Brevet FR2919391A1 — publié le 20090130

METHODE IMMUNOLOGIQUE POUR LA DETECTION DE LA BRUCELLOSE DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne un procédé immun-enzymatique permettant le diagnostic de la brucellose. Plus précisément, ce procédé de type ELISA indirect utilise, comme charge antigénique, 10 une suspension bactérienne de Brucella inactivée. Il s'avère que ce procédé est particulièrement performant en termes de spécificité et de sensibilité, notamment chez les suidés. 15 ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE La brucellose est une zoonose, maladie des animaux transmissible à l'homme, due aux bactéries du genre Brucella. Coccobacilles, Gram négatif, cette bactérie comporte plusieurs espèces et biovars. 20 L'espèce qui atteint principalement les suidés est Brucella suis. Il existe 5 biovars de Brucella suis et les trois premiers sont le plus souvent en cause chez les suidés. En Amérique et en Asie, ce sont les biovars 1 et 3, très pathogène pour l'homme, qui interviennent. En Europe, c'est Brucella suis biovar 2 qui est isolée quasi-exclusivement 25 depuis de nombreuses années chez les suidés domestiques et sauvages (Garin-Bastuji B., et al, 2001). Brucella suis biovar 2 est décrit comme peu pathogène pour l'homme mais sa transmission à l'homme a été documenté (Vaillant V. et al, 2005). En France, la brucellose porcine est une maladie à déclaration obligatoire et elle est 30 inscrite sur la liste des maladies réputées contagieuses (Décret N 2001-441 du 21 mai 2001). En cas de suspicion, des prises de sang et des prélèvements sur les animaux malades ou avortés sont effectuées (A.M. du 10/12/2002). Si le diagnostic de brucellose est confirmé par le laboratoire, l'abattage des porcs et la désinfection des bâtiments est indispensable pour l'assainissement. Cette maladie représente donc un enjeu économique 35 important. Le diagnostic clinique est difficile, la symptomatologie n'est pas spécifique. Chez le porc, la brucellose atteint l'appareil génital, en causant des avortements chez les femelles et des lésions testiculaires chez les mâles. Le recours aux examens de laboratoire est donc indispensable pour confirmer une suspicion de brucellose (Philippon A et al). La sérologie avec les tests classiques, tels que l'Epreuve à l'Antigène Tamponnée (BAT ou Rose Bengale) considérée comme la technique de référence, la réaction de fixation du complément (FC) et le sérodiagnostic de Wright (SAW), est utile mais reste peu spécifique. En effet, le porc porte de manière latente et fréquente Yersinia enterolitica 0:9, bactérie responsable de réactions sérologiques croisées. Toutefois, l'EAT et la FC sont de longue date les techniques les plus employées pour le dépistage de la brucellose animale. Epreuves officielles tant au plan international qu'européen, ce sont aussi les épreuves standardisées et décrites comme les plus fiables aujourd'hui pour le dépistage de la brucellose. L' EAT est une épreuve très sensible, détectant précocement l'infection mais qui présente quelques défauts de spécificité, notamment des faux positifs en cheptel indemne, surtout chez le porc. Ces propriétés en font une méthode de surveillance utilisée pour la détection des cheptels infectés. La FC est quant à elle plus spécifique, c'est-à-dire qu'elle révèle moins de faux positifs, mais elle est plus tardive et, d'une façon générale, légèrement moins sensible que l'EAT, ce qui se traduit par plus de faux négatifs en cheptel infecté. C'est l'utilisation conjointe des deux épreuves qui permet d'accroître la sensibilité du dépistage et d'assainir plus efficacement les cheptels infectés, si l'abattage concerne l'ensemble des animaux positifs à l'une au moins des deux épreuves. 30 Cependant, la très faible prévalence de l'infection s'accompagne obligatoirement d'une proportion importante de résultats faussement positifs. Du fait de leur spécificité respective, ce phénomène concerne davantage l'EAT que la FC. Ces résultats faux positifs sont aujourd'hui fréquemment liés à des infections par des micro-organismes croisant au plan antigénique avec les Brucella, principalement Yersinia enterocolitica 0: 35 9.25 L'ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) indirect a, quant à lui, fait l'objet de nombreux travaux ces vingt dernières années. Très sensible, il semble moins spécifique que les deux précédentes épreuves. Sauf chez les bovins, il ne fait par ailleurs pas encore l'objet d'une standardisation internationale et n'est donc pas reconnu comme test officiel. Pour rappel, l'ELISA indirect permet de doser des anticorps dans un échantillon sérique ou plasmatique. Pour cela, l'échantillon à doser est déposé dans un puits sensibilisé par l'antigène, susceptible de réagir avec l'anticorps recherché. La présence du complexe antigène û anticorps est détectée par ajout d'un anticorps secondaire anti-espèce du premier anticorps et conjugué à une enzyme (phosphatase, peroxydase, ...). Le conjugué réagit alors avec un substrat incolore pour donner un produit de réaction coloré. La majorité des tests proposés utilise comme antigène le LPS (LipoPolySaccharide). Or, celui-ci possède des épitopes communs avec les bacilles Gram négatifs, par exemple avec Yersinia enterocolitica 09, Vibrio cholerae, Francisella tularensis, ... Il constitue aussi l'antigène majeur des Brucella en phase lisse et la majorité des anticorps produits chez l'hôte infecté sont spécifiques d'épitopes portés par cette molécule. Cet épitope est constitué de 100 résidus de 4-formamido-4,6-didéoxy-D-mannopyranoside. Ainsi, il apparaît que seule la bactériologie constitue aujourd'hui un examen de choix et permet un diagnostic de certitude, en cas d'isolement. L'inconvénient majeur réside dans le fait que les Brucella poussent lentement sur les milieux de culture. Ainsi, 10 à 15 jours d'incubation sont nécessaires. Il existe donc un besoin persistant de développer de nouvelles méthodes de diagnostic rapide de la brucellose, de sensibilité et de spécificité acceptables. EXPOSE DE L'INVENTION Pour répondre à ce besoin, l'invention propose un procédé et un kit basé sur un dosage immuno-enzymatique permettant le dépistage spécifique de la brucellose, notamment porcine. 35 Plus précisément et selon un premier aspect, l'invention propose un procédé de diagnostic de la brucellose chez un sujet à tester comprenant les étapes suivantes : mettre en contact une suspension bactérienne de Brucella inactivée et un échantillon du sérum du sujet ; - effectuer une révélation immuno-enzymatique. La première étape permet donc une interaction antigène-anticorps, dans le cas où le sérum du sujet testé contient des anticorps spécifiques de l'antigène mis en oeuvre. La deuxième étape consiste à révéler cette interaction via une réaction immunoenzymatique. Ce procédé correspond donc au principe d'un ELISA indirect classique. Toutefois, les développements des tests ELISA actuels reposent essentiellement sur la recherche d'antigènes uniques, très spécifiques. A contrario, le Demandeur s'est orienté vers un cocktail antigénique correspondant à une suspension bactérienne inactivée. Or, dans le cadre de l'invention, il a été montré que cette solution technique, de mise en oeuvre aisée, donnait d'excellents résultats tant en termes de spécificité que de sensibilité. Il a donc été abandonné la sélection d'un épitope très spécifique mais peu sensible à l'origine des réactions croisées, le LPS, en faveur d'une suspension cellulaire entière correspondant à un cocktail antigénique puissant. Une souche particulièrement adaptée, notamment pour le diagnostic chez les suidés, est la souche Brucella suis. Le biovar 2 étant le plus fréquent chez ces suidés, ce biovar est avantageusement sélectionné en tant que source antigénique. D'autres souches de Brucella peuvent être choisies dans le cadre du procédé mis en oeuvre. En effet, il convient de choisir, en fonction du sujet à tester, l'espèce bactérienne prédominante dans l'espèce du sujet. Par exemple, Brucella abortus est prédominante chez le bovin. Une autre caractéristique de l'invention est que la suspension bactérienne mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est inactivée. Cette inactivation permet la suppression de l'activité biologique de la bactérie. Le repiquage sur milieu de culture confirme la destruction totale de la bactérie et permet un contrôle de stérilité. De manière avantageuse, la dénaturation est réalisée par exposition à la chaleur de la suspension bactérienne.. En pratique, Brucella étant sensible à la chaleur humide (typiquement à 121 C pendant au moins 15 minutes) et à la chaleur sèche (typiquement à 160 û 170 C pendant 1 heure), de telles conditions de dénaturation sont mises en oeuvre Comme déjà dit, ce procédé est avantageusement destiné aux suidés, en particulier lorsque la charge antigénique est issue de Brucella suis biovar 2. Cependant, il peut également être mis en oeuvre pour d'autres animaux d'élevage, tels que les caprins ou les bovins, les ovins, les canins ou les hommes. L'échantillon biologique testé à l'aide de ce procédé est avantageusement du sérum. Il a également été mis en évidence, dans le cadre de l'invention, que la dilution élevée de ce sérum était un facteur important, en particulier pour éliminer au maximum les faux positifs. Dans le cas notamment des suidés, une forte dilution des sérums au 1/1000 ou au 1/2000 garantit un signal spécifique élevé et une diminution importante de réponses faussement positives. En pratique, le sérum à tester est donc dilué à hauteur d'au moins 1/1000, voire de 1/2000. Sur la base d'une telle dilution, il est préconisé de mettre en contact environ 105 bactéries 20 inactivées avec 100 ] du sérum dilué du sujet à diagnostiquer, avantageusement un suidé. Les conditions de la mise en contact ou incubation peuvent être déterminées par l'homme du métier, tant au niveau de la température que du temps d'incubation ou de l'agitation. 25 De manière classique, l'agitation ou la température favorise l'interaction antigène-anticorps. Selon un second aspect, l'invention concerne un kit, également appelé trousse, de diagnostic de la brucellose, contenant des réactifs prêts à l'emploi pour la mise en oeuvre 30 du procédé revendiqué et donc pour la détection d'anticorps anti-brucelliques spécifiques de la brucellose, notamment chez les suidés. Dans sa composante essentielle, ce kit ou trousse comprend un support recouvert, par adsorption à sa surface, de la charge antigénique. Un tel support est dit sensibilisé par l'antigène . Comme déjà mentionnée et dans le cadre de l'invention, la charge antigénique est maîtrisée en qualité et en quantité. Il s'agit d'une suspension bactérienne de Brucella, avantageusement Brucella suis, encore plus avantageusement de biovar 2. Cette suspension bactérienne est inactivée avant son adsorption sur le support, avantageusement par la chaleur dans les conditions décrites ci-dessus. Dans un mode de réalisation privilégié, le support sensibilisé par l'antigène se présente sous la forme de microplaques ou de barrettes. De tels supports sont disponibles commercialement, notamment les plaques 96 puits. Il a été déterminé que chaque puits de microtitration contient avantageusement environ 105 bactéries inactivées. De manière classique, le sérum du sujet à diagnostiquer est ajouté dans les puits pour permettre aux anticorps anti-brucellique (s'ils sont présents) de se lier à l'antigène durant l'étape d'incubation. Dans une notice d'utilisation accompagnant la trousse, les conditions d'incubation peuvent être précisées, ainsi que la dilution du sérum à incuber. Comme déjà dit, une dilution élevée du sérum de l'ordre de 1/2000 est préconisée. Dans ces conditions, un volume d'environ 100 l de sérum dilué par puits est particulièrement adapté. Dans un mode de réalisation avantageux, le kit contient également une enzyme marquée conjuguée permettant la détection des anticorps liés à l'antigène, avantageusement une peroxydase. L'activité enzymatique de la peroxydase est révélée à l'aide d'un substrat transformé en un produit coloré, dont on peut suivre la réactivité par spectrophotométrie. L'anticorps anti-espèce conjugué à la peroxydase a la faculté de se lier aux complexes antigènes û anticorps anti-brucelliques. Ainsi, dans le cas d'un sérum porcin, on utilise un anticorps anti-porc. Le kit ou trousse de diagnostic selon l'invention peut en outre contenir un contrôle positif, ainsi qu'éventuellement un contrôle négatif. Le contrôle positif est avantageusement le sérum d'un animal de la même espèce que le sujet, immunisé à l'aide de la charge antigénique selon l'invention. De manière préférée, il s'agit donc d'un sérum de porc immunisé à l'aide d'une suspension de Brucella suis biovar 2 inactivée à la chaleur. Le contrôle négatif est avantageusement constitué du sérum d'un animal sain indemne de brucellose. A l'issue de la réaction, les résultats sont lus directement à l'aide d'un automate adapté 10 aux microplaques 96 puits pour test ELISA, de type spectrophotomètre de plaques. EXEMPLES DE REALISATION L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation 15 suivants, à l'appui de la figure annexée. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs. La figure 1 correspond à un graphe représentant les résultats d'une expérience mise en oeuvre pour déterminer la dilution du sérum à tester la plus adaptée afin de palier les réactions croisées de la brucellose porcine. PARTIE EXPERIMENTALE Fabrication de l'antigène brucellique 25 La souche Thomsen, Brucella suis biovar 2, est repiquée sur des boîtes de gélose trypticase soja + 5% de sérum de cheval puis incubée à 37 C sous 5% de CO2 pendant 72 heures. Les colonies à caractère lisse sont sélectionnées à l'aide d'une solution de cristal 30 violet à 2% et repiquées immédiatement dans des tubes de bouillon tryptose. L'incubation dure 72 heures à 37 C sous 5% de CO2. Un autre repiquage est effectué à partir des cultures en bouillon en flacons de Roux contenant 250 mL de gélose tryptose. L'incubation dure 4 jours à 37 C sous 5% de CO2. 35 Les bactéries sont récupérées par lavage de chaque flacon de Roux avec du PBS 0,02M pH 7,2. Le surnageant est centrifugé à 4 C. 20 La suspension bactérienne est alors inactivée par autoclavage 15 minutes à 121 C puis elle est lavée 2 fois en tampon PBS 0,02 M pH 7,2. Une vérification de l'inactivation est mise en oeuvre en incubant un aliquot de la suspension inactivée sur une gélose tryptose, incubé 4 jours à 37 C sous 5% de CO2. Préparation des microplaques pour la détection de l'anticorps anti-brucellique Des microplaques 96 puits ou des barrettes 16 puits sont sensibilisées par l'antigène brucellique précédemment fabriqué en tampon carbonate / bicarbonate 50 mM pH 9.6, de 10 façon à avoir 1.106 cellules/mL. l000 de cette suspension sont déposés par puits et l'ensemble est incubé sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Un lavage des puits par une solution de PBS / Tween 0.05% à raison de 3 x 2000, est réalisé entre chaque étape. La saturation des puits sensibilisés s'effectue par une solution de Synblock (commercialisée par SEROTEC) : l000 de cette solution sont déposés par puits et le tout est incubé sous agitation à température ambiante pendant 3 heures. 20 Les puits sont lavés comme décrit précédemment. Les puits sont ensuite séchés à 37 C pendant 30 minutes. Les barrettes ou plaques sont scellées sous vide et stockées à 4 C jusqu'à utilisation. 25 Ajout de l'échantillon /Dosage immuno-enzymatique Les échantillons de sérums porcins à tester sont dilués au 1/2000 en tampon PBS / Tween 0.05% / Thimérosal. 30 Des contrôles positifs (sérum de porc immunisé à l'aide de la charge antigénique selon l'invention = Brucella suis biovar 2 inactivée à la chaleur) et négatifs (sérum de porc sain, non immunisé, non porteur) sont également intégrés à l'expérience : ils sont dilués en tampon stabilisateur de façon à obtenir une densité optique finale (lue à 405 nm) respectivement de 1.000 et 0.200. 1000 sont déposés par puits et le tout est incubé sous 35 agitation, à température ambiante, pendant 1 heure. Les puits sont lavés comme décrit précédemment. 15 Le conjugué péroxydase (anti porc (IgG H+L) ù HRP) est préparé en tampon StabilZyme HRP (commercialisé par Diarect). 1001_tl sont déposés dans chaque puits et incubés sous agitation à température ambiante pendant 30 minutes. Les puits sont lavés comme décrit précédemment. La révélation se fait en solution d'ABTS (2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline ù 6 ù sulfonic acid). 100 1 sont déposés dans chaque puits et l'ensemble est incubé 10 minutes, 10 à température ambiante, à l'abri de la lumière (sous papier aluminium par exemple). 100 L d'une solution d'arrêt (SDS 1%) sont alors ajoutés dans chaque puits. L'intensité de la coloration est lue par un lecteur de microplaques à 405 nm. 15 Le zéro optique est effectué sur le témoin conjugué. Calculs et interprétations des résultats 20 Les densités optiques des sérums testés sont exprimées en fonction de la densité optique (DO) du contrôle positif (C+) soit : (DO sérum X 100) / DO contrôle positif La densité optique du contrôle positif avoisine 1.000 ( 10%) - Les échantillons ont un statut positif lorsque le %DO / C+ > 35% 25 - Les échantillons ont un statut négatif lorsque le %DO / C+ RÉSULTATS Détermination de la dilution optimale du sérum 30 Il a été recherché la meilleure dilution pour palier les réactions croisées de la brucellose porcine. Pour cela, il a été réalisé différents passages de pools de sérums porcins indemnes de brucellose (pool dit négatif ), infectés par la brucellose (pool dit positif ) et infectés par une autre maladie que la brucellose en l'occurrence la 35 yersiniose (pool dit Yersinia ).5 Les résultats obtenus sont représentés à la figure 1. Ceux-ci révèlent que le pool positif a une densité optique constante jusqu'à une dilution de 1/2000. En revanche, le pool Yersinia a une densité optique moindre, qui se rapproche de la densité optique du pool négatif à partir d'une dilution au 1/1000. Performances du test proposé / comparaison avec les tests de l'art antérieur Plus de 200 sérums porcins représentés par 73 sérums issus de cheptels infectés par la brucellose, 108 sérums indemnes et 27 sérums potentiellement infectés par une autre 10 maladie autre que la brucellose ont été testée à l'aide du procédé de diagnostic et au kit proposés dans le cadre de l'invention. Sur ce large échantillon, les résultats obtenus ont révélé une sensibilité de 92%, une spécificité de 98,5% et une efficacité de 96%. Pour évaluer l'intérêt réel de l'invention, ses performances ont été comparées à celles des tests déjà disponibles pour le diagnostic de la brucellose porcine. Les résultats obtenus sur 18 porcs sont présentés dans le tableau suivant : Sample EAT FC iELISA Bommeli iELISA VACCI-TEST Moyenne 60-70 Moyenne 20 35 1 1 0 1.962 148.59 P 1.445 136.6 P 2 1 10 0.652 44.16 N 0.278 25.9 N 3 2 107 1.378 102.03 P 1.225 116.0 P 4 0 0 0.117 1.51 N 0.167 15.7 N 0 0 0.128 2.39 N 0.236 21.9 N 6 1 93.3 2.494 190.99 P 0.692 66.0 P 7 2 93.3 2.022 153.37 P 0.813 76.6 P '. 8 3 426 2.011 152.49 P 1.763 166.4 P 9 0 0 0.174 6.06 N 0.181 16.6 N 2 0 1.446 107.45 P 0.866 81.9 P 11 0 0 0.13 2.55 N 0.241 23.3 N 12 0 0 0.126 2.23 N 0.194 18.4 N 13 2 10 0.181 6.62 N 0.447 42.7 P 14 3 426 1.700 127.70 P 1.437 137.5 P 0 0 0.181 -22,51 N 0.138 12. 9 N 16 0 0 0.105 -26,26 N 0.178 15.5 N 17 0 0 0.122 -23,33 N 0.239 22.5 N 18 0 0 0.517 -4,21 N 0.168 15.9 N Sensibilité 100 55.6 77.8 88.9 % Spécificité 100 100 100 % 100 VPP % 100 100 100 100 81.8 90 VPN % 100 69. 2 Positif Négatif 5 1520 L'interprétation des tests est la suivante : - Pour l'EAT (Epreuve à l'Antigène Tamponné) qui constitue la technique de référence officielle, le test est considéré comme positif pour une valeur 1 ; - Pour le FC (réaction de Fixation du Complément), le test est considéré comme positif pour une valeur 20 ; Pour le iELISA Bommeli, qui est un ELISA Indirect présumé mettre en oeuvre le LPS comme charge antigénique, le test est considéré comme positif pour une valeur 70, et négatif pour une valeur Pour le iELISA VACCI-TEST , qui est l'ELISA Indirect faisant l'objet de la présente invention, le test est considéré comme positif pour une valeur 35, et négatif pour une valeur La VPP en % est la valeur prédictive positive d'un signe pour un diagnostic et correspond 25 à la probabilité que le diagnostic soit vrai si le signe est présent. La VPN en % est la valeur prédictive négative d'un signe pour un diagnostic et correspond à la probabilité que le diagnostic soit faux si le signe est absent. 30 Il apparaît donc que le procédé et le kit permettant sa mise en oeuvre, proposés dans le cadre de la présente invention, constituent un outil de diagnostic quantitatif d'une très grande fiabilité. 1120 BIBLIOGRAPHIE (1) Garin-Bastuji B., Hars J., 2001, Situation épidémiologique de la brucellose à Brucella suis biovar 2 en France, Bulletin épidémiologique de l'AFSSA N 21. (2) Vaillant V., Garin-Bastuji B., Louguet Y., Brun M., Séroprévalence humaine autour des foyers porcins de brucellose à Brucella suis biovar 2, France 1993-2003. Rapport d'étude, Institut de veille sanitaire, 21p, 2005. (3) Philippon A., Garin-Bastuji B., Cours de Bactériologie sur Brucella, site Internet http://www.microbes-edu.org/professionnel/brucellavf.html REVENDICATIONS 1/ Procédé de diagnostic in vitro de la brucellose chez un sujet comprenant les étapes suivantes : mettre en contact une suspension bactérienne de Brucella inactivée et un échantillon du sérum du sujet ; -effectuer une révélation immuno-enzymatique. 2/ Procédé de diagnostic de la brucellose selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il s'agit de Brucella suis, avantageusement de biovar 2. 3/ Procédé de diagnostic de la brucellose selon l'une des revendications précédentes 15 caractérisé en ce que la suspension bactérienne de Brucella est inactivée par exposition à la chaleur. 4/ Procédé de diagnostic de la brucellose l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le sujet est un animal d'élevage, avantageusement un suidé. 5/ Procédé de diagnostic de la brucellose selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le sérum du sujet est mis en contact à une dilution élevée, avantageusement supérieure ou égale à 1/1000, encore plus avantageusement égale à 1/2000. 25 6/ Procédé de diagnostic de la brucellose selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'environ 105 bactéries inactivées sont mises en contact avec 100 1 de sérum dilué. 7/ Procédé de diagnostic de la brucellose selon l'une des revendications précédentes 30 caractérisé en ce que la révélation est réalisée à l'aide de la technique ELISA. 8. Kit de diagnostic de la brucellose comprenant un support sensibilisé par une suspension bactérienne de Brucella inactivée telle que définie dans les revendications 1 à 3, adsorbée et séchée à sa surface. 9/ Kit de diagnostic de la brucellose selon la revendication 8 caractérisé en ce que le support se présente sous la forme d'une plaque à 96 puits. 20 3510/ Kit de diagnostic de la brucellose selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que chaque puits comprend environ 105 bactéries inactivées. 11/ Kit de diagnostic de la brucellose selon l'une des revendications 8 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend en outre une enzyme marquée conjuguée, avantageusement une peroxydase. 12/ Kit de diagnostic de la brucellose selon l'une des revendications 8 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un témoin positif i