Brevet FR2902793A1 — publié le 20071228

COMPOSITION DE GEL D'ELECTROPHORESE A BASE DE MONOMERE NAT ET UTILISATION DUDIT GEL Domaine technique : La présente invention décrit une composition particulière de gel d'électrophorèse à base de monomère NAT (N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane) ainsi que l'utilisation avantageuse d'un tel gel notamment dans les techniques de caractérisation associées au transfert et/ou à l'extraction de molécules biologiques telles que des protéines ou des peptides. Technique antérieure : L'électrophorèse sur gel est une technique de séparation très couramment utilisée permettant de séparer sous l'action d'un champ électrique des mélanges complexes de molécules biologiques (ADN, ARN, protéines, enzymes), naturelles (polysaccharides) ou synthétiques (polyéléctrolytes). Selon la nature du gel et les conditions d'analyse, il est ainsi possible de séparer des protéines en fonction de leur taille, leur charge ou encore leur forme. Différentes techniques de coloration permettent ensuite de visualiser directement les protéines dans le gel et d'obtenir ainsi une représentation de l'échantillon initial. Toutefois, l'étape de séparation n'est souvent qu'une étape préliminaire permettant d'isoler dans le gel d'électrophorèse une ou plusieurs protéines recherchées en vue d'études ou de caractérisations ultérieures (purification, identification, dosage immunologique, détermination de l'activité biologique, etc.). Pour toutes ces applications, il est essentiel de pouvoir extraire les protéines de leur milieu de séparation, à savoir du gel d'électrophorèse, de manière efficace et si possible sans altérer leurs propriétés biologiques.30 Les protéines prisonnières du gel d'électrophorèse à l'issue de l'étape de séparation sont généralement extraites selon trois méthodes principales. La première méthode appelée western blotting consiste à transférer sous l'action d'un champ électrique les protéines sur une membrane de cellulose ou de PVDF afin de pouvoir ensuite les quantifier et les caractériser précisément. La seconde méthode appelée électroélution consiste à découper la portion de gel d'électrophorèse contenant la protéine recherchée et à la soumettre à un champ électrique afin de la récupérer dans un solvant approprié. Enfin, la troisième méthode consiste à immerger le gel d'électrophorèse ou la portion de gel concernée dans un mélange de solvant aqueux et organique approprié et de laisser diffuser les protéines hors du gel. Quelle que soit la méthode utilisée, cela suppose que les molécules sont suffisamment mobiles pour sortir librement du gel d'électrophorèse, soit sous l'action d'un champ électrique externe, soit sous l'action d'un solvant. Ce phénomène est étroitement lié à la force appliquée, à la nature et la taille des molécules considérées ainsi qu'à la nature du gel d'électrophorèse, et en particulier à sa porosité. Il est bien connu que quelle que soit la méthode utilisée, les rendements d'extraction ou de transfert sont extrêmement variables et dans tous les cas la quantité de molécules extraites est souvent insuffisante. Cela se traduit par une quantité plus ou moins importante de molécules qui restent prisonnières dans le gel d'électrophorèse et qui sont perdues pour les étapes ultérieures de caractérisation. Par exemple, il est connu que les protéines de poids moléculaires élevés sont extrêmement difficiles à transférer sur une membrane lors d'une expérience de western blotting. Les rendements de transfert sont généralement faibles, et n'autorisent pas une quantification précise de la protéine, surtout si celle-ci est initialement présente en faible quantité dans le gel. Il en est de même dans le cas d'une expérience de gel bidimensionnel (électrophorèse 2D) où il est nécessaire, après la digestion enzymatique, d'extraire les peptides du gel afin de pouvoir identifier les protéines correspondantes par spectrométrie de masse. Les rendements d'extraction étant faibles, variant généralement entre 20% et 50%, il arrive que les peptides ne soient pas en quantités suffisantes pour être clairement identifiés, ou plus grave conduire à des erreurs d'identification. Cela constitue une des limitations majeures de la technique d'électrophorèse 2D, la seule méthode pourtant disponible permettant l'analyse d'échantillons complexes de protéines. Ces deux exemples montrent clairement l'intérêt de pouvoir améliorer les étapes d'extraction et de transfert des molécules après séparation, qui constituent actuellement une limitation sérieuse à la technique d'électrophorèse. Les gels d'électrophorèse utilisés pour la séparation des protéines sont des gels poly(acrylamide) obtenus par polymérisation radicalaire de l'acrylamide en présence d'un agent de réticulation, généralement le N,N'-methylenebisacrylamide (Bis), donnant ainsi naissance à un réseau polymère tridimensionnel relativement dense. Les gels poly(acrylamide) sont faciles à préparer, de faible coût et possèdent un excellent pouvoir résolutif pour la séparation des protéines, mais également des acides nucléiques. Ces dernières années, des améliorations significatives ont été proposées dans la littérature dans le but d'améliorer les performances des gels d'électrophorèse en terme de résolution, de comportement mécanique (élasticité) ou encore de stabilité. En effet, des travaux décrivent, par exemple, l'utilisation de nouveaux monomères hydrophiles pour la synthèse des gels (US 5,055,517 Shorr et al. ; WO 93/11174 Righetti et al. ; US 6,117,293 Zhang et al.), l'ajout d'additifs et de polymères divers (US 5,840,877 Kozulic ; US 5,159,049 Allen et al.) ou encore l'utilisation de tampons spécifiques (US 6,733,647 Chan ; US 6,783,651 Updike). Si très peu de ces nouvelles formulations ont finalement donné lieu à des produits commerciaux, aucune d'entre elles n'a en tout cas permis d'oeuvrer dans le sens d'une amélioration de l'étape d'extraction des molécules préalablement séparées. Au contraire, la modification de la chimie des gels est souvent obtenue au détriment d'une extraction efficace. Le monomère NAT (N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane) a été proposé 30 comme une alternative très intéressante à l'utilisation de l'acrylamide pour la préparation de gels d'électrophorèse destinés à la séparation d'acides nucléiques et à la focalisation isoélectrique des protéines (US 5,319,046 Kozulic). En plus de posséder une toxicité plus faible que l'acrylamide, il a en effet été montré que le monomère NAT permet de préparer des gels d'électrophorèse plus hydrophiles et de plus grande porosité que les gels poly(acrylamide). Dans certaines conditions, il a été montré que les gels poly(NAT) (SpreadexTM, Elchrom Scientific) sont capables de nettement surpasser les performances des gels poly(acrylamide) et de résoudre des fragments d'ADN possédant une paire de base de différence sur une distance de séparation inférieure à 10cm (US 5,840,877 Kozulic). Il est à noter que des gels encore plus hydrophiles, préparés à partir de nouveaux monomères acryliques, ont également montré des propriétés particulièrement adaptées pour la séparation de molécules biologiques de hauts poids moléculaires (US 5,185,466 Kozulic ; US 5,202,007 Kozulic). Toutefois, il a été observé que ces gels de nouvelle génération, aussi bien à base du monomère NAT que des nouveaux monomères acryliques cités précédemment, souffrent de certaines limitations relatives à leur comportement mécanique ainsi qu'à une résolution souvent inférieure aux gels poly(acrylamide) dans le cas de la séparation des protéines. Dans le contexte scientifique actuel, ou l'analyse protéomique occupe une part prépondérante, il y a donc un besoin évident pour de nouveaux types de gels permettant d'améliorer l'extraction et le transfert des protéines tout en garantissant des performances, au minimum comparables aux gels poly(acrylamide), indispensables à la technique d'électrophorèse, à savoir principalement le pouvoir résolutif, mais également le comportement mécanique (élasticité) et les propriétés optiques (transparence) du gel. C'est précisément l'objet de cette invention de repousser les limites actuelles de la technique d'électrophorèse en décrivant des compositions particulières de gels à base du monomère NAT capables de répondre aux exigences mentionnées précédemment. Exposé de l'invention : La présente invention est relative à une composition particulière de gel d'électrophorèse permettant d'améliorer de manière très significative l'extraction et le transfert des molécules biologiques après séparation tout en garantissant d'excellentes performances au niveau de la résolution ainsi qu'au niveau des propriétés optiques et mécaniques du gel d' électrophorèse. Dans ce but, l'invention concerne une composition de gel d'électrophorèse obtenu par polymérisation radicalaire du monomère NAT (N-acryloyltris(hydroxymethyl)aminomethane), d'un monomère additionnel et d'un agent de réticulation, caractérisée en ce que la teneur massique du monomère NAT (N-acryloyltris(hydroxymethyl)aminomethane) est comprise entre 20wt% et 70wt% et la teneur massique du monomère additionnel est comprise entre 30wt% et 80wt%, ce monomère additionnel pouvant être de type vinylique ou de l'acrylamide. Le gel d'électrophorèse obtenu peut être homogène et avoir une concentration en monomères unique dont la valeur est comprise entre 4 et 25%T ou composé d'un 20 gradient de concentration en monomères variable entre 4 et 25%T. La concentration en agent de réticulation peut être comprise entre 1 et 5%C, cet agent de réticulation pouvant être choisi dans le groupe comprenant le N,N'-methylenebisacrylamide (Bis), la piperazidine di-acrylamide (PDA), le N,N'-(1,2 25 dihydroxyethylene)bisacrylamide (DHEBA), le 2,2'-(Bisacrylamino)diethyl disulfide (BAC), l'ethylene diacrylate. La composition peut contenir un additif de type polymère préformé à une concentration massique comprise entre 0,05% et 5%, cet additif pouvant être un polymère synthétique 30 ou naturel, non chargé, choisi dans le groupe comprenant le polyacrylamide, le poly(N- 5 acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane)), la poly(vinylpyrrolidone), un dérivé de la cellulose, du dextran ou de l'agarose. Dans ce but également, l'invention concerne l'utilisation du gel obtenu pour des applications relatives à des étapes d'extraction et/ou de transfert de molécules biologiques contenues dans ledit gel après séparation, telles que des protéines ou des peptides, en vue d'études et/ou de caractérisations ultérieures, telles que purification, identification, dosage immunologique, détermination de l'activité biologique. Cette utilisation peut concerner des techniques de western blotting dans lesquelles le transfert des molécules biologiques sur une membrane est obtenu sous l'action d'un champ électrique, des techniques de purification des molécules biologiques dans lesquelles la récupération des molécules biologiques contenues dans ledit gel est obtenue par électroélution, ou encore des techniques d'identification des molécules biologiques nécessitant la récupération des molécules contenues dans ledit gel par diffusion de solvant. Cette utilisation concerne également des techniques d'électrophorèse bidimensionnelle. Description sommaire des dessins : La présente invention et ses avantages apparaîtront mieux dans la description suivante de plusieurs modes de réalisation donnés à titre d'exemples non limitatifs, en référence à des expériences comparatives dont certains résultats sont représentés dans les figures annexées dans lesquelles : la figure 1 représente la fluorescence mesurée sur le gel de l'invention comparé à un gel connu, selon l'exemple 3 ci-après, la figure 2 représente la fluorescence résiduelle mesurée sur les deux gels dans le cas de l'exemple 3 ci-après, 25 les figures 3 et 4 représentent les spectres MALDI-TOF obtenus respectivement pour le gel de l'invention et pour un gel connu, selon l'exemple 4 ci-après, et les figures 5 et 6 montrent les images respectivement d'un gel 2-D poly(acrylamide) connu et d'un gel 2-D poly(acrylamide-co-NAT) de l'invention, ainsi que la position des spots sélectionnés sur chaque gel et notés A, B, C, D, E et F, selon l'exemple 5 ci-après. Description de l'invention : La présente invention concerne une composition particulière de gel d'électrophorèse incluant le monomère NAT (N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane), un monomère additionnel et un agent de réticulation, complété le cas échéant par divers additifs, permettant la séparation de molécules biologiques telles que des protéines ou des peptides, et présentant des performances supérieures aux gels d'électrophorèse actuels pour des applications relatives à l'extraction et au transfert de ces protéines après l'étape de séparation. Les gels décrits ci-après sont préparés simplement par polymérisation radicalaire du monomère NAT, du monomère additionnel et de l'agent de réticulation en présence ou non d'autres additifs, tous ces composés étant préalablement solubilisés en phase aqueuse. Les gels sont obtenus selon un procédé classique qui consiste à ajouter au mélange aqueux initial un amorceur de polymérisation qui pourra être par exemple de l'ammonium persulfate (APS) dont la décomposition pourra être catalysée par le N,N,N',N'-tetramethylethylendiamine (TEMED). La qualité et les performances des gels sont étroitement associées au degré de pureté des monomères utilisés pour les obtenir. En particulier, le monomère NAT obtenu par réaction du chlorure d'acryloyle avec le tris(hydroxymethyl)aminomethane en présence d'une base forte, avantageusement l'hydroxyde de potassium, doit ensuite subir les étapes de purification nécessaires à l'obtention d'une très grande pureté (US 5,319,046 Kozulic). Le monomère additionnel peut être choisi parmi différents types de dérivés acryliques mono ou di-substitués suffisamment hydrophiles pour que sa copolymérisation avec le monomère NAT permette la formation d'un gel possédant les propriétés souhaitées. Le monomère additionnel préférablement utilisé dans la présente invention est 1' acrylamide. On définit habituellement la concentration d'un gel, notée %T, comme la somme des masses de monomères et de l'agent de réticulation (c'est à dire la masse totale de solide) contenus dans 100 ml de solution. Ici, la concentration totale du gel est de préférence comprise entre 4%T et 25%T. Les performances du gel dépendant étroitement de sa composition, et principalement de sa teneur en monomères NAT et acrylamide, seule l'utilisation de ces monomères dans des proportions bien définies permet d'obtenir les gels possédant les propriétés souhaitées. Dans la présente invention, la teneur massique du gel en monomère NAT représente entre 20% et 70% et la teneur massique du gel en monomère additionnel représente entre 30% et 80% de la quantité totale de monomères utilisés. Différents agents de réticulation peuvent être utilisés pour la formation du gel. On citera le N,N'-methylenebisacrylamide (Bis) et la piperazidine di-acrylamide (PDA) comme les deux agents de réticulation particulièrement adaptés à la synthèse des gels à base de NAT, mais également le N,N'-(1,2 dihydroxyethylene)bisacrylamide (DHEBA), le 2,2'- (Bisacrylamino)diethyl disulfide (BAC) ou encore l'ethylene diacrylate. La concentration en agent de réticulation dans le gel, habituellement notée %C, s'exprime par le pourcentage massique de l'agent de réticulation par rapport à la quantité totale de monomères. La concentration en agent de réticulation dans le gel est de préférence comprise entre 1%C et 5%C.30 Les additifs qui peuvent être présents dans la formulation du gel peuvent être classés en deux catégories. La première catégorie concerne des molécules simples de types tensioactifs (par exemple sodium dodecylsulfate) ou agent de dénaturation (par exemple urée) utilisées habituellement pour assurer des conditions dénaturantes si celles-ci sont nécessaires lors de la séparation des molécules. La deuxième catégorie concerne des composés macromoléculaires de type polymères naturels ou synthétiques dont le rôle est d'améliorer la résolution et/ou de renforcer la structure du gel afin d'assurer de bonnes propriétés mécaniques (élasticité) nécessaires à la manipulation du gel. L'ajout de polymères dans la formulation du gel dans le but d'en améliorer les propriétés mécaniques est principalement utilisé pour la préparation de gels de grande taille, plus fragiles. Dans ce cas, les additifs peuvent être des dérivés de polysaccharides de type agarose, de cellulose, de dextran, ou de polymères linéaires synthétiques de type poly(acrylamide), poly(NAT) ou encore poly(vinylpyrrolidone). Ces additifs de type polymères sont présents dans le gel à une concentration massique comprise de préférence entre 0.05% et 5%. Les gels d'électrophorèse sont obtenus selon un procédé de polymérisation radicalaire. La polymérisation peut être initiée comme décrit précédemment par le couple amorceur(APS)/catalyseur(TEMED), et dans ce cas se dérouler à température ambiante ou à température modérée afin d'éviter une polymérisation trop rapide néfaste à la formation d'une structure tridimensionnelle régulière. Toutefois, les systèmes d'amorçage thermique, chimique ou photochimique classiquement décrits pour la synthèse de gels peuvent également être utilisés. A l'issue de la polymérisation, les gels d'électrophorèse peuvent être homogènes, c'est-à-dire de concentration %T unique ou peuvent être composés d'un gradient de concentration allant de 4%T à 25%T. Selon le type d'application souhaité et l'appareillage à disposition, les gels 30 d'électrophorèse peuvent être préparés entre deux plaques de verre, dans des cassettes plastiques (disponibles commercialement) ou sur un fin support plastique qui permet une manipulation aisée. Ces gels peuvent être utilisés pour l'électrophorèse en mode vertical ou en mode horizontal. A la suite d'expérimentations, il a été découvert que ces gels d'électrophorèse à base de NAT repoussent les limitations actuelles de la technique d'électrophorèse étant donné que les protéines sont extraites du gel de manière plus rapide et surtout beaucoup plus efficace, tout en garantissant d'excellentes propriétés au niveau de la résolution, de la sensibilité de détection, du comportement mécanique et des propriétés optiques. Ces performances uniques sont dues à la combinaison des monomères NAT et acrylamide dans des proportions bien déterminées et définies ci-dessus, pour lesquelles les propriétés hydrophiles et la porosité du gel sont optimales. C'est pourquoi, les gels à base de NAT dont la composition est décrite ci-dessus trouvent naturellement un domaine d'application privilégié dans les techniques actuelles de caractérisation d'échantillons biologiques complexes, et principalement le western blotting et l'électrophorèse bidimensionnelle (électrophorèse 2D). Exemples comparatifs : Les exemples suivants sont donnés afin d'illustrer les performances des gels d'électrophorèse à base de NAT selon l'invention en comparaison avec des gels connus. Ils ne sont en aucun cas donnés pour limiter les domaines d'application relatifs à la présente invention. Préparation des gels d'électrophorèse : Dans les exemples 1 à 4, les gels d'électrophorèse sont préparés dans des casettes plastiques disponibles commercialement (Novex û Invitrogen ) permettant d'obtenir des gels de dimensions suivantes longueur 80mm, largeur 78mm et épaisseur lmm. Les gels à base de NAT sont obtenus dans un système discontinu de type Laemmli (Laemmli et al. Nature 277: 680-685 (1970)) comprenant un gel de séparation (0.375M Tris, pH=8.8) surmonté d'un gel de concentration (0.125M Tris, pHû6.8). La composition du tampon d'électrophorèse est 250mM Tris, 192mM glycine et 0.1%(wt/v) SDS. La solution du gel de séparation est d'abord préparée par dissolution des monomères NAT et acrylamide dans un rapport massique déterminé, de l'agent de réticulation N,N'-methylenebisacrylamide (Bis) dans les quantités nécessaires de tampon de séparation concentré 4x (1.5M Tris, pH=8.8) et d'eau distillée ultra pure. La solution est ensuite filtrée puis dégazée sous vide pendant 20min. La polymérisation débute lors de l'ajout de 41/ml d'une solution de persulfate d'ammonium (11%wtly) et 0.50/m1 de TEMED. La solution est alors rapidement introduite dans la cassette et couverte par quelques millilitres d'une solution saturée de n-butanol saturée en eau. La polymérisation se déroule à température ambiante pendant 2heures. La solution du gel de concentration est préparée de manière similaire en utilisant le tampon approprié 4x (0.5 M Tris, pH=6.8). Après filtration, dégazage et avoir rincer la solution de butanol protégeant le gel de séparation, la solution du gel de concentration est introduite à son tour dans la cassette et polymérisée à température ambiante pendant 2 heures. Les gels obtenus peuvent être utilisés directement après la polymérisation. Dans le cas contraire, ils doivent être conservés à +4 C. Exemple 1 : Transfert de protéines par la technique de western blotting 20 Dans cet exemple, les gels d'électrophorèse 12%T poly(NAT-co-acrylamide) (NAT/acrylamide:70/30wt%) selon l'invention sont comparés à deux types de gels connus prêts à l'emploi et leaders du marché. D'après les informations disponibles, le premier type de gel connu, noté gel A , est un gel 10%T poly(acrylamide). Le second 25 gel, noté gel B , est un gel 10%T principalement à base d'acrylamide mais pouvant contenir un co-monomère dans une proportion non indiquée. Les deux gels connus sont de type Laemmli. L'objectif des expériences de blotting décrites dans la suite est d'évaluer et de comparer pour les trois types de gels l'efficacité du transfert de protéines purifiées sur une membrane cellulose. Pour les gels poly(NAT-co-acrylamide) de l'invention et les gels poly(acrylamide) connus et utilisés dans cet exemple, l'étape d'électrophorèse est réalisée dans des conditions identiques en utilisant un mélange de protéines disponibles commercialement, SigmaMarker Wide Range, contenant 13 protéines dans la gamme 6- 205 KDa. Une fois reconstituée dans son tampon de dénaturation (62mM Tris, pH8, 1mM EDTA, 3% sucrose, 0.5%DTT, 2% SDS et 0.005% bromophenol blue), la solution contient au total approximativement 2 à 3mg de protéines/ml. Un volume de 51_11 de cette solution est disposé dans chaque puit du gel. L'électrophorèse est effectuée à voltage constant (120V) dans un appareil XCell SureLockTM Mini-Cell (Invitrogen). La composition du tampon d'électrophorèse est 250mM Tris, 192mM glycine et 0.1%(wt/v) SDS. A ce stade, on observe que les temps d'électrophorèse sont similaires pour les trois types de gel, soit environ 100min pour que le bromophenol blue atteigne le bas du gel. Afin de vérifier la qualité de la séparation et pour disposer de gels de référence pour les expériences ultérieures de blotting, les gels sont colorés au bleu de coomassie (Brilliant Blue R250 - Sigma). Les résultats font apparaître, pour les trois gels, dix bandes extrêmement bien résolues et correspondant aux protéines suivantes, Myosin (rabbit muscle, 205KDa), (3-Galactosidase (E.coli, 116KDa), Phospharylase b (rabbit muscle, 97KDa), Fructose-6-phosphate Kinase (rabbit muscle, 84KDa), Albumine (bovine serum, 66KDa), Glutamic Dehydrogenase (bovine liver, 55KDa), Ovalbumine (chiken egg, 45KDa), Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (rabbit muscle, 36KDa), Carbonic Anhydrase (bovine erythrocytes, 29KDa), Trypsinogen (bovine, 24KDa). Les trois protéines de masse moléculaire inférieure à 24KDa ne sont pas résolues dans les gels utilisés dans cet exemple. L'étape précédente est reproduite à l'identique pour les trois gels, mais à l'issue de la séparation, les gels sont immédiatement soumis à une étape de western blotting. Le transfert des protéines est effectué dans l'appareil XCell IITM Blot module (Invitrogen ), à voltage constant (30V), dans un tampon Tris (25mM), glycine (120mM) contenant 20%v/v de méthanol. Le transfert est réalisé sur des membranes nitrocellulose de porosité 0.45 m. L'efficacité du transfert est évaluée en fonction du temps (10min, 20min, 40min et 60min) en effectuant la coloration des gels après l'étape de blotting et en comparant l'intensité des bandes résiduelles (protéines non transférées) avec les gels de référence. Dans chacun des cas, l'intensité des bandes est calculée très précisément à l'aide du logiciel d'imagerie TotalLabTM (Nonlinear Dynamics). Chaque expérience de blotting est reproduite à trois reprises afin d'obtenir une valeur moyenne significative. Les résultats rassemblés dans le tableau 1 indiquent un transfert des protéines beaucoup plus rapide et efficace dans le cas du gel poly(NAT-co-acrylamide), sûivi du gel B puis du gel A. Dans le cas du gel poly(NAT-co-acrylamide), le rendement de transfert est supérieur à 90% après 1 heure de blotting alors qu'il atteint environ 80% pour le gel B et seulement environ 50% pour le gel A. L'observation des gels après l'étape de blotting indique également un transfert homogène des protéines quelle que soit leur masse pour le gel poly(NAT-co-acrylamide), alors que les protéines résiduelles contenues dans les gels A et B correspondent principalement aux forts poids moléculaires. Les gels poly(NAT-co-acrylamide) semblent donc parfaitement adaptés au transfert de protéines de haut poids moléculaire. Tableau 1 Temps de blotting Rendement global du transfert (min) (%) Gel (NAT-co-acrylamide) Gel B Gel A 10 43 20 23 79 54 34 40 85 78 42 60 92 82 47 Exemple 2 : Influence de la composition des gels à base du monomère NAT sur l'efficacité du transfert des protéines Dans cet exemple, les gels d'électrophorèse 12%T poly(NAT-co-acrylamide) selon l'invention sont préparés avec des teneurs différentes en monomère NAT et sont comparés aux deux types de gels 10%T poly(acrylamide) connus A et B présentés dans 20 l'exemple 1. L'objectif est de montrer l'influence de la teneur en monomère NAT dans le gel poly(NAT-co-acrylamide) sur les performances de blotting. Les protocoles d'électrophorèse et de blotting décrits dans l'exemple 1 sont rigoureusement reproduits pour quatre gels poly(NAT-co-acrylamide) possédant les compositions NAT/acrylamide suivantes: 70/30, 60/40, 40/60 et 20/80 (wt/wt%). Les résultats obtenus montrent d'abord que les vitesses de migration relatives des protéines dans le gel (mobilités électrophorétiques) diminuent quand la teneur en acrylamide augmente. En effet, l'augmentation de la teneur en acrylamide a donc pour effet de diminuer la porosité du gel. Les résultats de blotting montrent que l'efficacité du transfert des protéines est étroitement liée à la composition du gel (tableau 2). Le rendement de transfert pour les gels poly(NAT-co-acrylamide) diminue lorsque que la teneur en acrylamide augmente. Tableau 2 Gel (NAT-co-acrylamide) 12%T Performances en blotting Teneur NAT/AA 70/30 gel (NAT/AA) >gelB > gelA 60/40 gel (NAT/AA) >gelB > gelA 40/60 gel (NAT/AA) = gelB > gelA 20/80 gelB > gel (NAT/AA) >gelA Exemple 3 : Quantification par fluorescence du transfert de la BSA (Bovine Serum Albumine) Dans cet exemple, les performances des gels d'électrophorèse 12%T poly(NAT-co- acrylamide) (NAT/acrylamide :70/30wt%) selon l'invention sont comparées aux gels 10%T poly(acrylamide) connus, dans le cas du transfert sur une membrane cellulose d'une protéinepurifiée, la BSA (Bovine Serum Albumine 66KDa, Sigma Aldrich) présente en faible concentration dans le gel. Le marquage préalable de la BSA avec un composé fluorescent (DyLight 547, Pierce Biotechnology) permet de quantifier très précisément l'efficacité du transfert. Le marquage s'effectue selon le protocole fournit qui préconise l'utilisation d'un rapport molaire DyLight 547/BSA : 4.3/1. L'électrophorèse de quantités variables de conjugués BSA-DyLight 547 (0.8ng, 1.5ng, 3ng, 6ng, 12ng et 25ng/puit) est ensuite réalisée à 120V. Le transfert de la BSA sur membrane nitrocellulose est ensuite effectué en tampon Tris (25mM), Glycine (120mM) contenant 20%v/v de méthanol, à voltage constant (80V) pendant 20min. La fluorescence émise par les conjugués BSA-DyLight 547 présents sur la membrane, mais également dans le gel après le blotting (florescence résiduelle), est finalement mesurée à l'aide d'un transillumateur TyphoonTM (Amersham). La figure 1 représente la fluorescence relative mesurée en unité arbitraire (u.a.) sur la membrane nitrocellulose après 20min de blotting à 80V en fonction de la quantité de BSA initialement contenue dans le gel 12%T poly(NAT-co-acrylamide) de l'invention (voir courbe E en trait plein) et dans le gel connu 10% poly(acrylamide) (voir courbe F en traits interrompus). La figure 2 représente la fluorescence résiduelle mesurée en unité arbitraire (u.a.) dans le gel 12%T poly(NAT-co-acrylamide) de l'invention (voir courbe G en trait plein) et dans le gel connu 10%T poly(acrylamide) (voir courbe H en traits interrompus) après 20min de blotting à 80V en fonction de la quantité de BSA initialement contenue dans les gels. Les résultats obtenus montrent des intensités de fluorescence mesurées sur la membrane cellulose très supérieures pour le gel poly(NAT-co-acrylamide) de l'invention traduisant une meilleure efficacité du transfert de la BSA (voir courbe E). La faible fluorescence résiduelle dans le gel poly(NAT-co-acrylamide) traduit un transfert pratiquement de toute la quantité de la BSA dans la gamme de concentration étudiée (voir courbe G). Exemple 4 : Extraction de peptides et identification par spectroscopie de masse Dans cet exemple, nous comparons les performances des gels 12%T poly(acrylamide-30 co-NAT) (acrylamide/NAT:60/40wt%) selon l'invention avec des gels 10%T poly(acrylamide) connus au cours d'une expérience d'extraction de peptides issus de la digestion trypsique de la protéine apolipoproteine AI precursor (30,7KDa, pI=5.6). On précise que les gels poly(acrylamide) connus sont préparés à partir d'une solution aqueuse de monomères acrylamide/N,N'-méthylènebisacrylamide disponible commercialement (Duracryl , Genomic Solutions). Un échantillon de plasma humain est préalablement purifié afin de s'affranchir au maximum de la présence d'albumine. L'échantillon est ensuite repris dans un tampon de dénaturation (62mM Tris-HC1, pH 6.8, 10% glycérol, 5mM DTT, 2% SDS et 0.005% bromophenol blue) et 15 l (environ 50 g de protéines) sont introduits dans chaque puit des gels. L'électrophorèse est effectuée à voltage constant (150V) pendant 80min. A l'issue de la séparation, les gels sont soumis à une étape de fixation (dans une solution 10%v/v éthanol, 7%v/v acide acétique) pendant 20min, suivie d'une étape de coloration au Sypro Ruby (Invitrogen ). Les gels sont finalement lavés à plusieurs reprises dans une solution 10%v/v éthanol, 7%v/v acide acétique jusqu'à obtenir l'intensité des bandes souhaitée. La bande correspondant à la protéine apolipoproteine AI precursor est découpée dans les deux gels. Les morceaux de gel contenant la protéine sont lavés à plusieurs reprises à l'aide d'une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM) et d'acétronitrile, séchés sous vide, puis réhydratés dans 300 d'une solution de trypsine (Promega ). La protéine est ainsi digérée toute la nuit à 37 C. Les peptides issus de la digestion sont séchés sous vide et finalement re-dissous dans une solution aqueuse d'acide formique. L'analyse des peptides issus des deux gels est réalisée par spectroscopie de masse de type MALDI-TOF (Voyager DE Pro, Applied Biosystem,). Les spectres obtenus sont calibrés en utilisant les pics de la trypsine m/z 842.41, 1045.56 et 2211.10, puis comparés aux bases de données Mascot et ProteinProspector. Les figures 3 et 4 représentent les spectres MALDI-TOF normalisés obtenus pour 30 l'apolipoproteine AI precurseur, respectivement pour le gel 12%T poly(acrylamide-co- NAT) (acrylamide/NAT:60/40wt%) de l'invention (figure 3, Imax3214) et le gel 10%T, poly(acrylamide) connu (voir figure 4, Imax 1175). L'intensité relative (en %) des pics peptidiques est en moyenne supérieure de trois unités de grandeur dans le cas du gel poly(acrylamide-co-NAT). Les résultats rassemblés dans le tableau 3 font apparaître l'identification de 33 peptides dans le cas du gel poly(acrylamide-co-NAT) contre seulement 11 peptides pour le gel poly(acrylamide), ce qui correspond à un taux de recouvrement de la séquence peptidique de l'apolipoproteine AI precurseur de 73% pour le gel poly(NAT-co-acrylamide) contre seulement 22% pour le gel poly(acrylamide). Tableau 3 Gel protéine Masse/PI Nombre de % recouvrement peptides identifiés Poly(acrylamide Apolipoprotein 30778/5.6 33 73 -co-NAT) A-I precurseur Poly(acrylamide) Apolipoprotein 30778/5.6 11 22 A-I precurseur Exemple 5: Electrophorèse bidimensionnelle. Extraction de peptides et 15 identification des protéines par spectroscopie de masse. Dans cet exemple, nous comparons au cours d'une expérience d'électrophorèse bidimensionnelle les performances d'un gel 12%T poly(acrylamide-co-NAT) (acrylamide/NAT:60/40wt% ; 0.8wt% dextran 500KDa) selon l'invention avec un gel 20 10%T poly(acrylamide) préparé à partir d'une solution acrylamide/N,N'-méthylènebisacrylamide commerciale connue (Duracryl , Genomic Solutions). Les gels 22x26cm sont préparés dans des cuves Daltsix Gel Caster (GE healthcare). L'échantillon de protéines utilisé pour cette étude provient de cellules mammaires cancéreuses de type MCF7. 25 Dans un premier temps, environ 204g d'échantillon sont soumis à une séparation par focalisation isoélectrique à une température de 20 C sur des bandes de gel à pH immobilisé, pH3-11, 18cm, NL (Immobiline DryStrip, GE healthcare). Le tampon de réhydratation dans lequel l'échantillon est dissous possède la composition suivante : 8M urée, 2% CHAPS, 20mM DTT, 0.5% IPG buffer pH 3-11. La focalisation isoélectrique est effectuée pendant 10 heures (Ettan IPG Phor 1EF System, GE healthcare), à 20 C et en utilisant un voltage maximum de 3500Volts. A l'issue de la séparation isoélectrique, les bandes sont équilibrées pendant 10min dans un tampon 50mM Tris-HC1 pH 6.8, 6M urée, 30% glycerol, 2%SDS, 2%DTT, puis pendant 15min dans un tampon 50mM Tris- HC1 pH 6.8, 6M urée, 30% glycerol, 2%SDS, 3%Iodoacétamide. Les bandes sont ensuite montées sur les gels et scellées par une solution d'agarose 1%. Les protéines sont alors séparées dans la seconde dimension selon leurs masses moléculaires à une température de 20 C, dans un appareil Ettan Daltsix (GE healthcare), à une intensité du courant de 15mA/gel pendant 16 heures dans un tampon d'électrophorèse 25mM Tris, 192mM Glycine, 0.1%SDS. Les gels sont ensuite soumis à une étape de fixation pendant 40min dans une solution 10%v/v éthanol, 7%v/v acide acétique, suivie d'une étape de coloration fluorescente au Sypro Ruby (Invitrogen ). Les gels sont finalement lavés à plusieurs reprises dans une solution 30%v/v méthanol, 10%v/v acide acétique jusqu'à obtenir l'intensité des spots désirée. Lors de la visualisation des gels, six spots possédant des positions identiques et non ambiguës sont sélectionnés sur les deux gels. Les morceaux de gel contenant les spots sont excisés, puis lavés à plusieurs reprises à l'aide d'une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM) et d'acétronitrile. Ils sont ensuite séchés sous vide, puis réhydratés dans une solution de bicarbonate d'ammonium (50 mM, pH8) contenant 10 g/ml de trypsine (Promega ). Les protéines sont ainsi digérées toute la nuit à 37 C. Les peptides issus de la digestion trypsique sont séchés sous vide et finalement redissous dans une solution aqueuse d'acide formique. L'analyse des peptides est réalisée par spectroscopie de masse de type MALDI-TOF (Voyager DE Pro, Applied Biosystem) en déposant sur la plaque MALDI un mélange de 11l d'échantillon peptidique et de 1 l de matrice acide 3,4-dihydroxybenzoique (10mg/ml, 50% méthanol, 50% H20). Les spectres obtenus sont calibrés en utilisant les pics de la trypsine m/z 842.41, 1045.56 et 2211.10, puis comparés aux bases de données Mascot et ProteinProspector. Les figures 5 et 6 montrent les images des gels 2-D poly(acrylamide) et poly(acrylamide-co-NAT), respectivement, obtenus à l'issue de l'étape de coloration fluorescente, ainsi que la position des six spots sélectionnés sur chaque gel et notés A, B, C, D, E et F. Le résultat de l'identification des spots par spectroscopie MALDI-TOF pour les gels poly(acrylamide) et poly(acrylamide-co-NAT) sont rassemblés dans le tableau 4. Tableau 4 gel gel poly(acrylamide) poly(acrylamide-co-NAT) spot Protéine nombre de recouvrement nombre de recouvrement (masse/PI) peptides séquence peptides séquence identifiés peptidique (%) identifiés peptidique (%) A H±transporting two- 20 32 31 56 sector ATPase beta chain precursor (humait) (56525/5.26) B chaperonin GroEL 21 30 38 71 human precursor (61016/5.7) C KRT8 protein 18 28 48 62 fragment (55874/5.62) D Actin cytoplasmic 2 24 49 28 72 (40194/5.55) E heat shock protein 27 Pas d'identification 16 63 (htunan) (2276815.98) F Nucleophosmin Pas d'identification 24 68 (30919/4.71 Dans le cas du gel poly(acrylamide) connu, seulement quatre protéines sont identifiées. L'analyse des deux protéines correspondantes aux spots E et F ne donne pas lieu à une identification car le nombre de peptides détectés est insuffisant. Dans le cas du gel poly(acrylamide-co-NAT) de l'invention, l'analyse des six spots donne lieu à l'identification des protéines correspondantes, avec dans chacun des cas, un nombre très important de peptides détectés garantissant des taux de recouvrement de la séquence peptidique très élevés (supérieur à 50%) et conduisant ainsi à une identification non ambiguë des protéines. Il apparaît clairement des exemples donnés ci-dessus que l'invention permet d'atteindre tous les buts fixés. La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation décrits, mais s'étend à toute modification et variante évidentes pour un homme du métier tout en restant dans l'étendue de ladite invention.15 Revendications 1. Composition de gel d'électrophorèse obtenu par polymérisation radicalaire du monomère NAT (N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane), d'un monomère additionnel et d'un agent de réticulation, caractérisée en ce que la teneur massique du monomère NAT (N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane) est comprise entre 20wt% et 70wt% et la teneur massique du monomère additionnel est comprise entre 30wt% et 80wt%. 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit gel d'électrophorèse est homogène et comporte une concentration en monomères unique dont la valeur est comprise entre 4 et 25%T. 3. Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit gel d'électrophorèse est composé d'un gradient de concentration en monomères variable entre 4 et 25%T. 4. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration en agent de réticulation est comprise entre 1 et 5%C. 5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le monomère additionnel est de type vinylique. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le monomère 25 vinylique est de l'acrylamide. 7. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent de réticulation est choisi dans le groupe comprenant le N,N'-methylenebisacrylamide (Bis), la piperazidine di-acrylamide (PDA), le N,N'-(1,2 2120dihydroxyethylene)bisacrylamide (DHEBA), le 2,2'-(Bisacrylamino)diethyl disulfide (BAC), l'ethylene diacrylate. 8. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient un 5 additif de type polymère préformé à une concentration massique comprise entre 0,05% et 5%. 9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit additif est un polymère synthétique ou naturel, non chargé, choisi dans le groupe comprenant le 10 polyacrylamide, le poly(N-acryloyl-tris(hydroxymethyl)aminomethane)), la poly(vinylpyrrolidone), un dérivé de la cellulose, du dextran ou de l'agarose. 10. Gel d'électrophorèse ayant une composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est préparé dans un tampon utilisé 15 pour la synthèse de gels d'électrophorèse. 11. Utilisation du gel d'électrophorèse ayant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour des applications relatives à l'extraction et/ou au transfert des molécules biologiques contenues dans ledit gel après séparation, en vue 20 d'études et/ou de caractérisations ultérieures, telles que purification, identification, dosage immunologique, détermination de l'activité biologique. 12. Utilisation selon la revendication 11, pour des techniques de western blotting dans lesquelles le transfert des molécules biologiques sur une membrane est obtenu sous 25 l'action d'un champ électrique. 13. Utilisation selon la revendication 11, pour des techniques de purification des molécules biologiques dans lesquelles la récupération des molécules biologiques contenues dans ledit gel est obtenue par électroélution. 30 14. Utilisation selon la revendication 11, pour des techniques d'identification des molécules biologiques nécessitant la récupération des molécules contenues dans ledit gel par diffusion de solvant. 15. Utilisation selon la revendication 11, pour des techniques d'électrophorèse bidimensionnelle. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, pour des molécules biologiques choisies dans le groupe comprenant les protéines et les peptides.10