Brevet FR2920235A1 — publié le 20090227

PROCEDE D'ESTIMATION DE CONCENTRATIONS DE MOLECULES DANS UN RELEVE D'ECHANTILLON ET APPAREILLAGE DESCRIPTION Le sujet de cette invention est un procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un relevé d'échantillon, et l'appareillage afférent. Certains appareils permettent de séparer la détection de différentes molécules d'un échantillon le long d'un signal qui est un spectre. Les composants détectés apparaissent typiquement sous forme de pics dont la hauteur dépend de la concentration de la molécule concernée dans l'échantillon. Les chromatographes en phase liquide et les spectromètres de masse possèdent cette propriété en séparant les molécules respectivement d'après leur temps de rétention dans la colonne et leur masse divisée par la charge. Ces appareils peuvent être utilisés conjointement, et le signal résultant est alors un spectre multiple, présentant une dispersion de pics sur un plan en fonction des deux paramètres. Les mesures peuvent être difficiles à exploiter en raison du nombre élevé de molécules présentes dans l'échantillon et de l'existence d'isotopes qui modifient la masse de certaines des molécules mesurées par rapport à leur valeur ordinaire et altèrent les formes des pics pour donner des massifs isotopiques moins reconnaissables et moins faciles à mesurer. Une autre difficulté apparaît pour des éléments présents en très faible concentration et dont la détection est pourtant parfois nécessaire. Les analyses classiques de signaux peuvent alors être mises en échec. Une méthode classique consiste ainsi à déduire une concentration d'une molécule d'après la hauteur ou la surface de son pic sur le signal. Une autre méthode consiste à analyser l'ensemble du signal par une analyse spectrale en faisant des comparaisons avec une bibliothèque de spectres connus. On conçoit que ces méthodes peuvent conduire à des résultats insuffisants pour des pics peu marqués de molécules en concentration faible, à cause du bruitage du signal ou de superposition avec des pics voisins. Le but essentiel de l'invention est d'obtenir de meilleurs résultats dans ces situations grâce à un procédé d'estimation différent. Sous sa forme la plus générale, l'invention concerne un procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon, consistant à faire passer l'échantillon par un appareillage et à obtenir ainsi un signal d'ensemble représentatif de ces concentrations en fonction d'au moins une variable ; caractérisé en ce qu'il consiste à faire une modélisation analytique du signal d'après une fonction de modélisation comprenant les concentrations et d'autres facteurs, puis à attribuer aux concentrations et à certains des autres facteurs, qui sont des facteurs incertains, des distributions de probabilités à priori, à résoudre la fonction de modélisation d'après le signal en obtenant des distributions de probabilités a posteriori pour les concentrations, et à estimer les concentrations d'après un paramètre d'estimation des distributions de probabilités a posteriori. Le paramètre de décision déduit des distributions a posteriori peut être une moyenne, une médiane, ou l'argument correspondant à la valeur maximale de la distribution par exemple ; les distributions de probabilités à priori peuvent comprendre des fonctions gaussiennes ou d'autres statistiques connues ; les distributions de probabilité a posteriori peuvent être de telles fonctions, ou être obtenues empiriquement par génération de nombres aléatoires. L'invention repose donc sur une décomposition de certains des facteurs entrant dans le modèle analytique du signal mesuré, dont les concentrations de molécules recherchées, en distributions de probabilités dont un paramètre est supposé donner une estimation plus exacte du facteur concerné qu'une mesure directe donnant un résultat univoque mais pouvant être biaisé. Elle peut être mise en oeuvre avec de nombreuses variantes selon les facteurs qu'on traite comme incertains et qui sont donc décomposés aussi en distributions de probabilités. Si ces facteurs sont peu nombreux, la résolution du modèle analytique peut être très rapide et simple. S'ils sont plus nombreux, des calculs plus compliqués seront nécessaires. Alors qu'une résolution directe est plausible avec un petit nombre de facteurs incertains, elle sera souvent itérative avec un grand nombre de tels facteurs, les distributions de probabilités dépendant les unes des autres : le calcul consistera à faire converger les paramètres de ces distributions de probabilités vers des valeurs limites, et les résultats définitifs des concentrations seront encore obtenus par une estimation faisant emploi de ces paramètres. Un élément de supériorité de l'invention est que tout le signal est utilisé dans la recherche du résultat et pas seulement des portions comprenant des pics de mesure, et avec un modèle fiable. La recherche des paramètres des distributions de probabilités pourra être directe si ces distributions sont des lois connues en statistique, sinon (ce qui peut être le cas avec des lois de probabilités composées ou conditionnelles), ils peuvent être obtenus empiriquement, par application de nombres aléatoires à ces distributions et collation des résultats. Un autre aspect de l'invention est la répartition des facteurs du modèle analytique du signal en facteurs jugés stables (constants avec le même appareillage quelle que soit l'expérience) et instables (variables d'une expérience à l'autre). Tous ces facteurs peuvent ou non être tenus pour incertains au sens de l'invention et se voir alors appliquer des distributions de probabilités. Les facteurs stables peuvent faire l'objet d'une calibration externe consistant en une injection de molécules semblables à certaines des molécules de l'échantillon, mais à des concentrations connues, dans l'appareillage (en l'absence de l'échantillon) et à déduire d'un signal de l'injection de calibration et du modèle analytique certains des autres facteurs. Il faut souligner que la calibration externe peut aussi être accomplie par des calculs probabilistes impliquant des distributions de probabilités pour les facteurs du modèle analytique, appliqué cette fois à l'injection de calibration, sauf les concentrations des molécules qui sont cette fois bien déterminées. L'invention peut aussi comprendre une calibration interne consistant en une injection de molécules marqueuses dans l'échantillon, les molécules marqueuses ayant respectivement des propriétés voisines de certaines des molécules de l'échantillon vis-à-vis de l'appareillage et donnant des pics de mesure proches de pics de mesures desdites certaines molécules de l'échantillon. La répartition en facteurs stables et instables peut être décidée par l'utilisateur d'après la nature de l'appareillage, les conditions des expériences et ses connaissances propres. C'est ainsi que le gain du niveau du signal par l'appareillage est normalement instable, de même que les temps de rétention des molécules par la colonne de chromatographie quand elle est employée. Un autre aspect de l'invention est un appareillage dans lequel le procédé est accompli pour obtenir le profil moléculaire l'échantillon. On explicitera maintenant l'invention d'après une application pour laquelle elle a d'abord été conçue : la mesure des protéines dans des fluides biologiques, pour laquelle les problèmes précédents se manifestent avec acuité en raison du grand nombre de protéines qu'on peut rencontrer et de la très faible concentration de certaines, alors qu'une mesure précise est pourtant souhaitée car certaines d'entre elles peuvent être décisives pour asseoir un diagnostic médical ou autre. Des protéines sont ainsi des marqueurs de cancers. La figure 1 est un schéma de l'appareillage de mesure, la figure 2 une illustration d'un signal, et la figure 3 un organigramme. L'ensemble de la chaîne de mesure est représenté de façon schématique à la figure 1. Un échantillon de sang ou de plasma est fourni à un module de préparation 1, qui est utilisé pour séparer les molécules qui seront l'objet de la mesure du reste de l'échantillon. Des procédés de nature biologique ou physique, comme des captures de certaines protéines par affinité avec des anticorps, peuvent être employés. Le mélange de protéines sélectionné passe ensuite dans l'appareillage de mesure, qui comprend d'abord un module de digestion 2 décomposant les protéines en peptides ou en acides aminés et réduisant leur masse, un chromatographe 3 en phase liquide qui sépare les protéines les unes des autres, donne une première mesure et permet éventuellement une autre sélection de protéines, et un spectromètre de masse 4 qui fournit une seconde mesure. Le module de digestion 2 est optionnel, et un seul des moyens de mesure 3 et 4 peut être employé. Les mesures consistent en un spectrogramme des protéines (figure 2) que reçoit un module de traitement 5 de l'information, dont le fonctionnement sera décrit maintenant et qui fournit des résultats interprétés par l'utilisateur. Un premier élément de l'invention est la construction d'un modèle analytique de la chaîne de mesure. Dans le cas de la figure 1, où le mélange de protéines est analysé suivant deux dimensions correspondant à deux paramètres physico-chimiques, le modèle intégrant des paramètres associés au chromatographe 3 et au spectromètre de masse 4. Une colonne de chromatographie est un système retardant différemment chacune des molécules qui la parcourt. L'entrée et la sortie de ce système sont des fonctions représentant une quantité de molécules en fonction du temps. La propagation des protéines dans la colonne peut être décrite par une équation différentielle qu'on peut aussi approcher par un modèle convolutif avec une réponse impulsionnelle gaussienne dont la moyenne Ti est appelée temps de rétention de la protéine i. Le signal de sortie d'une protéine Ci(t) peut donc être décrit par l'équation (1) c(t) û (271)h/2 exp (û 0.57 (t û T )2 ) où yc est l'inverse de la variance de la gaussienne. Les temps de rétention Ti sont tenus pour instables d'une mesure à une autre ; il est donc difficile d'identifier directement les natures des protéines associées à chacun des pics, mais on peut recourir à des molécules marqueuses, de concentration connue et de composition proche des protéines recherchées, qu'on injecte avec l'échantillon dans la colonne chromatographique pour détecter leurs pics, qui sont adjacents à ceux desdits protéines proches, qu'on identifie ainsi. A chaque instant, la sortie de la colonne de chromatographie est analysée par le spectromètre de masse 4. Il est sensible au rapport entre la masse d'une molécule et sa charge, et fournit en sortie une fonction donnant la quantité des molécules dans l'échantillon d'après leur rapport masse sur charge. Chaque protéine sera en général formée de plusieurs impulsions en raison des isotopes qui peuvent donner des masses différentes à une même molécule. De plus, le phénomène d'ionisation pouvant leur donner un nombre de charges différent. Classiquement, une protéine peut avoir jusqu'à trois neutrons et trois charges supplémentaires. Le signal de sortie du spectromètre de masse 4 peut être modélisé par l'équation (2) 3 3 TT =1111ijk exp j=1 k=0 Mi + kM, z J si 1/2 7s i' %i ik ijk '1/2 91 ; r i / =1 et 17L'ik = 1 , (2~) k où les Avec paramètres sont : - j, le nombre de charges portées par la protéine, - k, le nombre de neutrons supplémentaires, 25 - lu , proportions de la protéine i ayant j charges, -11 k, proportions de la protéine i ayant k neutrons supplémentaires, Ys, inverse de la variance des pics spectrométriques, - Mi, masse de la protéine i sans neutrons supplémentaires, - Mn, masse d'un neutron. Le modèle global du signal arrivant au module de traitement de l'information 5 peut donc être représenté par l'équation (3) quand le module de digestion 2 est présent : t t 10 Y = xpDZp~ZTCZJSZJCI +.xpDZpZTCZJSZJCI + B p,i,J où les symboles représentant le signal mesuré sont : - p : numéro de la protéine étudiée, - i : numéro du peptide étudié, - j : nombre de charge porté par le peptide étudié, - Y : données : spectrogramme, - B: bruit, - xp : concentration de la protéine p dans l'échantillon analysé, - xp* concentration de la version alourdie de la protéine p dans l'échantillon analysé, - Dip : gain de la digestion et des étapes de préparation de la protéine en peptides (idéalement un entier naturel), : gain du système pour le peptide i, - : proportion de peptide i ayant la charge j, 15 20 25 - s J spectre de masse du peptide i chargé j fois, forme échantillonnée du signal s (m), - sij*: spectre de masse du peptide alourdi i chargé j fois, ci : chromatogramme du peptide i, forme échantillonnée du signal ci(t). Le modèle est linéaire en fonction des concentrations en protéines ou peptides, et la partie redevable au spectromètre de masse 4 est indépendante de celle qui est redevable au chromatographe 3. L'utilisation d'un seul de ces appareils serait donc immédiatement exploitable en simplifiant le modèle. De même, l'influence du module de digestion 2 apparaît par le coefficient Dip, qui disparaîtrait de la formule pour un système dépourvu de ce module ; seules des protéines seraient considérées au lieu de peptides, sans changement dans l'invention. Le modèle de l'équation (3) peut être N représenté de façon simplifié par Y=Exisicit.+B (4), où Z=i Y et B sont des matrices. Ce système étant linéaire, il peut être récrit selon l'équation y = Hx+b (5), où y et b sont des vecteurs-colonnes, x= [x1 XN]t représente les variables à calculer que sont les concentrations des protéines, et H est une matrice formée par la juxtaposition de vecteurs- colonnes yi qui correspondent à des signaux que donnerait la protéine i respective à une concentration unitaire. H est paramétré par tous les facteurs intervenant dans la mesure, dont certains au moins peuvent être tenus pour incertains et sont donc susceptibles d'être recalculés d'après l'invention. Dans un premier exemple qu'on va maintenant donner, tous ces facteurs sont cependant tenus pour fixes et connus, et seul le bruit représenté par le vecteur b introduit de l'incertitude dans y et x. Dans toutes les variantes de l'invention, on procède à une analyse bayésienne des facteurs tenus pour incertains en estimant ces facteurs sous forme de distributions de probabilités, appelées distributions de probabilités a posteriori, dont un paramètre donne l'estimation définitive des facteurs et des concentrations des protéines et finalement le profil moléculaire de l'échantillon. Des valeurs a priori, avant cette estimation, des facteurs pourront être obtenues par la mesure ou par des hypothèses considérées comme plausibles, telles que des distributions de probabilités à prioris. PREMIER EXEMPLE Dans le premier exemple, on procède à une estimation presque directe des concentrations en supposant que la plupart des facteurs entrant dans la fonction de modélisation du signal de mesure sont connus sans incertitude, sauf le bruit qui est alors modélisé par une distribution gaussienne de probabilité à priori dont la moyenne est supposée être nulle (ce qui signifie que la chaîne de mesure ne commet pas d'erreur systématique) et dont la variance est 6b2, choisie par l'utilisateur d'après son expérience ou évaluée par une mesure d'analyse spectrale par exemple, sur l'appareillage à vide si besoin est. Une bonne évaluation donnera évidemment des résultats plus fiables mais même une évaluation approchée est susceptible d'améliorer l'évaluation par rapport à une mesure directe. Enfin, le bruit est considéré comme blanc. Si on appelle 0 l'ensemble des variables intervenant dans le modèle, la distribution de probabilités à priori du signal y (en fonction de x et 0) de (5) peut être décrite par (6) p(yx,9)= 1 exp (îbr 2~Z yùHx 2 2 6b i qui donne la valeur de la probabilité pour toute valeur de y en fonction de H et de x. La distribution de probabilités à priori pour les concentrations de protéines peut être représentée par une fonction de densité gaussienne de l'équation (7) i 2 exp x xo , où xo est la 2 6x 2 valeur la plus probable mesurée d'après la hauteur des pics ou une autre source d'information comme une expérience précédente, ou sur une série de telles expériences portant sur des échantillons différents provenant de différentes personnes, ou de différentes personnes malades,etc. ; et la variance o- est choisie par l'utilisateur pour exprimer la fiabilité qu'il attribue à la première mesure. Il peut se fonder sur des valeurs mesurées auparavant pour des échantillons différents, et qui ont donc donné des répartitions statistiques connues, sur lesquelles la distribution de probabilités a priori doit s'ajuster. La moyenne égale à xo de la fonction exprime que les valeurs réelles doivent être proches des valeurs mesurées et qu'il n'y a pas de corrélation entre les différentes concentrations de protéines. La distribution de probabilités a posteriori pour la variable x peut alors être déterminée par l'équation (8) d'après (6) et (7) : 1 yùHx 2 1 xùxo z 2 6 2 6X où le signe infini est ici symbole de proportionnalité. La dernière étape du procédé consiste à donner une estimation de x d'après cette distribution 15 de probabilités a posteriori. Différents critères peuvent être choisis ; on choisit ici une estimation par la moyenne z de cette distribution, qui est donnée par l'équation (9) i 2 -ii z H`H+ b 2l H`y+ -b xo 6x 6x 20 matrice identité, les paramètres de l'équation (9) étant tous connus soit par la mesure soit par une détermination de l'utilisateur. D'autres paramètres, tels que la médiane ou le maximum, peuvent être préconisés aussi dans certains cas, selon la fonction 25 de distribution de probabilités a posteriori obtenue. DEUXIEME EXEMPLE Un exemple plus général va maintenant être décrit. Comme certaines causes de fluctuation dans les mesures ne peuvent être parfaitement maîtrisées, ni p(xy,9) oc exp z= 6 où I est la tous les paramètres de modélisation calibrés efficacement, il peut être nécessaire d'en ajuster. Dans l'exemple que voici, ces paramètres seront l'écarttype a de la distribution d'une probabilité à priori du bruit b (déjà rencontré à l'exemple précédent) et la largeur du pic chromatographique, ici notée aussi sous forme d'un écart-type 6c. On appellera 0' tous les autres paramètres du vecteur 0, et on notera encore yb =6b let ye =a 2 . Des distributions de probabilités a priori doivent être déterminées pour ces paramètres Yb et Yc. On peut choisir la fonction de Jeffrey p(y) = y' pour le premier et une distribution uniforme entre deux valeurs conventionnelles (choisies par l'utilisateur) Ycm n et Ycmax pour le second. La distribution de probabilités a posteriori pour les variables [x Ybyc' en fonction de y et 8' est donnée par l'équation (10) p(x,Yb,Yc Y,B')p(x)p(Yb)p(YC)p(Yx,Yb,YC,B') d'après la règle de Bayes. Cette distribution n'est plus gaussienne, et sa moyenne sera estimée par une méthode d'échantillonnage stochastique faisant appel à un générateur de vecteurs aléatoires reproduisant cette distribution. L'estimation de la moyenne consistera à obtenir, pour chacune des variables x, Yb et yc, la moyenne des valeurs produites par ce générateur. On peut utiliser une structure de Gibbs qui permet de transformer l'échantillonnage d'une loi multivariée en un échantillonnage de lois monovariées ou gaussiennes. L'algorithme du générateur consistera donc à initialiser [x yb yC] à des valeurs x(0) (o) 7c(o) Yb , et, pour k variant de 1 à K, à engendrer successivement x(k+1) t ~x y, Y(k)Yck)) , Ybk+1> (Yby (k+1) k) h ,x 7c 7(k+1) p(y y,x~k+1) yak+1) où le signe û signifie que l'élément de gauche est tiré aléatoirement selon la distribution de probabilités de l'élément de droite, par exemple en 10 utilisant l'algorithme de Métropolis-Hasting, ou l'algorithme de génération de nombres aléatoires. Ces trois distributions de probabilités pourront correspondre respectivement à une gaussienne multivariée N 1 p(xy,Yb,Yc)ù(2z)z R 1 exp û~(x- /- 1(xù,u 15 avec ,u=(Hr,Hj 1H7,y, R+Yb1(Hr~HJ1 , une distribution gamma aù1 p Yb Yb (Yb Y, x,Yc)= fia ~a) exp r 11z a=M/2ä6= yùH7 x /2, et F est la fonction gamma, 20 et une distribution de probabilités p (Yc y, x, Yb ) exp 1 2 Yb Y Hy~ Jv[7cn;7cmax7c) , avec avec u qui est la fonction indicatrice de l'intervalle normalisé [ycminycmax appelée aussi distribution constante sur l'intervalle. Cette distribution peut être échantillonnée par une algorithme de Metropolis-Hasting connu des statisticiens. TROISIEME EXEMPLE On exposera ci-dessous un troisième exemple qui illustre une situation où plusieurs facteurs de la mesure (gain du système, temps de rétention, en plus du bruit) sont tenus pour incertains, en étant instables d'une mesure à une autre, et doivent être estimés par une méthode probabiliste. Ces facteurs sont regroupés en un vecteur de facteurs instables instable qu'on engendre par itérations par un échantillonneur de Gibbs, avec des distributions de probabilités a posteriori et conditionnelles. Voici comment les différents facteurs peuvent être engendrés : 1 ) Le vecteur x(k) exprimant la hauteur des pics et qui intervient aussi dans le procédé, peut être obtenu avec un générateur de loi multinormale de moyenne (H`H)- H`yûH`H*x*) et de matrice de covariance o (H `H) 1. 2 ) Le vecteur ek> résultat de la concaténation en vecteur-colonne du contenu de la matière E. de l'équation (3) (gain du système) est obtenu avec un générateur de loi multinormale de moyenne (GtG) -1 (Gty) et de matrice de covariance 6b(G`G)lprovenant d'une autre écriture de l'équation (3) . y = G,+b. 3 ) Les temps de rétention t dans la colonne de chromatographie font aussi partie des 5 paramètres instables, et chacun des Ti est engendré par un algorithme de Metropolis-Hasting indépendant : Générer T'ùN(T;6T) etu Um Calculer 8i=exp Zn_b2{O~iûOzi} avec Au = w(x(k), (k),[T(k) ... T(i) T' T(i-i) . T(kù1)J 10 Ali w(x(k), (k),[T(k) ... T(1) T(k 1) T(+1 i) ... Tl(kù1)J Si 8>log (u) alors T(k) T' sinon T(k) T(kù1) On rappelle que le Y est le vecteur des 15 variables Yi, égal à 2 Yù x D 8iTza~..sa~ a ..ct . T +x D 8iTza~..sct . T ~j p ap a p ap a a p,i,J 4 ) enfin, 6b2(k) ki`(x,, t) _ est obtenu par un générateur de loi gamma de densité avec 20 a=NM/2 ; 1/,6=W(x, ,t)/2. La résolution consiste à obtenir des valeurs de ce générateur aléatoire et de leur appliquer le critère d'estimation décidé auparavant, tel que la moyenne. Lorsque ce critère convergera, on obtiendra le 25 résultat recherché. Le distributeur de probabilité a posteriori est : p(x,,t,y ,e"y)=p(yx, ,t, Yb,e")p(x)p(Yb)p()1iz P(T) Avec p(yx,,t,yb,9")= p(yx,9) et p(x) comme dans le premier exemple, p(yb) identique à celle du deuxième exemple, 1 1 ù o z eXp 2 est la valeur connue d'expériences précédentes, ou la valeur du gain calculé à partir de la hauteur estimée du pic et la valeur connue de x sur cette expérience ou des expériences similaires, ou une valeur arbitraire, par exemple 0, si la valeur de l'écart-type tend vers l'infini ou à une valeur très importante par rapport à l'écart-type du bruit ; 6 un intervalle de recherche pour lesIl doit englober toutes les valeurs connues dei ; p(Ti) est la distribution uniforme choisie entre deux valeurs Ti min Timax choisies de façon à englober toutes les valeurs connues de Ti. Elles peuvent à l'extrême être choisies de façon à englober tout le signal. QUATRIEME EXEMPLE Voici encore un quatrième exemple. Ici, on cherche à obtenir certains facteurs du modèle analytique qui sont supposés être stables, c'est-à-dire constants d'une mesure à une autre. Il peut s'agir des proportions H de molécules de chaque espèce chimique d'après le nombre de charges ; ces proportions sont supposées dépendre du solvant utilisé dans la mesure pour mouvoir l'échantillon dans la colonne de chromatographie. On procède alors par une mesure de calibration distincte de la mesure principale, en injectant une quantité connue de l'espèce chimique considérée dans l'appareillage, en reproduisant les autres conditions de la mesure principale, de sorte que x est connu. L'algorithme du quatrième exemple permet d'obtenir F t. Certains facteurs comme le gain du système de digestion Dip, et les écarts-types exprimant la largeur des pics dans le chromatographe 3 et le spectromètre de masse 4,6d et o, sont supposés connus. Le procédé pourrait encore s'appliquer sinon. On peut procéder de la façon suivante. 1 ) Le vecteur e' est obtenu avec un générateur de loi multinormale identique à celui de l'exemple précédent. 2 ) tm peut être encore obtenu par un algorithme de Metropolis-Hasting indépendant semblable 25 à celui de l'exemple précédent. 3 ) Chaque élément de peut être engendré par un algorithme de Metropolis-Hasting indépendant. 4 ) o-b2(k) est obtenu par un générateur de -2(aù1) / -2 loi gamma de densité p(ab2)= ~a r )exp û b , où ra ,l3 a=NM/2;1/f=ço(t, ,Tc)/2, selon un algorithme connu des statisticiens : Générer Tc'ûD(TCl;62,,) et u ûu[o;1], D distribution de Dirichlet de moyenne Tc, et de variance u ; Selon l'algorithme Calculer 8 ~ =exp û ab2{Aij -02i} avec Olé =Ço(tk~ (k) TC~ TC{ l) ... Trik 1)]) 1 0 0 = ~tk (k) [ k) ~(k) ~(k 1) k 1) TL(k1)]) 2i , t t t+1 1 Si 8i >log (u) , alors Tc(k) Tc~ ; sinon Tc{ k) ~TC(k-1) t t Yù x D 8iTza~ a~ ..s..c (Ti ) + xpa Dp8iTza~ a~ ..s..c (Ti j p ap a a a On procède en faisant converger les distributions de probabilité de ces facteurs , t, H et b par boucles successives d'itérations, comme dans le troisième exemple. Quand la distribution de 20 probabilités de H a convergé, elle peut être utilisée dans la mesure principale et les conditions des exemples précédents, par exemple dans la fonction 'i du troisième exemple. 2 15 avec ço(t,,TC)= Une telle calibration pourrait être appliquée à la détermination d'autres facteurs tenus pour stable, comme 6si et coi dans certaines conditions. Le procédé peut être complété par certains raffinements. On peut ainsi utiliser le marquage isotopique en associant les molécules de synthèse de concentration connue, portant un certain nombre d'isotopes, à chaque molécule d'intérêt. La molécule d'intérêt et la molécule d'étalonnage ayant quasiment les mêmes propriétés physiques ou chimiques, certains paramètres peuvent être retrouvés. Il peut s'agir du gain EZ de l'appareil de mesure ou d'autres paramètres comme le temps de rétention Ti des molécules d'intérêt. Un étalonnage externe peut être réalisé en mesurant des molécules en concentration connue dans un environnement simplifié pour connaître certains paramètres du modèle. Les distributions de probabilités à prioris par lesquelles on donne un départ au calcul de certains facteurs peuvent comprendre les fonctions statistiques connues représentées par leurs paramètres, comme une valeur centrale et un écart-type, ou un intervalle de variation entre deux valeurs extrêmes. L'invention peut être étendue aux chromatographies multidimensionnelles ; les données de la matrice H seront alors un tenseur au lieu d'une matrice. Enfin, l'invention peut être étendue à d'autres molécules que les protéines. La figure 3 résume le procédé.30 REVENDICATIONS 1) Procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon, consistant à faire passer l'échantillon par un appareillage (2, 3, 4) et à obtenir ainsi un signal consistant en au moins un spectre (y) représentatif des concentrations des molécules en fonction d'au moins une variable (t, m) et à estimer les concentrations (x) des molécules ; caractérisé en ce qu'il consiste à faire une modélisation analytique du signal par une fonction de modélisation comprenant des facteurs, dont les concentrations (x) et d'autres facteurs ; puis à attribuer aux concentrations et à certains des autres facteurs, qui sont des facteurs incertains, des distributions de probabilités a priori ; à déduire du signal des distributions de probabilités a posteriori pour les concentrations, en utilisant la fonction de modélisation, des estimations des autres facteurs et les distributions de probabilités a priori, et à estimer les concentrations (x) d'après un paramètre déduit des distributions de probabilités a postériori. 2) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisé en ce que le paramètre des distributions de probabilités a priori des concentrations est une moyenne desdites distributions de probabilités postérieures.30 3) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisé en ce que le paramètre des distributions de probabilités a priori des concentrations est une médiane desdites distributions de probabilités postérieures. 4) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisé en ce que le paramètre des distributions de probabilités a priori des concentrations est un maximum desdites distributions de probabilités postérieures. 5) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les distributions de probabilités a priori comprennent des fonctions gaussiennes. 6) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdites fonctions gaussiennes sont estimées par des valeurs à priori de la moyenne et de la variance (6b, 62 7) Procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les distributions de probabilités a posteriori sont obtenues empiriquement, par application de nombres aléatoires aux distributions de probabilités a priori. 8) Procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que les facteurs incertains comprennent un bruit du signal. 9) Procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 et précédentes, caractérisé en ce que les facteurs incertains comprennent des temps de rétention (Ti) des molécules dans une colonne chromatographique. 10) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les facteurs incertains comprennent des gains () d'appareils ayant mesuré le signal. 11) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les facteurs incertains comprennent des largeurs de pics de mesure (as) des molécules. 12) Procédé d'estimation de concentration de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une calibration interne consistant en une injection de molécules marqueuses dans l'échantillon, les molécules marqueuses ayant respectivement des 25 propriétés voisines de certaines des molécules de l'échantillon vis-à-vis de l'appareillage et donnant des pics de mesure proches de pics de mesure desdites certaines molécules de l'échantillon. 13) Procédé d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend une calibration externe consistant en une 10 injection de calibration de molécules semblables à certaines des molécules de l'échantillon, mais à des concentrations connues, dans l'appareillage, et à déduire un signal de l'injection de calibration et du modèle analytique certains des autres facteurs. 15 14) Procédé d'estimation de concentrations de molécules selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les molécules sont des protéines. 20 15) Dispositif d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon, comprenant un appareil (3, 4) alimenté par l'échantillon et délivrant un spectre d'ensemble de 25 profils moléculaires représentatif de ces concentrations en fonction d'une variable, caractérisé en ce qu'il comprend un module de traitement (5) conçu pour appliquer le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes. 30 510 16) Dispositif d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'appareil comprend une colonne chromatographique (3) 17) Dispositif d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon la revendication 15 ou 16, caractérisé en ce que l'appareil comprend un spectromètre de masse (4). 18) Dispositif d'estimation de concentrations de molécules dans un échantillon selon la revendication 15, 16 ou 17, caractérisé en ce que l'appareil comprend, en amont, un dispositif de décomposition de protéines (2).