Brevet FR2898359A1 — publié le 20070914

VARIANTS AMELIORES DE L'INTERFERON- GAMMA HUMAIN (IFNy) Introduction La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle porte sur l'amélioration de l'interféron y humain (IFNy), ainsi que des compositions comprenant un IFNy amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations. L'IFNy est une cytokine de 166 acides aminés. La molécule possède un peptide signal permettant sa translocation membranaire et sa sécrétion, un site de clivage et une partie dite protéine mature. Le peptide signal de l'IFNy est constitué des 23 premiers ou des 20 premiers acides aminés selon les auteurs. En effet, il existe un doute dans la littérature sur la présence du triplet d'acides aminés Cys-Tyr-Cys (CYC) en N-terminal de la séquence mature. L'IFNy existe sous forme d'un homodimère dans lequel les deux sous unités ne sont pas liées covalemment. Chaque sous-unité possède deux sites de N- glycosylation (positions 48 et 120 du précurseur de 166 aa). On notera, si les CYC ne sont pas inclus, l'absence de ponts disulfures et de cystéines sur la protéine mature in vivo. Chacun de ces monomères possèdent six hélices alpha avec une partie compacte constituée des 4 premières hélices alpha les plus N-terminales (hélices alpha A, B, C, et D) et une partie C-terminale composée de deux hélices alpha isolées et étroitement en interaction avec le second monomère d'IFNy. L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose. Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses suivantes : - l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ; - la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, 30 expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface des macrophages ; 2 - la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'IgG et l'activation du complément ; - l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou - l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène. L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique. En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent thérapeutique humain dans le traitement de nombreuses maladies, de natures variées. Les IFNy commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont aujourd'hui utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. De nombreuses nouvelles indications thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques, en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi : infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite chronique à virus C ; différentes infections virales dont à papillomavirus ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome. Les principaux effets indésirables des IFNs sont dose-dépendants et donc étroitement liés au rythme d'administration. Ces effets sont cumulatifs et s'aggravent avec le temps. Outre la toxicité aiguë entraînant après injection (2 à 8 heures après injection sous cutanée) malaises, nausées et vomissements, les effets indésirables les plus fréquents sont les symptômes pseudo-grippaux (frissons, céphalées, asthénie), les réactions inflammatoires au site d'injection et l'élévation des transaminases du foie. Les effets indésirables les plus sérieux sont des cas de dépressions, lymphopénies ou de rares cas de nécrose au site d'injection sous-cutanés. Chez des malades traités avec de fortes doses d'IFN, un diabète peut survenir après le début du traitement. En outre, la tolérance de l'injection d'IFN est parfois limitée dans le temps et se traduit par le développement d'anticorps neutralisants (chez approximativement 10-20% des patients). La demi-vie de l'IFNy humain recombinant in vivo est de 25-35 min seulement. Pour cette raison, un traitement efficace avec l'IFNy implique des injections fréquentes. Dès 1990, et l'utilisation du l'IFNy humain recombinant commercialisé sous le nom d'Actimmune (Int:ermune inc), le besoin d'améliorer la demi-vie de l'IFNy s'est fait ressentir, d'autant plus que de tous les interférons la stabilité thermique de l'IFNy est la plus faible. Un IFNy plus stable permettrait en effet une fréquence d'administration moins importante, ce qui améliorerait le confort du patient. Un IFNy plus stable permettrait également un meilleur effet in vivo, puisque l'effet in vivo est la conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa durée d'action. Les intérêts économiques à améliorer la stabilité de l'IFNy sont donc clairs : une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que des additifs sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée, etc...), pourra permettre d'obtenir des médicaments de seconde génération, susceptibles de remplacer les molécules actuellement sur le marché. On peut même considérer qu'un IFNy plus stable permettrait d'étendre les indications de cette molécule : En effet, dans le cas d'un certain nombre de pathologies, les IFNa et g, entre autres molécules, ont constitué le traitement de référence. L'IFNy n'a pas été retenu en raison de sa durée de vie trop courte. Enfin, à plus long terme, on peut espérer qu'un IFNy stabilisé puisse permettre des formulations différentes d'administration de la molécule (forme orale notamment). De nombreux travaux de recherche ont déjà été menés sur l'IFNy : Variants naturels de l'IFNy Plusieurs formes mutées naturelles ont été décrites. L'une de ces formes est celle incluant la séquence N-terminale CYC. Deux variants naturels de l'IFNy humain présentant une mutation ponctuelle ont également été décrits K29Q et R160Q (Nishi et al. (J. Biochem. 97:153-159, 1985). Mais ces polymorphismes ne sont associés pour l'instant à aucun effet. Mutants artificiels de l'IFNy US 4,832,959 contient des polypeptides avec des séquences partielles de l'IFNy humain comprenant les résidus 1-127, 5-146 et 5-127 de l'IFNy mature et possédant les 3 acides aminés additionnels CYC. US 6,120,762 décrit un fragment peptidique comprenant les résidus 118-157 de l'IFNy précurseur et son utilisation. WO2004005341 décrit les méthodes pour générer et produire une série de mutants 10 actifs de l'IFNy comprenant les 143 acides aminés de la forme mature de l'IFNy sans CYC avec une variation comprenant au moins une des mutations dans le groupe S155 et S165 et au moins une mutation dans le groupe R160, R162 et R163. Ces mutants seraient utiles notamment dans le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique. 15 De nombreuses formes tronquées à divers endroits de la région C-terminale de l'IFNy ont été décrites. EP 0 219 781 décrit l'utilisation de séquences partielles d'IFNy humain comprenant les acides amines 3-124 de la protéine mature. L'importance des 20 derniers acides aminés sur l'activité et la stabilité de l'IFNy a constitué et constitue encore une source d'études controversées. Des IFNy humains avec l'extrémité Cterminale tronquée ont été décrits par Slodowski et al qui ont réalisé des troncatures de taille différente (de 10 à 20 acides aminés tronqués) (Eur. J. Biochem. 202:1133-1140, 1991). Dans le brevet EP 0 306870, des variants de l'IFNy ont été générés avec une activité qui 25 est significativement augmentée en coupant de 7 à 11 résidus C-terminaux. De plus, il est connu que, lorsque l'IFNy est produit en cellules de mammifères, une population hétérogène de polypeptide IFNy est obtenue à cause de troncatures naturelles par des activités d'endo- et d'exo- protéases sécrétées par la cellule hôte productrice. L'une des façons de résoudre ce problème de production est décrit dans le brevet US 6,958,388 : 30 cela consiste à produire un IFNy tronqué contenant les 155 premiers acides aminés de la protéine totale associée par exemple aux mutations améliorant la glycosylation de la molécule (S122T, E61N+S63T).5 WO 2004/022593 analyse in silico des séquences de nombreuses protéines à visée thérapeutique, y compris l'IFNy, pour l'existence de sites de protéolyse sensibles à des protéases présentes dans le sérum humain (telles que la trypsine, l'endoprotéinase Asp- N, la chymotrypsine et la proline endopeptidase). Les mutations censées apporter une protection contre les protéases citées sont les suivantes : L53V, L53I, K57Q, K57N, K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N, K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q. Les améliorations (activité ou stabilité) susceptibles d'être apportées par ces mutations 10 n'ont à ce jour pas été vérifiées expérimentalement pour aucun de ces mutants : il ne s'agit donc ici que de théories scientifiques. Mutants de l'IFNy avec une amélioration de la thermostabilité On sait que 1' IFNy (sous forme monomérique en particulier) est peu stable. Cela se 15 traduit par une sensibilité importante de la protéine dite sauvage à deux critères : pH acide et température. Il est attendu que la stabilité accrue de mutants dans ces conditions non physiologiques sera associée au même gain de stabilité dans les conditions physiologiques. Des travaux ont ainsi porté sur la recherche de mutants ayant en premier lieu gagné en thermostabilité, ce paramètre étant le plus simple à mesurer. 20 WO 92/08737 décrit des variants de l'IFNy comprenant une méthionine additionnelle en N-terminal en position -1, les 132 premiers acides aminés de la séquence mature sans CYC, le 133ème acide aminé étant une leucine au lieu d'une glutamine. Ce variant, tronqué des 10 acides aminés Cterminaux de l'IFNy, est appelé Delta 10 L ou encore 25 C l OL. Il aurait une activité biologique améliorée et présente une stabilité à la température légèrement améliorée (tm 55 C) comparée à l'IFNy sauvage (tm = 52-53 C). US 4,898,931 décrit une série de mutants de l'IFNy produit chez E.coli avec des 30 troncatures des 9 derniers résidus C-terminaux couplées aux mutations de certains acides aminés N- et C-terminaux. Ces mutations introduisent des ponts disulfures qui confèrent alors à ces molécules des propriétés thermostables tout en conservant une 6 activité anti-virale et anti-tumorale. Dans ce brevet, les acides aminés CYC font partie de la protéine mature et des variants des cystéines de ce triplet ont été réalisés. Sauvage (séquence totale) 25% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation Ml57C + Delta 9 81% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C21S-M157C et Delta 9 86% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C23 S-M 157C et Delta 9 98% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C Mutation C21S-C23S-M157C et Delta 9 23% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C US 6,046,034 décrit des variants thermostables de l'IFNy humain pour lesquels des paires de cystéines ont été incorporées à des endroits précis de la structure de l'IFNy de façon à créer des ponts disulfures inter-monomère et intra-monomère et ainsi assurer la stabilisation de l'homodimère d'IFNy. La seule paire de cystéines qui permet la conservation de l'activité biologique de l'IFNy est E30C-S92C qui relie les hélices A et D d'un même monomère, les autres paires de cystéines inter-monomère détruisant l'activité biologique de l'IFNy. Dans ce brevet, ces mutants possèdent aussi une extrémité C-terminale tronquée correspondant au mutant Delta 10. La modification de l'IFNy par ajout de polymères a été reportée par Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990), et dans les brevets EP 236987 et US 5,109,120.). 20 WO 99/03887 décrit des variants de protéines de la super-famille structurale de l'hormone de croissance (dont fait partie 1'IFNy). Dans ce brevet, certains résidus non essentiels de la structure peptidique sont remplacés par une cystéine : l'IFNy y est décrit comme exemple de cette super-famille mais aucun exemple expérimental de 25 modifications n'est décrit dans le cas de l'IFNy. WO 01/36001 décrit de nouvelles molécules d'IFNy modifiées par insertions de sites de glycosylations et/ou de dérivation par des entités type PEG. Ces molécules ont des propriétés améliorées telles que une demi-vie améliorée et/ou une bio-disponibilité 30 améliorée. WO03002152 décrit une composition pharmaceutique contenant un dérivé sulfoalkyl éther cyclodextrine d'interféron, dont la stabilité serait améliorée. Aucun de ces variants n'est pour l'instant disponible sous forme de médicament. C'est pour cette raison qu'il existe toujours une forte demande pour un IFNy amélioré, et notamment un [FNy présentant une meilleure stabilité dans les conditions physiologiques. Ce gain de stabilité en conditions physiologiques peut être évalué par un gain de stabilité à haute température. Résumé de l'invention La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci. En particulier, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A.147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprend au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, 8 S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L1581, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. La présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. Par le terme présentant est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci ne comporte que les substitutions indiquées. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne en particulier un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présente une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, M157C, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présente une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S, Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, M157C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G+F 159C, Al47E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P, Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et Y22T+K 109C+T 119P+A 147F+R 163L. La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention, une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné de préférence parmi un plasmide et un vecteur viral. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. Elle concerne en outre une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. Elle concerne l'utilisation d'une telle cellule pour produire un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. La cellule peut être procaryote ou eucaryote. 10 La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de 1"IFNy selon la présente invention ou un acide nucléique codant pour celle-ci. Ainsi, elle concerne en outre l'utilisation d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention ou de cette composition pharmaceutique comme médicament. Notamment, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention ou de cette composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. En particulier, le médicament selon la présente invention est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéoporose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. Brève description des figures Figure 1 : Schéma du vecteur pNCK utilisé pour la génération des banques de mutants et leur sélection dans Thermus thermophilus. Figure 2: Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy sélectionnés par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Figure 3 : Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy issus des positions doubles et multiples sélectionnées par Thermus thermophilus - Analyse thermostabilité ( ro d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Figure 4 : Résultats d'analyse fonctionnelle des simples mutants ponctuels de l'IFNy générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C) Tableau 1 : Mutants issus de la sélection primaire de la banque de l'IFNy dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus. Tableau 2 : Mutants validés en test de sélection secondaire dans Thermus thermophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du précurseur de 166 résidus. Description détaillée de l'invention La présente invention concerne des variants de l'interféron gamma humain (IFNy) dont la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à l'IFNy sauvage. Les variants protéiques de l'IFNy de cette invention ont été obtenus en couplant la génération d'une grande diversité de mutations par évolution dirigée à une méthode de sélection directe des variants améliorées pour leur thermostabilité. La stabilité face à la dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi que la conservation de leur activité a été validée par des tests biologiques. Les variants de cette invention constituent des alternatives aux IFNNy recombinants actuellement utilisés dans le domaine thérapeutique, notamment dans les traitements de la granulomatose chronique et de la fibrose pulmonaire idiopathique. Compte-tenu des doutes résidants sur la présence des acides aminés CYC en N-terminal de la protéine mature de 1'IFNy, et de ce fait sur la numération correspondant aux acides aminés de la protéine mature, la numérotation adoptée dans la présente demande sera celle qui tient compte de l'ensemble des résidus de l'IFNy avec la séquence du peptide signal incluse (numérotation en acides aminés totaux de 1 pour la méthionine N-terminale peptide signal inclus à 166 pour la glutamine de l'extrémité C-terminale de l'interféron ù la séquence SEQ ID No 2). La position de la substitution dans les deux autres formes (mature sans CYC, SEQ ID No 4, ou avec CYC, SEQ ID No 6) pourra facilement être déterminée par l'homme du métier.30 12 La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution décrite dans le tableau 1, le tableau 2 et les Figures 2 à 4. La présente invention concerne de préférence un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21 G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V ou une combinaison de ceux-ci. La combinaison peut consister en 2, 3 ou 4 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par ailleurs, le variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention peut comprendre d'autres mutations non-décrites dans ce groupe, de préférence des substitutions, notamment certaines connues dans le domaine. De préférence, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E ou une combinaison de ceux-ci. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une des mutations sélectionnées parmi le groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D ou une combinaison de ceux-ci. Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K1311, E135V,M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L1581, F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. De préférence, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157C, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. De manière encore plus préférée, la substitution est sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S, Q24A, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, L158I, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D. 14 Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G+F159C, Al47E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P, Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et Y22T+K 109C+T 1 19P+A147F+R163L. Les séquences SEQ ID Nos 1-6 décrivent les séquences protéiques de l'IFNy humain précurseur et mature ainsi que des séquences nucléiques codant celles-ci. Il peut correspondre à la protéine précurseur de 166 acides aminés (SEQ ID Nos 1-2), ou à la protéine mature avec ou sans le tripeptide CYC (SEQ ID Nos 3-6). Par fragment fonctionnel est entendu un fragment de l'IFNy humain présentant l'activité de l'IFNy humain. Par exemple, ce fragment peut correspondre à l'IFNy humain avec une délétion C-terminale de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 acides aminés. Le fragment peut comprendre 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés consécutifs de l'IFNy humain. Les variants selon la présente invention présentent une augmentation de la thermostabilité par rapport à l'IFNy humain sauvage. Cette augmentation est d'au moins 5 %, de préférence au moins 10, 20 ou 30 %. Par thermostabilité , est entendu la capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à l'action de la chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 59 C. La thermostabilité du variant est alors estimée par le pourcentage d'activité résiduelle après ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors comparée à la même valeur obtenue en utilisant l'IFNy sauvage produit dans les mêmes conditions. Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité réduite peut être utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de l'activité de l'IFNy humain sauvage, de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90 % de l'activité de l'IFNy humain sauvage. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une activité équivalente à celle de l'IFNy humain sauvage, voire augmentée. Un facteur intéressant de sélection des variants d'intérêt est l'activité relative du variant 5 multiplié par le pourcentage d'activité résiduelle. Le variant de l'IFNy humain selon la présente invention peut être glycosylé, de préférence aux positions 48 et 120. Par ailleurs, il peut être modifié par ajout de polymères (Kita et al., Drug Des. Deliv. 6:157-167, 1990 ; EP 236987 et US 5,109,120) 10 ou par pégylation (W099/03887 ; Voir WO2004005341 Conjugation of a polymer molecule ). La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention. La présente invention concerne également 15 une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention. Elle concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné parmi un plasmide et un vecteur viral. 20 L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN, un mélange des deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Il peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il peut être préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse chimique, 25 la recombinaison, la mutagenèse, etc... La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention, notamment les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule hôte. La cellule 30 hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette d'expression comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs procaryotes préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs 16 d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exemples de promoteurs eucaryotes préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols in Molecular Biology). La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une cassette d'expression codant pour un variant thermostable de 1'IFNy humain selon la présente invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire qu'il comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule hôte. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple E. coli, ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S cerevisiae) ou un champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs de vecteurs procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDl0, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET (Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les suivants : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et pQE-30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des 17 lentivirus, etc... De préférence, le vecteur d'expression est un plasmide ou un vecteur viral. La séquence codant l'IFNy selon la présente invention peut comprendre ou ne pas comprendre le peptide signal. Dans le cas où elle ne le comprend pas, une méthionine peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre alternative, un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal hétérologue peut être dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une cellule mammifère, d'insecte ou d'une levure. La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une cassette d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou transfecter une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant thermostable de l'IFNy humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. Elle concerne également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou transfection d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. Dans un mode de réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d'une cellule comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. En particulier, la cellule peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide nucléique codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous forme d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut citer les modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli, et JAMES et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en cellules mammifères. L'activité in vitro de l'IFNy est généralement déterminée par la réduction de l'effet cytopathique de virus sur une lignée cellulaire par traitement avec des quantités croissantes d'IFNy. Il existe d'autres tests biologiques spécifiques de l'IFNy (Meager, Journal of immunological Methods, 261, (2002) 21-36 pour une revue). Ces nouveaux tests permettent notamment d'évaluer plus spécifiquement l'une des caractéristiques de l'activité pléiotrope de l'IFNy. Il existe également des tests d'activité in vivo. La réponse anti-virale à des doses d'IFNy peut être mesurée sur différents couples de systèmes (virus /lignée cellulaire adhérente répondant à l'IFNy et sensible au virus employé). Par exemple, on peut citer les couples suivants : VSV/MDBK ; VSV ou EMCV/ A549 ; VSV, EMCV, SFV ou virus Sindbis/ WISH ; VSV ou EMCV/ HeLa ; VSV, EMCV ou Mengovirus/ FS4, FS71, ou Hep2 ; VSV, EMCV, Mengovirus ou virus Sindbis/ FL ; EMCV/ 2D9, avec VSV = virus de la stomatite vésiculaire ; EMCV = virus de l'encéphalomyocardite ; SFV = virus de la forêt de Semliki. De préférence, les virus utilisés seront le virus de la vaccine ou le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV). Le virus de l'herpès simplex (HSV) et le cytomégalovirus peuvent également être utilisés. L'activité de l'IFNy peut également être testée en utilisant un gène rapporteur, par exemple la luciférase, sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFNy contenant des éléments GAS (gamma-interféron activation sites) ou ISRE (interferon stimulated response element) . Ainsi, le gène rapporteur est dosé suite à une stimulation par l'IFNy. Les vecteurs pGAS/Luciférase et pISRE/Luciférase sont disponibles commercialement (#219091, Stratagene). Dans un mode de réalisation préféré, la méthode avec le vecteur pGAS/luciférase est utilisée pour mesurer l'activité de l'IFNy. L'augmentation de la thermostabilité de 1'IFNy tout en conservant son activité biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces permettant, à activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques utilisées, et par là même une réduction des effets secondaires associés au traitement. Cela permet également des traitements à plus forte dose d'IFNy pour réduire les infections virales telles que l'herpès, ces traitements étant jusqu'ici inenvisageables avec ce type de molécules. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention. La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et excipients sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]). La présente invention concerne également l'utilisation d'un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention comme médicament. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration. Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des gels des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales ou injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés. Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est liquide. Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 100 g de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique. Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Dans un mode de réalisation préféré, l'IFNy est administré par la voie parentérale, et préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose habituelle d'IFNy par injection sous-cutanée est comprise entre 1 et 100 g/m2 si la surface corporelle est supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 g/kg de poids corporel si la surface corporelle est inférieure ou égale à 0,5 m2. L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités. En effet, les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la réplication virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de l'apoptose. 20 Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses suivantes : -l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs anti-microbiens et anti-tumoraux) ; - la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes, expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la surface 25 des macrophages ; - la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps, ce qui a pour conséquence la production d'immunoglobuline de type G et l'activation du complément ; - l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de 30 radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou - l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN endogène.15 21 L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation modulant ainsi la réponse immunitaire spécifique. Parmi les propriétés pharmacologiques de l'IFNy, l'effet principal recherché et 5 développé en phases cliniques est principalement l'aspect immunomodulateur, l'aspect de molécule thérapeutique anti-virale étant moins développé à ce jour. En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent thérapeutique 10 humain dans le traitement de nombreuses maladies assez variées. Les IFNy commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont notamment utilisés pour deux indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale. En plus des indications thérapeutiques principales, de nombreuses nouvelles indications 15 thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à différentes phases cliniques (II et III), en particulier pour leur rôle d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi infections à mycobactérie atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B ; hépatite 20 chronique à virus C ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite rhumatoïde ; cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome. L'IFNy est également utile dans le traitement d'infections virales variées, possède une activité contre l'infection par les papillomavirus humains, et les infections hépatiques à 25 virus B et à virus C. De plus, si le problème de toxicité associée aux fortes doses d'IFNy était atténué ou résolu par une molécule plus stable, et ayant donc un plus important effet in vivo, l'utilisation de l'IFNy dans de nouvelles indications, et notamment pour traiter les 30 infections virales type herpès (HSV) de type I et II pourrait être reconsidéré. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la présente 22 invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. Ainsi, ce médicament est destiné à traiter des maladies inflammatoires, des cancers, des infections, des troubles osseux, des maladies auto-immunes, etc... Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéoporose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. Dans des modes de réalisation alternatifs, le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi un prurigo, une névrodermite, le diabète de type I, une sténose vasculaire, un épithélioma basocellulaire, un cancer ou un lymphome tel que un cancer de l'ovaire, un cancer du rein, une leucémie telle qu'un désordre hyperprolifératif des cellules B ou T, la leucémie myéloïde chronique et des syndromes apparentés, un cancer du sein, un cancer des poumons, un mélanome, un cancer du colon, un cancer du cerveau, un cancer de la plèvre, un cancer de l'estomac, un cancer du pancréas, une infection virale, par exemple par le virus de l'hépatite C ou B, la maladie de Crohn, le psoriasis, la sclérose en plaque, et la sclérose amyotrophique latérale. Le variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention peut être utilisé en combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif sélectionné parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétonoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison de ceux-ci. Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou après l'administration de l'IFNy selon la présente invention. De plus, il peut être administré par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration distinctes. Ainsi, 23 la présente invention concerne un produit comprenant le variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention et un autre principe actif, de préférence sélectionné dans la liste ci-dessus, pour une préparation combinée destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée pour le traitement d'une des pathologies citées ci-dessus. La combinaison avec un anticorps est utile pour le traitement de cancer. En effet, l'IFNy est capable d'augmenter l'effet des anticorps par l'ADCC (antibody-dependant cellular cytotoxicity). L'anticorps est de préférence dirigé contre un antigène exposé par les cellules cancéreuses. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, monoclonal, humanisé, ou chimérique. De préférence, l'anticorps est monoclonal et humanisé. Par exemple, dans le cas d'un désordre hyperprolifératif des cellules B tel que le lymphome non-hodgkinien, l'antigène peut être CD20. Cet anticorps peut être le Rituximab. La combinaison avec un glucocorticoïde est utile pour le traitement des maladies pulmonaires alvéolaires telles que la fibrose pulmonaire idiopathique. Des exemples de glucocorticoïdes adaptés sont l'hydrocortisone, la cortisone, la dexaméthasone, la bétaméthasone, la prednisolone, la méthyl prednisolone et leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Un mode de réalisation préféré de la présente invention concerne l'utilisation d'une combinaison entre l'IFNy selon la présente invention et la prednisolone. La combinaison avec un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique est utile notamment pour le traitement de maladies de la peau telles que un prurigo ou une névrodermite. La combinaison avec un agent anti-allergique, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, ou une cytokine est utile notamment pour le traitement de l'asthme. 30 La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention au patient. De préférence, la méthode de traitement25 24 est destinée au traitement d'une pathologie citée ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre l'administration d'un autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus. Exemples Sélection des variants thermostables de l'IFNy humain Les inventeurs ont mis en oeuvre une méthode de sélection directe de variants protéiques thermostables appelée THR et décrite dans la demande de brevet français numéro 0505935. Cette méthode est basée sur la préparation de protéine de fusion entre les variants de l'IFNy humain et un variant d'une protéine de résistance à la kanamycine, présentant une thermostabilité accrue (Ce double mutant de la kanamycine nucléotydil transférase est décrit dans Liao, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 286-92). La banque de variants de l'IFNy humain a été préparée par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314, et a été transformée à haute température dans la souche HB27 de Thermus thermophilus. Les clones transformants de cette banque ont été sélectionnés à des concentrations croissantes en kanamycine pour lesquelles la production de la fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus aux cellules de pousser. Les clones obtenus dans ces conditions sont théoriquement associés à un gain de stabilité à haute température, comme indiqué dans la demande de brevet FR 05 05935 déposé le 10 juin 2005. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées et les séquences résultantes sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants isolés lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau individuellement et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 20 mutants, conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage, ont ainsi été confirmés (tableau 2). Génération systématique de variants ponctuels de l'IFNy_ Par ailleurs, à partir du clone d'expression pORF/IFNy, nous avons généré une importante collection de mutations ponctuelles de l'IFNy présentant une et une seule différence d'acide aminé avec les positions de l'IFNy dit sauvage (en prenant comme référence la SEQ N 6). Analyse fonctionnelle des variants de lIFNy Les variants de l'IFNy humain sélectionnés par notre méthode de sélection ou générés de façon systématique sur toutes les positions de l'FNI, ont été exprimés transitoirement en cellules animales COS7. Ces protéines sont sécrétées dans le surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation de l'activité de ces variants, les surnageants de culture de cellules COS7 ont été soumis à une dénaturation thermique (10 minutes à 59 C). On a ensuite fait agir ces protéines (dénaturées ou non) sur des cellules HeLa transfectées contenant la luciférase comme gène rapporteur. Après 16 heures de stimulation, pour chaque mutant et pour chaque condition, nous avons mesuré le signal de la ftrefly luciférase correspondant à l'activité de l'IFNy testé. On a ensuite comparé l'activité induite par la protéine non dénaturée à l'activité induite par cette même protéine dénaturée et on en a déduit l'activité résiduelle après dénaturation thermique pour la protéine étudiée (Activité résiduelle = Activité dénaturée/ Activité non dénaturée * 100). L'activité basale du variant non dénaturé a également été comparée à celle de l'IFNy non muté. Détails des expériences : Biologie moléculaire Constructions plasmidiques Système THR : Le vecteur qui a été utilisé comportait les origines de réplication de E. coli et de T. Thermophilus, un gène de résistance à l'ampicilline qui permet la sélection de transformants dans E. coli, un gène codant la KNTase thermostable sous contrôle d'un promoteur actif à la fois chez E. coli et de T. thermophilus (le promoteur ps1pA). Voir Figure1. La séquence nucléotidique de l'IFNy (codant pour la forme mature de 146 acides aminés SEQ ID N 5) a été clonée entre les sites Ncol et Notl du vecteur en N-terminal de la KNTase. L'IFNy et la KNTase en fusion sont séparés par une séquence codant un peptide de liaison ( linker ) qui présentait la séquence peptidique AAAGSSGSI (SEQ ID No 8) et était codée par la séquence nucléique GCG-GCCGCA-GGA-AGC-TCT-GGT-TCC-ATC (SEQ ID No 7). Système d'expression eucaryote : Pour l'expression de l'IFNy en cellules de mammifères, nous avons utilisé le pORF/IFNy (Invivogen) dans lequel lIFNy est clonée dans une cassette d'expression contenant le promoteur hybride (EF-la-HLTV) et le signal de polyadénylation fort du SV40. 26 Génération de mutants références de l 'IFNy Plusieurs mutants thermostables décrits dans la bibliographie ont été construits et utilisés à titre de contrôles positifs. Ils codent pour : - la protéine IFNy E30C/S92C : mutant avec un pont disulfure (gain de stabilité 5 TM +15 C, Waschutza et al., 1996) - la protéine IFNy delta 10 (extrémité Cterminale de la protéine délétée de ces 10 derniers acides aminés activté et stabilité améliorée, TM + 7,5 C et activité antivirale multipliée par 4, Slodowski et al., 1991). Ces mutants sont générés au niveau des matrices pNCK-IFNy et PORF-IFNy par la 10 méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314. Génération dans le pORF-IFNy des mutants de 1'IFNy sélectionnés par la méthode THR Les mutations simples et multiples correspondants aux mutations identifiées sur les séquences des clones sélectionnés par la méthode THR sont introduites sur le pORFIFNy par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314. 15 Génération systématique des mutations simples de l 'IFNy dans le pORF/ IFNy La génération de façon systématique de tous les variants simples de 1' IFNy (c'est-à-dire la substitution de l'acide aminé de la protéine mature de type sauvage par les 19 autres acides aminés du code génétique) a été réalisée par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314 sur la matrice pORF/IFNy . 20 Sélection de mutants thermostables par la méthode THR Une banque de variants de l'IFNy cloné dans le vecteur pNCK a été générée grâce à Massive Mutagenesis . Une diversité totale a été introduite sur toutes les positions (de 21 à 166). La banque a ensuite été transformée à haute température (70 C) dans la souche HB27 de Thermus thermophilus et sélectionnée sur 20 ou 40 g/ml de 25 kanamycine (conditions où la fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus à la cellule de pousser). Les nutations identifiées après séquençage sur des clones poussant sur milieu sélectif sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants isolés par le moyen de cette sélection primaire ont ensuite été retransformés de manière unique et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 20 mutants, 30 conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage ont ainsi été confirmés (tableau 2). Validation fonctionnelle de la stabilité et de l'activité des mutants del' IFNy Tous les réactifs de culture cellulaire ont été fournis par Invitrogen. Les cellules HeLa ((human cervix epitheloid carcinoma cells) et les cellules COS-7 (African green monkey SV40 transformed kidney cells) ont été cultivées dans des conditions standards de culture (37 C en atmosphère humide contenant 5% CO2) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM) et Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM). Tous ces milieux de culture contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax) et sont supplémentés en sérum de veau foetal décomplémenté (10% final) et en antibiotiques à raison de 100 units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine. Le vecteur pSV-betagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées. Expression des mutants uniques de l'IFNy humain en cellules de mammifères COS7 Afin de réaliser les transfections des cellules COS7 par les constructions pORF/ IFNy natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence. Les cellules COS7 ont été ré-ensemencées suivant le ratio (c'est-à-dire de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une confluence de 25% environ). La transfection des cellules COS7 a été réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignent 70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEUADN de 5 en laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (5001.tL IMDM + SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant l'IFNy (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à 1 g/ml) ont été récupérés à T=24H post-transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à -20 C avant le dosage de l'activité de l'IFNy. Test primaire activité Il a été déjà été décrit que l'IFNy active spécifiquement les récepteurs à l'IFNy présents sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie des Jak/Statl des cellules HeLa par l'IFNy s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de la transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences GAS pour Gamma Activated Site . Il est alors possible de mesurer et de comparer les activités des variants de l'IFNy en transfectant dans les cellules HeLa un système de gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval d'un promoteur possédant plusieurs sites GAS (plasmide pGAS/Luciférase de Stratagene). Transfection transitoire des cellules HeLa par le pGAS/Luciférase Les cellules HeLa ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de confluence et ont été ré-ensemencées avec un ratio de 1/3. Les transfections de cellules HeLa à 50-80 % de confluence ont été réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du fournisseur : 20 000 cellules par puits ont été transfectées avec environ 150ng d'ADN pGAS/Luciférase et du jet PEI dans un rapport Jet PEI/ADN de 5. Le tout a été vortexé 30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20 L du mélange ADN/Jet PEI ont été répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées sont cultivées pendant 24 heures à 37 C et en 5% CO2. Mesure de l'activité totale basale des variants de l'IFNy (protéine non dénaturée) / protéine sauvage Les surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été dilués au 1/100eme. 10 L de ces dilutions de surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été ajoutés sur les cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase. Après 16 heures à 37 C 5% CO2 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase s'est effectuée, les culots de cellules ont été récupérés et congelés. 5011L de Glo lysis buffer TM (Promega), ont été ajoutés pour lyser les cellules. La lyse s'est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la stimulation spécifique de l'IFNy. Le test de l'activité luciférase à proprement dit a été initialisé par l'ajout du réactif Bright Glo TM (Promega) et la quantité de luciférase accumulée a ensuite été comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). Le calcul de l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant (non dénaturé) est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées par la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de présenter les résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque variant en pourcentage de l'activité de base de l'IFNy non muté exprimé dans les mêmes conditions pour chaque transfection. Mesure de l'activité résiduelle des variants après dénaturation thermique par gène rapporteur luciférase Comme précédemment décrit par le test primaire d'activité par gène rapporteur, la quantité de luciférase a été mesurée après stimulation des cellules par 101.tL de surnageants de cellules COS7 dilués au 1/ 100ème contenant l'IFNy qui, suivant les cas, ont été soumis à un traitement thermique de 10 minutes à 59 C ou bien n'ont pas été traités. L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque variant conservée après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée de chaque variant définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant dénaturation. Le calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité totale déterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant., au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). Mesure d'un indice d'amélioration des variants de l'IFNy (amélioration de la thermostabilité et/ou de l'activité) Une fois que l'on a vérifié qu'un variant de l'IFNy étudié présente à la fois une amélioration de la thermostabilité et une conservation au moins partielle de l'activité intrinsèque de la protéine, on peut calculer le produit de l'activité résiduelle du mutant étudié après prétraitement, par son activité (sans prétaitement). Cette indice donne une idée de la résultante du gain de thermostabilité et de perte relative d'activité, et donne donc une idée de l'effet in vivo attendu de la protéine. Les valeurs obtenues avec les protéines de référence sont les suivantes : un indice de 37 pour l'IFNy non muté et de près de 76 pour le variant delta 10 connu dans la bibliographie. Revendications 1- Variant thermostable de l'interféron gamma (IFNy) humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en F159C, R162E, A147E, C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L1581, F159V, R160A, R162D, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No2. 2- Variant thermostable de l'IFNy selon la revendication 1, dans lequel le variant présente une unique substitution. 3- Variant thermostable de l'IFNy selon la revendication 1, dans lequel le variant présente une combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G+F159C, A147E+R162D, M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P, Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et Y22T+K109C+T119P+A147F+R163L, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2. 4- Variant thermostable de l'interféron gamma (IFNy) humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L51I, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, MI00N, K109C, K109Q, K109L, K110H, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, 30F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V, les positions indiquées correspondant à celles de la SEQ ID No 2. 5- Acide nucléique codant un variant thermostable de l'IFNy selon l'une quelconque des 5 revendications 1-4. 6- Cassette d'expression d'un acide nucléique selon la revendication 5. 7- Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 5 ou une cassette 10 d'expression selon la revendication 6. 8- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 5, une cassette d'expression selon la revendication 6 ou un vecteur selon la revendication 7. 15 9- Composition pharmaceutique comprenant un variant thermostable de l'IFNy selon l'une quelconque des revendications 1-4. 10- Composition pharmaceutique selon la revendication 9, comprenant en outre au moins un composant sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent de 20 chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, une cytokine, un vaccin, 11- Variant thermostable de l'IFNy selon l'une quelconque des revendications 1-4 ou composition pharmaceutique selon la revendication 9 en tant que médicament. 12- Utilisation d'un variant thermostable de l'IFNy selon l'une quelconque des revendications 1-4 ou d'une composition pharmaceutique selon la revendication 9 pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. 30 13- Utilisation selon la revendication 12, dans laquelle le médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie atypique, le 25 32 cancer du rein, l'ostéoporose, une sclérodermie généralisée, une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite rhumatoïde. 14- Utilisation d'un acide nucléique selon la revendication 5, une cassette d'expression selon la revendication 6, un vecteur selon la revendication 7 ou d'une cellule selon la revendication 8 pour produire un variant thermostable de l'IFNy selon l'une quelconque des revendications 1-4.10