Brevet FR2918996A1 — publié le 20090123

La présente invention concerne le domaine technique du pronostic du caractère agressif des tumeurs endocrines, et plus particulièrement, des tumeurs hypophysaires. Les tumeurs hypophysaires se présentent sous la forme de micro et macroadénomes. De telles tumeurs sont fréquentes, mais sont le plus souvent considérées comme bénignes. Cependant, beaucoup d'entre elles (45 à 55 %) envahissent le sinus sphénoïdal, le sinus caverneux ou la dure-mère (1) et certaines sont décrites comme étant agressives, avec un taux de prolifération élevé et un court délai entre l'exérèse chirurgicale et la récidive. Seules 0,2 % de l'ensemble des tumeurs hypophysaires avec métastases arachnoïdiennes, cérébrales ou systémiques sont considérées comme malignes (2). La prévision du comportement d'une tumeur de l'hypophyse demeure une gageure (3.4). Jusqu'à présent, les études réalisées pour déterminer des marqueurs d'agressivité des tumeurs hypophysaires ont comparé les profils des différents types de tumeurs hypophysaires (à prolactine, somatrotopes, corticotropes...) à l'hypophyse normale. A ce jour, ces études n'ont jamais permis d'identifier des marqueurs d'agressivité. Les facteurs connus comme étant impliqués dans la cancérogenèse de l'hypophyse ne sont pas prédictifs du caractère invasif ni du caractère agressif (5). Ces facteurs incluent des marqueurs classiques de prolifération (Ki-67, l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) et P53) (b-8), des oncogènes putatifs [gène de prédisposition à des tumeurs de l'hypophyse (PTTG) et ras] (9'10), des facteurs de croissance [facteur de croissance de fibroblastes (FGF) et le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF)] (11,12), et un marqueur d'invasion, la molécule d'adhésion neurale polysialylée (PSA-NCAM) (13). L'utilité limitée de ces marqueurs est probablement due à leurs multiples fonctions dans la plasticité normale de l'hypophyse et à une mauvaise compréhension du passage de leur fonction physiologique à leur rôle dans le comportement tumoral. La localisation anatomique de l'hypophyse, l'existence de plusieurs phénotypes de cellules tumorales, les facteurs extrinsèques ou intrinsèques mis en jeu dans les tumeurs hypophysaires et la pauvreté des modèles tumoraux in vitro ou in vivo limitent également la détermination des critères d'invasion et d'agressivité. Aujourd'hui, en l'absence de marqueurs histologiques de malignité, la présence de métastases est le seul indicateur permettant de prédire si une tumeur est maligne ou non. Un des objectifs de l'invention est de fournir un procédé de pronostic 10 qui permette de différencier les tumeurs endocrines agressives, des tumeurs endocrines du même type non-agressives. Dans ce contexte, la présente invention concerne un procédé de pronostic ex vivo du caractère agressif d'une tumeur endocrine d'un patient dans lequel : 15 - on détermine, à partir d'un échantillon biologique du patient, le profil d'expression d'au moins un marqueur génique ARN ou ADN d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins un marqueur peptidique pour lequel code ledit marqueur génique, ou qui correspond à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code ledit marqueur génique, 20 et - on compare le profil d'expression obtenu à un profil de référence et on en déduit si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. L'Invention a également pour objet un kit de diagnostic d'une tumeur 25 endocrine dans un échantillon biologique comprenant : - des moyens de détection dans un échantillon biologique et de détermination du profil d'expression d'au moins un marqueur génique ARN ou ADN d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins un marqueur peptidique pour lequel code ledit marqueur acide nucléique ou qui correspond à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code ledit marqueur génique, et, - des instructions permettant de corréler la détection à la présence éventuelle d'une tumeur de l'hypophyse et de déterminer si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. Les inventeurs ont identifié des marqueurs dont l'expression est modifiée (modifiée à la hausse ou à la baisse) chez un individu atteint d'une tumeur endocrine agressive, et en particulier de tumeurs hypophysaires, par rapport à un individu atteint d'une tumeur non-agressive, et en particulier bénigne du même type. Par tumeur , on entend une masse tissulaire ressemblant plus ou moins au tissu normal adulte, résultant d'une prolifération cellulaire excessive et qui a tendance à croître et à perdurer. Comme tumeurs endocrines, on peut citer les tumeurs de l'hypophyse, les tumeurs du pancréas, les carcinoïdes pulmonaires ou les cancers médullaires de la thyroïde. Parmi les tumeurs hypophysaires, on distingue plusieurs types cytofonctionnels, les tumeurs à prolactine, somatrotopes, corticotropes, gonadotropes et thyréotropes. Par tumeurs endocrines du même type , on entend des tumeurs appartenant à l'une ou l'autre des familles de tumeurs endocrines que sont les tumeurs de l'hypophyse, les tumeurs du pancréas, les carcinoïdes pulmonaires ou les cancers médullaires de la thyroïde. Dans le cas des tumeurs de l'hypophyse, on considèrera du même type, de préférence, deux tumeurs appartenant à l'une ou l'autre des types cytofonctionnels que sont les tumeurs à prolactine, somatrotopes, corticotropes, gonadotropes et thyréotropes. Par tumeurs bénignes , on entend des tumeurs de croissance lente, non-invasives, c'est-à-dire restant limitées au tissu d'origine dans lequel elles sont nées. Après ablation chirurgicale, de telles tumeurs ne récidivent pas. Par tumeurs agressives , on entend des tumeurs malignes qui aboutissent spontanément à la mort du patient ou des tumeurs invasives ayant une croissance rapide et à fort potentiel de récidive après excision. Le terme agressif est actuellement retenu par la communauté scientifique par manque de preuve de malignité. Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence des marqueurs d'agressivité des tumeurs endocrines et, en particulier, des marqueurs d'agressivité des tumeurs hypophysaires. Certains de ces marqueurs sont particulièrement adaptés pour discriminer parmi les tumeurs à prolactine, les tumeurs agressives, des tumeurs bénignes. Les marqueurs d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées , peuvent, par exemple, être identifiés en comparant, d'une part les gènes ou protéines exprimées dans un ensemble de tissus ou échantillons biologiques issus d'un ensemble de patients atteints d'une forme agressive de la tumeur endocrine recherchée, et d'autre part, les gènes ou protéines exprimées dans un ensemble de tissus ou échantillons biologiques issus d'un ensemble de patients atteints d'une forme invasive non-agressive de la tumeur endocrine recherchée et/ou d'un ensemble de patients atteints d'une forme bénigne de la tumeur endocrine recherchée et/ou d'un ensemble de patients sains. A partir de l'ensemble des patients, on arrive à déterminer un niveau d'expression moyen pour certains gènes ou protéines qui ne présentent pas une grande variabilité d'un patient à un autre appartenant au même ensemble. Sont, par exemple, sélectionnés le ou les gènes ou protéines dont le niveau d'expression moyen est largement différent entre l'ensemble de patients atteints d'une forme agressive et l'ensemble de patients atteints d'une forme bénigne ou non invasive, non agressive de la tumeur endocrine recherchée. De préférence, le marqueur d'agressivité sélectionné présente un niveau d'expression moyen très différent, d'une part entre l'ensemble de patients atteints d'une forme agressive et l'ensemble de patients atteints d'une forme bénigne de la tumeur endocrine recherchée. De préférence, le niveau d'expression obtenu avec un échantillon biologique d'un patient sain, et, par exemple, d'un tissu endocrine normal, tel qu'une hypophyse normale, est pris comme niveau de référence pour la comparaison. Le niveau d'expression peut être modifié à la baisse ou à la hausse, d'une part par rapport au profil d'expression obtenu dans le cas d'un échantillon biologique d'un patient atteint d'une tumeur endocrine correspondante non agressive et d'autre part par rapport au profil d'expression obtenu dans le cas d'un échantillon biologique d'un patient sain. Lorsque le niveau moyen d'expression d'un marqueur est modifié à la hausse, on entend de préférence une augmentation d'au moins 2 fois, de préférence d'au moins 3 fois, et, de préférence d'au moins 5 fois. Une modification à la baisse s'entend d'un niveau moyen d'expression inférieur avec de préférence un niveau d'expression au moins divisé par deux, ou préférentiellement une absence totale dudit marqueur. Bien entendu, une différence significative doit être observée, à la fois, entre niveau d'expression tumeur agressive/niveau de référence et niveau d'expression tumeur agressive/niveau d'expression tumeur non agressive. Dans le cadre de l'invention, on utilise, de préférence au moins trois marqueurs : au moins un marqueur impliqué dans l'invasion, au moins un marqueur impliqué dans la prolifération et au moins un marqueur impliqué dans la différenciation. Par marqueur impliqué dans l'invasion , on entend des marqueurs qui incluent des molécules de la matrice, des récepteurs membranaires impliqués dans le mécanisme d'invasion d'une tumeur dans les tissus avoisinants. Par marqueur impliqué dans la prolifération , on entend des marqueurs stimulant la prolifération cellulaire. Par marqueur impliqué dans la différenciation , on entend des marqueurs exprimés au cours du développement qui contribuent à la 30 différenciation spécifique du tissu. Dans le cadre de l'invention, les termes peptide , polypeptide et protéine et les adjectifs correspondant sont employés indifféremment, pour désigner un enchainement d'acides aminés, sans qu'aucune notion de taille ne soit associée à l'un ou l'autre de ces termes. De préférence, dans le procédé de pronostic selon l'invention on détermine et compare avec un niveau de référence, le niveau d'expression d'au moins un marqueur impliqués dans l'invasion, d'au moins un marqueur impliqué dans la prolifération et d'au moins un marqueur impliqué dans la différenciation. Selon un mode de réalisation préféré, on cherche à détecter au moins les trois marqueurs suivants : - un marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1 (DCAMKL3) : ATGATGTG I I I 1 GCTTCCCCTTTGTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : - SEQ ID N 3 (AURKB) : CGGGTGCGTGTGTTTGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTCTTTACCATCACCTCATCCAGTTCGCT - et un marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : - SEQ ID N 5 (PITXI) AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC, - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG et on compare chaque niveau d'expression à un niveau de référence. Ce niveau de référence est, de préférence, obtenu avec un échantillon biologique d'un patient sain, tel qu'un tissu endocrinien normal correspondant. De façon particulièrement préférée, trois ou quatre des marqueurs SEQ 25 ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4, plus un des marqueurs SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6 ci-dessus, sont utilisés. Dans le cadre de l'invention, il a été mis en évidence que dans les tumeurs agressives, le marqueur DCAMKL3 mis en jeu dans l'invasion est régulé, généralement à la baisse par rapport aux tumeurs bénignes et le 30 marqueur ADAMTS6, régulé généralement à la hausse. Selon une variante de réalisation, le procédé selon l'invention comprend la détection d'au moins un polymorphisme ou mutation dans au moins l'une des séquences nucléiques choisies parmi : les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6. Pour cela, on peut hybrider avec une sonde, l'ARN ou l'ADN extrait de l'échantillon biologique du patient, dans des conditions stringentes qui permettent l'hybridation de la sonde avec une séquences nucléiques choisies parmi : SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, ou SEQ ID N 6, qui présente le polymorphisme ou la mutation recherchée, la présence d'un signal d'hybridation étant caractéristique dudit polymorphisme ou de ladite mutation. Il est également possible d'ajouter à la combinaison des trois, quatre, ou cinq marqueurs ci-dessus prévue, un ou plusieurs autres marqueurs d'agressivité, par exemple de 1 à 5. A titre d'exemple, on peut ajouter la détection et la comparaison à un niveau de référence d'un ou des deux marqueurs suivants, impliqués dans la prolifération : - SEQ ID N 7 (ASK) : TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC - SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGG Il est également possible d'ajouter au de substituer à l'un ou aux deux marqueurs de SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ci-dessus l'un ou les deux marqueurs suivants : - le marqueur impliqué dans l'invasion : SEQ ID N 9 (CRMP1) : CTACCACGCCCGACTACTTGACCTCCCTAC - le marqueur impliqués dans la prolifération : -SEQ ID N 1Q (PTTG) : TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA La présente invention propose donc une nouvelle méthode de différentiation de tumeurs endocrines d'un même type entre elles, et en particulier de tumeurs de l'hypophyse, afin de pronostiquer lesquelles de ces tumeurs sont des tumeurs agressives, à partir de la détection d'un marqueur ou d'un ensemble de marqueurs dans un échantillon biologique d'un patient ou dérivé d'un échantillon biologique d'un patient. En tant que patient, on désigne bien entendu de manière préférée un être humain, mais il est également possible que la détection soit effectuée chez d'autres vertébrés ou mammifères, tels que des rongeurs (souris, rats, hamsters, cochons d'Inde), ou encore des chiens, cochons, chats... La détection des marqueurs d'intérêt peut être réalisée par toute méthode adaptée, par exemple par RTPCR, ou grâce à des anticorps par immunohistochimie. En particulier, selon un premier mode de réalisation, le procédé de pronostic selon l'invention peut comprendre une étape consistant à mettre en contact un échantillon biologique du patient avec trois sondes nucléiques qui s'hybrident chacune sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec l'un des marqueurs suivants - un marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1 (DCAMKL3) : ATGATGTGTTTTGCTTCCCCTTTGTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : - SEQ ID N 3 (AURKB) CGGGTGCGTGTGTTTGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) AGTCTTTACCATCACCTCATCCAGTTCGCT - et un marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : - SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC - SEQ ID N 6 (PITXII) GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG De façon particulièrement préférée, trois ou quatre sondes telles que définies ci-dessus, pour trois ou quatre des marqueurs SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 seront utilisées, plus une sonde pour l'une des séquences SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6 ci-dessus. Il est également possible d'ajouter à la combinaison de trois, quatre, ou cinq sondes ci-dessus prévue, une ou plusieurs autres sondes, par exemple de 1 à 5, s'hybridant avec d'autres marqueurs d'agressivité. A titre d'exemple, on peut ajouter une ou deux sondes nucléiques qui s'hybrident chacune sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec un des deux marqueurs suivants, impliqués dans la prolifération : - SEQ ID N 7 (ASK) : TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC - SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGG Il est également possible d'ajouter au de substituer à l'une ou aux deux sondes dirigées contre les marqueurs de SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ou leurs analogues ci-dessus, une sonde ou deux sondes nucléiques qui s'hybrident chacune sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec : - le marqueur impliqué dans l'invasion : SEQ ID N 9 (CRMP1) : CTACCACGCCCGACTACTTGACCTCCCTAC -le marqueur impliqués dans la prolifération : - SEQ ID N 10 (PTTG) : TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA Il est également possible que l'on détermine le profil d'expression de marqueurs géniques d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, à partir des sondes nucléiques suivantes : - une sonde choisie parmi : o la séquence nucléique SEQ ID N 1 ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 1, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 1 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, o la séquence nucléique de SEQ ID N 2, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 2, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 2 ou avec un de ses 5 10 15 20 25 30 analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, une sonde choisie parmi : ola séquence nucléique de SEQ ID N 3, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 3, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 3 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, ola séquence nucléique de SEQ ID N 4, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 4, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 4 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, et une sonde choisie parmi o la séquence nucléique de SEQ ID N 5, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 5, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 5 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, o la séquence nucléique de SEQ ID N 6, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 6, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 6 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. De façon particulièrement préférée, trois des quatre premières sondes peptidiques ci-dessus ou les quatre premières sondes peptidiques ci-dessus, plus l'une des deux dernières sondes peptidiques mentionnées ci-dessus (correspondant à PITXI ou son isomorphe PITXII) sont utilisées. Il est également possible d'utiliser une ou plusieurs sondes supplémentaires lors de la détection, par exemple, on peut utiliser : - la séquence nucléique de SEQ ID N 7, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 7, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 7 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, et/ou la séquence nucléique de SEQ ID N 8, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 8, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 8 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. Il est également possible d'ajouter au de substituer à l'une ou aux deux sondes de SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ou leurs homologues ci-dessus, une sonde ou deux sondes nucléiques choisies parmi : - la séquence nucléique de SEQ ID N 9, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 9 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, et - la séquence nucléique de SEQ ID N 10, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 10, un acide nucléique qui s'hybride avec la séquence SEQ ID N 10 ou avec un de ses analogues, ou un de leur fragment comprenant de préférence au moins 10 préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. De telles sondes peuvent être des sondes double brin ou monobrin d'acide nucléique, les sondes monobrin étant préférées. Par analogue d'une séquence nucléique, on entend une séquence qui inclut une substitution, variation, modification, remplacement, délétion, addition, d'un ou plusieurs acides nucléiques par rapport à la séquence dont elle est l'analogue et qui présente une identité de séquence avec cette dernière d'au moins 90, de préférence au moins 95%. De préférence, deux séquences analogues ne diffèrent que par un, deux ou trois acides nucléiques différents. En particulier, la différence peut résulter d'au moins un polymorphisme ou mutation dans le marqueur d'intérêt sélectionné. Le pourcentage d'identité sera calculé, après alignement optimal, sur la longueur totale de la séquence. L'alignement optimal qui correspond à l'alignement qui donne le nombre le plus important de bases identiques après alignement entre les deux séquences d'acides nucléiques comparées, peut être obtenu, éventuellement par glissement des séquences l'une par rapport à l'autre et/ou l'insertion dans l'une des séquences comparées, d'un gap entre 2 bases consécutives. Au sens de l'invention, le pourcentage d'identité de deux séquences (une séquence d'une longueur de x bases et une séquence d'une longueur de y bases) est calculé, après alignement des deux séquences comparées, en comptant manuellement, ou à l'aide d'un logiciel commercial, le nombre de bases identiques (nombre égal à z) et en le divisant par la somme des nombres de bases des 2 fragments (x+y) moins le nombre de bases identiques (z) et fois 100. Cela donne la formule suivante : % d'identité =100* z/(x+y-z) Par conséquent, seules deux séquences strictement identiques peuvent présenter 100% d'identité. La mise en contact entre la sonde nucléique et l'échantillon biologique est réalisée pendant un temps suffisant et sous des conditions adaptées pour permettre l'hybridation. Ensuite, l'hybridation est détectée par tout moyen approprié et le niveau d'hybridation est comparé avec celui obtenu avec un échantillon biologique témoin ou de référence. Le plus souvent, l'échantillon biologique témoin correspond à un échantillon biologique d'un patient atteint du même type de tumeur endocrine de forme bénigne. Bien que ces variantes soient non préférées, il pourrait également être envisagé que l'échantillon biologique de référence soit issu d'un patient sain ou d'une tumeur endocrine du même type, invasive non-agressive. La détermination du profil d'expression consiste à déterminer la quantité ou la concentration du ou des marqueur(s) d'intérêt présent(s) dans l'échantillon biologique. Les différences et/ou les similitudes observées entre le profil d'expression obtenu et le profil d'expression de référence permettent de prédire la nature de la tumeur. Les différentes séquences géniques ou peptidiques servant à la détection des marqueurs peuvent être d'origine artificielle ou non. Les séquences nucléiques selon l'invention peuvent être des séquences d'ADN ou d'ARN. De telles séquences peuvent être préparées par synthèse chimique ou par les méthodes classiques de biologie moléculaire. Ces séquences nucléiques permettent la réalisation de sondes nucléiques capables de s'hybrider fortement et spécifiquement avec une séquence d'acides nucléiques, d'un ADN génomique ou d'un ARN messager issu de l'échantillon biologique du patient. Toutes les techniques de biologie moléculaire, d'ADN recombinant, de synthèse peptidique en phase solide, liquide ou d'immunologie, sont bien connues de l'homme du métier et pourront être appliquées dans le cadre de l'invention. De telles techniques sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans les ouvrages suivants auxquels on pourra se référer : - Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III; - DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and Il (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; - Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, ppl-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp83-115; and Wu et al., pp135-151; - Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, whole of text; - Perbal, B., A Practical Guide to Moleculard Cloning (1984); - Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miller, E., ed.), vol. 15, 41h edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart. - Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications). Les conditions d'hybridation appropriées correspondent, par exemple, aux conditions de température et de force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier (Sambrook et al., 1989, supra), de préférence à des conditions de température comprises entre(Tm-5 C) et (Tm-30 C), Tm étant la température théorique de fusion définie comme étant la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent. L'évaluation du profil d'expression des marqueurs peut être effectuée par différentes techniques bien connues de l'homme de l'art. Les marqueurs géniques peuvent être détectés et quantifiés à l'aide de sondes nucléiques spécifiques. Les polypeptides correspondants peuvent également être dosés à l'aide d'anticorps spécifiques. De tels anticorps peuvent être marqués de manière à ce que les complexes formés entre le polypeptide et lesdits anticorps soient ensuite facilement détectables dans des échantillons biologiques. Les méthodes classiques d'hybridation et d'amplification, ainsi que leur combinaison, peuvent être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention. Il est, par exemple, possible de mettre en oeuvre une réaction d'hybridation d'acide nucléique entre une sonde marquée et un second acide nucléique présent dans l'échantillon biologique issu d'un patient à tester, et d'ensuite détecter le produit d'hybridation marqué obtenu. Il est également possible que l'hybridation comprenne une réaction d'amplification, par exemple par PCR, dans lequel on utilise une amorce nucléique permettant d'amplifier les copies d'acide nucléique présentes dans l'échantillon. Toutes ces techniques sont bien connues de l'homme du métier, l'amplification permettant d'augmenter la sensibilité de détection, notamment dans le cas où les quantités de ARNm sont peu abondantes dans l'échantillon biologique. L'échantillon biologique soumis à la détection peut avoir subi plusieurs modifications, notamment il est possible que les acides nucléiques ou les protéines qu'il contient soient séparés ou immobilisés sur une matrice solide ou encore solubilisés pour obtenir un extrait pour l'hybridation. Pour toutes les techniques de détection de séquences d'acide nucléique, on pourra se référer à la demande WO2004/074510 pages 55 à 58, qui peuvent être appliquées dans le cadre de la présente invention. Pour plus de précision sur les techniquesd'hybridation et la définition des sondes et des amorces qui peuvent être utilisées, on pourra se référer au document WO 2004/074510 pages 65 à 78. La détection peut également être réalisée en détectant dans l'échantillon biologique les trois polypeptides suivants : - un polypeptide choisi parmi o un polypeptide codé par la séquence nucléique SEQ ID N 1, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% didentité avec SEQ ID N 1, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, o un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 2, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 2, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, - un polypeptide choisi parmi : o un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 3, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 3, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, ou o un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 4, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 4, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, - et un polypeptide choisi parmi : o un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 5, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 5, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, o un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 6, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 6, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. De façon particulièrement préférée, trois des quatre premiers polypeptides ci-dessus ou les quatre premiers polypeptides ci-dessus, plus l'un des deux derniers polypeptides mentionnés ci-dessus (correspondant à PITXI ou son isomorphe PITXII) sont détectés. Il est également possible de détecter en plus de la combinaison des trois, quatre ou cinq peptides ci-dessus prévue, un ou plusieurs autres peptides, par exemple de 1 à 5, codées par d'autres marqueurs géniques d'agressivité. A titre d'exemple, on peut ajouter une ou deux peptides choisis parmi : - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 7, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 7, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, et - un polypeptide codé par a séquence nucléique de SEQ ID N 8, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 8, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. Il est également possible d'ajouter ou de substituer à l'un ou aux deux peptides codées par les marqueurs de SEQ ID N 7 et SEQ ID N 8 ou leurs 30 analogues ci-dessus, une sonde ou deux peptides suivants choisis parmi : -un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 9, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques, et - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 10, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 10, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 acides nucléiques. Dans ce cas, la détection est réalisée en mettant en contact l'échantillon biologique du patient d'intérêt avec un anticorps pendant un temps suffisant et sous des conditions adaptées à la formation du complexe antigène anticorps. Le complexe ainsi formé est alors détecté et la quantité de complexes détectés est comparée à celle obtenue dans le cas où l'échantillon biologique provient d'un patient ou tissu sain. En fonction du marqueur détecté, une diminution ou une augmentation du niveau d'expression par rapport au contrôle permet de déduire la présence et la nature de la tumeur détectée. Lorsque la détection est réalisée sur les polypeptides, les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que par exemple décrites dans WO 2007/074510 pages 80 à 98, ainsi que les techniques d'immuno-essais décrites dans ce document, pourront être mises en oeuvre. Dans le cadre de l'invention, en général, plusieurs marqueurs sont détectés simultanément, de sorte que l'échantillon biologique peut être mis en contact avec une pluralité d'acides nucléiques, polypeptides ou anticorps. Dans le cadre de l'invention, la méthode de diagnostic implique de préférence une méthode permettant de quantifier soit la sur-expression soit la sous-expression des marqueurs sélectionnés. Une telle quantification peut être réalisée par comparaison avec un échantillon biologique contrôle30 approprié, le plus souvent dérivé d'un patient atteint de la tumeur endocrine d'intérêt sous forme bénigne. Alternativement, le contrôle peut être dérivé de données pré-établies qui ont été générées antérieurement avec des patients atteints de la tumeur endocrine d'intérêt sous forme bénigne. Le contrôle peut par exemple correspondre au niveau d'expression maximal obtenu, avec des patients atteints de la tumeur endocrine d'intérêt sous forme bénigne, lorsque que les tumeurs agressives sont prédits avec un niveau d'expression à la hausse. Inversement, le contrôle peut par exemple correspondre au niveau d'expression minimal obtenu, avec des patients atteints de la tumeur endocrine d'Intérêt sous forme bénigne ou avec des patients sains, et notamment de tissu endocrinien sain correspondant, lorsque que les tumeurs agressives sont prédites avec un niveau d'expression à la baisse. Pour chaque marqueur d'intérêt sélectionné, un niveau de sur-expression ou de sous-expression, par rapport à la valeur contrôle est préalablement déterminé, ce niveau permettant de classer la tumeur, en fonction du niveau d'expression obtenue, dans un groupe de tumeurs agressives ou non-agressives. En fonction de la position, par rapport à ces niveaux de sur- ou sous-expression, des niveaux d'expression du ou des marqueurs d'intérêt sélectionnés obtenus à partir de l'échantillon biologique d'intérêt, sera émise une décision positive (tumeur agressive) ou négative (tumeur non-agressive). Dans certains cas, la détection d'un seul marqueur ne permet pas d'avoir une décision suffisamment fiable, c'est pourquoi un set de marqueurs pourra être utilisé. Dans les différentes variantes cidessus décrites mettant en oeuvre plusieurs marqueurs géniques ou protéiques, lorsque plus de quatre marqueurs sont utilisés, il suffira, par exemple, que la comparaison entre quatre des niveaux d'expression mesurés, par rapport à chacun des niveaux de référence correspondant, permettent de conduire à une décision positive, pour conclure que la tumeur est agressive. Les échantillons biologiques qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention incluent les fluides corporels, les cellules ou tissus tumoraux, ainsi que tout tissu connu pour comprendre des cellules cancéreuses provenant de métastases de tumeurs endocrines. A titre d'exemple de fluide corporel, on peut citer l'urine, le sang, le sérum. Dans le cas de la détection de marqueurs géniques, un échantillon biologique à des cellules ou tissus tumoraux sera, de préférence, utilisé. Dans le cas de la détection d'anticorps circulants, l'échantillon biologique sera de préférence le sang. La description qui suit, en référence aux Figures annexées, détaille un mode de réalisation particulier de l'invention. La Figure 1 présente les caractéristiques principales des tumeurs à 10 prolactines (PRL) de rat. Le tableau de la Figure 1 montre que le lignage SMtTW2 est bénin, sans signe de malignité observable. Dans le lignage SMtTW3i du passage 3 à 11, les tumeurs paraissent bénignes, mais certains signes de malignité sont observés dans un petit nombre d'animaux (SMtTW3pm) ; du passage 35 à 46 15 les signes de malignité sont présents dans les tumeurs de nombreux animaux (SMtTW3m). Les valeurs données sont la moyenne avec l'intervalle entre parenthèses. La Figure 2A met en évidence les données histologiques sur les tumeurs humaines à PRL. 20 Toutes les cellules tumorales ont été marquées avec un anticorps anti-PRL (A,C). Dans la tumeur non invasive (A,B), elles n'envahissent pas l'hypophyse normale (np) ni la dure mère (dm) et leur cytoplasme (cp) est marqué par l'anticorps anti-PTTG (B). Dans une tumeur invasive (C,D), les cellules tumorales envahissent la muqueuse respiratoire (rm) et leur 25 cytoplasme (cp) ainsi que leur noyau (N) sont marqués par l'anticorps anti-PTTG (D). Barre = 100 pm (A) ; barre = 25 pm (B,C,D). La Figure 2B montre les caractéristiques principales des tumeurs humaines à PRL. Les Figures 3A et 3B présentent les résultats d'analyse de l'expression des marqueurs dans les tumeurs à PRL de l'homme et du rat en utilisant la q-RTPCR. Le tableau présenté Figure 3A donne l'expression des marqueurs par qRTPCR obtenus dans 25 tumeurs humaines à PRL. L'expression des gènes dans le tissu hypophysaire normal a été utilisée comme standard et fixée égale à 1 ; : tumeurs utilisées pour l'analyse sur micropuce ; # : la tumeur à PRL 11, en gris, a été retirée pour le calcul des moyennes et des erreurs types sur la moyenne ; * : trois autres tumeurs agressives-invasives à très faible expression d'ARNm de PITX1 prises en compte uniquement pour les moyennes entre parenthèses. La Figure 3B présente l'expression des marqueurs par qRTPCR dans les tumeurs à PRL de rat suivantes : • tumeurs bénignes (SMtTW2 passages 10, 19 et 21) ; • tumeurs pré-malignes (SMtTW3m passages 3, 4 et 6) ; • tumeurs malignes (SMtTW3m passages 41 et 42). Dans un groupe le passage le plus précoce est indiqué sur la gauche, en comparaison avec l'hypophyse normale. L'expression des gènes dans le tissu hypophysaire normal (NP) a été utilisée comme standard et fixée égale à 1. La Figure 4 présente les niveaux d'expression des marqueurs sélectionnés dans les trois catégories de tumeurs humaines. Pour identifier des marqueurs du caractère invasif ou agressif de tumeurs hypophysaires, les inventeurs se sont intéressés aux tumeurs à prolactine (PRL) et ont utilisé une combinaison d'approches histologiques et transcriptomiques dans des tumeurs humaines et dans un modèle de tumeur chez le rat (14,15), 25 tumeurs humaines à PRL ont été utilisées et classées en deux groupes (non invasives et invasives) selon des critères radiologiques et histologiques, incluant notamment les marqueurs décrits précédemment les plus fiables (Ki-67, PCNA, index mitotique, PTTG, P53 et PSA-NCAM). Contrairement à d'autres modèles de tumeurs hypophysaires, induites par des hormones ou par disruption génique, le modèle de tumeur à PRL chez le rat constitué par la tumeur spontanée mammotrope transplantable (SMtTW) dérive de tumeurs hypophysaires spontanées. La tumeur primaire et les tumeurs transplantées sous la capsule rénale forment un lignage et sont similaires aux tumeurs humaines à PRL (14-16), Deux lignages différents en termes de vitesse de croissance, d'invasion, de métastases et d'expression de PSA-NCAM peuvent être distingués, l'un restant bénin (non invasif) et l'autre devenant malin (invasif et métastatique) après plusieurs passages. Une étude transcriptomique supervisée sur micropuce d'ADN a été réalisée sur les tumeurs humaines et les tumeurs à PRL du rat pour identifier les gènes exprimés de façon différente dans les tumeurs humaines non invasives ou invasives et dans les tumeurs du rat bénignes ou malignes. Certaines ont ensuite été vérifiées par PCR quantitative en temps réel (qRTPCR). Ces approches histologiques et transcriptomiques combinées ont permis d'identifier une série de marqueurs qui différencient les tumeurs humaines à PRL non invasives, invasives non-agressives et agressives-invasives. Matériel et méthodes Tumeurs hypophysaires humaines Des fragments de tumeur hypophysaire ont été inclus dans de la paraffine pour diagnostic anatomopathologique et de nombreux fragments ont été congelés (Neurobiotec Bank, Lyon, France). Parmi les tumeurs congelées, ont été sélectionnées 25 tumeurs produisant de la PRL avec des taux plasmatiques de PRL supérieurs à 200 pg/l et avec immunocoloration uniquement de PRL (exclusion des tumeurs à PRL plurihormonales) opérées entre 1994 et 2004 (Figure 2B). La réponse à la dopamine a été testée chez 16 patients sur 25. La 30 résistance a été définie comme dans les publications précédentes (17, 18) D'après les données de l'IRM, le volume tumoral approximatif a été calculé selon la formule : hauteur x largeur x profondeur / 2 et l'invasion du sinus sphénoïdal ou caverneux identifiée dans 14 tumeurs a été confirmée par histologie dans 6 d'entre elles. Ces 25 tumeurs à PRL étaient constituées par 11 microadénomes non invasifs (sauf les n 4, 7 et 10) et 14 macroadénomes invasifs (volume > 0,5 cm). Pour analyser l'expression des gènes, en évitant toute contamination, l'hypophyse normale entourant chaque microadénome non invasif a été éliminée macroscopiquement par dissection manuelle. L'absence d'hypophyse normale a été contrôlée sur les coupes congelées et par l'absence des produits de transcription de propiomélanocortine, de GH, et d'hormone lutéinisante 13 sur q-RTPCR. L'expression des gènes a été analysée sur 10 tumeurs (3 adénomes non invasifs et 7 adénomes invasifs). La q-RTPCR a été réalisée sur les 15 25 tumeurs à PRL et sur des fragments d'hypophyse normale. Modèle de tumeur SMtTW Des rats femelles Wistar/Furth WF/Ico de même souche (Laboratoires Charles River, l'Arbresle, France) ont été utilisés. Les lignages SMtTW ont été générés à partir de tumeurs spontanées à PRL, greffées sous la capsule 20 rénale chez des rats consanguins femelles. Les caractéristiques principales de la souche et la procédure de greffage utilisées ont été décrites en détail (14) Chaque lignage a été entretenu par des séries de greffes de tumeurs ; les passages sont définis comme étant le nombre de transplantations successives sous la capsule du rein. Dans cette étude, deux lignages 25 différents de tumeurs SMtTW, à savoir SMtTW2 et SMtTW3 (14, 15), ont été utilisés. Les tumeurs à lignage SMtTW2 étaient bénignes, et n'ont présenté aucun signe de malignité jusqu'à au moins 26 passages. Elles sont restées circonscrites, sans invasion du rein ni des tissus environnants. Leur vitesse de croissance était faible et les tumeurs sécrétaient des niveaux élevés de PRL (8,1 pg/ml). Le lignage SMtTW3 a un phénotype PRL (161 pg/ml à 9,3 pg/ml) avec une faible sécrétion de GH (0,07 pg/ml). Les tumeurs SMtTW3 ont changé au cours des passages : pendant les passages 3 à 11, elles paraissaient bénignes, mais elles se sont développées plus rapidement que les tumeurs SMtTW2 et des nodules ont été quelquefois observés autour du rein greffé. Après le 34ème passage, les tumeurs SMtTW3 ont grossi très rapidement, ont envahi les tissus environnants et étaient fréquemment nécrotiques et métastatiques. Les résultats sont résumés Figure 1. Pour l'analyse de l'expression des gènes, des fragments de tumeur ont été prélevés dans les zones les plus cellulaires de la tumeur sans nécrose et sans fibrose et ont été conservés à l'état congelé à - 80 C jusqu'à utilisation. Dix-huit tumeurs ont été analysées : 7 tumeurs du lignage SMtTW2 prélevées au hasard entre les passages 10 et 26) et 7 tumeurs du lignage SMtTW3 avec un comportement pré-malin (SMtTW3pm) et 4 tumeurs du lignage SMtTW3 avec un comportement malin (SMtTW3m). Immunohistochimie La détection des marqueurs de prolifération et de PRL a été réalisée sur des coupes paraffiniques de tissu fixé dans du Bouin Holland en utilisant la méthode indirecte à l'immunoperoxidase et le kit Vectastain ABC (Vector, Burlingame, CA). Les anticorps suivants ont été testés : anti-PRL humain (1/400, Immunotech, Marseille, France), anti-PRL de rat du Dr Parlow (1/8000, NIDDK, Bethesda, Etats-Unis), anti-PCNA (pclO, 1/400, Novocastra, Newcastle upon Tyne, Royaume Uni), Ki-67 [Mibi (1/50, Dako, Glostrup, Danemark] pour les tumeurs humaines, MM1 1/200 (Novocastra) pour les tumeurs SMtTW], anti-p53 (1/200, Novocastra), anti-PTTG (1/200, laboratoires Zymed, San Francisco, CA, Etats-Unis), anti-galectine-3 (1/200, Novocastra). Pour déterminer l'indice de marquage par le Ki-67, le pourcentage de coloration pour PCNA et l'indice mitotique, les cellules ont été comptées à un grossissement de 400 dans 10 champs représentatifs par tumeur, une moyenne de 5000 noyaux ont été comptés. Pour la détection de PSA-NCAM, des coupes cryostat ont été mises à incuber avec un anti-PSA-NCAM (1/1000, AbCys SA, Paris, France) comme décrit précédemment (16). La coloration à l'immunoperoxydase a été réalisée en utilisant le kit Vectastain ABC (IgM de souris, Vector) et le chromogène 3-amino-9-éthylcarbazole (DAKO). La détection de PRL, des marqueurs de la prolifération et de PSA-NCAM a été effectuée sur toutes les tumeurs humaines et sur au moins 10 tumeurs de rat de chaque lignage pris à différents passages, sauf pour la galectine-3, PTTG et p53 pour lesquels il n'existe pas d'anticorps contre la protéine du rat. Extraction de l'ARN L'ARN total a été extrait de tumeurs hypophysaires humaines ou de rat en utilisant Trizol (Invitrogen) conformément au protocole du fabricant (Invitrogen, Carlsbad, Californie, Etats-Unis). Pour la q-RTPCR, l'ARN total a été soumis à un traitement par la désoxyribonucléase avec un minikit RNeasy (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément au protocole du fabricant. Le rendement en ARN total a été mesuré par la DO260, la pureté a été vérifiée par un rapport A260/A280 de 1,9-2,1, et la qualité a été évaluée sur des nanopuces avec le bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, Etats-Unis) conformément au protocole du fabricant. Amplification de l'ARN L'ARN total (2 pg) a été amplifié et marqué par de la biotine par une série de transcriptions in vitro (dIVT) avec un kit Message Amp aRNA (Ambion, Austin, Texas, Etats-Unis) conformément au protocole du fabricant. Avant amplification, des solutions d'ARNm synthétiques ont été ajoutées à différentes concentrations dans tous les échantillons ; ces témoins positifs ont été utilisés pour vérifier la qualité de la procédure. On a mesuré le rendement en ARNa avec un spectrophotomètre UV et on a contrôlé la qualité sur des nanopuces avec le bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent). Hybridation sur puce et traitement Dix microgrammes d'ARNa marqué par de la biotine ont été fragmentés en utilisant 5 pl de tampon de fragmentation sous un volume final de 20 NI, puis ont été mélangés avec 240 pi de solution d'hybridation Amersham (GE Healthcare Europe GmbH, Fribourg, Allemagne) et injectés sur des biopuces CodeLink Uniset Human Whole Genome contenant 55000 sondes oligonucléotidiques de gènes humains ou CodeLink Uniset Rat Whole Genome contenant 36000 sondes oligonucléotidiques de gènes de rat (tous deux de GE Healthcare Europe GmbH, Fribourg, Allemagne). Les puces ont été hybridées pendant une nuit à 37 C et 300 tours par minute dans un incubateur. Les lames ont été lavées dans un tampon TNT strict à 46 C pendant 1 heure, puis une étape de détection à la streptavidine-cy5 (GE Healthcare) a été réalisée. Chaque lame a été mise à incuber pendant 30 minutes dans 3,4 ml de solution de streptavidine-cy5 comme décrit précédemment (19), puis lavée quatre fois dans 240 ml de tampon TNT, rincée deux fois dans 240 ml d'eau contenant 0,2 % de Triton X-100 et séchée par centrifugation à 600 tours par minute. Les lames ont été scannées avec un scanneur Genepix 4000B (Axon, Union City, Etats-Unis) et le logiciel Genepix, avec le laser réglé à 635 nm, la puissance du laser à 100% et le potentiel du tube photomultiplicateur à 60%. Les fichiers des images scannées ont été analysés en utilisant le logiciel d'expression CodeLink, version 4.0 (GE Healthcare) qui produit un signal d'hybridation brut et normalisé pour chaque position sur la puce. Analyse des données des micropuces L'intensité relative du signal d'hybridation brut sur les puces varie dans les différentes expériences. Le logiciel CodeLink a donc été utilisé pour 30 normaliser le signal d'hybridation brut sur chaque puce à la valeur médiane de la puce (l'intensité médiane est égale à 1 après normalisation) pour mieux comparer les puces entre elles. Le seuil de détection a été calculé en utilisant l'intensité du signal normalisé de 100 échantillons témoins négatifs dans la puce ; les positions dont les intensités de signaux sont inférieures à ce seuil sont considérées comme absentes . La qualité du traitement a été évaluée par la génération du nuage de points de la distribution des signaux positifs. Les intensités des signaux ont ensuite été converties en valeurs logarithmiques base 2. La comparaison statistique et le filtrage ont été réalisés en utilisant le logiciel Genespring 7.0 (Agilent). Des comparaisons par paires ont été réalisées entre les tumeurs non invasives et invasives, les tumeurs non invasives et agressives-invasives et les tumeurs invasives et agressives-invasives. Chaque échantillon d'un groupe a été comparé à chaque échantillon de l'autre groupe et seuls les gènes présentant une variation > 1,3 fois ont été retenus. En outre, un produit de transcription d'un ARNm donné a été considéré comme exprimé différemment dans la comparaison de deux échantillons quelconques si la différence donne une valeur de p Transcription inverse L'ARN total (0,5 pg) a été soumis à une transcription inverse en utilisant 30 une transcriptase inverse MMLV (Invitrogen). L'absence d'ADN génomique contaminant dans les réactions de transcription inverse a été contrôlée par q-RTPCR directement sur l'ARN total. q-RTPCR L'ADN synthétisé a été mesuré en utilisant une q-RTPCR (SYBR Green, LightCycler, Roche Diagnostics, Indianapolis, Etats-Unis) conformément aux recommandations du fabricant. Le protocole des expériences de LightCycler a consisté en une activation initiale par Taq à 95 C pendant 10 mn et en 45 cycles du programme d'amplification et de quantification (95 C pendant 15 s, 60 C pendant 5 s, et 72 C pendant 10 s, avec une seule mesure de fluorescence). La spécificité de l'amplification par la PCR a toujours été analysée avec un programme de courbe de fusion (69-95 C), avec une vitesse de chauffage de 0,1 C par seconde et une mesure de fluorescence continue. Les amorces ont été conçues par le logiciel Primera (Whitehead Institute/MIT, Etats-Unis) et achetées à Eurogentec (Seraing, Belgique). Toutes les amorces avaient des températures de fusion entre 59 et 61 C et tous les produits étaient d'une longueur de 100 à 150 pb. Analyse des résultats de la q-RTPCR L'ARNm de RPL4 pour les échantillons humains et l'ARNm de GAPD et de YWHAE dans les échantillons de rat ont été utilisés comme standards internes pour contrôler les variations de l'amplification dues à des différences de concentration de l'ARNm de départ. Les taux relatifs d'ARNm de chaque tissu ont été calculés à partir des valeurs de Ct obtenues pour le gène concerné, le rendement de la série d'amorces et les taux d'ARNm de RPL4 dans les échantillons humains et la moyenne des taux d'ARNm de GAPD et de YWHAE dans les échantillons de rat en utilisant le logiciel RealQuant (Roche). 30 Résultats Analyse histofonctionnelle des tumeurs humaines à PRL marqueurs de la prolifération et un marqueur de l'invasion (13) ont été utilisés dans 25 tumeurs humaines à PRL. Les résultats sont présentés 5 Figure 2B. Dans les adénomes non invasifs, les mitoses sus-mentionnées sont absentes ou très rares. Le marquage par Ki-67 et PCNA a été négatif ou faible. Comme l'hypophyse normale, les adénomes non invasifs ont présenté une immunocoloration cytoplasmique pour le PTTG ; le signal était hétérogène, variable en intensité et localisé dans le cytoplasme, en particulier dans la zone de Golgi. Aucune coloration nucléaire de PTTG n'a été observée. PSA-NCAM n'a pas été exprimé, sauf dans 2 macroadénomes. Dans les tumeurs invasives, des mitoses ont été détectées dans 9 tumeurs sur 14, mais l'indice mitotique était faible, comme dans les adénomes non invasifs, sauf dans trois tumeurs dans lesquelles les mitoses étaient nombreuses et parfois anormales. Le marquage nucléaire par Ki-67, observé dans 9 des 14 tumeurs, était hétérogène dans une tumeur donnée et variait d'une tumeur à une autre. Dans cinq tumeurs, la valeur maximale était > 3%. L'indice de marquage par Ki-67 était donc corrélé avec l'envahissement, comme rapporté antérieurement (20) et les valeurs de marquage élevé ont reçu une attention particulière. Il est intéressant de noter que la coloration du PTTG a été observée dans le cytoplasme et les noyaux dans S tumeurs et la coloration nucléaire de p53 a été observée dans 4 de celles-ci. PSA-NCAM a été exprimé dans la moitié des tumeurs testées. Ces données immunocytochimiques ont confirmé qu'aucun des marqueurs utilisés pris individuellement n'a pu distinguer les tumeurs invasives des tumeurs non invasives. Cependant, la combinaison du marquage par Ki-67 et p53 et du marquage nucléaire par PTTG n'a été observée que dans un sous-groupe de 5 tumeurs dans les tumeurs invasives. Outre la forte expression de mitose, Ki-67, PCNA, ces 5 tumeurs ont présenté des caractéristiques histologiques similaires et une coloration nucléaire pour PTTG. Ces tumeurs pourraient correspondre aux adénomes agressifs ou atypiques décrits dans la classification de l'OMS (Organisation mondiale de la santé) (21). En outre, le rapport moyen PRL/dimension de la tumeur était significativement plus faible dans les tumeurs invasives que dans les tumeurs non invasives et trois des cinq tumeurs agressives-invasives étaient résistantes à un agoniste dopaminergique. Les résultats de ces études histofonctionnelles combinées avec l'analyse radiologique sont enaccord avec l'existence de trois groupes de tumeurs à PRL : tumeurs non invasives, invasives non-agressives et agressives-invasives. Analyse pathologique du modèle de rat SMtTW Dans les tumeurs SMtTW2 bénignes, les mitoses étaient absentes ou rares et l'indice nucléaire de Ki-67 était Les marqueurs de prolifération, l'expression de PSA-NCAM, le rapport PRL/masse de la tumeur et le comportement tumoral ont suggéré que les tumeurs du lignage SMtTW2 étaient bénignes, tandis que les tumeurs SMtTW3pm étaient pré-malignes et que les tumeurs SMtTW3m étaient malignes (Figure 1). Analyse génomique des tumeurs humaines à PRL Par l'analyse sur micropuce, il a été découvert que 510 gènes étaient exprimés différemment entre les différents groupes de tumeurs, 167 présentaient une différence d'expression entre les tumeurs non invasives et invasives, 225 entre les tumeurs non invasives et les tumeurs agressives- invasives et 179 entre les tumeurs invasives non-agressives et agressives- invasives. Ces gènes ont été rassemblés dans un arbre de décision, basé sur les corrélations de Pearson, pour identifier les différences de profils d'expression des gènes entre les trois groupes de tumeurs et l'hypophyse normale. L'expression de quelques gènes tels que CENPE, PTTG1, CCNB1 ou AURKB était différente dans chacun des trois groupes de tumeurs et l'expression augmentait progressivement en passant des tumeurs à PRL non invasives aux invasives et en passant des tumeurs à PRL invasives non-agressives aux agressives-invasives. 7 gènes ont d'abord été identifiés comme présentant une expression différente entre les tumeurs non invasives et les tumeurs invasives non-agressives et agressives-invasives. Ensuite 34 gènes ont été identifiés comme incluant 21 produits de transcription à fonction inconnue, qui pourraient différencier les tumeurs invasives des tumeurs non invasives et agressives-invasives. Enfin, 21 gènes, dont 5 sans fonction connue, étaient exprimés différemment dans les tumeurs agressives-invasives. Les 7 gènes exprimés différemment dans les tumeurs bénignes comparées aux tumeurs invasives et agressives-invasives combinées avaient tous une fonction connue. Trois gènes impliqués dans des voies de signalisation régulant l'invasion étaient régulés à la hausse (dont CRMP1) ou régulés à la baisse (DCAMKL3) dans les tumeurs à la fois invasives non agressives et agressives-invasives, trois gènes impliqués dans la prolifération (CENPE, PTTGI et CCNB1) étaient légèrement régulés à la hausse dans les tumeurs non invasives et nettement régulés à la hausse dans les tumeurs invasives et agressives-invasives. Dans les tumeurs invasives, 14 gènes à fonction connue ont été exprimés différemment de leur expression dans les tumeurs non invasives et agressives-invasives. Certains gènes impliqués dans la prolifération étaient régulés à la hausse (par exemple CENPE) ou régulés à la baisse. Dans les tumeurs à PRL agressives-invasives, parmi les 16 gènes de fonction connue régulés de façon différente, ont été mis en évidence (i) un facteur de transcription impliqué dans le développement de l'hypophyse (PITXI; un élément de la classe des facteurs d'homéodomaine b appariés ; nettement régulé à la baisse) ; (i) une désintégrine et une métalloprotéinase (ADAMTS6; régulée à la hausse) et (iii) des gènes mis en jeu dans le cycle cellulaire (CENPE, ASKet AURKB; tous régulés à la hausse). Comparaison entre les tumeurs à PRL chez le rat et l'homme Pour évaluer la précision de la classification histologique et moléculaire des tumeurs humaines à PRL, des analyses par micropuces ont été réalisées sur des tumeurs à PRL du rat. Le profil d'expression des gènes marqueurs moléculaires identifiés dans les types de tumeurs humaines a été analysé. Parmi les 34 gènes à fonctions connues identifiés dans l'analyse des tumeurs humaines à PRL, 13 gènes homologues ont été retrouvés sur les micropuces de rat. Neuf d'entre eux (dont Cenpe, Pttgl, Ccnbl, Pitxl, et Aurbk) ont présenté une expression différente dans les tumeurs bénignes SMtTW2, pré-malignes (SMtTW3pm) et malignes (SMtTW3m). Les résultats ont été validés par q-TRPCR sur le lignage SMtTW2 et les tumeurs pré-malignes et malignes du lignage SMtTW3, l'expression standard des gènes étant celle des hypophyses normales. Les données les plus intéressantes concernant 4 gènes sont représentées Figure 3B, pour lesquels des corrélations ont pu être faites avec les gènes observés chez les patients humains. L'expression de Aurkb et Cenpe chez le rat était faible dans les tumeurs bénignes et augmentait progressivement dans les tumeurs pré-malignes et malignes SMtTW3, ainsi que dans les tumeurs à PRL humaines invasives et agressives-invasives. Pttgl était régulé à la hausse uniquement dans les tumeurs malignes du rat (Figure 3B) et les niveaux d'ARNm les plus élevés ont été découverts dans des tumeurs à PRL humaines agressives-invasives. Pitxl n'était régulé à la baisse que dans les tumeurs malignes, de façon similaire au profil d'expression dans les tumeurs humaines agressives-invasives. Sélection de gènes marqueurs pour le diagnostic Pour identifier une série de gènes qui pourraient permettre de classer 30 de façon utile les tumeurs à PRL en tumeurs non invasives, invasives non- agressives et agressives-invasives, les critères suivants ont été utilisés : (1) modifications significatives de l'expression entre les trois groupes de tumeurs, (ii) gènes ayant une fonction connue dans la progression des tumeurs et/ou (iii) profil commun chez l'homme et le rat. 18 gènes candidats ont été sélectionnés et testés par qRTPCR sur les mêmes échantillons que ceux déjà utilisés pour les micropuces. Les variations d'expression ont été confirmées pour tous les gènes, avec un coefficient de corrélation s'étalant de 0,80 à 0,99 entre la micropuce et qRTPCR. Pour confirmer la capacité des gènes choisis à discriminer les tumeurs à PRL non invasives, invasives et agressives-invasives, la qRTPCR a été utilisée pour mesurer l'expression de ces 18 gènes dans les 15 tumeurs restantes sélectionnées sur la base de leurs caractéristiques histologiques (8 non invasives, 5 invasives et 2 agressives-invasives, tableau 1) et sélectionner les 9 gènes (DCAMKL3, CRMP1, ADAMTS6, PTTG1, ASK, CCNB1, AURKB, CENPE et PITXI) qui présentaient les variations les plus significatives entre les trois groupes de tumeurs. L'expression de ces gènes mesurée par qRTPCR sur les 25 tumeurs humaines à PRL est représenté Figure 3A. Comme résumé Figure 4, il existe une corrélation entre les marqueurs histologiques et l'expression des gènes mis en jeu dans l'invasion et la prolifération. Les profils des gènes sont en accord avec la classification histologique en trois groupes, si l'on exclut une tumeur non invasive (n 11) qui a eu un profil d'expression des gènes similaire à celui d'une tumeur invasive. En fait, cette tumeur considérée comme bénigne a donné lieu après opération à une récidive et pouvait en fait être qualifiée d'invasive non agressive. Par conséquent, dans cette étude, par l'utilisation combinée de marqueurs histologiques et de l'analyse génomique, les inventeurs ont identifié une série de gènes régulés à la hausse ou à la baisse dans l'invasion et la prolifération ; ces gènes permettent de distinguer 3 groupes de tumeurs humaines à PRL non invasives, invasives et agressives-invasives et donc de pronostiquer le caractère agressif d'une telle tumeur. L'importance possible de ces gènes a été renforcée par la présence d'une série altérée de façon similaire dans un modèle de rats à tumeurs à PRL bénignes et malignes. Pour chaque gène, leur expression est considérée comme positive pour une valeur de : -DCAMKL3 (SEQ ID N 1) 5 2 - AURK B (SEQ ID N 3) ? 10 - CENPE (SEQ ID N 4) ? 5 - CCNB1(SEQ ID N 8) ?4 - ASK (SEQ ID N 7) ? 2 - ADAMTS6 (SEQ ID N 2) 15 - CRMP1 (SEQ ID N 9) > 2 - PITX1 (SEQ ID N 5) 5 0,05 ou son isoforme PITX2 (SEQ ID N 6) 5 0,05 par rapport à un standard d'expression de ces gènes placé à une valeur de 1 15 pour l'hypophyse humaine normale. Le diagnostic de malignité est retenu lorsque au moins 4 des gènes présentent une expression positive. D'une manière générale, le procédé de pronostic ex vivo du caractère 20 agressif d'une tumeur endocrine selon l'invention, par exemple celui basé sur les résultats ci-dessus, pourra notamment être proposé dans deux situations : 1/ Dans le cadre d'un bilan post- opératoire immédiat - pour une tumeur présentant l'un des signes histologiques de suspicion de 25 malignité révélés par des indicateurs classiques tels que . nombre de mitoses >2 pour 10 champs au 40 . index de marquage max de KI-67 ? 3% .marquage nucléaire avec le PTTG . détection positive de la p53 mutée. 30 -pour une tumeur présentant un aspect radiologique d'agressivité . tumeur géante . tumeur invasive 2/ Dans le cadre d'un bilan de récidive tumorale -clinique avec réapparition des symptômes tumoraux -biologique avec augmentation des taux hormonaux plasmatiques -radiologique avec augmentation du volume du reliquat tumoral ou réapparition de la tumeur. 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DeLellis, R.A, Lloyd, R.V., Heitz, P.U, Eng, C. (Eds) World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and genetics of tumours of endocrine organs: IARC Press: Lyon 2004. 25 REVENDICATIONS 1 - Procédé de pronostic ex vivo du caractère agressif d'une tumeur endocrine d'un patient dans lequel : - on détermine, à partir d'un échantillon biologique du patient, le profil d'expression d'au moins un marqueur génique d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins un marqueur peptidique pour lequel code ledit marqueur génique, ou qui correspond à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code ledit marqueur génique, ledit marqueur génique comprenant l'une des séquences suivantes : - SEQ ID N 1(DCAMKL3) : ATGATGT(; I 1 I I GCTTCCCCTTTGTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - SEQ ID N 3(AURKB):CGGGTGCGTGTGIIIGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTC I I 1 ACCATCACCTCATCCAGTTCGCT -SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC, - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG - on compare le profit d'expression obtenu à un profil de référence et on en déduit si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la tumeur endocrine est une tumeur de l'hypophyse, et en particulier à prolactine. 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'on détermine le profil d'expression d'au moins deux marqueurs géniques d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins deux marqueurs peptidiques pour lesquels codent lesdits marqueurs géniques, ou qui correspondent à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code chacun desdits marqueurs géniques, on compare les profils d'expression obtenus à des profils de référence et on en déduit si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le profil d'expression est déterminé par hybridation d'acides nucléiques, PCR, RT-PCR 30 semi-quantitative ou quantitative en temps réel, histochimie, ELISA, dot protéine, ou Western blot. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'on détermine et compare avec un profil de référence, le profil d'expression d'un marqueur impliqué dans l'invasion, d'un marqueur impliqué dans la prolifération et d'un marqueur impliqué dans la différenciation. 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'on détermine le profil d'expression de chacun des trois marqueurs suivants : - un marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1(DCAMKL3) : ATGATGTG I t I I GCTTCCCCTTTGTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA 10 un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : - SEQ ID N 3 (AURKB) : CGGGTGCGTGTG I I I GTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTCTTTACCATCACCTCATCCAGTTCGCT et un marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : - SEQ ID N 5 (PITTXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC, 15 - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG et on compare chaque profil d'expression à un profil de référence, l'ensemble des comparaisons permettant de déduire si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 7 - Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que l'on détecte 20 également le profil d'expression d'un ou des deux marqueurs suivants, impliqués dans la prolifération : - SEQ ID N 7 (ASK) : TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC - SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGG et on le(s) compare à un profil de référence. 25 8 - Procédé selon les revendications 6 ou 7 caractérisé en ce que l'on détecte également le profil d'expression d'un ou des deux marqueurs suivants : - le marqueur impliqué dans l'invasion : SEQ ID N 9 (CRMP1) : CTACCACGCCCGACTACTTGACCTCCCTAC -le marqueur impliqué dans la prolifération : 30 SEQ ID N 10 (PTTG) : TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA, et on le(s) compare à un profil de référence. 9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le profil d'expression d'au moins trois marqueurs est détecté grâce à trois sondes nucléiques définies comme suit : - une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au 5 moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec le marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1 (DCAMKL3) : ATGATGTG I I I I GCTTCCCC I I I GTAACCA -SEQ ID N 2 (ADAMTSS) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au 10 moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : - SEQ ID N 3 (AURKB) : CGGGTGCGTGTGTTTGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTC I I I ACCATCACCTCATCCAGTTCGCT - et une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au 15 moins 90, de préférence au moins 95% d'identité le marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : -SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG et on compare chaque profil d'expression à un profil de référence, l'ensemble des 20 comparaisons permettant de déduire si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 10 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que le profil d'expression d'un ou deux marqueurs supplémentaires suivants est détecté : - un marqueur détecté grâce à une sonde qui s'hybride sélectivement avec 25 une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 7 (ASK) : TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC, - un marqueur détecté grâce à une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGG 30 et on le compare à un profil de référence. 11 - Procédé selon la revendication 9 ou 10 caractérisé en ce que le profil d'expression d'un ou deux marqueurs supplémentaires suivants est détecté :un marqueur détecté grâce à une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9 (CRMP1) : CTACCACGCCCGACTACTTGACCTCCCTAC un marqueur détecté grâce à une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95 /o d'Identité avec SEQ ID N 10 (PTTG) TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA et on le(s) compare à un profil de référence. 12 - Procédé selon l'une des revendications 6 à 11 caractérisé en ce que le profil d'expression est déterminé en utilisant la technique PCR. 13 - Procédé selon la revendication 12caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction de l'ARN total de l'échantillon biologique du patient, une étape de génération de ADNc double-brin à partir de l'ARN total, une étape de transcription in vitro de l'ADNc, une étape de marquage de l'ARN transcrit obtenu et une étape d'hybridation de l'ARN transcrit avec la ou les sondes sélectionnées. 14 - Procédé selon l'une des revendications 9 à 13 caractérisé en ce que la ou les sondes sélectionnées sont immobilisées sur une puce. 15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 14 caractérisé en ce qu'il comprend la détection d'au moins un polymorphisme ou mutation dans au moins l'une des séquences nucléiques choisies parmi : les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6. 16 - Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que l'on hybride avec une sonde, l'ARN ou l'ADN extrait de l'échantillon biologique du patient, dans des conditions stringentes qui permettent l'hybridation de la sonde avec une séquences nucléiques choisies parmi : SEQ ID N 1, SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6, qui présente le polymorphisme ou la mutation recherchée, la présence d'un signal d'hybridation étant caractéristique dudit polymorphisme ou de ladite mutation. 17 - Procédé selon l'une des revendications 6 à 16 caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de cellules ou tissus de la tumeur du patient. 18 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans l'échantillon biologique des trois polypeptides suivants: a) d'un polypeptide choisi parmi : - un polypeptide codé par la séquence nucléique SEQ ID N 1 ou d'une protéine contenant ce polypeptide ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 1, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 2, ou d'une protéine contenant ce polypeptide, ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 2, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, b) d'un polypeptide choisi parmi : - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 3, ou d'une protéine contenant ce polypeptide ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 3, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, ou - d'un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 4, ou d'une protéine contenant ce polypeptide ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 4, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, c) d'un polypeptide choisi parmi : - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 5, ou d'une protéine contenant ce polypeptide ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 5, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides,- un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 6, ou d'une protéine contenant ce polypeptide ou d'un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 6, ou d'un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. 19 - Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'on détecte également le profil d'expression d'un ou deux polypeptides choisis parmi : -un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 7, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 950/o d'identité avec SEQ ID N 7, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, et -un polypeptide codé par a séquence nucléique de SEQ ID N 8, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 8, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. - Procédé selon la revendication 18 ou 19 caractérisé en ce que l'on détecte également le profil d'expression d'un ou deux polypeptides choisis parmi : 20 - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 9, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, et - un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 10, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 10, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. 21 - Procédé selon l'une des revendications 18 à 20 caractérisé en ce que la détection des marqueurs peptidiques se fait grâce à un anticorps dirigé contre le ou les marqueurs peptidiques sélectionnés. 22 - Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que le ou les anticorps sont choisis parmi les anticorps monoclonaux, polyclonaux, les fragments d'anticorps. 23 - Procédé selon l'une des revendications 18 à 21 caractérisé en ce que 5 l'échantillon biologique est du sang, des tissus ou cellules normales ou des tissus ou cellules tumorales. 24 - Kit de diagnostic d'une tumeur endocrine dans un échantillon biologique comprenant : - des moyens de détection dans un échantillon biologique et de 10 détermination du profil d'expression d'au moins un marqueur génique d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins un marqueur peptidique pour lequel code ledit marqueur génique, ou qui correspond à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code ledit marqueur génique, ledit marqueur génique comprenant l'une des séquences suivantes : 15 - SEQ ID N 1(DCAMKL3) : ATGATGTGTTTTGCTTCCCC1 I 1 GTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - SEQ ID N 3 (AURKB) : CGGGTGCGTGTGTTTGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTCTTTACCATCACCTCATCCAGTTCGCT -SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC, 20 - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG et, - des instructions permettant de corréler la détection à la présence éventuelle d'une tumeur de l'hypophyse et de déterminer si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 25 - Kit de diagnostic selon la revendication 24 caractérisé en ce que les 25 moyens de détection et de détermination du profil d'expression permettent la détection et la détermination du profil d'expression de un ou plusieurs marqueurs d'agressivité des tumeurs de l'hypophyse, et en particulier à prolactine. 26 - Kit de diagnostic selon la revendication 24 ou 25 caractérisé en ce que les moyens de détection et de détermination du profil d'expression permettent 30 la détection et la détermination du profil d'expression d'au moins deux marqueurs géniques d'agressivité des tumeurs endocrines recherchées, ou d'au moins deux marqueurs peptidiques pour lesquels codent lesdits marqueurs géniques ou quicorrespondent à une protéine incluant la séquence peptidique pour laquelle code chacun desdits marqueurs géniques. 27 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 26 caractérisé en ce que les moyens de détection et de détermination du profil d'expression sont 5 adaptés à la technique d'hybridation d'acides nucléiques, PCR, RT-PCR semi- quantitative ou quantitative en temps réel, histochimie, ELISA, dot protéine, ou Western blot. 28 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 27 caractérisé en ce que les moyens de détection et de détermination du profil d'expression 10 permettent la détection et la détermination du profil d'expression d'un marqueur impliqués dans l'invasion, d'un marqueur impliqué dans la prolifération et d'un marqueur impliqué dans la différenciation. 29 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 28 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection et de détermination du profil 15 d'expression pour chacun des trois marqueurs suivants : - un marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1 (DCAMKL3) : ATGATGTGTTTrGCTTCCCCTTTGTAACCA - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA - un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : 20 - SEQ ID N 3(AURKB):CGGGTGCGTGT(IIIGTATGTCTGTGTATG - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTCI I IACCATCACCTCATCCAGTTCGCT - et un marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : - SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC, SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG 25 et on compare chaque profil d'expression à un profil de référence, l'ensemble des comparaisons permettant de déduire si la tumeur identifiée est une tumeur agressive ou non-agressive. 30 - Kit de diagnostic selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection et de détermination du profil d'expression 30 pour l'un ou les deux marqueurs suivants, impliqués dans la prolifération : - SEQ ID N 7(ASK):TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC - SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGGet on le compare à un profil de référence. 31 - Kit de diagnostic selon la revendication 29 ou 30 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection et de détermination du profil d'expression pour l'un ou les deux marqueurs suivants : - le marqueur impliqué dans l'invasion : SEQ ID N 9 (CRMP1) : CTACCACGCCCGACTACTTGACCTCCCTAC -le marqueur impliqué dans la prolifération : SEQ ID N 10 (PTTG) : TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA 32 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 29 à 31 caractérisé 10 en ce qu'il comprend trois sondes géniques définies comme suit : - une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec le marqueur impliqué dans l'invasion choisi parmi : - SEQ ID N 1 (DCAMKL3) : ATGATGTGTTTTGCTTCCCC I I I GTAACCA 15 - SEQ ID N 2 (ADAMTS6) : GATGCTGGAAGAGGAGGGCAGTCAGTGTCA -une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec un marqueur impliqué dans la prolifération choisi parmi : - SEQ ID N 3 (AURKB) : CGGGTGCGTGTGTTTGTATGTCTGTGTATG 20 - SEQ ID N 4 (CENPE) : AGTC I I I ACCATCACCTCATCCAGTTCGCT - et une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité le marqueur impliqué dans la différenciation choisi parmi : - SEQ ID N 5 (PITXI) : AACTCGGGCCTCAACAACATCAACAACCTC 25 - SEQ ID N 6 (PITXII) : GTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAG 33 - Kit de diagnostic selon la revendication 32 caractérisé en ce qu'il comprend : - une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 7 (ASK) : 30 TCGTCCCCTTCAACTTCTACATTTACTGGC,et/ou- une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 8 (CCNB1) : GCACTTCCTTCGGAGAGCATCTAAGATTGG 34 - Kit de diagnostic selon la revendication 32 ou 33 caractérisé en ce 5 qu'il comprend : une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9 (CRMP1):CTACCACGCCCGACTACITGACCTCCCTAC une sonde qui s'hybride sélectivement avec une séquence présentant au 10 moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 10 (PTTG) : TGTTCCTGCCTCAGATGACGCCTATCCAGA 35 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 34 caractérisé en ce que les moyens de détection et de détermination du profil d'expression sont adaptés à la technique PCR. 15 36 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 35 caractérisé en ce que la ou les sondes sélectionnées sont immobilisées sur une puce. 37 - Kit de diagnostic selon l'une des revendication 24 à 36 caractérisé en ce qu'il comprend une sonde qui s'hybride à l'ARN ou l'ADN extrait de l'échantillon biologique avec une séquences nucléiques choisies parmi : SEQ ID N 1, SEQ ID 20 N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 ou SEQ ID N 6 qui présente le polymorphisme ou la mutation recherchée, la présence d'un signal d'hybridation étant caractéristique dudit polymorphisme ou de ladite mutation. 38 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 24 à 28 caractérisé en ce qu'il comprend trois anticorps : 25 a) anticorps choisi parmi ; - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique SEQ ID N 1, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 1, ou un de leurs fragments 30 comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides,- un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 2, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 2, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, b) un anticorps choisi parmi : - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 3, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 3, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, ou - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 4, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 4, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, c) et un anticorps choisi parmi : - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 5, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 5, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 6, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 6, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. 39 - Kit de diagnostic selon la revendication 38 caractérisé en ce qu'il comprend également : - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 7, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses 5 analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 7, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, et/ou - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 8, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses 10 analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'Identité avec SEQ ID N 8, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. 40 - Kit de diagnostic selon la revendication 38 ou 39 caractérisé en ce qu'il comprend également : 15 - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 9, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 9, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides, et/ou 20 - un anticorps dirigé contre un polypeptide codé par la séquence nucléique de SEQ ID N 10, ou une protéine contenant ce polypeptide, ou un de ses analogues qui présente au moins 90, de préférence au moins 95% d'identité avec SEQ ID N 10, ou un de leurs fragments comprenant de préférence au moins 10, préférentiellement au moins 20 nucléotides. 25 41 - Kit de diagnostic selon l'une des revendications 38 à 40 caractérisé en ce que le ou les anticorps sont choisis parmi les anticorps monoclonaux, polyclonaux, les fragments d'anticorps.