Brevet FR2903305A1 — publié le 20080111

La présente invention se situe dans le domaine de la pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie et de la cosmétologie. La présente invention concerne l'utilisation d'extraits végétaux comprenant des peptides homologues en séquence à des fragments de protéines de la famille des UCP en tant qu'agents actifs amincissants, seul ou en association avec au moins un autre agent actif, dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique et/ou cosmétique. L'invention concerne également de nouvelles compositions contenant au moins un extrait végétal comprenant des peptides dérivés de protéines de la famille des UCP. Le terme UCP désigne la famille des Uncoupling proteins qui sont des protéines responsables de la dissipation sous forme de chaleur de l'énergie produite par la respiration mitochondriale (Nicholls et al. Physiol. Rev., 64 : 1-64, 1984). La respiration mitochondriale génère un gradient de protons entre le compartiment interne de la mitochondrie et le système des doubles membranes externes. Le retour des protons vers le compartiment interne se fait par les canaux de l'ATPsynthase. L'énergie produite par cette force proton-motrice permet alors la synthèse d'ATP. La protéine UCP-1 (Lin et al., FEBS Lett, 113 : 299-303, 1980) est un transporteur de protons inséré dans la membrane interne des mitochondries des cellules du tissu adipeux brun (Cassard et al. Journal of Cell biochemistry, 43, 1990), qui court-circuite le passage des protons par l'ATPsynthase. Les UCP catalysent de cette façon le découplage entre la force proton-motrice et la synthèse d'ATP. L'énergie, qui n'est plus utilisée pour produire de l'ATP, se libère sous forme de chaleur. D'autre part, le découplage de la respiration stimule l'oxydation des graisses. A ce jour, trois protéines de cette famille ont été identifiées : UCP-1, UCP-2 et UCP-3. Les protéines UCP-2 et UCP-3, moins bien connues, jouent probablement un rôle important dans l'homéostasie énergétique (Klingenbeg, J. Bioenerg. Biomembr. 25 : 447, 1993), notamment dans le contrôle de l'efficacité métabolique alimentaire. Le brevet FR 2 866 233 a récemment décrit l'utilisation de protéines ou de fragments peptidiques d'UCP en tant qu'agents cosmétiques actifs. Le problème technique à résoudre a été, pour les inventeurs, de trouver un substitut végétal, cosmétiquement et pharmaceutiquement acceptable, qui contienne une quantité efficace de peptides dérivés de protéines de la famille des UCP. Ces extraits végétaux devant présenter une activité thérapeutique et, plus particulièrement dermatologique et cosmétique amincissante lorsqu'ils étaient appliqués sur la peau. 2903305 2 Les études conduites par les inventeurs ont démontré que les extraits selon l'invention étaient capables de réduire, d'éliminer ou de prévenir les surcharges graisseuses sous-cutanées. 5 Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'extraits de plantes riches en au moins un peptide dérivé de protéines UCP, en tant qu'agents actifs, seuls ou en association avec au moins un autre agent actif, dans ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique et/ou cosmétique. Le terme peptide désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés 10 entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées ; un polypeptide désignant un peptide de taille plus importante. On entend par peptides dérivés de protéines de la famille des UCP des peptides homologues par leur séquence en acides aminés à des fragments de protéines de la famille des UCP. 15 De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir ces séquences au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de l'hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible 20 d'utiliser certains extraits hydrolysés sans en purifier les fragments peptidiques selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés. Le terme "extrait" désigne toute substance ou préparation isolée, obtenue à partir de matière végétale. Il s'obtient, par exemple, par dissolution des composants actifs au moyen 25 de solvants (comme l'eau, l'alcool, etc.) puis par concentration et purification de ces actifs, par exemple, par évaporation des solvants. Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée pour préparer l'extrait selon l'invention. Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière, ou une partie spécifique de la 30 plante (feuille, grain, etc.). Plus particulièrement selon l'invention on utilise une des nombreuses plantes de la famille des poacées, du genre oryza (riz) et préférentiellement l'espèce Oryza sativa L.. Selon l'invention le matériel végétal utilisé sera le grain et préférentiellement le grain débarrassé de son enveloppe par une étape de décorticage. 2903305 -3 Selon une autre forme de l'invention on utilise des plantes de la famille des Fabacées ; le soja ou le tourteau de soja et préférentiellement de l'espèce Glycine max L., Dans une première étape, la plante est broyée à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique 5 (comme par exemple un alcool, un hexane ou de l'acétone). On réalise ensuite classiquement l'extraction des protéines de la plante (Osborne, 1924) ; le broyat de plante étant mis en suspension dans une solution alcaline. La fraction soluble est récueillie après des étapes de centrifugation et de filtration, cette solution brute constituant alors une première forme de l'extrait contenant les protéines, les glucides et éventuellement 10 des lipides. Les protéines sont ensuite précipitées en faisant varier la force ionique et en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques. Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme 15 plus purifiée de l'extrait. L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide. L'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant. A ce 20 stade, l'extrait obtenu contient au minimum 70% de composés de nature protéique et peptidique. La fraction protéique isolée selon l'invention est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des polypeptides et des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette 25 réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases et exopeptidases d'origine végétale (papaïne, bromelaine, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). La solution obtenue constitue l'extrait actif. L'extrait actif peut être encore purifié par 30 fractionnement, notamment par une méthode de type chromatographique ou purifié et concentré par un procédé de dialyse. L'une quelconque des formes plus ou moins purifiées de l'extrait est alors solubilisée dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration. 2903305 4 L'extrait végétal obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour sa teneur en composés de nature protéique et peptidiques. On entend par composés de nature protéique et peptidiques, les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans le mélange. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont 5 dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait végétal actif contient une quantité de composés de nature protéique et peptidique représentant entre 30 et 90 % du poids total de la matière sèche, plus particulièrement cette quantité est comprise entre 60 et 80 % du poids total de la matière sèche. 10 L'extrait végétal selon l'invention présente également la propriété remarquable de contenir 10 et 200 mg/1 de composés de nature protéique et peptidiques biologiquement actifs. Préférentiellement selon l'invention, les peptides présents dans l'extrait sont dérivés de protéines de la famille des UCP, de formule (I) : 15 (I) (AA)n - Pro - X 1 - X2 - X 1 - X3 - Lys - X 1 Arg - X4 - X5 - (AA)n dans laquelle : X1 = Leu, Thr, Val ; 0 X2 = Asp, Glu ; 0 20 X3 = Ala, Val ; 0 X4 = Leu, Phe, Tyr ; X5 = Gln, Ile, Met ; et où (AA) est un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, et n est un entier compris entre 0 et 2. 25 Selon une méthode particulièrement avantageuse de réalisation de l'invention, l'extrait contient au moins un peptide correspondant aux séquences ID N : Pro Leu Asp Thr Ala Lys Val Arg Leu Gln Pro Thr Glu Val Ala Lys Val Arg Phe Gln Pro Thr Asp Val Ala Lys Val Arg Leu Gln Pro Thr Glu Val Ala Lys Val Arg Leu Gln Pro Thr Asp Val Ala Lys Val Arg Phe Gln (6) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Phe Ile Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Tyr Met Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Phe Met (5) 2903305 -5- (9) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Tyr Ile (10) Lys Val Arg Leu Gln Par ailleurs, selon une méthode de réalisation de l'invention toute particulièrement 5 préférée, l'extrait végétal contient au moins le peptide issu des protéines UCP de séquence ID N (10), c'est-à-dire la séquence Lys-Val-Arg-Leu-Gln. Ainsi un des objets de la présente invention est l'utilisation d'un extrait de plantes, tel que défini précédemment, dans ou pour la préparation d'une composition amincissante cosmétique et/ou dermatologique contenant une quantité efficace de peptide de séquence ID 10 N (10), Lys-Val-Arg-Leu-Gln. L'invention concerne aussi des formes variantes de ces peptides et/ou de ces fragments. Le terme variant désigne ici un polypeptide ou un peptide qui diffère, par exemple, de la séquence d'un peptide de référence tout en conservant ses propriétés essentielles. Généralement, les différences sont limitées de manière à ce que les séquences du peptide de 15 référence et celles du variant soient assez similaires et, dans certaines régions, identiques. Préférentiellement les formes variantes sont celles qui varient des séquences de référence, par la substitution d'acides aminés chimiquement équivalents (ou homologues), c'est-à-dire par la substitution d'un résidu par un autre possédant les mêmes caractéristiques. Ainsi, les substitutions classiques se font entre Ala, Val, Leu et Ile ; entre Ser et Thr ; entre les résidus 20 acides Asp et Glu ; entre Asn et Gln ; et entre les résidus basiques Lys et Arg ; ou entre les résidus aromatiques Phe et Tyr. Le terme variant désigne ainsi un peptide qui diffère, par exemple, de la séquence d'un peptide de référence tout en conservant ces propriétés essentielles. Généralement, les différences sont limitées de manière à ce que les séquences du peptide de référence et celles du variant soient assez similaires et, dans certaines régions, 25 identiques. Un peptide variant et un peptide de référence peuvent ainsi différer de la séquence d'acides aminés par une ou plusieurs substitutions, additions, délétions dans toutes les combinaisons. L'utilisation de l'extrait selon l'invention inclut aussi l'utilisation de tous fragments biologiquement actifs, ou d'un de ses analogues ou variants. Par l'expression tous 30 fragments biologiquement actifs , on entend des fragments qui possèdent une activité in vivo ou in vitro caractéristique de l'activité de l'actif selon l'invention, tel que par exemple, les activités amincissantes décrites précédemment. Dans l'invention, le terme "acide aminé" se réfère ici à tout acide organique naturel ou non naturel ayant la formule (II) : 2903305 -6 ùNHR-CR-C(0)-O-(II) où chaque -R est indépendamment sélectionné entre un hydrogène et un groupement alkyl ayant entre 1 et 12 atomes de carbone. Préférentiellement, au moins un groupement -R de chaque acide aminé est un hydrogène. Par le terme "alkyl", on entend ici une chaîne carbonée 5 pouvant être linéaire ou ramifiée, substituée (mono- ou poly-) ou non-substituée ; saturée, mono-saturée (une double ou triple liaison dans la chaîne) ou poly-insaturée (deux ou plusieurs doubles liaisons, deux ou plusieurs triples liaisons, une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs triples liaisons dans la chaîne). La quantité efficace d'extrait végétal correspond à la quantité nécessaire pour obtenir le 10 résultat désiré. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait végétal précité est utilisé, dans les compositions, à une concentration comprise entre 0,00001 % et 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,001 % et 10 % environ en poids par rapport au poids total de la composition finale. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les extraits selon l'invention sont 15 préalablement solubilisés dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, classiquement utilisé par l'homme du métier, comme l'eau, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, le glycérol (glycérine), une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 20 L'utilisation de l'extrait végétal selon l'invention se fera préférentiellement sous la forme d'une composition adaptée à l'administration par voie topique externe, principalement sur la peau, les muqueuses et/ou les phanères, comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable. Il est bien entendu que l'extrait selon l'invention peut être utilisé seul ou en association 25 avec au moins un autre agent actif. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une composition cosmétique et/ou dermatologique contenant une quantité efficace d'extrait végétal comprenant au moins un peptide dérivé de protéines de la famille des UCP, adaptée à l'administration par voie topique 30 cutanée comprenant un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles aussi peuvent se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux. 7 2903305 Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. 5 Ces compositions comprennent, en outre, tout additif usuellement utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des silicones, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles 10 essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.... Par exemple, dans lesdites compositions, l'extrait selon l'invention peut avantageusement être combiné avec tout autre ingrédient stimulant l'exfoliation cutanée, inhibant la lipogénèse ou stimulant la lipolyse tels que les dérivés de xanthine. On peut par exemple citer la caféine, 15 la théophylline, la théobromine, l'acéfylline, le nicotinate de xanthinol, la diniprophylline, la diprophylline, l'étamiphylline et ses dérivés, l'étophylline, la proxyphyline, la pentophylline, la propentophylline, la pyridophylline et la bamiphylline. Dans tous les cas, l'homme du métier veillera à ce que ces adjuvants actifs ou non actifs ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés 20 avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront 25 choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition. Selon un troisième aspect de l'invention, l'extrait selon l'invention peut être utilisé dans 30 ou pour la fabrication d'une composition à usage topique, destinée au traitement de la cellulite et/ou au traitement de la peau d'orange. L'extrait ou la composition le contenant est avantageusement utilisé afin de réduire, éliminer ou prévenir les surcharges graisseuses sous-cutanées. 2903305 8-L'hypoderme est constitué de grosses cellules vacuolisées, les adipocytes, presque entièrement remplies de triglycérides. Ce tissu adipeux contient également du tissu conjonctif dans lequel se trouvent, entre autres, des fibroblastes particuliers et des préadipocytes. Ce tissu adipeux constitue le plus grand réservoir énergétique de l'organisme. Il est capable de 5 stocker des lipides sous forme de triglycérides ou de les libérer sous forme d'acides gras et de glycérol. Les réserves lipidiques de l'organisme se renouvellent en permanence et il existe un équilibre constamment adapté aux besoins énergétiques de l'organisme, entre le phénomène de lipolyse, qui libère des acides gras, et le phénomène de lipogénèse qui les stocke. Si un déséquilibre s'installe dans l'organisme entre ces deux phénomènes, les acides gras sont 10 stockés dans les adipocytes, dont le volume et le nombre augmente : on parle d'hypertrophie et d'hyperplasie des adipocytes. Le développement excessif de la masse adipeuse peut alors se traduire par des modifications de l'aspect de la peau, voire évoluer vers une surcharge pondérale de l'individu, ou encore progresser vers une réelle obésité. La cellulite est une configuration particulière du tissu adipeux, considérée de nos jours 15 comme inesthétique. Elle désigne un aspect matelassé et capitonné de la peau qui correspond, de façon schématique, à l'accentuation de tissus adipeux dans certaines régions du corps, en particulier, chez la femme, au niveau des hanches, des cuisses, des fesses, des genoux et des avants-bras. A un stade avancé de la formation de cellulite, la peau prend spontanément l'aspect de peau d'orange ou capiton, qui se caractérise par une succession de petites 20 bosses et dépressions dues à une traction de l'épiderme vers les tissus profonds. Il a été constaté que l'extrait selon l'invention, ou la composition le contenant, possède une action très efficace au niveau des adipocytes. En effet, il contribue à faire diminuer significativement la quantité de triglycérides contenue dans les adipocytes de l'hypoderme. Ce phénomène est dû vraisemblablement à un blocage du phénomène de la lipogénèse, 25 c'est-à-dire au blocage du processus de stockage des triglycérides qui aboutit à une hypertrophie des adipocytes. Une maîtrise de la lipogénèse, c'est-à-dire de la réaction de synthèse des triglycérides dans les adipocytes, permettra d'éviter une hypertrophie des adipocytes ainsi qu'une hyperplasie consécutive. Ainsi, lorsque, en cours de différenciation adipocytaire, la quantité de triglycérides présents dans les vacuoles n'augmentent pas, le 30 volume des adipocytes et leur nombre n'augmentent pas non plus. La peau reprend ainsi, petit à petit, son aspect normal : le tissu cellulitique ne se développe plus, l'effet peau d'orange est atténué. L'aspect disgracieux du corps s'estompe peu à peu. L'extrait selon l'invention permet ainsi de prévenir l'apparition de la cellulite ainsi que de lutter contre son aggravation. -9 2903305 Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général et plus particulièrement aux êtres humains. Selon un quatrième aspect de l'invention, l'extrait selon l'invention peut être utilisé dans 5 ou pour la fabrication d'une composition pharmaceutique à usage topique, destinée au traitement de la cellulite et/ou au traitement des surcharges graisseuses sous-cutanées. Selon un cinquième aspect, la présente invention concerne un procédé de soin cosmétique afin d'obtenir une action amincissante, ainsi qu'un procédé de soin cosmétique destiné à 10 réduire, éliminer et/ou prévenir les surcharges graisseuses sous-cutanées, et/ou destiné à lutter contre la cellulite et/ou à lutter contre le phénomène de peau d'orange, consistant à appliquer, topiquement, sur les zones concernées de la peau, une quantité efficace d'au moins un des extraits selon l'invention ou une composition les contenant. Le procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être mis en oeuvre notamment en 15 appliquant régulièrement les compositions cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions, par exemple : application de crèmes, de gels, de sérums, de lotions, de laits, de shampooings ou de compositions anti-solaires sur la peau. Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. 20 L'avantage de la présente invention est de pouvoir disposer d'un traitement par voie topique efficace contre l'adiposité tout en employant des méthodes douces . D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif 25 Exemple 1 : Préparation d'extraits à partir de riz (Oryza sativa L.) L'agent actif est obtenu à partir d'un extrait de plantes de l'espèce Oryza sativa L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Oryza. 30 Dans une première étape, 1 kg de grains de riz décortiqués sont délipidés par l'action d'un solvant organique : l'hexane. Les grains de riz sont ensuite broyés dans un broyeur à couteau puis sont mis en suspension dans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 2903305 -10- 4 et 80 C) ; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat qui contient les fractions solubles du riz est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier la force ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants 5 glucidiques solubles, les lipides et les acides nucléiques. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait protéique brut contenant : 10 -Protéines : 75 % - Glucides : 20 % - Lipides : 5 % Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant. L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide. 15 L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques. A titre d'exemple on peut citer l'hydrolyse en présence d'exopeptidases (papaïne, ficine). L'hydrolysat est ensuite purifié puis dialysé sur membrane pour éliminer les composés de haut poids moléculaires. 20 On obtient alors une hydrolysat de couleur claire titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec et contenant une quantité de composés de nature protéique et peptidiques représentant environ 70 % du poids total de la matière sèche. L'hydrolysat est alors dilué de telle sorte que la concentration en protéines déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,5 et 2g/1. 25 D'autre part, l'analyse par HPLC montre que l'extrait végétal selon l'invention contient au minimum 20 mg/1 de composés de nature protéique et peptidique biologiquement actifs, contenant la séquence ID n (10) analogue à une séquence de protéine UCP. Exemple 2 : : Préparation d'extraits à partir de tourteau de soja (Glycine max L.) 30 Les tourteaux sont les résidus solides obtenus après extraction de l'huile des graines de soja. Ils représentent de 50 à 75 % de la masse des graines. Les tourteaux sont mis en suspension dans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 4 et 80 C) ; 2903305 préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat qui contient les fractions solubles du riz est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier la force ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants glucidiques 5 solubles, les lipides et les acides nucléiques. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait protéique brut contenant : 10 -Protéines : 75 % Glucides : 20 % - Lipides : 5 % Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant. L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide. 15 L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques. A titre d'exemple on peut citer l'hydrolyse en présence d'exopeptidases (papaïne, ficine). L'hydrolysat est ensuite purifié puis dialysé sur membrane pour éliminer les composés de haut poids moléculaires. 20 On obtient alors une hydrolysat de couleur claire titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec et contenant une quantité de composés de nature protéique et peptidiques représentant environ 70 % du poids total de la matière sèche. L'hydrolysat est alors dilué de telle sorte que la concentration en protéines déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,5 et 2 g/1. 25 D'autre part, l'analyse par HPLC montre que l'extrait végétal selon l'invention contient au minimum 20 mg/1 de composés de nature protéique et peptidiques biologiquement actifs, contenant la séquence ID n (10) analogue à une séquence de protéine UCP.Exemple 3 : Mise en évidence de l'activité des extraits selon l'invention sur les adipocytes. 30 I. Culture cellulaire : Des cellules de la lignée cellulaire préadipocytaire 3T3-L1, non différenciées, sont ensemencées dans des LabTek 8 puits (pour la coloration Oil Red), dans des plaques 12 puits (pour le dosage de l'ATP), dans des plaques 24 puits (pour le dosage de l'AMPc) et dans des plaques 6 puits (pour le dosage du glycérol) ainsi qu'avec du milieu de culture DMEM (4,5 2903305 -12- g/1) contenant des antibiotiques. Ces préadipocytes 3T3-L1 étant capables de rentrer, dans certaines conditions, en phase de différenciation terminale. II. Différenciation des adipocytes : Une fois que les cellules 3T3-L1 ont atteint une confluence de 100 %, ces cellules sont 5 différenciées par une culture dans différents milieux, sur une période allant de 6 à 8 jours. Durant les 2 premiers jours, les cellules sont cultivées en présence d'IBMX, de dexaméthazone et d'insuline, dilués dans du milieu de culture DMEM 4,5 g/1. Puis elles sont cultivées durant deux jours en présence, uniquement, d'insuline diluée dans du milieu de culture DMEM 4,5 g/1 et, enfin, les cellules sont cultivées durant 2 à 3 jours en milieu de 10 culture contenant exclusivement du DMEM 4,5 g/l. La différenciation des cellules en adipocytes matures est visualisée par l'apparition de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules. L'effet des extraits végétaux selon les exemples 1 et 2 ainsi que leur impact sur les cellules 3T3-L1 différenciées ou en cours de différenciation a été évalué au travers de 15 différentes techniques : - la coloration Oil Red , le dosage de la quantité de l'ATP intracellulaire, - le dosage de la quantité de l'AMP cyclique intracellulaire, - le dosage du glycérol relargué par les cellules. 20 III. La Coloration "Oil Red": Le principe de ce test d'évaluation de l'effet des extraits selon l'exemple 1 et 2 repose sur une observation microscopique du nombre et de la taille des vacuoles lipidiques des adipocytes après coloration. Les adipocytes étant incubés ou non, en présence de la substance à tester. 25 Les cellules 3T3-L1, ensemencées dans des Lab-teks 8 puits, sont traitées avec l'extrait selon l'exemple 1 ou 2, riche en peptide de séquence ID N (10), c'est-à-dire de séquence Lys-Val-Arg-Leu-Gln, représentatif des peptides dérivés de protéines de la famille des UCP selon l'invention, mis en solution à 0,5 %. L'actif a été ajouté à différents stades de culture : - Dès l'ensemencement et jusqu'à la fin de la différenciation adipocytaire (72 heures de 30 culture jusqu'à 100 % de confluence puis pendant les 6 jours de différenciation) ; 6 heures après l'ensemencement et jusqu'à la fin de la différenciation des cellules (66 heures de culture jusqu'à 100 % de confluence puis pendant les 6 jours de différenciation) ; 2903305 -13-Une fois les cellules différenciées en adipocytes, les cellules étant traitées avec l'actif durant 6, 24, ou 48 heures. Après ces différentes périodes d'incubation, en présence ou non de l'actif à tester, les 3T3-L1 sont colorées par la technique Oil Red . La solution Oil Red (Sigma, 0-0625) 5 est préparée par ajout de 0,5 g de produit dans 100 mL d'isopropanol et par dilution au 4/10 dans de l'eau distillée, puis filtration. Les cellules sont fixées durant 10 minutes dans une solution de formol 4 % et NaCl, la solution Red Oil est appliquée durant 15 minutes. Une contre-coloration à l'Hématoxyline durant 30 secondes est possible. Les cellules sont ensuite rincées avec de l'eau tiède et montées sur lames, en milieu hydrophile (Aquatex). 10 L'observation est effectuée au microscope optique de façon à distinguer les vacuoles graisseuses colorées en rouge. Les résultats de l'observation des cellules démontrent que les cellules qui ont été traitées avec l'extrait selon l'exemple 1 ou 2 avant le début de la différenciation (c'est-à-dire dès leur ensemencement, ou bien 6 heures après leur ensemencement) ont une morphologie moins 15 arrondie et un contenu en vésicules lipidiques intra-adipocytaires nettement diminué par comparaison avec les cellules témoins (sur lesquelles l'actif n'a pas été appliqué). Cette même observation est aussi effectuée par comparaison avec les adipocytes matures, c'est-à-dire différenciés, sur lesquels l'actif a été appliqué, qui ont une forme volumineuse sphérique et une accumulation importante de vésicules lipidiques intra-cytoplasmiques. 20 La solution contenant l'extrait selon l'invention s'avère donc particulièrement efficace au niveau des adipocytes en cours de différenciation et non pas au niveau des adipocytes matures qui ont déjà accumulé des triglycérides dans leurs vésicules intra-adipocytaires. En effet, aucune diminution n'a été observée lorsque l'actif a été appliqué une fois la différenciation terminée. 25 IV. Dosage de l'AMP cyclique intracellulaire : L'objectif de ce test est de mesurer la variation de la concentration d'AMPc intracellulaire dans les adipocytes, afin d'en déduire une éventuelle activation du phénomène de lipolyse. Le test a été effectué sur les cellules 3T3-L1 différenciées. Ces adipocytes sont traités 30 avec l'extrait selon l'exemple 1 ou 2, riche en peptide de séquence ID N (10), c'est-à-dire de séquence Lys-Val-Arg-Leu-Gln, représentatif des peptides dérivés de protéines UCP selon l'invention, mis en solution à 0,5 %, pendant des périodes de 15 minutes, 30 minutes ou 1 heure. En parallèle des cellules 3T3-L1 différenciées sont également traitées avec de 2903305 -14- l'isoprotérénol (un agent inducteur de la lipolyse), à 1 M, constituant ainsi un contrôle positif. Après les différentes périodes d'incubation, en présence de l'actif à tester ou en présence d'isoprotérénol, la quantité d'AMPc contenue dans les adipocytes est mesurée par le biais du 5 Kit CAMP Biotrak EIA System de Amersham Biosciences ainsi que sur un principe colorimétrique de type ELISA. Le kit permet la lyse des cellules par une solution permettant ainsi l'hydrolyse des membranes cellulaires et le relargage de l'AMPc intracellulaire dans le milieu. Puis la fixation sur l'anticorps de capture de l'AMPc intracellulaire, extrait des échantillons, est mise en compétition avec de l'AMPc couplé à une enzyme, la peroxydase. 10 Ainsi, après une révélation avec le substrat TMB, plus il y aura d'AMPc dans les échantillons à doser, plus le signal sera faible. Les résultats obtenus démontrent qu'en présence des extraits végétaux actifs, il n'y a aucune augmentation de la quantité d'AMPc intracellulaire sur des cellules différenciées, par rapport à la condition contrôle, c'est-à-dire par rapport aux cellules traitées avec 15 l'isoprotérénol. V. Dosage de l'ATP intracellulaire : Le but de cette étude est de déterminer l'influence des extraits végétaux actifs selon l'exemple 1 ou 2 sur la quantité d'ATP intracellulaire. Cette étude s'effectue à l'aide d'un Kit "ATP Bioluminescence Assay Kit HS II". Les 20 cellules 3T3-L1 différenciées sont traitées avec une solution à 0, 5 %, contenant l'extrait selon l'exemple 1 ou 2, riche en peptide de séquence ID N (10), représentatif des peptides dérivés de protéines UCP selon l'invention, pendant une période allant jusqu'à 96 heures. A la fin du temps d'incubation, les puits sont vidés de leur milieu et rincés avec 2 ml de PBS froid avant d'ajouter 250 l d'un tampon de lyse fournis par le kit. Les cellules sont ensuite détachées 25 mécaniquement puis récoltées dans des tubes 14 ml. Chaque puits est rincé avec 2 x 500 gl PBS froid et le tout est de nouveau récolté dans les tubes respectifs. Chaque tube est ensuite passé au polytron durant 10 secondes à 18000 tours/minute. A partir de ces échantillons, une dilution est réalisée au 1/12000'ème dans du PBS froid avant chaque lecture. Le dosage d'ATP est réalisé sur ces échantillons : 50 L de cette dilution sont déposés dans une luma-cuvette et 30 50 L de luminol sont ajoutés. Après 10 secondes, la lecture de la luminescence est déclenchée. Les valeurs sont standardisées par rapport à la quantité de protéines pour chaque échantillon. Les mesures sont effectuées à l'aide d'un appareil : le Biocounter M2010A LUMAC /3M. 2903305 -15- Les résultats obtenus démontrent qu'il n'y a aucune augmentation de la quantité d'ATP intracellulaire. Les mesures obtenues mettent même en évidence une diminution de la quantité d'ATP intracellulaire au bout de 96 heures de culture, sur des cellules différenciées et traitées par l'actif, en comparaison avec le contrôle. 5 VI. Dosage du glycérol : Le but de cette étude est de déterminer l'influence de l'extrait selon l'invention sur le relargage du glycérol par les adipocytes. Ce glycérol étant le résultat de la lipolyse. Les cellules 3T3-L1 différenciées sont traitées à la dose de 0,5 % contenant l'extrait selon l'exemple 1 ou 2, riche en peptide de séquence ID N (10), représentatif des peptides dérivés 10 de protéines UCP selon l'invention, durant des périodes de 1h30, 3h, 5h, 7h et 24 heures. Le dosage du glycérol est réalisé à l'aide d'une réaction enzymatique en cascade aboutissant à la formation de NADH dont la quantité produite est évaluée par lecture spectrophométrique à 340 nm, la formation de NADH étant proportionnelle à la quantité de glycérol relargué dans le milieu de culture. Un contrôle interne de glycérol à 1 mm a aussi été 15 utilisé. Les valeurs sont standardisées par rapport à la quantité de protéines pour chaque échantillon. Les résultats obtenus nous permettent de constater qu'aux différents temps étudiés, le relargage du glycérol est identique pour les puits contrôles et les puits traités avec l'actif à 0,5 % sur des cellules différenciées. 20 VII. Conclusions : Les résultats du test de la coloration "Oit Red" nous permettent de conclure que les extraits végétaux actifs selon l'invention ont un effet particulièrement efficace au niveau de la diminution de la formation de gouttelettes lipidiques intra-adipocytaires. Cependant, cet effet n'est seulement observé que lorsque l'actif est appliqué avant le début et/ou pendant la 25 différenciation cellulaire, aucune diminution n'étant observée lorsque l'actif est appliqué sur des adipocytes matures. Ces résultats suggèrent ainsi que les extraits végétaux selon les exemples 1 et 2 agissent au niveau de la lipogénèse et non au niveau de la lipolyse. Les augmentations des quantités d'AMPc et d'ATP intracellulaire sont des indicateurs de l'activation de la voie de la lipolyse, le taux d'AMPc intracellulaire régulant l'activité de la 30 Triglycéride-lipase, l'enzyme permettant l'hydrolyse des triglycérides. Ainsi, une non-augmentation des quantités d'AMPc et d'ATP intracellulaire suggère que l'actif selon l'invention n'agit pas en augmentant le phénomène de lipolyse. Ces résultats sont, par ailleurs, confirmés par la non-augmentation du relargage du glycérol dans le milieu extracellulaire, le glycérol étant un produit de la lipolyse. 2903305 -16- Ces résultats démontrent ainsi que les extraits selon l'invention possèdent une action réellement efficace au niveau des adipocytes, et qu'ils s'avèrent tout particulièrement efficaces dans le processus de limitation de l'hypertrophie adipocytaire. L'extrait végétal actif selon l'invention empêche ainsi l'accumulation de gouttelettes 5 lipidiques dans les adipocytes, et permet ainsi, plus ou moins directement, une diminution de la masse adipeuse et une inhibition de son développement. Cette diminution des vacuoles lipidiques dans les adipocytes non matures, combinée aux résultats des dosages d'AMPc, d'ATP et de glycérol, permet de conclure que les extraits végétaux selon l'invention agissent, au niveau des adipocytes, sur le mécanisme de la 10 lipogénèse et non pas sur le mécanisme de lipolyse. Les extraits végétaux selon l'invention favorisent donc la non-accumulation des triglycérides contenus dans les vésicules intraadipocytaires. Exemple 4 ù Préparation de compositions. 15 1. Crème amincissante Noms commerciaux I Noms INCI I % massique PHASE A Montanov 68 Cetearyl Alcohol (and) Cetearyl Glucoside 5.00 Squalane Squalane 2.50 DUB IPP Isopropyl Palmitate 3.50 Eutanol G Octyldodecanol 1.50 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0.50 (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben PHASE B Eau déminéralisée Aqua (Water) Qsp Glycerine Glycerin 3.00 Butylene Glycol Butylene glycol 3.00 PHASE C Simulgel EG Sodium Acrylate/Acryloyldimethyl 0.60 Taurate Copolymer(and) Isohexadecane(and) Polysorbate 80 PHASE D Extrait selon exemple 1 ou 2 2.0 Parfum Parfum (Fragrance) Qsp 2903305 -17- Noms commerciaux Noms INCI % massique Colorant Qsp Les constituants de la phase A sont fondus à 75 C et les constituants de la phase B chauffés à 75 C. La phase A est émulsionnée à B, puis le mélange est refroidi en dessous de 40 C. Les phases C et D sont ensuite additionnées sous agitation constante. 2. Spray Raffermissant ù Amincissant Noms commerciaux I Noms INCI I % massique PHASE A Emulgade SEV Glyceryl Stearate (and) Ceteareth-20 4.60 (and) Ceteareth-12 (and) Cetearyl Alcohol Eumulgin B2 Ceteareth-20 1.40 Cetiol OE Dicaprylyl Ether 3.00 DUB B1215 C12-C15 Alkyl Benzoate 5.00 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0.50 (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben DUB ININ Isononyl Isononanoate 5.00 Phenonip Phenoxyethanol (and) Methylparaben 0.50 (and) Ethylparaben (and) Butylparaben (and) Propylparaben (and) Isobutylparaben PHASE B Eau déminéralisée Aqua (Water) 15.00 Glycerine Glycerin 3.00 PHASE C Eau déminéralisée Aqua (Water) Qsp PHASE D Extrait selon exemple 1 ou 2 1.0 Parfum Parfum (Fragrance) qsp Colorant qsp Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément à 65 C ; la phase B est incorporée à la phase A sous agitation. La température du mélange est montée à 10 83 C puis il est refroidi jusqu'à une température d'inversion de phase. La phase C est ensuite 5 5 2903305 -18- additionnée. L'actif est incorporé lorsque la température atteint moins de 40 C. Il est alors possible d'ajouter des parfums etlou des colorants. 3. Gel Raffermissant ù Amincissant ù anti-cellulite Noms commerciaux Noms INCI % massique Carbopol Ultrez 10 (2%) Carbomer 25.00 Eau déminéralisée Aqua (Water) Qsp DUB DIOL Methyl Propanediol 3.00 EDTA Tetrasodium EDTA 0.10 Glydant Plus Liquid DMDM Hydantoïn (and) 0.20 Iodopropynyl butylcarbamate Extrait selon exemple 1 ou 2 0.5 TEA Triethanolamine 0.50 Parfum Parfum (Fragrance) Qsp Colorant hydrosoluble Qsp Le gel de Carbopol est préparé à 2 %. Les ingrédients sont ajoutés dans l'ordre énuméré ci-dessus, sous agitation. Le mélange est ensuite neutralisé avec la TEA. Le parfum et les colorants sont ajoutés si nécessaire. Revendications : 1. Composition cosmétique et/ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient, dans un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable, une quantité efficace d'extrait végétal comprenant au moins un peptide dérivé de protéines de la famille des UCP. 2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que l'extrait végétal contient au moins un peptide de formule (I) (AA)n-Pro- X1 -X2-X1 -X3-Lys-X1 -Arg-X4-X5-(AA)n dans laquelle : Xl = Leu, Thr, Val ; X2 =Asp, Glu ; X3 = Ala, Val ; X4 = Leu, Phe, Tyr ; X5 = Gln, Ile, Met ; (AA) est un acide aminé quelconque, ou un de ses dérivés, et n est un entier compris entre 0 et 2. 3. Composition selon les revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que le peptide est de séquence ID N : (1) Pro Leu Asp Thr Ala Lys Val Arg Leu Gln (2) Pro Thr Glu Val Ala Lys Val Arg Phe Gln (3) Pro Thr Asp Val Ala Lys Val Arg Leu Gln (4) Pro Thr Glu Val Ala Lys Val Arg Leu Gln (5) Pro Thr Asp Val Ala Lys Val Arg Phe Gln (6) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Phe Ile (7) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Tyr Met (8) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Phe Met (9) Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Tyr Ile (10) Lys Val Arg Leu Gln 30 35 2903305 - 20 - 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que le peptide possède la séquence ID N (10), c'est-à-dire la séquence Lys Val Arg Leu Gln. 5 5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'extrait végétal est obtenu à partir de plantes de la famille des poacées, préférentiellement de l'espèce Oryza sativa L. et plus particulièrement du grain desdites plantes. 10 6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que l'extrait végétal est obtenu à partir de plantes de la famille des fabacées, préférentiellement de l'espèce Glycine max L. et plus particulièrement des graines desdites plantes. 15 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait végétal contient une quantité de composés de nature protéique et peptidique représentant entre 30 et 90 % du poids total de l'extrait sec et plus particulièrement entre 60 % et 80% du poids total de l'extrait sec. 20 8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'extrait végétal est présent, dans la composition, à une concentration comprise entre 0.00001% à 20% en poids ou préférentiellement 0.001% à 10% en poids par rapport au poids total de la préparation finale. 25 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme d'une composition cosmétique ou pharmaceutique adaptée à l'administration par voie topique cutanée. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'extrait végétal est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables comme l'eau, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. -21- 2903305 11. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce qu'elle se présente sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ou sous la forme 5 d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ou sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore poudres ; ces compositions pouvant être plus ou moins fluides ou solides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte, d'une mousse ou d'un stick. 10 12. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un extrait végétal tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans ou pour la préparation d'une composition ; le composé ou la composition étant destinés au traitement de la cellulite et/ou de la peau d'orange ; et/ou afin de réduire, éliminer ou prévenir les surcharges graisseuses sous-cutanées. 15 13. Procédé de soin cosmétique destiné à réduire, éliminer et/ou prévenir les surcharges graisseuses sous-cutanées, et/ou destiné à lutter contre la cellulite, et/ou à lutter contre le phénomène de peau d'orange, caractérisé en ce que l'on applique sur la surface de la peau une quantité efficace d'une composition telle que définie selon 20 l'une quelconque des revendications 1 à 11.