Brevet FR2907220A1 — publié le 20080418

PROCEDE DE COLORATION DE CELLULES La présente invention se rapporte à un procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle. L'invention concerne également un fixateur particulier utile pour la mise en oeuvre de ce procédé. Pour identifier et différencier des cellules ou des parties de cellules, on utilise des techniques de coloration cellulaire associées à l'observation au microscope. Ces méthodes de coloration sont indispensables dans de nombreux domaines de la biologie, aussi bien en recherche fondamentale qu'en analyse médicale ou vétérinaire pour le cytodiagnostic. En hématologie notamment on utilise depuis de très nombreuses années la coloration connue sous le nom de MGG, May-Grunwald Giemsa. Les colorants MGG se présentent sous forme de deux composés : - May-Grunwald réalisé à partir de poudre de bleu de méthylène/éosine à 0,30g dilués dans 100g de méthanol, - Giemsa réalisé à partir de poudres de bleu Azur II/ éosine 3,0g et d'Azur II 0,8g diluées dans 375g de méthanol avec 125g de glycérine. Le procédé de coloration consiste à fixer les cellules à colorer sur une lame avec la première solution, à tremper la lame dans la première solution diluée avec de l'eau tamponnée, généralement au 1/2, à la tremper ensuite dans la seconde solution, généralement diluée entre 1/20 et 1/30 dans de l'eau tamponnée, puis à la rincer et enfin la sécher. 2907220 2 On obtient alors des colorations connues de tous les praticiens qui font que cette technique MGG est devenue un standard et permet d'établir des comparaisons. Néanmoins la coloration MGG présente de nombreux inconvénients. 5 Tout d'abord, les solvants utilisés pour mettre en solution les poudres de colorant sont des composés toxiques et volatils. La présence de glycérine engendre également des inconvénients car elle rend plus difficile les rinçages des lames et peut engendrer des colmatages des filtres lors de la filtration finale. 10 De plus, pour réaliser une bonne coloration il est important que le colorant soit stable et qu'il ne persiste pas de dépôts de colorants après rinçage de la lame. Or, de tels dépôts peuvent apparaître avec le MGG. Ces dépôts perturbent le fonctionnement des dispositifs automatiques de reconnaissance de cellules et empêchent de distinguer les différents éléments cellulaires et de reconnaître 15 les cellules saines des cellules malades dans le cas d'un cytodiagnostic. Afin d'éviter ces inconvénients, on a tenté de remplacer le MGG par d'autres procédés de coloration. Toutefois, les procédés existants ne permettent pas de conserver la reproductibilité du MGG, ni d'obtenir des résultats comparables. 20 De plus, les procédés de l'art antérieur utilisent tous du méthanol que se soit pour réaliser les colorants en eux-mêmes ou la solution de fixation des cellules. En effet, le méthanol présente des propriétés physiques particulières qui lui permettent de bien fixer les cellules. Il est difficilement remplaçable par les solvants existants qui seuls, ne donnent pas des résultats satisfaisants. Or, le méthanol est un produit toxique et volatil dont il est souhaitable de limiter l'utilisation car il peut s'avérer dangereux pour le praticien. 2907220 3 Il subsiste donc un besoin pour un procédé de coloration non toxique permettant d'obtenir des résultats comparables à ceux d'un MGG, qui soit rapide et facile d'utilisation, avec des produits stables, présentant une grande rinçabilité. C'est ce à quoi répond la présente invention en proposant un procédé de 5 coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, comprenant au moins les étapes suivantes : -plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur, - plonger la préparation fixée dans un premier composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) rouge(s), et 10 - plonger la préparation fixée dans un second composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) bleu(s). Préférentiellement, le fixateur est réalisé à base d'éthanol. Le procédé selon l'invention permet d'obtenir toujours une même coloration pour les mêmes éléments afin de pouvoir établir des comparaisons d'images réalisées à 15 partir de lames colorées. La présente invention propose également un fixateur utile pour la mise en oeuvre d'un procédé de coloration comprenant au moins de l'éthanol, du formol en petite quantité, un colorant bleu et un colorant rouge. Avantageusement le procédé de coloration selon l'invention n'est pas dangereux 20 pour le praticien. En outre, il est rapide, fiable, facile d'utilisation et ne nécessite qu'une faible teneur en colorants. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description non limitative qui va suivre de l'invention. Le procédé de coloration selon l'invention consiste donc à plonger la préparation 25 de cellules à colorer dans un fixateur avant de la plonger dans des réactifs de coloration sous forme de deux composés. Préférentiellement le fixateur comprend au moins de l'éthanol. 2907220 4 Selon un mode de réalisation préféré, le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - obtention d'une première solution par mise en solution d'au moins un colorant bleu dans du diméthylsulfoxyde, 5 - obtention d'une seconde solution par mise en solution d'au moins un colorant rouge dans du diméthylsulfoxyde, - ajout de la seconde solution à la première solution, - dilution du mélange obtenu avec de l'éthanol absolu contenant du formol. 10 Un tensioactif non-ionique peut également être ajouté dans la formule du fixateur pour améliorer la rinçabilité et éviter l'apparition de dépôts lors de l'utilisation. De manière préférentielle, la première solution du fixateur est obtenue par mise en solution de bleu de méthylène et/ou de bleu azur et/ou d'un colorant bleu 15 appartenant aux composés du groupe des thiazines dans du diméthylsulfoxyde, et la seconde solution du fixateur est obtenue par mise en solution d'éosine et/ou d'érythrosine dans du diméthylsulf oxyde. Selon un mode de réalisation particulier, le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : 20 - obtention d'une première solution par mise en solution dans 120m1 de diméthylsulfoxyde, des colorants bleus suivants : • entre 1 et 1,5g de bleu de méthylène, • entre 1 et 1,5g de bleu azur, et • entre 0,9 et 1,5g d'un colorant bleu appartenant aux 25 composés du groupe des thiazines, obtention d'une seconde solution par mise en solution dans 120 ml de diméthylsulfoxyde, d'éosine dans une proportion comprise entre 0,1 et 0,6g, 2907220 5 - ajout de la seconde solution à la première solution, dilution du mélange obtenu jusqu'à 1L avec de l'éthanol absolu contenant entre 15 et 25g de formol 37%. Un tel fixateur est utile pour la mise en oeuvre du procédé de coloration selon 5 l'invention. Après l'étape de trempage dans un fixateur, le procédé de coloration selon l'invention consiste ensuite à plonger la préparation de cellules à colorer dans des réactifs colorant formé de deux composés. La préparation du premier composé consiste à mettre en solution au moins un 10 colorant rouge, l'éosine et/ou l'érythrosine, dans du diméthylsulfoxyde et à diluer cette solution dans une solution tamponnée. La préparation du second composé consiste à mettre en solution au moins un colorant bleu, le bleu azur et/ou le bleu de méthylène et/ou un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines, dans du diméthylsulfoxyde 15 et à diluer cette solution dans une solution tamponnée. Préférentiellement, la solution tamponnée est une solution tamponnée à pH compris entre 5,5 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate monopotassique et de phosphate disodique. La solution tamponnée peut également contenir un agent anti-microbien. 20 Selon un mode de réalisation particulier : - on prépare le premier composé dans le rouge par mise en solution d'éosine dans une quantité de 31,2m1 de diméthylsulfoxyde, avec un dosage compris entre 0,100 et 0,300g, plus particulièrement 0,100 et 0,200g, puis dilution dans environ 1L de solution 25 tamponnée, - on prépare le second composé dans le bleu par mise en solution de bleu azur dans une quantité de 12,5ml de diméthylsulfoxyde, avec un dosage compris entre 0,100 et 0,200g, plus particulièrement 2907220 6 0,100 et 0,150g, puis dilution dans environ 1L de solution tamponnée. Si le premier composé intègre de l'érythrosine, elle l'est à raison de 0,100 à 0,250g, plus particulièrement à raison de 0,150 à 0,200g. 5 Si le second composé intègre du bleu de méthylène, il l'est à raison de 0,100 à 0,200g, plus particulièrement 0,100 à 0,150g. Si le second composé intègre un composé du groupe des thiazines, il l'est à raison de 0,010 à 0,050g, plus particulièrement 0,015 à 0,030g. L'utilisation des ces deux composés pour le procédé de coloration selon 10 l'invention permet une excellente stabilité et également une excellente dissolution car il n'y a pas de phase avec glycérine. La dissolution de chacun des composés ne pose pas de problème car elle ne génère pas de complexes. De plus, ces composés sont peu chargés en colorants du fait de leur dilution dans 15 une solution aqueuse, si bien qu'ils présentent une toxicité réduite et qu'ils sont très facilement rinçables. Selon un exemple particulier de l'invention, le procédé de coloration de cellules comprend la succession des étapes suivantes - plonger la préparation de cellules à colorer 600 à 1200 secondes 20 dans le fixateur, - plonger la préparation fixée 120 à 300 secondes dans le premier composé, - plonger la préparation fixée 120 à 480 secondes dans le second composé, 25 - rincer entre 10 et 30 secondes, et sécher à l'air. 2907220 7 Le procédé de coloration peut également comprendre une étape après la fixation des cellules à colorer qui consiste à plonger la préparation fixée entre 5 et 20 secondes dans une solution tamponnée. Préférentiellement, la préparation est rincée dans une solution de rinçage 5 constituée d'eau et d'un agent anti-microbien. Bien entendu, l'invention n'est évidemment pas limitée au mode de réalisation représenté et décrit ci-dessus, mais en couvre au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Procédé de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : - plonger la préparation de cellules à colorer dans un fixateur, - plonger la préparation fixée dans un premier composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) rouge(s), et - plonger la préparation fixée dans un second composé comprenant un ou plusieurs colorant(s) bleu(s). 2. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fixateur comprend au moins de l'éthanol. 3. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le fixateur est obtenu par la mise en oeuvre des étapes suivantes : - obtention d'une première solution par mise en solution d'au moins un colorant bleu dans du diméthylsulfoxyde, -obtention d'une seconde solution par mise en solution d'au moins un colorant rouge dans du diméthylsulfoxyde, - ajout de la seconde solution à la première solution, - dilution du mélange obtenu avec de l'éthanol absolu contenant du formol. 4. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 3, caractérisé en ce que le fixateur comprend également un tensioactif non ionique. 5. Procédé de coloration de cellules selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que la première solution du fixateur est obtenue par mise en solution de bleu de méthylène et/ou de bleu azur et/ou d'un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines. 2907220 9 6. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que la seconde solution du fixateur est obtenue par mise en solution d'éosine et/ou d'érythrosine. 7. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes 5 revendications, caractérisé en ce que le premier composé est obtenu par mise en solution d'au moins un colorant rouge, l'éosine, dans du diméthylsulfoxyde et par dilution de cette solution dans une solution tamponnée. 8. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications caractérisé en ce que le second composé est obtenu par mise en 10 solution d'au moins un colorant bleu, le bleu azur, dans du diméthylsulfoxyde et par dilution de cette solution dans une solution tamponnée. 9. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que la solution tamponnée est un solution tamponnée à pH compris entre 5,5 et 7,4 constituée d'eau déminéralisée, de phosphate 15 monopotassique et de phosphate disodique. 10. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que le premier composé comprend un colorant rouge, l'érythrosine, mis en solution dans du diméthylsulfoxyde. 11. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 10, 20 caractérisé en ce que le second composé comprend un colorant bleu, le bleu de méthylène, mis en solution dans du diméthylsulfoxyde. 12. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 7 à 11, caractérisé en ce que le second composé comprend un colorant bleu appartenant aux composés du groupe des thiazines mis en solution dans du diméthylsulfoxyde. 25 13. Procédé de coloration de cellules selon l'une quelconque des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes 2907220 10 - plonger la préparation de cellules à colorer 600 à 1200 secondes dans le fixateur, - plonger la préparation fixée 120 à 300 secondes dans le premier composé, 5 - plonger la préparation fixée 120 à 480 secondes dans le second composé, - rincer entre 10 et 30 secondes, et - sécher à l'air. 14. Procédé de coloration de cellules la revendication 13, caractérisé en ce 10 que la préparation fixée est plongée dans une solution tamponnée pendant 10 secondes avant d'être plongée dans le premier composé. 15. Procédé de coloration de cellules selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la préparation est rincée dans une solution de rinçage constituée d'eau et d'un agent anti-microbien. 15 16. Fixateur utile pour la mise en oeuvre du procédé de coloration selon l'une quelconque des précédentes revendications caractérisé en ce qu'il comprend au moins de l'éthanol, du formol, un colorant bleu et un colorant rouge.