Brevet FR2907225A1 — publié le 20080418

Division de la demande FR 06 54316 L'invention concerne le développement de principes actifs pour une application cosmétique, dermo-cosmétique, ou pharmaceutique, pour lutter contre la dégradation d'au moins un facteur de croissance. s L'invention concerne en particulier la protection de la dégradation du Fibroblast Growth Factor (FGF-2 ou FGF basique ou FGF-[3). La présente invention concerne notamment l'utilisation de principes actifs prévenant, limitant, ou améliorant la qualité du derme, notamment lorsque celui-ci subit les effets de l'âge, notamment chez un être humain. 10 ÉTAT DE LA TECHNIQUE De nombreux facteurs de croissance interviennent au niveau cutané et en particulier le FGF-2, qui possède un large spectre d'activité : 15 notamment la prolifération des fibroblastes permettant ainsi la synthèse des macromolécules de la matrice, essentielles à l'intégrité de la peau. Le FGF-2 est protégé dans la peau par les protéoglycanes à héparane sulfate. Dans les années 90, Feige & Baird (Médecine/Sciences, 1992;8:805-10) ont décrit la relation étroite entre les facteurs de croissance et les 20 protéoglycanes de la matrice extracellulaire, expliquant qu'outre un phénomène de réservoir, cette interaction protégeait les facteurs de croissances contre la protéolyse. Il en résulte une plus grande stabilité des facteurs de croissance (une demi-vie in vivo allongée), leur permettant ainsi de remplir au mieux leurs fonctions. 25 FGF-2 et protéoglycanes Le FGF-2 fait partie d'une famille composée de 23 FGF différents dénombrés à l'heure actuelle. Le FGF-2 se présente sous plusieurs 30 isoformes. Chez les vertébrés, cinq isoformes sont retrouvées avec des 1 2907225 Division de la demande FR 06 54316 poids moléculaires de 18 ; 22 ; 22,5 ; 24 et 34 kDa. Seule la forme de 18 kDa est détectée à l'extérieur des cellules, les autres sont confinées à l'intérieur de la cellule et plus précisément dans le noyau . Le FGF-2 est une protéine ubiquitaire qui joue un rôle très important au niveau physiologique ; le FGF-2 est impliqué dans le développement embryonnaire, angiogenèse, différentiation neuronale et entre autre la réparation tissulaire. Il est, en effet, présent dans la plupart des tissus avec une répartition plus particulièrement ciblée au niveau de la membrane basale de ceux-ci. Bien que le FGF-2 soit présent dans l'organisme dans une proportion telle qu'il puisse être purifié et caractérisé, son ARNm n'est pas détectable. Ce fait et la particularité qu'il soit distribué de façon intimement lié à la membrane basale des tissus laisse supposer qu'il est produit à un taux initial puis libéré par les cellules lors du développement pour être stocké dans la MEC (la membrane basale 15 subit au cours de ce processus un remodelage intense permettant la libération locale de FGF-2). Ce stockage permettrait une libération du FGF-2 à l'état adulte en cas de besoin pour participer à la réparation tissulaire et maintenir des fonctions différenciées. Avec l'âge, le stock de FGF-2 diminuerait donc n'assurant plus des conditions maximales d'activité. 20 Les protéoglycanes (PG) constituent des réservoirs potentiels de la forme extracellulaire de FGF-2 de 18KDa dans la matrice extracellulaire. Les protéoglycanes sont des molécules à localisation extracellulaire, membranaire ou intracellulaire. Ils sont constitués d'une chaîne protéique appelée "protéine coeur" sur laquelle sont greffées des 25 glycosaminoglycanes (GAG) variables. Les principaux GAG sont l'héparane sulfate (HS) ; l'héparine (HP) ; le chondroïtine sulfate (CS) le dermatane sulfate (DS), isomère de chondroïtine sulfate et le kératane sulfate (KS). 2 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) ont été décrits dans la littérature pour être associés avec une assez forte affinité au FGF-2, le protégeant de diverses dégradations et lui servant de réservoir. Il a été mis en évidence la liaison spécifique du FGF-2 à un GAG particulier : 5 l'héparane sulfate. Il a été montré une inhibition de la liaison du FGF-2 à la MEC de cellules endothéliales en culture en présence d'héparine ou de l'héparane sulfate mais pas en présence de chondroïtine sulfate, kératane sulfate ou acide hyaluronique. De plus, une absence de liaison du FGF-2 à une MEC prétraitée avec de l'héparitinase (enzyme spécifique de ro l'héparine et de l'héparane sulfate) mais pas avec de la chondroïtinase ABC (enzyme spécifique de la chondroïtine sulfate, du kératane sulfate et de l'acide hyaluronique) a été révélée. Tous ces résultats prouvent l'existence d'une relation spécifique entre le FGF-2 et l'héparane sulfate de la MEC, relation qui ne se retrouve pas avec d'autres GAG. 15 Au niveau structural, des études sur cette interaction ont révélé que la séquence minimale nécessaire sur la chaîne d'héparane sulfate pour lier le FGF-2 est un pentasaccharide contenant au moins un résidu acide iduronique sulfaté en C2 et au moins un groupe N-sulfate. De plus, la présence sur le FGF-2 d'un site de liaison à l'héparane sulfate permet cette 20 interaction. Ce site se retrouve au niveau de deux feuillets [3 (feuillets [310 et [311) contenant plusieurs résidus acides aminés basiques. Sur le FGF-2 se trouve également un site distinct de liaison à leurs récepteurs biologiques : les FGFR. L'interaction du FGF avec son récepteur de signalisation implique une dimérisation de ce récepteur et la présence 25 d'héparane sulfate en tant que corécepteur. Le modèle de la réponse au FGF-2 met en avant la formation de complexes binaires FGF-2/HSPG puis association instantanée de FGFR conduisant à la formation d'un complexe ternaire qui va subir une dimérisation pour donner une activité biologique in vivo par l'intermédiaire de la protéine kinase du récepteur (IBRAHIMI & 3 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Biochemistry, 2004, 43, 4724-4730). Ce modèle a été de plus supporté par la découverte sur le FGFR d'un site de liaison à l'héparine/héparane sulfate. Plusieurs protéoglycanes à héparane sulfate peuvent lier le FGF-2, 5 ces protéoglycanes peuvent être soit attachés à la surface des cellules, libres dans la MEC ou sur la membrane basale. Quatre d'entre eux ont été répertoriés dans la littérature. Il s'agit du p-glycane, protéoglycane à héparane sulfate membranaire qui possède cependant une plus forte affinité pour le TGFE3 ; le glypicane, protéoglycane à héparane sulfate lo relié à la membrane cellulaire par une attache glycosylphosphoinositol ; le syndécane, protéoglycane à héparane sulfate transmembranaire présentant le plus d'affinité pour le FGF-2 ; et le perlécane, protéoglycane à héparane sulfate de la matrice. Is Dégradation du FGF-2 et protection Le FGF-2 est sensible à la protéolyse et peut être dégradé rapidement, ceci même à température physiologique. Les conditions de la dégradation du FGF-2 ont été étudiées et décrites dans la littérature en 20 absence et en présence d'héparine (GAG hautement sulfaté naturel) qui constitue le témoin de référence pour sa très forte affinité pour le FGF-2. TARDIEU & colt, en 1992, (Tardieu et colt, Journal of cellular Physiology, 150:194-203;(1992)) ont étudié le comportement du FGF-1 (acide) et FGF-2 face à un changement de pH. Trois conditions ont été 25 testées, avec ou sans ajout d'héparine au préalable : pH 2, pH 7 et pH 9. La dégradation du FGF a été étudiée dans un modèle de prolifération fibroblastique par incorporation d'élément radioactif. Les résultats montrent que le FGF-2 est inactivé à pH acide et à pH basique mais que la 4 2907225 Division de la demande FR 06 54316 présence d'héparine permet de conserver une activité du FGF-2 similaire (voire un peu plus faible) à celle observée à pH neutre. Les auteurs ont également étudiés la dégradation thermique du FGF 1 et 2 dans ce même modèle Des solutions de FGF, en présence ou 5 non d'héparine, sont incubées à 0 C, 20 C, 37 C, 60 C et 90 C pendant différents temps : 1h, 24h, 7, 14, 30 et 60 jours. Les résultats obtenus montrent que l'activité du FGF-2 est fonction de la température. L'augmentation de cette dernière provoque une diminution de l'activité du FGF-2. Notamment, à 60 C et 90 C, aucune activité n'est détectée, et ceci même en présence d'héparine. Par contre, pour les autres températures étudiées, l'héparine permet une protection dans le temps de l'activité du FGF-2. Enfin, la dégradation enzymatique du FGF-1 et 2 a été étudiée face à la trypsine et à la chymotrypsine. Après 3 heures d'incubation à 37 C de 15 solutions de FGF en présence ou non d'héparine, une électrophorèse sur gel à 18% de polyacrylamide est effectuée afin de visualiser le FGF non dégradé. Le temps d'incubation permet de dégrader la totalité du FGF présent dans les échantillons, que ce soit avec la trypsine ou la chymotrypsine. Par contre, la présence d'héparine permet de retrouver la 20 bande à 18 kDa relative au FGF-2 signifiant une protection totale du FGF-2 par l'héparine. De la même façon, il a été montré que les GAG stabilisaient la conformation active du FGF-2, le protégeant de la dénaturation acide ou encore thermique et en augmentant l'interaction spécifique avec des 25 récepteurs cellulaires spécifiques. En présence d'héparine les FGFs sont plus stables lors du stockage et plus résistants aux conditions dénaturantes et protéolytiques. Compte tenu du rôle important du FGF-2 en thérapeutique, dans la cicatrisation, et la réparation tissulaire, et de sa sensibilité à différents 5 2907225 Division de la demande FR 06 54316 stress, tels que la température et la protéolyse enzymatique, des équipes ont étudié les effets d'un apport supplémentaire de FGF-2 ou encore la protection du FGF-2 par des molécules naturelles ou de synthèse. En effet, Yamanaka, en 2005 (Basic fibroblats growth factor 5 treatment for skin ulcerations in scleroderma, cutis, 2005 ; 76 :373-376), décrit l'utilisation topique de FGF-2 recombinant pour traiter des ulcères de la peau. Le FGF-2 stimule les récepteurs au FGF des fibroblastes et induit une activation des fibroblastes et la prolifération vasculaire. Pendant le processus de réparation, pendant la phase restructurante, le FGF-2 agirait aussi sur la prolifération des kératinocytes. Des dérivés de dextran ont été synthétisés (Tardieu, 1992, cité précédemment) pour potentialiser l'activité du FGF-2 (activité mitogénique des fibroblastes), en le protégeant contre la chaleur, la dénaturation au pH, la dégradation enzymatique (trypsine et chymotrypsine). Ces dérivés présentent une plus grande protection du FGF2 que l'héparine, ce qui permet d'avoir des composés présentant une alternative à l'utilisation de l'héparine qui présente une forte activité anti-coagulante. Ils constituent des stabilisateurs, potentialisateur et protectant de la matrice pour des formulations pharmaceutiques agissant sur la réparation tissulaire. De plus, Franck et al, en 2004 (J. Biomater Sci. Polymer Edn. Vol. 15. N 11, pp. 1463-1480(2004)), ont montré que d'autres dérivés de dextrans pouvaient en culture de fibroblastes augmenter la prolifération des cellules et promouvoir l'effet du facteur de croissance sur la croissance cellulaire. Enfin, Sylvia Colliec-Jouault et al, (Exopo/ysaccharides produced by bacteria isolated from deep-sea hydrothermal vents new agents with therapeutic patent/al, Pathologie Biologie, 52, 127-130 (2004)), traitent de l'utilisation d'un exopolysaccharide particulier néosynthétisé par une bactérie qui a été utilisée comme implant de comblement osseux dans un modèle expérimental chez le rat. Après 15 jours les animaux montrent une 6 2907225 Division de la demande FR 06 54316 cicatrisation complète avec aucune réaction inflammatoire observée. Ce résultat serait expliqué par l'interaction de l'exopolysaccharide avec les médiateurs solubles dont FGF-2 ; ce qui permettrait d'augmenter l'activité proliférative du FGF-2 et ainsi de favoriser le phénomène de cicatrisation. 5 Cet exopolysaccharide est utilisé pour la cicatrisation dentaire. La peau : FGF-2, protéoglycanes et vieillissement Dans la peau, le FGF-2 se trouve au niveau de l'épiderme, de la jonction dermo-épidermique ()DE), du derme, de l'hypoderme et des capillaires ; il possède un large spectre d'activité. Il assure la prolifération des fibroblastes au sein du derme leur permettant ainsi de synthétiser les macromolécules de la matrice, essentielles à l'intégrité de la peau, mais il agit également sur d'autres cellules de la peau. La prolifération des 15 mélanocytes est en effet contrôlée par ce FGF-2 qui constitue également un promoteur de la formation des capillaires. Au niveau des fibroblastes, outre leur prolifération, le FGF-2 augmente également le taux d'ARNm des gènes codant pour la hyaluronane synthase et ainsi accroît la production de hyaluronane, principal GAG du derme. 20 Lors de blessures, le FGF-2 est un important acteur du phénomène de cicatrisation. Il agit au niveau des fibroblastes, toujours en augmentant leur prolifération, mais aussi sur les kératinocytes afin d'inhiber l'expression de la collagènase-1 et ainsi permettre à la peau de se reconstruire plus rapidement. Cette action lors de la cicatrisation ne se fait 25 pas avec l'héparane sulfate comme transporteur/réservoir mais avec le dermatane sulfate. L'expression du FGF-2 est alors effectuée principalement par les kératinocytes, les macrophages et les fibroblastes. Le temps de demie vie du FGF-2 in vitro a été évalué à 24 heures environ à 37 C et à pH neutre (SOMMER & RIFKIN, Journal of cellular physiology 7 2907225 Division de la demande FR 06 54316 138:215-220 (1989)). Ainsi le FGF-2 constitue une importante cytokine de la peau du fait des nombreuses fonctions qu'elle remplit. Les protéoglycanes de la peau et leur répartition ont été étudiés. Les principaux GAG révélés pour leur capacité d'interaction avec le FGF-2 5 se retrouvent dans la peau. La répartition quantitative et qualitative des GAG a été déterminée comme suit : acide hyaluronique (31%), chondroïtine sulfate (25%), kératane sulfate (24%), dermatane sulfate (20%) et enfin héparane sulfate (18%). L'héparane sulfate contenu dans le derme permet un stockage du FGF-2 présent. Au cours du vieillissement, la peau subit de nombreuses modifications physiologiques. Outre les rides qui constituent les marques les plus visibles, ce sont de profonds changements structuraux qui apparaissent. Le derme notamment s'atrophie, conséquence notamment d'une réduction du nombre de fibroblastes et de leur pouvoir de synthèse 15 entraînant des modifications des macromolécules de la matrice extracellulaire. Une diminution de la synthèse des glycosaminoglycanes est constatée impliquant également une réorganisation des protéoglycanes présents. Des études sur des fibroblastes en culture ont permis de montrer que la synthèse d'acide hyaluronique diminuait fortement au 20 cours du vieillissement alors que celle des kératanes et chondroïtines sulfates augmentait. Quant au dermatane et héparane sulfate, leur synthèse ne cesserait de diminuer. Cette diminution ne permettrait plus de stocker et donc de protéger le potentiel endogène de FGF-2. 25 BUT DE L'INVENTION Aucun document de l'art antérieur n'a cherché à protéger un facteur de croissance, notamment le FGF-2, de sa dégradation ou dénaturation, intervenant notamment au niveau cutané. 8 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Ainsi la présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à compléter l'action protectrice des protéoglycanes à héparane sulfate par la mise au point de principes actifs mimant l'action de l'héparane sulfate, pour protéger le stock endogène de 5 FGF-2, notamment au niveau de la peau et en particulier au niveau du derme, et capables notamment de traverser la barrière cutanée pour atteindre leur cible. Un autre but est la fourniture de principes actifs protégeant la quantité endogène de FGF-2, tout en la rendant disponible pour le renouvellement de la matrice extracellulaire, et en particulier la 10 matrice dermique. L'invention a notamment pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture de principes actifs protégeant FGF-2 de sa dégradation ou dénaturation, intervenant dans les différents tissus et notamment au niveau de la peau, notamment pour fournir des 15 compositions cosmétiques, dermo-cosmétiques, ou pharmaceutiques destinées à restructurer la matrice extracellulaire, et en particulier le derme par la restructuration de la matrice dermique, à améliorer l'hydratation de la peau, à promouvoir la réparation de la peau, à maintenir l'intégrité du derme, à améliorer la prolifération des 20 mélanocytes, à renforcer la différentiation épidermique, ou à renforcer le renouvellement de l'épiderme, notamment chez l'être humain. La présente invention a notamment pour but de résoudre le nouveau consistant en la fourniture d'un principe actif d'origine végétale pour résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus. Les principes actifs 25 permettant de résoudre ces problèmes techniques doivent notamment ne pas être toxiques, ni irritants vis-à-vis de la peau. La présente invention a ainsi également pour but de fournir des principes actifs résolvant les problèmes techniques mentionnés dans le 9 2907225 Division de la demande FR 06 54316 domaine de la cosmétique, de la dermo-cosmétique ou de la pharmacie, en particulier pour une application topique chez l'être humain. La présente invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une méthode de criblage 5 de principes actifs permettant d'atteindre les buts mentionnés ci-dessus. Ce procédé de criblage doit notamment permettre de cribler un grand nombre de principes actifs à la fois, de manière reproductible, et fiable. RESUME DE L'INVENTION Pour identifier des principes actifs résolvant les problèmes techniques mentionnés ci-dessus, les inventeurs ont développé un modèle in vitro de criblage permettant de mettre en évidence une activité de protection du FGF-2 sur un grand nombre de substances à cribler, en 15 particulier face à la dégradation thermique de FGF-2. Par la protection du FGF-2, ces principes actifs jouent un rôle majeur, assurant l'intégrité de la matrice extracellulaire et notamment de la matrice dermique par le renouvellement de la population cellulaire des fibroblastes. Ils constituent donc des principes actifs de premier choix pour 20 lutter efficacement contre la dégradation du FGF-2, et pour lutter, entre autres, contre le vieillissement cutané. Selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une substance qui n'est ni un glycosaminoglycanne sulfaté (GAG sulfaté), ni un analogue structural d'un GAG sulfaté, protégeant FGF-2 25 comme principe actif dans une composition cosmétique ou dermocosmétique ou pharmaceutique pour prévenir ou lutter contre au moins une altération cutanée liée à la dégradation de FGF-2. 10 2907225 Division de la demande FR 06 54316 De préférence, la substance protégeant FGF-2 est un extrait végétal et ne comprend pas de GAG sulfaté ni d'analogue structural à un GAG sulfaté. Avantageusement, ladite substance étant choisie parmi le groupe 5 consistant en un extrait d'Hibiscus Abe/moschus ou ambrette, un extrait de Rebokza, un extrait de baies de Gougizi, un extrait de de Banha, un extrait de Lessonia, un extrait de farine de moutarde, un extrait de Wooyin, un extrait d'Orge, un extrait de Sésame ou une des combinaisons résultant de l'association d'au moins deux des extraits énumérés. 10 Avantageusement, FGF-2 est protégé au niveau de la peau humaine et de préférence au niveau de la JDE, et/ou du derme, et/ou de l'hypoderme, et/ou de l'épiderme, et/ou de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés. Avantageusement, les altérations cutanées liées à la dégradation du 15 FGF-2 interviennent au niveau de la peau humaine et de préférence au niveau de la JDE, et/ou du derme, et/ou de l'hypoderme, et/ou de l'épiderme, et/ou de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés. Avantageusement, ladite substance est un extrait aqueux ou hydroalcoolique en solution obtenu à partir de 1 à 10% d'une plante ou 20 partie de plante à l'état sec par rapport au poids de la solution totale. De préférence l'extrait aqueux est un extrait hydroglycolique. En particulier, la dégradation du facteur de croissance est résultante d'au moins une dégradation, notamment une dégradation thermique, qui se produit notamment à température physiologique ou par 25 exposition à la chaleur, et/ou une dégradation enzymatique, notamment par la cathepsin G. Avantageusement, ladite substance ou composition est utilisée pour stimuler la prolifération de cellules de la peau, en particulier la prolifération des fibroblastes et/ou des mélanocytes, et/ou augmenter la 11 2907225 Division de la demande FR 06 54316 synthèse d'au moins un composant matriciel, en particulier d'au moins un type de collagène, et/ou d'au moins une protéine spécifique des microfibrilles, telle que fibrilline 1 ou 2 et/ou fibuline 3 ou 5, et/ou d'au moins un glycosaminoglycanne (GAG), notamment d'un GAG sulfaté. 5 Selon un mode de réalisation particulier, la substance ou composition est utilisée pour effectuer un soin choisi parmi le groupe consistant à restructurer la matrice extracellulaire, et en particulier celle du derme, de la JDE, de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés, de l'hypoderme, de l'épiderme, et en particulier le derme par la restructuration de la matrice dermique, améliorer l'hydratation de la peau, promouvoir la réparation de la peau, maintenir l'intégrité du derme, améliorer la différenciation épidermique, et renforcer le renouvellement de l'épiderme, ainsi que l'une quelconque des combinaisons de ses soins. Ces différentes utilisations visent notamment à prévenir ou lutter 15 contre des altérations cutanées liées à la dégradation de FGF-2. Avantageusement, la substance ou composition est utilisée pour lutter contre le vieillissement de la peau, notamment chez un être humain. Avantageusement, la concentration de ladite substance est une concentration efficace pour la protection du FGF-2, notamment par 20 application topique, et est notamment comprise entre 0,01% et 10% en poids de la composition totale. La composition est notamment une composition cosmétique, dermo-cosmétique, ou pharmaceutique, notamment pour l'être humain. La substance selon la présente invention est de préférence un 25 extrait végétal protégeant FGF-2 de sa dégradation, et en particulier un extrait aqueux ou hydroalcoolique, de préférence hydroglycolique. Selon un mode de réalisation préférée, la substance est un extrait aqueux ou hydroalcoolique d'Hibiscus Abe/moschus obtenu à partir de la graine d'Hibiscus Abelmoschus. 12 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Selon un second aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une substance pour la fabrication d'une composition, notamment cosmétique, pharmaceutique, ou dermo-cosmétique, pour protéger FGF-2 de sa dégradation, notamment dans les différentes utilisations listées ci- 5 dessus. La présente invention concerne encore une méthode de soin cosmétique, pharmaceutique, ou dermo-cosmétique utilisant une composition définie ci-dessus selon l'un quelconque des modes de réalisation, notamment pour réaliser un soin lié au moins à l'une des différentes utilisations listées ci-dessus DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE LA PRÉSENTE INVENTION La présente invention permet d'obtenir une protection du FGF-2 par 15 les protéoglycanes de cette même matrice. On entend par protection du FGF-2 la protection de FGF-2 contre sa dégradation ou sa dénaturation. Cette dégradation ou dénaturation intervient généralement sous la forme d'une lyse due aux conditions environnementales, comme une lyse enzymatique ou 20 thermique. Cette dégradation ou dénaturation peut intervenir du fait de la diminution de la protection assurée par les protéoglycannes. Le procédé de criblage selon la présente invention a permis de cribler différents principes actifs extraits de végétaux. Aucun extrait végétal n'a été décrit comme protégeant FGF-2 de sa dégradation au 25 niveau de la peau, notamment chez l'être humain, seules des substances dont la structure est proche de l'héparane sulfate ayant été utilisées. Il a été identifié un principe actif particulièrement efficace et inattendu pour protéger FGF-2 de la dégradation thermique il s'agit d'un extrait aqueux obtenu à partir de la graine d'une plante appartenant à la 13 2907225 Division de la demande FR 06 54316 famille Malvaceae, plus particulièrement au genre Hibiscus et encore plus particulièrement Hibiscus Abe/moschus ou Ambrette. Hibiscus abelmoscus était connu notamment sous forme d'un extrait aqueux obtenu à partir de la plante entière, uniquement pour ses 5 propriétés amincissantes en cosmétique et plus particulièrement pour lutter contre la cellulite (US5705170). D'autres extraits ayant l'activité désirée pour la présente invention ont pu être sélectionnés. Leur activité est particulièrement inattendue, notamment quant à la protection du FGF-2. Les extraits sont notamment un extrait aqueux de Lycium chinense ou Baies de Gougizi obtenu à partir de baies entières déshydratées, un extrait aqueux de Pine//iae ternata ou Banha obtenu à partir de tubercule, un extrait aqueux de Raphanus sativus ou Rebokza obtenu à partir de la graine, un extrait de Brassica juncea ou moutarde obtenu à partir de la graine, un extrait aqueux de 15 Coicis semen ou Wooyin obtenu à partir de la graine, un extrait de Hordeum vu/gare ou d'orge obtenu à partir de la graine, un extrait de Sesamum Md/cm ou sésame doré obtenu à partir de la graine et un extrait d'algue entière de Lessonia sp ou Lessonia. Ces extraits ne sont cependant pas limités aux seuls extraits 20 aqueux. Ainsi la présente invention couvre également tout solvant polaire permettant d'obtenir essentiellement l'ensemble des composés actifs dans un extrait aqueux pour apporter les propriétés désirées dans le cadre de la présente invention. D'après les essais réalisés par les présents inventeurs, des extraits hydroglycoliques permettent d'obtenir les propriétés désirées. 25 Parmi les extraits hydroglycoliques, un solvant d'extraction du type eau/glycol est préféré. On préfère en particulier un mélange eau/butylène glycol. 14 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Les proportions du mélange eau/alcool peuvent varier comme le sait l'homme du métier. Les proportions eau/alcool varient généralement de 10/90 à 90/10, et par exemple de 50/50 à 85/15. Il est préférable d'utiliser dans la présente invention comme 5 principe actif un extrait en solution obtenu à partir de 1 à 10% d'une plante ou partie de plante à l'état sec par rapport au poids de la solution totale. La composition selon la présente invention comprend avantageusement de 0,001% à 20%, de préférence de 0,01 à 10%, de principe actif selon la présente invention en poids de la composition totale. La composition peut être appliquée topiquement ou administrée par voie orale. La méthode de criblage d'une substance potentiellement active pour la protection de FGF-2 quant à sa dégradation chez l'être humain 15 comprend notamment : a) la mise en contact d'une substance potentiellement active et de FGF-2 à une température d'environ 45 C pendant une période d'environ 2h, b) la sélection des substances protégeant FGF-2 d'au moins 50%, de préférence 65 % de sa dégradation. 20 Avantageusement, la méthode de criblage comprend une étape supplémentaire de test de la pénétration transcutanée pour sélectionner une substance active traversant la barrière cutanée. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne une méthode de criblage de substances actives issues de végétaux. 25 Avantageusement, laprésente invention concerne la méthode de préparation d'une composition, comprenant la mise en oeuvre de ladite méthode de criblage suivie d'une étape de mélange de la substance active sélectionnée avec un excipient pour la préparation de la composition. 15 2907225 Division de la demande FR 06 54316 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter 5 la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans 10 sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression 15 atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLES Exemple 1 : Etude de la dégradation thermique du FGF-2 20 Tardieu et al, en 1992 ont étudié la dégradation thermique du FGF-2 dans un modèle de prolifération fibroblastique par incorporation d'élément radioactif. Les présents inventeurs ont développé une méthode permettant d'étudier la stabilité du FGF-2 : cette méthode de 25 quantification utilisable à grande échelle permet la réalisation d'un criblage de principes actifs, ce qui n'aurait pas été possible avec la méthode décrite par Tardieu. Une solution à 5ng/ml de FGF-2 dans du tampon PBS 10mM-0.1%BSA et 0.1% de méthyl paraben est préparée. 16 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Cette solution est placée à différentes températures : 4 C, 20 C, 37 C, 50 C, et 80 C en présence ou non d'héparine à 500pg/ml. Des dosages du FGF-2 par un kit commercial ELISA (R&D system, France) sont effectués à différents temps (T=O, 3h, 24h et 48h) de façon 5 à établir une cinétique de dégradation pour chaque température d'étude. Les résultats sont exprimés en pourcentage de FGF-2 par rapport au temps T=0. Les expériences sont réalisées en triplicata (n=3). Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 1 et 2. Le FGF-2 est sensible aux conditions de température auxquelles il est soumis. La figure 1 montre l'évolution de la stabilité de FGF-2 en fonction du temps à différentes températures. Le FGF-2 stocké à 4 C est relativement stable sur une période de 48H puisque 20% de FGF-2 est dégradé à cette température. Avec l'augmentation de la température, les 15 pourcentages de dégradations augmentent : après 3H à 37 C, le FGF-2 subit 65 h de dégradation et 80% de dégradation à 50 C. Enfin, après 3H à 80 C, une dégradation totale du FGF-2 est observée qui est dû à une dénaturation des protéines à cette température. Enfin, plus le temps est long et plus la dégradation observée est 20 importante, après 24H à 37 C, 80% du FGF-2 est dégradé. La figure 2 représente la stabilité du FGF-2 à différentes températures en présence d'héparine. La figure 2, montre que cette dégradation est stoppée par la présence d'héparine à 0.05% qui est le témoin positif d'expérience et qui par sa forte affinité avec FGF-2 le 25 stabilise. L'héparine est un polysaccharide hautement sulfaté connu pour sa très forte affinité avec le FGF-2. Cette protection n'est pas efficace à 80 C car l'héparine est également dénaturée à cette température. 17 2907225 Division de la demande FR 06 54316 De manière surprenante, la dégradation du FGF-2 à environ 50 C intervient sur une période de temps courte. Une température proche de 45 C est sélectionnée pour des raisons pratiques et constitue un paramètre de choix pour réaliser un modèle de stress pour cribler des 5 principes actifs. Le témoin positif d'expérience étant de préférence constitué par l'héparine. Exemple 2 : Modèle in vitro pour la sélection d'un actif protégeant le FGF-2 face à la dégradation thermique. 10 La dégradation du FGF-2 observée à environ 50 C est particulièrement intéressante, car une période de temps courte permet une dégradation de FGF-2 de 80% environ, permettant ainsi de réaliser un grand nombre d'essais. Pour cette raison, il a été décidé de réaliser un 15 criblage avec un stress de 2H15 à 45 C et d'étudier la capacité d'un grand nombre d'actifs à protéger le FGF-2 face à cette dégradation thermique. Le modèle de criblage appliqué est le suivant : 180p1 d'une solution de FGF- 2 à 4.5 ng/ml préparée dans du tampon PBSBSA 0.1% sont répartis dans une microplaque 96 puits. 20pl d'eau distillée 20 ou d'héparine à 0.05% ou d'une solution contenant différents principes actifs extraits de différents végétaux à tester sont ajoutés. La plaque est agitée à l'aide d'un agitateur de plaque puis recouverte d'une bande adhésive et placée dans une étuve à 45 C pendant 2H15. A la fin de la période d'incubation, la plaque est sortie puis un dosage du FGF-2 est 25 réalisé par le kit ELISA. Une plaque témoin, contenant seulement du FGF-2 et de l'eau distillée traitée dans les mêmes conditions est laissée à température ambiante. 18 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Les résultats sont exprimés en pourcentage de protection du FGF-2 par rapport au témoin FGF- 2 non stressé ou non dégradé. Exemple 3 : Validation du modèle par les GAG et protéoglycanes de la 5 peau. Des essais ont été réalisés avec les GAG et PG disponibles commercialement afin de valider le modèle. Des solutions de GAG à différentes concentrations sont réalisées : lo L'héparane sulfate, le dermatane sulfate, les chondroïtines sulfate, et l'acide hyaluronique sont solubilisés puis testés à 0.1%-0.01%-0.001%. L'héparine utilisée comme témoin positif est testée à 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% et 0.00001%. Les protéoglycanes testés sont le Glypican-3 et la décorine testés à 15 0.1%, 0.01%, 0.001%. Le protocole de stress décrit dans l'exemple 2 est appliqué, les 20pl d'eau étant substitués par 20pl de solution de GAG ou PG correspondante. Les GAG et PG testés subissent ainsi une dilution supplémentaire au 1/10. La figure 3 illustre l'étude de la protection du FGF-2 par des GAG de 20 la peau. Les résultats obtenus figure 3, confirment les données de la littérature, à savoir : L'héparane sulfate protège le FGF-2 ainsi que le dermatane sulfate et ceci à chaque concentration testée. C'est en effet, le dermatane sulfate 25 qui est le principal promoteur de l'activité du FGF-2 lors du processus de cicatrisation. Le hyaluronane, quel que soit son poids moléculaire, ne permet en aucun cas de protéger le FGF-2. Quant à la chondroïtine sulfate, la protection qu'elle apporte dépend de sa dose mais cependant n'atteint pas 100%. 19 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Le test de 2 protéoglycanes, figure 4 (Etude de la protection de FGF-2 par des PG), le glypicane-3 et la décorine a confirmé les données issues de la littérature. A savoir que le glypicane-3 qui possède des chaînes d'héparane sulfate protége le FGF-2 de façon dose dépendante, 5 alors que la décorine (composé de chaînes de chondroïtine sulfate et de dermatane sulfate) se révèle inefficace. Cette étude met en évidence que la protection du FGF-2 dépend de la structure des GAG. L'interaction de l'héparane sulfate au FGF-2 est bien validée. Cette interaction est confirmée lorsque le PG portant les chaînes 10 d'héparane sulfate est testé dans le modèle. Cette étude a permis de valider notre modèle de criblage par la confirmation des résultats issus de la littérature. Exemple 4 : Criblage de principes actifs 15 Le criblage a été réalisé selon l'exemple 2, à partir d'une librairie composée de 2000 extraits végétaux et de molécules caractérisées. Ces composés, extraits végétaux, algues marines ou molécules caractérisées, solubilisés sont testés purs, ou à 10% ou 1% dans le milieu réactionnel 20 décrit à l'exemple 2. Les résultats des principes actifs les plus efficaces sont décrits dans le tableau 1, ci-dessous. 20 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Tableau 1 : résultats obtenus lors du criblage Principe actif testé Protection (%) Protection (%) Nom commun Obtenue pour le Obtenue pour le principe actif à principe l'actif à 10% 1% Extrait d'échalote 95.07 1.2 Extrait de farine de soja 86.85 67.66 Extrait d'urucum 103.5 29.8 Extrait de moutarde blanche 110.5 17.39 Extrait de Lycopode plante 71 11.27 Extrait de farine de lupin 116.39 65.77 Extrait de pomme de terre 73 16.5 Extrait de Jioh 70.9 23.18 Extrait d'ail 95.99 13.92 Extarit d'angélique souche 72.5 7.31 radicante Extrait d'Haricot mungo 76.78 2.42 Extrait de Ligusticum 70.53 38.15 chuanxiong Extrait de Carotte 83.93 1.65 Extrait d'Hibiscus Abe/moschus 135.1 87.53 ou ambrette Extrait de Panais 92.89 23.15 Extrait de Petit pois 74,33 0 Extrait de Pomme de terre 88.96 3.61 Extrait d'Orange 70 2.83 Extrait de Piment doux 87.35 28.44 21 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Extrait de Rebozka 142,5 77.34 Extrait de Concombre de mer 69,2 Extrait de Baies de gougizi 154,4 68.59 Extrait de Banha 129.5 65.64 Extrait de Lessonia 53,3 61.79 Extrait de Farine de Moutarde 110,1 56.85 Extrait de Wooyin 106,1 56.18 Extrait d'Orge 79,7 53.81 Extrait de Sésame 124,4 52.73 Extait d'Acore odorant 55,6 49.34 Extrait d'Hongsan 102,3 44.58 Extrait d'Acore odorant 77,7 43.24 Extrait de Luteolin 67,7 43.17 Extrait de Bryone 81 40.4 Extrait de Mounwhaja 102 39.56 Extrait d'Amande 99,5 38.53 Extrait de Ligusticum 70,5 38.15 chuanxiong Extrait de Chunnansung 108,4 37.7 Extrait de Courge 85,7 37.5 Extrait de Goborn 71,1 37.8 Extrait de Bangpung 117,9 36 Extrait d'Ammonium acrylate 54,9 Extrait de Hesongja 81,9 33.3 Extrait de Lin 93, 3 32.6 Extrait de Persil 97,4 30 Extrait de Graine de pavot bleu 70.33 8.8 Extrait de Boksin 75.69 27.56 22 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Extrait de Sanyak 63.05 16.78 Extrait de graine de Lin jaune 88.56 28.4 Extrait de Porphyra Tenera 38.35 29.77 Extrait de Lithotheminium 53.78 26.6 Les extraits ci-dessus sont obtenus de préférence par macération d'une partie de la plante dans un mélange eau/alcool, de préférence eau/glycol de 100/0 à 0/100 (v/v). La dilution est alors effectuée dans ce 5 solvant ou mélange de solvants. Certains actifs testés présentent une forte activité de protection qui est de plus dose dépendante. Exemple 5 Extrait d'Hibiscus Abe/moschus (Ambrette) 10 5a-Un extrait d'Ambrette hydroalcoolique est réalisé à partir des graines broyées à 5 % (p/p) dans de l'éthanol à reflux. L'extraction est réalisée pendant 1 heure puis la solution est filtrée, l'éthanol éliminé, et le résultat est solubilisé à 5% (p/p) dans un mélange eau/glycol (75/25) puis 15 ultrafiltré sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. 5b-Un extrait d'Ambrette hydroglycolique est réalisé dans un mélange eau (75%)/BG (25%) préférentiellement à partir des graines 20 broyées à 5% (p/p) . La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. BG signifiant butylène glycol. 5c-Un extrait d'Ambrette aqueux est réalisé dans de l'eau 25 préférentiellement à partir des graines broyées à 5% (p/p). La macération 23 2907225 Division de la demande FR 06 54316 est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 6 : Extrait de Baies de Gougizi 5 Un extrait de Baies de Gougizi est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de baies entières déshydratées à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, 10 et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 7 : Extrait de Banha Un extrait de Banha est réalisé préférentiellement dans un mélange 15 eau (75%)/BG (25%) à partir de tubercules à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 8 : Extrait de Rebokza 20 Un extrait de Rebokza est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de graines à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin 25 filtrée à 0,45pm. 24 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Exemple 9 : Extrait de Lessonia Un extrait de Lessonia est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de l'algue entière à 5% (p/p). La 5 macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 10 : Extrait de Moutarde 10 Un extrait de Moutarde est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin 15 filtrée à 0,45pm. Exemple 11 : Extrait de Wooyin Un extrait de Wooyin est réalisé préférentiellement dans un 20 mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. 25 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Exemple 12 : Extrait d'Orge Un extrait d'Orge est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p).La macération est 5 réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 13 Extrait de Sésame lo Un extrait de Sésame est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. 15 Chaque extrait (exemples 5 à 13) a été en partie conservé. L'éventuel conservateur, constitué de préférence par un mélange de Caprylyl Glycol, Phenoxyéthanol, Hexylene Glycol à 1%, est rajouté en final en présence ou non de xanthane. 20 Exemple 14 : Sélection des principes actifs ou extraits végétaux Les extraits les plus efficaces sont sélectionnés et testés à différentes concentrations selon le criblage de l'exemple 2. Les principes actifs utilisés sont les extraits des exemples 5 à 13, et sont dilués en 25 utilisant un solvant (ou mélange de solvants) ayant servi pour l'extraction Une gamme de concentration testée entre 0.1% et 10% dans ce solvant de façon à étudier la spécificité de ces principes actifs vis-à-vis de la dégradation thermique du FGF-2. Les dosages sont effectués en triplicata. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 2, ci-dessous : 26 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Tableau 2 : Effet-doses obtenus sur les principes ou actifs sélectionnés lors du criblage Principe actif Protection du FGF-2 (en %) en fonction de la concentration en principe actif 0.1% 1% 2% 3% 5% 10% Extrait d'Hibiscus 84.7 6.0 87.5 4.1 99.6 3.1 110.9 4. 123.6 1. 130.8 2. Abe/moschus 3 6 7 9 48 49 (Ambrette) Extrait de rebokza 8.5 1.6 72.3 5.6 99.9 5.4 106.6 3. 123.8 1. 129.4:EO. 4 7 21 43 89 Extait de Baies de 7.7 0.5 29.5 3.4 38 4.14 52 2.17 75 3.05 109.4 6. Gougizi 7 34 Extrait de Banha 8 1.46 52.5 4.1 76.6 2.5 85.5 2.4 91 2.82 98.9 0.7 7 5 5 Extrait de Lessonia sp 13.2 1.6 36 5.49 50.8 3.1 53.27 3. 53.67 4. 52.15 0. 3 6 04 49 84 Extrait de Moutarde 14.7 2.8 88.7 8.0 104.9 5. 111.3 2. 119 1.2 118 2.8 farine Codex 6 6 01 93 Extrait de Wooyin 9.4 0.95 56.4 2.9 69.2 0.8 80.6 2.4 92.9 4.3 102.4 1. 7 8 3 9 85 Extrait d'Orge 10.7 0.9 47.4i-1.8 60.8 2.3 70.2 0.5 82.5 0.4 97.8 1.0 5 6 1 9 9 Extrait de Sésame 2.3 1.06 21.5 0.4 48.4 1.7 55.7 19. 74.8 0.5 94.8 1.7 3 1 44 4 Les extraits sont très efficaces et présentent tous une activité dose 5 dépendante traduisant donc une spécificité d'activité de chaque actif sur la cible donnée. 27 2907225 Division de la demande FR 06 54316 L'extrait d'Hibiscus Abe/moschus (ambrette) présente l'activité la plus forte et constitue donc un principe actif de choix dans la protection du facteur de croissance FGF-2. 5 Dans les exemples 15 à 21 la concentration en principe actif (extrait 5c) est en pourcentage en volume (v/v) dans l'eau. Exemple 15 : Etude de la protection de FGF-2 par l'extrait aqueux d'Hibiscus Abe/moschus (ambrette) préparé selon l'exemple 5c (extrait 5c). 10 Une étude de la protection du FGF-2 par l'extrait 5c, a été réalisée sur 2 lots industriels. La protection a été étudiée face à un stress selon les conditions de l'exemple 2. Le témoin positif constitué par l'héparine testée à 0.01% dans le 15 milieu réactionnel final après dilution préalable dans l'eau protège à 105.52% 3.04. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 3, ci-dessous : Tableau 3 : Protection du FGF-2 à 45 C par 2 lots industriels de l'extrait 5c 20 Protection du FGF2 (en %) en fonction de la concentration en principe actif Extrait 5c 0.1% 0.5% 1% 2% 3% Loti 4.78 46.47 81.01 107.83 120.76 3.89 1-1.85 4.53 -1-2.53 2.61 Lot2 4.38 42.04 69.6 101.81 118.67 - 2.3 1-2.76 3.56 4.02 4.12 28 2907225 Division de la demande FR 06 54316 L'extrait 5c protège le FGF-2 de façon dose dépendante avec une activité forte pour une concentration de 1% en principe actif dans l'eau. Les résultats obtenus sur 2 lots industriels sont sensiblement identiques. Il était indispensable de vérifier que l'extrait 5c pouvait protéger le 5 FGF-2 à température physiologique c'est à dire 37 C. C'est pourquoi une étude a consisté à doser le FGF-2 après 24H à 37 C en absence ou en présence de concentrations croissantes de l'extrait 5c. Le témoin positif constitué par l'héparine à 0.01% protège à 110.53% 3.20. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 4, ci-dessous: Tableau 4 : Protection du FGF-2 à 37 C par 2 lots industriels de l'extrait 5c Protection du FGF-2 (en %) en fonction de la concentration en principe actif Extrait 5c 0.01% 0.1% 0.25% 0.5% 0.75% 1% Loti 8,37 17.81 51.02 82.62 108.39 110.69 -14.2 3.04 4.75 1.98 13.28 Lot2 2.12 20.56 55.49 91.06 110.64 122.87 1.17 1-2.29 2.61 0.87 2.45 5.75 15 Les résultats obtenus montrent que l'extrait 5c protège le FGF-2 à température physiologique et de façon dose-dépendante. L'extrait 5c protège davantage, à cette température, le FGF-2 qui est moins dégradé qu'à 45 C. 29 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Exemple 16 : concerne l'étude de cytotoxicité de l'extrait 5c sur des fibroblastes en monocouche par un dosage au PNPP Le but était d'étudier la cytotoxicité de l'extrait 5c sur des 5 fibroblastes humains normaux. Ce dosage est basé sur la transformation du p-nitrophényl phosphate (PNPP) en p-nitrophénol par les phosphatases acides intracellulaires des cellules viables. L'absorbance du p-nitrophenol à 405 nm est directement proportionnelle au nombre de cellules viables contenues dans les puits de culture. Une fois la confluence des fibroblastes humains normaux atteinte, les milieux de culture étaient remplacés par 200 pl/ puits de milieu additionné ou non (contrôle) de l'extrait 5c en concentrations croissantes : 0,1;0,5; 1 ; 2 ; 3 et 5 0/0. 15 Les cellules étaient incubées pendant 48 heures en étuve à 37 C. Après incubation et élimination des milieux de culture, les cellules étaient rincées deux fois par du PBS (Phosphate Buffered Solution) puis étaient mises en présence de 200 pl d'un tampon contenant 0,1 M d'acétate de sodium (pH 8), 0,1 % de Triton X-100 et 5 mM de p- 20 nitrophényl phosphate (Sigma, France). Après deux heures d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2, la réaction était stoppée par ajout de 20 pl de NaOH IN. L'absorbance des milieux réactionnels à 405 nm était alors déterminée à l'aide d'un lecteur de plaques (Victor2 V, Perkin Elmer, Finlande). 25 L'hydrolyse non enzymatique du p-nitrophényl phosphate était déterminée lors de chaque expérience sur des puits ne contenant pas de cellules ("blanc"). Toutes les mesures étaient réalisées en sextuplate (n=6). 30 2907225 Division de la demande FR 06 54316 Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 5, ci-dessous : Tableau 5 : Etude de la cytotoxicité sur fibroblastes humains normaux Concentration en extrait 5c Pourcentage de cellules viables par (%) rapport au témoin négatif 0,1 85,9 0,5 88,7 1 88,8 2 87,5 3 89,8 5 85,5 5 L'extrait 5c n'est pas cytotoxique dans toute la gamme de concentration testée. Exemple 17 : Etude de la prolifération des fibroblastes par le FGF-2 protégé par l'extrait 5c 10 Le but de cette étude a été de vérifier que le FGF-2 protégé par l'extrait 5c stimule la prolifération des fibroblastes humains normaux. Une solution de FGF-2 est préparée extemporanément (=FGF-2 non dégradé) ; une solution de FGF-2 est placée 24H à 37 C en absence 15 (=FGF-2 dégradé) et en présence d'héparine (=FGF-2 + Héparine à 37 C) à 0.01%. Chaque solution de FGF-2 est diluée de façon à appliquer sur les cellules, les concentrations finales suivantes en FGF-2 : 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 et lng/ml. 20 Des fibroblastes dermiques humains normaux sont ensemencés à faible densité dans des plaques 6 puits. Ils sont alors cultivés dans du 31 2907225 Division de la demande FR 06 54316 milieu en absence (témoin) ou en présence de FGF-2 aux différentes concentrations. Après 48H, l'activité des phosphatases acides intracellulaires (PNPP) est dosée, ce qui permet d'évaluer l'effet des solutions de FGF-2 traitées s ou non, sur la prolifération cellulaire. Les résultats sont exprimés en pourcentage de prolifération par rapport au puits témoin c'est à dire au puits non traité. Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 6 ci-dessous 10 et la figure 5: Tableau 6 : Etude de la prolifération (exprimée en % par rapport au puits non traité) obtenue après traitement par différentes concentrations en FGF-2 non dégradé, différentes concentrations en FGF-2 dégradé et différentes concentrations en FGF-2 + héparine à 37 C. 15 Concentration en FGF-2 FGF2 non FGF-2 dégradé FGF-2 + héparine à (ng/ml) dégradé 37 C 0,1 116,7 96,2 0.014 129,3 0.009 0.012 P=0.006 ** 0,25 138,7 111 0.006 154,8 0.01 0.005 P REVENDICATIONS 1. Procédé de criblage d'une substance potentiellement active pour la 5 protection de FGF-2 quant à sa dégradation chez l'être humain, ledit procédé comprenant : a) la mise en contact d'une substance potentiellement active et de FGF-2 à une température d'environ 45 C pendant une période d'environ 2h, b) la sélection des substances protégeant FGF-2 d'au moins 50%, de préférence 65 % de sa dégradation. 2. Procédé de criblage, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comprend une étape supplémentaire de test de la pénétration transcutanée pour sélectionner une substance active traversant la barrière 15 cutanée. 3. Procédé de criblage, selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le procédé comprend le criblage de substances actives issues de végétaux. 20 4. Méthode de préparation d'une composition comprenant une substance potentiellement active pour la protection de FGF-2 quant à sa dégradation chez l'être humain, comprenant la mise en oeuvre de ladite méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour 25 identifier une substance active pour la protection de FGF-2 quant à sa dégradation chez l'être humain, suivie d'une étape de mélange de la substance active sélectionnée avec un excipient pour la préparation de la composition. 52