Brevet FR2907464A1 — publié le 20080425

La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration du maïs, en particulier de la tolérance du maïs aux pathogènes fongiques et notamment à la fusariose par l'altération qualitative et/ou quantitative de la voie de biosynthèse de la lignine. Les maïs sont soumis aux attaques de nombreux pathogènes. Parmi ceux-ci, lo on peut citer les virus, bactéries, mais aussi les pathogènes fongiques, responsables de nombreuses maladies, et parfois de la présence de mycotoxines. Ainsi, le maïs peut être attaqué par des champignons responsables de fusarioses, de charbon (commun ou des inflorescences), d'anthracnose, de kabatiellose, de rouille, de mildiou. D'une façon générale, les attaques fongiques 15 sont responsables de dessèchement et/ou de pourriture des plantes, qui sont localisées différemment selon le pathogène. Les champignons du genre Fusarium sont responsables de la fusariose, on peut citer les espèces F. graminearum, et F. moniliforme pathogènes du maïs et dont l'importance varie suivant les conditions climatiques et la précocité des 20 variétés de maïs. On peut distinguer la fusariose de l'épi de la fusariose de la tige, les processus infectieux étant très différents. Certains agents pathogènes sont cependant communs aux deux types de fusariose. Plusieurs modes de contamination de la plante par le champignon sont connus, comme la pénétration du mycélium infectieux dans la plante par des lésions imputables aux insectes et aux oiseaux, ou 25 bien la pénétration directe au niveau des soies de l'épi aboutissant à l'infection des grains. Dans le cas de la fusariose de la tige, la contamination peut également avoir lieu via les semences ou plus rarement les racines. La fusariose de l'épi qui entraîne une destruction des grains diminue le rendement des cultures de maïs. Les agents pathogènes en cause sont par ailleurs 30 très dommageables car ils accumulent dans les grains détruits ou non différentes mycotoxines (Zéaralenone, Deoxynivalénol, Fumonisines), qui présentent des 2907464 2 niveaux de toxicité variables suivant les espèces animales et sont difficiles à éliminer. Les traitements fongicides sont difficiles d'utilisation et n'ont qu'un effet limité à l'encontre des Fusarium. La meilleure façon de combattre la fusariose de 5 l'épi est l'utilisation de la résistance génétique. Peu d'hybrides possèdent actuellement une telle résistance, quand elle existe il s'agit d'un résistance partielle qui reste modérée. Il apparaît donc important d'identifier des méthodes pour augmenter la tolérance aux maladies fongiques chez le maïs. L'approche utilisée par les inventeurs a consisté à modifier l'expression des gènes de la voie des phénylpropanoïdes. Cette voie conduit, à partir de la phénylalanine, à la synthèse d'une grande variété de substances telles que les anthocyanes, les isoflavonoïdes, les stilbènes, des ester d'acides hydroxycinnamiques, ou encore à la lignine. La lignine assure rigidité aux parois cellulaires et imperméabilité aux tissus conducteurs. Ainsi, des modifications dans la voie des phénylpropanoïdes ont des conséquences sur la synthèse de lignine. Un lien entre lignine et la tolérance aux pathogènes est communément suggéré, la lignine ayant notamment un rôle de barrière physique envers les pathogènes extérieurs, limitant la pénétration des pathogènes. Ainsi, lors de réactions incompatibles il y a accumulation de lignine au site de la HR (Hypersensitive Response). Toutefois, aucune démonstration directe de ce rôle n'a été décrite dans l'art antérieur. Toutefois, de nombreuses équipes ont travaillé sur l'inhibition d'enzymes de la voie de biosynthèse de la lignine afin de modifier la quantité ou la qualité de lignines du maïs, en particulier pour obtenir des plantes présentant une digestibilité accrue. La modification de la teneur et composition des plantes en lignines peut s'obtenir en surexprimant ou sous exprimant un ou plusieurs gènes de la voie de biosynthèse des lignines (Anterola et Lewis, 2002, Phytochemistry 61, 221-294). De tels travaux sont décrits notamment dans les demandes de brevets WO 9924561, 2907464 3 EP0516958, W09305160, W09712982 qui exposent les différentes stratégies imaginées. La Cinnamoyl Coenzyme-A Réductase (CCR) intervient dans la voie de biosynthèse des lignines pour convertir les p-coumaroyl CoA, feruloyl CoA et 5 sinapoyl CoA en aldéhydes. L'existence des ces trois substrats laisse penser que soit il existe plusieurs isoformes de CCR soit la ou les CCR sont capables de catalyser les réactions à partir d'une grande variété de substrats, à moins qu'il n'existe des isoformes de CCR différentes selon le type cellulaire. Aucune de ces hypothèses n'a été clairement prouvée à ce jour. 10 Chez le maïs, à ce jour, deux isoformes de la CCR ont été isolées (Pichon et al., 1998, Plant Mol Biol, 38, 671-676). Il semblerait que seule la CCRI (SEQ ID N 1) soit impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines. La Caffeoyl Coenzyme-A 0-Méthyl Transférase (CCoAOMT) est une 15 enzyme importante de la voie de biosynthèse des monolignols et plus particulièrement des sous-unités G. La CCoAOMT semble intervenir au cours de plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des lignines. Ainsi, elle serait impliquée dans une voie alternative de méthylation de la biosynthèse des lignines chez les zinnia, et la voie de méthylation médiée par la CCoAOMT serait probablement une 20 des voies générales de la biosynthèse des lignines pendant la croissance et le développement de la plante. Chez le maïs, deux gènes codent pour la CCoAOMT, le gène CCoAOMT1 et le gène CCoAOMT2. Le gène CCoAOMT2 est situé sur le chromosome 9, le gène CCoAOMT1 se situant sur le chromosome 6. 25 Les demandes de brevet W09910498 et W00134817 concernent entre autres, le gène de la CCoAOMT1 de maïs. La cinnamate 4-hydroxylase (C4H) existe au moins sous deux formes, en fonction des espèces considérées (C4H-1 et C4H-1/C4H-2). La forme C4H1 est 30 impliquée dans la lignification et le métabolisme des phénylpropanoïdes, alors que le rôle de la C4H-2 est encore peu clair. Des expériences de dérégulation de la C4H- 1 laisse entendre que ce gène est une étape limitante dans la formation de lignines, 2907464 4 la dérégulation résultant apparemment en une diminution progressive et une réduction quantitative (rapport SIG) de la lignine. La 4-Coumarate:CoA ligase (4CL) est généralement présente sous la forme 5 d'une famille multigénique dont les isoformes ont des spécificités de substrats différentes, de même que leurs profils d'expression spatiaux-temporels. Son rôle dans la lignification a été étudié notamment dans le tabac et chez Arabidopsis. Bily et al., 2003 (Phytopathology 93:712-719) ont travaillé sur la relation 10 entre des composés de la paroi et la résistance du maïs à des Fusarium chez différentes variétés de maïs. Ils ont observé chez les variétés présentant une résistance plus grande aux Fusarium la présence d'une quantité plus importante de dimères d'acide férulique, par contre aucune corrélation n'est démontrée entre les variétés résistantes et la présence de monomères d'acide férulique ou d'acide p- 15 coumarique. Ces travaux mettent en évidence l'importance d'éléments associés à la lignine dans la tolérance aux pathogènes, mais ne permettent pas de faire d'hypothèse sur une manipulation possible de la voie de biosynthèse de la lignine pour augmenter la tolérance aux pathogènes fongiques. 20 Ainsi, s'il est donc bien connu que l'on peut manipuler les gènes autologues impliqués dans la voie de biosynthèse de la lignine pour modifier la qualité et/ou la quantité de lignine, il n'est pas démontré qu'une telle manipulation puisse augmenter la tolérance aux pathogènes fongiques. La présente invention apporte des faits expérimentaux inattendus, 25 démontrant que la dérégulation (inhibition) d'enzymes de la voie de biosynthèse de la lignine chez le maïs augmente la tolérance aux pathogènes fongiques. Description : La présente invention se rapporte ainsi à une méthode pour augmenter la 30 tolérance à un pathogène fongique chez le maïs comprenant une étape consistant à altérer qualitativement et/ou quantitativement la synthèse de lignine, par l'inhibition totale ou partielle de l'expression d'au moins un gène impliqué dans la voie de 2907464 5 biosynthèse de la lignine (ou des phénylpropanoïdes), la tolérance audit pathogène fongique étant augmentée par rapport à un maïs dans lequel ledit gène n'est pas inhibé et/ou la synthèse de lignine n'est pas altérée. La tolérance ou résistance aux maladies fongiques selon l'invention s'entend comme une retard d'apparition des 5 symptômes après infection par le pathogène pour la plante selon l'invention par rapport à une plante témoin, ou à une intensité moindre des symptômes observés à une date donnée après infection. Par altération quantitative de la synthèse de lignine , on entend désigner une diminution de la quantité de lignine dans le maïs modifié selon l'invention par 10 rapport à un maïs normal (témoin non modifié selon l'invention), évalué, par exemple par mesure de la lignine de Klason ou de la lignine obtenue par détergent acid (acid detergent lignin) selon des méthodes bien connues dans l'art (voir par exemple Jung et al., J Agric Food Chem. 1999 May;47(5):2005-8 ; Jung et al, J Dairy Sci. 1997 Aug;80(8):1622-8). 15 Par altération qualitative de la synthèse de lignine , on entend désigner une modification dans la composition de la lignine de la plante modifiée selon l'invention par rapport à une plante témoin (non modifiée selon l'invention), par exemple une variation du rapport des sous unités S/G, ou une modification de la qualité d'acide férulique. Les méthodes d'analyse qualitative de la lignine sont 20 également connues dans l'art. On peut notamment citer la RMN. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le gène de la voie de biosynthèse de la lignine est choisi parmi les gènes codant pour les enzymes : cinnamoyl CoA reductase 1 (CCR1, EC 1.2.1.44, SEQ ID N 1, SEQ ID N 2), Caffeoyl Coenzyme A 3-0-methyltransferase (CCaOMT, SEQ ID Na 3 ; SEQ ID 25 N 4), cinnamate 4-hydroxylase (C4H, SEQ ID N 5), 4-coumarate :CoA ligase (4CL, SEQ ID N 6). Il convient de noter que les séquences fournies dans la liste de séquences ne doivent être considérées qu'en tant qu'illustrations de ces allèles. Il est clair que l'homme du métier, en utilisant ces séquences, est capable d'isoler ces mêmes gènes pour d'autres variétés de maïs (autres allèles). 30 Dans un mode de réalisation préféré, le gène de la voie de biosynthèse de la lignine dont l'expression est inhibée est le gène CCR1, dont la séquence d'allèles représentatifs de maïs sont SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. 2907464 6 Ainsi, on met en oeuvre l'invention, de façon préférentielle en inhibant totalement ou partiellement le gène de la CCR1 représenté par SEQ ID N 1 (ou tout autre allèle) chez le maïs. L'inhibition d'un gène impliqué dans la voie de biosynthèse de la lignine 5 peut être obtenue par tout moyen connu dans l'art. Ainsi, on peut procéder à la mutation des gènes par insertion d'un élément transposable ou d'un ADN de transfert (T-DNA). On peut aussi effectuer une mutagenèse physique ou chimique, notamment par l'utilisation d'EMS, de rayons X ou d'ultraviolets. Les plantes ainsi mutées sont criblées par exemple par PCR, en utilisant des 10 amorces situées dans le gène cible. Toutefois, on peut aussi utiliser d'autres méthodes de criblage, comme les Southern Blots ou un criblage via la méthode AIMS décrite dans WO 99/27085 (pour détecter les insertions), en utilisant des sondes spécifiques des gènes cibles, ou les méthodes de détection de mutations ponctuelles ou de petites insertions/délétions utilisant des endonucléases 15 particulières (Cet I, Endo I) telles que décrites dans WO 2006/010646. Dans un autre mode de réalisation, l'inhibition est obtenue par transformation de la plante avec un vecteur contenant un construit sens ou anti-sens du gène cible. Ces deux méthodes sont connues pour permettre, dans certaines conditions, l'inhibition du gène cible. On utilise également la méthode de 20 l'interférence d'ARN (RNAi) qui est particulièrement efficace pour l'extinction de gènes dans les plantes. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et consiste en la transformation de la plante avec un construit produisant, après transcription, un duplex double-brin d'ARN, dont l'un des brins est complémentaire à l'ARNm du gène cible. 25 L'invention permet ainsi d'obtenir un maïs présentant une tolérance à un pathogène fongique, en particulier du genre Fusarium, préférentiellement choisi parmi F. graminearum, F. liseola et F. monoliforme. Dans un mode de réalisation préférée, la présente invention est mise en oeuvre en utilisant un allèle favorable de la CCR1 (appelé A 3318) de maïs, une 30 insertion ayant été effectuée dans le premier intron du gène codant pour cette enzyme. La séquence de l'ARNm correspondant de la CCR1 de maïs est disponible sous le numéro X98083 de GenBank (SEQ ID N 5), avec une partie codante des 2907464 7 nucléotides 79 à 1194. Il est clair que ces séquences ne sont données qu'à titre d'exemples, et que l'homme du métier est à même d'identifier lui-même les séquences génomique et/ou d'ARNm de la CCR1 pour différentes variétés de maïs. Ainsi, un autre allèle correspondant à la séquence de la CCR1 de maïs non mutée 5 est représenté par l'accession Y13734 (GenBank). Des graines possédant l'allèle A 3318 ont été déposées au NCIMB Limited, 23 St Machar Drive, Aberdeen, Scotland, AB24 3RY, UK, le 23 juillet 2004, selon les dispositions du Traité de Budapest, sous le numéro NCIMB 41236. Ce maïs contenant l'allèle A3318 a été décrit dans WO 2006/035045. 10 Dans le mode préféré de réalisation de l'invention, pour le maïs, celle-ci concerne une méthode pour obtenir un maïs présentant une tolérance aux pathogènes fongiques, qui comprend l'étape d'introgression de l'allèle A3318 dans ledit maïs, ledit maïs contenant l'allèle A3318 présentant une tolérance accrue aux pathogènes fongiques par rapport à un maïs ne contenant pas ledit allèle. 15 L'introgression correspond à l'infiltration progressive de l'allèle A3318 d'un maïs le contenant dans un autre maïs ne le contenant pas initialement, par suite d'une hybridation interspécifique suivie de rétro-croisements en retour successifs avec le parent receveur. Ainsi, on peut réaliser l'introgression via les étapes consistant à : 20 (a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle A3318 avec une seconde lignée de maïs ne présentant pas ledit allèle, (b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle A3318, et ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est de ladite seconde lignée de maïs, 25 (c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs élite utilisable pour la production d'hybrides, (d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique dudit second maïs, présentant l'allèle A3318, (e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir 30 une plante homozygote pour l'allèle A3318. 2907464 8 Le génotypage de l'étape b) est effectué préférentiellement en utilisant des marqueurs moléculaires (marqueurs microsatellites par exemple), permettant de définir la part de chacun des deux parents dans la descendance. On sélectionne également, dans la descendance, les maïs qui possèdent le caractère génétique 5 approprié pour ce qui est de l'allèle A3318, de façon classique, par les méthodes de biologie moléculaire (telles que PCR ou Southern Blot). De manière surprenante, il a été montré que la répétition des rétrocroisements entre les lignées sélectionnées à l'étape b) et la seconde lignée de maïs (second maïs) permet d'obtenir l'apparition d'un phénotype bien plus marqué 10 au sein dudit second maïs. Ce résultat est tout à fait surprenant car on aurait pu s'attendre à observer une amélioration de la tolérance à la fusariose dès le premier croisement du maïs présentant l'allèle A3318 avec le second maïs. De façon préférée, l'invention est mise en oeuvre sur des plantes élites , c'est-à-dire notamment des plantes destinées à être commercialisées après 15 inscription sur un catalogue de référence. Il est important de noter que le caractère élite d'une plante est défini en relation avec le territoire envisagé pour la commercialisation, ainsi que le(s) caractère(s) agronomique(s) recherché(s). Ainsi, certaines plantes sont particulièrement adaptées pour certaines régions, et seront ainsi considérées comme élites pour la culture dans ces régions, alors qu'elles 20 ne le seront pas pour d'autres régions dans lesquelles les conditions environnementales sont différentes. Ainsi, une plante élite est une plante rassemblant le maximum de caractéristiques agronomiques nécessaires pour une pénétration économique du marché visé. Pour les marchés d'hybrides (par exemple le marché du maïs), 25 l'évaluation du caractère élite des plantes s'effectue également par leur aptitude à la combinaison/production d'hybrides. De façon préférée, l'invention est mise en oeuvre avec des maïs élite . L'homme du métier connaît bien la définition d'un maïs élite. Par maïs élite, on entend un maïs destiné à générer des hybrides destinés à être commercialisés par 30 croisement avec un autre maïs élite. Un maïs élite est défini comme tel en relation avec le territoire envisagé pour la commercialisation, ainsi que le(s) caractère(s) agronomique(s) recherché(s) pour la descendance hybride. Il s'agit notamment d'un 2907464 9 maïs pouvant être inscrit dans un catalogue de référence. Ainsi, selon que la descendance est destinée à l'alimentation humaine ou animale, on recherchera par exemple respectivement un rendement en grains, ou un rendement à l'hectare et une bonne digestibilité, lorsque l'on évalue la nature élite du maïs . Afin de 5 déterminer le caractère élite d'un maïs, on compare des hybrides obtenus à partir de celui-ci aux hybrides commerciaux de référence (vendus pour le même objectif dans la même région), par des essais en champs, par relevé et mesures de caractères agronomiques appropriés à l'objectif recherché. Un maïs est défini comme élite si les résultats obtenus sur les paramètres étudiés pour un hybride obtenu par 10 croisement dudit maïs sont supérieurs à 90 % aux résultats relevés pour les mêmes paramètres des hybrides de référence. Dans le cadre de la présente invention, on étudie, en plus des caractères agronomiques recherchés, la capacité de tolérance à la fusariose. Ainsi, un maïs élite est un maïs rassemblant le maximum de caractéristiques 15 agronomiques nécessaires pour une pénétration économique du marché visé. Le marché du maïs étant aujourd'hui un marché d'hybrides, l'évaluation du caractère élite d'un maïs s'effectue également par l'aptitude dudit maïs à la combinaison/production d'hybrides. Ainsi, la présente invention se rapporte préférentiellement à la préparation 20 d'un maïs élite destiné notamment à la commercialisation d'hybrides, pour l'alimentation humaine, animale ou l'ensilage, présentant l'allèle A3318. Ce maïs élite est donc homozygote pour l'allèle A3318. Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à la préparation et l'utilisation d'un maïs hybride obtenu par croisement de deux lignées parentes 25 homozygotes, ledit maïs hybride présentant un allèle A3318. Ce maïs hybride peut être homozygote (si chaque parent homozygote présente l'allèle A3318) ou hétérozygote pour l'allèle A3318. EXEMPLES 30 Ces exemples sont présents pour illustrer certains modes particuliers de réalisation de l'invention, et ne doivent pas être considérés comme restreignant le 2907464 10 champ d'application de l'invention. En particulier, on peut utiliser d'autes mutants, ou d'autres construits génétiques. Exemple 1 : Analyse phénotypiques de lignées de maïs mutants pour les gènes de la 5 voie des phénylpropanoïdes On dispose d'une plante mutante homozygote et d'un contrôle homozygote sauvage pour chaque évènement d'insertion. Etant donné les stades d'introgression de la mutation, on peut considérer que le mutant et le sauvage ne diffèrent que par la présence ou non de la mutation. L'expérimentation est réalisée selon le protocole 10 suivant : • 2 lieux • 3 répétitions par lieu • Inoculation artificielle de Fusarium monoliforme • Notation des symptômes observés sur épis (note de 1 à 7). Il s'agit d'une 15 notation visuelle d'intensité d'attaque sur épis : la note d'intensité d'attaque est calculée à partir du pourcentage de la surface de l'épi attaqué par le pathogène (Reid et alAgriculture and Agri-Food Canada, Ottawa, Ont. Technical Bulletin 1996-5E. 40 pp). Les notes correspondent à : 1 = 0% attaqué ; 2 = 1-3% ; 3 = 4-10% ; 4 = 11-25% ; 5 = 26-50% ; 6 = 51-75% ; 7 20 = 76-100%. • Eventuellement dosage des mycotoxines (fumonisines) Dans les exemples ci-dessous, les répétitions lieux ont été converties en répétitions simples de façon à réaliser une analyse statistique simple. L'analyse statistique a été réalisée sur chaque mutant de façon à savoir s'il existe 25 une différence entre mutant (M) et sauvage ou témoin (S). Les résultats démontrent que l'insertion d'un transposon dans les gènes C4H, CCR1, 4C12, CCoAOMT1, CCoAOMT2, impliqués dans la voie du métabolisme des phénylpropanoïdes et de la lignine augmente de façon plus ou moins importante la tolérance à une infection par Fusarium monoliforme. Cet effet est reproductible 30 selon les lieux de culture, bien qu'il puisse être plus ou moins accentué en fonction des contraintes environnementales. Mutant B0682 C4H 11 2907464 Méthode: 95,0 % LSD TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 61 4,42623 0,22603 S 70 4, 74471 0,189099 Contraste Différence +/- limites M ù S -0,318485 0,583536 * indique une différence statistiquement significative. Tendance Mutant plus résistant que sauvage. 5 Mutant D1938 C4H Méthode: 95,0 % LSD TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 72 2,9163 0,124743 S 81 3,8593 0,117351 Contraste Différence +/- limites M ù S *-0,942997 0,338582 * différence statistiquement significative. Mutant plus résistant que sauvage ; dépendance environnementale. 10 Mutant A3318 CCR1 TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 103 3,2961 0,137621 S 93 4,69213 0,143085 Contraste Différence +/- limites M ù S *-1,39603 0,391682 * différence statistiquement significative. Mutant plus résistant que sauvage : effet net de 1,4 points en moyenne 12 2907464 Mutant 11888 4CL2 TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 95 4,5253 0,125475 S 57 4,5412 0,163631 Contraste Différence +1- limites M ù S 0,0158996 0,407671 Tendance mutant plus résistant, mais forte dépendance environnementale. Mutant F0046 CCoAOMT1 TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 98 2,70723 0,120904 S 100 3,04586 0,119426 Contraste Différence +1- limites M ù S *-0,338633 0,335263 5 * différence statistiquement significative. Mutant plus résistant que sauvage, effet modéré. Mutant G2092 CCoAOMT2 TYPE Effectif Moyennes Ecarts- types M 81 3,07471 0,129118 S 103 3,71153 0,114828 Contraste Différence +1- limites M ù S *-0,636821 0,341066 * différence statistiquement significative. 10 Mutant plus résistant que sauvage ; effet modéré Analyses des mycotoxines 2907464 13 Un dosage de mycotoxines a été réalisé. On observe qu'il existe une bonne corrélation entre le niveau d'infection et l'accumulation de la fumonisine. Il a été remarqué que le taux de fumonisine observé est particulièrement élevé par rapport aux taux observés lors des infections naturelles. Le système d'infection artificielle 5 dans le canal des soies n'est peut-être pas le plus adapté à l'étude de l'accumulation des mycotoxines. Exemple 2 : Réalisation de plantes transgéniques portant une cassette d'expression permettant l'inhibition d'un gène du métabolisme des phénylpropanoïdes. 10 a-Transformation par Agrobacterium tumefaciens de plantes de maïs par un construit antisens d'un gène de la voie de biosynthèse de la lignine : CCoAOMT. La transformation du maïs par Agrobacterium tumefaciens, à été réalisée à l'aide d'un vecteur sous la forme d'un plasmide d'environ 50 kb obtenu par recombinaison dans Agrobacterium entre un vecteur pBIOS et un vecteur 15 superbinaire (pSB 1). Ce vecteur comporte notamment : une région d'origine de réplication plasmidique Col EI, nécessaire au maintien et à la multiplication du plasmide dans Escherichia coli, non fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens, une origine de réplication fonctionnelle dans Agrobacterium tumefaciens, les régions virB, virC et virG supplémentaires d'Agrobacterium tumefaciens qui 20 augmentent l'efficacité de transformation, les gènes de résistance à la tétracycline (Tétra) et à la spectinomycine (Spect) sous contrôle de promoteurs s'exprimant uniquement dans les bactéries, On introduit dans ce vecteur un ADN de transfert (ADN-T) porteur de deux cassettes d'expression. La première cassette comprend : la séquence promotrice du 25 CsVMV (WO 97/48819), une séquence issue de la séquence CCoAOMT du maïs en orientation antisens (CCoAOMT1 de maïs Numéro d'accession GenBank AJ242980, SEQ ID N 7, nucléotides 1 à 1143 ) et la séquence terminateur NOS (nopaline synthase). La seconde cassette comprend : la séquence promotrice du gène d'actine de riz et la séquence du premier intron de ce gène, un gène de 30 sélection à un herbicide, et une séquence terminateur NOS. 2907464 14 La transformation a été effectuée via le protocole de transformation par Agrobacterium tumefaciens d'Ishida et al. (Nature Biotechnology, 14, 745-750, 1996). Des épis immatures d'une lignée produite en serre, sont prélevés 10 jours 5 après la pollinisation et stérilisés pendant 15 minutes. Les embryons sont prélevés et mis en contact 5 minutes avec une suspension d'Agrobacterium contenant le vecteur décrit ci-dessus. Après avoir été retirés de la suspension d'Agrobacterium, les embryons sont mis en culture sur un milieu ne contenant ni de bactériostatique, ni d'agent sélectif. Cette co-culture a lieu durant 4 à 7 jours à l'obscurité. Après la co- 10 culture, les embryons sont repiqués sur un milieu de callogénèse frais contenant le bactériostatique et l'agent sélectif. Un cal s'initie et se développe à partir des cellules transformées de ces embryons. L'étape de callogénèse se passe à 25 C à l'obscurité et dure 5 semaines. Les embryons-cals sont repiqués sur milieu frais toutes les 2 à 3 semaines. Au terme de cette étape les cals sont repiqués sur un milieu de 15 régénération pendant 5 semaines avec repiquage du cal sur milieu frais après 2 à 3 semaines. On obtient une régénération de plantules à partir des cals, qui sont mises en enracinement en tube, une fois qu'elles sont assez développées. Après 10-15 jours en tube, les plantules sont acclimatées en phytotron avant d'être transférées en serre. Les transformants sont ensuite cultivés et croisés avec du pollen d'une plante 20 non transgénique pour produire la génération Ti. b- Transformation par Agrobacterium tumefaciens de plantes de maïs par un construit RNAi d'un gène de la voie de biosynthèse de la lignine : CCoAOMT. Construction d'un vecteur comprenant un fragment de la séquence d'un gène 25 de la voie de biosynthèse de la lignine CCoAOMT en orientation sens et antisens. Ce vecteur a été construit en utilisant le fragment Bglll de 768bp issu de la séquence CCoAOMT1 de maïs (numéro d'accession AJ242980, SEQ ID Na 7 (fragment 334-1102)) grâce au système Gateway (Invitrogen). Ce vecteur porte une cassette d'expressionconstituée du promoteur CsVMV, du fragment de la séquence 30 CCoAOMT1 en orientation antisens, du premier intron du gène de la tubuline de riz, du fragment de la séquence CCoAOMT1 en orientation sens et du terminateur 2907464 15 NOS. Le fragment de la séquence CCoAOMT1 a été choisi pour permettre de contrôler l'expression des séquences CCoAOMT1 et CCoAOMT2. Ce vecteur a été utilisé pour la transformation du maïs par biolistique, comme décrit ci-dessous. 5 La méthode de transformation par biolistique implique la co-transformation des cellules végétales d'une part avec le gène d'intérêt, et d'autre part avec un plasmide porteur d'une cassette d'expression comprenant un gène de sélection (par exemple, un gène de résistance à un herbicide). 10 Des embryons immatures prélevés 10 jours après la pollinisation sont mis en culture sur un milieu osmotique pendant 4 jours puis bombardés avec des particules d'or enrobées des plasmides contenant le gène d'intérêt et le gène de sélection. Les embryons sont ensuite repiqués sur un milieu de callogénèse, puis les cals développés sont placés sur un milieu de régénération, et les plantes régénérées 15 comme vu dans l'exemple 2.a. c- Analyses phénotypiques des transformants anti-sens et RNAi Le protocole d'inoculation artificielle par Fusariom monoliforme, écrit dans l'exemple 1 pour les lignées mutantes de maïs, est utilisé pour tester la tolérance des 20 transformants anti sens et RNAi du gène CCoAOMT. Exemple 3: Association génétique entre le gène CCR1, CCoAOMT1, CCoAOMT2, C4H et la tolérance à la fusariose chez le maïs. Afin de comparer l'effet potentiel de différents allèles du gène CCR1 chez le 25 maïs, on réalise des études d'association. Ces études d'association également appelées analyse de déséquilibre de liaison permettent d'associer un allèle donné avec un phénotype particulier. Le terme déséquilibre de liaison se réfère à l'association non-aléatoire entre deux allèles pris à des loci différents. Ainsi, il y a un déséquilibre de liaison entre deux 30 allèles (1 et 2) si l'allèle 1 présent à un locus donné a tendance à être présent chez les mêmes lignées que l'allèle 2 à un autre locus. Le déséquilibre de liaison peut être favorisé par plusieurs phénomènes comme la liaison génétique, la sélection, la 2907464 16 dérive génétique, la migration ou le mélange des populations. Cette méthode a fait l'objet d'une revue chez les plantes (Flint-Garcia et al., (2003). Rev. Plant. Biol, 54: 357-74). On recherche des associations entre un marqueur moléculaire spécifique du 5 gène CCR1 et le caractère de tolérance à la fusariose en tenant compte de la structuration résiduelle du panel utilisé. Des amorces spécifiques du gène CCR1 sont développées. On identifie ensuite les différents allèles existants dans le panel, soit en séquençant les produits PCR sur l'ensemble des lignées, soit en recherchant les polymorphismes 10 nucléotidiques (SNPs) à une ou plusieurs positions particulières sur l'ensemble des lignées. En théorie, il est préférable d'étudier en priorité les SNP qui affectent la fonction de la protéine ou son expression (non synonymes ou mutations non sens) car la probabilité de faire varier le phénotype est plus importante. Cependant, même si le polymorphisme détecté n'induit pas de changement sur la séquence en acide 15 aminé de la protéine, il peut affecter quand même la fonction du gène en altérant la régulation de l'expression, la stabilité, l'épissage, ou la localisation des ARNm. En langage statistique, une association est effectuée par une analyse de variance : la donnée quantitative expliqué est le phénotype observé (Y) et le facteur qualitatif variable est le marqueur de polymorphisme (X). L'analyse de variance 20 nécessite que l'ensemble des données suivent un modèle linéaire de type Y = XO +e où e correspond à l'erreur expérimentale. L'analyse de variance permet ensuite d'estimer les moyennes théoriques de chaque facteur et aussi les différences entre ces moyennes, ce qui détermine l'existence ou l'absence d'une association statistique entre le polymorphisme et le caractère. 25 Les tests d'association permettent ainsi de déterminer l'existence d'une corrélation entre un polymorphisme nucléotidique (SNP) et la résistance à la fusariose. Selon le principe rappelé ci-dessus, avec le gène CCR1, des études 30 d'association sont réalisés sur le maïs en utilisant un panel de lignées d'environ 350 lignées sélectionnées pour représenter la variabilité génétique du maïs mais aussi choisies pour leur aptitude à la sensibilité ou tolérance à la fusariose 2907464 17 épis. Une année d'expérimentation sur deux lieux pendant une année a été réalisée sur ce panel. Chaque lignée a été inoculée avec une suspension de spore de Fusarium monoliforme dans le canal des soies, 1-5 jours après floraison femelle. Les symptômes de sensibilité à la fusariose ont été notés sur les spathes (note de 1- 5 9) et sur épis à maturité (note de 1-7) pour chaque lignée. Des SNPs sont disponibles pour les gènes suivants, qui font partie de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes et de la lignine : • C4H : Cinnamic acid 4-hydroxylase EC 1.14.13.11). • CAD : Cinnamylalcohol dehydrogenase EC 1.1.1.195) (CAD) 10 (Brown-midrib lprotein). • PAL : Inducible phenylalanine ammonia-lyase Fragment). • CCR : Putative cinnamoyl-CoA reductase. • 4C13: 4-coumarate--CoA ligase 4CL3 EC 6.2.1.12). • CCoAOMT1: Caffeoyl-CoA 0-methyltransferase 1 (CCoAOMT-1). 15 • CCoAOMT2: Caffeoyl-CoA 0-methyltransferase 2 EC 2.1.1.104) (Trans-caffeoyl-CoA3-O-methyltransferase 2) (CCoAMT-2). • CCR1 : cinnamoyl CoA reductase 1 • COMT : Caffeic acid 3-0-methyltransferase EC 2.1.1.68) (S-adenosysl-L-methionine:caffeic acid 3-0-methyltransferase) (COMT 20 ou CAOMT). Ces SNPs peuvent aisément être identifiés sur des bases de données tels la base TIGR (The Institute for Genomic Research) ou GenBank. Pour chaque gène, une sélection de SNPs (entre 1-5 SNP) représentant au moins 95% de la variabilité allélique est utilisé pour réaliser le génotypage des 350 25 lignées du panel. Comme décrit pour le blé, des tests d'association sont réalisés de façon à déterminer l'existence d'une corrélation entre un polymorphisme nucléotidique (SNP) et la résistance à la fusariose. 2907464 18 Exemple 5 : Recherche d'allèles nouveaux pour le gène CCR1 dans les ressources génétiques ou dans une collection de mutations induites par un agent chimique chez le maïs On utilise une collection représentative appelée ci-après core collection 5 présentant une variabilité moléculaire maximale en relation avec des critères d'origines à la fois géographiques et temporels, afin d'identifier de nouveaux allèles du gène CCR1 par la méthode dite d'EcoTilling décrite dans la littérature (Mejlhede et al. 2006, Plant Breeding, 125 : 461-467). Simultanément au criblage de la core collection , une recherche 10 d'allèles induits est réalisé à partir d'une collection de maïs issue de la réunion de collections de maïs muté par des radiations ionisantes ou un agent chimique (EMS). Cette collection de maïs permet d'identifier des allèles non présents naturellement dans les variétés de maïs existantes naturellement. De plus, 5% des mutations découvertes sont des allèles nuls du gènes CCR1, c'est-à-dire un allèle du 15 gène CCR1 où la fonction est annulée (absence d'expression). Cette méthode dite de TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) est décrite dans la littérature (McCallum et al. 2000, Nature Biotechnology. 18 : 455-457). Les allèles issus des approches de Tilling ou d'EcoTilling sont identifiés grâce à la technologie développée par Henikoff et Comaï (Plant J. 2006 20 Feb;45(4):684-94, Annu Rev Plant Biol. 2003;54:375-401). Pour cela, des amorces spécifiques du gène CCR1 sont développées. Le produit PCR correspondant à l'amplification d'une copie du gène CCR1 est ensuite comparée avec un même produit PCR issu d'un ADN issue d'une variété de référence. La méthode d'analyse des mutations est réalisée par identification d'hétéroduplex d'ADN créés par la 25 renaturation des brins d'ADN provenant de la copie de la variété testée et la variété de référence. En cas de présence d'une mutation dans la variété testée, il s'ensuit une anomalie d'appareillement (ou mismatch ). Cette anomalie est détectée puis coupée par une enzyme de type endonucléase reconnaissant cette structure particulière (par exemple l'enzyme CelI ou l'enzyme Endol). La reconnaissance du 30 mismatch est ensuite détectée par électrophorèse. Par exemple sur gel d'agarose, sur séquenceur automatique en plaque (type LICOR), sur séquenceur capillaire sur ABI3100 ou sur ABI3730. 2907464 19 Chaque différence détectée constitue un haplotype particulier du gène CCR1. L'intérêt de chaque haplotype est ensuite évalué par une évaluation phénotypique. L'ensemble des variétés présentant des haplotypes distincts (provenant soit 5 d'un criblage des ressources génétiques soit de la découverte de mutations induites artificiellement) sont croisés avec une variété de référence afin de disposer d'une collection d'allèles de CCR1 dans un même fond génétique élite. Des évaluations phénotypiques sont entreprises pour déterminer si la présence d'un haplotype particulier est corrélée à une résistance à la fusariose. Ce 10 même type d'expérimentation est étendu à d'autres types de pathogènes du maïs. Une note de sensibilité est ensuite établie pour chaque variété afin d'établir la corrélation entre la présence d'un haplotype ou mutation particulière et une note de résistance à la fusariose. 15 Exemple 6 : Utilisation des allèles identifiés en sélection variétale Les haplotypes conférant le plus fort niveau de résistance sont ensuite utilisés en sélection variétale. Le brassage génétique entre la variété résistante et des variétés présentant d'autres qualités agronomiques telles que des rendements élevés, de fort taux en protéines, une aptitude à la résistance à la germination sur pied, 20 etc... permet de sélectionner de nouvelles variétés regroupant l'ensemble des caractères souhaités. L'allèle conférant la résistance à la fusariose est suivi par marquage moléculaire au cours de ce processus de sélection variétale. Ainsi les allèles identifiés par Tilling, EcoTilling ou validés par test d'association, permettent de proposer des plans de croisements entre les individus 25 les plus complémentaires sur la base de leurs allèles (ici un ou plusieurs allèles conférant une résistance à la fusariose) puis d'utiliser les connaissances accumulées pour proposer les croisements pertinents des parents potentiels afin de pyramider des gènes (accumuler différents haploytypes) devant aboutir à l'obtention de variétés améliorées. 30 Revendications 1. Méthode pour augmenter la tolérance à un pathogène fongique chez le maïs comprenant une étape consistant à altérer qualitativement et/ou quantitativement la synthèse de lignines, par l'inhibition totale ou partielle de l'expression d'au moins un gène impliqué dans la voie de biosynthèse de la lignine, la tolérance audit pathogène fongique étant augmentée par rapport à un maïs non altéré. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le pathogène fongique est du genre Fusarium. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le gène de la voie de biosynthèse de la lignine est choisi parmi les gènes codant pour les 15 enzymes : cinnamoyl CoA reductase (CCR), Caffeoyl Coenzyme A 3-0-methyltransferase (CCaOMT), cinnamate 4-hydroxylase (C4H), 4- coumarate:CoA ligase (4CL). 4. Méthode selon la revendication 3, dans laquelle le gène de la voie de 20 biosynthèse de la lignine est CCR1, dont la séquence d'un allèle représentatif est SEQ ID N 1. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'inhibition est obtenue par mutation dudit gène par insertion d'un élément transposable ou 25 d'un T-DNA ou par mutagénèse physique (EMS, Rayons X, UV). 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'inhibition est obtenue par transformation de ladite plante avec un vecteur contenant un construit sens ou anti-sens du gène cible, ou RNAi. 7. Méthode pour obtenir un maïs présentant une tolérance aux pathogènes fongiques, par l'introgression de l'allèle A3318 dans ledit maïs, ledit maïs 30 5 10 2907464 21 contenant l'allèle A3318 présentant une tolérance accrue aux pathogènes fongiques par rapport à un maïs ne contenant pas ledit allèle, comprenant les étapes consistant à : (a) croiser une première lignée de maïs présentant l'allèle A3318 avec une seconde lignée de maïs ne présentant pas ledit allèle, (b) effectuer un génotypage de la descendance obtenue et sélectionner les descendants présentant l'allèle A3318, et ayant le meilleur génome ratio pour ce qui est de ladite une seconde lignée de maïs, (c) effectuer un rétrocroisement desdits descendants avec ladite seconde lignée de maïs élite utilisable pour la production d'hybrides, (d) répéter si nécessaire les étapes b) et c) jusqu'à obtenir une lignée isogénique dudit second maïs contenant l'allèle A3318, (e) de façon optionnelle, effectuer une auto-fécondation afin d'obtenir une plante homozygote pour l'allèle A3318.