Brevet FR2911683A1 — publié le 20080725

Procédé de normalisation d'un ensemble de mesures. La présente invention concerne le domaine de la normalisation d'un ensemble de mesures. Elle est mise en oeuvre avantageusement dans le domaine de l'imagerie, en particulier en biologie. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de normalisation d'un ensemble de mesures, comprenant les étapes consistant à : a) réaliser un premier ensemble de mesures pour un premier échantillon donné par des premiers moyens de mesures comprenant au moins un premier photomultiplicateur, et b) fournir un référent au premier ensemble de mesures, ledit référent comprenant un ensemble de valeurs correspondant à un deuxième ensemble de mesures réalisées pour un deuxième échantillon donné par des deuxièmes moyens de mesures comprenant au moins un deuxième photomultiplicateur. Le problème que vise à résoudre l'invention est lié à l'utilisation de photomultiplicateurs. Ce problème est illustré en particulier dans le domaine de la cytométrie en flux qui, pour des raisons de clarté, sera la seule technique décrite ici. Les cytomètres en flux sont des appareils d'analyse ou de tri des cellules biologiques comprenant au moins un photomultiplicateur. Leur principe de fonctionnement repose sur le passage à vitesse constante d'une cellule en suspension dans une veine liquide (flux) devant une source laser fixe. La lumière diffractée par la cellule durant son bref passage devant le laser dépend en particulier de ses caractéristiques physiques telles que sa taille, sa granulosité, etc. Si la cellule a préalablement été marquée par un ou plusieurs fluorochromes associés à différents paramètres biologiques, la lumière émise par chacune des molécules fluorescentes participe également à sa caractérisation. Le recueil de la lumière à différentes longueurs d'onde à l'aide de filtres (en particulier passe-bande), et la mesure de l'intensité lumineuse émise, à l'aide de photomultiplicateurs associés à des moyens électroniques et informatiques appropriés, permettent une analyse dite multicouleur des cellules (couramment 4 à 6 couleurs actuellement). La cytométrie en flux est une technologie performante, rapide, très sensible, quantitative, facile à mettre en œuvre, et permet la caractérisation et/ou le tri rapide de sous-populations cellulaires pures et spécifiques (jusqu'à 30 000 évènements par seconde). Elle s'applique à tous les domaines de la biologie (biologie végétale, microbiologie, biologie cellulaire, cancérologie...), et elle est bien développée en milieu hospitalier et souvent nécessaire à la prise en charge de patients atteints par exemple de cancers, notamment de cancers hématologiques, et de maladies à conséquences immunologiques (infection par le VIH, allergie...). Un cytomètre en flux analyse aisément 1000 à 2000 cellules par seconde, soit en 3 minutes (temps moyen d'une acquisition) près de 2.105 évènements (objet d'analyse, cellule ou autre objet marqué par un ou plusieurs fluorochrome) et 1,5.106 mesures (pour une analyse de 6 paramètres simultanément). La rapidité de cette technique par rapport à d'autres techniques biologiques en biologie moléculaire en fait un outil de choix dans l'aide à la décision des stratégies thérapeutiques et dans le suivi des patients. La principale limite actuelle est l'absence de procédure de normalisation, standardisation, des cytomètres entre eux, ce qui attache un résultat d'analyse à sa machine (photomultiplicateur), ce qui pose des problèmes tant dans la caractérisation de populations cellulaires abondantes que pour la quantification d'évènements rares. Ce problème limite principalement les applications de la cytométrie en flux à l'analyse qualitative, puisque l'absence de normalisation des résultats d'analyses (histogrammes) entre machines rend impossible l'implantation directe d'un protocole d'analyse d'une machine à l'autre, liant le résultat pour un patient à une machine particulière, avec ses réglages particuliers. La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients en proposant un procédé qui, par ailleurs conforme au préambule cité ci-avant, est essentiellement caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes consistant à : c) calculer les paramètres d'une loi d'écart entre l'ensemble de mesures et l'ensemble des valeurs du référent à partir de sous-ensembles du premier ensemble de mesures et de sous-ensembles correspondants du référent, et d) recalculer les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction des paramètres de la loi 30 l'écart. 15 20 25 De préférence, le calcul des paramètres de la loi d'écart comprend au moins l'une des étapes préliminaires consistant à : -effectuer une correction de position, et - effectuer une correction de pente, entre un premier graphique correspondant à une partie du premier ensemble de mesures et un premier graphique correspondant à une partie correspondante du référent, la loi d'écart permettant de compenser une compression/dilation entre lesdits graphiques. Avantageusement, l'étape de correction de position comprend les étapes consistant à : - sélectionner au moins un premier point caractéristique relatif au premier graphique, et au moins un deuxième point caractéristique correspondant relatif au graphique du référent, - calculer le décalage entre les coordonnées des points caractéristiques, et - mettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction du décalage calculé. Dans un mode de réalisation, l'étape de correction de pente comprend les étapes consistant à : - calculer les différences entre les pentes de deux droites formées respectivement par deux points caractéristiques relatifs au premier graphique et leurs points correspondants respectifs relatifs au 30 graphique du référent, et - mettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction des différences de pentes calculées. Dans un mode de réalisation, l'étape de compensation d'une compression/dilation comprend les étapes consistant à : - calculer le coefficient de compression/dilation entre une pluralité de points caractéristiques relatifs au premier ensemble de mesures et leurs points correspondants respectifs relatifs au référent, et - mettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction du coefficient calculé. Dans un mode de réalisation, un point caractéristique et son correspondant sont les barycentres respectifs du premier graphique et du graphique référent. Selon l'invention, la loi d'écart est du type Log(Itest) = yLog(Iref)'6 dans laquelle : ô et y sont des constantes déterminées à l'étape c, Itest est la mesure de l'intensité du signal électrique en sortie du premier photomultiplicateur utilisé pour l'étape a, et Iref est la mesure de l'intensité du signal électrique en sortie du deuxième photomultiplicateur 25 utilisé pour l'étape b. Avantageusement, le premier et le deuxième échantillon sont les mêmes. De préférence, au moins le premier ensemble de mesures est réalisé sur une première machine de 30 cytométrie en flux. L'invention selon un autre de ses objets concerne un programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution des étapes du procédé selon l'invention lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur. Grâce à l'invention, le suivi des mesures d'un même échantillon dans le temps, la comparaison des échantillons mesurés entre eux, la comparaison des mesures obtenues pour une machine ou un centre d'analyses, à celles obtenues sur d'autres échantillons par d'autres centres d'analyses ou sur d'autres machines, ou avec celles publiées dans la littérature, devient possible. Grâce à l'invention, le décompte d'évènements anormaux (rares) est réalisé en conditionnant successivement les histogrammes d'intérêt sur des fenêtres définies graphiquement et cernant les évènements cibles. Ce décompte est particulièrement important pour le suivi d'une masse tumorale et l'adaptation de prescriptions thérapeutiques au patient considéré. Grâce à l'invention, on peut obtenir une correction a posteriori d'histogrammes obtenus par un cytomètre en flux quelconque, par rapport à un histogramme de référence, référence définie de façon arbitraire. Ainsi des histogrammes multiparamétriques résultant de la lecture de données test corrigés et de données source de référence sont superposables lorsque les données sources obtenues pour la machine test et la machine source proviennent du même échantillon. Les applications de l'invention concernent notamment la cytométrie en flux, et plus généralement toutes les données et histogrammes obtenus par représentation multiparamétrique de mesures simultanées d'intensités de signaux électriques amplifiés. C'est à dire que l'invention porte sur tous les domaines de la biologie et de l'imagerie utilisant des appareils de mesures simultanées de signaux électriques amplifiés, obtenus soit directement, soit par la conversion en signal électrique d'un signal physique détectable et mesurable (photon, électron, positon...). Ces applications portent notamment sur la comparaison des mesures entre différents échantillons que sur la comparaison de mesures successives dans le temps d'un même échantillon, en particulier sur différentes machines d'analyse. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante donnée à titre d'exemple illustratif et non limitatif et faite en référence aux figures annexées dans lesquelles : • la figure lA représente un premier ensemble de mesures pour un échantillon donné sur des premiers moyens de mesures comprenant au moins un premier photomultiplicateur, • la figure 1B un deuxième ensemble de mesures pour le même échantillon donné que pour la figure lA sur des deuxièmes moyens de mesures comprenant au moins un deuxième photomultiplicateur, • la figure 2A représente la sélection arbitraire de points caractéristiques sur la figure 1A, et • la figure 2B représente la sélection arbitraire de points caractéristiques sur la figure 1B. De manière classique, la technologie des cytomètres en flux, appareils dédiés à des mesures de fluorescence, repose sur la conversion et l'amplification d'un signal lumineux en signal électrique, à l'aide de photomultiplicateurs. Les signaux électriques amplifiés sont digitalisés et échantillonnés sur des canaux dont chaque représente un intervalle de tension électrique appliqué au photomultiplicateur. Selon le mode de représentation choisi, linéaire ou logarithmique, chaque canal comprend donc soit une valeur correspondant à la valeur d'une mesure de l'intensité à la sortie du photomultiplicateur, en réponse aux signaux lumineux émis par le(s) marqueur(s) lumineux passant devant la source laser, soit le logarithme de cette valeur. Les mesures physiques simultanées de chaque évènement, autrement dit les numéros de canaux, sont archivées sous forme électronique dans un fichier de données. On entend par événement un objet particulier à étudier (particule, microbe, bactérie, cellule, bille, etc.). Chaque événement comprend un ou plusieurs marqueurs lumineux (fluorochrome). Chaque marqueur lumineux est configuré pour émettre à une longueur d'onde propre. Pour l'analyse des données, les cellules sont représentées en tant qu'évènements ou points sur des graphiques (histogrammes bi ou tri paramétriques), les coordonnées étant choisies afin que soient visualisées graphiquement l'ensemble des mesures (les numéros de canaux) relatives aux évènements étudiés. Les figures 1A et 1B illustrent deux tels graphiques. Ces deux figures représentent deux histogrammes de mesure d'émission de lumière respectivement à 520 nm et à 575 nm, correspondant à la mesure d'émission de fluorescence de la fluorescéine et de la phycoérythrine d'un même échantillon sur deux machines différentes, après réglage des photomultiplicateurs à l'aide des billes de calibrage de fluorescence. Par exemple, la figure lA illustre un premier ensemble de mesures, et la figure lB le référent correspondant. Selon les méthodes dites de calibrage de l'art antérieur, on suppose qu'il existe une linéarité stricte, une proportionnalité directe, entre l'intensité de la lumière reçue, l'intensité du signal électrique amplifié par le photomultiplicateur, sa digitalisation et son échantillonnage en un canal dont la valeur définit la mesure. On définit classiquement I F.k.Va (1), avec I l'intensité du signal mesuré par le cytomètre, 20 F la lumière émise, V la tension d'amplification appliquée au photomultiplicateur, et k et a des constantes propres au photomultiplicateur. 25 C'est à dire selon (1), que : Log(I) = Log(F) + KO (2), Avec KO une constante pour une tension donnée appliquée au photomultiplicateur. Autrement dit : 30 x = Log(F) + KO (2') avec x le canal comprenant le logarithme de la valeur d'une mesure de l'intensité à la sortie du photomultiplicateur, en réponse aux signaux lumineux émis par le(s) marqueur(s) lumineux passant devant la source laser, tel que définit ci-dessus. De façon surprenante, ce pré-supposé est en réalité inexact et les mesures des signaux électriques amplifiés, autrement dit les numéros de canaux attribués à des signaux électriques, ne sont pas strictement linéaires par rapport au signal physique reçu. Ainsi, les méthodes actuelles de calibrage ne permettent pas de standardiser/normaliser des histogrammes de cytométrie en flux obtenus à partir de différentes machines. Selon l'invention, il apparaît en fait que les mesures des intensités des signaux électriques amplifiés, digitalisés et échantillonnés ne sont pas strictement linéaires par rapport au signal physique reçu, chaque cytomètre ayant ses propres constantes d'amplification non linéaires du signal. En conséquence, bien que ressemblants, les histogrammes représentés aux figures 1A et 1B sont différents, et illustrent clairement que, malgré le calibrage des photomultiplicateurs respectifs à l'aide de billes de calibrage de fluorescence identiques, il n'est pas possible d'obtenir des graphiques superposables. L'hypothèse de linéarité entre le signal lumineux émis et la mesure du signal électrique amplifié est donc inexacte. Cette hypothèse de linéarité est une approximation ne rendant pas compte des différences de conception et de vieillissement entre les machines, notamment. Selon l'invention, l'analyse comparative des données de mesures obtenues pour plusieurs cytomètres en flux, à partir d'un même échantillon, conduit à remplacer l'équation (1) précédente par une relation entre le signal lumineux et la mesure du signal électrique amplifié du type : Log(I) = p.Log(F)Aa + K (3), dans laquelle p et a sont des constantes caractéristiques des machines (photomultiplicateurs) et K une constante pour une tension donnée de photomultiplicateur. Autrement dit : x = p.Log(F)Aa + K (3') avec x le canal comprenant le logarithme de la valeur mesurée en sortie de photomultiplicateur. Ainsi, pour deux jeux de données provenant de deux machines différentes, on peut montrer que : Log(Itest) = g.Log(Iref)Ad (4), Où Itest est la mesure de l'intensité du signal électrique amplifié sur une machine test, Iref est la mesure de l'intensité du signal électrique amplifié sur la machine de référence, 20 g et d sont des constantes à déterminer. De même que précédemment on peut définir : xtest = g.xref^d (4') Où xtest est le canal comprenant le logarithme de la mesure de l'intensité du signal électrique amplifié 25 sur une machine test, et xref est le canal comprenant le logarithme de la mesure de l'intensité du signal électrique amplifié sur la machine de référence. Les équations (3) et (4) (ou de façon équivalente 30 les équations (3') et (4')) représentent une loi d'écart selon l'invention, et les constantes respectives les paramètres respectifs des dites lois. A partir de cette loi d'écart, on peut calculer ses paramètres entre l'ensemble de mesures (autrement dit de canaux) et l'ensemble des valeurs du référent à partir de sous-ensembles du premier ensemble de mesures (ou de canaux) et de sous-ensembles correspondants du référent, et on peut recalculer les valeurs du premier ensemble de mesures (ou de canaux) en fonction de ces paramètres de la loi l'écart. A cet effet, il est souhaitable dans une première étape de définir arbitrairement, par un opérateur par exemple, au moins trois sous-ensembles Ti, T2 et T3 (figure 2A) du premier ensemble de mesures (ou de canaux) et leur correspondants R1, R2 et R3 dans le référent (figure 2B). Dans un mode de réalisation, les sous-ensembles sont tels que le squelette joignant les trois points barycentre de ces trois régions parcourt au mieux l'histogramme étudié, pour la référence et pour le test. On calcule alors les barycentres GR et GT des graphes de référence et test, chaque barycentre servant de point caractéristique. Dans un autre mode de réalisation, les barycentres GR et GT sont calculés avec l'ensemble des mesures respectivement du référent et du test, ou à partir du calcul de barycentres locaux. Par barycentre local, on entend le calcul du barycentre d'un sous-ensemble Tl, T2, T3 ou un autre sous-ensemble. Dans un autre mode de réalisation, l'un des sous-ensembles Ti, T2 et T3 ou l'un de leurs points peut 30 servir de point caractéristique. Dans cet exemple, on définit les coordonnées des points de la manière suivante : Ri(rxl, ryl), R2(rx2, ry2), R3(rx3, ry3), Ti(txl, tyl), T2(tx2, ty2), T3(tx3, ty3), GR(grx, gry) et GT(gtx, gty). Dans ce cas, rxl, rx2, rx3, txl, tx2, tx3, grx, gtx sont les canaux correspondants au logarithme de la mesure de la fluorescence d'un premier fluorochrome FL1 (axe des x) et ryl, ry2, ry3, tyl, ty2, ty3, gry, gty les canaux correspondants au logarithme de la mesure de la fluorescence d'un deuxième fluorochrome FL2 (axe des y) des points R1, R2, R3, Ti, T2, T3, GR et GT respectivement. Dans une deuxième étape, il est souhaitable de d'effectuer une correction de position entre le premier graphique correspondant à une partie du premier ensemble de mesures (test) et un premier graphique correspondant à une partie correspondante du référent. Cette correction de position correspond à la superposition de deux points caractéristiques arbitraires correspondants entre le graphique de référence et le premier ensemble de mesures. Les valeurs du premier ensemble de mesures sont alors recalculées en fonction de cette correction de position. Soit dans l'exemple donné : T'1(t'xl, t'yl), T'2(t'x2, t'y2), et T'3(t'x3, t' y3) , les coordonnées des points respectifs Ti, T2 et T3 après cette étape de correction de position par superposition des barycentres GR et GT. Cette superposition peut être réalisée de deux façons. Dans un premier mode de réalisation, et de préférence, on pose que grx = Cor_x * gtx, et gry = Cor_y * gty, dans lesquelles Cor_x et Cor y sont des facteurs multiplicatifs de correction de position. d'où Cor x = grx / gtx, et Cor y = gry / gty, et t'xl = Cor x * txl, t'yl = Cor_y * tyl, t'x2 = Cor_x * tx2, t'y2 = Cor_y * ty2, t'x3 = Cor x * tx3, et t'y3 = Cor_y * ty3 A titre d'alternative, dans un deuxième mode de réalisation, on pose que grx = Cor x + gtx, et gry = Cor_y + gty, dans lesquelles Cor_x et Cor_y sont des 15 facteurs additifs de correction de position. d'où Cor x = grx - gtx, et Cor y = gry - gty, et t'xl = Cor x + txl, t'yl = Cor_y + tyl, t'x2 = Cor x + tx2, 20 t'y2 = Cor_y + ty2, t'x3 = Cor x + tx3, et t'y3 = Cor_y + ty3 D'un point de vue graphique, cette étape de correction de position par superposition permet de 25 compenser un éventuel décalage par translation entre le graphique du premier ensemble de mesures (test) et le référent. Dans une troisième étape, il est souhaitable d'effectuer une correction (compensation) de pente (ou 30 d'inclinaison), entre un premier graphique correspondant à une partie du premier ensemble de mesures (test) et un premier graphique correspondant à une partie correspondante du référent. Cette étape dite de correction de pente , consiste à superposer les axes définis par deux points du squelette de l'histogramme du premier ensemble de mesures par rapport à leurs correspondants de l'histogramme de référence. Les valeurs du premier ensemble de mesures sont alors recalculées en fonction de cette compensation de 10 pente. Soit dans l'exemple donné : T"1(t"x1, t"yl), T"2(t"x2, t"y2), T"3(t"x3, t " y3) les coordonnées des points respectifs Tl, T2 et T3 après cette étape de correction de pente telles que, 15 pour i=l à 3 dans le présent exemple : T" (t" xi, t" yi) , avec t" xi = t'xi - CompX * t'yi, et t"yi = t'yi -CompY * t'xi. 20 dans lesquelles CompX et CompY sont des constantes déterminées par différences des pentes selon l'axe des abscisses et l'axe des ordonnées respectivement entre les droites les plus parallèles aux axes possibles. C'est-à-dire, en référence aux figures 2A et 2B, 25 CompX est déterminée par la différence de pente entre la droite définie par les points R2 et R3 d'une part, et la droite définie par les points T2 et T3 d'autre part. De même, CompY est déterminée par la différence de pente entre la droite définie par les points R1 et R2 30 d'une part, et la droite définie par les points Tl et T2 d'autre part. En effet, en cytométrie en flux le spectre d'émission des fluorochromes s'étale toujours sur un large spectre. Ainsi, dans un mode de réalisation où l'on utilise deux fluorochromes FL1 et FL2 à spectre d'émission relativement proches (pic d'émission à 520nm et à 575nm respectivement par exemple), la lumière reçue par les photomultiplicateurs d'une même machine provient des deux fluorochromes FL1 et FL2 à la fois, cela malgré l'utilisation de filtres passe-bande devant les photomultiplicateurs. On peut définir : FL1 et FL2 deux fluorochromes utilisés pour un test donné, PMT1 et PMT2 deux photomultiplicateurs, sur une même machine, dédiés aux fluorochromes FL1 et FL2 grâce des filtres passe-bandes, F1 émis et F2 émis la lumière émise par les fluorochromes FL1 et FL2 excités par le laser de la 20 machine, Ftot lreçue la lumière totale reçue par le PMT1, Fl lreçue et F2 lreçue la lumière reçue par le PMT1 des fluorochromes FL1 et FL2 respectivement, Ftot 2reçue la lumière totale reçue par le PMT2, 25 F1 2reçue et F2 2reçue la lumière reçue par le PMT2 des fluorochromes FL1 et FL2 respectivement, et all, a21, a12, a22 des constantes comprises entre 0 et 1. On a alors . 30 Ftot lreçue = F1 lreçue + F2 lreçue, Ftot 2reçue = F1 2reçue + F2 2reçue. 25 30 Ainsi, en exprimant Fl lreçue et Fl 2reçue en fonction de Ftot lreçue et Ftot 2reçue : F1 lreçue = ail * Fl émis, F2 lreçue = a21 * F2 émis, Fl 2reçue = al2 * Fl émis, F2 2reçue = a22 * F2 émis. Or, de préférence, les fluorochromes et filtres passe-bandes sont choisis et spécifiques de telle sorte que l'on a : all a2l avec a21 - 0, et a22 a12 avec a12 - O. On a donc : F1 émis = F1 lreçue / ail, F2 émis = F2 2reçue / a22, Ftot lreçue = F1 lreçue + a21 * F2 émis, Ftot 2reçue = al2 * Fl émis + F2 2reçue, Ftot lreçue = Fl lreçue + a21/a22*F2 2reçue, Ftot 2reçue = al2/ali*F1 lreçue + F2 2reçue, Ftot lreçue = F1 lreçue + a21/a22*(Ftot 2reçue - al2/all * Fl lreçue), Ftot 2reçue = al2/ail*(Ftot lreçue - a21/a22 * F2 2 reçue) + F2_2reçue Ftot lreçue = (1 - al2/all) * Fl lreçue + a21/a22 * Ftot 2reçue, Ftot 2reçue = al2/all * Ftot lreçue + (1- a21/a22) * F2 2reçue. De préférence, les filtres passe-bandes sont choisis et sélectifs de sorte que al2/all - 0 et a21/a22 - 0, d'où Fl lreçue Ftot lreçue - a21/a22 * Ftot 2reçue, et F2 2reçue Ftot 2reçue - al2/all * Ftot lreçue Ainsi, a21/a22 et al2/all correspondent aux CompX et CompY respectivement. Le choix des CompX et CompY comme des constantes déterminées par différences des pentes selon l'axe des abscisses et l'axe des ordonnées respectivement entre les droites les plus parallèles aux axes possibles, vient du fait que pour ces points, il est raisonnable d'imaginer que F1 lreçue et F2 2reçue soit proche de 0, et donc que Ftot 1 rze a21/a22 * Ftot 2reçue, Ftot 2 al2/all * Ftot lreçue D'autres méthodes de calcul peuvent être envisagées, par exemple en définissant un point caractéristique tel qu'un centre de rotation (barycentre ou autre) du graphique représentatif du premier ensemble de mesures autour duquel aurait pivoté d'un certain angle le graphique représentatif du référent, l'angle pouvant être déterminé par la méthode des pentes ici exposée. D'un point de vue graphique, cette étape de correction de pente permet de compenser un éventuel décalage angulaire, voire rotationnel, entre le graphique du premier ensemble de mesures (test) et le référent. Enfin, selon l'invention, le procédé comprend une étape permettant de compenser une compression/dilatation entre lesdits graphiques. Cette étape consiste à résoudre la loi d'écart (3), autrement dit à calculer les paramètres (constantes) à partir des points caractéristiques des squelettes de 25 l'histogramme du premier ensemble de mesures test et de l'histogramme de référence. Les valeurs du premier ensemble de mesures sont alors recalculées en fonction de cette compensation de 5 compression/dilatation. Soit dans l'exemple donné : T''' 1 (t" ' xl, t" ' yl) , T" ' 2 (t" ' x2 , t' ' y2) , et T"'3(t"'x3, t"'y3) les coordonnées des points 10 respectifs Ti, T2 et T3 après cette étape de compensation de compression/dilatation. Soit, en généralisant pour i=1 à n (nombre de points du graphe test) : T''' ((t" ' xi, t" ' yi) , avec t"' xi = aX* rxlbX et 15 t"' yi = ay*rylbY On a donc t"xi = aX*rxlbX et t" x3- x3= aX*rx3bX, soit : Log (t" xl) = Log(ax) + bX*Log (rxl) , et 20 Log (t" x3) = Log(ax) + bX*Log(rx3), d'où par soustraction des ces deux équations : bX = (Log(t"x3) -Log(t"xl))/(Log(rx3) Log(rxl)) Comme Log(ax) = Log(t " x3) - bX*Log(rx3), on en déduit la valeur du paramètre ax. Les mêmes calculs sont effectués selon l'axe y des 30 ordonnées pour déterminer les valeurs des paramètres ay et bY. REVENDICATIONS 1. Procédé de normalisation d'un ensemble de mesures, comprenant les étapes consistant à : a. réaliser un premier ensemble de mesures pour un premier échantillon donné par des premiers moyens de mesures comprenant au moins un premier photomultiplicateur, et b. fournir un référent au premier ensemble de mesures, ledit référent comprenant un ensemble de valeurs correspondant à un deuxième ensemble de mesures réalisées pour un deuxième échantillon donné par des deuxièmes moyens de mesures comprenant au moins un deuxième photomultiplicateur, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes consistant à : c. calculer les valeurs de paramètres d'une loi d'écart entre l'ensemble de mesures et l'ensemble des valeurs du référent à partir de sous-ensembles du premier ensemble de mesures et de sous-ensembles correspondants du référent, et d. recalculer les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction des paramètres de la loi l'écart. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le calcul des paramètres de la loi d'écart comprend au moins l'une des étapes préliminaires consistant à effectuer : une correction de position, et une correction de pente, entre un premier graphique correspondant à une partie du premier ensemble de mesures et un premier graphique correspondant à une partie correspondante du référent,la loi d'écart permettant de compenser une compression/dilation entre lesdits graphiques. 3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étape de correction de position comprend les étapes 5 consistant à : sélectionner au moins un premier point caractéristique relatif au premier graphique, et au moins un deuxième point caractéristique correspondant relatif au graphique du référent, 10 calculer le décalage entre les coordonnées des points caractéristiques, et mettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction du décalage calculé. 4. Procédé selon l'une quelconque des 15 revendications 2 ou 3, dans lequel l'étape de correction de pente comprend les étapes consistant à : calculer la différence de pente entre deux droites formées respectivement par deux points caractéristiques relatifs au premier graphique et leurs points 20 correspondants respectifs relatifs au graphique du référent, et mettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction de cette différence de pente. 5. Procédé selon l'une quelconque des 25 revendications 2 à 4, dans lequel l'étape de compensation d'une compression/dilation comprend les étapes consistant à . calculer le coefficient de compression/dilation entre une pluralité de points caractéristiques relatifs 30 au premier ensemble de mesures et leurs points correspondants respectifs relatifs au référent, etmettre à jour les valeurs du premier ensemble de mesures en fonction du coefficient calculé. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel un point caractéristique et son correspondant sont les barycentres respectifs du premier graphique et du graphique référent. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel la loi d'écart est du type Log(Itest) = yLog(Iref)^5 dans laquelle : à et y sont les paramètres déterminés à l'étape c, Itest est la mesure de l'intensité du signal électrique en sortie du premier photomultiplicateur utilisé pour l'étape a, et Iref est la mesure de l'intensité du signal électrique en sortie du deuxième photomultiplicateur utilisé pour l'étape b. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier échantillon et le deuxième échantillon sont les mêmes. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins le premier ensemble de mesures est réalisé sur une première machine de cytométrie en flux. 10. Programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution des étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur.