Brevet FR2911278A1 — publié le 20080718

PROCEDE D'OBTENTION D'UN ACTIF COSMETIQUE DEPIGMENTANT, PRINCIPE ACTIF OBTENU ET COMPOSITIONS L'INCLUANT La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un actif cosmétique dépigmentant et éclaircissant de la peau, issu de Palmaria palmata. L'invention se rapporte également au principe actif susceptible d'être obtenu par ce procédé, à son utilisation et aux compositions cosmétiques associées. La couleur de la peau chez l'homme dépend principalement de la concentration en pigments mélaniques au niveau des kératinocytes. Les pigments mélaniques ou mélanines, sont synthétisés dans les mélanocytes par des organites intracellulaires spécialisés, les mélanosomes. A la fin de leur maturation, les mélanosomes sont distribués aux kératinocytes. Deux types de mélanines sont synthétisées : les eumélanines de couleur noire, qui sont photoprotectrices, et les phaeomélanines, de couleur jaune-rouge qui sont photosensibilisantes. La couleur de la peau découle de l'association de ces deux groupes de mélanines sous l'influence d'enzymes et de nombreux gènes de contrôle. Il est courant que des personnes souhaitent recourir à une dépigmentation de la peau pour des raisons cosmétiques diverses, soit pour un éclaircissement global, soit pour éliminer ou atténuer des tâches issues de désordres locaux de la pigmentation tels que des tâches de vieillissement, des tâches de rousseur, des hyperpigmentations dues à des coups de soleil, etc. Actuellement, il existe de nombreux agents de la dépigmentation qui agissent soit directement sur la vitalité des mélanocytes, soit en inhibant une des enzymes impliquées dans la synthèse de mélanine. Toutefois aucun de ces actifs n'est complètement satisfaisant. Il existe donc un besoin pour un produit cosmétique dépigmentant efficace capable d'atténuer visiblement la pigmentation de la peau. C'est ce à quoi répond la présente invention en proposant un principe actif cosmétique dépigmentant issu de Palmaria palmata, riche en sucres, capable d'éclaircir la peau en agissant simultanément sur plusieurs facteurs essentiels impliqués dans le phénomène de pigmentation cutané. En particulier la présente invention se propose d'agir simultanément sur la mélanocytogenèse, sur la mélanogenèse, sur le transport des mélanosomes et sur la mélanogenèse photo-induite. Les mélanocytes, à l'origine de la synthèse de la mélanine, sont des cellules épithéliales de l'épiderme qui deviennent fonctionnelles suite à une cascade de stimulations : c'est la mélanocytogénèse. En aval de cette cascade, le récepteur de la tyrosine kinase situé à la surface des mélanocytes, et son ligand, le Stem Cell Factor (SCF) produit par les kératinocytes, sont impliqués dans la prolifération et la survie des mélanocytes. Sans SCF, les mélanocytes ne peuvent pas devenir fonctionnels. La présente invention propose un actif issu de Palmaria palmata capable de 20 réduire la synthèse du SCF, limitant par conséquent la formation de mélanocytes fonctionnels. Le processus de synthèse des mélanines par les mélanocytes différenciés, la mélanogenèse, met en jeu différentes enzymes qui catalysent chacune des réactions conduisant à la formation des pigments mélaniques au sein des 25 mélanosomes. Trois enzymes sont particulièrement impliquées dont la tyrosinase. L'actif issu de Palmaria selon la présente invention propose de réduire l'activité de la tyrosinase et par conséquent de limiter la synthèse des pigments mélaniques. Les mélanocytes possèdent des expansions cytoplasmiques appelées dendrites mélanocytaires , qui leur permettent de rentrer en contact avec les kératinocytes des couches suprabasales. Chaque mélanocyte est en relation avec environ 36 kératinocytes, formant ainsi une unité épidermique de mélanisation . En même temps que se déroule la synthèse des mélanines, les mélanosomes sont transportés vers l'extrémité des dendrites mélanocytaires. Les mélanosomes sont transportés le long de fibres d'actine et de tubuline grâce à un complexe moléculaire d'ancrage aux extrémités des dendrites comprenant Rab27 et la mélanophiline. Les mélanosomes sont ensuite transférés vers les kératinocytes associés. La présente invention propose un actif issu de Palmaria palmata capable de réduire la synthèse de Rab27 et de la mélanophiline au sein des mélanocytes, limitant ainsi le transport des mélanosomes vers l'extrémité des dendrites mélanocytaires. En outre l'actif selon l'invention permet aussi de bloquer le transfert des mélanosomes, du mélanocyte vers les kératinocytes auxquels il est associé. Lorsque la peau est soumise à un stress UV, les kératinocytes produisent de l'endothéline (ET-1), stimulateur de la pigmentation. L'ET-1 stimule à la fois la croissance des mélanocytes et l'expression de la tyrosinase. L'actif issu de Palmaria selon la présente invention propose de limiter l'expression de l'ET-1 et par conséquent de réduire la mélanogenèse photo-induite. Le principe actif issu de Palmaria palmata selon l'invention permet donc d'atténuer la pigmentation de la peau, simultanément - en contrôlant la mélanocytogénèse par le SCF, - en contrôlant la mélanogénèse par la tyrosinase, - en contrôlant le transport des mélanosomes au sein des mélanocytes et en bloquant le transfert des mélanosomes vers les kératinocytes via Rab27 et/ou mélanophiline, et - en réduisant l'expression de stimulateurs de la pigmentation photo- induits, comme l'endothéline-1. Ainsi en réduisant la formation de pigments mélaniques et limitant leur concentration au sein des kératinocytes, le principe actif selon l'invention présente un effet dépigmentant efficace. La présente invention est maintenant décrite en détail pour permettre de mieux 10 appréhender les résultats obtenus. 1/ PROCEDE D'OBTENTION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : Le procédé d'obtention du principe actif selon l'invention comprend au moins la succession des étapes suivantes : 15 - solubilisation de Palmaria palmata en poudre dans l'eau, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s) des protéines et des sucres, et - élimination des protéines extraites par précipitation sélective des protéines. 20 Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'obtention du principe actif selon l'invention comprend la succession des étapes suivantes : - solubilisation de Palmaria palmata en poudre dans l'eau, à raison de 100 à 300g/l, -hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s) des 25 protéines et des sucres, - élimination des protéines extraites par précipitation sélective des protéines, - séparation des phases soluble et insoluble par filtration, décantation ou centrifugation, - inactivation des activités enzymatiques résiduelles par traitement thermique, -décoloration par ajout d'un adjuvant, - concentration par filtration, ultrafiltration, osmose inverse et/ou nanofiltration, et - filtration stérilisante. 2/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : 2-1/ Matières sèches : On mesure le taux de matières sèches par passage à l'étuve à 105 C d'un échantillon. Le taux de matières sèches est compris entre 20 et 200 g/I, plus particulièrement entre 60 et 100 g/I. 2-2/ Mesure du pH : Le pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante conduit à des valeurs comprises entre 3 et 7, plus particulièrement entre 4,5 et 5,5. 2-3/ Teneur en protéines par dosage de l'azote : L'azote total est déterminé par la méthode de KJELDHAL(Official method of analysis of the AOC 1975, 12th ed. W Horzwitz, E.b, New-York, p.15-60). La teneur en protéines est comprise entre 1 et 10 g/I, plus particulièrement entre 3 et 5 g/I. 2-4/ Teneur en cendres : La teneur en cendres brutes est déterminée par la pesée des résidus issu de l'incinération à 550 C dans un four. L'échantillon est pesé puis placé dans le four. La température est maintenue jusqu'à ce que les cendres soient blanches. La teneur en cendres brutes est comprise entre 6 et 65 g/I, plus particulièrement entre 19 et 32 g/I. 2-5/ Détermination de la teneur en sucres totaux On utilise la méthode de DUBOIS (DUBOIS M. & al [1956], Analytical chemistry, 28, n 3 p 350-356). En présence d'acide sulfurique concentré et de phénol, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé. A partir d'une gamme étalon, on peut déterminer le taux de sucres totaux d'un échantillon. Le taux de sucres totaux du principe actif selon la présente invention est de 12 à 125 g/I, préférentiellement de 33 à 63 g/I. 2-6/ Caractérisation des carbohydrates a. Dosage de sucres simples Les échantillons sont analysés selon la méthode KAMERLING et al. (1975) modifiée par MONTREUIL et al. (1986). Le taux de sucres simples est réparti en glucose, galactose et xylose. b. Degré de polymérisation L'analyse de polymérisation montre que la fraction glucidique du principe actif selon la présente invention est composé essentiellement de xylose, de galactose et de glucose présents sous forme d' oligosaccharides, disaccharides ou monosaccharides. L'analyse montre aussi que le principe actif ne contient pas de xylanes. Degré de Taux de polymérisation carbohydrates Monosaccharides et 10 0% xylanes) 3/EVALUATION DE L'EFFET DEPIGMENTANT DU PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION 3-1/Evaluation de l'effet sur la mélanocytogenèse Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet du principe actif selon l'invention sur la mélanocytogenèse, en particulier sur la synthèse du SCF. L'étude est réalisée sur kératinocytes humains normaux irradiés par UVB (rayons Ultraviolets B). Les kératinocytes sont incubés dans un milieu de culture adapté pendant plusieurs jours. Après incubation, on élimine le milieu de culture et une partie des cellules est irradiée par UVB. Deux groupes de cellules sont créés : un pour lequel les cellules sont placées dans le milieu de culture adapté et l'autre où le principe actif selon l'invention dosé à 0,5% est ajouté au milieu de culture adapté. Les cellules sont incubées puis le milieu de culture est éliminé, et les cellules qui avaient été irradiées une première fois, sont soumises à deux irradiations successives avant d'être réincubées. La synthèse de SCF est analysée par un test ELISA. Les résultats obtenus pour les cellules irradiées traitées avec le principe actif montrent une diminution de la synthèse de SCF de 39% par rapport aux cellules irradiées non traitées. Le principe actif selon l'invention diminue donc la synthèse de SCF par les kératinocytes humains et limite ainsi la formation de mélanocytes différenciés. 3-2/Evaluation de l'effet sur la mélanogenèse Cette étude a pour objectif d'évaluer l'effet dépigmentant du principe actif selon l'invention par mesure de l'activité tyrosinase et du taux de mélanine synthétisée. L'étude est réalisée sur culture de mélanocytes B16F1 selon le protocole suivant. Les cellules sont ensemencées dans un milieu de culture adapté et incubées. On ajoute au milieu de culture le principe actif selon l'invention à 1% et les cellules sont incubées pendant plusieurs jours. On réalise ensuite une trypsinisation cellulaire et on effectue le dosage de tyrosinase et le dosage de la mélanine. Les résultats obtenus pour les cellules traitées avec le principe actif par rapport aux cellules non traitées (témoin) montrent une diminution de l'activité tyrosinase de 17%, et une diminution du taux de mélanine synthétisée de 30%. Ces résultats montrent que le principe actif selon l'invention limite l'activité de l'enzyme tyrosinase impliquée dans la synthèse de mélanine et diminue fortement la synthèse le mélanine par les mélanocytes. 3-3/Evaluation de l'effet sur le transport des mélanosomes Le but de cette étude est d'évaluer la capacité du principe actif selon l'invention à limiter la synthèse de Rab27 et de la mélanophiline, protéines impliquées dans le transfert des mélanosomes. L'étude est réalisée par Western Blot sur culture de mélanocytes humains normaux. Le protocole opératoire est le suivant. Les mélanocytes sont ensemencées dans un milieu de culture adapté et sont traités par le principe actif selon l'invention à 1% puis incubés pendant plusieurs jours. A la fin de l'incubation, les extraits cellulaires sont récupérés puis stockés. On réalise ensuite un dosage des protéines totales à l'aide d'un kit de dosage. Le Western Blot est réalisé par électrophorèse sur gel SbS-polyacrylamide et l'immunomarquage est effectué avec des anticorps adaptés pour la mélanophiline et pour Rab27. Les bandes obtenues sont ensuite semi-quantifiées par densitométrie après analyse d'images. Les résultats obtenus pour les cellules traitées avec le principe actif par rapport aux cellules non traitées (témoin) sont présentés dans le tableau suivant : Taux de mélanophiline Taux de Rab27 / témoin /témoin (%) (%) Principe actif selon l'invention 1% +76 +70 3-4/Evaluation de l'effet sur la mélanogénèse photo-induite Cette étude a pour but de déterminer l'effet du principe actif selon l'invention sur la synthèse de l'endithéline-1 (ET-1), stimulateur de la pigmentation photo-induite. L'étude est réalisée sur kératinocytes humains normaux irradiés par UVB (rayons Ultraviolets B). Les kératinocytes sont incubés dans un milieu de culture adapté pendant plusieurs jours. Après incubation, on élimine le milieu de culture et une partie des cellules est irradiée par UVB. On replace ensuite les cellules dans un milieu de culture adapté auquel on ajoute ou non le principe actif selon l'invention dosé à 1%. Les cellules sont à nouveau incubées pendant plusieurs jours. La synthèse de ET-1 est analysée par un test ELISA. Les résultats obtenus pour les cellules irradiées traitées avec le principe actif montrent une diminution de la synthèse de ET-1 de 26% par rapport aux cellules irradiées non traitées. Le principe actif selon l'invention diminue donc la synthèse de ET-1 et limite ainsi la mélanogenèse photo-induite. 4/ COMPOSITION COSMETIQUE INCLUANT LE PRINCIPE ACTIF SELON L'INVENTION : La présente invention couvre aussi les compositions cosmétiques incluant le principe actif selon la présente invention dans différentes formes galéniques adaptées à l'administration par voie topique. Ces compositions peuvent se présenter sous forme de crèmes, émulsions huiledans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples, solutions, suspensions ou poudres. Elles peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse, ou sous forme solide. Ces compositions peuvent contenir entre 0,01 et 50% en poids du principe actif selon l'invention. On peut citer notamment un exemple de formulation ayant montré une stabilité physique incluant 4% de principe actif selon l'invention : -Arachidyl alcool/Behenyl alcool/Arachidyl glucoside : 3,0% - Isononyl isonoanoate : 2,0% - Cetearyl octanoate : 10,0% - Polyacrylamide/C13-14 Isoparaffin/Laureth-7 : 2,0% - Conservateurs : 0,5% - Principe actif selon l'invention : 4,0% - Eau : 78,5%. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'un principe actif cosmétique dépigmentant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la succession des étapes suivantes : - solubilisation de Palmaria palmata en poudre dans l'eau, -hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s) des 5 protéines et des sucres, et - élimination des protéines extraites par précipitation sélective des protéines. 2. Procédé d'obtention d'un principe actif dépigmentant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes 10 suivantes : - solubilisation de Palmaria palmata en poudre dans l'eau, à raison de 100 à 300g/I, - hydrolyse(s) enzymatique(s) simultanée(s) et/ou successive(s) des protéines et des sucres, 15 - élimination des protéines extraites par précipitation sélective des protéines, séparation des phases soluble et insoluble par filtration, décantation ou centrifugation, - inactivation des activités enzymatiques résiduelles par traitement 20 thermique, - décoloration par ajout d'un adjuvant, -concentration par filtration, ultrafiltration, osmose inverse et/ou nanofiltration, et - filtration stérilisante. 3. Principe actif obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par - un taux de matières sèches compris entre 20 et 200 g/I, - un pH compris entre 3 et 7, - une teneur en protéines comprise entre 1 et 10 g/I, - une teneur en cendres comprise entre 6 et 65 g/I, et - une teneur en sucres totaux comprise entre 12 et 125 g/I. 4. Principe actif selon la revendication 3, caractérisé par : - un taux de matières sèches compris entre 60 et 100 g/I, - un pH compris entre 4,5 et 5,5, - une teneur en protéines comprise entre 3 et 5 g/I, - une teneur en cendres comprise entre 19 et 32 g/I, - une teneur en sucres totaux comprise entre 33 et 63 g/I, et - la présence de xylose, de galactose et de glucose essentiellement sous forme d'oligosaccharides de degré de polymérisation inférieur ou égal à 4. 5. Utilisation cosmétique du principe actif selon l'une des revendications 3 ou 4 pour incorporation à une composition destinée à un effet dépigmentant. 6. Utilisation cosmétique du principe actif selon l'une des revendications 3 ou 4 pour incorporation à une composition cosmétique agissant sur la mélanocytogénèse. 7. Utilisation cosmétique du principe actif selon l'une des revendications 3 ou 4 pour incorporation à une composition cosmétique agissant sur la mélanogénèse. 8. Utilisation cosmétique du principe actif selon l'une des revendications 3 25 ou 4 pour incorporation à une composition cosmétique agissant sur le transport des mélanosomes. 9. Utilisation cosmétique du principe actif selon l'une des revendications 3 ou 4 pour incorporation à une composition cosmétique agissant sur la mélanogénèse photo-induite. 10. Composition cosmétique incluant le principe actif selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, émulsions eau-dans-huile, émulsions multiples, solutions, suspensions ou poudres.