Brevet FR2917171A1 — publié le 20081212

Méthode de détection d'une molécule d'intérêt dans un échantillon liquide DESCRIPTION Domaine technique La présente invention se rapporte à une méthode de détection par immunochromatographie d'une molécule d'intérêt. Elle se rapporte également à une trousse de détection et à un support de détection utilisables pour la mise en oeuvre de la méthode de la présente invention. La présente invention trouve une application notamment dans la détection de molécules de faible poids moléculaire dans des liquides corporels. Etat de la technique Il existe de nombreuses méthodes permettant la détection d'une molécule dans un échantillon liquide, en particulier des immuno-essais. Il existe de nombreux immuno-essais permettant le dosage d'haptènes, c'est à dire des molécules biologiques de petite taille d'origine naturelle ou obtenues par voie synthétique. De telles molécules peuvent par exemple être des composants actifs de médicaments, des hormones, des anabolisants, des pesticides... Ces petites molécules qui ne présentent qu'un site antigénique, ne peuvent pas être detectées au moyen d'un système sandwich , qui nécessite au moins deux sites antigéniques, l'antigène étant dans ce cas reconnu par deux anticorps. Les tests immunochrommatographiques actuels utilisent généralement un système par compétition pour la détection de molécules : lorsqu'un échantillon liquide susceptible de contenir une molécule à détecter est mis à migrer le long d'un support de détection comprenant une zone comprenant un conjugué marqué puis une zone comprenant un anticorps dirigé contre la molécule à détecter et le conjugué marqué, une compétition a lieu entre ladite molécule et le conjugué marqué. Si la molécule à détecter n'est pas présente à une concentration importante, l'anticorps est saturé par le conjugué marqué. On peut donc conclure à un test négatif, alors que la molécule à détecter peut être présente mais à une concentration insuffisante pour entrer en compétition avec le conjugué marqué. Un tel système présente donc l'inconvénient de ne pas être suffisamment sensible, la molécule ne pouvant être détectée qu'à des concentrations élevées. Il existe d'autres méthodes permettant de détecter des molécules dans des échantillons à des concentrations plus faibles, mais celles-ci doivent alors être réalisées en laboratoire et, du fait de l'utilisation d'appareils sophistiqués, la mise en oeuvre de ces méthodes est coûteuses. Il existe donc un réel besoin de mise au point d'une méthode permettant de détecter une molécule d'intérêt dans un échantillon liquide à de faibles concentrations, pour un faible coût et d'utilisation simple. Cette détection à partir de liquide corporel devrait pouvoir être réalisée rapidement et sans analyse de laboratoire, par exemple lors des contrôles routiers pour la détection de stupéfiants chez un individu. De nombreuses méthodes de détection ont donc été développées afin de pouvoir détecter rapidement et facilement la présence de stupéfiants à partir de liquide corporel, notamment à partir de la salive dont le prélèvement est aisé. Malheureusement, les techniques de l'art antérieur ne permettent pas de détecter la présence de stupéfiants à de faibles concentrations, il n'est donc pas toujours possible d'identifier une consommation de stupéfiants remontant à plusieurs heures ou à de faibles doses. Par exemple, les tests permettant la détection de THC à partir d'un prélèvement de salive utilisés aujourd'hui présentent un seuil de détection supérieur à 20ng/ml, ce qui n'est pas satisfaisant.(Voir par exemple JM Walsh et al.) Description de l'invention La présente invention répond précisément aux besoins précités et surmonte les inconvénients de l'art antérieur, en fournissant une méthode très sensible, de faible coût, rapide, et facile à mettre en oeuvre. La méthode de détection de la présente invention est une méthode de détection par immunochromatographie d'une molécule d'intérêt dans un échantillon liquide comprenant les étapes successives suivantes : (a) la mise en contact de l'échantillon liquide avec un premier anticorps qui se lie spécifiquement à ladite molécule d'intérêt si celle-ci est présente dans l'échantillon, (b) la mise en contact du premier anticorps avec un conjugué marqué en même temps ou après la mise en contact dudit premier anticorps avec l'échantillon, (c) puis, la mise en contact dudit premier anticorps avec un second anticorps dirigé contre le premier anticorps, ledit second anticorps étant immobilisé sur un support de détection au niveau d'une zone test dudit support, et (d) l'analyse de la zone test du support pour détecter, par différence par rapport au conjugué marqué, la présence éventuelle de ladite molécule d'intérêt. On entend par une méthode de détection par immunochromatographie une méthode de détection qui permet de déterminer la présence d'un composant en utilisant des réactions antigène-anticorps sur un support de détection (Millipore's short guide for developing immunochromatographic test strips (2nd edition) ; Michael G. Welter, Immunochromatographic techniques, Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :635-645). On entend par molécule d'intérêt tout analyte détectable par la méthode de la présente invention. S'agissant d'une méthode de détection 3 immunochrommatographique, l'homme du métier comprendra implicitemment que cet analyte présente au moins un épitope. En particulier, la molécule d'intérêt peut être un peptide, une protéine, une glycoprotéine, un haptène. On entend par haptène une molécule ne présentant qu'un épitope. La molécule d'intérêt peut par exemple être un stupéfiant, un principe actif médicamenteux, un pesticide, une hormone, une toxine ou toute autre molécule toxique. Les stupéfiants qui peuvent être détectés par la méthode de la présente invention sont par exemple le delta-9-tétrahydrocannabinol(THC), la D-amphétamine, la D-methamphetamine, la méthadone, la benzoylecgonine, la D,L Methylenedioxymethamphetamine, la phencyclidine, la nortryptiline ou dérivés ou des molécules de la famille des barbituriques, des benzodiazépines, de la morphine. Par échantillon liquide on entend par exemple un échantillon provenant d'un liquide corporel, d'un prélèvement d'eau susceptible d'être polluée, d'un extrait de plante, des stupéfiants prélevés sur des surfaces solides et remis en solution. Le prélèvement peut être utilisé pur ou être dilué. Le prélèvement peut subir un traitement préalable à la mise en oeuvre de la méthode de la présente invention. A titre, d'exemple de traitement, on peut citer les méthodes de purification, de filtration, de centrifugation, des traitements permettant l'inhibition de certaines enzymes. Le prélèvement peut être réalisé immédiatement avant la mise en oeuvre de la présente invention ou préalablement. L'échantillon liquide peut être utilisé directement après prélèvement pour la mise en oeuvre de la méthode de la présente invention ou être conservé, par exemple par congélation, pour une mise en oeuvre ultérieure de la méthode selon la présente invention. De préférence, l'échantillon liquide est un liquide corporel ou provient d'un liquide corporel. Parmi les liquides corporels dont peuvent être issus l'échantillon liquide, on peut citer par exemple la salive, l'urine, le lait, le sang, la sueur, le liquide céphalo-rachidien et le liquide synovial. De préférence, le liquide corporel est choisi dans le groupe comprenant la salive, l'urine, le lait, le sang, la sueur et le liquide céphalo-rachidien. La présente invention trouve par exemple une application pour la détection d'une molécule d'intérêt dans un liquide corporel prélevé sur un mammifère, par exemple sur un être humain. La méthode selon la présente invention peut par exemple être utilisée pour détecter la présence de delta-9-tétrahydrocannabinol chez un individu à partir d'un prélèvement de salive. Le premier anticorps utilisé dans la présente invention peut être préparé selon les méthodes connues de l'homme du métier, par immunisation d'animaux vertébrés avec la molécule d'intérêt (UCB Berkeley Animal care and use committee, Guidelines for polyclonal antibody production in laboratory animais, Revised and approved August 2006 ; http://www.chimie-biochimie.umoncton.ca/bch/dg/siitub/idprepab.html). Le premier anticorps peut par exemple être préparé en utilisant la techniques des anticorps recombinants (MORPHOSYS : HuCAL ANTIBODIES TECHNICAL MANUAL, http://www.ab-direct.com/uploads/huCAL-Technical-Manual.pdf). Les anticorps obtenus peuvent être purifiés par exemple par chromatographie d'affinité. De préférence, les anticorps sont obtenus par transformation de cellules productrices d'anticorps des animaux immunisés en hybridomes, selon les méthodes connues, et clonage des cellules hybrides produisant les anticorps souhaités ( Galfrè G, Howe S C, Milstein C, Butcher G W & Howard J C, Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell fines, Nature 266:550-2, 1977, MRC, Lab. Molecular Biology, and ARC, Inst. Animal Physiology, Cambridge, England; http://www.chimiebiochimie.umoncton.ca/bch/dg/siitub/idprepab.html; Kôhler G & Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-7, 1975; Cotton R G H & Milstein C, Fusion of two immunoglobulin-producing myeloma cells, Nature 244:42-3, 1973). Le premier et le deuxième anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Le deuxième anticorps peut par exemple être un anticorps anti-espèce du premier anticorps. A titre d'exemple, le premier anticorps peut être choisi dans le groupe comprenant un anticorps de souris, de lapin, de chèvre, de singe, d'âne et le second anticorps sera choisi dans le groupe comprenant un anticorps antisouris, un anticorps anti-lapin, un anticorps anti-chèvre, un anticorps anti-singe, un anticorps anti-âne respectivement. Ces anticorps sont disponibles par exemple auprès des fournisseurs Arista Biologicals, Lampire Biological Laboratories, Sigma Aldrich et AbD Serotec. Le deuxième anticorps peut être immobilisé sur le support de détection au moyen de tout type d'interactions connues de l'homme du métier et permettant l'immobilisation sur ledit support. (IVD Technology, January 2002, Qualification of cellulose nitrate membranes for lateral-flow assays. Hans H. Beer, Eric Jallerat, Karl Pflanzz, and Timo M. Klewitz; http://www.devicelink.com/ivdt/archive/02/01/002.html, Millipore, Immobilization of Protein to Millipore 96-Well Membrane-Bottom Plates, TN013, December 18, 1991). On peut citer comme interaction permettant l'immobilisation du deuxième anticorps sur le support de détection les liaisons ioniques, les liaisons covalentes, les interactions hydrophobes. Le premier anticorps peut être sous forme lyophilisée avant la mise en oeuvre de la présente invention.30 Dans le cas où le premier anticorps est sous forme lyophilisée, l'étape (a) est réalisée par mise en contact de l'échantillon liquide avec l'anticorps lyophylisé préalablement ou non reconstitué avec une solution tampon de reconstitution. La reconstitution du premier anticorps lyophilisé peut par exemple être réalisée à l'étape (a) par mise en contact de l'échantillon liquide avec l'anticorps lyophilisé sans reconstitution préalable. Alternativement, la reconstitution du premier anticorps lyophilisé peut par exemple être réalisée préalablement à l'étape (a) par mise en contact d'une solution tampon de reconstitution avec l'anticorps lyophilisé. De préférence, la concentration du premier anticorps est telle que ledit premier anticorps est saturé par la molécule d'intérêt si elle est présente dans l'échantillon liquide à une concentration au moins égale à un seuil de détection déterminé. De préférence, la concentration du premier anticorps est suffisante pour générer un signal détectable lorsque la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon. De manière encore plus préférée, la concentration du premier anticorps est telle que ledit premier anticorps est saturé si la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon à une concentration au moins égale à un seuil de détection déterminé, et suffisante pour générer un signal détectable lorsque la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon. Le seuil de détection dépend bien entendu du mode de réalisation utilisé pour la méthode selon la présente invention, de l'échantillon liquide à tester et de la molécule d'intérêt à détecter. Des exemples illustrant les méthodes d'étalonnage permettant de déterminer des seuils de détection sont donnés ci-dessous à titre illustratif de la présente invention. Les techniques d'étalonnage bien connues de l'homme du métier permettent d'optimiser les concentrations du premier anticorps et du deuxième anticorps pour la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention. Différentes concentrations du premier anticorps sont testées afin d'obtenir le seuil de détection souhaité. De manière préférée, la concentration du premier anticorps est comprise entre 10 et 500 ng/mL, de préférence entre 50 et 100 ng/mL. La concentration du premier anticorps pourra être ajustée en fonction du degré de purification de l'anticorps et de son affinité pour la molécule d'intérêt. De manière préférée, le deuxième anticorps est en excès par rapport au premier anticorps. De manière préférée, la concentration du deuxième anticorps est comprise entre 0,1 et 4 mg/mL, plus préférentiellement entre 0,1 et 1 mg/mL. De manière préférée, le deuxième anticorps est déposé sur le support de détection à une quantité comprise entre 0,02 pg et 0,40 pg par support de détection. De préférence, la longueur de la zone de détection, correspondant à la largeur du support de détection, est de 4 mm et la largeur de la zone de détection est comprise en moyenne entre 0.1 et 1.5 mm, de préférence entre 0,3 et 0,8mm. De préférence, le conjugué marqué est en excès par rapport au premier anticorps. De préférence, le premier anticorps est donc saturé par le conjugué marqué si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon liquide, ou si elle est présente à une concentration inférieure au seuil de détection. Par se lie spécifiquement , on entend qu'un épitope de la molécule d'intérêt ou du conjugué marqué va être reconnu par le premier anticorps. On entend par conjugué marqué une molécule couplée à un agent de marquage et susceptible d'être reconnue par le premier anticorps. Le couplage entre le conjugué marqué et l'agent de marquage peut être réalisé par exemple au moyen de liaisons covalentes (Duke Scientific, Note technique -013C, 1 er mai 2004 ; Estapor, Coupling on carboxylated particles, htt).//www.merck.de/servlet!PD/menu/ 1 31 9i 0/indexhtrl), de liaisons par adsorption, de liaisons passives au moyen de particules d'or colloïdal (Verheijen, R., Stouten, P., Cazemier, G., and Haasnoot, W. 1998, Development of a one step strip test for the detection of sulfadimidine residues, Analyst 123:2437-2441, http://www.rsc.org/delivery/_ArticleLinking/DisplayArticleForFree. cfm?doi=a804 695f&JournalCode=AN). L'agent de marquage peut être tout système permettant la détection du conjugué, comme par exemple une enzyme, un marqueur radioactif, un marqueur fluorescent ou luminescent, une particule colorée etc... Parmi les agents de marquages utilisés, on peut citer par exemple les microparticules de latex, les microparticules d'or colloïdal (http_//,tif ,tif_vedaIab_,c{ {m/ nstr{ menLht ), les microparticules de polystyrène ou dérivés du polystyrène (Polystyrene and carboxylate modified microparticles february 1999, http://www.seradyn.com/technical/pdf/polystyrene.pdf), lesdites particules pouvant être fluorescentes ou non fluorescentes (Biosite :http:l'Iwww,biositecom overviewltechnologv.aspx, RAMP http://www.responsebio.com/pdf/RAMP%20Fluorescence%20Technology_Biod efense.pdf), magnétisées ou non magnétisées (htts://Www. evicelink.com/ivrdt/archive/06/O7/0i 1htm1), les fluorochromes et les agents de marquages sous forme de liposomes (Environmental health Perspectives, vol. 110, number 10, oct. 2002 P.587-589, Anal Bioanal Chem (2005) 3822: 1217-1226). L'analyse pour détecter, par différence par rapport au conjugué marqué, la présence éventuelle de la molécule d'intérêt est réalisée par détection du signal du marqueur, duquel on déduit la présence éventuelle de la molécule d'intérêt. La détection du signal du marqueur peut être réalisée avec ou sans utilisation d'une instrumentation spécifique pour la détection d'un signal, en fonction du marqueur utilisé. A titre d'exemple d'intrumentation permettant la détection du signal, on peut citer les lecteurs de fluorescence, les lecteurs magnétiques, les lecteurs colorimétriques. (Biosite :tp:tly~__s{_a{{ipyryil{açy:spx, RAMP http://www.responsebio.com/pdf/RAMP%20Fluorescence%20Technology_Biod efense.pdf) Une analyse quantitative peut être réalisée, l'intensité du signal diminuant avec l'augmentation de la concentration de la molécule d'intérêt dans l'échantillon à tester. De manière préférée, le marqueur utilisé pour une analyse quantitative est un fluorochrome directement lié au conjugué. L'analyse quantitative peut être réalisée grâce à un lecteur à fluorescence couplé à un logiciel permettant la quantification du signal. L'utilisation du logiciel permettra donc d'obtenir un résultat quantitatif. Une analyse semi-quantitative peut également être réalisée sans utilisation d'une instrumentation spécifique. Cette analyse peut être réalisée en utilisant une charte de couleur étalonnée que l'on compare avec l'intensité de la zone test. L'intensité de la zone test varie de façon inverse à la concentration de la molécule d'intérêt. Le support de détection utilisé est de préférence un support permettant la migration de l'échantillon liquide. De préférence, le support de détection se présente sous forme de feuille ou de membrane, par exemple sous la forme d'une carte, d'un ruban ou d'une bandelette (Millipore'S short quide for developing immunochromatographic test strips (2nd Edition) ; Whatman Cat No. 59036-2153) . Le support de détection utilisé peut par exemple être une membrane cellulosique ou une membrane en papier de fibres de verre (Millipore'S short quide for developing immunochromatographic test strips (2nd Edition) ; Whatman Cat No. 59036-2153) . A titre de membrane cellulosique, on peut citer notamment les membranes en nitrocellulose ou en esters de cellulose mixtes d'acides nitrique et d'autres acides (Millipore'S short quide for developing immunochromatographic test strips (2nd Edition) ; Whatman Cat No. 59036-2153). Il est entendu que des supports ayant une autre forme et/ou une autre nature peuvent évidemment être utilisés pour la mise en oeuvre de la présente invention. De manière préférée, le support de détection utilisé est une membrane de nitrocellulose (Advanced Microdevices Pvt. Ltd., Sartorius, Whatman, Millipore). La taille des pores du support de détection varie généralement entre 5 et 100 microns selon les références de ces produits. D'autres types de supports peuvent être utilisés, comme par exemple une membrane en fibre de cellulose (Fusion 5 de société Whatman). Le support de détection peut comporter différentes zones, dont au moins une zone test sur laquelle le deuxième anticorps est immobilisé. On entend par zone test du support la zone qui présente, après la mise en oeuvre de la méthode selon la présente invention, le conjugué marqué si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon liquide. L'analyse de l'étape (d) de la présente invention est de préférence réalisée par analyse de la zone test. De manière préférée, le support de détection peut de plus comporter une 15 ou plusieurs des zones choisies dans le groupe comprenant : - une zone de contrôle située en aval de la zone test dans le sens de migration ; - une zone comprenant le conjugué marqué situé en amont de la zone test dans le sens de migration ; 20 - une zone comprenant le premier anticorps situé en amont de la zone comprenant le conjugué marqué dans le sens de migration ; et - une zone de dépôt, en amont des autres zones dans le sens de migration. 25 De préférence, lorsque le support de détection comporte plusieurs zones, ces zones sont clairement distinctes et séparées par des zones de migration. Lorsque le premier anticorps et/ou le conjugué marqué sont présents sur le support de détection avant tout contact avec l'échantillon liquide, ceux-ci 30 peuvent par exemple être déposés sur le support de détection par vaporisation sur le support de détection ou par imprégnation du support de détection suivie d'un séchage (Biodot : http://www.biodot.com/technologies/technoloqies dispensinq.htm). La vaporisation peut être réalisée au moyen d'un dispenseur (par exemple le dispenseur DCI-300 de Zeta Corporation ou l'appareil IsoFIowTM Reagent Dispenser d'Imagene Technology). De préférence, la vaporisation au moyen d'un dispenseur sera réalisée en présence d'air comprimé, qui permet une répartition homogène, espacée et régulière du premier anticorps et/ou du conjugué marqué (Biodot :http://www.biodot.com/technologies/technoloqies dispensinq.htm). L'imprégnation peut être réalisée en immergeant le support de détection dans une solution contenant le premier anticorps et/ou le conjugué marqué. Le support de détection peut ensuite être séché sur un support. De préférence, l'immobilisation du deuxième anticorps sur le support de détection est réalisé par vaporisation, de préférence au moyen d'un dispenseur. La vaporisation permet d'obtenir une zone test de surface prédéterminée. On entend par sens de migration , le sens dans lequel l'échantillon liquide migre de manière préférentielle. Dans le cadre de la présente invention, le premier contact entre l'échantillon liquide et le support de détection s'effectue de préférence à une extrémité du support de détection, de préférence au niveau de la zone de dépôt, puis l'échantillon liquide migre par capillarité de façon à atteindre successivement les différentes zones du support de détection telles que définies ci-avant. Si l'analyse du support de détection révèle la présence du conjugué marqué au niveau de la zone test, elle permet de conclure à un test négatif, ce qui signifie que la molécule d'intérêt est absente de l'échantillon liquide, ou présente à une concentration inférieure au seuil de détection. Un test négatif, permet de mettre en évidence la présence d'un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/conjugué marqué au niveau de la zone test. Si l'analyse du support de détection révèle une absence du conjugué marqué au niveau de la zone test, alors on peut conclure à un test positif, et donc que la molécule d'intérêt est bien présente dans l'échantillon liquide à une concentration supérieure ou égale au seuil de détection. Un test positif permet de mettre en évidence la présence d'un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/molécule d'intérêt au niveau de la zone test. On entend par seuil de détection la plus petite concentration de molécule d'intérêt détectable dans un échantillon liquide par la méthode selon la présente invention. Ce seuil de détection de la méthode selon la présente invention peut dépendre notamment de la molécule d'intérêt elle-même, du milieu dans lequel la molécule est recherchée, de la méthode de détection utilisée, du temps d'incubation entre la molécule d'intérêt présente dans l'échantillon et l'anticorps anti-THC. Ce seuil de détection peut aisément être déterminé par l'homme du métier et des exemples de détermination sont donnés plus loin à titre illustratifs. La méthode de détection selon la présente invention permet par exemple de détecter des concentrations de THC dans un échantillon liquide à des concentrations inférieures à 20 ng/mL, de préférence inférieure à 10 ng/mL, et encore plus préférentiellement inférieure à 4ng/mL. Un seuil de détection de 4ng/mL correspond aux exigences de l'organisme américain Samsha (WALSH). De manière préférée, la méthode de détection selon la présente invention comprend de plus une étape de contrôle permettant la mise en évidence d'une réaction antigène /anticorps différente. On entend par étape de contrôle une étape qui permet de vérifier que le test s'est déroulé correctement, et en particulier qu'un volume suffisant de liquide est présent pour permettre le bon déroulement de la méthode selon la présente invention et qu'une migration suffisante de l'échantillon liquide a été obtenue. La réaction antigène/anticorps de la zone contrôle peut être réalisée par reconnaissance par un troisième anticorps d'une molécule marquée. L'agent de marquage de la molécule marquée peut être identique ou différent de celui du conjugué marqué. La molécule marquée permettant de réaliser le contrôle peut soit être ajoutée à l'échantillon liquide avant la mise en contact avec le support de détection, soit être présente sur le support de détection avant la mise en contact de l'échantillon avec le support de détection, dans une zone située en amont de la zone contrôle dans le sens de migration. Le troisième anticorps peut être immobilisé sur le support de détection au moyen de tout type d'interactions connues de l'homme du métier et permettant l'immobilisation sur ledit support (IVD Technology, January 2002, Qualification of cellulose nitrate membranes for lateral-flow assays. Hans H. Beer, Eric Jallerat, Karl Pflanzz, and Timo M. Klewitz, http://vvww.devicelink.com/ivdt/archive/02/01/002.html). On peut citer comme interaction permettant l'immobilisation du troisième anticorps sur le support de détection les liaisons ioniques, les liaisons covalentes, les interactions hydrophobes. Selon un premier mode de réalisation l'étape (a) peut être réalisée en milieu liquide sans contact avec le support de détection. Ainsi, le premier anticorps est mis en présence de l'échantillon liquide, par exemple en introduisant directement une solution contenant ledit premier anticorps dans l'échantillon liquide, ou inversement, en introduisant l'échantillon liquide dans une solution contenant le premier anticorps. Si la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon liquide, un complexe premier anticorps/molécule d'intérêt se forme donc au sein dudit échantillon liquide. Toujours selon ce premier mode de réalisation, l'étape (b) est également réalisée en milieu liquide sans contact avec le support de détection. La mise en contact du premier anticorps avec le conjugué marqué peut être réalisée par exemple en introduisant directement une solution contenant ledit conjugué marqué dans l'échantillon liquide obtenu après l'étape (a), ou inversement, en introduisant l'échantillon liquide obtenu après l'étape (a) dans une solution contenant ledit conjugué marqué. Ainsi, si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon, ou si elle est présente mais à une concentration inférieure au seuil de détection, alors un complexe premier anticorps/conjugué marqué se forme au sein dudit échantillon liquide. La mise en contact telle que définie à l'étape (c), est réalisée après mise en contact de l'échantillon liquide avec le support de détection, et migration de l'échantillonliquide sur le support de détection. Lors de l'étape (c), un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/conjugué marqué se forme si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon ou si elle est présente en quantité inférieure au seuil de détection. Si la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon, alors un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/molécule d'intérêt se forme. La mise en contact de l'échantillon liquide avec le deuxième anticorps telle que décrite à l'étape (c) peut-être réalisée en immergeant dans l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non, et préalablement mis en contact avec le premier anticorps et le conjugué marqué, une partie du support de détection en amont de la zone test dans le sens de migration, en particulier par immersion de tout ou partie de la zone de dépôt. La mise en contact du premier anticorps avec le conjugué marqué telle que décrite à l'étape (c) peut également être réalisée par application d'une fraction de l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non, et préalablement mis en contact avec le premier anticorps et le conjugué marqué, sur le support de détection en amont de la zone test dans le sens de migration, en particulier par application sur la zone de dépôt. De manière préférée, le support de détection utilisé pour la mise en oeuvre du premier mode de réalisation selon l'invention ne comporte pas initialement le premier anticorps et le conjugué marqué. Selon un deuxième mode de réalisation, l'étape (b) peut être réalisée sur le support de détection, le conjugué marqué étant présent sur ledit support préalablement à l'étape (b), la mise en contact telle que définie à l'étape (c) étant réalisée par migration sur ledit support. L'étape (a) est réalisée comme décrit pour le premier mode de réalisation, c'est à dire qu'elle est réalisée en milieu liquide sans contact avec le support de détection. Ainsi, lors de l'étape (b) le conjugué marqué est mis en présence du premier anticorps seul, si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon, soit du complexe premier anticorps/molécule d'intérêt si la molécule est présente dans l'échantillon à une concentration suffisante pour saturer tous les premiers anticorps, soit à la fois du complexe et du premier anticorps seul si la molécule d'intérêt est présente mais à une concentration insuffisante pour saturer tous les sites de fixation des anticorps. La mise en contact du premier anticorps avec le conjugué marqué telle que décrite à l'étape (b) peut être réalisée en immergeant dans l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non et préalablement mis en contact avec le premier anticorps, une partie du support de détection en amont de la zone comprenant le conjugué marqué dans le sens de migration, en particulier par immersion de tout ou partie de la zone de dépôt. La mise en contact du premier anticorps avec le conjugué marqué telle que décrite à l'étape (b) peut également être réalisée par application d'une fraction de l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non et préalablement mis en contact avec le premier anticorps, sur le support de détection en amont de la zone comprenant le conjugué marqué dans le sens de migration, en particulier par application sur la zone de dépôt. L'étape (c) est alors réalisée par migration du complexe premier anticorps/conjugué marqué et/ou du complexe premier anticorps/molécule d'intérêt jusqu'à la zone test où le deuxième anticorps est immobilisé. Lors de l'étape (c), un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/conjugué marqué se forme si la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon ou si elle est présente en quantité inférieure au seuil de détection. Si la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon, alors un complexe deuxième anticorps/premier anticorps/molécule d'intérêt se forme. De manière préférée, le support de détection utilisé pour la mise en oeuvre du deuxième mode de réalisation selon l'invention ne comporte pas initialement le premier anticorps. Selon un troisième mode de réalisation, l'étape (a) peut être réalisée sur le support de détection, le premier anticorps étant présent sur ledit support de détection préalablement à l'étape (a). Les étapes (b) et (c) sont alors réalisées par migration sur le support de détection. La mise en contact de l'échantillon liquide avec le premier anticorps telle que décrite à l'étape (a) peut-être réalisée en immergeant dans l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non, une partie du support de détection en amont de la zone comprenant le premier anticorps dans le sens de migration, en particulier par immersion de tout ou partie de la zone de dépôt. La mise en contact du premier anticorps avec le conjugué marqué telle que décrite à l'étape (a) peut également être réalisée par application d'une fraction de l'échantillon liquide, dilué ou non, traité ou non, sur le support de détection en amont de la zone comprenant le premier anticorps dans le sens de migration, en particulier par application sur la zone de dépôt. Le support de détection utilisé pour la mise en oeuvre du troisième mode de réalisation selon l'invention comprend au moins : - une zone test comprenant le deuxième anticorps - une zone comprenant le conjugué marqué situé en amont de la zone test dans le sens de migration ; - une zone comprenant le premier anticorps situé en amont de la zone comprenant le conjugué marqué dans le sens de migration. Selon un quatrième mode de réalisation, les étapes (a) et (b) peuvent être confondues, le premier anticorps se liant de préférence à la molécule d'intérêt, lorsqu'il est en présence de ladite molécule d'intérêt et du conjugué marqué. Dans ce mode de réalisation, les étapes (a) et (b) peuvent être réalisées sans contact avec le support de détection, ou bien être réalisées sur le support de détection, le premier anticorps et la molécule d'intérêt étant alors présents sur le support de détection préalablement aux étapes (a) et (b). Dans ce mode de réalisation, le premier anticorps se lie de préférence à la molécule d'intérêt, ce qui signifie que le premier anticorps a une affinité plus importante pour la molécule d'intérêt que pour le conjugué marqué. Par exemple, le premier anticorps peut avoir une meilleure affinité pour la molécule d'intérêt que pour le conjugué marqué car le conjugué marqué a un encombrement stérique plus important que la molécule d'intérêt; le premier anticorps se lie donc plus facilement à la molécule d'intérêt qu'au conjugué marqué. Un deuxième aspect de l'invention concerne une trousse de détection d'une molécule d'intérêt comprenant un premier anticorps dirigé contre une molécule d'intérêt et contre un conjugué marqué, le conjugué marqué et un deuxième anticorps dirigé contre le premier anticorps. Un troisième aspect de l'invention concerne une support de chromatographie comprenant successivement dans le sens de migration d'un liquide sur ledit support: - une zone comprenant un premier anticorps dirigé contre une molécule d'intérêt et contre un conjugué marqué; - une zone comprenant ledit conjugué marqué ; - et une zone test comprenant un deuxième anticorps dirigé contre le premier anticorps, ledit deuxième anticorps étant immobilisé sur ledit support. De manière préférée, le support de chromatographie comprend de plus une zone de contrôle permettant la réalisation d'une étape de contrôle comme définie précédemment. De préférence, le support de détection se présente sous forme de feuille ou de membrane, par exemple sous la forme d'une carte, d'un ruban ou d'une bandelette. Brève description des figures La figure 1 illustre un premier mode de réalisation selon l'invention, pour lequel les étapes (a) et (b) sont réalisées en milieu liquide. La figure 2 illustre un second mode de réalisation selon l'invention, pour lequel l'étape (a) est réalisée en milieu liquide, les étapes (b) et (c) étant réalisées sur le support de détection. La figure 3 illustre un troisième mode de réalisation selon l'invention, pour lequel les étapes (a), (b) et (c) sont réalisées sur le support de détection. La figure 4 illustre un quatrième mode de réalisation selon l'invention, pour lequel les étapes (a) et (b) sont confondues. Les figures 1.a, 2.a, 3.a et 4.a illustrent des cas où la molécule d'intérêt n'est pas présente dans l'échantillon liquide. Les figures 1.b, 2.b, 3.b et 4.b illustrent des cas où la molécule d'intérêt 10 est présente dans l'échantillon à une concentration inférieure au seuil de détection. Les figures 1.c, 2.c, 3.c et 4.c illustrent des cas où la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon liquide à une concentration supérieure ou égale 15 au seuil de détection. Les figures 1.a.1, 1.b.1, 1.c.1, 2.a.1, 2.b.1, 2.c.1, 3.a.1, 3.b.1, 3.c.1, 4.a.1, 4.b.1 et 4.c.1 illustrent les étapes (a) selon différents modes de réalisation de l'invention. Les figures 1.a.2, 1.b.2, 1.c.2, 2.a.2, 2.b.2, 2.c.2, 3.a.2, 3.b.2, 3.c.2, 4.a.2, 4.b.2 et 4.c.2 illustrent les étapes (b) selon différents modes de réalisation de l'invention. 25 Les figures 1.a.3, 1.b.3, 1.c.3, 2.a.3, 2.b.3, 2.c.3, 3.a.3, 3.b.3, 3.c.3, 4.a.3, 4.b.3 et 4.c.3 illustrent les étapes (c) selon différents modes de réalisation de l'invention. Les figures 1.a.4, 1.b.4, 1.c.4, 2.a.4, illustrent les étapes (d) selon 30 différents modes de réalisation de l'invention. Les figures 1.a.5, 1.b.5, 1.c.5, 2.a.4, 2.b.4, 2.c.4, 3.a.4, 3.b.4, 3.c.4, 4.a.4, 4.b.4 et 4.c.4 illustrent les résultats observés sur les supports de détection pour différents modes de réalisation de l'invention. 20 T zone correspond à la zone test du support de détection selon la présente invention. La présence d'une bande noire au niveau de la T zone représente un signal détectable. L'absence d'une bande noire au niveau de la T zone signifie qu'il n'y a pas de signal détectable. La flèche au niveau du support de détection représente le sens de migration de l'échantillon liquide sur le support de détection. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, donnés à titre illustratif. EXEMPLES 1I Détermination du seuil de détection d'une molécule de THC selon le premier mode de réalisation de l'invention: 25 1.1. Influence du temps d'incubation entre l'échantillon et l'anticorps anti-THC Protocole : Des échantillons contenant du THC (Sigma Aldrich T-4764-1 mL) à des 30 concentrations de 0 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 3,5 ng/mL, 4 ng/mL, 4,5 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, sont réalisés par dilution dans de l'eau distillée. 20 pL d'échantillon à analyser sont déposés dans un tube. 20 20 pL d'anticorps monoclonaux anti-THC (d'Arista Biologicals ABTHC-0401) à 100 ng/mL dans du tampon phosphate sont ajoutés dans le tube. Le mélange est soit laissé à incuber 5 minutes à température ambiante soit immédiatement additionné de 20 pL de THC-BSA. 20 pL de de THC-BSA (Arista Biologicals AGTHC-0301) marqué avec des particules de latex carboxylé (Duke Scientific DBK104OLB) dilué au 1/20è" dans du tampon phosphate sont ajoutés. La bandelette est alors plongée dans le mélange et maintenue en position verticale dans le tube pendant 5 minutes. Puis la lecture est réalisée immédiatement après ces 5 minutes d'incubation. Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau suivant : Temps 0 5 d'incubation (Minutes) Seuil de détection 7.5 1 du test (ng/mL de THC) Les résultats montrent qu'à concentration en anticorps anti-THC égale, l'augmentation du temps d'incubation entre l'échantillon à analyser et l'anticorps permet de diminuer de façon significative le seuil de détection du test. Le seuil de détection du test peut être ajusté en jouant sur le temps d'incubation entre la molécule d'intérêt présente dans l'échantillon et l'anticorps anti-THC. 1.2. Influence de la concentration en anticorps anti-THC Protocole: Des échantillons contenant du THC (Sigma Aldrich T4764) à des concentrations de 0 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 3,5 ng/mL, 4 ng/mL, 4,525 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, sont réalisés par dilution dans de l'eau distillée. 20 pL d'échantillon à analyser sont déposés dans un tube. 20 pL d'anticorps anti-THC de souris (d'Arista Biologicals) à 100 ng/mL, 150 ng/mL, 450 ng/mL, 1 000 ng/mL ou 1 500 ng/mL dans du tampon phosphate sont ajoutés dans le tube. Le mélange est laissé à incuber 5 minutes à température ambiante. 20 pL de THC marqué avec des billes de latex noir de 400nm à 10pg/mg liquide dilué au 1/20ème dans du tampon phosphate sont ajoutés à l'échantillon. La bandelette est alors plongée dans le mélange et maintenue en position verticale dans le tube pendant 5 minutes. Puis la lecture est réalisée immédiatement après ces 5 minutes d'incubation. La bandelette comprend dans le sens de migration : - une zone de papier absorbant en fibre de verre(Ahlstrom #8964) -une zone de détection comprenant un anticorps anti-souris 1 mg/mL., vaporisé à 1 pL /cm pour une bandelette de 4mm de large. - une zone contrôle comprenant un anticorps anti-THC à une concentration de 0,25mg/mL, vaporisé à 1 pL /cm pour une bandelette de 4 mm de large. - une zone comprenant du papier absorbant en fibre de cellulose(Ahlstrom #222). Une lecture est réalisée au temps 5 minutes. Résultats Les résultats sont présentés dans le tableau suivant : Concentration en anticorps anti- 100 150 450 1 000 1 500 THC (ng/mL) Seuil de 1 Traces à Traces à Traces à Traces à détection 2 3 4,5 7,5 du test (ng/mL de THC) 25 Les résultats montrent que plus la concentration en anticorps anti-THC est élevée dans le milieu réactionnel, plus le seuil de détection est élevé. Le seuil de détection du test peut être ajusté en jouant sur la concentration en anticorps anti-THC dans le milieu réactionnel. Le seuil de détection du THC est bien inférieur à celui obtenu par les tests actuellement commercialisés par la société ALL DIAG et fabriqués par la société Innovacon utilisant le système par compétition classique (seuil variant de 20 à 50 ng/ml voire plus). Le seuil le plus bas obtenu est de 1 ng/mL de THC reprise dans de l'eau distillée. 2/ Détermination du seuil de détection d'une molécule de THC selon 15 le deuxième mode de réalisation de l'invention: Protocole : Des échantillons contenant du THC (Sigma Aldrich T4764) à des concentrations de 0 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 3,5 ng/mL, 4 ng/mL, 4,5 20 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, sont réalisés par dilution dans de l'eau distillée, du tampon phosphate ou du tampon phosphate/BSA 1%. 20 pL d'échantillon à analyser sont déposés dans un tube. 40 pL d'anticorps anti-THC de souris (d'Arista Biological) 25 ng/mL, 25 100ng/mL, 150 ng/mL, 450 ng/mL dans du tampon phosphate sont ajoutés dans le tube. Le mélange est laissé à incuber 5 minutes à température ambiante. 20 pL de de THC-BSA (Arista Biologicals AGTHC-0301) marqué avec des particules de latex carboxylé (Duke Scientific DBK104OLB) dilué au 1/20ème 30 dans du tampon phosphate sont ajoutés. La bandelette est alors plongée dans le mélange et maintenue en position verticale dans le tube pendant 5 minutes. Puis la lecture est réalisée immédiatement après ces 5 minutes d'incubation. La bandelette comprend dans le sens de migration : -- une zone de papier absorbant en fibre de verre (Ahlstrom #8964) - une zone comprenant le conjugué marqué. Des molécules de THC ont été utilisées, couplées à des billes de latex noir 400nm à 10 g/mg. La solution a été diluée au 1/20ème dans du tampon phosphate, et vaporisée à 4pL /cm. -une zone de détection comprenant un anticorps anti-souris 1 mg/mL, vaporisé à 1 pL /cm pour une bandelette de 4 mm de large. - une zone contrôle comprenant un anticorps anti-THC à une concentration de 0,25mg/mL, vaporisé à 1 microlitre/cm. - une zone comprenant du papier absorbant en fibre de cellulose(Ahlstrom #222). Une lecture est réalisée au temps 5 minutes. Résultats : Le tableau ci-dessous montre les seuils de détection du THC obtenus pour différentes concentrations en anticorps anti-THC. Concentration en 25 100 150 450 anticorps anti-THC (ng/mL) Seuil de détection du Inférieur à 1 1 2 Supérieur à 10 test (ng/mL de THC) Les résultats montrent que plus la concentration en anticorps anti-THC est élevée dans le milieu réactionnel, plus le seuil de détection est élevé. Le seuil de détection du test peut être ajusté en jouant sur la concentration en anticorps anti-THC dans le milieu réactionnel.25 3/ Mise en oeuvre du troisième mode de réalisation: Protocole : Des échantillons contenant du THC (Sigma Aldrich T4764) à des concentrations de 0 ng/mL, 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 3,5 ng/mL, 4 ng/mL, 4,5 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 10 ng/mL, 15 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, sont réalisés par dilution dans de l'eau distillée, du tampon phosphate ou du tampon phosphate/BSA 1%. 60 pL d'échantillon à analyser sont déposés dans un tube. 60 pL de tampon phosphate sont alors ajoutés dans le tube. La bandelette est alors plongée dans le mélange et maintenue en position verticale dans le tube pendant 5 minutes. Puis la lecture est réalisée immédiatement après ces 5 minutes d'incubation. La bandelette comprend dans le sens de migration : - une zone comprenant un anticorps anti-THC de souris vaporisé à 1 pL / cm pour une bandelette de 4 mm de large. - une zone de papier absorbant en fibre de verre(Ahlstroom #222) - une zone comprenant le conjugué marqué. Des molécules de THC ont été utilisées, couplées à des billes de latex noir 400nm à 10 g/mg. La solution a été diluée au 1/20ème dans du tampon phosphate, et vaporisée à 4 microlitres/cm. - une zone de détection comprenant un anticorps anti-souris 1 mg/mL, vaporisé à 1 pL /cm pour une bandelette de 4mm de large. - une zone contrôle comprenant un anticorps anti-THC à une concentration de 0,25mg/mL, vaporisé à 1 pL /cm pour une bandelette de 4 mm de large. - une zone comprenant du papier absorbant en fibre de cellulose. Une lecture est réalisée au temps 5 minutes. Résultats : Le tableau ci-dessous montre les seuils de détection obtenus pour des concentrations en anticorps de 50pg/mL et 100pg/mL. Concentration en 100 50 anticorps anti-THC (pg/mL) Seuil de 4 7,5 détectiondu test (ng/mL de THC) Les résultats montrent que plus la concentration en anticorps anti-THC est élevée dans le milieu réactionnel, plus le seuil de détection est élevé. Le seuil de détection du test peut être ajusté en jouant sur la concentration en anticorps anti-THC dans le milieu réactionnel. REVENDICATIONS 1. Méthode de détection par immunochromatographie d'une molécule d'intérêt dans un échantillon liquide, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes successives suivantes : (a) la mise en contact de l'échantillon liquide avec un premier anticorps qui se lie spécifiquement à ladite molécule d'intérêt si celle-ci est présente dans l'échantillon, (b) la mise en contact du premier anticorps avec un conjugué marqué en même temps ou après la mise en contact dudit premier anticorps avec l'échantillon, (c) puis, la mise en contact dudit premier anticorps avec un second anticorps dirigé contre le premier anticorps, ledit second anticorps étant immobilisé sur un support de détection au niveau d'une zone test dudit support de détection, et (d) l'analyse de la zone test du support de détection pour détecter, par différence par rapport au conjugué marqué, la présence éventuelle de ladite molécule d'intérêt. 2. Méthode de détection selon la revendication 1, dans laquelle la molécule d'intérêt est un haptène. 3. Méthode de détection selon la revendication 1, dans laquelle la molécule d'intérêt est un peptide. 4. Méthode de détection selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la molécule d'intérêt est un stupéfiant ou un principe actif médicamenteux. 30 5. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la molécule d'intérêt est une molécule de delta-9-tétrahydrocannabinol.25 6. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle l'étape (a) est réalisée en milieu liquide sans contact avec le support de détection. 7. Méthode de détection selon la revendication 6, dans laquelle l'étape (b) est réalisée en milieu liquide sans contact avec le support de détection. 8. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'étape (a) est réalisée sur le support de détection, le premier anticorps étant présent sur ledit support de détection préalablement à l'étape (a). 9. Méthode de détection selon la revendication 6 ou 8, dans laquelle l'étape (b) est réalisée sur le support de détection, le conjugué marqué étant présent sur ledit support de détection préalablement à l'étape (b), la mise en contact telle que définie à l'étape (c) étant réalisée par migration sur ledit support de détection. 10. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le premier anticorps est sous forme lyophilisé, l'étape (a) étant réalisée par mise en contact de l'échantillon liquide avec l'anticorps lyophilisé préalablement ou non reconstitué avec une solution tampon de reconstitution. 11. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les étapes (a) et (b) sont confondues, le premier anticorps se liant de préférence à la molécule d'intérêt, lorsqu'il est en présence de ladite molécule d'intérêt et du conjugué marqué. 12. Méthode de détection selon l'une des revendications précédentes, dans laquelle le deuxième anticorps est un anticorps anti-espèce du premier anticorps. 13. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le conjugué est marqué avec un agent de marquagechoisi dans le groupe comprenant des microparticules de latex, des microparticules d'or colloïdal, des microparticules de polystyrène ou dérivés du polystyrène, lesdites microparticules étant fluorescentes ou non fluorescentes, magnétisées ou non magnétisées, un flurochrome, ou un agent de marquage sous forme de liposome. 14. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'échantillon liquide est un liquide corporel ou provient d'un liquide corporel. 15. Méthode de détection selon la revendication 14, dans laquelle le liquide corporel est choisi dans le groupe comprenant la salive, l'urine, le lait, le sang, la sueur et le liquide céphalo-rachidien. 15 16. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le support de détection est une membrane de nitrocellulose. 17. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 20 précédentes, dans laquelle la concentration du premier anticorps est telle que ledit premier anticorps est saturé si la molécule d'intérêt est présente dans l'échantillon à une concentration au moins égale à un seuil de détection déterminé, et dans laquelle la concentration du premier anticorps est suffisante pour générer un signal détectable lorsque la molécule d'intérêt n'est pas 25 présente dans l'échantillon. 18. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le conjugué marqué est en excès par rapport au premier anticorps. 19. Trousse de détection d'une molécule d'intérêt comprenant un premier anticorps dirigé contre une molécule d'intérêt et un conjugué marqué, le conjugué marqué et un deuxième anticorps dirigé contre le premier anticorps. 30 20. Support de chromatographie comprenant successivement dans le sens de migration d'un liquide sur ledit support: - une zone comprenant un premier anticorps dirigé contre une molécule d'intérêt et contre un conjugué marqué; - une zone comprenant ledit conjugué marqué ; - et une zone test comprenant un deuxième anticorps dirigé contre le premier anticorps, ledit deuxième anticorps étant immobilisé sur ledit support.