Brevet FR2906808A1 — publié le 20080411

Utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques de la forme O-acétylée du ganglioside GD2 dans le traitement de certains cancers. Domaine de l'invention La présente invention vise à fournir de nouveaux moyens pour le diagnostic et la thérapie d'un cancer dont les cellules expriment la forme O-acétylée du ganglioside GD2. Ces moyens incluent essentiellement l'utilisation d'anticorps monoclonaux recombinants ou des fragments de celui-ci reconnaissant le GD2 O-acétylé -et qui ne reconnaissant pas les cellules saines et les fibres nerveuses du système périphérique. Art antérieur Les cellules tumorales possèdent à leur surface un certain nombre de déterminants antigéniques. Parmi ces déterminants antigéniques, certains sont des antigènes spécifiques de la tumeur. Ces antigènes tumoraux sont exprimés principalement voire exclusivement à la surface de cellules cancéreuses. Ces antigènes tumoraux humains induisent la production, par le système immunitaire d'espèces différentes comme la souris, des molécules appelées anticorps qui ont la particularité de reconnaître précisément les molécules d'antigène à l'origine de leur production. Cette reconnaissance spécifique entre un anticorps monoclonal et son antigène tumoral humain présente un intérêt majeur pour l'immunociblage des cancers. En effet, elle permet de concentrer au niveau des tissus ou des organes malades, des agents de détection dans un but de diagnostic ou des agents toxiques dans un but de traitement des tumeurs. Ces agents de détection ou toxiques peuvent être des composés chimiques ou biologiques, éventuellement radioactifs, attachés artificiellement aux anticorps avant ou après leur administration. Ces agents peuvent également être des composés biologiques naturellement présents chez le patient (composants du complément, chemokines, cytokines, cellules cytotoxiques, par 2906808 2 exemple lymphocytes T ou NK) recrutées vers les cellules tumorales par les anticorps. Les gangliosides sont des constituants de la membrane cellulaire et certains d'entre eux ont été caractérisés comme étant des antigènes tumoraux. Il a pu être 5 démontré que le ganglioside GD2 est fortement exprimé dans les cancers humains d'origine neuroectodermique tels que notamment les mélanomes, les glioblastomes, les carcinomes pulmonaires à petite cellule et les neuroblastomes. La liste des pathologies tumorales ici citées n'est pas exhaustive. Les rétinoblastomes et les ostéosarcomes expriment également le ganglioside GD2. Le ganglioside GD2 est un 10 glycolipide acide formé par un céramide associé un oligosaccharide dont la séquence est glucose galactose N-acétyl-galactosamine. A la molécule de galactose se trouvent rattachées deux molécules d'acide sialique. L'acide sialique terminal peut être modifié par l'ajout d'un groupement O-acétyle pour former le GD2 O-acétylé. A l'aide d'anticorps spécifique du GD2 qui reconnaissent également sa forme O- 15 acétylée, il a pu être montré que certains types de cancers, notamment les tumeurs d'origine neuroectodermique expriment le GD2 et sa forme O-acétylée, le GD2 O-acétylé, en proportion variable. Plusieurs anticorps monoclonaux anti-GD2 produits chez la souris ont été décrits. L'utilisation thérapeutique des anticorps monoclonaux anti-GD2, 14.G2a et 20 3F8, appartenant respectivement aux immunoglobulines de classe IgG2a et IgG3 de souris, a été testée dans des études cliniques. Ces études ont mis en avant plusieurs effets secondaires négatifs inhérents aux anticorps monoclonaux de souris. Un de ces effets négatifs est une réaction allergique ou anaphylactique qui peut être attribuée à une réponse immunitaire développée par 25 l'homme contre les anticorps de souris. Afin de résoudre ce problème d'immunogénicité des anticorps monoclonaux produits chez la souris, il est possible grâce à des techniques d'ingénierie génétique de réaliser des anticorps chimériques. Le principe de ces modifications génétiques 2906808 3 consiste à remplacer une partie plus ou moins importante de l'information génétique codant l'anticorps de souris par la partie correspondante d'un anticorps humain. Ces anticorps chimériques conservent la reconnaissance spécifique de l'antigène tumoral inhérente à l'anticorps monoclonal de souris tout en présentant les propriétés 5 physiques et effectrices inhérentes à l'anticorps humain. Ainsi, des études cliniques ont démontré que les anticorps chimériques ch.14G2a et ch.14.18 présentent une immunogénicité réduite et une demi-vie sérique accrue en comparaison à l'anticorps monoclonal de souris dont ils dérivent. De plus il a été mis en évidence que les anticorps monoclonaux anti-GD2 de souris présentent une capacité accrue à recruter 10 les cellules effectrices humaines lorsqu'ils sont chimérisés, alors que les anticorps de souris n'ont qu'une capacité limitée, à recruter ces cellules effectrices humaines. Inconvénients de l'art antérieur Une utilisation thérapeutique ou diagnostique in vivo des anticorps monoclonaux nécessite que ceux-ci réunissent des qualités particulières de spécificité, 15 d'affinité et de non toxicité. Or les études cliniques menées sur les anticorps monoclonaux et chimériques anti-GD2 mettent en avant un effet secondaire négatif majeur, non résolu par la chimérisation et qui est la neurotoxicité des anticorps anti-GD2. En effet, les patients présentant un cancer d'origine neuroectodermique auxquels ont été administrés des anticorps anti-GD2 ont présenté des douleurs au 20 cours de l'administration des anticorps et certains de ces patients ont développé une neuropathie du système nerveux périphérique. Ces effets s'expliquent par la présence de gangliosides GD2 à la surface des cellules fibres nerveuses du système périphérique. On comprend alors que cette toxicité nerveuse inhérente à l'utilisation des 25 anticorps anti-GD2 a limité le développement clinique de l'immunothérapie utilisant ces anticorps. Pourtant le grand nombre de cibles antigéniques GD2 reste un facteur d'intérêt majeur pour l'immunociblage des cancers d'origine neuroectodermique. 2906808 4 Une approche qui permettrait de résoudre le problème de toxicité nerveuse serait le développement d'anticorps reconnaissant un antigène tumoral associé aux cancers d'origine neuroectodermique différent du ganglioside GD2 et qui ne reconnaîtrait pas les fibres nerveuses du système périphérique. 5 Il y quelques années, les inventeurs ont mené une série d'immunisations de souris afin de produire des anticorps anti-GD2. Plusieurs anticorps anti-GD2 ont ainsi pu être isolé et leur caractérisation a conduit notamment à l'identification d'un anticorps de la classe des IgG3 de souris appelé 8B6 reconnaissant spécifiquement une molécule de ganglioside GD2 légèrement modifiée par la présence d'un 10 groupement O-acétyle. Ces travaux, et notamment cet anticorps 8B6 sont décrits dans l'article Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antivodies Sepcific to Disialoganglisosides (GD2,GD3) and their O-Actylated Derivatives , Cerato et al., Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997,307-316, ici incorporé par référence. La structure de cet anticorps a été étudiée, mais son développement n'a pas été 15 poursuivi. En effet, aucun intérêt particulier de ce nouvel anticorps par rapport aux anticorps anti-GD2 connus n'apparaissait alors. Contrairement à la forme non acétylée du GD2, la distribution tissulaire chez l'homme du GD2 O-acétylé reste très peu documentée en raison de l'absence de méthodes de détection plus sensibles réalisées comme les méthodes immunologiques reposant sur l'utilisation d'anticorps 20 monoclonaux spécifique de la forme acétylée du GD2. Il était donc présagé que l'utilisation clinique de ce nouvel anticorps présenterait probablement le même problème de neurotoxicité que l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-GD2. De plus aucune activité cytotoxique de l'anticorps 8B6 n'a été mise en évidence et les anticorps IgG3 ne sont pas de manipulation aisée du fait de leur tendance à 25 s'agglutiner Objectifs de l'invention Les anticorps monoclonaux spécifiques du ganglioside GD2-O-acétylé qui ne reconnaissent pas le ganglioside GD2, pourraient présenter l'avantage de ne pas 2906808 5 reconnaître les fibres nerveuses du système périphérique et donc ne pas être à l'origine d'une toxicité nerveuse. De tels anticorps pourraient donc présenter un avantage majeur dans l'immunociblage de certains type de cancers comme les cancers humains d'origine neuroectodermique qui expriment le ganglioside GD2 sous 5 sa forme O-acétylé par rapport aux anticorps monoclonaux anti-GD2. De tels anticorps pourront être obtenus par une variété de techniques connues de l'homme de l'art. Une partie de ces techniques commencent par l'immunisation d'animaux, notamment de rongeurs et parmi eux les souris, rats ou hamsters, les lagomorphes et notamment les lapins, les camélidés, et parmi eux les lamas. 10 L'immunogène, préparation contenant l'antigène contre lequel on veut obtenir des anticorps, peut être soit le glycolipide lui-même, purifié ou contenu dans un mélange brut ou partiellement purifié, soit le glycolipide ou une de ses parties, notamment la partie glycosylée hydrophile, éventuellement couplé de façon covalente ou non à des protéines ou des lipides servant de "carrier" pour stimuler la réponse immunitaire. 15 Dans un autre procédé d'immunisation, l'immunogène peut être préparé à partir de cellules exprimant l'antigène, obtenues par culture cellulaire de lignées de cellules tumorales ou de cellules primaires obtenues à partir de prélèvements tumoraux. Parmi les lignées utiles on peut citer notamment des lignées de cellules animales, comme le thymome murin EL-4, ou humaines, comme le neuroblastome humain IMR32, le 20 glioblastome humain U87MG, le carcinome pulmonaire à petite cellule HCI-H82 et le mélanome humain M21. - Ces cellules peuvent alors être administrées entières, vivantes ou fixées, ou être fractionnées pour n'injecter par exemple qu'une fraction partiellement purifiée contenant les composants de la membrane cellulaire ou du cytoplasme. 25 Ces immunogènes pourront être administrés aux animaux par diverses voies, notamment sous-cutanée, intra-péritonéale ou intra-musculaire, seul ou en présence d'un adjuvant, notamment alum ou adjuvant de Freund. Les immunisations peuvent être répétées avec une fréquence pouvant aller de quelques jours à quelques mois. 2906808 6 Trois méthodes générales pourront conduire à l'obtention des anticorps utilisables dans des applications industrielles. La première consiste à prélever le sang des animaux immunisés et à extraire de celui-ci, par des procédés connus de l'homme de 5 l'art, des fractions contenant l'anticorps plus ou moins purifié (sérum ou plasma, immunoglobulines totales). Les anticorps peuvent être encore purifiés par des techniques chromatographiques ou d'immunoadsorption. La deuxième méthode consiste à prélever des cellules capables de synthétiser les anticorps, et notamment des cellules spléniques ou de ganglions lymphatiques, et de les immortaliser, 10 notamment par transformation virale ou par hybridation somatique selon des procédés connus de l'homme de l'art. Parmi les cellules immortalisées, le clonage permet de sélectionner des cellules produisant les anticorps d'intérêt et la culture cellulaire permettra d'isoler à partir des surnageants de culture ces anticorps et de les purifier en grandes quantités. Enfin la troisième méthode consiste à isoler le RNA de cellules 15 capables de synthétiser des anticorps, notamment des cellules spléniques, de ganglions lymphatiques ou des lymphocytes périphériques prélevées à des animaux, immunisés ou non, voire d'êtres humains et de constituer des banques de cDNA à partir desquelles les séquences d'anticorps d'intérêt seront sélectionnées par criblage selon des méthodes connues de l'homme de l'art et notament par expression de cette 20 banque à la surface d'un bactériophage appelé encore système d'expression du phage display. La construction de banques combinatoires de régions VH et VL humaines, exprimées à la surface de phages filamenteux ("phage display"), sous forme de fragments simple chaîne ("single chain Fv", scFv), liant une région VH et une région VL ou de fragments F(ab), constitués de la chaîne légère associée au segment 25 peptidique VH-CH1, ce dernier correspondant au premier domaine de la région constante. 2906808 7 Les anticorps de la présente invention pourront être sélectionnés à partir des anticorps obtenus par l'une ou l'autre des méthodes décrites ci-dessus en ce qu'ils reconnaissent l'antigène GD2-O-acétylé et pas l'antigène GD2 non O-acétylé, propriété que l'on nommera spécificité requise. Cette sélection pourra être réalisée au 5 cours du procédé d'isolement des anticorps, par exemple en ne propageant que les cellules produisant des anticorps possédant la spécificité requise. Alternativement, on pourra rechercher parmi des anticorps déjà isolés, ceux qui possèdent cette spécificité. À cette fin, une variété de méthodes peuvent être utilisées, notamment l'immunofluorescence indirecte sur cellules pour distinguer ceux des anticorps qui 10 reconnaissent les cellules connues pour exprimer le GD2 O-acétylé, notamment IMR32, de ceux qui reconnaissent également des cellules exprimant le GD2 mais pas le GD2 O-acétylé, notamment Neuro 2A. On pourra également utiliser un test immuno-enzymatique ELISA sur des cellules dessiquées pour sélectionner les anticorps qui se fixent uniquement sur les cellules exprimant le GD2 O-acétylé et pas 15 sur celles qui n'expriment que le GD2. On pourra aussi sélectionner les anticorps présentant la spécificité requise en utilisant la chromatographie couche mince sur silice pour séparer les composants glycolipidiques de cellules exprimant à la fois GD2 O-acétylé et GD2, notamment IMR32, en ne retenant que les anticorps qui marquent seulement la bande correspondant au GD2-O-acétylé. On pourra confirmer 20 ce résultat en détruisant par traitement alcalin le GD2 O-acétylé dans l'extrait lipidique et en vérifiant que le marquage est bien aboli. Des exemples de mise en oeuvre de ces techniques pour la confirmation de la spécificité des anticorps de la présente invention sont donnés dans la description détaillée de l'invention, ci-dessous. D'autres méthodes, visant au même résultat, pourront être mises au point par l'homme 25 de l'art. Les anticorps de la présente invention pourront être modifiés par une variété de techniques connues de l'homme de l'art pour les adapter à différentes applications. On pourra ainsi utiliser les méthodes connues de l'art antérieur pour produire des 2906808 8 anticorps simple chaîne scFv ainsi qu'une variété de protéines de fusion conservant la capacité de lier l'antigène. On sait en particulier que l'on peut modifier entièrement les régions dites constantes des anticorps, par exemple pour échanger des régions constantes murines contre des régions constantes d'anticorps humains, sans perdre la 5 reconnaissance de l'antigène. La construction d'un anticorps chimérique consiste à isoler l'ADN codant pour la région VH et la région VL d'un anticorps monoclonal de souris et à le lier à l'ADN codant les régions constantes H et L d'une immunoglobuline humaine. Une telle construction génétique permet de produire un anticorps hybride dont la partie constante, humaine, n'est pas ou très peu immunogène 10 chez l'Homme (il s'agit en général de la région constante des IgGI humaines et de la région Ckappa humaine). On sait même conserver seulement les régions indispensables à la reconnaissance de l'antigène, régions dites hypervariables, régions déterminant la complémentarité ou encore CDR, et remplacer toutes les autres pour opérer ce que l'on appelle une "humanisation" de l'anticorps. L'ensemble des ces 15 protéines pourra être désigné par le terme anticorps modifiés artificiellement pour faciliter la description. Certaines de ces protéines ont un intérêt particulier pour les anticorps de la présente invention. Par exemple, les anticorps modifiés artificiellement anti-GD2 O-acétylés qui conservent la reconnaissance du ganglioside GD2 O-acétylés sans 20 reconnaître le ganglioside GD2 pourraient présenter un avantage majeur par rapport aux anticorps monoclonaux anti-GD2 O-acétyles de souris en ce qu'ils auraient des caractéristiques physiques et effectrices supérieures. Les anticorps modifiés artificiellement spécifiques du GD2 O-acétylé devront avoir une affinité suffisante pour l'antigène correspondant de façon à éliminer au 25 maximun la diffusion de cet anticorps, le cas échéant porteur d'une substance toxique ou thérapeutique dans les tissus ou des cellules sains. Dans le cadre de la présente invention, l'affinité pour le ganglioside GD2 devra être supérieure à 10' mole/litre. L'affinité de ces anticorps pourra être augmentée par des techniques connues de 2906808 9 l'homme de l'art. Ainsi, l'expression de fragments d'anticorps à la surface de bactériophages constitue un outil précieux pour la recherche de mutants de haute affinité à partir d'un scFv donné. Il est ainsi possible de mimer la maturation d'affinité observée lors du développement de la réponse immunitaire. Les techniques 5 de mutations aléatoires ou de mutations ciblées, suivies d'une sélection par des cycles répétés d'immuno-adsorption/élution ont été ainsi employées avec succès et ont permis d'obtenir des fragments d'anticorps ayant une affinité près de 10 fois supérieure à celle du fragment initial Un objet particulier de la présente invention, qui ne doit pas limiter celle-ci à 10 cet exemple, concerne les anticorps modifiés artificiellement préparés à partir de l'anticorps 8B6 dont on sait qu'il présente la spécificité requise, ainsi que les protéines recombinantes utilisant les séquences des régions déterminant la complémentarité définies SEQ ID NO: 3 à 8. C'est également un objet de l'invention de proposer des modifications des 15 anticorps présentant la spécificité requise afin de leur conférer des propriétés utiles pour le diagnostic ou la thérapeutique de certains cancers. Certaines de ces applications nécessitent l'injection des anticorps ou de leurs dérivés à des malades atteints de certaines pathologies cancéreuses. Dans ce cas, les dérivés dont la séquence se rapproche plus d'une séquence d'anticorps humain seront préférés car ils 20 sont susceptibles de limiter la production par le patient traité d'anticorps contre la molécule injectée, augmentant en cela la tolérance et permettant une administration répétée. De tels dérivés sont par ailleurs susceptibles de favoriser la réponse anticorps contre des déterminants spécifiques particulier à l'anticorps injecté, dits anticorps anti-idiotypes, qui ont été présentés comme possédant un intérêt thérapeutique. 25 Pour des applications thérapeutiques, les modifications préférées seront celles qui permettent d'obtenir une activité cytotoxique contre les cellules tumorales exprimant l'antigène cible, ici le GD2O-acétylé. 2906808 10 On sait que seules certaines classes d'immunoglobulines possèdent la propriété d'activer le complément ou d'induire une cytotoxicité à médiation cellulaire. À titre d'exemple, l'anticorps 8B6 reconnnaît le GD2O-acétylé mais n'est pas capable d'induire cette cytotoxicité efficacement. C'est donc un autre objet de cette invention 5 de proposer des anticorps reconnaissant le GD2 O-acétylé et possédant une activité cytotoxique. Ceci peut être obtenu notamment en remplaçant les régions constantes de l'anticorps par des régions constantes d'anticorps capables d'éliciter cette cytotoxicité et notamment des régions constantes d'immunoglobulines humaines de classe 1. Le pouvoir cytotoxique pourra alors être encore augmenté, notamment en 10 produisant des anticorps glycosylés de façon particulière, et notamment peu fucosylés, par exemple en les faisant produire par des cellules spécialement sélectionnées ou transformées. Des mutations spécifiques, décrites dans la littérature pourront être également introduites dans la séquence de l'anticorps pour le même effet. 15 Une autre manière de réaliser des anticorps thérapeutiques selon la présente invention est d'associer à un dérivé d'anticorps présentant la spécificité requise un agent cytotoxique. Ledit agent cytotoxique pourra être un agent toxique chimique, des ARN antisens, et notamment un médicament antitumoral cytotoxique, parmi lesquels on peut citer les taxanes, les alcaloïdes de la pervenche et leurs dérivés, les 20 anthracyclines, les agents alkylants, un agent toxique biologique, et notamment les toxines végétales ou bactériennes, parmi les quels on peut citer la ricine ou la toxine de pseudomonas, ou bien encore un isotope radioactif émettant des particules bêta, comme l'iode 131, l'yttrium 90, le lutétium 177, le rhénium 186 ou le cuivre 67, ou des électrons Auger, comme l'indium 111, ou encore des particules alpha, comme le 25 bismuth 213, le bismuth 212 ou l'astate 211, ces exemples ne devant en aucun cas limiter la portée de l'invention. L'anticorps peut être également produit par des méthodes d'ingénierie moléculaire, connues de l'homme de l'art, sous la forme d'une protéine de fusion associée à une cytokine. Les cytokines utilisées sont 2906808 11 essentiellement de la famille des interleukines comme l'interleukine-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 et IL-18, des facteurs de croissance hématopéitique tel que le GM-CSF (granulocyte macrophage Colony Stimulating Factor) ou le G-CSF (granulocyte Colony Stimulating Factor), le Tumor 5 Necrosis Factor (TNF), des chemokines. La protéine de fusion anticorps-cytokine obtenue possède les propriétés biologiques de la cytokine et la spécificité de l'anticorps dont elle dérrive. Les anticorps de la présente invention pourront également être appliqués avantageusement au diagnostic, que celui-ci soit pratiqué in vitro pour la détection de 10 la présence de l'antigène GD2 O-acétylé dans des prélèvements de cellules ou de fluides biologiques suivant l'une quelconque des techniques connues de l'homme de l'art, ou bien encore pratiqué in vivo par administration d'un dérivé de l'anticorps modifié pour le rendre détectable par une des techniques d'imagerie médicale connues, à savoir scintigraphie ou tomographie d'émission de positons. Dans ce cas, 15 le dérivé de l'anticorps sera associé à un isotope radioactif émetteur de photon gammas, comme l'iode 131, l'iode 123, l'indium 111, ou le technétium 99m pour l'imagerie scintigraphique ou la tomographie de simples photons, ou à un isotope émetteur de positons, comme le fluor 18, l'iode 124, l'yttrium 86, le cuivre 64, le scandium 44, pour la tomographie d'émission de positons, ces exemples ne devant 20 encore une fois pas limiter le champ de l'invention. Les anticorps de la présente invention pourront être associés à des composés toxiques ou radioactifs. Les produits toxiques sont couplés chimiquement, de façon covalente, aux anticorps par une variété de liaisons chimiques, parmi lesquelles on peut citer les liaisons esters, amides, disulfures ou thiooéthers. Les atomes radioactifs 25 sont couplés soit directement par substitution électrophile (cas des isotopes de l'iode) ou nucléophile (cas du fluor 18) ou par l'intermédiaire d'un synthon radiomarqué réactif, et notamment le réactif de Bolton et Hunter pour les isotopes de l'iode ou les esters activés stannylés pour les isotopes de l'iode ou l'astate 211, ou bien encore à 2906808 12 l'aide d'un agent chélatant quand il s'agit d'un métal radioactif. Dans ce dernier cas, l'homme de l'art sait choisir parmi les chélatants celui qui donnera avec le métal un complexe de bonne stabilité dans les fluides biolgiques. Ainsi le DTPA pourra être utilisé avantageusement avec l'indium 111, mais le DOTA sera préférable pour un 5 marquage avec l'yttrium 90. Les anticorps de la présente invention pourront être utilisés dans des méthodes connues de l'homme de l'art dans lesquelles l'agent toxique ou détectable n'est pas lié directement à l'anticorps, mais au contraire lié à une molécule de faible moléculaire administrée dans une deuxième étape, après qu'un dérivé de l'anticorps capable de 10 reconnaître in vivo cette petite molécule a été administré au patient. Dan ce cas le dérivé de l'anticorps est notamment un anticorps bispécifique ou un immunoconjugué ou une protéine de fusion entre un dérivé de l'anticorps et une avidine. Cette approche pourra être utilisée avantageusement avec les anticorps de la présente invention pour le diagnostic in vivo et le traitement des tumeurs. 15 L'anticorps de la présente invention et les dérivés , anticorps dérivés ou produits dérivés pourront donc être avantageusement utiliséspour le diagnostic ou la thérapeutique de ces tumeurs. Parmi celles-ci on trouve les tumeurs d'origine neuroectodermique et notamment les mélanomes, les cancers du poumon à petites cellules, les gliomes et les neuroblastomes. Les produits de la présente invention 20 pourront être appliqués avantageusement à la détection et au traitement de ces tumeurs, notamment lorsque celles-ci sont disséminées ou échappent aux traitements existants. Résumé de l'invention La présente invention décrit l'utilité d'anticorps dans l'immunociblage des 25 cancers humains d'origine neuroectodermique tels que les mélanomes, les glioblastomes, les carcinomes pulmonaires à petite cellule et les neuroblastomes. Dans l'ensemble des différents aspects de l'invention décrit ci-dessus, il est particulièrement surprenant de constater qu'un anticorps monoclonal spécifique du 2906808 13 GD2 O-acétylé ne se fixe pas sur les fibres nerveuses exprimant le GD2 alors qu'il reconnaissait les cellules tumorales exprimant le ganglioside GD2 et par conséquent sa forme O-acétylée. De tels anticorps possèdent donc une spécificité restreinte aux cellules tumorales d'origine neuroectodermique, et ne reconnaissant pas les fibres 5 nerveuses du système périphérique. Les anticorps de la présente invention ont une activité cytotoxique pour les cellules tumorales qu'ils reconnaissent, soit intrinsèquement (c'est une des raisons pour lesquelles on les chimérise ou humanise), soit parce qu'ils servent de vecteurs pour des agents toxiques, radioactifs notamment. 10 La présente invention couvre donc tout anticorps monoclonal modifié artificiellement ne reconnaissant que la forme O-acétylée du ganglioside GD2, ou fragment de cet anticorps, ledit anticorps ou ledit fragment reconnaissant les molécules de GD2 O-acétylé exprimées par des cellules tumorales et ne reconnaissant pas les molécules de GD2 exprimées à la surface des nerfs périphériques. 15 On precise que l'on entend dans le cadre de la présente invention par les termes "anticorps modifié artificiellement", les anticorps dont certains amino-acides ont été remplacés par d'autres en utilisant les technique de génétique moléculaire connues de l'homme de l'art, notamment pour modifier les propriétés de l'anticorps original, en particular pour diminiuer son immunogénicité, ou pour augmenter son 20 activité toxique ou encore pour accélérer ou ralentir son elimination après injection. Avantageusement l'anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est une IgG kappa d'affinité supérieure à 10"' mole/litre pour le GD2-O-acétylé et d'affinité au moins dix fois 25 plus faible pour le GD2 lui-même, ledit anticorps ou ledit fragment étant mono ou bispécifique. Notamment, mais non exclusivement, l'invention couvre tout anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci où les régions 2906808 14 déterminant lacomplémentarité de la région variable de la chaîne H ont comme séquences d'aminoacides celles représentées dans SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 et SEQ ID NO:5 et les régions déterminant la complémentarité de la région variable de la chaîne L ont comme séquences d'aminoacides celles représentées dans SEQ ID 5 NO:6, SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8. Notamment, mais non exclusivement, l'invention couvre tout anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci, dont la chaîne lourde est obtenue par la jonction entre l'ADNc codant la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps non humain et l'ADNc codant la région constante d'une 10 immunoglobuline humaine et dont la chaîne légère est obtenue par la jonction entre l'ADNc codant la région variable de la chaîne légère du même anticorps non humain et l'ADNc codant la région constante de la chaîne légère d'une Immunoglobuline humaine caractérisé en ce que ledit anticorps non humain est l'anticorps monoclonal de souris 8B6 et ledit anticorps modifié artificiellement est dirigé contre le 15 ganglioside GD2 O-acétylé et ne reconnaît pas les fibres nerveuses du système périphérique. Notamment, mais non exclusivement, l'invention couvre tout anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci dont la région variable de la chaîne lourde possède la séquence déduite en acides aminés définie par SEQ ID 20 NO :1 et dont la région variable de la chaîne légère possède la séquence déduite en acides aminés définie par SEQ ID NO :2. Préférentiellement, l'anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon la revendication 5, est l'anticorps KM8B6 pouvant être obtenu à l'aide de la lignée cellulaire CHO ou un fragment de celui-ci. 25 L'invention couvre également toute molécule pharmaceutique dérivée de l'anticorps modifié artificiellement ou d'un fragment de celui-ci selon l'invention dans laquelle l'anticorps ou le fragment de celui-ci est couplé avec une molécule X, 2906808 15 où X est une molécule toxique, un médicament, une pro-drogue, ou un deuxième anticorps quelle que soit sa spécificité. Selon une variante, ladite molécule toxique est une molécule toxique chimique, biologique ou radioactive, ladite molécule étant destinée à détruire des 5 cellules tumorales exprimant le ganglioside GD2-O-acétylé. Préférentiellement lesdites cellules tumorales visées par les molécules pharmaceutiques selon l'invention sont des cellules de neuroblastome, de mélanome, de glioblastome ou de cancer pulmonaire à petites cellules. Préférentiellement les molécules pharmaceutiques selon l'invention sont 10 mutées au niveau de leur région Fc par l'adjonction de sucres, modulant ainsi l'activation des cellules immunitaires et des molécules du système du complément. L'invention couvre également toute molécule pour le diagnostic des cancers montrant une expression du ganglioside GD2 O-acétylé à la surface des cellules tumorales, ladite molécule étant dérivée de l'anticorps modifié artificiellement ou 15 d'un fragment de celui-ci selon l'invention, dans laquelle ledit anticorps ou ledit fragment est lié à un agent permettant la détection de l'anticorps ou dudit fragment par la fluorescence ou la radioactivité. L'invention concerne donc toute utilisation d'un anticorps modifié artificiellement ou d'un fragment de celui-ci selon l'invention et/ou d'une molécule 20 selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament pour la thérapie d'un cancer dont les cellules expriment la forme O-acétylée du ganglioside GD2 ou pour la fabrication d'un produit pour le diagnostic d'un tel cancer. La présente invention couvre également toute utilisation de l'anticorps monoclonal 8B6 (décrit dans l'article Variable Region Gene Segments of Nine 25 Monoclonal Antivodies Sepcific to Disialoganglisosides (GD2,GD3) and their OActylated Derivatives , Cerato et al., Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997,307-316) pour la fabrication d'une molécule pharmaceutique dans laquelle ledit anticorps 2906808 16 est lié à un agent toxique chimique, biologique ou radioactif, ladite molécule étant destinée à détruire des cellules tumorales exprimant le ganglioside GD2-O-acétylé. Notamment, mais non exclusivement, l'invention couvre une telle utilisation lorsque lesdites cellules sont des cellules de neuroblastome, de mélanome, de 5 glioblastome ou de cancer pulmonaire à petites cellules. Notamment, mais non exclusivement, l'invention couvre une telle utilisation lorsque ladite molécule thérapeutique est mutée au niveau de sa région Fc par l'adjonction de sucres, modulant ainsi l'activation des cellules immunitaires et des molécules du système du complément. 10 L'invention couvre également toute utilisation de l'anticorps monoclonal 8B6 pour la fabrication d'une molécule pour le diagnostic des cancers montrant une expression du ganglioside GD2-O-acétylé à la surface des cellules tumorales, ladite molécule étant dérivée dudit anticorps, dans laquelle ledit anticorps est lié à un agent permettant la détection de l'anticorps par la fluorescence ou la radioactivité. 15 L'invention couvre aussi toute séquence d'ADN codant pour l'anticorps modifié artificiellement selon l'invention ainsi que tout vecteur d'expression comprenant une telle séquence d'ADN liée de façon opérationnelle à un promoteur. L'invention couvre aussi toute cellule, notamment animale, comprenant un tel vecteur d'expression, ainsi que tout transformant non humain qui produit l'anticorps 20 modifié artificiellement selon l'invention. Enfin, l'invention couvre tout procédé pour la production d'anticorps modifié artificiellement pour le ganglioside GD2-O-acétylé, ce procédé comprenant l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule ou un transformant non humain dans des conditions appropriées et la récupération de l'anticorps. 25 Préférentiellement, la cellule ou le transformant est cultivé dans des conditions dans lesquelles l'anticorps s'accumule. 2906808 17 Brève description des figures Fig. 1 décrit la construction du plasmide, pcDNA3 60C3 L-VL. Fig. 2 décrit la construction du plasmide, pcDNA3 60C3 L. Fig. 3 décrit la construction du plasmide, pcDNA3 KM8B6L. 5 Fig.4 décrit la séquence nucléotidique et la séquence déduite en acides aminés de la chaîne légère de l'anticorps modifié artificiellement KM8B6. Fig. 5 décrit la construction du plasmide, pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH. Fig. 6 décrit la construction du plasmide, pBluescript II SK (+) KM60C3-H. Fig. 7 décrit la construction du plasmide, pBluescript II SK (+) KM8B6-H. 10 Fig. 8 décrit la construction du plasmide, pcDNA3.1/Hygro (+) KM8B6-H. Fig. 9 décrit la séquence nucléotidique et la séquence déduite en acides aminés de la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement KM8B6. Fig. 10 décrit l'analyse SDS-PAGE de l'anticorps modifié artificiellement anti-GD2-O-acétylé purifié, KM8B6. L'analyse a été réalisée dans des conditions réductrices 15 (gauche) et non réductrices (droite). De gauche à droite, marqueur de poids moléculaire, KM8B6, IgG3 8B6 (conditions réductrices), marqueur de haut poids moléculaire, KM8B6, and IgG3 8B6 (conditions non réductrices). Fig. 11 est un graphique qui décrit la réactivité de l'anticorps 8B6 et de l'anticorps KM8B6 sur des cellules IMR 32 and NeuroA, possédant ou non les antigens GD2-O- 20 acétylés respectivement, mesurée par immunofluorescence, avec en ordonnées le nombre de cellules détectées et en abscisse l'intensité de fluorescence. Le trace bleu correspondant à la réactivité du control et le trace rouge correspondant à la réactivité des produits. Fig. 12 est un graphique qui décrit la réactivité des anticorps 8B6 et KM8B6 25 analysée pae test ELISA sur des cellules IMR 32 et NeuroA. Fig. 13 montre le profil d'immunocoloration obtenu avec l'anticorps KM8B6 de gangliosides de cerveau de rat séparés par chromatographie sur couche mince de 2906808 18 silice. Lane A coloration au résorcinaol des migrations des différents gangliosides de cerveau de rat. Fig. 14 montre les résultats de l'analyse immuno-histochimique de cellules de neuroblatome et de fibres nerveuses humains. 5 Fig. 15 montre les résultats de l'étude de toxicité (ADCC) Pourcentage d'activité ADCC de l'anticoprs modifié artificiellement KM8B6 et de l'AcM de souris 8B6 dont il dérive. * Anticorps Rituxan anti-CD20 utilisé comme contrôle négatif. 10 Description détaillée de l'invention Production d'anticorps modifié artificiellement KM8B6 1. Préparation de l'ADNc codant la région variable L-VL de l'anticorps 15 monoclonal de souris 60C3 (a). Extraction de l'ARN total de l'hybridome 60C3, producteur de l'anticorps monoclonal 60C3. L'ARN total est extrait à partir de 106 cellules d'hybridome 60C3 en phase 20 exponentielle de croissance grâce au réactif RNAble (Eurobio, Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. La concentration en ARN total est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. (b). Obtention de la séquence nucléotidique de l'ADNc 60C3 L-VL 25 L'amplification génique de l'ADNc codant la région variable 60C3 L-VL a été obtenue à partir des ARN messagers par RACE-PCR de façon à obtenir la séquence nucléotidique codant le peptide signal (L) associé à sa région variable (VL). Cette amplification a été réalisée en utilisant le coffret SMARTTM RACE cDNA 2906808 19 Amplification obtenu auprès de la société BD Biosciences (San Jose, CA, USA) selon les recommandations du fournisseur. La quantité d'ARN total utilisé pour la rétrotranscription est de 1 g. Le produit de la réaction a été dilué dans 100 L de solution tampon tricine EDTA fourni par le fournisseur. Un volume de 2,51LIL du 5 produit dilué a été utilisé pour l'amplification génique. L'amorce antisens spécifique de l'ADNc 60C3 VL utilisée est la suivante : 3'- 60C3 VL5'- TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC AGC -3'. L'amplification a été réalisée par incubation du mélange réactionnel dans un thermocycleur Perkin-Elmer (PE) DNA thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Wellesley, MA, USA) dans les conditions suivantes : 5 cycles (94 C 10 pendant 5 secondes, 72 C pendant 3 minutes), suivi de 5 cycles (94 C pendant 5 secondes puis 70 C pendant 10 secondes suivi de 3 minutes à 72 C) et de 25 cycles (94 C pendant 5 secondes suivi de 69 C pendant 10 secondes et 3 minutes à 72 C). Le produit de réaction de RACE-PCR est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (Q. Biogene, Morgan Irvine, CA, USA) dans une solution tampon de 15 migration de Tris EDTA pH 8 (40 mM Tris-base (Sigma Chemicals Co), 25 mM EDTA (Inerchim, Montluçon, France) , 20 mM acide acétique (Carlo Erba Reagenti SpA, Rodano, MI, Italie). Les produits de poids moléculaire attendu sont ensuite purifiés à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La détermination de la séquence en acide nucléique 20 des produits obtenus purifiés a été réalisée par la société GENOME express (Meylan, France) afin de vérifier la séquence de l'ADNc codant la région 60C3 L-VL. La séquence correspondant au peptide signal associé à la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 60C3 a été ainsi déterminée et des amorces dessinées pour permettre le clonage de l'ADNc 60C3 L-VL dans le vecteur d'expression. 25 (c). Amplification de l'ADNc 60C3 L-VL L'amplification de l'ADNc 60C3 L-VL a été obtenue par réaction de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN total de cellules d'hybridome 60C3. Le mélange 2906808 20 réactionnel est le suivant : Oligo d(T)18 0,51ug (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, USA), ARN 1 g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 12 L. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 5 41IL de solution tampon 5X First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies d'ADNc 60C3 L-VL sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de 10 PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse sont les suivantes : 5'- BamHl 60C3 L-VL : 5'- ag gga tcc aaa gac aaa atg gat -3' (amorce sens) et 3'- Xhol 60C3 L-VL : 5'- tt cag ctc gag ctt ggt ccc agc acc -3' (amorce anti-sens) Les amorces de synthèse utilisées permettent l'introduction de mutations silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau 15 de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction BamHI et XhoI nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 104L, ADNc (matrice) 1 L, MgCl2 (Invitrogen Life 20 Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- XhoI 60C3 L-VL et amorce 5'- BamHI 60C3 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. 25 Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel d'agarose à 1%, le cDNA 60C3 L-VL est purifié à l'aide du coffret QlAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 2906808 21 2. Construction d'un plasmide recombinant possédant l'ADNc 60C3 L-VL : pcDNA3 60C3 L-VL (a). Digestion du vecteur pcDNA3 et de l'ADNc 60C3 L-VL et 5 déphosphorylation du vecteur digéré La digestion par les enzymes de restriction permet d'obtenir un vecteur linéaire présentant des extrémités cohésives nécessaires pour l'insertion de l'ADNc d'intérêt. La digestion se fait dans les conditions suivantes : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), vecteur pcDNA3 ou cDNA 60C3 L-VL (1 g), enzyme 10 de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Xhol (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur et l'insert digérés sont purifiés grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Le vecteur est ensuite 15 déphosphorylé par la CIP (New Englan Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 C. La composition du mélange réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). Cette réaction permet d'augmenter le rendement de la ligature en diminuant le pourcentage d'autoligation du vecteur. En effet, le fait de supprimer les groupements phosphate aux extrémités 5' et 3' des bords libérés par la 20 digestion empêche la fermeture spontanée du vecteur. (b). Réaction de ligation La ligation permet d'insérer 1'ADNc 60C3 L-VL digéré dans le vecteur pcDNA3 digéré et déphosphorylé grâce à la T4 ligase (New England Biolabs Inc.). 25 La réaction est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur digéré déphosphorylé 200 ng, T4 ligase (400U) (New England Biolabs 2906808 22 Inc.), ADNc purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. (c). Transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 blue (Stratagene) 5 2011L de produit de la réaction de ligature est ajouté à 100 L de suspension de bactéries compétentes. L'ensemble est incubé à 4 C pendant 30 minutes. Les bactéries sont alors soumises à un choc thermique de 2 minutes à 42 C, suivies de 2 minutes à 4 C. Un volume de 1 mL de milieu LB est alors ajouté et les bactéries sont incubées 1 heure à 37 C sous agitation (250 rpm). Les bactéries sont récupérées par 10 centrifugation pendant 5 minutes à 4000 g à 4 C. Le culot bactérien est repris dans 10011L de milieu LB avant d'être étalé sur une boîte de Pétri contenant le milieu 2XTY agar contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,51,Lg/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co). Les colonies résistantes apparaissent après une nuit d'incubation à 37 C. 15 (d). Vérification de la présence de l'insert 60C3 L-VL dans le vecteur pcDNA3 par réaction de PCR Des colonies isolées sont déposées stérilement sous hotte respectivement dans un tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP (Promega) 500 M, Taq 20 polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 10 L, ADNc (matrice) 11L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- Xhol 60C3 L-VL et amorce 5'- BamHI 60C3 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 25 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique sur gel d'agarose 1%. Les clones qui ont été 2906808 23 correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille attendue. (e). Production du plasmide d'intérêt pcDNA3 60C3 L-VL 5 On utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,5 g/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QIAprep spin miniprep 10 (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 3. Préparation de l'ADNc codant la région constante hu-C kappa d'un anticorps monoclonal humain P3Non2 15 (a). Extraction de l'ARN total de l'hybridome P3Non2, producteur de l'anticorps monoclonal P3Non2. L'ARN total est extrait à partir de 106 cellules d'hybridome P3Non2 en phase exponentielle de croissance grâce au réactif RNAble (Eurobio, Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. La concentration en ARN total est 20 déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. (b). Amplification de l'ADNc hu-C kappa L'amplification de l'ADNc hu-C kappa a été obtenue par réaction de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN total de cellules d'hybridome P3Non2. Le mélange 25 réactionnel est le suivant : Oligo d(T)18 0,5 g (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, USA), ARN 1 g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 12 L. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 2906808 24 4 L de solution tampon 5X First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies 5 d'ADNc 60C3 L-VL sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse sont les suivantes : 5'- Xhol hu-C kappa: 5'-ag ctc gag ctg aaa cga act gtg gct gca c -3' (amorce sens) et 3'-Xbal hu-C kappa : 5'- ctt cta gat tta aca ctc tcc cct gtt ga -3' (amorce anti-sens). Les amorces de synthèse utilisées permettent l'introduction de mutations 10 silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction Xbal et XhoI nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR 15 (Invitrogen Life Technologies) 10 L, ADNc (matrice) 1 L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'Xbal hu-C kappa et amorce 5'- XhoI hu-C kappa 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 20 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel d'agarose à 1%, le cDNA hu-C kappa est purifié à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 25 4. Construction du vecteur d'expression de la chaîne légère de l'anticorps modifié artificiellement KM 60C3 : pcDNA3 KM6OC3-L 2906808 25 (a). Digestion du vecteur pcDNA3 60C3 L-VL et de l'ADNc hu-C kappa et déphosphorylation du vecteur digéré La digestion se fait dans les conditions suivantes : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), vecteur pcDNA3 60C3 L-VL ou ADNc hu-C kappa (1 g), 5 enzyme de restriction Xhol (10U), enzyme de restriction Xbal (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur et l'insert digérés sont purifiés grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Le vecteur est ensuite 10 déphosphorylé par la CIP (New Englan Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 c. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). (b). Réaction de ligation 15 La ligation permet d'insérer l'ADNc ADNc hu-C kappa digéré dans le vecteur pcDNA3 60C3 L-VL digéré et déphosphorylé grâce à la T4 ligase (New England Biolabs Inc.). La réaction est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur digéré déphosphorylé 200 ng, T4 ligase (400U) (New England 20 Biolabs Inc.), ADNc purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. Le produit de réaction de ligature est utilisé pour la transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 blue (Stratagene). (c). Vérification de la présence de l'insert hu-Ckappa dans le vecteur 25 pcDNA3 60C3 L-VL par réaction de PCR Les colonies résistantes isolées sont déposées stérilement sous hotte dans un tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP (Promega) 500 t1\4, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR (Invitrogen 2906808 26 Life Technologies) 10 L, ADNc (matrice) 1 L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'-Xbal hu-C kappa et amorce 5'- Xhol hu-C kappa 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes 5 à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique sur gel d'agarose 1%. Les clones qui ont été correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille attendue. 10 (d). Production du plasmide d'intérêt pcDNA3 KM60C3L On utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,51,tg/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une 15 minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QIAprep spin miniprep (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 5. Construction du vecteur d'expression de la chaîne légère de l'anticorps modifié artificiellement KM 8B6 : pcDNA3 8B6-L 20 (a). Obtention du vecteur pcDNA3 hu-C kappa Le vecteur pcDNA3 hu-C kappa a été préparé à partir du vecteur pcDNA3 KM60C3-L par digestion utilisant les enzymes de restriction BamHI et Xhol. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 25 100X (0,5 L), vecteur (1 g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction XhoI (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur digéré est purifié grâce au coffret QIAquick 2906808 27 Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Le vecteur est ensuite déphosphorylé par la CIP (New England Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 C. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). 5 (b). Extraction de l'ARN total de l'hybridome 8B6, producteur de l'anticorps monoclonal 8B6. L'ARN total est extrait à partir de 106 cellules d'hybridome 8B6 en phase exponentielle de croissance grâce au réactif RNAb1e (Eurobio, Courtaboeuf, France) 10 selon les recommandations du fournisseur. La concentration en ARN total est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. (c). Obtention de la séquence nucléotidique de l'ADNc 8B6 L-VL L'amplification génique de l'ADNc codant la région variable 8B6 L-VL a été 15 obtenue à partir des ARN messagers par RACE-PCR de façon à obtenir la séquence nucléotidique codant le peptide signal (L) associé à sa région variable (VL). Cette amplification a été réalisée en utilisant le coffret SMARTTM RACE cDNA Amplification obtenu auprès de la société BD Biosciences (San Jose, CA, USA) selon les recommandations du fournisseur. La quantité d'ARN total utilisé pour la 20 rétrotranscription est de 1 g. Le produit de la réaction a été dilué dans 100 L de solution tampon tricine EDTA fourni par le fournisseur. Un volume de 2,5 L du produit dilué a été utilisé pour l'amplification génique. L'amorce antisens spécifique de l'ADNc 8B6 VL utilisée est la suivante : 3'- mu C kappa 5'- gtt cat act cgt cct tgg tca acg tga ggg -3' qui s'hybride sur l'ADNc codant le domaine constant mu 25 C-kappa de la chaîne légère des anticorps de souris de type kappa. L'amplification a été réalisée par incubation du mélange réactionnel dans un thermocycleur Perkin-Elmer (PE) DNA thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Wellesley, MA, USA) dans les conditions suivantes : 5 cycles (94 C pendant 5 secondes, 72 C pendant 3 minutes), 2906808 28 suivi de 5 cycles (94 C pendant 5 secondes puis 70 C pendant 10 secondes suivi de 3 minutes à 72 C) et de 25 cycles (94 C pendant 5 secondes suivi de 69 C pendant 10 secondes et 3 minutes à 72 C). Le produit de réaction de RACE-PCR est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (Q. Biogene, Morgan Irvine, CA, USA) dans une 5 solution tampon de migration de Tris EDTA pH 8 (40 mM Tris-base (Sigma Chemicals Co), 25 mM EDTA (Inerchim, Montluçon, France) , 20 mM acide acétique (Carlo Erba Reagenti SpA, Rodano, MI, Italie). Les produits de poids moléculaire attendu sont ensuite purifiés à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La détermination de la séquence 10 en acide nucléique des produits obtenus purifiés a été réalisée par la société GENOME express (Meylan, France) afin de vérifier la séquence de l'ADNc codant la région 8B6 L-VL. La séquence correspondant au peptide signal associé à la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 8B6 a été ainsi déterminée et des amorces dessinées pour permettre le clonage de l'ADNc 8B6 L-VL dans le vecteur 15 d'expression. (d). Amplification de l'ADNc 8B6 L-VL L'amplification de l'ADNc 8B6 L-VL a été obtenue par réaction de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN total de cellules d'hybridome 60C3. Le mélange 20 réactionnel est le suivant : Oligo d(T)18 0,5 g (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, USA), ARN 11g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 121aL. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 4 L desolution tampon 5X First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 25 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies d'ADNc 8B6 L-VL sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de 2906808 29 PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse sont les suivantes : 5'- BamHI 8B6 LVL : 5'-aag gga tcc gcc acc atg aag ttg cct gtt -3' (amorce sens) et 3'- Xhol 8B6 LVL : 5'- ccg ttt tat ctc gag ctt ggt ccc -3' (amorce anti-sens) Les amorces de synthèse utilisées permettent l'introduction de mutations 5 silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction BamHI et Xhol nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR 10 (Invitrogen Life Technologies) 10 L, ADNc (matrice) 1 L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- XhoI 8B6 L-VL et amorce : 5'- BamHl 8B6 LVL 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 15 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel d'agarose à 1%, le cDNA 8B6 L-VL est purifié à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 20 (e). Digestion de lADNc 8B6 L-VL L'ADNc 8B6 L-VL est digéré utilisant les enzymes de restriction BamHI et Xhol. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), ADNc 8B6 L-VL (1 g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Xhol (10U). Les enzymes de restriction, les solutions 25 tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. L'insert digéré est purifié grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 2906808 (f). Réaction de ligation La ligation permet d'insérer l'ADNc 8B6 L-VL digéré dans le vecteur pcDNA3 hu-C kappa digéré et déphosphorylé grâce à la T4 ligase (New England 5 Biolabs Inc.). La réaction est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur pcDNA3 hu-C kappa digéré et déphosphorylé 200 ng, T4 ligase (400U) (New England Biolabs Inc.), ADNc 8B6 L-VL purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. Le produit de réaction de 10 ligature est utilisé pour la transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 blue (Stratagene). (g). Vérification de la présence de l'insert 8B6 L-VL dans le vecteur pcDNA3 hu-C kappa par réaction de PCR 15 Les colonies résistantes isolées sont déposées stérilement sous hotte dans un tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 tL, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 101,i,L, ADNc (matrice) 1 L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- Xhol 8B6 L-VL et amorce 5'- BamHI 8B6 L-VL 20 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique sur gel d'agarose 1%. Les clones qui ont été correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille 25 attendue. (h). Production du plasmide d'intérêt pcDNA3 KM8B6 L 2906808 31 On utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,51.tg/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une 5 minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QIAprep spin miniprep (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 6. Préparation de l'ADNc codant la région variable L-VH de l'anticorps monoclonal de souris 60C3 10 (a). Obtention de la séquence nucléotidique de l'ADNc 60C3 L-VH L'amplification génique de l'ADNc codant la région variable 60C3 L-VH a été obtenue à partir des ARN messagers par RACE-PCR de façon à obtenir la séquence nucléotidique codant le peptide signal (L) associé à sa région variable (VL). 15 Cette amplification a été réalisée en utilisant le coffret SMARTTM RACE cDNA Amplification obtenu auprès de la société BD Biosciences (San Jose, CA, USA) selon les recommandations du fournisseur. La quantité d'ARN total utilisé pour la rétrotranscription est de 11ätg. Le produit de la réaction a été dilué dans 10011L de solution tampon tricine EDTA fourni par le fournisseur. Un volume de 2,5 L du 20 produit dilué a été utilisé pour l'amplification génique. L'amorce antisens spécifique de l'ADNc 60C3 VH utilisée est la suivante : 3'- 60C3 L-VH 5'-tgc AGA gac agt gac cag cag agt agt ccc -3' (amorce anti-sens) qui s'hybride sur l'ADNc codant le domaine constant mu C-kappa de la chaîne légère des anticorps de souris de type kappa.. L'amplification a été réalisée par incubation du mélange réactionnel dans un 25 thermocycleur Perkin-Elmer (PE) DNA thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Wellesley, MA, USA) dans les conditions suivantes : 5 cycles (94 C pendant 5 secondes, 72 C pendant 3 minutes), suivi de 5 cycles (94 C pendant 5 secondes puis 70 C pendant 10 secondes suivi de 3 minutes à 72 C) et de 25 cycles (94 C pendant 5 secondes suivi 2906808 32 de 69 C pendant 10 secondes et 3 minutes à 72 C). Le produit de réaction de RACEPCR est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (Q. Biogene, Morgan Irvine, CA, USA) dans une solution tampon de migration de Tris EDTA pH 8 (40 mM Tris-base (Sigma Chemicals Co), 25 mM EDTA (Inerchim, Montluçon, 5 France) , 20 mM acide acétique (Carlo Erba Reagenti SpA, Rodano, MI, Italie). Les produits de poids moléculaire attendu sont ensuite purifiés à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La détermination de la séquence en acide nucléique des produits obtenus purifiés a été réalisée par la société GENOME express (Meylan, France) afin de vérifier la 10 séquence de l'ADNc codant la région 60C3 L-VH. La séquence correspondant au peptide signal associé à la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 60C3 a été ainsi déterminée et des amorces dessinées pour permettre le clonage de l'ADNc 60C3 L-VH dans le vecteur d'expression. 15 (b). Amplification de l'ADNc 60C3 L-VH L'amplification de l'ADNc 60C3 LVH a été obtenue par réaction de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN total de cellules d'hybridome 60C3. Le mélange réactionnel est le suivant : Oligo d(T)18 0,5 g (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, USA), ARN 1 g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 20 12 L. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 411L de solution tampon 5X First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 25 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies d'ADNc 60C3 LVH sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse sont les suivantes : 5'- BamHI 60C3 2906808 33 L-VH : 5'- cag gat ccg aac aca ctg act cta acc atg g - 3' (amorce sens) et 3'- Nhel 60C3 L-VH : 5'- t gct agc tgc aga gac agt gac cag agt -3' (amorce anti-sens). Les amorces de synthèse utilisées permettent l'introduction de mutations silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau 5 de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction BamHI et XhoI nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 14tL, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 101u,L, ADNc (matrice) 1 L, MgC12 (Invitrogen Life 10 Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- NheI 60C3 L-VH et amorce 5'- BamHI 60C3 L- VH 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. 15 Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel d'agarose à 1%, le cDNA 60C3 L-VH est purifié à l'aide du coffret QlAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 7. Construction du plasmide recombinant possédant l'ADNc 60C3 L-VH 20 (a). Construction du vecteur de clonage pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH Pour insérer la séquence codant la région 60C3 L-VH dans le vecteur pBluescript II SK (+), ce dernier est digéré par l'enzyme de restriction EcoRV `New England Biolabs Inc.) qui provoque une coupure à bouts francs. Le traitement du 25 plasmide ainsi linéarisé par la Taq polymerase en présence de dTTP permet de rajouter une thymidine à l'extrémité 3' du vecteur et empêche l'autoligature. La Taq DNA polymérase utilisée pour l'obtention de l'ADNc 60C3 L-VH possède une activité 5'-3' exonucléase ajoutant une adénine terminale à chaque extrémité 3' des 2906808 34 produits de PCR qui peut être directement cloné dans un tel vecteur. Le rendement de le réaction de ligature est largement amélioré du fait de la complémentarité A /T à celui de la réaction de ligature à bout franc. Le produit de réaction de ligature est utilisé pour la transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 blue (Stratagene). 5 (b). Vérification de la présence de l'insert 60C3 L-VH dans le vecteur pBluescript II SK (+) par réaction de PCR Les colonies résistantes isolées sont déposées stérilement sous hotte dans un tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP 500 M (Promega), Taq 10 polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 10 L , MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- Nhel 60C3 L-VH et amorce 5'- BamHI 60C3 L-VH 500 M.. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PIC 200 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 15 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique sur gel d'agarose 1%. Les clones qui ont été correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille attendue. 20 (c). Production du plasmide d'intérêt pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH Pour cela, on utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,5 g/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une 25 minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QIAprep spin miniprep (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 2906808 (d). Vérification de l'orientation de l'insert 60C3 L-VH dans le vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH par digestion enzymatique La présence de l'insert 60C3 L-VH en orientation sens est confirmée par une digestion enzymatique du vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH par l'enzyme 5 BamHI (New England Biolabs Inc.) selon les recommandations du fournisseur. En effet, la technique de clonage T n'impose pas d'orientation pour l'insert qui peut donc être inséré en orientation sens ou antisens. L'insert 60C3 L-VH n'est encadré par deux sites de restriction BamHI que s'il est en orientation sens. Ainsi après digestion par l'enzyme BamHI, l'analyse électrophorétique permet de distinguer et de 10 sélectionner un clone possédant l'ADNc 60C3 L-VH en orientation sens. 8. Préparation de l'ADNc codant la région constante d'un anticorps humain hu-C gamma 1 15 a. Extraction de l'ARN total de la lignée de myélome humain LP1 producteur d'une chaîne loruded'isotype gamma 1. L'ARN total est extrait à partir de 106 cellules d'hybridome LP1 en phase exponentielle de croissance grâce au réactif RNAble (Eurobio, Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. La concentration en ARN total est 20 déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. b. Amplification génique du segment ADNc hu-C gamma 1 L'amplification de l'ADNc hu-C gamma 1 a été réalisée à partir d'un extrait d'ARN total de l'hybridome LP1. Le mélange réactionnel est le suivant : Oligo 25 d(T)18 0,51ag (New England Biolabs Inc. Beverly, MA, USA), ARN 1 g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 1211L. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 4 L de solution tampon 5X 2906808 36 First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies d'ADNc ADNc hu-C 5 gamma 1 sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse sont les suivantes : 5'- Nhel hu-C gamma 1: 5'- ça gct agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc c -3' (amorce sens) et 3'- Xbal hu-C gamma 1: 5'- agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa tct aga cg -3' (amorce anti-sens). Les amorces de synthèse utilisées permettent l'introduction de mutations 10 silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction NheI et Xbal nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP (Promega) 500 M, Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 1 L, solution tampon de PCR 15 (Invitrogen Life Technologies) 10 L, ADNc (matrice) 11.1L, MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- Xbal hu-C gamma 1 et amorce 5'- NheI huC gamma 1500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 20 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel d'agarose à 1%, le cDNA hu-C gamma 1 est purifié à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 25 9. Construction d'un plasmide recombinant possédant l'ADNc 60C3 L-VH couplé à l'ADNc hu-C gamma 1 : pBluescript II SK (+) KM60C3 H 2906808 37 (a). Digestion du vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH et de l'ADNc hu-C gamma 1 et déphosphorylation du vecteur digéré La digestion se fait dans les conditions suivantes : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH ou l'ADNc hu-C 5 gamma 1 (1 g), enzyme de restriction Nhel (10U), enzyme de restriction Xbal (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur et l'insert digérés sont purifiés grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Le vecteur est 10 ensuite déphosphorylé par la CIP (New Englan Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 c. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). (b). Réaction de ligation 15 La ligation permet d'insérer l'ADNc hu-C gamma 1 digéré dans le vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH digéré et déphosphorylé grâce à la T4 ligase (New England Biolabs Inc.). La réaction de ligature est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur digéré déphosphorylé pBluescript II SK 20 (+) 60C3 L-VH 200 ng, T4 ligase (400U) (New England Biolabs Inc.), ADNc hu-C gamma 1 purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. Le produit de réaction de ligation est utilisé pour la transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 Blue (Stratagene). 25 (c). Vérification de la présence et de l'orientation de l'insert hu-C gamma 1 dans le vecteur pBluescript II SK (+) 60C3 L-VH par réaction de PCR En raison du choix des sites de restriction Nhel et Xbal, l'insert hu-C gamma 1 peut être dans l'orientation sens ou antisens. Ceci est dû à la séquence des sites de 2906808 38 restrction qui n'impose pas d'orientation pour l'insert. L'orientation sens de l'insert est confirmée par une réaction de PCR. Des colonies isolées sont déposées stérilement sous hotte respectivement dans un tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP 500 M (Promega), Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 5 1 L, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 10 L , MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce sens et amorce antisens 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Les amorces utilisées sont :5'- BamHI 60C3 10 L-VH : 5'- cag gat ccg aac aca ctg act cta acc atg g -3' (amorce sens) et 3'- Xbal hu-C gamma 1: 5'- agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taa tct aga cg -3' (amorce anti-sens). Si l'insert n'est pas dans la bonne orientation, les amorces se retrouvent sur le même brin de la séquence à amplifier et il n'y a donc pas d'amplification. La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique sur gel d'agarose 15 1%. Les clones qui ont été correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille attendue. (d). Production du plasmide d'intérêt pBluescript II SK (+) KM60C3 H On utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 20 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 1001,tg/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,5 g/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QIAprep spin miniprep (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 25 10. Construction du vecteur d'expression de la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement KM 8B6 : pcDNA3/Hygro 8B6H 2906808 39 (a). Obtention du vecteur pBluescript II SK (+) hu-C gamma 1 Le vecteur pBluescript II SK (+) hu-C gamma la été préparé à partir du vecteur pBluescript II SK (+) KM60C3 H par digestion utilisant les enzymes de restriction BamHI et XbaI. La composition du milieu réactionnel est la suivante : 5 tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), vecteur (1 g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Xbal (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur est alors purifié grâce au coffret QlAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations 10 du fournisseur. Le vecteur est ensuite déphosphorylé par la CIP (New England Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 C. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). (b). Extraction de l'ARN total de l'hybridome 8B6 producteur de l'anticorps 15 monoclonal 8B6. L'ARN total est extrait à partir de 106 cellules d'hybridome 8B6 en phase exponentielle de croissance grâce au réactif RNAble (Eurobio, Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. La concentration en ARN total est déterminée par mesure de la densité optique à 260 nm. 20 (c). Obtention de la séquence nucléotidique du cDNA 8B6 L-VH L'amplification génique de l'ADNc codant la région variable 8B6 L-VH a été obtenue à partir des ARN messagers par RACE-PCR de façon à obtenir la séquence nucléotidique codant le peptide signal (L) associé à sa région variable (VH). Cette 25 amplification a été réalisée en utilisant le coffret SMART RACE cDNA Amplification obtenu auprès de la société BD Biosciences (San Jose, CA, USA) selon les recommandations du fournisseur. La quantité d'ARN total utilisé pour la rétrotranscription était de 1 g. Le produit de la réaction a été dilué dans 10011L de 2906808 solution tampon tricine EDTA fourni par le fournisseur. Un volume de 2,51uL du produit dilué a été utilisé pour l'amplification génique. L'amorce antisens spécifique de l'ADNc 8B6 L-VH utilisée est la suivante : 3'- mu C gamma 3 5'- tga tca act cag tct tgc tgg ctg ggt ggg -3' qui s'hybride sur l'ADNc codant le domaine constant mu 5 C-gamma 3 de la chaîne lourde des anticorps de souris de type gamma 3. L'amplification a été réalisée par incubation du mélange réactionnel dans un thermocycleur Perkin-Elmer (PE) DNA thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Wellesley, MA, USA) dans les conditions suivantes : 5 cycles (94 C pendant 5 secondes, 72 C pendant 3 minutes), suivi de 5 cycles (94 C pendant 5 secondes puis 70 C pendant 10 10 secondes suivi de 3 minutes à 72 C) et de 25 cycles (94 C pendant 5 secondes suivi de 69 C pendant 10 secondes et 3 minutes à 72 C). Le produit de réaction de RACEPCR est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (Q. Biogene, Morgan Irvine, CA, USA) dans une solution tampon de migration de Tris EDTA pH 8 (40 mM Tris-base (Sigma Chemicals Co), 25 mM EDTA (Inerchim, Montluçon, 15 France) , 20 mM acide acétique (Carlo Erba Reagenti SpA, Rodano, MI, Italie). Les produits de poids moléculaire attendu sont ensuite purifiés à l'aide du coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. La détermination de la séquence en acide nucléique des produits obtenus purifiés a été réalisée par la société GENOME express (Meylan, France) afin de vérifier la 20 séquence de l'ADNc codant la région 8B6 L-VII. La séquence correspondant au peptide signal associé à la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps 8B6 a été ainsi déterminée et des amorces dessinées pour permettre le clonage de l'ADNc 8B6 L-VH dans le vecteur d'expression pBluescript II SK (+) hu-C gamma 1. 25 (d). amplification génique des segments 8B6 L-VH L'amplification de l'ADNc 8B6 L-VH a été obtenue par réaction de RT-PCR à partir d'un extrait d'ARN total de cellules d'hybridome 8B6. Le mélange réactionnel est le suivant : Oligo d(T)18 1 L (New England Biolabs Inc. Beverly, 2906808 41 MA, USA), ARN 1 g, dNTP 0,5 mM (Promega, Madison, WI, USA), eau stérile qsp 121IL. Ce mélange est incubé 5 minutes à 65 C (bain marie sec) puis 2 minutes à 4 C (glace fondante) pour dénaturer l'ARN. Sont ensuite ajoutés au mélange réactionnel, 4 L de solution tampon 5X First-strand Buffer (Invitrogen Life Biotechnologies), 10 5 mM DTT (Invitrogen Life Biotechnologies), 160 U de Rnasine (Promega) et 800 U de transcriptase inverse (Invitrogen Life Biotechnologies). L'ensemble est incubé 1 heure à 37 C puis à 70 C pendant 15 minutes afin d'arrêter la réaction. Les copies d'ADNc 8B6 L-VH sont obtenues par amplification génique grâce à une réaction de PCR utilisant les oligonucléotides de synthèse suivants : 5'- BamHI 8B6 L-VH : 5'ccg tcg gat ccg gcc acc atg aag ttg tgg -3' (amorce sens) et 3'- NheI 8B6 L-VH : 5'-cgg ggt gct agc tga gga gac tgt -3' (amorce antisens). Les amorces utilisées permettent l'introduction de mutations silencieuses dans la séquence d'ADN qui n'entraînent aucune modification au niveau de la séquence en acides aminés tout en permettant l'apparition des sites de restriction BamHI et NheI 15 nécessaires au clonage dans le vecteur. Le milieu réactionnel a la composition suivante : dNTP 500 M (Promega), Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 11,tL, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 1011L , ADNc (matrice) 1 L, MgCl2 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3'- NheI 8B6 L-VH et amorce 5'- BamHI 8B6 L- 20 VH 500 M. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 (Peltier Thermal Cycler) selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Après vérification des produits de PCR par analyse électrophorétique sur gel 25 d'agarose à 1%, le cDNA 8B6 L-VH est purifié à l'aide du coffret QlAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. (e). Digestion de l'ADNc 8B6 L-VH 2906808 42 L'ADNc 8B6 L-VH est digéré utilisant les enzymes de restriction BamHI et Nhel. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), ADNc 8B6 L-VH (1 g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Nhel (10U). Les enzymes de restriction, les solutions 5 tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. L'insert digéré est purifié grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. 10 (f). Réaction de ligation La ligation permet d'insérer l'ADNc 8B6 L-VH digéré dans le vecteur pBluescript II SK (+) hu-C gamma 1 digéré et déphosphorylé. La réaction est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur 15 digéré déphosphorylé pBluescript II SK (+) hu-C gamma 1 200 ng, T4 ligase (400U) (New England Biolabs Inc.), ADNc 8B6 L-VH purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. Le produit de réaction de ligature est utilisé pour la transformation de bactéries comp étentes E. coli XL1 blue (Stratagene). 20 (g). Obtention de l'ADNc codant la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement Le vecteur pBluescript II SK (+) KM8B6 H est digéré par les enzymes de restriction BamHI et Xbal pour obtenir l'ADNc codant la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement. La composition du milieu réactionnel est la suivante : 25 tampon NEB2 10X (5 !IL), BSA 100X (0,5 L), vecteur (1 p.g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Xbal (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 heures au bain marie à 37 C. L'insert libéré est 2906808 43 purifié grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. (h). Digestion du vecteur pcDNA3/Hygro et déphosphorylation du vecteur 5 digéré La digestion se fait dans les conditions suivantes : tampon NEB2 10X (5 L), BSA 100X (0,5 L), vecteur (1 g), enzyme de restriction BamHI (10U), enzyme de restriction Xbal (10U). Les enzymes de restriction, les solutions tampons de réaction et la solution de BSA sont de New England Biolabs Inc. La réaction est poursuivie 3 10 heures au bain marie à 37 C. Le vecteur et l'insert digérés sont purifiés grâce au coffret QIAquick Gel Extraction (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Le vecteur est ensuitedéphosphorylé par la CIP (New Englan Biolabs Inc.) pendant 1 heure à 37 c. La composition du milieu réactionnel est la suivante : tampon NEB3 10X (5 L), vecteur (1 g), CIP (1 L). 15 (i). Réaction de ligation La réaction de ligation permet d'insérer l'ADNc codant la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement dans le vecteur pcDNA3/Hygro digéré et déphosphorylé. La réaction de ligature est poursuivie au bain marie à 16 C pendant 20 16 heures dans le millieu réactionnel suivant : solution tampon de ligature 5X (4 L) (New England Biolabs Inc.), vecteur digéré déphosphorylé pcDNA3/Hygro 200 ng, T4 ligase (400U) (New England Biolabs Inc.), l'ADNc codant la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement purifié 170 ng (pour un insert de 1 kb). Le rapport molaire insert/vecteur est de 3/1. Le produit de réaction de ligation est utilisé pour la 25 transformation de bactéries compétentes E. coli XL1 blue (Stratagene). 2906808 44 (j). Vérification de la présence de l'ADNc codant la chaîne lourde de l'anticorps modifié artificiellement dans le vecteur pcDNA3/Hygro par réaction de PCR Les colonies résistantes isolées sont déposées stérilement sous hotte dans un 5 tube contenant le mélange réactionnel de PCR : dNTP 500 M (Promega), Taq polymerase (Invitrogen Life Technologies) 11,tL, solution tampon de PCR (Invitrogen Life Technologies) 10 L , MgC12 (Invitrogen Life Technologies) 1,5 mM, amorce 3' et amorce 5' 5001.tM. L'amplification a été réalisée dans un thermocycleur MJ-research PTC 200 selon les conditions suivantes : 5 minutes à 94 C, puis 35 cycles 10 suivants 30 secondes à 94 C, 45 secondes à 55 C et 1 minute à 72 C. Les amorces utilisées sont : 5'- BamHI 60C3 L-VH : 5'- ccg tcg gat ccg gcc acc atg aag ttg tgg -3' (amorce sens) et 3'- Nhel 8B6 L-VH: 5'- cgg ggt gct agc tga gga gac tgt -3' (amorce antisens). La taille du produit PCR amplifié est contrôlée par analyse électrophorétique 15 sur gel d'agarose 1%. Les clones qui ont été correctement transformés sont les seuls à donner un produit de PCR de taille attendue. (k). Production du plasmide d'intérêt pcDNA3 KM8B6 L On utilise un cure-dent stérile qui après prélèvement de la colonie est mis dans 20 5 mL de milieu liquide sélectif LB contenant 100 g/mL d'ampicilline (Sigma Chemicals Co) et 12,51g/mL de tétracycline (Sigma Chemicals Co) et incubé 16 heures à 37 C. La dilution bactérienne est alors utilisée pour la réalisation d'une minipréparation d'ADN plasmidique en utilisant le coffret QlAprep spin miniprep (QIAGEN) selon les recommandations du fournisseur. 25 11. Transfection des cellules CHO pour l'expression de l'anticorps modifié artificiellement KM8B6 2906808 Les cellules CHO ont été utilisées comme cellules hôtes pour exprimer et sécréter l'anticorps modifié artificiellement KM8B6. Ces cellules ont été cotransféctées avec les plasmides pDNA3 KM8B6-L et pDNA3.1/Hygro KM8B6-H, codant respectivement la chaîne légère (Figure 4) et la chaîne lourde de l'anticorps 5 modifié artificiellement KM8B6 (Figure 9),à l'aide du coffret PolyFect (Qiagen GMBH, Hildn, Allemagne) selon les recommandations du fournisseur. Les cellules transformées ont été sélectionnées pour leur résistance à la généticine et l'hygromycine B (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Des clones résistants ont été obtenus par une technique classique de clonage par dilution limite. 10 Ils ont été ensuite sélectionnés pour leur expression et leur sécrétion de l'anticorps KM8B6 par test immuno-enzymatique ELISA. Un clone transfectant stable sécrétant l'anticorps KM8B6 à 3,8!1g/mL a été retenu. 12. Purification des anticorps 8B6 et KM8B6 15 Les anticorps monoclonaux de souris spécifiques des gangliosides ont été produits à partir de surnageant de culture de l'hybridome correspondant (Cerato et al, 1997). Ils ont été purifiés par chromatographie sur protéine A (GE Healthcare Amersham Bioscience AB, Uppsala, Suède) selon un protocole mis au point par l'inventeur qui limite les phénomènes d'aggrégations homophiles irréversibles des 20 IgG3 de souris (Chapman et al, 1990). La colonne est d'abord équilibrée par un tampon 0,1 M Tris-HC1 pH 7,6. Un échantillon de 2 L de surnageant de culture contenant 10% de tampon d'équilibration est déposé sur la colonne avec un débit de 1 mL/min. La colonne est ensuite lavée avec 10 volumes de tampon d'équilibration. Le matériel fixé à la protéine A est élué avec un tampon acide 0,1 M citrate 0,3 M NaCl 25 pH 3 puis collecté par fractions immédiatement neutralisées par le dépôt préalable dans des tubes collecteurs d'un tampon 1 M Tris-HC1 pH 7,6. Le déroulement de la purification est suivi par la mesure de la variation de la densité optique des fractions collectées. Les fractions intéressantes sont ensuite dialysées dans une solution de PBS 2906808 46 pH 7,4 NaCl 0,3M et stérilisées par filtration sur filtre 0,221.tm. La quantité de protéine est déterminée par mesure de la densité optique à 280 nm puis la concentration de l'AcM est ajustée à une concentration inférieure ou égale à 0,9 mg d'AcN par mL de façon à prévenir le phénomène d aggrégation homophile des IgG3 5 de souris. Les AcM purifiés sont conservés ainsi à 4 C jusqu'à utilisation. L'anticorps modifié artificiellement KM8B6 a été purifié par chromatographie d'affinité sur protéine A à partir du surnageant de culture de cellule CHO provenant d'un clone co-transfécté de manière stable avec les plasmides pcDNA3 KM8B6-L et pcDNA3/Hygro KM8B6-H. 10 Les anticorps purifiés sont analysés par analyse SDS-PAGE en conditions dénaturantes réductrices. Les échantillons sont repris dans une solution tampon Tris-HC1 0,5 M pH 6,8, contenant 10% de glycérol 'VWR, Fontenay sous Bois, France) et 5% de B-mercaptoethanol (Promega). Ils sont portés à ébullition 5 minutes, puis analysés en électrophorèse SDS-PAGE selon la technique de Laemmli. Les protéines 15 sont déposées à raison de 3 g dans des puits d'un gel de polyacrylamide de 1,5 mm d'épaisseur avec pour gel supérieur et inférieur des concentrations respectives de polyacrylamide de 4,5% et 12% (VWR). Après électrophorèse à 200V pendant 45 minutes à température ambiante, le gel est fixé et coloré au bleu de Coomassie R250 (Sigma Chemicals Co). Les masses moléculaires sont calculées à partir de la 20 migration de marqueur de poids moléculaire Precision Plus Protein Standards (BIORAD). L'analyse SDS-PAGE sur gel à 12% en conditions dénaturantes réductrices montre que les masses moléculaires des chaînes chimériques L et H sont respectivement de 25 kDa et 50kDa. L'analyse SDS-PAGE sur gel à 6% en 25 conditions dénaturantes non réductrices montre que les chaînes L et H sont correctement assemblées pour former une molécule d'anticorps et que la masse moléculaire de l'anticorps modifié artificiellement est de l'ordre de 150 kDa. 2906808 47 13. Etude de la spécificité de l'anticorps KM8B6 (a). par immunofluorescence indirecte sur cellules vivantes La spécificité des anticorps a été étudiée sur les cellules IMR32 qui expriment 5 le GD2-O-acétylé et sur les cellules Neuro 2A qui n'expriment pas le GD2-O-acétylé. Les cellules au nombre de 106 sont mises à incuber avec l'anticorps 8B6 ou KM8B6 pendant 30 minutes à 4 C. Les cellules sont ensuite lavées deux fois dans du tampon PBS-BSA 1% pH 7,4 et mises à incuber de nouveau 30 minutes en présence d'anticorps de chèvre F(ab)2 anti-immunoglobulines de souris ou antiimmunoglobulines humaines marqués à l'isothiocyanate de fluorescéine (Jackson ImmunoResearch Europe LTD, Cambrideshire, UK) dilués au 1/100 dans du PBSBSA 1%. Après trois nouveaux lavages dans du PBS, 10 000 cellules sont analysées à l'aide d'un cytomètre de flux FACScan (Beton-Dockinson, Mountain View, CA) dans une fenêtre SSC/FL1-H après exclusion des cellules mortes et des débris 15 cellulaires. Sont déclarées positives, les cellules présentant une fluorescence supérieure à 1 Log après ajustement de la base à l'aide de témoins marqués non spécifiquement par le second anticorps seul. Les résultats obtenus montrent que l'anticorps KM8B6, comme l'anticorps 8B6, reconnaît uniquement les cellules IMR32. 20 (b). par test immuno-enzymatique ELISA sur des cellules dessiquées en plaque de microtitration à 96 puits La spécificité des anticorps a été étudiée sur les cellules IMR32 qui expriment le GD2-O-acétylé et sur les cellules Neuro 2A qui n'expriment pas le GD2-O-acétylé. 25 Les cellules tumorales cultivées in vitro sont décollées de leur support de culture par traitement à la trypsine. Après trois lavages avec du PBS, les cellules sont distribuées dans des plaques de microtitration à fond plat Maxisorp (Nunc AIS, Roskilde, Danemark) à raison de 105 cellules par puits dans un volume de 50!1L de PBS. Les 2906808 48 plaques sont ensuite placées dans une étuve à 37 C pendant une nuit pour permettre l'évaporation du PBS. Les plaques peuvent être utilisées directement ou conservées pendant plusieurs mois à température ambiante avant utilisation. Au moment de l'analyse, les plaques sont d'abord incubées sous agitation une heure à tempéarture 5 ambiante avec 2000L d'une solution tampon de PBS pH 7,4 contenant 1% d'e BSA afin de saturer les sites non spécifiques. La plaque est ensuite incubée durant 2 heures sous agitation à température ambiante avec 100 L d'une solution d'anticorps dilué dans du tampon PBS à 0,1% de BSA. Après trois lavages , chacun effectué avec 200 L de tampon PBS, 1000L d'une solution de F(ab')2 d'anticorps biotinylés 10 spécifiques soit d'immunoglobulines totales de souris, soit d'immunoglobulines totales humaine (Jackson ImmunoResearch Europe LTD, Cambrideshire, UK) dilués au 1/2500 dans du PBS-BSA 0,1% est déposée dans chaque puit. Après 1 heure d'incubation sous agitation à température ambiante et trois lavages en PBS, une solution de streptavidine peroxydase biotinylée (Jackson ImmunoResearch Europe 15 LTD, Cambrideshire, UK) dans du PBS-BSA 0,1% est mise à réagir pendant 1 heure avant d'être éliminée par lavage. La révélation du complexe fixé est mise en évidence par addition de 10011L de substrat ABTS (Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany). La densité optique est déterminée par une lecture de la plaque au spectrphotomètre (Multisan EX, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA) à 405 20 nm à différents intervals de temps. Les résultats obtenus montrent que l'anticorps KM8B6, comme l'anticorps 8B6, se fixe de manière dose-dépendante exclusivement sur les cellules IMR32. (c). sur couche mince de silice 25 L'analyse a été réalisée sur un extrait gangliosidique total de cellules IMR32. Les gangliosides tissulaires sont extraits selon la technique décrite par Ariga et al. (1991). L'échantillon à extraire est broyé dans dix volumes d'un mélange chloroforme/méthanol (C :M) (1 : 1, v/v) et laissé sous agitation mécanique à 2906808 49 température ambiante pendant une nuit. Après filtration, le résidu est repris dans 2,5 volumes (C :M) (1 : 1, v/v) et à nouveau agité durant six heures. Le mélange est alors filtré et les deux filtrats sont évaporés sous pression réduite dans un évaporateur rotatif. Le résidu sec est alors déposé sur une colonne contenant 2 mL de DEAE- 5 Sephadex A-25 sous forme acétate (Sigma Chemicals Co). Les lipides neutres sont éliminés par 15 mL de solvant A. Les gangliosides sont ensuite élués avec 15 mL de méthanol contenant 0,4M d'acétate de sodium `Sigma Chemicals Co). A la fraction obtenue sont ajoutés 30 mL de PBS pH 7,4 pour être déssalée sur une colonne Sep-Pak (Waters Co., Milford, MA, USA) de gel hydrophobe C18 selon la méthode de 10 Mc Luer (1990). Le gel C18 est d'abord conditionné par deux volumes de colonne de méthanol puis du mélange méthanol/PBS 1 :2 (v/v). L'extrait à dessaler est ensuite déposé sur la colonne à une vitesse de 1 mL/min. Les chaînes hydrocarbonnées des gangliosides interagissent par des liaisons hydrophobes avec le gel alors que les sels et les autres molécules non hydrophobes sont éliminés par deux volumes de colonne 15 d'eau distillée. Les glycosphingolipides sont ensuite élués par un volume de méthanol puis un volume d'un mélange chloroforme/méthanol 2 :1 (v/v). Les gangliosides élués de cette colonne sont concentrés dans un nouveau volume adéquat d'un mélange C/M 2 :1 (v/v) et conservés à -20 C. Les gangliosides sont ensuite séparés par chromatographie sur couche mince. 20 Cette méthode permet d'apprécier le profil des gangliosides totaux. Les plaques HPTLC sont constituées d'un gel de silice 60 `Merck) recouvrant une feuille d'aluminium. Les gangliosides déposés migrent 20 minutes à température ambiante dans une cuve saturée en solvant de migration. Ce solvant (phase mobile) est constitué d'un mélange C/M/CaC12 dans l'eau 0,22% (50:45:10, v/v/v). Plus un 25 ganglioside est sialylé, plus il est polaire et moins il sera mobile. La détection des gangliosides sur plaque est réalisée chimiquement par le réactif résorcinol/HC1 (Svennerholm, 1963). Ce réactif ne réagit qu'avec l'acide sialique qui est caractéristique des gangliosides. Après révélation au résorcinol, plusieurs bandes 2906808 colorées sont observées correspondant à la migration des gangliosides de l'extrait total. L'identification des gangliosides séparés est réalisée soit à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques, soit par comparaison avec des gangliosides standards utilisés comme marqueurs ayant migrés en même temps que l'extrait gangliosidique à 5 analyser. Après migration des gangliosides sur une couche mince de silice, la plaque est immergée dans une solution de poly-(isobutyl)-méthacrylate 0,01% en hexane pendant 1 minute puis séchée à l'air. Ceci permet de plastifier la plaque et d'éviter le décollement du gel de son support lors des étapes ultérieures. Le protocole du test 10 ELISA sur cellules dessiquées est alors suivi à l'exception de la révélation de la fixation de l'anticorps au ganglioside qui est effectué avec une solution de 4-chloro-1 naphtol (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Stenheim, germany) préparée extemporanément à raison de 1 mg de produit dissous dans 1 mL de méthanol, repris dans 20 mL de PBS et additionné de 30iuL d'eau oxygénée 30 volumes. 15 Les résultats montrent que l'anticorps KM8B6, comme l'anticorps 8B6, reconnaît le GD2-O-acétylé uniquement en absence de traitement alcalin de l'extrait gangliosidique. 14. Etude de la distribution du ganglioside GD2 et de sa forme O-acétylée 20 dans le système nerveux et sur des tissus tumoraux Les échantillons de tumeurs (glioblastome, neuroblastome mélanome de cancer pulmonaire) ont été obtenus à partir d'exérèse chirurgicale. Les échantillons de nerfs périphériques humains ont été prélevés sur le rameau sensitif distal du nerf musculo-cutané, branche latérale du nerf péronier. Il s'agit de prélèvements 25 diagnostiques de neuropathie périphérique ou pour des affections de la corne antérieure (nerfs sensitifs normaux) ayant posé des problèmes diagnostiques. Un volume de tissus ne dépassant pas les 0,5 cm3 est prélevé et congelé dans de l'isopentane refroidi à la température de l'azote liquide. Aprsè 60 secondes, 2906808 51 l'échantillon est retiré et transféré dans un tube de congélation préalablement refroifi à -70 C. Des coupes de 10p,m de tissu congelé sont réalisées à l'aide d'un cryostat. Les coupes sont recueillies sur des lames en verre Suoerfrost Gold + (VWR). Les coupes sont séchées à l'air pendant 3 minutes puis fixées dans de l'acétone pendant 5 10 minutes et de nouveau séchées à l'air. Les coupes sont alors conservées à -20 C jusqu'à la réalisation de l'analyse immmunohistochimique. L' immunocoloration des échantillons tissulaires a été réalisée en utilisant les AcM de souris primaires suivants : Anticorps primaire spécifique du GD2 : 10 AcM 10B8 (IgG3, kappa) spécifique du GD2 AcM 8B6 (IgG3, kappa) spécifique du GD2-O-Ac Anticorps primaire servant de réactif de témoin négatif : AcM MCA2063 (IgG3, kappa) spécifique du DNP (Serotec France, Cergy Saint Christophe, Rance). La révélation de la fixation de ces anticorps sur les échantillons tissulaires 15 testés a été effectuée à l'aide de la trousse DakoCytomation Envision + system, Peroxydase HRP (Dako, Glostrup, Danemark) pour un usage avec les anticorps primaires de la souris selon les recommandations du fournisseur. Les échantillons sont ensuite montés entre lames et lamelles avec um milieu de montage aqueux Aquadex (VWR). La recherche du marquage est alors réalisée par analyse en 20 microscopie optique à l'aide d'un microscope optique au grossissement 100 et 400. Des microphotographies numériques de trois champs microscopiques choisis au hasard par échantillons analysés. Les échantillons tumoraux, provenant de patients différents, ont tous présentés un marquage positif, membranaire et cytoplasmique, avec les anticorps 10B8 et 8B6 25 alors que les cellules saines n'ont pas été marquées par l'un ou l'autre de ces anticorps. Aucun marquage n'a été détecté avec l'anticorps MCA2063 anti-DNP. Les échantillons de nerfs examinés ont tous présentés un marquage au niveau d'internodes de fibres myélinisées avec l'anticorps 10B8 alors que les axones et les 2906808 52 fibroblastes ne présentaient pas de marquage. Ce marquage n'est pas retrouvé ou est difficilement détectable avec l'anticorps 8B6. Aucun marquage n'a été mis en évidence avec l'anticorps MCA2063. 5 15. Etude de la cytotoxicité des anticorps anti-GD2-O-acétylé 8B6 et KM8B6 (a). Préparation de la suspension de cellules cibles. 1x106 cellules de neuroblastome humain IMR32 cultivées dans du milieu RPMI sont incubées en présence de 1,85 Mbq de Na251CrO4 pendant 1 heure à 37 C. 10 Les cellules sont ensuite lavées trois fois par du RPMI et centrifugation avant d'être resuspendues dans du RPMI et incubées à 4 C pendant 30 minutes afin de mesurer le relargage spontané de la substance radioactive. Après une dernière centrifugation, les cellules sont reprises dans 5 mL de RPMI afin d'ajuster la concentration à 2x105 cellules/mL. 15 (b). Préparation des cellules effectrices Du sang humain à été prélevé sur des donneurs volontaires sur des tubes à prélèvement sanguin contenant de l'héparine. Les leucocytes périphériques du sang ont été séparés du sang total sur un gradient de Ficoll par centrifugation (1 800 x g 20 pendant 30 minutes). Les cellules obtenues sont centrifugées trois fois dans du RPMI à 1500 x g pour lavage et re-suspendues dans du RPMI afin d'obtenir une concentration en cellules de 5x106 cellules/mL. (c). Mesure de l'activité ADCC 25 Dans chacun des puits de plaque de microtitration à 96 puits en fond en U, obtenue auprès de la société Falcon, 50 L de suspension de cellules cibles, obtenues en a., sont déposés. 100 L de la suspension de cellules effectrices, obtenue en b., sont ensuite ajoutés soit 50 000 cellules par puit. Le ratio de cellules cibles sur le 2906808 53 nombre de cellules effectrices est de 1/50. L'anticorps 8B6, et l'anticorps modifié artificiellement KM8B6 et le rituxan , anticorps homme-souris IgGl, kappa, anti-CD20 utilisé comme contrôle négatif)sont ensuite ajoutés dans chaque puit à la concentration de 1 g/mL ou de 10 g/mL. Le mélange est incubés 4 heures à 37 C. 5 Après centrifugation, la plaque est centrifugée et la quantité de 51Cr présente dans le surnageant est mesurée à l'aide d'un compteur y. La quantité totale de 51Cr libérée est mesurée selon la même procédure en ajoutant du milieu sans anticorps, et une solution de soude 5 N à la place de la suspension de cellules effectrices. L'ADCC est alors calculée en utilisant la formule suivante : 10 % activité d'ADCC = (51Cr présent dans le surnageant - 51Cr libéré spontanément)/ (51Cr total - 51Cr libéré spontanément) REVENDICATIONS 1. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ne reconnaissant que la forme O-acétylée du ganglioside GD2, ou fragment de cet anticorps, ledit anticorps ou ledit fragment reconnaissant les molécules de GD2 O-acétylé exprimées par des cellules tumorales et ne reconnaissant pas les molécules de GD2 exprimées à la surface des nerfs périphériques. 2. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il est une IgG kappa d'affinité supérieure à 10-' mole/litre pour le GD2-O-acétylé et d'affinité au moins dix fois plus faible pour le GD2 lui-même, ledit anticorps ou ledit fragment étant mono ou bi-spécifique. 3. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon la revendication 1 ou 2, où les régions déterminant la complémentarité de la région variable de la chaîne H ont comme séquences d'aminoacides celles représentées dans SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 et SEQ ID NO:5 et les régions déterminant la complémentarité de la région variable de la chaîne L ont comme séquences d'aminoacides celles représentées dans SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 et SEQ ID NO:8. 4. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon la revendication 3, dont la chaîne lourde est obtenue par la jonction entre l'ADNc codant la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps non humain et l'ADNc codant la région constante de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine et dont la chaîne légère est obtenue par la jonction entre l'ADNc codant la région variable de la chaîne légère du même anticorps 2906808 ` 55 non humain et l'ADNc codant la région constante de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine caractérisé en ce que ledit anticorps non humain est l'anticorps monoclonal de souris 8B6 et ledit anticorps modifié artificiellement est dirigé contre le ganglioside GD2 O-acétylé et ne reconnaît 5 pas les fibres nerveuses du système périphérique. 5. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dont la région variable de la chaîne lourde possède la séquence déduite en acides aminés définie par SEQ ID 10 NO :1 et dont la région variable de la chaîne légère possède la séquence déduite en acides aminés définie par SEQ ID NO :2. 6. Anticorps monoclonal modifié artificiellement ou fragment de celui-ci selon la revendication 5, qui est l'anticorps KM8B6 pouvant être obtenu à l'aide de 15 la lignée cellulaire CI-1O ou un fragment de celui-ci. 7. Molécule pharmaceutique dérivée de l'anticorps modifié artificiellement ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle l'anticorps ou le fragment de celui-ci est couplé avec une 20 molécule X, où X est une molécule toxique, un médicament, une pro-drogue, ou un deuxième anticorps quelle que soit sa spécificité. 8. Molécule pharmaceutique selon la revendication 7 caractérisé en ce que ladite molécule toxique est une molécule toxique chimique, biologique ou 25 radioactive, ladite molécule étant destinée à détruire des cellules tumorales exprimant le ganglioside GD2-0-acétylé. 2906808 56 9. Molécule pharmaceutique selon la revendication 8 caractérisée en ce que lesdites cellules tumorales sont des cellules de neuroblastome, de mélanome, de glioblastome ou de cancer pulmonaire à petites cellules. 5 10. Molécule pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 caractérisée en ce que ladite molécule thérapeutique est mutée au niveau de sa région Fc par l'adjonction de sucres, modulant ainsi l'activation des cellules immunitaires et des molécules du système du complément. 10 11. Molécule pour le diagnostic des cancers montrant une expression du ganglioside GD2 O-acétylé à la surface des cellules tumorales, ladite molécule étant dérivée de l'anticorps modifié artificiellement ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit anticorps ou ledit fragment est lié à un agent permettant la détection de 15 l'anticorps ou dudit fragment par la fluorescence ou la radioactivité. 12. Utilisation d'un anticorps modifié artificiellement ou d'un fragment de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, pour la fabrication d'un 20 médicament pour la thérapie d'un cancer dont les cellules expriment la forme O-acétylée du ganglioside GD2 ou pour la fabrication d'un produit pour le diagnostic d'un tel cancer. 13. Séquence d'ADN codant pour l'anticorps modifié artificiellement selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 6. 14. Vecteur d'expression comprenant la séquence d'ADN selon la revendication 13, liée de façon opérationnelle à un promoteur. 2906808 57 15. Cellule comprenant le vecteur d'expression selon la revendication 14. 16. Cellule selon la revendication 15, ladite cellule étant une cellule animale. 5 17. Transformant non humain qui produit l'anticorps modifié artificiellement selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 18. Procédé pour la production d'anticorps modifié artificiellement pour le ganglioside GD2-O-acétylé, ce procédé comprenant l'expression de la 10 séquence d'ADN selon la revendication 13 dans une cellule ou un transformant non humain selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 dans des conditions appropriées et la récupération de l'anticorps. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel la cellule ou le transformant 15 selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 est cultivé dans des conditions dans lesquelles l'anticorps s'accumule.