Brevet FR2921670A1 — publié le 20090403

MILIEU DE CULTURE SPECIFIQUE POUR LA CROISSANCE, LA DETECTION, L'IDENTIFICATION ET/OU LA NUMERATION DES BACTERIES STAPHYLOCOQUES A COAGULASE POSITIVE La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse microbiologique. Plus particulièrement, la présente invention concerne un milieu de culture sélectif pour la croissance la détection, l'identification et/ou la numération des staphylocoques à coagulase positive. Les bactéries du genre Staphylococcus ou staphylocoques sont responsables d'un grand nombre d'infections nosocomiales et représentent un problème hospitalier important. Ces bactéries sont des bactéries à Gram positif, qui peuvent être classées en deux grands groupes que l'on distingue par la production d'une enzyme, la coagulase, déclenchant la coagulation du plasma. On distingue ainsi les staphylocoques à coagulase négative, dont le représentant principal est Staphylococcus epidermidis et les staphylocoques à coagulase positive, dont le représentant principal est Staphylococcus aureus, bien connu pour sa virulence. Les Staphylocoques sont largement répandus dans l'environnement, la peau et les muqueuses de l'homme et de l'animal. La desquamation régulière de ces hôtes a pour effet de les disperser abondamment dans la nature (eau, sol, air, aliments, objets), et en milieu hospitalier, des mesures draconiennes d'hygiène et d'isolement des patients sont requises pour limiter la dissémination des souches épidermiques. Ainsi, Staphylococcus aureus, qui représente 80 à 90% des Staphylocoques isolés en clinique est un pathogène majeur de l'homme responsable de nombreuses infections en milieu hospitalier, telles que notamment lors de pneumonies nosocomiales, d'infections de plaies chirurgicales, d'infections de brûlures, d'infections des corps étrangers (valves cardiaques, prothèses de hanche, agrafes...) et d'infections systémiques ou de septicémies qui sont souvent dues à l'usage de cathéters intra vasculaires, ou à la dissémination de la bactérie à partir d'un autre foyer infectieux. Dans le domaine alimentaire, le risque constitué par les staphylocoques, et en particulier par les staphylocoques à coagulase positive, est lui aussi très important. En effet, certaines souches de Staphylococcus aureus sont capables de produire des entérotoxines, dont l'ingestion par le consommateur entraîne une intoxination, source de nausées, douleurs abdominales et surtout vomissements violents et répétés souvent accompagnés de diarrhée. Les toxi- infections alimentaires à staphylocoques représentent ainsi une des premières toxi- infections alimentaires d'origine bactérienne. La dissémination se produit généralement par les animaux et l'homme qu'ils soient malades ou porteurs sains, par le lait cru (mammites), par l'air et les surfaces ou le matériel contaminés au contact d'aliments et de porteurs sains ou infectés. La détection et l'identification dans les aliments des staphylocoques et en particulier des staphylocoques à coagulase positive, tels que Staphylococcus aureus, constituent donc un enjeu de santé publique majeur. Parmi les milieux de culture utilisés pour la détection, l'identification et la numération des bactéries du genre Staphylococcus, on distingue les milieux non sélectifs tels le milieu Columbia ou la gélose trypticase-soja et les milieux lectifs, tels la gélose Chapman et la gélose Baird-Parker. S. aureus peut aussi être détecté sur une gélose au sang en fonction de ses caractéristiques morphologiques et de son profil d'hémolyse mais cette méthode n'est que peu ou pas utilisée dans l'industrie agro-alimentaire. Le bouillon coeur-cervelle est également employé de façon usuelle pour la recherche de staphylocoques. Les milieux de culture bactériologiques spécifiques favorisent la croissance de certains microorganismes et limitent celle des autres. Ils contiennent au moins un agent inhibiteur de microorganismes autres que le pathogène cible. L'effet des inhibiteurs doit rester limité sur le microorganisme d'intérêt, d'autant que le dit microorganisme d'intérêt peut être endommagé dans les préparations alimentaires élaborées. La gélose Chapman correspond à un milieu hyper salin sur une base nutritive ordinaire, utilisant le mannitol comme substrat dont la fermentation est révélée par un indicateur de pH. Ledit indicateur de pH peut être un indicateur coloré ou un indicateur fluorescent. Dans le cas d'un indicateur fluorescent, on pourra mesurer soit une apparition, soit une extinction de fluorescence. Le milieu de Baird-Parker correspond à une base nutritive riche additionnée de tellurite de potassium et de chlorure de lithium, agents sélectifs communément utilisés pour la croissance de Staphylococcus aureus. Le chlorure de lithium est un inhibiteur des entérocoques. D'autres éléments chimiques peuvent être combinés avec le tellurite de potassium et le chlorure de sodium ou de lithium : le sulfate d'ammonium, l'acide sorbique, la glycine, la polymyxine B. Néanmoins, l'analyse des matrices alimentaires pour les staphylocoques potentiellement toxinogènes présente des problèmes spéciaux qui limitent l'utilisation pratique des méthodes développées pour la clinique. En effet, les milieux couramment proposés permettent aussi la croissance et, selon le caractère phénotypique recherché, la détection des staphylocoques à coagulase négative qui ne sont pas considérés comme des agents de contamination alimentaire. Les milieux de culture permettant la croissance des staphylocoques à coagulase positive, tout en inhibant au moins partiellement la croissance des staphylocoques à coagulase négative, reposent essentiellement sur l'utilisation de colistine, qui est un antibiotique de la famille des polymyxines. Bien que polyvalents en terme d'utilisation, de tels milieux sont plus particulièrement utilisés dans le domaine agroalimentaire, pour la détection des staphylocoques à coagulase positive potentiellement présents dans les produits alimentaires. Or, dans le cas de telles applications, il se produit des problèmes de spécificité dus à l'inactivation de la colistine par le prélèvement. En effet, la colistine s'avère être sensible aux cations. Aussi, lorsque le prélèvement est riche en cations, ce qui est le cas des produits laitiers en raison d'une teneur importante en Calcium, il peut se produire une inactivation totale de la colistine, empêchant par là même, toute discrimination entre les staphylocoques à coagulase positive et les staphylocoques à coagulase négative. Il ressort de cet état des lieux qu'il n'existe pas, à ce jour, de milieu de culture permettant à la fois de favoriser la croissance, la détection et le dénombrement de Staphylococcus aureus, et de limiter la croissance de staphylocoques à coagulase négative et celle des bactéries à Gram négatif, à partir d'échantillons complexes. Eu égard aux problèmes soulevés par l'état de la technique considéré ci dessus, un des objectifs essentiels de la présente invention est de favoriser la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive dans le but de les détecter et/ou les identifier et/ou les dénombrer. Un autre objectif essentiel de la présente hvention est de limiter, sur un milieu culture, la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase négative susceptibles d'interférer dans la détection, l'identification ou la numération de bactéries à coagulase positive soit par une flore annexe trop importante (problème de sélectivité), soit par une réaction aspécifique (problème de spécificité du marqueur phénotypique recherché). Un autre objectif de l'invention est de pallier l'inhibition de la colistine ou des polymyxines, utilisées dans un milieu de culture, par les cations présents dans un 10 échantillon ou dans ledit milieu de culture. Ces objectifs, parmi d'autres, sont atteints par la présente invention qui concerne en premier lieu un milieu de culture permettant la croissance sélective des staphylocoques à coagulase positive, ledit milieu comportant en outre au moins un composé du type 15 aminoglycoside à titre d'inhibiteur des bactéries à coagulase négative. Le composé de la famille des aminoglycosides ou aminosides est préférentiellement choisi parmi les produits suivants : 1'amikacine, la gentamicine, la kanamycine, la néomycine, la nétilmicine, la paronomycine ou la streptomycine. Préférentiellement, les 20 aminoglycosides sont utilisés à une concentration comprise entre 0,2 et 10 mg/l. Selon un variante de l'invention, les composés de la famille des aminoglycosides sont utilisés en complément des autres agents sélectifs, éléments chimiques ou composés antibactériens, classiquement utilisés dans les milieux de culture et dont des exemples sont donnés supra. 25 Ainsi, le milieu de culture selon l'invention peut contenir de la colistine. Dans un mode de réalisation préférentiel, le milieu de culture selon l'invention se présente sous forme liquide. En effet, cette forme est particulièrement adaptée à 1' analyse microbiologique alimentaire, qui peut nécessiter une phase de malaxage des échantillons solides dans le milieu de culture, pour permettre la libération des microorganismes 30 potentiellement présents dans lesdits échantillons. Avantageusement, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en outre un substrat permettant de révéler une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou chromogène. Pour une détection indirecte, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant la croissance des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4- méthylumbelliferone, les dérivés de 1'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine Selon un premier mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en contrôle microbiologique alimentaire. Préférentiellement, il est utilisé pour la croissance et la numération de Staphylococcus aureus dans les produits laitiers. Selon un autre mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en contrôle microbiologique de l'environnement. Par environnement, on entend des prélèvements d'air, des prélèvements d'eau, ou des prélèvements de surfaces. Parmi les prélèvements de surfaces, l'objet de l'invention peut trouver une application particulière dans la détection en milieu hospitalier des staphylocoques à coagulase positive responsables d'infections nosocomiales. Selon un autre mode de réalisation, le milieu sélectif objet de l'invention est utilisé en analyse clinique pour détecter et/ou identifier et/ou dénombrer Staphylococcus aureus. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu sélectif objet de l'invention peut comporter en outre un marqueur de résistance, par exemple dans le cadre d'un test de résistance d'une souche de Staphylococcus aureus à la méthicilline. Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation in vitro d'un aminoglycoside dans un milieu sélectif pour limiter la croissance des staphylocoques à coagulase négative et favoriser la croissance des staphylocoques à coagulase positive.30 Enfin, un dernier objet de la présente invention concerne un procédé de détection et/ou l'identification des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : • Ensemencer un milieu de culture selon l'invention, avec un échantillon biologique, susceptible de contenir des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; • Mettre le milieu de culture ainsi ensemencé dans des conditions aptes à permettre la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; et • Mesurer la variation du niveau de fluorescence dans le milieu de culture à l'aide d'un lecteur de fluorescence, cette diminution correspondant à un variation du pH dans ledit milieu de culture. De façon préférentielle, l'échantillon biologique est un échantillon clinique, alimentaire ou environnemental. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1: Effet de la Kanamycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Une gamme de concentration de kanamycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4- méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 mg/1 de Kanamycine. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/-croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau I ci-dessous : TABLEAU I Kanamycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 2.5 mg/I 3 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + +1- +1- aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + +1- - aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + +/- +/- - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + +/- - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + - - warneri 04 07 185 Staphylococcus Exemple 2 : Effet de la Streptomycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Une gamme de concentration de Streptomycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 mg/1 de Kanamycine. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne -croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau II ci dessous : TABLEAU II Streptomycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 2.5 mg/I 3 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + +1- - - aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + + + + + + arlettae 92 03 375 Staphylococcus + + - - - - carnosus 97 03 075 Staphylococcus + + + - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + + + +/-+/- lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + + + warneri 04 07 185 Staphylococcus Exemple 3: Effet de l'Amikacine et de la Néomycine sur la croissance de Staphylococcus aureus et de staphylocoques à coagulase négative en milieu type Chapman. Une gamme de concentration d'Amikacine ou de Néomycine a été ajoutée à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman mais sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés comprennent respectivement 0 ; 1 ; 1,5 ; 2 mg/1 d'Amikacine et 1 ; 1,5 et 2 mg/1 de Neomycine. Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-dessous :25 TABLEAU III Amikacine Neomycine à 0 g/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I 1 mg/I 1.5 mg/I 2 mg/I souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + + - -aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 1 2 082 Staphylococcus + + + + +1- - - aureus QI 361 Staphylococcus + - - - - - -arlettae 92 03 375 Staphylococcus + - - - +1- +1- +1- carnosus 97 03 075 Staphylococcus + - - - - - - gallinarum 85 07 67 Staphylococcus + + +/-+/- - - - lentus 86 01 030 Staphylococcus + + + + - - - warneri 04 07 185 D'après ce tableau, l'amikacine permet l'inhibition de la majorité des staphylocoques à coagulase négative sans aucun impact sur la croissance de S. aureus. La neomycine, quant à elle, inhibe les staphylocoques à coagulase négative mais entraîne aussi un retard de croissance des S. aureus. Aussi cet exemple montre qu'en fonction du milieu, l'aminoglycoside et sa concentration sont à adapter. D'autre part, il est aussi envisageable de coupler plusieurs aminoglycosides ensemble en réduisant bien sûr les concentrations de chacun d'eux afin d'augmenter le nombre d'espèces à inhiber. Exemple 4: Gamme croisée en aminoglycosides et un autre antibiotique la Colistine en milieu type Chapman Différentes concentrations d'Amikacine, de Kanamycine et de Colistine ont été ajoutées à un milieu de culture liquide ayant comme composition de base le milieu Chapman sans agar. L'indicateur de pH utilisé est la 4-méthylumbelliferone. La détection de l'acidification du Mannitol est réalisée grâce à un fluorimètre. Les milieux testés sont les suivants : milieu 1 2 3 4 5 6 7 Colistine (en mg/1) 30 40 50 30 40 30 40 Amikacine (en mg/1) 1,5 1,5 1,5 2 2 1,5 1,5 Kanamycine (en mg/1) 0 0 0 0 0 1 1 Des micro-organismes issus de la collection de la Demanderesse ont été inclus dans ces milieux à partir d'une suspension à 0,5 McFarland. Les milieux ont été incubés à 37 °C pendant 24 heures. Les lectures sont réalisées à l'aide d'un fluorimètre après 24 heures d'incubation. Les résultats sont exprimés selon l'échelle suivante : + croissance +/- croissance moyenne - croissance nulle Les résultats sont présentés dans le tableau IV ci dessous : TABLEAU IV milieu 1 2 3 4 5 6 7 souches croissance croissance croissance croissance croissance croissance croissance Staphylococcus + + + + + + + Aureus 97 04 026 Staphylococcus + + + + + + + aureus 87 12 082 Staphylococcus + + + + + + + aureus QI 361 Staphylococcus + +/- - + - +/- - lentus Q I34 Staphylococcus +1- +1- +1- +1- - - - pasteurii 88 06 012 D'après ce tableau, la combinaison de plusieurs antibiotiques permet d'améliorer l'inhibition des staphylocoques à coagulase négative sans inhiber de S. aureus. Ces REVENDICATIONS 1. Milieu de culture spécifique pour la croissance, la détection, l'identification et/ou la numération des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit milieu étant caractérisé par le fait qu'il comporte au moins un composé du type aminoglycoside, à titre d'inhibiteur des bactéries staphylocoques à coagulase négative. 2. Milieu de culture selon la revendication 1, dans lequel la concentration en aminoglycoside est comprise entre 0,2 et 10 mg/1 inclus. 3. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le(s) composé(s) du type aminoglycoside est pris dans le groupe comprenant : l'amikacine, la gentamicine, la kanamycine, la néomycine, la nétilmicine, la paronomycine ou la streptomycine. 4. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, comportant en outre de la colistine. 5. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, se présentant sous forme 20 liquide. 6. Milieu de culture selon l'une des revendications précédentes, comportant en outre un marqueur direct de la croissance des staphylocoques à coagulase positive, ledit marqueur étant un substrat chromogène ou fluorescent. 7. Milieu de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comportant en outre un substrat et un marqueur indirect de la croissance des staphylocoques à coagulase positive, ledit marqueur étant un indicateur de pH chromogène ou fluorescent. 30 8. Utilisation in vitro d'aminoglycosides dans un milieu de culture sélectif pour limiter la croissance des staphylocoques à coagulase négative et favoriser la croissance des staphylocoques à coagulase positive. 15 25 9. Utilisation d'un milieu de culture selon les revendications 1 à 7, pour détecter et/ou caractériser et/ou dénombrer des bactéries staphylocoques à coagulase positive dans un échantillon complexe. 10. Utilisation d'un milieu de culture selon les revendications 1 à 7, pour le contrôle microbiologique alimentaire, le contrôle microbiologique de l'environnement ou l'analyse médicale. 10 11. Procédé de croissance, de détection, d'identification et/ou de numération des bactéries staphylocoques à coagulase positive, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : • Ensemencer un milieu de culture selon l'une des revendications 1 à 7, avec un échantillon biologique, susceptible de contenir des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; 15 • Mettre le milieu de culture ainsi ensemencé dans des conditions aptes à permettre la croissance des bactéries staphylocoques à coagulase positive ; et • Mesurer la variation du niveau de fluorescence dans le milieu de culture à l'aide d'un lecteur de fluorescence, cette variation correspondant à un variation du pH dans ledit milieu de culture. 20 12. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'échantillon biologique est un échantillon clinique, alimentaire ou environnemental.5