Brevet FR2915208A1 — publié le 20081024

La présente invention concerne une nouvelle composition de perméabilisation des parois de microorganismes comprenant l'association d'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA) et de polyéthylenimine (PEI) et ses utilisations, notamment, dans un procédé de dénombrement et/ou d'identification ciblée des microorganismes dans un milieu liquide ou gazeux. L'invention s'applique plus particulièrement au contrôle de la qualité microbiologique des milieux liquides et gazeux entrant, par exemple, dans les chaînes de production de produits alimentaires ou pharmaceutiques. Dans ce domaine, les microorganismes à détecter sont souvent peu nombreux car dilués dans des volumes importants d'eau ou de gaz. Cependant, leur identité doit être déterminée avec certitude. En effet, le contrôle pratiqué doit permettre de détecter, dans un délai le plus court possible, toute contamination des fluides entrant dans la composition d'un produit manufacturé ceci afin de pouvoir stopper, le cas échéant la fabrication du produit ou sa distribution, et prendre les mesures de décontamination qui s'imposent. De nombreux procédés de détection des microorganismes ont été mis au point afin de minimiser le temps de culture desdits microorganismes. Un tel procédé de détection des microorganismes, comprenant une filtration du liquide au travers d'une membrane, est par exemple décrit dans la demande WO 01/59157. Selon ce procédé, les microorganismes contenus dans un échantillon liquide sont retenus à la surface d'une membrane par passage du liquide à travers celle-ci. Les microorganismes sont cultivés à la surface de la membrane au contact d'un milieu de culture gélosé, le temps nécessaire pour former une microcolonie non visible à l'oeil nu. Les cellules formant la microcolonie sont alors lysées afin de libérer leur contenu en adénosine triphosphate (ATP) et en acides nucléiques. L'ATP libéré est utilisé comme marqueur pour identifier et quantifier les cellules vivantes par ATP-bioluminescence. L'ATP sert de substrat à une enzyme produisant une réaction de chimioluminescence par laquelle un signal lumineux est obtenu, puis détecté à l'aide d'une interface vidéo appropriée (ex : camera LCD). Le signal obtenu, mis sous forme d'image, permet de visualiser in-situ l'endroit de la membrane où le germe s'est développé, de manière analogue à un dénombrement classique effectué sur une boîte de Pétri en milieu gélosé. Dans ce cas, la détection est dite universelle car l'ATP est un marqueur présent chez tous les microorganismes vivants. Elle ne permet pas de différencier les différentes espèces de microorganismes. Le système Milliflex rapid , commercialisé par la firme Millipore, fonctionne sur le principe décrit ci-dessus. Il a été conçu pour réaliser les étapes de filtration et de détection sur une seule et même membrane, laquelle est maintenue sur un support en plastique. Ce support est conçu pour s'emboîter sur les différents dispositifs aidant à la filtration, la culture des microorganismes, et à la détection. Ce système miniaturisé permet un gain de temps appréciable par rapport aux tests traditionnels sur boites de Pétri. En outre, il permet de stocker les images obtenues sur support numérique, ce qui est avantageux en termes de traçabilité des produits analysés. Ce système présente néanmoins certaines limites liées au fait, qu'en pratique, l'énumération des microorganismes présents à la surface de la membrane est effectuée après lyse des cellules. Cette lyse est rendue nécessaire pour extraire des cellules les produits qui entrent en réaction avec les réactifs luminescents, par exemple l'ATP, pour produire le signal luminescent que l'on détecte. Cependant, une fois la membrane traitée, il devient difficile de la réutiliser en vue de procéder à d'autres analyses pouvant conduire par exemple, à une identification précise des microorganismes détectés. Il est possible de déterminer l'identité des microorganismes, par exemple, à l'aide de sondes venant s'hybrider de manière spécifique aux acides nucléiques (ADN ou ARN) contenus dans les microorganismes. Les sondes de ce type les plus courantes comprennent un fragment oligonucléotidique d'une longueur généralement comprise entre 10 et 40 nucléotides formant une séquence complémentaire à celle comprise dans l'ADN ou l'ARN du microorganisme. Des sondes de type PNA (peptides d'acides nucléiques) peuvent également se montrer avantageuses dans ce type de détection car elles présentent un squelette peptidique moins sensibles aux enzymes de dégradation présentes dans les microorganismes et offrent des possibilités différentes de marquage. La demande WO 2004/050902 décrit un système de détection sur membrane qui permet de détecter la présence de microorganismes contaminant les échantillons sanguins sans provoquer de lyse des microorganismes. La particularité de ce système réside en ce que la détection des microorganismes se fait par la pénétration d'agents de marquage à l'intérieur des microorganismes à travers leur paroi. Les agents de marquage utilisés sont des molécules de petites dimensions, en particulier des composés intercalants des acides nucléiques (ADN, ARN) tels que les dérivés cyanines, l'iodure de propidium, l'acridine orange ou le bromure d'éthidium. Ces composés de petite taille, pénètrent relativement facilement à travers la membrane à l'intérieur des microorganismes, en utilisant des agents perméabilisants connus de l'art antérieur tels que le polyéthylenemine (PEI), la digitonine, la nonensine, le sodium héxaméthaphosphate, ou le chlorure de benzalkonium. L'échantillon liquide contenant les microorganismes à tester est d'abord dilué dans une solution de perméabilisation comprenant l'agent de marquage en présence d'un réactif de perméabilisation cellulaire, puis les microorganismes sont filtrés sur une membrane pour y être détéctés. II en résulte une détection des microorganismes offrant une meilleure résolution. Toutefois, du fait que les marqueurs sont des marqueurs universels, c'est à dire non spécifiques des microorganismes, ce système ne permet pas de déterminer avec précision la nature des microorganismes détectés. En outre, dans un tel système, la manipulation des microorganismes (incubation dans la solution de perméabilisation) a lieu en solution, ce qui requiert des précautions particulières et un appareillage complexe. II est à noter que l'incubation des cellules vivantes en solution avant filtration, présente également l'inconvénient que les cellules peuvent continuer à croître et se diviser, avant d'être fixées sur la membrane, ce qui crée de facto une incertitude sur le résultat final du test. Une autre difficulté liée à ce type d'analyse est la quantité de réactifs de perméabilisation qu'il faut utiliser dans la solution de perméabilisation, Cette quantité varie en effet selon les types de microorganismes à détecter. Selon, par exemple, que les microorganismes (dans le cas des bactéries) sont de type gram positif ou gram négatif, le réactif de perméabilisation n'aura pas d'effet à la même concentration, ou pire, provoquera la lyse des microorganismes présents. Ainsi, les bactéries à gram positif possèdent une seule membrane disposant d'une couche externe épaisse formée de peptidoglycanes (polymère formé de chaînes peptidiques et polysaccharidiques), ce qui rend leur perméabilisation plus difficile que celle des bactéries à gram négatif, chez lesquelles la paroi est constituée d'une double membrane entre lesquelles les peptidoglycanes sont moins abondants et plus dispersés. Le polyéthylenemine (PEI), qui est un polymère aliphatique faiblement basique et polycationique, est décrit pour rendre les paroi de certaines bactéries à gram négatif perméable à diverses molécules antibiotiques [Helander, I.M. et al., Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of gramnegative bacteria, Microbiology (1997), 143 :3193-3199.]. La concentration de PEI utilisée dans ce but pour une bactérie comme Esherichia coli se situe entre 20 et 30 gg/ml. L'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA) de formule C10H16N2O8) est un agent chélatant bien connu, utilisé fréquemment en biochimie en tant qu'agent de stabilisation, notamment en tant qu'inhibiteur de réactions enzymatiques ou anti-oxydant. L'EDTA est présent dans certaines compositions à cet effet. Cependant il a été démontré que l'EDTA pris seul ne permettait pas une pérméabilisation satisfaisante des parois des microorganismes en vue d'obtenir un marquage des acides nucléiques, notamment en ce qui concerne les bactéries à gram positif (WO 04/050902). Le lysozyme est un produit utilisé pour perméabiliser les parois des bactéries à gram positif dans de nombreux protocoles de transfection cellulaire d'acides nucléiques. Il agit notamment en hydrolysant certaines liaisons entre les acides N-acétylglucosamine et N-acétylmuramique des peptidoglycanes présents dans les parois des bactéries. La présente invention a pour but de répondre aux limitations des systèmes de détection existants mentionnées ci-dessus, notamment en ce qui concerne les bactéries à gram positif, réputées plus difficiles à traiter. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté que l'association d'EDTA et de PEI, permet de perméabiliser plus efficacement les parois des microorganismes que les compositions décrites dans l'art antérieur, notamment celles comprenant uniquement du PEI ou de l'EDTA. II a pu ainsi être établi que des compositions associant au moins du PEI et de l'EDTA sont particulièrement adaptées à la pérméabilisation des microorganismes en particulier les bactéries à gram positif. Ces compositions permettent en particulier, selon l'invention, la mise en oeuvre d'un procédé de marquage desdits microorganismes à l'aide de sondes oligonucléotidiques utile pour détecter de manière spécifique les microorganismes. Ce procédé comprend la mise en contact d'un microorganisme avec une composition selon l'invention comprenant l'association de PEI et d'EDTA, en présence de macromolécules marquées telles que des sondes oligonucléotidiques ou de type PNA, afin que celles-ci puissent pénétrer à l'intérieur des microorganismes à travers leur paroi pour s'y fixer. En outre, il est apparu que les microorganismes ainsi traités toléraient des concentrations élevées de PEI, supérieures à celles habituellement utilisées, sans provoquer de lyse marquée des cellules. Par microorganisme on désigne dans la présente invention toute cellule vivante (eucaryote ou procaryote), organisme unicellulaire, gamète, ou virus comprenant un patrimoine génétique contenu dans une enveloppe formée d'une paroi simple ou multiple. Une composition telle que définie ci-dessus permet la pénétration de macromolécules à l'intérieur des microorganismes tout en limitant la destruction de leurs parois. Une macromolécule se définit comme une molécule résultant de l'association d'un grand nombre de molécules simples, comme des polypeptides, des protéines, des glycoprotéines, des oligonucléotides, des polysaccharides, des acides nucléiques (ADN, ARN), des anticorps, ou des dérivés de ceux-ci. Les macromolécules auxquelles l'invention est adaptée sont généralement des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 1000 daltons (1 kDa), de préférence supérieur à 2000 daltons (2 kDa) et plus préférentiellement supérieur à 5000 daltons (5 kDa). Le polyéthylèneimine (PEI) est un produit soluble disponible sous plusieurs formes. La forme polymérisée monomérique, qui a une masse moléculaire d'environ 750 kDa, est une forme préférée selon l'invention (N CAS 9002-98-6). Le PEI est utilisé dans de nombreux domaines, notamment en tant qu'agent de floculation des protéines et les acides nucléiques en solution dans différents procédés de purification. Il est aussi utilisé en tant qu'agent perméabilisant du fait qu'il a la propriété de déstructurer de manière réversible les phospholipides présents dans les parois des cellules, rendant ainsi ces parois perméables à des agents, qui normalement ne sont pas admis à pénétrer dans les cellules. Ainsi l'invention a pour premier objet une composition de perméabilisation des parois de microorganismes comprenant l'association de PEI et d'EDTA. La concentration en PEI dans la composition de perméabilisation peut être comprise entre 100 et 1000 préférentiellement entre 150 et 900 pg/mI, et plus préférentiellement entre 200 et 800 g/ml. Selon l'invention, l'EDTA est généralement présente dans la composition de perméabilisation à raison d'une concentration comprise entre 1 et 25 200 mM, préférentiellement entre 5 et 100 mM, plus préférentiellement entre 50 et 150 mM, et encore plus préférentiellement entre 50 et 100 mM. De préférence, la concentration d'EDTA dans la composition est supérieure à 50 mM. De préférence, cette composition comprend également du 30 lysozyme à une concentration généralement comprise entre 0.5 et 5 mg/ml, de préférence entre 1 et 4 mg/ml. Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition selon l'invention, et plus particulièrement un procédé de détection des microorganismes sur membrane comprenant une étape de pénétration de 35 macromolécules marquées à l'intérieur des microorganismes. Pour des raisons qui ne sont pas encore bien connues, l'association de PEI et d'EDTA, facilite la pénétration des macromolécules, telles que des sondes nucléotidiques, à l'intérieur des microorganismes, tandis que l'emploi de lysozyme est utile pour fragmenter les peptidoglycanes présents dans les parois desdits microorganismes. De préférence, la composition selon l'invention ne comprend pas de détergent, ce qui présente plusieurs avantages au regard du procédé de détection des microorganismes détaillé ci-après. L'absence de détergent permet d'éviter par exemple la destruction de certaines protéines nécessaire à la mise en oeuvre du procédé, telles que le lysozyme et les enzymes participant à l'obtention du signal de détection par luminescence. L'absence de détergent permet également de pouvoir procéder plus efficacement à la fixation des microorganismes sur la membrane par réticulation. Les sondes spécifiques participant à la détection des microorganismes sont de préférence des sondes oligonucléotidiques pouvant s'hybrider aux ARN ribosomiques desdits microorganismes. Ces sondes comprennent préférentiellement une des séquences suivantes : SEQ ID NO.1 : 5' TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC 3' SEQ ID NO.2 : 5' TTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCG 3' SEQ ID NO.3 : 5' GCTTCTCGTCCGTTCGCTCGAC 3' SEQ ID NO. 4 : 5' ACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTG 3' SEQ ID NO. 5 : 5' AAATCACTTCACCTACGTGTCAGCG 3' Ces séquences permettent respectivement la détection spécifique de Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia col/ and Salmonella enterica arizonae. Les macromolécules pouvant être utilisées dans le procédé de détection selon l'invention des microorganismes ne se limitent pas à des sondes oligonucléotidiques et peuvent consister, par exemples, en des antigènes, des anticorps ou des aptamères dirigés contre des constituants internes des microorganismes peuvent également être utilisées pour procéder à la détection des microorganismes selon l'invention. La figure 1 illustre les différentes étapes du procédé de détection spécifique des microorganismes selon l'invention tel qu'il est mis en oeuvre dans l'exemple 1. La figure 2 compare (A) les résultats obtenus selon le procédé de détection universelle par ATP bioluminescence et (B) les résultats obtenus en mettant en oeuvre la composition de perméabilisation N 7 comprenant comme réactif 1 mg/ml de Lysozyme, 100mM d'EDTA, 374,5 g/ml de PEI et un inhibiteur de RNAse (lx concentré) pour détecter spécifiquement B.subtilis selon le procédé de l'invention à l'aide d'une sonde d'hybridation dont la séquence correspond à SEQ ID NO. 2. Les procédés selon (A) et (B) sont mis en oeuvre sur la même membrane sur laquelle sont déposées par filtration des cellules de la bactérie à gram positif B.subtilis. La partie gauche montre en image de synthèse la position des micro-colonies de bactéries détectées par luminescence sur la membrane, la partie droite représente la même membrane sur un plan incliné avec une indication en relief représentant l'intensité du signal lumineux émis par chacune des micro-colonies détectées. Le nombre de microcolonies donnant lieu à un signal lumineux significatif est indiqué en bas à droite de l'image de synthèse. Le nombre de microcolonies dénombré est pratiquement le même sous (A) et (B) avec cependant un signal apportant une meilleure discrimination pour (B). La figure 3 représente les images de synthèse obtenues lorsqu'une sonde spécifique de B.subtilis est mise en oeuvre selon l'invention vis-à-vis de colonies bactériennes de (A) B. subtilis, (B) S. aureus, (C) P. aeruginosa, (D) E. coli, et (E) S. enterica susbsp arizonae. Cette figure montre que le procédé selon l'invention permet d'obtenir une détection spécifique des microorganismes. Les figures 4 à 9 représentent les images de synthèse obtenues selon le protocole décrit dans l'exemple 1 en utilisant B.subtilis comme microorganisme cible. Chaque figure correspond à la mise en oeuvre d'une composition de perméabilisation visée dans l'exemple 1. Dans ces figures, (A) la perméabilisation est effectuée à température ambiante, (B) la perméabilisation est effectuée à 37 C. La partie gauche montre en image de synthèse la position des micro-colonies de bactéries détectées par luminescence sur la membrane, la partie droite représente la même membrane sur un plan incliné avec une indication en relief représentant l'intensité du signal lumineux émis par chacune des micro-colonies détectées. La figure 4 correspond à la mise en oeuvre d'une composition de perméabilisation contenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme (composition N 1). La figure 5 correspond à la mise en oeuvre d'une composition comprenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme et 5mM 10 d'EDTA (composition N 2). La figure 6 correspond à la mise en oeuvre d'une composition comprenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme et 100mM d'EDTA (composition N 3). La figure 7 correspond à la mise en oeuvre d'une composition 15 comprenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme et 374,5 g/ml de PEI (composition N 4). La figure 8 correspond à la mise en oeuvre d'une composition comprenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme, 5mM d'EDTA et 374,5 g/ml de PEI (composition N 5 selon l'invention). 20 La figure 9 correspond à la mise en oeuvre d'une composition comprenant comme réactif de perméabilisation 4mg/ml de Lysozyme, 100 mM d'EDTA et 374,5 g/ml de PEI (composition N 6 selon l'invention). La figure 10 représente l'image de synthèse obtenue lorsque la bactérie à gram négatif Pseudomonas aeruginosa est détectée de manière 25 spécifique selon le procédé de l'invention à l'aide d'une composition de perméabilisation comprenant comme réactif 4 mg/mL de lysozyme, 100mM d'EDTA et 374.5pg/mL de PEI. La partie gauche montre en image de synthèse la position des micro-colonies de bactéries détectées par luminescence sur la membrane, la partie droite représente la même membrane sur un plan incliné 30 avec une indication en relief représentant l'intensité du signal lumineux émis par chacune des micro-colonies détectées. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de la composition de perméabilisation telle que décrite précédemment dans un procédé de dénombrement et/ou d'identification, sur une membrane, des microorganismes initialement présents dans un milieu liquide ou gazeux. Selon une forme particulière de l'invention, le procédé se caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) on filtre le milieu liquide ou gazeux à travers une membrane de sorte à retenir sur ou à l'intérieur de la membrane les microorganismes présents dans ce milieu ; (b) on met en contact la membrane et les microorganismes avec une composition de perméabilisation telle que décrite précédemment, comprenant du PEI, de l'EDTA et du lysozyme ; (c) on fixe les cellules sur la membrane à l'aide d'un agent de réticulation ; (d) on met en contact les microorganismes avec une ou plusieurs macromolécules, éventuellement marquées, aptes à traverser la paroi des microorganismes ; et (e) on procède à la détection des macromolécules ayant pénétré à l'intérieur des microorganismes. Les microorganismes visés par le procédé de l'invention sont plus particulièrement choisis parmi les bactéries pathogènes à gram positif ou négatif des genres Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter, ou Aeromonas ; les protozoaires du genre Giardia, 25 Entamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora ; les mycoplasmes du genre Mycoplasma et Uréaplasma, les champignons du genre Aspergillus, Candida ou Penicillium, les virus de l'hépatite A à E, lesquels sont des microorganismes à caractère pathogène rencontrés fréquemment dans l'environnement. Ce procédé est, en principe, également applicable à la détection 30 d'algues unicellulaires telles que des cyanobactéries, à des formes unicellulaires d'organismes parasitaires telles que des amibes ou des oeufs de nématodes, de trématodes ou d'ascaris, ou encore de gamètes de plantes ou d'animaux tels que des pollens ou des spermatozoïdes. Le but de ce procédé est de dénombrer les microorganismes présents dans un milieu liquide tel que de l'eau, ou gazeux tel que l'air, tout en déterminant, autant que possible, leur identité (famille, genre, espèce...). Par milieu liquide ou gazeux, on entend tout fluide pouvant être filtré en appliquant une différence de pression au travers d'une membrane ayant des pores d'un diamètre moyen compris généralement entre 0,1 et 1,5 microns, de préférence entre 0,15 et 0,8 microns, plus préférentiellement entre 0,2 et 0,6 microns. Un tel fluide peut consister en des solutions pures entrant dans la fabrication de produit stériles mais aussi en des solutions complexes telles que l'eau potable, des boissons, des fluides médicaux (sérum, urines, liquide amniotique...etc..). Le présent procédé peut d'ailleurs avoir des applications dans le domaine du diagnostic pour l'analyse d'échantillons liquides provenant d'animaux ou de patients. Par membrane , on désigne dans la présente demande un support synthétique présentant deux faces, dont les pores ont un diamètre moyen connu. La membrane utilisée dans le cadre de la présente invention 20 présente, en général, un rapport surface/volume élevé et une épaisseur constante comprise, de préférence, entre 90 et 200 microns. Une telle membrane peut être mono ou multicouche. Elle est en général constituée d'un ou plusieurs matériaux choisis parmi le polytetrafluoroéthylène, le fluorure de poly(vinylidene) (PVDF), le polycarbonate, 25 le polyamide, le polyester, le polyethersulfone, l'acétylcellulose et la nitrocellulose. Les matériaux sont de préférence choisis pour être compatibles avec les solvants utilisés, en particulier, les alcools et aldéhydes susceptibles d'être employés aux différentes étapes du procédé. 30 La membrane sur laquelle sont détectés les microorganismes est, de préférence, principalement constituée de PVDF (fluorure de poly(vinylidene) ou de Nylon . Plus préférentiellement, il s'agit d'une membrane filtrante en PVDF, du type de celle commercialisée par la firme Millipore sous le nom de marque Milliflex et les références MXHVWP124 ou RMHVMFX24. L'étape a) du procédé selon l'invention consiste en la filtration du milieu liquide ou gazeux à analyser à travers une membrane telle que définie ci-5 dessus de sorte à retenir à la surface de cette membrane les microorganismes contenus dans ledit milieu. Une fois les microorganismes filtrés et retenus sur la membrane, une étape facultative de culture des microorganismes au contact d'un milieu de culture approprié peut être incluse dans le procédé entre les étapes a) et b). Ce 10 milieu de culture est préférentiellement un milieu gélosé sur lequel on dépose la membrane après filtration. Cette étape, qui est facultative, permet d'obtenir des colonies de chacun des microorganismes initialement filtrés, afin de pouvoir plus facilement les détecter. Selon l'invention, les microorganismes sont ensuite incubés à 15 l'étape b), dans une composition de perméabilisation selon l'invention Cette étape d'incubation se produit dans un faible volume de solution formant un film à la surface de la membrane. Avantageusement, la composition de perméabilisation peut être contenue dans un support solide sur lequel la membrane sera déposée comme par exemple un tampon imprégné, ce 20 qui limite les éventuels déplacements de liquide à la surface de la membrane, et donc le mélange des microorganismes. Elle est conduite à une température comprise entre 20 C et 37 C pour une durée de 5 à 20 minutes. Le procédé selon l'invention est d'autant plus efficace qu'il comprend une étape (c) par laquelle on fixe les cellules sur la membrane à l'aide 25 d'un agent servant d'agent de réticulation. Cette étape permet de fixer les cellules sur le support que constitue la membrane. Un agent de réticulation préféré selon l'invention est choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde, le paraformaldéhyde se définissant comme une molécule composée d'au moins six unités de 30 formaldéhyde. Avantageusement, la composition de fixation peut être contenue dans un support solide sur lequel la membrane sera déposée comme par exemple un tampon imprégné, ce qui limite les éventuels déplacements de liquide à la surface de la membrane, et donc le mélange des microorganismes. Préférentiellement selon l'invention, l'étape de fixation est réalisée à une température comprise entre 20 C et 35 C pour une durée de 5 à 20 minutes. Cette étape de fixation peut être également réalisée par irradiation des microorganismes sur la membrane à l'aide d'un rayonnement UV. La membrane est alors préférentiellement constituée de Nylon . L'étape d) de mise en contact des microorganismes avec une ou plusieurs macromolécules, éventuellement marquées, la ou lesquelles pénètrent à travers la paroi des microorganismes à l'intérieur desdits microorganismes est réalisée préférentiellement à l'issu des étapes respectives d'incubation et de fixation b) et c), car c'est à ce moment précis qu'il a été observé que les parois des microorganismes étaient le plus perméables aux macromolécules. Selon une forme préférée de l'invention, les macromolécules sont marquées et utilisées en tant que sondes. Par sonde, on entend ici des macromolécules capables de reconnaître et de s'associer avec un élément biologique constitutif du microorganisme, permettant ainsi le marquage dudit microorganisme. Selon un aspect préféré de l'invention, la sonde est une macromolécule capable de s'hybrider avec des séquences d'ADN ou d'ARN présentes dans le microorganisme et présentant un certain degré de spécificité vis-à-vis desdits acides nucléiques. L'invention prévoit tout type de sonde connu de l'homme du métier pouvant donner lieu à une hybridation avec des acides nucléiques, tel que, par exemple des oligonucléotides simples, des oligonucléotides de type 2'O-méthyl-ARN, des sondes de type PNA (sondes constituées d'une chaîne polypeptidique substituées par des bases puriques et pyrimidiques) [Nielsen P.E. et al. Science (1991) 254 :1497-1500] ou LNA (oligonucléotides comprenant un ou plusieurs monomères de 2'-0-4'-C-methylène-[i-D-ribofuranosyl) telles que décrites dans le brevetEP 1 013 661. Les inventeurs ont pu constater que les sondes capables d'hybrider les ARN ribosomiaux des microorganismes étaient particulièrement utiles pour réaliser l'invention. Un aspect de l'invention consiste donc en des sondes comprenant une séquence identique à SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 ou SEQ ID NO.5 ou encore des sondes ayant une séquence présentant au moins 80 % d'identité, de préférence 90 %, plus préférentiellement 95 % avec les séquences indiquées ci-dessus. De telles sondes sont particulièrement indiquées pour la mise en oeuvre d'un procédé de dénombrement et/ou d'identification selon l'invention. Selon un autre aspect de l'invention les macromolécules que l'on fait pénétrer dans les microorganismes, et qui peuvent être de même nature que les sondes décrites ci-dessus, sont utilisées en tant qu'amorces pour réaliser une étape supplémentaire d'amplification spécifique des acides nucléiques contenus dans les microorganismes. Si de telles macromolécules sont utilisées dans le procédé selon l'invention, alors une étape supplémentaire, mais néanmoins facultative, est introduite dans le procédé entre les étapes c) et e), de préférence entre les étapes d) et e). Une telle étape d'amplification peut s'avérer utile pour une détection optimale des microorganismes en augmentant la quantité des acides nucléiques disponibles aux fins de la détection. Si cette étape d'amplification est hautement spécifique, elle permet en outre d'identifier les microorganismes avec davantage de sélectivité et de diminuer ainsi le nombre des faux positifs. L'amplification est de préférence une amplification de type TMA ou NASBA [Compton, J., Nature (1991) 350 :91-92 ] ou de type LAMP [Notomi T., Nucleic Acids Research (2000), 28(12): e63]. Les sondes ou amorces décrites plus haut peuvent être conçues pour détecter un seul ou plusieurs types de microorganismes. Elles peuvent, en cela présenter un degré de spécificité variable vis-à-vis des éléments biologiques présents dans les microorganismes. Par exemple, si les amorces ou sondes sont des acides nucléiques, choisis pour s'hybrider avec des acides nucléiques dont la séquence est conservée chez de nombreuses espèces de microorganismes, l'identification sera peu spécifique, si, au contraire, leur séquence est choisi pour ne reconnaître que des séquences propres à un petit nombre d'espèces la spécificité sera plus importante. Selon encore une autre forme particulière de l'invention, et de manière avantageuse, une étape d'hybridation spécifique des sondes acides nucléiques ou des amorces avec les acides nucléiques desdits microorganismes peut être mise en oeuvre après l'étape d) et avant l'étape de détection e) suivante. Cette étape d'hybridation des sondes acides nucléiques ou amorces s'effectue dans des conditions standard d'hybridation connues de l'homme du métier. Elle peut comprendre en outre une étape de lavage permettant d'éliminer les sondes acides nucléiques ou amorces ayant donné lieu à des hybridations non spécifiques. Aux fins de la détection, les sondes acides nucléiques ou amorces selon l'invention sont préférentiellement marquées en fluorescence ou bien couplées à des enzymes permettant de réaliser une réaction de chimioluminescence. L'étape (e) de détection des microorganismes est effectuée par la détection du signal lumineux provenant de la réaction de chimioluminescence ou l'émission obtenue en fluorescence correspondant au marquage de la sonde ou de l'amorce, à l'aide d'une interface appropriée. Selon un aspect plus préféré de l'invention, les sondes acides nucléiques telles que des oligonucléotides sont couplées à la peroxydase. La peroxydase lorsqu'elle est mise en présence de luminol (substrat de la peroxydase) émet des photons (réaction de bioluminescence). Les photons émis par les micro-colonies à la surface de la membrane peuvent être captés au travers d'une fibre optique pour atteindre une photocathode qui les convertit en électrons. Chaque électron va générer un nuage d'électron qui, en atteignant un écran à phosphore, est reconvertit en photons. La caméra CCD enregistre la lumière émise 30 fois par seconde durant l'intégration et l'image est transmise à l'analyseur d'images. Selon encore un autre aspect, une composition de perméabilisation telle que décrite plus haut l'invention peut être utilisée pour pratiquer un test diagnostique in-vitro. On peut, en effet, utiliser les propriétés particulières d'une composition selon l'invention pour faire pénétrer des sondes nucléotidiques ou toute autre complexe moléculaire dans des cellules prélevées sur l'homme ou l'animal, ou maintenues en culture, afin de réaliser de la détection in-situ. La composition de perméabilisation selon l'invention peut en outre, trouver de nombreuses applications dans le domaine médical, par exemple, en tant qu'adjuvant de médicament pour augmenter la perméabilité des parois à des principes actifs tels que des antibiotiques ou des antiviraux qui ne pourraient pénétrer naturellement facilement dans les cellules. Plus particulièrement, une composition selon l'invention est utile pour faire pénétrer des acides nucléiques antisens, particulièrement des ARN anti-sens (RNAi) dans des cellules dans lesquelles on cherche à inhiber l'expression de certains gènes, notamment dans le traitement de maladies génétiques ou de certains cancers. La présente invention entend couvrir, en outre, un kit pour la détection et l'énumération des microorganismes dans un milieu liquide ou gazeux comprenant au moins : - une membrane pour filtrer un milieu liquide ou gazeux ; et - une composition de perméabilisation telle que décrite dans la présente invention. De préférence la membrane contenue dans ce kit est constituée principalement de PVDF ou de Nylon . Avantageusement, un tel kit comprend, en outre, une composition comprenant un agent de réticulation choisi parmi le glutaraldehyde, le formaldehyde et le paraformaldehyde. Cette seconde composition permet la fixation des microorganismes sur la membrane, ce qui permet, en mettant en oeuvre le procédé selon l'invention, d'obtenir une meilleure résolution de la détection. Un kit selon l'invention peut également comprendre une macromolécule marquée telle qu'une sonde permettant la détection spécifique du microorganisme recherché, en particulier une sonde telle que définie plus haut comprenant une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 ou SEQ ID NO.5.35 Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention sans apporter de limitation. Exemple 1 Détection universelle de souches bactériennes selon le procédé Milliflex rapid Les souches testées sont conservées dans des cryotubes (Dutscher, réf.028049) congelés à -80 C préparés à partir de souches lyophilisées référencées ATCC, DSMZ et NCTC. Pour la fabrication des cryotubes, un flacon de bouillon TS de 100ml (Biomérieux, réf. 41146) est ensemencé le jour de la préparation des tubes et incubé à 35-37 C. Pendant la croissance, des mesures de DO à 600nm sont effectuées à intervalles réguliers à l'aide d'un spectrophotomètre (Eppendorf, Biophotometer réf.6131 000.012). La croissance est stoppée quand la DO atteint 0.5. Dans chaque cryotube, on répartit 600p1 de cryoprotecteur (Sigma, cell freezing with glycerol, réf. C6039) et 600 pl de culture. Les tubes sont mélangés puis placés à -80 C. On procède à un dénombrement du bouillon et d'un cryotube non congelé par étalement des dilutions 10-5 et 10-6. Ces dilutions sont préparées dans des flacons de 9ml d'eau peptonnée (Biomérieux, réf. 42111). 100p1 de chaque dilution est étalé au râteau sur une gélose TSA (Biomérieux, réf. 43011) incubée 24 heures à 35 C. L'opération est répétée trois fois. Le jour suivant, un cryotube est décongelé et dénombré de la même manière. Une galerie API (Biomérieux) permet l'identification et la confirmation de la pureté des cryotubes préparés. Pour tous les tests, les souches bactériennes sont diluées dans des tubes d'eau peptonnée (Biomérieux, réf. 42111). On procède à une dilution en cascade en ajoutant 1 ml du cryotube de la souche utilisée aux 9ml du tube d'eau peptonnée jusqu'à la dilution désirée. La filtration est réalisée à l'aide de la pompe Milliflex Plus Vacuum (Millipore, réf. MXP PLUS01) dans des entonnoirs Milliflex Rapid avec une membrane en PVDF de 0.45pm à quadrillage hydrophobe (Millipore, réf. RM HVMFX24). Les bactéries sont ajoutées à 50-100mI d'eau physiologique 0.9% NaCI (B.Braun, réf 0066570 E). Les membranes sont incubées sur des cassettes de milieux solides Milliflex Tryptic-soja agar (Millipore, réf. MXSM CTS48) ou R2A (Millipore, réf. 5 MXSM CRA 48) dans une étuve à 32.5 C +i- 2.5 C. Après une incubation dont la durée est dépendante de la bactérie utilisée, les réactifs de lyse et de bioluminescence (Millipore, réf. MXRP BLRST) sont appliqués sur la membrane au moyen de la Milliflex Rapid Autospray Station (Millipore, réf. MXRP SPRKT) qui distribue 35 pl de chaque réactif de 10 manière homogène à la surface de la membrane. Les membranes sont ensuite lues grâce au système Milliflex Rapid (Millipore, réf. MXRP KT230) suivant les instructions du fabriquant. Le système Milliflex Rapid est un système complexe qui détecte, amplifie et enregistre à l'aide d'une caméra CCD la lumière émise lors de la 15 réaction de bioluminescence. Il est composé d'une tour de détection avec caméra CCD, d'un amplificateur, d'un analyseur d'images et d'un logiciel permettant de collecter, de traiter et d'enregistrer les données. L'analyseur soustrait le bruit de fond du signal émis et génère une image qui est transmise à l'ordinateur. Une représentation de la membrane 20 apparaît alors à l'écran et le système dénombre les colonies présentes sur la membrane, ainsi que cela est représenté dans les figures 2 à 10. Détection spécifique de souches bactériennes selon le procédé de l'invention à l'aide d'une sonde oligonucléotidique. 25 De même que pour le système Milliflex rapid, les filtrations se font à l'aide de la pompe Milliflex Plus Vacuum dans des entonnoirs avec une membrane PVDF de 0. 45pm (Millipore, réf. MX HVWP 124). Les cellules des souches bactériennes à détecter sont ajoutées à 50-100ml d'eau physiologique à 30 0.9% NaCl. Les membranes sont incubées à 32.5 C +1- 2.5 C sur des cassettes Milliflex de milieu TSA (Millipore, réf. MXSM CTS48) le temps nécessaire pour que les microorganismes forment des microcolonies. 10 15 20 25 30 19 Les membranes sont séparées du milieu gélosé et mises en contact avec 2 ml de solution de perméabilisation sur un support étanche (pads absorbants des cassettes media liquide Millipore, réf. MXLM CO120) durant 5 à 20 minutes à température ambiante ou à 37 C (selon la nature des microorganismes à détecter). Les solutions de perméabilisation suivantes ont été testées : Solution de perméabilisation - Lysozyme Solution de perméabilisation - Lysozyme - EDTA Solution de perméabilisation - Lysozyme - EDTA Solution de perméabilisation - Lysozyme - PEI Solution de perméabilisation - Lysozyme - EDTA - PEI Solution de perméabilisation -Lysozyme - EDTA - PEI Une fois les perméabilisation, celles-ci sont mises en contact durant 10 minutes température ambiante avec 2 ml d'une solution de fixation comprenant : - H2O2 +Urée 0,01 % - Formaldéhyde 1% - Ethanol 80% - H2O qsp. 1 L N 1 4 mg/ml N 2 4 mg/ml 5 mM N 3 4 mg/ml 100 mM N 4 4 mg/ml 374,5 g/ml N 5 (selon l'invention) 4 mg/ml 5 mM 374,5 g/ml N 6 (selon l'invention) 4 mg/ml 100 mM 374,5 g/ml membranes traitées avec la solution de à Les membranes sont ensuite transférées sur une cassette d'hybridation, pour être mise en contact avec 1.5 ml d'une solution de pré-hybridation comprenant : - Dextran 10 % -NaCI 1,74% - Fornamide 30 % -Sodium pyrophosphate 0,1 % - PVP 0,2 % - Ficoll 0,2 % -EDTA 0,186% -Triton X-100 1 % - Tris-HCI 0,738 % - H2O qsp. 1 L Elles sont alors incubées à 50 C pendant 15 minutes sous faible 15 agitation (10 rpm). La solution de pré-hybridation est ensuite remplacée par 1.5 ml de la même solution comprenant 100 mM de la sonde, de sorte à former un film à la surface de la membrane. La membrane est ainsi incubée dans la solution d'hybridation à 50 C pendant 60 minutes sous faible agitation (10 rpm). 20 La membrane est ensuite lavée à l'aide de 20 ml d'une solution de lavage comprenant (pH = 10): - CAPSO 0.26 (Yo -Tween20 0.2% - H2O qsp 1 L 25 Cette solution de lavage est diluée dans1 litre d'eau préchauffée à 50 C. La membrane est introduite dans la solution de lavage sous agitation (30 rpm) à trois reprises. Des cassettes d'hybridation et un bac de lavage spécifiques sont disponibles sous les références Millipore MXREXPEND et MXRPWASHR 30 La membrane est ensuite traitée à l'aide d'un spray comprenant les réactifs de luminescence agissant sur les molécules de peroxydase couplées aux sondes oligonucléotidiques (luminol puis peroxyde d'hydrogène - Millipore, réf. 10 WBKL S0050) à l'aide d'une station de sprayage (Milliflex Rapid Autospray Station), puis analysée en imagerie suivant le programme R-pseudo du Milliflex rapid de la même manière que pour lé détection universelle. Les différents produits chimiques testés dans les essais de perméabilisation proviennent de la firme Sigma-Aldrich : lysozyme (réf. L6876), l'EDTA (réf. E5134), le polyéthylèneimine (réf. P3143), la chlorhexidine digluconate (réf. C9394), l'arginine éthylester (réf. A2883), la protéinase K (réf. P4850), l'inhibiteur de RNase (réf. R7397). Les solutions sont préparées dans du PBS (Gibco, réf. 20012-019) et appliquées sur les membranes à l'aide des cassettes media liquide. Les résultats obtenus à l'aide des différentes solutions de perméabilisation 1 à 6 mentionnées ci-dessus, en vue de détecter spécifiquement la bactérie à gram positif, Bacillus subtilis, sont illustrées dans les figures 4 à 9. Afin de vérifier que toutes les bactéries présentes sur la membrane ont été efficacement perméabilisées, le rapport du nombre de colonies détectées en suivant le protocole de perméabilisation et d'hybridation (à l'aide d'une sonde oligonucléotidique de séquence SEQ ID NO.2) selon l'invention, et du nombre de colonies détectées par énumération traditionnelle sur milieu gélosé a été calculé (taux de recouvrement). Les résultats obtenus et le taux de recouvrement correspondant ont été reportés dans le tableau 1 ci-après. Tableau 1 : Composition Recouvrement en % Recouvrement en % (Perméabilisation T amb.) (Perméabilisation à 37 C) Lysozyme (4mg/ml) 12.5% 13.7%25 Tableau 1 (suite) Composition Recouvrement en % Recouvrement en 0/0 (Perméabilisation T amb.) (Perméabilisation à 37 C) Lysozyme (4mg/ml) 18.8% 13.7% + EDTA (5mM) Lysozyme (4mg/ml) 22.9% 33.9% + EDTA (100mM) Lysozyme (4mg/ml) 25% 47.9% + PEI (374.5pg/ml) Lysozyme (4mg/ml) 22.9% 39.5% + EDTA (5mM) + PEI (374.5 pg/ml) Lysozyme (4mg/ml) 33.9% 60% + EDTA (100mM) + PEI (374.5 pg/ml) II ressort du tableau 1 que la solution de perméabilisation la plus efficace est la composition N 6 comprenant du lysozyme (4mg/ml), de l'EDTA (100mM) et du PEI (374.5 pg/ml), notamment lorsqu'elle est utilisée à 37 C. Par la suite deux concentrations de lysozyme ont été testées en ce qui concerne cette composition N 6 (1 et 4 mg/ml) afin de déterminer laquelle permettait d'obtenir le meilleur recouvrement, La comparaison de ces deux concentrations a été réalisée selon le protocole de détection spécifique décrit ci-dessus en prenant B.subtilis comme cible de détection. Les résultats de recouvrement sont présentés dans le tableau 2 Tableau 2 Concentration de 1 mg/ml 4 mg/ml lysozyme Recouvrement 71.4% 62.1 % Ces résultats montrent qu'une concentration de lysozyme de 1 mg/ml permet d'obtenir de meilleurs résultats selon l'invention qu'une concentration plus élevée de 4 mg/ml. Une composition de perméabilisation N 7 optimisée comprenant : -Lysozyme 1 mg/ml - EDTA 100 mM - PEI 375,5 .tg/ml - inhibiteur de RNAse 1 X a été testée pour B.subtilis selon le protocole visé plus haut, et parallèlement selon la méthode de détection universelle. Le résultat est représenté dans la Figure 2. Les valeurs de recouvrement calculées à partir nombre de colonies 15 dénombrées par l'analyseur d'image R-Pseudo sont de l'ordre de 100%. Des résultats similaires ont été obtenus avec la bactérie à gram positif Staphylococcus aureus (Tableau 3) à l'aide d'une sonde oligonucléotidique de séquence SEQ ID NO.3. 20 Tableau 3 : Nombre d'UFC Nombre d'UFC Nombre d'UFC comptées par le comptées par le comptées par le système après 6h système après 7h système après 8h d'incubation d'incubation d'incubation 7 25 48 7 5 32 8 20 30 7 11 30 31 20 21 Recouvrement Recouvrement Recouvrement 52,2% 73,9% 139%10 Des tests visant à valider la spécificité de la détection de B. subtilis selon le procédé de détection spécifique décrit dans l'invention ont été réalisés en utilisant 5 germes : B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli et S. enterica subsp arizonae. Le test s'est déroulé après une incubation sur la nuit à 25 C sur milieu TSA pour permettre la croissance de tous les germes. Le résultat obtenu à l'aide de la sonde spécifique de B.subtilis (SEQ ID NO.2) est représenté dans la Figure 3. La composition de pérméabilisation N 6 (Lysozyme 4mg/ml + EDTA 100mM + PEI 374.5 dag/ml) a été mise en oeuvre selon l'invention sur un tampon imprégné pendant 20 minutes à 37 C en vue de détecter spécifiquement la bactérie à gram négatif Pseudomonas aeruginosa de la même façon que pour B.subtilis. A cet effet, une sonde oligonucléotidique correspondant à la séquence SEQ ID NO.1 a été utilisée comme sonde d'hybridation. L'image obtenue à l'issu de ce protocole, via l'analyseur d'image, est représentée figure 10. On peut observer que le procédé selon l'invention permet une bonne discrimination des microcolonies bactériennes détectées. REVENDICATIONS 1. Composition de perméabilisation des parois de microorganismes, caractérisée en ce qu'elle comprend l'association de polyéthylèneimine (PEI) et d'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA). 2. Composition selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration d'EDTA finale dans ladite composition est supérieure à 50 mM. 3. Composition de perméabilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, du lysosyme. 4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration d'EDTA dans la composition finale est comprise entre 50 et 150 mM, de préférence entre 50 et 100 mM. 5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la concentration en PEI dans ladite composition est comprise entre 100 et 900 g/ml, de préférence entre 200 et 800 pg/ml. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas de détergent. 7. Procédé de dénombrement et/ou d'identification, sur une membrane, de microorganismes initialement présents dans un milieu liquide ou gazeux caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) on filtre le milieu liquide ou gazeux à travers une membrane de sorte à retenir sur ou à l'intérieur de la membrane les microorganismes présents dans ce milieu ; (b) on met en contact la membrane et les microorganismes avec une composition de perméabilisation de parois de microorganismes comprenant du PEI, de l'EDTA et du lysozyme; (c) on fixe les cellules sur la membrane à l'aide d'un agent de réticulation ; (d) on met en contact les microorganismes avec une ou plusieurs macromolécules, éventuellement marquées, aptes à traverser la paroi des microorganismes ; et(e) on procède à la détection des macromolécules ayant pénétré à l'intérieur des microorganismes. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend entre l'étape a) et l'étape b) une étape supplémentaire de culture des microorganismes. 9. Procédé selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que l'agent servant d'agent de réticulation de l'étape c) est choisi parmi le glutaraldéhyde, le formaldéhyde et le paraformaldéhyde. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'à l'étape d) la macromolécule utilisée est une sonde d'hybridation, de préférence oligonucléotidique ou de type PNA. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la sonde d'hybridation s'hybride aux ARN desdits microorganismes. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que la sonde d'hybridation s'hybride à l'ARN ribosomal desdits microorganismes. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que la sonde d'hybridation utilisée à l'étape d) comprend une séquence oligonucléotidique présentant au moins 80 % d'identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID NO.1, 2, 3, 4 ou 5. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, caractérisé en ce qu'à l'étape d), les macromolécules sont marquées par couplage avec une enzyme permettant l'émission d'un signal lumineux ou fluorescent. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la détection des microorganismes à l'étape (e) est effectuée par une réaction de chimioluminescence ou de fluorescence et reconnaissance du signal lumineux émis à l'aide d'une interface appropriée. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend entre l'étape d) et l'étape e) une étape supplémentaire d'hybridation spécifique des sondes ou amorces avec les acides nucléiques desdits microorganismes. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend entre l'étape c) et l'étape e) une étape supplémentaire d'amplification spécifique des acides nucléiques présents dans les microorganismes. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 17, caractérisé en ce que la membrane sur laquelle sont détectés les microorganismes est constituée principalement de PVDF ou de nylon . 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 18, caractérisé en ce qu'à l'étape b), la composition de perméabilisation est telle que définie selon l'une des revendications 1 à 6. 20. Utilisation d'une composition de perméabilisation comprenant l'association de PEI et d'EDTA, pour faire pénétrer des macromolécules dans un microorganisme. 21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre à l'aide d'une composition de perméabilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 22. Utilisation selon l'une des revendications 20 ou 21 dans un procédé de dénombrement ou/ou d'identification de microorganismes. 23. Utilisation selon l'une des revendications 20 ou 21, pour faire pénétrer in-vitro des acides nucléiques dans une cellule. 24. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 20 ou 21, pour faire pénétrer in-vitro des principes actifs dans une cellule. 25. Utilisation d'une composition de perméabilisation comprenant l'association de PEI et d'EDTA, en tant qu'adjuvant de médicament. 26. Un kit pour la détection et le dénombrement des microorganismes caractérisé en ce qu'il comprend : au moins une macromolécule marquée ; et une composition de perméabilisation des parois de microorganismes comprenant l'association de PEI et d'EDTA. 27. Un kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que la composition de perméabilisation est telle que définie selon l'une des revendications 1 à 6. 28. Un kit selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une composition comprenant un agent de réticulation choisi parmi le glutaraldéhyde, le formaldéhyde, et le paraformaldéhyde. 29. Un kit selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisé en ce que ladite macromolécule marquée consiste en une sonde d'hybridation. 30. Un kit selon la revendication 29, caractérisé en ce que la macromolécule marquée consiste en une sonde d'hybridation comprenant une séquence présentant au moins 80% d'identité avec l'une des séquences SEQ ID NO.1 à 6. 31. Un kit selon l'une quelconque des revendications 26 à 30, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une membrane de filtration, de préférence une membrane en PVDF ou en Nylon .