Brevet FR2901281A1 — publié le 20071123

PROCÉDÉ D'EXTRACTION DES ACIDES DÉSOXYRIBONUCLÉIQUES (ADN) DE MICROORGANISMES ÉVENTUELLEMENT PRÉSENTS DANS UN ÉCHANTILLON SANGUIN La présente invention se rapporte au domaine de la détection et de l'identification de microorganismes éventuellement présents dans un échantillon sanguin. Elle concerne tout particulièrement un procédé d'extraction des acides désoxyribonucléiques (ADN) de microorganismes éventuellement présents dans un échantillon sanguin en vue de leur identification. La mise au point de méthodes simples et rapides permettant la détection et/ou l'identification et/ou la détermination du taux de microorganismes éventuellement présents dans un échantillon sanguin est un enjeu majeur notamment dans le domaine de la santé. Actuellement, les méthodes de biologie moléculaire et particulièrement les techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR) sont en pleine expansion. En effet, ces techniques présentent une grande sensibilité et spécificité pour l'identification et/ou la quantification des microorganismes. Toutefois, l'application de ces méthodes de biologie moléculaire et particulièrement les techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à des échantillons sanguins présente des difficultés, notamment en termes de sensibilité et de réalisation. En effet, les échantillons sanguins comprennent des agents inhibiteurs des techniques de biologie moléculaire et en particulier des techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Ces agents inhibiteurs peuvent interférer avec les procédés d'extraction d'ADN et/ou dégrader les acides désoxyribonucléiques (ADN) des cellules et/ou inhiber l'activité des enzymes, notamment des polymérases utilisées dans différentes techniques de biologie moléculaire. À titre d'exemples de tels agents inhibiteurs en particulier des techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR), notamment présents dans le sang total, on peut citer les ions calcium, l'hémoglobine, la lactoferrine, l'hémine, l'urée et l'héparine du sang (Al-Soud, W.A. and Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol 39:2:485-493). Il subsiste donc un besoin pour des procédés d'extraction d'ADN de microorganismes présents dans un échantillon sanguin, en vue de leur détection et/ou de leur identification. Les inventeurs ont découvert un procédé particulier permettant de résoudre en tout ou partie les problèmes évoqués ci-dessus. Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'extraction d'ADN de microorganismes éventuellement présents dans un échantillon sanguin comprenant les étapes suivantes : i) la filtration d'un échantillon sanguin au travers 25 d'une membrane de filtration dont les pores présentent un diamètre allant de 0,01 wm à 50 t,m, en particulier de 0,1 m à 10 m et tout particulièrement de 0,2 Kim à 1 m ; ii) le lavage de ladite membrane de filtration ; iii) l'extraction des acides désoxyribonucléiques des 30 microorganismes éventuellement présents sur ladite membrane de filtration. On entend par échantillon sanguin au sens de la présente invention un échantillon de sang total ou d'hémoculture, qui a éventuellement été traité en vue de réduire le taux et/ou d'éliminer les globules rouges et/ou les plaquettes présents dans ledit échantillon. L'étape de traitement d'un échantillon sanguin en vue de réduire le taux et/ou d'éliminer les globules rouges et/ou les plaquettes présents dans ledit échantillon peut être réalisée selon des techniques bien connues de l'Homme du Métier. À titre d'exemples de telles techniques, on peut citer 10 celles décrites dans la Demande PCT WO 03/025207: - la technique d'agrégation plaquettaire à l'aide d'agents d'agrégation tels que des anticorps spécifiques d'un antigène plaquettaire, suivie de la filtration de l'échantillon traité ; 15 - la technique d'agglutination des globules rouges à l'aide d'agents d'agrégation tels que les lectines suivie de la filtration de l'échantillon traité. Les échantillons sanguins de sang total peuvent être obtenus selon des techniques bien connues de l'Homme du 20 Métier à l'aide par exemple d'une aiguille munie d'une seringue introduite en particulier dans une veine de l'avant-bras ou du pli du coude d'un individu. Un échantillon de 1 à 10 mL de sang prélevé en particulier sur anticoagulant, notamment EDTA, citrate de sodium ou 25 héparine, obtenu chez un sujet humain ou animal peut être suffisant pour mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention. Les échantillons sanguins d'hémoculture peuvent être obtenus après ensemencement du sang total prélevé chez un 30 sujet humain ou animal sur des milieux de culture appropriés au développement des microorganismes. Une membrane de filtration adaptée pour le procédé selon l'invention peut être identifiée simplement par l'Homme du Métier au regard de ses connaissances générales. En particulier, la membrane de filtration selon l'invention peut être choisie dans le groupe comprenant les membranes en fluoride de polyvinylidène, en polyester, en nylon, en polypropylène, en polycarbonate et en polyethersulfone, en particulier en fluoride de polyvinylidène. De préférence, ladite membrane de filtration n'est pas à base de cellulose. L'étape i) de filtration du procédé selon l'invention peut être effectuée à l'aide de dispositifs et de supports de filtre bien connus de l'Homme du Métier, notamment un support tel que décrit dans la Demande de Brevet US 2004/0208796. À l'étape ii), on entend par lavage , une étape permettant de réduire le taux des impuretés retenues sur la membrane de filtration tout en permettant à au moins une partie des microorganismes d'être maintenus sur ladite membrane. Les impuretés peuvent être notamment des agents inhibiteurs des techniques de biologie moléculaire (Wilson,J.G. 1997. Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification. Appt Environ Microbiol 63:10:3741-3751), notamment . - des protéines plasmatiques, les immunoglobulines G (Al-Soud, W.A., Jonsson, L.J., and Radstrom, P. 2000. Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR. J Clin Microbiol 38:1:345-350); - des enzymes (protéases) ; - des polyamines ; - du polyanéthole sulfonate de sodium (SPS) ; - des anticoagulants sanguins comme l'héparine (Satsangi, J., Jewell, D.P., Welsh, K., Bunce, M., and Bell, J.I. 1994. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:8911:1509-1510) et l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (Al-Soud, W.A. and Radstrom, P. 2001. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol 39:2:485-493); - l'hémoglobine, l'hémine (Akane, A., Matsubara, K., Nakamura, H., Tahahashi, S., and Kimura, K. 1994. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci 39:2:362-372), la bilirubine, les phénols ; - des détergents tels que le sodium dodecyl sulfate, le tryton X100 ; et - les acides biliaires. Avantageusement, ladite étape ii) permet également de lyser, en particulier par un choc hypothermique, les globules rouges de l'échantillon sanguin et en particulier d'éliminer leur contenu, notamment l'hémoglobine contenue dans ces globules rouges. L'Homme du Métier pourra déterminer simplement le volume de solution de lavage utilisée à l'étape ii) au regard de ses connaissances générales. Le volume de solution de lavage peut correspondre à un volume compris entre et 20, en particulier entre " et 10 et tout particulièrement entre 1 et 5 fois le volume de l'échantillon sanguin filtré à l'étape i). 5 Par exemple, lorsque l'échantillon sanguin filtré à l'étape i) a un volume allant de 0,2 à 5 mL et tout particulièrement de 0,5 à 1 mL, alors l'étape ii) de lavage peut être effectuée avec un volume de solution de lavage allant de 1 à 10 mL, en particulier de 3 à 5 mL et tout particulièrement de 3 mL. À titre d'exemple encore, lorsque l'échantillon sanguin filtré à l'étape i) a un volume allant de 5 à 100 mL, tout particulièrement de 5 à 20 mL, alors l'étape ii) de lavage peut être effectuée avec un volume de solution de lavage allant de 5 à 50 mL, en particulier de 8 à 20 mL et tout particulièrement de 10 mL. La solution de lavage adaptée pour le procédé selon l'invention peut être identifiée simplement par l'Homme du 15 Métier au regard de ses connaissances générales. La solution de lavage peut être choisie notamment parmi des solutions aqueuses, en particulier de l'eau et tout particulièrement de l'eau osmosée, préférentiellement stérilisée par filtration. 20 Ladite stérilisation de l'eau par filtration peut être réalisée notamment en utilisant une membrane de filtration dont les pores peuvent présenter un diamètre d'environ 0,22 pm. À titre d'exemples de solutions de lavage utilisables 25 pour l'étape ii) de lavage selon l'invention, on peut citer l'eau pure pour biologie moléculaire disponible chez Eppendorf avec notamment la référence 0032.006.159, l'eau pure issue des systèmes connus de purification avec notamment le système Purelab de chez ELGA Labwater, ou le 30 système Milli-Q de chez Millipore, ou le système Infinity UV/UF de chez Werner. Lorsque le procédé selon l'invention utilise un dispositif et/ou un support de filtre, l'étape ii) de lavage peut être effectuée notamment par passage de la solution de lavage sur ladite membrane de filtration, en laissant en place la membrane de filtration dans le dispositif et/ou sur le support de filtre utilisé à l'étape i). L'étape d'extraction des acides désoxyribonucléiques de microorganismes éventuellement présents sur ladite membrane de filtration peut être effectuée selon des techniques bien connues de l'Homme du Métier telles que des méthodes de lyse physique notamment thermique ou par sonication, des méthodes de lyse chimique, notamment décrites dans le manuel de Sambrook J., Fritsch E.F. et Maniatis T. (Molecular cloning : a laboratory manuel, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y., 1989 On entend par microorganisme un organisme vivant appartenant à l'un des trois règnes suivants, celui des monères, des protistes et des protozoaires. Les microorganismes présentent une structure cellulaire eucaryote ou procaryote, ou acaryote, une taille microscopique ou ultramicroscopique et sont unicellulaires. À titre d'exemples de microorganismes, on peut citer : - les bactéries telles que Escherichia coli, klebsielle, shigelle, streptocoques, staphylocoques, enterocoques, proteus, enterobacter, serratia, pseudomonas, bacillus, corynebactéries, listeria, acinetobacter, cryptocoques, bartonella, mycobactéries ; et - les champignons tels que candida, aspergillus. Tout particulièrement, le procédé seLon l'invention 30 comprend en outre l'étape suivante : iv) l'identification des microorganismes notamment des bactéries, des virus, des protozoaires et/ou des champignons éventuellement présents dans ledit échantillon sanguin. On entend par identification , la détermination de l'espèce d'un microorganisme. L'identification des microorganismes peut être effectuée à partir des acides désoxyribonucléiques extraits 5 desdits microorganismes par des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'Homme du Métier. En particulier, l'étape iv) comprend l'utilisation d'une technique utilisant une activité de type polymérase choisie dans le groupe comprenant la réaction en chaîne par 10 polymérase en point final, la réaction en chaîne par polymérase multiplex, la réaction en chaîne par polymérase qualitative, la réaction en chaîne par polymérase semiquantitative , la réaction en chaîne par polymérase quantitative. 15 Des appareils de PCR en point final disponibles en particulier chez Applied Biosystems sous la dénomination ABI PRISM , chez Roche Diagnostics sous la dénomination COBAS Amplicor peuvent être utilisés dans le procédé selon l'invention. 20 Des appareils de PCR en temps réel disponibles en particulier chez Applied Biosystems sous la dénomination 7500 Real-Time PCR System , chez Roche :Diagnostics sous la dénomination COBAS Taqman et chez Genesystems sous la dénomination GeneDisc cycler peuvent être utilisés 25 dans le procédé selon l'invention. Des kits de PCR en temps réel avec des couples d'amorces et sondes spécifiques d'un microorganisme disponibles chez Roche avec le Lightcycler SeptiFast kit sous les références 04469046001 ou 04488814001); 30 chez Biotage avec les kits microbial species determination and resistance sous les références 8, 7 et 12; chez BAG (Biologish Analysensystem GMbH) avec les kits Hyplex StaphyloResist sous la référence 3801, Hyplex StaphyloResist plus sous la référence 3809, Hyplex EnteroResist sous la référence 3802 peuvent être utilisés dans le procédé selon l'invention Par exemple, le kit de PCR en temps réel disponible chez Argène avec la référence 69-002 est utilisable pour identifier et déterminer le taux de virus d'Epstein-Barr (EBV) présent dans un échantillon sanguin. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape suivante : v) l'identification d'au moins un gène de résistance à un antibiotique chez au moins un microorganisme éventuellement présent dans ledit échantillon sanguin. L'identification d'un gène de résistance à un antibiotique à partir des acides désoxyribonucléiques extraits des microorganismes peut être effectuée par des techniques de biologie moléculaire bien connues de l'Homme du Métier. En particulier, l'étape v) comprend l'utilisation d'une technique de réaction en chaîne par polymérase avec notamment des couples d'amorces et éventuellement de sondes spécifiques d'au moins un gène de résistance à un antibiotique. Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape suivante : vi) la détermination du taux de microorganismes, notamment des bactéries, des virus, des protozoaires et/ou des champignons éventuellement présents dans ledit échantillon sanguin. On entend par taux de microorganismes , la quantité de microorganismes présents dans l'échantillon sanguin sur lequel le procédé selon l'invention est mise en oeuvre. La détermination du taux de microorganismes éventuellement présents dans ledit échantillon sanguin peut être effectuée par des techniques bien connues de l'Homme du Métier. À titre d'exemple, cette détermination peut s'effectuer en comparant les résultats obtenus à l'étape iv) d'identification des microorganismes avec les résultats obtenus avec des témoins positifs correspondant à des dilutions déterminées desdits microorganismes. En particulier, l'étape vi) comprend l'utilisation de la technique de la réaction en chaîne par polymérase en 10 temps réel. Avantageusement au moins une des étapes iv), v), vi) du procédé selon l'invention est réalisée dans un milieu adapté à au moins une technique de biologie moléculaire, comprenant un extrait des acides désoxyribonucléiques des 15 microorganismes obtenu à l'étape iii). On entend par milieu adapté à au moins une technique de biologie moléculaire , un milieu comprenant des agents permettant d'augmenter le rendement et/ou la sensibilité et/ou la spécificité de ces techniques, notamment des 20 réactions en chaîne par polymérase. De tels milieux sont bien connus de l'Homme du Métier, tels que décrits dans la littérature (Wilson, J.G. 1997. Inhibition and Facilitation of Nucleic Acici Amplification. Appt Environ Microbiol 63:10:3741-3751). 25 À titre d'exemple de milieux adaptés aux techniques de PCR, on peut citer les milieux comprenant notamment de l'albumine sérique bovine (Akane, A., Matsubara, K., Nakamura, H., Tahahashi, S., and Kimura, K. 1994. Identification of the heme compound c:opurified with 30 deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci 39:2:362-372), du glycérol, des ions magnésium (Satsangi, J., Jewell, D.P., Welsh, K., Bunce, M., and Bell, J.I. 1994. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:8911:1509-1510), de la triméthyl glycine, du diméthylsulfoxide, du polyéthylène glycol, du Tween 20 , du Tween 40 , du Tween 80 , du :DMSO, du Triton X-100 , du Triton X-114 , de la bétaine monohydrate, de la bétaine triméthylglycine, du PEG 35000, du :PEG 400, du PEG 6000 et de l'acétamide. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention, comprend préalablement à l'étape i), les étapes suivantes : a) l'addition au sang total ou à l'hémoculture d'une solution d'agglutination des globules rouges et/ou d'une solution d'agrégation plaquettaire ; et b) la filtration de la préparation obtenue à l'étape a) au travers d'un filtre dont les pores présentent un diamètre allant de 2 M à 50 M, en particulier allant de 10 M à 25 uM et tout particulièrement de 17 }gym. En particulier, ladite solution d'agglutination des globules rouges comprend au moins un agent d'agglutination choisi dans le groupe comprenant les lectines, le polyéthylènimine, la polyvinylpyrrolidone, les gélatines, les dextranes et les polyéthylènes glycols, en particulier les lectines. Tout particulièrement, les lectines sont choisies dans le groupe comprenant les lectines de _cens culinaris, 25 Phaseolus vulgaris, Vicia sativa, Vicia faba et de Erythrina corallodendron. L'agent d'agglutination, notamment la lectine, peut être présent dans la solution d'agglutination à une concentration allant de 10 g/ml à 200 g/ml, en 30 particulier de 15 log/ml à 100 g/ml et tout particulièrement de 20 log/ml à 30 pug/ml. En particulier, ladite solution d'agrégation plaquettaire comprend au moins un agent d'agrégation plaquettaire choisi dans le groupe comprenant les anticorps spécifiques d'un antigène plaquettaire, la thrombine, la trypsine, le collagène, le thromboxane A2, le facteur d'activation plaquettaire, l'adrénaline, l'acide arachidonique, la sérotonine et l'épinéphrine, en particulier les anticorps spécifiques d'un antigène plaquettaire et le collagène. Les anticorps spécifiques d'un antigène plaquettaire peuvent être présents dans la solution d'agrégation plaquettaire à une concentration allant de 0,5 log/ml à 100 lug/ml, en particulier de 1 'ug/ml à 60 g/ml et tout particulièrement de 5 g/ml à 45 g/ml. Le collagène peut être présent dans la solution d'agrégation plaquettaire à une concentration allant de 0,05 g/ml à 50 !.tg/ml, en particulier de 1 ig/ml à 20 g/ml D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des figures et des exemples qui suivent. Les figures et les exemples qui suivent sont donnés à 20 titre illustratif et non limitatif : - la figure 1 (A et B) illustre l'identification et la quantification d'Escherichia Coli présents dans des échantillons sanguins de sang total. La figure lA illustre sous forme de courbe les résultats des réactions en chaîne 25 par polymérase en temps réel utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia Coli. La figure 1B illustre sous forme d'un tableau le cycle seuil et l'amplitude des réactions en chaîne par polymérase en temps réel. 30 - la figure 2 (A et B) illustre l'identification et la quantification de Staphylococcus epidermis présents dans des échantillons sanguins de sang total. La figure 2A illustre sous forme de courbe les résultats des réactions en chaîne par polymérase en temps réel utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques de Staphylococcus epidermis. La figure 2B illustre sous forme d'un tableau le cycle seuil et l'amplitude des réactions en chaîne par polymérase en temps réel. - la figure 3A montre une photo d'un gel d'agarose après réaction en chaîne par polymérase (PCR) en point final et migration en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli.. - la figure 3B montre les résultats des réactions en chaîne par polymérase (PCR) quantitatives en temps réel en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli. - la figure 4 illustre sous la forme de courbes l'identification et la quantification d'Escherichia coli, de Staphylococcus epidermidis et de Klebsiella oxytoca présents dans des échantillons sanguins d'hémoculture. La figure 4 illustre sous forme de courbe les résultats des réactions en chaîne par polymérase en temps réel utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli, de Staphylococcus epidermidis et de Klebsiella oxytoca. - la figure 5 illustre sous la forme de courbes l'identification et la quantification d'Escherichia coli présents dans des échantillons sanguins de sang total prélevé sur EDTA (figure 5A) et sur citrate de sodium (figure 5B) et de Staphylococcus epidermidis présents dans des échantillons sanguins de sang total prélevé sur héparine (figure 5C). La figure 5 illustre sous forme de courbe les résultats des réactions en chaîne par polymérase en temps réel utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli et de Staphylococcus epidermidis. EXEMPLES 1. Exemple I : Procédé de préparation d'échantillons sanguins I.1 Procédé de préparation d'échantillons sanquins d'hémocultures 100 cul d'échantillon sanguin d'hémoculture ont été prélevés à l'aide d'une seringue stérile au travers du septum de flacons d'hémocultures. 1 mL d'eau osmosée filtrée (à l'aide d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,22 }gym) ont ensuite été ajoutés dans chaque échantillon. Chaque échantillon a été filtré au travers d'une membrane de filtration en fluoride de polyvinylidène de diamètre de 25 à 32 mm et dont les pores présentent un diamètre allant de 0,2 m à 1 m. La membrane de filtration était contenue dans un support de filtre tel que décrit dans la demande de brevet US 2004/0208796. Chaque membrane de filtration a ensuite été lavée avec 1 à 10 ml d'eau pure ou osmosée, par filtration à l'aide d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,22 m. Après filtration, chaque membrane de filtration a été 25 récupérée au moyen de pinces stériles et insérée dans un microtube stérile contenant de 200 iul à 1 ml: - d'eau pure pour biologie moléculaire telle que celle commercialisée par Eppendorf, ou - d'eau pure pour biologie moléculaire additionnée avec 30 de l'albumine sérique bovine (BSA) à 0,7 %, ou - d'eau pure pour biologie moléculaire additionnée avec du Tris HC1 à 125 mM, de la Bétaïne à 160 mM et du dimethylsulfoxide (DMSO) à 5 %, à un pH de 9,3 ajusté par du NaOH à 1 M. I.2 Procédé de préparation d'échantillons sanguins de sang 5 total ml de sang total prélevés sur anticoagulant (EDTA, Héparine ou citrate de sodium) ont été ajoutés à 20 ml de solution d'agglutination des globules rouges. Ladite solution d'agglutination comprenant la lectine lens culinaris à 25 pg/ml, du polyéthylène glycol (PEG) à 1% dans un milieu contenant 75% de bouillon de coeur de cervelle et 25% de Tryptone Soy Broth (TSB). Après incubation 30 minutes à température ambiante, les globules rouges ont agglutiné en culot. 15 à 20 mL de surnageant du culot de globules rouges ont été prélevés et incubés en présence de 1 ml de solution d'agrégation plaquettaire. Ladite solution d'agrégation comprenant l'anticorps monoclonal anti-CD9 à 45 pg/mL dans un milieu contenant 75% 20 de bouillon de coeur de cervelle et 25% de TSB. Après agrégation des plaquettes, la préparation a été filtrée au travers d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 17 }gym. Cette étape de filtration a permis de retenir sur le 25 filtre les agrégats plaquettaires et les cellules sanguines de taille supérieure à la taille des pores de du filtre. Le filtrat a ensuite été à nouveau filtré au travers d'une membrane de filtration en fluoride de polyvinylidène de diamètre de 25 à 32 mm et dont les pores ont un diamètre 30 allant de 0,2 m à 1 m. La membrane de filtration était contenue dans un support de filtre tel que décrit dans la Demande de Brevet US 2004/0208796. La membrane de filtration a ensuite été lavée avec 8 à 20 ml d'eau pure ou osmosée, par filtration. Après filtration, la membrane de filtration a été récupérée au moyen de pinces stériles et insérée dans un microtube stérile contenant entre 200 ~l et 1 ml soit : - d'eau pure pour biologie moléculaire telle que celle commercialisée par Eppendorf, soit - d'eau pure pour biologie moléculaire additionnée avec de l'albumine sérique bovine (BSA) à 0,7 %, soit - d'eau pure pour biologie moléculaire additionnée avec du Tris HCl à 125 mM, de la Bétaïne à 160 mM et du dimethylsulfoxide (DMSO) à 5 %, à un pH de 9,3 ajusté par du NaOH à 1 M. II. Exemple II : Identification de microorganismes présents dans des échantillons sanguins II.1 Procédé d'extraction d'ADN L'extraction d'ADN a été réalisée à partir des membranes de filtration contenues dans des microtubes stériles, obtenues après la mise en oeuvre des procédés décrits dans l'exemple 1. Chaque microtube a été soumis à une succession d'étapes de chauffage et/ou sonication, et/ou congélation telles que décrites dans le Maniatis (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. in Molecular cloning (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). II.2 Techniques de Réaction en chaîne par polymérase (PCR) utilisées II.2.1 Techniques de Réaction en chaîne par polymérase 30 (PCR) quantitative en temps réel 30 à 42 pL d'ADN extraits selon le procédé décrit dans le paragraphe précédent (11.1) ont été ajoutés à 30 pL de mélange contenant la polymérase Taq et des deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) en milieu tamponné. 12 pL de cette préparation ont été déposés dans des puits contenant la sonde fluorescente et le couple d'amorces spécifiques des souches de microorganismes à détecter tels que ceux décrits dans la Demande PCT WO 2004/024944. Le témoin négatif correspond à un puit dépourvu de sonde fluorescente. Le témoin positif correspond à un puit comprenant une séquence synthétique d'ADN avec les sondes fluorescentes et le couple d'amorces spécifiques de ladite séquence. Les résultats ont été exprimés d'une part sous la forme de courbes d'amplification montrant la variation d'intensité de la fluorescence en fonction des cycles d'amplification (courbes présentées sur les figures 1, 2 et 4). D'autre part, les tableaux des figures 1 et 3 présentent pour chaque réaction en chaîne par polymérase réalisée : - le cycle seuil ou Ct, correspondant au nombre de cycles minimal nécessaire pour atteindre la phase 25 exponentielle d'amplification de l'ADN. - l'amplitude correspondant à la différence entre l'intensité de fluorescence maximale et minimale obtenue. II.2.2 Techniques de Réaction en chaîne par polymérase (PCR) classique, puis migration sur gel d'agarose 30 7 l d'ADN extraits selon le procédé décrit dans le paragraphe précédant (11.1) ont été ajoutés à 43 pL d'un mélange contenant de la polymérase Taq , des deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) et le couple d'amorces spécifique des microorganismes à détecter, en milieu tamponné. 40 cycles d'amplification ont été réalisés. Puis, 15 pL d'ADN amplifiés ont été pipetés, 3 pL de bleu de bromophénol y ont été ajoutés et cette préparation a été déposée dans un puit au sein d'un gel d'agarose. Un courant a été appliqué afin de faire migrer les fragments d'ADN amplifiés en fonction de leur poids moléculaire (PM). Une photo d'un gel d'agarose après migration est présentée sur la figure3A. II.3 Identification d'Escherichia coli et de Staphylococcus epidermis présents dans des échantillons sanguins de sang 15 total 5 ml de sang total ont été traités selon le protocole décrit dans le paragraphe I.2 dans lequel la membrane de filtration était en fluoride de polyvinylidène de 25 mm de diamètre et dont les pores présentent un diamètre d'environ 20 0,65 m. 8mL d'eau osmosée filtrée à l'aide d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,22 pm ont été utilisés pour laver la membrane de filtration. Après extraction de l'ADN selon le protocole décrit dans le paragraphe II.1, des réactions en chaîne par 25 polymérase (PCR) en temps réel ont été réalisées selon le protocole décrit dans le paragraphe II.2.1, en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli et de Staphylococcus epidermis. La figure 1 (A et B) montre les résultats des réactions 30 en chaîne par polymérase utilisant des sondes fluorescentes et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli. La figure 2 (A et B) montre les résultats des réactions en chaîne par polymérase utilisant des sondes fluorescentes et un couple d'amorces spécifiques de Staphylococcus epidermis. Ces résultats montrent que le procédé de préparation d'échantillon sanguin de sang total selon l'invention permet d'obtenir des échantillons dans lesquels les microorganismes peuvent être identifiés et quantifier de manière spécifique et reproductible par des techniques de réaction en chaîne par polymérase. II.4 Identification d'Escherichia coli présents dans des échantillons sanquins de sanq total 5 ml de sang total ont été traités selon le protocole décrit dans le paragraphe I.2 dans lequel la membrane de filtration était en fluoride de polyvinylidène de 25 mm de diamètre et dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,65 m. 8mL d'eau osmosée filtrée à l'aide d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 0 ,22 m, ont été utilisés pour laver la membrane de filtration. Après extraction de l'ADN selon le protocole décrit dans le paragraphe I1.1, des dilutions de l'extrait d'ADN en eau pure pour biologie moléculaire ont été réalisées pour tester la sensibilité des PCR : dilution de l'extrait d'ADN de 1/100 à 1/50000. Des réactions en chaîne par polymérase (PCR) quantitatives en temps réel selon le protocole décrit dans le paragraphe II.2.1 et en point final selon le protocole décrit dans le paragraphe 1I.2.2 ont ensuite été réalisées. Une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli ont été utilisées. La figure 3A montre une photo d'un gel d'agarose après réaction en chaîne par polymérase (PCR) classique et migration en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli. La figure 3B montre les résultats des réactions en chaîne par polymérase (PCR) quantitatives en temps réel en utilisant des sondes fluorescentes et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli. Ces résultats montrent que le procédé de préparation d'échantillon sanguin issu de sang total selon l'invention permet d'obtenir des échantillons dans lesquels les microorganismes peuvent être identifiés et quantifiés de manière spécifique, reproductible et avec une certaine sensibilité par des techniques de réaction en chaîne par polymérase en temps réel ou en point final. II.5 Identification d'Escherichia coli, de Staphylococcus epidermidis et de Klebsiella oxytoca présents dans des échantillons sanquins d'hémoculture Des échantillons sanguins d'hémoculture ont été préparés selon le protocole décrit dans le paragraphe I.1 dans lequel la membrane de filtration était en fluoride de polyvinylidène de 25 mm de diamètre et dont le diamètre des pores est d'environ 0,65 m. 3mL d'eau osmosée ont été utilisés pour laver la membrane de filtration. Après extraction de l'ADN selon le protocole décrit dans le paragraphe II.1, des réactions en chaîne par polymérase (PCR) quantitatives en temps réel ont été réalisées selon le protocole décrit dans le paragraphe II.2.1, en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli, de Staphylococcus epidermidis et de Klebsiella oxytoca. Les résultats sont présentés sur la figure 4. Ces résultats montrent que le procédé de préparation d'échantillon sanguin issu d'hémoculture selon l'invention permet d'obtenir des échantillons dans lesquels les microorganismes peuvent être identifiés et quantifiés de manière spécifique et reproductible par des techniques de réaction en chaîne par polymérase. II.6 Identification d'Escherichia coli et de Staphylococcus epidermis présents dans des échantillons sanguins de sang total prélevé sur différents anticoagulants 5 ml de sang total prélevé dans des tubes contenant un anticoagulant sanguin de type EDTA tripotassique, citrate de sodium ou héparine (héparine de lithium) ont été traités selon le protocole décrit dans le paragraphe I.2 dans lequel la membrane de filtration était en fluoride de polyvinylidène de 25 mm de diamètre et dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,65 hum. 8mL d'eau osmosée filtrée à l'aide d'un filtre dont les pores présentent un diamètre d'environ 0,22 pm ont été utilisés pour laver la membrane de filtration. Après extraction de l'ADN selon le protocole décrit dans le paragraphe 11.1, des réactions en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel ont été réalisées selon le protocole décrit dans le paragraphe II.2.1, en utilisant une sonde fluorescente et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli et de Staphylococcus epidermis. Les figures 5 A et 5 B montre les résultats des réactions en chaîne par polymérase utilisant des sondes fluorescentes et un couple d'amorces spécifiques d'Escherichia coli pour de l'ADN bactérien issu de sang total prélevé sur EDTA tripotassique (figure 5A) et sur citrate de sodium (figure 5B). La figure 5 C montre les résultats des réactions en chaîne par polymérase utilisant des sondes :Fluorescentes et un couple d'amorces spécifiques de Staphylococcus epidermis pour de l'ADN bactérien issu de sang total prélevé sur héparine (figure 5C). Ces résultats montrent que le procédé de préparation d'échantillon sanguin issu de sang total prélevé sur différents anticoagulants selon l'invention permet d'obtenir des échantillons dans lesquels les microorganismes peuvent être identifiés et quantifiés de manière spécifique et reproductible par des techniques de réaction en chaîne par polymérase.10 REVENDICATIONS 1. Procédé d'extraction d'ADN de microorganismes éventuellement présents dans un échantillon sanguin 5 comprenant les étapes suivantes : i) la filtration d'un échantillon sanguin au travers d'une membrane de filtration dont les pores présentent un diamètre allant de 0,01 m à 50 m, en particulier de 0,1 pum à 10 m et tout particulièrement de 0,2 putt à 1 !Àm ; 10 ii) le lavage de ladite membrane de filtration ; et iii) l'extraction des acides désoxyribonucléiques des microorganismes éventuellement présents sur ladite membrane de filtration. 15 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : iv) l'identification des microorganismes notamment des bactéries, des virus, des protozoaires et/ou des champignons éventuellement présents dans ledit échantillon 20 sanguin. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape iv) comprend l'utilisation d'une technique de biologie moléculaire utilisant une activité de type 25 polymérase choisie dans le groupe comprenant la réaction en chaîne par polymérase en point final, la réaction en chaîne par polymérase en temps réel, la réaction en chaîne par polymérase multiplex, la réaction en chaîne par polymérase qualitative, la réaction en chaîne par polymérase semi- 30 quantitative et la réaction en chaîne par polymérase quantitative. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : v) l'identification d'au moins un gène de résistance à 5 un antibiotique chez au moins un microorganisme éventuellement présent dans ledit échantillon sanguin. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape v) comprend l'utilisation d'une technique de 10 réaction en chaîne par polymérase. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'étape suivante : 15 vi) la détermination du taux de microorganismes notamment des bactéries, des virus, des protozoaires et/ou des champignons éventuellement présents dans ledit échantillon sanguin. 20 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite membrane de filtration est choisie dans le groupe comprenant les membranes en fluoride de polyvinylidène, en polyester, en nylon, en polypropylène, en polycarbonate et en polyethersulfone, en 25 particulier en fluoride de polyvinylidène. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite membrane de filtration n'est pas à base de cellulose. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit échantillon sanguin est choisi dans le groupe comprenant : -un échantillon sanguin de sang total ;; et 3025 - un échantillon sanguin d'hémoculture. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend préalablement à 5 l'étape i), les étapes suivantes : a) l'addition au sang total ou à l'hémoculture d'une solution d'agglutination des globules rouges et/ou d'une solution d'agrégation plaquettaire ; et b) la filtration de la préparation obtenue à l'étape a) 10 au travers d'un filtre dont les pores présentent un diamètre allant de 2 M à 50 M, en particulier allant de 10 tlM à 25 M et tout particulièrement de 17 }gym. 11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en 15 ce que ladite solution d'agglutination comprend au moins un agent d'agglutination choisi dans le groupe comprenant les lectines, le polyéthylènimine, la polyvinylpyrrolidone, les gélatines, les dextrans et les polyethylènes glycols, en particulier les lectines de Lens culinaris. 20 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que ladite solution d'agrégation plaquettaire comprend au moins un agent d'agrégation plaquettaire choisi dans le groupe comprenant par les 25 anticorps spécifiques d'un antigène plaquettaire, la thrombine, la trypsine, le collagène, le thromboxane A2, le facteur d'activation plaquettaire, l'adrénaline, l'acide arachidonique, la sérotonine et l'épinéphrine, en particulier les anticorps spécifiques d'un antigène 30 plaquettaire et le collagène.