Brevet FR2907011A1 — publié le 20080418

UTILISATION DE LA CITRULLINE POUR LE TRAITEMENT DES ETATS DE DENUTRITION s La présente invention a pour objet l'utilisation de citrulline pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des états de dénutrition liés à une diminution de la synthèse protéique. De nombreux états cataboliques sont caractérisés par une dénutrition s'accompagnant d'une diminution de l'anabolisme protéique musculaire. Cette 10 diminution de la protéosynthèse contribue à la fonte musculaire observée dans de nombreux états cataboliques et favorise l'installation d'une cachexie. Or, il est bien connu que cette dernière est un facteur aggravant de morbidité et de mortalité (Schneider SM, Veyres P, Pivot X, Soummer AM, Jambou P, Filippi J et al. Malnutrition is an independent factor associated with nosocomial infections. Br J Nutr 15 2004; 92:105-111). Les inventeurs ont précédemment démontré que l'administration par voie entérale de L-citrulline à des rats souffrant d'un état de dénutrition dû à une insuffisance intestinale, permettait à ces rats de reprendre du poids (demande de brevet FR 2 857 262 déposée le 8 juillet 2003). 20 L'invention décrite dans cette demande de brevet résulte de la mise en évidence du fait que l'administration par voie entérale de L-citrulline à des rats souffrant d'un état de dénutrition dû à une insuffisance intestinale, permettait à ces rats de reprendre du poids. Les expériences décrites dans la demande FR03 08349 sont effectuées in vivo sur des rats ayant subi une résection sévère de l'intestin grêle. Cette résection a pour 25 conséquence une diminution de l'absorption des nutriments et donc une insuffisance intestinale qui conduit à un état de dénutrition. Les applications de la citrulline découlant de cette démonstration sont celles du traitement : û du syndrome du grêle court suite à une résection intestinale, 30 û de la maladie coeliaque, û des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn, et la rectocolite ulcéreuse, û de l'insuffisance intestinale liée au vieillissement, - de l'insuffisance intestinale liée à une irradiation, 2907011 2 à savoir du traitement de pathologies toutes liées à une insuffisance intestinale quelle que soit la cause de cette dernière. Dans le cadre d'études précédentes chez les rats âgés dénutris, les inventeurs ont plus particulièrement observé une insuffisance intestinale, encore désignée insuffisance 5- intestinale liée au vieillissement, résultant essentiellement d'un mécanisme de séquestration splanchnique des acides aminés qui ne circulent plus en périphérie (Curis E, Nicolis I, Moinard C, Osowska S, Zerrouk N, Benazeth S et al. Almost all about citrulline in mammals. Amino Acids 2005; 29:177-205). La citrulline n'étant pas captée par l'aire splanchnique, les inventeurs ont émis 10 l'hypothèse que la citrulline pouvait être un vecteur de l'azote en périphérie. Ils ont ainsi démontré au moyen d'expériences in vivo que l'apport de citrulline à des rats âgés dénutris permet de restaurer la synthèse protéique, à savoir que la citrulline permet de retrouver un niveau de synthèse protéique équivalent au niveau basal de synthèse protéique chez le rat âgé sain. 15 Ces expériences permettaient de suggérer que la citrulline est utilisable dans le cadre du traitement de l'insuffisance intestinale liée au vieillissement (comme mentionné dans la demande de brevet référencée ci-dessus). Les inventeurs ont étudié dans le cadre de la présente invention l'effet de la citrulline directement sur le muscle par mise en oeuvre d'expériences in vitro d'addition 20 de la citrulline sur des muscles isolés de rats adultes sains ou dénutris. En effet, il n'y a aucune donnée dans la littérature laissant suggérer que le muscle a une quelconque capacité de transformation de la citrulline en une substance active sur la synthèse protéique, ou que la citrulline a une action directe sur la synthèse protéique musculaire. 25 Les inventeurs ont par conséquent voulu étudier le sort de la citrulline dans le muscle afin d'expliquer le mécanisme métabolique conduisant à un effet sur la stimulation de la synthèse protéique. C'est ainsi que les Inventeurs ont mis en évidence : û que le muscle de rats adultes sains ou dénutris n'a pas la capacité de 30 métaboliser la citrulline puisque l'on ne retrouve pas de libération in vitro d'acides aminés métaboliquement liés à la citrulline dans le milieu expérimental, û et que l'addition de citrulline à des muscles de rats adultes dénutris augmente la synthèse protéique de ces muscles jusqu'à 30%, tandis que l'on observe aucun effet 2907011 sur la synthèse protéique par addition in vitro de citrulline sur des muscles de rats adultes sains. Par conséquent, les inventeurs ont pour la première fois démontré que, de façon inattendue, la citrulline n'est pas métabolisée dans le muscle et possède une action directe 5- sur la synthèse protéique musculaire qui est indépendante d'une insuffisance intestinale liée à toute pathologie digestive ou à toute modification du métabolisme digestif. Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir un moyen de traiter les états de dénutrition, et plus particulièrement la cachexie lorsque celle-ci est liée à une diminution de synthèse protéique dans le cadre de pathologies non liées à l'insuffisance 10 intestinale. Un autre but de l'invention est de fournir un moyen d'augmenter la synthèse protéique intramusculaire anormalement faible chez les patients en état de dénutrition liée à une diminution de la synthèse protéique dans le cadre de pathologies ne résultant pas d'une insuffisance intestinale. 15 La présente invention concerne l'utilisation de L-citrulline (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des états de dénutrition liés à une diminution de la synthèse protéique dans le cadre de pathologies ne résultant pas d'une insuffisance intestinale. /O H2N 20 NH (I) NH2 O 25 OH La L-citrulline est notamment fournie par Sigma. On désigne par insuffisance intestinale un état pathologique de l'intestin, notamment de l'intestin grêle, dans lequel l'absorption des nutriments est réduite par rapport à la normale, la diminution de l'absorption des nutriments étant liée à une 30 diminution du nombre et/ou de la fonctionnalité de cellules intestinales capables d'assurer cette absorption, cette diminution du nombre et/ou de la fonctionnalité de cellules intestinales étant elle-même due soit à une élimination physique de ces cellules (notamment par chirurgie ou par radiations), soit à un dysfonctionnement pathologique de ces cellules. 2907011 4 La présente invention concerne en particulier l'utilisation susmentionnée de L-citrulline pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la synthèse protéique intramusculaire anormalement faible chez les patients en état de dénutrition liée à une diminution de la synthèse protéique dans le cadre de pathologies ne résultant pas d'une insuffisance intestinale. La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des troubles ou pathologies suivantes : malnutrition protéino-énergétique liée à une carence d'apport, cancer, à l'exception du cancer de l'intestin entraînant une insuffisance intestinale, dénervation musculaire, chimiothérapies, à l'exclusion de celles ayant une action au niveau intestinal, diabète, obésité, apesanteur, membre immobilisé après fracture, - chirurgie réglée, à l'exclusion de la chirurgie digestive intestinale, et ù dystrophie. Les troubles ou pathologies susceptibles d'être traités dans le cadre de la présente invention sont illustrés dans l'article de Couet et al. (Couet C., Attaix D. Le muscle. In: Leverve X, Cosnes J, Erny P, Hasselmann M, editors. Traité de nutrition artificielle de l'adulte. Paris: Mariette Guéna, 1998: 261-274). Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, de la L-citrulline, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. On désigne notamment par sel pharmaceutiquement acceptable des sels de citrulline tels que le malate de citrulline, l'a-cétoglutarate de citrulline, le citrate de citrulline ou l'a-cétoisocaproate de citrulline. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables apparaîtront de manière évidente à l'homme de l'art. L'invention concerne notamment l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'une composition pharmaceutique caractérisée en ce la dose unitaire en L-citrulline est d'environ 2 g à environ 20 g, notamment environ 10 g, pour une 2907011 5 posologie d'environ 0,1 g/kg/jour à environ 0,5 g/kg/jour, notamment environ 0,25 g/kg/jour. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous 5 forme sèche ou sous forme de solution aqueuse. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. L'administration par voie entérale correspond notamment à une administration par l0 sonde naso-gastrique ou naso-intestinale, par gastrostomie ou jéjunostomie l'administration par voie parentérale correspond notamment à une administration par perfusion intraveineuse centrale, périphérique ou sous-cutanée. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée de L-citrulline, pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant 15 également un ou plusieurs autres composés destinés au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale. 20 Selon un autre mode de réalisation la présente invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, de la L-citrulline, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec au moins un autre composé destiné au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents 25 sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale, et avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon un autre mode de réalisation l'invention concerne des produits comprenant : 30 ù de la L-citrulline ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, ù et au moins un autre composé destiné au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un 2907011 6 mélange nutritionnel destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale, comme produits de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée, ou étalée dans le temps, dans le cadre du traitement de l'insuffisance intestinale. 5 L'invention est illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la régulation de la protéosynthèse musculaire par la citrulline dans le cadre d'une étude in vitro sur muscle isolé périfusé. 10 Description des figures La Figure lA représente la synthèse protéique fractionnaire (FSR) d'épitrochléaris issus de rats sains (colonnes de gauche) ou dénutris (colonnes de droite) et incubés en présence de citrulline (colonnes noires) ou en absence de citrulline (témoin - colonnes blanches). Les résultats sont exprimés en %/heure. 15 La Figure 1B représente la synthèse protéique fractionnaire (FSR) d'épitrochléaris issus de rats sains (colonnes de gauche) ou dénutris (colonnes de droite) et incubés en présence de citrulline (colonnes noires) ou en absence de citrulline (témoin - colonnes blanches). Les résultats sont exprimés en %/témoin. 20 Matériel et méthodes Traitement des animaux : Des rats mâles Sprague-Dawley (Charles River Laboratoires, L'Arbresles, France) âgés de 3 mois (n=20) sont placés dans des cages individuelles, en ambiance thermostatée (23 1 C), et soumis à un cycle 25 lumière/obscurité de 12h (obscurité de 8h à 20h). L'acclimatation des rats est effectuée pendant 2 semaines, au cours desquelles la consommation alimentaire spontanée est mesurée. Ils sont nourris avec un régime standard (A04, UAR, Villemoisson-sur-Orge, France) contenant 17% de protéines, 3% de lipides, 59% de glucides et 21% d'eau, fibres, vitamines et minéraux. La prise 30 alimentaire moyenne, durant cette période est de 28 g/jour pour les rats adultes. A la fin de la période d'acclimatation, les rats sont randomisés en 2 groupes : un groupe contrôle formés de rats nourris ad libitum (AL) et un groupe soumis à une restriction alimentaire durant la même période : les rats sont nourris à 50% des ingesta 2907011 7 spontanés pendant 6 semaines avec un régime à 5% de protéines (Walrand S, Chambon-Savanovitch C, Felgines C, Chassagne J, Raul F, Normand B et al. Aging: a barrier to renutrition? Nutritional and immunologic evidence in rats. Am J Clin Nutr 2000; 72:816-824). 5- Muscles isolés incubés. Les muscles ont été incubés selon une méthode préalablement utilisée (Minet-Quinard R, Moinard C, Villie F, Vasson MP, Cynober L. Metabolic pathways implicated in the kinetic impairment of muscle glutamine homeostasis in adult and old glucocorticoid-treated rats. Am J Physiol Endocrinol 10 Metab 2004; 287:E671-E676). L'epitrochlearis est utilisé car il est le plus adapté à ce type d'étude. Après dissection, les epitrochlearis sont incubés dans 3 mL de tampon Krebs-Ringer (119 mM NaCl ; 4,8 mM KC1; 1,25 mM MgSO4 ; 25 mM NaHCO3 ; 1,24 mM NaHPO4 ; 1,0 mM CaCl2 ; 2 mM HEPES, pH 7,4), contenant également du glucose (8 mM), de l'insuline (0,01 U/ml) et de l'albumine bovine sérique (BSA) (0,1% p/v). 15 Les muscles sont pré-incubés pendant 30 minutes à 37 C avec 95%02:5%CO2. Les muscles sont ensuite transférés dans un tube contenant 3 mL de milieu d'incubation (contenant de la 13C-phénylalanine (1 mM) avec ou sans 2,5 mM de citrulline) et sont incubés pendant 2 heures. Au terme de l'incubation, les muscles sont recueillis et conservés à -80 C jusqu'à la mesure de l'incorporation de la 13C-phénylalanine par 20 spectrométrie de masse pour déterminer la synthèse protéique fractionnaire (FSR)(Guillet C, Boirie Y, Walrand S. An integrative approach to in-vivo protein synthesis measurement: from whole tissue to specific proteins. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2004; 7:531-538). Par ailleurs, les acides aminés sont dosés dans le milieu d'incubation par chromatographie échangeuse d'ions. 25 Résultats Les résultats montrent que la citrulline n'est pas métabolisée par le muscle car aucun acide aminé métaboliquement lié à la citrulline n'est libéré dans le milieu d'incubation. 30 Par ailleurs, les résultats montrent que, conformément aux données de la littérature, la dénutrition diminue la synthèse protéique musculaire chez les rats adultes. Les résultats des expériences susmentionnées montrent que l'administration de L-citrulline permet d'augmenter la protéosynthèse musculaire (+27%) chez des rats dénutris (présentant une diminution de leur protéosynthèse musculaire). Ce travail, 2907011 8 ayant été réalisé ex vivo sur des muscles isolés incubés, permet de montrer que la L-citrulline à une action directe au niveau musculaire. Ce résultat est inattendu et totalement imprévisible au vue des données de la littérature, car seule la leucine (acide aminé essentiel) possède une telle propriété (Crozier SJ, Kimbali SR, Emmert SW, 5 Anthony JC, Jefferson LS. Oral leucine administration stimulates protein synthesis in rat skeletal muscle. J Nutr 2005; 135:376-382). Or, la L-citrulline est un acide aminé dont la structure est très différente de la leucine ; elle n'entre pas dans la composition des protéines, et est quasiment absente de l'alimentation. REVENDICATIONS 1. Utilisation de L-citrulline (I) ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des états de dénutrition liés à une diminution de la synthèse protéique dans le cadre de pathologies ne résultant pas d'une insuffisance intestinale. H2N /% NH (I) NH2 10 O OH 2. Utilisation de L-citrulline selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter la synthèse protéique intramusculaire anormalement faible chez les patients en état de dénutrition liée à une diminution de la synthèse protéique dans le cadre de pathologies ne résultant pas d'une insuffisance intestinale. 20 3. Utilisation de L-citrulline selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des troubles ou pathologies suivantes : malnutrition protéino-énergétique liée à une carence d'apport, cancer, à l'exception du cancer de l'intestin entraînant une insuffisance 25 intestinale, dénervation musculaire, chimiothérapies, à l'exclusion de celles ayant une action au niveau intestinal, ù diabète, obésité, 30 apesanteur, membre immobilisé après fracture, - chirurgie réglée, à l'exclusion de la chirurgie digestive intestinale, et -dystrophie. 15 2907011 10 4. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 3, pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, de la L-citrulline, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle-ci, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 5. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 4, pour la préparation d'une composition pharmaceutique caractérisée en ce que la dose unitaire en L-citrulline est d'environ 2 g à environ 20 g, notamment environ 10 g, pour une posologie d'environ 0,1 g/kg/jour à environ 0,5 g/kg/jour, notamment environ 0,25 g/kg/jour. 6. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 5, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous forme sèche ou sous forme de solution aqueuse. 7. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 6, pour la préparation d'une composition pharmaceutique se présentant sous une forme administrable par voie orale, sous-cutanée, entérale ou parentérale. 20 8. Utilisation de L-citrulline selon l'une des revendications 1 à 7, pour la préparation d'une composition pharmaceutique comprenant également un ou plusieurs autres composés destinés au traitement de la cachexie liée à la dénutrition tels que la leucine, la glutamine, l'arginine, l'ornithine et leurs différents sels utilisables tels que l'a-cétoglutarate ou l'a-cétoisocaproate, seuls ou au sein d'un mélange nutritionnel 25 destiné à la nutrition parentérale, ou d'un mélange destiné à la nutrition entérale ou d'un mélange destiné à la nutrition orale.15