Brevet FR2904000A1 — publié le 20080125

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase 7 (HSD17b7), pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies. Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200 g/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant, ces agents présentent des effets secondaires sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones 25 stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. La demanderesse a maintenant découvert que le gène HSD17b7 était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in 30 vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler ce gène, ou son produit d'expression l'enzyme hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase 7, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, 35 comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. 2904000 2 La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro, basées sur la détection de l'expression ou d'activité du l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7. 5 HSD17b7 La protéine HSD17b7, qui désigne l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, appartient à la famille des hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénases, qui catalysent la dernière réaction de la biosynthèse de plusieurs oestrogènes et androgènes, tels que l'oestradiol, la 5a-androstane-3(3,17(3-diol, la testostérone, et la dihydrotestostérone. 10 Douze isoformes sont connues, présentant des activités spécifiques, réductrices ou oxydantes (Poirier, Current Medicinal Chemistry, 2003, 10 :453-477 ; Thiboutot et al, J . Invest Dermatol, 1998, 111 :390-395). Comme une stimulation androgénique est à l'origine d'une augmentation de la production de sébum, ce qui peut induire des lésions acnéiques, l'inhibition des 17beta- 15 hydroxysteroid dehydrogénases, enzymes clefs dans le métabolisme des androgènes, a été indiqué comme un traitement potentiel de l'acné. Dans ces cas, une inhibition non spécifique d'une ou plusieurs hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénases est recherchée. Les membres de la famille des HSD17b ont moins de 30% d'homologie de structure primaire entre elles. Les différents types de HSD17b diffèrent par leur substrat, 20 leurs spécificités de cofacteurs (Labrie et al. (2000) Trends Endocrinol Metab., 11:421-7). En outre, certains types de HSD17b sont impliqués dans la pathogénicité de certains désordres humains. HSD17b-3 est connu comme étant impliqué dans le développement du pseudohermaphrodisme, le HSD17b-8 joue un rôle dans la maladie du rein à plusieurs kystes et le HSD17b-4 est lié à la survenue à la déficience des enzymes bifonctionnelles. Par la modulation d'un HSD17b particulier, il est possible d'influencer ou de contrôler la concentration locale et paracrine d'oestrogènes et d'androgènes dans différents tissus. Plusieurs inhibiteurs réversibles et irréversibles d'enzymes HSD17b-2 d'origine stéroïdienne ou non stéroïdienne sont déjà connus dans la littérature (Poirier D. (2003) Curr Med Chem. 10:453-77). Comme par exemple la demande WO 02/26706 qui décrit des inhibiteurs de la HSD17b-2 d'origine non-stéroïdienne. Le brevet JP48042271 décrit des composés utilisés comme composé anti-inflammatoire. Le brevet US5,597,823 décrit quant à lui des antagonistes adrénergiques utiles pour le traitement de l'hyperplasie bénigne de la prostate. La demande de brevet JP62132884 divulgue des benzylthienopyrimidinones pour le traitement des désordres cardiovasculaires. La demande WO2005032527 concerne l'utilisation des dérivés thiophenepyrimidinones, pour le traitement ou la prévention des maladies dépendants des hormones stéroïdiennes 2904000 3 par l'inhibition de la 17(3-HSD-1. Du fait que chaque sous-type de HSD17b a une affinité sélective d'un substrat, une distribution particulière de tissu, la sélectivité de l'action peut être réalisée en visant un isozyme de HSD17b particulier. 5 Outre sa capacité à synthétiser du 1713-oestradiol in vitro pour laquelle il n'y a aucune preuve d'une relevance physiologique à ce jour, la protéine HSD17b7 présente également une activité de 3-cétostéroïde réductase, qui est l'aspect d'intérêt dans la présente invention : HSD17b7 est capable de complémenter une déficience de l'activité 3-cétostéroïde réductase dans des levures Erg27p-déficientes et permet ainsi la pousse des 10 cellules dans un milieu sans stérol. HSD17b7 est localisée dans le réticulum endoplasmatique, qui est le site de la partie postsqualene de la synthèse du cholesterol, et est exprimée spécifiquement dans les tissus impliqués dans les désordres congénitaux de déficience en cholestérol (Marijanovic et al, Molecular Endocrinology 2003, 17(9) :1715-1725). 15 C'est donc cette activité de l'enzyme dans la biosynthèse du cholestérol qui est d'intérêt dans la présente invention, ainsi que la modulation sélective de cette enzyme. Dans le contexte de l'invention, le terme gène HSD17b7 ou acide nucléique HSD17b7 signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour 20 l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme (par exemple une enzyme d'un autre organisme). 25 Une séquence d'ADNc humain de HSD17b est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). ). Il s'agit de la séquence NM016371 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 96 à 1121. Applications diagnostiques Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de 30 l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 (HSD17B7), de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. 35 L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de la protéine (HSD17B7) par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment 2904000 4 pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de l'enzyme peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain . 5 Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine ou d'expression de son gène ou d'activité d'au moins un de ses promoteurs permet notamment de suivre l'efficacité d'un 10 traitement, notamment un traitement par un modulateur de l'enzyme, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. 15 Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine HSD17b7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon 20 biologique d'un sujet contrôle. Là encore, l'expression de la protéine HSD17b7 peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression de son gène, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de 25 l'activité de l'enzyme peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés 30 à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par 35 exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. 2904000 5 Méthodes de criblage Un objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler 5 l'expression ou l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, une modulation de l'expression ou de l'activité de l'enzyme indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de 10 moduler l'expression ou l'activité de la HSD17b7, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des 15 désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; 20 c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) 25 déshydrogénase de type 7, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 30 Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, l'expression du gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. 2904000 6 Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine ; Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la 5 transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou 10 d'un mélange de composés. Différentes techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7. 15 Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène HSD17b7, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un 20 substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène rapporteur, ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, 25 ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène HSD17b7 codant pour l'hydroxystéroïde (17-beta) déshydrogénase de type 7, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène. 30 La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène HSD17b7 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou 35 encore la glande sébacée de la peau. 2904000 7 Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour une hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, de préférence humaine, ou de mammifère. Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par 5 exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. 10 Dans ces méthodes, le niveau d'expression du gène HSD17B7 peut être déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine correspondante produite. 15 L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou d'autres ligands 20 (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d' un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué 25 (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases 30 spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. 35 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou 2904000 8 monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûhydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière, prélèvement puis épuisement de l'antisérum selon des méthodes en soi connues 5 de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la 10 technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli). Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre 15 d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection 20 peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible 25 grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico- 30 chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). 35 2904000 9 Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. De préférence, l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme 5 hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et un système réductase, et l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique. L'enzyme peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou 10 des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. Un exemple de mesure de l'activité enzymatique peut se faire selon la méthode classique de Marijanovic et al. Mol Endocrinol, September 2003, 17(9) :1715-1725. Elle consiste à mesurer la conversion de zymostérone en zymostérol par l'hydroxystéroide (17 beta) deshydrogénase. 15 L'enzyme est incubée pendant 90 min à 37 C dans un milieu réactionnel contenant 880pL de tampon (10 mM KPI, 0.05% BSA, et 1mM EDTA pH8), 100pL de lysat bactérien, 10pL de NADPH (5mg/ml), 10pL de substrat (zymostérone, ou 17Roestradiol, ou androstérone). Les stéroïdes produits pendant la réaction sont extraits par une chromatographie en phase inverse dans une colonne RP18 et élués deux fois avec une solution 1 :1 de méthanol :chloroforme et 20 une fois avec du chloroforme seul. Après évaporation du solvant, les stéroïdes sont solubilisés dans du chloroforme, séparés par une chromatographie sur couche mince (Merck) en utilisant une solution 80 : 20 de toluène : éthylacétate comme phase mobile et détectés par pulvérisation d'une solution de 30% de H2SO4 dans de l'éthanol et développé à 135 C. L'identification des substrats et des métabolites se fait par comparaison avec les 25 stéroïdes références. Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 susceptible d'être obtenu selon l'une des 30 méthodes ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. II est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine 35 hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, à un patient nécessitant un tel traitement. L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, pour le traitement esthétique des peaux grasses. 2904000 10 De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit substantiellement l'activité enzymatique de la hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7. Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence 5 d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur 10 de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore moins de 0,01 M. Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une 15 concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 pg par ml à environ 5 g/ml. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle 20 de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci). Plusieurs inhibiteurs de hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénases sont connus, mais l'invention vise préférentiellement l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de l'isoforme 7. L'invention comprend l'utilisation de tels composés inhibiteurs de la hydroxystéroïde (17- 25 beta) deshydrogénase 7 pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Les composés modulateurs sont formulés au sein de compositions pharmaceutiques, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions 30 peuvent être administrées par exemple par voie orale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques 35 ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition 2904000 11 pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de 5 crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme 10 aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la HSD17b7 allant de 0,001 à 10 % en poids,notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la 15 composition. La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; 20 - des agents d'amélioration de la saveur; - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; 25 - des agents modificateurs de pression osmotique; - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de 30 métaux. Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légendes des figures : 35 Les Figure 1A et 1B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène HSD17B7 chez des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le 2904000 12 DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 1A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B). GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule 5 DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de 10 Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloquent les effets des agonistes DHT et DHEA). Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Les Figures 2A et 2B sont des graphes rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96 15 heures utilisant deux séries d'amorce ( probe sets ) différentes s'hybridant sur différentes régions du gène HSD17B7. Concernant la Figure 2A la série d'amorces utilisée est la 1417871_at, pour la Figure 2B la série d'amorces utilisée est la 1448865_at. Les différents temps d'observations sont identiques pour les deux expériences. Dans la Figure 2A, les points ctrl-a-24h et ctrl-b-24 montrent le niveau d'expression de 20 HSD17B7 de souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures. Les points suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps successifs (en heures) de l'étude cinétique. Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le DHT au 25 temps zéro. Cercle: expression dans les souris gonadectomisées sans traitement DHT au temps zéro. Les Figures 2C et 2D sont des graphes rapportant une étude cinétique de 1 heure à 24 heures utilisant deux séries d'amorce ( probe sets ) différentes s'hybridant sur 30 différentes régions du gène HSD17B7. La Figure 2C représente le niveau d `expression de HSD17B7 utilisant la série d'amorce 1417871_at, la Figure 2D représente le niveau d'expression de HSD17B7 utilisant la série d `amorce 1448865_at. Les points Veh-24h-a et Veh-24h-b montrent le niveau d'expression de HSD17B7 de souris gonadectomisées non traitées avec le DHT. 35 Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm 2904000 13 Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : expression de HSD17B7 dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain. 5 Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et microdissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module 10 microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fourni par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus a été transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin on a synthétisé un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc ont été ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en 15 utilisant le système Lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi 20 que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1). 25 Tableau 1 : Mesure de l'expression de HSD17B7 dans l'épiderme et dans la glande sébacée par utilisation de la technologie Affymetrix 2904000 14 Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression* sébacée humain dans la dans humaine glande l'épiderme sébacée humain humaine 220081_x_at HSD17B7 155 111 1 1 *Indicateur de le significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : présence (=1) ou absence (=0). Résultats: 5 La HSD17B7 est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression légèrement plus forte dans la glande sébacée n'atteint pas de significativité par rapport à la valeur observée dans l'épiderme. 10 Exemple 2 : expression de la HSD17B7 dans la glande préputiale de souris A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de 15 microdissection. Les inventeurs ont analysé l'expression de la HSD17B7 dans les glandes préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques), suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont 20 ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEAFlutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions 25 expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques. 2904000 15 L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrite ci-dessus (Figure 1A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 1 B). La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société 5 Applied Biosystems en utilisant le 7900HT Sequence Detection System . L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en l'ADNc et celui-ci est amplifié par PCR (réaction en chaîne par polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ. 10 Résultat: L'ARNm de la HSD17B7 est induit par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale. 15 B. Des souris mâles ont été gonadectomisées et ensuite étaient traitées avec le véhicule, ou le DHT. Les glandes préputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4 jours (traitement androgénique unique û observation d'une cinétique de court terme). L'ARN a été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix utilisant deux séries d'amorce différentes : 1417871_at (Figure 2A et 2C) et 1448865_at 20 (Figure 2B et 2D). Les Figures 2A, 2B, 2C et 2D représentent le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps. Résultat : La gonadectomie qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes induit une 25 répression de la quantité d'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris (figure 2A et 2B). L'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris est induit modérément par un traitement court terme avec la DHT (effet visible à 24 et 96 heures) (Figure 2A et 2B). L'ARNm de la HSD17B7 dans la glande préputiale de la souris est induit par un traitement 30 court terme avec le DHT (effet débutant à 12h et bien visible à 18 et 24 heures) (Figure 2C et Figure 2D). REVENDICATIONS 1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7 l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine hydroxystéroïde (17-beta) deshydrogénase 7, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène HSD17B7, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 2904000 17 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène HSD17B7, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 5 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes. 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue, codant pour l'hydroxystéroïde 10 (17-beta) deshydrogénase 7. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 15 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant une enzyme hydroxystéroïde 20 (17-beta) deshydrogénase 7 et un substrat de l'enzyme, et un système réductase, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité enzymatique.