Brevet FR2916275A1 — publié le 20081121

B07/0287FR Association dite : Institut National de Recherche et de Sécurité pour la prévention des accidents du travail et des maladies professionnelles (I.N.R.S) Procédé de détection d'hydrocarbures aromatiques polycycliques Invention de : PICHON Valérie MAISONNETTE Carine SIMON Patrice 1 Procédé de détection d'hydrocarbures aromatiques polycycliques La présente invention est relative à un procédé de détection de 3-benzo(a)pyrène-glucuronide (3-BPG) dans les urines comprenant une première extraction par l'intermédiaire d'un polymère à empreinte moléculaire MIP1_oHp et une seconde extraction sur immunoadsorbant. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP constituent une vaste famille de quelques centaines de composés de structure chimique commune. Les HAP sont des contaminants environnementaux issus de toutes combustions incomplètes de carbones organiques. Le plus connu est le benzo(a)pyrène ou BaP. Tous les phénomènes de combustion sont à l'origine de leur formation (incinération, sidérurgie, moteurs automobiles, feux de cheminée, tabagisme, combustion du gaz, ...). La fumée de cigarette est une source significative d'exposition au benzo(a)pyrène avec environ 0,4 g de benzo(a)pyrène par cigarette (G.P. Casale., et al., Chem. Res. Toxicol. 14 (2001) 192). Dans l'environnement, les HAP sont retrouvés dans tous les milieux que ce soit l'air, l'eau et les sols, ainsi que dans les aliments usuellement consommés, qu'ils soient d'origine animale ou végétale. Ils sont toujours émis sous forme de mélange, avec des proportions relatives des divers composés variables selon la source de combustion. Dans l'air, ils se présentent, pour certains HAP les plus légers, sous forme gazeuse, mais ils sont surtout trouvés sous forme particulaire. Les émissions de benzo(a)pyrène en milieu rural sont en moyenne de 0.2 ng/m3. Dans les villes, elles varient de 1 à 10 ng/m3. Mais la plus importante exposition aux HAP a lieu pour les ouvriers sur leurs lieux de travail (R. Santella., et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 3 (1994) pp 137; D. Kang, et al., J. Occup. Environ. Med. 52 (1995) pp 593, R.K. Bentsen-Farmen, et al., Int. Arch. Occup. Environ. Health 72 (1999) pp 161, J. Gundel et J. Angerer, J. Chromatogr. B 738 (2000) pp 47, M.-T. Wu, et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11 (2002) pp 311. En milieu professionnel exposé, la peau et les poumons sont des voies de pénétration prépondérantes tandis que l'alimentation est majoritaire en ce qui concerne la population générale. Fortement hydrophobes, ces molécules pénètrent dans l'organisme humain par inhalation, ingestion ou par voie cutanée (IARC monography, Vol. 32 Polynuclear Aromatic Compounds, Part 1, Chemical, Environmental and Experimental Data, International Agency for Research on Cancer, Lyon, 1983). La plus grande partie de ces HAP est rapidement éliminée par les urines sous forme de métabolites sulfatés ou glucuronidés. Cependant la partie restante exerce son activité cancérigène via ces métabolites en interagissant avec l'ADN. En effet, de nombreux HAP, comme le benzo(a)pyrène, sont suspectés d'être cancérigènes, mutagènes et tératogènes. Plusieurs études épidémiologiques en milieu professionnel ont en effet montré que les HAP sont impliqués dans l'apparition de nombreuses formes de cancers chez l'homme. Le cancer du scrotum des petits ramoneurs de Londres a été l'un des premiers cancers professionnels identifiés, au 181ème siècle ; il était dû au passage cutané des polluants présents dans la suie. Le cancer de l'oesophage et de l'estomac ont été reliés à l'ingestion d'aliments très fumés, tandis que le cancer de la vessie, des voies nasales ou du poumon surviennent après inhalation. Les instances internationales compétentes ont d'ailleurs classé certains HAP comme des cancérogènes probables ou possibles. Les 16 HAP plus particulièrement définis par l'Agence de Protection de l'Environnement (EPA) sont l'acénaphtène, l'acénaphtylène, l'anthracène, le benzo(a)anthracène, le benzo(a)pyrène, le benzo(b)fluoranthène, le benzo(g,h,i)perylène, le benzo(k)fluoranthène, le chrysène, le dibenz(a,h)anthracène, le fluoranthène, le fluorène, l'indéno(1,2,3-c,d)pyrène, le naphtalène, le phénanthrène et le pyrène. Il est donc important de pouvoir estimer le risque d'exposition des humains à ces molécules. Cela implique de disposer d'outils analytiques performants pour doser les faibles teneurs de ces composés dans les urines. L'extraction liquide-liquide ou les méthodes d'extraction en phase solide sur des supports classiques habituellement utilisés pour l'extraction de métabolites d'HAP ne constituent pas des méthodes sélectives et leur application à des matrices complexes telles les urines induit de nombreuses co-extractions de composés qui limitent la sensibilité de la procédure. Pour un suivi "sur le terrain" d'un nombre important de personnes et pour être utilisées en routine par la médecine du travail, il apparaît nécessaire de substituer les méthodes classiques mais longues et coûteuses par d'autres plus simples de type tests immuno-enzymatiques ou ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). De nombreux métabolites urinaires d'HAP ont été utilisés comme marqueur d'exposition aux HAP dans l'environnement ou sur des lieux de travail dont en particulier le 1-hydroxypyrène (1-OHP). Cependant, l'utilisation de métabolites du benzo(a)pyrène est plus indiquée. En particulier, le 3-hydroxybenzo(a)pyrène (3-OHBP), métabolite phénolique du benzo(a)pyrène présente une meilleure corrélation à différents scénarios d'exposition aux HAP que le 1-OHP. Mais ceci nécessite cependant une étape d'hydrolyse pour obtenir le 3-OH-BP à partir de son glucuroconjugué. Le 3-benzo(a)pyrène-glucuronide (3-BPG) a été préféré comme biomarqueur représentatif du risque d'induction cancérigène (C. Johnson et A. Greenberg, J. Chromatogr. B 728 (1999) pp 209) Celui-ci a l'avantage d'être aisément détecté en raison d'une fluorescence plus intense. Ainsi était-il très intéressant de développer une méthode de dosage de ce biomarqueur urinaire. Le 3-BPG est présent à l'état de traces dans les urines (0.1-5 ng/L) soit à des concentrations 200 fois moindres que celles du 1-OHP. Une technique de détection fiable nécessite une concentration de ces traces de 3-BPG tout en obtenant une grande sélectivité lors de l'extraction en raison de la complexité de la matrice urinaire. Cependant, il n'existe à ce jour aucune procédure d'extraction sélective et d'isolement du 3-BPG des matrices complexes. La demanderesse a découvert qu'en utilisant des techniques d'extraction sélectives basées sur la reconnaissance moléculaire : les immunoadsorbants (IS) et les polymères à empreintes moléculaires (MIP), on pouvait isoler sélectivement puis doser le 3-BPG afin de quantifier la mesure de l'exposition aux HAP. Le 3-BPG est ensuite dosé par méthode ELISA. Il est ainsi nécessaire d'associer un polymère à empreintes moléculaire (MIP) à un immunoadsorbant (IS) afin d'isoler totalement le 3-BPG de la matrice urinaire et des autres composés de structures proches qui fausseraient la réponse des tests ELISA. L'invention a ainsi pour objet un procédé de détection de 3-BPG dans les urines comprenant une première extraction par l'intermédiaire d'un MIP synthétisé pour le piégeage du 1-OHP, nommé MIP1_oHp, puis une seconde extraction sur IS mettant en oeuvre des anticorps spécifiques du 3-BPG et un dosage par la méthode ELISA du composé 3- BPG. D'autres objets de l'invention apparaîtront à la lumière de la description, des exemples qui suivent ainsi que des dessins annexés à la présente demande. La Figure 1 décrit la procédure de synthèse d'un MIP (adapté de Trends in Analytical Chemistry, 24, 5 (2005)409.) La Figure 2 montre les différents taux de récupération obtenus après percolation de 5 mL d'urine-PBS (1 : 3, v/v) et dopés avec 0,2 g/L de chaque composé sur l'IS BaP-13. L'étape de lavage est effectuée avec 0,5 mL d'eau contenant 50% d'acétonitrile, l'élution est effectuée avec 3 mL 80% d'acétonitrile dans l'eau. Ces résultats sont la moyenne de trois tests.La Figure 3 montre une comparaison de l'affinité du MIP1_oHp (30 mg de phase) pour trois métabolites d'HAP après percolation de 5 mL d'urine contenant 2% de PBS (0.25M) et dopée avec 2 ng de 1-PG, 3-BPG ou 1-OHP. Le lavage est effectué avec 2 mL d'une solution à 70% de méthanol dans l'eau en voUvol, et l'élution est effectuée avec 5 mL de méthanol., Ces résultats sont la moyenne de trois tests.La Figure 4 présente le bilan de la procédure d'isolement du 3-BPG et du 1-OHP d'une matrice urinaire pour leur dosage par test immunoenzymatique de type ELISA. Les immunoadsorbants (IS) sont constitués d'anticorps, dirigés contre une molécule ciblée, immobilisés sur un support solide. Ceci permet une extraction sélective basée sur la reconnaissance spécifique d'un anticorps pour son antigène, c'est à dire la molécule contre laquelle sont dirigés les anticorps. Les polymères à empreintes moléculaires (MIP) sont, quant à eux, obtenus par polymérisation de monomères en présence d'une molécule cible qui est éliminée après synthèse afin de libérer des cavités propres à reconnaître cette molécule lors de la percolation d'un échantillon sur le MIP. Le principe de la synthèse est représenté sur la Figure 1. La synthèse d'un MIP1_oHp c'est-à-dire un MIP reconnaissant le 1-OHP, interférent majeur dans l'urine et également reconnu par l'anticorps monoclonal BaP-13 (Exbio Vestec, République Tchèque) est connue et a été décrite par Kirsch et al. (The Analyst 126 (2001) pp 1936). Néanmoins, ce support avait été synthétisé pour être utilisé comme capteur et non à des fins d'extraction. De plus, la possible réactivité croisée de ce support pour d'autres composés de structure proche également présents dans les urines (le 1-PG et le 3-BPG) n'avait jamais été étudiée. Ce MIP1_oHp permet d'isoler le 1-OHP du reste de la matrice mais pas le 3-BPG des autres interférents. La demanderesse a combiné ce mode d'extraction avec l'IS. Ainsi, une fois l'échantillon urinaire débarrassé de l'interférent majeur, le 1-OHP, grâce au MIP1_oxr, une seconde extraction avec l'IS peut avoir lieu qui permettra d'éliminer le 1-PG et ainsi d'isoler le 3-BPG dans la fraction à analyser par ELISA. Les anticorps monoclonaux BaP-13 ont été utilisés car leur réactivité croisée vis à vis des 16 HAP définis par l'EPA, de quelques autres HAP méthylés et du 1-hydroxypyrène (1-OHP) avait été étudiée. Un IS a ainsi été synthétisé avec des anticorps BaP-13 en utilisant une procédure d'immobilisation sur sépharose décrite par M. Gomes, et R. Santella, (Chem. 6 2916275 Res. Toxicol. 3 (1990) pp 307) mais en optimisant la densité de greffage des anticorps, afin de limiter les coûts de fabrication, ainsi que les conditions de percolation, de lavage et d'élution. Ainsi, 100 ug d'anticorps monoclonaux du clone BaP13 ont été immobilisés sur 30 mg de gel de Sépharose et introduit après greffage dans une cartouche d'extraction entre deux frittés pour être utilisés comme phase d'extraction. En fait, l'utilisation seule de l'ISBap_13 ne permettrait pas d'isoler complètement le biomarqueur d'exposition 3-BPG du reste des composés de structures proches. De plus, l'étape d'enrichissement de l'échantillon est indispensable afin d'atteindre des concentrations de l'ordre du ng/L dans l'urine. La demanderesse a ainsi développé une méthode d'extraction simple et sélective pour le composé ciblé qui permet d'isoler complètement le biomarqueur 3-BPG du reste des composés également présents dans les urines tout en rendant possible l'analyse de traces de ce composé. La simplicité d'utilisation des deux supports MIP et IS est manifeste car on peut les utiliser directement sur les échantillons d'urine sans passage préalable sur cartouche de C18 dans le cas de l'IS ou sans changement de solvant dans le cas du MIP. Ces deux supports sélectifs sont utilisés en extraction sur phase solide classique. Il est ainsi nécessaire de combiner les deux modes d'extraction sélectifs. Une première extraction a ainsi lieu sur le MIP1_oHP afin d'éliminer dans un premier temps, le 1-OHP de l'échantillon d'urine. Ensuite, les fractions contenant le biomarqueur, après percolation et lavage, sont récupérées et subissent une seconde extraction sélective sur l'ISBaP..13 permettant d'isoler le 3-BPG du reste des composés de la matrice urinaire. Enfin, le dosage par test ELISA du 3-BPG est envisagé puisque celui-ci est maintenant le seul composé présent dans l'éluat. De préférence, l'étape de lavage du MIP1_oHP s'effectue dans une solution de méthanol à 70% en volume dans de l'eau et l'étape d'élution s'effectue dans du méthanol pur. De préférence, l'étape de lavage de l'IS s'effectue dans une solution d'acétonitrile à 50% en volume dans de l'eau et l'étape d'élution s'effectue dans une solution d'acétonitrile à 80% en volume dans de l'eau. L'association de ces deux techniques fournit une très haute sélectivité et rend ainsi possible le dosage immunoenzymatique du 3-BPG sans risque de faux négatif ou de faux positif puisque le biomarqueur est totalement isolé des autres composés présents dans les urines. Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant présenter un caractère limitatif. Exemple 1 : Recherche de sélectivité de 1' ISBap_13 Dans un premier temps la sélectivité de l'IS pour le 3-BPG a été évaluée en comparant la rétention sur les anticorps des autres molécules de structure similaire et également présentes dans l'urine, soit le 1-PG et le 1-OHP. Ceci a été réalisé en percolant sur l'ISBaP_13 un mélange de ces trois composés et en mesurant les taux de récupération dans les fractions de percolation (5 ml d'urine diluée par du tampon phosphate salin û 5 x 10-3 M tampon phosphate, NaCl 0,15 M, pH 7.4- rapport de dilution : 1/3, v/v), de lavage (0.5 ml d'un mélange acétonitrile : eau 1:1) et d'élution (3 ml d'un mélange acétonitrile : eau 8:2). Les résultats de cette étude sont présentés sur la Figure 2 et correspondent à la préconcentration de 5m1 d'urine-PBS (1:3, v/v) dopée à 0,2 g/L de chaque composé. Après extraction sur ISBaP_13, il s'avère que seul 7% de 1-PG sont encore récupérés dans la fraction d'élution. En revanche il persiste 22% de 1-OHP, considéré comme l'interférent majeur en raison de sa concentration 200 fois supérieure à celle du biomarqueur 3-BPG. Exemple 2 : analyse de MIP1_oHP Dans un premier temps l'affinité du MIP1_oHp pour trois molécules de structures proches a été évaluée en comparant la rétention de chacun d'entre eux sur le MIP lors d'une extraction dans une matrice urinaire (urine-PBS, 1:3, v/v). Ces résultats sont présentés sur la Figure 3 et correspondent à la préconcentration de 20 ng de chaque composé dans 5 ml d'urine contenant 2% de PBS (0.25M). Il s'avère que ce MIP1_oHP est très sélectif à la molécule ciblé, c'est à dire le 1-OHP puisqu'il est fortement retenu malgré une étape de lavage et extrait à 81% dans la fraction d'élution obtenue par percolation de 5 ml de méthanol. Ainsi, l'échantillon urinaire est débarrassé de l'interférent majeur, le 1-OHP, grâce au MIP1_oHp. La Figure 4 montre le schéma bilan de la procédure d'isolement du 3-BPG d'une matrice urinaire pour son dosage par test immunoenzymatique. REVENDICATIONS 1. Procédé de détection du 3-benzo(a)pyrène-glucuronide (3-BPG) dans les urines comprenant une première extraction par l'intermédiaire d'un polymère à empreinte moléculaire reconnaissant le 1-OHP (MIP1_oHp), une seconde extraction sur immunoadsorbant (IS) et un dosage par la méthode ELISA du composé 3-BPG, caractérisé par le fait que l'anticorps monoclonal utilisé dans la seconde extraction est le BaP-13. 2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'étape de lavage du MIP1_oxr s'effectue dans une solution de méthanol à 70% en volume dans de l'eau et l'étape d'élution s'effectue dans du méthanol pur. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape de lavage de l'IS s'effectue dans une solution d'acétonitrile à 50% en volume dans de l'eau et l'étape d'élution s'effectue dans une solution d'acétonitrile à 80% en volume dans de l'eau.15