Brevet FR2903998A1 — publié le 20080125

L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs de ELOVL5 pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies. Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à 200 g/cm2 mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation, un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres esthétiques, l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la flore bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de comédons et/ou de lésions acnéiques. Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé sous dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité de traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des androgènes sur la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des anti-androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires ou la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné incluent notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide. Cependant ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi, toute grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients masculins. Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des hormones stéroïdiennes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire, mais avec des effets secondaires réduits. La demanderesse a maintenant découvert que le gène ELOVL5 codant pour une élongase d'acide gras-CoA, était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler le gène ELOVL5 ou son produit d'expression, pour prévenir et/ou améliorer l'acné, ainsi que les désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de peau grasse. 2903998 2 Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle. La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou pronostic in 5 vitro, basées sur la détection du niveau d'expression ou d'activité de l'enzyme ELOVL5. 10 ELOVL5 L'enzyme ELOVL5 fait partie de la famille des enzymes ELOVL (pour Elongation of very long chain fatty acids ) qui comprend 5 membres identifié à ce jour chez l'homme. Récemment le gène codant pour l'enzyme ELOVL 3 a été étudié et il a été montré que le produit d'expression du gène ELOVL3 (ARNm) se retrouvait plus particulièrement au 15 niveau des glandes sébacées de la peau et des cellules épithéliales des follicules pileux (Westerberg et al. J. Bio. Chem.,2004, 279 vol 7, 5621-5629). ELOVL3 ne présente cependant pas d'homologie de séquence significative avec ELOVL5. C'est donc de manière surprenante que les inventeurs ont identifié ELOVL5, et non tant ELOVL3, comme étant impliquée dans les phénomènes d'acné. 20 Dans le contexte de l'invention, le terme gène ELOVL5 ou acide nucléique ELOVL5 signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la ELOVL5. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant une ELOVL5 hétérologue, par intégration génomique ou expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant 25 pour l'enzyme Une séquence d'ADNc humain de ELOVL5 est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il s'agit de la séquence NMO21814.3 dont la partie codante se situe de l'acide nucléique 337 à 1236. 30 Applications diagnostiques Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de suivi de l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. 2903998 3 L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène ELOVL5, est de mesurer la quantité d'ARNm correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité de la 5 protéine ELOVL5 peut être également envisagé. Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain . Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre cutané lié à une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même sujet à un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette mesure de la 10 différence de l'expression ou de l'activité de la ELOVL5 permet notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la ELOVL5, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce traitement. 15 Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses 20 promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un sujet contrôle. Là encore, l'expression peut être déterminée par un dosage de la protéine ELOVL5 par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène ELOVL5, est de mesurer la quantité d'ARNm 25 correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de l'activité du ELOVL5 peut être également envisagé. Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble cutané lié à une hyperséborrhée ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode, signifie un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette susceptibilité permet 30 la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance accrue des signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon biologique testé peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une biopsie. De 35 préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum. 2903998 4 Méthodes de criblage Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à 5 une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la ELOVL5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode permet donc de sélectionner les composés capables de 10 moduler l'expression ou l'activité de la ELOVL5, ou l'expression de son gène, ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés 15 associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes suivantes : a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; 20 c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou 25 de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de l'enzyme, sur 30 l'expression de son gène ou sur l'activité d'au moins un de ses promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle ou complète. Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence l'expression ou l'activité de la protéine ELOVL5, l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par rapport à 35 un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou plus. 2903998 5 Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement, par expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine ; Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ; Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à déclencher la 5 transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc indirectement la synthèse de la protéine correspondante). Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine naturelle ou avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de composés 10 chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non caractérisés, ou d'un mélange de composés. Différents techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression ou de l'activité de ELOVL5. 15 Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène ELOVL5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 20 Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT (chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur, ou de son 25 activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques, fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres. Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour ELOVL5, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer 30 l'expression dudit gène. La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule exprimant le gène ELOVL5 de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des organes 2903998 6 d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale, clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau. Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique hétérologue, codant pour ELOVL5, de préférence humain, ou de mammifère. 5 Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que par exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 L'acide nucléique peut être transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus, électroporation, ou microinjection. 10 Dans ces méthodes, l'expression du gène ELOVL5 peut être déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de traduction. Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm correspondant produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine 15 correspondante produite. L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection quantitative ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la RNase). Il peut être avantageux d'utiliser des marqueurs de 20 détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques ou autres ligands (par exemple, avidine/biotine). En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel ou par protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un ARNm connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une hybridation 25 spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué (radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un ARNm connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm recherché et la 30 sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie. 35 2903998 7 Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique du produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type polyclonal ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un anticorps polyclonal antiûELOVL5 peut, entre autres, être obtenu par immunisation d'un animal tel 5 qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme entière. L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de l'homme du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par exemple, produire des anticorps 10 monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSES pour E.coli). 15 Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase homogène; en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps de capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de polystyrène, ou des 20 particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques. Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de détection peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-anticorps formés. La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des protéines 25 isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la digestion 30 enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice 35 connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple Mascot). 2903998 8 Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme ELOVL5 et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer l'activité enzymatique. 5 L'enzyme ELOVL5 peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21. 10 La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la détermination de l'activité synthétase via l'utilisation de précurseurs radioactifs et la synthèse de produits radioactifs. Des dosages de l'activité enzymatique de ELOVL5 sont décrits dans la littérature (voir par exemple Westerberg et al. J. Bio. Chem.,2004, 279 vol 7, 5621-5629 ou Matsuzaka et al. 15 J Lip Re,2002, 43, 911-920). A titre d'exemple, l'enzyme ELOVL5 est incubée dans un milieu réactionnel (0.25m1 total) contenant 100 M de Tris-HCL, pH 7.4, 60 M de palmitoyl CoA, 500 M NADPH, et 30 g d'enzyme. Après 2 minutes de préincubation à 37 C, la réaction est initiée par l'ajout de 60 M de malonyl-CoA (contenant 0.0371Ci de [2-14C] malonyl-CoA) et laissée pendant 5 20 minutes à 37 C. L'incubation est terminée par l'ajout de 0.5m1 de 15% KOH méthanol et saponifiée à 65 C pendant 45 minutes. Les échantillons sont ensuite refroidis et acidifiés avec 0.5m1 de 5N HCI glacé. Les acides gras libres sont extraits du mélange trois fois avec 1 ml d'hexane. Les fractions extraites avec l'hexane sont séchées sous vide, et après addition de 3 ml de scintillant, la radioactivité incorporée est comptée. Les contrôles 25 sont réalisés en parallèle par incubation sans l'enzyme. Modulateurs de l'enzyme L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme humaine ELOVL5 susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes décrites ci-dessus pour la 30 préparation d'un médicament destiné au traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de l'enzyme humaine 35 ELOVL5, à un patient nécessitant un tel traitement. 2903998 9 L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme humaine ELOVL5, pour le traitement esthétique des peaux grasses. De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le terme inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou réduit 5 substantiellement l'activité enzymatique de ELOVL5. Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de préférence d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme (de manière irréversible ou non), comme des composés du type 10 inhibiteur compétitif. Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations en inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore moins de 0,01 M. Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-ELOVL5, de préférence un 15 anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir une concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de préférence d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml. Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne polypeptidique 20 substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci). Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent 25 être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou topique. De préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par voie orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques 30 ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection. Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement destinée au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme d'onguents, de 35 crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous forme de 2903998 10 suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la composition 5 pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion. La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la ELOVL5 allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de la composition. 10 La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou des combinaisons de ces additifs, tels que : - des agents mouillants; - des agents d'amélioration de la saveur; 15 - des agents conservateurs tels que les esters de l'acide parahydroxybenzoïque; - des agents stabilisants; - des agents régulateurs d'humidité; - des agents régulateurs de pH; - des agents modificateurs de pression osmotique; 20 - des agents émulsionnants; - des filtres UV-A et UV-B - et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou le butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains chelatants de métaux. 25 Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. Légende des figures : Les Figures 1 A, 1B et 1C montrent l'expression de ELOVL5 dans la glande sébacée de la 30 peau de souris et dans la glande préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 1A en éclairage classique et en éclairage à fond noir est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une hybridation in situ utilisant une sonde sens de ELOVL5 (contrôle négatif; animal 44, gonadectomisé). La Figure 1B en éclairage classique et en éclairage à fond noir est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise à une 35 hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact (animal 44). La Figure 1C en éclairage classique est une photographie d'une coupe de peau de souris soumise 2903998 11 à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53). Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de ELOVL5 dans la glande préputiale de 5 souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde sens de ELOVL5 (contrôle négatif; animal 43). La Figure 2B est une photographie en éclairage classique et en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal intact 10 (animal 43). La Figure 2C est une photographie en éclairage à fond noir d'une coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 53). Les Figures 3A et 3B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression du gène 15 ELOVL5 chez des souris males gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique Affymetrix (Figure 3A) ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 3B). GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule 20 DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste du récepteur aux androgènes) DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone (précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en androgène actif) DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de 25 Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagonistes du récepteur aux Androgènes; qui bloquent les effets des agonistes DHT et DHEA). Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES Exemple 1 : Expression de ELOVL5 dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain. Méthodes : 30 2903998 12 Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme. L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module microfluidic; 5 four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en utilisant le 10 système Lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des réactionsenzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MASS fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi 15 que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single mismatch ) dans la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1). 20 Tableau 1 : mesure de l'expression de ELOVL5 dans l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la technologie des puces affymetrix. Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité Affymetrix gène dans la dans de de glande l'épiderme l'expression* l'expression* sébacée humain dans la dans humaine glande épiderme sébacée humain humaine 208788_at ELOVL5 1295 273 1 1 *Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans l'échantillon indiqué : 25 présence (=1) ou absence (=0). Résultats: 2903998 13 ELOVL5 est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme humain montre que l'expression légèrement plus forte dans la glande sébacée n'atteint pas de significativité par rapport à la valeur observée dans l'épiderme (tableau 1). Exemple 2 : Expression de ELOVL5 dans la qlande sébacée de la peau de souris par hybridation in situ 10 Méthodes : Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène ELOVL5 par incubation du gène linéarisé (2 g) avec 631Ci de [35S]UTP (1250 Ci/mmol ; NEN, Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé dans de la paraffine. Des sections 15 (41.1m de large) ont ensuite été déparaffinées dans du toluène et réhydratées par un gradient d'alcool. Après séchage, les différentes sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux heures. L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon de préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/ l 35Smarqué) à 53 C. L'excès de sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées 20 dans une émulsion LM1 (Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4 C pendant au moins un mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée comme témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande préputiale de souris. 25 Suite à l'incubation en présence d'une émulsion photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par la sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 1B et Figure 1 C) et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1A) utilisé comme contrôle négatif. 30 Résultats: On observe sur la Figure 1A qu'il n'y a pas d'accumulations de grains argentés (pas de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des chercheurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 1B montre un très fort marquage de la glande sébacée, visible 35 par accumulation de grains argentés. La Figure 1C montre aussi un marquage de la glande sébacée. 5 2903998 14 ELOVL5 est bien exprimée dans les couches basales des glandes sébacées de la peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes histologiques obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadectomisés n'indique pas de fortes différences 5 d'expression entre les glandes sébacées des animaux intacts et les glandes sébacées des animaux gonadectomisés. Exemple 3: Expression de ELOVL5 dans la glande préputiale de souris par 10 hybridation in situ Méthodes : Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple 2. 15 Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Résultats : La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce qui est en 20 accord avec les attentes des chercheurs car elle correspond au contrôle négatif. La Figure 2B montre un fort marquage de la glande préputiale de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage très fort des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé. 25 ELOVL5 est exprimée dans (Figure 2B) la glande préputiale de souris. Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles et 4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les glandes préputiales des animaux intacts (Figure 2B et 2C). 30 En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression de l'enzyme ELOVL5 augmente dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation androgénique (animaux gonadectomisés). 35 Exemple 4 : Expression de ELOVL5 dans la glande préputiale de souris 2903998 15 Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type sébocytaire et sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une taille suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des technologies de microdissection. 5 L'analyse de l'expression de ELOVL5 dans les glandes préputiales de souris a été réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes (notamment en hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone (DHT) ou de 10 Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de DHEAFlutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux Androgènes bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de 15 l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques. L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix décrit ci-dessus (Figure 3A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique de PCR en temps réel (Figure 3B). 20 La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la société Applied Biosystems en utilisant le 7900HT Sequence Detection System . L'ARN total isolé des tissus est transcrit (RT) en l'ADNc et celui-ci est amplifié par PCR (Réaction en Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en utilisant des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la quantité 25 d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ. Résultat: L'ARNm de ELOVL5 est diminué par un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale. REVENDICATIONS 1. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la ELOVL5 ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 2. Méthode in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes : a. Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; b. Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un ou plusieurs des composés à tester ; c. Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges réactionnels ; d. Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou de l'activité de la protéine ELOVL5 ou une modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité. 3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que les composés sélectionnés à l'étape d) inhibent l'expression ou l'activité de la protéine ELOVL5, ou l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs. 4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie du promoteur du gène codant pour la protéine ELOVL5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène rapporteur. 2903998 17 5. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que les échantillons biologiques sont des cellules exprimant le gène codant pour la protéine ELOVL5, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'expression dudit gène. 5 6. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des sébocytes. 7. Méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle les cellules sont des cellules transformées par un acide nucléique hétérologue codant pour la ELOVL5. 8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène est déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène. 9. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, dans laquelle l'expression du gène 15 est déterminée en mesurant le taux de traduction dudit gène. 10. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que l'étape a) consiste à préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme ELOVL5 et un substrat de l'enzyme, et en ce que l'étape c) consiste à mesurer l'activité 20 enzymatique. 10