Brevet FR2904112A1 — publié le 20080125

PROCEDE DE DETECTION, IDENTIFICATION ET QUANTIFICATION DE RADICAUX LIBRES, DISPOSITIF DE PRELEVEMENT ET KIT POUR SA MISE EN OEUVRE La présente invention concerne un nouveau procédé de détection, 5 identification et quantification de radicaux libres, un dispositif de prélèvement et un kit pour sa mise en oeuvre. II existe actuellement des méthodes indirectes pour la détection, l'identification et la quantification de radicaux libres. On peut citer par exemple la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et la spectrophotométrie 10 UV, deux techniques permettant le dosage de produits secondaires oxydés formés lors de la dégradation des lipides ou protéines par les radicaux libres. II faut savoir que ces produits secondaires ne sont pas nécessairement spécifiques de dégradations d'origine radicalaire, pouvant être obtenus par d'autres voies. 15 La résonance paramagnétique électronique (RPE) est la seule technique de détection directe des radicaux libres permettant, sous certaines conditions et dans un délai relativement court (1 à 5 minutes), d'obtenir un résultat sur la nature et la concentration de radicaux libres présents dans un mélange, par l'obtention d'un signal de résonance (spectre). La seule possibilité 20 d'observer des radicaux centrés sur l'oxygène ou le carbone, hautement instables en milieu aqueux à température ambiante, est d'utiliser la technique de piégeage (spin trapping) consistant à faire réagir le radical instable R• avec une molécule piège P initialement introduite dans le milieu. Cette réaction donne naissance à un nouveau radical (PR)• suffisamment stable pour conduire 25 à une observation par RPE ; il est appelé adduit de piégeage et appartient à la famille chimique des nitroxydes. L'analyse du spectre de RPE de l'adduit et la connaissance de la structure chimique de P permettront ensuite de remonter à la nature chimique de R•. Parmi les nombreux pièges ayant été développés pour la capture 30 spécifique des radicaux libres oxygénés en milieu biologique, les plus performants appartiennent à la famille chimique des nitrones. Le 5- diéthoxyphosphoryl-5-méthyl-1-pyrroline N-oxyde (DEPMPO) et le 2- 2904112 2 ethoxycarbonyl-2-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide (EMPO) se sont montrés remarquablement performants dans le piégeage du radical superoxyde, intermédiaire clé des processus radicalaires in vivo). Cependant, dans les conditions usuelles rencontrées en biologie, notamment en présence de nombreux constituants réducteurs de la cellule (ascorbate, thiols) et d'oxygène, les adduits nitroxydes sont rapidement réduits en espèces non radicalaires (diamagnétiques) indétectables par RPE. II serait donc souhaitable de disposer d'un procédé de détection, identification et quantification directs de radicaux libres qui donne des résultats 10 conformes à la réalité. Or après de longues recherches les demandeurs ont mis au point un tel procédé et un dispositif pour sa mise en oeuvre compte tenu de la nécessité d'effectuer très rapidement un des stades du procédé. C'est pourquoi la présente demande a pour objet un procédé de 15 détection, identification ou quantification de radicaux libres dans un fluide biologique dans lequel : - on prélève un fluide biologique, on mélange immédiatement ledit fluide biologique avec une composition réactive renfermant un composé piégeur de radicaux libres, un agent 20 stabilisant et un agent chélatant non oxydant, puis on procède à l'analyse du mélange ainsi obtenu à l'aide d'un appareil d'analyse détectant un composé comprenant un électron libre, par exemple en utilisant la technique de résonance paramagnétique électronique (RPE). Dans la présente demande et dans ce qui suit, le terme composé 25 piégeur de radicaux libres désigne un composé capable de réagir avec un radical libre et de le fixer, par exemple une nitrone c'est-à-dire un N-oxyde d'imine encore appelé oxyde d'azométhine, notamment une nitrone cyclique, de préférence un analogue de la 5,5-diméthyl-1-pyrroline N-oxyde (DMPO) et particulièrement le 5-diéthoxyphosphoryl 5-méthyl-1-pyrroline N-oxyde (DEPMPO) 30 ou le 2-ethoxycarbonyl-2-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide (EMPO). La concentration du composé piégeur de radicaux libres lors de l'analyse est avantageusement comprise entre 50 et 300 mM, de préférence 2904112 3 comprise entre 50 et 200 mM, notamment comprise entre 50 et 150 mM, tout particulièrement comprise entre 80 et 100 mM. Le terme agent stabilisant désigne un composé présentant une cavité autorisant la formation de complexes d'inclusion, par exemple un composé 5 minéral comme un zéolithe ou une kaolinite, ou organique comme un éther-couronne, un cyclophane, un oligomère cyclique d'un ose tel le glucose, de préférence un oligomère cyclique d'un ose tel le glucose (par exemple une cyclodextrine) ou un éther-couronne, particulièrement une cyclodextrine ou un éther-couronne et tout particulièrement une 33-cyclodextrine comme l'éther 2- hydroxypropylique de béta-cyclodextrine ou la méthyl- béta -cyclodextrine. La concentration de l'agent stabilisant lors de l'analyse est avantageusement comprise entre 50 et 300 mM, de préférence comprise entre 50 et 200 mM, notamment comprise entre 50 et 150 mM, tout particulièrement comprise entre 80 et 100 mM. Elle dépendra du composé utilisé et sera de préférence comprise entre 50 et 200 mM, notamment comprise entre 50 et 150 mM, tout particulièrement comprise entre 80 et 100 mM pour la méthyl-pcyclodextrine (Randomly Methylated- beta -cyclodextrine, RM- beta -CD). Le terme immédiatement signifie le plus rapidement possible, et avantageusement en moins de 10 secondes, de préférence en moins de 5 secondes, notamment en moins de 3 secondes, particulièrement en moins de 2 secondes et tout particulièrement en moins de 1 seconde après le prélèvement. L'agent chélatant est par exemple la deferoxamine, et particulièrement l'acide diéthylène triamine pentacétique (DTPA). L'acide éthylène diamine tétraacétique, qui est oxydant, ne convient par exemple pas. La concentration de l'agent chélatant est avantageusement comprise entre 0,1 et 2 mM, de préférence comprise entre 0,1 et 1,5 mM, notamment comprise entre 0,2 et 1 mM, tout particulièrement comprise entre 0,5 et 1,0 mM. On peut citer par exemple, à titre de fluide biologique, les fluides biologiques de mammifères, par exemple d'équidés, notamment d'humains, en particulier le sang, l'urine, la sueur, des effluents d'origine biologique comme 2904112 4 des perfusats d'organes ou des milieux de culture cellulaire, de préférence le plasma et le sang, et notamment ce dernier. Selon le fluide biologique, la composition réactive peut renfermer d'autres composés. Par exemple, si le fluide biologique est le sang, elle 5 renferme en outre un anticoagulant comme des ions citrate comme dans l'acide citrate dextrose ou de l'héparine. La quantité de l'agent anticoagulant est avantageusement comprise entre 10 et 100 UI, de préférence comprise entre 10 et 50 UI, notamment comprise entre 10 et 25 UI pour l'héparine. Elle dépendra du 10 composé utilisé et sera par exemple comprise entre des doses produisant un effet anticoagulant équivalent à celui-ci-dessus. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit la composition réactive renferme en outre un tampon. Le tampon utilisé est alors avantageusement un tampon pH 7 15 comme le tampon phosphate, le plus classiquement utilisé. Elle peut renfermer en outre un acide ou une base pour ajuster le pH du milieu. Dans encore d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit, le mélange de l'échantillon et des réactifs de la composition réactive est congelé avant analyse à l'aide d'un appareil d'analyse 20 détectant un composé comprenant un électron libre. Par exemple après prélèvement de l'échantillon, notamment de sang, on peut transférer le prélèvement dans un cryotube et placer ledit tube dans de l'azote liquide. Pour procéder ensuite à l'analyse, on décongèle rapidement le 25 mélange et on procède immédiatement à l'analyse. Par exemple on décongèle le mélange en 30 secondes et on procède dans les 30-60 secondes après décongélation au remplissage de la cellule de mesure et de préférence à l'analyse. Comme on l'a vu ci-dessus, le mélange de l'échantillon et des 30 réactifs de la composition réactive doit être réalisé le plus rapidement possible. Il a donc été conçu spécialement pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus un dispositif de prélèvement d'un échantillon pouvant comprendre une 2904112 5 seringue, permettant le prélèvement d'un échantillon par exemple le prélèvement in vivo d'un échantillon sanguin pour l'envoyer immédiatement en mélange avec la composition réactive sans risque d'injection en retour de l'échantillon mêlé à des réactifs. 5 C'est pourquoi la présente demande a aussi pour objet un dispositif de prélèvement d'un échantillon d'un fluide biologique pour l'envoyer immédiatement en mélange avec une composition réactive ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre d'aspiration dudit échantillon paramétrée pour prélever la quantité d'échantillon nécessaire pour la réaction 10 avec une quantité préétablie de composition réactive ci-dessus, et un dispositif anti-retour. Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention, le dispositif de prélèvement ci-dessus comprend une seringue munie d'un dispositif anti-retour. 15 La présente demande a aussi pour objet un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection, identification ou quantification de radicaux libres dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif de prélèvement d'un échantillon d'un fluide biologique ci-dessus ainsi qu'un récipient contenant une quantité préétablie de composition réactive ci-dessus, 20 ainsi, optionnellement, qu'un récipient contenant une quantité préétablie d'un composé piégeur de radicaux libres. Le procédé objet de la présente invention possède de très intéressantes qualités. II permet notamment de détecter, identifier ou quantifier directement les radicaux libres dans un fluide biologique. 25 Ces qualités sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des procédés, dispositifs et kits ci-dessus décrits, dans la détermination des radicaux libres comme les radicaux centrés sur l'oxygène (superoxyde, hydroxyle, alkoxyle...) ou le carbone (alkyle..) dans le sang. Par exemple chez l'homme, on obtient ainsi des informations sur la présence d'une 30 inflammation, d'une ischémie, d'un choc septique, l'effet d'un entraînement sportif intensif, etc... 2904112 6 On peut citer aussi la possibilité de tester l'efficacité de médicaments ou de produits ou compositions biologiques comme des milieux de transport ou de conservation de transplants. C'est pourquoi la présente demande a également pour objet un 5 procédé pour la détermination des radicaux libres comme les radicaux centrés sur l'oxygène (superoxyde, hydroxyle, alkoxyle...) ou le carbone (alkyle..) dans le sang, dans lequel on met en oeuvre le procédé ci-dessus sur un échantillon sanguin. Grâce au dispositif de prélèvement ci-dessus, une analyse est 10 possible aussi bien en laboratoire d'analyses qu'à l'hôpital et il n'est pas nécessaire de se trouver près de l'appareil d'analyse pour bénéficier de celle-ci. Un prélèvement prêt pour analyse peut attendre avant que l'on procède à l'analyse. Les conditions préférentielles de mise en oeuvre des procédés de 15 détection, identification ou quantification de radicaux libres dans un fluide biologique ci-dessus décrites s'appliquent également aux autres objets de l'invention visés ci-dessus, notamment aux dispositifs de prélèvement d'un échantillon d'un fluide biologique pour l'envoyer immédiatement en mélange avec une composition réactive et aux kits pour la mise en oeuvre dudit procédé. 20 La figure 1 représente les résultats obtenus sur des prélèvements sanguins effectués sur un rat nageur (à raison de 30 min, 3 fois/jour pendant 3 mois) à l'issue de la phase d'exercice. Piègeage avec la DEPMPO (100 mM). A) en présence de méthyl-béta-cyclodextrine (100 mM), spectre enregistré 35 sec 25 après prélèvement; B) en présence de méthyl-béta-cyclodextrine (100 mM) et après congélation de l'échantillon dans l'azote liquide pendant 3 jours, spectre enregistré 35 sec après décongélation; C) en absence de méthyl-bétacyclodextrine, spectre enregistré 35 sec après décongélation. 30 La figure 2 représente les résultats obtenus sur des prélèvements sanguins effectués sur un rat nageur (à raison de 30 min, 3 fois/jour pendant 3 mois) à l'issue de la phase d'exercice. Piègeage avec la DEPMPO (100 mM) en 2904112 7 présence de méthyl-béta-cyclodextrine (100 mM). Congélation de l'échantillon dans l'azote liquide pendant 3 jours, A) spectre enregistré 35 sec après décongélation; B) spectre enregistré l min 30 sec après décongélation; C) spectre enregistré 2 min 30 sec après décongélation; D) spectre enregistré 3 min 30 sec 5 après décongélation. La figure 3 représente les résultats obtenus sur des prélèvements sanguins effectués sur un coeur de rat reperfusé avec du sang après conservation du greffon pendant 5 heures dans du liquide cardioplégique. A) Arrêt et 10 conservation dans du Ringer lactate; B) Arrêt et conservation dans Celsior . Piègeage avec la DEPMPO (150 mM) en présence de méthyl-béta-cyclodextrine (120 mM). La figure 4 représente les résultats obtenus sur des prélèvements 15 sanguins veineux effectués chez un patient âgé, atteint de la maladie d'Alzheimer et présentant des signes de démence, recruté dans le cadre d'un essai clinique. Piégeage avec la DEPMPO (100 mM) en présence de méthyl-béta-cyclodextrine (100 mM); A) spectre enregistré 35 sec après décongélation; B) spectre enregistré 2 min 30 sec après décongélation; C) spectre enregistré 3 min 30 sec 20 après décongélation. Les exemples qui suivent illustrent la présente demande. Exemple 1 : Tube pour analyse 25 On a réalisé un tube pour analyse sanguine en installant dans un cryotube de 1,8 ml un aliquote de 0,25 ml d'une composition ayant la composition molaire suivante : 2904112 8 DTPA 2,4 mM Héparine sodique 30 UI (ou 6 L) Méthyl-~3-cyclodextrine 480 mM Tampon phosphate (pH7) 240 mM Le pH du tampon phosphate a été préalablement ajusté à 7, avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium. On a prévu séparément un flacon contenant 5 ml de DEPMPO 5 (600 mM dans l'eau distillée). Exemple 2 : Tube pour analyse prêt à l'emploi On ajoute au tube pour analyse sanguine de l'exemple 1, 0,25 ml 10 de la solution de DEPMPO dans l'eau distillée. On a donc la composition réactive finale suivante : DTPA 1,2 mM Héparine sodique 15 UI (ou 3 L) Méthyl-3-cyclodextrine 240 mM Tampon phosphate 120 mM DEPMPO 300 mM Eau distillée 0,5 ml Exemple 3 : Seringue pour analyse 15 On a réalisé une seringue pour analyse sanguine en installant dans une seringue dont la chambre d'aspiration est de 2 ml et munie d'un dispositif anti-retour, 0,25 ml d'une composition dosée comme indiqué à l'exemple 1. Exemple 4 : Kit pour analyse 20 On a réalisé un kit pour analyse sanguine en prévoyant dans un emballage, une seringue pour analyse sanguine de l'exemple 3 et un flacon contenant 0,25 ml de DEPMPO (600 mM dans l'eau distillée). 2904112 9 Exemple 5 : Dosage des radicaux libres dans un échantillon sanguin in vivo chez le rat. On aspire le contenu du tube pour analyse prêt à l'emploi de 5 l'exemple 2 dans une seringue de 2 ml. On prélève grâce à la même seringue 1 ml de sang dans l'artère fémorale d'un rat anesthésié à l'issue d'une période d'entraînement sportif (nage) de 30 min faisant partie d'un programme intensif (à raison de 30 min, 3 fois/jour pendant 3 mois). La composition finale des réactifs dans cet échantillon est la 10 suivante : DTPA 0,2 mM Héparine sodique 5 UI (ou 1 l) Méthylp-cyclodextrine 80 mM Tampon phosphate 40 mM DEPMPO 100 mM Eau distillée 0,5 ml Sang 1 ml On transfère le mélange dans une cellule plate en quartz, puis dans l'entrefer de l'aimant d'un spectromètre de RPE (Bruker ESP 300). 15 On procède immédiatement (dans les 30-60 secondes après le prélèvement et le remplissage de la cellule de mesure en quartz) à l'analyse à 25 C dans les conditions suivantes : Fréquence micro-onde : 9,79 GHz Puissance micro-onde : 10 mW Amplitude de modulation : 0,198 Gauss Fréquence de modulation : 100 kHz Gain du récepteur : 1 x 105 Constante de temps : 40,96 ms Etendue de balayage en champ : 130 Gauss 20 25 2904112 10 Vitesse de balayage en champ : 3,1 Gauss/s On obtient le spectre de la figure 1 A. Dans le prélèvement analysé par RPE, on peut observer que 5 l'exercice physique intensif se traduit par une production intense de radicaux libres, ce qui avait déjà été signalé par d'autres méthodes, indirectes. Exemple 6 : Dosage des radicaux libres dans un échantillon sanguin in vivo après congélation dans l'azote liquide et déconqélation. 10 On procède comme à l'exemple 5, mais après prélèvement du sang, on transfère le contenu de la seringue dans un cryotube et on place le tube dans l'azote liquide. On décongèle le mélange (en 30 secondes) 3 jours après l'avoir placé dans l'azote liquide et on procède immédiatement (dans les 30-60 15 secondes après décongélation et remplissage de la cellule de mesure en quartz) à l'analyse dans les conditions de l'exemple 5. On obtient un spectre représenté en figure 1B, semblable qualitativement à celui de la figure 1A. On précise que les comparaisons entre les spectres ne peuvent être effectuées que lorsque ces spectres ont été 20 enregistrés au même moment après prélèvement ou décongélation. La figure 2 (A à D) montre que la décroissance du signal est cependant faible dans un délai raisonnable (3 min 30 secondes au minimum) après décongélation de l'échantillon, ceci permettant de l'enregistrer de manière reproductible. De manière surprenante, on peut donc congeler le prélèvement 25 avant analyse. Exemple de comparaison: Utilisation d'une composition réactive sans agent stabilisant dans un échantillon sanguin in vivo 30 On procède comme à l'exemple 5, mais le tube pour analyse sanguine de l'exemple 1 ne renferme pas de méthylp-cyclodextrine. On obtient le spectre de la figure 1 C. 2904112 11 On peut observer qu'aucun signal de RPE ne peut être détecté dans ces conditions. La stabilisation est donc nécessaire. 5 Exemple 7 : Dosage des radicaux libres dans un échantillon sanquin obtenu dans un modèle in vitro. On aspire le contenu du tube pour analyse prêt à l'emploi de l'exemple 2 dans une seringue de 2 ml. On prélève grâce à la même seringue 0,5 ml de sang après canulation et aspiration dans le sinus coronaire d'un coeur 10 de rat dans les conditions suivantes. Le prélèvement sanguin est effectué dans le sinus coronaire d'un coeur de rat qui a été préalablement isolé et perfusé puis soumis au protocole expérimental suivant : - une période de contrôle normoxique de 30 min avec une solution de KrebsHenseleit (37 C, pH 7.35 ; 2.5 mM CaCl2, 10 mM glucose), un arrêt cardioplégique à 4 C réalisé d'une part par la solution cardioplégique classique de l'Hôpital Saint-Thomas d'autre part par une solution de type Celsior contenant des agents antiradicalaires (voir Pietri et al (1994) Transplantation 58(6): 739; Ménasché et al. (1994) Eur. J. 20 Cardiothorac. Surg. 8: 207). - une période de conservation de 5 heures en solution cardioplégique. - une reperfusion de 1 minute avec du sang de rat, au cours de laquelle le prélèvement est effectué dans le sinus coronaire, additionné au mélange piégeur + stabilisant (seringue de l'exemple 2), puis congelé dans l'attente 25 de l'expérience de RPE. La composition finale des réactifs dans cet échantillon est la suivante : 2904112 12 DTPA 1.2 mM Héparine sodique 7.5 UI (ou 1.5 L) Méthyl-R-cyclodextrine 120 mM Tampon phosphate 60 mM DEPMPO 150 mM Eau distillée 0,5 ml Sang 0,5 ml Le mélange est immédiatement congelé dans l'azote liquide. Après décongélation (effectuée en 30 secondes), on transfère le mélange dans une 5 cellule plate en quartz, puis dans l'entrefer de l'aimant d'un spectromètre de RPE (Bruker ESP 300). On procède immédiatement (dans les 30-60 secondes après la décongélation et le remplissage de la cellule de mesure en quartz) à l'analyse dans les conditions suivantes : 10 Fréquence micro-onde : 9,79 GHz Puissance micro-onde : 10 mW Amplitude de modulation : 0,198 Gauss Fréquence de modulation : 100 kHz 15 Gain du récepteur : 1 x 105 Constante de temps : 40,96 ms Etendue de balayage en champ : 130 Gauss Vitesse de balayage en champ : 3,1 Gauss/s 20 On obtient les spectres de la figure 3 (A et B). Le spectre de la figure 3A correspond à un prélèvement effectué dans un coeur de rat qui a été arrêté puis conservé dans la solution cardioplégique de Saint-Thomas; le spectre de la figure 3B correspond à un 25 prélèvement effectué dans un coeur de rat qui a été arrêté puis conservé dans 2904112 13 la solution cardioplégique de type Celsior . Les deux spectres ont été enregistrés 35 secondes après la décongélation. On observe que des radicaux sont produits à la reperfusion post-ischémique en présence de sang (Figure 3A) et que la conservation du greffon dans une solution antiradicalaire inhibe cette 5 production. Par ailleurs, des résultats antérieurs ont montré que la présence d'agents antiradicalaires améliore significativement la récupération postischémique cardiaque (voir Pietri et al (1994) Transplantation 58(6): 739; Ménasché et al. (1994) Eur. J. Cardiothorac. Surg. 8: 207), soulignant ainsi 10 l'intérêt de la détection des radicaux libres. Exemple 8 : Dosage des radicaux libres dans un échantillon sanguin in vivo chez l'homme. 15 Le prélèvement sanguin veineux a été réalisé chez des patients âgés, atteints de la maladie d'Alzheimer et présentant des signes de démence, recrutés dans le cadre d'un essai clinique. On aspire le contenu du tube pour analyse prêt à l'emploi de l'exemple 2 dans une seringue de 2 ml. On prélève grâce à une seringue stérile 20 séparée 3 ml de sang veineux d'un patient ci-dessus, et on transfère immédiatement le sang prélevé dans un tube à hémolyse hépariné. Immédiatement, 1 ml de ce sang est aspiré dans la seringue de 2 ml contenant le mélange piégeur + stabilisant préalablement installé puis congelé dans l'azote liquide dans l'attente de l'expérience de RPE. 25 La composition finale des réactifs dans cet échantillon est la suivante : 2904112 14 DTPA 0,2 mM Héparine sodique 5 UI (ou 1 L) Methyl-~i-cyclodextrine 80 mM Tampon phosphate 40 mM DEPMPO 100 mM Eau distillée 0,5 mL Sang 1 ml Après décongélation, le mélange est transféré dans une cellule plate en quartz, puis dans l'entrefer de l'aimant d'un spectromètre de RPE (Bruker ESP 300). On procède immédiatement (dans les 30-60 secondes après la 5 décongélation et le remplissage de la cellule de mesure en quartz) à l'analyse par RPE dans les conditions suivantes : Fréquence micro-onde : 9,79 GHz Puissance micro-onde : 10 mW 10 Amplitude de modulation : 0,198 Gauss Fréquence de modulation : 100 kHz Gain du récepteur : 1 x 105 Constante de temps : 40,96 ms Etendue de balayage en champ : 130 Gauss 15 Vitesse de balayage en champ : 3,1 Gauss/s On obtient les spectres de la figure 4 (A, B, C) enregistrés à différents temps suivant la décongélation (35 sec, 2 min 30 sec, 3 min 30 sec) 20 Les spectres obtenus montrent l'existence de radicaux libres dans les prélèvements issus de cette population de patients et souligne l'intérêt de cette technique de détection pour des études à visée clinique et thérapeutique. REVENDICATIONS 1. Un procédé de détection, identification ou quantification de radicaux libres dans un fluide biologique dans lequel : on prélève un fluide biologique, on mélange immédiatement ledit fluide biologique avec une composition réactive renfermant un composé piégeur de radicaux libres, un agent stabilisant et un agent chélatant non oxydant, puis on procède à l'analyse du mélange ainsi obtenu à l'aide d'un appareil d'analyse détectant un composé comprenant un électron libre. 2. Un procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'analyse du mélange est effectué par résonance paramagnétique électronique (RPE). 3. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le 15 composé piégeur de radicaux libres est une nitrone. 4. Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé piégeur de radicaux libres est une nitrone choisie parmi le 5-diéthoxyphosphoryl 5-méthyl-1-pyrroline N-oxyde (DEPMPO) et le 2-ethoxycarbonyl-2-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide (EMPO). 20 5. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la concentration du composé piégeur de radicaux libres lors de l'analyse est comprise entre 50 et 200 mM. 6. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'agent stabilisant est une cyclodextrine. 25 7. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la concentration de l'agent stabilisant lors de l'analyse est comprise entre 50 et 200 mM. 8. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'on mélange le fluide biologique avec la composition réactive renfermant 30 un composé piégeur de radicaux libres, un agent stabilisant et un agent chélatant non oxydant en moins de 10 secondes après le prélèvement. 2904112 16 9. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'agent chélatant qui n'est pas oxydant est l'acide diéthylène triamine pentacétique. 10. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce 5 que la concentration de l'agent chélatant est comprise entre 0,1 et 1,5 mM. 11. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le fluide biologique est choisi parmi le sang, l'urine, la sueur, des perfusats d'organes et des milieux de culture cellulaire humains. 12. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en 10 ce que la composition réactive renferme en outre un anticoagulant. 13. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la composition réactive renferme en outre un tampon. 14. Un procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le mélange de l'échantillon et des réactifs de la composition réactive est 15 congelé avant analyse à l'aide de l'appareil d'analyse. 15. Un dispositif de prélèvement d'un échantillon d'un fluide biologique pour l'envoyer immédiatement en mélange avec une composition réactive telle que définie à l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend une chambre d'aspiration dudit échantillon paramétrée pour prélever 20 la quantité d'échantillon nécessaire pour la réaction avec une quantité préétablie de composition réactive ci-dessus, et un dispositif anti-retour. 16. Un kit pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 14 de détection, identification ou quantification de radicaux libres dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un 25 dispositif de prélèvement d'un échantillon d'un fluide biologique tel que défini à la revendication 14 ainsi qu'un récipient contenant une quantité préétablie de composition réactive telle que définie à l'une des revendications 1,3,4,5,6,7,8,9,10,12 et 13. 17. Un kit selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend 30 en outre un récipient contenant une quantité préétablie d'un composé piégeur de radicaux libres.