteurs, ou l'hémorragie résultant de saignements pouvant être dus à un déficit en facteurs de la coagulation. L'analyse et le dosage des facteurs activateurs ou inhibiteurs de la coagulation permet ainsi d'établir des diagnostics de prédisposition ou de risques de thrombose ou d'hémorragie dans différentes situations cliniques. Ces tests sont réalisés pour la plupart en routine dans des laboratoires d'analyse ou des hôpitaux, de manière semi-automatisée ou automatisée. Généralement, selon les tests effectués et les instruments utilisés, les résultats consistent soit en un signal mesuré par l'instrument, soit en une activité biologique calculée par l'instrument. Comme pour la plupart des tests biologiques réalisés sur des appareils d'analyse, il est nécessaire lorsque l'on effectue un test automatisé en hémostase, de disposer d'une calibration qui permette de calculer directement le taux ou l'activité du facteur étudié. Ces données de calibration sont obtenues généralement à l'aide de calibrants dont l'activité ou la concentration de l'analyte ciblé est bien caractérisée, et à partir desquels peuvent être établies des courbes de calibration permettant d'attribuer une concentration ou une activité à une intensité de signal donnée. Or, dans la mesure où un même test peut souvent être réalisé sur des automates de gammes différentes, il est fréquent d'observer une variabilité inter-instruments. Cette variabilité ne permet pas toujours de comparer directement, pour un même test, des résultats obtenus sur des appareils différents qui utiliseraient toujours une même calibration standard. Par ailleurs, comme beaucoup de réactifs se présentent sous forme liquide, ceux-ci peuvent être plus sensibles au phénomène de vieillissement que les réactifs sous forme lyophilisée. De ce fait, même si ces réactifs restent fonctionnels pendant un certain temps, ils peuvent néanmoins voir leur sensibilité diminuer en partie ou évoluer en fonction du temps. Il en résulte alors une difficulté pour interpréter les résultats obtenus à partir d'un même réactif mais découlant de tests réalisés sur des périodes différentes. La demande US 2007/0020765 décrit une méthode pour standardiser le temps de coagulation d'un échantillon, dans laquelle on utilise au moins deux calibrants pour lesquels des temps de coagulation standards ont été prédéterminés dans le même système de test que celui appliqué à l'échantillon, et à partir desquels on établit une courbe de calibration entre les temps standards prédéterminés et les temps réels mesurés pour ces mêmes calibrants, dans le test utilisé. Le temps de coagulation mesuré dans l'échantillon est converti en temps de coagulation standardisé à l'aide de la courbe de calibration ainsi établie. Cette méthode consiste donc à créer localement une calibration chaque fois que l'on utilise un nouveau kit pour mesurer un temps de coagulation dans un test d'hémostase. La présente invention vise à fournir une méthode d'ajustement pour des instruments d'analyse et les réactifs précalibrés associés, ladite methode permettant de limiter ou d'éviter des fluctuations des résultats obtenus au cours du temps et/ou selon le type d'instrument utilisé pour les tests. La présente invention a ainsi pour objet une méthode d'ajustement, soit du signal mesuré ou de l'activité calculée par l'instrument, soit d'une courbe de calibration préétablie (courbe de précalibration) pour un test diagnostique en biologie médicale, réalisé sur un instrument avec des réactifs précalibrés, comprenant les étapes suivantes : (i) établir une valeur de signal ou d'activité, dite valeurstandard, pour un unique ou pour deux ajusteur(s) de calibration ayant une concentration ou une activité prédéterminée en un composé testé, et mesurer pour cet ou ces ajusteurs(s) l'écart entre la (ou les) valeur(s) standard de signal ou d'activité et la (ou les) valeur(s) soit du signal mesurée par l'instrument soit de la (ou des) valeur(s) d'activité calculée(s) à partir de la courbe de précalibration et, si l'écart mesuré a une valeur acceptable, (ii) ajuster le signal mesuré par l'instrument la ou (les) valeur(s) de la courbe de précalibration de manière à ce que la valeur du signal mesuré ou de l'activité calculée sur la courbe de précalibration pour l'unique ou les deux ajusteur(s) soit ramenée à une valeur de signal ou d'activité identique à la valeur de signal ou d'activité standard déterminée dans l'étape (i) pour l'ajusteur unique ou pour chacun des deux ajusteurs, (iii) appliquer le même ajustement que celui décrit en (ii) à tous les échantillons testés dont le signal ou l'activité est mesuré avec lesdits réactifs précalibrés. Préférentiellement, la méthode de l'invention est mise en oeuvre dans un test d'exploration de la coagulation sanguine. On entend par écart mesuré ayant une "valeur acceptable", un écart qui reste compris entre deux valeurs de la gamme des valeurs considérées comme admissibles par l'homme du métier, pour le réactif et l'instrument utilisés. Cette différence peut être plus ou moins importante en fonction de la sensibilité du test mis en oeuvre et de l'ordre de grandeur des signaux mesurés. De ce fait, la limite au-delà de laquelle l'ajustement de la précalibration ne sera plus acceptable doit être définie par rapport au type de test et d'instrument mis en oeuvre. L'homme du métier qui est habitué à analyser les résultats fournis par les automates d'analyse peut facilement détecter lorsqu'il réalise des tests, les valeurs à partir desquelles les résultats sont considérés comme anormaux, que ce soit du fait du réactif utilisé ou de l'instrument. II est ainsi capable de définir des écarts entre les valeurs de signal ou d'activité standard et les valeurs de signal mesuré par l'instrument ou d'activité calculée sur la courbe de précalibration selon l'étape (i) de la méthode de l'invention, qui soient suffisamment faibles pour ne pas masquer des anomalies des réactifs ou des appareils utilisés. De préférence, l'écart mesuré est d'au maximum 20 à 30 %. Selon une variante préférée, la méthode de l'invention est réalisée avec un seul ajusteur. L'ajusteur utilisé dans le cadre de la méthode de l'invention est une composition qui permet : lors de l'utilisation d'un nouveau lot de réactifs, d'ajuster les résultats d'analyse rendus, à l'instrument mis en oeuvre pour réaliser le test tout en utilisant la précalibration. L'objectif est de recentrer les contrôles lorsqu'ils sont systématiquement décalés. au fur et à mesure du temps, de compenser une perte de sensibilité du réactif par exemple due à son vieillissement. Comme cela a été indiqué plus haut, ce point concerne particulièrement les réactifs liquides qui sont moins stables au cours du temps que les réactifs lyophilisés. La composition de l'ajusteur en facteurs de la coagulation ou autres composants est définie en fonction du test réalisé. L'ajusteur doit contenir au moins le composé étudié dans le test mis en oeuvre, dont la concentration ou l'activité est prédéterminée. Dans le cas d'un test d'exploration de la coagulation sanguine, l'ajusteur est de préférence constitué par du plasma lyophilisé stabilisé ou par un pool de plasmas lyophilisés stabilisés. II peut également être constitué par des protéines plasmatiques purifiées ou semi-purifiées, lesdites protéines constituant l'apport des facteurs nécessaires au déroulement de la réaction produite dans le cadre du test réalisé et comprenant en outre le composé étudié (encore appelé facteur étudié), dont la concentration ou l'activité est prédéterminée. La concentration ou le taux d'activité du facteur étudié utilisée dans l'ajusteur doit être choisie de façon à réduire au maximum l'influence d'un éventuel bruit de fond sur la correction de la précalibration. Pour ce faire, la concentration ou l'activité du composé testé de l'ajusteur est fixée de façon à ce que le rapport signal / bruit de fond soit élevé. Selon le type de test mis en oeuvre, la relation entre le signal mesuré et l'activité ou la concentration du composé étudié de l'ajusteur est différente. De ce fait, on obtient des courbes dont les profils sont différents selon les tests. Par exemple, dans le cas d'un dosage de l'antithrombine (AT) tel que celui proposé par le kit STA-Stachrom ATIII, commercialisé par Diagnostica Stago, la DDO (delta DO) diminue quand la concentration en ATIII augmente. Or, la concentration en ATIII étant plus faible en situation pathologique qu'en situation normale, la concentration en AT de l'ajusteur pour la mise en oeuvre de la méthode d'ajustement selon l'invention, sera choisie pour que l'ajusteur soit positionné dans une zone couvrant une valeur pathologique (i.e. faible quantité d'ATIII). Inversement, dans le cas d'un dosage de la protéine C tel que celui proposé par le kit STA-Stachrom Protein C (Diagnostica Stago), l'ajusteur sera positionné sur une zone correspondant à la normalité de la concentration en Protéine C, car le signal mesuré augmente proportionnellement avec la quantité de protéine C, et la zone de normalité est délimitée par les valeurs supérieures en taux de protéine C. Dans le cas du dosage du D-Dimère comme par exemple celui réalisé par le kit STA-Liatest D-Di (Diagnostica Stago), on observe que le signal augmente avec la quantité de D-Di. Or, en situation de normalité, le taux de D-Dimère est plus faible qu'en situation pathologique. L'ajusteur selon l'invention sera donc choisi de façon à ce que le signal observé soit positionné en zone pathologique. La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre pour tout type de test d'exploration de la coagulation sanguine tel qu'un TCA (temps de Céphaline Activée), un TP (temps de Prothrombine ou temps de Quick) ou un TT (temps de Thrombine), ou tout autre test enzymologique classique basé sur des mesures de densité optique (DO) ou de temps. Elle peut également être appliquée à des tests de type dosage immunologique en phase solide dispersée, basés sur la mesure photométrique de l'augmentation de turbidité d'une suspension de microsphères. Les exemples ci-après illustrent la présente invention. Exemple n°1 : Etude de l'ajustement de la précalibration du STA Liatest D-Di : Faisabilité de la correction des DDO en un point sur la perte de réactivité liée au vieillissement du réactif. La méthode de l'invention est appliquée sur un test commercialisé sous le nom STA-Liatest D-Di par la société Diagnostica Stago. II s'agit d'un kit de dosage des D-Dimères plasmatiques (D-Di) par immunoturbidimétrie à l'aide de microsphères de latex recouvertes par deux anticorps monoclonaux anti-D-Dimères. En présence de l'analyte (D-Dimère), la réaction de type antigène/anticorps entraîne une agglutination des particules de latex, qui induit une augmentation de la turbidité du mélange réactionnel. Celle-ci est mesurée sur un analyseur de la gamme STA (Diagnostica Stago) en mode cinétique à 540 nm pendant 140 secondes, conformément aux 30 indications de la notice du kit. L'augmentation de l'absorbance est proportionnelle à la concentration en D-Dimères de l'échantillon testé. Les réactifs du kit sont liquides, prêts à l'emploi. Pour chaque lot de réactifs, une précalibration est fournie par papillon code-barré. Les coefficients de la précalibration du lot utilisé sont ainsi directement transmis à l'instrument par simple lecture du papillon code-barré. Des plasmas de contrôle (contrôle Positif et contrôle Négatif) permettent la validation de l'étalonnage et des séries de dosage. La mesure de la concentration en D-Di a été réalisée une première fois à T=0 (Tableau 1) sur 4 échantillons de plasma avec un lot spécifique de STA Liatest D-Di, puis une seconde fois sur les mêmes échantillons et avec le même lot, 20 mois plus tard (à T=20 mois) (Tableau 2). Les plasmas utilisés sont des plasmas de niveau dont les valeurs cibles pour le paramètre mesuré (D-Di) sont déterminées : (valeur cible = valeur moyenne établie sur un grand nombre de tests expérimentaux) û RIN2 est un plasma dont la valeur cible en D-Di est à 0,58 pg/ml û PN2 est un plasma dont la valeur cible en D-Di est à 0,83 pg/mI. - LCP est un plasma contrôle pathologique (STA Liatest Control P), ciblé à 2,40 pg/ml en D-Di. û P2 est un autre plasma pathologique. Le point d'ajustement utilisé dans cet exemple est le � STA Liatest Control P � (LCP). Les DDO sont mesurées sur 10 intruments de la gamme STA. Les DDO mesurées par chaque instrument ont été corrigées par un coefficient qui est calculé par le ratio de la DDO standard de ce réactif, égale à 0,129, sur la DDO moyenne d'un quadruplet (X4) obtenue sur chaque instrument. Cette DDO standard de 0,129 correspond à la moyenne des DDO obtenues sur un lot de STA Liatest Control P (LCP dans cet exemple), lors de la détermination de la précalibration du lot de STA Liatest D-Di utilisé. Quatre niveaux de concentration ont été testés sur un lot STA Liatest D-Di spécifique précalibré à T=0. Les tableaux 1 et 2 donnent respectivement les résultats obtenus à T=0 (tableau 1) et à T=20 mois (tableau 2). Les résultats du tableau 3, qui sont ceux obtenus à T=20 mois après ajustement par le LCP, sont très proches de ceux obtenus initialement à T=0 (tableau 1). En conclusion : l'ajustement en un point des DDO permet de retrouver 20 mois plus tard avec le réactif précalibré à T=0 (Tableau 3) des concentrations moyennes équivalentes à celles obtenues à T=0 (Tableau 1) . L'ajustement en un point des DDO mesurées est donc efficace pour compenser la perte de sensibilité du STA Liatest D-Di. Tableau 1 : Concentrations en D-Dimère (pg/ml) obtenues à T=0 avec le réactif précalibré RIN2 PN2 P2 LCP MIN 0,55 0,79 2,30 2,33 MAX 0,66 0,88 2,56 2,53 MOY 0,59 0,84 2,46 2,45 SD 0,032 0,032 0,079 0,067 CV (%) 5,47 3,86 3,20 2,73 Tableau 2 : Concentrations en D-Dimère (pg/ml) obtenues à T=20 mois avec le réactif précalibré RIN2 PN2 P2 LCP MIN 0,50 0,71 1,98 2,00 MAX 0,60 0,79 2,19 2,17 MOY 0,54 0,75 2,11 2,10 SD 0,029 0,028 0,064 0,054 CV (%) 5,43 3,77 3,04 2,59 Tableau 3 : Concentrations en D-Dimère (pg/ml) obtenues à T=20 mois avec le réactif précalibré et après ajustement des DDO sur chaque instrument par le LCP RIN2 PN2 P2 LCP MIN 0,57 0,82 2,40 MAX 0,66 0,90 2,61 MOY 0,60 0,85 2,49 REF SD 0,028 0,028 0,070 CV (%) 4,67 3,29 2,82 Exemple n°2 : Etude de l'ajustement de la précalibration pour le STA Liatest Free PS. L'étude est réalisée à partir d'un autre kit commercialisé par Diagnostica Stago, le STA Liatest Free PS. Il s'agit d'un kit du même type que le précédent, qui permet un dosage quantitatif de la protéine S libre par méthode immuno-turbidimétrique. La mesure est effectuée sur 10 instruments STA Elle est réalisée sur différents lots de plasma, à savoir : Un plasma contrôle normal et un plasma contrôle pathologique (LCN et LCP : STA Liatest Control N+P û). Un plasma à 53 % : il s'agit d'un plasma pathologique lyophilisé. Un pool congelé de plasmas unitaires (pool Stago). Un plasma unitaire congelé. Le tableau 4 indique les concentrations en protéine S libre (%) obtenues avec la calibration de chaque appareil par un calibrant interne. Le tableau 5 indique les concentrations en protéine S libre (%) obtenues avec la précalibration commerciale appliquée sans ajustement : précalibration non ajustée. Le tableau 6 indique les concentrations en protéine S libre (%) obtenues avec la précalibration commerciale après ajustement des DDO en un point sur le pool Stago : précalibration ajustée. Tableau 4 : Concentrations en Protéine S libre (%) obtenues avec la calibration de chaque instrument par un calibrant interne Résultats LCP Plasma LCN Pool Plasma 53 % Stago unitaire MIN 25.07 50.07 78.20 88.24 86.71 MAX 27.09 55.82 84.85 97.89 113.21 MOY 25.75 53.00 80.88 93.96 103.54 SD 0.63 1.80 2.32 2.81 7.63 CV 2.45 3.40 2.87 2.99 7.36 Tableau 5 : Concentrations en Protéine S libre (%) obtenues avec la précalibration commerciale appliquée sans aucun ajustement Résultats LCP Plasma LCN Pool Plasma 53 % Stago unitaire MIN 24.35 46.77 70.57 81.89 77.84 MAX 27.51 57.79 94.48 104.71 125.35 MOY 26.05 52.72 80.58 93.79 103.82 SD 0.92 3.49 7.39 7.29 12.18 CV 3.55 6.62 9.16 7.77 11.74 Tableau 6 : Concentrations en Protéine S libre obtenues avec la précalibration commerciale après ajustement des DDO et en un point sur le pool Stago Plasma Pool Plasma Résultats LCP LCN 53 % Stago unitaire MIN 25.11 51.03 77.05 88.86 MAX 26.78 54.08 84.78 113.03 MOY 26.07 52.68 80.24 REF 103.47 SD 0,58 1,04 2,45 6,87 CV 2,22 1,97 3,06 6,64 La variabilité inter-instruments mesurée sur 10 STA pour des concentrations supérieures à 50 % est très marquée avec le STA Liatest Free PS précalibré 10 (précalibration non ajustée). Ainsi, le CV inter-instruments sur LCN est de 9.16 % sur la précalibration non ajustée contre 2.87 % sur la calibration de chaque instrument et 2,45 % sur la précalibration ajustée. De la même manière, la variabilité inter-instruments est améliorée sur le plasma à 53 % (dans la zone décisionnelle) et sur le LCP à 26 % lorsque la précalibration est ajustée : Plasma à 53 % : CVcal. instrument = 3.40 % . CVprécal. non ajustée = 6.62 %, CVprecal. ajustée = 1.97 %. Plasma LCP à 26 % : CVcal. instrument = 2.45 % . CVprécal. non ajustée = 3,45 %, CVprecal. ajustée = 2,22 %. En conséquence, l'ajustement en un point de la précalibration permet de retrouver, à tous les niveaux de concentration, des CV inter-instruments : - meilleurs que ceux obtenus avec la précalibration non ajustée - au moins équivalents à ceux obtenus avec une calibration de chaque instrument par un calibrant interne. En conclusion, la variabilité inter-instruments est nettement améliorée sur le STA Liatest Free PS par la méthode d'ajustement en un point des DDO selon l'invention.20 REVENDICATIONS 1. M éthode d 'ajustement, s oit d u s ignal m esuré o u de l'activité c alculée par l'instrument, soit d'une courbe de calibration préétablie (courbe de précalibration) pour u n test d iagnostique e n b iologie médicale, réalisé sur u n instrument avec des réactifs précalibrés, comprenant les étapes suivantes : (i) établir une valeur de signal ou d'activité standard pour un unique ou pour deux ajusteur(s) de calibration ayant une concentration ou une activité prédéterminée en un composé testé, et mesurer pour cet ou ces ajusteurs(s) l'écart entre la (ou les) valeur(s) de signal ou d'activité standard et la (ou les) valeur(s) soit du signal mesurée par l'instrument soit de la (ou des) valeur(s) d'activité calculée(s) à partir de la courbe de précalibration, et, si l'écart mesuré a une valeur acceptable, (ii) ajuster le signal mesuré par l'instrument ou les valeurs de la courbe de précalibration de manière à ce que la valeur du signal mesuré ou de l'activité calculée sur la courbe de précalibration pour l'unique ou les deux ajusteur(s) soit ramenée à une valeur de signal ou d'activité identique à la valeur de signal ou d'activité standard déterminée dans l'étape (i) pour l'ajusteur unique ou pour chacun des deux ajusteurs, (iii) appliquer le même ajustement que celui décrit en (ii) à tous les échantillons dont le signal ou l'activité est mesuré avec lesdits réactifs précalibrés. 2. Méthode d'ajustement selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre dans un test d'exploration de la coagulation sanguine. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la concentration ou l'activité du composé testé de l'ajusteur est fixée de façon telle que le rapport 30 signal/bruit soit élevé dans le test considéré. 4. Méthode d'ajustement selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que l'on utilise un seul ajusteur. 13 5. Méthode d'ajustement selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'écart mesuré selon l'étape (i) est d'au maximum 20 à 30%. 6. Méthode d'ajustement selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que la composition de l'ajusteur en facteurs de la coagulation est définie en fonction dudit test d'exploration de la coagulation, ledit ajusteur contenant au moins le composé étudié dans le test mise en oeuvre, dont la concentration ou l'activité a été prédéterminée. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que l'ajusteur est constitué par du plasma lyophilisé stabilisé ou d'un pool de plasmas lyophilisés stabilisés. 8. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisée en ce que l'ajusteur est constitué par des protéines plasmatiques purifiées ou semi-purifiées, lesdites protéines constituant l'apport des facteurs nécessaires au déroulement de la réaction produite dans le cadre du test réalisé et comprenant en outre le composé étudié, dont la concentration ou l'activité est prédéterminée. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que le test d'exploration de la coagulation sanguine est un test de type dosage immunologique en phase solide dispersée. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans laquelle le test d'exploration fonctionnelle est un test de dosage des D-Dimères. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans laquelle le test d'exploration de la coagulation est un TCA, un TP, un TT ou tout autre test enzymologique classique. 12. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour corriger l'influence de l'évolution des réactifs, notamment des réactifs liquides, utilisés dans un automate donné pour la mise en oeuvre d'un test diagnostique en biologie médicale, notamment du fait de la durée de conservation desdits réactifs. 13. Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour corriger l'influence de l'instrument utilisé lors d'un test diagnostique en biologie médicale. 14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que le test est un test d'exploration de la coagulation sanguine. 15. Ajusteur de calibration pour un test d'exploration de la coagulation sanguine selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasma lyophilisé stabilisé ou d'un pool de plasmas lyophilisés stabilisés, dont la concentration ou l'activité en un composé testé dans un test d'exploration de la coagulation est prédéterminée. 16. Ajusteur de calibration pour un test d'exploration de la coagulation sanguine selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, caractérisé en ce que qu'il s'agit des protéines plasmatiques purifiées ou semi-purifiées, lesdites protéines constituant l'apport des facteurs nécessaires au déroulement de la réaction produite dans le cadre du test réalisé et comprenant en outre le composé étudié, dont la concentration ou l'activité est prédéterminée. 17. Ajusteur de calibration selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que la concentration ou l'activité en composé testé est choisie dans une zone correspondant à un rapport signal / bruit élevé pour ledit test d'exploration.