Brevet FR2904219A1 — publié le 20080201

MICROPARTICULES A BASE DE COPOLYMERE AMPHIPHILE ET DE PRINCIPE(S) ACTIF(S) A LIBERATION MODIFIEE ET FORMULATIONS PHARMACEUTIQUES EN CONTENANT La présente invention concerne de nouveaux transporteurs de principe(s) actif(s) -PA-, en particulier protéinique(s) et peptidique(s), ainsi que de nouvelles formulations pharmaceutiques à libération modifiée contenant lesdits transporteurs de PA. Les applications thérapeutiques (humaines et vétérinaires) de ces formulations sont nombreuses. La référence PA utilisée dans tout le présent exposé, vise au moins un principe actif. Par "libération modifiée", on désigne une libération prolongée et/ou retardée et/ou pulsatile Plus précisément les nouveaux transporteurs de PA visés par l'invention sont des microparticules de polymères amphiphiles, par exemple des polyaminoacides modifiés par des groupements hydrophobes. Ces microparticules contiennent au moins un PA associé au polymère et peuvent se présenter sous forme de suspensions colloïdales ou sous forme sèche. Dans le domaine de la libération prolongée des PAs pharmaceutiques notamment des peptides/protéines thérapeutiques, on cherche très souvent à reproduire au mieux chez le patient, une concentration plasmatique en peptide ou en protéine proche de la valeur observée chez le sujet sain. Cet objectif se heurte à la faible durée de vie des protéines dans le plasma qui conduit à injecter de façon répétée la protéine thérapeutique. La concentration plasmatique en protéine thérapeutique présente alors un profil "en dents de scie" caractérisé par des pics élevés de concentration et des minima de concentration très bas. Les pics de concentration, très supérieurs à la concentration basale chez le sujet sain, ont des effets nocifs très marqués du fait de la toxicité élevée des protéines thérapeutiques telles que l'interleukine IL2. Par ailleurs, les minima de concentration sont inférieurs à la concentration nécessaire pour avoir un effet thérapeutique, ce qui entraîne une mauvaise couverture thérapeutique du patient et des effets secondaires graves à long terme. Aussi, pour reproduire chez le patient une concentration plasmatique en protéine thérapeutique proche de la valeur idéale pour le traitement du patient, il importe que la formulation pharmaceutique considérée permette de libérer la protéine thérapeutique sur une durée prolongée, de façon à limiter les variations de concentration plasmatique au cours du temps. Par ailleurs, cette formulation active doit, de préférence, satisfaire au cahier des charges suivant, déjà connu de l'homme de l'art : 2904219 2 1 libération prolongée d'une protéine thérapeutique active et non dénaturée, par exemple humaine ou synthétique, de sorte que la concentration plasmatique est maintenue au niveau thérapeutique ; 2 ù viscosité à l'injection suffisamment basse pour être aisément injectable; 5 3 - forme biocompatible et biodégradable ; 4 ù forme ne présentant ni toxicité, ni immunogénicité; 5 - forme ayant une excellente tolérance locale. Pour tenter d'atteindre ces objectifs, l'une des meilleures approches proposées dans l'art antérieur fut de développer des formes à libération prolongée de protéine(s) 10 thérapeutique(s) constituées par des suspensions, liquides et peu visqueuses de nanoparticules chargées en protéines thérapeutiques. Ces suspensions ont permis l'administration aisée de protéines thérapeutiques natives. Ainsi, la société Flamel Technologies a proposé une voie, dans laquelle la protéine thérapeutique est associée à des nanoparticules d'un copolyaminoacide 15 comprenant des groupements hydrophobes et des groupements hydrophiles. Le brevet US-B-5,904,936 décrit des particules submicroniques (NPV) -de taille moyenne comprise entre 0,01 et 0,5 m- et des particules microniques (MPV) -de taille moyenne comprise entre 0,5 et 20 m- de copolymère amphiphile de polyaminoacides comprenant au moins deux types d'aminoacides, l'un étant neutre hydrophobe, l'autre étant ionisable. 20 Des protéines telles que l'insuline s'adsorbent spontanément en solution aqueuse à ces particules. Le copolymère de polyaminoacide est, par exemple, un copolymère bloc de poly(L-leucine-b-L-glutamate de sodium). Ce brevet décrit l'agrégation de NPV en MPV par addition à une suspension colloïdale de poly-Leu/Glu, de sels monocationiques (sulfate d'ammonium) ou polycationiques (Fe2+, Fei+, Zn2+, Cal+, Ah+, A13+ ou Cul+), 25 d'acide (HCl), de polymères cationiques (polylysine). La demande de brevet WO-A-03/104303 divulgue des polyaminoacides amphiphiles comprenant des unités aspartique et/ou des unités glutamiques, au moins une partie de ces unités étant porteuses de greffons comportant au moins un motif alpha-tocophérol, e.g. : (polyglutamate ou polyaspartate greffé par l'alpha tocophérol d'origine synthétique ou 30 naturelle). Ces homopolyaminoacides "modifiés hydrophobes" forment spontanément dans l'eau une suspension colloïdale de nanoparticules, lesquelles sont aptes à s'associer aisément en suspension aqueuse à pH 7,4, avec au moins une protéine active (insuline). La durée de libération in vivo de la (ou les) protéine(s) active(s) (e.g. insuline) "vectorisée" par les suspensions selon US-B-5,904,936 & WO-A-2003/104303 gagnerait à 35 être augmentée. L'augmentation de la durée de libération a été partiellement obtenue par les formes pharmaceutiques décrites dans la demande PCT WO-A-05/051416 . Dans cette demande, 2904219 3 est divulguée une suspension colloïdale de nanoparticules (0,001-0,5 m) de poly(L-glutamate de sodium) modifiée hydrophobe est injectée à une concentration telle qu'après injection sous cutanée, il se forme in situ chez le patient un gel au contact de l'albumine endogène. La protéine est alors lentement libérée sur une période typique d'une semaine. 5 Cependant, lorsque la concentration en protéine thérapeutique à administrer est relativement élevée, comme c'est le cas par exemple pour l'hormone de croissance humaine, la durée de libération est limitée à quelques jours seulement. Il est possible d'améliorer cet art antérieur en proposant une formulation 10 pharmaceutique pour la libération prolongée de PA: • permettant après injection par voie parentérale (e.g. sous cutanée), d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée pour des PA (e.g. protéines, peptides thérapeutiques et petites molécules) non dénaturés et fortement concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml. 15 • et qui est stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique. Pour ce faire, il convient d'agréger entre elles les nanoparticules de la formulation selon WO 05/051416 en microparticules, au moyen d'ions multivalents de polarité opposée à 20 celle des groupements (GI) ionisables et au moins en partie ionisés du polyaminoacide amphiphile, lesdits ions étant présents dans des proportions bien définies. Cela conduit à une sélection d'une population spécifique de microparticules permettant une prolongation significative de la durée de libération du PA (e.g. protéine ou du peptide) avec lequel elles sont associées. Certains ions multivalents comme Mg2+, Cal+, Zn2+, Fe2+, Cul+ou leurs 25 mélanges et/ou A13+, Fei+ ou leurs mélanges, confèrent une excellente tolérance à une telle formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA. Cette dernière peut par exemple comprendre une suspension colloïdale, aqueuse, de basse viscosité, à base de particules microniques de polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique de taille comprise entre 0,5 et 100 microns, contenant des ions multivalents 30 Mg2+, Cal-', Znn+, Fe'', Cul+ A13+ ou Fei+, avec un produit R de la valence desdits ions multivalents au rapport molaire de ces ions aux groupements GI, étant compris entre 0,3 et 10. Ces particules microniques sélectionnées sont issues de l'agrégation d'un grand nombre de nanoparticules de copolymère amphiphile. Une suspension de microparticules chargée en PA (e.g. hGH) peut ainsi être fabriquée par 35 floculation avec des ions multivalents Mgr+, Cap+, Zn2+, Fei+, Cui+ A13+ ou Fei+, cette floculation étant suivie d'une maturation et d'un lavage. La suspension peut être ensuite lyophilisée ou atomisée puis reconstituée avec de l'eau pour réaliser une formulation prête à injecter . 2904219 4 Il est clair que ces formes de poudres sèches de microparticules sont a priori avantageuses au regard de la conservation. En effet, elles devraient permettre d'accroître la stabilité physique de ces microparticules et la stabilité du PA. Cependant, dans le cadre d'une utilisation de ces poudres de microparticules pour des 5 applications thérapeutiques par injection par voie parentérale, la difficulté consiste à pouvoir aisément disperser (ou mettre en suspension) extemporanément ces poudres pour obtenir une forme liquide microparticulaire, plus précisément une suspension, reconstituée qui soit stable par exemple au moins pendant quelques minutes, voire au moins quelques dizaines de minutes, à température ambiante. Cette stabilité est notamment recherchée afin 10 de permettre une manipulation aisée de cette suspension reconstituée. Il importe également que cette suspension reconstituée puisse être facilement injectée par passage au travers d'une aiguille creuse associée à une seringue ou à un stylo d'injection (type stylo à insuline). Enfin, il convient de tenir compte du fait que les opérations de dispersion, de manipulation et d'injection de la suspension reconstituée sont destinées à être exécutées 15 par les patients ou le personnel médical. Dans ce contexte, l'un des objectifs essentiels de l'invention serait de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la 20 formulation décrite dans le WO-A-05/051416, ces microparticules étant chargées en PA et ayant vocation à présenter des propriétés améliorées, notamment sous forme solide sèche, en particulier au regard de leur aptitude à la dispersion ("dispersabilité"), et, s'agissant de la suspension reconstituée, de sa stabilité et de son aptitude à être facilement manipulée et injectée. 25 Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant de bonnes propriétés de dispersion que ce soit en phase aqueuse ou organique et tout en conservant l'intégrité desdites microparticules. 30 Un autre objectif de l'invention est de proposer de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, lesdites microparticules étant chargées en PA et ayant d'excellentes propriétés de stabilité sous forme solide et sèche. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nouveau procédé de préparation 35 de microparticules sous forme solide et sèche, ces microparticules étant par ailleurs: obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-05/051416, 2904219 5 chargées en PA et telles que définies dans les objectifs ci-dessus. Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de préparation de microparticules sous forme solide et sèche, du type de celui visé dans l'objectif précédent 5 et qui soit par ailleurs simple, économique et industriel. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique comprenant de nouvelles microparticules obtenues par agrégation de nanoparticules de polymère amphiphile, biodégradable et hydrosoluble, par exemple du type de celles selon la formulation décrite dans le WO-A-03/104303, ces microparticules étant par ailleurs: 10 -* chargées en PA et telles que définies dans les objectifs ci-dessus. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée de PA, remédiant aux carences de l'art antérieur, et en particulier permettant après injection par voie parentérale (e.g. sous cutanée), d'obtenir une 15 durée de libération in vivo prolongée pour des PA (e.g. protéines, peptides thérapeutiques et petites molécules) non dénaturés, par exemple des protéines humaines ou synthétiques. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique permettant après injection par voie parentérale (e.g. sous cutanée), d'obtenir une durée de libération in vivo prolongée pour des protéines et peptides thérapeutiques fortement 20 concentrés, par exemple à plusieurs mg/ml. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à libération prolongée du PA in vivo, qui soit stable à la conservation tant sur le plan physico-chimique que biologique. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique à 25 libération prolongée du PA in vivo, qui présente au moins l'une des propriétés suivantes: biocompatibilité, biodégradabilité, atoxicité, bonne tolérance locale. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique pour la libération prolongée lente de PA in vivo, comprenant des microparticules de polymère PO amphiphile auto-associées à au moins un PA, le polymère PO étant un 30 polymère biodégradable, hydrosoluble, porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles [de préférence ionisables (GI) au moins en partie ionisés], formant spontanément dans l'eau une suspension de nanoparticules colloidales, ce polymère PO étant, par exemple, un polyamino acide dont la chaîne principale est formée par des unités aspartique et/ou des unités glutamiques, au moins une partie de ces unités 35 étant modifiées par greffage d'au moins un groupement hydrophobe GH, dans la chaîne et/ou en bout de chaîne. Un autre objectif de l'invention est de proposer un nécessaire de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce nécessaire étant par 2904219 6 exemple simple à l'utilisation de sorte qu'il puisse être mis en oeuvre aisément par le patient ou par le personnel médical. Un autre objectif de l'invention est de proposer un procédé de reconstitution de la formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés, ce procédé étant par exemple 5 simple à mettre en oeuvre en particulier pour le patient ou le personnel médical. Un autre objectif de l'invention est de proposer une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA en particulier une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire: • à base de microparticules PO associées à au moins un PA, telles que 10 définies dans les objectifs sus-énoncés; • ou obtenue à partir de la formulation formulation telle que définie dans les objectifs sus-énoncés. Pour atteindre ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le mérite de 15 découvrir, après de longues et laborieuses recherches, que, de façon tout à fait surprenante et inattendue, l'atomisation de formulations à base de PO amphiphile (par exemple de copolyamino-acides) et de PA conduit à des microparticules PO/PA sèches, très stables, en milieu liquide pour reconstituer une suspension et de taille comprise entre 0,5 et 100 microns. 20 Par ailleurs, les inventeurs ont eu le mérite de mettre au point des moyens de reconstitution d'une suspension à partir de ces microparticules, lesdits moyens permettant d'optimiser leur dispersion aussi bien en phase liquide aqueuse qu'en phase liquide organique. Une dispersion aisée, de bonne qualité et stable est en effet un préalable à 25 l'utilisation de ces suspensions reconstituées à partir de microparticules sèches PO/PA, à titre de formulations injectables. L'atomisation est une technique industrielle connue pour obtenir des particules sèches à partir d'une solution ou suspension de la matière constitutive desdites particules. L'atomisation consiste à évaporer très rapidement dans un flux d'air ou de gaz inerte 30 chaud des gouttelettes nébulisées de cette solution ou suspension. L'atomisation que l'on qualifie également de "spray-drying" est utilisée depuis de nombreuses années dans l'industrie chimique, agro-alimentaire ou pharmaceutique. Dans ce domaine pharmaceutique, l'atomisation peut être délicate car elle impose une contrainte thermique qui peut s'avérer rédhibitoire pour certains PA thermosensibles 35 tels que les PA à base de protéines ou d'autres composés peptidiques. Le recours à l'atomisation pour produire des particules sèches à base d'excipients et de PA ne va donc pas de soi, sauf à choisir des excipients aptes à empêcher voire à minimiser la dénaturation des PAs peptidiques. 2904219 7 C'est ainsi que la demande US-A-2005/0158392 divulgue la préparation de microparticules solides lipophiles chargées en PA peptidique par atomisation. Cette dernière consiste soit à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et un agent de surface lipophile (e.g. lécithine), voire un autre tensioactif du type 5 Tween 80; soit, dans un premier temps, à atomiser une solution aqueuse contenant de l'acide hyaluronique, du PA et éventuellement un tensioactif du type Tween 80 pour obtenir des particules primaires, et, dans un deuxième temps, à atomiser une solution alcoolique d'agent de surface lipophile (e.g. lécithine) dans laquelle sont dispersées les particules primaires. On met l'accent dans cette demande US sur la combinaison 10 protectrice acide hyaluronique et agent de surface lipophile (e.g. lécithine), ce dernier étant destiné à former un film d'enrobage des microparticules à base d'acide hyaluronique et de PA. Ce document ne fait pas mention ni même allusion à la mise en oeuvre de PO amphiphiles et encore moins de copolyaminoacides amphiphiles, à titre d'excipients ou de transporteurs de PA formant ensemble les microparticules. 15 Un autre exemple d'atomisation est celui décrit dans l'article Maa et al, J Pharm Sci, 87(2), 152-159, 1988. Selon ce document, le PA (l'hormone de croissance humaine) est complexé par du zinc en présence de tensio-actifs biodégradables, avant d'être atomisé en microparticules. Il apparaît donc que l'atomisation de protéines est une opération délicate 20 nécessitant l'utilisation de formulations complexes comprenant de nombreux excipients présents pour protéger le PA lors du procédé et garantir sa stabilité au stockage, ce qui est particulièrement crucial pour certaines molécules sensibles telles que l'hormone de croissance humaine ("human Growth Hormone" hGH). 25 Par ailleurs, le mérite des inventeurs est d'autant plus grand que l'art antérieur n'enseigne rien sur le difficile problème de la dispersion et de la stabilisation dans un liquide de microparticules sèches (s'agissant notamment des microparticules de PO amphiphile) conçues pour la libération prolongée de PA. 30 D'où il s'ensuit que l'invention concerne dans un premier aspect, des microparticules de polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère PO • étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles, • formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans 35 l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique, • et étant associé de façon non covalente avec le PA; lesdites microparticules étant caractérisées 2904219 8 a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 microns, de préférence entre 1 et 70 microns, de préférence entre 2 et 40 microns, 5 c. et en ce qu'elles sont dispersables en suspension colloïdale dans un test de "dispersabilité" DP1. Dans un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé de préparation de microparticules de PO associées avec au moins un principe (PA), ces microparticules 10 PO/PA étant en particulier celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention, i. le polymère PO • étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles [de préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés], 15 • formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique, • et étant associé de façon non covalente avec le PA; ii. lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 microns, de préférence entre 1 et 70 microns, de préférence entre 2 et 40 microns, 20 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution ou une suspension colloïdale de PO contenant du PA. Dans un troisième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une 25 suspension colloïdale, de "basse" viscosité, à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention. 30 Dans un quatrième aspect, l'invention concerne un nécessaire de reconstitution, en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention caractérisé en ce qu'il comprend: • des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le 35 procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention; • et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : les liquides essentiellement aqueux; les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau; 2904219 9 et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau. Dans un cinquième aspect, l'invention concerne un procédé de reconstitution, en particulier de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de 5 l'invention caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : • à mélanger des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de 10 l'invention; et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : les liquides essentiellement aqueux; les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau; et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau. 15 • et à agiter ce mélange. Dans un sixième aspect, l'invention concerne une formulation pharmaceutique solide pour la libération prolongée de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire: 20 • à base de microparticules PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles définies ci-dessus selon le premier aspect de l'invention ou celles obtenues par le procédé défini ci-dessus selon le deuxième aspect de l'invention; • ou obtenue à partir de la formulation telle que définie ci-dessus selon un troisième aspect de l'invention. 25 Avantages: Sans vouloir être lié à la théorie, on peut penser que les groupements hydrophobes des polymères PO, qui peuvent s'assembler en domaines hydrophobes, jouent un rôle important dans le processus de libération modifiée de la protéine tout comme dans la 30 stabilisation de celle ci . On peut avancer que des interactions physiques (non covalentes), se développent entre les domaines hydrophobes du polymère amphiphile PO et le PA (la protéine). Cette forte affinité de la protéine pour le polymère conduit à sa libération prolongée après administration sous cutanée. Ce mécanisme de libération diffère notablement, et peut être 35 éventuellement conjugué, à celui observé pour les microparticules d'acide polylactique, d'acide polylactique-glycolique ou encore à celles de hyaluronate de sodium dans lesquelles la libération du PA est essentiellement liée à la diffusion de l'actif et à la dégradation/érosion de la particule. 2904219 10 L'affinité de la protéine pour le polymère PO permet de limiter le phénomènes d'agrégation des protéines et autres dégradations qui peuvent intervenir lors du procédé d'atomisation sans nécessité d'avoir recours à d'autres stabilisants (e.g; sucres, tensio- 5 actifs...). Cet effet protecteur de PO permet également d'obtenir aisément des formulations liquides stables au stockage. Enfin, lorsque PO a un caractère essentiellement amorphe (notamment lorsque PO est un polyaminoacide) cela confère aux microparticules d'excellentes propriétés de stabilité physique lorsqu'elles sont conservées sous forme sèche. 10 Il apparaît donc que la présence de ces polyaminoacides amphiphiles PO apporte des leviers supplémentaires pour la libération modifiée du PA ainsi que pour sa stabilisation vis à vis de l'agrégation ou d'éventuelles dégradations chimiques. 15 De plus, la nature amphiphile du polymère PO permet lors du procédé d'atomisation, de pouvoir utiliser soit une phase entièrement aqueuse, soit une phase entièrement organique volatile, soit un mélange volatil de phase aqueuse et organique, ce qui offre une grande souplesse dans la mise en oeuvre du procédé. 20 En outre, du fait de leur nature chimique, les microparticules formées à partir de PO du type (co)polyaminoacides sont biodégradables et biocompatibles et possèdent généralement de bonnes propriétés de tolérance locale. Concernant le procédé d'obtention des microparticules solides et sèches suivant 25 l'invention, à savoir l'atomisation, il est par nature facilement industrialisable. Enfin, les microparticules selon l'invention et les formulations en contenant sont non toxiques, bien tolérées localement. 30 Définitions: Dans tout le présent exposé, à la différence des microparticules selon l'invention, le terme "particules submicroniques" ou "nanoparticules" désigne des particules de taille (mesurée dans un test T décrit ci-après), e.g. supérieure ou égale à 1 nm et inférieure à 500 nm, de préférence comprise entre 5 et 250 nm. 35 Au sens de l'invention, le terme "protéine" désigne, par exemple, aussi bien une protéine qu'un peptide, qu'il s'agisse d'un oligo ou d'un polypeptide. Cette protéine ou ce peptide peut être modifié ou non, par exemple, par greffage d'un ou de plusieurs 20 2904219 groupements polyoxyéthylèniques. Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, les termes "association" ou "associer" employés pour qualifier les relations entre un ou plusieurs PA et les polymères 5 PO, signifient en particulier que le ou les principes actifs sont liés au(x) polymère(s) PO par une liaison non covalente, par exemple par interaction électrostatique et/ou hydrophobe et/ou liaison hydrogène et/ou gêne stérique. ter aspect de l'invention: les microparticules 10 Caractéristique,La) Le fait d'associer, avant atomisation, le PA, par exemple une protéine ou un autre composé peptidique, avec un polymère PO amphiphile, tel qu'un (co)polyaminoacide amphiphile présente de nombreux avantages à la fois au niveau du procédé lui même que des propriétés des microparticules produites par atomisation. 15 Le traitement physique d'atomisation confère aux microparticules sèches solides obtenues, une structure particulière à l'origine de bon nombre de leurs propriétés avantageuses. Cette structure est correctement caractérisée par ce mode d'obtention par atomisation, de même que par les fonctions attachées à ces propriétés avantageuses. ~araçtéristiqu..0?à; Cette caractéristique est définie objectivement par le test T décritci-après. Test T de mesure de la taille des microparticules par diffraction laser: 25 a-Test TO dans le cas où les microparticules sont sous forme sèche 1 Matériel et conditions opératoires 11 2904219 12 Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 Module Voie Liquide Hydro 2000SM Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm Vitesse d'agitation 2000 tr/min Domaine d'analyse 0.02 tm to 2000 tm Modèle optique (Théorie de Mie) nfluide = 1.39 + i.0 Valeurs des indices de réfraction utilisés : npolystyrène latex = 1.59 + i.0 Fluide dispersant (eau) Polystyrène latex Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5% et20% Temps d'acquisition 10 s 3 Préparation de l'échantillon 5 - Préparer une solution de span 80 à (0% dans l'heptane (pour cela peser 0,01g de poudre de span 80 dans un flacon de 20 ml puis ajouter par pesée de l'heptane afin d'obtenir au final 10 g), - Peser environ 6 mg de poudre dans un tube à essai de 5mL, 10 -Ajouter 0,7 g d'heptane contenant 0,1% de span80 dans le dans le tube à essai, - Placer le tube à essai pendant 2 minutes dans un bain à ultrason afin de bien disperser la poudre 4 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est 15 vidangé et remplacé par de heptane. L'agitation du mobile Hydro2000SM est positionnée à 2400 tr/min. Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales pré-citées : - Alignement du faisceau laser, -Enregistrement des bruits de fond, 20 Après ces étapes l'opérateur va introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajout au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon diluée jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5% et 20% et lancer l'acquisition. 2904219 13 On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50% des objets analysés. Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes. 5 b- Test Tl dans le cas où les microparticules sont sous forme de dispersion aqueuse 1 Matériel et conditions opératoires Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 Module Voie Liquide Hydro 2000SM Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm Vitesse d'agitation 2400 tr/min Domaine d'analyse 0.02 tm to 2000 tm Modèle optique (Théorie de Mie) nfluide = 1.33 + i.0 Valeurs des indices de réfraction utilisés : npolystyrène latex = 1.59 + i.0 Fluide dispersant (eau) Polystyrène latex Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5% et20% Temps d'acquisition 10 s 3 Préparation de l'échantillon L'échantillon à analyser est introduit dans la cellule tel quel ou peut éventuellement être 10 redilué par de l'eau dans le cas d'échantillons très diffusants. 4 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'eau déminéralisée fraîche. L'agitation du mobile Hydro2000SM est positionnée à 2400 tr/min. 15 Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales pré-citées : -Alignement du faisceau laser, - Enregistrement des bruits de fond, Après ces étapes l'opérateur va introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajout au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon diluée jusqu'à ce 20 que l'obscuration soit comprise entre 5% et 20% et lancer l'acquisition. 10 2904219 14 On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50% des objets analysés. Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes. 5 c-Test T2 dans le cas où les microparticules sont en dispersion dans un solvant organique Ce test est analogue au test Ti. Il faut remplacer néanmoins dans ce cas l'eau par un solvant parfaitement miscible au liquide de dispersion et dans lequel les particules ne gonflent pas. Dans de nombreux cas l'heptane est utilisé. 1 Matériel et conditions opératoires Granulomètre laser Malvern Mastersizer 2000 G Module Voie Liquide Hydro 2000SM Volume du fluide vecteur dispersant 150 ml Longueurs d'onde (bleu et rouge) 466 et 632 nm Vitesse d'agitation 2000 tr/min Domaine d'analyse 0.02 tm to 2000 tm Modèle optique (Théorie de Mie) nheptane = 1.39 + i.0 Valeurs des indices de réfraction utilisés : npolystyrène latex = 1.59 + i.0 Fluide dispersant (par exemple heptane) Polystyrène latex Valeurs de l'obscuration pour déclencher l'analyse Entre 5% et20% Temps d'acquisition 10 s 3 Préparation de l'échantillon Pour préparer l'échantillon à analyser, il faut diluer 400 L de l'échantillon à analyser dans un tube à essai de 5mL avec 600 L d'heptane, puis passer la préparation au 15 vortex pendant 10 secondes (10 5), 4 Analyse de l'échantillon Le fluide circulant stocké dans le système de dispersion voie liquide au repos est vidangé et remplacé par de l'eau déminéralisée fraîche. L'agitation du mobile Hydro2000SM est positionnée à 2400 tr/min. 20 Démarrer la mesure avec les conditions expérimentales pré-citées : - Alignement du faisceau laser, 2904219 15 -Enregistrement des bruits de fond, Après ces étapes l'opérateur va introduire l'échantillon à analyser de la façon suivante : ajout au goutte à goutte (à la pipette pasteur) l'échantillon diluée jusqu'à ce que l'obscuration soit comprise entre 5% et 20% et lancer l'acquisition. 5 On obtient les données relatives au D50 qui est le diamètre en dessous duquel se trouvent 50% des objets analysés. Réaliser la moyenne du D50 de 3 mesures réalisées sur 3 préparations différentes. ~araçtéristique,(c) 10 Cette caractéristique est définie objectivement par le test DP1 décrit ci-après. Test de dispersabilité DP1 des poudres : 30 mg environ de poudre de particules sont introduits dans un flacon de 3 ml muni d'un septum. La masse précise des particules est alors déterminée (mi). 1 ml de solution de 15 reconstitution sont ajoutés à la poudre à travers le septum à l'aide d'une seringue de 1 ml munie d'une aiguille de 25G 5/8 - 0,5x16 mm (de type BD microlance3 par exemple) et le flacon est agité de manière manuelle par intermittence pendant une période 15 minutes. Le flacon est pesé de façon à connaître la masse exacte de solution introduite (m2). A l'issue de ce temps la totalité de la suspension est aspirée à travers une seringue de 1 ml (de type 20 Braun Injeckt-F Luer 1 ml û ref 9166017V) munie d'une aiguille de 25G et transvasée dans un nouveau flacon préalablement taré et on détermine la masse m3 de solution récupérée. On note l'aspect qualitatif de la dispersion (facilité à disperser, opacité, homogénéité 25 visuelle de la solution), la possibilité ou non de l'injecter à travers une aiguille de 25G, le % de solution récupérée (= m3/(mi+m2)) et on mesure la taille des microparticules selon un test Tl ou T2 (selon que le liquide de dispersion est une solution aqueuse ou un liquide organique). 30 On considère que la poudre a des bonnes propriétés de dispersion dans le liquide la suspension obtenue contient des microparticules de diamètre moyen compris entre 2 et 40 m, si l'aspect de la suspension est homogène et si elle peut être injectée à travers une aiguille de 25G et qu'au moins 80% de la suspension puisse être ainsi récupérés. 2904219 16 Au-delà des caractéristiques (a), (b) & (c), les microparticules selon l'invention peuvent être définies objectivement par le fait qu'elles sont stables dans un test ST1 et/ou dans un test ST2. 5 Test ST1 de stabilité physique des microparticules sèches : La taille des microparticules présentes dans la poudre sèche atomisée est mesurée dans la semaine qui suit l'atomisation de la poudre sur un granulomètre laser selon le test T0. La poudre est alors placée dans une étuve à 30 C pendant une semaine. Un échantillon témoin est laissé à 5 C. Une mesure de taille est réalisée à nouveau après dispersion 10 dans les mêmes conditions qu'au temps tO. Les distributions des particules avant et après vieillissement sont comparées. Test ST2 de stabilité colloïdale des particules en suspension: La poudre de microparticules est dispersé dans le liquide de dispersion sous 15 agitation magnétique à la concentration à laquelle on veut observer sa stabilité et est laissée à agiter sous agitation magnétique modérée pendant au minimum 2h (mesure tO). La taille des particules est mesurée sur un granulomètre laser selon le test Tl ou T2 en fonction du milieu (aqueux ou organique) de dispersion. La suspension est ensuite laissée au repos pendant 7 jours à 5 C. Le culot de 20 sédimentation est dispersé par agitation quelques minutes (jusqu'à obtention d'une suspension homogène après observation visuelle). Une mesure de taille est réalisée à nouveau après dispersion dans les mêmes conditions qu'au temps tO. Le polymère PO 25 Les polymères PO selon l'invention sont des polymères biodégradables, hydrosolubles et porteurs de groupements hydrophobes GH et de groupements hydrophiles [de préférence des groupements GI ionisables, au moins en partie ionisé]. Les groupements hydrophobes GH peuvent être en nombre réduit vis à vis du reste de la chaîne et peuvent se situer latéralement à la chaîne ou intercalés dans la chaîne, et être 30 répartis de façon aléatoire (copolymère statistique) ou répartis sous forme de séquences ou de greffons (copolymères blocs ou copolymères séquencés). Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un (co)polyamino acide amphiphile. Un tel choix de PO procure une excellente compatibilité avec les PA de type 35 protéine(s)/peptide(s). Il est ainsi possible de simplifier grandement la composition de la solution ou suspension de départ du PA de type protéine(s)/peptide(s) avec le polymère PO. Cette solution ou suspension de départ peut comprendre uniquement le PA et le PO dans une phase aqueuse et/ou organique. L'absence d'autres ingrédients permet qu'une telle 25 2904219 17 solution ou suspension de départ peut être filtrée sur 0,2 m avant l'atomisation, ce qui permet de réaliser cette dernière dans des conditions aseptiques. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, PO est choisi parmi les (co)polyaminoacides amphiphiles et leurs mélanges. 5 Au sens de l'invention et dans tout le présent exposé, le terme polyaminoacide couvre aussi les polyaminoacides naturels que les polyaminoacides synthétiques, ainsi que les oligoaminoacides comprenant de 2 à 20 unités "acide aminé" au même titre que les polyaminoacides comprenant plus de 20 unités "acide aminé". De préférence, les polyaminoacides selon la présente invention sont des oligomères 10 ou des homopolymères comprenant des unités récurrentes acide glutamique ou aspartique ou des copolymères comprenant un mélange de ces deux types d'unités "acide aminé". Les unités considérées dans ces polymères sont des acides aminés ayant la configuration D ou L ou D/L et sont liées par leurs positions alpha ou gamma pour l'unité glutamate ou glutamique et alpha ou bêta pour l'unité aspartique ou aspartate. 15 Les unités "acide aminé" préférées de la chaîne polyaminoacide principale sont celles ayant la configuration L et une liaison de type alpha. Suivant un mode encore plus préféré de réalisation de l'invention, le polymère PO est un polyaminoacide formé par des unités aspartiques et/ou des unités glutamiques, au moins une partie de ces unités étant porteuses de greffons comportant au moins un 20 groupement hydrophobe GH. Ces polyaminoacides sont notamment du type de ceux décrits dans la demande de brevet PCT WO-A-00/30618. Selon une première éventualité, le (ou les) PO est (sont) défini(s) par la formule générale (I) suivante : (I) dans laquelle : ^ RI représente un H, un alkyle linéaire en C2 à ClO ou ramifié en C3 à 30 C10, benzyle, une unité acide aminé terminale ou -R4-[GH] ; ^ R2 représente un H, un groupe acyle linéaire en C2 à C10 ou ramifié en C3 à C10, un pyroglutamate ou -R4-[GH]; NHRI 2904219 18 ^ R3 est un H ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, 5 - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyethylèneimine étant 10 particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le 15 sousgroupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ; ^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 unités acide aminé ; ^ A représente indépendamment un radical -CH2- (unité aspartique) ou -CH2-CH2(unité glutamique) ; 20 ^ n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH 7 et à 25 C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de PO, de préférence n/(n + m) est compris entre 1 à 25 % molaire et mieux encore entre 1 et 15 % molaire ; 25 ^ n + m est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ; ^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone. Dans une forme préférée de réalisation de l'invention, le groupement hydrophobe 30 GH de PO est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol, et en ce que R4 représente une liaison directe. Selon une deuxième éventualité, PO répond à l'une des formules générales (II), 35 (III) et (IV) suivantes : 2904219 19 COOR3 / A H H _ 1 I NN\ N I _m, R30 H O COOR3 A O N In' O H [G H] R4' o [GH]NR4 (II) COOR3 A/ O O A N N I R50 - I O H H O H m' R 3' COOR 5 20 25 (III) 3' COOR [GH] \R4 --N dans lesquelles : ^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone; 10 ^ R30 est un groupement alkyle linéaire en C2 à C6 ; ^ R3 ' est un H ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, 15 - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine, ^ R50 est un groupement alkyle, dialcoxy ou diamine en C2 à C6; ^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 unités acide aminé ; n" R4 A o [GH] o N I- H 5 2904219 20 ^ A représente indépendamment un radical -CH2- (unité aspartique) ou -CH2-CH2- (unité glutamique) ; ^ n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300. Suivant une variante intéressante, le groupement R4 représente une liaison directe. Selon une troisième éventualité, PO est une copolhydroxyalkyl(de préférence éthyl)glutamine "essentiellement neutre" comprenant une multiplicité de groupements 10 hydrophobes (GH) pendants et identiques ou différents entre eux. La copolyhydroxyalkylglutamine est également porteuse de groupements hydroxyalkylamine. Ces groupements hydroxyalkylamine sont, de préférence, liés au copolymère par l'intermédiaire d'une liaison amide. Les groupements hydroxyalkylamine utilisables pour fonctionnaliser les unités glutamates de cette copolyhydroxyalkylglutamine sont 15 identiques ou différents entre eux et sont par exemple choisis parmi les groupements suivants: le 2-hydroxyéthylamine, le 3-hydroxypropylamine, le 2,3-dihydroxypropylamine, le tris(hydroxyméthyl)aminométhane et le 6-hydroxyhexylamine. Avantageusement, au moins l'un des groupements hydrophobes GH est inclus dans un greffon hydrophobe comprenant au moins une rotule (ou motif) d'espacement ("spacer") 20 permettant de relier le groupement hydrophobe GH à une chaîne de copolyglutamates (par exemple une chaîne principale ù squelette-copolyglutamates). Cette rotule peut comprendre, e.g. au moins une liaison covalente directe et/ou au moins une liaison amide et/ou au moins une liaison ester. Par exemple, la rotule peut être du type de celles appartenant au groupe comportant notamment: les unités "acide aminé" différentes de 25 l'unité monomérique constitutive du copolyglutamates , les dérivés des aminoalcools, les dérivés des polyamines (par exemple les diamines), les dérivés des polyols (par exemple les diols) et les dérivés des hydroxyacides. Le greffage des GH sur la chaîne copolyglutamates ou polyalkylglutamine peut passer par la mise en oeuvre de précurseurs de GH, aptes à se lier à la chaîne copolyglutamates ou copolyhydroxyalkylglutamines. Les 30 précurseurs des GH sont, en pratique et sans que cela ne soit limitatif, choisis dans le groupe comprenant les alcools et les amines, ces composés pouvant être fonctionnalisés facilement par l'homme de l'art. Pour plus de détails sur cette copolhydroxyalkyl(de préférence éthyl)glutamine, on se référera au FR-A-2.881.140 35 Suivant une variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant : 20 25 2904219 21 ^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, ^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs 5 carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu- ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro-atome (de préférence O et/ou N et/ou S). 10 Suivant une autre variante avantageuse, notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, le groupement hydrophobe GH est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol, et en ce que R4 représente une 15 liaison directe. Suivant une autre variante avantageuse, les n groupements GH du PO notamment selon au moins l'une des trois éventualités susvisées, représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante : H O 1 N R5 (GH) dans laquelle : - R5 représente un méthyle(alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ; - R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone; - lvariede0à6. Selon une caractéristique remarquable de l'invention, tout ou partie des 30 groupements hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante, dans le groupe de radicaux comportant : ^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, 6 tiR 2904219 22 ^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu- ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et 5 pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro- atome (de préférence O et/ou N et/ou S). En pratique et sans que cela ne soit limitatif, le radical hydrophobe R6 du greffon du PO est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le 10 cholestérol. Avantageusement, la chaîne principale du polyaminoacide est : - un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique; - un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique 15 - ou un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique. De manière remarquable, la distribution des unités aspartiques et/ou glutamiques de la chaîne polyaminoacide principale du PO est telle que le polymère ainsi constitué est 20 soit aléatoire, soit de type bloc, soit de type multibloc. Selon un autre mode de définition, PO a une masse molaire qui se situe entre 2 000 et 100 000 g/mole, et de préférence entre 5 000 et 40 000 g/mole. Selon une variante, PO est porteur d'au moins un greffon de type polyalkylèneglycol lié à une unité glutamate et/ou aspartate. 25 Avantageusement, ce greffon est de type polyalkylène-glycol est de formule (V) suivante. 0t,,, -R8 R7 (V) 3 0 dans laquelle : 35 R'4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 unités acide aminé ; X est un hétéroatome choisi dans le groupe comportant l'oxygène, l'azote ou un soufre ; R7 et R8 représentent indépendamment un H, un alkyle linéaire en Cl à C4; 2904219 23 - n"' varie de 10 à 1000, de préférence de 50 à 300. En pratique, le polyalkylèneglycol est par exemple un polyethylène glycol. Il est souhaitable, conformément à l'invention, que le pourcentage molaire de greffage du polyalkylène glycol varie de 1 à 30 %. 5 Les polyaminoacides PO sont en outre extrêmement intéressants, du fait qu'à un taux de greffage ajustable, ils se dispersent dans l'eau à pH 7,4 (par exemple avec un tampon phosphate) pour donner des suspensions colloïdales. De plus, des principes actifs PA tels que des protéines, des peptides ou des petites molécules, peuvent s'associer spontanément à des nanoparticules comprenant ces 10 polyaminoacides PO. Il convient de comprendre que les PO contiennent des fonctions ionisables qui sont, selon le pH et la composition, soit neutres (par exemple COOH), soit ionisées (par exemple COO),. Pour cette raison, la solubilité dans une phase aqueuse est directement fonction du taux de fonctions ionisées et donc du pH. En solution aqueuse, dans le cas de 15 fonctions carboxyliques, le contre-ion peut être un cation métallique tel que le sodium, le calcium ou le magnésium, ou un cation organique tel que la triéthano lamine, la tris(hydroxyméthyl)-aminométhane ou une polyamine tel que la polyéthylèneimine. Les PO de type polyaminoacide sont obtenus, par exemple,par des méthodes connues de l'homme de l'art. Les polyaminoacides statistiques peuvent être obtenus par 20 greffage du greffon hydrophobe, préalablement fonctionnalisé par "l'espaceur", directement sur le polymère par une réaction classique de couplage. Les PO polyaminoacides blocs ou multiblocs peuvent être obtenus par polymérisation séquentielle des anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA) correspondants. On prépare par exemple un polyaminoacide, homopolyglutamate, 25 homopolyaspartate ou un copolymère glutamate/aspartate, bloc, multibloc ou aléatoire selon des méthodes classiques. Pour l'obtention de polyaminoacide de type alpha, la technique la plus courante est basée sur la polymérisation d'anhydrides de N-carboxy-aminoacides (NCA), décrites, par exemple, dans l'article "Biopolymers, 1976, 15, 1869 et dans l'ouvrage de H.R. Kricheldorf 30 "alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydride and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Les dérivés d'NCA sont de préférence des dérivés NCA-0-Me, NCA-0-Et ou NCA-0-Bz (Me = Méthyl, Et = Ethyle et Bz = Benzyle). Les polymères sont ensuite hydrolysés dans des conditions appropriées pour obtenir le polymère sous sa forme acide. Ces méthodes sont inspirées de la description donnée dans le brevet FR-A-2 801 226 de la 35 demanderesse. Un certain nombre de polymères utilisables selon l'invention, par exemple, de type poly(alpha-L-aspartique), poly(alpha-L-glutamique), poly(alpha-D-glutamique) et poly(gamma-L-glutamique) de masses variables sont disponibles commercialement. Le polyaspartique de type alpha-bêta est obtenu par condensation de l'acide aspartique (pour 2904219 24 obtenir un polysuccinimide) suivie d'une hydrolyse basique (cf. Tomida et al. Polymer 1997, 38, 4733-36). Le couplage du greffon avec une fonction acide du polymère est réalisé aisément par réaction du polyamino acide en présence d'un carbodiimide comme agent de couplage 5 et optionnellement, un catalyseur tel que le 4-diméthylaminopyridine et dans un solvant approprié tel que la diméthylformamide (DMF), la N-méthylpyrrolidone (NMP) ou la diméthylsulfoxide (DMSO). Le carbodiimide est par exemple, le dicyclohexylcarbodiimide ou le diisopropylcarbodiimide. Le taux de greffage est contrôlé chimiquement par la stoechiométrie des constituants et réactifs ou le temps de réaction. Les greffons 10 hydrophobes fonctionnalisés par un "espaceur" sont obtenus par couplage peptidique classique ou par condensation directe par catalyse acide. Ces techniques sont bien connues de l'homme de l'art. Pour la synthèse de copolymère bloc ou multibloc, on utilise des dérivés NCA préalablement synthétisé avec le greffon hydrophobe. Par exemple, le dérivé NCA- 15 hydrophobe est copolymérisé avec le NCA-O-Benzyl puis on enlève par hydrolyse sélectivement les groupements benzyliques. Le(s) principe(s) actif(s) PA Concernant le PA, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant: les protéines, les 20 glycoprotéines, les protéines liées à une ou plusieurs chaînes polyalkylèneglycol [de préférence polyéthylèneglycol (PEG) : "protéines-PEGylées"], les peptides, les polysaccharides, les liposaccharides, les oligonucléotides, les polynucléotides et leurs mélanges, et, plus préférentiellement encore, dans le sous-groupe de érythroproïétine, oxytocine, 25 vasopressine, hormone adrénocorticotropique, facteur de croissance épidermal, facteur de croissance des plaquettes (PDGF), les facteurs stimulants de l'hématopoïèse et leurs mélanges, les facteurs VIII et IX, hémoglobine, les cytochromes, les albumines prolactine, luliberine, hormone relargant l'hormone lutéinisante (LHRH), les antagonistes de la LHRH, les concurrents de la LHRH, les hormones de croissance (GH) humaine, 30 porcine ou bovine, le facteur relargant l'hormone de croissance, l'insuline, la somatostatine, le glucagon, les interleukines ou leurs mélanges (IL-2, IL-11, IL-12), les interférons-a, 13 ou y, la gastrine, la tétragastrine, la pentagastrine, l'urogastrone, la sécrétine, la calcitonine, l'enkephaline, les endomorphines, les angiotensines, l'hormone relargant la thyrotropine (TRH), le facteur nécrosant des tumeurs (TNF), le facteur de 35 croissance des nerfs (NGF), le facteur stimulant les colonies granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF), le facteur stimulant les colonies de macrophages (M-CSF), heparinase, la protéine morphogénique de l'os (BMP), hANP, le peptide ressemblant au glucagon (GLP-1), VEG-F, l'antigène 2904219 25 recombinant de l'hépatite B (rHBsAg), la rénine, les cytokines, la bradykinine, les bacitracines, les polymixines, les colistines, la tyrocidine, les gramicidines, les cyclosporines et analogies synthétiques, les modifications et fragments actifs pharmaceutiquement d'enzymes, de cytokines, d'anticorps, d'antigènes et de vaccins. 5 Selon une variante, le principe actif est une "petite" molécule organique, éventuellement ionique, hydrophobe ou hydrophile, du type de celles appartenant à la famille des anthracyclines, des taxoïdes ou descamptothécines ou du type de celles appartenant à la famille des peptides telles que la leuprolide ou la cyclosporine et leurs 10 mélanges Au sens du présent exposé, une "petite" molécule est notamment une petite molécule non protéinique, par exemple exempte d'acides aminés. Selon une autre variante, le principe actif est avantageusement choisi parmi au 15 moins l'une des familles de substances actives suivantes : les agents de traitement de l'abus d'alcool, les agents de traitement de la maladie d'Alzheimer, les anesthésiques, les agents de traitement de l'acromégalie, les analgésiques, les antiasthmatiques, les agents de traitement des allergies, les agents anticancéreux, les anti-inflammatoires, les anticoagulants et antithrombotiques, les anti-convulsivants, les antiépileptiques, les 20 antidiabétiques, les antiémétiques, les antiglaucomes, les antihistaminiques, les anti- infectieux, les antibiotiques, les antifongiques, les antiviraux, les antiparkinsoniens, les anti-cholinergiques, les antitussifs, les inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, les agents cardiovasculaires, les hypolipémiants, les anti-arythmiques, les vasodilatateurs, les antiangineux, les anti-hypertenseurs, les vasoprotecteurs, les inhibiteurs de cholinestérase, 25 les agents de traitement des désordres du système nerveux central, les stimulants du système nerveux central, les contraceptifs, les promoteurs de fécondité, les inducteurs et inhibiteurs du travail utérin, les agents de traitement de la mucoviscidose, les agonistes des récepteurs de la dopamine, les agents de traitement de l'endométriose, les agents de traitement des dysfonctionnements érectiles, les agents de traitement de la fertilité, les 30 agents de traitements des troubles gastro-intestinaux, les immunomodulateurs et les immunosuppresseurs, les agents de traitement des troubles de la mémoire, les antimigraineux, les relaxants des muscles, les analogues de nucléosides, les agents de traitement de l'ostéoporose, les parasympathomimétiques, les prostaglandines, les agents psychothérapeutiques, les sédatifs, les hypnotiques et tranquillisants, les neuroleptiques, 35 les anxiolytiques, les psychostimulants, les antidépresseurs, les agents de traitements dermatologiques, les stéroïdes et les hormones, les amphétamines, les anorexiques, les anti-douleurs non analgésiques, les anti-épileptiques, les barbituriques, les 2904219 26 benzodiazépines, les hypnotiques, les laxatifs, les psychotropes et toutes les associations de ces produits. Sur le plan quantitatif, il est particulièrement intéressant que la fraction massique 5 en PA non associé aux particules microniques [PA non associé] en % en poids soit telle que : o [PA non associé] L'agrégation en conditions stériles selon les modes de préparation décrits ci-dessus permet ainsi d'injecter directement la formulation à un patient. 25 6eme aspect de l'invention: Formulation pharmaceutique solide Cette formulation pour la libération prolongée de PA comprend une forme poudre sèche pour inhalation et administration pulmonaire à base de microparticules PO/PA ci-dessus définies. 30 Autres aspects de l'invention La présente invention vise également des produits solides, dérivés des microparticules de PO selon l'invention. En pratique, ces produits dérivés peuvent notamment être constitués par des poudres, des gels, des implants ou des films, entre autres. 35 Ainsi, l'invention vise des produits dérivés de la formulation selon l'invention, pris en tant que tels, quel que soit leur procédé d'obtention. 20 2904219 36 L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique consistant essentiellement à administrer la formulation telle que décrite dans le présent exposé, par voie parentérale, mucosale, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intra-péritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, voire par voie orale, nasale, 5 pulmonaire, vaginale ou oculaire. Suivant une variante particulière de l'invention, cette méthode de traitement thérapeutique consiste à administrer la formulation telle que décrite supra par injection parentérale, sous-cutanée, intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale, intracérébrale ou dans une tumeur, de préférence de manière à ce qu'elle forme un dépôt sur le site 10 d'injection. L'invention sera mieux comprise et ses avantages et variantes de mise en oeuvre ressortiront bien des exemples qui suivent et qui décrivent la synthèse des PO formés par des polyaminoacides greffés par un groupement hydrophobe, leur transformation en 15 système de libération prolongée de PA, à savoir en formulation selon l'invention (poudre de microparticules sèches) et les caractéristiques de stabilité et de redispersabilité de tels systèmes. EXEMPLES : EXEMPLE 1 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO-A Synthèse d'un polyglutamate greffé par l'alpha-tocophérol d'origine synthétique On solubilise 15 g d'un acide alpha-L-polyglutamique (de masse équivalente à environ 16 900 Da par rapport à un standard en polyoxyéthylène et obtenu par polymérisation de 25 NCAG1uOMe suivie d'une hydrolyse comme décrits dans la demande de brevet FR-A-2 801 226) dans 288 ml de diméthylformamide (DMF) en chauffant à 80 C jusqu'à solubilisation du polymère. On refroidit la solution à 15 C et on ajoute successivement 2,5 g de D,L-alpha-tocophérol (> 98 % obtenu de Fluka ) préalablement solubilisé dans 8 ml de DMF, 280 mg de 4-dimethylaminopyridine préalablement solubilisé dans 1 ml de 30 DMF et 1,6 g de diisopropylcarbodiimide préalablement solubilisé dans 6 ml de DMF. Après 3 heures sous agitation, le milieu réactionnel est versé dans 1200 ml d'eau contenant 15 % de chlorure de sodium et d'acidechlorhydrique (pH 2). Le polymère précipité est ensuite récupéré par filtration, lavé par de l'acide chlorhydrique 0,1 N, de l'eau et par de l'éther diisopropylique. Le polymère est ensuite séché à l'étuve sous vide à 40 C. On 35 obtient un rendement de l'ordre de 90 %. La masse molaire mesurée par la chromatographie d'exclusion stérique est de 15500 par rapport à un standard polyoxyéthylène. La taux de tocophérol greffé, estimé par la spectroscopie RMN du 2904219 37 proton, est de 5,1 % molaire. Une suspension de nanoparticules du polymère dans l'eau est obtenu en le solubilisant dans l'eau en ajustant le pH (neutralisation des carboxylates) à 7 +/-1. 5 EXEMPLE 2 : SYNTHESE D'UN POLYMERE AMPHIPHILE PO B L'exemple 2 est adapté de l'exemple 1 en visant un taux de greffage de 20% EXEMPLE 3 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IFN-a2B 10 Préparation d'une solution contenant 20 mg/g de polymère et 0, 25 mg/g d'IFN 200 g de solution de polymère PO-A à 30 mg/g sont introduits dans un flacon de 500 ml. 68 g d'eau sont ensuite introduits dans le flacon contenant le polymère. Une solution congelée d'IFN-a-2b concentrée à 2,8 mg/g est décongelée à 25 C pendant 1h et 26,8 g de 15 cette solution congelée sont introduits dans le flacon contenant la solution de polymère. Le mélange est laissé pendant 14 h à température ambiante. La solution est filtrée sur un filtre stérilisant 0,21um. 20 Atomisation de la solution polymère-IFN La solution est atomisée sur un appareil de spray-drying de type Büchi B290 . La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (7 bars û 900 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) 25 est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 90 C ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 45 C. Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) =5 m. 30 Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme dégradée n'est détectée. EXEMPLE 4 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE 35 POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IFN-a2B ET DU POLYSORBATE 80 La solution de polymère PO et d'interferon est préparée à l'identique de l'exemple 3. 0,9 g de polysorbate 80 sont ajoutés à la solution avant atomisation. 2904219 38 Atomisation de la solution polymère-IFN en présence de polysorbate La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3. 5 Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) =5 m. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme dégradée n'est détectée. 10 EXEMPLE 5: PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES ACIDIFIEES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IFN-a2B La solution de polymère PO-A et d'IFN est préparée à l'identique de l'exemple 3. Elle est 15 ensuite diluée par ajout d'eau de façon à ce que la concentration en polymère PO-A soit de 15 mg/g (la concentration en IFN étant alors de 0,188 mg/g). Après filtration sur 0,21um, la solution est acidifiée par ajout de HC1 1N jusqu'à obtention d'un pH=4. La solution ainsi obtenue est opalescente 20 Atomisation de la solution polymère-IFN acidifiée La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3. Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) =5 m. 25 Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme dégradée n'est détectée. EXEMPLE 6 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE 30 POLYMERE PO-A ENROBEES DE PVP ET CONTENANT DE L'IFN-a2B Une poudre de microparticules sèches de polymère PO-A et d'IFN est obtenue à partir d'un mélange PO-A/IFN selon le protocole utilisé à l'exemple 3. A l'issue de l'étape d'atomisation 1,5 g de cette poudre sont remis en suspension dans une 35 solution éthanolique contenant 7 g/1 de polyvinylpyrolidone (PVP) de grade injectable de type PVP K30. La suspension éthanolique est agitée 2h puis elle est ensuite atomisée une deuxième fois sur l'appareil de spray-drying de type Büchi B290 muni d'un piège d'extraction pour solvant organique (boucle d'inertage à -20 C) et fonctionnant en circuit 2904219 39 fermé sous azote. La solution liquide est aspirée à une vitesse de 5 ml/min et nébulisée à travers une buse de pulvérisation alimentée en azote (7 bars û 670 1/h). Le débit d'aspiration (air de séchage) est de 40 m3/h. La température d'entrée est maintenue à 80 C ce qui induit dans ces conditions une température en sortie de 55 C. 5 Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) = 6 m. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de 10 l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme dégradée n'est détectée. 15 EXEMPLE 7 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE 20 POLYMERE PO-B CONTENANT DE L'IFN-a2B Le protocole de préparation de la solution polymère-IFN et d'atomisation est exactement identique à celui décrit dans l'exemple 3 en remplaçant le polymère PO-A par le polymère PO-B. 25 Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) =4 m. Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'IFN par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme 30 dégradée n'est détectée. EXEMPLE 8 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'HGH 35 Préparation de la solution d'hGH concentrée : 60 g d'une solution d'hormone de croissance humaine recombinante (concentration 3,9 mg/g) sont décongelés pendant 1h30 à 25 C et concentrées environ 6 fois par 2904219 ultrafiltration frontale sur membrane de 10 KD jusqu'à obtention d'une concentration de 24 mg/g (contrôle par HPLC). Mélange avec la solution de polymère 5 52 g d'une solution concentrée de polymère PO-A à 30 mg/ sont dilués à 19,5 mg/g par ajout de 28 g d'eau. 8g de la solution d'hGH à 24 mg/g sont versés lentement sur la solution de polymère ainsi diluée. Le mélange est laissé pendant une nuit à température ambiante puis filtré sur filtré stérilisant 0 ,2 m. 10 Atomisation de la solution polymère-HGH La solution est atomisée dans des conditions identiques à celle décrites dans l'exemple 3. Caractérisation des microparticules obtenues : La taille des particules obtenues (selon test TO) est de D(0,5) =5 m. 15 Après dispersion de la poudre dans l'eau à la concentration d'atomisation, le dosage de l'HGH par HPLC est identique à celui de la solution avant atomisation et aucune forme dégradée n'est détectée. 20 EXEMPLE 9 PREPARATION DE PARTICULES MICRONIQUES SECHES DE POLYMERE PO-A CONTENANT DE L'IL2 Préparation de la solution d'IL2 concentrée: 25 100 g d'une solution congelée d'IL2 à la concentration de 2 g/1 stabilisée par du SDS sont décongelés à température ambiante puis la solution est refroidit à une température comprise entre 0 et 2 C. 100 g d'éthanol absolu sont ajoutés lentement à cette solution de façon à précipiter la protéine. Le précipité est récupéré par filtration sur une membrane de 0,65/0,45 m dans une cellule de diafiltration frontale et lavé avec 200 g d'eau. Le 30 précipité est séché par application d'une flux d'azote. Le précipité est alors dissous dans 10 g de soude 0,02N préalablement refroidit ( REVENDICATIONS - 1 - Microparticules de polymère (PO) contenant au moins un principe actif (PA), le polymère PO • étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles, • formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique, • et étant associé de façon non covalente avec le PA; lo lesdites microparticules étant caractérisées a. en ce qu'elles sont obtenues par atomisation d'une solution ou d'une suspension colloïdale de PO comprenant au moins un PA, b. par une taille, mesurée dans un test T, comprise entre 0,5 et 100 microns, de préférence entre 1 et 70 microns, de préférence entre 2 et 40 microns, 15 c. et en ce qu'elles sont dispersables en suspension colloïdale dans un test de "dispersabilité" DP1. - 2 - Microparticules selon la revendication 1 caractérisées en ce qu'elles sont stables dans un test ST1 et/ou dans un test ST2. - 3- Microparticules selon la revendication 1 ou 2 caractérisées en ce que PO est un copolymère de type bloc ou aléatoire. - 4 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées 25 en ce que les groupements hydrophiles du PO sont des groupements ionisables (GI), au moins en partie ionisés. - 5 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le polymère PO est un (co)polyaminoacide amphiphile ou un mélange de 30 (co)polyaminoacides amphiphiles. - 6 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que PO est un polyaminoacide dont la chaîne principale est formée par des unités aspartiques et/ou des unités glutamiques, au moins une partie de ces unités étant 35 modifiées par greffage d'au moins un groupement hydrophobe (GH), dans la chaîne et/ou en bout de chaîne. 2904219 46 - 7 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que PO est défini par la formule générale (I) suivante : NHRI 5 (I) dans laquelle : ^ RI représente un H, un alkyle linéaire en C2 à ClO ou ramifié en C3 à C10, benzyle, une unité acide aminé terminale ou -R4-[GH] ; ^ R2 représente un H, un groupe acyle linéaire en C2 à CIO ou ramifié en C3 à C10, un pyroglutamate ou -R4-[GH] ; ^ R3 est un H ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, • les cations à base de polyamine (la polyethylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine ; ^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 unités acide aminé ; ^ A représente indépendamment un radical -CH2- (unité aspartique) ou - CH2-CH2- (unité glutamique) ; ^ n/(n+m) est défini comme le taux de greffage molaire et sa valeur est suffisamment basse pour que PO mis en solution dans l'eau à pH 7 et à 25 C, forme une suspension colloïdale de particules submicroniques de PO; 5 2904219 47 ^ n + m varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300 ; ^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone. - 8 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisées en ce que le (ou les) PO répond à l'une des formules générales (II), (III) et (IV) suivantes : COOR3 / A H H 1 1 N N N 1 m R3 H O COOR3 A O N 1 - n, H o [G H] R4' o [GH]NR4 COOR3 A O O A H N, [GH] m' R 3' COOR o N 1- H n' R5 15 20 25 H [GH]N , 4, R 3' COOR y [GH] I \R4 ---N dans lesquelles : ^ GH représente un groupement hydrophobe comportant 6 à 30 atomes de carbone; ^ R30 est un groupement alkyle linéaire en C2 à C6 ; ^ R3 ' est un H ou une entité cationique, de préférence sélectionnée dans le groupe comprenant : - les cations métalliques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, - les cations organiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant : • les cations à base d'amine, • les cations à base d'oligoamine, n" R4 A o [GH] o N 1- H 5 10 15 2904219 48 • les cations à base de polyamine (la polyéthylèneimine étant particulièrement préférée), • les cations à base d'acide(s) aminé(s) avantageusement choisis dans la classe comprenant les cations à base de lysine ou d'arginine, - ou les polyaminoacides cationiques avantageusement choisis dans le sous-groupe comprenant la polylysine ou l'oligolysine, ^ R50 est un groupement alkyle, dialcoxy ou diamine en C2 à C6 ; ^ R4 représente une liaison directe ou un "espaceur" à base de 1 à 4 unités acide aminé ; ^ A représente indépendamment un radical -CH2- (unité aspartique) ou - CH2-CH2- (unité glutamique) ; ^ n' + m' ou n"est défini comme le degré de polymérisation et varie de 10 à 1000, de préférence entre 50 et 300. - 9 - Microparticules selon la revendication 7 ou 8 caractérisées en ce que le groupement R4 représente une liaison directe. - 10 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisées en ce 20 que le (ou les) PO comprend au moins une copolhydroxyalkyl(de préférence éthyl)glutamine "essentiellement neutre" comprenant une multiplicité de groupements hydrophobes (GH) pendants et identiques ou différents entre eux. - 11 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en 25 ce que tout ou partie des radicaux hydrophobes GH des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant : ^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, 30 ^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insatu- ration et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), ^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéro-35 atome (de préférence O et/ou N et/ou S). - 12 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en ce que le groupement hydrophobe GH est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le 2904219 49 groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol, et en ce que R4 représente une liaison directe. - 13 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 10 caractérisées en 5 ce que les n groupements GH du PO représentent chacun indépendamment les uns des autres un radical monovalent de formule suivante : H O 1 6 R R5 (GH) dans laquelle : 10 - R5 représente un méthyle(alanine), isopropyle (valine), isobutyle (leucine), secbutyle (isoleucine), benzyle (phénylalanine) ; - R6 représente un radical hydrophobe comportant de 6 à 30 atomes de carbone; - 1 varie de 0 à 6. 15 - 14 - Microparticules selon la revendication 13 caractérisées en ce que tout ou partie des radicaux hydrophobes R6 des PO sont choisis de façon indépendante dans le groupe de radicaux comportant : ^ un alcoxy linéaire ou ramifié comportant de 6 à 30 atomes de carbone et 20 pouvant comporter au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S) et/ou au moins une insaturation, ^ un alcoxy comportant 6 à 30 atomes de carbone et ayant un ou plusieurs carbocycles annelés et contenant éventuellement au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S), 25 ^ un alcoxyaryle ou un aryloxyalkyle de 7 à 30 atomes de carbone et pouvant comporter au moins une insaturation et/ou au moins un hétéroatome (de préférence O et/ou N et/ou S). - 15 - Microparticules selon la revendication 13 ou 14 caractérisées en ce que le radical 30 hydrophobe R6 du greffon du PO est issu d'un précurseur alcoolique choisi dans le groupe comprenant: l'octanol, le dodécanol, le tétradécanol, l'hexadécanol, l'octadécanol, l'oleylalcool, le tocophérol ou le cholestérol. 2904219 50 - 16 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 11 à 15 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-glutamique. 5 - 17 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 11 à 15 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un homopolymère d'alpha-L-aspartate ou d'alpha-L-aspartique. - 18 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, 11 à 15 10 caractérisées en ce que la chaîne principale du polyaminoacide est un copolymère d'alpha-L-aspartate/alpha-L-glutamate ou d'alpha-L-aspartique/alpha-L-glutamique. - 19 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 18 caractérisées en ce que PO comprend GH, (n/n+m) dans la formule (I), à hauteur d'au moins 10% molaire, 15 de préférence d'au moins 15% molaire. - 20 - Microparticules selon l'une quelconque des revendications 6 à 19 caractérisées en ce que la masse molaire du PO se situe entre 2000 et 100 000 g/mole, et de préférence entre 5000 et 40 000 g/mole. 20 - 21 - Procédé de préparation de microparticules de PO contenant au moins un principe (PA), ces microparticules étant en particulier selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, i. le polymère PO 25 • étant un copolymère amphiphile, biodégradable, hydrosoluble et porteur de groupements hydrophobes (GH) et de groupements hydrophiles [de préférence ionisables (GI), au moins en partie ionisés], • et formant spontanément une suspension colloïdale de nanoparticules dans l'eau, à pH 7,0, en condition isotonique, 30 • et étant associé de façon non covalente avec le PA ii.lesdites microparticules ayant une taille, mesurée dans un test Tl, comprise entre 0,5 et 100 microns, de préférence entre 1 et 70 microns, de préférence entre 2 et 40 microns, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à atomiser une solution 35 ou une suspension colloïdale de PO contenant du PA. - 22 - Procédé selon la revendication 21 caractérisé en ce que le PO contenu dans la solution ou la suspension colloïdale est au moins en partie sous forme de nanoparticules 2904219 51 de PO ayant une taille, mesurée dans le test Tl, inférieure à 500 nm, de préférence comprise entre 10 et 300 nm , et plus préférentiellement encore comprise entre 10 et 100 nm. 5 - 23 - Formulation pharmaceutique liquide pour la libération prolongée de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une suspension colloïdale, de "basse" viscosité, à base de microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon la revendication 21 ou 22. 10 - 24 - Formulation selon la revendication 23 caractérisée en ce qu'elle comprend un moyen de dispersion des microparticules de PO associées à au moins un PA. - 25 - Formulation selon la revendication 23 ou 24 caractérisée en ce que la phase 15 continue de la suspension est essentiellement aqueuse. - 26 - Formulation selon la revendication 23 ou 24 caractérisée en ce que la phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique miscible à l'eau. 20 - 27 - Formulation selon la revendication 23 ou 24 caractérisée en ce que la phase continue de la suspension est une phase essentiellement organique non miscible à l'eau. - 28 - Formulation selon la revendication 23 et 24 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend des ions multivalents dont la polarité est opposée à la polarité des 25 groupements ionisables du polymère PO et qui sont contenus dans la phase continue aqueuse. - 29 - Formulation selon la revendication 23 et 24 ou 28 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend essentiellement : 30 - au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable) ajouté dans la suspension/solution de PO à atomiser et donc contenus dans les microparticules PO/PA atomisées; et/ou au moins un enrobage des microparticules par au moins un film d'au moins un composé hydrophile (de préférence utilisable pour une préparation injectable). - 30 - Formulation selon la revendication 29 caractérisée en ce que le composé hydrophile d'enrobage est choisi dans le groupe comprenant: les acides aminés; 2904219 52 les polyalkylène glycols, de préférence les polyéthylène glycols; les copolyalkylène glycols, de préférence les copolymères -éthylèneglycolpropylène-glycol (de type Poloxamer ou Pluronic ou Lutrol); les polymères cellulosiques et leurs dérivés, de préférence les 5 carboxyalkylcelluloses (e.g. les carboxyméthylcelluloses) ou les alkylcelluloses (e.g. les méthylcelluloses); les saccharides hydrogénés ou non, tels que le tréhalose, le sorbitol, le mannitol, le saccharose; les polyols tels que le propylène glycol ou le glycérol; 10 -* les gélatines de préférence hydrolysées; les (co)polymères azotés, de préférence ceux contenus dans le groupe comprenant les polyacrylamides, les poly-N-vinylamides, les polyvinylpyrrolidones (PVP) et les poly-N-vinyl-lactames; les alcools polyvinyliques (APV); 15 -* le polyglutamate de sodium; et leurs mélanges; ledit composé hydrophile d'enrobage comprenant de préférence au moins un polymère hydrophile. 20 - 31 - Formulation selon les revendications 24 et 26 ou 27 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend un liquide lipophile, dont la température de fusion est de préférence inférieure ou égale à 15 C et contenu dans la phase continue miscible ou non à l'eau. 25 - 32 - Formulation selon la revendication 31 caractérisée en ce que le liquide lipophile comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés et/ou au moins une huile végétale et/ou au moins un lipide et/ou au moins un dérivé de lipide et/ou au moins un acide gras et/ou au moins un dérivé d'acide gras. 30 - 33 - Formulation selon la revendication 32 caractérisée en ce que le liquide lipophile comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras en saturés en Cg -CIO issu de l'huile de noix de coco, de préférence celui commercialisé sous la dénomination "MIGLIOL 812" par DYNA-France. 35 - 35 - Formulation selon les revendications 24 et 26 ou 27 et éventuellement 31, 32 ou 33 caractérisée en ce que le moyen de dispersion comprend un enrobage des microparticules par au moins un composé filmogène d'enrobage, (de préférence utilisable pour une préparation injectable). 2904219 53 - 36 - Formulation selon la revendication 35 caractérisée en ce que le composé filmogène d'enrobage comprend au moins un polymère hydrophobe choisi dans le groupe comprenant les polylactides; les polyglycolides; les poly(lactide-co-glycolide); les 5 polyorthoesters; les polyanhydrides; les acides polyhydroxybutyriques; les polycaprolactones; les polyalkylcarbonates; les polymères PO insolubles dans l'eau; leurs dérives et leurs mélanges. - 37 - Formulation selon les revendications 24 et 26 ou 27 et éventuellement au moins 10 l'une des revendications 31 à 36 caractérisée en ce que le composé filmogène d'enrobage est de nature lipidique et présente une température de fusion de préférence supérieure ou égale à 15 C et comprend au moins un mélange de triglycérides d'acides gras saturés et/ou au moins une huile végétale et/ou au moins un lipide et/ou au moins un dérivé de lipide et/ou au moins un acide gras et/ou au moins un dérivé d'acide gras. 15 - 38 - Nécessaire de reconstitution, en particulier de la formulation selon l'une quelconque des revendications 23 à 37 caractérisé en ce qu'il comprend: • des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé 20 selon lades revendication 21 et 22; • et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : les liquides essentiellement aqueux; les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau; et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau. 25 - 39 - Procédé de reconstitution, en particulier de la formulation selon l'une quelconque des revendications 23 à 37 caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement : • à mélanger des microparticules de PO contenant au moins un PA, ces microparticules 30 étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé selon la revendication 21 ou 22. et un liquide de reconstitution choisi dans le groupe comprenant : les liquides essentiellement aqueux; les liquides essentiellement organiques et miscibles à l'eau; 35 -* et les liquides essentiellement organiques non miscibles à l'eau. • et à agiter ce mélange. 2904219 54 -Formulation pharmaceutique solide pour la libération de PA caractérisée en ce qu'elle comprend une forme poudre sèche: • à base de microparticules PO contenant au moins un PA, ces microparticules étant celles selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 ou celles obtenues par le procédé 5 selon la revendication 21 ou 22; • ou obtenue à partir de la formulation selon l'une quelconque des revendications 23 à 37. - 41 - Formulation pharmaceutique solide selon la revendication 40 pour inhalation et lo administration pulmonaire.