Brevet FR2917501A1 — publié le 20081219

Utilisation de la forme soluble du ligand de CD40 (sCD40L ou CD154) comme marqueur de l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur. La présente invention concerne l'évaluation de la qualité d'un échantillon de liquide biologique (plasma, sérum, urine, salive, LCR, liquide synovial etc...) avant son analyse et plus particulièrement l'évaluation de son éventuelle dégradation liée à une exposition accidentelle à la chaleur lors de la chaîne de traitement dudit échantillon biologique. La qualité de l'analyse d'un échantillon biologique dépend dans une large mesure de la qualité intrinsèque dudit échantillon au moment de l'analyse. Celle-ci dépend des variables pré-analytiques et en particulier des variables pré-analytiques liées à la chaîne de traitement de l'échantillon entre son prélèvement et son analyse. Plus précisément, la chaîne de traitement d'un échantillon biologique regroupe l'ensemble des étapes de manipulations opératoires qui ont lieu entre le prélèvement du liquide biologique et l'analyse effective, et qui sont nécessaires pour que ledit liquide biologique soit mis dans des conditions optimales pour l'analyse. A titre d'illustration, la chaîne de traitement d'un échantillon de sérum comprend notamment les étapes suivantes : - prélèvement du sang ; aliquotage ; - traitement proprement dit des échantillons : (i) coagulation ; (ii) centrifugation ; (iii) récupération du surnageant ; - conservation : (i) congélation ; (ii) conservation proprement dite (par exemple à -80 C) ; mise en condition pour l'analyse : (i) décongélation ; (ii) dilutions éventuelles A chaque étape de la chaîne de traitement de l'échantillon biologique, des variations de certains paramètres peuvent influencer la qualité de l'échantillon et donc son analyse. Ces paramètres, également appelés variables pré-analytiques, incluent de manière non limitative : - le temps écoulé entre le prélèvement de l'échantillon et la congélation ; - la durée de l'étape de congélation (vitesse de diminution de la température) ; la température de conservation, la durée de la conservation ; - le nombre de cycles de congélation-décongélation. Pour tenir compte de l'influence de ces paramètres sur la qualité de l'échantillon biologique et pour limiter leur variation, des procédures opératoires standardisées, telles que les bonnes pratiques de laboratoire (BPL), sont généralement mises en oeuvre. Outre ces paramètres (ou variables pré-analytiques) liés aux différentes étapes de la chaîne de traitement de l'échantillon, il existe des facteurs imprévus, tels qu'une exposition temporaire à la chaleur, qui même si toute la chaîne de traitement a été effectuée dans des conditions standardisées (par exemple BPL), peuvent ne pas être détectés et peuvent dégrader de manière préjudiciable la qualité de l'échantillon et donc la fiabilité de l'analyse de ce dernier. Ainsi, tout au long de la chaîne de traitement de l'échantillon biologique, celui-ci peut accidentellement être exposé à la chaleur, c'est-à-dire à une température supérieure à la température ambiante, ce qui risque de nuire à la qualité et donc à la fiabilité de l'analyse. Ce risque, accru en fonction de certaines conditions climatiques (saisons, canicule), existe notamment dans les situations suivantes : - transport des échantillons dans des conditions où la température n'est pas contrôlée ; - emplacement des échantillons à proximité d'une source de chaleur ; absence de refroidissement ou échauffement anormal d'un matériel défectueux (centrifugeuse, congélateur) ; - locaux insuffisamment équipés pour réguler la température. Or, il n'existe actuellement aucun marqueur permettant de contrôler si un échantillon biologique a été exposé à la chaleur par inadvertance, avant son analyse. En conséquence, la présente invention a pour but de pourvoir à un marqueur fiable de l'exposition d'un échantillon biologique à la chaleur, avant son analyse ; un tel marqueur est en particulier nécessaire pour les structures confrontées au problème du contrôle de la qualité des échantillons biologiques, telles que les laboratoires de recherche, les hôpitaux, les centres de ressources biologiques (CRB) ou biobanques, les centres d'essais cliniques et les laboratoires d'analyse. Pour répondre à ce besoin, les Inventeurs se sont donné pour objectif d'identifier un ou plusieurs marqueur(s) biologique(s), dont la quantité dans l'échantillon biologique varie en fonction d'une exposition de celui-ci à une température supérieure à la température ambiante et plus précisément à une température supérieure à 28 C, les valeurs de température ambiante généralement 3 admises étant comprises entre 18 et 28 C. Pour cela, ils ont recherché un marqueur réunissant les critères suivants : ce marqueur doit être si possible ubiquitaire, c'est-à-dire que pour un liquide biologique donné contenant naturellement ce marqueur, celui-ci est présent chez presque tous les sujets. lorsque l'échantillon est exposé à la chaleur, le marqueur doit donner une réponse de type on/off, c'est-à-dire qu'il doit être presque entièrement dégradé ou perdre près de 100% de son activité. Les études portant sur l'influence des paramètres (ou variables pré- analytiques) de la chaîne de traitement d'un échantillon sur la stabilité de certaines constantes biologiques présentes dans les échantillons biologiques n'ont jusqu'à présent pas permis d'identifier un tel marqueur de qualité. En effet, les molécules telles que des acides aminés, des acides gras libres, le sodium, le cholestérol, les triglycérides et la vitamine E ne varient pas de façon significative après 30 cycles de congélation-décongélation (Paltiel et al., 2004) ; l'eestradiol, la prolactine et la testostérone totale, dans le sérum et le plasma, ainsi que la testostérone libre dans le sérum, sont stables lorsque l'échantillon est congelé à -80 C pendant 3 ans (Bolleli et al., 1995) ; les vitamines telles que le rétinol, le f3-carotène, l'a-tocophérol sont légèrement sensibles aux cycles de congélation- décongélation (Wahrendorf et al.) ; certaines catécholamines, telles que la noradrénaline, l'adrénaline et la dopamine, dans le plasma et dans l'urine, sont sensibles au temps écoulé entre le prélèvement et la centrifugation, ainsi qu'à la durée et à la température de congélation (Boomsma et al.) ; le niveau de certains acides gras dans le sérum sont influencés par la durée et la température de congélation (Umemura etal.). Ces études concernent donc uniquement la sensibilité de certains marqueurs à la durée et à la température de conservation ou bien aux cycles de congélation/décongélation. En revanche, aucune de ces études ne révèle l'existence d'un marqueur biologique apte à renseigner sur l'exposition de l'échantillon à la 3 0 chaleur (température supérieure à 28 C). Les Inventeurs ont maintenant, de manière surprenante, mis en évidence le fait que la forme soluble du ligand de CD40 (sCD40L) peut constituer un marqueur d'exposition d'un échantillon biologique à la chaleur, dans l'ensemble de la chaîne de traitement de l'échantillon. 35 Le ligand de CD40 (CD40L), également dénommé CD 154, gp39, TRAP (TNF-related Activation Protein) ou TBAM (T-cell B-cell Activating Protein), un membre de la superfamille du TNF, est un ligand exprimé à la surface de nombreux types cellulaires, incluant les plaquettes activées. Une fois exprimé à la surface cellulaire, le CD40L est partiellement clivé par des protéases et est libéré sous forme soluble (sCD40L) dans la circulation. La forme soluble est détectable au moins dans le sérum et dans le plasma. Le sCD40L est synthétisé par les lymphocytes T activés, notamment les lymphocytes de type CD4+. Par conséquent, la forme soluble doit être également détectable dans le liquide synovial puisque ce liquide contient des lymphocytes activés, ainsi que dans le liquide céphalorachidien, puisque les protéines du sérum traversent la barrière hémato-encéphalique. Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence que le sCD40L réunit les critères qu'ils ont fixés pour constituer un marqueur convenable, c'est-à-dire qu'il est ubiquitaire (il est présent au moins dans le sérum et dans le plasma chez presque tous les sujets) et qu'il est apte à donner une réponse de type on/off lorsque l'échantillon de liquide biologique a été exposé à la chaleur (température supérieure à la température ambiante). En effet, les Inventeurs ont montré, de manière surprenante, la quasi-disparition du sCD40L dans l'échantillon notamment lorsque celui-ci est placé à 37 C. Cette quasi-disparition est observable dès 12 heures à 37 C. Elle est observée notamment à l'aide des techniques d'ELISA et de dot blot avec révélation chimioluminescente. La cause possible de la disparition du signal immunologique est 2 0 une dégradation protéolytique, une agrégation ou encore une dénaturation. Ces données sont tout à fait inattendues au vu des études antérieures concernant la mesure du sCD40L dans le sérum ou dans le plasma. En effet : - Weber et al. ont testé l'influence des paramètres (variables pré-analytiques) de la chaîne de traitement de l'échantillon précités sur la concentration 25 de sCD40L dans des échantillons de sérum et de plasma (sur EDTA ou sur citrate), avant ou après la centrifugation qui intervient dans l'étape de traitement proprement dit (processing) des échantillons (Weber et al., 2006). Les données obtenues, très hétéroclites, les ont conduit à faire les remarques suivantes : (a) les valeurs de sCD40L dans le sérum sont significativement plus hautes que dans le plasma (sur 30 citrate ou sur EDTA). De plus, le sCD40L dans le sérum augmente en fonction du temps écoulé entre le prélèvement du sang et le traitement de l'échantillon. Au contraire, les valeurs de sCD40L dans le plasma (sur citrate ou sur EDTA) diminuent après 1 h30 de temps de pré-traitement (preprocessing) et retournent aux valeurs de base après 3 heures. (b) après la centrifugation, les valeurs mesurées pour chaque type 35 d'échantillon sont stables après une période d'au moins 3 heures à température ambiante ou à une température comprise entre 4 et 8 C. Plus précisément, ils ont montré que : (i) dans le sérum, la concentration de sCD40L augmente lorsque l'échantillon est placé, avant la centrifugation, pendant 1h30 à 3 heures à température ambiante ou à une température comprise entre 4 et 8 C. Après la centrifugation, lorsque l'échantillon est placé à température ambiante ou à une température comprise entre 4 et 8 C, la concentration de sCD40L ne diminue pas pendant les trois premières heures, mais diminue après une période prolongée. (ii) Dans le plasma sur EDTA, la concentration de sCD40L diminue lorsque l'échantillon est placé, avant la centrifugation, pendant 1h30 ou 3 heures à une température comprise entre 4 et 8 C. A température ambiante, la concentration diminue après 1 h30 et retourne à la valeur initiale après 3 heures. Après ladite centrifugation, la concentration de sCD40L reste constante après 24 heures à température ambiante, mais diminue après 24 heures à une température comprise entre 4 et 8 C. (iii) Dans le plasma sur citrate, la concentration de sCD40L ne varie pas lorsque l'échantillon est placé, avant la centrifugation, pendant 1h30 ou 3 heures à une température comprise entre 4 et 8 C, alors qu'elle diminue lorsque ledit échantillon est placé pendant 1h 30 à température ambiante et retourne à sa valeur de base après 3 heures à température ambiante. Après la centrifugation, la concentration de sCD40L augmente légèrement à température ambiante, cette augmentation étant 2 0 significative après 24 heures. En revanche, la concentration de sCD40L diminue après 24 heures à une température comprise entre 4 et 8 C. - Selon Varo et al., la teneur en plaquettes du plasma et le nombre de cycles de congélation/décongélation peuvent avoir une influence sur la concentration de sCD40L dans le plasma (Varo et al., 2006). En outre, ils montrent que la 25 concentration de sCD40L dans le sérum ou dans le plasma sur citrate diminue significativement lorsque l'échantillon est placé pendant une période prolongée à température ambiante. Il ressort donc de ces études qu'aucune réponse de type on/off à une exposition de l'échantillon de liquide biologique à la chaleur n'a jusqu'à présent été 30 décrite. Cette réponse à la chaleur de type on/off, mise en évidence pour la première fois par les Inventeurs pour le sCD40L, permet donc désormais d'envisager une utilisation du sCD40L pour détecter une exposition de l'échantillon biologique à la chaleur, notamment une exposition accidentelle à la chaleur, qui peut avoir lieu à 35 n'importe quel moment tout au long de la chaîne de traitement de l'échantillon. La présente invention a donc pour objet l'utilisation du sCD40L comme marqueur d'une exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur. Pour déterminer la concentration de sCD40L dans l'échantillon de liquide biologique, il est préférable d'utiliser un test d'immunodétection, tel qu'un test d'immunochimioluminescence ou un test immunoenzymatique (ELISA ou Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), mettant en oeuvre des anticorps polyclonaux dirigés contre sCD40L, tel que le kit Quantikine Human soluble CD40 Ligand Immunoassay commercialisé par R&D Systems (FR) sous la référence DCDL40. De préférence, le sCD40L est détecté à l'aide d'un test ELISA mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux, tel que le kit sCD40L ou le kit sCD40L high sensitivity commercialisés par Bender MedSystems (AT) respectivement sous les références BMS239 et BMS293. Dans le cadre de la présente invention, on considère que l'échantillon de liquide biologique a été exposé à la chaleur lorsqu'on observe une absence de sCD40L dans ledit échantillon. L'absence de sCD40L correspond à une concentration en sCD40L dans l'échantillon inférieure au seuil de détection ou, lorsque ladite concentration est supérieure audit seuil de détection, à une concentration de sCD40L dans l'échantillon inférieure d'au moins 95% à la concentration en sCD40L dans un échantillon contrôle. Le seuil de détection correspond à la concentration minimale de sCD40L détectable dans les conditions d'utilisation du test de détection mis en oeuvre. 2 0 Il dépend notamment du test lui-même et des conditions d'expérimentation (opérateur, technique de pipetage, technique de lavage, durée et température d'incubation). Un échantillon contrôle est un échantillon (i) du même liquide biologique que l'échantillon à tester, (ii) ayant subi, au cours de sa chaîne de traitement, les mêmes étapes que l'échantillon à tester, aux variables pré-analytiques 25 près, à condition que lesdites variables ne soient pas de nature, en soi, à modifier significativement la concentration du sCD40L dans l'échantillon et (iii) dont on sait en outre qu'il n'a pas été exposé à la chaleur. Ainsi, selon les cas, l'échantillon contrôle peut notamment être prélevé à une date différente, être conservé à -80 C pendant une durée différente ou 30 encore provenir d'un autre donneur que l'échantillon à tester. On entend par chaleur une température supérieure à la température ambiante, c'est-à-dire supérieure à 28 C, de préférence supérieure à 30 C et de préférence encore supérieure à 35 C. Avantageusement, ledit liquide biologique est sélectionné dans le 35 groupe constitué par le plasma, le sérum, l'urine, la salive, le liquide céphalorachidien et le liquide synovial. De préférence, ledit liquide biologique est le sérum ou le plasma. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de l'utilisation selon l'invention, le sCD40L est naturellement présent dans le liquide biologique. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de l'utilisation selon l'invention, le sC'D40L est utilisé en tant que xénobiotique et est ajouté audit liquide biologique fraîchement préparé, c'est-à-dire juste après son prélèvement ou, dans le cas d'un sérum et d'un plasma, juste après l'étape de traitement proprement dit. Ce mode de mise en oeuvre est particulièrement adapté à la détection de l'exposition à la chaleur d'un échantillon de liquide biologique ne contenant pas naturellement du sCD40L. De préférence, ledit liquide est l'urine ; Varo et al. (précité) ont en effet montré que le sCD40L est absent dans ce liquide biologique. Avantageusement, le sCD40L est ajouté de manière à avoir une concentration connue de sCD40L dans chaque échantillon. Préférentiellement, il est ajouté avant l'aliquotage dudit liquide biologique, de manière à obtenir une concentration de sCD40L homogène dans chaque échantillon final. Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, il est particulièrement avantageux d'utiliser le sCD40L sous la forme d'une protéine recombinante. La synthèse et la préparation du sCD40L recombinant peuvent être effectuées à l'aide de toutes techniques adaptées connues en elles-même que l'on peut trouver notamment dans des ouvrage de référence dans le domaine de la biologie moléculaire et des systèmes d'expression hétérologue (Sambrook J. et al., 2000). Un exemple de sCD40L recombinant pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de la présente Invention est le sCD40L recombinant humain produit chez E. coli et commercialisé par Leinco Technologies (US) (ref.C386). Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de ladite utilisation, le sCD40L (natif ou recombinant) est utilisé en combinaison avec la protéine S et/ou en combinaison avec le facteur VIII. Ces deux facteurs de coagulation sont en effet connus pour leur instabilité thermique, et notamment leur instabilité aux cycles de congélation-décongélation (Milam et al., 1980 ; Dzik et al., 1989 ; Sward-Nilsson et al., 2006 ; Woodhams et al., 2001 ; McLellan et al., 1983). Ainsi, l'utilisation combinée du sCD40L avec l'un et/ou l'autre de ces facteurs de coagulation présente l'avantage d'affiner le contrôle de la qualité de l'échantillon biologique lors de la chaîne de son traitement et permet aussi bien de contrôler l'influence (i) d'une variable pré-analytique, telle que les conditions de conservation de l'échantillon et plus spécifiquement les cycles de congélation-décongélation et (ii) d'un facteur imprévu ou accidentel tel qu'une exposition à la chaleur à travers toute la chaîne de traitement de l'échantillon. De préférence, le facteur VIII et/ou la protéine S sont naturellement présents dans ledit liquide biologique (par exemple le plasma). Comme pour sCD40L, la protéine S peut être utilisée sous sa forme native ou sous forme de xénobiotique. Dans ce dernier cas, on peut notamment utiliser une protéine S recombinante. L'utilisation de la protéine S comme xénobiotique est particulièrement adaptée aux échantillons de sérum provenant de sujets présentant une déficience en protéine S, telle qu'une déficience congénitale (de type I, II ou III) ou une déficience acquise (syndromes inflammatoires, désordres hépatiques, syndromes néphrétiques, traitement avec des contraceptifs oraux, traitement par la L- asparaginase). Le facteur VIII peut également être utilisé sous sa forme native ou en tant que xénobiotique. Dans ce dernier cas, on peut notamment utiliser un facteur VIII recombinant, tel que celui commercialisé par Biochain (réf. Z5010339) ou celui commercialisé par RayBiotech (ref. IP-03-317). L'utilisation du facteur VIII comme xénobiotique est particulièrement adaptée aux échantillons de plasma provenant de sujets présentant une déficience en facteur VIII, telle qu'une déficience congénitale (hémophilie A). Le dosage de la protéine S et celui du facteur VIII sont de préférence effectués à l'aide de tests fonctionnels. Par exemple, le test chronométrique STACLOT Protein S de Diagnostica Stago (FR) est particulièrement adapté pour doser l'activité de la protéine S ; le test fonctionnel mettant en oeuvre le kit STA-Deficient VIII de Diagnostica Stago (FR) est particulièrement adapté pour doser l'activité du facteur VIII. La présente invention a également pour objet une méthode de détermination de l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur, caractérisé en ce qu'elle comprend : (1) la détection de la présence ou de l'absence de sCD40L dans ledit échantillon de liquide biologique et (2) l'évaluation de l'exposition dudit échantillon de liquide biologique à la chaleur par comparaison du résultat de la détection du sCD40L obtenu à l'étape (1) par rapport à un échantillon contrôle, l'observation de l'absence de sCD40L étant le signe d'une exposition à la chaleur dudit échantillon à tester, ladite absence de sCD40L étant définie comme indiqué plus haut. Avantageusement, le sCD40L est détecté à l'aide d'un test d'immunodétection et préférentiellement à l'aide d'un test ELISA mettant en oeuvre des anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre le sCD40L, tel que décrit plus haut. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de la méthode selon l'invention, ledit liquide biologique contient naturellement le sCD40L. De préférence, ledit liquide biologique est sélectionné dans le groupe constitué par le sérum, le plasma, le liquide synovial et le liquide céphalorachidien. De préférence, ledit liquide biologique est le sérum ou le plasma. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de la méthode selon l'invention, ledit liquide biologique ne contient pas de sCD40L de manière naturelle. Dans ce cas, la protéine sCD40L est ajoutée au liquide biologique fraîchement préparé en tant que xénobiotique, de préférence sous forme de protéine recombinante. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, ledit liquide biologique rie contenant pas naturellement le sCD40L est l'urine. Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de la méthode selon l'invention, ladite méthode comprend en outre la détermination de l'activité du facteur VIII et/ou de l'activité de la protéine S dans ledit échantillon de liquide biologique, l'absence de sCD40L associée à une diminution de l'activité de la protéine S et/ou à une diminution de l'activité du facteur VIII indiquant que ledit échantillon a été exposé à la chaleur. La présente invention a en outre pour objet un kit (ou trousse) de détection de l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins (i) un moyen de détection du sCD40L et (ii) un moyen de détection du facteur VIII et/ou un moyen de détection de la protéine S. Selon un mode de réalisation préféré du kit selon l'invention, ledit 25 moyen de détection du sCD40L comprend des anticorps monoclonaux anti-sCD40L et/ou des anticorps polyclonaux anti-sCD40L. Selon un autre mode de réalisation préféré du kit selon l'invention, ledit moyen de détection de la protéine S comprend au moins un moyen de mesure de l'activité de ladite protéine S. 30 Selon un autre mode de réalisation préféré du kit selon l'invention, ledit moyen de détection du facteur VIII comprend au moins un moyen de mesure de l'activité dudit facteur VIII. Selon encore un autre mode de réalisation préféré du kit objet de la présente invention, ledit kit comprend en outre un sCD40L recombinant, un facteur 35 VIII recombinant et/ou une protéine S recombinante ainsi qu'au moins un échantillon contrôle tel que défini ci-dessus. Un tel mode de réalisation est en effet particulièrement avantageux notamment pour tester les échantillons ne contenant pas de manière naturelle le sCD40L, la protéine S et/ou le facteur VIII. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise erg oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'au dessin annexé, dans lequel : La Figure 1 illustre la réponse de type on/off de la forme soluble du ligand de CD40 (sCD40L) dans le sérum lorsque l'échantillon a été placé pendant 24 heures à 37 C. La détection est réalisée par un test ELISA. Abscisses : cytokines détectées après un, cinq ou dix cycles de congélation/décongélation (respectivement conditions PI, P5 et P10) ou après 24 heures à 37 C (condition P37). Ordonnées : Quantité de cytokines détectées exprimée en moyenne du nombre de pixels. EXEMPLE 1 û MATERIELS ET METHODES 1) Dosage des cytokines -Echantillons et analyse des variables pré-analytiques (chaîne de traitement de l'échantillon) Quatre sérums provenant de donneurs sains (un homme de 60 ans et trois femmes de 30, 39 et 48 ans) ayant donné leur consentement sont prélevés le même jour et dans les mêmes conditions (sujet non à jeûn, prélèvement le matin, position assise) puis sont traités parallèlement selon les mêmes conditions de centrifugation, d'aliquotage et de stockage. Des échantillons de 1 ml de chaque sérum sont distribués à température ambiante dans des tubes de polypropylène. Tous les échantillons provenant des quatre sérums sont aléatoirement répartis, à température ambiante, dans deux lots. Les tubes des deux lots sont congelés à -80 C. Les tubes du premier lot sont décongelés 1, 5 et 10 fois à température ambiante, une heure avant l'analyse (respectivement conditions PI, P5 et P10). Les tubes du second lot sont congelés puis conservés 24 heures à 20 C (condition P20) ou 24 heures à 37 C (condition P37) avant l'analyse. - Analyse Le dosage de 36 cytokines (Tableau 1) est effectué à l'aide du kit Proteome Profiler- Human Cytokine Array (ref. ARY005) de R&D Systems en suivant les recommandations du fabricant. Les réactifs du même lot sont utilisés tout au long de l'étude. Les mesures sont effectuées avec 30 secondes, 3 minutes et 10 minutes d'exposition au film photographique. Les résultats sont exprimés en nombre de pixels moyens. Les différences entre les conditions Pl et chacune des conditions P5, P10 ou P37 sont calculées par le test de Student (p Pour chacun des 26 sérums, un échantillon est conservé pendant 24 heures à température ambiante, c'est-à-dire à environ 20 C (condition P20), un échantillon est conservé pendant 24 heures à 37 C (condition P37) et un échantillon est immédiatement congelé à -80 C puis décongelé à température ambiante une heure avant l'analyse (condition P1). - Dosage du sCD40L Le dosage du sCD40L dans les échantillons de sérum est effectué à l'aide du dispositif Quantikine Human sCD40 Ligand , de R&D Systems (ref DCDL40) en suivant les recommandations du fabricant, les échantillons ayant été préalablement dilués cinq fois dans le diluant du kit. 3) Dosage des facteurs de coagulation - Echantillons et variables pré-analytiques 60 spécimens de sang (18 hommes et 42 femmes, âge médian 40 ans [15-71]) sont prélevés sur citrate. Après centrifugation, le plasma de chaque spécimen est distribué dans des paillettes, puis congelé à -80 C, 3 heures après le prélèvement. Les paramètres de coagulation (protéine S et facteur VIII) sont testés sur les échantillons de plasma fraîchement obtenu, avant la distribution dans les paillettes et la congélation (condition P0). Les paillettes sont soumises à un ou deux cycles de congélation/décongélation avant l'analyse(respectivement conditions PI et P2). - Dosage Le dosage de la protéine S est effectué à l'aide d'un test chronométrique (STACLOT Protein S , Diagnostica Stago) sur un automate STA-R (Diagnostica Stago). Ce test est basé sur la mesure de l'allongement du temps de coagulation dû à l'activité cofacteur de la protéine S qui potentialise l'effet anticoagulant de la protéine C activée, dans un système enrichi en facteur Va, substrat de la protéine C activée. Le dosage du Facteur VIII est effectué à l'aide d'un plasma immunodéplété (STA-Deficient VIII , Diagnostica Stago) sur un automate STA-R (Diagnostica Stago). Ce test est basé sur la mesure, en présence de céphaline et d'activateur, du temps de coagulation d'un système où tous les facteurs sont présents, constants et en excès à l `exception du facteur VIII, apporté par l'échantillon. EXEMPLE 2 ù Résultats et Discussion 1) Identification de sCD40L comme marqueur spécifique de l'exposition à la chaleur dans les conditions de conservation d'un échantillon de liquide biologique Les Inventeurs ont cherché à identifier un marqueur biologique dont la concentration varie en fonction de l'exposition à la chaleur de l'échantillon de liquide biologique. Dans un premier temps, ils ont dosé la concentration de trente-six cytokines ubiquitaires (Tableau I) dans des échantillons de sérums placés dans les conditions P1, P5, P10, P20 ou P37 comme indiqué dans l'Exemple 1.1). Les résultats pour les conditions Pl, P5, P10 et P37 sont représentés 12 sur la Figure 1. - Con • élation/décon élation conditions PI P5 et P10 Sur les 36 cytokines testées, 18 cytokines sont détectées dans les conditions Pl, P5 et P10 (Figure 1). L'influence du nombre de cycles de congélation-décongélation sur la concentration de ces cytokines est différente selon les cas. - Conservation à température ambiante (P20) et à 37 C (P37) Dans la condition P20 (24 heures à température ambiante), on observe une diminution de l'immunoréactivité associée à sCD40L d'environ 50% (non représenté). Les autres cytokines sont également détectables dans cette condition mais avec des variations différentes selon les cas. Dans la condition P37 (24 heures à 37 C), on observe une 35 disparition du signal uniquement pour sCD40L (Figure 1), les autres cytokines détectées dans les conditions P1, P5 et P10 étant toujours détectées dans cette condition. Ces résultats montrent que le sCD40L est la seule cytokine testée présentant une réponse de type on/off après une exposition à la chaleur et pouvant ainsi représenter un marqueur de l'exposition à la chaleur. En effet, les autres cytokines sont absentes dès la condition PI ou bien sont présentes à P37. Pour confirmer ces résultats montrant la disparition du sCD40L lors d'une exposition de l'échantillon à la chaleur, les Inventeurs ont testé l'immunoréactivité associée au marqueur sCD40L dans 26 sérums préalablement soumis aux conditions Pl, P20 et P37, comme indiqué dans l'Exemple 1.2). Les résultats sont indiqués dans le Tableau II Tableau II : Diminution et quasi-disparition de l'immunoréactivité du sérum associée à sCD40L en fonction de l'exposition à la chaleur Echantillon Standards Pl P20 P37 DOaso~m 0.02 0.032 0.085 0.195 0.375 0.784 1.188 0.84 0.66 0.03 Concentration 62.5 125 250 500 1000 2000 4000 14000 10500 500 (pg/ml) Dans ces conditions, le seuil de quantification est de 62 pg/ml. La valeur moyenne de la concentration du sCD40L dans les 26 sérums est de 2,8 ng/ml et 2,1 ng/ml respectivement pour les échantillons soumis aux conditions P 1 et P20. Dans la condition P37, la concentration du sCD40L est de 0,1 ng/ml. Toutefois, cette concentration à P37 est à la limite du seuil de quantification (60 pg/ml). Ces résultats montrent donc une baisse de l'immunoréactivité associée au marqueur sCD40L lorsque les échantillons sont placés pendant 24 heures à température ambiante (P20) et une quasi-disparition (réponse de type on/off) de l'immunoréactivité lorsque les échantillons sont placés pendant 24 heures à 37 C. Il ressort donc de ce qui précède que la forme soluble du ligand de CD40 (sCD40L) représente un marqueur biologique d'intérêt capable d'indiquer l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur. 2) Etude de la stabilité des facteurs de coagulation dans le La protéine S et le facteur VIII sont des facteurs de coagulation connus pour leur instabilité en réponse à au moins un cycle de congélation/décongélation comme précisé ci-dessus. Les Inventeurs ont déterminé l'activité de la protéine S dans le plasma chez 31 sujets (7 hommes et 32 femmes d'âge médian 38 ans [15-71]) et celle du facteur VIII chez 38 sujets (9 hommes et 29 femmes d'âge médian 42 ans [19-71]). Le dosage de l'activité de la protéine S et de celle du facteur VIII est effectué juste après le prélèvement (condition P0), après un cycle de congélation-décongélation (condition Pl) ou après deux cycles de congélation-décongélation (condition P2) comme indiqué dans l'Exemple 1.3). Dans la présente étude, les plasmas ont été congelés pendant 9 ans avant de tester les conditions Pl et P2. Les résultats pour les conditions PO et PI, exprimés en pourcentage d'activité par rapport à un plasma de calibrage dont le taux de protéine S ou de facteur VIII est connu, sont représentés dans les Tableaux III et IV. Tableau III. Diminution de l'activité de la protéine S après un cycle de congélation-décongélation plasma Echantillon de % de la protéine S % de la protéine S % variation plasma (n ) (P0) (P1) [(%P1-%P0)/%P0] 37201 _ i - o : ' 37210 ù . UMIMI/Iffl/ -solo 37218 •• :'o 37220 ù I. - l'o 37222 • 37226 - •'o 37233 •' -• 1'0 37234 ' 37236 • • _ 0 37242 - • - " 0 37254 b 37261 :' -• '0 37301 -•'0 37303 - ''0 37305 -• o 3730 1 1 - 11'0 37309 _ :' 37310 _ 22 -46% 41 37314 _ • - '0 37322 :• -••'o 37359 1 ' •''o 37329 1 -81'0 37331 1 7 -•''o 37338 1 -:•'o 37340 1 -: ' 0 37342 1 1 - 7'o 37344 • -: ' 0 _ 37352 - : ' 37362 - 'o 37366 • -' ' 0 37386 • :•'o ND, non déterminé Tableau IV. Diminution de l'activité du facteur VIII après un cycle de congélation-décongélation Echantillon de ' o • u acteur ' o u acteur o variation plasma (n ) VIII Po VIII Pi %PI-%PO /Mn) 37201 -• ' o 37204 •1 ' - 0'o 37206 : -••' o 37207 • -: ' o 37210 1• - 'o 37212 .. o 37216 1 - Io 37218 11 - : l'o 37220 --••'o 37222 37226 11 • - o 37231 _ -•~'o _ 37233 1 - o 37242 ' -• 0 37295 61 -• 1 o 37298 11 - l'o 37301 _ II • -• • o 37303 1 4 - o 37305 1 4• -• 'o 37307 1 : -• o 37309 - 1 -• o 37310 - 1 -:1' o 37313 1 4 -• o 37314 11 : - • o 37359 I -• ' o 37326 1 • -• 'o 37328 1 - 'o 37329 II :4 - :'o 37331 11 -•~'o 37340 1 : ' o 37342 - 1 -•:'o 37344 11 1 - 'o 37346 II - l'o 37350 11 • -• 1 l' o 37352 :1 • -• 'o 37357 - . -• 'o 37362 : • -••'o 37365 :1 - o 37386 1 ND, non déterminé La moyenne attendue de l'activité de la protéine S dans le plasma étant de 79,86% (SD 14,1) pour les femmes et 99,8% (SD 19,4) pour les hommes et celle du facteur VIII dans le plasma étant entre 60% et 150% dans une population adulte, on observe dans les Tableaux III et IV que, dans la majorité des cas, l'activité de la protéine S et celle du facteur VIII diminuent en dessous des seuils inférieurs de valeurs normales ( Par conséquent, aux éventuelles variations près dues à la durée de conservation des plasmas (9 ans), lesdites variations étant vraisemblablement faibles si l'on considère la stabilité des deux facteurs pendant au moins 24 mois à -74 C (Woodhams et al., précité), ces résultats confirment l'instabilité de la protéine S et du facteur VIII en réponse à au moins un cycle de congélation-décongélation et montrent que ces deux facteurs permettent de déterminer si un échantillon a subi au moins un cycle de congélation-décongélation. Ces résultats, en association avec les résultats présentés ci-dessus en relation avec sCD40L, permettent donc d'envisager l'utilisation combinée du sCD40L avec l'un et/ou l'autre de ces deux facteurs de coagulation, notamment pour affiner la détection rétrospective d'une exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur. BIBLIOGRAPHIE Bolelli G, Muti P, Micheli A, Sciajno R, Franceschetti F, Krogh V, Pisani P, Berrino F. Validity for epidemiological studies of long-term cryoconservation of steroid and protein hormones in serum and plasma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1995; 4:509-513. Boomsma F, Alberts G, van Eijk L, Man in't Veld AJ, Schalekamp MA. Optimal collection and storage conditions for catecholamine measurements in human plasma and urine. Clin Chem 1993; 39:2503-2508. Dzik WH, Riibner MA, Linehan SK. Refreezing previously thawed fresh-frozen plasma. Stability of coagulation factors V and VIII:C. Transfusion 1989; 29:600-604. 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REVENDICATIONS 1 ) Utilisation de la forme soluble du ligand de CD40 (sCD40L) comme marqueur d'une exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur. 2 ) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit liquide biologique est sélectionné dans le groupe constitué par le plasma, le sérum, l'urine, la salive, le liquide céphalorachidien et le liquide synovial. 3 ) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le sCD40L est naturellement présent dans ledit liquide biologique. 4 ) Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que le sCD40L est ajouté audit liquide biologique fraîchement préparé, comme xénobiotique. 5 ) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le sCD40L est une protéine recombinante. 6 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le sCD40L est utilisé en combinaison avec la protéine S et/ou en combinaison avec le facteur VIII. 7 ) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le facteur VIII et/ou la protéine S sont naturellement présents dans ledit liquide biologique. 8 ) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le facteur VIII et/ou la protéine S sont ajoutés audit échantillon de liquide biologique juste après le prélèvement, comme xénobiotique(s). 9 ) Méthode de détermination de l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur, caractérisée en ce qu'elle comprend : (1) la détection de la présence ou de l'absence de sCD40L dans ledit échantillon de liquide biologique et (2) l'évaluation de l'exposition dudit échantillon de liquide biologique à la chaleur par comparaison du résultat de la détection du sCD40L obtenu à l'étape (1) par rapport à au moins un échantillon contrôle, l'observation de l'absence de sCD40L étant le signe d'une exposition à la chaleur dudit échantillon à tester, ladite absence de sCD40L étant définie comme une concentration en sCD40L inférieure au seuil de détection ou, lorsque ladite concentration est supérieure audit seuil de détection, comme une concentration de sCD40L dans l'échantillon inférieure d'au moins 95% à la concentration en sCD40L dans ledit échantillon contrôle.10 ) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit liquide biologique contient naturellement le sCD40L et est sélectionné dans le groupe constitué par le sérum, le plasma, le liquide synovial et le liquide céphalorachidien. 11 ) Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit liquide biologique ne contient pas naturellement le sCD40L, et en ce que le sCD40L est ajouté comme xénobiotique dans ledit échantillon de liquide biologique fraîchement préparé. 12 ) Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit sCD40L est une protéine recombinante. 13 ) Méthode selon la revendication 11 ou la revendication 12, caractérisée en ce que ledit liquide biologique ne contenant pas naturellement le sCD40L est l'urine. 14 ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre la détermination de l'activité du facteur VIII et/ou de l'activité de la protéine S dans ledit échantillon de liquide biologique, l'absence de sCD40L associée à une diminution de l'activité de la protéine S et/ou à une diminution de l'activité du facteur VIII indiquant que ledit échantillon a été exposé à la chaleur. 15 ) Kit de détection de détection de l'exposition d'un échantillon de liquide biologique à la chaleur, caractérisé en ce qu'il comprend au moins (i) un moyen de détection du sCD40L et (ii) un moyen de détection du facteur VIII et/ou un moyen de détection de la protéine S. 16 ) Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit moyen de détection du sCD40L comprend des anticorps monoclonaux anti-sCD40L et/ou des 2 5 anticorps polyclonaux anti-sCD40L. 17 ) Kit selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisé en ce que ledit moyen de détection de la protéine S comprend au moins un moyen de mesure de l'activité de ladite protéine S. 18 ) Kit selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, 30 caractérisé en ce que ledit moyen de détection du facteur VIII comprend un moyen de mesure de l'activité du facteur VIII. 19 ) Kit selon l'une quelconque des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un sCD40L recombinant, un facteur VIII recombinant et/ou une protéine S recombinante ainsi qu'au moins un échantillon 35 contrôle.