Brevet FR2902334A1 — publié le 20071221

B1655FR 2902334 1 La présente invention concerne une nouvelle utilisation dans le domaine cosmétique et/ou dermatologique, et plus particulièrement l'utilisation d'extrait de souci pour préparer une composition utilisable en cosmétique et en dermatologie pour les soins et la protection de la peau contre les signes du vieillissement. La peau comprend des couches superficielles, à savoir l'épiderme, et des couches plus profondes, le derme et l'hypoderme, et chacune possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et s'adapter aux conditions de son environnement. Le derme sert de support à l'épiderme et est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire essentiellement à base de collagène et d'élastine. Les fibres de collagène contribuent à la tonicité et à l'élasticité de la peau. Avec l'âge, leur renouvellement diminue, ce qui se traduit par un amincissement de la peau, et leur perte progressive d'élasticité entraîne un durcissement de la peau. L'épiderme, qui est constitué de trois types de cellules dont les plus importantes sont les kératinocytes, constitue la couche externe, et joue un rôle fondamental pour assurer la protection et le maintien d'une bonne trophicité. C'est pourquoi de nombreuses compositions ont été mises au point afin de le protéger et d'améliorer les fonctions de la peau. On sait que le vieillissement de la peau s'accompagne d'un certain nombre de signes et en particulier de la formation de rides plus ou moins profondes et étendues, outre une perte d'élasticité et un amincissement. L'apparition des premières rides, qui peut survenir chez des individus dès l'âge de 30 à 40 ans, est un phénomène qui peut être aggravé par des agressions physiques ou chimiques provenant de la pollution, de l'exposition aux rayonnements ultraviolets ou des modes de vie qui accélèrent le vieillissement cutané. A l'échelle de la peau, le vieillissement provoque notamment une diminution des synthèses protéiques (colla- B1655FR 2902334 2 gène, élastine), ainsi qu'une élévation des métalloprotéinases de type MMP-3. Par ailleurs, les phénomènes d'oxydation (teneur en radicaux libres) entraînent des processus inflammatoires qui 5 augmentent la sensibilité cutanée. D'une manière générale, le traitement et la prévention des signes du vieillissement cutané sont l'objet de nombreux travaux et études depuis des années, notamment pour mettre au point des compositions susceptibles de favoriser la 10 restructuration tissulaire, et en particulier la néosynthèse d'éléments constitutifs de la peau comme le collagène. Par néosynthèse , on entend la synthèse du collagène qui se forme uniquement en cas de besoin, par exemple pour le comblement des rides. 15 Par ailleurs, on sait que, pour être acceptées par les utilisateurs, les compositions cosmétiques et/ou dermatologiques destinées au traitement et à la prévention des affections de la peau par application topique doivent être agréables à utiliser et doivent présenter de bonnes propriétés 20 physiques, notamment de consistance et d'onctuosité, tout en garantissant une efficacité satisfaisante et en évitant les inconvénients tels que tiraillements, irritations ou démangeaisons, que peuvent occasionner certains principes actifs. Dans l'état de la technique, par exemple le brevet 25 FR-A-2.761.607 décrit une composition dermatologique destinée au traitement des symptômes du vieillissement de la peau, comportant un dérivé de silanol méthylé et un dérivé d'une protéine végétale hydrolysée, additionnée le cas échéant d'un dérivé de vitamine C. Le brevet EP-A-662.319 décrit 30 des compositions cosmétiques et dermatologiques comprenant un céramide comme agent apaisant pour compenser l'effet irritant du principe actif anti-vieillissement. Le brevet FRA-2.783.169 décrit l'utilisation de pentapeptides du type Lys-Thr-Thr-Lys-Ser dans des compositions topiques pour fa- 35 voriser la synthèse du collagène et des glycosaminoglycannes, et par conséquent la régénération cutanée. On connaît également, du brevet FR-A-2 848 116, une composition cosmétique et/ou dermatologique à base B1655FR 2902334 3 d'inhibiteurs de métallo-protéinases matricielles, en particulier d'extrait de Siegesbeckia, et de lipopeptides permettant le traitement et la prévention des signes du vieillissement cutané tels que l'apparition de rides et la 5 perte d'élasticité de la peau. Cependant, il existe toujours un besoin accru de trouver des compositions topiques alternatives permettant de lutter efficacement contre le vieillissement cutané, et notamment de trouver des compositions topiques à base de 10 végétaux appropriés, particulièrement provenant de plantes aisément accessibles. Suivant la présente invention, on a trouvé qu'il était possible d'agir efficacement contre les signes du vieillissement cutané en utilisant des compositions topiques 15 à base d'extraits de souci. La présente invention a donc pour objet une nouvelle utilisation d'un extrait de souci pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou dermatologique pour application topique, permettant de lutter contre les signes du 20 vieillissement cutané tels que l'apparition de rides et la perte d'élasticité de la peau. La présente invention a encore pour objet un procédé cosmétique pour combattre les signes du vieillissement cutané, consistant à appliquer sur les zones de la peau 25 affectées une composition contenant une quantité efficace d'extrait de souci. Le souci (Calendula officinalis, ou souci des jardins et Calendula arvensis, ou souci des champs ) est déjà connu pour posséder des propriétés thérapeutiques. 30 En particulier, il a été montré que l'espèce Calendula officinalis possède, en usage interne, des propriétés sudorifiques, emménagogues, antispasmodiques et cholérétiques, et, en usage externe, des propriétés vulnéraires et anti-inflammatoires. Des propriétés ocytociques, hypoten- 35 sives et vasodilatatrices ont également été mises en évidence. En France, le Calendula officinalis est principalement utilisé en homéopathie ou en mélange dans des tisanes. Dans d'autres pays tels que l'Allemagne, les Pays-Bas B1655FR 2902334 4 et la Russie, il est utilisé dans des mélanges théiformes ou, en usage externe, contre les contusions, les ulcères, les gelures et les furoncles. Il a d'autre part été montré que le souci pouvait être 5 efficace contre l'acné, et en tant qu'agent adoucissant. L'espèce Calendula arvensis possède également des propriétés emménagogues, vaso-dilatatrices et hypotensives. Les études effectuées par la demanderesse ont montré de manière surprenante que l'utilisation d'une quantité 10 efficace d'un extrait de souci (Calendula officinalis ou Calendula arvensis) avait notamment pour effet de favoriser fortement la synthèse des collagènes, ce qui entraîne un épaississement de l'épiderme et par conséquent un aplanissement des rides, d'améliorer la néosynthèse des 15 collagènes de type I et de type III et de diminuer le rapport collagène I/collagène III, et également de diminuer l'expression des métalloprotéinases 3 (MMP-3) visant à un meilleur stockage de collagène néoformé. Les résultats des tests in vitro mettant en évidence ces propriétés sont 20 détaillés ci-après. Les extraits de souci utilisés suivant l'invention sont avantageusement obtenus à partir de pétales de fleurs de souci, par exemple par macération hydro-glycolique des fleurs pulvérisées. La macération peut être réalisée dans un 25 mélange butylène-glycol/eau. A cet effet, un mode de réalisation consiste à faire macérer des pétales de souci pulvérisés dans de l'eau à une température comprise entre environ 45 C et 50 C pendant 48 heures, puis à filtrer et à exprimer le gâteau. Les liqueurs sont ensuite réunies et 30 l'on ajoute 50% de butylène glycol. La mise en oeuvre est généralement de 10g / 100g de fleurs sèches. Typiquement, on peut utiliser un extrait de souci présentant la composition suivante : - eau / butylène glycol 50/50 35 -matières sèches 1,5 à 3,0% - flavonoïdes 0,2 à 3,0% (sur matière sèche, exprimé en rutine) B1655FR 2902334 5 Les matières sèches comprennent notamment de caroténoïdes, de flavonoïdes, des saponosides triterpéniques dérivés de l'acide oléanolique, des alcools triterpéniques et de la calendine. 5 Parmi les caroténoïdes, on peut citer le carotène, le lycopène, la violaxanthine, la flavoxanthine. Les flavonoïdes comprennent des hétérosides de l'isorhamnitol (tétrahydroxy-3,5,7,4' méthoxy 3' flavone). Parmi les saponosides triterpéniques dérivés de l'acide oléanolique, on 10 peut citer l'acide glycuronique, le glucose, le galactose. Des exemples d'alcools triterpéniques sont l'arnidiol, le faradiol, le taraxastérol, l'a et (3-amyrine. Les compositions topiques selon l'invention incluent typiquement entre 0,001 et 0,5% en poids d'extrait de souci 15 par rapport au poids total de la composition. Le pH de la composition est de préférence compris entre 6 et 6,5, et peut être ajusté, selon les compositions, par addition d'un acide tel que l'acide citrique ou d'une base telle que l'hydroxyde de sodium. 20 Il peut être avantageux, suivant une variante de la présente invention, d'incorporer dans la composition des principes actifs ou ingrédients auxiliaires choisis pour leurs propriétés complémentaires, afin de renforcer les effets anti-âge de la composition. Ainsi, il est particu- 25 lièrement avantageux de les combiner avec des quantités appropriées d'une ou plusieurs substances choisies parmi la Vitamine A palmitate, la Vitamine C ou ses dérivés, les protéines de graines d'amarante (Amarantus caudatus), les globulines de pois ou des mucilages tels que le mucilage de 30 fruits de baobab afin d'obtenir un effet tenseur de la peau, l'huile de Calophylum afin de renforcer l'effet anti-rides, l'huile d'Echium pour son effet anti-inflammatoire, un palmitoyl pentapeptide-3 tel que le Matrixyl ou des dérivés tels que le palmitoyl GHK (possédant la chaîne GlycylHistidyl-Lysine) et le palmitoyl GQPR (Glycyl-Glutamyl-Prolyl-Arginine) ou le palmitoyl VGVAPG (Valyl-Glycyl-Valyl-Alanyl-Prolyl-Glycine) associé à un céramide-2, ainsi que de manière générale toute association avec un céramide, une B1655FR 2902334 6 association comprenant du Matrixyl et un extrait de Siegesbeckia orientalis, les polyphénols, et notamment les polyphénols de cacao, l'acide oléanolique, un extrait de protéines de graines de Mimosa des fleuristes(Acacia 5 dealbata) en pH acide, une antihyaluronidase telle que Echinacine B afin de générer un maximum d'eau liée, l'Imperata cylindrica, par exemple MOIST 24 de la société Sederma, afin de favoriser l'hydratation de la peau par modification de la pression osmotique, un extrait de graines 10 de lotus, de graines de coquelicot, de racine de guimauve, les peptides d'Hibiscus (tel que le Myoxynol , commercialisé par les Laboratoires Sérobiologiques), les extraits de fenouil, les peptides d'origine végétale de type Argireline (commercialisés par la société Lipotec). 15 Les compositions peuvent également contenir diverses substances et excipients choisis en fonction de leurs propriétés connues et de la forme galénique envisagée. Ainsi, on peut incorporer des agents hydratants, des agents calmants, des agents émulsionnants, des tensioactifs, des 20 épaississants, des gélifiants, des agents viscosants, des conservateurs, des antioxydants, des parfums, des huiles, des lipides, un solvant spécifique ainsi que de l'eau et divers additifs destinés à améliorer les propriétés physiques des compositions. On peut encore avantageusement 25 incorporer des filtres ou écrans solaires choisis en fonction du degré de protection recherché. L'agent hydratant peut être choisi parmi les produits connus dans la préparation de compositions utilisables en cosmétologie et en dermatologie, et par exemple on peut uti- 30 liser un polyol, la glycérine (glycérol et des dérivés de glycérol), des alkylène polyols tels que le polyéthylène glycol, le sorbitol, le maltitol, le penta-érythritol, les polyacrylates et polyméthacrylates de glycéryle, les mucopolysaccharides tels que l'acide hyaluronique, des dérivés du 35 chitosan et des dérivés de l'acide pyrrolidone carboxylique. Les compositions peuvent être présentées sous les for-mes classiquement utilisées pour une application topique, c'est-à-dire sous forme de gel, lotion, sérum, émulsion (en B1655FR 2902334 7 particulier crème ou lait), masque, stick, pommade ou patch, contenant les composants décrits ci-dessus, et des excipients et supports usuels compatibles et pharmaceutiquement acceptables. Les formes préférées sont les sérums, les crè- 5 mes, les gels ou les patches, sous forme vectorisée ou non. Ces formes d'administration par voie topique sont préparées par les techniques connues, et par exemple, dans le cas d'une crème, par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse pour obtenir une émulsion huile dans eau, 10 ou inversement pour préparer une émulsion eau dans huile. Dans le cas de crèmes, on préfère utiliser des émulsions à structure lamellaire contenant peu de produits éthoxylés ou n'en contenant pas du tout. Dans le cas des émulsions, la phase grasse peut 15 représenter entre 10 et 60% environ du poids de la composition, la phase aqueuse entre 10 et 80% environ et l'agent émulsionnant entre 2 et 20%, le reste étant constitué par les composants de base de la composition selon l'invention et par les autres substances mentionnées ci- 20 dessus. Si un agent hydratant est incorporé, il est avantageusement introduit dans la phase aqueuse lors de la préparation de l'émulsion. La teneur en agent hydratant est généralement comprise entre 0,1 et 10% en poids par rapport au poids total de la composition. 25 Les exemples qui suivent illustrent la présente invention, sans en limiter la portée. Des exemples de formulations sont rapportés aux exemples 1 et 2. Dans ces exemples, les parties sont exprimées en poids, sauf indication contraire. 30 L'exemple 3 est relatif à des tests d'activité sur une co-culture d'épidermes reconstitués/fibroblastes humains, qui ont permis d'évaluer l'effet régénérant et protecteur vis-à-vis des radicaux libres d'un extrait hydroglycolique de souci, dénommé ci-après par "le produit extrait de 35 souci ". Exemple 1 On prépare par les techniques classiques une crème anti-rides ayant la composition pondérale suivante. B1655FR 2902334 8 Crème anti-rides Pentylène glycol 5,0 Capryl glycol 3,0 Octyl glycérol 0, 3 5 Matrixyl 3000 3,0 Stéaryl glucoside 3,0 PEG-20 stéaryl glucoside 2,5 Alcool béhénylique 2,5 Caprylyl glycocolle 1,5 10 Huile d'Inca-Inchi 3,0 Huile de framboises 1,0 Beurre de mangue 1,0 Acide oléanolique 0,5 Protéines de soja hydrolysées 15,0 15 Extrait de fleurs de souci 0,5 Gomme xanthane 0,5 Acide hyaluronique 0,1 Huiles essentielles naturelles 0,3 Eau déminéralisée QSP 100,0 20 Exemple 2 Crème anti-rides fluide Matrixyl 3000 3,0 Extrait de fleurs de souci 0,2 Extrait de graines d'Acacia dealbata 2,0 25 Mucilage de fruits de Baobab 5,0 Pentylène glycol 5,0 Capryl glycol 3,0 Octyl glycérol 0,3 Sodium heptonate 0,1 30 Acide 10-hydroxydécanoïque 0,15 PEG-20 sorbitan monostéarate 3,5 Sorbitan monostéarate 2,5 Perhydrosqualène 5,0 Protéines de soja hydrolysées 10,0 35 Globulines de pois 3,0 Huile de camélia 2,0 Monostéarate de glycérol 2,0 Alcool cétostéarylique 0,3 B1655FR 2902334 9 Gomme xanthane 0,5 Extrait de miel 3,0 Palmitate de Vitamine C 0,15 Parfum 0,1 Eau déminéralisée QSP 100,0 Exemple 3 Le but de l'étude décrite ci-dessous est d'évaluer le potentiel régénérant et protecteur vis-à-vis des radicaux libres d'un extrait hydroglycolique (butylène glycol) de 10 souci (Calendula officinalis) sur une co-culture d'épidermes reconstitués/fibroblastes humains. Pour cela, les dosages suivants sont réalisés : - dosage du malondialdéhyde (MDA) - dosage des collagènes totaux 15 - dosage du rapport collagène type I / collagène type III -dosage des métalloprotéinases 3 (MMP-3). 3-1. PROTOCOLE EXPERIMENTAL 3.1.1. Epidermes reconstitués, modèle SKINETHICTM Des kératinocytes d'origine humaine sont ensemencés sur 20 des filtres en polycarbonate de 0,5 cm2 dans un milieu défini (MCDB 153 modifié) et supplémenté. Les cellules sont cultivées pendant 14 jours à l'interface air/liquide, le milieu de culture étant changé tous les deux jours. Les épidermes ainsi formés sont utilisés pour la réalisation de 25 l'étude à partir du 17e jour de la culture. Pour évaluer la viabilité cellulaire, un essai préliminaire est effectué pour chaque produit étudié afin de déterminer les temps de contact composition/épiderme n'entraînant pas de cytotoxicité. 30 L'essai est conduit en duplicate à chaque temps expérimental : 6 et 24 heures. - Lot 1 : deux épidermes témoins ne recevant pas d'extrait de souci - Lot 2 : deux épidermes traités recevant un extrait de 35 souci à 0,1% (2 l/cm2) - Lot 3 : deux épidermes traités recevant un extrait de souci à 0,25% (2 1.1l/cm2) 5 B1655FR 2902334 10 Lot 4 : deux épidermes traités recevant un extrait de souci à 0,5% (2 l/cm2) . La viabilité cellulaire est d'abord étudiée par réaction colorimétrique au sel de tétrazonium (MTT). 5 Le sel de tétrazolium a la propriété d'être réduit en cristaux bleux de formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules. Cet enzyme, qui joue un rôle important dans le cycle de Krebs, catalyse la déshydrogénation du succinate en fumarate. C'est l'activité de cet 10 enzyme, flavoprotéine très fortement liée à la membrane interne mitochondriale qui est mesurée, par réduction du MTT. Par un dosage spectrophotométrique, il est possible de déterminer la toxicité d'une population cellulaire donnée. En effet, l'absorbance est directement reliée à l'activité 15 des succinates déshydrogénases, elle-même liée à la toxicité cellulaire. 0,15 ml de milieu de culture contenant 10% vol/vol de solution de MTT est pipetté sous chacun des filtres/support de culture. Après une incubation de 30 minutes à température 20 ambiante, la couleur des différentes cultures est observée et notée. Les cultures doivent être de couleur bleue/pourpre intense, preuve de la viabilité des cellules de l'épiderme. La viabilité cellulaire est également étudiée par examen histologique. Pour cela, les épidermes fixés dans une 25 solution contenant 10% de formaldéhyde sont inclus dans des blocs en paraffine. Les coupes verticales de 4 microns sont colorées à l'hématoxyline/éosine et photographiées sous un microscope optique. 3.1.2. Fibroblastes humains en culture 30 On utilise la méthode de la digestion enzymatique per-mettant d'obtenir des primocultures de fibroblastes à partir d'une biopsie de peau humaine. Les essais sont réalisés sur des fibroblastes entre le 2e et le 4e passage afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expériences. 35 La cytotoxicité du produit extrait de souci est évaluée par le test de réduction au bleu de Formazan (MTT) après 24 heures de traitement des cellules avec le produit étudié. B1655FR 2902334 11 L'essai est réalisé en effectuant, pour chaque lot, 5 mesures de la densité optique à 570nm. La constitution des lots est la suivante : - Lot 1 : témoin négatif non traité 5 - Lot 2 : traité par un extrait de souci à 0,1% - Lot 3 : traité par un extrait de souci à 0,25% - Lot 4 : traité par un extrait de souci à 0,5%. Après 24 heures d'incubation des cellules avec les différentes concentrations du produit à l'étude, elles sont 10 mises en contact avec du MTT pendant 3 heures à 37 C, puis lysées avec du DMSO. La densité optique est déterminée à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre après homogénéisation de la coloration. 3.1.3. Co-culture Epidermes reconstitués / fibroblastes 15 humains en culture Les cultures de fibroblastes sont établies à partir de peau de prépuces humains récoltés lors de circoncisions et sont amplifiées en milieu de culture RPMI 1640 supplémenté par du sérum de veau foetal, de la L-glutamine et de la 20 gentamycine. Les essais sont réalisés sur des fibroblastes, entre le 2e et le 4e passage, afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expérimentations. Les fibroblastes sont ensemencés dans des plaques 24 puits à raison de 105 cellules par ml. Ils sont ensuite incubés à 37 C et 25 5% de CO2. Après 24 heures d'incubation, les cellules sont mises en contact avec les épidermes reconstitués traités avec l'extrait de souci à raison de 2 l/cm2. 3.1.3.1. Evaluation de l'activité anti-radicalaire En dosant le malondialdéhyde (MDA), qui est l'un des 30 marqueurs essentiels de la cytotoxicité par les processus oxydatifs et le stress, on dispose d'un indice qui renseigne sur l'activité anti-radicalaire d'une substance donnée. Si de plus, en parallèle, le collagène de la matrice extracellulaire est dosé, on dispose d'un autre indice de 35 l'activité anti-radicalaire de la substance étudiée. L'essai est réalisé en duplicate (deux épidermes par lot constitué) sur une co-culture épiderme reconstitué/fibroblaste. B1655FR 2902334 12 La constitution des lots est la suivante : - Lot 1 : 2 épidermes/fibroblastes témoins ne recevant aucun produit - Lot 2 : 2 épidermes/fibroblastes témoin positif traités 5 avec l'hypoxanthine /xanthine oxydase - Lot 3 : 2 épidermes/fibroblastes traités avec de la vitamine E + hypoxanthine / xanthine oxydase - Lot 4 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,1% 10 -Lot 5 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,25% - Lot 6 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,5% - Lot 7 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un 15 extrait de souci à 0,1% + hypoxanthine/xanthine oxydase - Lot 8 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci 0,25% + hypoxanthine/xanthine oxydase - Lot 9 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci 0,5% + hypoxanthine/xanthine oxydase. 20 Dosage du MDA : indice de lipoperoxydation physiologique et induite Les épidermes sont traités, lavés et récupérés. Puis les épidermes sont remis en suspension dans : - 250 l de tampon Tris 50 mM, pH 8 contenant du NaC10,1M 25 et de l'EDTA 20 mM - 25 l de SDS à 7% - 300 gl de HC1 (0,1 N) - 38 gl d'acide phosphotungstique à 1% dans l'eau - 300 l d'acide thiobarbiturique à 0,67% dans l'eau. 30 Après 1 heure d'incubation dans l'obscurité à 50 C et un refroidissement dans l'eau glacée, 300 gl de n-butanol sont ajoutés dans chaque tube. Ceux-ci sont centrifugés à 10000 g à 0 C pendant 10 minutes. La phase supérieure est récupérée pour le dosage du MDA. 35 Le MDA est dosé par mesure de la fluorescence après séparation du complexe MDA-TBA par CLHP. Les appareils suivants sont utilisés : - pompe Bischoff Model 2.200 B1655FR 2902334 13 - Injecteur automatique Alcoot Model 788 autosampler Colonne UltraSep C18 (30 cm*0,18 cm), 6 mm de porosité - Détecteur de fluorescence, Jasco 821-FI. La détection de fluorescence est effectuée avec une ex- 5 citation à 515 nm et une émission à 553 nm. L'éluant utilisé est composé de méthanol :eau 40 :60(v/v), le pH étant ajusté à 8,3 avec du KOH 1 M. Le dosage du MDA induit est réalisé de la même façon, la seule différence résidant dans l'induction des radicaux 10 libres par le complexe hypoxanthine/xanthine oxydase. La quantification est faite par rapport à des standards traités comme les échantillons (0,125 ; 0,25 ; 0,5 et 1 mM) à l'aide d'un logiciel informatique ICS (Pic 3) (Instrumentation, Consommable Service). 15 Le dosage des protéines est réalisé selon la méthode de Bradford. L'augmentation de l'absorbance à 595 nm est proportionnelle à la concentration de protéines déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre UNICAM 8625. 3.1.3.2. Dosage de la néosynthèse des collagènes 20 Dosage quantitatif des collagènes totaux L'essai est conduit en triplicate après 24 heures de traitement. La constitution des lots est la suivante : - Lot 1 : 2 épidermes/fibroblastes témoins ne recevant 25 aucun produit - Lot 2 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,1% (2 l/cm2) - Lot 3 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,25% (2 l/cm2) 30 - Lot 4 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,5% (2 l/cm2). Après le temps d'incubation, les fibroblastes sont récupérés par centrifugation. Les culots sont digérés par les collagénases (1 mg/culot cellulaire) dans l'acide acéti- 35 que 0,5 ml/l pendant 24 heures à 4 C. Après centrifugation à 10 000 g, les collagènes sont précipités par le chlorure de sodium (NaCl) à 1 M, le précipité est resuspendu puis dialysé. B1655FR Les acides aminés primaires sont dérivés par l'acide ophtaldéhyde (OPA) éliminant ainsi leur interférence. L'hydroxyproline et la proline sont alors dérivées par le NBD-Cl par couplage des groupement aminés au NBD-Cl. Le NBD-Hyp est séparé et identifié par HPLC en phase inverse. Pour la mise au point de la séparation des dérivés d'acides aminés, un couplage au NBD-CL d'un standard contenant l'hydroxyproline est d'abord réalisé. L'hydroxyproline est dosée par mesure de la fluores-10 cence après séparation par HPLC en phase inverse : o Injecteur automatique o Colonne Ultrasep C18 (30cm*0,18cm) o 6 }gym de porosité o Détecteur de fluorescence 15 La phase mobile est constituée d'un mélange d'acétonitrile/tampon phosphate de sodium 0,1 mol/l, pH 7,2 (9:91 v/v), le débit est réglé a 1 ml/min, l'élution est réalisée en mode statique et le cycle est de 10 minutes. La phase mobile est préalablement filtrée, puis dégazée avant utilisation. 20 Les solutions sont préparées de la façon suivante : NBD-Cl : 25 mmol dissous dans le méthanol, OPA = 150 mol/1 dissous dans du méthanol, Tampon phosphate = 0,4 mmol/l, pH ajusté à 7,2. La gamme étalon est préparée à partir d'une solution 25 d'hydroxyproline à 50 mg/l. Les dilutions successives permettent d'obtenir des solutions allant de 0,5 à 40 mg/1. La dérivatisation et l'établissement de la courbe d'étalonnage sont effectués à partir de 10 pl d'une solution étalon à différentes concentrations mélangées avec 10 pl du 30 tampon. Après addition de 5 pl d'OPA et agitation, les tubes sont gardés 5 minutes à température ambiante puis 10 pl de la solution NBD-Cl sont ajoutés. Le dérivât se fait à 60 C, au bain marie, pendant 3 minutes, à l'abri de la lumière. Les tubes sont ensuite retirés et la coloration orange permet de vérifier la dérivatisation. Ils sont, par la suite, mis dans la glace afin d'assurer le refroidissement. 50 pl de ce mélange sont ensuite injectés dans la colonne afin d'obtenir la courbe d'étalonnage qui doit être linéaire. B1655FR 15 Les échantillons sont traités de la même façon. Dosage qualitatif des collagènes de type I et de type III. Calcul du rapport collagène I / collagène III L'essai est conduit en triplicate après 24 heures de 5 traitement. La constitution des lots est la suivante : - Lot 1 : 2 épidermes/fibroblastes témoins ne recevant aucun produit ; - Lot 2 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un 10 extrait de souci à 0,1% (2 l/cm2) ; - Lot 3 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,25% (2 gl/cm2) - Lot 4 : 2 épidermes/fibroblastes traités recevant un extrait de souci à 0,5% (2 gl/cm2). 15 Après le temps d'incubation, un marquage isotopique est réalisé en présence de : - acide ascorbique : 50 gg/mL ; - glutamine : 2 mM ; - sérum de veau foetal : 1% v/v ; 20 - [3H]-Proline (réf. TRK323, Amsterdam) : 50 Ci/puits ; - l'extrait de souci aux différentes concentrations. Un volume de chaque échantillon contenant le même taux de radioactivité (100 000 dpm) est prélevé, auquel est ajouté 7,5% (v/v) final de(3-mercaptoéthanol (Merck), puis déna- 25 turé pendant 3 minutes à 100 C. Les échantillons sont supplémentés par 3 l de bleu de bromophénol. Les échantillons sont passés sur un gel (SDS PAGE) à 7,5% d'acrylamide. Après décoloration du gel, les bandes correspondant aux différentes chaînes collagéniques sont découpées et placées 30 dans des tubes à scintillation en présence de 500 gl de Soluène (Packard). Les bandes sont dissoutes à 60 C pendant 18 heures. La radioactivité est ensuite mesurée en scintillation liquide (compteur (3 Kontron). 35 3.1.3.3. Etude de l'effet du produit sur la suppression de la MMP-3 (Metalloprotéinase 3) A la fin du temps d'incubation (24 heures), les milieux de culture sont prélevés, et le dosage de la MMP-3 est réa-B1655FR 2902334 16 lisé conformément aux protocoles décrits dans les kits de dosage (Kit de détection de la Métalloprotéinase-3) : Interchim). 3.2.RESULTATS 3.2.1. Evaluation de la cytotoxicité - Epidermes reconstitués L'évaluation de la cytotoxicité par réaction colorimétrique au sel de tétrazonium (MTT) est réalisée en fonction des différentes concentrations du produit extrait de souci , après 24 heures de contact. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous. Densité optique % Témoin 1,210 0,03 - Souci (0,1%) 1,220 0,02 n.s. Souci (0, 25%) 1,214 0,04 n. s. Souci (0,5%) 1,218 0,02 n.s. n.s. : non significatif Les épidermes reconstitués traités par les différentes concentrations du produit extrait de souci à raison de 2 l/cm2 montrent une couleur bleue/pourpre intense, preuve de la viabilité des cellules de l'épiderme. Par examen histologique, il apparaît que le produit extrait de souci déposé à raison de 2 l/cm2 sur des épidermes reconstitués traités pendant 48 heures, comparativement à des épidermes témoins, n'a induit aucune toxicité. Les images histologiques, après coloration HES, d'épidermes traités par les produits sont comparables à celles des épidermes témoins et répondent aux paramètres histologiques normaux. - Fibroblastes humains en culture L'évaluation de la cytotoxicité par réaction colorimétrique au sel de tétrazonium (MTT) est réalisée en fonction des différentes concentrations du produit extrait de souci , après 24 heures de contact. Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous : B1655FR 2902334 17 Densité optique % Témoin 0,330 0,01 - Souci (0,1%) 0,337 0,02 n.s. Souci (0,25%) 0,340 0,03 n.s. Souci (0,5%) 0,342 0,02 n.s. n.s. : non significatif Les résultats obtenus montrent que le produit extrait de souci n'entraîne aucune cytotoxicité aux différentes concentrations testées. 5 3.2.2. Dosage du malondialdéhyde (MDA) dans l'homogénat cellulaire - Lipoperoxydation physiologique Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous : MDA ( M/mg % de diminution du protéines) MDA Témoin 705 33 - Souci (0, 1%) 656 24 -7 Souci (0,25%) 540 27* -23 Souci (0, 5%) 483 37* -31 *Significativement différent par rapport au témoin : p REVENDICATIONS 1. Utilisation d'un extrait de souci pour la préparation d'une composition cosmétique et/ou dermatologique pour application topique, destinée à lutter contre les signes du vieillissement cutané. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait de souci est un extrait de Calendula officinalis. 3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait de souci est un extrait de Calendula 10 arvensis. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir de pétales de souci. 5. Utilisation selon l'une quelconque des 15 revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu par macération hydro-glycolique de fleurs pulvérisées. 6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu par macération de fleurs 20 pulvérisées dans un mélange butylène glycol/eau. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'extrait de souci présente les caractéristiques suivantes : - eau / butylène glycol 50/50 25 - matières sèches 1,5 à 3,0% - flavonoïdes 0,2 à 3,0% (sur matière sèche, exprimé en rutine) 10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la 30 composition comprend entre 0,001 et 0,5% en poids d'extrait de souci. 11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition comprend en outre des quantités appropriées d'une ou 35 plusieurs substances choisies parmi la Vitamine A palmitate, la Vitamine C ou ses dérivés, les protéines de graines B1655FR 2902334 22 d'amarante (Amarantus caudatus), les globulines de pois ou des mucilages tels que le mucilage de fruits de baobab, l'huile de Calophylum, l'huile d'Echium, un palmitoyl pentapeptide-3 ou des dérivés tels que le palmitoyl GHK et 5 le palmitoyl GQPR ou le palmitoyl VGVAPG associé à un céramide-2, ainsi qu'un céramide, une association comprenant du palmitoyl pentapeptide-3 et un extrait de Siegesbeckia orientalis, les polyphénols, tels que les polyphénols de cacao, l'acide oléanolique, les peptides de Mimosa des fleuristes (Acacia dealbata), une antihyaluronidase telle que Echinacine B, l'Imperata cylindrica, un extrait de graines de lotus, de graines de coquelicot, de racine de guimauve, les peptides d'Hibiscus de type Myoxynol , les extraits de fenouil, les peptides d'origine végétale de type Argireline . 10. Procédé cosmétique pour combattre les signes du vieillissement cutané, consistant à appliquer sur les zones de la peau affectées une composition contenant une quantité efficace d'extrait de souci.