Brevet FR2909559A1 — publié le 20080613

Préparations cellulaires pour une utilisation comme agent stimulant la revascularisation La présente invention se rapporte à une préparation cellulaire et à une utilisation de cette préparation cellulaire comme agent stimulant la revascularisation. Les pathologies visées sont ici nombreuses, et globalement ce sont les pathologies qui ont conduit à une dénaturation ou une destruction d'un système vasculaire. De telles circonstances se rencontrent notamment io lorsque l'apport sanguin artériel dans un tissu ou un organe diminue ou s'arrête. Les thérapies cellulaires consistent précisément à régénérer un tissu altéré, quel qu'il soit, à partir de cellules spécifiques cultivées in vitro, ou non, puis ensuite transplantées au sein du tissu altéré. De nombreuses is avancées ont déjà été faites pour traiter différentes pathologies à l'aide de ces thérapies cellulaires. Le principe général repose essentiellement sur la faculté qu'ont certains types de cellules à certains stades de leur développement, de se multiplier et de se différencier pour produire des cellules spécialisées qui 20 acquièrent une morphologie et une fonction spécifique du tissu dans lequel elles sont implantées. Les cellules souches embryonnaires, aux premiers stades après la fécondation, sont indifférenciées et vont pouvoir conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme. Les cellules souches adultes en revanche, sont déjà engagées dans un programme 25 tissulaire spécifique et elles ne peuvent conduire qu'à la formation ou la régénération de tissus distincts ; elles sont dites multipotentes alors que les cellules souches embryonnaires sont elles, totipotentes. En outre, les cellules précurseurs issues des divisions de cellules souches ont déjà acquis, lors de leur développement, un certain degré de spécialisation et 30 sont physiologiquement fonctionnelles. Ainsi, il a déjà été imaginé de préparer des populations de cellules souches multipotentes à partir de tissus du muscle squelettique. On 2909559 2 pourra notamment se référer au document WO03/027281 lequel décrit un procédé de préparation de telles cellules souches multipotentes capables de se différencier en cellules du muscle squelettique et en bien d'autres cellules et notamment, en cellules de muscle lisse, en cardiomyocytes, en 5 cellules du sang, en cellules vasculaires endothéliales, en adipocytes, etc. Ce procédé permet de préparer des populations de cellules souches multipotentes visant la régénération de nombreux types de tissus, en revanche il est relativement complexe à mettre en oeuvre. Par ailleurs, puisque les tissus du myocarde sont dépourvus de io cellules souches capables de former des cardiomyocytes pour se régénérer, il a aussi été imaginé de préparer des populations cellulaires relativement homogènes dont le type dominant a les caractéristiques de cellules myoblastiques, et d'injecter directement ces populations dans le tissu myocardique ou encore indirectement dans la circulation artérielle. 15 On pourra également se référer au document WO01/94555, dans lequel est décrit un tel procédé. Là également, le tri des différentes populations cellulaires exige l'observation de marqueurs cellulaires spécifiques. En outre, les populations cellulaires obtenues sont spécifiquement adaptées à la 20 régénération du muscle cardiaque. Ainsi, autant le premier document analysé ci-dessus présente un spectre relativement large d'utilisation de populations de cellules souches multipotentes obtenues, mais ne permettant pas d'obtenir de résultats probants pour une activité pro-angiogénique, autant le second document 25 divulgue des populations cellulaires spécifiques présentant les caractéristiques de cellules myoblastiques et par conséquent d'une utilisation plus restreinte. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention, est de fournir une préparation cellulaire pour une utilisation 30 comme agent stimulant la revascularisation, qui permette de reconstituer le système vasculaire d'un tissu endommagé de mammifère et en 2909559 3 particulier d'humain, lorsqu'elle lui est administrée. En outre, il s'agit de pouvoir obtenir une telle préparation de façon relativement aisée. Dans le but de résoudre ce problème, la présente invention propose une préparation cellulaire comprenant des précurseurs de cellules 5 endothéliales (EPCs, pour Endothelial Precursor Cells en langue anglaise) et des précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs, pour Smooth Muscle Cells, en langue anglaise), comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour une utilisation comme agent stimulant la revascularisation. to Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en oeuvre de deux types de cellules, à la fois des précurseurs de cellules endothéliales et des précurseurs de cellules musculaires lisses qui interagissent alors pour stimuler la formation et le développement de capillaires sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. De la 15 sorte, à partir d'un tissu cellulaire quel qu'il soit, dans lequel la circulation sanguine a été diminuée ou stoppée, l'injection des précurseurs de cellules endothéliales et des précurseurs de cellules musculaires lisses dans le tissu infarci provoquent alors la régénération des capillaires sanguins à condition bien évidemment que la circulation sanguine 20 réapparaisse normalement. Préférentiellement, lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) sont obtenus par différenciation in vitro de progéniteurs provenant de sang de cordon ombilical ou de moelle hématopoïétique ou encore de sang circulant périphérique ou bien de tout autre tissu. Ainsi qu'on 25 l'expliquera plus en détail ci-après, on isole les cellules mononucléées, par exemple du sang de cordon ombilical puis on provoque leur différenciation in vitro pour les récupérer ensuite et les associer aux précurseurs de cellules musculaires lisses. De façon particulièrement avantageuse, lesdits précurseurs de 30 cellules endothéliales (EPCs) expriment un récepteur spécifique apte à recevoir un matériau protéique pour activer lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs). De la sorte, l'activation des précurseurs de cellules 2909559 4 endothéliales induit une synergie supplémentaire entre ces cellules précurseurs et les précurseurs de cellules musculaires lisses ; synergie qui conduit alors à une activité de revascularisation ou pro-angiogénique, supérieure à celle des seules cellules précurseurs non activées ou des 5 seuls précurseurs de cellules musculaires lisses. Avantageusement, ledit récepteur spécifique est un récepteur Eph à activité tyrosine kinase, par exemple de type EphB et plus précisément EphB4. En outre, le matériau protéique comporte de préférence, un ligand spécifique dudit marqueur, ledit ligand étant associé à un polypeptide de to liaison. De plus, et selon un mode préféré de mise en oeuvre, le ligand spécifique est un ligand éphrine, par exemple éphrine-B ou plus précisément éphrine-B2 ou encore éphrine-B1. S'agissant du polypeptide de liaison, il est de préférence un fragment Fc d'immunoglobuline. On obtient de la sorte des cellules endothéliales présentant des 15 récepteurs spécifiques, auxquels récepteurs spécifiques sont associés un matériau protéique constitué d'un ligand et d'un polypeptide de liaison ; de tels précurseurs de cellules endothéliales sont alors activés. S'agissant des précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs), ils sont préférentiellement obtenus par différenciation in vitro de progéniteurs 20 provenant de sang de cordon ombilical ou de moelle hématopoïétique ou encore de sang circulant périphérique ou bien de tout autre tissu . Tout comme les précurseurs de cellules endothéliales, on isole d'abord des cellules mononucléées, par exemple à partir de sang de cordon ombilical puis on provoque ensuite leur différenciation en précurseurs de cellules 25 musculaires lisses. Ils sont ensuite récupérés puis associés aux précurseurs de cellules endothéliales pour être administrés. Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, lesdits précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs) sont obtenus à partir d'une biopsie de tissu musculaire que l'on prélève dans un muscle 30 squelettique d'un être humain et que l'on met en culture pour ne récolter que les précurseurs de cellules musculaires lisses identifiés. Ces 2909559 5 précurseurs de cellules musculaires lisses sont en effet clairement identifiables grâce à des marqueurs cellulaires spécifiques. Selon un autre aspect, la présente invention propose l'utilisation d'une préparation cellulaire associant des précurseurs de cellules 5 endothéliales et des précurseurs de cellules musculaires lisses pour la préparation d'une composition cellulaire destinée à stimuler la revascularisation ou l'angiogénèse de tissus ischémiés, chez les mammifères et en particulier chez l'homme. Par ailleurs, il est aussi envisagé une association de ces précurseurs de cellules endothéliales et précurseurs de cellules musculaires lisses pour la préparation d'un médicament destiné à normaliser la revascularisation tumorale. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - l'unique Figure 1 est un histogramme montrant l'efficacité comparée de l'activité pro-angiogénique des préparations cellulaires objet de la présente invention. Premier mode de réalisation Ainsi, selon un premier mode de réalisation de l'invention, les précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) et les précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs) sont obtenus conjointement à partir de sang de cordon ombilical humain. Aussi, selon un premier mode de préparation, on collecte tout d'abord des échantillons, de 30 à 50 ml chacun de sang de cordon ombilical humain et on les place dans des tubes stériles contenant une solution anticoagulante d'héparine sodique. On isole ensuite les cellules mononucléées du sang de cordon ombilical par centrifugation de gradient de densité au moyen de Pancoll (1,077 g par millilitre, produit commercialisé par la société Dominique Dutscher S.A., à Brumath, France). Les cellules mononucléées isolées sont ensuite séparées des cellules adhérentes par culture sur des boîtes plastiques durant 24 heures 2909559 6 à 37 C. On recueille alors un mélange de cellules mononucléées isolées et débarrassées des cellules adhérentes, mélange qui est ensuite placé dans les puits d'une plaque à six puits recouverts d'une matrice définie. Cette matrice définie contient de la fibronectine, de la laminine, du sulfate 5 de sodium d'héparan, du collagène de type I et de type IV (ces produits sont tous fournis par la société Sigma-Aldrich) et un facteur de croissance hVEGF (R&D Systems, Oxford UK). De la sorte, après 15 jours de culture, on voit apparaître distinctement des colonies de type pavimenteux et des colonies de type io fusiforme. On recueille alors chacune de ces colonies pour les repiquer indépendamment l'une de l'autre puis les amplifier pour obtenir de grandes quantités de cellules de ces deux types. Les cellules de type pavimenteux sont en réalité des précurseurs de cellules endothéliales car elles expriment les principaux marqueurs de ce is type de cellules, Von Willebrand Factor, CD31, eNOS, VE-Cadherine, VEGF-R1 ou VEGF-R2. Et les cellules de type fusiforme sont des précurseurs de cellules musculaires lisses car elles expriment comme marqueur, l'aSMA, la calponine, SM22a et SM-MHC. Une première préparation cellulaire comprenant alors à la fois des 20 précurseurs de cellules endothéliales et les précurseurs de cellules musculaires lisses est testée sur des lots de souris mâles Nude selon un premier protocole défini ci-dessous. On comparera l'efficacité de la préparation précitée, non seulement par rapport à une préparation témoin neutre avec du PBS (tampon : 137 25 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1,84 mM KH2PO4) dépourvue de colonie cellulaire, mais aussi par rapport à une préparation ne contenant que des précurseurs de cellules endothéliales et à une préparation ne contenant que des précurseurs de cellules musculaires lisses. Par conséquent, on réservera quatre lots de six animaux, et les 30 quatre préparations seront respectivement administrées aux animaux des quatre lots. 2909559 7 Tout d'abord, à un instant t=0, on procède à la ligature de l'artère fémorale droite de toutes les souris âgées de sept semaines pour simuler une ischémie. Cinq heures après, on injecte simultanément par voie intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital, la première préparation 5 cellulaire de précurseurs de cellules endothéliales et de précurseurs de cellules musculaires lisses, à raison de 250 000 cellules environ pour les deux type de cellules et pour chaque souris d'un premier lot, et respectivement les autres préparations aux trois autres lots d'animaux. Les autres préparations cellulaires testées contiendront environ 500 000 io cellules. Ensuite, 12 jours après la ligature, les souris sont sacrifiées et les muscles gastronecmius de la patte ischémiée et de la patte non ischémiée sont prélevés. On mesure alors trois paramètres, le score angiographique, la densité capillaire, et le flux sanguin cutané. 15 Le score angiographique mesure la densité des vaisseaux et il est déterminé par micro-angiographie (modalités opératoires dans l'article de Silvestre J. S et al., Cir. Res., 2001; 89: 259-264). En l'espèce, la densité des vaisseaux est mesurée pour chaque animal dans le membre ischémié et dans le membre non ischémié et le résultat obtenu est présenté sous la 20 forme d'un rapport, patte ischémiée sur patte non ischémiée. S'agissant de la densité capillaire, qui représente le nombre de capillaires par millimètre carré, on la mesure par marquage de coupes du muscle gastronecmius au moyen d'un anticorps dirigé contre le marqueur CD31, spécifique des cellules endothéliales comme indiqué ci-dessus, et 25 en en comparant ces coupes à des coupes du même muscle du membre non ischémié. Les résultats ainsi obtenus, sont présentés sous la forme du rapport, patte ischémiée sur patte non ischémiée. Quant au flux sanguin cutané, il est évalué quantitativement par le ratio, du flux sanguin mesuré sur le membre ischémié et du flux sanguin 30 mesuré sur le membre non ischémié. On vérifie ainsi que la variation du nombre de vaisseaux correspond à une adaptation fonctionnelle et donc à une variation de la perfusion du membre ischémié. 2909559 8 Tableau I des résultats La mesure des trois paramètres précités est consignée dans le tableau ci-dessous pour chacun des quatre groupes de six individus. La mesure est le résultat de la moyenne réalisée sur les six animaux. Témoin PBS EPCs SMCs SMCs+EPCs Score 100 157 +/- 8 134 +/- 18 239 +/- 20 angiographique _ Densité 100 163 +1- 9 144 +/- 6 226 +/- _ capillaire 16 Flux sanguin 100 150 +/- 6 141 +/- 5 217 +/- 18 cutané Ainsi on observe que l'injection des précurseurs de cellules endothéliales EPCs ou des précurseurs de cellules musculaires lisses SMCs, provoque une légère augmentation, respectivement d'environ io 60 % et 35 %, de la densité des vaisseaux par rapport à celle du groupe d'animaux contrôle , auxquels a été administré le témoin PBS (ou, respectivement multiplié par 1,60 et 1,35). De façon inattendue, lorsque l'on injecte simultanément les précurseurs de cellules endothéliales et les précurseurs de cellules musculaires lisses, la densité de vaisseaux est 15 multipliée sensiblement par 2,4 par rapport à celle du groupe d'animaux contrôle . S'agissant de la densité capillaire, on observe que les animaux auxquels ont été administrés simultanément les précurseurs de cellules endothéliales et les précurseurs de cellules musculaires lisses, présentent 20 une densité capillaire sensiblement supérieure de 50 % à la densité capillaire des animaux auxquels il a été administré soit des précurseurs de cellules endothéliales seuls, soit des précurseurs de cellules musculaires lisses seuls. Quant à la mesure du flux sanguin cutané, des quatre groupes 25 d'animaux, il corrobore les résultats ci-dessus, puisque le flux sanguin cutané des animaux auxquels il a été administré simultanément les précurseurs de cellules endothéliales et les précurseurs de cellules 5 2909559 9 musculaires lisses, est d'environ 50 % plus élevés que le flux sanguin des animaux auxquels il a été administré que les précurseurs de cellules endothéliales ou que les précurseurs de cellules musculaires lisses. Ainsi, les résultats des trois paramètres mesurés, le score 5 angiographique, la densité capillaire et le flux sanguin cutané, lesquels représentent une mesure de l'activité angiogénique ou de revascularisation, sont-ils concourants et au surplus dans des proportions comparables. Par conséquent, l'action conjuguée des précurseurs de cellules endothéliales et de précurseurs de cellules musculaires lisses au to sein d'un tissu préalablement ischémié, provoque-t-elle une régénération des vaisseaux et des capillaires sanguins. Par conséquent, une synergie des précurseurs de cellules endothéliales et des précurseurs de cellules musculaires lisses par effet de potentialisation, au sein du tissu ischémié provoque cette régénération des vaisseaux sanguins. 15 Ainsi, une préparation cellulaire selon l'invention incorporant des précurseurs de cellules endothéliales et des précurseurs de cellules musculaires lisses, peut être administrée en tant que médicament, notamment pour traiter les insuffisances vasculaires, en particulier dans la revascularisation des tissus ischémiés cardiaques, cérébraux ou 20 périphériques. En outre, une telle préparation est aussi indiquée pour normaliser la vascularisation tumorale et permettre ainsi aux drogues administrées en chimiothérapie de mieux se répandre dans la tumeur. En effet, la vascularisation tumorale n'est pas conforme à la vascularisation normale des tissus sains et elle s'accompagne notamment de désordres 25 hémostatiques et chimiques. Aussi, les drogues administrées atteignent plus difficilement le coeur de la tumeur ce qui par là même diminue leur activité et leur efficacité. Or, la préparation cellulaire précitée conduit à redonner à la tumeur une vascularisation normale et par conséquent à recevoir normalement les drogues circulant dans le sang. 30 La préparation cellulaire selon l'invention peut être conditionnée sous forme de dose unitaire renfermant à la fois les précurseurs de cellules musculaires lisses et les précurseurs de cellules endothéliales ou 2909559 10 bien encore sous forme de doses séparées. Dans ce cas, les deux compositions cellulaires sont administrées, soit simultanément, soit séparément ou encore étalées dans le temps. Par ailleurs, les précurseurs de cellules endothéliales et les 5 précurseurs de cellules musculaires lisses peuvent être indépendamment, congelés et stockés à moins 80 C. Ainsi, lorsque nécessaire, ils sont ensuite décongelés puis cultivés pendant une période d'environ une semaine pour être administrés simultanément ou séparément. La préparation cellulaire convient en particulier pour la préparation io d'une composition destinée au traitement de l'artérite, de l'insuffisance vasculaire coronarienne, ou cardiaque, et de l'insuffisance vasculaire cérébrale. Sur le modèle animal précité, elle a fourni de bons résultats dans le traitement de l'ischémie dite critique des membres inférieurs ; et par conséquent l'espoir est grand de pouvoir obtenir, chez l'homme en de 15 pareilles circonstances, une guérison permettant d'éviter l'amputation. La composition cellulaire selon l'invention peut donc être administrée chez le mammifère et en particulier chez l'homme selon un mode opératoire connu en soi. Par exemple, la composition cellulaire est susceptible d'être injectée au niveau ou au voisinage de la lésion 20 vasculaire, dans le sang, ou encore amenée directement sur le site de la lésion au moyen d'un vecteur approprié. En variante, on peut administrer séparément par voie injectable les précurseurs de cellules endothéliales, d'une part, et les précurseurs de cellules musculaires lisses, d'autre part. Chez l'homme adulte, on peut administrer par injection une 25 composition cellulaire conforme à l'invention comportant entrel05 et 109 cellules. Deuxième mode réalisation Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, on associe des précurseurs de cellules endothéliales EPCs activés et des 30 précurseurs de cellules musculaires lisses SMCs. Pour ce faire, on fournit des précurseurs de cellules endothéliales présentant un marqueur cellulaire spécifique à la surface de la membrane 2909559 11 externe de la cellule, ledit marqueur cellulaire étant choisi parmi l'ensemble constitué par les Eph, notamment EphB4 ou EphBl ; et on y associe un matériau protéique de structure L-K. Le matériau protéique est constitué d'un ligand (L) spécifique dudit marqueur, et d'un peptide de 5 liaison (K), notamment un fragment Fc d'immunoglobuline ou d'anticorps. L'ensemble formant un système capable de fournir des populations cellulaires ou un matériau cellulaire de structure EPC-Eph-L-K. On pourra se reporter au document FR 05 08029 dans lequel est décrit la mise en oeuvre d'un tel matériau cellulaire. 10 Ainsi, pour stimuler l'angiogenèse on active les cellules EPCs comportant le marqueur Eph par le ligand L spécifique appartenant à la famille des éphrines. Le ligand L peut également être constitué d'un fragment peptidique d'une éphrine, par exemple de éphrine-B2, qui aurait alors la même activité biologique. 15 Ce sont alors ces précurseurs de cellules endothéliales activés qui vont être administrés en combinaison avec les précurseurs de cellules musculaires lisses pour stimuler la revascularisation ou l'angiogénèse d'un tissu préalablement ischémié. Préférentiellement, selon ce deuxième mode de mise en oeuvre 20 de l'invention, les précurseurs de cellules endothéliales sont activés par l'intermédiaire d'un marqueur cellulaire EphB4 sur lequel vient se fixer un ligand éphrine-B2, le ligand étant lui-même associé à un fragment Fc d'anticorps. On obtient ainsi des précurseurs de cellules endothéliales activés de la forme : EPC-EphB4-éphrine-B2-Fc. 25 Tout d'abord, il s'agit d'obtenir une population cellulaire contenant majoritairement des précurseurs de cellules endothéliales présentant le marqueur EphB4. Selon un premier mode d'obtention, on recueille des colonies cellulaires de type pavimenteux issues de la préparation cellulaire obtenue 30 selon le premier mode de préparation précité. Cette préparation cellulaire contient entre autres, des précurseurs de cellules endothéliales pourvus du marqueur EphB4. On traite alors ces colonies cellulaires avec 311g/ml 2909559 12 de protéine de fusion Ephrine-B2-Fc, pendant une durée d'incubation de 30 minutes à 37 C. On écarte par rinçage avec du PBS chaque protéine de fusion non liée (au moins deux rinçages sont nécessaires). On obtient alors une composition de précurseurs de cellules endothéliales de 5 structure EPC-EphB4-éphrine-B2-Fc. Ensuite, il s'agit d'associer cette composition cellulaire à des précurseurs de cellules musculaires lisses pour constituer une deuxième préparation cellulaire conforme à l'invention. La préparation cellulaire précitée obtenue selon le premier mode de préparation, contient des io précurseurs de cellules musculaires lisses identifiables par leur forme du type fusiforme. Par conséquent, on prélèvera ces précurseurs de cellules musculaires lisses dans une telle préparation, et on les associera aux précurseurs de cellules endothéliales de structure EPC-EphB4-éphrine-B2-Fc. 15 Selon un second mode d'obtention, on recueille une composition cellulaire à l'issue de la première partie du premier mode de préparation précité à hauteur du premier mode de réalisation de l'invention. On a ainsi isolé par centrifugation les cellules mononucléées du sang de cordon ombilical que l'on a ensuite séparées des cellules adhérentes par culture 20 sur boites plastiques pendant 24 heures à 37 C. On obtient alors un mélange cellulaire contenant des cellules mononucléées exprimant le marqueur EphB4 et des cellules mononucléées n'exprimant pas ledit marqueur. Ensuite, on isole et purifie les cellules marquées CD34+ des cellules 25 non adhérentes par une technique de séparation immunomagnétique standard, notamment au moyen du matériel "CD34 isolation Kit" (commercialisé par la société MILTENY/ BIOTECH, Paris France), qui comporte un anticorps monoclonal anti-CD34. L'analyse des cellules, ainsi obtenues, par cytométrie de flux et en utilisant un anticorps monoclonal 30 anti-CD34 (de préférence différent du précédent) couplé au FITC, montre que 75% ( 5,6%) d'entre elles possèdent le marqueur CD34. 2909559 13 Le mélange cellulaire, ainsi obtenu, qui contient 1,5 x 106 à 3,5 x 106 cellules CD34+, peut être placé dans les puits d'une plaque à 6 puits revêtus d'une matrice contenant de la fibronectine, de la laminine, du sulfate sodique d'héparane, et du collagène de type I et IV (produits 5 commercialisés par la société dite SIGMA ALDRICH précitée) et dans un milieu de culture contenant hVEGF, bFGF et IGF1 (produits commercialisés par la société dite R&D SYSTEMS INC., Oxford, Royaume-Uni). Après 15 jours de culture, on recueille un mélange cellulaire enrichi en EPC-EphB4. io Ce mélange cellulaire est alors traité de manière identique au premier mode d'obtention, avec 3 g/ml de protéine de fusion Ephrine-B2-Fc. Et on obtient alors une composition cellulaire comportant majoritairement des précurseurs de cellules endothéliales de structure EPC-EphB4-éphrine-B2-Fc. 15 Ensuite, on associe à cette composition cellulaire des précurseurs de cellules musculaires lisses prélevés de façon analogue au premier mode d'obtention, dans une préparation cellulaire selon le premier mode de préparation. On obtiendra alors une troisième préparation cellulaire conforme à l'invention. 20 On notera également, que les précurseurs de cellules musculaires lisses peuvent également être obtenus selon le second mode d'obtention précité. La deuxième préparation cellulaire comprenant à la fois des précurseurs de cellules endothéliales de structure EPC-EphB4-éphrine- 25 B2-Fc et des précurseurs de cellules musculaires lisses, est testée selon un deuxième protocole sensiblement identique au premier protocole ci-dessus, sur des lots de souris mâles Nude. On notera que la troisième préparation cellulaire précitée conduirait au même résultat que la deuxième préparation. 30 On comparera l'efficacité de la deuxième préparation par rapport à une préparation témoin (PBS), et aussi par rapport à une préparation contenant uniquement des précurseurs de cellules endothéliales de 2909559 14 structure EPC-EphB4-éphrine-B2-Fc. On réservera alors trois lots de six animaux, et on administrera respectivement les trois préparations aux animaux de ces trois lots. Selon ce deuxième protocole, et de façon similaire au premier, à un 5 instant t=0 on procède à la ligature de l'artère fémorale droite de toutes les souris âgées de sept semaines pour simuler une ischémie. Cinq heures après, on injecte simultanément par voie intraveineuse au niveau du sinus rétro-orbital, la deuxième préparation cellulaire à raison de 250 000 cellules pour les deux type de cellules et pour chaque souris d'un io premier lot, et les préparations précitées à titre de comparaison respectivement aux animaux des deux autres lots. Ensuite, 12 jours après la ligature, les souris sontsacrifiées et les muscles gastronecmius de la patte ischémiée et de la patte non ischémiée sont prélevés. On mesure alors les trois paramètres déjà 15 rencontrés ci-dessus, le score angiographique, la densité capillaire, et le flux sanguin cutané. Tableau Il des résultats La mesure des trois paramètres précités est consignée dans le 20 tableau ci-dessous pour chacun des trois groupes de six individus. La mesure est la moyenne des résultats observés sur les six animaux. Témoin PBS EPCs SMCs + EPCs-Ephrine-B2-Fc EphB4 Ephrine-B2-Fc Score 100 206 +1- 10 350 +/angiographique Densité 100 219 +1- 16 259 +/- _ capillaire 13 Ainsi, on constate, de manière tout à fait surprenante que les 25 précurseurs de cellules endothéliales activés par l'intermédiaire de leur marqueur EphB4 associé au ligand éphrine-B2 et au fragment d'anticorps Fc, et en combinaison avec des précurseurs de cellules musculaires 2909559 15 lisses, provoquent une augmentation de la densité des vaisseaux équivalente à 3,5 fois la densité des vaisseaux obtenue avec la composition témoin qui est dépourvue de cellules. Au surplus, la composition cellulaire ne contenant que des cellules 5 endothéliales activées par l'intermédiaire de leur marqueur EphB4 associé au ligand éphrine-B2 et au fragment Fc d'anticorps, provoque déjà une augmentation de la densité des vaisseaux deux fois supérieure à celle de la composition témoin. Ainsi, la deuxième préparation cellulaire selon l'invention incorporant io des précurseurs de cellules endothéliales activés et en combinaison, des précurseurs de cellules musculaires lisses, peut être administrée en tant que médicament, afin de traiter aussi les insuffisances vasculaires, en particulier dans la revascularisation des tissus ischémiés cardiaques, cérébraux ou périphériques. Tout comme la première préparation 15 cellulaire, cette deuxième préparation est adaptée à la réalisation d'un médicament pour normaliser la vascularisation tumorale. On se reportera alors, à la Figure 1, sur laquelle sont reportés les scores angiographiques, sous forme d'un histogramme, des préparations cellulaires testées conformément à l'invention. 20 Ainsi, si l'on constate que les progéniteurs de cellules endothéliales et les précurseurs de cellules musculaires lisses produisent indépendamment un effet pro-angiogénique il est remarquable que l'action combinée de ces deux types cellulaires a un effet proangiogénique marqué. La densité des vaisseaux est en effet multipliée par 25 2,4 par rapport à la densité des vaisseaux de la composition témoin. En outre, il est tout aussi remarquable, que la combinaison des précurseurs de cellules musculaires lisses et des précurseurs de cellules endothéliales activés par l'intermédiaire de leur récepteur EphB4, multiplie par 3,5 la densité des vaisseaux sanguins par rapport à la densité de 30 vaisseaux obtenue avec la composition témoin. REVENDICATIONS 1. Préparation cellulaire comprenant des précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) et des précurseurs de cellules musculaires lisses 5 (SMCs), comme produit de combinaison pour une administration simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour une utilisation comme agent stimulant la revascularisation. 2. Préparation cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) sont obtenus io par différenciation in vitro de progéniteurs provenant de sang de cordon ombilical. 3. Préparation cellulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) sont obtenus par différenciation in vitro de progéniteurs provenant 15 de sang circulant. 4. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) sont obtenus par différenciation in vitro de progéniteurs provenant de moelle hématopoïétique. 20 5. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs) expriment un récepteur spécifique apte à recevoir un matériau protéique pour activer lesdits précurseurs de cellules endothéliales (EPCs). 25 6. Préparation cellulaire selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit récepteur spécifique est un récepteur Eph à activité tyrosine kinase. 7. Préparation cellulaire selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit récepteur spécifique est un récepteur de type EphB. 30 8. Préparation cellulaire selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit récepteur spécifique est un récepteur de type EphB4. 2909559 17 9. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que ledit matériau protéique comporte un ligand spécifique dudit marqueur, ledit ligand étant associé à polypeptide de liaison. 10. Préparation cellulaire selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit ligand spécifique dudit marqueur est un ligand éphrine. 11. Préparation cellulaire selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit ligand spécifique dudit marqueur est un ligand éphrine-B. 12. Préparation cellulaire selon la revendication 11, caractérisée en io ce que ledit ligand spécifique dudit marqueur est un ligand éphrine-B2. 13. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce que ledit polypeptide de liaison est un fragment Fc d'immunoglobuline. 14. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 13, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs) sont obtenues par différenciation in vitro de progéniteurs provenant de sang de cordon ombilical ou de sang périphérique. 15. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 14, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de cellules musculaires lisses (SMCs) sont obtenues par différenciation in vitro de progéniteurs provenant de moelle hématopoïétique. 16. Préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que lesdits précurseurs de 25 cellules musculaires lisses (SMCs) sont obtenues à partir d'une biopsie musculaire. 17. Utilisation d'une préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'un médicament destiné à stimuler la revascularisation. 30 18. Utilisation d'une préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'un médicament destiné à normaliser la vascularisation tumorale.