Brevet FR2919188A1 — publié le 20090130

La présente invention concerne la formation de complexes originaux hydrosolubles entre un polymère amphiphile et une protéine ostéogénique appartenant à la famille des Bone Morphogenetic Proteins, BMPs, complexes stables physiquement et chimiquement et qui de ce fait améliorent la stabilité physique et chimique des BMPs, à la fois in vitro et in vivo. Les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sont des facteurs de croissance impliqués dans les mécanismes d'ostéoinduction. Les BMPs appelées également Osteogenic Proteins (OPs) ont été initialement caractérisées par Urist en 1965 (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Ces protéines isolées à partir d'os cortical ont la capacité d'induire la formation d'os chez un grand nombre d'animaux (Urist MR. Science 1965; 150, 893). Les BMPs sont exprimées sous forme de propeptides qui, après maturation post-traductionnelle, ont une longueur comprise entre 104 et 139 résidus. Elles possèdent une grande homologie de séquences entre elles et ont des structures tridimensionnelles similaires. En particulier, elles possèdent 6 résidus cystéine impliqués dans des ponts disulfure intramoléculaires formant un cysteine knot (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287, 103 ; Schlunegger MP,J. Mol. Biol. 1993; 231, 445). Certaines d'entre elles possèdent une 7e cystéine impliquée également dans un pont disulfure intermoléculaire à l'origine de la formation du dimère (Scheufler C. 2004 J. Mol. Biol. 1999; 287:103.). Sous leur forme active, les BMPs s'assemblent en homodimères, voire en hétérodimères comme cela a été décrit par lsrael et al. (Israel Dl, Growth Factors. 1996; 13(3-4), 291). Les BMPs dimériques interagissent avec les récepteurs transmembranaires de type BMPR (Mundy et al. Growth Factors, 2004, 22 (4), 233). Cette reconnaissance est à l'origine d'une cascade de signalisation intracellulaire impliquant notamment les protéines Smad aboutissant ainsi à l'activation ou à la répression des gènes cibles.35 Les BMPs, à l'exception des BMP 1 et 3, jouent un rôle direct et indirect sur la différenciation des cellules mésenchymateuses provoquant leur différenciation en ostéoblastes (Cheng H., J. Bone and Joint Surgery, 2003, 85A 1544-1552). Elles possèdent en outre des propriétés de chimiotactisme et induisent la prolifération, la différentiation et l'angiogénèse. Certaines BMPs recombinantes humaines et notamment la rhBMP-2 et la rhBMP-7 ont clairement montré une capacité à induire la formation d'os in vivo chez l'homme et ont été approuvées pour certaines applications médicales. Ainsi, la BMP-2 recombinante humaine, dibotermine alfa selon la dénomination commune internationale, est formulée dans les produits commercialisés sous le nom de InFUSE aux Etats-Unis et de InductOs en Europe. Ce produit est prescrit dans la fusion des vertèbres lombaires et la régénération osseuse du tibia pour les fractures dites non- union. Dans le cas d'InFUSE pour la fusion des vertèbres lombaires, l'intervention chirurgicale consiste tout d'abord, à imbiber une éponge de collagène avec une solution de rhBMP-2, puis à placer l'éponge dans une cage creuse, LT Cage, préalablement implantée entre les vertèbres. La BMP-7 recombinante humaine, eptotermine alpha selon la dénomination commune internationale, a les mêmes indications thérapeutiques que la BMP-2 et constitue la base de deux produits : OP-1 Implant pour les fractures ouvertes du tibia et OP-1 Putty pour la fusion des vertèbres lombaires. OP- 1 Implant se compose d'une poudre contenant de la rhBMP-7 et du collagène à reprendre dans une solution saline à 0,9%. La pâte obtenue est ensuite appliquée au niveau de la fracture lors d'une intervention chirurgicale. OP-1 Putty se présente sous la forme de deux poudres : l'une contenant la rhBMF'-7 et du collagène, l'autre de la carboxyméthylcellulose (CMC). Au cours d'une intervention chirurgicale, la CMC est reconstituée avec une solution saline 0,9% et mélangée avec la rhBMP-7 et le collagène. La pâte ainsi obtenue est appliquée sur le site à traiter. Parmi toutes les protéines actuellement commercialisées, les BMPs se singularisent par leur forte hydrophobicité et leur capacité à s'agréger ce qui conduit à une très faible solubilité à pH physiologique. Dans le cas de la BMP-2, ces propriétés ont été documentées dans le cadre des études ayant servies à son développement clinique. Elle est peu soluble en conditions physiologiques et a tendance à s'agréger (Schmoekel, 2004 J. Orthop. Res. 2004; 22(2), 376, Friess, W., Drug Delivery Systems Based on Collagen, Shaker Verlag, Thesis Aachen Germany 1999, Schwartz DH, Thesis München Germany 2005). Ainsi, Abbatiello et Porter (Protein Sci. 1997, 6,Suppl 2 99) ont montré que la BMP-2 dans un tampon de faible force ionique devient de plus en plus insoluble lorsque le pH croît au-delà de 4.5. La précipitation de la protéine est observée pour un pH supérieur à 6,5 mais également à des pH moins élevés en présence d'ions chlorures et/ou sulfates (pH 5.8 à 50 mM NaCl, and pH 5.5 à 5 mM Na2SO4) comme cela a été montré par Friess (Friess, W., Drug Delivery Systems Based on Collagen, Shaker Verlag, Thesis Aachen Germany 1999). La formulation de la BMP-2 en conditions physiologiques est donc un problème à part entière. Un autre exemple de ce problème d'instabilité physique des BMPs est mis en évidence par Biopharm dans le brevet US2004132653 avec une protéine de la sous-classe de la BMP-14, le GDF-5 pour Growth and Differentiation Factor, aussi appelé MP-52. Les propriétés du GDF-5 sont très similaires à celles de la BMP-2 et il a été constaté une instabilité du lyophilisat qui a tendance à se condenser et à ne pas pouvoir être redissout totalement lors de la reconstitution de la solution. Ces deux phénomènes sont liés à une agrégation irreversible des protéines. Pour répondre à ce problème, le mannitol est ajouté avant lyophilisation et permet ainsi de prévenir ces problèmes à l'état solide. Cependant, le mannitol n'apporte qu'une stabilisation faible in vitro et ne prévient pas l'instabilité physique in vivo. Compte tenu des contraintes imposées par les propriétés physiques de ces facteurs de croissance, le produit InFUSE a du être formulé à pH acide (tampon acide acétique, pH 4) et en présence d'un tensio-actif, le 30 polysorbate 80 pour assurer la solubilité et la stabilité physique de la rhBMP-2. Or, les fabricants de médicaments à base de protéines thérapeutiques sont extrêmement concernés par les problèmes de stabilité physique des protéines. En effet, la formation d'agrégats de BMP peut être à 35 l'origine : • d'une diminution de la quantité des espèces biologiquement actives, • d'une modification de la bioactivité ou de la vitesse d'absorption, • d'une réponse immunologique potentielle vis-à-vis de ces agrégats, • d'une apparence indésirable due à une opalescence du produit, • d'une obstruction des équipements de filtration et des dispositifs 5 d'injection. Pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité, il est nécessaire d'employer des doses thérapeutiques de BMP très importantes, supérieures d'un facteur 10 000 à la dose physiologique. Ceci est en particulier le cas dans 10 le traitement de la fusion vertébrale avec un produit tel qu'InFUSE puisque plusieurs milligrammes de rhBMP-2 sont administrés. Cette forte quantité de BMP à administrer implique de devoir travailler à des concentrations élevées de BMP en solution, de l'ordre de 1.5 mg/ml. A ces concentrations, les BMPs s'agrègent très facilement et ne sont donc pas stables physiquement. Les 15 solutions apportées emploient des tampons acides et des tensio-actifs. Or du point de vue de l'application thérapeutique, l'emploi d'une solution acide et contenant des tensio-actifs est problématique. Plusieurs approches ont été développées pour répondre à ces 20 problèmes de stabilité physique et chimique. Tout d'abord, l'héparine et les héparanes sulfates sont bien connus pour stabiliser les facteurs de croissance dont les BMPs puisque ces polysaccharides sont des molécules endogènes de stabilisation (Ruppert et al. 25 Eur. J. Biochem. 1996, 237, 295). Cependant, l'héparine et les héparanes sulfates ont une très forte activité anti-coagulante et anti-complémentaire et ne peuvent donc pas être employés dans une composition pharmaceutique. Hubbell a décrit une approche de greffage de la protéine qui 30 consiste à créer une liaison chimique entre la protéine et un vecteur afin de la stabiliser dans une matrice du type fibrine. Cette liaison est établie par le biais d'une protéine de fusion clivable par les enzymes. Cette voie, rapportée dans la publication Biotechno. Bioeng. 2005, 89, 3, 253, permet effectivement de stabiliser physiquement la protéine en empéchant l'agrégation. Cependant, 35 cette voie conduit à employer un analogue de la BMP-2 qui n'a pas démontré, à ce jour, son efficacité thérapeutique et son innocuité. Dans le brevet US20050209145, Stupp et al. décrivent des peptides amphiphiles pour la vectorisation de facteurs de croissance, et en particulier de BMP-2. Ces peptides amphiphiles sont constitués d'une chaîne alkyle terminale, d'une séquence peptidique hydrophile et d'un épitope permettant l'adhésion de la BMP-2. Ces peptides s'organisent en solution pour former des structures macromoléculaires de type batonnet dans lesquelles les groupements hydrophobes se regroupent au coeur. Les aminoacides en périphérie permettent d'apporter la compatibilité avec l'eau et l'adhésion de la protéine. Cependant, ces peptides présentent un risque immunologique à cause de leur structure primaire complexe. Takaoka et al. se sont intéressés à la vectorisation de la BMP pour des applications de régénération osseuse dans le brevet US6258382. Ces auteurs ont mis au point de nouveaux polymères à base d'acide lactique et/ou glycolique, de p-dioxanone, de polyéthylène glycolique permettant de contrôler la libération de ces protéines. Cependant, ces auteurs n'adressent aucun des problèmes liés à ce facteur de croissance, en terme de stabilité physique ou chimique. De plus, ces polymères ne sont pas solubles dans l'eau mais adsorbent l'eau pour former des gels. Ces polymères sont en revanche solubles en milieu organique et sont solubilisés dans l'acétone. La préparation de la formulation polymère-BMP-2 nécessite donc l'emploi d'un solvant organique, ce qui représente un risque de dénaturation de la protéine (Nature Biotechnology, 2001, 19, 332). Dans le brevet US2005/0287135, Wyeth décrit des hyaluronanes modifiés par un groupement hydrophobe, l'alcool benzylique, pour la vectorisation de BMPs. Dans ces polymères, le taux de groupement hydrophobe est compris entre 50 et 100% de telle sorte que le polymère n'est pas soluble dans l'eau mais peut adsorber de l'eau. Dans ce cas, ces polymères amphiphiles ne peuvent former un complexe hydrosoluble avec la protéine permettant de résoudre les problèmes de stabilité des BMPs. Dans le brevet NZ530701, Brodbeck et al. emploient des PLAGA pour la vectorisation de BMPs. Ces polymères sont insolubles dans l'eau et ne peuvent donc pas forrner de complexe hydrosoluble avec la protéine. L'objectif des auteurs est, à l'inverse de la demanderesse, d'insolubiliser, en milieu aqueux, la BMP dans un solide constitué de PLAGA ce qui là encore requiert l'emploi d'un solvant organique lequel représente un risque de dénaturation de la protéine. A titre d'exemple, on peut citer les travaux de Blanquaert et al. et Barritault et al. décrivent l'utilisation de dextrans modifiés par de la benzylamine supposés interagir avec différents facteurs de croissance. Les polymères sont décrits pour avoir une activité thérapeutique par eux-mêmes. Ces auteurs revendiquent que certains de ces dextrans et plus particulièrement les dextrans subsitués par des groupes carboxyméthyles (CM), benzylamides (B) et sulfonates (S), (composés CMDBS) permettaient de stimuler la reconstruction osseuse sans ajout de facteur de croissance (1995, Bone, 17, 6, 499-506). Barritault et al. ont décrit dans le brevet US6573251 que ces dextrans modifiés sont capables d'interagir avec le basic Fibroblast Growth Factor, FGF-2. Cependant, ce facteur de croissance a des propriétés physico-chimiques très différentes de celles des BMPs, le FGF-2 étant soluble à pH physiologique contrairement aux BMPs. De plus, la formation d'un complexe n'est jamais réellement décrite. Selon une démarche similaire, dans le brevet FR2794649A, Blanchat et al. décrivent des dextrans modifiés par de la benzylamine et des sulfates insolubilisés par réticulation des chaînes de polymères à l'aide de triméthylphosphate. Ces éponges en milieu aqueux servent de réservoirs de BMP puisqu'ils sont capables de retenir cette protéine. Les polymères amphiphiles avant réticulation forment des complexes avec la BMP-2 comme démontré dans un essai d'interaction par électrophorèse sur gel. La stabilisation chimique ou physique de la BMP n'est pas documentée. En outre, les ratios massiques polymére/BMP utilisés sont très élevés, supérieurs à 5 000. Par ailleurs, il est à nouveau revendiqué une activité thérapeutique des dextrans décrits en tant que tels. Il est également connu que la benzylamine peut présenter une certaine toxicité et peut nuire à la biocompatibilité des polymères décrits dans les nombreux travaux sur les dextrans modifiés par de la benzylamine. La formulation galénique de telles protéines destinées à la reconstruction osseuse doit obligatoirement répondre à des impératifs d'innocuité des excipients et pour atteindre ces impératifs, il est indispensable d'utiliser des composés qui soient biocompatibles mais également d'en limiter la quantité par rapport au principe actif. Ainsi le problème de la mise au point de formulations injectables permettant de solubiliser et de stabiliser les protéines ostéogéniques comme les BMPs choisies dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine-alpha), la BMP-14 et le GDF-5 n'est pas résolu de façon satisfaisante. La présente invention permet de former un complexe hydrosoluble stable entre les protéines ostéogéniques et un polymère amphiphile biocompatible à un ratio massique polymère/BMP inférieur à 700. Ce complexe permet : • d'éviter l'agrégation des BMPs qui a lieu en raison de leur hydrophobicité à pH physiologique in vitro et in vivo, • de stabiliser les BMPs en présence de cellules à 37 C. Ce complexe hydrosoluble est formé en milieu totalement aqueux sans recourir à l'usage de solvant organique. La présente invention concerne donc un complexe polymère 30 amphiphile-BMP, stable physiquement et chimiquement, soluble dans l'eau, caractérisé en ce que : - les polymères amphiphiles sont constitués d'un squelette polysaccharide hydrophile fonctionnalisé par des substituants hydrophobes et 35 des groupements hydrophiles selon la formule générale suivante : s Polysaccharide DP = m unités monomère Y F' 1 R' 1 • R, R' identiques ou différents représentent une liaison ou une chaîne comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, • F, F' identiques ou différents représentent un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une amine, • X représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué 10 des carboxylates, des sulfates, des sulfonates, des phosphates, des phosphonates, • Y représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué des sulfates, des sulfonates, des phosphates des phosphonates, 15 • Hy représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué par : o les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30, éventuellement insaturés et/ou contenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que C), N ou S. 20 o les alkylaryles ou un arylalkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C18, éventuellement insaturés et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S. o les polycycles en C8 à C30 éventuellement insaturé. et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels 25 que O, N ou S, o à l'exclusion de la benzylamine. • n et o sont compris entre 1 et 3, 15 • h représente la fraction molaire de motif hydrophobe par rapport à une unité monomérique comprise entre 0.01 et 0.5 • x représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité monomérique, comprise entre 0 et 2.0. • y représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité monomérique, comprise entre 0 et 0.5. • la BMP est choisie dans le groupe des BMPs (Bone morphogenetic Proteins) thérapeutiquement actives, • le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 700. Dans un mode de réalisation, le polysaccharide selon l'invention est caractérisé en ce que le groupe R est choisi dans les groupes suivants : F F F OH OH Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe 20 caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 600. Dans un mode de réalisation, elle concerne un complexe caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 25 500. La concentration de BMP d'usage thérapeutique est d'environ 1.5 mg/ml en solution. Lorsque le ratio est supérieur à 700, on obtient des compositions comprenant 1.0 g/ml de polymère amphiphile. A partir de telles 30 concentrations en polymère, les formulations ont un comportement physico-chimique qui n'est plus adaptée à une application pharmaceutique, par exemple au niveau de la viscosité. Elle concerne un complexe caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (eptotermine alpha), la BMP-14 et le GDF-5. Les substituants des polymères amphiphiles sont répartis de façon contrôlée ou statistique. Parmi les polymères ayant une répartition contrôlée des substituants, on peut citer, par exemple, les copolymères à blocs et les copolymères alternés. 10 Copolymère statistique *ùMonomer Monomer Monomer ùMonomer Monomer ùMonomerù. Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe Copolymère à blocs * ùMonomerùMonomer MonomerùMonomer Monomer ùMonomer Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe Copolymère alterné * ùMonomerùMonomer MonomerùMonomer MonomerùMonomerù* Hydrophobe Hydrophobe Hydrophobe 15 Ainsi dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les polymères dont les substituants sont répartis de façon statistique. 20 Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans, les galacturonanes, la chondroitin-sulfate, les dextrans, les celluloses. 15 20 Le groupe des celluloses est constitué des celluloses fonctionnalisées par des acides comme la carboxyméthylcellulose. Le groupe des dextrans est constitué des dextrans fonctionnalisés 5 par des acides comrne le carboxyméthyldextran. Dans un mode de réalisation, les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans. 10 Ces différents polysaccharides peuvent être représentés comme suit : o o HOt - OH o Galacturonane Hyaluronane R = H, Dextran R = CH2COOH ou H, Carboxymethyl Dextran Chitosari OH _ NH2 * * Alginate Le polysaccharide peut avoir un degré de polymérisation moyen m compris entre 10 et 10000. Dans un mode de réalisation, il a un degré de polymérisation 10 moyen m compris entre 10 et 1000. Dans un autre mode de réalisation, il a un degré de polymérisation moyen m compris entre 10 et 500. Dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un 15 complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides. 20 Dans un mode de réalisation, l'invention concerne également un complexe polymère amphiphile-BMP caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est le tryptophane ou un dérivé ester ou amide du tryptophane. 25 Parmi les dérivés du tryptophane, on citera le tryptophanol, le tryptophanamide, le 2-indoleéthylamine. Dans un mode de réalisation, le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est réversible. 30 Les polymères utilisés sont synthétisés selon les techniques connues de l'Homme de l'art ou achetés auprès de fournisseurs comme par exemple Sigma-Aldrich, NOF Corp. ou CarboMer Inc. Les BMP sont choisies parmi les BMP recombinantes humaines, obtenues selon les techniques connues de l'Homme de l'art ou achetées auprès de fournisseurs comme par exemple la société Research Diagnostic Inc. (USA). La BMP est un facteur de croissance très hydrophobe. A pH physiologique, l'hydrophobie de cette protéine conduit à l'agrégation puis à la précipitation. Les complexes polymère amphiphile-BMP selon l'invention, via des interactions hydrophobes, permettent de stabiliser physiquement cette protéine en solution à pH physiologique. On entend par dégradation physique ou chimique tout évènement d'ordre physique, tel que l'agrégation, ou chimique, tel que la protéolyse, conduisant à une diminution de l'activité biologique de la protéine. Parallèlement, on entend par stabilisation physique ou chimique de la protéine l'action de maintien de l'activité biologique de la protéine. La stabilité du complexe est suivie par la mesure de la stabilité de la BMP. La stabilisation de la protéine par un polymère amphiphile peut ainsi être mise en évidence, notamment par la mise en oeuvre des tests suivants : • un test de mise en évidence du complexe polymère amphiphile-BMP 30 par coélectrophorèse sur gel • un test de stabilité thermique de la BMP en présence de cellules dans le complexe polymère amphiphile-BMP réalisé à 37 C et à pH neutre • un test de stabilisation physique de la BMP dans ledit complexe à pH physiologique. 35 Le test de mise en évidence du complexe polymère amphiphile-BMP par coéléctrophorèse est basé sur le déplacement d'ions sous l'effet d'un champ électrique. Les complexes anioniques migrent vers l'anode et les complexes cationiques se déplacent vers la cathode. Après migration, les protéines sont transférées par capillarité sur membrane de PVDF et révélées par un anticorps spécifique de la protéine reconnu par un deuxième anticorps couplé à la peroxidase. La protéine seule ne migre pas, la protéine complexée au polymère amphiphile migre vers l'anode ou la cathode en fonction de la charge globale du complexe. Le test de stabilité thermique de la BMP en présence de cellules est réalisé à 37 C - pH neutre et consiste à déposer une solution de BMP dans un milieu de culture contenant des myoblastes C2C12. La concentration en BMP en solution est déterminée par dosage ELISA après le dépôt et au bout de 5 jours de culture. L'activité biologique de la BMP est évaluée par dosage de l'activité de l'alcaline phosphatase produite lors de la différenciation des myoblastes en ostéoblastes. Le test de stabilisation physique d'une BMP à pH physiologique est basé sur la mise à pH physiologique d'une solution de protéine par échange du tampon d'origine de la protéine, en général à pH acide, par une solution de PBS à pH 7.4. Trois échanges sont réalisés en maintenant la BMP à concentration constante en fin d'échange. La concentration de la BMP en solution à la fin du processus est déterminée par dosage ELISA après centrifugation. Le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est formé par la mise en solution aqueuse d'une BMP et d'un polymère amphiphile à pH physiologique en l'absence de tout solvant organique susceptible de dénaturer la protéine. La formation du complexe polymère amphiphile-BMP est spontanée et n'implique pas de liaison covalente entre la BMP et le polymère amphiphile. Cette association se fait par des liaisons faibles qui sont essentiellement des interactions hydrophobes et des interactions ioniques. Cette formation de complexe ne nécessite aucun solvant organique.35 D'autres tests peuvent être mis en place pour parfaire la mise en évidence de la formation du complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention. • un test de maintien de la structure tertiaire de la BMP déterminé par 5 dichroïsme circulaire • un test de stabilité d'une BMP dans le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention à pH physiologique sous stress. Le stress peut être un mode d'agitation particulier, la présence de sels, etc. 10 L'un des problèmes résolus par l'invention est une stabilisation accrue de la protéine et donc le maintien de l'activité biologique in vitro et in vivo. Cette activité biologique peut être évaluée par différents tests mettant en évidence la capacité d'une BMP à différencier les myoblastes en ostéoblastes. 15 Cette différentiation peut être mesurée par : • le dosage de l'activité de la phosphatase alcaline produite dans une culture de cellules. • la coloration des cellules produisant de la phosphatase alcaline. • RT-PCR de l'ARN de l'osteocalcine produite dans une culture de cellules. L'invention concerne également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention. On entend par composition thérapeutique une composition utilisable en médecine humaine ou vétérinaire. La composition pharmaceutique selon l'invention est de préférence 30 une composition à application locale pouvant se présenter sous la forme d'un soluté, d'un gel, d'une crème, d'un lyophilisat, d'une poudre ou d'une pâte. La nature des excipients susceptibles d'être formulés avec le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention est choisie en fonction 35 de sa forme de présentation selon les connaissances générales du galéniste. 20 25 Ainsi, lorsque la composition selon l'invention est sous la forme d'une pâte, celle-ci est par exemple obtenue à partir de produits tels que les carboxyméthylcelluloses (CMC), le tricalcium phospate et le collagène. D'autres excipients peuvent être utilisés dans cette invention afin d'ajuster les paramètres de la formulation comme un tampon pour ajuster le pH, un agent permettant d'ajuster l'isotonicité, des conservateurs comme le parahydroxybenzoate de méthyle, le parahydroxybenzoate de propyle, le m-crésol, ou le phénol ou encore un agent anti-oxydant comme le chlorhydrate de L-lysine. Selon l'invention, la composition thérapeutique est caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1,5 mg/ml de BMP. La présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in-vivo. Elle concerne également une méthode de traitement thérapeutique à usage humain ou vétérinaire caractérisée en ce qu'elle consiste à administrer au site de traitement une composition thérapeutique comprenant le complexe polymère amphiphile-BMP selon l'invention. Synthèse des Polymères amphiphiles Exemple 1: carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique du 5 tryptophane (PA 1) Ce polymère amphiphile est synthétisé à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. L'ester éthylique du tryptophane 10 est greffé sur les acides de ce polymère selon une méthode classique de couplage en solvant organique employant le chloroformiate d'éthyle et la NMéthylMorpholine. Après dilution du milieu réactionnel dans l'eau et réglage du pH à 7 par ajout de NaOH IN, le polymère est purifié par ultrafiltration. Le polymère final est caractérisé par : 15 x un degré de substitution en TrpOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN 1H dans D2O/NaOD. x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique. 20 Exemple 2: carboxyméthyldextran modifié par le tryptophane, sel de sodium (PA 2) Ce polymère amphiphile est obtenu par hydrolyse basique du PA 1. De la soude 1 N (3.79 ml) est ajoutée à une solution aqueuse du polymère amphiphile 25 1 (64 ml à 31 mg/ml) pour atteindre pH 12.7. La solution obtenue est agitée une nuit à température ambiante. Le polymère est purifié par dialyse contre de l'eau (NaCl 0.9% et H20). Le polymère final est caractérisé par : x un degré de substitution en TrpONa par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN 1H dans D2O/NaOD. 30 X un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate, carboxylate du tryptophane) de 1.0 déterminé par dosage potentiométrique. 35 Exemple 3: carboxyméthyldextran modifié par l'ester éthylique de la phénylalanine (PA 3) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par : X un degré de substitution en PheOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN 1H dans D2O/NaOD. x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique. Exemple 4 : carboxyméthyldextran modifié par l'ester méthylique de la tyrosine (PA 4) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par : X un degré de substitution en TyrOMe par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN 1H dans D2O/NaOD. x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique. Exemple 5: acide dextransuccinique modifié par l'ester éthylique du tryptophane (PA 5) Ce polymère amphiphile est synthétisé à partir d'un acide dextransuccinique ayant un degré de substitution en acide succinique par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 70 kg/mol obtenu selon l'article de (Sanchez-Chaves, Manuel et al., Polymer 1998, 39 (13), 2751-2757.). L'ester éthylique du tryptophane est greffé sur les acides de ce polymère selon une méthode classique de couplage en solvant organique employant le chloroformiate d'éthyle et la N-MéthylMorpholine. Après dilution du milieu réactionnel dans l'eau et réglage du pH à 7 par ajout de NaOH IN, le polymère est purifié par ultrafiltration. Le polymère final est caractérisé par : x un degré de substitution en TrpOEt par unité saccharidique de 0.45, déterminé par RMN 1H dans D20/NaOD. x un degré de substitution en carboxylates (succinic carboxylate) de 0.55, déterminé par dosage potentiométrique. Contre-exemple 1 : carboxyméthyldextran modifié par la dodécylamine (PA 6) Ce polymère amphiphile est synthétisé selon l'exemple 1 à partir d'un 10 carboxyméthyldextran ayant un degré de substitution en carboxyméthyl par unité saccharidique de 1.0 et une masse molaire moyenne de 60 kg/mol. Le polymère final est caractérisé par x un degré de substitution en dodécylamine par unité saccharidique de 0.10, déterminé par RMN 1H dans D20/NaOD. 15 x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0.90, déterminé par dosage potentiométrique. Contre-exemple 2 : carboxyméthyldextran modifié par la benzylamine (PA 7) Ce polymère amphiphile est décrit dans le brevet FR2794649A, il est caractérisé par : x un degré de substitution en benylamine par unité saccharidique de 0.45, x un degré de substitution en carboxylates (méthylcarboxylate) de 0.55. Affinité de la BMP-2 pour un Polymère Amphiphile par coélectrophorèse Préparation du complexe BMP-2/Polymère Amphiphile pl d'une solution de BMP-2 à 0.28 mg/ml dans un tampon H2O / AcN / TFA 30 (64.9 / 35 / 0.1%) sont ajoutés à 7 pl d'une solution de PA à 100 mg/ml tamponnée à pH 7.4. Cette solution est complétée à 14 pi par une solution de NaCl 0.9%. Cette solution a une concentration en BMP-2 de 0.1 mg/ml et un ratio BMP-2/PA de 1/500. Cette solution est mise sous agitation douce 30 minutes à température ambiante 5 20 25 35 Mise en évidence du complexe BMP-2/Polymère Amphiphile La solution de BMP-2 / PA est diluée au 20ème dans du tampon de migration (solution de tris-acétate à pH 7). 2 pl de la solution diluée sont ensuite ajoutés à 8 pl d'eau et 7 pl de tampon de charge (glycérol, tris-acétate et bleu de bromophénol dans de l'eau). Ces 17 pl contenant 10 ng de BMP-2 et 5 dag de PA sont déposés dans un puit d'un gel d'agarose 0.8%. La cuve d'éléctrophorèse est fermée et le générateur est réglé à 30V. La migration dure 1 heure. Après migration, le gel est transféré sur une membrane de PVDF placé sur l'anode sous un champ électrique (20 minutes, 15V, Trans-Blot SD de Bio-Rad). La membrane est saturée avec du lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante puis incubée avec des anticorps primaires de la BMP-2 (une nuit à 4 C) et enfin incubée avec des anticorps secondaires, rabbit anti goat HRP (1 heure à température ambiante). La révélation se fait par réaction de l'HRP sur le Opti-4CN. La révélation est stoppée lorsque la coloration est suffisante puisque le produit de la réaction absorbe dans le visible, Lorsque la BMP-2 forme un complexe avec le PA, le complexe est détecté sous forme d'un spot unique à 0,7 cm du dépôt (migration vers l'anode). Lorsque la BMP-2 est seule ou ne forme pas de complexe avec le PA, elle est 20 détectée à l'endroit du dépôt et n'a donc pas migré. 21 Les résultats pour les 5 polymères sont résumés dans le tableau suivant. Polymère Amphiphile Migration Aucun Non PA 1 Oui PA 2 Oui PA 3 Oui PA 4 Oui PA5 Oui PA 6 Non PA 7 Non Stabilité de la BMP-2 en présence de Polymère Amphiphile à pH physiologique Préparation du complexe BMP-2 / Polymère Amphiphile A partir d'une solution de BMP-2 à 0.28 mg/ml dans un tampon H2O / AcN / TFA (64.9 / 35 / 0.1%), sont préparées différentes solutions : 1. une solution de BMP-2 à 0.084 mg/mi obtenue par dilution dans l'eau 2. une solution de BMP-2 / Polymère Amphiphile à 0.084 / 9.8 mg/ml obtenue par dilution de la BMP-2 avec une solution de PA à 14 mg/ml. Chaque solution est ensuite diluée au 1/10 par une solution de PBS 10 mM à pH 7.4 et 300 mOsm puis reconcentrée par centrifugation sur cellule Microcon (YM10, 10 kD, 500 pl). Cette opération est répétée deux fois. A l'issue de ces trois lavages, chaque solution est centrifugée et la concentration en BMP-2 dans le surnageant est déterminée par dosage ELISA. Une partie de la solution de BMP-2 à 0.084 mg/ml ne subit aucun lavage afin de servir de contrôle. Une autre partie de la solution de BMP-2 à 0.084 mg/ml subit trois cycles de lavage contre une solution de HCI 1 mM (pH 3). Ce tampon est connu pour stabiliser la BMP-2 mais n'est pas compatible avec une application pharmaceutique. Le dosage ELISA de la solution de BMP-2 n'ayant subi aucun lavage donne une concentration en BMP-2 de 83.4 pg/ml. Cette valeur correspond à 100% de BMP-2. Les concentrations déterminées par ELISA des autres solutions à l'issue des trois lavages contre du PBS sont rapportées à cette valeur de la BMP-2 non lavée. Les pourcentages de BMP-2 retrouvée sont rassemblés dans le tableau suivant. Solution % BMP-2 présente BMP-2 2 BMP-2/PA 1 68 BMP-2/PA 2 90 BMP-2/PA 3 68 BMP-2/PA 4 51 BMP-2/PA 6 0 Les PA capables de former un complexe avec la BMP-2 rendent la BMP-2 stable à pH physiologique. En absence de PA, la BMP-2 n'est plus présente en solution à pH physiologique. De la même façon, en présence d'un PA qui ne forme pas de complexe avec la BMP-2, la protéine n'est plus présente en solution. 25 Stabilité de la BMP-2 en présence de Polymère Amphiphile en milieu de culture à 37 C et à pH physiologique Activité biologique de la BMP-2 en présence de PA par dosage de l'activité de la phosphatase alcaline Mise en évidence de la stabilité et de l'activité biologique du complexe BMP-2/PA 1 à 37 C en présence de cellules. A JO, les cellules C2C12 (cellules musculaires de souris) sont ensemencées (7000 cellules/puit) clans des plaques de culture 96 puits contenant du DMEM à 10% SVF et 1% ATB puis sont mises à l'étuve pendant 24h. A J1, après adhésion des cellules, le milieu est remplacé par du DMEM à 2% SVF et 1% ATB pendant 24h. A J2, le milieu est remplacé par du DMEM à 2% SVF et 1% ATB supplémenté avec une solution de BMP-2 seule (0.3 pg/ml) ou une solution du complexe BMP-2 / PA 1 (0.3 / 150 pg/ml, ratio 1/500). Le complexe est préparé par dilution de la BMP-2 et du PA séparément dans du DMEM à 2% SVF et 1% ATB. Le mélange protéine / PA 1 est laissé à reposer pendant l h avant dépôt. A J7, soit 5 jours après dépôt, le surnageant est prélevé afin de doser la BMP-2 20 résiduelle par ELISA. % BMP-2 dans le surnageant Dépôt Dépôt + 5 jours BMP•-2 seule 100 2 BMP-2/PA 1 100 41 Après 5 jours au contact des cellules, il reste moins de 5% de BMP-2 seule alors qu'il reste plus de 40% de BMP-2 lorsqu'elle est complexée avec PA 1. A J7, dans cette même expérience, les cellules sont lavées 2 fois au PBS puis lysées par 50 pl de tampon de lyse et subissent 3 cycles de congélation (-80 C) / décongélation (37 C). L'activité enzymatique de la phosphatase alcaline est mesurée dans les lysats sur un substrat, la p-nitrophényl phosphate qui absorbe à 405nm. Cette activité est ramenée à la quantité de protéines mesurée par microBCA et est donc exprimée en nmol pnP/min.pg de protéines. Activité ALP (nmol pnP / pg protéine.min) BMP-2 seule 0,9 0,12 BMP-2/PA 1 1,7 0,05 La BMP-2 est plus active dans le complexe BMP-2/PA1 que seule. REVENDICATIONS 10 1. Complexe polymère amphiphile-BMP, stable physiquement et chimiquement, soluble dans l'eau, caractérisé en ce que : - les polymères amphiphiles sont constitués d'un squelette polysaccharide hydrophile fonctionnalisé par des substituants hydrophobes et 15 des groupements hydrophiles selon la formule générale suivante : 25 Polysaccharide F' Y 1 DP = m unités monomère R' 1 F R 1 Hy • R, R' identiques ou différents représentent une liaison ou une chaîne 20 comprenant entre 1 et 18 carbones, éventuellement branchée et/ou insaturée comprenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou/et S, • F, F' identiques ou différents représentent un ester, un thioester, un amide, un carbonate, un carbamate, un éther, un thioéther ou une 25 amine, • X représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe constitué des carboxylates, des sulfates, des sulfonates, des phosphates, des phosphonates, • Y représente un groupement hydrophile choisi dans le groupe 30 constitué des sulfates, des sulfonates, des phosphates des phosphonates, • Hy représente un groupement hydrophobe choisi dans le groupe constitué par : o les alkyles linéaires ou ramifiés en C8 à C30, éventuellement insaturés et/ou contenant un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S. o les alkylaryles ou un arylaikyles linéaires ou ramifiés en C8 à C18, éventuellement insaturés et/ou contenant éventuellement 10 un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S. o les polycycles en C8 à C30 éventuellement insaturé. et/ou contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, tels que O, N ou S, o à l'exclusion de la benzylamine. • n et o sont compris entre 1 et 3, • h représente la fraction molaire de motif hydrophobe par rapport à une unité monomérique comprise entre 0.01 et 0.5 • x représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par 20 rapport à une unité monomérique, comprise entre 0 et 2.0. • y représente la fraction molaire de groupements hydrophiles par rapport à une unité monomérique, comprise entre 0 et 0.5. • la BMP est choisie dans le groupe des BMPs (Bone morphogenetic 25 Proteins) thérapeutiquement actives, • le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 700. 2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ratio 30 massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 600. 3. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce que le ratio massique polymère/BMP est inférieur ou égal à 500. 35 4. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la BMP est choisie dans le groupe 15 constitué par la BMP-2 (Dibotermine-alpha), la BMP-4, la BMP-7 (Eptotermine alpha), la BMP-14 et la GDF-5. 5. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les polymères dont les substituants sont répartis de façon statistique. 6. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans, les galacturonanes, la chondroitin-sulfate, les dextrans, les celluloses. 7. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe des celluloses est constitué des celluloses fonctionnalisées par des acides comme la carboxyméthylcellulose. 8. Complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le groupe des dextrans est constitué des dextrans fonctionnalisés par des acides comme le carboxyméthyldextran. 25 9. Complexe l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les polysaccharides sont choisis dans le groupe constitué par les hyaluronanes, les alginates, les chitosans. 10. Complexe selon l'une quelconque des revendications 30 précédentes caractérisé en ce que le groupe hydrophobe Hy est choisi dans le groupe constitué par les acides aminés hydrophobes d'origine naturelle, choisis dans le groupe constitué par le tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine, la leucine ou l'isoleucine ou leurs dérivés alcools, esters, décarboxylés ou amides. 35 11. Complexe selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le groupe Hydrophobe Hy, est le tryptophane ou un dérivé ester ou amide du tryptophane.20 12. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la formation du complexe polymère amphiphile-BMP est réversible. 13. Complexe selon l'une quelconque des revendications 10 précédentes caractérisé en ce que la BMP est stable à pH physiologique. 14. Complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la BMP présente une activité biologique à 37 C et à pH neutre. 15. Procédé de préparation du complexe polymère amphiphile-BMP selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on prépare ce complexe polymère/BMP en milieux aqueux et en absence de solvant organique susceptibles de dénaturer la protéine. 16. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'une quelconque des revendications 1 à 14. 17. Composition thérapeutique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle permet une administration d'environ 1,5 mg par ml de BMP. 18. Utilisation d'un complexe polymère amphiphile-BMP selon l'une 30 quelconque des revendications 1 à 14 pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à induire la formation d'os in vivo. 15 20 25