Brevet FR2916763A1 — publié le 20081205

La présente invention concerne de nouveaux substrats enzymatiques pour la détection d'activité peptidase. Ces substrats sont utilisables dans les applications comportant une étape d'hydrolyse enzymatique produisant un signal physico-chimique notamment en microbiologie, biochimie, immunologie, biologie moléculaire, histologie, etc. L'invention concerne également des milieux réactionnels contenant de tels substrats, l'utilisation des substrats ou des milieux pour la détection d'activités peptidases et/ou la différenciation de bactéries à Gram positif par rapport à des bactéries à Gram négatif et des procédés d'utilisation. l0 Il existe actuellement de très nombreux milieux permettant la détection de microorganismes. Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de substrats particuliers, spécifiques d'une enzyme du microorganisme que l'on souhaite détecter. D'une manière générale, les substrats synthétiques d'enzymes sont constitués d'une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, et d'une seconde 15 partie faisant office de marqueur, généralement chromogène ou fluorescent. Ainsi dans le cas des bactéries, par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Une activité peptidase peut notamment être utilisée pour révéler un groupe, un genre ou une espèce de bactéries. Ainsi, l'activité alanine-aminopeptidase, par exemple, permet de différencier les 20 bactéries à Gram négatif des bactéries à Gram positif. Des substrats chromogènes enzymatiques pour la détection d'activité peptidase sont connus de l'état de la technique. On peut citer notamment la publication de Manafi (Manafi et al, Microbiol Rev 55(3) : 335-348, 1991), qui est une revue de substrats enzymatiques utilisés en microbiologie. Toutefois, les substrats d'aminopeptidase 25 décrits libèrent par hydrolyse des composés diffusant dans le milieu (betanaphtylamine, 7-amino-4-methylcoumarine). De ce fait, en milieu réactionnel hétérogène (colonies sur boites de Petri, coupe histologique...), il n'est pas possible de localiser précisément le lieu de l'hydrolyse. On peut citer également les substrats décrits dans les demandes de brevet WO 98/04735 et WO 99/38995 déposées par la 30 Demanderesse. Toutefois, bien que ces substrats diffusent peu en milieu de culture, ils présentent certains inconvénients : leur synthèse est difficile, la pureté est réduite, les rendements faibles et ils sont toxiques vis-à-vis de certains micro-organismes. 2 La présente invention propose donc de nouveaux substrats de peptidase permettant la détection de microorganismes. Comparativement aux substrats existants, ces nouveaux substrats sont de synthèse aisée, et peuvent être utilisés notamment en milieux gélifiés pour la détection de micro-organismes car ils produisent une coloration ne diffusant pas dans le milieu réactionnel. Cela permet de repérer une colonie ou une organelle exprimant une activité peptidase parmi d'autres ne l'exprimant pas. Avant d'aller plus avant dans la description de l'invention, les définitions ci dessous sont données afin de faciliter l'exposé de l'invention. l0 Par substrat enzymatique, on entend un substrat pouvant être hydrolysé par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme, d'une cellule ou d'une organelle. Ce substrat comprend notamment une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur. 15 Les substrats selon l'invention sont particulièrement bien adaptés à une utilisation en cytométrie en flux, car le produit de l'hydrolyse restant principalement localisé dans la cellule exprimant l'activité enzymatique, il est possible de compter spécifiquement les cellules exprimant cette activité, voire de les séparer du reste de l'échantillon. Les substrats selon l'invention sont également bien adaptés à une utilisation en 20 histoenzymologie, car le produit d'hydrolyse restant principalement localisé sur le lieu de l'hydrolyse, il est possible d'identifier spécifiquement les cellules ou organelles exprimant cette activité au sein d'un tissu. Du fait de leur faible toxicité, les substrats selon l'invention sont bien adaptés au suivi d'activité peptidase de culture cellulaire. 25 Les substrats selon l'invention sont également très bien adaptés à une utilisation en milieu de détection et/ou d'identification car ils produisent une coloration ou une fluorescence ne diffusant pas dans le milieu réactionnel. Dans la présente demande, le terme coloration est employé pour couvrir une coloration, absorption de lumière dans le spectre visible, ou une fluorescence, absorption à une longueur d'onde (a,ex) et émission 30 à une longueur d'onde supérieure (a,em, lem > 2ex). Les substrats de l'invention peuvent être salifiés, c'est à dire sous forme de sel tel que chlorure, bromure ou trifluoroacétate. 3 Par peptidase, on entend une enzyme capable de cliver par hydrolyse le groupement amide formé entre le reste acyle d'un peptide et une amine primaire. Par aminopeptidase, on entend une enzyme capable de cliver par hydrolyse le groupement amide formé entre un acyle d'acide aminé et une amine primaire. Dans la présente demande, le terme peptidase peut désigner, selon les cas, tant une peptidase qu'une aminopeptidase telles que définies précédemment. Par peptide, on entend une chaîne peptidique comprenant de 1 à 10 acides aminés, préférentiellement de 1 à 4 acides aminés. Préférentiellement, le peptide est un di-Alanine ou tri-Alanine. Par acide aminé, on entend tout acide aminé connu de l'homme du métier, naturel ou non. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'acide aminé est une beta Alanine ou L Alanine, ou une Glycine, Pyrroglutamyl, .... Ledit peptide peut comprendre un agent de blocage en son extrémité N terminale. Les agents de blocage selon l'invention comprennent tout agent de blocage connu de l'homme du métier qui est capable de protéger les amines. A titre d'exemple, on peut citer le t-Butoxycarbonyle (N-tBOC), le 9-Fluorenyloxycarbonyle, un agent de solubilisation tel que le Succinyle, ou bien un acide aminé non métabolisable, c'est-à-dire non naturel, tel que l'acide pipécolique ou la forme D d'un acide aminé, tel que la D-Phénylalanine. Les agents de blocage ne sont pas systématiquement présents dans les composés de l'invention. Par groupement alkyle, on entend une chaîne de groupements hydrocarbonés saturés, tel que notamment un alkyle en Ci-C6, c'est a dire un alkyle droit ou ramifié ayant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'iso-propyle, le butyle, le t-butyle, le pentyle, l'iso-pentyle et l'hexyle. Par groupement aryle, on entend un groupement fonctionnel (ou substituant) qui dérive 25 d'un noyau aromatique tel que notamment un noyau aromatique en C6-C10, notamment phényle, benzyle, 1-naphtyle ou 2-naphtyle. Par groupement carboxyle, on entend notamment un groupe fonctionnel composé d'un atome de carbone, lié par une double liaison à un premier atome d'oxygène, et par une liaison simple à un second atome d'oxygène, lui- même chargé négativement ou relié à 30 un atome d'hydrogène. En fonction du pKa de la molécule et du pH du milieu, le groupement carboxyle peut être sous forme ionisée, c'est à dire sans H lié au second atome d'oxygène, qui est alors chargé négativement. 4 Par milieu réactionnel, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression d'un métabolisme et/ou à la croissance de microorganismes, d'une cellule ou d'une organelle. Ce milieu réactionnel peut être utilisé en cytométrie en flux, histoenzymologie, culture cellulaire ... ou en tant que milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes. Le milieu réactionnel peut comprendre un ou plusieurs éléments en combinaison, tels que des acides aminés, des peptones, des hydrates de carbone, des nucléotides, des minéraux, des vitamines, des antibiotiques, des tensioactifs, des tampons, des sels de phosphate, d'ammonium, de sodium, de métaux. l0 Le milieu peut comprendre également un colorant. A titre indicatif, on peut citer comme colorant le bleu d'Evans, du rouge neutre, du sang de mouton, du sang de cheval, un opacifiant tel que l'oxyde de Titane, de la nitroaniline, du vert malachite, du vert brillant... Le milieu réactionnel peut être solide, semi-solide ou liquide. Par milieu solide, on 15 entend par exemple un milieu gélifié. L'agar est l'agent gélifiant traditionnel en microbiologie pour la culture des microorganismes, mais il est possible d'utiliser de la gélatine ou de l'agarose. Un certain nombre de préparation sont disponibles dans le commerce, comme par exemple l'agar Columbia, la gélose Trypcase-soja, la gélose Mac Conkey, la gélose Sabouraud ou plus généralement celles décrites dans le 20 Handbook of Microbiological Media (CRC Press). Le milieu réactionnel peut être un milieu de détection et/ou d'identification, c'est à dire un milieu de révélation ou un milieu de culture et de révélation. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection et/ou d'identification constitue également le milieu de 25 culture. Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment. Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de 30 prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le lait, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales. L'échantillon peut également être un prélèvement de l'environnement clinique, d'élevage ou de production alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique. Par prélèvement d'environnement, on entend notamment un prélèvement de surface, de liquide, de matière première ou de produit. 5 Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries, les levures, et plus généralement, les organismes généralement unicellulaires, invisibles à l' oeil nu, qui peuvent être multipliés et manipulés en laboratoire. A titre de bactéries à Gram négatif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedecea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas et Legionella. A titre de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants Aerococcus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Lactobacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Falkamia, Gemella, Pediococcus, Mycobacterium et Corynebacterium. A titre de levures, on peut citer les levures des genres suivants: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces et Trichosporon. L'invention concerne un substrat enzymatique pour la détection d'une activité peptidase de formule (I) suivante : R1 selon laquelle : ^ X représente S; NX1; O ; NX1-CO ^ R1 représente rien, ou un des substituants suivants : Cl, Br, F, I, OH, un groupement alkyle, aryle, carboxyle, 6 ^ R2 représente rien ou un des substituants suivants : Cl ; O-CH2-O ; O-CH3 ; F, diethylenediamine-CH3, NR3R4, Br, I, OH, un groupement alkyle, aryle, carboxyle ^ X1 est choisi parmi H, C2H4Ph, OH, un groupement alkyle, un groupement 5 aryle ^ R3 et R4 représentent indépendamment H ou un groupement alkyle ayant de 1 a 4 atomes de carbone ^ P représente un peptide 10 Bien entendu, le substrat selon l'invention peut comprendre plusieurs substituants, c'est à dire plusieurs groupements R1, R2 en différente position du cycle. Lorsque R1 et/ou R2 est un groupement alkyle ou aryle, il peut également être substitué par un ou plusieurs substituants tel que OH, carboxyle, Br, Cl, F, I. Lorsque R2 représente O- CH2-O, R2 représente un cycle accolé à l'aminophenyl, deux de leurs sommets étant 15 partagés. Lorsque X représente NX1-CO, le cycle comprenant X est un cycle à 6 sommets, comprenant un O en position 3 et NX1 en position 4 dudit cycle à 6 sommets. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, R1 est en position 5. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, R2 est en position 4'. Selon un 20 autre mode particulier de réalisation de l'invention, R2 est en position 5'. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, R2 est en position 4' et en position 5'. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, P comprend à son extrémité N-terminale, un agent de blocage. 25 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente O • R1 et R2 ne représentent rien • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement 30 choisi parmi une beta Alanine, une L Alanine, une Glycine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 et R2 ne représentent rien et P est une beta Alanine. 7 Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 et R2 ne représentent rien et P est L Alanine. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 5 répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 et R2 ne représentent rien et P est une Glycine. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle • X représente O 10 • R1 représente Cl • R2 ne représente rien • P représente un peptide Préférentiellement, P est un acide aminé, préférentiellement une L Alanine. Préférentiellement, R1 est en position 5. 15 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 représente Cl en position 5, R2 ne représente rien et P est une L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle 20 • X représente O • R1 représente CH3 • R2 ne représente rien • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine 25 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 représente CH3 en position 5, R2 ne représente rien, et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle 30 • X représente O • R1 ne représente rien • R2 représente Cl 8 • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine ou beta alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente 5 Cl en position 5', et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente Cl en position 5', et P est beta alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 10 répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente O • R1 ne représente rien • R2 représente O-CHz-O • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, choisi 15 préférentiellement parmi L Alanine et beta alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente O-CHz-O, accolé à l'aminocycle en position 4' et 5', et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 20 répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente O-CHz-O, accolé à l'aminocycle en position 4' et 5', et P est beta Alanine. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente O 25 • R1 ne représente rien • R2 représente O-CH3 • P représente un peptide Préférentiellement, P est un acide aminé, préférentiellement, une beta Alanine ou une L-Alanine. Préférentiellement R2 est en position 4' et 5'. 30 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente O-CH3 en position 4' et 5' et P est une beta Alanine. 9 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente O-CH3 en position 4' et 5' et P est une L-Alanine. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 5 répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente O • R1 ne représente rien • R2 représente F • P représente un peptide 10 Préférentiellement, P est un acide aminé, préférentiellement une beta Alanine. Préférentiellement R2 est en position 5'. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente O, R1 ne représente rien, R2 représente F en position 5' et P est une beta Alanine. 15 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente NX1 • X1 représente CH3 • R1 et R2 ne représentent rien 20 • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1, X1 représente CH3, R1 et R2 ne représentent rien, et P est L Alanine. 25 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente NX1 • X1 représente C2H4Ph • R1 et R2 ne représentent rien 30 • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine 10 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1, X1 représente C2H4Ph, R1 et R2 ne représentent rien, et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 5 répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente NX1 • X1 représente C2.H4Ph • R1 ne représente rien • R2 représente Cl 10 • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1, X1 représente C2.H4Ph, R1 ne représente rien, R2 représente Cl en position 5', et P est L Alanine. 15 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente NX1 • X1 représente C2.H4Ph • R1 ne représente rien 20 • R2 représente O-CHz-O • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, choisi préférentiellement parmi L Alanine et beta alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1, X1 représente C2.H4Ph, R1 ne 25 représente rien, R2 représente O-CHz-O, accolé à l'aminocycle en position 4' et 5', et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1, X1 représente C2H4Ph, R1 ne représente rien, R2 représente O-CHz-O, accolé à l'aminocycle en position 4' et 5', et P 30 est beta Alanine. 11 Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus et selon laquelle : • X représente S • R1 ne représente rien • R2 ne représente rien • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement, choisi parmi L Alanine ou une beta Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente S, R1 et R2 ne représentent rien et P représente L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente S, R1 et R2 ne représentent rien et P représente beta Alanine. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus et selon laquelle : • X représente S • R1 ne représente rien • R2 représente Cl • P représente un peptide Préférentiellement, P est un acide aminé, préférentiellement L Alanine. 20 Préférentiellement R2 est en position 5'. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente S, R1 ne représente rien, R2 représente Cl en position 5' et P représente L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 25 répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente S • R1 représente CH3 • R2 ne représente rien • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement 30 L Alanine 12 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente S, R1 représente CH3 en position 5, R2 ne représente rien, et P est L Alanine. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique 5 répond à la formule (I) telle que définie précédemment et selon laquelle : • X représente NX1-CO • X1 représente H • R1 ne représente rien • R2 représente Cl 10 • P représente un peptide, préférentiellement un acide aminé, préférentiellement L Alanine Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit substrat enzymatique répond à la formule (I) ci dessus, X représente NX1-CO, X1 représente H, R1 ne représente rien, R2 représente Cl en position 5', et P est L Alanine. 15 Préférentiellement, le substrat selon l'invention est choisi parmi les substrats décrits dans le tableau 1. Tableau 1 û Exemples de substrats selon l'invention Substrats Référence X X1 R1 R2 P 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole Substrat 1 0 - -L-Ala VLS206, 27 2-(B-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole Substrat 2 O -- f3-Ala OF22A 2-(Glycyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole Substrat 3 O - -Gly OF30B 2-(2'-L-Alanyl-amidophenyl)-5-chloro- Substrat 4 0 - Cl - LAla benzoxazole 35 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-5-méthyl- Substrat 5 0 CH3 -L-Ala benzoxazole 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)- Substrat 6 O - -Cl L-Ala benzoxazole VLS283 2-(B-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-Substrat 7 O - - Cl B-Ala benzoxazole OF23A 2-(L-Alanyl-2'-amido-4',5'-Substrat 8 O - - O-CHz-O L-Ala cyclomethylenedioxy-phenyl)-benzoxazole 2-(B-Alanyl-2'-amido-4',5'Substrat 9 O - - O-CHz-O B-Ala cyclomethylenedioxy-phenyl)-benzoxazole 2-(L-Alanyl-2'-amido-4',5'-dimethoxy- Substrat 10 O _ O CH3, O CH3 L-Ala phenyl)-benzoxazole VLS284 2-(B-Alanyl-2'-amido-4',5'-dimethoxy- Substrat 11 0 _ 0 CH3, 0 CH3 B-Ala phenyl)-benzoxazole OF24A Substrats Référence X X1 R1 R2 P 2-(B-Alanyl-2'-amido-5'-fluoro-phenyl)- Substrat 12 O - - F B-Ala benzoxazole OF28A 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-3-methyl- Substrat 13 NX1 CH3 _ - L-Ala benzimidazole 43 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-3-phenethyl- Substrat 14 NX1 C2H4Ph _ - L-Ala benzimidazole 57 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-3- Substrat 15 NX1 C2H4Ph _ Cl L-Ala phenethyl-benzimidazole 59 2-(L-Alanyl-2'-amido-4',5'-Substrat 16 NX1 C2H4Ph - O-CH2-O L-Ala cyclomethylenedioxy-phenyl)-3-phenethyl- 60 benzimidazole 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzothiazole Substrat 17 S - - - L-Ala OF38A 2-(3 -Alanyl-2'-amidophenyl)-benzothiazole Substrat 18 S - - - B-Ala OF33A 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)- Substrat 19 S - - Cl L-Ala benzothiazole 2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-5-méthyl- Substrat 20 S - CH3 -L-Ala benzothiazole 2-(2'-L-Alanyl-amido-5'-chloro-phenyl)- Substrat 21 NX 1- H - Cl L-Ala quinoxazol-4-one VLS289 CO L'invention concerne également un milieu réactionnel comprenant au moins un substrat enzymatique tel que défini ci avant. Préférentiellement, ledit milieu réactionnel est un milieu de détection et/ou 5 d'identification de microorganismes, cedit milieu comprenant au moins un substrat enzymatique tel que défini ci avant. Préférentiellement, ledit substrat est à une concentration comprise entre 1 et 1000 mg/1, préférentiellement entre 10 et 500 mg/1. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu de détection et/ou 10 d'identification selon l'invention comprend en outre au moins un autre substrat enzymatique, spécifique d'une activité enzymatique différente de celle détectée par le substrat selon l'invention. L'hydrolyse enzymatique du ou des autres substrats génère un signal détectable, différent du signal détecté par le substrat de l'invention, comme par exemple des 15 produits colorés ou fluorescents différents, pour permettre la mise en évidence comme la détection et/ou l'identification et/ou la quantification d'un ou plusieurs microorganismes. A titre d'autre substrat spécifique, on peut utiliser tout autre substrat classiquement utilisé dans la détection des microorganismes. La concentration de l'autre substrat enzymatique spécifique est généralement comprise entre 0,01 et 1 14 L'homme du métier pourra déterminer facilement une telle concentration en fonction du substrat utilisé. A titre indicatif, il est possible de combiner les substrats selon l'invention avec des substrats enzymatiques de peptidase, d'osidase, d'estérase ou de réductase. En particulier, il est possible d'associer un substrat selon l'invention pour lequel P est une B-Alanine avec un substrat d'osidase, tel que le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-glucoside, ou l'Alizarine-B-galactoside. Il est également possible d'associer un substrat selon l'invention pour lequel P est la L-Alanine avec un substrat d'estérase, tel que le 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-octanoate ou le 5-Bromo-3-indoxyl-phosphate. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit milieu dedétection et/ou d'identification selon l'invention comprend en outre au moins un autre substrat enzymatique spécifique de l'activité enzymatique détectée par le substrat selon l'invention. Par le choix particulier de substrats, il est alors possible d'identifier des groupes de microorganismes exprimant une même activité enzymatique. La concentration de l'autre substrat enzymatique spécifique est généralement comprise entre 0,01 et 1 g/1. L'homme du métier pourra déterminer facilement une telle concentration en fonction du substrat utilisé. En particulier, il est possible d'associer un substrat selon l'invention pour lequel P est une L-Alanine avec un substrat de L-Alanine aminopeptidase décrit dans la demande WO2006030119, tel que la L-Alanine- pentyl-résorufamine. L'invention concerne également l'utilisation de substrats enzymatiques, tels que définis ci avant ou d'un milieu de détection et/ou d'identification tel que défini ci avant pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité peptidase. L'invention concerne également l'utilisation de substrats enzymatiques, tels que définis 25 ci avant ou d'un milieu de détection et/ou d'identification tel que défini ci avant pour séparer les bactéries à Gram positif des bactéries à Gram négatif L'invention concerne également un procédé pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité peptidase, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par les étapes suivantes: 30 a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification tel que défini précédemment, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et 30 15 d) révéler la présence d'au moins une activité peptidase L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Lors de l'étape d), on peut révéler la présence de l'activité peptidase, seule ou en combinaison avec au moins une autre activité enzymatique. L'invention concerne également un procédé pour la différenciation chez des bactéries de leur appartenance aux bactéries à Gram positif ou aux bactéries à Gram négatif, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification tel que défini précédemment, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) révéler la présence d'au moins une activité peptidase Comme indiqué précédemment, l'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. L'étape d) peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Lors de l'étape d), on peut révéler la présence de l'activité peptidase, seule ou en combinaison avec d'autres activités enzymatiques. Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 - Synthèse de substrats • X représente S 16 1 Synthèse de 2-(2'-Aminophenyl)-benzothiazole 1.1 2-(2' -Nitrophényl)-benzothiazole Un mélange de léq de 2-Aminophénol, d'éthanol et de léq de 2-Nitrobenzaldéhyde a été chauffé par un bain d'huile à reflux à la température de 110 C durant une heure. Les inventeurs ont laissé refroidir le mélange à température ambiante et récupéré le précipité par filtration. Afin de récupérer un maximum de produit, le ballon a été rincé avec le filtrat pour évaporer une partie significative. Le solide a été séché dans un dessiccateur sous pression réduite pour obtenir le produit 10 intermédiaire. Le solide précédemment obtenu a été dissous dans 100 ml de Dichlorométhane, puis a été ajouté petit à petit léq de 2,3-Dicyano-5,6-dichloro-parabenzoquinone à température ambiante. La réaction s'est déroulée durant une nuit, puis la verrerie a été filtrée et rincée avec du D.C.M. afin de récupérer le maximum de produit, soluble dans 15 le D.C.M. Le solvant a ensuite été évaporé sous pression réduite afin d'obtenir le produit. 1.2 2 -(2 ' -Aminophényl)-b enzothiazo le Dans un bécher de 250m1, 15g (0,15mol) d'acide polyphosphorique ont été placés, puis 20 4,56g (0,036mo1) de 2-Aminothiophénol et 5,OOg (0,036mo1) d'acide anthranilique ont été ajoutés. Le mélange a été porté à 200-220 C durant 3 heures dans un bain de sable avec un bec Bunsen et remué à intervalles réguliers à l'aide d'un agitateur en verre. Le mélange a été refroidi lentement à 60 C et de la glace pilée a été ajoutée. Ensuite, 60m1 d'eau ont été ajoutés, et la solution obtenue a été basifiée à l'aide d'une 25 solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) jusqu'à atteindre un pH de 9-10. Un précipité orange a ainsi été obtenu, qui a été récupéré par filtration sous Buchner. Le solide obtenu a été séché puis dissout dans 50ml de Dichlorométhane, puis lavé 3 fois a l'eau. Les phases organiques ont été collectées puis séchées avec du MgSO4, filtrées puis le solvant évaporé afin d'obtenir le produit brut. Une masse de 3,Olg d'un solide 30 jaune/vert a été obtenue après une purification par chromatographie sur colonne avec un rendement de 64%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 5 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 6.40 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.75 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 6.78 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.23 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.35 (1H, t, J = 7 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 7Hz, Ar-H), 7.71 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.97 (1H, d, J = 7Hz, Ar-H). 2 Synthèse de 2-(L-Alanyl-2'-amidophényl)-benzothiazole (substrat 17) 2.1 Méthode des anhydrides mixés Une masse de 1,51g (0,008 mol) de Boc-Ala-OH a été dissous dans 10m1 de 10 Tétrahydrofurane sec et un piège de CaC12 a été ajouté sur le col du ballon afin d'assurer l'étanchéité. Le mélange a été agité magnétiquement, et la température a été descendue à -15 C en utilisant un bain de glace congelée mélangée à des sels de NaCl. Une fois cette température atteinte, le mélange a été agité 5 minutes de plus. Puis, 1,01g (0,010 mol) de N-Methylmorpholine a été ajouté tout en prenant bien soin que la 15 température redescende à -15 C avant de procéder à la prochaine étape. Ensuite, 1,09g (0,008 mol) d'Isochlorobutylformate a été ajouté goutte à goutte avec la plus grande précaution, le mélange s'est troublé comme prévu à chaque goutte ajoutée. Ensuite, 1,36g (0,006 mol) de 2-(2'-Amiophényl)-benzothiazole ont été dissous dans le minimum de T.H.F. sec, et ajouté au mélange. Le bain de glace a été retiré après 2 20 heures et le mélange a été agité durant la nuit. La solution a été filtrée, le ballon a été rincé avec du T.H.F. normal et le filtrat a été conservé. La solution a ensuite été transférée à l'aide d'une pipette pasteur dans un bécher de 400m1 contenant de la glace, de l'eau ainsi que du carbonate de sodium (Na2CO3). La 25 solution a ensuite été agitée durant deux d'heures; jusqu'à obtenir une solution limpide. La solution a ensuite été filtrée dans un petit Buchner puis le précipité a été dissous dans du méthanol afin de le recristalliser. Une masse de 0,87g d'OF37A, une poudre beige/marron a été ainsi obtenue, avec un rendement de 37%. 30 Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 1.42 (9H, s, C-CH3x3), 1.57 (3H, d, J = 7.92 Hz, CH3-CH-), 3.50 (1H, s, NH-Ar), 4.52 (1H, qt ,NH-CH-CH3), 4.51 (21H, d, NH-CH), 7.18 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.44 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.48 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.49 (1H, t, J = 7.42 Hz, Ar-H), 7.87 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 7.92 (1H, d, J = 7.92 Hz, Ar-H), 8.14 (1H, d, 35 J=7.92 Hz, Ar-H), 8.82 (1H, d, J= 7.92 Hz, Ar-H). 2.2 Déprotection Une masse de 0,30g (0,00075 mol) du composé à déprotéger a été placée dans un ballon équipé d'un piège à CaC12,et 7 ml d'acide trifluoroacétique ont été ajouté. Le mélange a été placé sous agitation magnétique toute la nuit. Le T.F.A. a été évaporé afin d'obtenir 0,35g d'OF38A sous forme de sel d'acide trifluoroacétique, une poudre beige/marron ayant pour rendement 88%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : iH NMR (270 MHz, DMSO): 6 = 1.62 (3H, d, J = 7.42 Hz, CH3-CH-), 4.35 (1H, sx ,NH2-CHCH3), 5.31 (2H, broad s, NH2), 7.37 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.53 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.61 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 7.62 (1H, t, J = 7.8 Hz, Ar-H), 8.02 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.12 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J = 7.42 Hz, Ar-H), 8.31 (2H, Ar-H + NH). m. p.: 150-154 C. 3 Synthèse de 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-benzothiazole (substrat 19) 3.1 2 -(2 ' -Nitro-5 ' -chlorophenyl)-benzothiazo le Un mélange de 1,18g (0,0094mo1) de 2-Aminothiophénol et de 1,74g (0,0094mo1) de 5-nitro-3-chlorobenzaldéhyde dans l'éthanol (150ml) a été chauffé à reflux durant 2 heures. Après avoir été refroidie à température ambiante, la solution a été concentrée sous pression réduite. Le solide restant a été dilué dans un mélange d'eau et d'acétate d'éthyle (500ml), et la phase aqueuse a été extraite encore deux fois en utilisant de l'acétate d'éthyle (2x500ml). Les phases organiques réunies ont été séchées (MgSO4), filtrées et concentrées afin d'obtenir le produit brut, qui a été recristallisé à partir d'éthanol. Une masse de 0,66g d'OF31A, un solide marron a été obtenue avec un rendement de 25%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 7.55 (4H, m, Ar-H), 7.79 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, s, Ar-H), 8.10 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H). 3.2 2-(2'-Amino-5'-chlorophényl)-benzothiazole Un mélange de 0,65g (0,00223mo1) de 2-(2'-Nitro-5'-chlorophényl)-benzothiazole OF31A et de 2,52g (0,01118mol) de SnC12, 2H20 dans 100ml d'éthanol a été chauffé à 19 70 C durant 2 heures. Une étape de vérification à l'aide de chromatographie couche mince montrait que le mélange ne contenait plus aucun réactif de départ. Après avoir laissé le mélange refroidir à température ambiante, la solution a été versée dans un bécher contenant de la glace. Le pH a été ajusté a une pH légèrement basique (pH 7-8) en ajoutant une solution aqueuse de bicarbonate de sodium (5%) NaHCO3 avant d'avoir extrait la phase aqueuse à l'aide d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse ainsi obtenue a été soigneusement lavée avec de la saumure (solution aqueuse de NaCl saturée) et séchée à l'aide de sulfate de sodium afin d'obtenir 0,31g de OF53A, un solide marron jaune avec un rendement de 53%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : iH NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 6.41 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.74 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.42 (3H, m, Ar-H), 7.67 (1H, d, J = 2 Hz, Ar-H), 7.90 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.98 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H). 3.3 2 -(Alanyl-2 ' -amido-5 ' -chlorophényl)-benzothiazole 3.3.1 Méthode des anhydrides mixés Une masse de 0,29g (0,00153mol) de Boc-L-Ala a été dissoute dans 10ml de Tétrahydrofuranne sec. Un piège de CaC12 a été ajouté sur le col du ballon afin d'assurer l'étanchéité. Le mélange a été agité magnétiquement et la température du mélange a été descendue à -15 C en utilisant un bain de glace congelée mélangée à des sels de NaCl. Une fois cette température atteinte, le mélange a été agite 5 minutes de plus. Puis, 0,19g (0,00191 mol) de N-Méthylmorpholine a été ajouté tout en prenant bien soin que la température redescende à -15 C avant de procéder à l'étape suivante. Ensuite, 0,21g (0,00153mol) d'Isochlorobutylformate a été ajouté goutte à goutte avec la plus grande précaution, le mélange s'est troublé comme prévu à chaque goutte ajoutée. Quelques minutes plus tard, une masse de 0,30g (0,00115 mol) de 2-(2'-Amino-5'-chlorophényl)-benzothiazole a été dissoute dans le minimum de T.H.F. sec et ajouté au mélange. Le bain de glace a été retiré après 2 heures et le mélange a été laissé agité durant la nuit. La solution a été filtrée, et le ballon a été rincé avec du T.H.F. normal et conservé le filtrat. La solution a été transférée à l'aide d'une pipette pasteur dans un bécher de 400 ml contenant de la glace, de l'eau ainsi que du carbonate de sodium (Na2CO3). Le 20 mélange a été placé sous agitation pendant deux heures ; jusqu'à obtenir une solution limpide. La solution a été filtrée dans un petit Buchner puis le précipité a été dissout dans du méthanol afin de le recristalliser. Une masse de 0,18g d'OF55A, un solide vert clair a été obtenu avec un rendement de 5 36%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 1.41 (9H, s, 3xCH3), 1.56 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.58 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 6.45 (1H, broad s, NH), 6.74 (1H, d, J= 3 Hz, Ar-H), 7.45 (3H, m, Ar-H), 7.66 (1H, d, J= 3 Hz, Ar-H), 7.92 (2H, m, Ar-H). 10 3.3.2 Déprotection Une masse de 0,18g (0,00042mo1) du composé à déprotéger a été placé dans un ballon équipé d'un piège à CaC12, et 5m1 d'acide trifluoroacétique a été ajoute. Le mélange a été placé sous agitation magnétique toute la nuit. 15 Le T.F.A. a été évaporé afin d'obtenir 0,22g d'OF57A sous forme de sel d'acide trifluoroacétique, un solide marron et collant ayant pour rendement 94%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : iH NMR (270 MHz, DMSO): 6 = 1.50 (1H, d, J = 7 Hz, CH-CH3), 1.55 (3H, d, J = 4 Hz, CH3-CH), 4.80 (3H, broad s, NH3), 6.87 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 7.21 (1H, d, J = 9 Hz, Ar-H), 20 7.52 (1H, m, Ar-H), 8.10 (4H, m, Ar-H). m. p.: 124-128 C. • X est O 1 Synthèse de 2-(2'-Aminophenyl)-benzoxazole 25 1.1 2-(2' -Nitrophényl)-benzoxazole Un mélange de 8,73g (0,0800 mol) de 2-Aminophénol, de 20 ml d'éthanol et de 12,09g (0,0800 mol) de 2-Nitrobenzaldéhyde a été chauffé par un bain d'huile à reflux à la température de 110 C durant une heure. 30 Le mélange a été mis a à température ambiante et le précipité a été récupéré par filtration. Afin de récupérer un maximum de produit, le ballon a été rincé avec le filtrat pour évaporer une partie significative. Le solide a été séché dans un dessicateur sous pression réduite pour obtenir 13,25g de 2-(2'-Nitro-benzylidineamino)-phénol avec un rendement de 69%. Le solide précédemment obtenu a été dissout dans 100ml de dichlorométhane, puis a été ajouté petit à petit 12,43g (0,0547 mol) de 2,3-Dicyano-5,6-dichloroparabenzoquinone à température ambiante. La réaction a été laissée se dérouler durant la nuit, la verrerie a été filtrée puis rincée avec du D.C.M. afin de récupérer le maximum de produit. Le solvant a ensuite été évaporé sous pression réduite afin d'obtenir 8,39g de 2-(2-Nitrophényl)-benzoxazole, une solide marron-beige avec un rendement de 64%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.42 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.73 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.89 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.15 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H). m. p.: 104-107 C. 1.2 2-(2'-Aminophényl)-benzoxazole Un mélange de 8g (0,033 mol) de 2-(2'-Nitrophényl)-benzoxazole et de 37,58g (0,167 mol) de SnC12,2H2O dans 200m1 d'éthanol a été chauffé à 70 C jusqu'à ce que la réaction soit complètement terminée. Après avoir laissé le mélange refroidir à température ambiante, la solution a été versée dans un bécher contenant de la glace. Le pH a été ajusté a un pH légèrement basique (pH 7-8) en ajoutant une solution aqueuse de bicarbonate de sodium (5%) NaHCO3 avant d'avoir extrait la phase aqueuse à l'aide d'acétate d'éthyle. La phase aqueuse ainsi obtenue a été soigneusement lavée avec de la saumure (solution aqueuse de NaCl saturée) et séchée à l'aide de sulfate de sodium afin d'obtenir 4,72g de OF1OC, un solide marron jaune avec un rendement de 67%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 6.20 (2H, broad s, Ar-NH2), 6.78 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 6.81 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.31 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.32 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.34 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.58 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 7.72 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H), 8.08 (1H, d, J = 7 Hz, Ar-H). m. p.: 100-104 C. 2 Synthèse de 2-(Glycyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole (substrat 3) 25 30 2.1 Méthode des anhydrides mixés Une masse de 1,40g (0,008 mol) de N-t-Boc-Gly a été dissoute dans 10m1 de tétrahydrofurane sec et un piège de CaC12 a été ajouté sur le col du ballon afin d'assurer l'étanchéité. Le mélange a été agité magnétiquement et la température du mélange a été descendue à -15 C en utilisant un bain de glace congelée mélangée à des sels de NaCl. Une fois cette température atteinte, le mélange a été agité 5 minutes de plus. Puis, une masse de 1,Olg (0,010 mol) de N-Méthylmorpholine a été ajouté tout en prenant bien soin que la température redescende à -15 C avant de procéder à l'étape suivante. Ensuite, a été ajouté goutte à goutte avec la plus grande précaution 1, 09g (0,008 mol) d'Isochlorobutylformate, le mélange s'est troublé comme prévu à chaque goutte ajoutée. Quelques minutes plus tard, une masse de 1,26g (0,006 mol) de 2-(2'-Aminophényl)-benzoxazole a été dissous dans le minimum de T.H.F. sec et ajouté au mélange. Le bain de glace a été retiré après 2 heures et le mélange a été placé sous agitation durant la nuit. La solution a été filtrée, le ballon a été rincé avec du T.H.F. normal et le filtrat a été conservé. Un léger précipité était présent. La solution a été transférée à l'aide d'une pipette pasteur dans un bécher de 400m1 contenant de la glace, de l'eau ainsi que du carbonate de sodium (Na2CO3). le mélange a été placé sous incubation pendant 2 heures, jusqu'à obtenir une solution limpide. La solution a été filtrée dans un petit Buchner puis le précipité a été dissous dans du méthanol afin de le recristalliser. Une masse de 0,98g d'OF27A, une poudre blanche a été obtenue avec un rendement de 45%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, CDC13): 6 = 1.47 (9H, s, C-CH3x3), 4.05 (1H, d, J= 8 Hz, -NH-CH2), 4.17 (2H, d, J = 8 Hz, CO-CH2-NH), 5.38 (1H, broad s, Ar-NH-), 7.20 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.60 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.80 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.85 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H). 2.2 Déprotection Une masse de 0,25g (0,00068 mol) du composé à déprotéger a été placé dans un ballon équipé d'un piège à CaC12, et a été ajouté 7 ml d'acide trifluoroacétique. Le mélange a été placé sous agitation magnétique toute la nuit. Le T.F.A. a été évaporé afin d'obtenir 0,29g d'OF30B sous forme de sel d'acide trifluoroacétique, une poudre beige ayant pour rendement 86%. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H NMR (270 MHz, DMSO): 6 = 4.05 (2H, d, J = 8 Hz, CH2-NH3), 4.90 (3H, broad s,NH3), 7.40 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.46 (1H, t, J = 5 Hz, Ar-H), 7.50 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 7.70 (1H, t, J= 5 Hz, Ar-H), 7.85 (1H, t, J= 5 Hz, Ar-H), 8.20 (1H, d, J= 8 Hz, Ar-H) 8.25 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H), 8.40 (1H, d, J = 8 Hz, Ar-H). ESI-MS: C15H15N3O2+ requires m/z 269.77 [M + H]+, 226.96 [M + H]- High-resolution M.S.E.I. for C15H15N3O2+. Calculated mass of molecular ion 268.1081 [M + Hf. Measured mass: 10 268.1083 [M + H]+. m. p.: 219-222 C. • X est NX1-CO 15 1 Synthèse de 2-(2' -Amino-5' -chloro-phenyl)-quinoxazol-4-one 1.1 Synthèse de la 1,2-Dihydro-2-(2'-nitro-5'-chloro-phényl)-quinoxazoline-4-one (ref : VLS 276) Une masse de 2,31g (0,017mol) de 2-Amino benzamide et 3,14g (0,017mol) de 20 3-Chloro-6-nitro benzaldéhyde a été chauffée dans l'ethanol à reflux durant 1 heure. Le mélange a ensuite été refroidi, et les cristaux oranges obtenus on été récoltés et séchés dans un dessiccateur à pression réduite. Une masse de 3,97g de cristaux orange clair a été obtenue avec un rendement de 76% et un point de fusion mesuré de 234-236 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 25 1H-NMR:(DMSO) 8 6.35 (1H, t, J=2 Hz, CH), 6.70 (1H, d, J=1 Hz, Ph-H(8H)), 6.80 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.05 (1H, s (broad), NH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d,d, J=6 Hz, J=1.5 Hz, Ph-H (5H)), 7.75 (1H, d,d, J=9 Hz, J=3 Hz, Ph-H (4'H)), 7.85 (1H, d, J=3 Hz, Ph-H (6'H)), 8.15 (1H, d, J=9 Hz, Ph-H (3'H)), 8.30 (1H, d (broad), NH-CO), High-resolution M.S.E.I for C14H10C1N303 Calculated mass of molecular ion 304.0483 (M+H)+. Measured mass: 30 304.0482 vmax cm-1 1661 (C=ONH), 1564 (NO2), 1358 (NO2), 1602 (C=N), 774 (C-Cl) 1.2 Oxydation de la 2-(2'-Nitro-5'-chloro-phényl)-quinoxazoline- 4-one (ref : VLS 278) 35 Une masse de 9,10g (0,03 mol) de 2-(2'-Nitro-5'-chloro-phényl)-quinoxazoline-4-one a été dissoue dans 40m1 d'acétone anhydre et a été traitée par 4,74g (0,03 mol) d'une solution de Permanganate de potassium dans de l'acétone anhydre. Cette solution a été ajoutée goutte à goutte au mélange sur une période de 2-3 heures à température ambiante. Ensuite la réaction a été laissée sous agitation durant la nuit. L'excès de KMnO4 a été éliminé par l'addition de bisulfite de sodium solide en excès. Puis la solution a été filtrée et évaporée.Une masse de 2,26g d'une poudre blanche et pâle a été obtenue avec un rendement de 25% et un point de fusion mesuré de 276-278 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : High-resolution M.S.E.I for C14H8C1N303 Calculated mass of molecular ion 302.0327 (M+H)+. Measured mass: 304.0327 .1H-NMR:(DMSO) 8 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (7H)), 7.65 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (4'H)), 7.85 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H (6H)), 7.90 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H (5H)), 8.05 (1H, d, J=2 Hz, Ph-H (6'H), 8.25 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H (3'H). vma,, cm-1 3132 (NH2), 3070 (NH2), 1578 (NO2), 1368 (NO2), 1603 (NH), 1660 (CONH), 1531 (C=N), 772 (C-Cl) 1.3 Synthèse de la 2-(2'-Amino-5'-chloro-phényl)-quinoxazol-4-one - Réduction du composé VLS 278 (VLS 285) Une masse de 4,96g (0,028 mol) de SnC12.2H20 a été dissoute dans un mélange de 40m1 d'HC1 et de 5ml d'acide acétique glacial. La solution a été portée à reflux à 120 C et 1,34g (0,0044 mol) du composé VLS 278 a été ajouté petit a petit. Le mélange a été maintenu à 120 C durant une demi-heure puis réduit à 100 C durant 2-3 heures. Un solide jaune a été obtenu et récupéré par filtration, dissous dans l'eau et rendu basique par l'addition d'une solution de 4M de NaOH. Le précipité jaune pâle a été récolté et séché avec un dessiccateur sous pression réduite. Une masse de 1,17g d'une poudre jaune a été obtenue avec un rendement de 98% et un point de fusion mesuré de 286 - 288 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : .1H-NMR:(DMSO) 8 6.80 (1H, d, J= 8.6 Hz, Ph-H (3'H)), 7.20 (1H, d,d, J=8.6 Hz, J=1 Hz, Ph-H ), 7.30 (1H, s (broad), NH), 7.45 (1H, t, J=8 Hz Ph-H), 7.70 (1H, d J=7 Hz, Ph-H), 7.75 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.90 (1H, d J=2 Hz, Ph-H (6'H), 8.10 (1H, d,d, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H ). vma,, cml 3465 (NH2), 3278 (NH2), 1674 (CO), 1582 (NH), 1560 (C=N), 1159 (C-N), 766 (C- Cl) 2 Synthèse de 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-quinoxazol-4-one (substrat 21)35 2.1 Méthode des anhydrides mixes (VLS 286 rep) Une masse de 0,50g (0,002mo1) de tBoc-L-Ala a été dissout dans 10m1 de THF anhydre. La température a été portée à -15 C et 0,34g (0,0032mo1) de NMM (N-Méthyle morpholine) a été ajouté sur une période de 1 minute, suivi par 0,36g (0,00266mo1) d'IBCF (Isobutyle choloroformate) toujours à la même température. Apres cet ajout, le mélange a été mélangé durant 5-10 minutes puis une solution de 0,55g (0,002mo1) de 2-(2'-Amino-5'-chloro-phényle)-quinoxazol-4-one dissout dans le minimum de THF anhydre, soit 5m1, a été ajoutée goutte à goutte sur une période de 2 minutes à la même température. Le mélange a été équipé d'un bain de glace durant 2-3 l0 heures, puis laissé durant la nuit à température ambiante. Le mélange a ensuite été filtré afin d'enlever le sel de NMM, le volume du filtrat réduit afin de le verser dans un bécher contenant de l'eau et du carbonate de sodium. Le solide jaune a été récupéré et recristallisé avec de l'éthanol. Une masse de 0,43g d'une poudre jaune a été obtenue avec un rendement de 50% et un point de fusion mesuré de 268-270 C. 15 Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : iH-NMR:(DMSO) 8 1.20 (9H, s, (CH3)3C), 1.18 (1H, s (broad), NHCO), 1.40 (1H, d, J=7 Hz, CH3), 1.37 (1H, d, J=2 Hz, NH), 4.05 (1H, quartret, J=7 Hz, alaH), 7.25 (1H, t, J=7 Hz, NHCO(CH3)3), 7.3-7.42 (2H, m, Ph-H ), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H), 7.65 (1H, d, Ph-H (3' H)), 8.00 (1H, d, J=7 Hz, Ph-H (4'H)), 8.60 (1H,, d, J=2 Hz, Ph-H), 8.65 (1H, s, Ph-H (6'H)). u,T 20 cm-i 1668 (CONH), 1608 (NH), 1560 (C=N), 1169 (C-N), 722 (C-Cl) 2.2 Déprotection (ref : VLS 289) Le dérivé t-Boc-L-ala de la 2-(2'-Amino-5-chloro-phényle)-quinoxazoline-4one a été déprotégé par addition d'acide trifluoro acétique. Un mélange de 0,30g (0,0007 mol) de 25 2-(t-BocûL-ala-2'-amido-5-chloro-phényle)-quinoxazoline-4-one et de 5m1 d'acide trifluoro acétique a été mélangé durant la nuit à température ambiante. L'excès d'ATF a été évaporé et le solide marron ainsi obtenu a été séché à l'aide d'un dessicateur sous pression réduite. Une masse de 0,26g (0,00057 mol) d'un solide marron orangé a été obtenue avec un rendement de 81% et un point de fusion mesuré de 268-270 C. 30 Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H-NMR:(DMSO) 8 1.40 (3H, d, CH3), 3.40 (1H, quartret, H-ala), 7.55 (1H, t, J=7 Hz, Ph-H ), 7.67 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H ), 7.71 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H ), 7.83 (1H, m, PhH ), 7.90 (1H, d, J=8 Hz, Ph-H), 8.20 (1H, d,d, J=8 Hz, J=1 Hz, Ph-H ), 8. 30 (2H, s (broad), NH2), 10.92 5 (1H, s (broad), NHCO). u cm-1 1667 (CONH), 1605 (NH), 1560 (C=N), 1435 (CH3), 1181 (C-N), 770 (C-Cl) • X est NX1 1 Synthèse de 2-(2'-Amino-4',5'-cyclomethylenedioxy-phenyl)-3-phenethyl-benzimidazole 1.1 Synthèse du 2-(2'-Nitro-4' ,5 ' -cyc lomethyleneddioxy-phenyl)- 10 3 -phenylethyl-benzimidazole 1.1.1 N-Phenylethyl-2-nitroaniline (ref : VLS 209) Une masse de 4,8g (0,04 mol) de 2-Phenylethylamine a été ajoutée goutte à goutte, et ce à température ambiante, à un mélange de 5,6g (0,04 mol) de 2-Fluoronitrobenzene et 15 de 11,06g (0,08 mol) de carbonate de potassium anhydre dans 30m1 de DMSO. Le mélange a été chauffé à 100 C durant 3 heures. Ensuite le mélange a été refroidi à température ambiante et a été ajouté à 100ml d'eau, ce qui a conduit à la précipitation d'un composé orange clair. Le solide a été récupéré par filtration et séché à l'aide d'un dessiccateur à pression réduite. Une masse de 9,4g de cristaux orange a été obtenue 20 avec un rendement de 98%. Le point de fusion trouvé a été cohérent avec la valeur théorique, soit 64-66 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H-NMR: (CDC13) 8 3.00 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 8 3.55 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 8 6.65 (1H, m, Ph-H), 8 6.85 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), 8 7.20-7.50 (6H, m, Ph-H), 8 8.10 (1H, s(broad), 25 NH), 8 8.20 (1H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H). 1.1.2N-Phenylethyl-1,2-diaminobenzene (ref: VLS 210) A une suspension de 0,52g (0,002 mol) d'acétonate d'acétyle de cuivre dans l'éthanol, une solution de 0,38g (0,01 mol) de borohydrure de sodium a été ajoutée, agitée 30 magnétiquement sous Azote à température ambiante. A cette solution ont été ajouté 2,42g (0,01 mol) du composé nitro VLS209 dans l'éthanol suivi de 0,76g (0,02 mol) de borohydrure de sodium dans l'éthanol. Le mélange a été laissé à agiter durant la nuit sous Azote à température ambiante. Ensuite le mélange a été concentré afin de retirer l'excès d'éthanol et de l'eau a été ajoutée. Puis une étape d'extraction a été réalisée 35 avec 2x20m1 de DCM et la phase organique a été lavée plusieurs fois avec de l'eau, 30 séchée à l'aide de carbonate de potassium et concentrée à l'évaporateur rotatif. Une masse de 1,69g d'un liquide sombre et huileux qui s'est solidifié par la suite a été obtenue, avec un rendement de 80%. Le point de fusion trouvé a été cohérent avec la valeur théorique, soit 42-44 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H-NMR: (CDC13) 8 2.95 (2H, t, J=7 Hz, -CH2-), 8 3.27 (2H, s (broad), NH2), 8 3. 38 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), 8 6.69 (3H, m, Ph-H), 8 6.82 (1H, m, Ph-H), 8 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H). 1.1.3 2-(2'-Nitro-4',5'-cyclomethylenedioxy-phenyl)-3-phenethyll0 benzimidazole (ref: VLS 213) A une solution sous agitation magnétique de 5,08g (0,024 mol) de N-Phenylethyl-1,2-diaminobenzene, de 4,8g (0,024 mol) de 6-Nitropiperonal dans 25m1 de DMF et d'lml d'eau, 8,60g (0,014 mol) d'oxone (monopersulphate de potassium) ont été ajoutés durant une période de 15 minutes à température ambiante. Le mélange a été 15 refroidi par un bain d'eau car la réaction était exothermique, et laissé à agiter durant la nuit. Ensuite de l'eau a été ajoutée au mélange et deux extractions consécutives au DCM ont été réalisées. Les phase organiques réunies ont été lavées à l'eau plusieurs fois, séchées (MgSO4) et concentrées pour donner le produit brut d'une couleur jaune/marron. Une recristallisation avec de l'éthanol a été réalisée afin de purifier le 20 composé. Une masse de 6,19g de cristaux marron a été obtenue avec un rendement de 67%, et un point de fusion mesuré de 162-164 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : High-resolution M.S.E.I for C22H17N304 Calculated mass of molecular ion 388.1292 (M+H)+. Measured mass: 388.1297 .1H-NMR: (CDC13) 8 3.10 (2H, t, J=7 Hz,-CH2-), 8 4.20 (2H, t, J=7 25 Hz,-CH2-), 8 6.02 (1H, s, Ph-H), 8 6.18 (2H, s, O-CHz-O), 8 6.80 (2H, dd, J=8 Hz, J=2 Hz, Ph-H), 8 7.10-7.40 (5H, m, Ph-H), 8 7.48 (1H, m, Ph-H), 8 7.65 (1H, s, Ph-H), 8 7.80 (1H, m, Ph-H). vmax cm-1 1364 (NO2), 1523 (NO2), 1610 (C=N), 1152 (C-N), 1207 (C-N), 1089 (C-O), 1473 (C-H), 728 (-CH2). 1.2 Synthèse du 2-(2'-Amino-4',5'-cyclomethylenedioxy-phenyl))-3 -phenylethyl-benzimidazole A une suspension de 0,16g (0,0006 mol) d'acétonate d'acétyle de cuivre dans l'éthanol, une solution de 0,llg (0,003 mol) de borohydrure de sodium a été ajoutée, agitée magnétiquement sous Azote à température ambiante. A cette solution a été ajouté 1,07g (0,003 mol) du composé nitro VLS213 dans l'éthanol suivi de 0,23g (0,006 mol) de borohydrure de sodium dans l'éthanol. Le mélange a été laissé à agiter durant la nuit sous Azote à température ambiante. Ensuite le mélange a été concentré afin de retirer l'excès d'éthanol et de l'eau a été ajoutée. Puis, une extraction a été réalisée avec 2x20m1 de DCM et la phase organique a été lavée plusieurs fois avec de l'eau, séchée (K2CO3) et concentrée à l'évaporateur rotatif. Une masse de 0,92g d'une poudre marron a été obtenue avec un rendement de 87% et un point de fusion mesuré de 170-172 C. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : High-resolution M.S.E.I for C22H19N3O2 Calculated mass of molecular ion 358.1550 (M+H)+. Measured mass: 358.1550 1H-NMR: (CDC13) 8 3.00 (2H, t, J=7 Hz -CH2-), 8 4.40 (2H, t, J=7 Hz, -CH2), 8 6.00 (2H, s, OCHz-O), 8 6.35 (1H, s, Ph-H (6'H), 8 6.50 (1H, s, Ph-H (3' H)), 8 7.00 (2H, m, Ph-H), 8 7.20-15 7.40 (5H, m, Ph-H), 8 7.55 (1H, m, Ph-H), 8 7.85 (1H, m, Ph-H). vmax cm-1 3434 (N-H), 3350 (N-H), 1618 (C=N), 1219 (C-O), 1037 (C-N), 1157 (C-N), 1495 (Ar), 1473 (Ar), 1521 (Ar), 728 (-CH2-) 2 Synthèse de 2-(L-Alanyl-2'-amido-4' ,5'-cyclomethylenedioxy-phenyl)-20 3-phenethyl-benzimidazole (substrat 16) Une masse de 0,50g (0,0026 mol) de tBoc-L-alanine a été dissoute dans 10ml de DCM anhydre et 0,54g (0,0026 mol) de Dicyclohexylcarbodiimide a été ajouté à la solution sous agitation, suivi par 0,35g (0,0026 mol) d'hydroxybenzatriazole. Le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante durant 45 minutes puis 0,65g (0,0019 mol) 25 de 2-(2'-Amino-4',5'-methylenedioxolanephenyl)-3-phenylethyl-benzimidazole a été ajouté avant de laisser poursuivre la réaction de nuit. Le lendemain, le mélange a été filtré à travers de la celite et le solvant évaporé, puis le liquide résultant a été versé dans un mélange eau/glace. Le précipité huileux ainsi formé a été récupéré, dissout dans de l'acétate d'éthyle et lavé plusieurs fois avec une solution de 10% de NaHCO3 puis avec 30 de l'eau. La phase organique a été séchée (MgSO4) et concentrée. Le solide marron ainsi obtenu a été déprotégé par l'addition d'une solution saturée de HC1 dans de l'acétate d'éthyle. Le précipité a été agité avec une solution aqueuse saturée en Na2CO3 et 10ml de DCM. La phase organique a été séparée et séchée (MgSO4) puis concentrée. Une masse de 0,37g d'un solide marron a été obtenue avec un rendement de 38% et un point de fusion mesuré de 80-82 C. Le composé a été purifié avec une chromatographie sur colonne (gel de silice), ce qui a donné un solide jaune/marron. Les données qui ont été obtenues en RMN sont ci dessous : 1H-NMR: (CDC13) 8 1.30 (3H, d, J=6 Hz, ala CH3), 1.50 (2H, s (broad), NH2), 3.07 (2H, t, J=7 Hz, CH2), 3.40 (1H, quartret, ala H), 4.45 (2H, t , J=7 Hz, CH2), 6.04 (2H, s, CH202), 6.58 (1H, s, Ph-H (6'H)), 6.85 (2H, m, Ph-H (6H,7H)), 7.15 (3H, m, Ph-H), 7.35 (2H, d,d, Ph-H (5H, 8H)), 8.10 (1H, s, Ph-H (3'H)) , u cm-11667 (C=O), 1622 (C=N), 1239 (C-O), 1152 (C-N), 728 (-CH2-) Exemple 2 ù Utilisation de substrats de formule I selon l'invention pour détecter une activité peptidase a) Synthèse des substrats • Substrat No 1 -2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole - VLS206 L-Ala /HN • Substrat No 2 - 2-(B-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole - OF22A /HN beta-Ala • Substrat No 3 - 2-(Glycyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole -OF30B /HN Gly • Substrat No 4 -2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-5-chloro-benzoxazole û 35 Cl HN beta-Ala • Substrat No 11 -2-(B-Alanyl-2'-amido-4',5'-dimethoxy-phenyl)-benzoxazole - OF24A HN beta-Ala • Substrat No 17 -2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)benzothiazole - OF38A L-Ala /HN • Substrat No 18 2-(B-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzothiazole - OF33A beta-Ala /HN • Substrat No 19 -2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-benzothiazole Cl L-Ala /HN Les substrats No 1, 3, 4 et 11 ont été synthétisés de façon analogue à la synthèse du 2-(Glycyl-2'-Amidophenyl)-benzoxazole (substrat No 3) dans l'exemple 1. De même les substrats No 17 et 18 ont été synthétisés de façon analogue à la synthèse du 2-(L-Alanyl-2'-amido-5'-chloro-phenyl)-benzothiazole (substrat No 19) dans l'exemple 1. b) Préparation du milieu 40mg de chaque substrat sont dissous dans 4m1 de Diméthyl formamide (DMF). Cette solution est intégralement reprise dans 400m1 de gélose Columbia préalablement autoclavée et maintenue en surfusion à 50 C. La concentration finale pour chaque substrat est donc de 100mg/1. Chacun des milieux est réparti en boîte de Petri de 90mm de diamètre à raison de 20m1 par boîte. c) Ensemencement et incubation 18 souches de micro-organismes issus de collections et appartenant à différentes espèces de bactéries et de levures sont ensemencées sur ces milieux par isolement 20 semi-quantitatif de 10gl d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les milieux sont incubés 24 heures à 37 C, puis les colonies formées sont examinées visuellement sous éclairage UV à 360-365nm. d) Lecture des résultats Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2. Tableau 2 : Intensité et couleur de la fluorescence produite par différentes souches de microorganismes en présence de substrats selon l'invention Substrat selon l'invention No 1 No 2 No 3 No 4 No 11 No 17 No 18 No 19 Qr Qy N Lr, - - - V1 o N â ,1+ â N N o N N N N NN Q ~N N Q _ c~d ê c,d N N Q â Q â N Q DG Q DG k N N N NN CJ ON Q â N- N- y., N o Escherichia coli ++1 + ++ PdC2 + + ++ + NCTC 10418 Bleue Verte Bleue Bleue Bleue Jaune Bleue Serratia marcescens ++ + ++ ++ + + ++ - NCTC 10211 Bleue Verte Bleue Bleue Bleue Bleue Jaune Pseudomonas aeruginosa ++ + +/- +/-+/+ ++ - NCTC 10662 Bleue Verte Bleue Violette Bleue Jaune Jaune Burkholderia cepacia - + + - + + PdC - 1222 Verte Bleue Bleue Jaune Yersinia enterocolitica ++ +/- +/- + +/- + PdC NA NCTC 11176 Bleue Verte Bleue Bleue Bleue Jaune Salmonella Typhimurium ++ - - PdC + PdC PdC +/-NCTC 74 Bleue Bleue Bleue Enterobacter cloacae ++ + ++ + + + PdC + NCTC 11936 Bleue Verte Bleue Bleue Bleue Bleue Bleue Providencia rettgeri ++ +/- ++ + + + PdC + NCTC 7475 Bleue Verte Bleue Bleue Bleue Bleue Bleue Bacillus subtilis - PdC +/- PdC - PdC PdC - NCTC 9372 Verte Enterococcus faecalis +/- +/- - +/- +/- PdC PdC - NCTC 775 Bleue Verte Bleue Bleue Enterococcus faecium +/- +/- PdC - +/- PdC PdC - NCTC 11047 Bleue Verte Bleue Staphylococcus epidermidis - - PdC - - PdC PdC PdC NCTC 11047 Staphylococcus aureus + - + - + PdC PdC - NCTC 6571 Verte Verte Bleue Staphylococcus aureus + - + - - PdC PdC - NCTC 11939 Verte Verte Streptococcus pyogenes - PdC PdC - - PdC PdC PdC NCTC 8306 Substrat selon l'invention No 1 No 2 No 3 No 4 No 11 No 17 No 18 No 19 ,S] U z VI) 1-1 N O O ê ,S] - ,S] N C'l ,S] O 71- â - u â O â N O ct Z N O N k ON N N N 1-1 O O N o N ^ z ~ DG Q N 3 N ,O 7'N N N ~/ N U pr N - 1 1-1 N Í N Listeria monocytogenes NCTC 11994 Candida albicans PdC PdC PdC PdC ATCC 90028 Candida glabrata PdC PdC PdC PdC NCPF3943 1 : intensité de fluorescence, -= pas de fluorescence détectée, e = trace de fluorescence, +/- = faible fluorescence, + = fluorescence moyenne, ++ = forte fluorescence 2 : PdC = Pas de Croissance Contrairement à ce qui est observé avec des substrats à base de 7-Amino-4-méthyl- coumarine (AMC) telle que la L-Alanine-7-AMC, pour tous les substrats selon l'invention testés, la fluorescence était localisée au niveau de la colonie uniquement ou à proximité immédiate. Pour les substrats 1, 2 et 3 pour lesquels seul P diffère (L-Alanine, B-Alanine et Glycine respectivement), l'intensité et/ou la couleur de la fluorescence produite par une même souche différaient. Avec le substrat 1, l'ensemble des souches de bactéries à Gram négatif (à l'exception de la souche de Burkholderia cepacia) produisaient une forte fluorescence bleue. Les deux souches d'entérocoques produisaient une faible fluorescence bleue et les deux souches de Staphylococcus aureus produisaient une fluorescence verte moyenne. En revanche la souche de B. cepacia produisait une fluorescence bleue moyenne avec le substrat 3 et verte avec le substrat 2. Ces résultats indiquaient également que la couleur de la fluorescence, son intensité et la toxicité variaient lorsque P est constant mais que X et/ou R2 variaient. C'était le cas entre les substrats 1, 4, 17 et 19. Ainsi avec le substrat 4, la souche de Pseudomonas aeruginosa produisait une fluorescence violette faible et pour les souches de S. aureus aucune fluorescence n'était détectée. Le substrat 17 inhibait toutes les souches de +/_ Verte C verte +/-Bleue +/-Verte PdC PdC 34 bactéries à Gram positif et les levures, et avec le substrat 19, la souche de P. aeruginosa était négative. De même, il y a de grandes différences de couleur de fluorescence (de longueur d'onde d'émission), d'intensité et de toxicité entre les substrats 2, 11 et 18 pour lesquels P 5 représente la B-Alanine. e) Conclusion En fonction de l'application recherchée, il convient de définir P, X, R2 ou R1. Par exemple, le substrat 1 (2-(L-Alanyl-2'-amidophenyl)-benzoxazole) permet de différencier les bactéries à Gram négatif (fluorescence bleue intense), des levures et des 10 bactéries à Gram négatif, et, parmi ces dernières, de différencier les entérocoques (fluorescence bleue faible) et les S. aureus (fluorescence verte moyenne) des autres. Le substrat 3 permet également de distinguer les bactéries à Gram négatif (fluorescence bleue) des autres microorganismes. Le substrat 19 permet de séparer certaines entérobactéries (Escherichia coli, 15 Salmonella, Enterobacter, Morganella et Providencia) des autres microorganismes.. D'autres substituants, notamment l'utilisation d'autres peptides peuvent permettre de séparer d'autres groupes de microorganismes. En fonction des groupements X, R1 et R2, il est possible de faire varier tant la couleur que l'intensité de la fluorescence, la sensibilité ou la spécificité de la détection de groupes de microorganismes ou même la 20 toxicité. Ces variations sont très utiles notamment dans le cas de combinaisons avec d'autres substrats enzymatiques. REVENDICATIONS 1. Substrat enzymatique pour la détection d'une activité peptidase de formule (I) suivante : HN P selon laquelle : ^ X représente S; NX1; O ; NX1-CO ^ Rl représente rien, ou un des substituants suivants : Cl, Br, F, I, OH, un groupement alkyle, aryle, carboxyle, ^ R2 représente rien ou un des substituants suivants : Cl ; O-CH2-O ; O-CH3 ; F, diethylenediamine-CH3, NR3R4, Br, I, OH, un groupement alkyle, aryle, carboxyle ^ X1 est choisi parmi : H, C2H4Ph, OH, un groupement alkyle, un groupement aryle ^ R3 et R4 représentent indépendamment H ou un groupement alkyle ayant de 1 a 4 atomes de carbone ^ P représente un peptide 2. Substrat enzymatique selon la revendication 1 selon lequel : • X représente O • R1 et R2 ne représentent rien • P représente un peptide 3. Substrat enzymatique selon la revendication 1 selon lequel : • X représente O • R1 représente Cl • R2 ne représente rien • P représente un peptide 4. Substrat enzymatique selon la revendication 1 selon lequel : • X représente S • R1 ne représente rien • R2 ne représente rien • P représente un peptide 5. Substrat enzymatique selon la revendication 1 selon lequel: • X représente S • R1 ne représente rien • R2 représente Cl • P représente un peptide 6. Milieu réactionnel comprenant au moins un substrat enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 7. Milieu de détection et/ou d'identification de microorganismes comprenant au moins un substrat enzymatique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 8. Milieu de détection selon la revendication 7 comprenant en outre au moins un autre substrat enzymatique, spécifique d'une activité enzymatique différente de celle détectée par le substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 9. Milieu de détection selon la revendication 7 ou 8 comprenant en outre au moins un autre substrat enzymatique spécifique de l'activité enzymatique détectée par le substrat selon l'une quelconque des revendications 1 à 5. 10. Utilisation des substrats enzymatiques, tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'un milieu de détection et/ou d'identification selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité peptidase. 11. Utilisation des substrats enzymatiques, tels que définis dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'un milieu de détection et/ou d'identification selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 pour séparer les bactéries à Gram positif des bactéries à Gram négatif. 12. Procédé pour la détection chez des micro-organismes d'au moins une activité peptidase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) révéler la présence d'au moins une activité peptidase 13. Procédé pour la différenciation chez des bactéries de leur appartenance aux bactéries à Gram positif ou aux bactéries à Gram négatif, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes à : a) disposer d'un milieu de détection et/ou d'identification selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, b) ensemencer le milieu avec un échantillon biologique à tester, c) laisser incuber, et d) révéler la présence d'au moins une activité peptidase