Brevet FR2905380A1 — publié le 20080307

L'invention concerne un procédé de production de cellules dendritiques, et notamment de cellules de Langerhans et/ou de cellules dendritiques interstitielles/cellules dendritiques dermiques, à partir de monocytes CD14+ isolés de sang circulant périphérique, notamment pour la préparation de modèles tissulaires, notamment dans le but de tester des principes actifs et/ou d'étudier les phénomènes biologiques/biochimiques impliqués au niveau de ces modèles. ETAT DE L'ART io Les cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentatrices d'antigènes qualifiées de sentinelles du système immunitaire. En effet, elles présentent une localisation quasi-ubiquitaire à savoir dans le thymus, la circulation systémique, les organes lymphoïdes secondaires et également les tissus périphériques tels is que la peau et les muqueuses monostratifiées ou pluristratifiées. Bien qu'en très faible nombre dans l'organisme, les CD sont au centre du déclenchement des réponses immunitaires spécifiques, en exerçant un contrôle sur la spécificité, l'intensité et la nature de la réponse immune et se placent à l'interface entre l'immunité innée et acquise. Outre leur fonction d'allumage de la réponse 20 immune, les CD jouent également un rôle dans l'induction de la tolérance périphérique. Les précurseurs des CD sont issus de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ tout comme de nombreuses populations du système immunitaire et des cellules sanguines. Ils sont acheminés par voie sanguine au 25 niveau de la peau et des muqueuses pour se différencier et y résider sous la forme de CD immatures. Cet état immature se traduit par un phénotype caractéristique et une forte capacité fonctionnelle à capturer des antigènes. Deux types de CD périphériques sont décrits en fonction de leur localisation in vivo : 2905380 2 - Les cellules de Langerhans (CL) sont localisées au niveau des épithélia de type malpighien (peau et muqueuses) où elles expriment spécifiquement la Langerine qui est une lectine de type C. La Langerine est impliquée dans la formation d'un organite intracytoplasmique, le granule de Birbeck, qui est le 5 marqueur ultrastructural spécifique et de référence des CL. Les CL expriment également des marqueurs caractéristiques tels que CD1a et HLADR. - Les CD interstitielles (CDI) sont quant à elles retrouvées au niveau de la lamina des muqueuses comme au niveau du derme de la peau où elles sont aussi qualifiées de CD dermiques (CDD). Ces cellules partagent de nombreuses similitudes et marqueurs communs avec la lignée cellulaire des monocytes/macrophages. Dans le derme de la peau, les CDD expriment spécifiquement DC-SIGN mais également des marqueurs caractéristiques tels que HLA-DR, FXIIIa, MMR et CD1a. La description qui suit fait référence de manière générale aux cellules dendritiques interstitielles (CDI) indépendamment du fait quelles soient situées au niveau de la lamina des muqueuses ou au niveau du derme de la peau. Suite à la capture d'un antigène, les CL et CDI migrent vers les ganglions lymphatiques afin de présenter l'information antigénique aux lymphocytes T. Cette migration qui est corrélée à l'activation des CL et CDI, se traduit par des modifications phénotypiques et fonctionnelles. Par exemple, les CL et CDI activées acquièrent l'expression de CD80 et CD86 qui sont des marqueurs de co-stimulation et acquièrent l'expression du récepteur CCR7 qui est indispensable à la migration cutanée de ces cellules. Au niveau des ganglions lymphatiques, les CL et CDI activées acquièrent un phénotype de CD matures ou interdigitées de par leur interaction avec les lymphocytes T. Cet état mature est synonyme d'un phénotype caractéristique tel que par exemple l'expression de CD83 et DC-LAMP et d'une forte capacité allostimulante 2905380 3 c'est-à-dire la capacité d'induire la prolifération de lymphocytes T. De par leur capacité à migrer vers les ganglions proximaux après avoir capturé un exoantigène, les CL et CDI sont responsables de nombreuses pathologies cutanées telles que l'allergie de contact et sont décrites plus récemment comme les 5 premières cibles du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Une utilisation intéressante des CL et des CDI, notamment en combinaison avec des cellules épithéliales ou des cellules mésenchymateuses de type fibroblastique, issues de peau ou de muqueuses humaines, consiste à les intégrer dans des cultures organotypiques tri-dimensionnelles telles que : io - des modèles d'épidermes reconstruits et de muqueuses reconstruites , par exemple de type vaginale et orale, intégrant uniquement des CL (Régnier et al., JID 1997; 109 :510-2 ; brevet EP 0 789 074 de L'OREAL ; Sivard et al., Exp Dermatol 2003; 12 :346-55), - des modèles de derme reconstruit et de chorion reconstruit , is intégrant des CDD ou CDI (Guironnet et al., JID 2001; 116 :933-9 et Dumont et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2004; 20 :383-97). Ces utilisations sont aujourd'hui extrêmement limitées du fait : 1/ de l'absence de procédé rapide, simplifié, et peu onéreux, à l'échelle industrielle, de production in vitro de CL et CDI et, 2/ de l'imperfection des modèles 3D 20 décrits qui présentent uniquement la partie épithéliale ou la partie conjonctive du tissu reconstruit et en aucun cas les deux compartiments tissulaires associés. Les articles de Régnier et al., Sivard et al. et Dumont et al. traitent de l'utilisation de précurseurs CD34+ issus de sang de cordon ombilical qui 25 présente les inconvénients majeurs suivants : 1 le nombre de progéniteurs CD34+ isolés est limité puisqu'ils sont extraits à partir de sang de cordon ombilical qui est une source limitée, donc difficile à utiliser sur le plan industriel ; 1 la culture au préalable (6 à 12 jours) des progéniteurs CD34+ avant leur intégration dans les modèles 3D et ceci afin d'induire leur 2905380 4 différenciation en CL ou CDI ; 1 les méthodes décrites requièrent l'ajout de cytokines exogènes dans les milieux de culture des épidermes reconstruits, muqueuses reconstruites et chorions reconstruits intégrant les CL ou des CDI. Dans l'article de Guironnet et al., les auteurs ont généré des CDD à partir 5 de monocytes sanguins afin de les intégrer dans un modèle de derme reconstruit. Comme précédemment, deux inconvénients sont à souligner : 1 la culture au préalable des monocytes (6 jours) avant leur intégration dans le derme reconstruit et ceci afin d'induire leur différenciation en CDD ; 2/ l'ajout de cytokines exogènes dans les milieux de culture du derme reconstruit io intégrant les CDD. Dans ce même article, les auteurs montrent également que des monocytes intégrés directement dans le derme équivalent et sans ajout de cytokines ne se différencient pas en CD. Le brevet de L'Oréal US 6 130 482 décrit la co-culture de kératinocytes et de précurseurs de CL dans un milieu nutritif adéquat afin d'effectuer la is différenciation des précurseurs en CL, notamment dans le but de les intégrer dans un modèle d'épiderme pour évaluer le potentiel sensibilisant, irritant, ou allergène d'un produit. Cependant cette demande décrit l'utilisation de progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de sang de cordon ombilical en se référant à la méthode décrite par Caux et al., Nature, 1992 Nov 19, 20 360(6401) :258-61. La méthode décrite dans cet article comprend la culture des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ en présence de cytokines exogènes. Ce brevet définit de manière générale les précurseurs des CL comme étant aptes à exprimer CD1a+, cependant il n'y est décrit que l'utilisation de cellules hématopoïétiques CD34+ en tant que précurseurs CD34+ de CL. Les cellules 25 hématopoïétiques CD34+ ne sont cependant que très peu nombreuses dans le sang périphérique et ne permettent pas le développement d'un procédé de différenciation industriellement satisfaisant. L'utilisation de précurseurs issus de sang de cordon ombilical n'est pas satisfaisante dans la mesure où ce sang n'est pas disponible en grande quantité. 25 2905380 5 Récemment, Engelhard Lyon (Coletica, brevet français FR 2 833 271B1, déposé le 10 décembre 2001) a décrit la différenciation de monocytes CD14+ pour obtenir des CL, des CDI, des CL et des CDI simultanément, qui peuvent ensuite être cultivées en présence de cellules épithéliales et/ou des cellules 5 mésenchymateuses issues de peau ou de muqueuses humaines. Il est décrit dans ce brevet notamment : - des modèles d'épiderme reconstruit et de muqueuses reconstruites intégrant uniquement des CL, - des modèles de derme reconstruit et de chorion reconstruit 10 intégrant des CDD ou CDI, - des modèles de peaux reconstruites et de muqueuses reconstruites intégrant simultanément des CL et des CDI. Comme précédemment, l'inconvénient de la méthode décrite est la culture au préalable des monocytes (6 jours) avant leur intégration dans des 15 modèles 3D et ceci afin d'induire leur différenciation en CL, ou en CDI, ou en CL et CDI simultanément, en présence de cytokines exogènes. A ce jour seule la méthode développée par Engelhard Lyon, qui fait l'objet du brevet FR 2 833 271 B1, décrit la différenciation de monocytes en CL et/ou enCDI dans le but de fournir des CL et/ou des CDI pour le développement 20 de modèles tissulaires immunocompétents proche de la peau humaine normale. Toutefois, ce procédé peut encore être amélioré notamment en utilisant un procédé de différenciation simple, peu coûteux, et rapide. BUT DE L'INVENTION L'invention permet pour la première fois de résoudre chacun des problèmes techniques énoncés précédemment d'une manière sûre et fiable, reproductible et utilisable à l'échelle industrielle et commerciale et notamment à 2905380 6 l'échelle industrielle cosmétique et/ou pharmaceutique et/ou médicale et/ou agro-alimentaire. L'invention consiste principalement à générer des CL, ou des CDI, ou des CL et des CDI simultanément, ou des CDI et des macrophages et des cellules 5 endothéliales simultanément ou des CL et des CDI et des macrophages et des cellules endothéliales simultanément, à partir d'un précurseur unique vivant issu de sang circulant périphérique. L'invention consiste notamment à fournir des modèles d'épidermes, d'épithélia, de dermes, de chorions, de peaux, ou de muqueuses contenant les io cellules précitées (CL, CDI/CDD, etc.), lesdits modèles étant de la meilleure qualité possible pour reproduire un épiderme, un épithélium, un derme, un chorion, une peau, ou une muqueuse d'un être vivant, en particulier d'un mammifère, et notamment d'un être humain. La présente invention a encore pour but de fournir des feuillets épithéliaux et/ou conjonctifs ainsi que des is équivalents de peau ou de muqueuses immunocompétents. La présente invention consiste notamment à fournir un procédé de différenciation de monocytes issus de sang circulant périphérique pour obtenir les cellules précitées (CL, CDI/CDD, etc.). La présente invention consiste également à fournir des modèles décrits 20 ci-dessus comme méthodes alternatives à l'expérimentation animale, notamment pour tester le potentiel irritant et/ou sensibilisant d'ingrédient cosmétique. La présente invention a pour but également de fournir des modèles décrits ci-dessus pour tester des principes actifs notamment en cosmétique, en 25 dermo-pharmacie, et en pharmacie, notamment pour évaluer leur activité et/ou leur toxicité ou pharmaco-toxicité. La présente invention a pour but également de fournir des modèles décrits ci-dessus pour tester des molécules ou produits chimiques notamment pour évaluer leur toxicité. 2905380 7 La présente invention consiste également à fournir des modèles décrits ci-dessus pour étudier les phénomènes biologiques/biochimiques au niveau intercellulaire et intracellulaire. La présente invention a pour but principal de fournir un modèle/outil 5 d'étude pharmaco-toxicologique, dans le but par exemple de réaliser des tests in vitro de prédictivité du pouvoir allergisant/irritant/sensibilisant d'agents extérieurs. La présente invention a encore pour but de fournir un modèle/outil d'étude de substances ayant des propriétés immunomodulatrices. L'invention concerne également l'utilisation des modèles décrits ci-dessus io dans l'ingénierie tissulaire ou cellulaire, notamment pour la réparation d'au moins une partie des tissus d'un être vivant. RÉSUMÉ DE L'INVENTION is Dans le cadre de l'invention, lorsqu'on parle de cellules , il s'agit toujours de cellules vivantes , sauf indications contraires. Par sang circulant périphérique , on entend selon l'invention le sang de tout être vivant ayant un système sanguin dans lequel le sang accompli un circuit, notamment à la périphérie, en particulier les animaux, les mammifères, 20 de préférence un être humain. Par principe actif , on entend toute substance, produit ou composition potentiellement capable de présenter une activité intéressante dans l'industrie, en particulier dans l'industrie cosmétique, pharmaceutique, dermopharmaceutique, alimentaire, agro-alimentaire, etc. 25 Par ajout de cytokine exogène on entend un ajout d'au moins une cytokine en plus des cytokines synthétisées par les cellules présentes dans le milieu cellulaire considéré.L'invention concerne donc la différenciation des monocytes CD14+, en présence de cellules épithéliales et/ou de cellules mésenchymateuses, par exemple de type fibroblastique, en : 2905380 8 - CL, - CDI, - CL et CDI simultanément, - CDI et macrophages et/ou cellules endothéliales simultanément, 5 - CL et CDI et macrophages et/ou cellules endothéliales simultanément. L'invention concerne notamment la différenciation de monocytes CD14+ en CL et/ou en CDI (sans culture préalable dans des conditions favorisant leur différenciation, et notamment sans culture préalable avec des cytokines io exogènes) en présence de cellules épithéliales et/ou des cellules mésenchymateuses, par exemple de type fibroblastique, pour obtenir un modèle cellulaire comprenant des CL et/ou des CDI, la culture étant de préférence effectuée essentiellement sans ajout significatif de cytokines exogènes, c'est à dire sans ajout de cytokine en plus des cytokines endogènes is synthétisées par les cellules présentes dans le milieu. L'invention concerne notamment un procédé de différentiation de monocytes CD14+ en CL et/ou CDI, comprenant les étapes suivantes: - la collection de monocyte CD14+ à partir de sang circulant, notamment d'un être humain; 20 - le maintien des monocytes CD14+ dans des conditions ne favorisant pas leur différentiation en CD; - la mise en contact des monocytes CD14+ dans un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes, et/ou des cellules mésenchymateuse, par exemples des fibroblastes, dans des 25 conditions favorisant la différenciation des monocytes CD14+ en CL, ou CDI, ou CL et CDI. L'étape de maintien des monocytes CD14+ dans des conditions ne favorisant pas leur différenciation en CD est de préférence limitée dans le 2905380 9 temps pour effectuer notamment l'ensemencement des monocytes CD14+ peu de temps, voir directement, après leur collection à partir du sang circulant. Avantageusement les conditions ne favorisant pas la différenciation des monocytes CD14+ en CD sont obtenues dans des conditions de culture ne 5 comprenant pas de cytokine exogène. Le but ici est notamment que les monocytes CD14+ ne s'engagent pas dans les voies de différenciations en CD. L'invention permet d'obtenir notamment un gain en nombre de précurseurs/cellules car elle évite la culture préalable des monocytes CD14+ qui s'accompagne d'un certain niveau de mortalité cellulaire. io Les CD générées in vitro sont des cellules très sensibles et fragiles. Le 1er paramètre à contrôler est le rendement des cellules obtenues. Il est évident, mais non quantifiable, que la perte et/ou la mortalité cellulaire des CD est significative lorsque ces dernières sont ensemencées dans un modèle quelconque de culture cellulaire. L'utilisation de monocytes CD14+ selon la is présente invention, en tant que précurseurs des CD, pallie à ce problème et permet ainsi un meilleur rendement cellulaire. L'invention permet d'obtenir notamment un gain de temps car la différenciation des monocytes en LC ou en CDI nécessite 6 jours de culture. L'invention permet d'obtenir notamment un gain de réactifs car de 20 préférence aucune cytokine exogène n'est utilisée. L'invention permet notamment d'obtenir un gain dans la qualité des cellules générées. La génération in vitro de CD à partir de monocytes est apparentée à une phase de différenciation cellulaire sous l'effet de médiateurs solubles immuns que sont les cytokines. Il a été décrit récemment dans un 25 article (Nicolas BECHETOILLE et al., Journal of Leukocytes Biology : Mixed Langerhans cell and interstitial/dermal dendritic cell subsets emanating from monocytes in Th2-mediated inflammatory conditions respond differently to proinflammatory stimuli) que les CD de type CL et CDD dérivées de monocytes ne sont pas synchrones dans leur processus de différenciation cellulaire. 2905380 io Autrement dit, les monocytes CD14+ qui ont initié leur différenciation génèrent des CL et des CDD qui ne présentent pas toutes le même stade de différenciation. En évitant cette étape de différenciation, on s'affranchit de cette imperfection. Les monocytes cultivés dans la présente invention sont influencés 5 par l'environnement cellulaire, cytokinique et matriciel des reconstructions cellulaires qui constitue un environnement de différenciation des CD plus physiologique. Il est bien connu que les CD générées in vitro présentent la capacité de maturer spontanément, ce qui est un problème majeur car des CD matures io ne sont plus activables et stimulables. Bien que les inventeurs maîtrisent l'état immature de ces cellules in vitro, l'utilisation directe de monocytes en tant que précurseurs de CL et de CDD permet de s'affranchir du risque de maturité spontanée in vitro. De même que l'utilisation avantageuse des modèles cellulaires ou tissulaires de culture selon l'invention comme système de is différenciation des monocytes CD14+ en CD est plus physiologique car il reproduit mieux les conditions de différenciation naturelles des CD dans la peau et les muqueuses et permet l'obtention de CD immatures comparables à leurs homologues in vivo. Dans ce même contexte, l'utilisation des monocytes CD14+ en tant que 20 précurseurs des CD, par opposition à l'utilisation de CD préalablement générées, permet de générer dans les présents modèles de culture des CL et CDD phénotypiquement plus immatures et fonctionnellement plus sensibles. En effet et dans ce contexte, les inventeurs ont démontré récemment que des CD dérivées de progéniteurs CD34+ puis cultivées dans un chorion reconstruit en 25 présence de cytokines exogènes présentent un état d'immaturité plus satisfaisant, en terme de réplication du virus HIV, que ses homologues cultivées en présence de cytokines exogènes (Sandy DUMONT et al., When integrated in a sub-epithelial mucosal layer equivalent, dendritic cells keep their immature stage and their ability to replicate type R5 HIV-1 strains in absence of T cell 2905380 Il subsets. AIDS Res. and Hum. Retroviruses 20 : 383-397, 2004). Les CD obtenues sont bien différentes de celles décrites antérieurement et notamment dans le brevet français FR 2 833 27181, déposée par Coletica le 10 décembre 2001. 5 De plus, l'utilisation directe de monocytes CD14+ en tant que précurseurs des CD de la peau est un processus plus physiologique comparativement au processus antérieurement décrit. En effet, in vivo dans l'organisme, les monocytes sanguins colonisent la peau où l'environnement cellulaire, cytokinique et matriciel contrôle leur différenciation. L'intégration de io CD préalablement différenciées dans les présents modèles de culture était une alternative intéressante qui est aujourd'hui moins satisfaisante que l'utilisation directe de leurs précurseurs que sont les monocytes CD14+. Cette amélioration du système se traduit immunohistologiquement par une répartition cellulaire plus homogène des CL et des CDD dans les présents modèles de culture is tridimensionnels. L'invention permet notamment de pouvoir congeler les monocytes fraîchement isolés avant leur utilisation dans les modèles . La présente invention permet de générer des cellules ayant sensiblement le même phénotype et les mêmes fonctions que leurs homologues in vivo. 20 La présente invention concerne notamment un précurseur cellulaire unique qui quand co-cultivé : - Dans un environnement épithélial se différencie phénotypiquement et/ou fonctionnellement en CL, - Dans un environnement conjonctif se différencie phénotypiquement et/ou 25 fonctionnellement en CDI, macrophages et cellules endothéliales. 2905380 12 DESCRIPTION DE L'INVENTION Ainsi, la présente invention concerne selon un premier aspect un procédé de préparation de CL, ou de CDI, ou de CL et de CDI, à partir de monocytes 5 CD14+ issus de sang circulant périphérique d'un être vivant, et notamment d'un être humain, comprenant la différenciation des monocytes CD14+ en CL, ou enCDI, ou en CL et CDI, par la mise en présence des monocytes CD14+ avec un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et/ou des cellules mésenchymateuses, telles que des 10 fibroblastes dermiques. Avantageusement, la différenciation des monocytes CD14+ permet l'obtention de CDI et de macrophages et de cellules endothéliales, ou de CL, de CDI, de macrophages et de cellules endothéliales. Avantageusement, la répartition de la population cellulaire des CL et des 15 CDI est fonction du type cellulaire qui est co-cultivé avec les monocytes. L'utilisation de kératinocytes favorise une différenciation en CL et l'utilisation de fibroblastes favorise une différenciation en CDI. Avantageusement, la différenciation des monocytes s'effectue sans ajout significatif de cytokine exogène. Selon un mode de réalisation, on n'ajoute pas 20 de cytokine exogène. Avantageusement, la culture des monocytes avec un environnement cellulaire épithélial, tel que des kératinocytes, favorise la différenciation des monocytes en CL immatures et fonctionnelles. Par immature , les inventeurs entendent notamment : qui n'expriment pas ou très faiblement des marqueurs 25 d'activation (CD80, CD86, CCR7) et des marqueurs de maturation (CD83, DCLAMP). Les CL immatures expriment par contre CCR6. Par fonctionnelles les inventeurs entendent notamment : dotées de capacités d'internalisation d'antigène (état immature), de migration cellulaire (état immature et activé), et de présentation antigénique (état mature). 2905380 13 Selon un mode de réalisation, la culture des monocytes avec un environnement cellulaire mésenchymateux, tel que des fibroblastes dermiques, favorise la différenciation des monocytes en CDI immatures et fonctionnelles. Il est fait référence à la définition ci-dessus, mais les CDI immatures n'expriment 5 pas CCR6. Avantageusement, la culture des monocytes avec un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques, favorise la différenciation des monocytes en CL et CDI typiques. Par typique , les lo inventeurs entendent : proches de leurs homologues in vivo en terme de phénotype immature et de fonctionnalité c'est-à-dire de leurs capacités à réagir après une stimulation, un stress, etc. La proportion de cellules épithéliales et/ou de cellules mésenchymateuse par rapport aux monocytes CD14+ utilisée pour la culture (pour la 1s différenciation) dépend de la répartition cellulaire entre les CL et/ou CDI et les cellules épithéliales et/ou les cellules mensenchymateuses que l'on souhaite obtenir. L'invention concerne selon un second aspect un procédé de culture de monocytes CD14+, le procédé de culture comprenant l'intégration dans un 20 modèle cellulaire ou tissulaire des monocytes CD14+ issus de sang circulant périphérique d'un être vivant, et notamment d'un être humain, ledit modèle cellulaire ou tissulaire comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes et/ou des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques, pour obtenir la différenciation des monocytes CD14+ au sein du 25 modèle en CL, ou en CDI, ou en CL et en CDI, par la culture des monocytes CD14+ en présence de cellules épithéliales, telles que des kératinocytes et/ou des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques . Avantageusement, la culture des monocytes s'effectue sans ajout de cytokine exogène. 2905380 14 Avantageusement, le modèle cellulaire ou tissulaire est choisi parmi le groupe consistant en un modèle d'épiderme, un modèle d'épithélium, un modèle de derme, un modèle de chorion, un modèle de peau, ou un modèle de muqueuse, en particulier de muqueuse gingivale ou vaginale. 5 Avantageusement, le modèle de culture tridimensionnel comprend un support matriciel dermique ou de chorion choisi parmi le groupe consistant en : - un gel ou un film à base de collagène ou de fibrine comprenant des cellules mésenchymateuses en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse qui est réalisée à partir de collagène pouvant contenir lo un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosan, ces matrices poreuses intégrant ou non des cellules mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes, - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose 15 semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de polytétrafluoroéthylène (téflon , PTFE), une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique de structure poreuse capillaire d'oxyde d'aluminium (membrane Anopore semi-perméable), d'acétate ou d'ester de 20 cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant ou non des cellules mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes. - un support inerte traité pour la culture à base de polycarbonate ou de polystyrène, ledit support inerte contenant ou non des cellules 25 mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes. Avantageusement, le modèle tissulaire utilisé comprend ledit support dermique ou de chorion sur lequel des cellules épithéliales ont été disposées en surface, en particulier des kératinocytes. 2905380 15 Avantageusement, le modèle cellulaire ou tissulaire comprend au moins un type cellulaire supplémentaire, par exemple des cellules nerveuses et/ou des cellules endothéliales et/ou des mélanocytes et/ou des lymphocytes et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, 5 des glandes sébacées. Avantageusement, une partie des monocytes CD14+ se différencie en cellules endothéliales et en macrophages, en particulier quand ils sont mis dans un modèle cellulaire ou tissulaire comprenant au moins des cellules mésenchymateuses. 10 Avantageusement, le procédé comprend principalement soit des CL, soit des CDI, soit un mélange de CL et de CDI, soit un mélange de CL, de CDI, de cellules endothéliales et de macrophages, soit un mélange de CDI, de cellules endothéliales et de macrophages. Avantageusement, le modèle cellulaire ou tissulaire comprend une partie 15 épithéliale et une matrice conjonctive et est caractérisé en ce que les CL sont localisées essentiellement dans la partie épithéliale, et en ce que les CDI, les macrophages et les cellules endothéliales sont localisés essentiellement dans la matrice conjonctive. L'invention concerne selon un troisième aspect un modèle cellulaire 20 comprenant au moins l'unedesdites populations de CL et/ou de CDI, et comprenant en outre éventuellement une population de macrophages et/ou de cellules endothéliales, susceptible d'être obtenu selon un procédé tel que défini précédemment. Ledit modèle est caractérisé en ce que les CD obtenues sont différentes 25 de celles obtenues selon les méthodes décrites antérieurement, les principales différences portant sur la synchronisation des étapes de différenciation cellulaires des CL et des CDI. L'invention concerne selon le quatrième aspect un modèle tissulaire, comprenant au moins l'une desdites populations de CL et/ou de CDI, et 2905380 16 comprenant en outre éventuellement une population de macrophages et/ou de cellules endothéliales, susceptible d'être obtenue selon un procédé tel que défini précédemment, ledit modèle tissulaire étant choisi parmi le groupe consistant en un modèle d'épiderme, un modèle d'épithélium, un modèle de 5 derme, un modèle de chorion, un modèle de peau, ou un modèle de muqueuse, en particulier de muqueuse gingivale ou vaginale. Avantageusement, le modèle cellulaire ou tissulaire décrit ci-dessus est immunocompétent. Avantageusement, le modèle tissulaire comprend une partie épithéliale lo comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et une matrice conjonctive comprenant des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques ou de chorion, ledit modèle étant caractérisé en ce que les CL sont localisés essentiellement dans la partie épithéliale, et en ce que les CDI, et les macrophages et/ou les cellules endothéliales présents, sont 1s localisées essentiellement dans la matrice conjonctive. Ledit modèle est caractérisé en ce que les CD obtenues sont différentes de celles obtenues selon les méthodes décrites antérieurement, les principales différences portant sur la répartition cellulaire plus homogène des CL et des CDD dans les présents modèles de culture tridimensionnels. 20 L'invention concerne selon un cinquième aspect des monocytes CD14+ congelés, isolés du sang circulant périphérique d'un être vivant, en particulier d'un être humain. L'invention permet en particulier de générer des populations de CD différentes, dont les différentes fonctionnalités permettent de rendre compte de 25 l'ensemble des phénomènes intervenant dans les processus d'infection/défense de l'organisme, tels que les phénomènes d'irritation, d'allergénicité et de sensibilisation. Ainsi l'invention concerne selon un sixième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, comme modèle 2905380 17 d'étude dans le domaine de la cosmétique, de la dermo-pharmacie, ou de la pharmacie, et/ou pour la sélection de principe actif. Une autre utilisation intéressante des CL et/ou des CDI consiste à les utiliser pour évaluer le potentiel irritant versus sensibilisant de nouvelles 5 molécules. La directive européenne 2003/15/CE, qui interdit depuis 2005 l'utilisation d'animaux pour évaluer la toxicité d'un produit fini cosmétique, incite fortement les laboratoires publics et industriels à développer des méthodes prédictives in vitro ou in silico pour la prédiction du potentiel sensibilisant de nouvelles molécules. Dans ce contexte, de par leur rôle clé dans le io déclenchement de l'allergie de contact, l'utilisation des CD cutanées comme méthode alternative à l'expérimentation animale constitue aujourd'hui un axe de développement. L'invention concerne selon un septième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, pour étudier les is phénomènes intervenant dans les processus d'infection/défense de l'organisme et l'activité, en particulier l'activité immunostimulante ou immunosuppressive, d'un principe actif ou pour évaluer ou pour induire une immuno-modulation (immuno-tolérance ou immuno-activation) par ledit principe actif, ou pour réaliser des tests in vitro de prédictivité du pouvoir 20 allergisant/irritant/sensibilisant d'agents extérieurs ou pour étudier la toxicité de molécules ou produits chimiques. L'invention concerne selon un huitième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, pour étudier la physiopathologie des barrières épithéliales ; l'irritation de la peau et des 25 muqueuses ; les agressions d'ordre biologique telles que par exemple les virus, les rétrovirus, tel que HIV, les bactéries, les moisissures, les microorganismes, les antigènes particulaires ; la phototoxicité ; la photo-protection ; l'effet de principes actifs, en particulier cosmétiques ou pharmaceutiques ; l'effet de produits finis, en particulier produits cosmétiques ou pharmaceutiques ; l'effet 2905380 18 de molécules ou produits chimiques ; les mécanismes d'infection par un agent pathogène. Avantageusement, cette utilisation concerne la recherche de toxicité de principes actifs ou d'autres substances. Notamment cette recherche s'effectue 5 par l'étude de marqueurs cellulaires, y compris notamment ceux des CD. L'invention concerne selon un neuvième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, pour étudier les mécanismes impliqués dans les phénomènes d'infection, de réplication et de transmission des virus, incluant les rétrovirus comme HIV, ou pour rechercher io et mettre au point des méthodes alternatives thérapeutiques, incluant l'administration de vaccins ou de médicaments. L'invention concerne selon un dixième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, pour détecter la présence d'un agent pathogène tel que par exemple des virus, rétrovirus, tel is que HIV, des bactéries, des moisissures, des microorganismes, des antigènes particulaires. L'invention concerne selon un onzième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire ou tissulaire tel que défini précédemment, pour une application médicale, biomédicale, ou cosmétique, en particulier pour moduler 20 la réponse immunitaire ou de tolérance in vitro ou in vivo, suite à une agression environnementale, en particulier du type physique, tel qu'une irradiation UV, chimique, tel que des agents irritants/allergisants/sensibilisants, biologique, en particulier dans un but thérapeutique préventif ou curatif. L'invention concerne selon un douzième aspect l'utilisation d'au moins un modèle cellulaire 25 ou tissulaire tel que défini précédemment, pour des applications d'ingénierie cellulaire ou tissulaire, pour des applications médicales ou biomédicales, par exemple en thérapie cellulaire anti-cancer, par exemple par une injection de CD capables de stimuler la réponse immune ; par exemple en thérapie cellulaire dans le cas de maladie auto-immune, par exemple par la création d'une 2905380 19 stimulation d'immunotolérance, par exemple en produisant des cellules T anergiques ; par exemple en thérapie génique de maladie touchant le système immunitaire ; ou pour la mise au point et la réalisation de vaccins. L'invention concerne selon un treizième aspect un procédé de fabrication 5 d'un modèle tissulaire comprenant : - l'isolation de monocytes CD14+ à partir de sang circulant périphérique d'un être vivant, - l'ensemencement de cellules cutanées ou de muqueuse, sur un support et leur culture dans un milieu nutritif pour obtenir un tissu reconstruit, 10 - l'ensemencement dans le tissu reconstruit des monocytes CD14+ de manière simultanée ou non avec les cellules cutanées ou de muqueuse, - la culture du tissu reconstruit comprenant les monocytes CD14+ et les cellules cutanées ou de muqueuse dans des conditions permettant la différenciation des monocytes CD14+ en CL, en mélange de CDI, de cellules endothéliales et de 1s macrophages , en mélange de CL, de CDI, de cellules endothéliales et de macrophages, les cellules cutanées étant des kératinocytes épidermiques quand le tissu reconstruit est un modèle d'épiderme, les cellules cutanées étant des fibroblastes dermiques quand le tissu reconstruit est un modèle de derme, les cellules de muqueuse étant des cellules épithéliales de muqueuse quand le tissu 20 reconstruit est un modèle d'épithélium, les cellules de muqueuse étant des fibroblastes de muqueuse quand le tissu reconstruit est un modèle de chorion. Les cellules épithéliales sont par exemple isolées à partir d'au moins un tissu cutané. On peut effectuer l'ensemencement des cellules cutanées ou de 25 muqueuses avant ou après l'ensemencement des monocytes CD14+. De préférence, l'ensemencement des monocytes CD14+ est effectué simultanément avec l'ensemencement des cellules cutanées ou de muqueuses. L'invention concerne selon un quatorzième aspect un procédé de fabrication d'une peau reconstruite ou d'une muqueuse reconstruite 2905380 20 comprenant une partie épithéliale comprenant des kératinocytes ou des cellules épithéliales de muqueuse, éventuellement en présence de cellules de Merkel et/ou de mélanocytes, et une matrice conjonctive comprenant des fibroblastes dermiques ou de muqueuse, ledit procédé comprenant: 5 -l'ensemencement et la culture dans un milieu nutritif de kératinocytes ou de cellules épithéliales de muqueuse, éventuellement en présence de cellules de Merkel et/ou de mélanocytes, à la surface d'un modèle de derme ou de chorion comprenant des CDI, et éventuellement des cellules endothéliales et des macrophages, ledit modèle de derme ou de chorion étant susceptible d'être io obtenu par un procédé de fabrication d'un modèle de derme ou de chorion tel que défini ci-dessus, - l'ensemencement et la culture, de manière simultanée ou non avec les kératinocytes ou les cellules épithéliales de muqueuse, de monocytes CD14+ isolés de sang circulant périphérique d'un être vivant en présence des 15 kératinocytes ou des cellules épithéliales de muqueuse dans des conditions permettant la différenciation des monocytes CD14+ en CL. Avantageusement, les cellules sont des cellules d'un être humain. De préférence ces procédés de fabrication de modèles tissulaires ne comprennent pas d'ajout de cytokine exogène. 20 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute 25 caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. 5 2905380 21 D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLES Exemple 1 : Procédés de séparation des monocytes à partir du sang circulant périphérique 10 Le sang circulant périphérique a été récolté par prise de sang veineux sur un ou plusieurs donneurs humains, de préférence dans des vacutainers ou des poches supplémentées en produits anti-coagulants habituels tels que le lithium héparine. La séparation des monocytes à partir du sang circulant peut être réalisée 15 avantageusement selon les protocoles suivants : 1/ Après centrifugation du sang sur un milieu de séparation lymphocytaire, les cellules mononucléées sont récupérées, puis : - Soit marquées avec un cocktail d'anticorps, tel que par exemple des anticorps anti-CD3, anti-CD7, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD56, anti-CD123, 20 anti-Glycophorin A couplés à des billes magnétiques. Après passage sur une colonne aimantée, seuls les monocytes non marqués sont élués et récupérés. - Soit marquées avec un anticorps spécifique des monocytes, tel qu'un anticorps anti-CD14 couplé à des billes magnétiques. Après passage sur 25 colonne magnétique, seuls les monocytes marqués sont retenus dans la colonne. Après élution de la colonne, les monocytes marqués sont récupérés. - Soit marquées avec un anticorps spécifique des monocytes, tel qu'un anticorps anti-CD16 couplé à un fluorochrome, tel que la phycoérythrine. 2905380 22 Après un tri cellulaire en cytométrie en flux, seuls les monocytes marqués sont récupérés. 2/ Les monocytes sont récupérés en procédant par tout procédé physique de séparation bien connu de l'homme de l'art et notamment par sédimentation ou 5 centrifugation et sont élués tels quels pour les cultures ultérieures. 3/ Pour 100 mL de sang prélevé, on extrait jusqu'à environ 150 millions ( 20 millions) de cellules mononucléées et on purifie jusqu'à 40 millions de monocytes. io Exemple 2 : Procédé de congélation des monocytes isolés du sang circulant périphérique Les monocytes, tels qu'obtenus à l'exemple 1, sont suspendus dans un milieu nutritif, par exemple le milieu RPMI, supplémenté avec du sérum et un cryoprotectant, tel que le DMSO (Dimethyl sulfoxide), puis congeler. is Lors de la décongélation des monocytes, la mortalité cellulaire est de moins de 30%. Pour 100 mL de sang circulant périphérique prélevé, on congèle jusqu'à 80.106 monocytes, et on récupère après décongélation jusqu'à 76.106 de monocytes. 20 Exemple 3 : Modèle pluricellulaire en monocouche de kératinocytes et de CL en co-culture Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. 1 à 2.106 kératinocytes humains et 1 à 2.106 monocytes humains 25 (obtenus selon l'exemple 1 ou 2) sont co-cultivés dans un milieu nutritif, par exemple de type K-SFM, dans des boîtes de culture, par exemple de type plaque 6 puits. La co-culture est maintenue pendant 6 jours dans un milieu nutritif, par exemple de type K-SFM, sans ajout de cytokine exogène. 2905380 23 Les cellules sont ensuite récupérées par un procédé enzymatique bien connu de l'homme de l'art et notamment par trypsination. 2.105 cellules de la suspension cellulaire mixte composée de kératinocytes et de monocytes sont incubées avec un anticorps monoclonal anti-Langerine, puis analysées en 5 cytométrie de flux. Nous visualisons jusqu'à 40% de CL Langerine+. Exemple 4 : Modèle pluricellulaire en monocouche de fibroblastes et de CDD en co-culture Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. 10 1 à 2.106 fibroblastes humains et 1 à 2.106 monocytes humains (obtenus selon l'exemple 1 ou 2) sont co-cultivés dans un milieu nutritif, par exemple de type FBM, dans des boîtes de culture, par exemple de type plaque 6 puits. La co-culture est maintenue pendant 6 jours dans un milieu nutritif, par exemple de type FBM, sans ajout de cytokine exogène. is Les cellules sont ensuite récupérées par un procédé enzymatique bien connu de l'homme de l'art et notamment par trypsination. 2.105 cellules de la suspension cellulaire mixte composée de fibroblastes et de monocytes sont incubées avec un anticorps monoclonal anti-DC-SIGN, puis analysées en cytométrie de flux. Nous visualisons jusqu'à 60% de CDD DC-SIGN+. 20 Exemple 5 : Utilisation des modèles pluricellulaires en monocouche décrits aux exemples 3 et 4 pour étudier le profil des cytokines sécrétées sous l'effet d'un principe actif Pour évaluer le potentiel irritant, sensibilisant, allergisant et juger d'une 25 éventuelle activité pro- ou anti-inflammatoire d'un principe actif destiné à la peau humaine, nous quantifions dans les surnageants de culture la sécrétion de cytokines, par exemple IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a INFy, selon le protocole suivant : - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 3 ou 4. 2905380 24 - Du rétinol est ensuite ajouté dans le milieu de culture à une concentration finale de 0,05% pendant 3 jours. - Les surnageants de culture sont ensuite récupérées et analysés. On observe que le rétinol entraîne une stimulation de sécretion des cytokines 5 pro-inflammatoires. Exemple 6 : Utilisation des modèles pluricellulaires en monocouche décrits aux exemples 3 à 4 pour étudier l'activité immunoactivatrice ou immunosuppressive d'un principe actif io Pour évaluer la capacité des CL et des CDD à induire ou non des réponses immunes et/ou tolérogéniques vis-à-vis d'un principe actif, nous avons étudié leur profil phénotypique par cytométrie en flux, selon le protocole suivant : -Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 3 ou 4. 15 -Le principe actif est ensuite ajouté dans le milieu de culture à différentes concentrations et pendant 3 jours. - Les cellules sont ensuite récupérées par trypsination. 2.105 cellules de la suspension cellulaire mixte composée soit de kératinocytes et de CL ou soit de fibroblastes et de CDD sont incubées avec une batterie d'anticorps : anti- 20 CCR7, anti-HLA-DR, anti-CD80, anti-CD83, anti-CD86, anti-DC-LAMP. Le phénotypage cellulaire permet d'établir le profil immunoactivateur (induction et/ou augmentation de l'expression des molécules marquées) ou immunosuppresseur (inhibition et/ou suppression de l'expression des molécules 25 marquées) des principes actifs testés. 2905380 25 Exemple 7 : Utilisation des modèles pluricellulaires en monocouche décrits aux exemples 3 à 4 pour étudier l'activité immunomodulatrice d'un principe actif L'effet immunomodulateur d'un principe actif après un stress irritant, sensibilisant ou allergisant est étudié selon le protocole suivant : 5 - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 3 ou 4. - On ajoute ensuite 300 pl de TNP (acide 2,4,6 trinitrobenzène-sulfonique) à une concentration de 5 mM pendant 30 minutes à 37 C. - Après cette stimulation, les principes actifs testés à différentes concentrations sont ajoutés dans le milieu de culture pendant 2 jours. 10 - Les milieux de culture comprenant les cellules sont ensuite récupérés pour étudier la sécrétion de cytokines immunes, par exemple IL-12 ; les cellules sont récupérées puis incubées soit avec un anticorps anti-Langerine ou soit avec un anticorps anti-DC-SIGN afin de trier les CL ou les CDD en cytométrie de flux, respectivement. 15 - Les CL ou les CDD triées sont ensuite ensemencées dans des chambres de migration de type Boyden (porosité de la membrane de 5 à 8 pm recouverte ou non de MATRIGELTM) puis incubées jusqu'à 72 h à 37 C. - Le nombre de CL ou CDD ayant migré est quantifié, par exemple, par numération en microscopie optique. 20 Les résultats des tests de migration et/ou de la synthèse et sécrétion d'IL- 12 permettent d'établir le profil immunomodulateur des principes actifs testés. Exemple 8 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel d'épiderme reconstruit 25 contenant des CL Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - 0,5 à 1.106 kératinocytes de peau humaine normale sont ensemencés dans des inserts de type chambre de Boyden (membrane de porosité 0,4 pm) 2905380 26 puis cultivés dans un milieu nutritif, par exemple de type DMEM-Glutamax supplémenté avec du sérum de veau, acide ascorbique et de préférence à une concentration finale de 1 mM, EGF (facteur de croissance épidermique) et de préférence à une concentration finale de 10 ng/mL, hydrocortisone et 5 de préférence à une concentration finale de 0,4 pg/mL, umuline et de préférence à une concentration finale de 0,12 UI/mL, isuprel et de préférence à une concentration finale de 0,4 pg/mL, triiodothyronine et de préférence à une concentration finale 2.10-9 M, adénine et de préférence à une concentration finale de 24,3 pg/mL, Normocin et de préférence à une io concentration finale de 100 pg/mL, pendant 2 jours. - Puis 1 à 5.104 monocytes sont ensemencés à la surface de l'équivalent épithélial lequel est cultivé pendant une période de 2 jours supplémentaires. - Les cultures sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 10 jours supplémentaires dans le même milieu utilisé pour la culture en immersion, is excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'umuline, l'isuprel et la triiodothyronine. - Les cultures sont ensuite enrobées dans une résine amorphe, comme le Tissue-Teck , et directement congelées dans l'azote liquide. - Des études immunohistochimiques sont ensuite réalisées sur des coupes 20 histologiques afin de caractériser les types cellulaires à l'aide d'anticorps spécifiques. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence de CL (cellules Langerine+). 25 Conclusion Les monocytes intégrés dans le modèle d'épiderme reconstruit se différencient en CD de type CL comme démontré par la visualisation de la lectine Langerine. 2905380 27 Exemple 9 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel d'épiderme reconstruit pigmenté et/ou nerveux contenant des CL Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 8, en co-5 ensemençant simultanément 0,5 à 1.105 mélanocytes et/ou cellules de Merkel issus de peau humaine normale avec les kératinocytes. On réalise, en plus des marquages décrits à l'exemple 8, un marquage des mélanocytes (HMB45) et une DOPA réaction pour mettre en évidence la mélanine, ainsi qu'un marquage avec un anticorps anti-kératine 20 pour 10 identifier les cellules de Merkel. Conclusion Les monocytes intégrés dans le modèle d'épiderme reconstruit pigmenté et/ou nerveux se différencient en CD de type CL comme démontré par la is visualisation de la lectine Langerine. Exemple 10 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel d'épithélium de muqueuses reconstruites gingivale et vaginale contenant des CL Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. 20 Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 8 avec les modifications suivantes: - Les kératinocytes humains normaux sont remplacés par des cellules épithéliales de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales. - Le pourcentage de sérum dans le milieu de culture est de 1%. 25 - La culture est réalisée totalement en immersion dans le milieu. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence de CL (cellules Langerine+). 2905380 28 Conclusion Les monocytes intégrés dans le modèle d'épithélium de muqueuses reconstruites gingivales et vaginales se différencient en CD de type CL comme démontré par la visualisation de la lectine Langerine. 5 Exemple 11 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite Ce modèle est l'association d'une culture d'un derme reconstruit sur laquelle est ensuite réalisée une culture supplémentaire d'un épiderme reconstruit. io Le modèle de derme reconstruit est réalisé selon le protocole suivant : -0,5 à 1.106 fibroblastes de peau humaine normale sont ensemencés sur un substrat matriciel à base de collagène réticulé au diphényl-phosphoryl-azide, puis cultivés dans un milieu nutritif, par exemple DMEM-Glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau, acide ascorbique et de 15 préférence à une concentration finale de 1 mM, EGF (facteur de croissance épidermique) et de préférence à une concentration finale de 10 ng/mL, Normocin et de préférence à une concentration finale de 100 pg/mL, pendant 14 jours. 20 Le modèle de peau reconstruit est réalisé selon le protocole suivant : - 0,5 à 1.106 kératinocytes humains normaux sont ensemencés sur l'équivalent dermique, puis cultivés dans un milieu nutritif, par exemple DMEM-Glutamax/Ham F-12 (ratio 3/1 v/v) supplémenté avec du sérum de veau, acide ascorbique et de préférence à une concentration finale de 1 25 mM, EGF (facteur de croissance épidermique) et de préférence à une concentration finale de 10 ng/mL, hydrocortisone et de préférence à une concentration finale de 0,4 pg/mL, umuline et de préférence à une concentration finale de 0,12 UI/mL, isuprel et de préférence à une concentration finale de 0,4 pg/mL, triiodothyronine et de préférence à une 2905380 29 concentration finale 2.10-9 M, adénine et de préférence à une concentration finale de 24,3 pg/mL, Normocin et de préférence à une concentration finale de 100 pg/mL. La culture est poursuivie pendant 7 jours en condition immergée. 5 Les cultures sont ensuite placées à l'interface air-liquide pendant 14 jours supplémentaires dans le même milieu que la culture en immersion, excepté le sérum de veau, l'hydrocortisone, l'isuprel, la triiodothyronine et l'umuline. Conclusion io Nous sommes capables de reconstruire in vitro les 2 compartiments cellulaires de la peau que sont l'épiderme et le derme. Exemple 12 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de derme reconstruit contenant des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales is Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. La culture du derme reconstruit est réalisée selon l'exemple 11. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - 1 à 5.104 monocytes sont ensemencés à la surface de l'équivalent dermique lequel est cultivé pendant une période de 7 jours supplémentaires. 20 - Les cultures sont ensuite enrobées dans une résine amorphe, comme le Tissue-Teck , puis directement congelées dans l'azote liquide. - Des études immunohistochimiques sont réalisées sur des coupes histologiques afin de caractériser les types cellulaires présents à l'aide d'anticorps spécifiques. 25 - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CDD (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+). 2905380 Conclusion Les monocytes intégrés puis cultivés dans notre modèle de derme reconstruit sont capables de se différencier simultanément en CD de type CDD, en macrophages et cellules endothéliales. 5 Exemple 13 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de chorion reconstruit contenant des CDI, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 12 avec les io modifications suivantes: - Les fibroblastes sont des fibroblastes issus de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CDI (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules 15 endothéliales (cellules CD31+ et CD36+). Conclusion Les monocytes intégrés puis cultivés dans notre modèle de chorion reconstruit de type gingival et vaginal sont capables de se différencier 20 simultanément en CD de type CDI, en macrophages et cellules endothéliales. Exemple 14 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite contenant des LC Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. 25 La culture du modèle de peau reconstruite est réalisée selon l'exemple 11. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - 1 à 5.104 monocytes sont co-ensemencées avec les kératinocytes sur l'équivalent dermique. 2905380 31 - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence de CL (cellules Langerine+ et granules de Birbeck+) dans le compartiment épidermique des cultures. 5 Conclusion Les monocytes cultivés avec les kératinocytes dans notre modèle de peau reconstruite se différencient en CD de type CL. Exemple 15 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite lo pigmentée et/ou nerveuse contenant des LC Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. La culture du modèle de peau reconstruite contenant des CL est réalisée selon l'exemple 14. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : 15 - 1 à 5.104 mélanocytes et/ou cellules de Merkel issus de peau humaine normale sont co-ensemencés avec les kératinocytes et les monocytes sur le derme reconstruit. - On réalise, en plus des marquages décrits à l'exemple 14, un marquage des mélanocytes (HMB45) et une DOPA réaction afin de mettre en évidence la 20 mélanine, ainsi qu'un marquage avec un anticorps anti-kératine 20 pour identifier les cellules de Merkel Conclusion Les monocytes cultivés avec les kératinocytes, les mélanocyteset/ou les 25 cellules de Merkel dans notre modèle de peau reconstruite se différencient en CD de type CL. 20 2905380 32 Exemple 16 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de muqueuses reconstruites contenant des LC Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 14 avec les s modifications suivantes: - Les kératinocytes sont remplacés par des cellules épithéliales de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales, et les fibroblastes sont des fibroblastes issus de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales. - Le pourcentage de sérum de veau dans le milieu de culture pour l'étape 10 d'épithélialisation est de 1%. - La culture est réalisée totalement en immersion dans le milieu. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence de CL (cellules Langerine+ et granules de Birbeck+) dans le compartiment épithélial des cultures. 15 Conclusion Les monocytes cultivés avec des cellules épithéliales de type gingival ou vaginal dans notre modèle de muqueuse reconstruite se différencient en CD de type CL. Exemple 17 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite contenant des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. La culture du modèle de peau reconstruite est réalisée selon l'exemple 25 11. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - 1 à 5.104 monocytes sont ensemencés à la surface de l'équivalent dermique lequel est cultivé pendant une période de 7 jours supplémentaires. 2905380 33 Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CDD (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+). 5 Conclusion Les monocytes intégrés puis cultivés dans le compartiment dermique du modèle de peau reconstruite se différencient simultanément en CD de type CDD, en macrophages et en cellules endothéliales. io Exemple 18 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite pigmentée et/ou nerveuse contenant des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 17, en coensemençant simultanément 1 à 5.104 mélanocytes et/ou cellules de Merkel is issus de peau humaine normale avec les kératinocytes. On réalise, en plus des marquages décrits à l'exemple 17, un marquage des mélanocytes (HMB45) et une DOPA réaction afin de mettre en évidence la mélanine, ainsi qu'un marquage avec un anticorps anti-kératine 20 pour 20 visualiser les cellules de Merkel. Conclusion Les monocytes intégrés puis cultivés dans le compartiment dermique du modèle de peau reconstruite pigmentée et/ou nerveuse se différencient 25 simultanément en CD de type CDD, en macrophages et en cellules endothéliales. 2905380 34 Exemple 19 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de muqueuses reconstruites contenant des CDI, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 17 avec les 5 modifications suivantes: - Les kératinocytes sont remplacés par des cellules épithéliales de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales, et les fibroblastes sont des fibroblastes issus de muqueuses gingivales et vaginales humaines normales. - Le pourcentage de sérum de veau dans le milieu de culture pour l'étape 10 d'épithélialisation est de 1%. - La culture est réalisée totalement en immersion dans le milieu. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CDI (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+). 15 Conclusion Les monocytes intégrés puis cultivés dans le compartiment conjonctif du modèle de muqueuse reconstruite de type gingival et vaginal se différencient simultanément en CD de type CDI, en macrophages et en cellules 20 endothéliales. Exemple 20 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite contenant des CL, des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. 25 Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - Le modèle de derme reconstruit contenant des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales est réalisé selon l'exemple 12. - Le modèle de peau reconstruite contenant des CL est réalisé selon l'exemple 14. 2905380 Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CL (cellules Langerine+ et granules de Birbeck+) dans le compartiment épidermique des cultures, et de CDD (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+) 5 dans le compartiment dermique des cultures. Conclusion Les monocytes cultivés successivement dans le compartiment dermique puis avec des kératinocytes dans le modèle de peau reconstruite se io différencient en CD de type CL dans le compartiment épidermique et simultanément en CD de type CDD, en macrophages et en cellules endothéliales dans le compartiment dermique. Exemple 21 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite 15 pigmentée et/ou nerveuses contenant des LC, des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : 20 - Le modèle de derme reconstruit contenant des CDD, des macrophages et des cellules endothéliales est réalisé selon l'exemple 12. - Le modèle de peau reconstruite pigmentée et/ou nerveuse contenant des CL est réalisé selon l'exemple 15. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CL 25 (cellules Langerine+ et granules de Birbeck+) dans le compartiment épidermique des cultures, et de CDD (cellules DC-SIGN+), de macrophages (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+) dans le compartiment dermique des cultures. 2905380 36 Conclusion Les monocytes cultivés successivement dans le compartiment dermique puis simultanément avec des kératinocytes, des mélanocytes et/ou des cellules de Merkel dans le modèle de peau reconstruite pigmenté et/ou nerveuse se 5 différencient en CD de type CL dans le compartiment épidermique et simultanément en CD de type CDD, en macrophages et en cellules endothéliales dans le compartiment dermique. Exemple 22 : Modèle pluricellulaire tridimensionnel de muqueuses reconstruites io contenant des CL, des CDI, des macrophages et des cellules endothéliales Obtention des monocytes : voir exemple 1 ou 2. Le modèle est réalisé selon le protocole suivant : - Le modèle de chorion reconstruit contenant des CDI, des macrophages et des cellules endothéliales est réalisé selon l'exemple 13. 15 - Le modèle de muqueuse reconstruite contenant des CL est réalisé selon l'exemple 16. - Les marquages réalisés mettent en évidence la présence simultanée de CL (cellules Langerine+ et granules de Birbeck+) dans le compartiment épithéliale, et la présence de CDI (cellules DC-SIGN+), de macrophages 20 (cellules CD68+) et de cellules endothéliales (cellules CD31+ et CD36+) dans le compartiment conjonctif des cultures. Conclusion Les monocytes cultivés successivement dans le compartiment conjonctif 25 puis avec des cellules épithéliales dans le modèle de muqueuse reconstruite de type gingival ou vaginal se différencient en CD de type CL dans le compartiment épithélial et simultanément en CD de type CDI, en macrophages et en cellules endothéliales dans le compartiment conjonctif. 2905380 37 Exemple 23 : Utilisation du Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite décrit à l'exemple 20 pour étudier l'influence d'un rayonnement UV solaire Pour étudier l'influence de divers facteurs environnementaux, et en 5 particulier le rayonnement UV solaire, nous avons évalué la migration et le profil phénotypique des CL et CDD dans le modèle de peau reconstruite par des études immunohistochimiques, selon le protocole suivant : - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 20 - Au 42ème jour de culture, les peaux reconstruites sont irradiées, par exemple io à une dose unique de 526 kJ/cm2 d'énergie solaire correspondant à 2 J/cm2 d'UVA et 0,5 J/cm2 d'UVB (irradiateur solaire Suntest CPS+, ATLAS). Les cultures sont poursuivies pendant 2 jours supplémentaires. - Les études immunohistochimiques sont ensuite réalisées avec une batterie d'anticorps (anti-CD1a, anti-CD80, anti-CD83, anti-CD86, anti-CCR7, anti-15 DC-LAMP, anti-DC-SIGN, anti-Langerine, anti-HLA-DR) afin de visualiser la migration des CL et CDD et de caractériser leur état phénotypique. Après irradiation UV solaire, on observe une migration des CL dans le compartiment dermique des cultures ainsi qu'une acquisition de l'expression du 20 récepteur CCR7 sur les CL et CDD. De plus, seules les CL qui ont migré dans le compartiment dermique expriment le marqueur de maturation DC-LAMP. Conclusion Notre modèle pluricellulaire est donc prédictif d'un stress UV de par le 25 ciblage des CL et CDD qui présentent une capacité de migration, d'activation et de maturation. 2905380 38 Exemple 24 : Utilisation du Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite décrit à l'exemple 20 pour étudier l'efficacité de principes actifs Pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire de principes actifs destinés à la peau humaine, nous quantifions dans les surnageants de culture la sécrétion 5 de cytokines pro-inflammatoires, par exemple IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alpha et INF-gamma, selon le protocole suivant : - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 20. - Au 42ème jour de culture, les peaux reconstruites sont irradiées, par exemple à une dose unique de 526 kJ/cm2 d'énergie solaire correspondant à 2 J/cm2 io d'UVA et 0,5 J/cm2 d'UVB (irradiateur solaire Suntest CPS+, ATLAS). - Ensuite, 8 pl d'une formulation cosmétique contenant ou non un actif antioxydant à 3%, par exemple Flavagrum (Hesperitine Laurate, ENGELHARD) et Flavenger (Quercitine Caprylate, ENGELHARD), sont appliqués sur les peaux reconstruites pendant 10 jours. 15 - En fin de traitement, les peaux reconstruites sont cultivées pendant 48 h supplémentaires dans le milieu d'émersion puis l'efficacité du traitement antioxydant est évaluée par : 1/ une analyse de la viabilité cellulaire (test au MTT - methylthiazoletetrazolium), 2/ un dosage par cytométrie de flux (CBA û Cytometric Bead Array) de la sécrétion de cytokines dans les surnageants 20 de culture. Peau reconstruite Peau reconstruite Peau reconstruite Peau reconstruite Témoin Irradiée UV Irradié UV + Flavagrum Irradié UV + Flavenger MU (viabilité) 100% 76% 88% 92% IL1I3 (pg/mL) 76 179 125 97 IL6 (pg/mL) 379 649 452 426 IL8 (pg/mL) 275 395 312 294 TNFa (pg/mL) 53 152 105 89 2905380 39 Les méthodes de l'invention permettent de voir que le stress UV solaire induit une diminution de la viabilité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la synthèse d'interleukines pro-inflammatoires. Il est donc être intéressant de limiter cette synthèse de molécules pro-inflammatoires ainsi que la mortalité 5 cellulaire en utilisant des principes actifs sélectionnés correctement. Parmi les principes actifs criblés, deux d'entre eux, Flavagrum et Flavenger, ont démontré une efficacité capable de tendre à la restauration du niveau de référence pour ces deux paramètres. io Exemple 25 : Utilisation du Modèle pluricellulaire tridimensionnel de peau reconstruite décrit à l'exemple 14, 17 et 20 pour étudier l'activité immunostimulante ou immunosuppressive d'un principe actif Pour évaluer la capacité des CL et/ou des CDD à induire ou non des réponses immunes et/ou tolérogéniques vis-à-vis d'un principe actif, nous avons 15 étudié la fonctionnalité de ces cellules à stimuler la prolifération de lymphocytes T naïfs allogéniques, selon le protocole suivant : - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 14, 17 et 20. - Au 42ème jour de culture, soit le principe actif est appliqué directement sur les peaux reconstruites à l'aide d'un coton-tige (application topique), soit le 20 principe actif est introduit dans le milieu de culture (application systémique), pendant 10 jours. - A la fin du traitement, les cultures sont digérées successivement par des traitements enzymatiques de 2 h à 37 C à la trypsine (1 mg/mL) et à la collagénase (1 mg/mL) afin de récupérer les CL et/ou les CDD. 25 - Les CL et/ou les CDD sont cultivées pendant 3 jours avec des lymphocytes T naïfs allogéniques dans un milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum humain AB. Une gamme de CL et/ou de CDD comprise entre 125 et 8000 cellules est effectuée et cultivée avec 105 lymphocytes T naïfs. Au 2905380 3ème jour de la culture mixte lymphocytaire, 20 pl de thymidine tritée à 5 mCi sont ajoutés pendant une période de 18 h. - Les résultats sont exprimés sur un graphe portant en abscisse le nombre de CL et/ou de CDD et en ordonnée l'incorporation de la thymidine tritiée dans 5 les lymphocytes T naïfs allogéniques exprimées en cpm (coup par minute). Nombre de CL ou CDD CPM (non traité) CPM (actif) 125 500 500 250 800 1500 500 1000 10000 1000 1500 22500 2000 2300 39850 4000 2800 47250 6000 3000 52500 8000 3800 55000 Après traitement avec notre actif X, les CL et/ou les CDD stimulent fortement la prolifération des lymphocytes T (entre 5.104 et 7.104 cpm) comparativement 10 aux CL et/ou CDD non traitées qui induisent seulement une faible prolifération des lymphocytes T naïfs (entre 1.103 et 4.103 cpm). Exemple 26 : Utilisation des modèles pluricellulaires tridimensionnels pour réaliser un criblage de principes actifs capables de moduler les réactions is allergiques L'effet immunomodulateur d'un principe actif après induction d'un stress irritant, sensibilisant et allergisant est étudié selon le protocole suivant : - Le modèle est réalisé selon le protocole décrit à l'exemple 12. - Après 21 jours de culture, l'irritant SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) de 20 préférence à la concentration finale de 2% et le sensibilisant DNCB (1,4- 2905380 41 chloro-dinitrobenzène) de préférence à la concentration finale de 0,25% sont introduits dans le milieu de culture pendant 24 h. - Ensuite, 100 pl d'une formulation cosmétique contenant ou non un actif apaisant, à la concentration finale de 3%, sont introduits dans le milieu de 5 culture des dermes équivalents pendant 3 jours. - En fin de traitement, les surnageants de culture sont récupérées pour doser, par exemple l'IL-10 et l'IL-12, et une étude immunohistochimique est développée avec une batterie d'anticorps : anti-CD80, anti-CD83, anti-CD86, anti-CCR7, anti-DC-LAMP, anti-HLA-DR. 10 Les résultats de la sécrétion d'IL-10 et d'IL-12 et de l'étude phénotypique des CDD par immunohistochimie permettent d'établir le profil immunomodulateur des principes actifs testés. 15 Conclusion Notre modèle pluricellulaire est donc un outil prédictif qui permet d'évaluer l'effet immunomodulateur potentiel d'un principe actif de par le ciblage des CDD qui présentent des capacité de sécrétion de cytokine, d'activation et de maturation. 20 REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation de cellules de Langerhans (CL), ou de cellules dendritiques dermiques/interstitielles (CDI), ou de CL et de CDI à partir de monocytes CD14+ issus de sang circulant périphérique d'un être vivant, et notamment d'un être humain, ledit procédé comprenant la mise en présence des monocytes CD14+ avec un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales telles que des kératinocytes et/ou des cellules mésenchymateuses telles que des fibroblastes dermiques pour la différenciation ]o des monocytes CD14+ en CL ou CDI ou en CL et CDI . 2. Procédé, selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé comprend la mise en présence des monocytes CD14+ avec un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales tels que des kératinocytes et/ou 15 des cellules mésenchymateuses telles que des fibroblastes dermiques pour la différenciation des monocytes CD14+ en CDI, et macrophages et/ou cellules endothéliales; ou en CL, CDI, macrophages et cellules endothéliales. 3. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé 20 en ce que la différenciation des monocytes CD14+ s'effectue sans ajout de cytokine exogène. 4. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en présence des monocytes avec un environnement cellulaire 25 épithélial, tel que des kératinocytes, favorise la différenciation des monocytes en CL immatures et fonctionnelles. 2905380 25 43 FR0653567 du 18-01-07 5. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en présence des monocytes avec un environnement cellulaire mésenchymateux, tel que des fibroblastes dermiques, favorise la différenciation des monocytes en CDI immatures et fonctionnelles. 5 6. Procédé, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en présence des monocytes avec un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques, favorise la lo différenciation des monocytes en CL et CDI typiques. 7. Procédé de culture de monocytes CD14+, le procédé de culture comprenant l'intégration dans un modèle cellulaire ou tissulaire des monocytes CD14+ issus de sang circulant périphérique d'un être vivant, et notamment d'un être 15 humain, ledit modèle cellulaire ou tissulaire comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et/ou des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques, pour obtenir la différenciation des monocytes CD14+ au sein du modèle en CL, ou en CDI, ou en CL et en CDI , par la culture des monocytes CD14+ en présence de cellules épithéliales, telles 20 que des kératinocytes et/ou des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques. 8. Procédé, selon la revendication 7, caractérisé en ce que la culture des monocytes CD14+ s'effectue sans ajout de cytokine exogène. 9. Procédé, selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le modèle cellulaire ou tissulaire est choisi parmi le groupe consistant en un modèle 2905380 44 FR0653567 du 18-01-07 d'épiderme, un modèle d'épithélium, un modèle de derme, un modèle de chorion, un modèle de peau, et un modèle de muqueuse. 10. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce 5 que le modèle de culture cellulaire ou tissulaire comprend un support matriciel dermique ou de chorion choisi parmi le groupe consistant en : un gel ou un film à base de collagène ou de fribrine comprenant des cellules mésenchymateuses en particulier des fibroblastes, une matrice poreuse qui est réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosan, ces matrices poreuses intégrant ou non des cellules mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes, - un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de polytétrafluoroéthylène (téflon , PTFE), une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi-perméable, une membrane inorganique de structure poreuse capillaire d'oxyde d'aluminium (membrane Anopore semi-perméable), d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi-perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant ou non des cellules mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes. un support inerte traité pour la culture à base de polycarbonate ou de polystyrène, ledit support inerte contenant ou non des cellules mésenchymateuses, en particulier des fibroblastes. 11. Procédé, selon la revendication 10, caractérisé en ce que le modèle cellulaire ou tissulaire utilisé comprend ledit support dermique ou de chorion sur 2905380 45 FR0653567 du 18-01-07 lequel des cellules épithéliales ont été disposées en surface, en particulier des kératinocytes. 12. Procédé, selon la revendication 10 et 11, caractérisé en ce que le modèle 5 cellulaire ou tissulaire comprend au moins un type cellulaire supplémentaire, par exemple des cellules nerveuses et/ou des cellules de Merkel et/ou des cellules endothéliales et/ou des macrophages et/ou des mélanocytes et/ou des lymphocytes et/ou des cellules adipeuses et/ou des annexes cutanées, comme des poils, des cheveux, des glandes sébacées. Io 13. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que le procédé comprend la culture des monocytes CD14+ dans un modèle cellulaire ou tissulaire comprenant au moins des cellules mésenchymateuses pour qu'une partie des monocytes se différencie en cellules endothéliales et/ou 15 en macrophages. 14. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce que le modèle cellulaire ou tissulaire comprend une partie épithéliale et une matrice conjonctive, et en ce que les CL sont localisées essentiellement dans la 20 partie épithéliale, et en ce que les CDI, les macrophages et/ou les cellules endothéliales sont localisées essentiellement dans la matrice conjonctive. 15. Procédé de différenciation de monocytes CD14+ en CL et/ou CDI, comprenant les étapes suivantes: 25 - la collection de monocytes CD14+ à partir de sang circulant; - le maintien des monocytes CD14+ dans des conditions ne favorisant pas leur différenciation en CD; 2905380 46 FR0653567 du 18-01-07 - la mise en présence des monocytes CD14+ dans un environnement cellulaire comprenant des cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes, et/ou des cellules mésenchymateuse, par exemples des fibroblastes, dans des conditions favorisant la différenciation des monocytes CD14+ en CL, ou CDI, ou 5 CL et CDI. 16. Modèle cellulaire comprenant au moins l'une desdites populations de CL et/ou de CDI, et comprenant en outre éventuellement une population de macrophages et/ou de cellules endothéliales, susceptible d'être obtenue selon lo un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15. 17. Modèle tissulaire comprenant au moins l'une desdites populations de CL et/ou de CDI, et comprenant en outre éventuellement une population de macrophages et/ou des cellules endothéliales, susceptible d'être obtenue selon 15 un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 15, ledit modèle tissulaire étant choisi parmi le groupe consistant en un modèle d'épiderme, un modèle d'épithélium, un modèle de derme, un modèle de chorion, un modèle de peau, et un modèle de muqueuse. 20 18. Modèle tissulaire, selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend une partie épithéliale comprenant des cellules épithéliales, telles que des kératinocytes, et une matrice conjonctive comprenant des cellules mésenchymateuses, telles que des fibroblastes dermiques ou de chorion, et caractérisé en ce que les CL sont localisées essentiellement dans la partie 25 épithéliale, et en ce que les CDI, et les macrophages et/ou les cellules endothéliales présents, sont localisés essentiellement dans la matrice conjonctive. 2905380 47 FR0653567 du 18-01-07 19. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, comme modèle d'étude dans le domaine de la cosmétique, de la dermo- 5 pharmacie, ou de la pharmacie, et/ou pour la sélection de principe actif. 20. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, pour étudier les phénomènes intervenant dans les processus 10 d'infection/défense de l'organisme et l'activité, et en particulier l'activité immunostimulante ou immunosuppressive, d'un principe actif ou pour évaluer ou pour induire une immuno-modulation par ledit principe actif, ou pour réaliser des tests in vitro de prédictivité du pouvoir allergisant, irritant, sensibilisant d'agents extérieurs, ou pour réaliser des études, notamment des études de 15 toxicité, de molécules ou produits chimiques. 21. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, pour étudier la physiopathologie des barrières épithéliales ; l'irritation de la 20 peau et des muqueuses ; les agressions d'ordre biologique telles que par exemple les virus, les rétrovirus, tel que HIV, les bactéries, les moisissures, les microorganismes, les antigènes particulaires ; la phototoxicité ; la photo-protection ; ainsi que l'effet de principes actifs, en particulier cosmétiques ou pharmaceutiques ; l'effet de produits finis, en particulier produits cosmétiques 25 ou pharmaceutiques ; étudier les mécanismes d'infection par un agent pathogène. 2905380 48 FR0653567 du 18-01-07 22. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, pour étudier les mécanismes impliqués dans les phénomènes d'infection, de réplication et de transmission des virus, incluant les rétrovirus comme HIV, ou 5 pour rechercher et mettre au point de méthodes alternatives thérapeutiques, incluant l'administration de vaccins ou de médicaments. 23. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 10 18, pour détecter la présence d'un agent pathogène tel que par exemple des virus, rétrovirus, tel que HIV, des bactéries, des moisissures, des microorganismes, des antigènes particulaires. 24. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 15 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, pour une application médicale, biomédicale, ou cosmétique, en particulier pour moduler la réponse immunitaire ou de tolérance in vitro ou in vivo, suite à une agression environnementale, en particulier de type physique, tel qu'une irradiation UV, chimique, tel que des irritants/allergisants/sensibilisants, 20 biologique, en particulier dans un but thérapeutique préventif ou curatif. 25. Utilisation d'au moins un modèle cellulaire tel que défini à la revendication 16 ou d'au moins un modèle tissulaire tel que défini à la revendication 17 ou 18, pour des applications d'ingénierie tissulaire et cellulaire, pour des 25 applications médicales ou biomédicales, par exemple en thérapie cellulaire anticancer, par exemple par une injection de CD capables de stimuler la réponse immune ; par exemple en thérapie cellulaire dans le cas de maladie auto-immune, par exemple par la création d'une stimulation d'immunotolérance, par 2905380 49 FR0653567 du 18-01-07 exemple en produisant des cellules T anergiques ; par exemple en thérapie génique de maladie touchant le système immunitaire ; ou pour la mise au point et la réalisation de vaccins. 5 26. Procédé de fabrication d'un modèle tissulaire comprenant : -l'isolation de monocytes CD14+ à partir de sang circulant périphérique d'un être vivant, - l'ensemencement de cellules cutanées ou de muqueuse sur un support et leur culture dans un milieu nutritif pour obtenir un tissu reconstruit, 10 - l'ensemencement dans le tissu reconstruit des monocytes CD14+ simultanément ou non avec les cellules cutanées ou de muqueuse - la culture du tissu reconstruit comprenant les monocytes CD14+ et les cellules cutanées ou de muqueuse dans des conditions permettant la différenciation 15 des monocytes CD14+ en CL, en mélange de CDI, de cellules endothéliales et/ou de macrophages, en mélange de CL, de CDI, de cellules endothéliales et/ou de macrophages, les cellules cutanées étant des kératinocytes épidermiques quand le tissu reconstruit est un modèle d'épiderme, les cellules cutanées étant des fibroblastes dermiques quand le tissu reconstruit est un 20 modèle de derme, les cellules de muqueuse étant des cellules épithéliales de muqueuse quand le tissu reconstruit est un modèle d'épithélium, les cellules de muqueuse étant des fibroblastes de muqueuse quand le tissu reconstruit est un modèle de chorion. 25 27. Procédé de fabrication d'une peau reconstruite ou d'une muqueuse reconstruite comprenant une partie épithéliale comprenant des kératinocytes ou des cellules épithéliales de muqueuse, éventuellement des cellules de Merkel 2905380 50 FR0653567 du 18-01-07 et/ou des mélanocytes, et une matrice conjonctive comprenant des fibroblastes de derme ou de chorion, ledit procédé comprenant : - l'ensemencement et la culture dans un milieu nutritif de kératinocytes ou de cellules épithéliales de muqueuse, éventuellement en présence de cellules de 5 Merkel et/ou de mélanocytes, à la surface d'un modèle de derme ou de chorion comprenant des CDI et éventuellement des cellules endothéliales et/ou des macrophages, ledit modèle de derme ou de chorion étant susceptible d'être obtenu par un procédé de fabrication d'un modèle de derme ou de chorion tel que défini à la revendication 26, 10 - l'ensemencement et la culture, de manière simultanée ou non avec les kératinocytes ou les cellules épithéliales de muqueuse, de monocytes CD14+ isolés de sang circulant périphérique d'un être vivant en présence des kératinocytes ou des cellules épithéliales de muqueuse dans des conditions permettant la différenciation des monocytes CD14+ en CL. 15 28. Procédé de fabrication, selon la revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules humaines.