Brevet FR2903916A1 — publié le 20080125

DISPOSITIF MICROFLUIDIQUE POUR LA CRISTALLISATION ET L'ANALYSE CRISTALLOGRAPHIQUE DE MOLÉCULES La présente invention se rapporte au domaine de la cristallisation. Elle concerne tout particulièrement un dispositif microfluidique pour la cristallisation et l'analyse cristallographique de molécules, notamment biologiques. La mise au point de dispositifs permettant l'obtention de cristaux de qualité est un enjeu majeur, notamment dans les domaines de la biologie, en particulier en génomique structurale, de la chimie, de la pharmacie et de la médecine, notamment pour la recherche de nouveaux principes actifs. La cristallisation de molécules, notamment biologiques, est un processus multi-paramétrique complexe qui fait intervenir un grand nombre de variables physico-chimiques et biochimiques. Ainsi, la recherche et l'optimisation de conditions permettant l'obtention de cristaux de qualité, peut nécessiter une quantité importante de substances à cristalliser telles que des biomolécules ou des composés synthétiques, matériel pouvant être très coûteux. Actuellement, la recherche de dispositifs visant à obtenir des cristaux de qualité avec une faible quantité d'échantillon à cristalliser est en pleine expansion. Ainsi, depuis 2003, la société Californienne Fluidigm propose une puce microfluidique permettant de préparer des cristaux de qualité à partir d'une faible quantité d'échantillon. Toutefois, ce système doit être 2903916 2 rempli à la main et fonctionne avec un système de vannes activées par pressurisation qui rend complexe son utilisation et qui peut être une source de panne. En outre, ce dispositif est onéreux et permet 5 difficilement une analyse des cristaux in situ. Bien que certains dispositifs miniaturisés soient déjà utilisés pour la cristallisation de molécules, ils peuvent être coûteux, insuffisamment fiables, difficiles d'utilisation, ne pas être adaptés à la fois 10 au criblage et à l'optimisation des conditions de cristallisation, ou encore ne pas permettre une analyse des cristaux in situ, notamment par diffraction des rayons X. Il subsiste donc un besoin pour des dispositifs 15 présentant des propriétés améliorées pour la cristallisation de molécules. Les inventeurs ont maintenant mis au point un dispositif permettant de résoudre tout ou partie des problèmes évoqués ci-dessus. 20 Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un dispositif microfluidique comprenant au moins une chambre de cristallisation susceptible de comprendre une solution dans laquelle au moins un composé est présent selon un gradient de concentration et dans 25 lequel la géométrie de ladite chambre de cristallisation permet de limiter les phénomènes de convection. On entend par dispositif microfluidique au sens de la présente invention un appareil miniaturisé 30 utilisant de très faibles quantités d'échantillon liquide, de l'ordre du microlitre voire inférieures au microlitre. Au sein du dispositif, la géométrie et les 2903916 3 dimensions réduites de ladite chambre de cristallisation minimisent les mouvements de convection dans les solutions, tels qu'observés par exemple en interférométrie. L'environnement microfluidique 5 favorise ainsi une croissance cristalline plus homogène dans un milieu limitant les phénomènes de convection, voire exempt de phénomènes de convection. On entend par chambre de cristallisation au sens de la présente invention une chambre adaptée à la 10 cristallisation de molécules, en particulier un espace étanche aux liquides et aux gaz, et tout particulièrement à l'eau, aux solvants volatiles tels que les alcools, à la vapeur d'eau et/ou à l'air. En particulier, la chambre de cristallisation est 15 reliée à au moins un réservoir (R1). On entend par réservoir au sens de la présente invention, une enceinte étanche permettant de contenir un fluide dont le volume peut être supérieur à celui de la chambre de cristallisation. 20 La chambre de cristallisation selon l'invention peut être agencée de manière à permettre une cristallisation par batch, par contre-diffusion, de préférence par contre-diffusion. La technique de cristallisation par contre- 25 diffusion a été développée par Garcia-Ruiz en 1994 (Garcia Ruiz & Moreno, 1994, Acta. Cryst. D50, 484-490), cette technique est bien connue de l'Homme du Métier. En particulier, la chambre de cristallisation selon 30 l'invention présente une section ou un diamètre, inférieur ou égal à 400 m, notamment inférieur ou égal 2903916 4 à 300 hum, en particulier inférieur ou égal à 200 fum, voire inférieur ou égal à 100 m. La chambre de cristallisation selon l'invention peut présenter une longueur supérieure ou égale à 10 5 mm, notamment supérieure ou égale à 30 mm. La chambre de cristallisation selon l'invention peut présenter un rapport longueur / largeur supérieur ou égal à 10, en particulier supérieur ou égal à 100, et tout particulièrement supérieur ou égal à 1000. 10 La chambre de cristallisation selon l'invention peut présenter une section carrée, rectangulaire, hémisphérique, triangulaire ou tubulaire, notamment carré ou rectangulaire. En particulier, la géométrie de la chambre de 15 cristallisation selon l'invention comprend des moyens permettant d'améliorer la cristallisation notamment d'augmenter le nombre de cristaux formés, en particulier par greffage de fonctions chimiques, de charges, de substrats d'enzymes et/ou de ligands, ou 20 encore par des arrangements géométriques particuliers, comme des chicanes, des aspérités ou des irrégularités de surface. Les techniques de greffage de fonctions chimiques, de charges, de substrats d'enzymes ou de ligands sont 25 des techniques bien connues de l'Homme du Métier (Ulman, 1991, Introduction to thin organic films : From Langmuir-Blodgett to self Assembly ; Academic Press, Boston). Ainsi, le dispositif selon l'invention peut 30 notamment permettre la cristallisation de macromolécules telles que les enzymes, les acides nucléiques ou les protéines membranaires. 2903916 5 La chambre de cristallisation selon l'invention peut être réalisée par au moins un procédé de lithographie, de micro-usinage, de moulage par injection, de moulage par compression, de compression à 5 chaud ou à froid par coulage et/ou d'impression. On entend par procédé de lithographie une méthode dérivée de l'industrie des semi-conducteurs dont le principe général consiste à créer une image sur un substrat recouvert d'une couche de matériau sensible 10 telle que décrite par Chang et Sze (1996, ULSI technology, Mac Graw-Hill International Editions) et par Xia et Whitesides (1998, Annu. Rev. Mater. Sci., 28, 153-184). À titre d'exemple de procédé de lithographie, on 15 peut citer la photolithographie, la lithographie X, la lithographie EUV, la lithographie électronique, la lithographie ionique et la lithographie de nano- impression. De telles techniques peuvent être facilement identifiées par l'Homme du Métier à l'aide 20 de ses connaissances générales. Des procédés de micro-usinage par enlèvement de matière peuvent être basés sur l'utilisation d'un outil coupant ou d'un laser. Le (ou les) matériau(x) constituant la chambre de 25 cristallisation selon l'invention et son entourage peu(ven)t être transparent(s) , notamment laisse(nt) passer le spectre visible, les rayons X incidents et/ou le signal diffracté par le cristal. Le(s) matériau(x) peu(ven)t notamment être choisi(s) dans le groupe 30 comprenant le polydiméthyl-siloxane (PDMS), le polyméthyl-méthacrylate (PMMA), le polycarbonate, le copolymère de cyclo-oléfine (COC) et la résine SU8, de préférence le polyméthyl-méthacrylate. 2903916 6 Ainsi, le dispositif selon l'invention peut permettre le suivi cinétique de la croissance des cristaux, par exemple par vidéomicroscopie, de la formation d'un gradient de concentration, notamment par 5 interférométrie. En particulier, au moins une partie du volume défini par la chambre de cristallisation selon l'invention comprend un gel. On entend par gel un milieu diphasique 10 constitué d'un réseau tridimensionnel de polymère réticulé imprégné d'un liquide tel qu'une solution moléculaire à cristalliser. La réticulation peut être d'origine physique dans le cas par exemple d'un gel d'agarose, de cellulose et leurs dérivés, ou chimique 15 dans le cas par exemple d'un gel de silice ou d'acrylamide-bisacrylamide. Ledit gel selon l'invention peut être choisi dans le groupe comprenant les gels d'agarose, de cellulose et/ou leurs dérivés, de silice et/ou d'acrylamide- 20 bisacryamide. En particulier, au moins une partie du volume défini par une extrémité de la chambre de cristallisation selon l'invention comprend un gel. En particulier, l'ensemble du volume défini par la 25 chambre de cristallisation selon l'invention comprend un gel. La chambre de cristallisation selon l'invention peut présenter sur au moins une partie de sa surface interne des moyens permettant d'en augmenter la 30 mouillabilité. On entend par mouillabilité au sens de l'invention l'aptitude d'une surface à être mouillée par une solution aqueuse, ce qui se traduit par l'observation d'un angle de contact inférieur à 90 . 2903916 7 À titre d'exemples de moyens permettant d'augmenter la mouillabilité, on peut citer : - i) les modifications de surface par des traitements physiques, chimiques ou une combinaison des 5 deux, par exemple des traitements plasmas, notamment oxygène, ozone, ultra-violets, par des ions, l'adsorption de tensio-actifs, le greffage de groupements hydrophiles ; - ii) l'ajout de molécules tensioactives à une 10 solution aqueuse. Selon un mode de réalisation particulier, la chambre de cristallisation est susceptible d'être remplie par capillarité. On entend par capillarité selon l'invention un 15 phénomène se traduisant par la montée d'un fluide dans un tube de faible diamètre. On entend par solution au sens de la présente invention, un liquide homogène comprenant au moins un solvant et un soluté, ledit soluté étant dissous dans 20 le solvant. On entend par composé au sens de la présente invention, une substance chimique. En particulier, ledit composé est un agent de cristallisation. 25 On entend par agent de cristallisation au sens de la présente invention un composé organique ou inorganique, naturel ou de synthèse, favorisant la cristallisation de molécules. À titre d'exemples d'agent de cristallisation, on 30 peut citer des sels tels que le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium, des alcools tel que le méthyl-2,4-pentanediol, l'éthanol, des polymères tels que les 2903916 8 polyéthylène-glycols et leurs dérivés et les polyamines. On entend par gradient de concentration au sens de la présente invention, la variation de la 5 concentration d'un composé du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré. En particulier, le dispositif microfluidique permet d'obtenir un gradient de concentration en composé, et en notamment en agent de cristallisation, allant d'une 10 concentration inférieure ou égale à 25 %, notamment 20 %, voire 15 %, en particulier 10 %, tout particulièrement 5 %, voire 0%, à une concentration supérieure ou égale à 50 %, voire 75 %, notamment 85 %, en particulier 95 % et tout particulièrement 100 % de 15 la concentration de saturation en composé et notamment en agent de cristallisation. En particulier, ledit gradient de concentration s'établit sur au moins 20 % de la longueur, notamment sur au moins 40 % de la longueur, en particulier sur au 20 moins 60 % de la longueur, tout particulièrement sur au moins 80 % de la longueur, voire sur toute la longueur de la chambre de cristallisation. Ainsi, le dispositif selon l'invention permet d'obtenir une très grande variété, un continuum, de 25 conditions de cristallisation. Ce dispositif permet tout particulièrement d'obtenir une variation continue ou quasi continue des conditions. En particulier, lorsque le dispositif selon l'invention comprend plusieurs chambres de 30 cristallisation, ledit composé, notamment l'agent de cristallisation est présent à une concentration différente dans chaque chambre de cristallisation. 2903916 9 Ainsi, lorsqu'une condition de cristallisation est identifiée, ce dispositif peut être utilisé pour l'optimiser. Le dispositif selon l'invention, en limitant les 5 phénomènes de convection, peut permettre l'obtention de cristaux de qualité avec de très faibles quantités de matériels à cristalliser. On entend par phénomène de convection au sens de la présente invention, les mouvements au sein d'un 10 fluide dus, par exemple, à une variation de température ou de densité. On entend par géométrie au sens de la présente invention, la disposition dans l'espace des éléments, en particulier l'arrangement de ladite chambre de 15 cristallisation. En particulier, le dispositif selon l'invention peut permettre la cristallisation de molécules dans un milieu dépourvu d'air et/ou de gaz entraînant la dégradation de composés, et en particulier de molécules 20 à cristalliser. Ceci peut ainsi permettre la cristallisation de molécules sensibles, notamment à l'oxydation. Le dispositif selon l'invention peut comprendre au moins une solution comprenant une substance 25 tensioactive, notamment choisie dans le groupe comprenant des tensioactifs non-ioniques et zwitterioniques, notamment permettant de solubiliser les molécules à cristalliser. On entend par substance tensio-active au sens 30 de la présente invention un composé chimique présentant des propriétés tensioactives. 2903916 10 À titre d'exemples de substance tensio-active, on peut citer l'octylglucoside, l'octylthioglucoside, le nonylglucoside, le LDAO (lauryl-diamine oxide), le Triton X-100 (polyoxyethylène octyl phenyl ether), le 5 CHAPS (acide 3((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-propanesulfonique) et leurs dérivés, en particulier l'octylglucoside. La concentration en substance tensio-active peut varier en fonction du produit choisi, notamment de 1 à 10 100, % ou plus de la concentration micellaire critique (CMC). À titre d'exemples, la CMC dans l'eau de l'octylglucoside est de 20 mM, celle de l'octylthioglucoside est de 6,5 mM, du nonylglucoside 15 est de 9,5 mM, du LDAO est de 2 mM, du Triton X-100 est de 0,9 mM, du CHAPS est de 8 mM. En particulier, le dispositif selon l'invention est dépourvu : - de moyens de remplissage mécanique, notamment de 20 la chambre de cristallisation, comme des vannes et des moyens de pression, et/ou - de partie mobile, en particulier pour permettre l'utilisation dudit dispositif, tout particulièrement lors du remplissage 25 de la chambre de cristallisation. Ainsi, le dispositif selon l'invention peut être d'une utilisation facile, présenter une fiabilité améliorée et/ou avoir un coût de production réduit. Avantageusement, le dispositif selon l'invention 30 peut permettre une analyse in situ des cristaux présents dans la chambre de cristallisation par diffraction de rayons X. 2903916 11 Le dispositif selon l'invention peut être transparent ou translucide à la lumière, en particulier pour permettre l'observation des cristaux à l'oeil nu, en grossissement optique, notamment en grossissement 5 optique. En particulier, ladite solution selon l'invention comprend en outre au moins une molécule d'intérêt, d'origine chimique, biologique, médicale et/ou pharmaceutique, notamment une molécule inorganique ou 10 organique, une macromolécule naturelle ou de synthèse, notamment choisie dans le groupe comprenant les acides nucléiques, les protéines, les complexes supramoléculaires et les virus. Le dispositif microfluidique selon l'invention peut 15 comprendre des moyens permettant d'obtenir une température donnée dans tout le dispositif ou dans au moins une chambre de cristallisation. Le dispositif microfluidique selon l'invention peut comprendre des moyens permettant d'obtenir gradient de 20 température dans au moins une partie d'au moins une chambre de cristallisation, en particulier sur toute la longueur d'au moins une chambre de cristallisation et tout particulièrement dans l'ensemble du dispositif selon l'invention. 25 De tels moyens peuvent être facilement identifiés par l'Homme du Métier à l'aide de ses connaissances générales. À titre d'exemples de moyens permettant d'obtenir une température donnée dans tout le dispositif ou dans 30 au moins une chambre de cristallisation, on peut citer l'utilisation d'éléments Peltier. Par effet Peltier , on entend un effet de déplacement de chaleur en présence de courant électrique dans des matériaux conducteurs de natures différentes liés par 2903916 12 des jonctions. Une des jonctions se refroidit alors légèrement pendant que l'autre jonction se réchauffe. En particulier, le dispositif microfluidique selon l'invention peut comprendre des moyens permettant 5 d'obtenir un gradient de température dans au moins une partie d'au moins une chambre de cristallisation, voire sur toute la longueur d'au moins une chambre de cristallisation. De tels moyens peuvent être facilement identifiés 10 par l'Homme du Métier à l'aide de ses connaissances générales. À titre d'exemples de moyen permettant d'obtenir un gradient de température dans au moins une partie d'au moins une chambre de cristallisation, voire sur toute 15 la longueur d'au moins une chambre de cristallisation, on peut citer les éléments Peltier. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation du dispositif selon l'invention pour l'une des applications suivantes : 20 -cristallisation par contre-diffusion, - recherche de nouveaux principes actifs et/ou de nouvelles formes de principes actifs, notamment de nouvelles formes cristallines, - recherche par criblage et optimisation des 25 conditions de cristallisation, notamment dans le cas de molécules d'intérêt, telles que des sels ou des molécules organiques ou inorganiques, des macromolécules biologiques, des virus ou des principes actifs de médicaments. 30 Ainsi, le dispositif selon l'invention peut être utilisé pour cribler et optimiser les conditions de cristallisation de molécules. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet l'utilisation du dispositif selon l'invention au 2903916 13 sein d'un dispositif permettant une analyse par diffraction des rayons X des cristaux présents dans la chambre de cristallisation. Ainsi, le dispositif selon l'invention peut être 5 utilisé pour analyser des cristaux in situ sans manipulation pouvant détériorer leur qualité. Selon un autre aspect, l'invention a également pour objet un procédé de cristallisation comprenant au moins les étapes consistant à : 10 (i) déposer à une extrémité d'une chambre de cristallisation une solution comprenant au moins une molécule d'intérêt, notamment une macromolécule, (ii) déposer à une autre extrémité de la chambre de cristallisation une solution comprenant au moins un 15 agent de cristallisation, puis (iii) laisser des cristaux se former. En particulier, dans le procédé selon l'invention, ladite chambre de cristallisation est comprise dans un dispositif selon l'invention. 20 En particulier, le procédé de cristallisation selon l'invention comprend en outre l'étape consistant à : (iv) déposer à une extrémité d'une chambre de cristallisation une solution comprenant un composé choisi dans le groupe comprenant des substrats 25 d'enzymes, des ligands, des cryoprotectants, des composés facilitant la détermination de structure tridimensionnelle tels que des atomes lourds. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au regard des figures et des 30 exemples qui suivent. Les figures et les exemples qui suivent sont donnés à titre illustratif et non limitatif : 2903916 14 - La Figure 1 (A et B) illustre des dispositifs en PDMS selon l'invention. La Figure lA illustre sous la forme d'un dessin un masque présentant 3 types de géométries de chambres de cristallisations sous forme 5 de canaux isolés, de peigne et en arborescence. La Figure 1B représente un substrat de PDMS comportant quatre dispositifs à géométrie arborescence moulés par la méthode de coulage. - La Figure 2 (A, B et C) illustre sous la forme de 10 schémas trois types de dispositifs selon l'invention. La Figure 2A illustre un dispositif d'épaisseur totale de 4-5 mm, formé par une couche de PDMS (figurée par des rayures) dans laquelle sont moulées les chambres de cristallisation sous forme de canaux et qui sont 15 fermées par collage d'une seconde couche de PDMS. La Figure 2B illustre un dispositif formé par une couche de PDMS de 0,5-1 mm d'épaisseur, dans laquelle sont moulées les chambres de cristallisation sous forme de canaux et qui sont fermées par un film plastique 20 transparent (figuré en gris foncé). La couche de PDMS est rigidifiée par une couche-support en PMMA (figurée en gris clair). La Figure 2C illustre un dispositif d'épaisseur de 0,25 mm, formé par une couche de PMMA dans laquelle sont moulées les chambres de 25 cristallisation sous forme de canaux et qui sont fermées par un film plastique transparent. - La Figure 3 illustre le remplissage d'un dispositif selon l'invention en PDMS. - La Figure 4 (A, B, C, D et E) illustre sous la 30 forme de photos la formation de cristaux du virus de la mosaïque jaune du navet (VMJN), de la thaumatine, de lysozymes de poule et de dinde dans des dispositifs selon l'invention. 2903916 15 - La Figure 5 illustre le positionnement du dispositif selon l'invention sur une ligne de lumière synchrotron en vue d'une analyse aux rayons X. Le dispositif a été fixé sur une microplaque standard 5 (plaque NUNC 96 puits à rangées amovibles), l'ensemble étant placé dans le faisceau de rayons X à 200 mm du détecteur MAR CCD et maintenu par la pince du bras manipulateur d'un robot (Stâubli, France). - La Figure 6 (A à D) illustre l'analyse in situ de 10 cristaux de lysozyme de poule par diffraction des rayons X. La Figure 6A représente un dispositif selon l'invention en PMMA dont les chambres de cristallisation sont disposées en arborescence. Le dispositif est fixé sur une microplaque et maintenu par 15 une pince. La Figure 6B représente un cristal de lysozyme de poule observé via une caméra à visée axiale. La Figure 6C est un cliché de diffraction dont les plages de résolution sont indiqués par les cercles à 2,1 À, 2,8 À, 4,3 À et 8,5 À. La Figure 6D représente 20 une carte de densité électronique (à 2,15 À de résolution) avec le modèle atomique de la protéine. EXEMPLES 1. Exemple 1 : Fabrication de dispositifs 25 I.1 Fabrication de dispositifs en polydiméthyl-siloxane (PDMS) Des dispositifs microfluidiques ont été réalisés en polydiméthyl-siloxane (PDMS) en quatre étapes successives : 30 1) Un masque sur film transparent a été obtenu par impression laser. 2903916 16 2) Un moule en résine SU8 épaisse a ensuite été réalisé par photolitographie à partir dudit masque (Figure 1B). 3) Les dispositifs ont ensuite été obtenus par 5 moulage. 4) Les chambres de cristallisation sont ensuite scellées par collage d'une seconde couche de PDMS ou d'un film plastique transparent tel que ViewSeal , ClearSeal , Mylar . Des dispositifs comprenant des chambres de cristallisation présentant diverses géométries ont été fabriqués tels que représentés sur la Figure lA : des chambres de cristallisations sous forme de canaux soit isolés, soit en forme de peigne ou en arborescence. La Figure 1B représente le moulage de quatre dispositifs en PDMS dont les chambres de cristallisation présentent une géométrie arborescente. I.2 Fabrication de dispositifs en polyméthyl-20 méthacrylate (PMMA) Des dispositifs selon l'invention ont été fabriqués en polyméthyl-méthacrylate (PMMA) par ablation laser (gravure de chambres de cristallisation dans une couche de 250 m de PMMA). Les chambres de cristallisation ont 25 ensuite été fermées par un film plastique transparent (Figure 2 C). Les dispositifs selon l'invention fabriqués en PMMA se sont révélés particulièrement bien adaptés à l'analyse cristallographique, notamment par diffraction 30 des rayons X, et offrent de nombreux avantages par rapport aux dispositifs en PDMS. 10 15 2903916 17 II. Remplissage des dispositifs II.1 Deux techniques principales de remplissage des dispositifs 5 Les chambres de cristallisation du dispositif selon l'invention ont été remplies par capillarité, notamment selon deux techniques : 1) Une goutte de solution comprenant une molécule à cristalliser, un agent gélifiant tel que 10 l'agarose (0,2%-0,5% m/v) et une substance tensioactive telle que l'octylglucoside (0,5% m/v) a été déposée à l'extrémité d'une chambre de cristallisation qui s'est remplie par capillarité. Une solution comprenant un agent de cristallisation 15 a ensuite été déposée à une autre extrémité de la chambre de cristallisation. 2) Une goutte de solution comprenant une molécule à cristalliser et une substance tensioactive telle que l'octylglucoside (0,5% m/v) a été déposée à 20 l'extrémité d'une chambre de cristallisation qui s'est remplie par capillarité. Une solution comprenant un agent gélifiant tel que l'agarose (2% m/v) a ensuite été déposée à une autre extrémité de ladite chambre de cristallisation. 25 Enfin, une solution comprenant un agent de cristallisation a ensuite été déposée sur le gel à cette autre extrémité de la chambre de cristallisation. La substance tensioactive a permis de stabiliser les molécules, notamment les macromolécules. 30 L'agent gélifiant a permis d'immobiliser les solutions et les cristaux dans les chambres de 2903916 18 cristallisation. En outre, il a permis de réduire encore d'avantage le phénomène de convection et ainsi de favoriser la croissance de cristaux de qualité. 5 II.2 Remplissaqe de dispositifs en PDMS Le remplissage d'un dispositif en PDMS est illustré sur la Figure 3. Une couche de PDMS comprenant les chambres de cristallisation sous forme de canaux a été déposée sur 10 une fine plaque de PMMA (C) placée du côté opposé aux canaux. Ces derniers sont fermés par un film plastique transparent (D) tel que ViewSeal , ClearSeal et Mylar . Cet ensemble a ensuite été vissé sur un support de PMMA épais de 5 mm (B'). Une goutte de solution 15 comprenant une molécule à cristalliser, un agent gélifiant tel que l'agarose (0,2%-0,5% m/v) et un détergent tel que l'octylglucoside (0,5% m/v) a été déposée à l'extrémité de l'arborescence des canaux qui se sont remplis par capillarité (F). 20 L'ensemble (A) a ensuite été pris en sandwich entre les deux plaques vissables de PMMA (B et B') et une solution comprenant un agent de cristallisation a ensuite été déposée dans des réservoirs reliés aux chambres de cristallisation. 25 L'ensemble a ensuite été scellé par un film transparent pour en assurer l'étanchéité. III. Cristallisation du virus VMJN, de la thaumatine, de lysozyme de poule et de dinde dans les dispositifs 30 selon l'invention 2903916 19 En utilisant les protocoles décrits précédemment, des cristaux de trois protéines différentes et d'un virus ont été obtenus par contre-diffusion. Des cristaux de thaumatine (22kDa) sont représentés 5 sur les Figures 4A et 4C. Le gradient de concentration de l'agent cristallisant s'est établi par diffusion de la droite vers la gauche. La taille des cristaux augmente et leur nombre diminue à mesure que la concentration d'agent cristallisant diminue le long de 10 la chambre de cristallisation sous forme de canal. La Figure 4C est une vue rapprochée des cristaux de thaumatine sous forme de bipyramides obtenues en 3 jours dans une chambre de cristallisation selon l'invention, sous forme de canal présentant une section 15 de 100 m. Des cristaux de virus VMJN, virus de la mosaïque jaune du navet (5. 106 kDa) sont représentés sur la Figure 4B. Des cristaux quadratiques de lysozyme de poule 20 obtenus dans un dispositif en PDMS comprenant des chambres de cristallisation sous forme de canaux isolés sont représentés sur la Figure 4D. Les cristaux sont bien visibles en lumière polarisée. Des cristaux hexagonaux de lysozyme de dinde 25 obtenus dans un dispositifen PDMS comprenant des chambres de cristallisation sous forme de canaux en arborescence sont représentés sur la Figure 4E. Les cristaux sont bien visibles lorsque polariseur et analyseur sont croisés (photo dans l'encart). 30 Ces résultats montrent que le dispositif selon l'invention permet la cristallisation de protéines par contre-diffusion. 2903916 20 De plus, les dispositifs selon l'invention en PDMS et PMMA sont suffisamment transparents pour permettre une observation des cristaux à l'oeil nu ou au microscope, y compris en lumière polarisée. 5 En outre, les cristaux obtenus dans les dispositifs selon l'invention présentent des tailles supérieures à 50 m et donc compatibles avec une analyse directe par diffraction des rayons X. 10 IV. Analyse directe des cristaux par diffraction des rayons X Des cristaux de lysozyme de poule ont été analysés in situ par diffraction des rayons X (Figure 6). Cette analyse a été effectuée sous rayonnement X synchrotron 15 à l'ESRF à Grenoble. Ces cristaux ont été obtenus par la technique de batch dans des dispositifs selon l'invention en PMMA de 250 et fermés par un film plastique (Figure 2C). Les dispositifs ont ainsi été remplis avec 3 l du 20 mélange de cristallisation de composition suivante : - 5 !11 de lysozyme à 80 mg/ml dans 100 mM acétate-Na pH 4,6 - 3 !ul d'agent X : 100 mM acétate-Na pH 4,6, 1 M NaCl, 30 % PEG 3350) 25 - 0,3 l d'octyl-glucoside 10% (m/v) soit 0,3% (m/v) - 1,7 l de tampon 100 mM acétate-Na pH 4,6. Le dispositif a ensuite été fixé sur une microplaque standard (plaque NUNC 96 puits à rangées 30 amovibles), l'ensemble étant placé dans le faisceau de rayons X à 200 mm du détecteur MAR CCD et maintenu par un bras manipulateur robotisé (Stàubli, France) (Figure 5). 2903916 21 Un jeu de trente images successives collecté sur l'un des cristaux (conditions d'exposition : 20 secondes, distance de 200 mm, longueur d'onde de 0,800 À) a permis de calculer une carte de densité 5 électronique à une résolution de 2,15 À et de déterminer la structure tridimensionnelle de la protéine (Figure 6D). Les données cristallographiques sont résumées ci-après : 10 Longueur d'onde 0,799 À Distance 200 mm Exposition 15 sec Oscillation 1 Nombre d'images 30 15 Groupe d'espace P43212 Maille cristalline a=79,1 À, c=38,8 , Résolution 2,15 û 20 À Nombre de réflexions (uniques) 12115 (5040) Complétude 72,4 % (72,7 %)* 20 Rsym 7,4 % (20,1 %)* *données à haute résolution : 2,15-2,21 À L'ensemble de ces expériences montrent que le 25 dispositif selon l'invention permet d'obtenir des cristaux de qualité avec une faible quantité d'échantillon à cristalliser. En outre le dispositif selon l'invention permet à la fois le criblage et l'optimisation des conditions de cristallisation, le 30 suivi par vidéo-microscopie et l'analyse in situ des cristaux par diffraction des rayons X. La simplicité de fonctionnement et la géométrie des dispositifs devraient faciliter l'automatisation de l'ensemble des 2903916 22 étapes, notamment dans le cadre d'applications à haut débit pour la génomique structurale. REVENDICATIONS 1. Dispositif microfluidique comprenant au moins une chambre de cristallisation susceptible de comprendre une solution dans laquelle au moins un composé est présent selon un gradient de concentration et dans lequel la géométrie de ladite chambre de cristallisation permet de limiter les phénomènes de convection. 2. Dispositif microfluidique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins un composé est présent selon un gradient de concentration allant d'une concentration inférieure ou égale à 25 %, notamment 20 %, voire 15 %, en particulier 10 %, tout particulièrement 5 %, voire 0%, à une concentration supérieure ou égale à 50 %, voire 75 %, notamment 85 %, en particulier 95 % et tout particulièrement 100 % de la concentration de saturation en composé. 3. Dispositif microfluidique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation est reliée à au moins un réservoir (R1). 4. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation est agencée de manière à permettre une cristallisation par contre- diffusion. 5. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit composé est un agent de cristallisation. 2903916 24 6. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit gradient de concentration s'établit sur au 5 moins 20 % de la longueur, notamment sur au moins 40 % de la longueur, en particulier sur au moins 60 % de la longueur, tout particulièrement sur au moins 80 % de la longueur, voire sur toute la longueur de la chambre de cristallisation. 10 7. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation présente une section ou un diamètre, inférieur ou égal à 400 !lm, notamment 15 inférieur ou égal à 300 wn, en particulier inférieur ou égal à 200 m, voire inférieur ou égal à 100 m. 8. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce 20 que la chambre de cristallisation présente une longueur supérieure ou égale à 10 mm, notamment supérieure ou égale à 30 mm. 9. Dispositif microfluidique selon l'une 25 quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation présente un rapport longueur / largeur supérieur ou égal à 10, en particulier supérieur ou égal à 100 et tout particulièrement supérieur ou égal à 1000. 30 10. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'au moins une partie du volume défini par la chambre de cristallisation comprend un gel. 2903916 25 11. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'au moins une partie du volume défini par une 5 extrémité de la chambre de cristallisation comprend un gel. 12. Dispositif microfluidique selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit 10 gel est choisi dans le groupe comprenant les gels d'agarose, de cellulose et/ou leurs dérivés, de silice et/ou d'acrylamide-bisacrylamide. 13. Dispositif microfluidique selon l'une 15 quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une solution comprenant une substance tensioactive notamment choisie dans le groupe comprenant des tensioactifs non-ioniques et zwitterioniques. 20 14. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation est susceptible d'être remplie par capillarité. 25 15. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il est dépourvu : - de moyens de remplissage mécanique, notamment de 30 la chambre de cristallisation, comme des vannes et des moyens de pression, et/ou - de partie mobile, 26 2903916 en particulier pour permettre l'utilisation dudit dispositif, tout particulièrement lors du remplissage de la chambre de cristallisation. 5 16. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que la géométrie de la chambre de cristallisation comprend des moyens permettant d'améliorer la cristallisation notamment d'augmenter le nombre de 10 cristaux formés choisis dans le groupe consistant en le greffage de fonctions chimiques, des charges, ou de substrat d'enzymes et/ou des ligands, des arrangements géométriques particuliers, comme des aspérités ou des irrégularités de surface. 15 17. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il permet une analyse in situ des cristaux présents dans la chambre de cristallisation par diffraction de 20 rayons X. 18. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le (ou les) matériau(x) constituant la chambre de 25 cristallisation et son entourage est (sont) transparent(s) , notamment laisse(nt) passer le spectre visible, les rayons X incidents et/ou le signal diffracté par le cristal. 30 19. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le (ou les) matériaux constituant la chambre de cristallisation est (sont) choisi(s) dans le groupe comprenant le polydiméthyl-siloxane (PDMS), le 27 2903916 polyméthyl-méthacrylate (PMMA), le polycarbonate, le copolymère dé cyclo-oléfine (COC), la résine SU8, de préférence le polyméthyl-méthacrylate. 5 20. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'il est transparent ou translucide à la lumière, en particulier pour permettre l'observation des cristaux à l'oeil nu, en grossissement optique, notamment en 10 grossissement optique. 21. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que la chambre de cristallisation présente une section 15 carrée, rectangulaire, hémisphérique, triangulaire ou tubulaire, notamment carré ou rectangulaire. 22. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce 20 que la chambre de cristallisation est réalisée par au moins un procédé de lithographie, de micro-usinage, de moulage par injection, de moulage par compression, de compression à chaud ou à froid par coulage et/ou d'impression. 25 23. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce ladite solution comprend en outre au moins une molécule d'intérêt, d'origine chimique, biologique, médicale 30 et/ou pharmaceutique, notamment une molécule inorganique ou organique, une macromolécule naturelle ou de synthèse, notamment choisie dans le groupe comprenant les acides nucléiques, les protéines, les complexes supramoléculaires et les virus. 2903916 28 24. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 caractérisé en ce qu'il comprend des moyens permettant d'obtenir une 5 température donnée dans tout le dispositif ou dans au moins une chambre de cristallisation. 25. Dispositif microfluidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 caractérisé en ce 10 qu'il comprend des moyens permettant d'obtenir un gradient de température dans au moins une partie d'au moins une chambre de cristallisation, en particulier sur toute la longueur d'au moins une chambre de cristallisation et tout particulièrement dans 15 l'ensemble dudit dispositif. 26. Utilisation du dispositif tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, pour l'une des applications suivantes : 20 -cristallisation par contre-diffusion, - recherche de nouveaux principes actifs, et/ou de nouvelles formes de principes actifs, notamment de nouvelles formes cristallines, - recherche par criblage et optimisation des 25 conditions de cristallisation, notamment dans le cas de molécules d'intérêt, telles que des sels, des molécules organiques, inorganiques, des macromolécules biologiques, des virus ou des principes actifs de médicaments. 30 27. Utilisation du dispositif tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 au sein d'un dispositif permettant une analyse par des diffraction 2903916 29 des rayons X des cristaux présents dans la chambre de cristallisation. 28. Procédé de cristallisation comprenant au moins 5 les étapes consistant à : (i) déposer à une extrémité d'une chambre de cristallisation une solution comprenant au moins une molécule d'intérêt, notamment une macromolécule, (ii) déposer à une autre extrémité de la chambre 10 de cristallisation une solution comprenant au moins un agent de cristallisation, puis (iii) laisser des cristaux se former et caractérisé en ce que ladite chambre de cristallisation est comprise dans un dispositif tel que 15 défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 25.