Brevet FR2912425A1 — publié le 20080815

Le domaine de l'invention est celui de l'analyse microbiologique par voie biochimique, et en particulier de la détection et de l'identification de bactéries. Les bactéries pathogènes, et notamment les bacilles à gram négatif, tels que les entérobactéries sont responsables chaque année de nombreuses maladies, épidémies... L'espèce E. coli (Escherichia coli) est l'espèce aérobie la plus représentée dans le tube digestif. Toutefois, leur présence dans l'eau est un témoin de contamination fécale, et certaines souches sont pathogènes et responsables de suppurations péritonéales, biliaires, appendiculaires ou génitales. Une détection précoce et spécifique d'E. coli permet de proposer une solution adaptée, en terme de traitement, de décontamination...Cette détection peut être basée notamment sur l'utilisation de milieux de détection comprenant des substrats particuliers, spécifiques d'une activité métabolique, dite activité métabolique cible, telle qu'une activité enzymatique, de la bactérie que l'on souhaite détecter : par le choix des substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme. Le milieu CPS ID 3 (bioMerieux) utilise un substrat de B-glucuronidase associé à un substrat de lglucosidase et éventuellement à la détection de la tryptophanase pour la détection des souches de l'espèce Escherichia coli. Toutefois, si ce milieu présente une excellente spécificité, l'utilisation d'un substrat de B-glucuronidase pour la détection des E. coli présentent une sensibilité imparfaite du fait de l'existence d'une faible proportion de souches d'E. coli (5-10%) n'exprimant pas cette activité. De plus, certaines souches de Citrobacter peuvent également produire des colonies lglucuronidase positives, de la même couleur que celles d' E. coli L'invention se propose de résoudre les problèmes de l'état de la technique en présentant un nouveau milieu particulièrement adapté pour identifier les bactéries E coli d'une manière rapide, peu coûteuse et aisée à mettre en oeuvre. D'une nunière surprenante, les inventeurs ont montré qu'un test complémentaire adapté permettait une détection rapide et aisée d' E. coli. Plus précisément, les inventeurs ont notamment montré qu'un test indole réalisé sur les E. coli n'exprimant pas l'activité métabolique cible permettait d'augmenter la sensibilité du test. Avant d'aller plus avant dans l'exposé de l'invention, les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de l'invention. Par échantillon biologique, on entend un échantillon clinique, issu d'un prélèvement de liquide biologique, ou un échantillon alimentaire, issu de tout type d'aliment ou un échantillon d'environnement tel qu'un prélèvement de surface, d'eau, d'air, .... Cet échantillon peut être ainsi liquide ou solide et on peut citer d'une manière non limitative, un échantillon clinique de sang, de plasma, d'urines, de fécès, de prélèvements de nez, de gorges, de peaux, de plaies, de liquide céphalo-rachidien, un échantillon alimentaire d'eau, de boissons tels que le la it, un jus de fruits; de yaourt, de viande, d'oeufs, de légumes, de mayonnaise, de fromage ; de poisson..., un échantillon alimentaire issu d'une alimentation destinée aux animaux, tel que notamment un échantillon issu de farines animales. Par milieu de détection, on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance de microorganismes. Ce milieu de détection peut soit servir uniquement de milieu de détection, soit de milieu de culture et de détection. Dans le premier cas, la culture des microorganismes est effectuée avant ensemencement et, dans le deuxième cas, le milieu de détection constitue également le milieu de culture. Le milieu de culture selon l'invention peut contenir d'éventuels autres additifs comme par exemple : des peptones ou extraits de tissus, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants... Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est à dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon, ou sur boite de Petri. Au sens de la présente invention, la détection peut être réalisée en milieu liquide, bandelette ou autre support solide Par substrat, on entend toute molécule susceptible d'engendrer directement ou indirectement un signal détectable dû à une activité enzymatique ou métabolique du microorganisme. Le substrat peut être notamment un substrat métabolique, telle qu'une source de carbone ou d'azote, couplée à un indicateur produisant une coloration en présence de l'un des produits du métabolisme. Le substrat peut être également un substrat enzymatique, c'est à dire un substrat pouvant être hydrolysé par une enzyme en un produit permettant la détection, directe ou indirecte d'un microorganisme. Ce substrat peut notamment comprendre une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler et une seconde partie faisant office de marqueur, ci-après appelée partie marqueur. Cette partie marqueur peut être chromogène, fluorogène, luminescente... Comme substrat chromogène, bien adapté aux supports solides (filtre, gélose, gel d'électrophorèse), on peut citer notamment les substrats à base d'indoxyl et ses dérivés, et les substrats à base d'hydroxyquinoline ou d'esculétine et leurs dérivés, qui permettent la détection d'activités osidase et estérase. On peut citer également les substrats à base de nitrophénol et nitroaniline et dérivés, permettant de détecter les activités osidases et estérases dans le cas de substrats à base d; nitrophénol, et des activités peptidases dans le cas de substrats à base de la nitroaniline. On peut citer enfin les substrats à base de naphtol et naphtylamine et leurs dérivés, qui permettent de détecter les activités osidases et estérases par l'intermédiaire du naphtol, et les activités peptidases par l'intermédiaire de la naphtylamine. Ce substrat peut permettre notamment, mais d'une façon non limitative, la détection d'une activité enzymatique telle que l'activité d'une osidase, peptidase, estérase... Le substrat enzymatique peut également être un substrat naturel dont le produit d'hydrolyse est détecté directement ou indirectement. Comme substrat naturel, on peut notamment citer le Tryptophane pour détecter une activité tryptophanase ou desaminase, un acide aminé cyclique (Tryptophane, Phénylalanine, Histidine, Tyrosine) pour détecter une activité désaminase, le Phosphatidyl Inositol pour détecter une activité phospholipase, ... Selon la présente invention, le substrat est préférentiellement choisi parmi les substrats à base d'Indoxyl (3-Indoxyl, 5-Bromo-3-indoxyl, 5-Iodo-3-indoxyl, 4Chloro-3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro- 3-indoxyl, 6-Bromo-3-indoxyl, 6-Fluoro- 3-indoxyl, 5-Bromo-4-chloro-N-méthyl-3-indoxyl, N-Méthyl-3-indoxyl, ...) ; à base d'umbelliférone (4-Méthylumbelliférone, Cyclohexenoesculétine, ...) ; à base d'Alizarine ; à base de p-Naphtolbenzéine ; à base de Nitrophénol (ortho-Nitrophénol, para-Nitrophénol, ...) ; à base d'Aminophénol (para-Aminophénol, Dichloro-aminophénol, ...) ; d'Hydroxyquinoline ; de Cathécol (Cathécol, Dihydroxyflavone, Hydroxyflavone, ...) ; de Résorufine ; de Chlorophénol Red; de Fluorescéine ; de Naphtol (alpha-Naphtol, 2- Naphtol, Naphtol-ASBI, ...) ; d'Aminocoumarine (7-Amino-4-méthyl-coumarine, ...); de Naphtylamide ; d'Acridine (Amino-phényl-acridine...) ; d'Amino-phénoxazine (Amino-benzophénoxazinone, Amino-pentyl resorufine...). A titre indicatif, les substrats utilisés pour la détection d'une activité betaglucuronidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro3-indolyl-beta- glucuronide, le 6-Chloro- 3- indolyl- beta- glucuronide, 1' Alizarine- beta- glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-betaglucuronide ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-galactosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 6Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 1' Alizarine -beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetinebeta-galactoside ou leurs sels. Les substrats utilisés pour la détection d'une activité beta-glucosidase peuvent notamment être le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chi oro- 3-indolylbe ta- Glucoside, le 6- Chloro- 3-indolylbeta-Glucoside, 1'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophényl-beta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels. Comme substrat d'alpha - galactosidase, on peut citer le 4-Méthylumbelliféryl-alphagalactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro- 3- indolyl-alpha-galactoside, 1' Alizarine - alpha- galactoside, le Nitrophényl-alpha-galactoside ou leur sels. Par enzyme A ou C. exprimée par la majorité des E. coli, on entend une enzyme qui est exprimée par plus de 80% des E. coli dans des conditions données. L'homme de l'art connaît un grand nombre d'activités exprimées par la majorité des souches d' E coli. Certaines sont notamment décrites dans le Manual of Clinical Microbiology 7 édition (P. R. Murray et al. 1999), ainsi que dans les bases de données des produits d'identification de bioMérieux (api20E, ID 32E, rapid ID 32, ...) A titre d'enzyme exprimée par la majorité des E coli, on peut citer notamment la beta-glucuronidase, alpha -galactosidase, beta -ribosidase, phosphatase, L-Alanine - aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta galactosidase, l'acidification du Lactose, la tryptophanase. Par enzyme B, non exprimée par la majorité des E. coli, on entend une enzyme qui est exprimée par moins de 20% des E coli dans des conditions données. Un test pour mettre en évidence une enzyme non exprimée par la majorité des E. coli est donne ci dessous a titre indicatif : Ces activités sont aussi connues de l'homme du métier et pour certaines décrites dans les documents cités ci-dessus. On peut citer notamment beta-glucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-xylosidase, phospholipase, alpha -mannosidase, beta-mannosidase, beta-cellobiosidase, alpha -glucosidase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, beta-Alanine-aminopeptidase, élastase. Par test indole, on entend un test permettant de détecter la production d'indole par des microorganisme. En général, l'indole produit dans un milieu réactionnel est détecté à l'aide d'un réactif, tel que le réactif de Kovacs, le Diméthyl-amino-cinnamaldéhyde (DMACA) ou le réactif de James. En présence d'indole, une coloration rouge est obtenue avec les réactif de Kovacs et de James et une coloration bleue est obtenue avec le DMACA. Par inducteur, on entend un composé induisant une augmentation de l'expression de l'activité métabolique ciblée, toute condition expérimentale étant égale par ailleurs, l'activité métabolique est plus forte lorsque l'inducteur est à une concentration appropriée que lorsqu'il est absent ou à une concentration inadaptée. On peut citer notamment : • pour la beta-glucuronidase, un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta-glucuronide. • pour la beta-galactosidase, un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside • pour la beta-glucosidase, un hydrate de carbone constitué d'un hydrate de carbone lié en position B au glucose ou hydrate de carbone avec une sous -unité B-glucoside, en particulier le cellobiose, la cellulose, l'amidon, le cellotriose, le trehalose. On peut citer également le Méthyl-B-glucoside, l'Isopropyl-13-thioglucoside, 1'Indoxyl-B-glucoside ou le Méthyl-B-thio-glucoside • pour l'alpha galactosidase, , un alpha -galactoside, préférentiellement choisi parmi le Mélibiose, le Méthyl-alpha-galactoside. A ce titre, l'invention concerne un procédé de détection et/ou d'ide ntification d' Escherichia coli (E. coli) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir E. coli sur un milieu de détection comprenant du tryptophane et un substrat d'une enzyme A, exprimée par la majorité des E. coli pour obtenir des colonies de bactéries b) on détecte les colonies exprimant l'activité de l'enzyme A, et on les identifie comme étant E. coli c) on détecte les colonies n'exprimant pas l'activité de l'enzyme A, on réalise un test indole, et on identifie les colonies ayant un test indole positif comme étant E. coli. L'ensemencement des microorganismes peut être réalisé par toutes les techniques d'ensemencement connues de l'homme du métier. Une étape d'incubation peut être réalisée à une température pour laquelle l'activité enzymatique que l'on souhaite détecter est optimale, que l'homme du métier peut choisir aisément selon l'activité enzymatique à détecter. La détection/identification peut s'effectuer par un examen visuel, par colorimétrie ou fluorimétrie. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est choisi parmi la beta glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanineaminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta galactosidase. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta-glucuronidase (beta glucuronidase). Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucuronidase est choisi parmi le 4Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chi oro3-indolyl- be ta- glucuronide, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, 1'Alizarine-beta-glucuronide, le Cyclohexenoesculetine- beta-glucuronide ou leurs sels, à des concentrations comprises préférentiellement entre 20 et 1000mg/1. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la beta-galactosidase (beta galactosidase). Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5- B romo4-chloro- 3- indolyl- beta- galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolylbeta-galactoside, le 6-Chi oro-3-indolyl-betagalactoside, 1' Alizarine -beta- galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme A est à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02 g/1, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4 g/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme B, non exprimé par la majorité des E. coli. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme B est choisi parmi la betaglucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-xylosidase, phospholipase, alpha-mannosidase, beta -mannosidase, beta-cellobiosidase, alphaglucosidase, désaminase, oxydase, synthèse de pigment, beta-Alanine-aminopeptidase, élastase. Préférentiellement, l'enzyme B est la beta-glucosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta -Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro3-indolyl- beta- Glucoside, le 6-Chloro- 3-indolyl- beta- Glucoside, l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophénylbeta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme B est à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme C, exprimé par la majorité d' E coli. Deux modes de réalisation sont alors possibles : • soit l'enzyme C est identique à l'enzyme A, dans ce cas, le substrat doit être différent. On peut citer par exemple comme enzyme A et C, la beta-galactosidase, dans ce cas, le milieu comprend par exemple comme substrat de l'enzyme A, le 4- Méthylumbelliféryl-beta-glucuronide et comme substrat de l'enzyme C, le 5- Bromo6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide. • soit l'enzyme C est différente de l'enzyme A, on peut citer par exemple comme enzyme A la beta-galactosidase, en combinaison avec, comme enzyme C, alphagalactosidase. On peut citer également comme enzyme A la beta-galactosidase, en combinaison avec, comme enzyme C, la beta-glucuronidase. Préférentiellement, l'enzyme C est choisi parmi beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, L-Alanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta- galactosidase. Préférentiellement, l'enzyme C est la beta-glucuronidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucuronidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliférylbeta-glucuronide, le 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucuronide, le 6-Chloro- 3- indolyl-betaglucuronide, 1' Alizarine - beta- glucuronide, le Cyclohexenoesculetine-beta-glucuronide ou leurs sels, à des concentrations comprises préférentiellement entre 10 et 1000mg/1. Préférentiellement, l'enzyme C est l'alpha-galactosidase. Préférentiellement, le substrat d'une activité alpha-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-alphagalactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 6-Chloro- 3- indolyl-alpha-galactoside, 1' Alizarine - alpha- galactoside, le Nitrophényl-alpha-galactoside à des concentrations comprises entre 10 et 1000mg/l/, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Préférentiellement, le substrat de ladite enzyme C est à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A es t la betagalactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est l'alphagalactosidase. Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention, • le substrat de l'enzyme A est préférentiellement le 5Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolylbeta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl beta-galactoside, l'Alizarine -beta -galactoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, • le substrat de l'enzyme B est préférentiellement le 5Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 1'Alizarine-beta-glucoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, • le substrat de l'enzyme C est préférentiellement 5-Bromo-4-chloro-3-indolylalpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolylalpha-galactoside, le 6Chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, l'Alizarine-alpha -galactoside à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'enzyme A est la betagalactosidase ; l'enzyme B est la beta glucosidase, et l'enzyme C est la betaglucuronidase. Dans ce mode particulier de réalisation de l'invention, • le substrat de l'enzyme A est préférentiellement le 5Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolylbeta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolylbeta-galactoside, l'Alizarine -beta -galactoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, • le substrat de l'enzyme B est préférentiellement le 5Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-glucoside, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-beta-glucoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucoside, 1'Alizarine-beta-glucoside, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1, • le substrat de l'enzyme C est préférentiellement le 5Bromo-4-chloro-3-indolylbeta-glucuronide, le 5-Bromo-6-chloro-3-indolylbeta-glucuronide, le 6-Chloro- lo 3-indolyl-beta-glucuronide, 1'Alizarine-beta-glucuronide, à une concentration comprise entre 10 et 1000mg/1 Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le milieu de détection comprend en outre, un inducteur de l'enzyme A, un inducteur de l'enzyme B et/ou un inducteur de l'enzyme C. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'inducteur de l'enzyme A, B ou C est a une concentration comprise entre 100ng/1 à 10g/1, préférentiellement comprise entre l0mg/1 et 3g/1. Lorsque l'enzyme A ou C est la beta-glucuronidase, l'inducteur de ladite enzyme A ou C est préférentiellement un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta-glucuronide. Lorsque l'enzyme A ou C est la beta-galactosidase, l'inducteur de ladite enzyme A ou C est préférentiellement un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, 1' Isopropyl- beta- thio - galactoside. Lorsque l'enzyme B est la beta-glucosidase, l'inducteur de l'enzyme B est préférentiellement un beta-glucoside, préférentiellement choisi parmi la Méthylbeta-glucose, le Cellobiose, cellotriose, trehalose, cellulose, amidon. Préférentiellement, l'inducteur de l'enzyme B est le Cellobiose, à une concertration préférentiellement comprise entre l0mg/1 à l0g/1 Lorsque l'enzyme C est l'alpha-galactosidase, l'inducteur de l'enzyme C est préférentiellement le Mélibiose, le Méthyl-alpha-galactoside. L'invention concerne également un milieu de détection comprenant du tryptophane, un substrat d'une enzyme beta-galactosidase, un substrat d'une enzyme beta-glucosidase, et du cellobiose. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02g/1, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4g/1. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-glucosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Glucoside, le 5-Bromo-6-chloro- 3-indolylbeta- Glucoside, le 6-Chloro- 3-indolyl- beta- Glucoside, Il l'Alizarine-beta-Glucoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-Glucoside, le Nitrophénylbeta-glucoside, le Dichloroaminophényl-glucoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Préférentiellement, le substrat d'une activité beta-galactosidase est choisi parmi le 4-Méthylumbelliféryl-beta-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro-3indolyl beta-galactoside, le 6-Chloro-3-indolyl-beta-galactoside, 1'Alizarine-beta-galactoside, le Cyclohexenoesculetine-beta-galactoside ou leurs sels, à une concentration comprise préférentiellement entre 10 et 1000mg/1, préférentiellement entre 20 et 500 mg/l. Préférentiellement, le cellobiose est à une concentration comprise entre 10mg/1 à 10g/1. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention,, le milieu de détection comprend en outre un substrat d'une enzyme alpha-galactosidase. Comme substrat d'alpha-galactosidase, on peut citer notamment le 4-Méthylumbelliférylalpha-galactoside, le 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, le 5-Bromo-6-chloro3-indolyl alpha - galactoside, le 6-Chloro- 3-indolyl-alpha-galactoside, 1' Alizarine -alpha -galactoside, le Nitrophényl-alpha- galactoside à des concentrations comprises entre 20 et 1000mg/l/. L'invention concerne également l'utilisation d'un milieu tel que défini ci dessus pour détecter E. coli. Les exemples ci dessous sont donnés à titre explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Ils permettront de mieux comprendre l'invention. Exemple 1 : Apport du test Indole sur les colonies incolores pour la détection d' Escherichia coli Trois mille (3 000) prélèvements urinaires ont été ensemencés sur le milieu CPS ID 3 commercialisé (bioMérieux). Les milieux ont été incubés et analysés conformément aux recommandations du fournisseur : pour la détection et l'identification des souches d'Escherichia coli, les colonies roses à rouges ont été pré-identifiées comme appartenant à l'espèce E coli. Un test Indole a été pratiqué pour confirmer cette identification. Parallèlement, les milieux ont été utilisés et analysés conformément à la présente invention : les colonies roses à rouges ont été identifiées comme appartenant à l'espèce E. coli ; un test Indole a été effectué sur les colonies incolores, si la réaction était positive la souche était identifiée comme E. coli. L'ensemble des identifications a été confirmé par des tests biochimiques adaptés couramment utilisés par les laboratoires d'analyses médicales. Sans test Indole Méthodologie du fournisseur ; Avec test Indole sur colonies roses à rouges Selon l'invention Avec test Indole sur colonies incolores Sensibilité d'identification des E. coli 94% 90% 99,9% Tableau 1 : Apport du test Indole sur colonies incolores pour l'identification des souches d' E. coli sur le milieu CPS ID 3 Du tableau 1, il ressort très nettement que lorsque le test Indole est pratiqué uniquement sur les colonies roses à rouges sur le milieu CPS ID 3, comme proposé par le fournisseur, cela conduit à une diminution de la sensibilité d'identification des souches d' E coli. Au contraire, si ce test est pratiqué sur les colonies incolores, cela permet d'obtenir une très haute sensibilité d'identification. Exemple 2 : Apport du test Indole sur un milieu associant Cellobiose, 6-Chloro-3-indolyl-B- glucuronide, 5-Bromo-6-chloro- 3- indolyl- B- gal actos ide et 5-Bromo - 4-chl oro-3- indolyl-B -glucoside Au milieu Trypcase Soja Agar (bioMérieux) sont ajoutés du Tryptophane à 0,9g/1, du 6-Chloro-3-indolyl-B-glucuronide à 0,15g/l du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside à 0,05g/l et du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-glucoside à 0,1g/l. Ce milieu est additionné ou non de Cellobiose à 0,5g/1. Ces deux milieux sont répartis à raison de 20m1 par boîte de Petri. Des micro-organismes fréquemment isolés de prélèvements urinaires et issus de la collection de la demanderesse sont ensemencés sur ces milieux par isolement serai-quantitatif de l0 1 d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes sont incubées à 37 C pendant 24 heures, puis les colonies formées sont examinées visuellement. La coloration de ces colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-après : Concentration en Cellobiose en mg/1 0 500 Souches Colonies : Indole Colonies ; Indole Escherichia coli 407 Rose Rose Escherichia coli 067 Rose Rose Escherichia coli 001 Incolore Positif Incolore : Positif Klebsiella pneumoniae 111 Turquoise Turquoise Serratia marcescens 112 Turquoise Turquoise Citrobacer freundii 031 Gris Gris Citrobacter freundii 009 Rose Violet ; Streptococcus agalactiae 019 Mauve Mauve Enterococcus faecalis 117 Turquoise ; Turquoise ; )leau 2 : Annort du test Indole sur un milieu associant 6-Chloro-3-indo: B-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside et 5-Bromo-4chloro-3-indolyl-B-glucoside additionné ou non de Cellobiose sur l'identification des E. coli Dans le tableau 2 ci dessus, il ressort que dans un milieu combinant Tryptophane, 6-Chloro- 3-indolyl-B-glucuronide, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl B-galactoside et 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-B-glucoside, le Cellobiose permet de mieux différencier la souche de Citrobacter 009 des souches d' E. coli. Par ailleurs, en présence de Tryptophane, la recherche de la production d'Indole par les colonies incolores permet d'accroître encore la sensibilité pour la détection d' E. coli sans être pénalisé par une dégradation de la spécificité. Exemple 3 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores d' E coli Différentes concentrations de Tryptophane (&0,3-0,6-0,9g/l) ainsi que du Cellobiose à 100mg/1 sont ajoutés au milieu CPS ID 3 (bioMérieux). Ces milieux comprennent du 6-Chloro-3-indolyl-beta-glucuronide à 250mg/1 et du 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucoside à 50mg/1. Ces milieux sont répartis à raison de 20m1 par boîte de Ta yl- Petri. Des micro-organismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur ces milieux par isolement serai-quantitatif de l0 1 d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 20e. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation. La coloration de ces colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous : Concentration en Tryptophane en g/1 0,3 0,6 0,9 Souches Colonies Indole Colonies Indole Colonies : Indole Escherichia coli 407 Rose Rose Rose Escherichia coli 067 Rose Rose Rose Escherichia coli 001 Incolore Faible Incolore : Positif Incolore : Positif Klebsiella pneumoniae 111 Turquoise Turquoise Turquoise Serratia marcescens 112 Turquoise Turquoise Turquoise Citrobacter freundii 031 Gris Gris ~ Gris Citrobacter freundii 009 Rose Rose Violet Streptococcus agalactiae 019 Mauve Mauve : Mauve Enterococcus faecalis 117 Turquoise Turquoise Turquoise Tableau 3 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores d' E coli Dans le tableau 3 ci-dessus, il ressort que même avec une concentration en Tryptophane de 0,3g/1, il est possible de détecter la production d'Indole par les souches d'E. coli, néanmoins la réaction est plus marquée à des concentrations supérieures. Exemple 4 : Apport du test Indole sur un milieu associant Cellobiose, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside et 5-Bromo- 4-chloro- 3indolyl-B- glucoside Au milieu CPS ID 3 (bioMérieux) duquel ont été enlevés les substrats enzymatiques synthétiques, sont ajoutés du 5-Bromo-6-chloro-3-indolylalpha-galactoside à 75mg/1, du 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside à 50mg/1, du 5- B romo- 4-chloro3- indolyl- B- glucoside à 50mg/1 et de 1'Isopropyl-thio-B-galactoside à 10mg/1. Ce milieu est réparti à raison de 20m1 par boîte de Petri. Des micro-organismes issus de la collection de la demanderesse ont été ensemencés sur ce milieu par isolement serai-quantitatif de l01a1 d'une suspension à 0,5 McFarland diluée au 2U. Les boîtes ont été incubées à 37 C pendant 24 heures. Les colonies formées ont été examinées visuellement après 24 heures d'incubation La coloration de ces colonies est notée. Un test Indole est pratiqué sur les colonies incolores à l'aide du réactif de James (bioMérieux). Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous : Souches Colonies ~ Indole Escherichia coli 407 Rouge Escherichia coli 003 Rouge Escherichia coli 051 Incolore ; Positif Klebsiella pneumoniae 043 Bleu Serratia marcescens 112 Turquoise Citrobacer freundii 025 Violet Streptococcus agalactiae 003 Turquoise Enterococcus faecalis 117 Turquoise Tableau 4 : Impact de la concentration en Tryptophane sur la détection des colonies incolores d' E coli Dans le tableau 4 ci-dessus, il ressort que dans un milieu associant 5Bromo-6-chloro-3-indolyl-alpha-galactoside, 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-B-galactoside et 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl B-glucoside la production d'Indole par les colonies incolores permet d'accroître la sensibilité pour la détection d' E. coli. REVENDICATIONS 1) Procédé de détection et/ou d'identification d' Escherichia coli (E. coli) dans un échantillon biologique selon lequel a) on ensemence l'échantillon biologique susceptible de contenir E. coli sur un milieu de détection comprenant du tryptophane et un substrat d'une enzyme A, exprimée par la majorité des E. coli pour obtenir des colonies de bactéries b) on détecte les colonies exprimant l'activité de l'enzyme A, et on les identifie comme étant E. coli c) on détecte les colonies n'exprimant pas l'activité de l'enzyme A, on réalise un test indole, et on identifie les colonies ayant un test indole positif comme étant E. coli. 2) Procédé selon la revendication 1 selon lequel la concentration en tryptophane est égale ou supérieure à 0,02g/1, préférentiellement égale ou supérieure à 0,4 g/l. 3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme B, non exprimé par la majorité des E. coli 4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un substrat d'une enzyme C, exprimé par la majorité des E. coli 5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 selon lequel l'enzyme A est choisie parmi la beta- glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, LAlanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta-galactosidase. 6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 selon lequel l'enzyme A est la beta- glucuronidase ou la beta- galactosidase. 7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6 selon lequel l'enzyme B est choisi parmi la beta-glucosidase, N-Acétyl hexosaminidase, estérase, sulfatase, beta-xylosidase, phospholipase, alpha-mannosidase, beta-mannosidase, betacellobiosidase, alpha-glucosidase, désaminase, oxydase, beta-Alanineaminopeptidase, élastase 8) Procédé selon la revendication 7 selon lequel l'enzyme B est la beta-glucosidase 9) Procédé selon l'une quelconque des revendication 4 à 8 selon lequel l'enzyme C est choisi parmi beta-glucuronidase, alpha-galactosidase, beta-ribosidase, phosphatase, LAlanine-aminopeptidase, L-Leucine-aminopeptidase, beta-galactosidase. 10) Procédé selon la revendication 4 selon lequel l'enzyme A est la betagalactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est l'alphagalactosidase 11) Procédé selon la revendication 4 selon lequel l'enzyme A est la betagalactosidase ; l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'enzyme C est la betaglucuronidase 12) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 selon lequel le milieu de détection comprend en outre, un inducteur de l'enzyme A, un inducteur de l'enzyme B et/ou un inducteur de l'enzyme C 13) Procédé selon la revendication 12 selon lequel l'enzyme A est la betaglucuronidase et l'inducteur de ladite enzyme A est un glucuronide, préférentiellement choisi parmi le Glucuronate, le Méthyl-beta-glucuronide. 14) Procédé selon la revendication 12 selon lequel l'enzyme A est la beta-galactosidase et l'inducteur de ladite enzyme A est un beta-galactoside, préférentiellement choisi parmi le Lactose, l'Isopropyl-beta-thio-galactoside..18 15) Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 a 14 selon lequel l'enzyme B est la beta-glucosidase, et l'inducteur de l'enzyme B est un beta-glucoside, préférentiellement choisi parmi la Méthyl-beta-glucose, le Cellobiose, cellotriose, trehalose, cellulose, amidon 16) Procédé selon la revendication 15 selon lequel l'inducteur de l'enzyme B est le Cellobiose 17) Milieu de détection comprenant du tryptophane, un substrat d'une enzyme betagalactosidase, un substrat d'une enzyme beta-glucosidase, et de le cellobiose. 18) Milieu de détection selon la revendication 17 comprenant en outre un substrat d'une enzyme alpha-galactosidase. 19) Utilisation d'un milieu tel que défini dans la revendication 17 ou 18 pour détecter E. coli