Brevet FR2903997A1 — publié le 20080125

La présente invention est relative à des bactéries qui présentent une activité protectrice contre Botrytis cinerea, connu en particulier comme agent de la pourriture grise chez la vigne. La vigne (Vitis vinifera L.), comme la plupart des plantes de grande culture, est sensible à de nombreuses maladies cryptogamiques dont, en particulier, la pourriture grise, le mildiou, l'oïdium, etc.. Jusqu'à présent, la lutte contre les agents pathogènes responsables de ces maladies s'effectue principalement au moyen de produits chimiques fongicides dont les effets secondaires sont notamment un risque de pollution vis-à-vis de l'environnement, de déséquilibre écologique et d'apparition de souches pathogènes qui résistent aux produits de traitement. Par exemple, dans le cas de Botrytis cinerea, responsable de la pourriture grise, on a pu observer des résistances aux imides. Ainsi, l'utilisation de fongicides, et plus généralement de pesticides, est actuellement remise en cause par les viticulteurs eux-mêmes qui sont devenus de plus en plus attentifs aux améliorations de leurs conditions de travail et à leur environnement. En conséquence, de nombreuses matières actives sont progressivement retirées du marché (cf. révision européenne des substances phytosanitaires dans le cadre de la directive européenne n 91/414/CE). Dans la perspective d'une agriculture durable, différentes stratégies alternatives à l'utilisation des produits phytosanitaires font d'ores et déjà l'objet d'investigations. Parmi celles-ci, est particulièrement étudiée l'utilisation de microorganismes impliqués dans la lutte biologique et l'exploitation des défenses naturelles de la plante elle-même. Aussi un des buts de la présente invention est-il de proposer des bactéries qui 25 présentent une activité protectrice contre Botrytis cinerea, connu en particulier comme agent de la pourriture grise chez la vigne. Un autre but de la présente invention est de fournir de telles bactéries qui permettent de réduire voire de supprimer tout traitement chimique contre cet agent. Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par des 30 bactéries qui présentent une activité protectrice contre Botrytis cinerea, qui, selon la présente invention, sont caractérisées par le fait qu'elles sont choisies parmi les genres Acinetobacter, Bacillus, Pantoea et Pseudomonas. Avantageusement, ces bactéries sont choisies parmi Pseudomonas groupe HhSoUsc du complexe fluorescens (PTA-268), Pseudomonas sp. du groupe S2du 35 complexe fluorescens (PTA-CT2), Bacillus subtilis (PTA-271), Pantoea agglomerans 2903997 2 (PTA-AF1), Pantoea agglomerans (PTA-AF2), Acinetobacter lwoffii (PTA-113) et Acinetobacter lwoffii (PTA-152). La présente invention concerne aussi une composition pour traiter des plantes contre Botrytis cinerea, caractérisée par le fait qu'elle contient de 106cfu/ml à 5 109cfu/ml d'une bactérie ci-dessus ou un mélange de celles-ci. La description qui va suivre et qui ne présente aucun caractère limitatif, permettra à l'homme du métier de mieux comprendre la mise en oeuvre et l'intérêt de la présente invention. A partir de prélèvements de populations bactériennes sur différents 10 échantillons de sol rhizosphérique et de différentes parties de la vigne (racines, tiges, feuilles), ainsi que sur des tiges et feuilles de plants de vigne présentant des grappes saines à côté d'autres plants dont les baies étaient infectées par Botrytis cinerea, il a été isolé 282 bactéries. Ces prélèvements ont été effectués sur la même parcelle en Champagne. 15 La capacité protectrice des bactéries contre Botrytis cinerea est évaluée in vitro sur des feuilles isolées de vigne. Les feuilles sont incubées pendant 20 heures en présence d'une suspension des différentes bactéries isolées (10' CFU/ml). Chaque feuille prétraitée est alors inoculée avec 5 pl d'une suspension de conidies de Botrytis cinerea àl,5.106 conidies/ml. Les résultats sont analysés lorsque le pathogène a 20 totalement envahi les feuilles témoins non traitées (Figure 1). L'étendue de la nécrose provoquée par Botrytis cinerea sur les feuilles est alors mesurée. Elle rend compte du pourcentage de protection de chaque bactérie sur une échelle allant de 0 à 100% de protection. Les résultats obtenus montrent que parmi les 282 bactéries d'origine seules 28 d'entre elles protègent efficacement les feuilles de la vigne contre Botrytis cinerea (de 60 à 100% de protection). Seules 7 bactéries parmi les 28 ci-dessus protégeant efficacement la vigne contre Botrytis cinerea ont été retenues pour identification. En effet, si les 28 bactéries ont une capacité protectrice contre Botrytis cinerea d'au moins 60%, les 7 retenues présentent une capacité protectrice pouvant dépasser les 80%, comme indiqué dans le tableau I ci-après : 15 2903997 3 Tableau I Souches Origine Protection en % (Min û Max) Psi Sol 82 - 95 Ps2 Tige 87 - 100 B Sol 71 - 85 Pal Feuille 61 - 100 Pa2 Feuille 63 - 95 Al Racine 87 - 100 A2 Racine 87 - 100 5 La texture et la morphologie de chaque colonie bactérienne ont été analysées. Les colorations de gram correspondantes ont été validées par ensemencement sur milieu gélosé de Mac Conkey. Chaque bactérie a été soumise à divers tests : test de mobilité et tests métaboliques (activité catalase et oxydase, fermentation et oxydation 10 du glucose). Les propriétés physiologiques de ces bactéries sont regroupées dans le tableau II ci-après : Tableau II Genre Gram Oxydase Catalase Aérobie Mobilité Psi - + + + + Ps2 - + + + + B + + + + - Pal - -+ + + Pa2 - - + + + Al - - + + + A2 - - + + + Ces tests ont permis de choisir les galeries API (Biomérieux) les plus judicieuses pour pré-identifier les souches sélectionnées. Il s'agit des galeries API 20E (pour entérobactéries et autres bactéries gram négatif), API 20NE (pour bacilles gram 2903997 4 négatif non-entérobactéries) et API 50CH (pour Bacillus et entérobactéries). Les résultats obtenus ont permis de distinguer quatre genres majeurs parmi ces 7 souches. Le tableau III regroupe les résultats d'analyse des galeries API : Tableau III Genre API 20 E API 20 NE API 50 CH Psi Non-fermenter spp(32%) Pseudomonas fluorescens (99,8%) Ps2 Non-fermenter spp(32%) Pseudomonas fluorescens (99,8%) B Bacillus subtils Pal Pantoea sppl (61,9%) Pantoea sppl Pa2 Pantoea Pantoea sppl Al Acinetobacter Acinetobacter A2 Acinetobacter Acinetobacter 5 Ces bactéries sont deux Pantoea, deux Pseudomonas, deux Acinetobacter et un Bacillus. Des analyses moléculaires ont été réalisées par séquençage double brin du 10 gène rrs codant l'ARNr 16S des bactéries ainsi distinguées.Les identités des bactéries sont les suivantes : Psl :Pseudomonas groupe HhSoUsc du complexe fluorescens Ps2 : Pseudomonas sp. du groupe S2du complexe fluorescens B : Bacillus subtilis 15 Pal : Pantoea agglomerans Pa2 : Pantoea agglomerans Al : Acinetobacter Iwoffii A2 : Acinetobacter Iwoffii 20 Les séquences de ces 7 souches sont représentées aux figures 1 à 7 sous les codes PTA-AF1, PTA-AF2, PTA-268, PTA-CT2, PTA-113, PTA-152 et PTA-271 qui correspondent respectivement aux souches nommées Pal, Pa2, Psl, Ps2, Al, A2 et B dans la présente description. 25 2903997 5 Etude 1 : Effet de la concentration des souches sur la protection contre Botrytis cinerea Des feuilles de vitroplants de vigne sont préalablement incubées pendant 20 5 heures en présence de différentes concentrations en bactéries avant d'être inoculées avec l'agent pathogène. La protection est estimée lorsque Botrytis cinerea a totalement envahi les feuilles du témoin (Figure 8a). Les résultats obtenus montrent une protection contre Botrytis cinerea (Figure 8b) à partir d'une concentration de 104 cfu/mI de milieu d'incubation. 10 Etude 2 : Concentration des bactéries dans les feuilles de vigne en fonction de leur concentration dans le milieu d'incubation Des feuilles de vitroplants de vignes sont incubées pendant des temps variables en présence des souches B ou Pa2 à une concentration de 106 cfu/ml. A 15 l'issue de ces différents temps, le matériel végétal est soigneusement lavé afin d'éliminer toute bactérie présente à sa surface. Les feuilles sont ensuite broyées pour récupérer les bactéries présentes à l'intérieur des tissus foliaires. Les extraits sont dilués puis étalés sur des milieux nutritifs solides (par exemple celui dénommé LB). Après 24 heures à 25 C, les unités formant les colonies bactériennes sont comptées 20 et rapportées à la masse fraîche végétale. Sur le plan temporel (figure 9), la concentration en bactéries Pa2 dans les feuilles atteint son maximum 20 heures après le mise en incubation des feuilles sur une suspension bactérienne à 106 cfu/ml. De nouvelles feuilles de vitroplants sont incubées pendant 20 heures en présence de différentes concentrations d'une suspension de Pa2. A l'issue de ces 20 heures, 25 le matériel végétal est récupéré et la concentration en bactéries intrafoliaires est évaluée. Les résultats obtenus (Figure 10) montrent que la concentration des bactéries dans les feuilles est corrélée à celle présente dans le milieu d'incubation. Etude 3 : Effet des bactéries sur les marqueurs de défense de la vigne 30 La capacité des bactéries à stimuler les défenses naturelles de la vigne a été recherchée en utilisant trois marqueurs enzymatiques : la lipoxygénase (LOX, enzyme qui catalyse l'oxydation des acides gras polyinsaturés, conduisant à la synthèse de messagers lipidiques susceptibles d'induire les réponses de défense des plantes), la phénylalanine ammonialyase (PAL, enzyme clé de la voie des phénylpropanoïdes, conduisant à la synthèse 35 de composés antimicrobiens) et les chitinases (protéines PR dont le pouvoir antifongique est 2903997 6 lié à leur capacité à hydrolyser la chitine présente dans les parois cellulaires de champignons). Les expériences ont été réalisées sur des feuilles de vitroplants de vigne incubées pendant des temps variables en présence des différentes suspensions bactériennes. A l'issue de ces différents temps, les enzymes sont extraites des feuilles afin de 5 mesurer leur activité. Les figures 11a à 11c correspondent aux résultats obtenus pour les quatre genres étudiés, Acinetobacter, Bacillus, Pantoea et Pseudomonas, en comparaison avec le témoin indiqué en pointillé sur ces figures. Ces résultats montrent que les bactéries sélectionnées sont toutes capables de 10 stimuler l'activité de la LOX et de la PAL dans les feuilles de vitroplants. Ces deux voies métaboliques sont responsables de la synthèse du jasmonate et de l'acide salicylique réputés être des messagers secondaires impliqués dans le renforcrment des réactions de défense des plantes comme l'accumulation de protéines PR (telles que les chitinases). Toutes les bactéries identifiées sont également capables de stimuler l'activité chitinase dans 15 les tissus foliaires de la vigne. Etude 4 : Effet antaqoniste Des tests d'antagonisme envers Botrytis cinerea ont été réalisés in vitro sur milieu gélosé PDA (potato û dextrose û agar, Sigma) pour chacune des 7 20 bactéries ci-dessus. La suspension bactérienne et les conidies de Botrytis cinerea sont déposées sur le milieu PDA, les bactéries au centre et Botrytis cinerea sur le pourtour. Les résultats sont analysés après 7 jours d'incubation à 22 C. La capacité antagoniste de chaque souche bactérienne est déterminée à l'oeil nu lorsque apparaît une zone d'inhibition de la croissance de Botrytis cinerea autour de la colonie 25 bactérienne (Figure 12a) ; la figure 12b représente le cas où il n'u a pas de capacité antagoniste et la figure 12c représente le témoin. Ces tests d'antagonisme montrent que seules 2 bactéries parmi les 7 étudiées sont de surcroît capables de bloquer directement la croissance de Botrytis cinerea in vitro. 30 L'ensemble de ces résultats indique donc que certaines des bactéries ont un effet antagoniste vis-à-vis de Botrytis cinerea. Leur effet protecteur serait donc lié aux deux mécanismes d'action (antagonisme + élicitation). Le souchier constitué contient donc des bactéries antagonistes et/ou inductrices des mécanismes de défense de la vigne sans effet direct sur Botrytis cinerea. 35 2903997 7 Etude 5: Sensibilité des bactéries aux pesticides autres qu'anti-Botrytis Une lutte intégrée bien gérée nécessite de pratiquer une lutte chimique neutre à l'égard des 5 agents de la lutte biologique : seule condition qui permettra d'améliorer la protection de la vigne contre Botrytis, en particulier lorsque l'apport des bactéries est effectué au sol. Des fongicides anti-mildiou et anti-ôidium ainsi que des herbicides ont été testés sur les 7 bactéries identifiées, agents de lutte biologique. Il s'avère que parmi les 15 pesticides testés trois d'entre eux ont un effet bactéricide : il s'agit de deux anti-mildiou commercialisés sous les marques 10 Valiant et Mikal au nom de la société Bayer CropScience et d'un herbicide commercialisé sous la marque Weedazol au nom de la société Nufarm. Les résultats obtenus avec les substances actives correspondantes indiquent que les bactéries sélectionnées sont sensibles au fosétyl aluminium contenu dans les produits commercialisés sous les marques Valiant et Mikal et à l'aminotriazole contenu 15 dans le produit commercialisé sous la marque Weedazol. Afin de préserver l'activité des bactéries, les applications au vignoble des produits formulés ayant des effets bactéricides sont à proscrire. Etude 6 : Application des bactéries identifiées au viqnoble 2 Les traitements ont été effectués selon trois modalités différentes et à différentes dates : une application au sol, un badigeonnage faisant suite à un rognage et une pulvérisation sur feuilles. Les suspensions bactériennes (à la concentration finale de 108 cfu/ml) réalisées avec une souche pure ou une association de souches sont appliquées à raison de 150 ml/cep sur le sol, de 5 ml/cep par badigeonnage et de 100 ml/cep par pulvérisation. Les effets des bactéries sur l'activation des défenses de la vigne ont été entrepris avec comme marqueurs enzymatiques les activités chitinase et glucanase. Les résultats montrent que les activités chitinase et glucanase sont stimulées dans les feuilles et dans les baies par la présence des bactéries quel que soit leur mode d'application (sol, 30 pulvérisation, badigeonnage). Chronologiquement, on a observé que les réponses de défense prospectées dans les feuilles et dans les baies posent la question d'un transfert d'information(s) des feuilles vers les baies à partir de la véraison. Les genres Pseudomonas et Pantoea (seuls ou en mélanges) semblent davantage stimuler l'activité chitinase alors que l'activité 35 glucanase apparaît davantage stimulée en présence du genre Acinetobacter (seul ou en 2903997 8 mélange). Quant au genre Bad/lus, il semble induire des réponses plus précoces au niveau des feuilles et plus tardives au niveau des baies. La capacité protectrice des bactéries au vignoble est évaluée selon deux protocoles. D'une part, au moyen de tests de protection réalisés à partir des feuilles de vigne 5 prélevées au vignoble après deux mois d'application des bactéries puis inoculées avec Botrytis, et, d'autre part, par comptage des baies contaminées par Botrytis en fin de maturation. Le pourcentage de baies par grappe atteintes par la pourriture grise rend compte du pourcentage de protection induite par les bactéries par rapport au témoin. Au vignoble, les applications des rhizobactéries selon la présente invention ont permis 10 d'obtenir une protection hétérogène pouvant atteindre 60 % quel que soit le mode d'application. Il est apparu que la suspension bactérienne doit contenir de 106 cfu/ml à 109 cfu/ml d'une des bactéries selon la présente invention ou d'un mélange de celles-ci. La mise en suspension de ces bactéries dans une solution compatible tel que le 15 milieu Luria-Bertani (LB) contenant du chlorure de sodium (5g/l), de la peptone de caséine (10g/I) et de l'extrait de levure (10g/I) peut être réalisée au moment du traitement. L'originalité de la présente invention réside dans l'exploitation des défenses naturelles de la plante et donc dans la capacité des rhizobactéries de l'invention caractérisées à induire la résistance de la vigne (bactéries élicitrices) et dans certains cas à inhiber 20 directement la croissance de l'agent pathogène (bactéries antagonistes). Aussi, l'application combinée de bactéries élicitrices et antagonistes peut conférer à la vigne une protection optimale via des mécanismes d'action complémentaires. Cette invention présente des avantages d'ordres pratique et économique. Les bactéries proposées comme agents de lutte biologique ne présentent aucune difficulté de 25 mise en culture et se multiplient rapidement. L'origine de ces bactéries, isolées de la rhizosphère et des organes de la vigne constitue également un avantage qui permet de préserver le caractère des cépages cultivés et garantir une protection de la vigne à long terme. Cette invention n'exclut pas complètement l'utilisation de certains produits chimiques, mais 30 propose de s'y associer afin de réduire la dose ou la fréquence d'application de ces produits. La présence des bactéries dans les organes de la vigne permet en effet de réduire fortement l'utilisation des fongicides et en conséquence de réduire d'autant les coûts des viticulteurs. Il sera rappelé que les mécanismes généraux de lutte microbiologique contre les 35 maladies cryptogamiques des plantes sont principalement de deux types : l'antagonisme 2903997 9 microbien via des interactions directes entre l'agent de lutte et l'agent pathogène, et l'induction de résistance chez la plante hôte par l'agent de lutte permettant de contrer de manière indirecte l'agent pathogène. L'antagonisme résulte d'un hyperparasitisme, d'une compétition trophique 5 et/ou d'une antibiose. La compétition pour le fer s'exerce par exemple entre Pseudomonas producteurs de sidérophores et champignons pathogènes. L'antibiose résulte de la sécrétion de métabolites toxiques de nature chimique variée (iturine, pyrrolnitrine, ... ) produits par diverses bactéries (Bacillus subtilis, Pseudomonas sp.) La résistance active des plantes implique la stimulation de réponses de défense 10 capables d'établir un état antifongique : épaississement de la paroi de la cellule végétale, stimulation de certaines voies du métabolisme secondaire (voies de synthèse des phytoalexines, de l'acide salicylique, de l'acide jasmonique), production de protéines de défense (protéines PR), ... Ces réponses des plantes peuvent résulter d'un effet direct des bactéries vivantes endophytes ou des diverses molécules qu'elles 15 sécrètent. L'un ou/et l'autre de ces mécanismes de lutte microbiologique pourraient expliquer la protection induite par les souches bactériennes. Les domaines d'application de cette invention sont liés à la viticulture et à la protection de la vigne contre ses agents pathogènes, en particulier fongiques 20 (ici contre Botrytis cinerea, agent de la pourriture grise). Il est envisagé d'utiliser ces microorganisrnes comme des biopesticides. REVENDICATIONS 1. û Composition pour traiter des plantes contre Botrytis cinerea, caractérisée par le fait qu'elle contient de 106cfu/ml à 109cfu/ml d'une bactérie choisie parmi les genres Acinetobacter, Bacillus, Pantoea et Pseudomonas ou un mélange de celles-ci. 2. û Composition selon la revendication 1, caractérisée par le fait que les bactéries sont choisies parmi Pseudomonas groupe HhSoUsc du complexe fluorescens (PTA-268), Pseudomonas sp. du groupe S2 du complexe fluorescens (PTA-CT2), Bacillus subtilis (PTA-271), Pantoea agglomerans (PTA-AF1), Pantoea agglomerans (PTA-AF2), Acinetobacter Iwoffii (PTA-113) et Acinetobacter lwoffii (PTA-152).