Brevet FR2917172A1 — publié le 20081212

L'invention a pour objet une méthode de mesure de l'activité plasmine des microparticules présentes dans un échantillon de fluide biologique ou extrait tissulaire, ladite méthode pouvant servir comme méthode de diagnostic ou comme méthode de suivi d'un traitement. Ces microparticules résultant de bourgeonnements de la membrane cellulaire ont été décrites dans divers modèles cellulaires et dans de nombreuses conditions pathologiques en tant que marqueurs fiables de l'activation et/ou de l'apoptose cellulaire. Particulièrement, les inventeurs ont initialement décrit le relargage de ces microparticules par les cellules endothéliales en réponse à une stimulation inflammatoire et l'augmentation de la quantité de microparticules endothéliales circulantes chez des patients présentant un risque de thromboses. Depuis, des niveaux élevés de microparticules endothéliales circulantes ont été décrits dans différentes conditions pathologiques telles que les syndromes coronariens, l'insuffisance rénale, le diabète, le syndrome des antiphospholipides (SAPL), le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) ou encore la drépanocytose, désordres dans lesquels la présence des microparticules reflète des disfonctionnements endothéliaux et est indicative d'un mauvais pronostic. Les microparticules exprimant divers composants bioactifs provenant des cellules dont elles sont issues, elles peuvent présenter un large éventail d'activités biologiques capables de moduler des fonctions de cellules endothéliales ou sanguines, d'influencer l'homéostasie vasculaire et de participer aux réponses inflammatoires ou à l'angiogénèse. Par exemple, les microparticules présentent des surfaces phospholipidiques procoagulantes impliquées dans l'assemblage et l'activation des facteurs de coagulation. De même, la participation des microparticules dans la génération de thrombine résulte de leur capacité à exprimer, transférer ou induire le facteur tissulaire dans le compartiment vasculaire. Parmi les principaux régulateurs de l'équilibre hémostatique, le système d'activation du plasminogène est la principale voie physiologique de la dissolution du caillot de fibrine. Cette voie facilite également l'angiogénèse en aidant à la protéolyse des composants de la matrice extracellulaire. La conversion du plasminogène en plasmine active dépend de deux sérines -protéases : l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA : tissue-type plasminogen activator) qui dans les vaisseaux est principalement impliqué dans la fibrinolyse et I' urokinase (u-PA ; urokinase-type plasminogen activator) qui liée à son récepteur spécifique, uPAR, est impliquée dans la protéolyse péricellulaire. La génération de plasmine induite par l'uPA et l'activation des métalloprotéinases de la matrice (MMP) qui en résulte, favorise la migration de cellules au travers de la matrice interstitielle et participe aux processus tels que le remodelage tissulaire, l'invasion métastatique et l'angiogénèse. Une activation non contrôlée et/ou excessive du plasminogène peut avoir des conséquences délétères en induisant le détachement cellulaire et/ou l'apoptose cellulaire. On comprend donc que la régulation de l'expression de la plasmine à la surface des cellules, particulièrement des cellulesendothéliales est d'importance critique dans la régulation de l'homéostasie vasculaire. A la lecture de ce qui précède on comprend donc l'intérêt qu'il y a d'une part à pouvoir évaluer la génération de I"activité plasmine" des microparticules dans un fluide biologique, particulièrement le sang, ou dans des extraits tissulaires et d'autre part à pouvoir moduler cette activité. Par "fluide biologique" on entend tout liquide corporel extractible dont par exemple le sang, le liquide céphalorachidien (LCR), le liquide broncho-alvéolaire (LBA), l'urine, le liquide synovial, le lait maternel, la salive, les larmes, le liquide séminal, les liquides d'ascite, l'épanchement pleural, le liquide amniotique. Parmi les sources d'extrait tissulaire on peut citer les plaques d'athérome ou tout autre tissue obtenu par chirurgie. Par "activité plasmine " on doit comprendre dans le présent texte la capacité d'un échantillon fluide biologique contenant des microparticules à générer de la plasmine, quel que soit le mécanisme mis en oeuvre. A titre de méthode de diagnostic, mesurée dans l'échantillon fluide biologique contenant les microparticules et comparée à la mesure de cette même capacité dans un échantillon témoin obtenu d'individus dits normaux, c'est-à-dire ne présentant aucune pathologie, la valeur de 1-activité plasmine de l'échantillon testé", si elle est significativement supérieure à celle du témoin reflétera par exemple et sans limitation, pour un individu, un risque plus ou moins élevé à subir par exemple des accidents vasculaires causés par une instabilité accrue des plaques d'athérome, un risque plus ou moins élevé pour un individu atteint d'un cancer à subir une invasion métastasique ou encore pour un individu un risque plus ou moins élevé à subir un accident vasculaire cérébral et ses conséquences délétères sur le fonctionnement cérébral. Si cette valeur de l'activité plasmine de l'échantillon testé" est inférieure à celle du témoin, alors elle reflétera par exemple pour l'individu dont le sang a été testé un risque accru de thrombose. A titre de suivi d'un traitement, mesurée dans les microparticules d'un 'échantillon fluide biologique d'un individu en cours de traitement, et comparée à la mesure de cette même capacité dans un échantillon témoin obtenu du même individu avant le traitement ou précédemment dans le traitement, la valeur de I"'activité plasmine de l'échantillon testé" permet de suivre l'évolution de la réponse dudit individu en fonction du traitement qui lui est administré. Cependant, Il existe toujours un besoin en test simple, efficace et fiable, des risques encourus par un patient, liés à une trop forte ou à une trop faible activité plasmine de son sang ou encore un test simple du suivi de l'évolution d'un traitement visant à moduler l'activité plasmine des microparticules d'un fluide biologique d'un individu. C'est un des buts de la présente invention que de fournir un tel test. En effet, après de longs travaux et de manière surprenante, les inventeurs ont montré et ce à leur connaissance pour la première fois, que les microparticules circulantes présentes dans un fluide biologique, particulièrement dans le sang, d'un individu, sont porteuses d'une activité biologique leur conférant la capacité à générer de la plasmine. Sur la base de cette découverte, la présente invention a pour objet une méthode de mesure de l'activité plasmine des microparticules d'un échantillon de fluide biologique, particulièrement de sang, préalablement prélevé, dans lequel dans une première étape on isole les microparticules circulantes présentes dans ledit échantillon, dans une deuxième étape on mesure, par tout moyen approprié, la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine et dans une troisième étape on compare le résultat de la mesure obtenu à l'étape 2 au résultat d'une mesure identique réalisée dans les mêmes conditions sur un échantillon de fluide biologique identique témoin. Selon une variante de l'invention, le fluide biologique identique témoin peut être un fluide biologique identique à celui testé mais provenant d'au moins un individu considéré comme sain, c'est-à-dire ne présentant pas de pathologie, à tout le moins pas la pathologie dont souffre l'individu dont le fluide biologique est testé, et permettant alors d'évaluer les risques dudit individu au regard d'une valeur considérée comme normale. Selon une autre variante de l'invention, le fluide biologique identique témoin peut être le même fluide biologique que celui testé, provenant du même individu mais obtenu dans un prélèvement antérieur à celui ayant donné l'échantillon testé, par exemple avant le début d'un traitement, afin de pouvoir établir un suivi de l'évolution de la capacité des microparticules à générer de la plasmine par exemple au cours d'un traitement. Selon l'invention, la première étape de la méthode (isolement des microparticules circulantes présentes dans l'échantillon), peut être réalisée selon tout procédé compatible avec l'isolement de telles microparticules. Par exemple on citera la centrifugation à hautes vitesses ou encore des techniques de biocapture quel que soit le support capteur (par exemple des anticorps, par exemple de l'annexine V). Selon une variante préférée de la première étape de la méthode selon l'invention, les microparticules peuvent être isolées par une succession de centrifugations et d'ultracentrifugations dans un procédé selon lequel dans une étape 1A on centrifuge un volume compris entre 500 pI et 5 ml, préférentiellement entre 1 ml et 2 ml, d'un échantillon de fluide biologique, par exemple de sang, préalablement prélevé, à une vitesse comprise entre 1000 g et 2000 g, préférentiellement entre 1200 g et 1800g, pendant un temps compris entre 5 minutes et 20 minutes, préférentiellement entre 10 et 15 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3et5 C; - dans une étape 1 B, on centrifuge le plasma ou surnageant obtenu à l'étape 1A à une vitesse comprise entre 10000 g et 20000 g, préférentiellement entre 12000 g et 15000g, pendant un temps compris entre 1 minute et 5 minutes, préférentiellement entre 2 et 3 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1C on centrifuge le surnageant obtenu à l'étape 1B à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1D on reprend le culot obtenu à l'étape 1C dans un volume compris entre 250 pI et 4 ml, préférentiellement entre 1 et 2 ml, de tampon phosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1E on reprend le culot obtenu à l'étape 1C dans un volume compris entre 250 pI et 4 ml, préférentiellement entre 1 et 2 ml, de tampon phosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1 F on reprend le culot obtenu à l'étape 1E dans un volume compris entre 20 pI et 500 pI préférentiellement entre 50 et 100 pI, de tampon phosphate salin (PBS). La suspension de microparticules obtenue à l'étape 1 F peut être utilisée immédiatement pour analyse ou peut être conservée préférentiellement à -80 C. Selon l'invention, la deuxième étape de la méthode (mesure de la capacité des microparticules à générer de la plasmine) peut être réalisée directement sur la quantité de microparticules obtenues à l'issu de la première étape. Préférentiellement selon l'invention, la deuxième étape de la méthode peut être réalisée sur une quantité déterminée de microparticules obtenues à l'issu de la première étape, ladite quantité pouvant être comprise entre 10000 et 1000000 microparticules, préférentiellement entre 100000 et 300000 microparticules. Dans ce cas la méthode selon l'invention peut comporter une étape supplémentaire (étape Ibis) de dénombrement des microparticules obtenues à l'issu de la première étape, ladite étape de dénombrement intervenant entre la première et la deuxième étape de la méthode selon l'invention. Ladite étape de dénombrement peut être réalisée selon l'invention selon tout procédé connu de dénombrement de microparticules. Avantageusement, le dénombrement des microparticules peut être réalisé par cytométrie de flux selon les protocoles classiquement utilisés dans l'art antérieur, par exemple ceux décrits dans la demande de brevet français FR-A-2795820, ou encore par un test de détection basé sur l'activité procoagulante des microparticules (Zymuphen MP-activity, Hyphen BioMed) ou encore un dosage protéique. Préférentiellement selon l'invention, on dénombre les microparticules par cytométrie de flux. Selon l'invention, la deuxième étape de la méthode, c'est-à-dire la mesure de la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine peut être déterminée soit par la mesure de la quantité de plasmine spontanément présente sur les microparticules, soit par mesure de la quantité de plasmine susceptible d'être produite par ces microparticules. Lesdites mesures de la plasmine peuvent être réalisée par toute méthode connue. Selon une variante de l'étape 2 de la méthode selon l'invention, la mesure de la quantité de plasmine spontanément présente sur les microparticules, peut être réalisée par toute méthode connue, comme par exemple une mesure immunologique (FASEB J 2003, 17 : 1301-3) (ELISA ou Western blot) à l'aide d'anticorps antiplasmin(ogèn)e (par exemple TC12040, Technoclone, Austria ou product 3641, American Diagnostica) ou encore par spectrophotométrie, par lecture de l'absorbance de l'échantillon à 405 nm à l'aide de substrats chromogènes sélectifs de la plasmine (par exemple CBS0065, Stago). Selon une autre variante de l'étape 2 de la méthode selon l'invention, la mesure de la quantité de plasmine susceptible d'être produite par les microparticules peut être réalisée selon le procédé décrit dans Thromb Haemost 2004 ; 92 :1066-75, dans lequel dans une étape 2-1, on ajoute aux microparticules obtenues à l'étape 1 ou à l'étape Ibis de la méthode selon l'invention, du plasminogène, avantageusement purifié, en une quantité finale comprise entre 0,1 pM et 2,0 pM, préférentiellement entre 0,5 pM et 1 pM, et d'un substrat chromogénique sélectif de la plasmine, comme par exemple le (méthyl-malonyl)-hydroxypropylarginine-p-nitroanilide (CBS0065) commercialisé par la société STAGO (France), en une quantité finale comprise entre 0,50 mM et 1,0 mM, préférentiellement entre 0,65 mM et 0, 85 mM ; dans une étape 2-2 on incube, le mélange obtenu à l'étape 2-1, par exemple dans une étuve sèche, à une température comprise entre 25 C et 45 C, préférentiellement 30 C et 40 C, pendant un temps compris entre 30 minutes et 90 minutes, préférentiellement entre 50 et 70 minutes et dans une étape 2-3 on mesure la quantité de plasmine susceptible d'être produite est détectée par photométrie par lecture de l'absorbance de l'échantillon à 405 nM (par exemple dans un lecteur de plaques de 96 puits comme le lecteur de microplaque MR 700 Dynex). Selon une variante de l'étape 2-1, le substrat sélectif de la plasmine peut être un substrat fluorescent comme par exemple le H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcoumarin (Bachem, Bubendorf, Switzerland) ou le D-AFK-ANSNH-C4H9.2HB (Haematologic Technologies Inc, Vermont USA). Selon une variante de l'étape 2-2 le mélange obtenu à l'étape 2-1 est déposé dans un lecteur de plaques, thermostaté à 37 C, qui mesure la cinétique de formation de plasmine par mesure de l'absorbance à 405 nm en fonction du temps. Selon l'invention, la deuxième étape de la méthode peut être réalisée sur tout support compatible avec les incubations et les mesures à réaliser. A cet égard on peut citer des cupules à fond rond ou des cupules à fond plat, par exemple les cupules de plaques 48 ou 96 puits en polystyrène ou en chlorure de polyvinyl. Préférentiellement l'étape 2 de la méthode selon l'invention est réalisée dans de cupules à fond rond ou des cupules à fond plat de plaques à 96 puits. Selon l'invention, la mesure de la quantité de plasmine susceptible d'être produite par les microparticules, ou de la quantité de plasmine spontanément présente sur les microparticules, peut être réalisée dans un volume final compris entre 25 pI et 150 pl, préférentiellement entre 50 pI et 100 pI, ajusté par exemple à l'aide de tampon phosphate salin (PBS) additionné d'albumine de sérum bovin (Bovin Serum Albumin: BSA) à une concentration comprise entre 1,0 et 3,0 mg/ml, préférentiellement entre 1,5 et 2,5 mg/ml. Le nombre de microparticules à tester par puits peut être compris entre 50 000 et 400 000 particules, préférentiellement 100 000 à 200 000 particules par puits. Avantageusement, lorsque la mesure est réalisée dans des cupules à fond rond, le volume final est préférentiellement de 50 pI et quand la mesure est réalisée dans des cupules à fond plats, le volume final est préférentiellement de 100 pI. Selon l'invention, les résultats sont exprimés en quantité de plasmine produite par nombre de microparticules. Dans un échantillon de fluide biologique, particulièrement de sang, les microparticules circulantes représentent une population globale des microparticules dont on a vu précédemment qu'elles ont pour origine un bourgeonnement cellulaire et qu'elles peuvent être issues de nombreux types cellulaires différents. A cet égard on peut citer des microparticules issues de cellule endothéliales, de cellules hématopoïétiques. Ainsi, selon le type cellulaire dont elles sont issues, les microparticules seront porteuses de caractéristiques propres au type cellulaire dont elles sont issues. Sur cette base il est possible d'isoler les microparticules en fonction de leur origine et ainsi de générer des populations distinctes de microparticules d'un seul type. Or, il peut être intéressant de ne réaliser la mesure de l'activité plasmine que sur un type particulier de microparticules. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode peut comprendre en outre une étape 1ter d'isolement des microparticules en fonction de leur origine. Cette étape peut être réalisée après la première étape de la méthode selon l'invention, c'est-à-dire après l'étape 1 ou l'étape 1 bis de la dite méthode, préférentiellement après l'étape 1 et avant l'étape 1 bis. L'isolement des microparticules d'intérêt peut être réalisé par toute méthode connue de l'art antérieur. On citera à cet égard une procédure de tri cellulaire par cytométrie ou encore l'immunoséparation magnétique. Préférentiellement selon l'invention on utilise la méthode d'immunoséparation magnétique. Selon encore une autre variante de la méthode selon l'invention, il est possible 35 d'immobiliser les microparticules isolées à l'étape 1 au support sur lequel l'étape 2 va être réalisée. L'immobilisation des microparticules peut être réalisée selon tout procédé connu de l'art antérieur, particulièrement celui décrit dans la demande internationale WO-A-96/03655. Par exemple il est possible de préparer le support utilisé à l'étape 2 de la méthode selon l'invention en couvrant sa surface à l'aide d'un composé apte à immobiliser les microparticules puisque reconnaissant un élément de la surface desdites microparticules. On peut citer à cet égard l'annexine V qui reconnaît les phospholipides procoagulants, ou encore les anticorps spécifiques des complexes glycoprotéiques conformationnels actifs et/ou fonctionnels des membranes GPIIb/GPIIIa, ou encore les récepteurs adhésifs des monocytes ou des lymphocytes LFA-1 ou encore la thrombomoduline endothéliale ou encore le CD146. Selon une autre variante de la méthode selon l'invention il est possible d'immobiliser les microparticules à l'aide d'un polycation comme la poly-L-lysine. L'invention a également pour objet l'utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de mesure de l'activité plasmine dudit échantillon de fluide biologique, particulièrement dans une méthode de mesure de l'activité plasmine telle que décrite précédemment. L'invention a encore pour objet l'utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de diagnostic, chez un l'individu dont le fluide biologique est issu, du risque plus ou moins élevé à subir des accidents vasculaires causés par exemple par une instabilité accrue des plaques d'athérome, ou encore du risque plus ou moins élevé pour ledit individu atteint d'un cancer à subir une invasion métastasique, ou encore du risque plus ou moins élevé pour ledit individu à subir un accident vasculaire cérébral, ses complications hémorragiques, ou encore ses conséquences sur 25 le fonctionnement cérébral. - du risque pour ledit individu de subir une thrombose. - du risque plus ou moins élevé pour ledit individu atteint d'une maladie où la production de plasmine par les microparticules est augmentée comme l'hyperfibrinolyse ou la protéolyse péricellulaire. 30 Préférentiellement selon l'invention, ladite méthode de diagnostic est une méthode de mesure de l'activité plasmine telle que décrite précédemment. L'invention a aussi pour objet l'utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de suivi de la réponse de l'individu dont le fluide biologique est issu à un traitement. 35 Préférentiellement selon l'invention, ladite méthode de suivi du traitement est la méthode de mesure de l'activité plasmine telle que décrite précédemment. Les inventeurs ont par ailleurs pu montrer que les microparticules circulantes, particulièrement les microparticules issues de cellules endothéliales, contenues dans un fluide biologique, par exemple du sang, porteuses d'une activité plasmine au sens de l'invention, présentent une grande résistance à l'inactivation, particulièrement à la neutralisation ou l'inhibition par les inhibiteurs d'enzymes protéolytiques présentes dans le fluide biologique. Cette propriété confère auxdites microparticules circulantes la capacité à véhiculer l'activité plasmine au travers de l'organisme par le fluide biologique jusqu'au lieu où la présence de la plasmine développe son activité, sans risque d'inhibition, à tout le moins avec un risque d'inhibition extrêmement diminué. A cet égard on sait que la plasmine native circulante est rapidement inhibée dans les fluides biologiques. Lesdites microparticules peuvent alors être assimilées à un vecteur de l'activité plasmine, ce qui permet d'envisager leur utilisation en tant que tel, une fois purifiées ou semi-purifiées. De la même façon que les microparticules portant le facteur tissulaire sont potentiellement utiles dans le traitement de maladies hemorrhatiques congénitales comme l'hémophilie (Nature Medicine 2003, 9 : 1020-1025). Par purifiée ou semi-purifiées, on entend selon l'invention que les micorparticules sont utilisées après avoir subi au moins une étape de purification. Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation de microparticules circulantes, particulièrement des microparticules issues de cellules endothéliales, purifiée ou semi- purifiées, à titre de vecteur de l'activité plasmine. L'invention a encore pour objet l'utilisation de microparticules circulantes, particulièrement des microparticules issues de cellules endothéliales, purifiée ou semipurifiées, à titre de médicament, particulièrement de médicament à activité protéolytique ou antithrombotique. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre illustratif et ne limitent en rien la présente invention. Exemples Exemple 1 : Mise en évidence de l'activité plasmine portée par les microparticules de cellules endothéliales en culture : 1-A : Préparation de microparticules de cellules endothéliales : Des cellules de lignée endothéliale microvasculaire humaine HMEC-1 (J. Invest. Dermatol. 1992 ; 99 : 683-90) ont été cultives à sous confluence en milieu MCDB 131 (Invitrogen Life Technologies, Cergy Pontoise, France) additionné de 10% de sérum de veau foetal exempt de microparticule (FCS), 10 ng/ml d'EGF humain recombinant (Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY, USA) et de 1 pg/ml d'hydrocortisone (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Les microparticules endothéliales (EMP) ont été purifiées à partir du milieu de culture des cellules HMEC-1 stimulées pendant 48 h avec 100 ng/ml de TNF-a 5 (PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, USA) selon les conditions décrites dans J. Clin. Invest. 1999 Jul; 104(1):93-102) Les surnageants de culture ont été centrifugés 4300g pendant 5 minutes afin de les débarrasser des cellules et des débris cellulaires flottants. Les surnageants ont alors été centrifugés à 20000g pendant 120 minutes à 4 C. 10 Le culot d'EMP a alors été lavé 2 fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et resuspendu dans du PBS. Des aliquots de 10 pl de suspension d'EMP, dilué au 1/100, ont été marqués par de l'annexine V conjuguée à de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (Abcys, Paris, France). Les EMPs ont été dénombrées par cytométrie de flux comme préalablement décrit dans J. Thromb. Haemost. 2004 Oct; 2(10):1842-3 et demande de 15 brevet français FR-A-2795820. 1-B : Immobilisation des EMP Les EMP ont été immobilisées sur une surface en polycation selon le principe de l'adsorption physico-chimique. Pour cela les parois et le fond des puits à fond rond de plaques 96 puits en PVC 20 ont été activés avec 25pg/ml poly-L-lysine (Aldrich-Sigma). Différentes concentrations d'EMP dans du PBS ont alors été incubées pendant une nuit à 4 C dans les puits préalablement activés. Les puits sont alors lavés et les EMP immobilisées ont été utilisées dans le test de génération de plasmine. 1-C : Test de génération de plasmine 25 1-C-1 : protocole Dans les puits de plaques 96 puits à fond rond en PVC, différentes concentrations d'EMP en suspension dans du PBS additionné de 0,8% sérum albumine bovine (PBSA) ont été incubées avec 50 pl d'un mélange de plasminogène 1 pM et de (methylmalonyl)-hydroxypropylarginine-p-nitroanilide (CBS0065, Stago, Asnières, France), 30 substrat chromogénique sélectif de la plasmine, à 0,75 mM. Un volume identique de surnageant du dernier lavage des EMP a été utilisé comme contrôle. La microplaque est déposée dans le lecteur de microplaques et la cinétique de l'apparition de la plasmine a été suivie pendant 9 heures à l'aide d'un spectrophotomètre 35 adapté à la lecture des plaques multi puits (MX5000, Dynex) à 37 C par mesure des modifications de l'absorbance à 405 nm produites par le relargage de la p-nitroaniline en fonction du temps. 1-C-2 : Résultats Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau suivant : EMP/50pL A405nm/min 106 48,7 105 12,9 5.104 4,7 104 1,6 103 1,1 0 0,5 5.104+EACA 0,6 EACA : acide E-aminocaproique (c-aminocaproic acid), inhibiteur de la liaison du plasminogène aux MPs. 1-D : Mesure de la constante de Michaelis 1-D-1 : mesure sur des EMP en suspension 1-D-1 a : protocole Dans les puits de plaques 96 puits à fond rond en PVC, 2.105 EMP en suspension dans du PBS additionné de 0,8% sérum albumine bovine (PBSA) ont été incubées avec différentes concentrations de plasminogène (0 to 5 NM) dans un volume final de 50 pl en présence de (methyl-malonyl)-hydroxypropylarginine-p-nitroanilide (CBS0065, Stago, Asnières, France), substrat chromogénique sélectif de la plasmine, à 0,75 mM. Un volume identique de surnageant du dernier lavage des EMP a été utilisé comme contrôle. 1-D-lb : Résultats Les résultats de ces mesures sont présentés dans le tableau suivant : Pg (pM) A405nm/min 5 36,8 2,5 31,81,25 25,9 0,62 21,8 0,31 18,2 0,18 16,4 0 0,4 Par application de l'équation de Michaelis-Menten, ces résultats permettent de déterminer la constante de Michaelis de la génération spécifique de plasmine : Km = 0,122 M 1-D-2 : mesure sur des EMP immobilisées 1-D-2a : protocole Les microparticules ont été immobilisées dans les puits comme indiqué ci-dessus (1-B Immobilisation de microparticules). Le plasminogène et le substrat chromogène ont été ajoutés aux microparticules immobilisées selon le même protocole que pour les EMP en suspension. La cinétique de formation de plasmine est détectée dans un lecteur de microplaques par mesure de l'absorbance à 405 nm. Cette variante permet après détection de la cinétique d'activation de mesurer la plasmine liée aux microparticules immobilisées. A cet effet, les plaques sont lavées avec du PESA et la plasmine fixée aux microparticules immobilisées a été détectée par addition de 50 pl/puits de 0,325 mM de CBS0065 et mesure de modifications de l'absorbance à 405 nm. 1-D-2b : Résultats EMP/50NL A405nm/min 2.1 05 4,6 105 2,3 7,5.104 1,5 5.1 04 0,8 2,5.1 04 0,6 1-E : Conclusion Ces résultats montrent que la formation de plasmine par les microparticules est fonction du nombre de microparticules ajoutées aux puits ou à concentration fixe de microparticules de la concentration de plasminogène ajoutée. Ces résultats montrent également que l'effet des microparticules est du à la présence d'un activateur du plasminogène présent sur les microparticules. Exemple 2 : Mise en évidence de l'activité plasmine portée par les 25 microparticules in vivo : 2-A : Protocole A partir d'un échantillon de sang total préalablement obtenu d'un individu présentant une pathologie autoimmune à risque thrombotique on isole les microparticules selon la méthode suivante : + (étape 1A) on centrifuge 2 ml dudit échantillon de sang à la vitesse de 1500g, pendant 10 minutes, à la température de 4 C; + (étape 1B) on centrifuge le surnageant obtenu à l'étape 1A à la vitesse de 17500g, pendant 2 minutes, à la température de 4 C ; + (étape 1C) on centrifuge le surnageant obtenu à l'étape 1B à la vitesse de 17500g, pendant 90 minutes, à la température de 4 C ; + (étape ID) on reprend le culot obtenu à l'étape 1C dans 1000 pl de tampon phosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à la vitesse de 17500g, pendant 90 minutes, à la température de 4 C ; + (étape 1E) on reprend le culot obtenu à l'étape 1 D dans 1000 pI de tampon phosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à la vitesse de 17500g, pendant 90 minutes, à la température de 4 C; + (étape 1 F) on reprend le culot obtenu à l'étape 1E dans 50 pI de tampon phosphate salin (PBS) pour conservation et utilisation ultérieure. Les microparticules ainsi obtenues à l'étape 1 F sont dénombrées par cytométrie de flux. Dans une cupule à fond rond d'une plaque 96 puits (Vinyl alphanumeric U bottom plates, Ref. 2101, Thermo), dans un volume final de 50 pI, ajusté si nécessaire par du tampon phosphate salin (PBS) additionné de sérumalbumine bovine à la concentration finale de 2 mg/ml, à 200000 microparticules précédemment obtenues et préservées dans du PBS additionné de sérumalbumine bovine à la concentration finale de 2 mg/ml, on ajoute du plasminogène purifié (Américan Diagnostica, Hyphen) à une concentration finale de 0,5 pM (ou l pM) et du CBS0065 (STAGO) à la concentration finale de 0,75 mM. A l'issu de l'addition du plasminogène et du substrat chromogène aux microparticules dans un volume final de 50 pl dans la plaque de 96 puits, ladite plaque est placée directement dans le photomètre thermostaté à 37 C (MX5000, Dynex) afin de détecter la variation de l'absorbance à 405 nm en fonction du temps pendant 4 à 8 heures. L'activité plasmine d'un échantillon témoin, provenant d'un sujet exempt de risque thrombotique est mesurée en parallèle dans les mêmes conditions. La quantité de plasmine produite par les microparticules est calculée par rapport à une courbe de référence faite avec des concentrations variables de plasmine (0 à 20 nM). 2-B : Résultats E A P A A P A A P 1A 1 1,35 5 3,5 9 0,4 13 1,5 1713,75 2111,5 2? 1,8 6]1,0 10 0,7 14]1,05 18 7,5 22 0,9 3 0,7 7 0,6 111 1,2 15 1,8 19 1 6,5 4 0,5 8 2,8 12 9,05 16 2,15 20 0,85 A : absorbance (405 nm/min) ; P = patient 2-C : Conclusion Ces résultats montrent que les microparticules circulantes isolées à partir du plasma d'un sujet présentant une maladie autoimmune, génèrent de la plasmine comme les particules du prototype testé in vitro. Ces résultats montrent également que l'effet des microparticules produites in vivo est dépendant de la présence de plasminogène ajouté. REVENDICATIONS 1.) Méthode de mesure de l'activité plasmine des microparticules d'un échantillon de fluide biologique, particulièrement de sang, préalablement prélevé, dans laquelle - dans une première étape on isole les microparticules circulantes présentes dans ledit échantillon, dans une deuxième étape on mesure, par tout moyen approprié, la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine et dans une troisième étape on compare le résultat de la mesure obtenu à l'étape 2 au résultat d'une mesure identique réalisée dans les mêmes conditions sur un échantillon de fluide biologique identique témoin. 2.) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fluide biologique identique témoin est un fluide biologique identique à celui testé mais provenant d'au moins un individu considéré comme sain, ou est le même fluide biologique que celui testé, provenant du même individu mais obtenu dans un prélèvement antérieur à celui ayant donné l'échantillon testé, par exemple avant le début d'un traitement. 3.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la première étape de ladite méthode (isolement des microparticules circulantes présentes dans l'échantillon), est réalisée selon un procédé dans lequel dans - une étape 1A on centrifuge un volume compris entre 500 pl et 5 ml, préférentiellement entre 1 ml et 2 ml, d'un échantillon de fluide biologique, par exemple de sang, préalablement prélevé, à une vitesse comprise entre 1000 g et 2000 g, préférentiellement entre 1200 g et 1800g, pendant un temps compris entre 5 minutes et 20 minutes, préférentiellement entre 10 et 15 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1B, on centrifuge le plasma ou surnageant obtenu à l'étape 1A à une vitesse comprise entre 10000 g et 20000 g, préférentiellement entre 12000 g et 15000g, pendant un temps compris entre 1 minute et 5 minutes, préférentiellement entre 2 et 3 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; - dans une étape 1C on centrifuge le surnageant obtenu à l'étape 1B à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3et5 C; dans une étape ID on reprend le culot obtenu à l'étape 1C dans un volume compris entre 250 pl et 4 ml préférentiellement entre 1 et 2 ml, de tamponphosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1E on reprend le culot obtenu à l'étape 1C dans un volume compris entre 250 pI et 4 ml préférentiellement entre 1 et 2 ml, de tampon phosphate salin (PBS) et on centrifuge le mélange à une vitesse comprise entre 15000 g et 25000 g, préférentiellement entre 18000 g et 22000g, pendant un temps compris entre 45 et 120 minutes, préférentiellement entre 60 et 100 minutes, à une température comprise entre 2 et 6 C, préférentiellement entre 3 et 5 C ; dans une étape 1 F on reprend le culot obtenu à l'étape 1E dans un volume compris entre 20 pI et 500 pI préférentiellement entre 50 et 100 pI, de tampon phosphate salin (PBS). 4.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la deuxième étape de ladite méthode (mesure de la capacité des microparticules à générer de la plasmine) est réalisée directement sur la quantité de microparticules obtenues à l'issu de la première étape. 5.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la deuxième étape de ladite méthode (mesure de la capacité des microparticules à générer de la plasmine) est réalisée sur une quantité déterminée de microparticules obtenues à l'issu de la première étape. 6.) Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que, ladite quantité est comprise entre 10000 et 1000000 microparticules, préférentiellement entre 100000 et 300000 microparticules. 7.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5 ou 6, caractérisée en ce qu'elle comporte une étape supplémentaire (étape Ibis) de dénombrement des microparticules obtenues à l'issu de la première étape, ladite étape de dénombrement intervenant entre la première et la deuxième étape de la méthode selon l'invention. 8.) Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que le dénombrement des microparticules est réalisé par cytométrie de flux. 9.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la deuxième étape de ladite méthode, c'est-à-dire la mesure de la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine est déterminée soit par la mesure de la quantité de plasmine spontanément présente sur les microparticules, soit par mesure de la quantité de plasmine susceptible d'être produite par cesmicroparticules. 10.) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que la mesure de la quantité de plasmine spontanément présente sur les microparticules, est réalisée par toute méthode connue comme par exemple une mesure immunologique (ELISA ou Western blot) à l'aide d'anticorps antiplasmin(ogèn)e ou encore par spectrophotométrie par lecture de l'absorbance de l'échantillon à 405 nm a l'aide de substrats chromogènes sélectifs de la plasmine. 11.) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que la mesure de la quantité de plasmine susceptible d'être produite par les microparticules est réalisée selon un procédé dans lequel dans une étape 2-1 on ajoute aux microparticules obtenues à l'étape 1 ou à l'étape Ibis de ladite méthode, du plasminogène, avantageusement purifié, en une quantité finale comprise entre 0,1 pM et 2,0 pM, préférentiellement entre 0,5 pM et 1 pM, et un substrat chromogénique sélectif de la plasmine, en une quantité finale comprise entre 0,50 mM et 1,0 mM, préférentiellement entre 0,65 mM et 0,85 mM ; dans une étape 2-2 on incube, le mélange obtenu à l'étape 2-1, par exemple dans une étuve sèche, à une température comprise entre 25 C et 45 C, préférentiellement 30 C et 40 C, pendant un temps compris entre 30 minutes et 90 minutes, préférentiellement entre 50 et 70 minutes et dans une étape 2-3 la quantité de plasmine susceptible d'être produite est détectée par photométrie par lecture de l'absorbance de l'échantillon à 405 nM. 12.) Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que de l'étape 2-1, le substrat sélectif de la plasmine est un substrat fluorescent comme par exemple le H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcoumarin (Bachem, Bubendorf, Switzerland) ou le D-AFKANSNH-iC4H9.2HB (Haematologic Technologies Inc, Vermont USA). 13.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la deuxième étape de ladite méthode, c'est-à-dire la mesure de la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine, est réalisée dans un volume final compris entre 25 pl et 150 pI, préférentiellement entre 50 pI et 100 pI. 14.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la deuxième étape de ladite méthode, c'est-à-dire la mesure de la capacité desdites microparticules isolées à l'étape 1 à générer de la plasmine, est réalisée dans un tampon phosphate salin (PBS) additionné de sérumalbumine bovine (Bovine Serum Albumin : BSA) à une concentration comprise entre 1,0 et 3,0 mg/ml, préférentiellement entre 1,5 et 2,5 mg/ml. 15.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une étape 1ter d'isolement des microparticules en fonction de leurorigine. 16.) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que les microparticules isolées à l'étape 1 sont immobilisées au support sur lequel l'étape 2 est réalisée. 17.) Méthode selon la revendication 16, caractérisée en ce que les microparticules isolées à l'étape 1 sont immobilisées au support à l'aide d'un composé apte à immobiliser lesdites microparticules, ledit composé étant préalablement fixé à la surface dudit support. 18.) Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que le composé apte à immobiliser lesdites microparticules est choisi parmi l'annexine V, les anticorps spécifiques des complexes glycoprotéiques conformationnels actifs et/ou fonctionnels des membranes GPllb/GPllla, les récepteurs adhésifs des monocytes ou des lymphocytes LFA-1, la thrombomoduline endothéliale, ou encore le CD 146 ou encore un polycation comme la poly-L-lysine. 19.) Utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de mesure de l'activité plasmine dudit échantillon de fluide biologique telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 18. 20.) Utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de mesure de l'activité plasmine dudit échantillon de fluide biologique telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 18, chez un individu dont le fluide biologique est issu, du risque plus ou moins élevé à subir des accidents vasculaires causés par exemple par une instabilité accrue des plaques d'athérome, ou encore du risque plus ou moins élevé pour ledit individu atteint d'un cancer à subir une invasion métastasique, ou encore du risque plus ou moins élevé pour ledit individu à subir un accident vasculaire cérébral et ses conséquences hémorragiques, ou encore du risque pour ledit individu de subir une thrombose. du risque plus ou moins élevé pour ledit individu atteint d'une maladie où la production de plasmine par les microparticules est augmentée comme l'hyperfibrinolyse ou la protéolyse péricellulaire. 21.) Utilisation de microparticules circulantes présentes dans un échantillon de fluide biologique, dans une méthode de suivi de la réponse d'un individu dont le fluide biologique est issu à un traitement, ladite méthode de suivi du traitement étant la méthode de mesure de l'activité plasmine telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 1 à 18.