Brevet FR2918568A1 — publié le 20090116

La présente invention se rapporte à la modulation du récepteur P2X7 et plus précisément à un mode d'administration de l'acide hyaluronique ou de l'un de ses dérivés antérieurement à l'administration d'une substance active comprenant un conservateur qui induit des effets délétères sur le récepteur P2X7. L'invention se matérialise notamment en une trousse. 1. Vieillissement cellulaire, stress oxydant, apoptose et récepteur P2X7 Le vieillissement est généralement associé à des phénomènes de stress oxydant qui aboutissent à des mécanismes de mort cellulaire directe dit de nécrose ou des mécanisme retardées dit d'apoptose. Ces deux mécanismes se distinguent principalement du fait que l'apoptose est une mort cellulaire programmée et active alors que la nécrose correspond à l'éclatement d'une cellule en contact avec un milieu non viable. Les agents inducteurs de tous ces stress sont nombreux et les mécanismes encore mal connus. Plus récemment, les études de pathologies associées au vieillissement et à la dégénérescence cellulaire ont permis de comprendre le rôle particulier de certains récepteurs d'apoptose et notamment, à la surface des cellules, le rôle important du récepteur de mort P2X7. Différents laboratoires pharmaceutiques essaient de produire des inhibiteurs du récepteurs P2X7 afin d'obtenir une nouvelle classe d'anti-inflammatoires contre ces pathologies dégénératives. Récemment, nos travaux ont mis en évidence que ce récepteur de mort existait aussi sur des cellules de la peau et surtout sur des cellules de l'oeil. Ces dernières sont extrêmement sensibles à certains toxiques tels que les conservateurs. La modulation du récepteur P2X7 permettrait donc de bloquer différents mécanismes délétères de la cellule associés à des polluants et au vieillissement cellulaire. Ceci serait particulièrement important pour certaines pathologies et notamment en dermatologie, cosmétologie, ophtalmologie où des formes topiques pourraient permettre de neutraliser les effets délétères des conservateurs ; mais aussi en gastroentérologie sous forme orale. . Acide hyaluronique L'acide hyaluronique est un polymère de disaccharides eux-mêmes composés d'acide D-glucuronique et de D-N-acétylglucosamine, liés entre eux par des liaisons glycosidiques alternées R-1,4 et (3-1,3. Cette macromolécule, sous forme sodique, se retrouve en quantité importante dans différentes parties du corps comme le liquide synovial des articulations, la peau, ou l'humeur vitrée au niveau des yeux. L'acide hyaluronique est depuis longtemps utilisé en thérapeutique pour ses propriétés de visco-supplémentat:ion. En effet, l'acide hyaluronique a une très grande capacité de rétention d'eau et forme un gel volumineux et viscoélastique capable de résister à des pressions considérables et de diminuer les frottements. Pour ces propriétés physico-chimiques, l'acide hyaluronique a été rapidement employé dans le traitement de l'arthrite du genou (en servant d'amortisseur pour le genou), lors la reconstitution du globe oculaire suite à une opération de la cataracte et plus récemment utilisé en médecine esthétique comme produit de comblement des rides. Certains laboratoires ont essayé de produire des molécules anti-P2X7 bloquant le récepteur directement. On observe par contre certains effets cytotoxiques de ces molécules. L'originalité de notre invention est d'utiliser une molécule non cytotoxique, l'acide hyaluronique, permettant de bloquer le récepteur P2X7 non pas directement mais indirectement. En effet, nous avons remarqué que le récepteur CD44 qui fixe l'acide hyaluronique, jouxte le récepteur P2X7. Ainsi, l'acide hyaluronique, en se fixant sur son récepteur CD44, va masquer le récepteur P2X7, par encombrement stérique, tel un parapluie moléculaire. Nous utilisons ainsi, non pas les propriétés physico-chimiques de l'acide hyaluronique mais sa capacité, en tant que molécule à se fixer sur un récepteur particulier le CD44, à recouvrir la membrane plasmique des cellules et, de ce fait, à recouvrir des récepteurs de mort (notamment le P2X7) susceptible d'induire la mort des cellules. De plus, nous avons montré que l'acide hyaluronique et capable de diminuer la production d'espèces réactives de l'oxygène. Ainsi les effets toxiques de certains agents stressant oxydants ou de conservateurs, pourraient être modulés par protection de la membrane plasmique et par blocage des récepteurs de mort qui oeuvre comme de véritables détonateurs mortels pour la cellule. 2 L'invention a donc pour objet une trousse, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un premier récipient contenant de l'acide hyaluronique ou l'un de ses dérivés d'une masse moléculaire comprise entre 105 et 3.106 daltons et, de préférence entre 8.105 et 1,5.106 daltons, avec un pourcentage final en masse d'acide hyaluronique ou de l'un de ses dérivés compris entre 0,001% et 90%, et de préférence, entre 0,05% et 10% et un excipient agréé alimentairement ou acceptable pharmaceutiquement. b) un deuxième récipient contenant une substance active et un conservateur ayant un pourcentage final en masse compris entre 0,0001% et 5%. Lorsque le premier récipient contient du liquide, l'excipient est un solvant, notamment du sérum physiologique (NaCl 0.9%), un dérivé d'eau de mer ou une solution à ionisation contrôlée, notamment enrichi en ions bivalents, et un acide hyaluronique ou l'un de ses dérivés avec un pourcentage final en masse compris entre 0,001% et 3%. De préférence, le premier récipient a une capacité comprise entre 7 et 30 ml et, de préférence, entre 10 et 20 ml correspondant à une unité de prise. Le dérivé de l'acide hyaluronique peut être un hyaluronate, notamment de métal alcalin, tel que de sodium ou de potassium, de métal alcalino-terreux, tel que de magnésium ou de calcium, ou de zinc. Pour mieux protéger le récepteur de mort, il est avantageux que le premier récipient comprenne en plus un additif, tel que le soufre, une molécule soufrée de masse moléculaire inférieure à 250 daltons, du sélénium, l'additif étant présent avec un pourcentage final en masse de 0.00001 et 10%. La substance active contenue dans le deuxième récipient peut être un principe actif médicamenteux ou une base active du point de vue dermatologique ou cosmétique. La substance active peut être aussi un aliment, tel que de la viande, un légume, une préparation alimentaire. Comme substances actives médicamenteuses, on peut citer notamment : l'acétylcystéine, l'acide aminocaproique, l'acide cromoglicique et ses sels, l'acide fusidique, l'azélastine, la béclométasone, le béfunobol, la bétaméthasone, le bétaxolol, 25 30 la brimonidine, le bromure d'ipratopium, le carbomère, la cartéolol, la pyridoxine, la chlorhexidine, la ciprofloxacine, le dozolamide, la fluorométhalone, la fluticasone, la framycétine, la gentamicine, le kétorolec throméthamine, le lodoxamide, le métipronolol, la :néomycine, la polymicine B, la norfloxacine, l'ofloxacine, l'oxymétazoline, la pholcodine, la pilocarpine, la prédnirolone, le timolol. La trousse suivant l'invention peut être utilisée avec avantage notamment dans des pathologies liées à des stress oxydant, des mécanismes incriminant des récepteurs de morts ou plus largement à des mécanismes d'apoptose. Tous ces stress et mécanismes se retrouvent dans des pathologies inflammatoire ou dégénératives. Dans l'oeil par exemple, sont visées les inflammations ou brûlures de la surface oculaire ou des mécanismes de dégénérescence cellulaire comme la cataracte ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Ces molécules peuvent être utilisés directement en topique dans des applications dermatologiques, cosmétiques et ophtalmologiques, notamment sous forme de collyre. De plus, ils peuvent être utilisé par voie orale pour des applications gastro-entérologiques. L'invention a aussi pour objet un procédé de traitement de ces pathologies dans lequel on administre d'abord de l'acide hyaluronique ou l'un de ses dérivés d'une masse moléculaire comprise en 105 et 3.106 daltons et de préférence entre 8.105 et 1,5.106 daltons, puis 10 minutes à trois heures plus tard et de préférence quinze minutes à une heure plus tard une substance active additionnée d'un conservateur. Les conservateurs peuvent être classés parmi les catégories suivantes. Ils peuvent être divisés en 2 types : les conservateurs chimiques et les conservateurs oxydatifs. a) Les Principaux conservateurs chimiques Les ammoniums quaternaires sont des agents surfactants auxquels appartiennent le chlorure de benzalconium (principale conservateur utilisé en ophtalmologie), le cétrémide, le bromure de benzododécinium, le miramine, le chlorure de cétylpiridinium, le chlorure de polidorium, le polyaquaternium ou le polyquad, le polexitonium (ou polyquarternium-42), le sepazonium. Les dérivés mercuriels comme les sels de phénylmercure (acétate, borate ou nitrate), le mercuriothiolate sodique (thiomersal ou thimérosal) et le mercurobutol. Les amidines comme le digluconate de chlorhexdine ou le biguanide polyhexaméthylène (PHMB). Les alcools comme le chlorobutanol ou le phényléthanol, phenoxyéthanol. Les esters de l'acide parahydroxybenzoïque (ou parabens) comme le méthylparaben, 1'éthylparaben, propylparaben et le butylparaben. De manière plus isolée l'EDTA et l'acide sorbique. b) Les Conservateurs Oxydatifs Ces conservateurs sont capables de pénétrer la membrane cellulaire et interfèrent les fonctions cellulaires tuant ainsi les germes. Le perborate de sodium ou GenAqua qui fonctionne en oxydant la membrane cellulaire et détruisant les fonctions cellulaires. Quand il se combine à l'eau, le perborate de sodium se convertit en peroxyde d'hydrogène, qui détruit ainsi les micro-organismes. En contact avec le film lacrymal, il se convertit en molécules d'oxygène et de d'eau. Stabilized oxychloro complex (SOC) ou Purite qui est habituellement utilisé pour la 20 stérilisation de l'eau. Ou tout autre produit dérivé oxydant On donne, ci-dessous, une liste des agents conservateurs que peuvent contenir les produits cosmétiques. 25 SUBSTANCES INSCRITES N à l'inventaire européen des SUBSTANCES réglementées CE ingrédients cosmétiques (INCI) ammonium benzoate. benzoic acid. butyl benzoate. calcium benzoate. ethyl benzoate. isobutyl benzoate. isopropyl benzoate. Acide benzoïque, ses sels et ses esters. magnesium benzoate. MEA-benzoate. methyl benzoate. phenyl benzoate. potassium benzoate. propyl benzoate. sodium benzoate. { propionic acid. 2 ammonium propionate. calcium propionate. Acide propionique et ses sels. magnesium propionate. potassium propionate. sodium propionate. 3 salicylic acid. calcium salicylate. magnesium salicylate. Acide salicylique et ses sels. MEA-salicylate. potassium salicylate. sodium salicylate. 4 sorbic acid. Acide sorbique et ses sels. calcium sorbate. potassium sorbate. sodium sorbate. TEA-sorbate. formaldehyde. Formaldéhyde et paraformaldéhyde. 7 o-phenylphenol. O-phénylphénol et ses sels. MEA-o-phenylphenate. potassium o-phenylphenol. sodium o-phenylphenol. 8 zinc pyrithione. Sels de zinc du pyridine-1-oxy-2-thiol (pyrithione de zinc). 19 ammonium bisulfite. Sulfites et bisulfites inorganiques. ammonium sulfite. sodium bisulfite. sodium metabisulfite. sodium sulfite. potassium sulfite. potassium metabisulfite. sodium iodate. Iodate sodique. 11 chlorobutanol. 1,1-Trichloro-2-méthyl-propanol-2 (chlorobutanol). 12 4-hydroxybenzoïc acid. Acide parahydroxybenzoïque, ses sels et esters. butylparaben. calcium paraben. etylparaben. isobutylparaben. isopropylparaben. methylpaxaben. phenylparaben. potassium butylparaben. potassium ethylparaben. potassium met:hylparaben. potassium paraben. potassium propylparaben. propylparaben. sodium butylparaben. sodium ethylparaben. sodium methylparaben. sodium paraben. sodium propylparaben, etc. 13 dehydroacetic acid. Acide déhydroacétique et ses sels. sodium dehydroacetate. 14 formic acid. Acide formique et son sel de sodium. sodium formate. 15 dibromohexamidine. 1,6-Di(4-amidino-2-bromophénoxy)-n-hexane dibromohexamidine { (dibromohexamidine) et ses sels (y compris isethionate. l'isethionate). 16 thimerosal. Thiosalicylate d'éthylmercure sodique (thiomerosal). 17 phenylmercuric acetate. Phénylmercure et ses sels (y compris le borate). phenylmercuric benzoate. phenylmercuric borate. phenylmercuric bromide. phenylmercuric chloride. 118 MEA-undecylenate. Acide undécylénique et ses sels. calcium undecylenate. sodium undecylenate. undecylen:ic acid. 19 hexetidine. Amino-5-bis (éthyl-5-hexyl)- 1,3 méthyl-5- perhydropyrimidine (hexetidine). 20 5-bromo-5-nitro-1,3- Bromo-5 nitro-5-dioxane 1,3. 152 Silver chloride (and) 3 Chlorure d'argent déposé sur dioxyde de titane. titanium dioxide. 53 benzethonium chloride. Chlorure de benzéthonium. 54 benzalconium bromide. benzalconium chloride. benzalconium saccharinate. cetalkonium chloride. cetearalkoniu.m bromide. lauralkoniurn bromide. Chlorure, bromure et saccharinate de benzalconium lauralkoniurn chloride. ou d'un ammonium quaternaire. myristalkonium chloride. myristaikonium saccharinate. olealkonium chloride. stearalkonium chloride. 55 benzylhemiformal. Benzylhémiformal. 56 iodopropynyl Carbamate de 3-iodo-2-propynylbutyle. butylcarbamate. On utilise de préférence le chlorure de benzalconium dans la trousse suivant l'invention. On donne ci-dessous deux exemples de trousse : Exemple de trousses utilisables en ophtalmologie pour limiter les effets délétères des conservateurs associés aux antiglaucomateux - Trousse n 1 Flacon 1 : dérivés d'acide hyaluronique à 1,2 millions daltons. Solution à 0,2 % dans une solution aqueuse à ionisation contrôlée. Flacon 2 : collyre de timolol (beta bloquant antiglaucomateux) avec un conservateur à 0,002 % (chlorure de benzalconium). - Trousse n 2 Flacon 1 : dérivés d'acide hyaluronique à 1, 2 millions daltons. Solution à 0,2 % dans un dérivé d'eau de mer à ionisation contrôlée. Flacon 2 : collyre de dérivés prostaglandine E2 synthétique (prostaglandine antiglaucomateux) associé à un conservateur à 0,002 % (chlorure de benzalconium). Les essais suivants illustrent l'invention. Les essais ont été faits sur plusieurs types cellulaires particulièrement sur des cellules connues pour posséder les récepteurs de mort P2X7 et étant sensibles à certains 15 conservateurs. L'utilisation des cellules de la surface oculaire met en évidence que des agents oxydants (comme le terbutylperoxyde) induisent une augmentation de l'activité du récepteur de mort P2X7. De plus, les conservateurs (notamment les ammoniums quaternaires tel que le chlorure de benzalconium) qui existent aussi dans des shampooings et autres produits de cosmétologie induisent une très forte augmentation 20 du récepteur P2X7. Ainsi, il a été montré que les acides hyaluroniques, notamment ceux ayant un poids moléculaire élevé, sont capables de diminuer le stress oxydant et différents mécanismes d'apoptose induit par le chlorure de benzalconium, tout en augmentant la viabilité des cellules. 25 A. Types cellulaires et milieux de culture 1. Lignée cellulaire cornéenne humaine HCE La lignée HCE (hurnan corneal epithelial cell line) présente une prolifération lente et 30 régulière qui adaptée aux techniques de microtitration. Ces cellules sont cultivées en flasque de 75 cm2 (Costar) avec un milieu D-MEM/Ham F12 (Eurobio) supplémenté en SVF 10% (Eurobio), Glutamine (Eurobio) et d'un mélange pénicilline/streptom:ycine (Eurobio), dans une étuve à 37 C sous une atmosphère humide et contrôlée à 5% de CO2.10 2. Lignée cellulaire conjonctivale humaine WKD La lignée WKD (Wong Kilbourne derivative of Chang conjunctiva cell line) présente une prolifération relativement lente et régulière qui adaptée aux techniques de microtitration. Ces cellules sont cultivées en flasque de 75 cm2 (Costar) avec un milieu D-MEM (Eurobio) supplémenté en SVF 10% (Eurobio), Glutamine (Eurobio) et d'un mélange pénicilline/streptomycine (Eurobio), dans une étuve à 37 C sous une atmosphère humide et contrôlée à 5% de CO2. B. Technique d'ensemencement et de traitement 1. Ensemencement dans des microplaques de 96 puits Une fois les flasques de 75 cm2 à confluence, les cellules sont décollées et séparées de la flasque grâce à l'ajout de 4 ml de trypsine (Eurobio) pendant 5 minutes. Les cellules sont ensuite reprises dans 10 ml de milieu de culture puis comptées (hémacytomètre de Malassez). Les cellules sont ensuite reparties dans les microplaques de 96 puits (costar) avec une concentration de 90 000 cellules/ml pour les cellules HCE et 70 000cellules/ml pour les cellules WKD. Après ensemencement, les plaques sont placées à l'étuve à 37 C sous une atmosphère humide et contrôlée à 5% de CO2 pendant 24h. Le jour du test, l'état morphologique et la confluence des cellules sont vérifiés. 2. Traitement des cellules Le jour du test, le milieu de culture est éliminé de la microplaque. Les cellules sont préalablement incubées avec deux différents acides hyaluroniques (bas poids moléculaire : 20 kDa ; haut poids moléculaire : 1000kDa) à une concentration de 0,2%. Le milieu est ensuite éliminé et les cellules sont traitées pendant 20 minutes avec différentes concentrations de chlorure de benzalconium (0,002% pour les cellules HCE, 0,005% pour les cellules WKD). C. Tests de microtitration cytofluorimétrique . Principe général La microplaque est scannée par un pinceau de lumière d'une longueur d'onde définie qui illumine chaque puits. En fonction de la sonde fluorescente choisie, une émission fluorescente particulière est émise et analysée par l'appareil (Tecan, Safire). Cette technique est sensible, reproductible, spécifique et permet de mettre au point des méthodes standardisées de la cytotoxicité. 2. Evaluation de l'intégrité membranaire : Test Rouge Neutre L'intégralité membranaire et la viabilité cellulaire ont été évaluées en réalisant un test au rouge neutre (Sigma) en fluorimétrie (Xexc = 535 nm, Xém = 600 nm). Le rouge neutre est un colorant vital qui diffuse de manière passive à travers les membranes et qui se fixe dans les lysosomes où le pH est acide. Le jour du test, les différents milieux d'incubation à tester sont éliminés après le temps requis. Les microplaques sont rincées avec du PBS. Une solution de rouge neutre à 0.005% préparée dans du milieu de culture est distribuée dans tous les puits. Les plaques sont placées en incubateur (37 C atm saturée en eau et 5% CO2) pendant 3 heures. La solution rouge en excès est ensuite éliminée et les cellules sont rincées avec du PBS. Les cellules sont ensuite lysées avec une solution composée d'acide acétique et d'éthanol. Les plaques sont mises sous agitation pendant 15 minutes afin d'homogénéiser la coloration puis lues au cytofluorimètre en microplaque. 3. Evaluation du potentiel d 'oxydoreduction intracellulaire : Test Alamar Blue L'état d'oxydoréduction intracellulaire est évalué avec le test à l'Alamar Blue (résazurine) en fluorimétrie (Xexc = 535 nm, Xém = 600 nm). La résazurine (Sigma) est une sonde flurorogène et bleue qui sera réduite, par des enzymes d'oxydoréduction intracellulaires, en résorufine qui est rouge et fluorescente. Après les différentes incubations, une solution à 1% de résazurine est préparée dans un milieu de culture supplémenté avec 2,5% de SVF et distribuée dans chaque puits. Les microplaques sont alors placées dans un incubateur à 37 C en atmosphère saturée en eau et à 5% de 14 CO2 pendant 6h00. La détection de la florescence est effectuée au cytofluorimètre en microplaque. 4. Evaluation de la condensation de la chromatine : Test Hoechst 33342/IP 5 Le Hoechst 33342 (Molecular Probes) se fixe sur l'ADN en émettant une fluorescence bleue après avoir franchi sans altération la membrane cytoplasmique. L'iodure de propidium (Molecular Probes) est un intercalant de l'ADN qui émet une fluorescence rouge mais qui est incapable de passer la membrane plasmique des cellules viables. 10 Ainsi la sonde Hoechst 33342 va marquer les cellules viables (en apoptose ou non) alors que l'iodure de propidium sera un contre-marqueur des cellules en nécrose du fait de sa cinétique plus rapide que le Hoechst 33342. Après les différentes incubations, la microplaque est rincée au PBS et la solution de Hoechst 33342/IP est distribuée à raison de 200 41/puits, puis placée à température ambiente dans 15 l'obscurité, pendant: 30 minutes. La plaque est ensuite lue au cytofluorimètre (? exc --365 nm, Xém = 450 nm) ; la quantité de fluorescence émise est proportionnelle à la quantité d'ADN présente dans les cellules avec un signal de fluorescence plus intense lorsque l'ADN est condensé donc quand les cellules sont en apoptose. Les cellules sont ensuite observées en microscopie inversée en fluorescence (Leica, DMIRB) et 20 photographiées avec un appareil photo numérique (Nikon, Coolpix 5000). 5. Evaluation de l'activation des récepteurs de mort P2X7 : Test YO-PRO-1 Le YOPRO-1 (Molecular Probes) est un cation divalent de 376 Da, disponible à 1mM 25 dans le DMSO. Le YOPRO-1 est une sonde fluorogène (Xexc = 491 nm, Xém = 509 nm) qui s'intercale dans l'ADN quelque soit son état de compaction. Le YOPRO-1 ne peut pas entrer dans les cellules vivantes, une modification de la perméabilité membranaire via les pores P2X7 est nécessaire. Il va alors se fixer à l'ADN et émettre une fluorescence verte. Cette fluorescence est directement proportionnelle à 30 l'activation des pores P2X7 qui sont des marqueurs d'apoptose. Pour les tests, une solution de YOPRC)-1 0,111M est ajoutée dans chaque puits après incubation avec les solutions. La microplaque est ensuite mise à l'obscurité, à température ambiante pendant 10 minutes puis lue au cytofluorimètre (Xexc = 491 nm, ? ém = 509 nm). Les cellules sont ensuite observées en microscopie inversée en fluorescence (Leica, DMIRB) et photographiées avec un appareil photo numérique (Nikon, Coolpix 5000). 6. Evaluation de l 'apoptose mitochondriale : Test Nonylacridine Orange 5 La nonylacridine orange (Molecular Probes) est une sonde fluorogène qui est spécifique de la cardiolipine. Cette protéine mitochondriale est normalement peu disponible car liée au cytochrome c. La libération du cytochrome c hors de la mitochondrie associée à une augmentation de la fixation de la NAO sur la cardiolipine 10 est une des étapes précoces dans la voie d'apoptose mitochondriale. Après les différentes incubations, une solution de 10 M dilué dans du milieu de culture est distribuée dans chaque puits. La microplaque après 30 minutes d'incubation est lavée avec du PBS. Une solution de milieu de culture est distribuée à nouveau pendant 1h00. La plaque est ensuite lavée au PBS et les cellules sont lysées avec une solution 15 de lyse composée d'acide acétique et d'éthanol. Les plaques sont mises sous agitation pendant 15 minutes afin d'homogénéiser la coloration puis lues au cytofluorimètre en microplaque. 7. Evaluation de la production d'espèces réactive de l'oxygène : Test DCFH-DA 20 Le dichlorodihydrofluorescéine diacetate (DCFH-DA) (Molecular Probes), diffusant par voie passive dans la cellule, est hydrolysé par des estérases cellulaires en dichlorodihydrofluorescéine. Ce composé en présence d'espèces réactive de l'oxygène (et notamment du peroxyde d'hydrogène) et oxydé en dichlorofluorescéine qui est un 25 dérivé fluorescent. Pour les tests, les différents milieux d'incubations sont éliminés puis remplacés par une solution de DCFH-DA à 20 M diluée dans du PBS. La microplaque est ensuite mise à l'obscurité, à température ambiante pendant 20 minutes puis lue au cytofluorimètre (Xexc = 485 nm, Xém = 535 nm) 30 Evaluation de la production d'anion superoxyde : Test Hydroéthidine Arrivée dans le cytosol de la cellule, l'hydroéthidine (Molecular Probes), en contact avec l'anion superoxide, est hydrolysée en éthydium qui est un intercalant fluorescent de l'ADN. Au moment des tests, les différents milieux d'incubations sont éliminés puis remplacé par une solution d'hydroéthidine à 5 M diluée dans du PBS. La microplaque est ensuite mise à l'obscurité, à température ambiante pendant 20 minutes puis lue au cytofluorimètre (Xexc = 485 nm, Xém = 600 nm) D. Microscopie inversée Un contrôle microscopique est réalisé avant toute mesure des microplaques (Leica, DMIRB) et pour certaines sondes, une analyse qualitative en fluorescence inversée est réalisée à l'aide d'un appareil photo numérique (Nikon, Coolpix 5000) E. Analyse statistique Chaque solution est testée dans 6 puits et chaque test est réalisé au minimum trois fois (n=18). Les moyennes de fluorescence des résultats obtenus sont calculées à la 15 moyenne du témoin cellulaire existant dans chaque plaque. Une analyse de variance à un facteur est réalisée suivie d'un test bilatéral de Dunnett. Sur chaque histogramme, les barres correspondent aux intervalles de confiance avec un risque a = 0.05 18 Résultats A. Evaluation de l'intégrité membranaire (Test Rouge Neutre) Cellules HCE ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20kDa Cellules WKD ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20 kDa BAKO% BAK 0.002% BAK 0% BAK 0.005% Figure n 1 : Evaluation de l'intégrité membranaire des cellules HCE et WKD suite à 5 un préincubation avec un acide hyaluronique et une incubation avec du chlorure de benzalconium Les cellules HCE et WKD après une préincubation de 20 minutes avec deux acides hyaluroniques différents (1000 et 20kDa) à 0,2%, ont été incubées avec du chlorure de benzalconium pendant 20 minutes (0,002% pour les cellules HCE, 0,005% pour les 10 cellules WKD). Trois tests indépendants ont été ensuite réalisés. P Une préincubation avec un acide hyaluronique de 20 kDa (AH 20) n'induit aucune différence modification de fluorescence du rouge neutre avec les cellules HCE et 15 WKD (figure n 1) (respectivement 108% et 102%, non significatif par rapport aux cellules témoins non traitées). Les résultats sont similaires avec l'acide hyaluronique 1000 kDa (AH 1000) sur les cellules WKD (99%, non significatif par rapport aux cellules témoins non traitées). Par contre, on note une augmentation significative de la fluorescence du rouge neutre avec une préincubation de AH 1000 avec les cellules 20 HCE (123% P B. Evaluation du potentiel oxydoreduction intracellulaire (Test Alamar Blue) Cellules HCE ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20kDa 100 0 100- 80 80 - *** 60 60 - 100 104 m 40 40 - Cellules WKD ^ control ^ HA1000 kDa ^ HA20 kDa BAK 0% BAK 0.002% BAK 0% BAK 0.005% Figure n 2 : Evaluation du potentiel d'oxydation intracellulaire des cellules HCE et WKD suite à un préincubation avec un acide hyaluronique et une incubation avec du 10 chlorure de benzalconium Les cellules HCE et WKD après une préincubation de 20 minutes avec deux acides hyaluroniques différents (1000 et 20kDa) à 0,2%, ont été incubées avec du chlorure de benzalconium pendant 20 minutes (0,002% pour lescellules HCE, 0,005% pour les cellules WKD). Trois tests indépendants ont été ensuite réalisés. P Une préincubation avec AH 1000 ou AH 20 n'induit aucune modification de fluorescence de la sonde avec les cellules HCE et WKD (figure n 2) (respectivement 104%, 104%, 101% et 101%, non significatif par rapport aux cellules témoins non 20 traitées). Une incubation de 20 minutes en présence de BAK induit une forte diminution de la fluorescence avec les cellules HCE et WKD (respectivement, 39% P C. Evaluation de la condensation de l'ADN (Test Hoechst 33342/IP) Cellules HCE ^ control lm HA 1000 kDa D HA20kDa Cellules WKD ^ control ^ HA 1000 kDa D HA 20 kDa 450 - 400 - 350 - 300 - 250 - 200 - 150 - 100 - 50 98 0 BAK 0% BAKO% BAK 0.005% BAK 0.002% Figure n 3 : Evaluation de la condensation de la chromatine des cellules HCE et WKD suite à un préincubation avec un acide hyaluronique et une incubation avec du 10 chlorure de benzalconium Les cellules HCE et WKD après une préincubation de 20 minutes avec deux acides hyaluroniques différents (1000 et 20kDa) à 0,2%, ont été incubées avec du chlorure de benzalconium pendant 20 minutes (0,002% pour les cellules HCE, 0,005% pour les cellules WKD). Trois tests indépendants ont été ensuite réalisés. P Une préincubation avec AH 1000 ou AH 20 n'induit aucune modification de fluorescence de la sonde Hoechst 33342 avec les cellules HCE et WKD (figure n 3) (respectivement 96%, 98%, 93% et 96%, non significatif par rapport avec les cellules 20 témoins non traitées). Une incubation de 20 minutes en présence de BAK induit une augmentation de l'intensité de fluorescence de la sonde Hoechst 33342 avec les cellules HCE et WKD (respectivement, 401% P D. Evaluation de l'activation des récepteurs de mort P2X7 (Test YO-PRO-1) Cellules HCE ^ control ^i HA 1000 kDa ^ HA20kDa Cellules WKD ^control ^ HA 1000 kDa D HA20 kDa 3500 - BAK C% BAK 0.002% BAKO% BAK 0.005% Figure n 4 : Evaluation de l'activation des récepteurs de mort P2X7 des cellules HCE et WKD suite à un préincubation avec un acide hyaluronique et une incubation avec 10 du chlorure de benzalconium Les cellules HCE et WKD après une préincubation de 20 minutes avec deux acides hyaluroniques différents (1000 et 20kDa) à 0,2%, ont été incubées avec du chlorure de benzalconium pendant 20 minutes (0,002% pour les cellules HCE, 0,005% pour les cellules WKD). Trois tests indépendants ont été ensuite réalisés. P Une préincubation avec AH 20 n'induit aucune modification de fluorescence de la sonde YO-PRO-1 avec les cellules HCE et WKD (figure n 4) (respectivement 81% et 83%, non significatif par rapport aux cellules témoins non traitées). Il en est de même 20 avec les cellules HCE lorsqu'elles sont préincubées avec AH 1000 (82%, pas de différence significative avec les cellules témoins non traitées). Par contre, les cellules WKD préincubées avec AH 1000, présentent une diminution significative (62% P E. Evaluation de l'apoptose mitochondrial (Test Nonylacridine Orange) Cellules WKD ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20 kDa Cellules HCE ^ contrai ^ HA 1000 kDa ^ HA20kDa 300 95 105 300 - 250 - 200 - 150 - 100 - 50 - 0 o Une préincubation avec AH 1000 ou AH 20 n'induit aucune modification de fluorescence de la sonde noylacridine orange (NAO) avec les cellules HCE et WKD (figure n 5) (respectivement 103%, 101%, 95% et 105%, non significatif par rapport aux cellules témoins non traitées). Une incubation de 20 minutes en présence de BAK induit une augmentation du signal fluorescent de la sonde NAO avec les cellules HCE et WKD (respectivement, 263% P F. Evaluation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (Test DCFH-DA) Cellules HCE o control ^ HA 1000 kDa o HA 20kDa Cellules WKD ^ control ^ HA 1000 kDa o HA 20 kDa 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 BAK O% BAK 0.002% BAK 0% BAK 0.005% Figure n 6 : Evaluation de la production d'espèces réactives de l'oxygène des cellules 15 HCE et WKD suite à un préincubation avec un acide hyaluronique et une incubation avec du chlorure de benzalconium Les cellules HCE et WKD après une préincubation de 20 minutes avec deux acides hyaluroniques différents (1000 et 20kDa) à 0,2%, ont été incubées avec du chlorure de benzalconium pendant 20 minutes (0,002% pour les cellules HCE, 0,005% pour les 20 cellules WKD). Trois tests indépendants ont été ensuite réalisés. P Une préincubation avec AH 1000 ou AH 20 n'induit aucune modification de fluorescence avec les cellules HCE et WKD (figure n 6) (respectivement 93%, 92%, 98% et 101%, non significatif avec les cellules témoins non traitées). Une incubation de 20 minutes en présence de BAK induit une augmentation de fluorescence avec les cellules HCE et WKD (respectivement, 279% P G. Evaluation de la production d'anion superoxide (Test Hydroéthidine) Cellules HCE ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20kDa Cellules WKD ^ control ^ HA 1000 kDa ^ HA 20 kDa 500 - 400 m Pour évaluer le potentiel cyto-protecteur de l'acide hyaluronique, cette étude a été conduite selon trois axes principaux. Premièrement, nous avons étudié la viabilité cellulaire afin d'estimer la cytotoxicité de nos différentes incubations. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à évaluer la part des cellules entrant en apoptose parmi l'ensemble des cellules viables. En dernier lieu, nous avons étudié le stress oxydant de ces cellules afin de corroborer l'ensemble de nos résultats. La viabilité cellulaire a été analysée grâce à deux indicateurs cellulaires indépendants : l'intégrité membranaire évaluée par le test du rouge neutre et le potentiel d'oxydoréduction intracellulaire évalué par le test Alamar blue. Les résultats obtenus avec ces deux tests différents ont données des résultats concordants. Les cellules HCE, incubées pendant 20 minutes avec une concentration de 0,002% de BAK, ont une viabilité estimée à 47% (+/-9%) avec le test rouge neutre et estimée à 39% (+/- 3%) avec le test Alamar blue. Avec une concentration de 0,005% de BAK, les cellules WKD ont une viabilité estimée à 33% (+/- 7%) avec le test rouge neutre et à 44% (+/- 4%) avec le test Alamar blue. Ainsi, le BAK, avec les concentrations choisies pour chaque lignée cellulaire, induit une réduction comparable de viabilité cellulaire. L'acide hyaluronique 1000 kDa (AH 1000) et l'acide hyaluronique 20 kDa (AH 20) à une concentration de 0,2%, avec les tests réalisés, ne montrent aucun effet cytotoxique sur les cellules HCE et WKD. Une préincubation de 20 minutes avec AH 1000 assure une cyto-protection des cellules HCE et WKD vis-à-vis du BAK. En effet, la viabilité cellulaire a augmenté de façon très significative qu'elle soit mesurée avec l'intégrité membranaire (HCE : +23%, WKD : +14%) ou avec le potentiel d'oxydoréduction intracellulaire (HCE : +23%, WKD : +27%). Par contre, AH 20 ne semble pas avoir les mêmes propriétés car aucune différence significative n'a été observée par rapport aux cellules témoins traitées par le BAK. Ainsi, seul un acide hyaluronique de haut poids moléculaire est capable de moduler la cytotoxicité du BAK de façon comparable avec deux types distincts de cellules. L'apoptose ou mort cellulaire programmée a été évaluée par trois tests indépendants marquant différentes étapes ou voie d'apoptose. Le test Hoechst 33342/IP qui évalue la condensation de l'ADN permet d'avoir une estimation de l'apoptose de manière globale. Le test YO-PRO-1, qui évalue l'activation des récepteurs de mort P2X7, permet d'évaluer une voie d'apoptose passant par des récepteurs de mort membranaire. Le test nonylacridine orange, qui évalue le potentiel de fixation à la cardiolipine, lui-même relié à la libération du cytochrome c, permet une évaluation de l'activation de l'apoptose par la voie mitochondriale. Ces trois tests marquent des phénomènes précoces d'apoptose. Que ce soit au niveau des cellules HCE ou des cellules WKD, AH 20 et AH 1000 n'induisent aucune modification de condensation de l'ADN, aucune activation des récepteurs de mort P2X7 et aucune modification du potentiel de fixation à la cardiolipine. Il est même observé avec les cellules WKD, une diminution significative (62% P L'étude du stress oxydant a été menée en premier lieu sur l'ensemble des espèces réactives de l'oxygène avec le test DFCH-DA puis dans un second temps, sur l'anion superoxyde plus particulièrement connu pour être un inducteur majeur d'apoptose (test hydroéthidine). Parmi l'ensemble des espèces réactives de l'oxygène, le test DCFH-DA mesure essentiellement le peroxyde d'hydrogène. Cette molécule potentiellement cytotoxique et relativement bien éliminée par la cellule tant que son système de détoxification n'est débordé. Une incubation de BAK induit une forte augmentation de production de ERO (HCE : 279% et WKD : 194%). Les cellules HCE semblent produire plus de ERO en présence de BAK que les cellules WKD. Avec une préincubation de AH 1000 et de AH 20, cette surproduction d'espèces réactives de l'oxygène est diminuée de manière significative et reproductible sur nos deux lignées (avec les cellules HCE : AH 1000 = -34%, AH 20 = -16% ; WKD : AH 1000 = -36%, AH 20 = -11%). Toutefois, les résultats obtenus avec AH 20 ne sont pas comparables aux résultats obtenus avec AH 1000. L'anion superoxyde est dans la cellule un élément très cytotoxique du fait qu'il peut potentiellement se transformer rapidement en un ensemble de molécules radicalaires excessivement dangereuses pour la cellule et que le potentiel enzymatique de détoxification de la cellule est très vite saturé (seul la superoxyde dismutase est active). Une surproduction d'anion superoxyde conduit donc une cellule vers une apoptose rapide. Une incubation de BAK induit une forte augmentation de production d'anion superoxyde sur les deux lignées, notamment avec les cellules WKD (HCE : 371%, WKD 487%). Une préincubation de AH 1000 permet de diminuer de manière significative cette surproduction avec les cellules HCE (-32%) et surtout avec les cellules WKD (-60%). Ainsi, AH 1000 en bloquant la production d'anion superoxyde permet une diminution de l'effet pro-apoptotique du BAK sur les cellules HCE et WKD. La taille des cellules semble être un facteur primordial car AH 20 ne possède pas ces propriétés car aucune différence significative n'a été observée par rapport aux cellules témoins traitées par le BAK. Des tests complémentaires ont prouvé un effet équivalents avec d'autres types cellulaires et d'autres conservateurs faisant partis de la liste présentée précédemment. Conclusion des essais réalisés Les acides hyaluroniques de 20 kDa et 1000 kDa, avec les tests réalisés dans cette étude et avec les deux lignées cellulaires WKD et HCE, n'engendrent aucune cytotoxicité. Le chlorure de benzalconium (BAK), très utilisé en ophtalmologie et cosmétologie, est un conservateur qui s'est révélé cytotoxique sur les cellules épithéliales oculaires HCE et WKD. Deux concentrations différentes de BAK ont été choisies pour chaque lignée cellulaire de manière à obtenir un effet cytotoxique équivalent permettant ainsi une comparaison plus aisée. Ces concentrations utilisées de BAK sont inférieures ou égales aux doses utilisées dans des produits vendus dans le commerce. Cette étude a montré, avec les cellules HCE et WKD, que l'acide hyaluronique est une molécule non cytotoxique et qu'une préincubation d'acide hyaluronique 1000 kDa, permet de moduler la cytotoxicité du BAK. En effet, cet acide hyaluronique de haut poids moléculaire permet par rapport aux cellules témoins incubées avec le BAK, d'augmenter la viabilité cellulaire (deux tests indépendants), de diminuer l'apoptose (trois tests) et de diminuer la production de stress oxydant induit par le BAK (deux tests indépendants). En outre, il faut noter que l'ensemble de ces effets, évoquant une cyto-protection par rapport au BAK, n'est observable uniquement en présence d'un acide hyaluronique de haut poids moléculaire (1000 kDa) ce qui sous entend que la taille de ce polymère est un facteur essentiel a son activité. En effet, ces expériences montrent qu'avec les cellules HCE et WKD, les acides hyaluroniques de 20 kDa ne montrent que très peu de différences significatives par rapport aux cellules témoins incubées dans le BAK. 2825 REVENDICATIONS 1. Trousse, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un premier récipient contenant de l'acide hyaluronique ou l'un de ses dérivés, d'une masse moléculaire comprise entre 105 et 3.106 daltons, et de préférence, entre 8.105 et 1,5.106 daltons avec un pourcentage final en masse de la formulation d'acide hyaluronique ou l'un de ses dérivés compris entre 0,001% et 90%, et de préférence, entre 0,05% et 10% et un excipient agréé alimentairement ou acceptable phai uiaceutiquement. b) un deuxième récipient contenant une substance active et un conservateur avec un pourcentage final en masse compris entre 0,0001 et 5%. 2. Trousse suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'excipient est un solvant, notamment du sérum physiologique (NaCl 0.9%), un dérivé d'eau de mer ou une 15 solution à ionisation contrôlée. 3. Trousse suivant la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le dérivé de l'acide hyaluronique est un hyaluronate de métal alcalin, tel que du sodium ou du potassium, du métal alcalino-terreux, tel que du magnésium ou du calcium, du zinc. 20 4. Trousse suivant l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le premier récipient comprend en plus un additif tel que du soufre, une molécule soufrée de masse moléculaire inférieure à 250 daltons, du sélénium avec un pourcentage final en masse de la formulation contenant l'acide hyaluronique ou de l'un de ses dérivés 25 compris entre 0,0001 et 10%. 5. Trousse suivant l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance active est un aliment, une base active du point de vue dermatologique ou cosmétique ou une substance médicamenteuse telle que l'acétylcystéine, l'acide 30 aminocaproique, l'acide cromoglicique et ses sels, l'acide fusidique, l'azélastine, la béclométasone, le béfunobol, la bétaméthasone, le bétaxolol, la brimonidine, le bromure d'ipratopium, le carbomère, la cartéolol, la pyridoxine, la chlorhexidine, la ciprofloxacine, le dozolamide, la fluorométhalone, la fluticasone, la framycétine, la gentamicine, le kétorolec throméthamine, le lodoxamide, le métipronolol, lanéomycine, la polymicine B, la norfloxacine, l'ofloxacine, l'oxymétazoline, la pholcodine, la pilocarpine, la prédnirolone, le timolol. 6. Trousse suivant l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le 5 conservateur est généralement le chlorure de benzalconium mais peu aussi être un autre conservateur.