Brevet FR2908660A1 — publié le 20080523

Composition terpénique anti-microorganisme La présente invention se rapporte à une composition terpénique antimicroorganisme et à son utilisation notamment contre le VIH. Les terpènes et en particulier le camphre et ses dérivés ont largement été utilisés en médecine et ils étaient réputés actif contre tous les maux. Le camphre était employé généralement en application externe locale comme antiseptique ou anesthésique. Le camphre est aussi employé en usage 'interne comme tonicardiaque. Cependant, il est très io peu soluble dans l'eau ce qui limite son utilisation. Le camphre est généralement obtenu à partir de l'alpha-pinène contenu dans l'essence de térébenthine, laquelle est obtenue à partir du suc résineux qui s'écoule du pin maritime. Ainsi, on transforme l'alphapinène en camphre en passant par différents intermédiaires, et 15 notamment, le chlorure de bornyl, le camphène et l'ester organique de l'isobornéol. Par ailleurs, des dérivés de substitution du camphre associés au mercure ont aussi largement été utilisés dans le passé comme diurétiques. 20 Cependant, compte tenu de leur faible solubilité dans l'eau, l'utilisation des terpènes et en particulier les dérivés du camphre ou de ses intermédiaires de synthèse, reste limitée en médecine humaine ou animale. En outre, un certain nombre de ses dérivés s'avère être cytotoxique, 25 et notamment les dérivés cétoniques. Toutefois, la chimie des terpènes est ancienne et bien connue maintenant et par conséquent, les coûts d'obtention de ces molécules biologiquement actives et aux vertus thérapeutiques sont relativement faibles. 30 Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir une composition terpénique utilisable comme agent anti-microorganisme et qui puisse être administrée chez l'homme 2908660 2 aisément. Un autre but, est de fournir une composition terpénique dont l'efficacité du principe actif soit améliorée. Dans le but de résoudre ce problème, la présente invention propose, selon un premier aspect, une composition terpénique pour utilisation 5 comme agent anti-microorganisme. Selon l'invention, la composition terpénique comprend : un composé terpénique cyclique obtenu à partir d'un terpène de formule générique (C5 H8)n, n étant compris entre 2 et 5 et, une substance organique formant vecteur, associée audit composé terpénique cyclique. to Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans l'association d'un composé terpénique cyclique qui présente des propriétés anti-microorganisme, à une substance organique permettant de véhiculer le composé terpénique actif vers les micro-organismes. En outre, la substance organique permet éventuellement de transférer le composé 15 terpénique à travers le micro-organisme lui-même pour atteindre une cible déterminée, par exemple son matériel génétique, où le composé terpénique peut provoquer sa destruction. Préférentiellement, ledit composé terpénique cyclique associé à ladite substance organique est lié à un cation métallique. Le cation 20 métallique promeut alors les propriétés anti-micro-organismes de ladite composition. Avantageusement, le composé terpénique cyclique est obtenu à partir d'un monoterpène, pour lequel n=2, et dont l'activité anti-microorganisme est supérieure à celle des autres terpènes. Préférentiellement, 25 le monoterpène conduit à un composé terpénique présentant un seul cycle à cinq atomes de carbone. Par exemple, le composé terpénique est obtenu par oxydation du camphre, lui-même issu de la transformation de l'alpha-pinène comme indiqué ci-dessus. 30 Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, le composé terpénique présente au moins une fonction acide 3 2908660 carboxylique et de préférence deux. En outre, ledit composé terpénique forme des liaisons esters avec ladite substance organique. Avantageusement, le composé terpénique est l'acide camphorique. En outre, le cation métallique associé au composé terpénique est 5 choisi parmi les métaux de la troisième et quatrième période des éléments du tableau périodique des éléments de Mendeleïev. De préférence, le cation métallique est choisi parmi les éléments de l'ensemble comprenant le zinc, le cuivre et le magnésium ou encore le nickel. Cependant, d'autres métaux de la cinquième et sixième période du 10 tableau périodique précité, comme l'étain ou le mercure, peuvent également former un composé stable. De plus, la substance organique formant vecteur et qui permet de véhiculer le composé terpénique à travers les tissus et le conduire à sa cible potentielle, le micro-organisme à détruire, est choisie parmi, les 15 glucides, de préférence les oses et osides et en particulier les gluconates, les composés aminoacides, les vitamines, les acides nucléiques ou encore les composés benzéniques. Sont inclus dans ces composés benzéniques, notamment l'acide salicylique ou para-amino-salicylique. Parmi les vitamines, on retiendra notamment, l'acide folique, l'acide 20 para-amino-benzoïque ou encore l'acide ascorbique. On formera ainsi par exemple, l'ascorbate de bornyle ou l'ascorbo-camphorate de zinc. Selon un autre aspect, l'invention propose l'utilisation d'une composition terpénique telle que décrite ci-dessus, pour la réalisation d'un médicament destiné à vaincre le VIH ou bien comme agent anti-microbien 25 à usage externe. Ainsi, un tel médicament est susceptible d'être produit à un coût très avantageux, puisque la composition terpénique précitée peut elle-même être produite à faible coût. La composition terpénique en vue de la préparation d'un médicament, peut être diluée dans une solution aqueuse ou dans un 30 mélange eau/alcool et être conditionnée avec un excipient physiologiquement acceptable, sous la forme d'un gel pour une application externe ou sous la forme d'une solution injectable. Cependant, 2908660 4 la composition terpénique est aussi susceptible d'être conditionnée en poudre pour pouvoir être administrée oralement. D'une façon générale, la composition terpénique précitée, peut servir à la préparation d'agents antiseptiques, microbicides ou désinfectants, 5 que ce soit pour le traitement des pathologies humaines et animales ou végétales ou bien encore dans les applications sanitaires. Selon un autre aspect, la l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition terpénique selon laquelle on associe une substance organique formant vecteur à un composé terpénique cyclique io obtenu à partir d'un terpène de formule générique (C5 H8)n, n étant compris entre 2. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif. 15 Une particularité de l'invention, réside dans la mise en oeuvre d'un composé terpénique cyclique issu d'un terpène de formule générique (C5 H8)n, où n est compris entre 2 et 5 avec un cation métallique et une substance organique formant un vecteur. Dans les exemples ci-dessous, les compositions terpéniques selon 20 l'invention ont été préparées proportionnellement avec des quantités expérimentales qui permettent de montrer leurs effets et leur efficacité. Toutefois, l'extrapolation de ces quantités expérimentales à des quantités industrielles ne soulève aucune difficulté. Exemple 1 25 Une première préparation à base d'acide ascorbique, d'acide camphorique et de zinc a été préparée dans des conditions ambiantes de température et de pression, soit sensiblement 298,15 K et 105 Pa. Néanmoins, dans certaines phases les mélanges sont légèrement chauffés et agités. 30 Selon ce premier exemple, on prépare à partir du camphre obtenu selon un procédé bien connu utilisant comme matière première le pinène, l'acide camphorique de formule (I) : 2908660 5 et ce, par oxydation du camphre. Ainsi, 200 mg d'acide camphorique sont solubilisés dans 1 g d'éthanol à 90 . Ensuite, 0,5 g d'eau ultra pure est additionnée au 5 mélange. Puis, le mélange d'acide camphorique est associé à un oxyde de zinc en solution. Pour cela, 81,3 mg d'oxyde de zinc sont mélangés à 1 g d'eau ultra pure qui après agitation forment une solution laiteuse. Le mélange d'acide carphorique précité est lentement versé dans la solution io laiteuse. L'ensemble est agité modérément et par intermittence. En outre, entre chaque phase d'agitation, il est légèrement chauffé, par exemple à l'étuve, afin d'accélérer la réaction. Il se forme alors un précipité, le camphorate de zinc, qui est récupéré par extraction du solvant, soit par chauffage soit par 15 lyophilisation. Ensuite, 265,3 mg de camphorate de zinc ainsi obtenu, sont mélangés à une solution de 100 g d'eau pure contenant 176 mg d'acide ascorbique de formule II : (I) HO I HO,C/H H2 HO OH (II) 20 De préférence, le mélange s'effectue à une température inférieure à 298,15 K. La préparation ainsi obtenue est modérément agitée et est gardée à l'abri de la lumière afin d'éviter l'oxydation de l'acide ascorbique. Durant l'agitation, le camphorate de zinc se dissout pour former alors en solution l'ascorboùcamphorate de zinc. Ce dernier est récupérable 2908660 6 sous forme de poudre par lyophilisation. Une récupération par chauffage et évaporation du solvant est à proscrire pour éviter l'oxydation de l'acide ascorbique. Ainsi qu'on l'expliquera ci-après, cette poudre en solution, permet de 5 réaliser une composition terpénique permettant de détruire les micro-organismes et les virus, notamment le VIH. Une deuxième préparation est réalisée selon un exemple 2, avec les mêmes produits de base, et selon le même protocole excepté la quantité d'acide ascorbique. En effet, dans cet exemple 352 mg d'acide Io ascorbique sont dissous dans 100 g d'eau ultra pure. Ainsi, la deuxième composition comprend non pas une, mais deux moles d'acide ascorbique pour une mole d'acide camphorique. Une troisième préparation est réalisée selon un exemple 3, également avec les mêmes produits de base et selon le même protocole, 15 hormis la quantité d'acide ascorbique qui est alors de 704 mg. La troisième composition comprend alors quatre moles d'acide ascorbique pour une mole d'acide camphorique. Par ailleurs, une quatrième préparation, selon un exemple 4 est préparée non plus avec de l'acide ascorbique mais à partir de l'acide 20 cinnamique de formule : O(III) Exemple 4 On solubilise dans 1 g d'éthanol, 148 mg d'acide cinnamique et on y ajoute 500 mg d'eau ultra pure. On incorpore dans la solution ainsi 25 réalisée, 132,65 mg de camphorate de zinc obtenu selon le procédé ci-dessus. Après dissolution, il se forme un précipité que l'on récupère par extraction du solvant soit par chauffage ou alors par lyophilisation. Sont ainsi résumées dans le tableau I ci-dessous, les proportions molaires des constituants de base des quatre préparations ci-dessus 2908660 7 obtenues dans les quatre exemples correspondants et à base desquels sont réalisées des compositions terpéniques conformes à l'invention. Tableau I Préparations Acide Acide Acide Oxyde de camphorique ascorbique cinnamique zinc ZnO Première 200 mg 176 mg 81,3 mg Deuxième 200 mg 352 mg 81,3 mg Troisième 200 mg 704 mg 81,3 mg Quatrième 100 mg 148 mg 40,65 mg 5 Afin de réaliser des tests, de cytotoxicité et d'activité inhibitrice d'infection, trois types cellulaires et deux souches virales ont été utilisées. II s'agit d'une souche de laboratoires HIV-1 NDK (X4-tropique) qui a été amplifiée par des lymphocytes provenant de donneurs sains et d'une ro souche primaire HIV-1 Bal (R5-tropique) qui a été amplifiée par des macrophages. S'agissant des types cellulaires, des macrophages et des cellules dendritiques ont été obtenues à partir de cellules sanguines mononucléés de sang périphérique. En outre des lymphocytes ont été fournies. 15 La cytotoxicité des compositions terpéniques est contrôlée grâce au test au MTT de la société Sigma. Les macrophages ou les cellules dendritiques précitées sont alors cultivées puis traitées avec chacune des compositions, et le réactif MTT est alors ajouté. Ce dernier forme alors des cristaux avec les cellules vivantes hautement métaboliques. 20 L'absorbance à 490 nm des cristaux dissous correspond alors au nombre de cellules vivantes. Aussi, par comparaison avec des macrophages et des cellules dendritiques cultivées mais non traitées, on obtient un pourcentage de survie révélant la toxicité des compositions terpéniques. Les résultats montrent que les dilutions au 10 000e, au 500e et au 25 100e des quatre composés précités ne sont pas toxiques pour les cellules étudiées. 25 2908660 8 S'agissant de l'activité inhibitrice, les macrophages ou les cellules dendritiques sont incubées avec des particules virales des souches précitées, HIV-1NOK (X4-tropique) ou HIV-1 Ba, (R5-tropique), en présence et en l'absence des compositions terpéniques. Les cellules sont ensuite 5 lavées puis remisent en culture et enfin centrifugées. Les surnageant sont alors récupérés et les particules virales sont lysées afin de mesurer la concentration d'une protéine virale grâce au test ELISA. De la sorte, l'activité inhibitrice des compositions terpéniques est évaluée par comparaison entre les cellules infectées non traitées et les cellules io infectées traitées. En outre, des tests et de transfert du virus, des cellules dendritiques vers les lymphocytes T autologues, c'est-à-dire provenant de mêmes cellules souches, ont été réalisés. Pour cela, des cellules dendritiques sont transférées et incubées 15 avec chacune des compositions terpéniques et le virus. Ensuite, après lavage, des lymphocytes T autologues sont ajoutées dans un rapport de une cellule dendritique pour cinq lymphocytes T. Puis, la concentration en protéines virales du type précité, est évaluée par le test ELISA. Ensuite, a été évaluée l'inhibition de l'infection des macrophages. 20 Ces derniers étant des réservoirs potentiels du VIH, il s'agit de mesurer la capacité de la composition terpénique a empêché l'infection des macrophages. Tableau Il : Test d'inhibition de l'infection des macrophages Dilution au 200e HIV-1 NDK (X4-tropique) HIV-1 Ba, (R5-tropique) Première 56,9 +/- 5% 48,1 +/- 4% Deuxième 61,5 +/- 3% 58,5 +1- 4% Troisième > 95% > 95% Quatrième > 90% > 90% 2908660 9 Il s'avère ici, que la composition terpénique obtenue à partir de la troisième préparation, et diluée au 200e, inhibe de plus de 95 % l'infection des macrophages par des souches du groupe tropique X4 et R5. Par ailleurs, pour les troisième et quatrième compositions obtenues 5 respectivement à partir des troisième et quatrième préparations, et ce diluées, non plus au 200e mais au 2000e, on obtient les mêmes résultats De plus, des tests ont été conduits sur l'inhibition de l'infection des cellules dendritiques, car ces cellules sont impliquées dans la transmission du VIH au niveau de la muqueuse. Tableau III : Test d'inhibition de l'infection des cellules dendritiques Dilution au 200e HIV-1 NDK (X4-tropique) HIV-1 Bal (R5-tropique) Première 32,4 +/- 3% 75,7 +/- 5% Deuxième 31,5 +/- 2% 73,4 +/- 1 Troisième > 95% > 95% Quatrième 0% 0% Là encore, la composition terpénique obtenus à partir du troisième composé, et diluée au 200e inhibe à plus de 95 % l'infection des cellules dendritiques par les souches X4 et R5. On notera ici, que la troisième composition obtenue à partir de la troisième préparation et diluée au 2000e permet également d'obtenir les mêmes résultats. Les cellules dendritiques expriment à leur surface une protéine d'adhésion DC-SIGN formant un récepteur viral capable de capter le VIH et de faciliter l'infection de cellules permissives par un mécanisme dit de trans-infection. En effet, le récepteur DC-SIGN peut interagir avec l'enveloppe du VIH et retenir le virion dans un état infectieux pour le transmettre ensuite aux lymphocytes T permissif au niveau des ganglions lymphatiques adjacents. 2908660 10 Tableau IV : Test d'inhibition du transfert des cellules dendritiques aux lymphocytes T Dilution au 200e HIV-1 NDK (X4-tropique) HIV-1 Bal (R5-tropique) Premier 83,1 +/- 3% 82,3 +/- 7% Deuxième 65,4 +/- 3% 81,3 +/- 5% Troisième > 95% > 95% Quatrième 0% 0% Ainsi, une dilution au 200e de la composition terpénique provenant du troisième composé, provoque alors une inhibition de l'infection des cellules dendritiques par les souches R5 et X4 tropiques de plus de 95 %. io Là encore, la troisième composition obtenue à partir de la troisième préparation et diluée au 2000e conduit aux mêmes résultats. En conséquence, des compositions terpéniques réalisées à base des compositions précitées, permettent la préparation de médicaments à usage interne ou externe pour lutter contre le VIH. On remarquera que la 15 composition terpénique la plus efficace et qui présente la plus grande activité dans tous les tests de précitée, est la composition issue de la troisième préparation. Aussi, le rôle de l'acide ascorbique en tant que vecteur est déterminant. On notera également que cette composition terpénique issue de la 20 troisième préparation, présente une activité détergente vis-à-vis des souches X4, lorsqu'elle est diluée au centième. S'agissant d'applications externes, les compositions terpéniques sont formulées avec un excipient physiologiquement acceptable sous la forme d'un gel ou d'une pommade. 25 Aussi, afin d'utiliser la composition terpénique issue de la troisième préparation dans une application microbicide en vue de lutter contre le 5 2908660 11 VIH, des tests de toxicité vaginale ont été menés sur le modèle lapine. Ces tests, ont permis de vérifier l'innocuité de la composition. Pour les applications internes, les compositions terpéniques sont obtenues sous forme solide, par exemple pulvérulente, et sont ensuite 5 transformées en comprimés pour une administration par voie orale ou solubilisée dans un excipient physiologiquement acceptable pour être administrée par voie parentérale. Par ailleurs, les compositions terpéniques ont été testées en terme toxicologique chez la souris et ont révélé une DL 50 (dose létale à partir io de laquelle 50 % des individus meurent) à 48 heures après l'administration, de 5,5 g plus ou moins 0,5 g par kilogramme. Ainsi, de telles compositions sont considérées comme atoxiques. De plus, les tests de toxicité subaiguës ont également montré que les compositions terpéniques selon l'invention étaient adaptées aux 15 traitements de pathologies humaines. En thérapeutique humaine, les compositions terpéniques ci-dessus, sont formulées à raison de 1 à 300 mg par absorption pour des prises fractionnaires ou non, et ce pour une posologie allant de 1 à 3000 mg par jour chez un adulte. 20 Bien évidemment, les posologies pourraient être supérieures si on utilisait d'autres modes de mise en oeuvre de l'invention, et notamment si le -composé terpénique était issu du bornyle. REVENDICATIONS , 1. Composition terpénique pour utilisation comme agent anti-microorganisme ou anti-viral, caractérisée en ce qu'elle comprend : un composé terpénique cyclique obtenu à partir d'un terpène de formule générique (C5 H8)n, n étant compris entre 2 et 5 ; et, - une substance organique formant vecteur, associée audit composé terpénique cyclique. 2. Composition terpénique selon la revendication 1, caractérisée io en ce que ledit composé terpénique cyclique associé à ladite substance organique est lié à un cation métallique. 3. Composition terpénique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit terpène est un monoterpène pour lequel n=2. 4. Composition terpénique selon la revendication 3, caractérisée 15 en ce que ledit composé terpénique présente un seul cycle à cinq atomes de carbone. 5. Composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit composé terpénique présente une fonction acide carboxylique. 20 6. Composition terpénique selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit composé terpénique forme des liaisons esters avec ladite substance organique. 7. Composition terpénique selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que ledit composé terpénique est l'acide camphorique. 25 8. Composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit cation métallique est choisi parmi les métaux de la troisième et quatrième période des éléments du tableau périodique des éléments. 9. Composition terpénique selon la revendication 8, caractérisée 30 en ce que ledit cation métallique est choisi parrni les éléments de l'ensemble comprenant le zinc, le cuivre et le magnésium. 2908660 13 10. Composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite substance organique formant vecteur est choisi parmi l'ensemble constitué des glucides, des composés aminoacides, des vitamines et des composés benzéniques. 5 11. Composition terpénique selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite substance organique est l'acide ascorbique. 12. Composition terpénique selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite substance organique est l'acide cinnamique. 13. Procédé de fabrication d'une composition terpénique selon io l'une quelconque des revendication 1 à 12, caractérisé en ce qu'on associe une substance organique formant vecteur à un composé terpénique cyclique obtenu à partir d'un terpène de formule générique (C5 H8)n, n étant compris entre 2. 14. Utilisation d'une composition terpénique selon l'une quelconque 15 des revendications 1 à 12, comme agent anti-microbien. 15. Utilisation d'une composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour obtenir un médicament destiné à luter contre une infection virale. 16. Utilisation d'une composition terpénique selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 12 pour la préparation d'une composition terpénique à usage externe. 17. Utilisation d'une composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour la préparation d'une composition terpénique susceptible d'être administrée par voie parentérale ou orale. 25 18. Utilisation d'une composition terpénique selon l'une quelconque des revendications 14 à 15 selon une posologie comprise entre 1 et 3000 mg par jour pour un adulte.