Brevet FR2909686A1 — publié le 20080613

Méthode d'identification phénotypique permettant de différencier Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 La présente invention concerne le domaine de l'identification bactérienne par différentiation phénotypique d'Acinetobacter baumanii et d'Acinetobacter espèce génomique 3 par auxanogramme. Les bactéries du genre Acinetobacter sont des bactéries apparaissant sous forme de cocco-bacilles Gram négatif, de croissance aérobie. Ces bactéries sont essentiellement, mais pas uniquement, des agents d'infections nosocomiales. Leur spectre va de la simple colonisation à des infections mettant en jeu le pronostic vital, notamment des pneumonies, des infections urinaires, des bactériémies et des méningites (van Dessel et al., 2004). Leur excellente capacité de survie dans l'environnement extérieur de l'hôpital et leur capacité à développer rapidement des résistances à la majorité des antibiotiques sont des facteurs majeurs de leur émergence comme agent d'infections nosocomiales, notamment dans les unités de soin intensif (BergogneBerezin and Towner, 1996). Bien que la plupart des espèces soient responsables d'infections chez l'homme, certaines espèces n'ont été isolées que dans l'environnement (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003). Alors que dans le genre Acinetobacter, 32 espèces ont été proposées (van Dessel et al., 2004), 24 espèces génomiques sont reconnues et seulement 17 espèces ont un nom validé (Nemec et al., 2003; Carr et al., 2003), à savoir les 24 espèces génomiques suivantes : A. calcoaceticus (espèce génomique 1), A. baumanii (espèce génomique2), espèce génomique 3, A. haemolyticus (espèce génomique 4), A. junii (espèce génomique 5), espèce génomique 6, A. johnsonii (espèce génomique 7), A. lwoffii (espèce génomique 8), espèce génomique 9, espèce génomique 10, espèce génomique 11, A. radioresistens (espèce génomique 12), espèce génomique 13, espèce génomique 16, A. schindleri, A. ursingii, A. baylyi, A. bouvetii, A. gerneri, A. grimontii, A. tandoii, A. tjernbergiae, A. towneri, A. parvus. 2909686 2 Les espèces génomiques 1 à 16 correspondent à des souches référencées dans GENEBANK, pour certaines (n 3, 6, 9, 10, 13 et 16) aucun nom ne leur ayant encore été attribué. Malheureusement, les membres de ce genre Acinetobacter ont une 5 très grande variabilité phénotypique intra spécifique et ne sont donc pas différentiables sur un plan phénotypique L'accroissement du nombre d'infections liées à ces agents a stimulé la recherche de méthodes d'analyse pour l'identification et la taxonomie de ces bactéries. Il a aussi été démontré que les méthodes d'identification basées sur les caractères 10 phénotypiques et le séquençage du gène de l'ARN 16S ribosomique par comparaison à l'hybridation DNA-DNA n'étaient pas valables. Ainsi, la recherche de méthodes d'identification rapide de ces bactéries est toujours d'actualité (Gerner-Smidt et al. 1991; Ibrahim et al. 1997; Rainey et al., 1994). Notamment, les techniques moléculaires basées sur le séquençage du 15 gène de l'ARN 16S ribosomique ne permettent pas de distinguer les espèces les plus proches, notamment en raison d'un manque de polymorphisme de ce gène dans ce genre. (Yamamoto and Harayama, 1998; Stackebrandt and Goebel, 1994). De plus, en raison de ce manque de polymorphisme, il y a nécessité de déterminer la séquence complète du 20 gène 16S ARNr si l'on désire pouvoir identifier une espèce. Cela impose de séquencer la totalité du gène qui fait environ 1600 paires de bases. La conséquence pratique est que le séquençage doit s'appuyer sur un minimum de 6 réactions de séquençage en plus de la réaction d'amplification pour avoir un résultat évaluable. Des tentatives de phylogénies ont été faites en 25 utilisant la comparaison des gènes gyrB (Yamamoto and Harayama, 1996; Yamamoto et al., 1999) et recA (Krawczyk et al., 2002) en alternative au gène de l'ARN 16S ribosomique (Ibrahim et al., 1997). Malheureusement, les séquences de ces gènes n'ont pas été déterminées sur les 10 espèces les plus récentes (Nemec et al., 2001, 2003; Carr et al., 2003). Dans un travail 30 récent, on a réussi à mettre au point un outil moléculaire d'identification permettant de différencier toutes les espèces d'Acinetobacter (La Scola et al, 2006 WO 2006/097636). L'originalité de cet outil est d'autoriser une 2909686 3 identification à l'aide d'une seule paire d'amorce et sur un fragment d'ADN court. Selon cette méthode de WO 2006/097636, des séquences d'acides nucléiques spécifiques de chaque espèce du genre Acinetobacter citée ci-dessus, tirées du gène rpoB ou encadrant ledit gène rpoB desdites bactéries 5 ont été décrits. Afin de valider cette méthode pour une utilisation clinique, on a testé cet outil sur 100 isolats cliniques obtenus dans les différents services de l'AP-HM (Assistance Publique des Hôpitaux de Marseille). Dans ce travail, les espèces A. baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3, encore appelé parfois species 3 ci-après abrégé g.sp. 3, représentent 80 10 (80%) des isolats. Les deux espèces Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 présentaient les séquences du gène rpoB complet, respectivement SEQ. ID. n 10 et SEQ. ID. n 11 décrites dans le listage de séquences annexé à WO 2006/097636, ainsi que les séquences présentant au moins 96% de similarité ou leurs séquences complémentaires. 15 Actuellement il n'existe aucun système phénotypique permettant de séparer ces deux dernières espèces alors qu'on sait par des analyses moléculaires qu'Acinetobacter espèce génomique 3 représente la deuxième espèce d'Acinetobacter isolée en pratique clinique (Chang et al 2005). Le but de la présente invention est donc de déterminer un test 20 phénotypique pour séparer les espèces Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3. Pour ce faire, les inventeurs ont testé de nombreux substrats et notamment différents de ceux initialement décrits par Bouvet et Grimont qui s'étaient révélés par la suite inefficaces pour séparer ces 2 espèces 25 (Gerner-Smidt et al., 1991).Après de nombreux tests d'assimilation de sources de carbone, les inventeurs ont pu identifier des combinaisons de 4, voire seulement de 2 ou 3 substrats qui permettent de séparer ces 2 espèces dans 100% des cas, dans des tests d'assimilation de source de carbone. L'intégration de ces substrats à des galeries d'identification biochimiques 30 permet ainsi de différencier ces 2 espèces qui représentent 80% des souches isolées chez l'homme. 2909686 4 Les inventeurs ont découvert et démontré selon la présente invention, qu'en réalisant un auxanogramme (technique dans laquelle on teste la capacité de la bactérie à pousser avec, pour seule source de carbone, un composé donné que l'on a ajouté dans un milieu de culture 5 sans carbone), il était possible de différencier A. baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 (définis sur la base des séquences du gène rpoB). Les composés carbonés qui permettent cette différentiation sur l'auxanogramme sont D(-) Ribose 10 - D(+) Xylose - Trigonelline En effet, en auxanogramme : le D(+) Xylose est positif pour A. baumanii dans 100% des cas et négatif pour Acinetobacter espèce génomique 3 dans 100% des cas, 15 - le D(-) Ribose est positif pour A. baumanii dans 100% des cas et négatif pour Acinetobacter espèce génomique 3 dans 80% des cas, - la Trigonelline est positive pour A. baumanii dans 84% des cas et négative pour Acinetobacter espèce génomique 3 dans 100% des cas. Avec ce système et en tenant compte des tests ayant une valeur 20 inférieure à 100%, on peut déterminer que A. baumanii est différencié d'Acinetobacter espèce génomique 3 quand, au moins, 2/3 composés sont positifs pour A. baumanii et au moins 2/3 composés sont négatifs pour Acinetobacter espèce génomique 3. Ainsi, D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline constituent des 25 marqueurs phénotypique permettant la différentiation entre A. baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 par auxanogramme. 2909686 5 D'autre part, en auxanogramme, le a D(+) Glucose est positif pour A. baumanii dans 92% des cas et négatif pour Acinetobacter espèce génomique 3 dans 40% des cas. Dès lors, en prenant en compte, en plus, le composé a D(+) Glucose comme composé carboné et en tenant compte des 5 tests ayant une valeur inférieure à 100%, on peut déterminer que A. baumanii est différencié d'Acinetobacter espèce génomique 3 quand, au moins, 3/4 composés sont positifs pour A. baumanii et, au moins, 2/4 composés sont négatifs pour Acinetobacter espèce génomique 3. Plus précisément, la présente invention fournit une méthode 10 d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 dans laquelle : - on réalise au moins deux tests de la capacité de ladite bactérie à croître sur un milieu de culture hydrominéral, de préférence comprenant 15 des vitamines et acides aminés, le dit milieu de culture étant inapte à faire croître la bactérie, dans lequel on rajoute un unique composé source de carbone et d'énergie choisi parmi les composés D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, chaque test étant réalisé avec un même dit milieu de culture et un dit composé source de carbone différent, et 20 - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins deux dits composés source de carbone et d'énergie, et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on n'observe aucune croissance de la bactérie avec au moins deux dits composés source de carbone et d'énergie. 25 En d'autres termes, on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on observe une croissance de la bactérie dans au moins 2 tests avec au moins deux dits composés différents pris séparément, et la présence d'une bactérie Acinetobacter génospecies 3 si on n'observe aucune croissance de la bactérie dans au moins deux tests. 2909686 6 Ce milieu de culture inapte à faire croître la bactérie, est aussi appelé milieu de culture sans carbone, c'est-à-dire ne comprenant pas de composé source de carbone en quantité suffisante pour faire croître la bactérie. Cette absence de croissance est vérifiée dans la cupule dans laquelle on 5 introduit le dit milieu de culture et on ne rajoute pas de dit composé source de carbone et d'énergie afin de contrôler qu'aucune croissance n'est visible. Le milieu de culture peut contenir des facteurs de croissance comme des acides aminés ou vitamines notamment des acides organiques mais en 10 quantité insuffisante pour assurer la croissance de la bactérie. Plus particulièrement, la méthode d'identification permet de déterminer : - la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins l'un des deux composés D(-) 15 Ribose et D(+) Xylose, et - la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on ne peut observer aucune croissance de la bactérie avec au moins l'un des deux composés Trigonelline, et D(+) Xylose. Dans un mode préféré de réalisation, la méthode de détermination de 20 ladite bactérie se fait à l'aide de deux tests, de la manière suivante : - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins les D(-) Ribose et D(+) Xylose, et - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on 25 peut observer une croissance de la bactérie avec au moins les deux composés D(-) Ribose et D(+) Xylose. De préférence encore, une méthode d'identification phénotypique selon l'invention est caractérisée en ce que : 2909686 7 - on réalise trois tests respectivement avec chacun desdits trois composés D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, et - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec les trois dits composés, 5 et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on n'observe aucune croissance de la bactérie avec les trois dits composés. Selon une variante de réalisation, une méthode d'identification phénotypique selon l'invention est caractérisée en ce que : - on réalise au moins quatre dits tests avec des dits composés source 10 de carbone et d'énergie différents, choisis parmi les composés D(-) Ribose, D(+) Xylose, Trigonelline et alpha D(+) Glucose, et - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins trois dits composés, et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si 15 n'on observe aucune croissance de la bactérie avec au moins deux dits composés. Selon un mode de réalisation avantageux, ledit milieu de culture inapte à faire croître une dite bactérie comprend de l'eau, des sels minéraux, des acides organiques comprenant de préférence des acides 20 aminés. Plus particulièrement, une méthode d'identification phénotypique selon l'invention, est caractérisée en ce que : - on réalise un dit test en déposant une suspension de ladite bactérie dans un dit milieu de culture, sur un support ,de préférence sous forme de 25 cupule,comprenant un dit composé source de carbone et d'énergie de préférence lyophilisé, et 2909686 8 - on observe une croissance quand le milieu de culture devient turbide et une absence de croissance si le milieu de culture reste translucide. La présente invention a donc également pour objet un kit 5 d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins trois supports, de préférence seulement trois, comprenant 10 chacun un dit composé différent choisi parmi les D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, et - un dit milieu de culture inapte à faire croître une dite bactérie. Plus particulièrement encore, un kit d'identification phénotypique selon l'invention comprend au moins quatre supports, de préférence 15 seulement quatre, comprenant chacun un dit composé différent choisi parmi les alpha D(+) Glucose, D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline. D'autre caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre, faite en référence à la figure unique annexée. 20 Cette figure est un dendogramme représentant les relations phylogéniques des différentes espèces d'Acinetobacter et des différents génotypes identifiés dans ce travail par la méthode du "neighbour-joining". L'arbre a été construit par l'alignement des séquences de la zone 1 du gène rpoB. 25 1. Matériels et méthodes. 1.1. Souches bactériennes. Un total de 100 bactéries isolées de divers prélèvements cliniques de patients hospitalisés dans l'un des 4 hôpitaux de l'Assistance Publique ù 2909686 9 Hôpitaux de Marseille (AP-HM) appartenant au genre Acinetobacter ont été étudiées. Ces bactéries ont été isolées dans le sang (47 souches), d'une poche d'autotransfusion (1 souche), d'os et de matériel prothétique intraarticulaire (44 souches), de liquide d'ascite (2 souches), de LCR (3 5 souches), de tissus mous (2 souches)], de prothèse vasculaire (1 souche). Ces isolats représentent l'ensemble des souches d'Acinetobacter isolées à l'AP-HM considérées comme étant en situation pathogène sur une période de 4 ans. 1.2. Identification moléculaire des souches 10 L'ensemble des souches ont été identifiées par séquençage partiel du gène rpoB (La Scola et al. 2006). De ce travail il avait été défini qu'à l'exception d'A. junii, A. grimontii, A. baylyi et Acinetobacter espèce génomique 11, toutes les espèces ont moins de 96% de similarité dans la zone 1 du gène rpoB. On a donc décidé que tous les isolats de ce travail 15 avec plus de 96% de similarité dans la zone 1 du gène rpoB étaient correctement identifiés à condition qu'il ne s'agisse pas de A. junii, A. grimontii, A. baylyi ou Acinetobacter genomic speciés 11. Pour les isolats avec une similarité moindre, la zone 2 de rpoB et les spacers intergéniques rplL-rpoB et rpoB-rpoC ont aussi été comparés puis séquencés. Les alignements multiples, le 20 calcul des pourcentages de similarité et la construction des arbres phylogéniques ont été réalisés comme décrit précédemment (La Scola et al., 2006). 1.3. Différenciation phénotypique d'A. baumanii et d'Acinetobacter espèce génomique 3. 25 Parmi les isolats cliniques isolés dans cette étude, 12 souches d'A. baumanii et 5 souches d'Acinetobater espèce génomique 3 ont été choisies pour la réalisation des tests phénotypiques. Les souches ont été choisies de façon à représenter tous les génotypes observés (Tableau 3). On a travaillé sur 12 souches d'A. baumanii et 5 souches 30 d'Acinetobacter espèce génomique 3, représentant respectivement 5 et 3 2909686 10 génotypes différents définis sur la base des séquences du gène rpoB, ainsi que sur une souche au positionnement douteux (génotype 10) proche sur le plan génomique d'une souche présente au catalogue de la CIP et classée dans cette collection dans l'espèce A. baumanii. Toutefois, dans notre 5 travail précédant, nous avions déjà insisté sur le positionnement atypique de cette souche (La Scola et al., 2006). La souche du génotype 10 est très proche de la souche 103655 et possède elle aussi le même positionnement ambiguë (cf. figure). L'analyse génotypique a été faite par réalisation de galeries biotype 10 100 (Biomérieux, Marcy l'étoile, France) à partir des bactéries mises en suspension dans le medium 1. Les différents composés sources de carbone testés,au nombre de 99, choisis parmi les composés listés au tableau 3, étaient inclus sous forme lyophilisée dans des supports en forme de cupules. 15 On réalise des suspensions de colonies bactériennes à partir d'une dizaine de colonies dans un milieu de suspension consistant dans de l'eau déminéralisée stérile (5 ml), jusqu'à atteindre une turbidité équivalent à 3 sur l'échelle standard de Mc Farland ou correspondant également à la diode n 27 sur un densitomètre ATB1550. 20 On mélange 2 ml de cette suspension bactérienne avec les 60 ml de milieu de culture. Après homogénéisation, on verse dudit mélange dans ladite cupule jusqu'à former une surface convexe à son bord supérieur que l'on laisse incuber à 30 C en condition aérobie. Le milieu de culture MEDIUM 1 avait la composition suivante Composition quantité par litre sulfate d'ammonium 2 g Agar 1,5 g 2909686 11 Tampon phosphate 0,1 M pH 7 Base minérale : Magnésium Mg++ 60 mg - Calcium Ca++ 18 mg - Zinc Zn++ 2,5 mg - Fer Fe++ 1,4 mg - Manganèse Mn++ 0,5 mg - Cuivre Cu++ 0,1 mg - Borate B4O7-- 0,07 mg - Cobalt Co++ 0,05 mg - Molybdate MoO4 0,15 mg Facteurs de croissance : - Acide para aminobenzoïque 0,09 mg - Acide nicotinique 0,09 mg - Sel de calcium d'acide 0,09 mg D-Pantothénique - Thiamine 0,0018 mg - L-Alanine 18 mg -Acide L-Aspartic 18 mg - L-Cystéine 18 mg - L-Histidine 18 mg 2909686 12 Les lectures ont été réalisées sur 6 jours à J2, J4 et J6 après incubation à 30 C. Dans ces galeries sont testés en auxanogramme avec les 99 sources de carbone répertoriées dans le tableau 3. Le substrat source de carbone est considéré comme positif, c'est-à- 5 dire que la bactérie croît en présence dudit substrat, lorsque le milieu devient turbide. Le substrat est considéré comme négatif, c'est-à-dire que la bactérie ne croît pas en présence dudit substrat, lorsque ledit milieu reste transparent 10 Dans certains cas, la lecture d'interprétation était douteuse ("W" dans les tableaux 3 et 4), le milieu n'étant que très légèrement trouble. Certaines cupules requièrent toutefois une lecture différente: pour l'esculine on recherche l'apparition d'un pigment brun/noir, pour l'Hydroxyquinoline (3-glucuronide, on recherche l'apparition de points 15 noirs ou d'un dépôt noir, pour le L-tryptophane on recherche une coloration orange et pour la L-histidine, on recherche une coloration rose ou violette au fond de la cupule. - L-Méthionine L-Phénylalanine - L-Proline - L-Sérine -L-Thréonine - L- Tryptophane L-Tyrosine - L-Valine 18 mg 18 mg 18 mg 18 mg 18 mg 18 mg 18 mg 18 mg 2909686 2. Résultats La détermination des zones 1 des 100 isolats a permis d'obtenir 15 types de séquences différentes que l'on a défini comme des génotypes. Parmi ces génotypes, 14 ont une similarité > 96% avec la souche type d'une 5 espèce connue d'Acinetobacter (Tableau 1). Ainsi, la zone 1 a permis d'identifier de façon certaine 99/100 isolats cliniques. Le génotype 10 qui a une similarité 95% avec la souche type d' A. baumanii a bénéficié de la détermination de sa zone 2 et des spacers rp/L-rpoB et rpoB-rpoC. L'analyse des séquences et la construction de l'arbre 10 phylogénique montrent que cette souche a une position atypique et qu'elle ne peut être classée avec certitude. La souche la plus proche est une souche d' A. baumanii (souche CIP 103655) dont l'atypie avait déjà été relevée dans notre précédant travail (La Scola et al. 2006). Au total, les souches d'A. baumanii et les souches d'Acinetobater espèce génomique 3 représentent 80% 15 des souches isolées en pratique clinique. La réalisation des auxanogrammes permet de constater que 4 composés carbonés sont utilisés de façons différentes par les souches testées, il s'agit du a-D(+) Glucose; du D(-) Ribose, du D(+) Xylose et de la Trigonelline (Tableau 3). En tenant compte des tests ayant une valeur 20 inférieure à 100%, on peut conclure qu'A. baumanii est différencié d'Acinetobacter espèce génomique 3 quand, au moins 3/4 composés sont positifs pour A. baumanii et, au moins 2/4 composés sont négatifs pour Acinetobacter espèce génomique 3. En ne prenant en compte que les trois composés D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, on peut conclure qu'A. 25 baumanii est différencié d' Acinetobacter espèce génomique 3 quand, au moins, 2/3 composés sont positifs pour A. baumanii , notamment D(-) Ribose et D(+) Xylose et, au moins 2/3 composés sont négatifs pour Acinetobacter espèce génomique 3, dont au moins D(+) Xylose et Trigonelline. 13 2909686 14 Le tableau 1 représente la répartition des 100 isolats cliniques identifiés par la détermination de la séquence de la zone 1 du gène rpoB (* cette valeur est celle observée avec la souche type de l'espèce concernée). Le tableau 2 représente une tentative d'identification de la souche 5 correspondant au génotype 10. non identifiée par la seule zone 1 pour laquelle ont aussi été réalisées les séquences de la zone 2 et des 2 spacers flanquant le gène rpoB (* la première ligne est la valeur observée avec la souche type de l'espèce concernée, la seconde ligne avec la souche la plus proche). 10 Le tableau 3 représente les différents substrats sources de carbone testés sur les différentes souches par un galerie biotype 100 de BIOMERIEUX."W" symbolise une croissance douteuse trop modérée. Aucune souche ne présentait de croissance avec les substrats suivants: 15 B-D(+) Fructose; D(+) Raffinose; D(+) Galactose; D(+) Trehalose; D(+) Mannose; L(+) Sorbose; a-D(+) Melibiose; D(+) Raffinose; Maltose; oc-Lactose; Lactulose; I-0-Methyl-(3-galactopyranoside; D(+) Cellobiose; BGentiobiose; 1-0-Methyl-Ç D-glucopyranoside; Esculin; Palatinose; a-LRhamnose; a-L(-) Fucose; D(+) Melezitose; D(+) Arabitol; L(-) Arabitol; 20 Xylitol; Dulcitol; D-Tagatose; Glycerol; Myo-Inositol; D-Mannitol; Maltitol; D(+) Turanose; D-Sorbitol; Adonitol; Hydroxyquinoline-(3-glucuronide; D-Lyxose; i-Erythritol; 1-0-Methyl-a-D-glucopyranoside; 3-0-Methyl-D-glucopyranoside; D(-) Tartrate; Meso-Tartrate; 2-Keto-D-Gluconate; 5-Keto-D-Gluconate; L-Tryptophan; N-Aetyl-D-Glucosamine; Gentisate; m- 25 Hydroxybenzoate (= 3-Hydroxybenzoate); m-Coumarate; Betain; L-Histidine; DL-cxAminonvalerate (= 5-Aminovalerate); Tryptamine; DGlucosamine; Itaconate; L-Serine Le tableau 4 récapitule les résultats pour les 4 composés alpha D(+) Glucose, D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline tirés du tableau 3. Tableau 1: Répartition des 100 isolats cliniques identifiés par la détermination de la séquence de la zone 1 du gène rpoB (* cette valeur est celle observée avec la souche type de l'espèce concernée). Isolats Génotypes Espèce Similarité* (n=92) 10 A. haemolyticus 99 44 97 3 97 1 A. baumannii 97 3 98 1 98 26 Acinetobacter espèce génomique 3 98 A. shcindleri 3 99 A. hvofi 1 98 1 A. baumannii 95 génotype 1 génotype 2 génotype 3 génotype 4 génotype 5 génotype 6 génotype 7 génotype 8 génotype 9 genotype 10 genotype 11 genotype 12 genotype 13 genotype 14 genotype 15 1 Acinetobacter espèce génomique 3 97 1 Acinetobacter espèce génomique 3 97 2 Acinetobacter espèce génomique 9 97 1 Acinetobacter espèce génomique 9 97 2 A. schindleri 97 Tableau 2 : Tentative d'identification de la souche du génotype 10 non identifiée par la seule zone 1 pour laquelle ont aussi été réalisées les séquences de la zone 2 et des 2 spacers flanquant du gène rpoB (* la première ligne est la valeur observée avec la souche type de l'espèce concernée, la seconde ligne avec la souche la plus proche). similarité Génotypes Nombre zonel / zone 2 / Espèce d'isolats rpob-rpoc / rplL-rpoB * genotype 10 1 95 / 94 / 97 / 96 A. baumanii 70.34 T / A. baumanii 70.34'/ A. baumanii 70.34'/ A. baumanii 70.34 T 97 / 97 / 98 / 96 A. baumanii 103655 / A e.pècegénomique 9 / A baumanii 103655/ A baumanii 103655 2909686 18 GENOMIC SPECIES 3 GENOTYPE 12 = . + + + + + + + + + + GENOTYPE 11 a` + + + + + + + + + + + A. BA UMANNII / GENOTYPE 10 vr ' + + + + + + + ATYPIQUE GENOMIC SPECIES 3 GENOTYPE 7 - +++++++++ ;O 3 + + + + + + + + + + N + + + + 3 + + + + GENOTYPE 6 + + + + + + + + + + GENOTYPE 5 + + + + + + + + + + + + + + + v + + + 3 + + + + + + + + + + + + A. BAUMANNII + + + 3 + + + + + + + + + + + + GENOTYPE 4 + + + + + + + + + + + GENOTYPE 3 + + + + + + + + + + + + + 3 oo + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + GENOTYPE 2 + 3 + + + + + + + + + + + + tr) + + + + + + + + 3 + + + + + M + + + + + + + + + + + + + + vii O u b1) Q) Q o a) a) Q) 'ù,,Ti c O U Q) Q) O à (n b o c) U 0 ^ ^ Q oc co ù co O. o cçi o cà + - C Ça Il i co ^ ^ EL- . sa, + -}- c o ê cC Zt ,e a) O + --cd V] oos~o.a c~2~Q -. N en ' 'f r Oô OO O :--N M ~t [~ 2909686 19 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 + 3+I++ , + + ++++++ + ++++++++ + + + + + + + + + + 3 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + + ++++++ + + + + 3++++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + I3 + + + 3 + 3 3 + + + + + + + + + +++++ ++ + '13+++ 3+ 33 + ++++++++ +++++ ++I + 3+++ 3+ 33 + +++++II+++ +++1++ É + + ++++++ + +++++'+++ 3 +++1++ ++ + ++'.;++++ + ++I++II++++ + 3 +++++ ++ + ++++++ + ++I+'III+++++ 1 + I ~~ I +++++ ++ + ++II++++ I + +++I+I++j+ I ++++++ + ++,++++ + ++++++++ I +++++, ++ + ++ 3+++ + + + + + + ++ +++++ ++ + i + + + + + + ++++I1+++j3 i + ++++1+ ++1 + +++~+++ + ++3+j+++ + o a) ~; a, III CII a) ~ 71- u I a) a) M ~ c I N a) o a) ~ a; c`a E Il o i-2 a) a) a _ 0~ a) cyC bA >, â Q i x o o p o N A '5 b _ro .I y i a ~sO >, ]L aa a, WWU.Hffl o -,:tZL1UUv)wc7QwCiZ '5' >2.1 C7w o1rn -a -a2a-a 00 a, O --N M V v1 VD r'-- 00 O -- N M 7 v) 00 D\ O -- N c1 V• en \D r•ûr ^-N N N N N N N N N N en M c~ M M M c1 M M c~ d- d- d- - d- V V 2909686 20 GENOTYPE 12 GENOMIC SPECIES 3 GENOTYPE Il rn + A. BAU.EIANNII / GENOTYPE 10 + + ATYPIQUE GENOMIC SPECIES 3 GENOTYPE 7 3 3 N i GENOTYPE 6 + + + + + + + GENOTYPE 5 + + + + + + + + GENOTYPE 4 + + + + + + + A. BAUMANNII GENOTYPE 3 00 + + + + 3 + + + + + + + GENOTYPE 2 ,o + + + + + + + + + + + + 3.. V) V) O N c/D ô O H ~C C + .e t3 O t~ F~ 00 O~ O V v 2909686 21 BIBLIOGRAPHIE Bergogne-Berezin, E., and K. J. Towner. 1996.Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin. Microbiol. Rev. 9:148-165. 5 Carr, E. L., P. Kampfer, B. K. Patel, V. Gurtler, and R. J. Seviour. 2003. Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:953-963. Chang, H.S., Y.F. Wei, L. Dijkshoorn, M. Vaneechoutte, C.T. Tang, and T.S. Chang. 2005. Species level identification of isolates of the 10 Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumanii complex by sequence analysis of the 16S-23S rRNA gene spacer region. J. Clin. Microbiol. 43:1632-1639. Gerner-Smidt, P., I. Tjernberg, and J. Ursing. 1991. Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species. J. Clin. Microbiol. 29:277-282. 15 Ibrahim, A., P. Gerner-Smidt, and W. Liesack. 1997. Phylogenetic relationship of the twenty-one DNA groups of the genus Acinetobacter as revealed by 16S ribosomal DNA sequence analysis. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:837-841. Krawczyk, B., K. Lewandowski, and J. Kur. 2002. Comparative 20 studies of the Acinetobacter genus and the species identification method based on the recA séquences. Mol. Cell Probes. 16:1-11. La Scola , B., V.A.K. Gundi, A. Khamis, D. Raoult. 2006. Sequencing of the rpoB gene and flanking spacers for molecular identification of Acinetobacter species. J Clin Microbiol. 44:827-832. 25 Nemec, A., L. Dijkshoorn, I. Cleenwerck, T. De Baere, D. Janssens, T. J. Van Der Reijden, P. Jezek, and M. Vaneechoutte. 2003. Acinetobacter parvus sp. nov., a small-colony-forming species isolated from human clinical specimens. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:1563-1567. 2909686 22 Nemec, A., T. De Baere, I. Tjernberg, M. Vaneechoutte, T. J. van der Reijden, and L. Dijkshoorn. 2001. Acinetobacter ursingii sp. nov. and Acinetobacter schindleri sp. nov., isolated from human clinical specimens. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:1891-1899. 5 Rainey, F. A., E. Lang, and E. Stackebrandt. 1994. The phylogenetic structure of the genus Acinetobacter. FEMS Microbiol. Lett. 124:349-353. Stackebrandt, E., and B. M. Goebel. 1994. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the 10 present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849. Van Dessel, H., L. Dijkshoorn, T. Van Der Reijden, N. Bakker, A. Paauw, P. Van Den Broek, J. Verhoef, and S. Brisse. 2004. Identification of a new geographically widespread multiresistant 15 Acinetobacter baumannii clone from European hospitals. Res. Microbiol. 155:105-112 Yamamoto, S., and S. Harayama. 1996. Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nucleotide sequences of gyrB genes and on the amino acid sequences of their products. Int. J. Syst. Bacteriol. 20 46:506-511. Yamamoto, S., and S. Harayama. 1998. Phylogenetic relationships of Pseudomonas putida strains deduced from the nucleotide sequences of gyrB, rpoD and 16S rRNA genes. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:813-819. Yamamoto, S., P. J. Bouvet, and S. Harayama. 1999. 25 Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:87-95. REVENDICATIONS 1. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 dans laquelle : - on réalise au moins deux tests de la capacité de ladite bactérie à croître sur un milieu de culture hydrominéral, de préférence comprenant des vitamines et acides aminés, le dit milieu de culture étant inapte à faire croître la dite bactérie, milieu de culture dans lequel on rajoute un unique composé source de carbone et d'énergie choisi parmi les composés D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, chaque test étant réalisé avec un même dit milieu de culture et un dit composé source de carbone différent, et - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins deux dits composés source de carbone et d'énergie, et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on observe aucune croissance de la bactérie avec au moins deux dits composés source de carbone et d'énergie. 2. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins l'un des deux composés D(-) Ribose et D(+) Xylose. 3 Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins les D(-) Ribose et D(+) Xylose. 2909686 24 4. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce 5 génomique 3 si on ne peut observer aucune croissance de la bactérie avec au moins l'un des deux composés Trigonelline, et D(+) Xylose. 5. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon la revendication 4, caractérisée en 10 ce que l'on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins les deux composés D(-) Ribose et D(+) Xylose. 6. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et 15 Acinetobacter espèce génomique 3 selon la revendication 1, caractérisée en ce que - on réalise trois tests respectivement avec chacun desdits trois composés D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, et - on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si 20 on peut observer une croissance de la bactérie avec les trois dits composés, et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on n'observe aucune croissance de la bactérie avec les trois dits composés. 7. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et 25 Acinetobacter espèce génomique 3 selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que - on réalise au moins quatre dits tests avec des dits composés source de carbone et d'énergie différents, choisis parmi les composés D(-) Ribose, D(+) Xylose, Trigonelline et alpha D(+) Glucose, et 2909686 25 on détermine la présence d'une bactérie Acinetobacter baumanii si on peut observer une croissance de la bactérie avec au moins trois dits composés, et la présence d'une bactérie Acinetobacter espèce génomique 3 si on n'observe aucune croissance de la bactérie avec au moins deux dits 5 composés. 8. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit milieu de culture inapte à faire croître une dite 10 bactérie comprend de l'eau, des sels minéraux, et des acides organiques comprenant de préférence des acides aminés. 9. Méthode d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon l'une des revendications 1 à 8, 15 caractérisée en ce que - on réalise un dit test en déposant une suspension de dite bactérie dans un dit milieu de culture sur un support , de préférence sous forme de cupule, comprenant un dit composé source de carbone et d'énergie de préférence lyophilisé, et 20 - on observe une croissance quand le milieu de culture devient turbide et une absence de croissance si le milieu de culture reste translucide. 10. Kit d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et 25 Acinetobacter espèce génomique 3 pour la mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 8 ou 9, caracterise en ce qu'il comprend - au moins trois dits supports, de préférence seulement trois, comprenant chacun un dit composé différent choisi parmi les D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, et 2909686 26 - un dit milieu de culture inapte à faire croître une dite bactérie. 11. Kit d'identification phénotypique d'une bactérie du genre Acinetobacter d'une des deux espèces génomiques Acinetobacter baumanii et Acinetobacter espèce génomique 3 selon une méthode selon la revendication 5 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il comprend - au moins quatre dits supports, de préférence seulement quatre, comprenant chacun un dit composé différent choisi parmi les alpha D(+) Glucose, D(-) Ribose, D(+) Xylose et Trigonelline, et - un dit milieu de culture inapte à faire croître une dite bactérie. 10