Brevet FR2905009A1 — publié le 20080222

La présente invention relève du domaine médical, et intéresse en particulier les unités de recherche pharmacologique. L'invention concerne en effet une méthode de criblage de composés aux propriétés anti-amyloïde. A cette fin, l'invention met en oeuvre des techniques de biochimie pour l'analyse ex vivo de prélèvements biologiques permettant d'identifier rapidement des composés destinés au traitement curatif et/ou préventif des maladies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier. Ainsi, l'invention a pour objet une méthode de criblage de composés ayant l'aptitude de dissocier des complexes de forte affinité entre le peptide J3-amyloïde et le récepteur nicotinique de l'acétylcholine de tissus de cortex humains. La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative progressive qui affecte une large proportion de la population âgée. Cette maladie se caractérise sur le plan clinique par une perte de la mémoire et un déclin des fonctions cognitives. Sur le plan neuropathologique, la maladie d'Alzheimer se traduit par la présence de deux types de lésions histopathologiques cérébrales : les plaques amyloïdes et la dégénérescence neurofibrillaire (DNF). Une troisième caractéristique de la maladie d'Alzheimer est l'atrophie corticale correspondant à une perte neuronale prononcée. L'accumulation de peptides J3-amyloïde (A[3) sous forme de dépôts intraneuronaux et de plaques amyloïdes ou plaques séniles autour des neurones serait à l'origine de l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. Conjointement avec les désordres cognitifs associés et la dégénérescence neurofibrillaire, l'accumulation de dépôts amyloïdes représente la caractéristique précoce et invariable de toutes les formes de la maladie d'Alzheimer, incluant les formes familiales. La dégénérescence neurofibrillaire correspond à une accumulation intraneuronale de fibrilles formées de filaments appariées en hélice ou PHF (paired helical filaments). Les PHF sont constituées par l'assemblage de protéines microtubulaires tau. La caractérisation biochimique de ces protéines révèle la présence d'un triplet majeur de protéines tau anormalement phosphorylées (tau 60, 64 et 69) et agrégées. La protéine tau normale est phosphorylée 2 à 3 fois contre 5 à 9 fois dans la maladie d'Alzheimer et joue un rôle dans 2905009 -2- la polymérisation-dépolymérisation des microtubules du cytosquelette neuronal ainsi que dans le transport axonal. L'atrophie corticale se traduit par une perte de 8 à 10% du poids du cerveau tous les dix ans chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer alors que chez des sujets sains 5 cette perte n'est que de 2%. L'atrophie corticale s'accompagne d'une dilatation des ventricules cérébraux et des sillons corticaux, d'une réduction du volume de l'hippocampe ainsi que d'une perte neuronale affectant particulièrement le système cholinergique. Les plaques amyloïdes résultent de dépôts de substance amyloïde de forme sphérique. La substance amyloïde est constituée de filaments d'un polypeptide de 39 à 43 acides aminés 10 nommé A(3 (13-amyloïde). Le peptide J3-amyloïde présente une conformation en feuillet J3 lui conférant son caractère insoluble et sa toxicité. Le peptide J3-amyloïde est un produit catabolique normal d'une glycoprotéine membranaire de grande taille appelée APP (protéine précurseur de l'amyloide). Les plaques amyloïdes sont entourées de prolongements neuritiques et de cellules gliales. Les plaques amyloïdes imprègnent le 15 parenchyme nerveux et diffusent dans la substance grise corticale de toutes les régions cérébrales. Le cortex occipital semble plus fréquemment affecté par ces dépôts amyloïdes. La neurotoxicité du peptide (3-amyloïde constitue un problème majeur de la maladie d'Alzheimer. Des travaux récents montrent que les plaques amyloïdes localisées dans l'espace 20 extracellulaire sont issues de la lyse cellulaire de neurones présentant une accumulation très importante de dépôts amyloïdes dans le compartiment lysosomal. Cette accumulation intraneuronale entraîne une dégénérescence de la cellule neuronale puis la mort cellulaire et le relargage de ces dépôts dans l'espace extracellulaire, formant peu à peu les plaques amyloïdes (Nagele et al. 2002). Les plaques amyloïdes sont entourées de prolongements 25 neuritiques et de cellules gliales et contiennent des fragments de noyaux, preuve qu'elles proviennent de neurones morts. Le récepteur nicotinique de type a7 joue un rôle primordial dans l'entrée du peptide AJ3 dans les neurones (D'Andrea et Nagele 2006). 2905009 -3- Wang et al. ont démontré que le peptide AP se lie de manière spécifique et avec une haute affinité aux récepteurs nicotiniques a7 de l'acétylcholine (a7 nAChR) présents à la surface extracellulaire du neurone (Wang et al. 2000). L'interaction du peptide A(3, en particulier le peptide A1342, avec le récepteur a7 nAChR semble être une étape essentielle et préalable 5 à l'accumulation intraneuronale des complexes A(342-a7 nAChR, lesdits complexes à la surface des neurones faisant l'objet d'une endocytose aboutissant à leur accumulation dans le compartiment lysosomal (Nagele et al. 2002). En outre, l'accumulation intraneuronale de ces composés A(3-a7 provoque une phosphorylation anormale de tau (Wang et al. 2003) et des dysfonctionnements 10 synaptiques dont une défaillance de la neurotransmission cholinergique (Roselli et al. 2005 ; Almeida et al. 2005 ; Shemer et al. 2006). L'ensemble de ces données tendent à démontrer qu'une perturbation chronique des récepteurs a7 nAChR par les peptides A(3,en particulier les AR42, chez les individus âgés et les malades atteints de la maladie d'Alzheimer est un mécanisme central par lequel les 15 peptides A(3 provoquent des dysfonctionnements neuronaux, la formation de plaques amyloïdes et la phosphorylation de protéines tau à l'origine de la neurodégénérescence fibrillaire. En conséquence, les composés capables d'inhiber l'interaction AR42-a7 nAChR pourraient s'avérer être des agents particulièrement efficaces pour réduire la formation de plaques 20 amyloïdes ainsi que les dysfonctionnements neuronaux. Il apparaît donc intéressant, à la lumière de leur importance dans les pathologies neurodégénératives et liées au vieillissement, d'identifier des composés capables d'agir sur le complexe A(342-a7 nAChR à l'origine de la formation de plaques amyloïdes. L'identification de ces composés peut être effectuée par différentes méthodes, lesquelles se 25 révèlent plus ou moins adaptées et efficaces en fonction des cas. Elles sont parfois insuffisantes à elles seules, ne sont alors utiles que combinées, et présentent, en tout état de cause, un certain nombre d'avantages et d'inconvénients sommairement rappelés ci-après et qui seront discutés sur la base de deux critères de validité des modèles animaux : la validité de construction basée sur la similitude des conditions inductrices de la pathologie 2905009 -4- et des mécanismes neurobiologiques sous jacents, la validité descriptive basée sur la similitude des états comportementaux induits. Une première méthode consiste en une injection de peptides 0-amyloïdes dans des cerveaux de souris, réalisée à l'aide d'une canule en position intra-cérébro-ventriculaire 5 (i.c.v). Cette méthode (Yamada et al. 2005 ; Mazzola et al. 2003) permet d'obtenir des souris présentant un déficit de mémoire après 7 jours d'apport exogène de peptides f3-amyloïdes. Ce modèle murin est obtenu rapidement et peut être utilisé pour tester de nouveaux produits pressentis dans le traitement des pathologies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier. Cette méthode est basée sur un modèle ne représentant 10 pas exactement la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. En effet, cette méthode d'identification de composés agissant sur le complexe A042-a7 nAChR n'a pas de validité apparente puisque la pathologie tau du vieillissement cérébral ne se développe pas dans ce modèle murin. En outre, le présent modèle murin ne respecte pas une validité de construction compte-tenu que, d'une part les peptides 13-amyloïdes sont d'origine exogènes 15 et non produits de manière naturelle par l'animal et d'autre part le modèle est animal et non humain. Enfin, l'injection de peptides 0-amyloïdes exogènes dans des cerveaux de souris exige de travailler in vivo ce qui écarte cette méthode d'un usage en routine pour le criblage et l'identification de composés anti-Alzheimer. Plusieurs autres méthodes d'identification de composés utilisent des souris transgéniques 20 comme modèle de maladie d'Alzheimer, portant des mutations présentes dans les formes familiales de la maladie d'Alzheimer, sur les gènes APP et/ou PSI (préséniline-1). Ces modèles présentent donc une validité de construction indéniable pour les formes familiales mais très discutable pour les formes sporadiques qui représentent plus de 97% des cas. Un premier type de souris transgénique ne comporte qu'une mutation sur l'APP (Hsiao et 25 al. 1996) ou une double mutation sur APP et PSI (Holcomb et al. 1998). La validité descriptive des modèles transgéniques décrits supra n'est pas complète puisqu'ils ne reproduisent pas de manière fiable les caractéristiques physiopathologiques liées à la maladie d'Alzheimer. En effet, on observe d'une part une absence de dégénérescence neurofibrillaire, d'autre part peu ou pas de perte neuronale ainsi qu'une apparition tardive 2905009 -5-des plaques séniles dans le cortex des souris simple ou double transgéniques. En conséquence, l'utilisation de modèles de souris simple ou double transgéniques n'est pas recommandée compte-tenu des différences physiologiques existant avec la maladie d'Alzheimer et du délai auquel apparaissent les lésions liées à cette pathologie. 5 L'utilisation d'un modèle transgénique de souris comprenant trois gènes mutés (APP, PSI et tau) (LaFerla et al. 2003) présente également des désavantages. La validité de construction de ce modèle est discutable puisqu'une mutation dans le gène tau, non présente chez l'homme atteint de maladie d'Alzheimer, est ajoutée par rapport aux modèles précédents. Cependant, la validité descriptive de ce modèle est bonne puisqu'il 10 mime bien les lésions physiologiques de la maladie d'Alzheimer qui consistent en des plaques amyloïdes, des dégénérescences neurofibrillaires et de la perte neuronale. Cependant, cette méthode nécessite un délai de 6 mois à 12 mois avant d'obtenir des souris présentant les lésions typiques de la maladie d'Alzheimer. En conséquence, ce modèle de souris transgéniques peut valablement être utilisé dans une méthode de confirmation des 15 propriétés anti-amyloïde d'un composé testé mais ne peut raisonnablement pas être utilisé en première intention pour le criblage de composés compte-tenu de la durée et de la difficulté de mise en oeuvre dudit modèle. Une troisième méthode (Wang et al. 2000) consiste à tester la capacité de composés à empêcher la formation de complexes entre peptides A(3 apportés de manière exogène et a7 20 présent dans des tissus de rat (synaptosomes d'hippocampe et de cortex de rat). Cette méthode in vitro est plus rapidement mise en oeuvre que les méthodes décrites supra, toutefois elle a l'inconvénient de ne pas être représentative des complexes présents chez l'homme puisque ce sont des extraits de cerveaux de rat et que les peptides A(3 sont apportés manière exogène. En conséquence, ce modèle ne respecte ni les conditions de 25 validité de construction ni celles de validité descriptive requises pour l'utilisation de ce dernier dans une méthode de criblage de composés capables d'agir sur le complexe A P42-a7 nAChR à l'origine de la formation de plaques amyloïdes. La présente invention a donc pour but de proposer une stratégie alternative aux méthodes d'identification de composés susceptibles d'agir sur les complexes (3-amyloïde-a7 nAChR, 2905009 -6- en vue de remédier au moins en partie, aux inconvénients déjà connus des méthodes de sélection desdits composés. L'invention propose donc à ce titre une méthode de criblage ex vivo recréant les conditions physiologiques présentes chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ces conditions optimales sont obtenues en utilisant des cerveaux 5 humains en particulier des cortex frontaux issus de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ce modèle remplit par définition les critères de validité de construction et de validité descriptive puisqu'il s'agit d'une utilisation directe du tissu humain malade. Les conditions ex vivo de la méthode de criblage selon l'invention permettent de lever les contraintes liées à la réalisation et à la manipulation de modèles animaux. 10 De plus, l'utilisation de matériels biologiques humains permet de s'affranchir de tous les artéfacts et erreurs liés aux différences physiologiques existantes entre les espèces animales et humaine. L'utilisation de matériels biologiques humains dans le cadre de la méthode de criblage selon l'invention est particulièrement importante compte-tenu du fait que la maladie d'Alzheimer et les pathologies neurodégénératives en général n'existent pas 15 de manière naturelle chez des espèces autre que l'espèce humaine. L'invention concerne donc une méthode de criblage de composés capables de dissocier ou de prévenir les complexes de peptides (3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine issus de cerveaux humains. De manière préférée, l'invention porte sur une méthode de criblage de composés capables 20 de dissocier ou prévenir les complexes de peptides (3- amyloïde avec les récepteurs nicotiniques a7 de l'acétylcholine issus de cerveaux humains. La méthode de criblage selon l'invention permet donc d'identifier des composés aux propriétés curative ou préventive en fonction que ces composés sont respectivement capables de dissocier ou de prévenir les complexes A(342-a7 nAChR. 25 Par propriété anti-amyloïde ou anti-bêta amyloïde on entend la capacité pour un composé à dissocier ou à s'opposer à la formation de dépôts intracellulaires ou extracellulaires de peptides 13-amyloïde que ce soit par dissociation ou par inhibition de la formation des complexes que forment les peptides A(3 avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. 2905009 -7 Dans le contexte de l'invention le récepteur nicotinique alpha 7 de l'acétylcholine (a7 nAChR) désigne un récepteur cellulaire de surface pentamérique, exprimé principalement dans le cortex et l'hippocampe, et possédant un rôle important dans l'apprentissage et la mémoire. 5 Dans le contexte de l'invention les expressions (3-amyloïde , A(3 et peptide [3-amyloïde concernent l'ensemble des peptides (3-amyloïdes dont les peptides A(31_39 ou A1339, A131-40 OU AR40, A(31-41 OU A(341 A(31_42 OU A1342, A(31-43 Ou A(343 et leurs fragments (Glenner et al. 1984). Les fragments des peptides (3-amyloïde supra ont une activité biologique et sont utilisables dans la méthode de criblage selon la présente invention. 10 Lesdits fragments sont par exemple des fragments A(31_28 et A(325-35. Les peptides 13-amyloïde utilisés dans le cadre de l'invention sont en particulier les peptides A(339, A134o, A(341, A[342 et/ou A(343. Le peptide A(342 présente la plus forte affinité vis à vis des récepteurs nicotiniques a7 de l'acétylcholine et a le rôle le plus important dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer. 15 La présente méthode de criblage est réalisée à partir d'échantillons de cerveaux humains et de préférence à partir de cortex et d'hippocampe humains. Ces échantillons sont prélevés post-mortem sur des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. L'invention porte, de manière préférée, sur une méthode de criblage caractérisée en ce que la dissociation des complexes de peptides 13-amyloïde et de récepteurs nicotiniques a7 de 20 l'acétylcholine est mise en évidence par immunohistochimie. Dans le cadre de l'invention, le terme immunohistochimie concerne l'ensemble des techniques de révélations des antigènes par des anticorps pour détecter ou isoler des molécules définies. De préférence, la méthode de criblage comprend les étapes suivantes d'incubation des 25 complexes de peptides (3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine en présence ou en l'absence d'un composé à tester, puis de détermination de la quantité de complexes non dissociés en présence ou en l'absence de composé à tester et l'évaluation de 2905009 -8- la différence de quantité de complexes non dissociés, ladite différence indiquant que le composé testé module la dissociation des complexes de peptides [3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. Préférentiellement, la méthode de criblage selon l'invention comprend également une 5 étape d'isolement des complexes non dissociés de peptides [3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine à l'aide d'anticorps anti-peptide f3-amyloïde. De façon préférée, les anticorps anti-peptide [3-amyloïde utilisés dans la méthode de criblage sont dirigés contre les peptides I3-amyloïde A(339, A1340, A(341, A(342 et/ou A1343. Ces anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux de souris ou de chèvre. 10 De manière encore préférée, la présente méthode de criblage se caractérise par la révélation, en particulier par méthode Western-blot, des complexes non dissociés à l'aide d'anticorps anti-récepteurs à l'acétylcholine nicotiniques, en particulier d'anticorps antirécepteurs nicotiniques a7 de l'acétylcholine. Avantageusement, la méthode de criblage selon l'invention a mis en évidence le composé 15 S 24795, i.e. chlorure ou iodure de 1-(4-bromophényl)-2-(1-méthyl-2 pyridiniumyl)-1-éthanone, comme composé capable d'une part d'inhiber la formation de complexes 13-amyloïde-a7 nAChR et d'autre part de dissocier lesdits complexes 13-amyloïde-a7 nAChR accumulés en plaques amyloïdes autour du neurone et en dépôt à l'intérieur du neurone. Le composé S 24795, identifié par la méthode de criblage de la présente invention, est donc 20 un composé capable de dissocier les complexes de peptides (3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine présents dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer ainsi que d'inhiber la formation desdits complexes. L'invention vise également chaque composé identifié à partir de la méthode de criblage selon l'invention. 2905009 -9- L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant le composé obtenu à partir de la méthode de criblage selon l'invention en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipient(s) pharmaceutiquement acceptables. Par principe actif , on entend toute substance responsable des propriétés 5 pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique. Dans le contexte de l'invention, on entend par excipients toute substance à laquelle on incorpore le principe actif d'un médicament afin d'en faciliter la préparation ainsi que l'administration et d'en conditionner la consistance, la forme ainsi que le volume. Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables on peut citer à titre 10 indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants. De plus, les compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement 15 des pathologies neurodégénératives et de la maladie d'Alzheimer en particulier sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les 20 ampoules buvables ou injectables. La présente invention porte, en outre, sur l'utilisation de composés identifiés à partir de la méthode de criblage selon l'invention pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinées à la prévention et/ou au traitement de maladies neurodégénératives. Les composés identifiés par la méthode de criblage selon l'invention sont utilisés dans le 25 traitement des pathologies neurodégénératives telles que par exemple la maladie d'Alzheimer, la maladie de Pick, la démence à corps de Lewy, le syndrome de Steel-Ridchardson, le syndrome de Down, le syndrome de Shy-Drager, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie neurodégénérative, la maladie de Huntigton, la maladie de Parkinson, l'aphasie primaire progressive, la maladie de Machado-Joseph, la maladie de 2905009 -10- Gilles de La Tourette, le dusarthrie paralytique, la maladie de Kennedy, la paralysie spasmodique familiale, la maladie de Werdnig-Hoffmann, la maladie de Kugelberg-Welander, la maladie de Tay-Sach, la maladie de Sandhoff, la maladie de Wohlfart-Kugelberg-Welander, la paraparésie spastique, la leucoencéphalite multifocale progressive 5 et les maladies liées au prion dont Creutzfeldt-Jakob ou la maladie de Gerstmann-Strussler Scheinker. Le terme préventif selon l'invention correspond à un traitement à visée préventive ayant pour objectif de diminuer le risque de développer la maladie d'Alzheimer en inhibant la fixation des peptides [3-amyloïde sur les récepteurs cellulaires nicotiniques a7 de 10 l'acétylcholine. Cette inhibition limite la formation de complexes j3-amyloïde-a7 nAChR à l'origine des plaques amyloïdes, lésion présente dans la maladie d'Alzheimer. En outre, le terme préventif peut s'entendre comme la prévention secondaire qui est destinée à diminuer la prévalence en réduisant l'évolution et la durée de la maladie. On entend par traitement , un traitement à visée curative prescrit aux fins de soigner les 15 patients atteints de la maladie d'Alzheimer en dissociant les complexes (3-amyloïde-a7 nAChR présents dans les cerveaux humains et constituant les plaques séniles. Plus particulièrement, l'utilisation de composés issus de la méthode de criblage selon l'invention pour l'obtention de compositions pharmaceutiques est destinée à la prévention et/ou au traitement de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. 20 On entend par maladie d'Alzheimer une maladie neurodégénérative fatale affectant la mémoire et le fonctionnement mental avec notamment l'altération du langage, la perturbation des gestes élaborés, des troubles d'orientation dans le temps et dans l'espace. Ces troubles cognitifs sont liés à deux lésions neuropathologiques caractéristiques les plaques séniles et la dégénérescence neurofibrillaire qui permettent son diagnostic définitif 25 post-mortem. La présente invention est illustrée par, sans pour autant se limiter aux figures suivantes : - Figure 1 : Western-blot illustrant l'inhibition par le S 24795 des complexes A[342a7 nAChR provenant de synaptosomes de cortex frontal de patients atteints de la 2905009 -11- maladie d'Alzheimer ou de sujets témoins post-mortem. Les complexes A(342-a7 nAChR sont incubés en milieu seul (Kreb's-Ringer) ou en présence de S 24795 (30 M) pendant 10 minutes suivie d'une incubation en présence de peptide A(342 pendant 30 minutes. 5 Figure 2 : Quantification de l'inhibition de la formation de complexes A(342-a7 nAChR dans des synaptosomes de cortex frontal humains provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer et de sujets contrôles post-mortem, incubés ou non avec S 24795 (301.tM) puis avec des peptides A(342 (100nM). * : p REVENDICATIONS 1. Méthode de criblage de composés capables de dissocier ou de prévenir les complexes de peptides (3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine issus de cerveaux humains, caractérisée en ce qu'elle comprend l'incubation de complexes de peptides (3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine en présence ou en l'absence d'un composé à tester ; la détermination de la quantité de complexes non dissociés en présence ou en l'absence de composé à tester et l'évaluation de la différence de quantité de complexes non dissociés. 2. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine sont de type a7. 3. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les peptides 13-amyloïde sont A(339, AP40, A(341, A[342 et/ou AR43. 4. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que les complexes de peptides j3-amyloïde avec les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine sont issus de cortex ou d'hippocampes humains. 5. Méthode de criblage selon la revendication 1, caractérisée en ce que la dissociation des complexes de peptides [3-amyloïde et de récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine est mise en évidence par immunohistochimie. 6. Méthode de criblage selon la revendication 5, caractérisée en ce que les complexes non dissociés sont isolés avec des anticorps anti-peptides [3-amyloïde. 7. Méthode de criblage selon la revendication 6, caractérisée en ce que les anticorps sont dirigés contre les peptides [3-amyloïde A(339, A[340, A1341, A(342 et/ou A(343. 2905009 -19- 8. Méthode de criblage selon la revendication 5, caractérisée en ce que les complexes non dissociés sont mis en évidence à l'aide d'anticorps dirigés contre les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. 9. Méthode de criblage selon la revendication 8, caractérisée en ce que les complexes 5 non dissociés sont mis en évidence à l'aide d'anticorps anti-récepteurs nicotiniques a7 de l'acétylcholine.