Brevet FR2916451A1 — publié le 20081128

SYSTEME DE CULTURE DE CELLULES BIOLOGIQUES La présente invention concerne un système permettant la culture de cellules biologiques vivantes, et également le transport de ces cellules dans des conditions permettant leur maintien en vie. Les cellules biologiques sont des organismes très fragiles, qui nécessitent des conditions environnementales favorables pour pouvoir se développer et être maintenues en vie. Ces conditions s'expriment, par exemple, en termes de température, d'éclairement, de salinité du milieu, ou encore de quantité d'oxygène fournie aux cellules. Il est connu, pour la culture de cellules biologiques, d'utiliser du matériel de laboratoire tel que des boîtes de Petri. Ces boites sont des boîtes cylindriques peu profondes, dans lesquelles on dépose des cellules biologiques à cultiver sur un gel nutritionnel, appelé gélose, comprenant tous les éléments nécessaires au développement de ces cellules. Ces boîtes sont réalisées en verre ou en plastique, et elles sont donc soumises à toutes les variations de température de l'environnement dans lequel elles sont situées. Ainsi, pour maintenir ces boîtes à une certaine température, il est nécessaire de les placer dans un réfrigérateur ou dans une étuve, rendant ainsi leur transport difficile. Une alternative à ces boîtes de Petri consiste en des plaques comportant plusieurs cavités dans lesquelles on dépose des cellules dans un milieu de culture. Ces plaques, par exemple utilisées pour réaliser des séries de test immunologiques, présentent les mêmes inconvénients que les boîtes de Petri, à savoir qu'elles doivent être placées dans un environnement à température constante tel qu'une étuve. On connaît également, pour le chauffage de tubes à essais ou de micro-tubes, des blocs comprenant des emplacements permettant de recevoir les différents éléments à chauffer. Ces blocs sont installés dans un appareil de chauffage électrique, souvent appelé thermobloc, permettant à un utilisateur de réguler la température. Ces dispositifs présentent toutefois plusieurs inconvénients pour la culture et le transport des cellules. En effet, ce sont des dispositifs de taille relativement grande, ce qui peut les rendre difficiles à transporter. En outre, ils nécessitent l'utilisation de tubes à essais, puisqu'il n'est pas possible de placer directement les cellules biologiques dans les cavités des blocs. Or, les tubes à essais sont des objets relativement fragiles, qui risquent donc de se casser pendant le transport, et leur utilisation nécessite des efforts importants en termes d'entretien et de maintenance. L'invention vise à remédier à au moins une partie de ces inconvénients en proposant un système, permettant la culture et le transport de cellules, qui soit économe en termes de place, et qui soit également facile à utiliser. Ainsi, l'invention concerne un système pour la culture de cellules biologiques, comprenant une ou plusieurs cavités, destinées à recevoir les cellules biologiques, creusées dans une plaque de substrat. Ce système est caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif électronique de contrôle de la température des cavités, ce dispositif comprenant : - un élément chauffant, et - un élément de régulation de température, ces deux éléments étant réalisés sur une surface active d'un matériau semi- conducteur, à proximité des cavités. Dans une réalisation avantageuse de l'invention, le matériau à semi-conducteur est du silicium. Afin de maintenir une cellule en vie, il est nécessaire, à la fois, de la maintenir à une température constante, par exemple 37 C, et également de lui apporter de l'oxygène. La première condition, à savoir le maintien à une température constante, est remplie en utilisant plusieurs dispositifs électroniques. Le premier de ces dispositifs est un élément chauffant, qui permet d'apporter de l'énergie calorifique à la cavité, sous forme d'une polarisation électrique. Selon les réalisations cet élément chauffant est, par exemple, une résistance ou un transistor de chauffe. Le système comprend également un dispositif permettant de réguler cette température. Cet élément de régulation est, par exemple, une diode dont la caractéristique électrique varie en fonction de la température. Afin que le dispositif de contrôle de température soit efficace il est utile, dans une réalisation, qu'il comprenne un asservissement électronique entre l'élément chauffant et la diode variable. Le dispositif de contrôle de température est alimenté via une alimentation électrique extérieure. A cet effet, dans une réalisation, le système comprend des connexions métalliques permettant de relier les éléments du dispositif de contrôle à l'alimentation extérieure. Cette alimentation extérieure prend la forme, par exemple, d'une batterie ou d'une ou plusieurs piles. Les différents éléments composant le dispositif de contrôle de température sont des composants électroniques, et ils sont donc sensibles aux conditions environnementales dans lesquelles ils sont placés. Afin d'éviter toute détérioration de ces composants, notamment au cours d'un transport du système, il est utile de prévoir, dans une réalisation, une couche protectrice disposée sur ces différents éléments. Cette couche de protection des dispositifs électroniques est, dans un mode de réalisation, une couche de passivation, par exemple composée d'oxyde et de nitrure. La seconde condition à remplir pour assurer un maintien en vie des cellules conservées dans le système est que ces cellules soient alimentées en oxygène. A cet effet, dans une réalisation, les cavités destinées à recevoir les cellules sont en contact avec l'air extérieur. La mise en contact est effectuée soit par une ouverture complète des cavités, soit par des orifices pratiqués dans une couche de protection placée sur les cavités. En ce qui concerne le positionnement des cavités dans le système, plusieurs modes de réalisation sont envisagés, indépendants les uns des autres. Ces différents modes, présentés ci-après, seront ultérieurement détaillés à l'aide de figures. Le premier mode de réalisation consiste à creuser les cavités dans le matériau semi-conducteur supportant les éléments du dispositif de contrôle de température. Toutefois, les cavités sont creusées sur une autre surface du matériau que celle supportant ces éléments, typiquement sur la face arrière non active. Ce premier mode de réalisation présente l'avantage de ne pas requérir l'emploi de matériaux autres que le semi-conducteur présent dans le système. En conséquence, la gravure complète des cavités peut être effectuée dans un seul et même équipement de fabrication de composants électroniques à semi-conducteurs. Dans ce mode de réalisation, les cavités sont directement creusées en profondeur d'une face du matériau semi-conducteur, par exemple du silicium. Or, sur l'autre face, active, se trouvent les éléments formant le dispositif de contrôle de température. Il est donc utile de prévoir des moyens pour garantir que la gravure permettant la création des cavités n'atteigne pas les éléments situés sur l'autre face de la couche de silicium. A cet effet, dans une réalisation, la couche de matériau semi-conducteur comprend une couche d'arrêt de gravure, la gravure étant effectuée par voie électrochimique. En variante, la couche de matériau semi-conducteur comprend une couche isolante de type silicium sur isolant .35 Un deuxième mode de réalisation consiste à creuser les cavités dans un substrat polymère. En effet, un substrat polymère est moins coûteux que du silicium ou autre semi-conducteur, et son utilisation permet ainsi de réaliser des cavités plus profondes, puisqu'elles peuvent être creusées dans une couche plus épaisse que lorsqu'elles sont creusées dans le silicium. Le substrat polymère utilisé est, par exemple, du poly(diméthylsiloxane), dit PDMS, c'est à dire un polymère dont le squelette moléculaire comporte un enchaînement silicium-oxygène, ainsi que deux groupements méthyle portés par le silicium tétravalent. Ce substrat polymère est déposé sur la face active du matériau semi-conducteur, le silicium. Ce silicium sert alors de support mécanique aux cavités, puisqu'il forme le fond des cavités, et il permet également le contrôle en température. Un troisième mode de réalisation, enfin, consiste à creuser les cavités sur la face inactive du silicium, comme dans le premier mode décrit, et à en augmenter la profondeur en ajoutant, sur cette face inactive, un substrat polymère, similaire à celui utilisé dans le deuxième mode de réalisation. En variante de ce troisième mode de réalisation, on utilise, à la place du substrat polymère, une plaque de verre. Le substrat polymère et/ou la plaque de verre sont ajourés au niveau des cavités creusées dans le silicium, formant ainsi des parois permettant d'augmenter la profondeur des cavités. Ces différents modes de réalisation vont maintenant être détaillés à l'aide des figures 1 et 2, les descriptions étant effectuées à titre non limitatif. La figure 1 représente une mise en oeuvre du premier mode de réalisation. Dans cet exemple, le système de culture de cellules biologiques est réalisé à partir d'un substrat 1 en silicium monocristallin. Sur une face active de la couche 1 de silicium, on réalise un élément chauffant 2, sous forme d'une résistance ou d'un transistor, ainsi qu'un élément de régulation et/ou contrôle de la température, sous forme d'une diode variable 3. Ces composants électroniques sont réalisés de la façon suivante : - tout d'abord, on définit sur la surface de silicium des zones destinées à être actives, et des zones destinées à être des zones d'isolation entre les composants, - ensuite on procède au dopage des zones actives, et à l'activation des dopants, - puis on réalise des connexions métalliques 5, destinées à permettre l'alimentation des composants via l'utilisation d'une alimentation électrique extérieure, et - enfin, on dépose une couche de protection 7, pour isoler les composants électroniques de l'extérieur. 15 Les connexions métalliques ont, par exemple, une hauteur de l'ordre de deux micromètres. Dans une variante, ces connexions métalliques peuvent atteindre une épaisseur inférieure à un micromètre. Dans cette réalisation, ainsi que mentionnée précédemment, les cavités 4 sont creusées sur la surface arrière de la couche 1 de silicium 20 monocristallin. A cet effet, on utilise un masque spécifique appliqué sur la face arrière de silicium, ce masque étant ajouré au niveau des zones devant être creusées pour la formation de cavités. Un tel masque, sous forme d'une matrice, permet de réaliser plusieurs cavités à l'intérieur du silicium. 25 La profondeur des cavités ainsi creusées varie généralement entre 250 et 600 micromètres. L'épaisseur non creusée du substrat, c'est à dire la couche se situant entre le fond des cavités et la surface active du silicium, est par exemple de l'ordre d'une dizaine de micromètres. 30 Le creusement des cavités est, par exemple, effectué par gravure électrochimique. Dans certaines réalisations, une couche d'arrêt 6 de gravure électrochimique est située à l'intérieur du substrat de silicium de manière à fixer le fond des cavités creusées. 10 On utilise, par exemple, une couche d'oxyde isolante, formant alors, avec le substrat de silicium, un assemblage de type silicium sur isolant. Une telle couche d'oxyde, dans une structure silicium sur isolant, sépare le silicium passif, utilisé pour la tenue mécanique de l'ensemble, du silicium actif en surface du substrat. Ainsi, au cours d'un procédé de gravure du silicium sur la face arrière, ou inactive, du substrat, l'attaque chimique est naturellement stoppée au niveau de cette couche. Dans le cadre de ce mode de réalisation, le système pour la culture de cellule est donc créé directement à partir d'une plaque de substrat présentant une structure Silicium sur Isolant. Le système ainsi créé comprend donc une plaque 1 de silicium, contenant éventuellement une couche isolante, plaque dans laquelle sont creusées des cavités 4, ou puits. Le système comprend également un dispositif de chauffe et de régulation de température installé au fond des puits destinés à recevoir les cellules à cultiver. Le procédé de fabrication d'un système selon ce premier mode de réalisation est relativement simple, puisque l'ensemble du système est réalisé dans un seul substrat, et ne nécessite donc pas d'assemblage pour la réalisation des cavités. La figure 2 représente une mise en oeuvre avantageuse du deuxième mode de réalisation décrit dans la présente demande. Dans cette deuxième solution, on utilise toujours un substrat 1 de silicium, sur la face active duquel sont implantés un dispositif de chauffage 2 ainsi qu'un dispositif de régulation de température 3. Les caractéristiques et la réalisation de ces éléments sont identiques à celles du premier mode de réalisation, ainsi que décrit à l'aide de la figure 1. L'objectif de ce deuxième mode de réalisation est de fournir un système de culture disposant de cavités plus profondes que celles décrites précédemment. En effet, il a été mentionné que dans le cadre du premier mode de réalisation, la profondeur des cavités était de l'ordre de 250 à 600 micromètres, ce qui peut s'avérer insuffisant pour le transport et la culture de certaines cellules nécessitant la présence de liquide nutritif. Ce deuxième mode de réalisation peut ainsi être envisagé lorsque l'on souhaite obtenir un système avec des cavités présentant une profondeur de l'ordre du millimètre. En effet, dans le mode de réalisation précédemment décrit, il est difficile d'atteindre de telles dimensions puisque la profondeur de la cavité peut être limitée par l'épaisseur de la couche de passivation déposée, par exemple une couche d'oxyde et de nitrure. Ainsi, dans ce deuxième mode de réalisation, on a envisagé l'idée de creuser les cavités non pas directement dans le substrat de silicium, mais dans une couche d'un autre matériau déposée sur ce substrat. Le matériau employé est, par exemple, du polymère ou du verre. Ces matériaux présentent, en outre, l'avantage d'être moins coûteux et plus faciles à creuser que le silicium, facilitant ainsi la réalisation des cavités d'une profondeur de quelques millimètres. Dans l'exemple décrit ici, le matériau polymère utilisé est du poly (dimethylsilane), dit PDMS, ou un polyimide. La réalisation du système consiste, dans ce cas, à creuser un film de PDMS de façon à créer une matrice de cavités, puis à déposer ce film sur le substrat de silicium 1. Dans ce mode de réalisation, le film de PDMS est déposé sur la surface active du silicium, de façon à ce que les fonds des cavités soient relativement proches des éléments de chauffage 2 et de régulation de température 3. En effet, le substrat de silicium, d'une épaisseur de l'ordre de quelques centaines de micromètres, réalise une certaine isolation thermique qui ne permettrait pas un bon chauffage des cavités si ces dernières étaient situées en surface de la face arrière du silicium. Ainsi que décrit précédemment, il est utile que les composants électroniques de chauffage et de régulation soient isolés de l'extérieur par une couche protectrice 7. Dans le cas présent, cette couche protectrice 7 forme également le fond des cavités, puisque le film de PDMS est entièrement ajouré au niveau de ces cavités. Ainsi, le substrat de silicium est, dans ce cas, utilisé uniquement en tant que support mécanique des cavités, ainsi qu'en tant que base du système de chauffage et régulation de la température. Dans un troisième mode de réalisation, non montré sur les figures, on utilise un compromis entre les deux modes de réalisation précédemment décrits. En effet, dans cette solution, les cavités sont creusées sur la face arrière du silicium, et leur profondeur est augmentée à l'aide d'un matériau polymère tel que le PDMS, ou un polyimide, déposé sur les zones non creusées de la face arrière de la couche de silicium, ou encore une plaque de verre collée sur le silicium, ajourée au niveau des cavités. Ce troisième mode de réalisation trouve une application particulièrement avantageuse dans le cas où l'on souhaite observer les cellules biologiques contenues dans le système, par exemple en utilisant un microscope en transmission. Pour que les observations effectuées par ce microscope soient correctes et exploitables, il est utile que l'épaisseur du fond des cavités soit faible, par exemple inférieure à une dizaine de micromètres, afin de permettre le passage d'une partie du spectre lumineux à travers le silicium. Ainsi, il est particulièrement utile de pouvoir disposer de cavités profondes, mais ayant un fond de faible épaisseur. Une solution pour obtenir un tel système consiste donc d'une part à creuser les cavités dans le silicium pour diminuer l'épaisseur de silicium restant, et à augmenter la profondeur de ces cavités en ajoutant, en surface du silicium, une couche de polymère ou d'un autre matériau tel que du verre. Par ailleurs, il est indispensable, pour la culture des cellules, qu'elles puissent être oxygénées. Cet apport en oxygène est rendu possible grâce au fait que les cavités sont ouvertes vers l'extérieur. REVENDICATIONS 1. Système pour la culture de cellules biologiques, comprenant une ou plusieurs cavités (4), destinées à recevoir les cellules biologiques, creusées dans une plaque de substrat (1), et caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif électronique de contrôle de la température des cavités, ce dispositif comprenant : - un élément chauffant (2) et - un élément de régulation de température (3), ces deux éléments étant réalisés sur une surface active d'un matériau semi-conducteur, à proximité des cavités (4). 2. Système selon la revendication 1, caractérisé en ce que le matériau semi-conducteur est du silicium. 3. Système selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'élément chauffant (2) est une résistance et/ou un transistor. 4. Système selon l'une des revendications précédentes, 20 caractérisé en ce que l'élément de régulation (3) de température est une diode variable. 5. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif de contrôle de température 25 comprend en outre un asservissement entre l'élément de chauffage (2) et l'élément de régulation de température (3). 6. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des connexions métalliques 30 (5) permettant de relier les éléments du dispositif de contrôle de température à une alimentation électrique extérieure. 7. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une couche protectrice (7) 35 déposée sur les éléments du dispositif de contrôle de température.15 8. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cavités (4) destinées à recevoir les cellules biologiques sont en contact avec l'air extérieur, pour permettre un apport en oxygène aux cellules. 9. Système selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cavités sont creusées sur une surface du matériau semi-conducteur autre que celle supportant les éléments du dispositif de contrôle de température. 10. Système selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend, à l'intérieur de la couche de matériau semi-conducteur, une couche d'arrêt de gravure (6), par exemple une couche isolante. 11. Système selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les cavités sont creusés dans un substrat polymère. 12. Système selon la revendication 11, caractérisé en ce que le substrat polymère est déposé sur la surface active du matériau 20 semi-conducteur. 13. Système selon la revendication 11, caractérisé en ce que le substrat polymère est déposé sur une surface du matériau semi-conducteur ne comportant pas le dispositif de contrôle de la 25 température. 10 15