Brevet FR2908786A1 — publié le 20080523

KIT DE DETECTION DE BRETTANOMYCES POUR L'OENOLOGIE La présente invention se rapporte à un système pour la détection d'une contamination levurienne par Brettanomyces d'un produit issu de la vendange, en vu de maîtriser le caractère phénolé dans le vin. La viticulture est sans cesse à la recherche d'une meilleure maîtrise de la qualité 5 de ses vins. En effet, le vin peut subir des attaques, en particulier d'origine microbiologique, qui altèrent sa qualité et son goût. Certaines levures notamment sont susceptibles d'altérer le vin, on peut citer en particulier les Brettanomyces. Ces Brettanomyces peuvent engendrer d'importantes modifications gustatives et olfactives. En particulier elles 10 induisent des goûts et arômes prononcés de type animal ou cuir qui masquent la typicité aromatique du vin et déprécient sa qualité gustative. Les composés produits par les Brettanomyces responsables de ce caractère dit phénolé sont des éthyl-phénols et des éthyl-gaïacols. Dans les cas les plus graves, l'arôme est très fortement modifié et le vin devient inconsommable. 15 Les Brettanomyces peuvent se développer au cours de n'importe quelle étape de la fabrication du vin : sur la vigne, pendant la vendange, au niveau des moûts, des jus, pendant l'élevage, etc., la période la plus critique se situant généralement entre la fin de la fermentation alcoolique et la fermentation malolactique. Leur présence entraîne la perte de lots et de revenus pour les viticulteurs et peuvent 20 également avoir un impact sur leur image, en particulier pour les grands crus. Il est très difficile de prévenir une contamination par Brettanomyces, et ce malgré de bonnes mesures d'hygiène. Elles sont résistantes au 502, dépendantes de divers facteurs, comme le pH et la température par exemple, et peuvent se 2908786 2 développer en anaérobiose même sur des vins ayant achevé complètement leurs fermentations. Seule la détection précoce du développement des Brettanomyces permet d'agir au bon moment, en mettant en place des mesures correctives et une méthode de désinfection adaptée. En effet, il existe bien des moyens pour lutter contre les Brettanomyces mais il faut pouvoir les mettre en pratique au plus tôt car si la multiplication est déjà fortement engagée, le succès du traitement risque d'être compromis et il y aura un retentissement sur la qualité du vin. Il est donc nécessaire de faire un suivi très strict et d'effectuer des analyses ICI régulières, mais la présence des Brettanomyces dans le vin est difficile à surveiller. Actuellement la méthode de détection principale s'effectue en laboratoire qui demande des délais de l'ordre d'une semaine au moins et engendre des coûts inadaptés à une détection préventive. 15 Il existe également une méthode de dénombrement microbiologique sous forme de kit prêt à l'emploi mais il ne s'agit que d'une simple mise en évidence sur un milieu gélosé. La détection suppose des concentrations très importantes de Brettanomyces dans l'échantillon, et le milieu n'est pas sélectif : le screening est très large et les résultats très peu précis. Une confusion est aisée entre les 20 Brettanomyces et les autres micro-organismes levuriens en général. De plus, l'analyse demande là aussi un délai de 7 à 8 jours ce qui est beaucoup trop long car passé un certain stade, la contamination par les Brettanomyces peut s'avérer trop importante pour une éventuelle cure. Enfin, il est possible d'avoir recours à la biologie moléculaire, mais les techniques 25 utilisées actuellement sont coûteuses, peu sensibles, non quantitatives et ne permettent pas de distinguer précisément la présence des germes morts ou vivants. 2908786 3 Il subsiste donc un besoin pour un système de détection préventive des Brettanomyces pour le milieu de l'cenologie, facile à mettre en oeuvre et rapide, permettant aux établissements vinicoles et producteurs d'établir un suivi régulier pour un diagnostic précoce et précis de la contamination et de se situer 5 par rapport au risque d'apparition d'un défaut détectable à la dégustation. Aussi, la présente invention vise à répondre à ce besoin en proposant un moyen pour une détection sélective simple, rapide et reproductible permettant de détecter les Brettanomyces dans le vin. A cet effet, l'invention a pour objet un kit pour la détection spécifique d'une contamination levurienne par Brettanomyces d'un produit issu de la vendange, qui intègre des moyens de détection déterminés à partir des caractéristiques d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. L'invention est notamment basée sur le fait que si une telle souche, virulente, 15 ayant des difficultés à se développer est détectée à un seuil donné, la propension d'avoir une cuvée agressée par des Brettanomyces est grande. Par produit issu de la vendange on entend tout produit, de la récolte du raisin frais ou du jus de raisin jusqu'à la mise en bouteille du vin, quel que soit le stade de traitement : égrappage, éraf lage. et foulage, mise en cuve, fermentation 20 alcoolique, écoulage et pressurage, débourbage, fermentation malolactique, élevage, conservation et mise en bouteille. Les moyens de détection du kit selon l'invention sont réalisés à partir des caractéristiques d'au moins une des souches de Brettanomyces qui à la fois : - poussent le plus difficilement dans le milieu du vin, et 25 - sont les plus virulentes c'est-à-dire qui produisent le plus de phénols et présentent les plus mauvais arômes dans le vin. Ce choix confère une grande sélectivité au kit de détection. La détection d'au moins une des souches se développant difficilement dans le milieu du vin implique 2908786 4 la détection des autres souches. De plus ces souches étant également les plus néfastes pour la qualité du vin, le test est notamment spécifique des Brettanomyces présentant de forts risques d'apparition d'un défaut détectable à la dégustation. 5 Parmi les souches de Brettanomyces répondant aux critères de choix selon la présente invention on connaît notamment : Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces intermedius, Brettanomyces lambicus, Brettanomyces anomala, Brettanomyces custerii. Parmi les souches de Brettanomyces répondant spécialement bien aux critères 10 de choix selon la présente invention, on peut citer en particulier les souches de type Bruxellensis et de type Anomala. De manière préférentielle, les moyens de détection sont déterminés à partir des caractéristiques des souches de Brettanomyces bruxellensis CB12 et/ou CB63 et/ou CB28 dont le profil génétique est représenté sur les figures 2A à 2C. Le kit de détection selon l'invention peut se présenter sous différentes formes. Un modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par filtration d'un échantillon du produit susceptible d'être contaminé par Brettanomyces, avec un milieu de culture réalisé à partir des caractéristiques d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. Un deuxième modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test immuno-enzymatique réalisé avec un anticorps capable de reconnaître au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. Un troisième modèle préférentiel du kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par Amplification en Chaîne par Polymérisation en temps réel réalisé avec des séquences d'amorce spécifiques d'une séquence 2908786 5 d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. Le kit de détection selon l'invention est facile d'utilisation, et permet de détecter en moins de 48 heures, et de façon très sélective et très sensible la 5 présence de Brettanomyces dans le produit issu de la vendange quel que soit le stade de traitement. Avantageusement, le kit de détection selon l'invention permet aux producteurs de réaliser les analyses de détection de Brettanomyces par eux-mêmes ce qui, outre la fiabilité et la rapidité d'analyse, présente un grand intérêt en terme de 10 rentabilité et d'économie. D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre de l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement en regard de trois modèles de forme du kit de détection et des figures annexées sur lesquelles : 15 - la figure 1 représente un exemple de résultat obtenu avec le modèle 1, - la figure 2A représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces bruxellensis CB12 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé, -la figure 2B représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces 20 bruxellensis CB63 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé, et - la figure 2C représente le profil génétique de la souche de Brettanomyces bruxellensis CB28 obtenu après digestion par l'enzyme Notl et migration dans un gel d'électrophorèse en champ pulsé. 25 1. Modèle 1 : kit sous la forme d'un média filtrant Selon une première variante, le kit de détection se présente sous forme d'un test par filtration sur média avec un milieu de culture particulier, pour filtrer un 2908786 6 échantillon d'un produit issu de la vendange susceptible d'être contaminé par Brettanomyces. La filtration sur média est une technique qui permet de séparer un liquide des microorganismes qu'il contient à l'aide d'un appareillage de filtration. Le média 5 agit comme un filtre très spécifique qui laisse passer le liquide et retient les microorganismes quantitativement à sa surface. En utilisant des milieux de culture particuliers on peut identifier et dénombrer une ou plusieurs souches microbiennes particulières. Le milieu de culture selon l'invention est un milieu qui permet l'identification et le 10 dénombrement spécifique des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Le milieu de culture selon l'invention présente un pH basique compris entre 7 et 10. Préférentiellement, il présente un pH compris entre 7,5 et 8,5. 15 La présence de Brettanomyces au niveau de ce milieu de culture basique provoque une acidification . Cette diminution de pH, indicateur de la présence de colonies de Brettanomyces, se traduit visuellement par un changement de couleur claire, caractéristique au niveau du milieu de culture, comme illustré sur la figure 1. 20 Le système tampon et le pH du milieu de culture sont optimisés pour la meilleure détection possible des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Ils sont déterminés pour la détection d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. En particulier, ils sont déterminés pour la détection des 25 souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Selon un mode de réalisation permettant une détection optimisée des Brettanomyces selon l'invention, le milieu de culture contient notamment : 2908786 7 - entre 0,1 et 0,2 g de KH2PO4, - une quantité de NaOH ajustée par rapport au KH2PO4 pour obtenir un pH compris entre 7,5 et 8,5, - entre 5 et 20 g de Glucose, et 5 - entre 5 et 30 q de Thiamine. Le milieu de culture selon l'invention est préférentiellement un milieu sélectif prêt à l'emploi. Il peut se présenter sous différentes formes notamment sous forme d'un milieu gélosé pré coulé ou prêt à couler, ou sous forme d'un milieu prédisposé et pré imprégné sur cartons déshydratés à réhydrater avec de l'eau 1Ci stérile (milieu NKS) ou sous forme liquide en flacons. De manière préférentielle, le milieu de culture est un NKS, la présence de Brettanomyces se traduisant visuellement par l'apparition d'unités formantes de colonies de couleur jaune. Ce milieu de culture est très spécifique des Brettanomyces. 15 Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, pour augmenter la sélectivité du milieu de culture on peut également y inclure des inhibiteurs des autres souches microbiennes présentes dans le milieu du vin, telles Saccharomyces par exemple. Le milieu de culture selon l'invention présente l'avantage d'être sensible et 2,0 spécifique. Il est simple d'utilisation et permet d'obtenir des résultats entre 24 et 48 heures après mise en culture. L'analyse s'effectue par simple observation du milieu de culture : il suffit de dénombrer le nombre d'unités formantes de colonies de couleur spécifique de la présence de Brettanomyces. 25 Ce premier modèle de kit de détection de Brettanomyces selon l'invention est donc facile et rapide d'utilisation. 2908786 8 2. Modèle 2 : kit sous la forme d'un test immuno-enzymatique Selon une deuxième variante, le kit de détection selon l'invention se présente sous forme d'un test immuno-enzymatique. Le test immuno-enzymatique ou ELISA (Enzyme-linked Immuno5orbent Assay) 5 permet de détecter et doser un micro-organisme dans un liquide. Il est basé sur l'utilisation combinée d'anticorps dont l'objectif est de fixer le micro-organisme et d'anticorps qui portent le système de mesure. Le test immuno-enzymatique selon l'invention est un test ELISA dit sandwich , qui permet l'identification et la quantification spécifique des 10 Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Le kit se présente sous forme d'une microplaque pré-coatée prête à l'emploi. Les puits de la microplaque sont tapissés avec un anticorps de capture capable de lier spécifiquement l'antigène recherché spécifique de la présence de 15 Brettanomyces, en particulier de Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Lors de cette opération, appelée coating , l'anticorps de capture se fixe au plastique des puits par interactions électrostatiques. L'échantillon du produit issu de la vendange à tester est ensuite déposé dans les 20 puits de la microplaque et si l'antigène recherché, caractéristique de la présence de Brettanomyces, est présent, il se lie spécifiquement à l'anticorps de capture. Un deuxième anticorps, l'anticorps traceur, capable de se lier à l'antigène capturé est alors ajouté dans le puits. Cet anticorps traceur est couplé à une enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction peut ainsi ensuite 25 être quantifiée par colorimétrie. C'est l'anticorps de capture qui assure la spécificité du test ELISA. Selon l'invention, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement des souches de levures appartenant au genre Brettanomyces. 2908786 9 En particulier, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. De manière préférentielle, on utilise des anticorps de capture capables de reconnaître spécifiquement les souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Le procédé d'obtention des anticorps de capture spécifique des Brettanomyces selon l'invention comprend les étapes suivantes : -préparation des immunogènes : des cellules de Brettanomyces, 10 préférentiellement des souches CB28 et/ou CB63, sont cultivées soit dans les conditions naturelles de contamination, à savoir du vin, soit dans un milieu contenant un extrait de malt. On utilise ensuite en tant qu'immunogènes soit les cellules entières telles quelles non traitées, soit les cellules entières mortes, tuées par chaleur, soit des extraits de 15 membranes de cellules. - immunisation d'un animal : on injecte les immunogènes à l'animal, de préférence une souris. Après plusieurs injections on récupère le sang de l'animal immunisé et on teste l'antisérum récupéré. - production des anticorps monoclonaux : des cellules de la rate de 20 l'animal immunisé sont mélangées avec une lignée de cellules de miscellium, puis fusionnées. Les cellules sont ensuite cultivées et 12 jours après la fusion, les surnageants de la culture cellulaire sont prélevés de manière à récupérer les anticorps anti-Brettanomyces. Ce sont ensuite ces anticorps qui sont utilisés pour le test immuno-enzymatique 25 selon l'invention. Ces anticorps sont spécifiques des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Ils ne 2908786 10 détectent pas les autres souches le.vuriennes présentes dans le milieu du vin, telles que Saccharomyces par exemple. Le test immuno-enzymatique selon "invention présente donc l'avantage d'être sensible et spécifique. 5 Ce deuxième modèle de kit de détection selon l'invention est simple d'utilisation et rapide : il permet d'obtenir des résultats en moins de quatre heures. L'analyse des résultats pour la quantification par colorimétrie peut être effectuée automatiquement à l'aide de logiciel informatique qui évalue l'intensité de la coloration obtenue dans les différents puits. L'analyse peut être réalisée 10 par visualisation optique directe. 3. Modèle 3 : kit sous la forme d'un test par PCR quantitative Selon une troisième variante, le kit de détection selon l'invention se présente sous la forme d'un test par Amplification en Chaîne par Polymérisation (PCR pour 15 Polymerase Chain Reaction) en temps réel. La PCR est une technique de réplication in vitro qui permet d'obtenir d'importantes quantités d'une séquence spécifique d'ADN à partir d'une quantité initiale très faible. Chaque réaction de réplication met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques 20 qui définissent, en la bornant, la séquence d'ADN à amplifier. L'amplification de l'ADN est réalisée par cycles successifs qui comprennent trois étapes : dénaturation, hybridation et extension. C'est la séquence d'amorce qui assure la spécificité du test. La PCR en temps réel est une amélioration de la PCR classique, qui permet 25 d'obtenir des résultats quantitatifs et d'estimer la quantité d'ADN initial. Elle consiste à mesurer la quantité d'ADN polymérisée à chaque cycle de réplication par fluorescence. 2908786 11 Le test par Amplification en Chaîne par Polymérase selon l'invention est une PCR en temps réel qui permet d'obtenir des résultats quantitatifs sur une séquence d'ADN spécifique des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Il permet de détecter 5 la présence de Brettanomyces dans un produit issu de la vendange en déterminant la quantité d'ADN spécifique des Brettanomyces présente initialement dans un échantillon dudit produit. Pour réaliser la PCR selon l'invention, on utilise des séquences d'amorces spécifiques d'une séquence d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes 10 de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. De manière préférentielle, on utilise des séquences d'amorces spécifiques d'une séquence d'ADN des souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12. Selon une caractéristique de l'invention les séquences d'amorce utilisées sont 15 relativement longues. Leur taille est supérieure à 15 paires de bases. Préférentiellement, leur taille est comprise entre 16 et 30 paires de bases. Le procédé de réalisation de la PCR spécifique des Brettanomyces selon l'invention consiste dans un premier temps à introduire dans un tube notamment : - un échantillon d'un produit issu de la vendange à analyser 20 ou l'ADN extrait de cette échantillon, - des amorces selon l'invention spécifiques d'une séquence d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin, 25 - de l'ADN polymérase, et - un mélange des quatre désoxyribonucéotides constitutifs de l'ADN. Préférentiellement on utilise directement l'échantillon, sans extraction de l'ADN. 2908786 12 Le tube est ensuite placé dans un thermocycleur où sont réalisés les cycles successifs de réplication. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les conditions de la PCR sont les suivantes : -on réalise une première phase de dénaturation pendant 1 minute à 94 C, puis - on réalise 35 fois le cycle suivant : • dénaturation pendant 30 secondes à 94 C, • hybridation pendant 1 minute à 55 C, et • élongation pendant 30 secondes à 72 C, - et enfin on réalise une élongation pendant 5 minutes à 72 C. Pour la fluorescence, la PCR en temps réel selon l'invention utilise préférentiellement une sonde dite Taqman , spécifique d'une séquence interne 15 au fragment d'ADN amplifié. La fluorescence peut également être obtenue à l'aide d'un colorant telle que SYBRGreen . L'analyse des résultats s'effectue par mesure de fluorescence, l'intensité de l'émission de la fluorescence étant proportionnelle au nombre de fragments 20 d'ADN présents correspondants à la séquence à identifier. Les séquences d'amorces selon l'invention sont spécifiques des Brettanomyces, en particulier des Brettanomyces susceptibles de contaminer un produit issu de la vendange. Elles ne permettent pas d'amplifier par PCR les autres souches microbiennes présentes dans le milieu du vin, telles que Saccharomyces par 25 exemple. Ce troisième modèle de kit de détection selon l'invention présente donc l'avantage d'être sensible et spécifique. 5 10 2908786 13 Le test est rapide à mettre en oeuvre et permet d'obtenir des résultats en moins de 4 heures. Bien entendu, l'invention n'est évidemment pas limitée aux modèles de réalisation 5 représentés et décrits ci-dessus, mais en couvre au contraire toutes les variantes. REVENDICATIONS 1. Kit pour la détection spécifique d'une contamination levurienne par Brettanomyces d'un produit issu de la vendange quel que soit le stade de traitement, caractérisé en ce qu'il intègre des moyens de détection comprenant un test par Amplification en Chaîne par Polymérisation en temps réel, avec des séquences d'amorces spécifiques d'une séquence d'ADN d'au moins une des souches les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin. 2. Kit selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les souches la ou les plus virulentes de Brettanomyces difficilement susceptibles de se développer dans le milieu du vin sont choisies parmi les souches de Brettanomyces CB28 et/ou CB63 et/ou CB12.