Brevet FR2917407A1 — publié le 20081219

Domaine de l'invention La présente invention concerne un composé de protection du foie, en particulier un composé cyclohexénone isolé et purifié à partir d'extraits d'Antrodia camphorata, lesquels peuvent être appliqués dans la protection du foie et le soulagement d'une lésion et d'une fibrose du foie. Technique antérieure Le foie est l'organe le plus grand et le plus compliqué du métabolisme dans le corps, qui est responsable du fait de métaboliser les graisses, les glucides, les protéines, les vitamines, les hormones et la bile. En outre, il a les capacités de sécrétion, d'excrétion, de transformation biologique et analogues. Le foie est également un organe de barrière importante où la désintoxication est importante pour protéger l'organisme. La fonction du foie endommagée peut entraîner une altéra- tion du métabolisme, qui peut affecter la fonction d'autres organes ou peut mener à la mort dans des cas sérieux. La prédominance des affections hépatiques est assez élevée à Taiwan. Selon le département de la santé de Taiwan, l'affection hépatique chronique et la cirrhose du foie sont au sixième rang parmi les dix causes principales de mort des ha- bitants de Taiwan, et ont entraîné plus de 3000 morts par an. Le taux augmente toujours. Par conséquent, le développement de substances de protection du foie, en outre pour prévenir ou traiter les maladies hépatiques est actuellement crucial. L'Antrodia camphorata est également appelée Chang-Zhi, Niu Chang-Zhi, champignon de camphre rouge et analogues, qui est un champignon pérenne appartenant au genre Aphyllophorales, de la fa-mille Polyporaceae. Il s'agit d'une espèce endémique à Taiwan se développant sur un mur en bois interne à coeur putréfié de foin de Cinnamomum kanehirae. Le foin de Cinnamomum kanehirae est rare- ment distribué en étant surcoupé illégalement, ce qui rend rare le développement de l'Antrodia camphorata à l'intérieur de l'arbre à l'état sauvage. Le prix de d'Antrodia camphorata est très élevé en raison de la vitesse de croissance extrêmement lente de l'Antrodia camphorata naturel poussant seulement entre juin et octobre. Les corps de fructification d'Antrodia camphorata sont pé- rennes, sessiles, durs et boisés, lesquels exhalent une forte odeur de sassafras (arôme de camphre). Les aspects sont divers avec des formes de plaque, de cloche, de sabot ou de tour. Ils sont de couleur rougeâtre et plats lorsqu'ils sont jeunes, attachés à la surface du bois. Ensuite, les bords de l'embout avant deviennent légèrement courbés et inclinés et se prolongent aux environnements. La couleur tourne à un marron-rouge fané ou un marron-jaune crème, avec une forte présence d'ostioles. Cette région est d'une très grande valeur médicale. En médecine traditionnelle taïwanaise, l'Antrodia cam- phorata est généralement utilisé en tant qu'antidote, médicament de protection du foie et médicament anticancéreux. L'Antrodia camphorata, tout comme les champignons généraux comestibles et médicinaux, est enrichi en de nombreux nutriments comprenant des polysaccharides (tels que le 3-glucosane), des triterpénoïdes, la superoxyde dismu- tase (SOD), l'adénosine, des protéines (les immunoglobulines), des vitamines (telles que la vitamine B et l'acide nicotique), des oligo-éléments (tels que le calcium, le phosphore et le germanium et autres), un acide nucléique, l'agglutinine, des acides aminés, des stéroïdes, des lignines et des stabilisateurs pour la tension artérielle (tels que l'acide d'antrodia) et analogues. Ces substances physiologiquement actives sont censées présenter des effets tels que : des activités antitumorales, une augmentation des activités immunorégulatrices, anti-allergiques, anti-bactériennes, contre l'hypertension artérielle, la baisse du sucre dans le sang, la baisse du cholestérol, la protection du foie, une lutte contre la fatigue et analogues. Les triterpénoïdes sont les composants les plus étudiés parmi les nombreuses compositions de l'Antrodia camphorata. Les triterpénoïdes correspondent à un terme associé à des composés naturels, lesquels contiennent 30 atomes de carbone avec des structures penta- cycliques ou hexacycliques. Le goût amer de l'Antrodia camphorata pro-vient du composant des triterpénoïdes. Trois nouveaux triterpénoïdes de type ergostane (l'antcine A, l'antcine B, l'antcine C) ont été isolés par Cherng et al. à partir des corps de fructification de l'Antrodia camphorata (Cherng, I. H., and Chiang, H. C. 1995. Thee new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371). Trois nouveaux com-posés, l'acide zhankuique A, l'acide zhankuique B et l'acide zhankuique ont été extraits à partir des corps de fructification de l'Antrodia camphorata avec de l'éthanol par Chen et al. (Chen, C. H., and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661). En outre, Cherng et al. ont également découvert trois autres nouveaux triterpénoïdes à partir des corps de fructification de l'Antrodia camphorata, les-quels sont des composés dérivés de sesquiterpène lactone et de 2-biphényle, le 4,7-diméthoxy-5-méthyl-1,3-benzodioxole et le 2,2',5,5'-tétraméthoxy-3,4,3',4'-bisméthylènedioxy-6,6'-diméthylbiphényle (Chiang, H. C., Wu, D. P., Cherng, I. W., and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616). En 1996, quatre nouveaux triterpénoïdes de type ergostane (les antcines E et F et les antcinates de méthyle G et H) ont été isolés par Cherng et al. avec les mêmes procédés analytiques (Cherng, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41 :263-267). Et deux stéroïdes de type ergostane, les acides zhankuiques D et E ainsi que trois triterpènes de type lanosta, l'acide 15-alpha- acétyl- 2o déshydrosulfurénique, l'acide déshydroéburicoïque, l'acide déshydrosulfurénique ont été isolés par Yang et al. (Yang, S. W., Shen, Y. C., and Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392). 25 Bien qu'il ait été rapporté que des extraits d'Antrodia camphorata présentent les effets mentionnés ci-dessus à partir des expériences précédentes, et que les composants aient été analysés successivement, d'autres expériences sont nécessaires pour identifier la composition efficace pour la protection du foie. L'application dans le 30 traitement et la prévention d'affections hépatiques de composants pro-venant d'extraits d'Antrodia camphorata sera d'un grand effet bénéfique à partir d'études de la protection du foie si une composition réellement efficace est découverte. Exposé de l'invention 35 Afin d'identifier les composés destinés à prévenir ou trai- ter des affections hépatiques à partir d'extraits de l'Antrodia camphorata, le composé répondant à la formule (1) a été isolé et purifié dans la présente invention, (1) dans laquelle X et Y peuvent représenter un atome d'oxygène ou de soufre, Ri, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène, un groupe méthyle ou (CH2)m-CH3, et m vaut de 1 à 12 ; n vaut de 1 à 12. Un composé préféré répondant à la formule générale (1) est la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6,11-triényl) -cyclohex-2-énone telle que représentée par la formule (2), avec une formule moléculaire C24H3804, ayant un aspect d'une poudre jaune pâle et une masse moléculaire de 390. H3 (2) Les composés cyclohexénone ayant les structures répon- dant à la formule (1) et à la formule (2) sont purifiés à partir d'une ex-traction aqueuse ou d'une extraction de solvant organique de l'Antrodia camphorata. Les solvants organiques utilisés comprennent, mais sans s'y limiter, des alcools tels que le méthanol, l'éthanol ou le propanol, des esters tels que l'acétate d'éthyle, des alcanes tels que l'hexane ou des alcanes halogénés tels que le chlorométhane, le chloroéthane. Parmi ces derniers, on préfère un alcool, et l'éthanol est plus particulièrement préféré. Les composés cyclohexénone répondant à la formule (1) et à la formule (2) selon la présente invention sont appliqués dans la 25 protection du foie et le soulagement d'une lésion et d'une fibrose du foie. Alimenter la cyclohexénone à des rats traités avec du tétrachlorure de carbone (CC14) a permis d'aider à soulager l'évolution d'une lésion et d'une fibrose du foie du rat. Les niveaux d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) ont été diminués de façon à réaliser la protection du foie souhaitée. En outre, la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata a permis d'augmenter la glutathione peroxydase (GSHPx) et la catalase d'enzymes antioxydantes (CAT) dans le foie de façon à diminuer la lésion de cellules de foie et abaisser la pression oxydante induite par des radicaux libres, de façon à augmenter en outre la capacité antioxydante. D'autre part, les composés répondant à la formule (1) et/ou à la formule (2) dans la présente invention peuvent être incorporés dans des compositions pharmaceutiques pour traiter une lésion du foie de façon à améliorer les symptômes induits par une lésion du foie chez les mammifères tels que l'être humain. Les compositions pharmaceutiques comprennent non seulement les composés répondant à la formule (1) et/ou à la formule (2), mais également les supports pharmaceutiquement acceptables. Les exemples de tels supports comprennent, mais sans s'y limiter, des excipients tels que l'eau, des charges telles que le saccharose ou l'amidon, des liants tels que des dérivés de cellulose, des diluants, des agents désintégrants, des agents améliorant l'absorption ou des édulcorants. Les compositions peuvent être préparées en mélangeant les composés répondant à la formule (1) et/ ou à la formule (2) avec au moins un des supports au moyen de procédés clas- Biques connus dans le domaine des techniques pharmaceutiques, qui peuvent être formulés sous la forme, mais sans s'y limiter, de poudre, de comprimés, de capsules, de pastilles, de granules ou de toute autre formulation liquide. La présente invention est expliquée de manière plus dé- taillée dans l'illustration des modes de réalisation et les exemples suivants. Les exemples ci-dessous ne devraient, cependant, pas être considérés comme une limitation de la portée de l'invention, il est aisé-ment possible que les hommes du métier puissent envisager des modifications, lesquelles resteront dans l'esprit de l'invention et la portée des revendications jointes. Dessins Dans les dessins annexés : - la figure 1 montre la masse corporelle des rats de chaque groupe. * : témoin sain (groupe A) ; 0 : témoin modèle (groupe B, animaux rece- vant 20 % de CC14) ; ^ : témoin positif (groupe C, animaux recevant 20 % de CC14 et de la silymarine) ; ^ : animaux recevant 20 % de CC14 et 300 mg/kg de cyclohexénone (groupe D) ; • : animaux recevant 20 % de CC14 et 1000 mg/kg de cyclohexénone (groupe E), et • : animaux recevant 20 % de CC14 et 3000 mg/kg de cyclohexénone (groupe F), - la figure 2 montre les quantités de prise de nourriture des rats de chaque groupe. * : témoin sain (groupe A) ; 0 : témoin modèle (groupe B, animaux recevant 20 % de CC14) ; ^ : témoin positif (groupe C, animaux recevant 20 % de CC14 et de la silymarine) ; ^ animaux recevant 20 % de CC14 et 300 mg/kg de cyclohexénone (groupe D) ; À : animaux recevant 20 % de CC14 et 1000 mg/kg de cyclohexénone (groupe E), et • : animaux recevant 20 % de CC14 et 3000 mg/kg de cyclohexénone (groupe F), - la figure 3 montre les changements pathologiques de la surface du foie observée à l'oeil nu des rats de chaque groupe. (A) témoin sain (groupe A, seulement de l'huile de maïs) ; (B) témoin modèle (groupe B, animaux recevant 20 % de CC14) ; (C) témoin positif (groupe C, animaux recevant 20 % de CC14 et 200 mg/kg de silymarine) ; (D) animaux recevant 20 % de CC14 et 300 mg/kg de cyclo- hexénone (groupe D) ; (E) animaux recevant 20 % de CC14 et 1000 mg/kg de cyclohexénone (groupe E), et (F) animaux recevant 20 % de CC14 et 3000 mg/kg de cyclohexénone (groupe F), -la figure 4 montre les changements pathologiques d'une lésion du foie induite par CC14 chez les rats de l'invention. (A) Coloration avec H&E, agrandi 200 fois ; (B) Coloration avec H&E, agrandi 400 fois ; (C) Coloration avec une solution TM de fibres de collagène, agrandi 100 pois, montrant des vacuoles, une fibrose avec des nodules et la formation d'une cirrhose, et - la figure 5 montre les changements pathologiques de la fibrose du 35 foie chez les rats avant ou après l'induction par CC14 avec une colo- 6 ration MT sur des fibres de collagène. (A) tissu de foie sain ; (B) divers degrés de fibrose de foie et prolifération du collagène après le traitement avec CC14 ; (C) septum incomplet entre la veine centrale et la région périportale après le traitement avec CC14 ; (D) fibrose du septum intacte et pontage, beaucoup de nodules dans le foie, les septum est mince ; (E) septum épais complet, cirrhose définie après le traitement avec CC14 ; (F) fibrose du foie et collagène vert après le traitement avec CC14. De (A) à (E) : agrandissement 40 fois ; (F) agrandissement 100 fois. Description détaillée du mode de réalisation préféré Les mycéliums, les corps de fructification ou le mélange des deux de l'Antrodia camphorata sont en premier lieu extraits avec de l'eau ou des solvants organiques de façon à obtenir l'extrait aqueux ou l'extrait dans un solvant organique d'Antrodia camphorata en utilisant les procédés bien connus dans l'art. Les solvants organiques comprennent, mais sans s'y limiter, des alcools tels que le méthanol ; l'éthanol ou le propanol ; des esters tels que l'acétate d'éthyle ; des alcanes tels que l'hexane ; ou des alcanes halogénés tels que le chlorométhane et le chloroéthane. Parmi ceux-ci, on préfère un alcool et l'éthanol est parti- culièrement préféré. Les extraits aqueux ou dans un solvant organique de l'Antrodia camphorata ont été soumis à une chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour l'isolement et la purification. Chaque fraction a été récupérée et appliquée à un dosage de protection du foie. Les fractions efficaces avec une capacité de protection du foie ont été analysées pour déterminer la composition et en outre testées avec des tests biochimiques relatifs pour soulager une lésion du foie. L'approche ci-dessus mène ensuite à l'identification des composés répondant à la formule (1) et à la formule (2) dans la protection du foie en soulageant la lésion du foie. Le composé 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6,10-triényl) -cyclohex-2-énone répondant à la for-mule (2) est expliqué ci-dessous à titre d'exemple pour la présente invention. La capacité de protection du foie de la 4-hydroxy-2,3- diméthoxy- 6 -méthyl- 5 (3 ,7, 1 1 -triméthyl-dodéca-2 , 6, 1 0-triényl) -cyclohex- 2-énone a été évaluée en estimant l'ampleur de la lésion du foie dans la fibrose du foie avec l'analyse des marqueurs de la lésion du foie tels qu'ALT, AST, la glutathione (GSH), la glutathione peroxydase (GSHPx), la catalase (CAT), la superoxyde dismutase (SOD) après l'alimentation de divers dosages de cyclohexénone de l'Antrodia camphorata sur une maladie chronique du foie des rats induite par le tétrachlorure de carbone. Ces esssais ont démontré que la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6,10-triényl) -cyclohex- 2-énone de l'Antrodia camphorata peut être utilisée pour soulager une lésion et une fibrose du foie provoquées par des produits chimiques. Les niveaux des marqueurs inflammatoires ALT et AST ont été diminués, les niveaux de GSHPx et de CAT dans le foie ont été augmentés de façon à diminuer les lésions de cellules de foie et diminuer la pression oxydante induite par des radicaux libres, de façon à augmenter en outre la capa-cité antioxydante du foie. Les détails des exemples sont décrits ci-dessous : Exemple 1 Isolement de la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl-5(3,7,11-triméthyl-dodéca-2,6,10-triényl) -cyclohex-2-énone Cent grammes de mycéliums, de corps de fructification ou du mélange des deux de l'Antrodia camphorata ont été placés dans un ballon. Une quantité appropriée d'eau et d'alcool (solution d'alcool de 70 à 100 %) a été ajoutée dans le ballon et a été agitée à une tempéra- ture de 20 à 25 C pendant au moins 1 heure. La solution a été filtrée à travers un filtre et une membrane de 0,45 }1m et le filtrat a été recueilli sous la forme d'un extrait. Le filtrat de l'Antrodia camphorata a été soumis à une chromatographie liquide haute performance (HPLC). La séparation a été effectuée sur une colonne RP 18, la phase mobile était composée de méthanol (A) et de 0,1 à 0,5 % d'acide acétique (B), dans les conditions de gradient de 0 à 10 min dans 95 % à 20 % de B, de 10 à 20 min dans 20 % à 10 % de B, de 20 à 35 min dans 10 % à 10 % de B, de 35 à 40 min dans 10 % à 95 % de B, à un débit de 1 ml/min. L'effluent de la colonne a été surveillé avec un détecteur UV-visible. Les fractions recueillies au cours de la période de 25 à 30 min ont été recueillies et concentrées pour donner la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl- 5 (3,7, 1 1-triméthyl-dodéca-2,6, 10-triényl)-cyclohex-2-énone, un produit sous la forme d'une poudre jaune pâle. L'analyse de la 4-hydroxy-2 ,3-diméthoxy-6-méthyl- 5(3,7, 1 1-triméthyl-dodéca-2 ,6,10-triényl) -cyclohex-2-énone répondait à la formule moléculaire C24H3804, présentait une masse moléculaire de 390, une température de fusion de 48 C à 52 C. L'analyse des spectres RMN est la suivante : RMN 1H (CDC13) 6 (ppm) = 1,51, 1,67, 1,71, 1,75, 1,94, io 2,03, 2,07, 2,22, 2,25, 3,68, 4,05, 5,07 et 5,14 ; RMN 13C (CDC13) 6 (ppm) = 12,31, 16,1, 16,12, 17,67, 25,67, 26,44, 26,74, 27,00, 39,71, 39,81, 40,27, 43,34, 59,22, 60,59, 120,97, 123,84, 124,30, 131,32, 135,35, 135,92, 138,05, 160,45 et 197,12. 15 Exemple 2 Tests de protection du foie avec la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata Les causes principales de l'affection hépatique comprennent un virus, un alcool et des produits chimiques. Une lésion du foie 20 induite par un produit chimique chez les rats présente des caractéristiques conformes à une section pathologique d'une lésion de foie humain. L'évaluation de la protection du foie dans cette étude est concentrée sur la lésion du foie induite par un produit chimique. Les effets de la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata sur une maladie chronique du foie 25 de rats ont été évalués par des analyses biochimiques de la lésion du foie et la section de tissu du foie sur la base du modèle de maladie chronique du foie des rats induites par le tétrachlorure de carbone. Le tétrachlorure de carbone (CC14) entraîne une nécrose hepatocellulaire, pouvant entraîner une fibrose et une cirrhose si elle n'a pas été retirée. 30 La toxicité du tétrachlorure de carbone est activée dans le foie par le système de cytochrome P-450. Le métabolite initial est le radical trichlorométhyle (•CC13), qui se lie à la protéine pour inhiber la synthèse de la protéine, induit un métabolisme de lipide non équilibré donnant une accumulation de triglycéride. Le produit peroxyle de •CC13 induit une 35 peroxydation de lipide et des lésions de la membrane des cellules dans le foie, ce qui entraîne la sécrétion d'enzymes du foie et la nécrose des cellules. Tel que cité ci-dessus, le modèle animal de la lésion du foie in-duite par le tétrachlorure de carbone a une certaine similitude avec la cirrhose du foie humain. Par conséquent, le modèle peut être appliqué dans l'évaluation des effets thérapeutiques de médicaments ou de compositions alimentaires. Les détails des procédures sont décrits ci-dessous. (1) Etablissement d'un modèle animal de lésion du foie induite par CC14 Le modèle animal a été réalisé avec des rats de Sprague- Dawley (SD) âgés de 5 semaines achetés auprès de BioLasco Taiwan Co., Ltd. Des rats sains pesant de 220 à 270 g ont été choisis pour l'expérience après une observation pendant 2 semaines dans une salle de laboratoire pour animaux. Les rats ont été aléatoirement divisés en 6 groupes (12 rats/groupe) : sain (groupe A) ; des groupes témoins comprenant un témoin modèle (groupe B) et un témoin positif (groupe C, animaux recevant de la silymarine) ; des groupes de traite-ment comprenant des animaux recevant 300 mg/kg de cyclohexénone (groupe D), 1000 mg/kg de cyclohexénone (groupe E) et 3000 mg/kg de cyclohexénone (groupe F), comme indiqué dans le tableau 1. Seul le groupe sain n'a pas été empoisonné avec CC14. Les masses corporelles ont été enregistrées de façon à calculer le dosage. On a démontré que la silymarine, le flavonoïde extrait du chardon argenté, aidait à la diminution de l'inflammation du foie et favorise la guérison. Elle aide à éliminer les toxines des cellules du foie en neutralisant la toxicité des composés toxiques ou en entrant en concurrence avec les sites de liaison dans le foie. Il s'agit d'un antioxydant puissant, qui protège le foie contre les radicaux libres. Il a été largement étudié pour le traitement de divers types de lésions du foie chez les animaux et en essais cliniques. Les effets bénéfiques sur la protection du foie ont fait de la silymarine un bon médicament pour les affections hépatiques et un médicament dans le groupe de témoin positif pour le modèle animal d'une lésion du foie. Tableau 1 : Groupes expérimentaux présentant les substances alimentées et les dosages Groupe 20 % en volume Cyclohexénone Silyma de CC14 rine A (sain) 0 0 0 Groupes té- B (témoin mo 2 ml/kg de MC 0 0 moins dèle) C (témoin positif) 2 ml/kg de MC 0 200 mg/k g Groupe de trai D 2 ml/kg de MC 300 mg/kg 0 terrent E 2 ml/kg de MC 1000 mg/kg 0 F 2 ml/kg de MC 3000 mg/kg 0 Les rats dans le groupe sain (groupe A) ont été alimentés avec de l'huile de maïs (Sigma chemical co.) à l'aide de sondes gastri- ques. Le tétrachlorure de carbone (Shimakyu, Osaka, Japon) a été administré aux groupes B à F par l'intermédiaire de sondes gastriques deux fois par semaine (tous les mardis et jeudis après-midi) pendant 8 semaines, à une dose de 2 ml/kg de masse corporelle, dilué avec de l'huile de maïs. La silymarine a été préparé avec une solution saline en une quantité de 200 mg/kg de masse corporelle et a été donné aux rats du groupe C par l'intermédiaire d'une sonde gastrique. La cyclohexénone préparée à partir de l'exemple 1 a été mélangée à la solution saline, et alimentée en des quantités de 300 mg/kg, de 1000 mg/kg et de 3000 mg/kg de masse corporelle aux rats des groupes D à F par l'intermédiaire de sondes gastriques. Le volume total d'alimentation a été estimé à un rapport de 10 ml/kg de masse corporelle pour les groupes C à F cinq jours par semaine (chaque matin) pendant 8 semaines. Les masses corporelles des rats et les quantités de prise alimentaires des rats pour chaque groupe sont représentées sur la figure 1 et la fi- gure 2, respectivement. La figure 1 montre les changements de masse corporelle des rats pendant 8 semaines d'expérience dans les groupes témoins et les groupes de traitement. La masse des rats a diminué dans tous les groupes traités avec CC14 à l'exception des rats dans le groupe sain après une semaine d'expérience bien que les masses initiales ne soient pas sensiblement différentes entre les groupes. Les masses corporelles des rats dans le groupe de modèle (groupe B, 366,9 g) étaient remarquablement inférieures à celles dans le groupe sain (groupe A, 448,7 g), à la 5ème semaine de l'expérience. Le traitement avec CC14 a entraîné des changements pathologiques chez les rats, qui ont provoqué la diminution de masse corporelle. En outre, les rats alimentés avec de la silymarine (témoin positif, groupe C) ont montré une plus petite diminution en masse aussi petite que 375,8 g que les rats dans le groupe de témoin modèle (groupe B). Les masses corporelles n'ont pas chuté brusquement lorsque de la silymarine a été administrée. Tandis que les rats alimentés avec de la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata en une quantité de 300 mg/kg, de 1000 mg/kg et de 3000 mg/kg présentaient des masses de 386,6 g, de 365,1 g et de 355,0 g, respectivement. Ceci a démontré que l'alimentation en cyclohexénone de l'Antrodia camphorata pouvait soulager de manière efficace la situation de diminution de la masse en recevant la cyclohexénone en une quantité aussi basse que 300 mg/kg de masse corporelle. La figure 2 illustre les quantités de prise alimentaire pen- dant 8 semaines d'expérience dans les groupes témoins et les groupes de traitement. La prise alimentaire a augmenté de la première à la 5ème semaine d'expérience, tandis que la prise a chuté et montrait des tendances à décroître dans chaque groupe après la 5ème semaine. Le traitement avec CC14 peut affecter la prise alimentaire. (2) Effets de CC14 sur les masses du foie, du rein et de la rate. Tous les rats ont été sacrifiés à la fin de la Sème semaine d'expérience. Les masses du foie, du rein et de la rate ont été récupérées et pesées et ont été comparées aux masses corporelles de façon à calculer les rapports et à observer les effets de la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata sur le traitement avec CC14. Toutes les valeurs sont exprimées sous la forme d'une moyenne un écart type, qui ont été évaluées en utilisant une analyse de la variance unidirectionnelle. Ceux avec des différences significatives ont en outre été testés avec le test de plus petite différence significative ou le test de Student (t-test) de façon à comparer les groupes de traitement avec de la cyclohexénone et les groupes sains, les groupes de témoin positif et modèle. P 13 Tableau 2 : Effet de la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata sur les masses des organes chez les rats après une lésion du foie induite par CC14 Groupe Rate (%) Rein (%) Foie (%) A (sain) 0,16 0,03 0,62 0,06 2,68 0,33 B (témoin modèle, 20 % de 0,25 0,08* 0,76 0,11* 3,30 0,54* CC14) C (témoin positif, silyma 0,22 0,05* 0,71 0,08* 3,43 0,63* rine) Groupes de traitement Cyclohexénone de l'Antrodia camphorata (mg/kg) D. 300 mg/kg 0,20 0,05* 0,68 0,06* 3,29 0,35 E. 1000 mg/kg 0,22 0,06* 0,69 0,13 3,20 0,47* F. 3000 mg/kg 0,30 0,10* 0,73 0,08* 3,65 0,53* 1) toutes les valeurs sont exprimées sous la forme d'une moyenne un écart type en utilisant le logiciel MS-Excels P Chaque rapport de la masse du foie, de la rate et du rein sur la masse corporelle (%) du groupe modèle est sensiblement plus élevé que ceux du groupe sain. Il a été démontré que CC14 entraîne des changements pathologiques dans ces organes par une augmentation des masses. Les augmentations, du groupe traité avec de la silymarine sont inférieures à celles du groupe modèle étant donné que la silymarine a des effets de protection du foie. D'autre part, les rats traités avec CC14 alimentés avec une quantité différente de cyclohexénone de l'Antrodia camphorata ont démontré une augmentation du rapport de la masse des organes sur la masse corporelle, mais les augmentations sont inférieures à celles du groupe modèle lorsque la quantité d'alimentation en cyclohexénone était de 300 mg/kg ou de 1000 mg/kg. Ces résultats montrent un effet bénéfique de lacyclohexénone de l'Antrodia camphorata chez les rats traités avec CC14 étant donné que les masses des organes n'ont pas augmenté de manière uniforme. (3) Changements pathologiques des tissus du foie Les changements pathologiques de la surface du foie ont été examinés à l'oeil nu lorsque le foie a été retiré des rats, et on a en-suite effectué des sections de tissu. La moitié de chaque lobe de foie a été stockée à -80 C de façon à effectuer par la suite un dosage de l'enzyme antioxydante. Le reste des tissus du foie a été fixé dans 10 0/0 de formaline pendant une semaine, incorporé dans la paraffine découpée en sections de 2 }im, et coloré avec de l'hématoxyline-éosine (H&E) de façon à visualiser un dépôt de lipide, une inflammation, une nécrose des cellules et une fibrose, ou coloré avec une solution trichromique de Masson (TM) de façon à visualiser une matrice extracellulaire et des fibres de collagène pour le développement d'une fibrose du foie. Les changements pathologiques d'une lésion du foie ont été évalués sous un microscope optique (Opticphot-2, Nikon, à Tokyo au Japon) après une coloration avec la solution mentionnée ci-dessus. L'évaluation de la pathologie d'une maladie chronique du foie, de l'ampleur de l'inflammation, de la dégénération vasculaire, de la nécrose des cellules du foie et de la prolifération de la voie biliaire principale ont été évaluées de manière semi-quantitative sur une échelle de 0 à 4 (niveau 0 = -, aucun ; niveau 1 = +, léger ; niveau 2 = ++, moyen ; niveau 3 = +++, modéré et niveau 4 = ++++, remarquable, selon Jonker et al. (Jonker, A. M., Dijkhuis, F. W., Boes, A., Hardonk, M. J. and Grond J. 1992. Immunohistochemical study of extracellular matrix in acute galactosamine hepatitis in rats. Hepatology. 15(3):423-31). La fibrose du foie a été évaluée de manière semi- quantitative selon les procédés d'évaluation de Gabriele et al. (Gabriele, B. 1997. Silymarin retards collagen accumulation in early and advanced biliary fibrosis secondary to complete bile duct obliteration in rats. Hepatology 26:643-649) et de Wang et al. (Wang, G. S., Eriksson, L. C., Xia, L., Olsson, J. and Stal, P. 1999. Dietary iron overload inhibits car- bon tetrachloride-induced promotion in chemical hepatocarcinogenesis: effects on cell proliferation, apoptosis, and antioxidation. J. Hepatol. 30(4):689-98.). La fibrose a été évaluée sur une échelle de 0 à 4 : niveau 0, aucune fibrose, tissu du foie sain ; niveau 1, prolifération du colla-gène, fibrose portale sans septum (prolifération de radiation de fibre dans la veine centrale ou la région périportale) ; niveau 2, septum in-complet entre la veine centrale et la région périportale (septum sans pontage) ; niveau 3, fibrose septale intacte et pontage, beaucoup de nodules dans le foie, le septum est mince ; et niveau 4, septum épais et complet, cirrhose définie. Les résultats sont illustrés sur les figures 3 à 5, et le tableau 3. La figure 3 illustre les changements pathologiques de la surface du foie observés à l'oeil nu de chaque groupe. Dans le groupe sain, la surface du foie était lisse (Figure 3A) ; tandis que dans le groupe modèle traité avec CC14, le foie était de couleur jaune, avec une surface rugueuse, inégale et dure et présentant des gonflements (figure 3B). Après, les rats recevant de la silymarine ou diverses quantités de cyclohexénone de l'Antrodia camphorata, l'ampleur des changements pathologiques du foie était sensiblement plus faible que celle du groupe modèle (figures 3C à 3F), montrant cependant un gonflement et des conditions pathologiques. Parmi ceux-ci, les rats alimentés avec de la cyclohexénone en une quantité de 3000 mg/kg de masse corporelle ont démontré les plus légers gonflements et les plus légères conditions pathologiques (figure 3F). Ceci illustre le fait que la cyclohexénone de l'Antrodia camphorata peut améliorer de manière efficace les symptômes de lésion en surface induits par CC14 sur les surfaces du foie. Tableau 3 : Evaluation histologique de lésion du foie induite par CC14 chez les rats des différents groupes Groupe Lésion du foie Evalua- Fibrose du foie Évalua tion tion + ++ +++ +++ - + ++ +++ ++++ + A (sain) 125) - - - - 0,0 12 - - - - 0,0 B (témoin - - 2 3 4 3,2* -- 2 3 4 3,2* modèle, 20 % de CC14) C (témoin - 2 1 4 3 2,8* - 2 1 5 3 2,8* positif, sily- marine) Groupes de traitement Cyclohexénone de l'Antrodia camphorata (mg/kg) D. 5 6 - 1 1,8*a - 6 4 1 1 1,8*a 300 mg/kg E. 3 6 1 1 2,0*a 2 1 4 3 1 2,0*a 1000 mg/kg* F. 2 6 1 2 2,3*a - 2 4 3 2 2,5* 3000 mg/kg 1) Evaluation de la pathologie d'une maladie chronique du foie, de l'ampleur de l'inflammation, de la dégénération vacuolaire, de la nécrose des cellules du foie et de la prolifération de la voie biliaire principale a été évaluée de manière semiquantitative selon Jonker et al. 1992 sur une échelle de 0 à 4 (niveau 0 = -, aucun ; niveau 1 = +, léger ; niveau 2 = ++, moyen ; niveau 3 = +++, modéré et ni-veau 4 = ++++, remarquable). 2) Evaluation d'une maladie chronique du foie chez les rats = nombre de rats patho-25 logiques sur le nombre total de rats. 3) La fibrose a été évaluée selon Gabriele et al. (1997) et Wangs et al. (1999) sur une échelle de 0 à 4 : niveau 0, aucune fibrose, tissu du foie sain ; niveau 1, prolifération du collagène, fibrose portale sans septum (prolifération de radiation de fibre dans la veine centrale ou la région périportale) ; niveau 2, septum incomplet entre la veine centrale et la région périportale (septum sans pontage) ; niveau 3, fibrose septale intacte et pontage, beaucoup de nodules dans le foie, le septum est mince ; et niveau 4, septum épais et complet, cirrhose définie. 4) Evaluation de la fibrose du foie chez les rats = nombre de rats pathologiques sur le nombre total de rats. 5) nombre de rats pathologiques. * : P REVENDICATIONS 1 ) Composé cyclohexénone d'Antrodia camphorata utilisé pour la pro-tection du foie répondant à la formule suivante : R3 CH3 CH3 C H3 R2 dans laquelle X et Y représentent un atome d'oxygène ou de soufre, R1, R2 et R3 représentent chacun un atome d'hydrogène, un groupe méthyle ou (CH2)m-CH3, et m vaut de 1 à 12 ; n vaut de 1 à 12. 2 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la 10 revendication 1, isolé à partir d'extraits dans un solvant organique d'Antrodia camphorata. 3 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 2, dans lequel les solvants organiques sont choisis dans 15 le groupe constitué par des alcools, des esters, des alcanes et des alcanes halogénés. 4 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 3, dans lequel l'alcool est l'éthanol. 5 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 1, isolé à partir d'extraits aqueux d'Antrodia camphorata. 6 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la 25 revendication 1, lequel composé étant la 4-hydroxy-2,3-diméthoxy-6-méthyl- 5 (3 , 7, 1 1 -triméthyl-dodéca-2 -6- 1 0-triényl) -cyclohex-2 -énone. 7 ) Composé cyclohexénone d'Antrodia camphorata utilisé pour la protection du foie selon la revendication 1, pouvant prévenir et soulager 30 une lésion et une fibrose du foie chez les mammifères. 20 208 ) Composé cyclohexénone d'Antrodia camphorata utilisé pour la protection du foie selon la revendication 6, pouvant prévenir et soulager une lésion et une fibrose du foie chez les mammifères. 9 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 7, pouvant prévenir et soulager une lésion du foie provoquée par des composés chimiques. 10 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la 10 revendication 8, pouvant prévenir et soulager une lésion du foie provoquée par des composés chimiques. 11 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 9, pouvant prévenir et soulager une lésion du foie provo-15 quée par le tétrachlorure de carbone (CC14). 12 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 10, pouvant prévenir et soulager une liaison du foie provoquée par le tétrachlorure de carbone (CC14). 13 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 7, pouvant protéger le foie par une inhibition des niveaux d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST). 25 14 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la revendication 8, pouvant protéger le foie par l'inhibition des niveaux d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST). 15 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la 30 revendication 7, pouvant soulager une lésion du foie induite par des radicaux libres à travers l'augmentation des niveaux de glutathione peroxydase (GSHPx) et de catalase (CAT). 16 ) Composé cyclohexénone utilisé pour la protection du foie selon la 35 revendication 8, pouvant soulager une lésion du foie induite par des rar'dicaux libres à travers l'augmentation des niveaux de glutathione peroxydase (GSHPx) et de catalase (CAT). 17 ) Composition pharmaceutique utilisée pour la protection du foie, 5 comprenant au moins une substance active du composé selon la revendication 1 et un support pharmaceutiquement acceptable. 18 ) Composition pharmaceutique utilisée pour la protection du foie, comprenant au moins une substance active du composé selon la revendication 6 et un support pharmaceutiquement acceptable. 15