Brevet FR2918666A1 — publié le 20090116

La présente invention concerne des composés 5 polycarboxyliques utilisables comme colorants fluorescents, les compositions qui les contiennent, leur préparation et leur utilisation. Les colorants fluorescents sont utilisés dans nombreux domaines en tant qu'indicateurs biologiques. Une 10 application particulièrement intéressante des colorants fluorescents est leur utilisation en tant que sondes de pH. Par le terme sonde de pH on entend un colorant fluorescent permettant la mesure du pH dans un milieu biologique in vitro et in vivo. 15 La détermination précise du pH tissulaire en médecine humaine et en biotechnologie nécessite une sonde de pH dont les caractéristiques spectrales d'absorption et de fluorescence soient constantes, parfaitement maîtrisées et reproductibles car l'étalonnage de la 20 mesure de pH est principalement basé sur l'expérience clinique. Ceci suppose une détermination du pH à partir d'une seule structure moléculaire et non pas d'un mélange d'isomères. De plus, les exigences de qualité et de sécurité des nouvelles normes pharmaceutiques 25 internationales (ICH : International Commission of Harmonisation, ICH Q Topic Q3A 1999) se sont considérablement accrues et la fabrication de médicaments de diagnostic à partir de colorants polycarboxyliques fluorescents requiert maintenant un niveau de pureté 30 élevé surtout lorsqu'ils sont administrés par voie intraveineuse chez l'homme. Par ailleurs, l'évaluation de l'innocuité d'un agent de diagnostic et le suivi de sa pharmacovigilance ne sont concrètement envisageables que s'il est administré sous forme d'un isomère pur ; ces deux évaluations étant nécessaires pour la délivrance de son autorisation de mise sur le marché. Du fait de la multiplicité de leurs fonctions acides carboxyliques les colorants fluorescents polycarboxyliques n'étaient pas accessibles sous forme d'un seul isomère par les méthodes de synthèse de l'art antérieur et ne pouvaient être obtenus que sous forme d'un mélange en proportions variables de plusieurs isomères de position dont les caractéristiques spectrales étaient différentes. Cette inhomogénéité spectrale empêchait l'utilisation diagnostique des colorants polycarboxyliques pour la détermination du pH tissulaire chez l'homme. L'apparition d'isomères de position est notamment due au fait que les colorants polycarboxyliques fluorescents fabriqués selon les techniques de l'art antérieur, sont obtenus par une réaction unique de condensation qui doit mettre en jeu certaines fonctions acides carboxyliques des réactifs. Néanmoins, les autres fonctions acides carboxyliques des réactifs, pouvant être également activées durant la réaction, réagissent de façon concurrente et génèrent la formation des isomères de position. Ainsi, la préparation des colorants polycarboxyliques fluorescents selon les procédés de synthèse de l'art antérieur qui ne comportent qu'une seule étape de condensation, favorise l'apparition de nombreux sous-produits, diminue le rendement de la réaction et génère de nombreuses impuretés. Ainsi il est connu de préparer certains des colorants fluorescents polycarboxyliques comme la Biscarboxyéthyl-carboxyfluorescéine en une seule étape de condensation par chauffage à la température de fusion d'un mélange d'un dérivé de l'acide trimellitique et d'un dérivé phénolique, dans les proportions souhaitées éventuellement en présence d'un catalyseur de Lewis en particulier le chlorure de zinc. Toutefois, cette réaction de condensation n'est pas spécifique et génère de nombreux produits secondaires et notamment un mélange en proportions variables des isomères de positions. De plus, le rendement de cette réaction est généralement faible. Les isomères de position des colorants polycarboxyliques fluorescents ne possèdent pas les mêmes propriétés spectrales mais leur solubilité et leur polarité sont très voisines. Cette particularité empêche leur séparation physique par recristallisation ou même par chromatographie. Il s'en suit que les procédés de séparation et de purification connus de l'art antérieur ne permettent pas davantage l'obtention d'un composé sous forme d'un seul de ses isomères de position, c'est-à-dire avec une pureté isomérique élevée. Par exemple, la Bis-carboxyéthyl-carboxyfluorescéine ou BCECF est connue pour la mesure in vitro du pH par fluorimétrie en utilisant deux longueurs d'ondes d'excitation et une longueur d'onde d'émission. La BCECF produite selon les techniques de l'art antérieur est un mélange de plusieurs isomères de position dont les principaux composants sont la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine et la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine, ce qui ne permet pas son utilisation in vivo en imagerie médicale, notamment chez l'homme. Or il existe actuellement un besoin important sur le plan médical pour des colorants fluorescents polycarboxyliques de pureté isomérique élevée. Ainsi la forme mono-isomérique (mono-isomère en position 5 ou monoisomère en position 6) de la BCECF présenterait un grand intérêt en réanimation et en ophtalmologie pour la réalisation d'imagerie médicale en fluorescence, notamment au cours d'endoscopies digestives et d'angiographies de la rétine. Ce nouveau type d'imagerie médicale permettrait d'obtenir une cartographie de pH tissulaire de grande valeur diagnostique et pronostique par exemple pour la prise en charge thérapeutique du sepsis et pour le traitement des maladies micro-vasculaires de l'oeil (par exemple la dégénérescence oraculaire liée à l'âge). Par ailleurs, l'intérêt diagnostique des colorants fluorescents polycarboxyliques de pureté isomérique élevée est actuellement accru par l'apparition de nouveaux médicaments efficaces permettant le traitement des pathologies micro-vasculaires de l'ceil et de produits issus des biotechnologies permettant le traitement du sepsis. Ces colorants polycarboxyliques peuvent être utilisés pour l'obtention d'une imagerie médicale fonctionnelle permettant de visualiser l'anoxie et/ou la souffrance tissulaire par la réalisation d'une cartographie du pH des tissus. Les inventeurs, à l'issue de recherches approfondies, ont mis au point des colorants fluorescents polycarboxyliques permettant une mesure du pH et présentant une pureté isomérique minimum de 95 %, exprimée en poids d'un seul isomère de position du colorant fluorescent polycarboxylique. Au sens de la présente invention, une pureté isomérique égale à au moins 95% signifie que l'isomère majoritaire représente 95% en poids relativement à l'ensemble des isomères de position ; une pureté isomérique égale à au moins 98% signifie que l'isomère majoritaire représente 98% en poids relativement à l'ensemble des isomères de position et une pureté isomérique égale à au moins 99% signifie que l'isomère majoritaire représente 99% en poids relativement à l'ensemble des isomères de position. Aussi la présente invention a-t-elle pour objet des composés de pureté isomérique égale à au moins 95%, avantageusement égale à au moins 98%, encore plus avantageusement égale à au moins 99% répondant à la formule (I) R5 (I) R2 HO dans laquelle : - deux au moins des Rl, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement A-COOH identique ou différent ou un de ses sels alcalins, deux au moins des groupements A n'étant pas une simple liaison, où A représente: o soit un groupe - (CH2) n-, n étant un nombre entier de 0 à 30 et n étant différent de 0 pour 5 au moins un des groupements A, o soit un groupe alkylène en CI à c,,, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué 10 par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR10R11 où R, R10 et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à Cao, o soit un groupe cycloalkylène en c, à C12, 15 o soit un groupe alkyle en (c1 à C30) cycloalkylène en (c, à C12) , o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, 20 o soit un groupe alkyle en (C1 à C30)arylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe aryl(alkyle en C1 à Cao) 25 éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, et tous les autres R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, o les alkyles en Cl à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en Cl à Cao, o les cycloalkyle en C3 à Ciz, o les alkyloxy en Cl à Cao, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl(alkyle en C1 à C30), o les bases puriques ou pyrimidiques, o les oses, o les oligosides, o les polyosides, o les polypeptides, o les protéines, o les phospholipides, et les esters correspondants, notamment comme pro-médicaments. Au sens de la présente invention, on entend par sels alcalins du groupe -A-COOH, notamment les sels de sodium et de potassium. Au sens de la présente invention, on entend par 10 simple liaison une simple liaison chimique covalente. Au sens de la présente invention, on entend par alkyle en C1 à C30 tout groupe alkyle de 1 à 30 atomes de carbones, linéaire ou ramifié, en particulier les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso- 15 butyle, t-butyle, n-pentyle, isopentyle, hexyle, heptyle, octyle nonyle, dodecyle, et les groupes alkyles en C11 à C20. Au sens de la présente invention, on entend par aryle , un ou plusieurs cycles aromatiques ayant 5 à 8 20 atomes de carbones, pouvant être accolés ou fusionnés. En particulier, les groupes aryles peuvent être des groupes monocycliques ou bicycliques, comme par exemple phényle, naphtyle, tétrahydronaphtyle ou indanyle et par aryl(alkyle en C1 à 030) ces mêmes groupes liés à un 25 groupe alkyle comprenant de 1 à 30 atomes de carbone. On peut citer à titre d'exemple le groupe benzyle. Au sens de la présente invention, on entend par ester , un groupe -COOR20 où R20 représente un groupe alkyle en C1 à 030 ou aryle tels qu'ils ont été définis 30 précédemment. Au sens de la présente invention, on entend par base purique , notamment la purine, l'adénine et la guanine. Au sens de la présente invention, on entend par 5 base pyrimidique , notamment la pyrimidine, la cytosine, l'uracile et la thymine. Au sens de la présente invention, on entend par ose , un monomère de glucides, appelé également monosaccharide. On peut citer à titre d'exemple, les 10 trioses, les tétroses, les pentoses comme le ribose, l'arabinose et le xylose, et les hexoses comme le glucose, le mannose et le galactose. Au sens de la présente invention, on entend par polyoside , un polymère composé de plusieurs 15 monosaccharides définis ci-dessus liés entre eux par une liaison osidique. On peut citer à titre d'exemple, le dextran. Au sens de la présente invention, on entend par oligoside un polymère composé de 3 à 6 monosaccharides 20 définis ci-dessus liés entre eux par une liaison osidique. Au sens de la présente invention, on entend par polypeptide une chaîne comprenant moins de 100 acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, de préférence 25 les chaînes peptidiques contenant moins de 10 acides aminés, ainsi on peut citer de manière avantageuse les pentapeptides. Au sens de la présente invention, on entend par protéine une chaîne comprenant plus de 100 acides 30 aminés reliés par des liaisons peptidiques. On peut citer de manière avantageuse l'albumine et les immunoglobulines. Au sens de la présente invention les phospholipides sont choisis dans le groupe comprenant notamment la phosphatidyl sérine, le phosphatidyl inositol, la phosphatidyl éthanolamine, la phosphatidyl choline et la sphyngomyéline. Dans un mode avantageux de réalisation de 10 l'invention, les composés répondent à la formule (la) . 15 (Ia) dans lesquelles A et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-COOH sont tels que définis pour le composé de 20 formule(I) . De manière encore plus avantageuse, les composés sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Iai) à (Ia4) qui suivent : 25 Vù000H SZ 52i (EEI) St OZ H000 ot (TRI) S 52~ tt 99981.62 dans lesquelles A et R1, R3, R4, R5, R6 différents de -A-COOH sont tels que définis pour le composé de formule(la). Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, les composés répondent à la formule (lb) (Ib) dans laquelle n et m sont des nombres entiers de 0 à 30, avantageusement de 0 à 10, encore plus avantageusement de 0 à 3 identiques ou différents, l'un au moins de n et m étant différent de 0 et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-COOH sont tels que définis précédemment pour le composé de formule(I). Avantageusement les composés sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Ib1) à (Ib4) qui suivent: HOOCù (CH2)n (CH2)n COOH (Ib1) R3 R3 R5 (Ib2) 15 20 R5 (Ib3) (Ib3 25 R5 (Ib4) R0 Ki 35 HO O OH R3 dans lesquelles m, n et R1, R3, R4, R5, R6, R7 différents de -A-COOH, sont tels que définis précédemment pour le composé de formule(Ib). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les composés répondent à la formule (Ic) (Ic) dans laquelle A et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-COOH, sont tels que définis précédemment pour le composé de formule(I). Avantageusement les composés sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Ici) à (Ic4) qui suivent : R5 (Ic2) R5 (Ic3) R5 (Ic4) dans lesquelles A et R1, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis précédemment pour le composé de formule(Ic). 15 Encore plus avantageusement les composés sont ceux pour lesquels A représente un groupement choisi dans le groupe comprenant le groupe û (CH2) 2û et le groupe -CH=CH-. Très avantageusement les composés sont choisis dans 20 le groupe comprenant les isomères de formule (Id1) à (Id8) qui suivent : COOH COOH (Id1) HOOC R5 (Id2) (Id3) HOOC COOH HOOC COOH (Id4) (Id5) 15 R5 HOOC HOOC COOH 20 R5 HOOC (Id6) 17 R5 HOOC (Id7) R5 HOOC COOH (Id8) dans lesquelles R1, R3, R4, R5, R6, R7 différents de 15 -A-COOH sont tels que définis précédemment pour le composé de formule(I). De manière particulièrement avantageuse, les composés sont choisis dans le groupe comprenant : la 2',7'-bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine de 20 formule : COOH HOOC COOH la 2 ,7'-bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine de formule : HOOC COOH la 2 ,7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxy-5 fluorescéine de formule COOH HOOC et la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine de formule : HOOC 10 L'invention a également pour objet les esters des composés de formule (I) susceptibles d'être obtenus par estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques de ce composé de formule 15 (I) avec un composé de formule (III) : R8-OH (III) dans laquelle - R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en C1 à C30 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, et -COOR où R est un groupe alkyle en C1 à C3o, o cycloalkyles en C3 à C12, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en Cl à C30 o aryles éventuellement substitués par un ou 15 plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en CI à C3o, o aryl-alkyle en CI à C30. L'invention a également pour objet les esters 20 spécifiques des composés de formule 1 choisis dans le groupe comprenant : la 2',7'-bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine ; la 2',7'-bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine; la 2',7'-bis(2-carboxyméthoxy-1,2-déhydroéthyl)-5-25 carboxyfluorescéine ; la 2',7'-bis(2-carboxyméthoxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine. 10 Les inventeurs ont découvert qu'il était possible d'obtenir des colorants fluorescents polycarboxyliques de pureté isomérique élevée avec un rendement satisfaisant en réalisant la condensation en deux étapes successives et en faisant intervenir à un stade approprié une estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques (-COOH) qui ne sont pas liées directement au cycle aromatique, tout en laissant libres les groupes -COOH qui sont directement liés à un cycle aromatique du colorant. Les inventeurs ont découvert que cette estérification spécifique permettait non seulement d'améliorer la spécificité et le rendement des étapes de condensation pour la synthèse du colorant mais surtout de permettre une séparation aisée des isomères de position de ce colorant puisque les isomères de ces esters spécifiques peuvent être séparés par lavage et recristallisation. Ceci était particulièrement inattendu puisque les techniques de séparation de l'art antérieur sont inefficaces lorsqu'elles sont appliquées après estérification non spécifique du colorant polycarboxylique. Par estérification non spécifique, on entend l'estérification de toutes les fonctions acides carboxyliques du colorant, qu'elles soient aromatiques, c'est à dire fixées directement sur les cycles ou qu'elles soient non aromatiques, c'est à dire fixées sur les cycles par au moins un carbone. Ainsi, les groupements -A-COOH lorsque A représente -(CH2)n où n=0 et les autres groupements -COOH directement fixés sur les cycles sont des fonctions carboxyliques aromatiques ; en revanche les autres groupements -A-COOH dans lesquels A est différent de -(CH2)n où n=0 sont des fonctions carboxyliques non aromatiques. De même, il est rappelé que l'application directe des techniques de séparation de l'art antérieur sur les isomères du colorant polycarboxylique ne permet pas l'obtention d'une séparation de ses isomères. Ainsi les inventeurs ont découvert que chaque isomère pur du colorant peut être isolé sous forme de son ester spécifique et qu'il peut être ensuite régénéré par saponification de cet ester. Aussi l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule (I), de pureté isomérique égale à au moins 95%, avantageusement égale à au moins 98%, encore plus avantageusement égale à au moins 99%, qui comprend une étape d'estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques d'un composé répondant à la formule (I), ou d'un de ses intermédiaires de synthèse, ayant une pureté isomérique inférieure à 95%, suivie d'une étape de séparation des esters obtenus, puis éventuellement d'une étape de saponification desdits esters. Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de séparation des esters obtenus puis éventuellement une étape de saponification desdits esters. D'autre part, et de façon inattendue, les inventeurs ont découvert qu'il était possible d'estérifier de façon spécifique les fonctions non aromatiques des colorants polycarboxyliques en les faisant réagir avec BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température comprise entre 10 C et 40 C. Avantageusement, la réaction d'estérification spécifique est réalisée avec un composé de formule (III) R8-OH (III) dans laquelle R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en Cl à C30 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, et -COOR où R est un groupe alkyle en C1 à C30, o cycloalkyles en C3 à C12, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en C1 à C30 o aryles éventuellement substitués par un ou 20 plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en C1 à C3o, o aryl-alkyle en C1 à C3o. Dans un premier mode de réalisation du procédé 25 selon l'invention, on fait réagir un composé de formule (III) R8-OH (III) dans laquelle R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en Cl à C30 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, et -COOR où R est un groupe alkyle en C1 à Cao, o cycloalkyles en C3 à C12, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en C1 à C30 o aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en C1 à C30, o aryl-alkyle en C1 à C30, avec un composé de formule (II) HO R3_~. OH R1 20 dans laquelle l'un au moins des Rl, R2, R3 est un groupement -A-COOH où A similaire ou différent pour chaque groupement -A-COOH, et au moins l'un des groupements A n'est pas une simple liaison, représente: o soit un groupe -(CH2)n-, n étant un nombre entier de 0 à 30 et n étant différent de 0 pour au moins un des groupements A, o soit un groupe alkylène en C1 à C30 éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR1OR11 où R, R10 et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à Cao, o soit un groupe cycloalkylène en c, à C12r o soit un groupe alkyle en (c1 à C30) cycloalkylène en (C3 à 012) , 15 o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30) arylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs 20 groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe aryl (alkyle en Cl à C30) éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les 25 hydroxyles, et tous les autres Ri, R2, R3 identiques ou différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: l'hydrogène, 10 30 o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, o les alkyles en C1 à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C3o, o les cycloalkyle en C3 à C12, 15 o les alkyloxy en CI à C3o, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, 20 o les aryl(alkyle en C1 à C30), o les bases puriques ou pyrimidiques, pour réaliser une estérification spécifique du ou des groupements carboxyliques non aromatiques et obtenir un composé de formule (IV) HO OH R' 25 (IV) dans laquelle l'un au moins des R'1, R'2 et R'3 est un groupement -A-COO-R8, similaire ou différent, avec A et R8 tels que définis précédemment, l'un au moins des groupements A étant différent d'une simple liaison, et les autres R' 1, R'2 et R'3 différents de -A-COOR8 sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, 10 o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, 15 o les alkyles en C1 à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, 20 nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C3o, o les cycloalkyle en C3 à C12, o les alkyloxy en C1 à C3o, 25 o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl (alkyle en C1 à C30) , o les bases puriques ou pyrimidiques. Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, l'étape d'estérification spécifique est réalisée en présence d'un acide de Lewis ou d'un acide de Bronsted en solution dans R8-OH à une température comprise entre 10 C et le point d'ébullition de R8-OH pendant une durée comprise entre 2 heures à 24 heures. Les acides de Lewis avantageusement utilisés sont choisis dans le groupe comprenant BF3, AlCl3 et ZnC12 et les acides de Bronsted sont avantageusement choisis parmi l'acide toluène sulfonique et l'acide méthane sulfonique. De manière encore plus avantageuse la réaction est conduite en présence de BF3 dissous dans l'alcool R8-OH lui-même avantageusement choisi dans le groupe comprenant le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol. Dans un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, on fait réagir un composé de formule (III) R8-OH (III) tel que défini précédemment avec un composé de formule (V) R7 COOH R6 J (V) R5 R4 COOH dans laquelle l'un au moins des R4, R5, R6, R7 est un groupement -A-COOH où A similaire ou différent pour chaque groupement -A-COOH, et représente: o soit un groupe -(CH2)n-, n étant un nombre entier de 0 à 30, o soit un groupe alkylène en C1 à C30 éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR1OR11 où R, R10 et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à C30, o soit un groupe cycloalkylène en c, à Cie, o soit un groupe alkyle en (c1 à C30)cycloalkylène en (C3 à C12) , o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30) arylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe aryl(alkyle en C1 à Cao) éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, et 25 - tous les autres R4, R5, R6 et R7, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, 15 20 30 o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, o les alkyles en C1 à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C30, o les cycloalkyle en C3 à C12, o les alkyloxy en CI à C3o, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl(alkyle en ci à C30), o les bases puriques ou pyrimidiques, pour réaliser une estérification spécifique des groupements carboxyliques non aromatiques et obtenir un composé de formule (VI)25 dans laquelle un ou plusieurs des groupes R'4, R'5, R'6 et R'7 sontun groupement -A-COOR8 avec A et R8 tels que définis précédemment, similaires ou différents, et les autres R'4, R'5, R'6 et R'7 différents de -A-COOR8 sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, o les alkyles en C1 à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C3o, o les cycloalkyle en C3 à 012, 25 o les alkyloxy en CI à C3o, 15 20 o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, 5 o les aryl(alkyle en C1 à Cao) , o les bases puriques ou pyrimidiques. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape d'estérification spécifique est réalisée en présence d'un acide de Lewis ou d'un acide de 10 Bronsted dans les conditions décrites précédemment. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend - une première étape de condensation d'un composé de formule (IV) tel que défini précédemment, avec un composé 15 de formule (VI) tel que défini précédemment, ou avec son anhydride de formule (VI') (VI') dans laquelle les groupes R'4, R'5, R'6, R'7 sont tels 20 que définis précédemment pour le composé de formule (VI). pour obtenir un intermédiaire de formule (VII) (VII) R'2 OH dans laquelle les groupes R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tel que défini précédemment. - une deuxième étape de condensation du composé de formule (VII) avec un composé de formule (IV) pour obtenir un composé de formule (VIII): (VIII) dans laquelle les groupes R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 sont tels que définis précédemment pour les composés de formule (VII) et (IV). une étape de séparation des isomères de position du composé de formule (VIII) par lavage et/ou recristallisation, dans un alcool primaire ou secondaire, puis - une étape de saponification des fonctions avec une base alcaline afin de générer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de 20 position. Avantageusement la première étape de condensation est réalisée dans les conditions d'une réaction de Friedel et Crafts, notamment en présence d'un acide de Lewis comme A1C13 ou ZnCl2 en milieu nitrobenzène ou nitrométhane à une température comprise entre 15 C et 110 C pendant 5 à 72 heures. Avantageusement la seconde étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Bronsted choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide polyphosphorique, l'acide phosphorique, les acides arylsulfoniques ou alkylsulfoniques, supportés ou non sur un polymère et leurs mélanges, éventuellement dans un solvant aprotique dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N-diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges. De manière très avantageuse, le solvant aprotique est la N-méthylpyrrolidone. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de réalisation, cette seconde étape de condensation est réalisée dans l'acide phosphorique qui sert à la fois de solvant et de catalyseur avec un diluant aprotique dipolaire tel que défini précédemment, de préférence dans la N-méthylpyrrolidone. Avantageusement l'étape de séparation des isomères de position est réalisée par lavage et/ou recristallisation, dans un alcool primaire ou secondaire avantageusement choisi dans le groupe comprenant l'éthanol ou l'isopropanol. Avantageusement l'étape de saponification des fonctions esters est réalisée avec une base alcaline, avantageusement choisie dans le groupe comprenant la soude, la potasse et le carbonate de sodium, à une température de 20 C à 90 C pendant une durée de 10 minutes à 4 heures selon la température et la base utilisée. Cette réaction de saponification permet de régénérer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I). Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend : - une étape de condensation du composé de formule (II) avec un composé de formule (V) pour obtenir un intermédiaire de formule (IX): dans laquelle les groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 sont 15 tels que définis précédemment pour les composés de formules (II) et (V). - une étape d'estérification spécifique du composé de formule (IX) avec un alcool de formule R8-OH (III) pour réaliser une estérification sélective des fonctions 20 acides carboxyliques non aromatiques et obtenir le composé intermédiaire de formule (VII) R5 R6 R4 R7 HOOC R2 (IX) R'2 HO OH (VII) dans laquelle R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis précédemment, - une étape de condensation du composé de formule (VII) avec un composé de formule (IV) pour obtenir le composé de formule (VIII): (VIII) dans laquelle les groupes R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 sont tels que définis précédemment. - une étape de séparation des isomères de position du composé de formule (VIII) par lavage et/ou recristallisation dans un alcool primaire ou secondaire puis - une étape de saponification des fonctions esters avec une base alcaline pour générer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I). Dans un mode de réalisation avantageux de ce procédé, la première étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Lewis en milieu nitrobenzène ou nitrométhane à une température comprise entre 15 C et 110 C pendant 5 à 72 heures, la seconde étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Bronsted choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide polyphosphorique, l'acide phosphorique, les acides arylsulfoniques ou alkylsulfoniques, supportés ou non sur un polymère et leurs mélanges, éventuellement dans un solvant aprotique dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N-diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges, l'étape de séparation et de saponification étant réalisées dans les conditions décrites précédemment. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention on utilise, pour la deuxième étape de condensation, l'acide phosphorique dans un solvant aprotique dipolaire, de préférence la N- méthylpyrrolidone. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, utilise le BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température comprise entre 10 C et 40 C pour réaliser l'estérification spécifique des fonctions carboxyliques non aromatiques. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend : -une étape de condensation du composé de formule (II) avec un composé de formule (V) pour obtenir un intermédiaire de formule (IX): R5 R6 R1 dans laquelle les groupes Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis précédemment. - une étape de purification de l'intermédiaire de formule (IX) par lavage et/ou recristallisation. 10 - une étape de condensation du composé intermédiaire de formule (IX) avec un composé de formule (II) pour obtenir le composé de formule : R2 OH (X) 15 dans laquelle les groupes Rl, R2, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis précédemment pour le composé de formule (1). - une étape d'estérification spécifique du composé de formule (X) avec un alcool de formule R8-OH (III) pour réaliser une estérification sélective des fonctions acides carboxyliques non aromatiques et obtenir le composé intermédiaire de formule (VIII) : dans laquelle les groupes R'l, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 sont tels que définis précédemment. - une étape de séparation des isomères de position du composé de formule (VIII) par lavage et/ou 10 recristallisation, - une étape de saponification des fonctions esters permettant de régénérer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I). Dans un mode de réalisation avantageux de ce 15 procédé, la première étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Lewis en milieu nitrobenzène ou nitrométhane à une température comprise entre 15 C et 110 C pendant 5 à 72 heures, la seconde étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de 20 Bronsted choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide polyphosphorique, l'acide phosphorique, les acides arylsulfoniques ou alkylsulfoniques, supportés ou non sur un polymère et leurs mélanges, éventuellement dans un solvant aprotique 25 dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N-diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges, l'étape de séparation et de saponification étant réalisées dans les conditions décrites précédemment. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention on utilise, pour la deuxième étape de condensation, l'acide phosphorique dans un solvant aprotique dipolaire, de préférence la N-méthylpyrrolidone. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, utilise le BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température comprise entre 10 C et 40 C pour réaliser l'estérification spécifique des fonctions carboxyliques non aromatiques. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé comprend : -la préparation d'un composé de formule (VII) R0e z HO OH (VII) dans laquelle les groupes R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6, R'7 sont tels que définis précédemment. la séparation des isomères de position de l'intermédiaire (VII) par recristallisation, - une étape de condensation de l'isomère ainsi isolé avec le composé de formule (IV) pour donner le composé de formule (VIII) - une étape de purification des isomères de position 5 du composé de formule (VIII) ainsi obtenu par lavage et/ou recristallisation, - une étape de saponification des fonctions esters permettant de régénérer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I). 10 Dans un mode de réalisation avantageux de ce procédé, la première étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Lewis en milieu nitrobenzène ou nitrométhane à une température comprise entre 15 C et 110 C pendant 5 à 72 heures, la seconde étape de 15 condensation est réalisée en présence d'un acide de Bronsted choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide polyphosphorique, l'acide phosphorique, les acides arylsulfoniques ou alkylsulfoniques, supportés ou non sur un polymère et 20 leurs mélanges, éventuellement dans un solvant aprotique dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N-diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges, l'étape de séparation et de saponification 25 étant réalisées dans les conditions décrites précédemment. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention on utilise, pour la deuxième étape de condensation, l'acide phosphorique dans un solvant aprotique dipolaire, de préférence la Nméthylpyrrolidone. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, utilise le BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température comprise entre 10 C et 40 C pour réaliser l'estérification spécifique des fonctions carboxyliques non aromatiques. Au cours de chacun des procédés précédemment décrits, le colorant polycarboxylique de pureté isomérique élevée peut éventuellement, en utilisant les techniques connues de l'art antérieur au niveau de l'étape la plus appropriée de la synthèse, être couplé au niveau de l'un ou plusieurs de ses groupes R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 à l'un des groupements similaires ou différents suivants o les oses, o les oligosides, o les polyosides, o les polypeptides, o les protéines, o les phospholipides. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un composé de formule (I) comme colorant fluorescent. La présente invention a également pour objet des 25 compositions de colorants fluorescents dans lesquelles le colorant fluorescent est un composé de formule (I). La présente invention concerne également l'utilisation de compositions de colorants polycarboxyliques fluorescents selon l'invention ainsi que des colorants polycarboxyliques fluorescents obtenus à l'aide des procédés selon l'invention comme sondes de pH in vivo chez l'homme. En effet Les colorants fluorescents polycarboxyliques faisant l'objet de la présente demande ont la propriété, lorsqu'ils sont soumis à une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation, de fluorescer avec une intensité variable en fonction du pH du milieu. Ainsi, ces colorants polycarboxyliques permettent la mesure du pH par quantification de l'intensité de leur fluorescence à une ou plusieurs longueurs d'ondes d'excitation données. Le nombre de fonctions acides carboxyliques présentes sur ces colorants ayant une incidence notable sur leur sensibilité dans la gamme de pH concernée par la mesure. Les colorants de l'invention décrite dans la présente demande permettent la réalisation de nouvelles techniques d'imagerie médicale en fluorescence, notamment l'exploration de la physiologie tissulaire in vivo chez l'homme. Ce nouveau mode d'investigation médicale a pour objet l'imagerie in vivo et en temps réel des variations d'état physiologique au niveau tissulaire. Cette nouvelle technique d'imagerie conduit à une évaluation de la souffrance tissulaire au niveau d'une partie précise de l'organe, ce qui confère à ces colorants un très grand intérêt, notamment en toxicologie, en pharmacologie et en médecine où elles représentent un potentiel intéressant pour l'industrie pharmaceutique, en particulier pour le diagnostic médical et la réalisation d'études pharmacologiques in vivo. Du fait que les compositions de colorants fluorescents polycarboxyliques selon l'invention contiennent au moins 95 %, de préférence au moins 98 %, et plus préférentiellement encore au moins 99 % en poids d'un seul isomère de position relativement au poids de l'ensemble des isomères, elles sont particulièrement utiles pour la détermination du pH tissulaire in vivo chez l'homme. Ces sondes de pH trouvent leur application par exemple dans le domaine du diagnostic, dans le domaine de la toxicologie, de la pharmacologie et en médecine, par exemple pour la réalisation de nouvelles techniques d'imagerie médicale en fluorescence, notamment l'exploration de la physiologie tissulaire in vivo chez l'homme. L'objectif étant d'imager en temps réel, des variations d'état physiologique d'un organe au niveau tissulaire, et notamment d'évaluer la souffrance tissulaire. L'invention a donc également pour objet l'utilisation des composés selon l'invention dans le domaine du diagnostic médical. L'invention a donc également pour objet l'utilisation des compositions de colorants fluorescents polycarboxyliques selon l'invention en imagerie médicale 25 fonctionnelle par cartographie du pH tissulaire. La 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine et la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine sont particulièrement utiles comme sondes de pH pour la réalisation d'endoscopies digestives et pour la 30 réalisation d'angiographies en fluorescence de la rétine car elle permet ainsi d'obtenir une cartographie de pH tissulaire de grande valeur diagnostique et pronostique pour la prise en charge thérapeutique du sepsis et pour la mise en évidence précoce des maladies micro vasculaire de l'ceil, telles que la dégénérescence 5 maculaire liée à l'âge. Les exemples 1 à 6 qui suivent illustrent la présente invention, sans en limiter en aucune façon la portée. EXEMPLE 1: Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-10 carboxyfluorescéine) 1.1. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine sous forme d'un mélange d'isomères de position 10 g (0,055 mol) d'acide 3-(2,4-dihydroxyphényl) 15 propionique (ou acide 2,4-dihydroxyhydrocinnamique) sont condensés avec 5,3 g (0,028 mol) d'anhydride trimellitique en présence de 10 mL d'acide phosphorique dans 10 mL de N-méthylpyrolidone. Le mélange est porté à 190 C pendant 10 heures. Le milieu réactionnel devient 20 rouge-brun foncé. Après refroidissement à 120 C, 120 mL de solution d'hydroxyde de sodium à 20% (m/m) sont lentement ajoutés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation à 60 C pendant 1 heure avant d'être refroidi à température ambiante. Après acidification à pH 25 3, le produit brut est extrait avec un mélange acétate d'éthyle/éthanol (75/25 v/v). La phase organique est lavée avec une solution saturée de chlorure de sodium et séchée avec du sulfate de magnésium, puis évaporée à sec sous vide. 30 Masse du produit brut = 15 g Rendement brut = quantitatif RMN 1H (DMSO D6): isomères 5 / 6 : 50/50 % 1.2. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine sous forme d'un mélange 5 d'isomères de position 14 g de 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine obtenue dans l'étape 1.1. {0,027 mol) sont solubilisés dans 40 mL de méthanol. A cette solution sont ajoutés 6 mL de complexe BF3/2MeOH (0,055 mol). 10 Après 5 heures d'agitation à température ambiante, 75 mL d'eau salée sont ajoutés puis 100 mL d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchée avec du sulfate de magnésium, puis évaporée à sec. 15 Masse du produit brut = 15,3 g Rendement brut = quantitatif RMN 1H (DMSO D6): isomères 5 / 6 : -50/50 % 1.3. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-20 carboxyfluorescéine 15,3 g (0,028 mol) de 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine obtenue dans l'étape 1.2. sont solubilisés à chaud dans 10 ml d'éthanol absolu puis sont concentrés. Après 25 refroidissement à 4 C pendant au moins 24 heures, la résine obtenue est délitée avec 30 mL d'isopropanol. Le précipité est filtré et réempaté à chaud dans 30 mL d'éthanol. Ensuite, il est de nouveau filtré et lavé avec du tert-butylméthyléther. Le filtrat est conservé pour la préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine. Masse du produit obtenu : 2 g Rendement isomérique = 27,2 % Rendement global = 13,6 % Pureté isomérique déterminée par RMN 1H : Appareillage : Spectromètre BRUKER 400 MHz Solvant : DMSO D6 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine = 97% 10 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine = 3% Structure de la 2',7'-bis (2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine e f COOH d c H3000C RMN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique 8 (PPm) Hb triplet 4 2,39 Ha triplet 4 2,61 Hd singulet 6 3,41 Hl. - H8, singulet 2 6,43 H4. - H5, singulet 2 6,70 H7 doublet 1 7,31 (J H7-H6 = 2,0 Hz) H6 doublet 1 8,29 (JH6_H7= 2,0 Hz) H4 singulet 1 8,41 OH singulet 2 10,28 COOH singulet aplati Partiellement 13,54 échangé RMN du 13C (par JMOD) Carbone Déplacement chimique Carbone Déplacement chimique 8 (ppm) 8 (ppm) Ca 24,9 Cl'ûC8' 128,7 Cb 33,4 C3 132,9 Cd 51,2 C6 136,2 Cl 83,7 C4'aû C5'a 150,4 C4' û C5' 102,0 C2 156,3 C1'a-C8'a 108,6 C3' û C6' 157,6 C2'-CT 124,1 Ce 166,3 C7 124,7 Cg 168,1 C4 125,6 Cc 172,7 C5 127,0 48 1.4. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine 2 g de 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5- carboxyfluorescéine sont saponifiés dans 20 mL de solution d'hydroxyde de sodium 5 M à 80 C pendant 15 minutes. Après refroidissement et neutralisation avec 20 mL d'acide chlorhydrique 5 M, le 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine est filtré et lavé à l'eau purifiée puis séché sous vide à 50 C. Masse obtenue = 1,86 g (98%) Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6): 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine = 98,0 % 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine = 2,0 % Structure de la 2',7'-bis (2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine COOH HOOC RMN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique (PPm) Hb triplet 4 2,39 Ha triplet 4 2,61 Hl. - H8, singulet 2 6,43 H4, - H5, singulet 2 6,70 H7 doublet 1 7,31 (J H7_H6 = 2,0 Hz) H6 doublet 1 8,29 (JH6_H7= 2,0 Hz) H4 singulet 1 8,41 OH singulet partiellement 10,28 échangé COOH singulet aplati partiellement 13,54 échangé 5 EXEMPLE 2: Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine 2.1. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine Après évaporation du filtrat obtenu au cours de la préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine (Exemple 1.3), le solide obtenu est porté à ébullition dans 10 mL d'isopropanol pendant 10 minutes. Après refroidissement à température ambiante, la 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine est filtrée et lavée avec de l'isopropanol préalablement refroidi à 4 C. L'opération est renouvelée. Puis le solide obtenu est lavé avec du terbutylméthyléther et séché sous vide. Masse du produit obtenu : 1,1 g Rendement isomérique = 15 % Rendement global = 7,5 % Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6) : 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine = 4,0% 20 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine = 96,0% Structure de la 2',7 -bis (2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine d c H3000C c d COOCH3 RNN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique 8 (ppm) Hb triplet 4 2,39 Ha triplet 4 2,61 Hd singulet 6 3,40 H,. - H8, singulet 2 6,40 H4, - H5, singulet 2 6,71 H7 singulet 1 7,58 H4 doublet 1 8,12 (J H4-H5 - 2,0 Hz) H5 doublet 1 8,23 (JH5-H4= 2,0 Hz) OH singulet 2 10,29 COOH singulet aplati partiellement 13,54 échangé 5 RMN du 13C (par JMOD) Carbone Déplacement chimique Carbone Déplacement chimique (ppm) S (ppm) Ca 24,9 C6 129,7 Cb 33,3 C5 131,0 Cd 51,1 C3 137,4 Cl 83,7 C4'aû C5'a 150,4 C4' û C5' 102,0 C2 152,9 C l'a-C8'a 108,6 C3' û C6' 157,5 C2'-C7' 124,0 Ce 166,3 C7 124,6 Cg 168,2 C4 125,4 Cc 172,7 Cl' û C8' 128, 6 53 2.2. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine 1,1 g de 2',7'-Bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine est saponifié dans 11 mL de solution d'hydroxyde de sodium 5 M à 80 C pendant 15 minutes. Après refroidissement et neutralisation avec 11 mL d'acide chlorhydrique 5 M, le 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine est filtré et lavé à l'eau purifiée puis séché sous vide à 50 C. Masse obtenue = 1 g (rendement : 96 %) Rendement isomérique = 14,4 % %Rendement global 7,2 % Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6) . 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine = 4,0 % 15 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine = 96,0 % Structure de la 2',7'-bis (2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine HOOC COOH RMN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique 6 (Ppm) Hb triplet 4 2,39 Ha triplet 4 2,61 HI, - H8. singulet 2 6,40 H4, - H5, singulet 2 6, 71 H7 singulet 1 7,58 H4 doublet 1 8,12 (J H4-H5 = 2,0 Hz) H5 doublet 1 8,23 (JH5-x4= 2,0 Hz) OH singulet 2 10,29 COOH singulet aplati partiellement 13,54 échangé 5 EXEMPLE 3: Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine) 3.1. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine sous forme d'un 5 mélange d'isomères de position Porter à 190 C 5,3 g (0,028 mol) d'anhydride trimellitique solubilisés dans 10 mL d'acide phosphorique et 10 mL de N-méthylpyrolidone. Ajouter 10 g (0,055 mol) d'acide 2,4-dihydroxycinnamique. Le milieu réactionnel 10 est maintenu à 190 C pendant 10 heures au cours duquel il devient rouge-brun foncé. Après refroidissement à 120 C, 120 mL de solution d'hydroxyde de sodium à 20% (m/m) sont lentement ajoutés. Le milieu réactionnel est maintenu sous agitation à 60 C pendant 1 heure avant d'être 15 refroidi à température ambiante. Après acidification à pH 3, le produit brut est extrait avec un mélange acétate d'éthyle/éthanol (75/25 v/v). La phase organique est lavée avec une solution saturée de chlorure de sodium et séchée avec du sulfate de magnésium, puis évaporée à sec 20 sous vide. Masse du produit brut = 11,2 g Rendement brut = 79,4% RMN 1H (DMSO D6): isomères 5 / 6 -50/50 % 3.2. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-25 déhydroéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine sous forme d'un mélange d'isomères de position 10 g de 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine obtenue dans l'étape 3.1. (0,019 mol) sont solubilisés dans 30 mL de méthanol. A cette solution sont ajoutés 4,1 mL de complexe BF3/2MeOH (0,038 mol). Après 5 heures d'agitation à température ambiante, 50 mL d'eau salée sont ajoutés puis 70 mL d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchée avec du sulfate de magnésium, puis évaporée à sec. Masse du produit brut = 8,4 g Rendement brut = 80 % RMN 1H (DMSO D6): isomères 5 / 6 -50/50 3.3. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine 8,4 g (0,015 mol) de 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-5(6)-carboxyfluorescéine obtenue dans l'étape 3.2. sont solubilisés à chaud dans 10 ml d'éthanol absolu puis sont concentrés. Après refroidissement à 4 C pendant au moins 24 heures, la résine obtenue est délitée avec 30 mL d'isopropanol. Le précipité est filtré et réempaté à chaud dans 30 mL d'éthanol. Ensuite, il est de nouveau filtré et lavé avec du tert-butylméthyléther Le filtrat est conservé pour la préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine. Masse du produit obtenu : 1,3 g Rendement isomérique = 24,8 % Rendement global = 14,4% Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6) . Isomère 5 95,8 % Isomère 6 = 4,2 % Structure de la 2',7'ùbis (2ùcarbométhoxyù1,2ùdéhydroéthyl)ù5ùcarboxyfluorescéine COOH CH300C RMN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique 8 (ppm) CH3 singulet 6 6,43 Hb doublet 2 6,24 H4. ù H5, singulet 2 6,81 Hl, ù H8. singulet 2 7,41 H7 doublet 1 7,31 (J H7_H6 = 2,0 Hz) Ha doublet 2 7,67 H6 doublet 1 8,29 (JH6-H7= 2,0 Hz) H4 singulet 1 8,41 OH singulet partiellement échangé 10,17 COOH singulet aplati partiellement échangé 13,24 3.4. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine 1,3 g de 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine sont saponifiés dans 13 mL de solution d'hydroxyde de sodium 5M à 80 C pendant 15 minutes. Après refroidissement et neutralisation avec 13 mL d'acide chlorhydrique 5 M, la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine est filtrée, lavée à l'eau purifiée puis séchée sous vide à 50 C. Masse obtenue = 1,2 g (rendement : 97,5%) Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6) . Isomère 5 = 94,9% Isomère 6 = 5,1% EXEMPLE 4: Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)- 6-carboxyfluorescéine 4.1. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine Après évaporation du filtrat obtenu au cours de la préparation de la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine (Exemple 3.3), le solide obtenu est porté à ébullition dans 7 mL d'isopropanol pendant 10 minutes. Après refroidissement à température ambiante, la 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine est filtrée et lavé avec de l'isopropanol préalablement refroidi à 4 C. L'opération est renouvelée. Puis le solide obtenu est lavé avec du terbutylméthyléther et séché sous vide. Masse du produit obtenu : 0,9 g Rendement : 8,5 % Rendement isomérique = 17,1 % RMN 1H (DMSO D6) : Isomère 5 = 5,8 % Isomère 6 = 94,2 % Structure de la 2',7'-bis (2-carboxyméthoxy-1,2-déhydroéthyl)- 6-carboxyfluorescéine CH300C RMN du Proton 1H Proton Signal Intégration Déplacement chimique 8(ppm) CH3 singulet 6 3,43 Hb doublet 2 6,24 H4, - H5, singulet 2 6,82 Hl' - H8, singulet 2 7,41 H7 doublet 1 7,96 (J H7_H6 = 2,0 Hz) Ha doublet 2 7,67 H6 doublet 1 8,30 (JH6_H7= 2,0 Hz) H4 singulet 1 8,41 OH singulet partiellement 10,25 échangé COOH singulet aplati partiellement 13,20 échangé 4.2. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine 0,9 g de 2',7'-Bis(2-carbométhoxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine sont saponifiés dans 9 mL de solution d'hydroxyde de sodium 5 M à 80 C pendant 15 minutes. Après refroidissement et neutralisation avec 9 mL d'acide chlorhydrique 5 M, le 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine est filtré et lavé à l'eau purifiée puis séché sous vide à 50 C. Masse obtenue = 0,82 g (rendement : 96,4 %) Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6): Isomère 5 = 5,4 % Isomère 6 = 94,6 % Exemple 5 : préparation de l'acide 2-[5'-(2- carboxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-5-carboxybenzoïque 5.1. Préparation de l'acide 2-[5'-(2-carboxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4(5)-carboxybenzoïque (mélange d'isomères de position) On dissout 6 g d'acide 3-(2,4-dihydroxyphényl)- propionique (0,033 mol) dans 25 mL de nitrobenzène. On ajoute 9,3 g (0,033 mol) d'anhydride trimellitique benzyl ester puis 11 g (0,0825 mol) d'AlCl3 en maintenant sous agitation pendant 48 heures à température ambiante. Le milieu réactionnel est extrait avec 1000 mL d'acétate d'éthyle. Le produit est séparé de la phase organique par l'ajout de 200 mL de soude 2N. La phase aqueuse est maintenue à 60 C pendant 30 minutes, permettant ainsi de saponifer l'ester benzylique. Après acidification à pH compris entre 1 et 3 avec de l'acide chlorhydrique 2N, l'acide 2-[5'-(2-carboxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4(5)-carboxybenzoïque est extrait par 500 mL l'acétate d'éthyle. Après lavage à l'eau purifiée, la phase organique est séchée avec du sulfate de magnésium, puis évaporée à sec sous vide. Masse du mélange d'isomères obtenu = 9,2 g Rendement = 74, 5 % 5.2.Préparation de l'acide 2-[5'-(2-carbométhoxyéthyl)-10 2',4'-dihydroxybenzoyl]-4(5)-carboxybenzoïque (mélange d'isomères de position) La méthylation spécifique de l'acide 2-[5'-(2-carboxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4(5)- carboxybenzoïque est réalisée selon la méthode de 15 l'exemple 1.2. (rendement quantitatif). 5.3. Préparation de l'acide 2-[5'-(2-carbométhoxyéthyl)-2',4' dihydroxybenzoyl]-4-carboxybenzoïque Transférer le mélange d'isomères obtenu dans 20 l'exemple 5.2. dans 50 mL de terbutylméthyléther. Porter à reflux pendant 30 minutes. Après refroidissement, le produit obtenu est filtré, lavé avec le même solvant puis recristallisé dans l'éthanol absolu. Masse de l'isomère 4 = 3 g Rendement isomérique = 65,2 % 25 Pureté isomérique par RMN 1H (DMSO D6): Isomère 4 = 94,8% Isomère 5 = 5,2% Le filtrat est conservé pour isoler l'isomère 5. Structure de l'acide 2-[5'-(2-carbométhoxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4-carboxybenzoïque CH300C COOHd RMN 1'H (DMSO D6 Proton Signal Intégration Déplacement chimique 8 (ppm) Hb triplet 2 2,30 Ha triplet 2 2,53 CH3 singulet 3 3,43 H6' singulet 1 6,38 H3' singulet 1 6,88 H3 singulet 1 7,80 H6 doublet 1 8,07 H5 doublet 1 8,15 OH Singulet aplati partiellement échangé 10,9 COOHd Singulet aplati partiellement échangé 11,8 COOHc Singulet aplati partiellement échangé 13,15 EXEMPLE 6: Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine) à partir de l'acide 2[5' - (2- carbométhoxyéthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4- carboxybenzoïque 6.1. Préparation de la 2',7'-Bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine 1 g (0,0026 mol) d'acide 2-[5'-(2-carbométhoxy-éthyl)-2',4'-dihydroxybenzoyl]-4-carboxybenzoïque est condensé avec 0,47 g (0,026 mol) d'acide 3-(2,4dihydroxyphényl)propionique (ou acide 2,4-dihydroxyhydrocinnamique) en présence de 1 mL d'acide phosphorique dans 1 mL de N-méthylpyrolidone. Les conditions de la réaction et le traitement du milieu réactionnel sont ceux décrits dans l'exemple 1.1. Masse du produit brut = 1 g Rendement brut = 71,9% CLHP : isomère 6 = 98,1% Les puretés isomériques obtenues dans les exemples 1 20 à 6 peuvent encore être améliorées, par mise en œuvre une seconde fois du procédé. Revendications 1. Composés de pureté isomérique égale à au moins 95%, avantageusement égale à au moins 98%, encore plus avantageusement égale à au moins 99% répondant à la formule (I) R5 HO (I) R2 dans laquelle : - deux au moins des R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupement -A-COOH identique ou différent ou un de ses sels alcalins, deux au moins des groupements A n'étant pas une simple liaison, où A représente: o soit un groupe -(CH2)n-, n étant un nombre entier de 0 à 30 et n étant différent de 0 pour au moins un des groupements A, o soit un groupe alkylène en Cl à Cao éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR1OR11 où R, R10et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à Cao, o soit un groupe cycloalkylène en c, à 012, o soit un groupe alkyle en (cl à C30) cycloalkylène 5 en (C3 à C12) , o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30) arylène, 10 éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe aryl(alkyle en C1 à C30) éventuellement substitué par un ou plusieurs 15 groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, et tous les autres R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7, identiques ou différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le 20 groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, 25 o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate,o les alkyles en Cl à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C3o, o les cycloalkyle en C3 à C12, 10 o les alkyloxy en Cl à C3o, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, 15 o les aryl(alkyle en C1 à C3o) , o les bases puriques ou pyrimidiques, o les oses, o les oligosides, o les polyosides, 20 o les polypeptides, o les protéines, o les phospholipides, et les esters correspondants, notamment comme pro-médicaments. 2. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (Ia) 25 10 15(Ia) dans lesquelles A et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-COOH sont tels que définis à la revendication 1. 3. Composés selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Iai) à (Ia4) qui suivent : R5 COOH 1 A (Ia2) 20 70R5 (Ia3) R5 (Ia4) dans lesquelles A, R1, R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis dans la revendication 1. 4. Composés selon la revendication 2 caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (Ib) (Ib) dans laquelle 25 n et m sont des nombres entiers de 0 à 30 identiques ou différents, l'un au moins de n et m étant différent de 0et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-COOH sont tels que définis dans la revendication 1. 5. Composés selon la revendication 4 caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Ib1) à (Ib4) qui suivent : (Ib1) R5 (Ib2) 20 R5 25 (Ib3) 72R5 (Ib4) dans lesquelles m, n, R1, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis dans la revendication 1. 6. Composés selon la revendication 2 qui répondent à la formule (Ic) (Ic) 20 dans laquelle A et R1, R3, R4, R5, R7 différents de -A-000H sont tels que définis dans la revendication 1. 7. Composés selon la revendication 6 caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les isomères de position répondant à l'une des formules (Ici) à (Ic4) qui suivent : 25COOH R5 (Ic2) 10 R5 (Ic3) 15 R5 (Ic4) 20 dans lesquelles A et Ri, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis dans la revendication 1. 25 8. Composés selon la revendication 7 dans lesquelles A représente un groupement choisi dans le groupe comprenant le groupe ù(CH2)2ù et le groupe ùCH=CHù. 9. Composés selon la revendication 8 caractérisés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe comprenant les isomères de formule (Id1) à (Id8) qui suivent : COOH HOOC COOH (Id1) HOOC R5 COOH (Id2) 20 R5 HOOC COOH (Id3) 25R5 HOOC COOH (Id4) COOH HOOC (Id5) R5 HOOC COOH (Id6) R5 HOOC COOH (Id7) R5 HOOC (Id8)25dans lesquelles R1, R3, R4, R5, R6, R7 différents de -A-COOH sont tels que définis à la revendication 1. 10. Composés selon la revendication 1 caractérisés en ce 5 qu'ils sont choisis dans le groupe comprenant : la 2',7'-bis(2-carboxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine de formule : COOH HOOC COOH 10 la 2',7'-bis(2-carboxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine de formule : HOOC COOH la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-5-carboxyfluorescéine de formule : COOH HOOC 15et la 2',7'-Bis(2-carboxy-1,2-déhydroéthyl)-6-carboxyfluorescéine de formule : HOOC 11. Esters des composés de formule (I) selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques de ce composé de formule (I) avec un composé de formule(III) : R8-OH (III) dans laquelle - R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en cl à 030 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, et -000R où R est un groupe alkyle en Cl à Cao, o cycloalkyles en C3 à Cu, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en C1 à 20 C30o aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en C1 à Cao, 5 o aryl-alkyle en C1 à Cao. 12. Esters spécifiques des composés selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe comprenant : 10 la 2',7'-bis(2-carbométhoxyéthyl)-5-carboxyfluorescéine ; la 2',7'-bis(2-carbométhoxyéthyl)-6-carboxyfluorescéine; la 2',7'-bis(2-carboxyméthoxy-1,2-déhydroéthyl)-5- carboxyfluorescéine ; la 2',7'-bis(2-carboxyméthoxy-1,2-déhydroéthyl)-6- 15 carboxyfluorescéine. 13. Procédé de préparation d'un composé de formule (I), de pureté isomérique égale à au moins 95%, avantageusement égale à au moins 98%, encore plus 20 avantageusement égale à au moins 99%, selon l'une quelconque des revendication 1 à 12 , caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape d'estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques d'un composé répondant à la formule (I) 25 mentionné à la revendication 1, ou d'un de ses intermédiaires de synthèse, ayant une pureté isomérique inférieure à 95%, suivie d'une étape de séparation des esters obtenus, puis éventuellement d'une étape de saponification desdits esters. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'étape d'estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques est une réaction 5 avec BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température de 10 C à 40 C. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la réaction d'estérification 10 spécifique est réalisée avec un composé de formule (III) R8-OH (III) dans laquelle R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en 15 C1 à 030 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, 20 et -COOR où R est un groupe alkyle en Cl à C30, o cycloalkyles en C3 à C12, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en Cl à 030 o aryles éventuellement substitués par un ou 25 plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en C1 à C30, o aryl-alkyle en C1 à C30. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il implique la réaction d'un composé de formule (III) R8-OH dans laquelle R8 est choisi dans le groupe comprenant : o les groupes alkyles linéaires ou ramifiés en Cl à C30 et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis dans le groupe comprenant les groupes halogéno, hydroxy, nitro, amino, et -COOR où R est un groupe alkyle en Cl à C30, o cycloalkyles en C3 à 012, o alkyloxyalkylène linéaires ou ramifiés en C1 à C30 o aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupes halogéno, hydroxy et ester, o aryloxyalkylène en C1 à C30, aryl-alkyle en C1 à C30 avec le composé de formule (II) suivante : HO R3_~. OH R1 (II) dans laquelle- l'un au moins des R1, R2, R3 est un groupement -A-COOH où A similaire ou différent pour chaque groupement -A-COOH, et au moins l'un des groupements A n'étant pas une simple liaison, représente o soit un groupe -(CH2)n-, n étant un nombre entier de 0 à 30 et n étant différent de 0 pour au moins un des groupements A, o soit un groupe alkylène en C1 à Cao éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR1OR11 où R, R10 et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à Cao, o soit un groupe cycloalkylène en C3 à 012, o soit un groupe alkyle en (c1 à C30) cycloalkylène en (C3 à Cu), o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30)arylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe aryl(alkyle en C1 à Cao) éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, ettous les autres R1, R2, R3 identiques ou différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, o les alkyles en Cl à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en Cl à 030, o les cycloalkyle en C3 à 012, 20 o les alkyloxy en C1 à C3o, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, 25 o les aryl(alkyle en cl à C30) , o les bases puriques ou pyrimidiques,pour réaliser une estérification spécifique du ou des groupements carboxyliques non-aromatiques et obtenir un composé de formule (IV) - dans laquelle l'un au moins des R'l, R'2 et R'3 est un groupement -A-000-R8, similaire ou différent, avec A et R8 tels que définis précédemment, l'un au moins des groupements A étant différent d'une simple 10 liaison, et les autres R'l, R'2 et R'3 différents de -A-COOR8 sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, 15 o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, 20 o les alkyles en Cl à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, 25 nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avecR, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à Cao, o les cycloalkyle en C3 à 012, o les alkyloxy en C1 à Cao, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl(alkyle en cl à Cao) , o les bases puriques ou pyrimidiques. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, caractérisé en ce qu'il implique la réaction d'un composé de formule (III) tel que défini à la revendication 16, avec un composé de formule (V) dans laquelle un ou plusieurs des groupes R4, R5, R6 et R7 sont un groupement -A-COOH où A similaire ou différent 20 pour chaque groupement -A-COOH et représente : o soit un groupe -(CH2)n-, n étant un nombre entier de 0 à 30, o soit un groupe alkylène en C1 à Cao éventuellement ramifiés et/ou pouvant 25 comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitué R7 R5 R6par un ou plusieurs groupe(s) choisi(s) parmi halogéno, hydroxy, -CONHR,-CONR10R11 où R, R10 et R11 représentent chacun indépendamment les uns des autres un groupe alkyle en C1 à C30r o soit un groupe cycloalkylène en c, à C12, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30)cycloalkylène en (c, à C12) , o soit un groupe arylène éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les 10 halogènes et les hydroxyles, o soit un groupe alkyle en (C1 à C30)arylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, 15 o soit un groupe aryl(alkyle en C1 à C30) éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi les halogènes et les hydroxyles, et tous les autres R4, R5, R6 et R7, identiques ou 20 différents les uns des autres, sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, 25 o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate,o les alkyles en C1 à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à C30, o les cycloalkyle en C3 à C12, o les alkyloxy en C1 à C3o, o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogéno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl(alkyle en C1 à C3o) , o les bases puriques ou pyrimidiques, pour réaliser une estérification spécifique des groupements carboxyliques non aromatiques et obtenir un composé de formule (VI) - dans laquelle un ou plusieurs des groupes R'4, R'5, R'6 et R'7 sont un groupement -A-COOR8 avec A et R8 tels que définis précédemment, similaires ou différents, et les autres R'4, R'5, R'6 et R'7différents de -A-COOR8 sont choisis indépendamment les uns des autres, dans le groupe comprenant: o l'hydrogène, o les atomes d'halogène, 5 o le groupe hydroxy, o le groupe amino, o le groupe phosphate, o le groupe nitro, o le groupe sulfonate, 10 o les alkyles en Cl à C30, éventuellement ramifiés et/ou pouvant comprendre une ou plusieurs double(s) ou triple(s) liaison(s), éventuellement substitués par un ou plusieurs substituants choisis parmi halogéno, hydroxy, 15 nitro, amino, sulfo, -CONHR et -CONR11R12 avec R, R11 et R12 représentant chacun indépendamment un groupe alkyle en C1 à 030, o les cycloalkyle en C3 à C12, o les alkyloxy en CI à C30, 20 o les aryles éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes choisis parmi les groupements halogèno, hydroxyles, o les aryloxy, o les aryl(alkyle en C1 à C30) , 25 o les bases puriques ou pyrimidiques. 18. Procédé de préparation selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :- une première étape de condensation d'un composé de formule (IV) (IV) dans laquelle R'l, R'2 et R'3 sont tels que définis à la revendication 16, avec un composé de formule (VI) (VI) dans laquelle R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis à la revendication 17, ou son anhydride de formule (VI') (VI') dans laquelle R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis à la revendication 17, pour obtenir un intermédiaire de formule (VII)(VII) dans laquelle R'l, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis précédemment aux revendications 16 et 5 17. - une deuxième étape de condensation du composé de formule (VII) avec un composé de formule (IV) pour obtenir un composé de formule (VIII): (VIII) 10 15 dans laquelle R'l, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis précédemment. - une étape de séparation des isomères de position du composé de formule (VIII) par lavage et/ou recristallisation, dans un alcool primaire ou secondaire, 20 puis - une étape de saponification des fonctions esters avec une base alcaline afin de générer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I) tel que défini à la revendication 1. 19. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend : - une étape de condensation du composé de formule (II) avec un composé de formule (V) pour obtenir un intermédiaire de formule : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 et R8 sont tels 10 que définis aux revendications 16 et 17. - une étape d'estérification spécifique du composé de formule (IX) avec le composé de formule R8-OH (III) tel que défini à la revendication 16, pour réaliser une estérification sélective des fonctions acides 15 carboxyliques non aromatiques et obtenir le composé intermédiaire de formule (VII) . , n, (VII) dans laquelle R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis dans les revendications 16 et 17, R5 R6 R4 R7 HOOC (IX)- une étape de condensation du composé de formule (VII) avec un composé de formule (IV) pour obtenir le composé de formule (VIII) : (VIII) dans laquelle R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis précédemment, - une étape de séparation des isomères de position 10 du composé de formule (VIII) par lavage et/ou recristallisation dans un alcool primaire ou secondaire puis - une étape de saponification des fonctions esters avec une base alcaline pour générer le colorant 15 polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I) tel que défini à la revendication 1. 20. Procédé de préparation selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend : 20 - une étape de condensation du composé de formule (II) HO R3_~. OH R15dans laquelle R1, R2, R3 sont tels que définis à la revendication 16, avec un composé de formule (V) dans laquelle R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis à la revendication 17, pour obtenir un intermédiaire de formule (IX): 10 (IX) dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 sont tels que définis précédemment, une étape de purification de l'intermédiaire de formule (IX) par lavage et/ou recristallisation. 15 -une étape de condensation du composé intermédiaire de formule (IX) avec un composé de formule (II) pour obtenir le composé de formule : R7 R5 R6 20 (X)dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6 et R7 sont tels que 5 définis précédemment. - une étape d'estérification spécifique du composé de formule (X) avec le composé de formule R8-OH (III) tel que défini précédemment, pour réaliser une estérification sélective des fonctions acides carboxyliques non 10 aromatiques et obtenir le composé intermédiaire de formule (VIII) : (VIII) 15 dans laquelle R'1, R'2, R'3, R'4, R'5, R'6 et R'7 sont tels que définis aux revendications 16 et 17, -une étape de séparation des isomères de position 20 du composé de formule (VIII) par lavage et/ou recristallisation, - une étape de saponification des fonctions esters permettant de régénérer le colorant polycarboxylique sous forme d'un seul isomère de position de formule (I) tel 25 que défini à la revendication 1. 21. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend :-la préparation d'un composé de formule (VII) : HO le OH R'2 (VII) selon le procédé de l'une quelconque des revendications 5 18 ou 19, - la séparation des isomères de position de l'intermédiaire (VII) par lavage et/ou recristallisation, - une étape de condensation de l'isomère de l'intermédiaire (VII) ainsi isolé avec le composé de 10 formule (IV) tel que défini à la revendication 16, pour donner le composé de formule (VIII) tel que défini à la revendication 18, - une étape de purification des isomères de position du composé de formule (VIII) ainsi obtenu par lavage 15 et/ou recristallisation, - une étape de saponification des fonctions esters permettant de régénérer le colorant polycarboxylique de formule (I) sous forme d'un seul isomère de position tel que défini à la revendication 1. 20 22. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 21, caractérisé en ce que l'étape d'estérification spécifique est réalisée en présence d'un acide de Lewis ou d'un acide de Bronsted en solution dans R8-OH à une 25 température comprise entre 10 C et le point d'ébullitionde R8-OH pendant une durée comprise entre 2 heures et 24 heures. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendication 13 à 22, caractérisée en ce que l'étape d'estérification spécifique des fonctions acides carboxyliques non aromatiques est une réaction avec BF3 dissous dans un alcool primaire ou secondaire à une température de 10 C à 40 C. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisé en ce que en ce que la première étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Lewis en milieu nitrobenzène ou nitrométhane à une température comprise entre 15 C et 110 C pendant 5 à 72 heures. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 24, caractérisé en ce que la seconde étape de condensation est réalisée en présence d'un acide de Bronsted choisi dans le groupe comprenant l'acide sulfurique, l'acide polyphosphorique, l'acide phosphorique, les acides arylsulfoniques ou alkylsulfoniques, supportés ou non sur un polymère et leurs mélanges, éventuellement dans un solvant aprotique dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N-diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges.30 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23, caractérisé en ce qu'une des étapes de condensation est réalisée en présence d'acide phosphorique utilisé comme solvant et catalyseur, éventuellement en mélange avec un solvant aprotique dipolaire, choisi dans le groupe comprenant la N-méthylpyrrolidone, le N,N- diméthylformamide, le formamide sous pression, l'acétonitrile sous pression et leurs mélanges. 27. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comme colorant fluorescent. 28. Compositions de colorants fluorescents caractérisées en ce que le colorant fluorescent est un composé selon 15 l'une quelconque des revendications 1 à 12. 29. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans le domaine du diagnostic médical. 30. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 comme sondes de pH in vitro et in vivo. 25 31. Utilisation des composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 en imagerie médicale fonctionnelle par cartographie du pH tissulaire. 20