Brevet FR2904833A1 — publié le 20080215

La présente invention concerne un procédé fluorimétrique de détermination de la quantité d'acide nucléique présente dans un échantillon, un fluorimètre adapté à la mise en oeuvre dudit procédé et une barquette de dosage d'un composé par fluorescence. L'existence d'acide nucléique libre circulant dans le sang est connue depuis de nombreuses années [Mandel et Métais, 1947 ; Tan et al., 1966]. On a pu constater, dès cette époque, en utilisant des techniques comme la RIA (immunodosage radioactif), que les patients atteints de cancers présentaient un niveau élevé d'ADN circulant par rapport à ceux qui souffraient de tumeurs bénignes ou par rapport à des personnes en bonne santé [Leon et al, 1977 ; Shapiro et al, 1983]. Cependant, c'est au cours de ces dernières années, avec le développement des techniques de biologie moléculaire très performantes telle que la PCR en temps réel, qu'on a commencé à s'intéresser aux fragments d'ADN circulant dans le but d'une utilisation comme marqueur de biologique clinique. L'ADN extrait du plasma de patients atteints de cancer présente le plus souvent les caractéristiques de l'ADN tumoral [Anker P. et al, 1999] tels que l'instabilité des brins, la présence d'oncogènes spécifiques, de gènes suppresseurs de tumeurs et des altérations des microsatellites. La notion que cet ADN circulant provenait des cellules tumorales a été supposée par de Kok et al. [De Kok et al. 1997] qui rapportaient que l'ADN dérivant des tumeurs, caractérisé par des altérations spécifiques, pouvait se retrouver dans le sérum de patients atteints d'une tumeur colorectale. Ainsi, ces auteurs ont détecté quelques mutations ponctuelles de k-Ras dans l'ADN du sérum qui avaient été préalablement identifiées au niveau de la tumeur primaire. C'est pourquoi la majeure partie des études sur l'ADN circulant a porté sur la détection de mutations, la perte d'hétérozygotie, les mutations micro satellitaires, ainsi que la méthylation de l'ADN extrait des tumeurs (tissus) ou de sérum de patients atteints de différents types de cancers. Les mutations et les instabilités microsatellitaires détectées dans l'ADN génomique libre du sérum suggèrent qu'il puisse être un nouveau marqueur potentiel, avec une spécificité importante pour le suivi des tumeurs. 2904833 2 Plus récemment, de nombreuses études tentent d'utiliser la simple augmentation de la concentration en ADN circulant, qu'il soit génomique ou non, comme marqueur de diagnostic ou de progression précoce du cancer du sein, du poumon ainsi que pour le suivi et le contrôle de patients déjà traités par 5 chimiothérapie [Sozzi et al., 2001]. Cette mesure permettrait d'éviter, ou de limiter du moins, les procédures plus invasives, telles que les biopsies. Elle pourrait aussi être utile dans le dépistage de certains cancers au stade précoce tel que le cancer des poumons [Sozzi et al., 2003], du sein [Gal et aI, 2004] ou de la prostate [Boddy et al, 2005 ; Jung et al 2004]. Enfin, elle pourrait également servir de complément aux 10 dosages de marqueurs courants dans la surveillance de patients atteints de cancers ou suivants une chimiothérapie, ou de patients ayant subi une intervention chirurgicale, un traumatisme [Lam et al. 2003] ou un infarctus du myocarde [Chang et al., 2003]. Il existe essentiellement deux types d'ADN circulant dans le sang : 15 - l'ADN associé aux cellules nucléées circulantes ; et - l'ADN circulant librement dans le plasma. L'ADN génomique dans le sérum est fragmenté chez les patients atteints de cancer ou ayant fait un infarctus du myocarde, avec la présence de fragments d'environ 100 paires de bases dans le cas de carcinomes [Wu et aI, 2002] et 20 d'environ 200 paires de bases en cas d'infarctus myocardique [Chang et al., 2003]. Ces fragments ne sont pas retrouvés dans le sang de témoins indemnes de pathologies chez lesquels de plus l'ADN circulant est retrouvé avec de très faibles concentrations. Le mécanisme selon lequel l'ADN est relargué dans la circulation sanguine reste encore mal connu. Jahr et al. [Jahr et al, 2001] avancent l'hypothèse 25 que les cellules apoptotiques et nécrotiques sont les sources majeures de cet ADN. Actuellement il n'existe pas de valeur limite de référence situant la concentration de cet ADN circulant chez les personnes en bonne santé. Plusieurs études ont tenté d'approcher ce seuil, toutefois il est assez difficile de faire une comparaison entre elles tant les méthodologies et les résultats obtenus diffèrent sur 30 beaucoup de plans. De plus, les unités utilisées varient selon les études : ng/ml ; nombre de copie/ml, génome-équivalent/mi (quantité d'ADN contenue dans une cellule diploïde estimée à 6,6 picogrammes/mI), etc... Plusieurs groupes de recherche ont mesuré le niveau de l'ADN circulant en cherchant une application potentielle dans le pronostic notamment en essayant 2904833 3 d'établir des corrélations avec les marqueurs usuels de diagnostics. Jusqu'ici, toutes les études conviennent que les niveaux moyens d'ADN sont sensiblement élevés chez les patients atteints de cancers par rapports à des contrôles sains en bonne santé, indépendamment de l'utilisation du sérum ou du plasma. Cependant les 5 quantités absolues mesurées varient entre les différentes études. Cette différence pourrait être liée au type de cancer analysé ainsi qu'aux diverses méthodologies utilisées. Les niveaux d'ADN mesurées dans le plasma sont plus bas par rapport à ceux mesurées dans le sérum, en accord avec beaucoup de données éditées [Thijssen et al, 2002]. En ce qui concerne la signification clinique, deux rapports au 10 moins décrivent une corrélation entre les niveaux d'ADN et des facteurs de pronostic connus. Dans les cancers du poumon (à petite cellule ou non) il existe une corrélation étroite entre les niveaux d'ADN plasmatique et l'activité de la LDH du sérum et de l'énolase neuro-spécifique (NSE), avec des rapports semblables entre chaque marqueur et la survie des patients [Fournié et al, 1995]. De même, les 15 niveaux d'ADN ont été corrélés avec le stade clinique dans le cas des métastases des ganglions lymphatiques et la taille de la tumeur chez des patients atteints de cancer du sein [Shao et al, 2001]. En outre, il est important de considérer que la fraction d'ADN circulant due à la contribution des tumeurs varie considérablement parmi les patients [Jahr et al, 2001]. 20 De nombreuses techniques de mesures des acides nucléiques en solution sont de nos jours disponibles et permettent, selon la méthode, de s'adapter aux différents besoins des cliniciens et des chercheurs. Parmi ces techniques on retrouve en premier lieu la spectrophotométrie [Greenstock et al, 1975] une méthode très couramment utilisée dans tous les laboratoires de recherche qui présente l'intérêt 25 d'être très peu onéreuse mais a l'inconvénient, majeur en pratique clinique, d'être extrêmement peu sensible : elle ne permettrait pas de mesurer les quantités d'ADN circulants de patients. D'autres techniques plus sensibles existent, mais elles présentent toutes des caractéristiques les rendant plus ou moins difficile d'utilisation en routine en partie du 30 fait d'une étape commune qui est l'extraction de l'ADN du milieu biologique avant mesure : • les techniques de radio-immunodosage [Leon et al, 1975] sont relativement longues (plusieurs heures pour une série de dosage), doivent être réalisée par série de mesure et non au coup par coup, et surtout 2904833 4 nécessitent des structures et des personnels spécialisés et autorisés pour le maniement de radioéléments. • la PCR compétitive [Siebert et aI, 1992 ; Yap et al, 1992], basée sur la visualisation comparative par rapport à des standards connus, est 5 l'addition de plusieurs techniques en série qui permettent d'assurer la sensibilité et la spécificité de la détection. Ces techniques sont lourdes et relativement confidentielles, il n'est pas envisageable de pouvoir les utiliser un jour en routine dans des laboratoires d'analyses médicales. • la PCR quantitative en temps réel [Mulder et al, 1994] est la technique la 10 plus en vogue dans les différentes publications qui s'intéressent à ce problème de la mesure de l'ADN circulant. Elle présente en effet un double intérêt : elle est spécifique de l'ADN cible que l'on cherche à mettre en évidence (ici de l'ADN humain), et elle n'est plus de nos jours réservée aux laboratoires de recherche car l'équipement existe sur de nombreux sites 15 hospitaliers. Cependant elle conserve quelques défauts : une extraction obligatoire, des coûts relativement onéreux de manipulations, un appareillage spécifique non utilisable pour des dosages en routine à grande échelle, et une sensibilité qui demande à être améliorée. • la fluorimétrie quantitative. [Greenstock et aI, 1975], Même si elle 20 n'épargne pas l'étape d'extraction, elle permet de mesurer plus rapidement et directement de l'ADN libre présent en solution, cependant les conditions techniques de son utilisation (microplaque, volume de réactif, mesure de la fluorescence) l'empêchent d'atteindre les limites de sensibilité désirée tout en ne permettant pas d'affirmer l'origine de l'ADN détecté (humain ou non). 25 Un objet de la présente invention est donc de fournir un procédé de détermination de la quantité d'acide nucléique présente dans un échantillon dépourvu des inconvénients des procédés existants. L'invention découle de la mise en évidence par les inventeurs qu'il est possible de déterminer la quantité d'acide nucléique présente dans un échantillon, en 30 ajoutant un fluorophore à l'échantillon et en déterminant l'intensité de fluorescence émise, en analyse synchrone, ou à au moins trois longueurs d'onde d'émission différentes en réponse à une excitation à au moins trois longueurs d'onde correspondantes. 2904833 5 Résumé de l'invention La présente invention concerne un procédé de détermination de la quantité d'acide nucléique présente dans un échantillon par fluorescence à au moins trois longueurs d'onde, dans lequel : 5 - on ajoute un fluorophore à l'échantillon, - on mesure des intensités de fluorescence émises par le fluorophore à au moins trois longueurs d'onde d'émission en réponse à des stimulations lumineuses à au moins trois longueurs d'onde d'excitation respectivement, et - on déduit des au moins trois intensités de fluorescence mesurées la quantité 10 d'acide nucléique présente dans l'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, on mesure les intensités de fluorescence, Il, 12 et 13, émises par le fluorophore à trois longueurs d'onde d'émission 4 X2 et 2,3 en réponse à des stimulations lumineuses à trois longueurs d'onde d'excitation, X'i, X'2 et X13, respectivement, avec Xl expérimental Les plasmas aliquotés conservés dans le congélateur (à -20 C ) sont 30 décongelés et portés à la température ambiante du laboratoire (entre 15 et 25 c), ensuite on effectue des dilutions (d'un facteur 10 à 300 ) dans le tampon TBE 1X (Vf= 450p1). Ces dilutions sont conservées dans la glace jusqu'au dosage. On pipette 40m1 du tampon TBE 1X auxquels on ajoute 100pl de Picogreen (ce qui fait au final un facteur de dilution égale à 20.000) décongelé 35 extemporanément, le tout est conservé dans la glace à l'abri de la lumière. 10 15 20 2904833 20 Le spectrofluorimètre allumé au moins 20 à 30 minutes avant le début des mesures est programmé comme suit : -en excitation le monochromateur va balayer de 400 à 600nm. -en émission le monochromateur va balayer de 430 à 630 nm. 5 Pour effectuer les mesures on procède de la façon suivante : - 1,9 ml de Picogreen dilué au 1/20000 sont prélevés et transférés dans un tube à hémolyse qui est mis à l'abri de la lumière sur la paillasse ; -ensuite on rajoute 100pI de la dilution de plasma/sérum (Vf = 2ml)-, on vortexe 8 à12 secondes et on laisse sur la paillasse pendant 2 à 3 minutes, au bout desquelles on 10 transvase rapidement dans une cuve en acryl pour commencer l'enregistrement du spectre. On fait toujours une gamme étalon à partir de l'ADN standard de concentration connue fourni avec le Picogreen, les points de gamme choisis sont: 2,5ng; 25ng et 50ng/ml. 15 N.B : Le tampon TBE 1X doit être préparé 24h au moins avant les mesures et gardé sur la paillasse car cela diminue sensiblement les phénomènes de diffusion Rayleigh. 20 D-Résultats a-Mise au point des conditions expérimentales 1-Choix du tampon 25 Le Picogreen s'intercalant dans la double hélice d'ADN, entre les bases, la nature du tampon doit influer sur le signal de fluorescence. Différents types de tampons couramment trouvés dans les laboratoires ont donc été testés. 30 -Tampon TE 1X (tris(hydroxymethylamine) aminométhane 1 M, EDTA 0.1 mM, pH=7,5) : Tampon classique d'utilisation du Picogreen -Tampon phosphate monopotassique 10 mM, pH = 7,8 : Le tampon phosphate présente une fluorescence importante ne permettant pas de mesurer avec une précision suffisante les concentrations d'ADN présente dans les étalons ou le 35 plasma. 2904833 21 -Tampon TBE 1X (tris(hydroxymethylamine) aminométhane 90 mM, acide borique 90 mM, EDTA 2 mM, pH=8,5): Le tampon TBE 1X, présence une faible fluorescence résiduelle, mais surtout il ne présente pas de pic de fluorescence à la longueur d'onde de mesure. Son utilisation est donc avantageuse dans le dosage selon 5 l'invention. 2-Choix du pH Les trois tampons précédents ont été testés à différents pH : 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 10 7,5, 8 et 8,5. Les variations de pH dans ces zones ne modifient pas les spectres de fluorescence. 3-Choix de la dilution du réactif : le Picogreen 15 Les techniques fluorimétriques s'effectuent en milieu extrêmement dilué afin de limiter les phénomènes classiques d'interférence : l'auto inhibition, le quenching, le Fading et la compétition, auxquels s'ajoutent la diffusion de Rayleigh. Les Inventeurs ont déterminé la concentration la plus basse en réactif qui 20 donne le signal le plus intense. Les concentrations suivantes de Picogreen ont été testées : 1/100, 1/250, 1/500 ,1/1000, 1/2000, 1/4000, 1/8000, 1/12000, 1/20000 Une dilution plus faible donne des signaux de plus faibles intensités. Une dilution trop forte donne des signaux beaucoup moins répétables et de croissance 25 non proportionnelle à la concentration d'ADN testée. A partir de dilution au 1/4000, les signaux deviennent détectables, mais la technique manque de sensibilité. A cette dilution, il n'est pas possible de faire la différence entre un plasma de contrôle (Figure 2) et de malade (Figure 3). Les meilleurs résultats sont trouvés pour une dilution du Picogreen au 30 1/20 000. A cette dilution de réactif la technique semble sensible et linéaire et il est possible de faire la différence entre un plasma de contrôle (Figure 4) et de malade (Figure 5). 2904833 4-Choix de la dilution du plasma Afin d'éviter les interférences liées à la matrice biologique il est important 5 travailler avec des échantillons dilués le plus fortement possible. Des plasmas dilués au 1/20, 1/50/ 1/100, 1/150, 1/200, 1/300, 1/400 ont été utilisés. Les meilleurs résultats sont obtenus pour des plasmas dilués au 1/100. Il n'a pas été observé de troubles liés ni à la turbidité des plasmas, même pour des plasmas opalescents ou troubles, ni à l'hémolyse, l'ictère ou l'hyper protidémie. 10 Cette dilution permet de mesurer des plasmas de contrôle avec une précision suffisante. 5-Choix de la différence de longueur d'onde entre les lumières d'excitation et d'émission 15 Les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission maximale proposées par le fabricant du Picogreen sont respectivement 485 et 530 nm. Les choix de ces longueurs d'onde et de leur différence de 45 nm peuvent être dus aux propriétés de la molécule, mais également à des contraintes matérielles liées à la diffusion de la 20 lumière dans les cuves de lecture. Le choix d'une différence de 45 nm pourrait provenir de contraintes techniques liées à la grande majorité des fluorimètres qui ne sont capables de limiter l'interférence de rayleigh que lorsque les longueurs d'onde d'excitation et d'émission sont séparées de 40 nm. Si c'était le cas, il ne s'agirait pas des longueurs d'onde maximale de 25 fluorescence mais de longueurs d'onde de compromis entre la meilleure sensibilité et les moindres interférences. L'utilisation de la fluorescence synchrone, en limitant considérablement l'interférence de Rayleigh permet de travailler avec des molécules dont les longueurs d'onde maximales de fluorescence peuvent être séparées de moins de 10 nm. 30 Des différences de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, et 55 nm ont donc été testées. La meilleure sensibilité a été obtenue pour une différence entre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 30 nm (Fiqure 6). 22 2904833 23 6-Stabilité du Picoqreen au cours du temps La répétabilité des mesures est la suivante : Conc ng/ml 5 moyenne 4,5 Ecart type 0,026 CV % 0,59 5 CV% = (écart-type/moyenne)xl 00 Leur reproductibilité est la suivante : Conc ng/ml 2 60 moyenne 5,1 66,85 Ecart type 0, 9 2, 96 CV % 5,57 4,43 10 La précision de la technique est acceptable pour l'utilisation en biologie clinique b-Qualité de la technique en fluorescence synchrone 15 1- Précision Le test de précision inclus les tests de répétabilité et de reproductibilité. Répétabilité 20 Le test a été réalisé en mesurant à 10 reprises, le même jour avec la même préparation de réactifs sur les différents types d'échantillons. Trois standards de concentrations différentes ont été utilisés par les Inventeurs ainsi que deux échantillons plasmatiques de patients : le premier a été 25 congelé une semaine, le second a été dosé sur du plasma frais. Les résultats exprimés en CV% ((écart-type/moyenne)*100) sont reportés dans le tableau suivant : 2904833 24 Type d'échantillon CV % Standard 1 (5 ng/ml) 6,7 Standard 2 ( 50 ng/ml) 2,4 Standard 3 ( 100 ng/ml) 2,3 Patient 1 (congelé) (215 2,8 ng/ml) Patient 2 (frais) (1110 ng/ml) 3,5 Reproductibilité 5 Le test a été réalisé en dosant à 20 reprises, 20 jours différents, avec des réactifs reconstitués chaque jour. Trois standards de concentrations différentes ont été utilisés par les Inventeurs, ainsi qu'un échantillon plasmatique congelé par aliquotes. Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : 10 Type d'échantillon CV Standard 1 (5 ng/ml) 15 Standard 2 (50 ng/ml) 2,4 Standard 3 (100 ng/ml) 5,9 Patient 1 (congelé) (245 ng/ml) 4,8 2Exactitude Le test a été réalisé de la façon suivante. Deux échantillons d'ADN purifiés ont 15 été dosés par une technique photométrique (260 nm) (corrigée de la présence d'ARN ou de protéines). Ces valeurs mesurées servent de référence au dosage. Ces ADN purifiés ont ensuite été dosés par la méthode de fluorimétrie synchrone. Le tableau suivant reporte l'exactitude de la méthode exprimée en pourcentage d'ADN retrouvé par rapport à la méthode photométrique. 20 2904833 25 Concentration en ng/ml % exactitude 15 102 77 106 159 93 3-Seuil de détection Le seuil de détection est calculé de la façon suivante. Il a été procédé à la 5 mesure de 20 échantillons ne contenant que du tampon TBE 1X. La moyenne de ces dix déterminations est ensuite calculée, à laquelle est ajouté 3 fois l'écart type des mesures obtenues. Le seuil ainsi mesuré est de 3,5 ng/ml 4-Seuil de sensibilité La première concentration d'ADN détectable avec une précision suffisante de 20% est de 4 ng/ml. Elle s'avère relativement satisfaisante. En effet, la concentration 15 plasmatique d'un sujet sain est environ 2 à 6 ng/ml d'ADN circulant. En clinique, les valeurs pathologiques sont très supérieures à ces valeurs normales. 5-Test de linéarité 20 Dès 4 ng/ml d'ADN la technique est linéaire jusqu'au moins 5000 ng/ml (Figure 7). c-Qualité de la technique par mesure des trois points de fluorescence. 25 Les résultats obtenus par cette méthode sont en tous points identiques à ceux de la technique en fluorescence synchrone (Fiqure 13). Conclusion : ces premiers essais indiquent que les méthodes en fluorimétrie synchrone ou par mesure des trois points de fluorescence sont des techniques 30 fiables et utilisables en biologie clinique. Ces résultats sont comparés, dans la suite, avec ceux de la PCR quantitative. 10 2904833 26 d-Dosage de l'ADN circulant par la méthode de fluorimétrie synchrone dans différents cancers (prostate, côlon) 5 Dans un premier temps, des travaux ont été effectués sur des même extraits d'ADN afin de valider la méthode sur des extraits purifier et vérifier sa pertinence par rapport au dosage de référence : la PCR quantitative. Puis, dans un second temps, cette méthode a été validée directement sur des plasmas de patients, toujours en comparaison avec la technique de référence. 10 1Corrélations PCR vs. Fluorimétrie sur ADN extrait à l'aide de kit dans différents cancers -Cancer de la prostate 15 La corrélation est excellente, cependant on note une déformation du nuage de points pour les basses concentrations d'ADN (Figure 8). Cette déformation est analysée par le graphique des rapports entre les résultats présenté dans la Figure 9. On note une forte déformation du nuage de 20 point. En dessous d'une valeur de 100 copies de génome/ml, la technique de PCR semble manquer de sensibilité, à l'inverse de la fluorimétrie synchrone. Au-delà de ce seuil de 100 copies de génome/ml la corrélation reste excellente (Figure 10) 25 -Cancers de la prostate et du côlon à différents stades Une seconde série de mesure a été réalisée sur des prélèvements de malades présentant soit des cancers de la prostate soit de cancers du colon. Comme dans la série précédente on retrouve le seuil de 100 copies de génome/mi pour la 30 technique de PCR quantitative (Fiqure 11) 2- Corrélations PCR vs. Fluorimétrie sur ADN plasmatique L'étude a été également validée sur des échantillons biologiques n'ayant subit 35 aucune préparation. Les Inventeurs ont utilisé des plasmas congelés de patients 2904833 27 soufrant de cancer de la prostate ou du colon. Des échantillons présentant un nombre de copies de génome ? 100 copies/ml (n=32) ont été plus particulièrement utilisés et l'ADN a été quantifié directement dans le plasma (Figure 12). On observe que la corrélation est excellente et de même niveau que celle 5 obtenue avec de l'ADN extrait. e-Dosage de l'ADN circulant par la méthode des trois points de fluorescence dans différents cancers (prostate, côlon) 10 En parallèle à la mesure en fluorimétrie synchrone, les Inventeurs ont dosé par la méthode des trois points de fluorescence, la concentration en ADN circulant de chacun des plasmas mesurés sans préparation préalable de l'ADN (Figure 13). On observe que la corrélation est excellente et tout à fait identique à celle obtenue avec la fluorescence synchrone. Les deux nouvelles techniques de dosage 15 de l'ADN circulant sont donc tout à fait équivalentes et parfaitement corrélée à la technique de référence : la PCR quantitative. DISCUSSION 20 La PCR quantitative est actuellement la méthode la plus utilisée pour mesurer la quantité d'ADN circulant. Cependant cette méthode est relativement coûteuse, spécialisée et peu compatible avec une utilisation dans des centres d'urgence médicale. Par son principe même, la PCR amplifie de façon très importante tout l'ADN 25 présent dans l'échantillon. Elle ne peut donc que très difficilement faire la différence entre des échantillons de patients présentant de faibles variations de leur concentration en ADN, car ceux-ci vont être amplifiés dans des proportions à peu près identiques. La technique de PCR manque donc, dans ce cas, de sensibilité. Les patients doivent présenter des augmentations nettes de leur concentration en ADN 30 pour pouvoir être distingués des témoins ou distingués entre eux. De plus, en PCR quantitative, la mesure de fluorescence s'effectue dans un milieu réactionnel complexe, riche en enzyme et en macromolécules (amorces, fragment d'ADN purifié, fluorophore,..) qui risquent d'induire un grand nombre d'interférences dans le dosage. En effet, on sait que la lecture en fluorescence est 2904833 28 d'autant moins performante qu'elle s'effectue dans un milieu plus concentré. Les principales interférences possibles dans ce contexte sont les suivantes. L'auto-inhibition. II peut y avoir auto-inhibition de la fluorescence aux fortes concentrations, du fait de l'augmentation du nombre de collisions entre les 5 molécules, qui dissipent l'énergie reçue ou bien du fait de la formation de polymères non fluorescents. - L'inhibition de fluorescence ou quenching. En milieu complexe très concentré ou hétérogène, on risque également d'avoir un phénomène d'inhibition de fluorescence ou quenching, consécutif à une interaction de la 10 molécule fluorescente avec le solvant ou avec un autre soluté. Le rendement de fluorescence et/ou la durée de fluorescence sont diminués. D'un point de vue pratique cela signifie que le composé est moins fluorescent lorsqu'il est en présence d'une substance inhibitrice. C'est un des inconvénients lors d'un dosage dans un milieu biologique préalablement non purifié. De plus 15 l'extinction n'est pas toujours uniforme. - Le fading (photobleaching). C'est la perte de la fluorescence du fluorochrome par hyperexcitation lumineuse aboutissant à la destruction de la molécule ou à son absence de réaction par couplage de sa forme réactive avec une autre molécule. 20 - La compétition. Elle est due à l'auto fluorescence de certaines substances ou de contaminants de la verrerie. En PCR quantitative si l'ADN est dosé à peu près à la même concentration qu'avec la technique de fluorescence synchrone, le fluorophore y est 1000 fois plus concentré. De plus, les molécules d'amorce et de polymérases sont à des 25 concentrations suffisantes pour interférer elles-mêmes sur la lumière émise. Cette forte concentration moléculaire dans le milieu favorise également l'effet Rayleigh, lié la dispersion de la lumière incidente par les molécules en solutions. Et ceci risque d'être d'autant plus sensible que les longueurs d'ondes d'excitation et 30 d'émission sont proches, séparées seulement de 45 nm, ce qui apporte des contraintes techniques importantes dans le choix del'intensité de la lampe et le choix des fentes du lecteur. 2904833 29 Tous ces éléments ont incité les Inventeurs à réfléchir à une nouvelle technique basée sur un dosage en milieu beaucoup plus dilué. Le choix d'une technique en fluorescence classique permet d'augmenter considérablement la sensibilité du dosage, et d'éviter les phases d'extraction et 5 d'amplification qui sont celles qui apportent le plus de risques d'interférences, de variabilité technique et d'erreurs de manipulation. Le choix de la fluorimétrie synchrone, assure une excellente spécificité au dosage et en autorisant l'utilisation des longueurs d'ondes maximales d'excitation et 10 d'émission permet d'augmenter encore la sensibilité du dosage. La mise en oeuvre de cette méthode a permis de constater l'existence de trois points clés dans le spectre synchrone. L'analyse de l'ensemble des données a en outre permis aux Inventeurs de s'assurer de la stabilité de ces points. Ils sont toujours présents, et toujours aux même longueurs d'onde. Une nouvelle stratégie de 15 mesure a donc été développée en ne mesurant plus que trois intensités de fluorescence et en développant une formule de calcul permettant de mesurer avec précision la fluorescence spécifique à l'ADN. Cette nouvelle technique possède les mêmes excellentes qualités analytiques que celle développé en fluorimétrie synchrone notamment en ce qui concerne sa sensibilité. 20 Une meilleure sensibilité du dosage de l'ADN permet de détecter des augmentations dans le suivi des malades plus précocement. Ceci est particulièrement vrai chez le sujet âgé (>65 ans) où il semblerait (données non montrées) que les valeurs normales augmentent progressivement avec l'âge. Cela 25 permettra vraisemblablement d'étendre le champ d'application de ce dosage. Les techniques développées sont très satisfaisantes. Elles présentent une bonne précision et un domaine d'analyse tout à fait en rapport avec les besoins cliniques. Elles sont, de plus, très bien corrélées à la technique la plus couramment 30 utilisée : la PCR quantitative en temps réel. Les différentes corrélations réalisées nous assurent de l'excellente pertinence clinique de nos résultats. Le seuil de 100 copies de génome/ml est proche de celui de 150 copies de génome/ml qui est actuellement le seuil de décision pathologique en PCR quantitative. Cela correspond 2904833 30 environ à 15 000 copies de génome/ml d'ADN par notre technique, valeur retrouvée également dans la littérature. Les Inventeurs ont donc pu définir deux nouvelles techniques qui permettent 5 d'éliminer les étapes d'extraction et d'amplification d'ADN, ce qui a permis de réduire considérablement le temps d'analyse, ramené à quelques minutes. 2904833 REFERENCES • Anker P. et al. Detection of Circulating Tumour DNA in the blood (plasma /serum) of Cancer Patients. Cancer Metastasis Rev 1999, 18:65-73. 5 Boddy J.L. et al. Prospective Study of Quantitation of plasma DNA Levels in Diagnosis of Malignant versus Benign Prostate Disease. Clinical Cancer Res 2005, 11:1394-1399. • Chang C.P. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta 2003, 327:95-101. 10 • De Kok JB et al. Detection of Tumour DNA in Serum of Colorectal Cancer Patients. Scand J Lab Clin Invest 1997,57:601-4. • Fournié G.J. et al. Plasma DNA as a Marker of Cancerous Cell Death : Investigation in Patients Suffering from Lung Cancer in Nude Mice Bearning Human Tumours. 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Procédé de détermination de la quantité d'acide nucléique présente dans un échantillon, dans lequel : - on ajoute un fluorophore à l'échantillon, - on mesure des intensités de fluorescence émises par le fluorophore à au moins trois longueurs d'onde d'émission en réponse à des stimulations lumineuses à au moins trois longueurs d'onde d'excitation respectivement, et - on déduit des au moins trois intensités de fluorescence mesurées la quantité d'acide nucléique présente dans l'échantillon. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'acide nucléique est d'origine naturelle ou synthétique. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'acide nucléique est de l'ADN ou de l'ARN. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel l'échantillon est d'origine naturelle ou synthétique. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon est un échantillon biologique ou un dérivé d'échantillon biologique. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'échantillon dérive d'un échantillon 25 biologique par dilution. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel le fluorophore est un agent intercalant d'acide nucléique. 30 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le fluorophore est le Picogreen ([N-bis-(3-diméthylaminopropyl)-amino]-4-[2,3-dihydro-3-méthyl-(benzo-1, 3-thiazol-2-yl)-méthylidène]-1-phényl-quinoliniumj+). 2904833 34 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel on mesure les intensités de fluorescence, 12 et 13, émises par le fluorophore à trois longueurs d'onde d'émission fil, 12 et 13 en réponse à des stimulations lumineuses à trois longueurs d'onde d'excitation, 1'1, 1'2 et 1'3, respectivement, avec Il 10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel la quantité d'acide nucléique est déduite de la valeur de F suivante : F=I2ù I1ùI3 ùM3ù2Il Xiù X1 11. Procédé selon la revendication 10, dans laquelle la quantité d'acide nucléique dans l'échantillon est déduite de la valeur de F à l'aide d'une courbe étalon. 12. Procédé selon l'une des revendications 9 à 11, dans lequel le fluorophore est le 15 Picogreen et les longueurs d'onde sont les suivantes : I'l=472 5nm X1=502 5nm 1'2=496 5nm =526 5nm 1'3=538 5 nm 13= 568 5 nm 20 13. Fluorimètre adapté à la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini dans l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend : -un ou plusieurs moyens d'excitation lumineuse à trois longueurs d'onde d'excitation 1'1, 1'2 et 1:3 ; - un ou plusieurs moyens de mesure de l'intensité de fluorescence émise, Il, 12 et 13, 25 à trois longueurs d'onde d'émission Il, 12 et 13 ; - un calculateur permettant de calculer une valeur F suivante : F=Izù I1ùI312_L13ù2.3Il 14. Fluorimètre selon la revendication 13, dans lequel les longueurs d'onde 30 d'excitation et d'émission sont les suivantes : 1'1 = 472 5 nm Il = 502 5 nm 10 35 2904833 X'2=496 5 nm 12=526 5 nm Â'3= 538 5 nm X3=568 5 nm