Brevet FR2903495A1 — publié le 20080111

PROCEDE DE DETECTION D'INTERACTIONS A L'AIDE DU RAPPORTEUR DE FLUORESCENCE Pva La présente invention se rapporte au domaine de la détection, par fluorescence, d'interactions entre des composés peptidiques et leurs cibles. Plus précisément, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre (i) un composé peptidique contenant au moins un acide aminé phosphorylé ou phosphorylable et (ii) une cible (par exemple, une enzyme telle qu'une protéine phosphatase ou une protéine kinase) susceptible d'interagir avec ce composé peptidique. Selon ce procédé, la détection est réalisée grâce à la présence, dans l'enchaînement peptidique dudit composé, de l'acide aminé Pya utilisé comme rapporteur de fluorescence et ce, en l'absence de clivage dudit enchaînement peptidique. La connaissance des mécanismes intracellulaires qui permettent le contrôle du cycle cellulaire est essentielle. Les cascades de phosphorylations-déphosphorylations des protéines font partie de ces mécanismes biologiques essentiels. Selon toute vraisemblance, de nombreux noeuds de communication existent entre ces mécanismes intracellulaires et les voies de signalisation des médiateurs intercellulaires. Au plan des mécanismes, on constate que la diversité des contrôles ne s'appuie pas sur une grande variété de réactions. Pour ce qui concerne les médiateurs à récepteurs membranaires, on observe toujours l'activation d'une ou plusieurs protéines kinases suivie de la phosphorylation de diverses protéines substrats. Ces protéines substrats sont, par exemple, des enzymes, des canaux ioniques, des protéines du cytosquelette, des facteurs de transcription, des protéines de contrôle du cycle cellulaire, etc., dont la phosphorylation entraînera une modification des propriétés biologiques (activation ou désactivation). Les changements 2903495 2 de propriétés de ces protéines substrats conduisent, plus ou moins directement, à des modifications métaboliques et/ou génomiques qui, ensemble, constituent la réponse cellulaire spécifique. II est également intéressant de constater que de très nombreuses 5 étapes de transduction des signaux cellulaires consistent en la levée d'inhibitions. C'est le cas de l'activation des récepteurs membranaires tyrosines kinases et des récepteurs nucléaires aux facteurs de transcription. Dans ces deux cas, pourtant structurellement très différents l'un de l'autre, on observe que l'absence du domaine de liaison de 10 l'hormone entraîne l'activation constitutive du récepteur. Ceci indique que les domaines de liaison des hormones inhibent les activités des domaines transducteurs en l'absence du ligand. Il est donc important de rechercher les protéines dont l'interaction dépend de manière critique de la phosphorylation-déphosphorylation d'une ou plusieurs tyrosine(s). 15 Un exemple type d'une cascade de signalisations impliquant des protéines kinases (également ici appelées kinases ou PK) et protéines phosphatases (également ici dénommées phosphatases ou PP) est celui qui concerne les actions mitogéniques de l'insuline. Elles s'exercent par l'intermédiaire d'une cascade complexe d'événements. Le premier 20 substrat du récepteur de l'insuline après la liaison de celle-ci, a été nommé, de manière assez logique, substrat n 1 du récepteur de l'insuline Insulin Receptor Substrate 1 (IRS-1). Ce récepteur est une protéine de 165-180 kDa. L'activation du récepteur de l'insuline entraîne la phosphorylation de PRS-1 sur de nombreux résidus tyrosines (Tyr). Au 25 moins 8 tyrosines de IRS-1 subissent ainsi une phosphorylation par le récepteur de l'insuline. Ces phosphotyrosines (Tyr-O-PO3H2 ou pTyr) sont les points d'ancrage d'autres protéines intervenant dans les voies de signalisation de l'insuline (GRB2, PLCy, PI3 kinase, etc.). Toutes ces protéines ont en commun de posséder des domaines SH2 ( src 30 homology 2 ) responsables des interactions spécifiques avec des régions 2903495 3 portant ces phosphotyrosines. Ces protéines à SH2 reconnaissent des phosphotyrosines appartenant à des séquences différentes dans l'enchaînement d'IRS-1. Ce sont les séquences situées autour des tyrosines phosphorylées qui déterminent les spécificités de liaison des 5 différentes protéines à SH2 avec IRS-1. A titre d'exemple, le complexe IRS-1/Grb-2 interagit avec une protéine homologue du produit du gène Son of Sevenless (SoS) de la drosophile. Cette protéine SoS catalyse l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la protéine ras (p21 ras), ce qui entraîne l'activation 10 phosphorylante de cette dernière. La protéine ras possède également une activité GTPase qui reste cependant faible et doit être stimulée (jusqu'à 10 000 fois) par une GTPase Activating Protein (GAP). L'action de GAP entraîne la désactivation de ras. La tyrosine phosphatase SHP-2, impliquée dans la transduction du 15 signal de certains facteurs de croissance (IGF-1, EGF, etc.) et de cytokines, en activant la cascade des MAP kinases après sa liaison au complexe Grb2-SoS, pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation du signal. Dans le cas des protéines à phosphotyrosine, la spécificité de 20 reconnaissance des sites phosphorylés porte sur la phosphotyrosine elle-même et sur les 3 résidus adjacents du côté C-terminal. Néanmoins, on a récemment mis en évidence un domaine appelé TPB ( phosphotyrosine binding ), dont la spécificité de liaison porte sur les résidus du côté N-terminal par rapport à la phosphotyrosine. Ce recouvrement des sites de 25 spécificité laisse envisager une certaine compétition entre les deux types de domaine (et, donc, une balance entre les voies de signalisation concernées). Ces résidus adjacents du côté N-terminal de la phosphotyrosine sont également déterminants pour la liaison des 2903495 4 tyrosines phosphatases et, donc, pour la durée de vie de la phosphorylation de la tyrosine considérée. En effet, les mécanismes de régulation des processus cellulaires impliquent un équilibre permanent entre l'état phosphorylé d'une protéine 5 par une kinase, et son état déphosphorylé par une phosphatase. Ainsi, certaines tyrosines phosphatases membranaires, en déphosphorylant le récepteur de l'insuline, sont capables de l'inactiver. Chez la souris, l'absence de la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP-1 B) entraîne une augmentation de la sensibilité à l'insuline. Grâce à son domaine SH2, 10 SHIP-2 se lie à certaines phosphotyrosines d'IRS-1 et inhibe ainsi son activité. Autre phosphatase jouant un rôle probable dans la régulation du signal insulinique, la SHIP-2 (inositol 5-phosphatase à domaine SH2) catalyse normalement la conversion de PIP3 en PIP2. Chez la souris, l'invalidation hétérozygote du gène de SHIP-2 augmente 15 l'insulinosensibilité. Ainsi apparaît-il que de nombreux mécanismes peuvent moduler la cascade de réactions faisant suite à la liaison des messagers extracellulaires (insuline dans les exemples précédents) à leurs récepteurs. En outre, les diverses voies d'activation impliquées présentent 20 entre elles des interactions, rendant ainsi particulièrement difficile la compréhension du rôle précis de chaque molécule. C'est la raison de l'intérêt porté aux phosphatases et kinases ainsi qu'à leur(s) cible(s). D'un point de vue pratique, il existe à ce jour de nombreuses méthodes pour étudier les kinases et phosphatases. Quelques-unes des 25 méthodes les plus courantes sont décrites ci-après à titre de présentation non-exhaustive de l'arrière-plan technologique de l'invention. La déphosphorylation de la tyrosine dans un peptide peut être suivie par la mesure de l'accroissement de fluorescence de cet acide aminé au cours de l'hydrolyse du groupe O-P03H2 (Zhang et al., 1993). 2903495 5 Toutefois, cette variation est très faible, de l'ordre de 130 à 150 unités, ce qui représente à peine un doublement de la fluorescence de base du substrat. Elle est en outre facilement altérée par la présence d'autres amino-acides, en particulier Tyr ou Trp. 5 Plusieurs dosages utilisant la fluorescence ont été rapportés tant pour mesurer l'activité kinase que l'activité phosphatase. Ces dosages sont basés sur le changement de conformation attendu lorsqu'une protéine ou un peptide gagne ou perd le groupe P03H2 sur un acide aminé phosphorylable. Pour être efficaces, ces méthodes exigent l'introduction 10 d'un groupe fluorescent, tel que 6-acryloyl-2-diméthylaminonaphtalène (acrylodan), BODIPY, IANBD amide, IAEDANS, etc., sur la chaîne latérale d'une cystéine nécessairement adjacente à l'acide aminé phosphorylable ou phosphorylé (revue dans Brennan J.D., 1999 ; Past et al., 1994 ; Higaschi et al., 1997 ; Noble J. et al., 2003). L'avantage de ces essais est 15 de pouvoir être conduits de manière homogène (en solution et de manière continue). Ils possèdent toutefois plusieurs inconvénients. En particulier, l'obligation de vicinité entre la cystéine et le reste phosphorylable peut représenter une gêne à la liaison avec la kinase ou la phosphatase et ce, d'autant plus que ce reste Cys va comporter un fluorophore très 20 encombrant. En outre, la contrainte de vicinité limite la construction (et la diversité) de librairies de substrats. Enfin, la sensibilité reste assez faible, ce qui rend nécessaire des quantités d'enzymes importantes et un temps de mesure long. Ceci est un facteur défavorable pour le tri à haut débit d'inhibiteurs (Noble J., 2003). 25 Deux méthodes proches des techniques précédentes et s'appuyant sur la fluorescence ont été rapportées. Elles consistent à introduire un fluorophore, tel que la rhodamine, à l'extrémité d'un peptide phosphorylable, puis à placer ce peptide en présence d'un complexe soluble ou non du fer. La phosphorylation de l'acide aminé (Tyr, Ser, Thr) 30 par une kinase conduit à la liaison du groupe O-P03H2 avec le complexe 2903495 6 du fer et à un rapprochement du fluorophore. Ceci entraîne une diminution de la fluorescence qui peut donc être utilisée pour doser l'activité de l'enzyme, son inhibition, etc. Inversement, dans le cas d'une phosphatase, la fluorescence du phosphopeptide, éteinte au début du fait de l'interaction 5 du peptide avec le complexe du fer, va augmenter au fur et à mesure de la déphosphorylation. Là encore, cette technique possède plusieurs inconvénients : i) elle nécessite un apport extérieur de complexe métallique qui peut interagir avec du phosphate inorganique présent dans la préparation utilisée (homogénats) ou avec un groupe de ce type dans 10 un inhibiteur à tester ; ii) elle présuppose que la conformation du peptide est suffisamment flexible pour se modifier et venir à très grande proximité du complexe du fer, ce qui dépend bien évidemment de la séquence du peptide. Cette technique est actuellement commercialisée sous différents noms (QTL biosystems, IQTM technology). Une variante plus compliquée 15 exige une révélation par polarisation de fluorescence (Molecular Devices). Elle se base sur le changement (réduction) dans la vitesse de rotation-déplacement du peptide phosphorylé lorsqu'il est lié au complexe du fer par son groupe phosphate, et inversement (augmentation) lorsque le phosphate est éliminé par l'action d'une phosphatase. Outre la 20 sophistication d'appareillage que cette technique exige, la sensibilité reste faible. Une autre méthode est décrite dans la demande de brevet internationale WO 2005/012329. Cette méthode s'effectue en deux temps et exige la construction de peptides phosphorylables possédant un site de 25 clivage spécifique pour une enzyme donnée. Le peptide contient en N-terminal un groupe fluorescent et en C-terminal un reste capable d'éteindre la fluorescence émise par le fluorophore ( quencher ). Le quenching s'effectue par transfert d'énergie de fluorescence (FRET). La phosphorylation d'un tel peptide n'affecte pas le FRET mais le 30 quenching disparaît lorsque l'enzyme ajoutée coupe le peptide et 2903495 libère le fluorophore contenu dans un des deux métabolites. II s'agit d'un dosage non homogène (deux étapes) qui présente de nombreuses limitations, parmi lesquelles la mise en oeuvre d'une peptidase dont l'activité est modulée par la présence ou l'absence du reste phosphorylé, 5 ce qui limite le caractère universel de la méthode. D'autres méthodes d'étude de l'activité des protéines kinases basées sur le transfert d'énergie de fluorescence FRET ont été rapportées. Elles diffèrent par la nature du couple donneur-accepteur (Sato et al., 2002 ; Ting et al., 2001 ; Zhang et al., 2001). Cependant, 10 toutes exigent l'introduction d'un couple de fluorophores, ce qui rend plus difficile, notamment, la construction de librairies de peptides substrats. Des substrats fluorescents sensibles à l'activité des protéines kinases ont été décrits récemment (Wang et al., 2006). Afin de mettre en évidence la phosphorylation de résidus Tyr, les auteurs ont fixé le 15 fluorophore pyrène à l'extrémité de la chaîne latérale de l'acide L-2,3-diaminopropionique (Dap) ou de l'acide L-2,4-diaminobutanoîque (Dab). Les résidus Dap ou Dab ainsi modifiés sont ensuite introduits dans des chaînes peptidiques comprenant 10 acides aminés, dont la tyrosine, afin de constituer des librairies de substrats potentiels. La fluorescence du 20 reste pyrényl est augmentée lors de la phosphorylation de la tyrosine par des tyrosines kinases. Cependant, les auteurs ont constaté que ces substrats n'étaient pas universels. En effet, un certain nombre de tyrosines kinases ne les reconnaissent pas. Plusieurs explications peuvent être avancées. D'une part, le reste pyrényl, parce qu'il est introduit à 25 l'extrémité de la chaîne latérale du Dap ou du Dab, est mobile et, donc, d'autant plus susceptible d'entraver l'accès de l'enzyme à sa cible et, par conséquent, de nuire à leur interaction. D'autre part, Wang et al. introduisent le reste pyrène dans les substrats à la fin de la synthèse peptidique en phase solide, après l'étape de déprotection des restes Dab 30 et Dap jusque-là protégés sous forme de 4-méthyltrityl. Ceci limite 2903495 considérablement les possibilités de diversification des acides aminés utilisables pour construire la librairie de substrats. En l'occurrence, compte tenu des possibilités de réaction de l'acide 1-pyrène acétique avec les chaînes latérales, seuls 4 acides aminés différents (G, A, E et I) sont 5 utilisés dans la formule générale. Les acides aminés G, A et I sont par constitution dépourvus de groupement réactif dans leur chaîne latérale ; le carboxylate en y de l'acide glutamique E est protégé par un reste t-Bu. Dans ces conditions, comme le soulignent les auteurs, la reconnaissance des substrats par un grand nombre de kinases différentes est de facto 10 limitée, du fait de la faible variabilité de séquence des substrats présents dans la librairie. Du reste, le changement de fluorescence (ici, une augmentation) lors de la phosphorylation du résidu Tyr n'est observé que lorsque la chaîne latérale portant le reste pyrène se trouve en position +3 ou -2 par rapport à la tyrosine. II en résulte donc que cette méthode ne 15 peut permettre l'étude que d'un nombre restreint de tyrosines kinases. II existe ainsi diverses méthodes pour étudier les molécules d'intérêt qui présentent une activité biologique, notamment enzymatique, telles que les kinases et phosphatases. Pourtant, toutes les méthodes disponibles à ce jour imposent des contraintes de faisabilité et de 20 réalisation et/ou présentent des inconvénients techniques, qui en limitent de manière notable l'utilité, la facilité d'usage, la mise en oeuvre à grande échelle (ou à haut débit : pour du high-throughput screening û HTS ) et la généralité d'application. II existe donc un besoin pour une méthode et des moyens qui seraient à la fois (i) simples de réalisation et d'utilisation ; 25 (ii) efficaces ; (iii) sensibles et (iv) applicables de manière beaucoup plus générale que les méthodes et moyens connus. La présente invention représente précisément la première réponse technique satisfaisante apportée dans le domaine. La Demanderesse propose ici pour la première fois d'utiliser un 30 rapporteur de fluorescence unique, à la fois universel et puissant, de l'état 2903495 9 phosphorylé ou non de résidus tyrosines, à savoir le reste Pya (L-pyrénylalanine). Et, dans le cadre de la présente invention, la Demanderesse propose d'introduire Pya dans de courtes séquences peptidiques 5 contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylables ou phosphorylées, et de l'utiliser comme rapporteur des réactions de phosphorylation et/ou déphosphorylation de cet acide aminé par des kinases ou phosphatases, respectivement. Les séquences comprenant le ou les résidus Tyr et Pya peuvent avantageusement être immobilisées sur un support (e.g., bille, 10 colonne ou plaque). Brièvement, les Inventeurs se sont aperçus que les états phosphorylés ou non de séquences peptidiques, issues de substrats connus de phosphatases ou de kinases, ou bien provenant d'une librairie restreinte, conduisent à un changement intense (diminution jusqu'à 15 l'extinction, ou augmentation) de la fluorescence du rapporteur Pya, sous l'effet d'un phénomène de modulation de ce paramètre par collision ( collisional quenching ). La présente invention montre que ces changements de fluorescence peuvent être avantageusement utilisés pour mesurer l'activité d'une phosphatase ou d'une kinase et, ainsi, rechercher 20 des inhibiteurs ou activateurs de ces enzymes et quantifier la puissance de ces molécules dans un test homogène à haut débit. La Demanderesse propose donc ici des méthodes qui facilitent la caractérisation et le dosage de tyrosines phosphatases et tyrosines kinases, ainsi que la caractérisation et le dosage de leurs inhibiteurs ou 25 activateurs spécifiques. Sont également proposées des méthodes qui facilitent l'identification de nouvelles phosphatases ou kinases, ainsi que la recherche de substrats des phosphatases ou des kinases. La Demanderesse propose en outre des moyens de sélectionner le substrat optimisé pour une phosphatase/kinase connue ou inconnue, et de 2903495 10 l'utiliser pour mesurer le pouvoir inhibiteur ou activateur d'une substance donnée. La Demanderesse propose également une méthode sensible permettant de mettre en évidence et de caractériser des complexes entre 5 peptides ou protéines phosphorylés et leurs cibles protéiques réceptrices en milieu homogène ou sur cellules ou tissus. Comme indiqué ci-dessus, la présente invention tire profit des propriétés singulières, mises en évidence ici pour la première fois, du reste fluorescent Pya, lorsqu'il est placé dans une séquence 10 d'aminoacides dont l'un au moins correspond à une tyrosine ou une tyrosine phosphorylée. Cet acide aminé Pya peut être produit en grande quantité sous forme L (Soleilhac et al., 1996) et s'introduit facilement par synthèse en phase solide dans une séquence peptidique, ce qui minimise 15 considérablement les problèmes d'encombrement stérique associés, dans les techniques connues, à l'introduction de divers groupes fluorescents à l'extrémité de chaînes latérales d'acides aminés (cystéine, lysine, Dap/Dab). Un intérêt majeur du reste Pya tient à la fluorescence très intense 20 du pyrène qui possède deux maxima d'émission à 377 nm et 405 nm, c'est-à-dire situés dans des régions qui ne sont pas affectées par l'émission des tyrosines et tryptophanes éventuellement présents dans la protéine à étudier ou dans le milieu cellulaire. De plus, le pyrène possède un excellent rendement quantique de fluorescence (0,32) ainsi qu'un long 25 temps de vie de fluorescence (100 ns) (Berlman ID (ed.), 1971). La fluorescence émise par Pya est sensible à un environnement très polaire, la proximité de ce dernier conduisant à une extinction de fluorescence par collision (Yaron et al. 1979). Cette sensibilité à un 2903495 11 environnement polaire a d'ailleurs déjà été mise à profit dans le passé pour mesurer, par exemple, la dégradation de l'endothéline par l'enzyme de conversion de l'endothéline (ECE) (Luciani et al., 2001 ; brevet FR 2 807 523), celle des substrats des toxines botuliques B (Anne et al., 5 2001 ; brevet FR 2 809 733) et A (demande de brevet FR 2 869 908). . Dans ces exemples, un reste très polaire, la p-nitrophénylalanine (pNF), a été introduit dans les substrats pour servir de quencher . Le clivage du substrat entre les deux chromophores libère deux métabolites et une intense fluorescence du reste Pya est observée, puisque celui-ci ne subit 10 plus l'influence du groupe quencher . Or, dans le cadre de la présente invention, les Inventeurs ont trouvé de manière tout à fait inattendue que la fluorescence du reste Pya était fortement affectée par l'état de phosphorylation d'une tyrosine cible d'une kinase ou d'une phosphatase. En outre, de manière tout aussi 15 surprenante, ils ont trouvé que la phosphorylation par une kinase de cet acide aminé et, donc, son changement de polarité, produisait non pas une diminution mais une augmentation de la fluorescence de Pya. Réciproquement, l'action d'une phosphatase telle que la PTP1B produit l'effet inverse, c'est-à-dire une diminution très importante de la 20 fluorescence de Pya. Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et 25 - une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : 2903495 12 a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence F1 dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et 5 c) la comparaison du niveau de fluorescence F1 obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite cible, une différence significative entre FO et F1 révélant une interaction entre la cible et le peptide. Au sens de l'invention, une interaction peut être directe ou 10 indirecte. Une interaction directe entre deux partenaires au moins ne fait intervenir aucun intermédiaire ou relais. Soit les partenaires sont en contact physique immédiat les uns avec les autres (interaction que l'on pourrait qualifier de structurelle), soit les partenaires interagissent à distance . A l'opposé, dans une interaction indirecte entre au moins 15 deux partenaires, un ou plusieurs partenaires additionnels servent de relais. Ce(s) relais est(sont) donc, lui(eux), en interaction directe avec les partenaires en question. Dans tous les cas, quel que soit le type d'interaction, elle a pour conséquence de produire un effet sur la fonction biologique de l'un des partenaires au moins (interaction fonctionnelle). 20 Les termes et expressions activité , fonction , activité biologique et fonction biologique sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Une telle activité peut être notamment de nature enzymatique. Un enchaînement peptidique est une séquence de restes ou 25 résidus , qui peuvent être des acides aminés naturels, de série L, ou des acides aminés modifiés tels que des acides aminés naturels phosphorylés, la phénylalanine modifiée Phe-(p-CH2PO3H2) ou p-CH2-Phe, le marqueur Pya. Les termes enchaînement (peptidique) , chaîne (peptidique) séquence (peptidique) et peptide sont 30 équivalents et désignent une suite d'acides aminés, incluant le marqueur Pya, dont la longueur peut aller de 2 à 30 résidus, de préférence de 2 à 20 2903495 13 résidus, de préférence encore de 2 à 15 résidus, de manière encore préférée de 5 à 11 résidus. Comme il ressort de ce qui précède, les termes reste et résidu sont synonymes et désignent ici une unité dans la chaîne peptidique, en particulier un acide aminé, modifié ou non, 5 phosphorylé ou non, et Pya. De préférence, les séquences peptidiques mises en oeuvre dans le cadre de la présente invention comprennent au moins un résidu tyrosine, phosphorylé ou non. L'expression en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique signifie que l'on exclut toute rupture d'une ou plusieurs 10 liaisons peptidiques dans la séquence en cause. Cette caractéristique de l'invention reflète la capacité du reste Pya à servir de marqueur autonome de fluorescence, permettant à lui seul de détecter un signal d'interaction. Bien évidemment, on distingue ici clairement le clivage tel que décrit ci-dessus de l'hydrolyse, catalysée par une phosphatase, d'un 15 groupe -O-PO3H2 en groupe -OH. Comme cela ressort sans ambiguïté du présent texte, les termes et expressions marqueur Pya , marqueur de fluorescence Pya , rapporteur de fluorescence Pya , rapporteur Pya , reste Pya , résidu Pya sont synonymes. 20 Le peptide est dit marqué lorsque l'enchaînement peptidique contient le marqueur Pya. Le terme cible est ici utilisé pour désigner n'importe quel type de composé de nature biologique, qu'il soit d'origine naturelle, recombinant ou synthétique. Il peut notamment s'agir de protéines, 25 d'acides gras, d'acides nucléiques, d'anticorps, de polysaccharides, etc. De préférence, la cible selon l'invention est une protéine et, plus particulièrement, une enzyme. En ce cas, l'enzyme est, de préférence, apte à modifier la structure et/ou la fonction du peptide tel que sus-défini. Par exemple, il peut s'agir d'une phosphatase ou d'une kinase. Ainsi, dans 30 le cas où l'enzyme est une phosphatase (respectivement, une kinase), le peptide peut être, par interaction directe ou indirecte avec cette enzyme, 2903495 14 modifié structurellement par déphosphorylation (respectivement, par phosphorylation), entraînant ainsi une modification de sa fonction. Cette modification peut se traduire par une activation ou une inhibition, partielle ou totale, ou un changement d'activité. 5 Selon un mode de réalisation, l'enzyme est une phosphatase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé. Alternativement, l'enzyme est une kinase et le peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylable. De manière préférée, l'enzyme selon l'invention est une 10 phosphatase et, en ce cas, la molécule comprend, ou est, de préférence au moins un résidu Tyr phosphorylé. En pratique, préalablement à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, Pya peut être incorporé dans l'enchaînement peptidique via une liaison covalente, c'est-à-dire une liaison de nature peptidique. Le 15 marqueur Pya est alors de préférence incorporé dans la séquence peptidique de manière à être séparé du ou d'un résidu Tyr ou pTyr par au maximum 3, de préférence 2, acides aminés. Lors des étapes b) et c), la détermination des niveaux de fluorescence FO et F1 du peptide marqué est réalisée par des méthodes 20 conventionnelles, bien connues de l'homme du métier. Cette détermination peut être purement qualitative (on détecte alors l'apparition ou la disparition, ou bien l'augmentation ou la diminution d'intensité, de la fluorescence). Alternativement ou bien additionnellement, la détermination peut être une mesure quantitative de la fluorescence (on effectue alors 25 des mesures de fluorescence qui permettent d'accéder aux constantes cinétiques, aux constantes de dissociation, de déterminer un pouvoir inhibiteur ou activateur, etc.). La détermination quantitative de la fluorescence selon le procédé objet de la présente invention est avantageusement adaptée au tri systématique, à haut débit (HTS) (Pour 30 une revue récente des techniques actuellement disponibles, voir la demande US 2005/0026234 au nom de Violin et al.) 2903495 Selon un mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une augmentationde la fluorescence. Ceci est, par exemple, le cas lorsque la cible est une protéine tyrosine kinase et le peptide contient une tyrosine. 5 Selon un autre mode de réalisation, la différence entre les niveaux de fluorescence FO et F1 observée à l'étape c) correspond à une diminution de la fluorescence. On citera à titre d'exemple de ce mode de réalisation, le cas où la cible est une tyrosine phosphatase et le peptide contient une pTyr. 10 Un deuxième aspect de la présente invention vise l'application du procédé décrit ci-dessus à la détection, l'identification et la sélection d'une cible ayant une activité biologique, de préférence une enzyme. Un mode de réalisation correspond, par exemple, à un procédé de criblage pour identifier une enzyme, dans lequel on met en oeuvre le 15 procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention, en utilisant, en tant que substrat de l'enzyme, le peptide contenant le marqueur de fluorescence Pya. En ce cas, la cible est alors l'enzyme à identifier. La détection, l'identification et la sélection de l'enzyme se feront d'après l'activité susceptible d'être mise en évidence en présence du substrat. 20 Selon un troisième aspect, la présente invention s'intéresse à l'application du procédé de détection par fluorescence tel que précédemment décrit, au dosage de l'activité biologique d'une cible, de préférence une enzyme. Selon un mode de réalisation, l'on met en oeuvre un procédé de 25 dosage de l'activité d'une enzyme, notamment d'une kinase (activité de phosphorylation) ou d'une phosphatase (activité de déphosphorylation). A cette fin, on utilise le procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, dans lequel le peptide contenant Pya est le substrat de l'enzyme, et les niveaux de fluorescence, déterminés quantitativement, sont corrélés 30 aux niveaux d'activité enzymatique. 2903495 16 Un quatrième aspect de la présente invention a trait à l'application du procédé de détection par fluorescence ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une enzyme. 5 Un mode de réalisation particulier correspond à un procédé de criblage d'un peptide contenant le marqueur Pya et susceptible d'agir comme substrat d'une enzyme, lequel procédé comprend au moins la mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de détection par fluorescence précédemment décrit, de telle sorte qu'à l'issue de l'étape c), 10 si FO et F1 sont significativement différents, on sélectionne le peptide pour sa capacité à agir comme substrat de l'enzyme. Dans un cinquième aspect, la présente invention concerne l'application du procédé de détection par fluorescence décrit ci-dessus, à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable de 15 perturber l'interaction entre un peptide contenant Pya agissant comme substrat et une cible. Le terme perturber peut ici être synonyme de promouvoir/augmenter/activer ou, à l'opposé, de altérer/réduire/inhiber/supprimer . 20 Selon un mode de réalisation, cette application correspond à un procédé de criblage d'un composé susceptible de perturber l'interaction entre une cible et un peptide contenant Pya et agissant comme substrat, ledit procédé comprenant au moins la mise en oeuvre des étapes a) à c) du procédé de détection selon l'invention puis, si FO et F1 sont 25 significativement différents, la sélection du composé capable de perturber l'interaction entre le peptide et la cible. De préférence, la cible est une enzyme, notamment une phosphatase ou une kinase. Lors de l'étape de sélection, si FO est significativement supérieur à 30 F1, le composé est capable d'inhiber l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est donc un inhibiteur). En revanche, si F1 est 2903495 significativement supérieur à F0, ledit composé est capable de promouvoir l'interaction entre le peptide et la cible (le composé est alors un activateur). Un sixième aspect de la présente invention concerne l'application 5 du procédé de détection par fluorescence tel que décrit plus haut, à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase. 10 Selon un mode réalisation particulier, cette application du procédé de détection par fluorescence conforme à l'invention comprend en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation. 15 Un septième aspect de la présente invention concerne un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, comprenant un marqueur Pya, de formule générale choisie parmi les formules (I) et (II) suivantes : 20 Z-(XI )I-X2-(X' 1)m-Pya-(X" I )n-N H2 (1) Z-(X, )I-Pya-(X', )m-X2-(X"I )n-NH2 (II) dans lesquelles : Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 25 XI, X'1 et X"l représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ; I+m+n est inférieur ou égal à 9 ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. 2903495 18 Selon un mode de réalisation particulier, un substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation a pour formule, une formule choisie parmi : 5 Z-(XI)3-X2-(X'1 )2-Pya-E-NH2 (III) Z-(XI)3-Pya-(X'l)2-X2-E-NH2 (IV) dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 10 X, et X'1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. Avantageusement, une ou plusieurs librairies (ou banques) de 15 substrats répondant à l'une ou l'autre de ces formules (I) à (IV) seront constituées et pourront notamment être utilisées à des fins de criblage, de substrats (en particulier, de substrats de phosphatases ou de kinases) et/ou d'enzymes (en particulier, de phosphatases ou de kinases) susceptibles d'agir sur ces substrats. 20 Selon un huitième aspect, la présente invention vise l'utilisation d'un tel substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation, dans un procédé de détection par fluorescence conforme à la description précédente, ou dans l'une des applications susmentionnées. II en est ainsi de la fixation sur un support (plaque, 25 résine, billes magnétiques, etc.) par l'intermédiaire du reste hexanoyl ou biotinyl d'un substrat phosphorylé correspondant à une séquence phosphorylée d'une kinase. L'introduction de l'aminoacide p-CH2-Phe à la place de pTyr empêche l'hydrolyse non spécifique ou par une phosphatase, et permet d'isoler la(les) cible(s) potentielle(s) de la kinase. 30 On peut à cet égard citer l'exemple typique de la séquence phosphorylée du récepteur aux facteurs de croissance ou aux facteurs angiogéniques 2903495 19 qui possèdent une activité tyrosine kinase intracellulaire. Le peptide phosphorylé, résistant aux phosphatases et immobilisé, permet d'isoler une cible, par exemple SoS pour le récepteur à l'EGF, par la variation de fluorescence du reste p-CH2-Phe, lors de l'interaction avec sa (ses) 5 cible(s) spécifique(s), celle(s)-ci pouvant être des phosphatases. Les figures suivantes illustrent la présente invention, sans en limiter ni l'objet ni la portée. - Fiqure 1 : Comparaison des spectres d'émission de fluorescence des peptides 9 (phosphorylé) et 8 (non phosphorylé). 10 Conditions : Tampon utilisé : Hepes 50 mM pH 6:9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. Mesure à l'aide d'un spectrophotomètre Perkin-Elmer à Xex=343 nm; f ex = 15 ; f em = 2.5. -Figure 2 : Cinétique de la déphosphorylation du peptide 9 (10 pM) par la PTP1B (10 ng/mL). 15 Conditions :Tampon utilisé : Hepes 50mM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1B a été utilisée à une concentration de 10 ng/mL. La cinétique a été suivie à l'aide d'un fluorimètre Berthold (2^,ex=340 nm; ? em= 405 nm; Lamp energy = 10 000) à 30 C. Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 1.30 0.20 pM, kcat = 46.0 20 2.0 s-1, kcat/Km = 3.20 0.10 107 M-1.s-1 - Fiqure 3 : Inhibition de l'activité phosphatase de la PTP1B sur le substrat 9 par un inhibiteur compétitif et réversible : le PTP inhibitor IV. Conditions : Tampon utilisé : Hepes 50mM pH 6.9, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 2 mM. La PTP1B a été utilisée à une concentration de 20 25 ng/mL, le substrat 9 à une concentration de 10 pM. Les tests d'activité ont été réalisés après une incubation de 15 min à 30 C. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à Xex=340 nm; 2çem= 405 nm; Lamp energy = 10 000). - Figure 4 : Cinétique de phosphorylation du peptide 12 (20 pM) par la 30 kinase p60s-src. 2903495 20 Conditions : Tampon utilisé : Tris 50mM pH 7.5, DTT 2mM, MgCl2 5mM, MnCl2 1 mM, BSA 0,01 mg/mL, ATP 1 mM. La p60c-src (famille des tyrosines kinase) (humaine, SIGMA, ref : S5439, lot n 014K2706) a été utilisée à une concentration finale de 10 nM, le substrat 12 a été utilisé à 5 une concentration de 20 pM. (Lecture sur plaques 96 puits, à l'aide d'un fluorimètre Berthold à Xex=340 nm; hem= 405 nm; Lamp energy = 10 000). Paramètres cinétiques de la réaction : Km = 20.16 pM, kcat = 1.53 s-1, kcat/Km = 7.59 104 M-1 .s-1. 10 D'autres propriétés, modes de réalisation et avantages de la présente invention pourront ressortir à la lecture des exemples suivants, donnés ici à titre purement illustratif. EXEMPLES I-Préparation de séquences peptidiques marquées, utilisables comme substrats potentiels de kinases ou phosphatases : Le reste Pya peut être introduit : - dans des séquences peptidiques connues, susceptibles de servir 20 de substrats à des phosphatases et des kinases, - dans des librairies de séquences peptidiques lorsque les substrats des enzymes sont inconnus. 15 2903495 21 I-1- Introduction du reste Pya dans une séquence peptidique connue, susceptible de servir de substrat à des phosphatases et des kinases A titre d'exemple et de manière non limitative, on peut citer : 5 a) la mise au point d'un substrat de la phosphatase PTP1B. Le domaine d'activation du récepteur à l'insuline, le fragment 1157-1168 (I-pY-E-T-D-pY-pY-R-K-G-G-K) est déphosphorylé très rapidement, sur les deux pY adjacentes, par la PTP1B. Le peptide 9 Ac-I-Pya-E-T-D-pY-pY-R-K-NH2, dans lequel Pya 10 remplace une tyrosine, a été synthétisé et s'est révélé être un excellent substrat de PTPIB, avec déphosphorylation simultanée des deux pY restantes (voir exemples ci-dessous). L'analogue non phosphorylé 8 (Ac-I-Pya-E-T-D-Y-Y-R-K-NH2) est un substrat de kinase et, plus particulièrement, du domaine PTK du 15 récepteur à l'insuline. b) la mise au point d'un substrat de la kinase p60c-src. A partir du substrat commercial Ac-I-Y-G-E-F-NH2 (Nair et al., 1995), le peptide 11 et son analogue phosphorylé 10 ont été synthétisés (Ac-I-Y-G-E-Pya-NH2 et Ac-l-pY-G-E-Pya-NH2). 20 c) la mise au point d'un substrat de la kinase Hck. A partir du substrat décrit dans la littérature (Porter et al., 2000), on a procédé à la synthèse du composé 12 (Ac-E-E-Pya-I-Y-G-E-I-E-A-NH2) et de son analogue phosphorylé 13 (Ac-E-E-Pya-l-pY-G-E-I-E-A-NH2). 25 2903495 22 I-2- Librairie de séquences peptidiques : Les librairies de peptides substrats revendiquées ici peuvent avantageusement être obtenues par synthèse en phase solide tel que décrit dans la littérature (D. Conis et al., 1998). 5 L'accès chimique à ces librairies est simplifié, soit par l'utilisation de la méthode split-mix qui conduit à des peptides possédant en une seule position un mélange de n aminoacides (Furka A. et al., 1991), soit en utilisant la méthode Ala scan inverse (Vetter S.W. et al., 2000) qui consiste à partir d'un peptide ne contenant que des alanines et à 10 changer successivement chaque Ala par divers aminoacides. a) Librairies construites par la méthode split and mix : Ces librairies développées par la Demanderesse correspondent aux formules générales : 15 Ac-S-K-G-Pya-(X)n-Y (ou pY) ùG-G-K-NH2 (V) et Ac-S-K-G-Y (ou pY) -(X)n-Pya-G-G-K-NH2 (VI) dans lesquelles n=1, 2 ou 3 et X est un mélange d'a-aminoacides choisis parmi les aminoacides suivants : G, V, L, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, E, D, H, K, R, pY, pCH2Phe. b) Librairies construites par la méthode Ala scan inverse : A partir de la séquence suivante, comportant des restes alanines (formule VII ci-dessous). Z-(A)m-X2-(A)n-N H2 (VII) 20 2903495 Où: Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl (lors de la synthèse effectuée en phase solide, le groupe Z est un acétyl) ; m et n sont chacun inférieurs ou égaux à 4 ; 5 X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. Une seule alanine est remplacée dans chaque peptide par un résidu Pya, conduisant ainsi à 8 peptides différents si chacun des m et n vaut 4. Puis, dans chacun de ces peptides, chaque alanine restante est 10 successivement remplacée par un mélange des 18 acides aminés naturels (sauf Ala), auxquels on ajoute les acides aminés modifiés Tyr- OPO3H2 (pTyr) et Phe-CH2-PO3H2 (pCH2-Phe). II- Exemples de substrats de phosphatases et de kinases marqués 15 selon l'invention : Afin d'illustrer les méthodes proposées dans la partie I précédente, les peptides suivants ont été synthétisés selon la procédure susmentionnée. Chaque peptide a été synthétisé sous forme phosphorylée ou non sur la(les) tyrosine(s) contenue(s) dans leur 20 séquence. 1 AcSKGPyaAKpYGG-K-NH2 2 Ac S K G Pya A K Y G G-K- NH2 3 AcELEFpYMDPyaENH2 4 AcELEF Y MDPyaENH2 25 5 AcEpYpYMDPyaENH2 6 AcE Y Y MDPyaENH2 23 2903495 7 AcIPyaETDpYYRKNH2 8 AcIPya ETD YY RKNH2 9 AcIPyaETDpYpYRKNH2 10 Ac I pY G E Pya NH2 5 1 1 Acl Y GEPyaNH2 12 AcEEPyaIYGEIEANH2 13 AcEEPyaIpYGEIEANH2 La figure 1 illustre la différence de fluorescence du reste Pya dans un peptide contenant une tyrosine phosphorylée 9 ou non phosphorylée 8 à 10 la même concentration (1 micromolaire). La figure 2 représente la cinétique de déphosphorylation du peptide 9 en présence de la phosphatase PTP1 B. La figure 3 représente la courbe d'inhibition de l'activité de la PTP1 B sur le substrat 9 par action d'un inhibiteur compétitif. 15 La figure 4 représente la cinétique de phosphorylation du substrat 12 par la kinase p60 ' III- Dosage de l'activité enzymatique et identification d'inhibiteurs ou d'activateurs : 20 Lorsque la meilleure séquence peptidique substrat a été déterminée pour une enzyme (protéine phosphatase (PP) ou protéine kinase (PK)), elle peut être avantageusement utilisée comme substrat afin de déterminer les caractéristiques cinétiques de la réaction enzymatique selon les méthodes conventionnelles (voir la légende des figures 2 et 4). 25 On recherche en particulier le meilleur rapport Km/kcat pour une variation de fluorescence maximale (par exemple, pour PTP1 B). 2903495 25 La détermination du pouvoir inhibiteur d'un composé candidat peut ensuite s'effectuer selon les méthodes classiques (voir figure 3), notamment par (i) pré-incubation de doses croissantes du composé potentiellement inhibiteur avec l'enzyme utilisée à une concentration 5 voisine de son Km et pendant un temps tel que l'on reste en-dessous d'un seuil fixé à 15% de l'activité maximale (définie comme étant l'activité conduisant à une déphosphorylation ou un phosphorylation totale), suivie d'une (ii) mise en contact de l'enzyme ainsi préincubée avec le peptide substrat sélectionné au préalable. On recherche alors une diminution de 10 l'activité enzymatique en présence du substrat et de l'inhibiteur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat. L'identification d'un activateur peut s'effectuer de manière analogue, mais en recherchant, à l'inverse, une augmentation de l'activité 15 enzymatique en présence du substrat et de l'activateur potentiel, par rapport au niveau d'activité de référence de l'enzyme en présence du seul substrat. IV- Recherche, caractérisation et inhibition/activation des complexes 20 formés par des peptides ou protéines phosphorylés et un domaine protéique récepteur : Plusieurs méthodes ont été décrites pour mettre en évidence des complexes formés entre un peptide ou une protéine phosphorylé(e) et un domaine protéique récepteur. Ces techniques sont le plus souvent basées 25 sur l'utilisation d'un fragment de la protéine contenant la séquence phosphorylée (Liu et al., 1999). Toutefois, en l'absence de rapporteur, la variation de fluorescence du reste Tyr-PO3H2 lors de l'interaction avec son substrat est très faible (Cussac et al., 1994). 2903495 Or, un autre avantage propre à l'invention tient à la variation importante et inattendue de la fluorescence du reste Pya dans une des séquences peptidiques d'une librairie conforme à ce qui précède, lorsque cette séquence reconnaît un effecteur de la tyrosine phosphatase ou 5 kinase spécifique. Ce (ou ces) effecteur(s) correspond(ent) à une protéine, un ensemble de protéines, un peptide, un acide nucléique libre ou complexé qui est ou sont impliqués de manière plus ou moins critique dans la signalisation cellulaire régulée par l'action des phosphatases et kinases. 10 Lorsque la séquence peptidique contenant le reste Pya doit être phosphorylée sur une tyrosine, on peut avantageusement remplacer cet aminoacide par un reste PheûCH2-PO3H2 (Marseigne et Roques, 1988), qui n'est pas hydrolysable et se prête donc plus facilement à des mesures, en milieu homogène ou non (homogénats cellulaires, cellules, tissus), 15 sans risque de clivage alors que ce pourrait être le cas avec le reste OPO3H2. La variation de la fluorescence de Pya observée lors de la liaison entre la séquence phosphorylée contenant le fluorophore et un effecteur est utilisée pour caractériser des inhibiteurs (ou activateurs) de cette interaction. Cette réaction qui s'effectue dans un milieu homogène en une 20 seule étape se prête facilement, et avantageusement du fait de sa sensibilité, à un tri systématique à haut débit de molécules inhibitrices ou activatrices (criblage de type HTS). V- Mise en évidence de phosphatases ou de kinases jusque-là 25 inconnues : La caractérisation des phosphates et kinases et leur mise en évidence lorsqu'elles sont inconnues devrait en principe pouvoir s'appuyer sur l'existence de séquences préférentielles pour les deux types d'enzymes. 2903495 27 II est intéressant de noter que, même si la séquence globale est évidemment identique pour un système kinase/phosphatase donné, la séquence particulière permettant une reconnaissance spécifique optimisée de l'une ou l'autre enzyme n'est pas identique, la kinase 5 nécessitant généralement un enchaînement d'acides aminés plus long autour de l'amino-acide Tyr phosphorylable. Conformément à la présente invention, dans une première étape, les peptides marqués présents dans une librairie sont criblés afin d'isoler la séquence peptidique la plus affine pour une enzyme potentielle par 10 variation de fluorescence. Dans une seconde étape, le peptide le plus affin est utilisé pour isoler l'enzyme. Pour ce faire, on remplace le reste tyrosine (respectivement pTyr) par son analogue non hydrolysable pCH2-Phe. La séquence peptidique peut être immobilisée, par exemple, par l'intermédiaire d'un reste biotinyle en N-terminal qui va interagir avec une 15 avidine, ou bien par fixation covalente directe grâce à l'acide aminohexanoïque N-terminal. Les exemples ci-dessus s'intéressent plus particulièrement aux protéines kinases et protéines phosphatases comme cibles biologiques d'intérêt. Bien entendu, les moyens et méthodes proposés dans le cadre 20 de la présente invention sont d'application générale (universels). Par conséquent, grâce à la description détaillée de l'invention qui précède et à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine, l'homme du métier est tout à fait capable de transposer - et, si nécessaire, d'adapter par des mises au point de routine - avec succès et sans efforts, les 25 exemples donnés ci-dessus. 2903495 28 REFERENCES Zhang et al., Anal. Biochem. 1993, 211, 7-15 Brennan J.D., J. Fluorescence, 1999, 9, 295-312 5 Past et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 12880-12887 Higaschi et al., FEBS Letters, 1997, 414, 55-60 Noble J. et al., Anal. Biochem, 2003, 75, 2042-2047 Sato et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 287-294 Ting et al., PNAS, 2001, 98, 15003-15008 10 Zhang et al., PNAS, 2001, 98, 14997-15002 Wang et al., JACS, 2006, 128,1808-1809 Soleilhac et al., Anal. Biochem. 1996, 241,120-127 Yaron et al. Anal. Biochem.1979,95,228-235 Luciani et al., 2001, Biochem. J., 356, 813-819 15 Anne et al., Anal. Biochem. 2001, 291, 253-261 Kennely P.J. et Krebs E.G., J. Biol. Chem., 1991, 256, 15555-15558 Shelson S.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 1992, 89, 2027-2031 Garcia P. et al., J. Biol. Chem., 1993, 25, 25146-25151 Salmeen A. et al., Molecular Cell, 2000, 6, 1401-1412 20 Conis D. et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol., 1998, 31, 1345 Furka A. et al., General Method for the rapid synthesis of multicomponent peptide mixtures, Int. J. Pept. Prot. Res., 1991, 37, 487-493 Sakai et al., J. Cell Biol., 1997, 139, 1465-1476 Root et al., PNAS, 1997, 94, 5685-5690 25 Xu et al., PNAS, 1999, 96, 151-156 Marseigne et Roques, J. Org. Chem., 1988, 53, 3621-3624 Berlman ID (ed.), 1971. Handbook of fluorescence spectra of aromatic molecules. Acad. Press N.Y. Nair et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 4276 30 Porter et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 2721 Cussac et al., EMBO J., 1994, 17, 4011 2903495 29 Vetter S.W. et al., J. Biol. Cham., 2000, 275, 2265-2268 Liu et al., J.Med.Chem., 1999, 42, 3737-3741 REVENDICATIONS 1 Procédé de détection par fluorescence d'une interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou 5 phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une cible susceptible d'interagir avec ce peptide, ledit procédé comprenant au moins, en l'absence de clivage de l'enchaînement peptidique : a) la mise en présence du peptide contenant le marqueur Pya, avec ladite 10 cible ; b) la détermination du niveau de fluorescence FI dudit peptide marqué en présence de ladite cible ; et c) la comparaison du niveau de fluorescence FI obtenu à l'étape b) avec le niveau de fluorescence FO dudit peptide marqué en l'absence de ladite 15 cible, une différence significative entre FO et FI révélant une interaction entre la cible et le peptide. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite interaction est directe. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite interaction est indirecte. 4. Procédé selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que ladite 25 cible est une enzyme. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite enzyme est une phosphatase ou une protéine kinase. 20 2903495 31 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite enzyme est une phosphatase et ledit peptide comprend au moins un résidu Tyr phosphorylé. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la détermination des niveaux de fluorescence FO et FI de ladite molécule marquée est quantitative. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 10 caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et FI correspond à une augmentation de la fluorescence. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la différence entre les niveaux de fluorescence FO et 15 F1 correspond à une diminution de la fluorescence. 10. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'une cible ayant une activité biologique, de préférence une enzyme. 11. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 au dosage de l'activité biologique d'une cible, de préférence une enzyme. 25 12. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'un peptide capable d'agir comme substrat d'une enzyme. 13. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 30 1 à 9 à la détection, l'identification et la sélection d'un composé capable 20 2903495 32 de perturber l'interaction entre un peptide et une cible, de préférence une enzyme. 14. Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 5 1 à 9 à la détermination des caractéristiques cinétiques de l'interaction entre : - un peptide contenant une ou plusieurs tyrosines phosphorylées ou phosphorylables et un marqueur Pya ; et - une enzyme présentant une activité kinase ou phosphatase. 15. Application selon la revendication 14, comprenant en outre la détermination quantitative du pouvoir d'un composé à inhiber ou activer ladite interaction et, facultativement, le calcul des constantes thermodynamiques de cette inhibition ou activation. 16. Substrat peptidique auto-rapporteur de son état de phosphorylation comprenant un marqueur Pya et susceptible d'être utilisé dans un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 10 à 15, de formule générale choisie parmi les formules (I) et (Il) suivantes : Z-(XI )I-X2-(X'1)m-Pya-(X"I )n-NH2 (1) Z-(X1)I-Pya-(X'1)m-X2-(X"1)n-NH2 (II) dans lesquelles : Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; XI, X'l et X"1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L, phosphorylé ou non, ou p-CH2-Phe ; I+m+n est inférieur ou égal à 9 ; - X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. • 2903495 33 17. Substrat peptidique selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il a pour formule, une formule choisie parmi les formules (III) et (IV) suivantes : 5 Z-(X1)3-X2-(X'1)2-Pya-E-N H2 (III) Z-(X1)3-Pya-(X'1)2-X2-E-NH2 (IV) dans lesquelles : - Z est un groupe acétyl, biotinyl ou 6-aminohexanoyl ; 10 X1 et X'1 représentent indépendamment les uns des autres un acide aminé naturel de série L choisi parmi A, E, D, L ; X2 est choisi parmi Tyr, pTyr et p-CH2-Phe. 18. Utilisation d'un substrat selon la revendication 16 ou 17 dans un 15 procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou dans une application selon l'une quelconque des revendications 10 à 15.