Brevet FR2906968A1 — publié le 20080418

La présente invention concerne un procédé de lutte biologique contre la prolifération de Legione//a pneumophlla, et constitue donc une méthode originale pour lutter contre la prolifération de la bactérie pathogène. Legione//a pneumophi/a responsable chez l'homme de la légionellose, est une bactérie gram négatif, qui se caractérise par une réplication intracellulaire facultative à l'intérieur des macrophages pulmonaires. La légionellose est une maladie qui a atteint 1200 personnes en France en 2004, causant la mort de 130 malades. Aussi, la surveillance et la prévention de la légionellose constituent une préoccupation de plus en plus importante. Au delà du problème de santé publique, la présence de la bactérie dans les eaux d'installations industriellès impose une surveillance contraignante et d'importantes pertes d'exploitations en cas d'arrêt de ces installations imposées dans le cadre réglementaire. Dans l'environnement, L. pneumophi/a présente une répartition hydrique ubiquitaire associée à une relative thermophilie, caractéristiques qu'elle partage avec les amibes libres. ROWBOTHAM en 1980 (ROWBOTHAM, T.J. J. Clin. Pathol. (1980) 33 : 1179-1183), par analogie avec ce que l'on observe chez l'homme, a été le premier à supposer et à démontrer l'existence d'une multiplication intracellulaire de Legionella pneumoph//a à l'intérieur de cellules de protozoaires telles que les amibes libres. Depuis, de nombreux essais de cocultures réalisés en milieu liquide ont démontré une prolifération très importante des légionelles en présence d'amibes. D'autres arguments de type indirect, viennent également renforcer l'existence d'interactions entre amibes libres et légionelles. Ainsi, lors des épidémies de légionellose, des légionelles et des amibes libres ont pu être isolées simultanément à partir des eaux mises en cause (BARBAREE et a/. Appl. Environ. Microbiol. (1986) 51 : 422-424; BREIMAN et al. JAMA (1990) 263 : 2924-2926). SANDEN et a/. dans Environ. Microbiol. (1992) 58 : 2001-2004 indiquent que l'isolement des légionelles à partir de l'eau est fortement amélioré par une simple incubation des échantillons d'eau en présence d'amibes. Enfin, STEINERT et a/. (STEINERT et a/. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63 : 2047-2053) montrent que l'addition d'amibes est même capable de provoquer la reviviscence de souches de légionelles non détectables dans les conditions habituelles car devenues non 2906968 2 cultivables, bien que toujours viables (VBNC), en raison d'un séjour trop prolongé dans un milieu appauvri tel que l'eau distillée. FIELDS (Trends Microbiol. (1996) 4: 286-290) a énuméré 13 espèces d'amibes libres et 2 espèces de ciliés susceptibles d'assurer la multiplication de L. 5 pneumophi/a. Mais en fait, les études réalisées in vitro ont porté, dans l'immense majorité des cas, sur seulement trois genres amibiens : Acanthamoeba (ANAND et a/. J. Hyg. Camb. (1983) 91 : 167-178 ; HOLDEN et al. Neff. Infect. Immun. (1984) 45 :18-24 ; VANDENESCH et al. Zbl. Bakt. (1990) 272: 265-275 ; MOFFAT et TOMPKINS Infect. Immun. (1992) 60 : 296-301 ; BOZUE et JOHNSON, Infect. 10 Immun. (1996) 64 : 668-673 ; GAO et a/. Infect. Immun. (1997) 65 :4738-4746 ; NEUMEISTER et a/. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63 : 1219-1224), Hartmannella (KING et a/. Infect. Immun. (1991) 59 : 758-763 ; ABU KWAIK, Appl. Environ. Microbiol. (1996) 62 : 2022-2028 ; ABU KWAIK et a/. Infect. Immun. (1994) 62 : 1860-1866 et Appl. Environ. Microbiol. (1998) 64: 3134-3139) et Naegleria 15 (NEWSOME, Infect. Immun. (1985) 50 :449-452). Avec ces genres, les légionelles se multiplient en grand nombre à l'intérieur des amibes où elles sont observées à l'intérieur de vacuoles phagocytaires. De plus, alors que les amibes libres sont suspectées de favoriser le maintien et la multiplication des légionelles en milieu hydrique, notamment au niveau des 20 biofilms, aucune étude n'a jusqu'à présent envisagé les répercussions sur la multiplication des légionelles, des inter-relations complexes qui peuvent exister (phénomènes de compétition, de phagocytose inter-amibienne) entre les différents genres amibiens cohabitant au sein de la microfaune amibienne. Il est, aujourd'hui, reconnu que les amibes libres jouent le rôle de vecteurs 25 grâce auxquels les légionelles se développent et se propagent dans l'environnement. Les techniques, à ce jour, utilisées pour lutter contre les légionelles font appel à des traitements thermiques, des traitements physiques (rayons UV) ou encore à des traitements chimiques. Néanmoins, ces traitements ne donnent pas entière satisfaction car ils permettent seulement d'éliminer 30 provisoirement les bactéries planctoniques de L. pneumophi/a présentes à l'état libre dans le milieu traité, mais s'avèrent inefficaces vis à vis des bactéries présentes et protégées à l'intérieur des protozoaires. 2906968 3 Dans ce contexte, les inventeurs ont mis en évidence, de façon totalement originale, que le genre amibien Willaert/a stoppe la prolifération des bactéries L. pneumoph//a et que ce genre présente également un pouvoir phagocytaire vis-à-vis d'autres espèces amibiennes susceptibles d'être elles mêmes infestées par la 5 bactérie. La présente invention a donc pour objet tout procédé de lutte biologique utilisant des amibes du genre Willaert/a contre la prolifération des Leg/one//a pneumoph//a. Les procédés conformes à l'invention n'incluent pas les méthodes de traitement appliquées au corps humain ou à l'animal. Dans le procédé selon 10 l'invention, le plus souvent c'est un flux gazeux ou liquide qui est traité avec des protozoaires du genre Willaert/a, et en particulier avec l'espèce Willaert/a magna. Le procédé selon l'invention trouve, en particulier des applications, dans la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissements des installations industrielles, ou des réseaux de 15 climatisation. En particulier, le procédé selon l'invention pourra être mis en oeuvre, par adjonction d'amibes Willaert/a, pour lutter au sein des biofilms contre la prolifération de L, pneumoph//a dans les canalisations d'eaux, ces biofilms étant un lieu de développement de différentes espèces d'amibes. Les amibes Willaert/a pourront être directement ajoutées, sous forme d'une suspension de formes 20 végétatives ou de kystes, aux eaux ou liquides circulant dans les canalisations ou réseaux à traiter. Il est également possible d'envisager de les pulvériser en aérosol, par exemple sous la forme d'une suspension de kystes, dans les tours aéroréfrigérantes et les installations industrielles à désinfecter. En particulier, l'agent biologique utilisé peut correspondre à une des deux 25 souches amibiennes appartenant à l'espèce Willaert/a magna déposées à I'ATCC (Etats-Unis) et enregistrées sous les numéro N PTA-7824 et N PTA-7825. Ces souches N PTA-7824 et N PTA-7825 font partie intégrante de l'invention. Ces souches sont de la famille des Vahlkampfiidae. Elles sont caractérisées par l'expression de pseudopodes lobés, arrondis émis de façon brutale lors du 30 déplacement des individus. Les individus sous forme végétative ont une taille comprise entre 45 à 100 pm et entre 18 à 25 pm pour la forme kyste. Ces kystes 2906968 4 sont arrondis, de forme ovoïde ou parfois très déformés et possèdent de 7 à une dizaine de pores dans leur paroi. Le mode de division est la pro-mitose. De telles amibes pourront donc être utilisées dans des agents désinfectants, en particulier destinés à l'élimination des bactéries Legione//a pneumophi/a et à 5 lutter contre la prolifération et la contamination par légionellose. Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un agent désinfectant contenant des amibes du genre Wi//aertia, et en particulier de l'espèce Wi//aertia magna. Les amibes correspondant à la souche déposée sous le numéro PTA-7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA-7825 à I'ATCC seront préférées. 10 De façon avantageuse, l'agent désinfectant selon l'invention se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse, par exemple dans de l'eau distillée. L'agent désinfectant pourra se présenter sous une forme pulvérisable, par exemple en aérosol. L'activité inhibitrice des protozoaires amibiens du genre Wi//aertia, et en 15 particulier de l'espèce Wi//aertia magna, vis-à-vis de L. pneumophi/a a été mise en évidence par les inventeurs en comparant la réplication de la bactérie chez les genres Acanthamoeba et Hartmanne//a utilisés en tant que modèles amibiens de référence avec celle observée chez le genre amibien Wi//aertia. De plus, l'existence d'un processus phagocytaire des protozoaires du genre Wi//aertia vis-à-vis d'autres 20 genres amibiens a également été démontrée. Etant donné le rôle essentiel joué par les amibes libres dans la prolifération et le maintien de L. pneumoph//a dans le milieu extérieur, éléments qui conditionnent l'épidémiologie de la légionellose puisqu'il n'existe pas de transmission interhumaine, le procédé et l'agent désinfectant envisagé selon l'invention 25 présentent de nombreux avantages, en termes de coût, d'efficacité et de respect de l'environnement. Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figure 1 montre les cinétiques comparées du développement de L. 30 pneumophi/a obtenu en coculture avec différents genres amibiens, dont le genre Wi//aertia. 2906968 5 La Figure 2 montre l'effet de L. pneumophi//a sur les différentes espèces d'amibes et la résistance particulière de Wi//aertia par rapport aux Hartmann//a et aux Acanthamoeba. La Figure 3 montre la résistance de Wi//aertia envers la cytotoxicité induite 5 par L. pneumophi//a. Noter, au contraire, l'effet cytotoxique prononcé qui est observé chez Acanthamoeba. La Figure 4 montrent la phagocytose des amibes Hartmann//a par les amibes Willaert/a observée en microscopie à contraste de phase sur le vivant (x1200). La Figure 5 montre l'évolution spontanée des populations respectives 10 d'amibes Hartmann//a (H) et W/laert/a (W) après mise en présence selon un ratio initial H/W aux environs de 15. La Figure 6 représente les évolutions respectives des populations d'amibes Hartmann//a (série " témoin " et " essai ") et Willaert/a dans les cocultures emboîtées de L. pneumophi/a. 15 La Figure 7 représente les cinétiques comparées du développement de L. pneumophi/a en coculture mono-amibienne (Hartmannella seules) et en coculture tripartite (Hartmann/la + Wi/laertia). 1- MA TERIEL ET METHODES 20 Souches utilisées - Légionnelles : la souche utilisée est la souche de Legione//a pneumophi/a sérogroupe 1 déposée sous le numéro 107 629T à l'institut Pasteur à Paris (CNCM). Elle est entretenue sur gélose en pente BCYE à raison d'un repiquage toutes les trois semaines. La souche est ensemencée en stries larges sur boîte de gélose BCYE 25 (AES ) et incubée 3 à 4 jours à 37 C avant la réalisation des cocultures de manière à disposer de bactéries en phase post-exponentielle. - Amibes : les souches utilisées appartiennent à trois genres amibiens différents : o Hartmannella vermiformis, 30 o Acanthamoeba castel/ani/, o Willaertia magna. 2906968 6 Ces trois souches sont cultivées axéniquement, en présence de 10% de sérum de veau foetal, sur milieu SCGYEM (voir composition en annexe), réparti en tubes FALCON (3033) à raison de 3 ml par tube. En entretien, les formes végétatives sont repiquées tous les 8-9 jours. Pour les cocultures, on utilise des repiquages de 3 5 à 4 jours de manière à disposer de trophozoites en phase de croissance exponentielle. - Milieu SCGYEM Composition : 10 15 Aux 900 ml d'eau distillée, on ajoute 2,5 ml de NaOH (IN), puis Na2HPO4 et KH2PO4. On chauffe légèrement sur plaque chauffante, puis on ajoute progressivement la caséine sous agitation magnétique. Après dissolution de la caséine, on incorpore le glucose et l'extrait de levure. 20 Après dissolution complète, on filtre successivement sur fibre de verre (SARTORIUS SM 6513400), puis sur membrane de lpm (WHATMAN 7190 004). Le milieu est ensuite aliquoté en flacons de verre. Les flacons sont stérilisés à l'autoclave 20 minutes à 120 C. Avant l'utilisation définitive et répartition du milieu, on ajoute stérilement sous hotte à flux laminaire le sérum de veau foetal à 25 raison de 10% du volume final. 1,2, Cocuiture monoamnibienne de L. oneumophila. 1,2,1, Préparation de /'inocu/um bactérien 30 A partir d'une culture de 3 à 4 jours sur gélose BCYE, on prépare une suspension de L. pneumophi/a dans de l'eau distillée stérile de façon à obtenir 1 unité de Densité Optique à 550nm, soit une concentration de 109 UFC/ml. - Caséine (MERCK 1.02244.010) 10 g - Na2HPO4 1,325 g - KH2PO4 0,8 g - Glucose 2,5 g - Extrait de levure (DIFCO 0127-17-9) 5 g - Eau distillée 900 ml - Sérum de veau foetal 100 ml 2906968 7 1,2,2. Réalisation des cocu/tares mono-amibiennes Les cocultures sont réalisées dans des tubes pour cultures cellulaires (FALCON 3033) contenant 3 ml de milieu SCGYEM. L'ensemencement des tubes se fait à raison d'environ 7.104 amibes/mi, à partir d'une suspension amibienne 5 axénique préalablement dénombrée sur cellule de THOMA. L'infestation des amibes par L. pneumophi/a est réalisée en fixant un ratio L. pneumophi/aAmibe de 50, donc aux environs de 3,5 106 bactéries/ml. Aussitôt après l'infestation, les tubes de cocultures sont centrifugés à faible vitesse (760g pendant 5 min) pour favoriser le contact entre amibes et bactéries. Après 10 min, les tubes sont remis en suspension 10 manuellement et sont incubés, en position inclinée, à l'étuve à 37 C. 1,2,2,1 Etude cinétique des cocultures Les cocultures sont suivies pendant au moins 5 jours (JO à J+4) après l'infestation bactérienne. A chaque intervalle de temps, un tube est prélevé et 15 examiné à la fois du point de vue amibien et bactérien après agitation vigoureuse au vortex afin de détacher les amibes des parois. Pour chaque tube examiné : - La numération des amibes s'effectue directement sur cellule de THOMA ou de MALASSEZ. En raison des résultats obtenus à la suite des essais préliminaires de lyse 20 amibienne, le dénombrement des légionelles totales est effectué par étalement direct du milieu de culture sur gélose BCYE (AES ) après dilution de 10 en 10 en eau distillée stérile, dans des microtubes Eppendorf. Chaque dilution est étalée en triplicat sur gélose BCYE à raison de 100pI par boîte. Les boîtes sont alors mises à incuber à 37 C pendant 6 jours au minimum. Une première lecture des étalements 25 s'effectue à partir du 4ème jour en dénombrant les colonies; elle est suivie d'une deuxième lecture au 6ème jour pour confirmation. Le nombre de L. pneumophi/a est exprimé en UFC/ml en tenant compte du facteur de dilution et en supposant que chaque colonie correspond à 1 bactérie initialement présente dans la suspension diluée. 30 Pour chaque genre amibien, les courbes de croissance de L, pneumophi/a, sont représentées en fonction du temps et correspondent à la moyenne d'au moins trois essais indépendants avec les écarts-types correspondants. 2906968 8 En raison de la lenteur du développement des colonies de L. pneumophi/a en culture sur BCYE, l'obtention de l'ensemble des résultats pour une manipulation de ce type demande un délai d'au moins 11 jours. 5 1,2,2,2 Cytotoxicité de L. pneumophi/a vis-à-vis des différents genres amibiens Des cocultures des trois genres amibiens ont également été réalisés dans des microplaques de 24 puits contenant 5.104amibes/puits, infestées avec un ratio L. pneumophi/a/amibe de 50, afin d'observer microscopiquement les monocouches 10 cellulaires et de fournir une évaluation qualitative de l'effet cytopathogène de la bactérie vis-à-vis de l'amibe. La cytotoxicité a également été déterminée au bout de 48 et de 72 H de coculture par un test d'exclusion au bleu Trypan sur les genres Acanthamoeba et Wi//aertia. Les amibes sont récupérées par centrifugation douce du contenu des 15 tubes de cocultures, puis resuspendues dans 200 pl de milieu SCGYEM avant mélange avec le bleu trypan selon un ratio 4/1. Les cellules sont examinées à l'hématimètre et on détermine pour chaque genre amibien le pourcentage de cellules tuées apparaissant colorées en bleu. 20 1,3, Cocu/cures tripartites de L. pneumophi/a. Les répercussions possibles des interactions entre différents genres amibiens, et notamment de la phagocytose inter-amibienne, sur la réplication et la transmission des légionelles ont été étudiées. Dans un premier temps, la cinétique du processus de phagocytose inter-amibienne entre Hartmannella et Wi//aertia a été 25 étudiée, puis des cocultures tripartites de L. pneumophi/a mettant en jeu deux hôtes amibiens successifs ont été réalisées. 1,3,1. Etude cinétique de /a ahaaocytose inter-amibienne Hartmannella-Wi//aertia. 30 A partir des cultures axéniques respectives, on prépare une série de tubes de milieu SCGYEM contenant à la fois des amibes Hartmannella et des amibes Wilaert/a selon un ratio fixé aux environs de 20 Hartmann/la pour 1 Wi//aertia. Le processus phagocytaire est observé microscopiquement in vivo en contraste de phase, et, grâce aux différences prononcées de taille et d'aspect entre les deux 2906968 9 genres amibiens, son évolution peut être suivie par numération des deux populations amibiennes en présence à différents intervalles de temps. L3,2. Réalisation des cocu/tores tripartites de L. pneumophi/a. 5 Dans ce but, un protocole expérimental en deux temps a été utilisé : / la première étape correspond, comme dans les cocultures mono-amibiennes, à l'infestation en coculture du premier hôte amibien par L, pneumophila. / la deuxième étape consiste, après élimination des légionelles 10 extracellulaires, à introduire dans la coculture un deuxième genre amibien. 1,3,2.1, Infestation du premier hôte amibien à J-1; Cette étape correspond à l'infestation de l'amibe H. vermiformes par L. pneumophi/a. Elle est réalisée en tubes FALCON dans des conditions analogues à 15 celles indiquées précédemment au paragraphe 1.2.2. Les seules différences portent sur la concentration amibienne de départ qui est de l'ordre de 2.105 Hartmann/la/ml et sur le ratio d'infestation L. pneumophila /Hartmann//a qui est de 20. Les tubes sont incubés en position inclinée pendant 24H à 37 C. 20 1,3,22, Addition du deuxième hôte amibien à JO, qb E/im/nation des /égione//es extracel/u/aires A l'issue du temps d'incubation destiné à assurer l'infestation du premier hôte amibien, les légionelles extracellulaires sont éliminées par traitement des cocultures à la gentamycine à raison de 50pg/ml pendant 1H à 37 C (Moffat, J.F, and 25 Tompkins, L.S. Immun. (1992) 60: 296-301). Après centrifugation à 2000 g pendant 10min, l'antibiotique est éliminé par décantation du milieu de culture et le culot cellulaire d'Hartrnanne//a est lavé à deux reprises avec 2ml de milieu SCGYEM sans sérum pour éliminer toute trace d'antibiotique. Après le dernier lavage, le culot amibien de chaque tube est remis en suspension, par passage au vortex, dans son 30 volume initial de milieu SCGYEM (3ml). On procède à une numération (JO), à la fois des Hartmann//a et des légionelles. 2906968 10 q> Inoculation du deuxième hôte amibien (Willaertia) Parallèlement, on prépare une suspension amibienne du deuxième hôte Willaertia à partir d'une culture axénique. Après dénombrement à la cellule de 5 THOMA, on calcule le volume nécessaire de suspension à introduire dans les tubes de cocultures constituant la série essai de façon à obtenir un rapport cellulaire ler hôte amibien / 2ème hôte amibien (Hartmannella/Wil/aertia) voisin de 20. Les tubes correspondant à la série témoin sont traités exactement de la même manière, mais ne reçoivent pas d'amibes Willaertia après le traitement à la 10 gentamycine. q> Suivi des cocultures de JO à J+S. Chaque jour, un tube de coculture de la série essai et témoin , après agitation au vortex, est examiné à la fois du point de vue amibien et bactérien: - La numération des trophozoites pour chaque genre amibien est effectuée sur 15 cellule de THOMA ou de MALASSEZ. - Le dénombrement des légionelles totales est effectué comme dans le cas des mono-cocultures par étalement sur gélose BCYE des dilutions du milieu de culture en eau distillée stérile. Une seule manipulation demande donc un délai d'une douzaine de jours pour être interprétée. 20 2,RESULTATS 2, .1. Résultats des cocu/tores monoamibienne de L. pneumophila, O Absence de croissance de L, pneumophila en présence des amibes 25 Willaertia. La Figure 1 montre la croissance comparée de L. pneumophlla en coculture avec les trois genres amibiens, les cocultures étant réalisées comme décrit précédemment dans la section matériel et méthode, à savoir : les amibes axénisées sur milieu SCGYEM sont cocultivées en présence de L. pneumophila à partir de JO 30 selon un ratio d'infestation L. pneumophi/a/amibe de 50. Les résultats correspondent à la moyenne écart-type de 6 (Hartmannella) à 8 (Acanthamoeba et Willaert-la) essais indépendants. 2906968 11 Les cocultures de L. pneumophi/a réalisées en présence d'amibes appartenant aux genres Hartmanne//a et Acanthamoeba confirment une nette multiplication de la bactérie en présence de ces deux genres amibiens puisqu'on note une augmentation atteignant respectivement 1,3 et 1,4 log à 3+3 (Figure 1). A 5 l'inverse, alors que les conditions expérimentales sont strictement identiques, les cocultures de L. pneumophi/a en présence d'amibes Wi//aertia sp., non seulement n'aboutissent pas à un développement significatif de la bactérie, mais conduisent même à une diminution de 1 log de la population bactérienne et finalement la différence de développement de L. pneumophi/a entre les cocultures en présence 10 d'Hartmanne//a sp. ou d'Acanthamoeba sp. et les cocultures en présence d'amibes Wi//aertia sp. atteint 2,3 log à 3+2 (Figure 1). Simultanément, l'observation microscopique des cocultures montrent d'importantes modifications morphologiques affectant exclusivement les amibes des 15 genres Hartmannella et Acanthamoeba : leurs trophozoites deviennent progressivement arrondis, ratatinés et perdent leur capacité d'adhérence de 32 à J4. Dans ces conditions, le dénombrement exact des amibes pour ces deux genres devient difficile et incertain du fait qu'une majorité des cellules dénombrées est en réalité déjà nécrotique et sur le point de se lyser ; néanmoins le dénombrement 20 montre que la croissance de ces deux genres est ralentie à partir de 3+1 avec une nette diminution à 3+2 (Tableau 1). Les cocultures en présence de Wi//aertia sp. ne présentent pas cette involution et sont caractérisées, au contraire, par une prolifération des amibes (Tableau 1). 25 Les résultats présentés dans le Tableau 1 sont obtenus comme suit : Les différentes espèces amibiennes sont co-cultivées en présence de L. pneumophi/a selon un ratio d'infestation de 50 (L. pneumophi/amibe) et les amibes sont dénombrées quotidiennement avec un hématimètre. Les résultats en 30 nombre d'amibes/ml de milieu correspondent à la moyenne de 6 (Hartmann//a) à 8 (Acanthamoeba et Wi//aertia) expérimentations indépendantes. Les différences statistiquement significatives entre le nombre des Wi//aertia et les deux autres espèces amibiennes sont indiquées (*: P REVENDICATIONS 1 - Procédé de lutte biologique contre la prolifération des Legionel/a pneumophila, à l'exception des méthodes de traitement appliquées au corps humain ou animal, caractérisé en ce qu'il utilise des protozoaires amibiens du genre Wi//aertia. 2 - Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le traitement d'un flux liquide avec des protozoaires amibiens du genre Willaert/a, et en particulier de 10 l espècë Tlrillae7t/a mâgnâ 3 - Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que ces protozoaires amibiens correspondant, avantageusement, à la souche déposée sous le numéro PTA-7824 à I'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA-7825 à l'ATCC. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est mis 15 en oeuvre pour la désinfection des réseaux de distribution d'eaux sanitaires ou d'eaux industrielles, des circuits de refroidissements et des tours aéro-réfrigérantes des installations industrielles, ou des réseaux de climatisations. 5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre pour lutter contre la prolifération de Legionella pneumophila au sein des 20 biofilms dans les canalisations d'eaux. 6 - Agent désinfectant contenant des protozoaires amibiens du genre Willaert/a, et en particulier de l'espèce Willaert/a magna. 7 - Agent désinfectant selon la revendication 6 caractérisé en ce que les protozoaires amibiens correspondent à la souche déposée sous le numéro PTA- 25 7824 à l'ATCC ou à la souche déposée sous le numéro PTA-7825 à l'ATCC. 8 - Agent désinfectant selon la revendication 6 ou 7 caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'une solution ou d'une suspension aqueuse. 16