Brevet FR2906537A1 — publié le 20080404

La présente invention concerne le domaine de la cancérologie. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro du cancer bronchopulmonaire primitif chez un patient humain par détermination de la présence au-delà d'un seuil prédéterminé, d'un transcrit majoritaire du gène KLK8 de la kallicréine 8 dans un échantillon biologique issu de ce patient. Le cancer broncho-pulmonaire primitif est la première cause de décès par cancer chez l'homme et ce, dans tous les pays développés. Des données récentes montrent une nette augmentation de l'incidence chez les femmes. On estime le nombre de nouveaux cas par an à 25 000 en France et à plus de 160 000 aux Etats-Unis, entraînant le décès annuel d'environ 22 000 individus en France et 155 000 aux Etats-Unis. Au niveau mondial, le cancer broncho-pulmonaire serait responsable d'environ 900 000 décès chaque année, ce qui correspondrait environ à 18% des décès par cancer. L'étiologie principale du cancer broncho-pulmonaire est le tabagisme. Environ 90% des cancers bronchiques chez l'homme et environ 50% chez la femme sont attribuables au tabac. D'autres facteurs environnementaux ou professionnels peuvent également être reconnus dans la carcinogénèse bronchique. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) distingue les cancers bronchiques à petites cellules (CBPC), qui représentent environ 20% des cas, et les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) qui regroupent entre autres les carcinomes épidermoïdes, les adénocarcinomes, et les carcinomes à grandes cellules, et qui représentent environ 80% des cas. Les carcinomes épidermoïdes et les adénocarcinomes sont les cancers les plus répandus. A l'heure actuelle, le diagnostic du cancer broncho-pulmonaire se fait essentiellement par radiographie pulmonaire et scanner thoracique. Une endoscopie bronchique permettant la réalisation de biopsies confirme ensuite le diagnostic. Malheureusement, les symptômes évocateurs sont malheureusement tardifs et peu spécifiques, et le diagnostic intervient tardivement, réduisant ainsi grandement l'efficacité et la faisabilité des traitements existants. De plus, ce type de diagnostic nécessite un matériel performant et du personnel qualifié ce qui est coûteux. Différentes méthodes de traitement sont actuellement disponibles: la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie. Ces traitements peuvent être réalisés, soit de manière isolée, 2906537 2 soit de manière séquentielle ou combinée. Le taux de survie du cancer du poumon est très dépendant du degré de dissémination de la tumeur au moment du diagnostic. Le taux global de survie à 5 ans est de l'ordre de 15%. Ce taux masque cependant des disparités importantes. Le taux de survie des patients 5 ayant un cancer métastasé à distance lors du diagnostic est inférieur à 5 % tandis que les patients dont le cancer non à petites cellules (CBNPC) est localisé au moment de sa découverte présentent des taux de survie proches de 50%1. Ces derniers sont essentiellement traités par résection chirurgicale de la tumeur, approche qui pour l'instant représente la seule solution curative pour ce type de cancer. Toutefois, moins d'un patient sur 3 peut faire l'objet 10 d'un tel traitement et un patient sur 2 traités par chirurgie décède dans les mois suivants l'opération, suite à une récidive tumorale. Les progrès récents dans le domaine de la chimiothérapie moderne du CBNPC permettent d'envisager des traitements adjuvants ou néo- adjuvants améliorant l'espérance de vie des patients opérés. De tels traitements ne sont cependant pas anodins avec un taux de mortalité associé non négligeable. Dans ce contexte, il 15 est important de pouvoir identifier les patients opérables présentant un haut risque de décès par récidive, afin de faciliter la décision d'appliquer ou non une chimiothérapie néo- adjuvante ou adjuvante. Des marqueurs qui permettent de distinguer les cellules tumorales des cellules saines sont recherchés et étudiés depuis des années pour tous les cancers et notamment du cancer 20 broncho-pulmonaire. Ils permettraient de diagnostiquer précocement la maladie, d'en établir le pronostic et la sensibilité au traitement, et d'en surveiller l'évolution. Dans les dernières années, plus de 100 candidats ont été suggérés comme marqueurs moléculaires de diagnostic du cancer broncho-pulmonaire. Les études ont ainsi envisagé le rôle diagnostic de protooncogènes, de facteurs impliqués dans le cycle cellulaire, l'apoptose ou l'angiogenèse. 25 Cependant, peu de corrélations entre les résultats obtenus par différentes techniques et de validations entre différentes cohortes de patients ont pu être obtenues selon la technique employée (immunohistochimie, dosage immunologique, puces à ADN utilisant différents algorithmes) et la grande diversité des tumeurs (type histologique, stade, degré de différenciation). 2906537 3 D'autres marqueurs, appartenant à une sous-famille de protéases à sérine, les kallicréines, dont on en dénombre 15, ont également été testés. Ainsi, dans une étude par puces à ADN, le gène hKLK11 a été identifié comme marqueur des adénocarcinomes endocrines de type C23. Une étude similaire a montré que les gènes hKLK5 et hKLK10 sont 5 surexprimés dans les carcinomes épidermoïdes4. De même, il a été montré que les gènes hKLK5 et hKLK7, codant respectivement les protéines hK5 et hK7, étaient surexprimés dans les tissus tumoraux de carcinomes épidermoïdes, alors qu'une sous-expression du gène hKLK7 dans les tissus tumoraux est le plus souvent observée chez les patients présentant un adénocarcinome5. Cependant, aucun lien entre l'expression différentielle de ces gènes hKLK 10 et un pronostic vital pour les patients atteints d'un cancer broncho-pulmonaire n'a pu être établi. Les gènes des 15 kallicréines présentent des caractéristiques communes, dont la présence de plusieurs transcrits pour le même gène. Les transcrits de ces gènes ont également été étudiés en tant que marqueurs. Ainsi, il a été indiqué que trois transcrits alternatifs des 15 gènes hKLK46, hKLK57, un transcrit du gène hKLK77 étaient sur-exprimés dans les tumeurs et/ou dans des lignées cellulaires ovariennes comparativement au tissu non cancéreux. Il est connu que le profil d'expression du gène hKLK8 donne lieu à au moins 4 transcrits différents, appelés NT1 à NT4. Le transcript NT1 ou neuropsine type 1 , identifié par Yoshida S. et a18, code une préproenzyme de 260 acides aminés contenant un 20 peptide signal de sécrétion de 28 acides aminés et un très court prosegment de 4 résidus devant être clivé pour libérer la forme active de la kallicréine 8. NT1 est considérée comme la forme régulière d'expression du gène. Le transcript NT2 ou neuropsine-T2 , identifié par Mitsui S. et a19, se différencie de la forme NT1 par l'insertion d'une séquence codant 45 acides aminés supplémentaires dans la région carboxy-terminale du peptide signal. Les 25 transcrits NT3 et NT4 ont été identifiés par Magklara A. et al10 et codent des protéines contenant respectivement 119 et 32 résidus. La forme protéique prédite à partir de NT3 ne possède qu'une partie du peptide signal de kallicréine 8 et ne conserve pas la zone de clivage de celui-ci. La protéine prédite à partir de NT4 est constituée des 23 premiers résidus du peptide signal de la kallicréine 8 et de 9 résidus supplémentaires sans identité avec la 2906537 4 kallicréine 8. Magklara A. et ai10 ont montré que, bien que la forme régulière d'expression du gène KLK8, NT1, ait une valeur pronostique dans le cadre du cancer de l'ovaire, les formes NT3 et NT4 n'ont aucune valeur. Les Demanderesses ont maintenant mis en évidence de façon surprenante que les 5 transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8 codant la kallicréine 8, choisis parmi NT3 et NT4, en un taux élevé, étaient un bon marqueur de diagnostic, et notamment de pronostic défavorable, dans le cadre des cancers broncho -pulmonaires, et en particulier des cancers bronchiques non à petites cellules. Ainsi, la présente invention a pour premier objet un procédé de diagnostic in vitro du 10 cancer broncho-pulmonaire, notamment du cancer bronchique non à petites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en l'étape de détection, dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint dudit cancer broncho-pulmonaire, d'au moins un des transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8 de la kallicréine 8. Le procédé de l'invention permet donc d'établir un diagnostic dans le cadre du 15 cancer broncho-pulmonaire par un test simple consistant à détecter les transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8, notamment en un taux élevé. Par transcrit alternatif du gène KLK8, on entend les produits de transcription du gène KLK8. De tels transcrits sont tels que décrits précédemment et sont appelés, notamment, NT1, NT2, NT3 et NT4. Comme on le verra plus loin, les Demanderesses ont découvert 20 deux nouveaux transcrits dénommés NT5 et NT6. Par transcrit majoritaire, on entend les transcrits produits en majorité à partir du gène d'expression de la la kallicréine 8. Selon un mode de réalisation, les transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8 sont choisis parmi les transcrits NT3 et NT4. Par taux élevé de transcrit majoritaire, on entend un taux supérieur à une valeur-seuil 25 déterminée. On sait que, de façon générale, les résultats des tests de détection d'analytes dépendent en grande partie des caractéristiques des partenaires de liaison utilisés. Ainsi, par exemple, dans le cas de la détection d'ARN par hybridation avec des sondes nucléotidiques, les résultats dépendent en particulier des caractéristiques de taille, de composition et de 2906537 5 pourcentage de complémentarité des sondes, et que ces caractéristiques influent sur les valeurs nesurées avec ces sondes. On conçoit donc qu'il n'est pas possible de donner des valeurs- seuils précises et que des valeurs- seuils adaptées à chaque partenaire de liaison utilisé peuvent être déterminées dans chaque cas par de simples expériences de routine. 5 Il faut bien comprendre que l'on appelle ici valeur- seuil soit une valeur discrète, soit un intervalle de valeurs correspondant à une zone d'indétermination. Bien évidemment, lorsque la valeur mesurée est incluse dans l'intervalle d'indétermination, ou est très proche de la valeur-seuil dans le cas d'une valeur discrète, on ne peut pas conclure définitivement et il convient de conduire des investigations supplémentaires. 10 Les échantillons biologiques dans lesquels le procédé de l'invention est mis en oeuvre sont tout échantillon biologique susceptible de contenir des transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8. A titre d'exemple de tels échantillons, on peut citer les échantillons solides tels que le tissu provenant de la biopsie de la tumeur, de ganglions lymphatiques, des métastases du patient, les liquides biologiques tels que le sang, le sérum, le plasma et les expectorations, 15 et les cellules purifiées à partir de ces échantillons solides ou liquides. On entend par détection de transcrit, en particulier du transcrit majoritaire alternatif, soit la détection directe du transcrit, soit la détection indirecte du transcrit, ou tout autre procédé de détermination de la présence d'un ARN dans un échantillon, connu de l'homme du métier. 20 Par détection directe du transcrit, en particulier du transcrit majoritaire alternatif, on entend la mise en évidence dudit transcrit lui-même dans l'échantillon biologique. La détection directe du transcrit majoritaire alternatif dans l'échantillon biologique peut être mise en oeuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, comme par exemple par hybridation avec un partenaire de liaison spécifique du transcrit majoritaire alternatif, le 25 cas échéant après amplification par la technique PCR ou NASBA. Par hybridation, on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques se lient avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques pour former un complexe double brin. Ces liaisons hydrogènes se forment entre les bases complémentaires Adénine (A) et thymine (T) (ou uracile (U)) (on parle de liaison A- 2906537 6 T) ou entre les bases complémentaires Guanine (G) et cytosine (C) (on parle de liaison G -C). L'hybridation de deux fragments nucléotidiques peut être totale (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences complémentaires), c'est-à-dire que le complexe double brin obtenu lors de cette hybridation comprend uniquement des liaisons A -T et des liaisons C-G. 5 Cette hybridation peut être partielle (on parle alors de fragments nucléotidiques ou de séquences suffisamment complémentaires), c'est-àdire que le complexe double brin obtenu comprend des liaisons AT et des liaisons C-G permettant de former le complexe double brin, mais également des bases non liées à une base complémentaire. L'hybridation entre deux fragments nucléotidiques dépend des conditions opératoires qui sont utilisées, et 10 notamment de la stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants 15 et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou 20 oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par 25 synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au 2906537 7 moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du 5 sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide'', soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates. Les partenaires de liaison spécifiques du transcrit majoritaire alternatif sont tout partenaire susceptible de se lier au transcrit majoritaire alternatif. A titre d'exemple, on peut 10 citer les sondes nucléiques, les amorces d'amplification, et toute autre molécule capable de se lier au transcrit majoritaire alternatif. Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le 15 matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique 20 comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs 25 nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : 2906537 8 - PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159, - LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, 5 - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, -3SR (Self Sustained Sequence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et 10 - TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491. Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, et permettant l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN 15 messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifique d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible). Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR. Par détection, on entend soit une méthode physique, soit une méthode chimique avec 20 un agent colorant intercalant tel que SYBR Green I ou le bomure d'éthydium, soit une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques'2,is Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter. Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un 25 signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta- galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase; les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie 2906537 9 ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P 35S ou 125I. 5 Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. Grâce à la présence de ce marqueur, on peut détecter la présence d'une réaction d'hybridation entre une sonde de détection donnée et le transcrit à détecter. La sonde de détection peut être notamment une sonde de détection molecular 10 beacons 14. Ces "molecular beacons" deviennent fluorescentes lors de l'hybridation. Elles possèdent une structure de type tige-boucle et contiennent un fluorophore et un groupe "quencher". La fixation de la séquence de boucle spécifique avec sa séquence complémentaire d'acide nucléique cible provoque un déroulement de la tige et l'émission d'un signal fluorescent lors de l'excitation à la longueur d'onde qui convient. 15 La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels 20 que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, 25 des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un transcrit cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un 2906537 10 support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro-électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique. Le principe de fonctionnement 5 repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont 10 positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène/transcrit ou de plusieurs gènes/transcrits cibles. Après hybridation, le support ou puce est lavé(e), et les complexes ADNc ou ARNc marquées / sondes de capture sont 15 révélés par un ligand de forte affinité lié par exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays")15 16 pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de 20 tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans de nombreuses publications'7' 18, 19, 20, 21 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A-5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond 25 minimum pour la méthode de détection. Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication. Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de 2906537 11 micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. 5 Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume 18 Par diagnostic, on entend tant le diagnostic au sens large du ternie, à savoir tant le diagnostic précoce que le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic des rechutes. Le type de diagnostic va dépendre de la nature de l'échantillon biologique dans lequel 5 le procédé de l'invention est mis en oeuvre. Ainsi, les fluides biologiques seront préférentiellement utilisés dans le cadre du diagnostic précoce, du dépistage, du diagnostic des rechutes et éventuellement du suivi thérapeutique. S'agissant des échantillons solides, tels que le tissu cancéreux, les ganglions lymphatiques ou les métastases, le cancer est déjà avéré. Le procédé de l'invention va donc être utile dans le cadre du pronostic et éventuellement du 10 suivi thérapeutique. Le procédé de l'invention est particulièrement approprié dans le pronostic de survie des patients atteints de cancer broncho-pulmonaire. En effet, les Demanderesses ont démontré qu'un taux élevé de transcrit majoritaire alternatif du gène KLK8, en particulier de NT3 et NT4, est un facteur pronostic défavorable du cancer et notamment du CBNPC. 15 Ainsi, un autre objet consiste en l'utilisation du procédé de diagnostic de l'invention dans le pronostic de survie des patients atteints de cancer broncho-pulmonaire. Comme précédemment, le pronostic est amélioré par association de l'une des étapes suivantes : - étape de détection d'au moins un autre transcrit alternatif du gène KLK8, 20 - étape de détection d'au moins un transcrit d'un autre gène de kallicréine, de préférence KLK5, KLK11 et KLK13, KLK11 étant particulièrement préféré, éventuellement en association avec la détection d'au moins un autre transcrit alternatif du gène KLK8, - étape de détection d'au moins un transcrit d'un autre gène s'exprimant dans le poumon. Pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de l'invention, l'invention a pour 25 autre objet un kit de diagnostic comprenant les outils nécessaires à la détection des transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8. A titre non limitatif d'outils nécessaires à la détection des transcrits majoritaires alternatif du gène KLK8, on peut citer les partenaires de liaison desdits transcrits majoritaires, tels que les sondes d'hybridation et de détection. 2906537 19 L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 et 2 annexées, sur lesquelles : - la figure 1 est la photographie d'un gel d'électrophorèse montrant les différents transcrits alternatifs du gène KLK8 NT1 à NT6 obtenus à partir de tissus cancéreux de patients atteints 5 d'adénocarcinome (Ad) ou de carcinome épidermoïde (C. EPI), la piste de gauche correspondant à la piste des marqueurs de poids moléculaire et - la figure 2 est la photographie d'un gel d'électrophorèse montrant la présence de transcrit NT4 dans le sang d'un patient atteint de carcinome, la piste de gauche correspondant à la piste des marqueurs de poids moléculaire (MM). 10 Exemple 1 : Mise en évidence des transcrits pulmonaires majoritaires du gène KLK8 et des nouveaux transcrits Des ARN totaux ont été extraits à partir de tissus cancéreux de patients atteints d'adénocarcinome ou de carcinome épidermoïde en utilisant le système RNAeasy Midi 15 kit (Qiagen S.A., Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. Les ARN totaux ont été rétrotranscrits en ADNc à l'aide de la PowerScript Reverse Transcriptase (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Pour chaque échantillon, une réaction de transcription inverse a été effectuée à 42 C pendant une heure dans un volume fmal de 20 l. Le milieu réactionnel était composé de 2 g 20 d'ARN totaux, 5 M d'oligonucléotides décamériques aspécifiques (Random decamers RETROscript, Ambion, Cambridgeshire), de dNTP à la concentration chacun de 1 mM, de 20 U d'inhibiteur de RNase (Roche Diagnostics, Meylan), du tampon de réaction une fois concentré et d'une unité de Power Script Reverse Transcriptase (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). 25 Les ADNc ont été amplifiés par PCR. Le mélange réactionnel de 25 l contenait : 50 ng d'ARN total rétro-transcrit, 1 unité de FastStart Taq DNA (Polymérase Roche Diagnostics, Meylan), du tampon de réaction une fois concentré (50 mM Tris-HC1 pH 8.3, 10 mM KC1, 5 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgClz), des dNTP à la concentration de 0,3 mM et de 0,2 M des amorces spécifiques. 2906537 20 Ces amorces ont été choisies de part et d'autre de la séquence codant la kallicréine KLK8 (NT1) et comportaient un site de coupure par une enzyme de restriction (Not 1 ou EcoR V). Ces amorces étaient : - K8Notfor : TGG AGG GCG GCC GCA TGG GAC GCC CCC GAC (SEQ ID N 1) et 5 - K8Ecorev : TCC TAG ATA TCG CCC TTG CTG CCT ATG (SEQ ID N 2). Les réactions de PCR ont été réalisées dans un thermocycleur à gradient de température (Master cycler Gradient, Eppendorf). Les conditions d'amplification étaient les suivantes : un cycle de dénaturation de 5 min à 95 C suivi de 45 cycles comportant une étape de dénaturation à 95 C pendant 20 s, une étape d'hybridation à 56 C pendant 20 s et 10 une étape d'élongation à 72 C pendant 1,30 minutes. La réaction a été terminée par un cycle supplémentaire d'élongation de 1,30 min à 72 C. Dix microlitres de la réaction ont été déposés sur un gel d'agarose à 0,8% contenant du bromure d'éthidium à 0,5 g/ml. Les produits ont été séparés par électrophorèse et visualisés sous UV. Le marqueur de taille utilisé (Gene Ruler DNA Ladder mix) a été fourni 15 par la firme MBI-Fermentas. La photographie du gel d'électrophorèse est donnée sur la figure 1 qui met en évidence les différents transcrits issus de l'expression pulmonaire du gène KLK8 et la caractérisation de transcrits majoritaires des NT3 et NT4. Il est à noter que ces transcrits ont été identifiés par séquençage nucléotidique (voir exemple 2) comme étant les transcrits déjà 20 décrits sous le vocable de Neuropsine de type 1 à 4 (NT1 à NT4), les deux nouveaux transcrits ayant été identifiés et dénommés NT5 et NT6. Exemple 2 : Caractérisation structurale des transcrits pulmonaires du gène KLK8 et conception d'amorces spécifiques. 25 Les produits de PCR obtenus dans l'exemple 1 ont été clonés dans le vecteur pcDNA5-FRT-VS-His TOPO (Invitrogen, Cergy Pontoise) selon les recommandations du fournisseur. La préparation d'ADN plasmidique a été réalisée à partir de différents clones en utilisant le système Qiaprep MiniPrep (Qiagen S.A, Courtaboeuf). L'ADN plasmidique purifié a ensuite été quantifié par spectrophotométrie à 260 nm, puis séquencé dans les 2 2906537 21 directions à l'aide du couple d'amorces T7 et pCR 3.1 (BGH rev). Les séquences obtenues, données ci-après, ont été comparées aux séquences se trouvant dans les banques de données. La structure des transcrits clonés, donnée dans le tableau 1, a été déterminée par alignement avec la séquence du gène KLK8 à l'aide du logiciel CLUSTAL W. 5 - Séquence de l'ADNc pulmonaire YC170310.03 identique au transcrit NT1 (NM 007196).: SEQ ID N 3 - Séquence de l'ADNc pulmonaire YC140710.03 identique au transcrit NT2 (NM 144505). : SEQ ID N 4 - Séquence de l'ADNc pulmonaire YC090310.03 identique au transcrit NT3 10 (NM 144506). : SEQ ID N 5 -Séquence de l'ADNc pulmonaire YC100310.03 identique au transcrit NT4 (NM 144507). : SEQ ID N 6 - Séquence de l'ADNc pulmonaire YC210710.03 correspondant à un nouveau transcrit (NT5). : SEQ ID N 7 15 - Séquence de l'ADNc pulmonaire YCO50710.03 correspondant à un nouveau transcrit (NT6). : SEQ ID N 8 Tableau 1 Transcrit pulmonaire Nom générique Structure YC 170310.03 NT1 EX 1+EX2+EX3+E4+EX5+EX6 YC140710.03 NT2 EX1+EX2+EX3 ALT+EX4+EX5+EX6 YC090310.03 NT3 EX1+EX2+EX5+EX6 YC 100310.03 NT4 EX 1+EX2+EX6 YC210710.03 NT5 EX1+EX2+EX4+EX5+EX6 YCO50710.03 NT6 EX1+EX2+EX3+EX5+EX6 EX = exon ; ALT= exon alternatif Comme le montre le Tableau 1, les transcrits pulmonaires ne se distinguent les uns des 20 autres que par des combinaisons différentes d'exons identiques. Il n'est donc pas possible de les cibler individuellement en jouant sur des séquences nouvelles (sauf NT2 qui possède une 2906537 22 séquence additionnelle dans en 5' de l'exon 2). La connaissance du transcriptome pulmonaire du gène KLK8 permet de déterminer pour chaque transcrit la combinaison d'exons le distinguant des autres transcrits présents dans ce tissu, comme indiqué dans le Tableau 2. Tableau 2 Transcrit pulmonaire Nom générique Combinaison distinctive au niveau pulmonaire YC170310.03 NT1 EX2-EX3 + EX4-EX5 YC140710.03 NT2 EX2-EX3 ALT YC090310.03 NT3 EX2-EX5 YC 100310.03 NT4 EX2-EX6 YC210710.03 NT5 EX2-EX4 YCO50710.03 NT6 EX3-EX5 5 L'utilisation dans les sondes d'hybridation ou de détection des séquences jonctionnelles des exons présents dans ces combinaisons est donc le seul moyen de cibler spécifiquement et individuellement les transcrits pulmonaires. Ceci a été mis à profit pour générer l'amorce d'amplification conférant la spécificité de quantification des transcrits majoritaires NT3 et 10 NT4 dans cet organe (voir Tableau 3). Tableau 3 Transcrit ciblé Localisation de Nom de l'amorce spécifique sens et séquence l'amorce (SEQ ID N ) NT3 Jonction EX2-EX5 NT3 for : GGA GCC TGG GCA GAG AAT (SEQ ID N 9) NT4 Jonction EX2-EX6 NT4 -2/6 : TGG GCA GGG CGA TTC T (SEQ ID N 10) Exemple 3: Quantification des transcrits NT3 et NT4 dans les tissus tumoraux de patients atteints de cancer pulmonaire. 15 Les transcrits NT3 et NT4 ont été dosés par PCR quantitative en temps réel en 2906537 23 présence du fluorophore intercalant SYBR Green dans un thermocycleur iCycler iQ Détection Système (Biorad, Marnes la Coquette). Chaque essai incluait deux mesures de quantification des ADNc provenant d'échantillons pulmonaires tumoraux, deux mesures de témoins sans ADN et une courbe d'étalonnage construite en utilisant différentes dilutions 5 d'ADN plasmidique étalon isolé des clones YC090310.03 (NT3) et YC100310.03 (NT4) (voir exemple 2). Les valeurs trouvées pour chaque échantillon ont été normalisées avec celle déterminée lors de la quantification des transcrits codant la sous-unité ribosomique 18S. Dans ce dernier cas, les courbes d'étalonnage ont été réalisées à partir de différentes dilutions d'une séquence de ce gène (853 pb) amplifiée par PCR conventionnelle et purifiée 10 directement en utilisant le coffret Macherey Nagel selon les recommandations du fournisseur. Les oligonucléotides utilisés pour l'obtention de cette séquence étaient : - l'oligo 18S for : CTA CCA CAT CCA AGG AAG GCA GCA (SEQ ID N 11) et - l'oligo 18S rev : GCT ATC AAT CTG TCA ATC CTG TCC (SEQ ID N 12). Le mélange réactionnel pour l'amplification quantitative de NT3 et NT4 comprenait : 15 100 ng d'ARN total rétro-transcrit (voir exemple 1), 1 unité de FastStart Taq DNA Polymérase, du SYBR Green (Roche Diagnostics, Meylan) 0,2 fois concentré, du tampon de réaction une fois concentré (50 mM Tris-HC1 pH 8.3, 10 mM KC1, 5mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCh), des dNTP à la concentration chacun de 0,2 mM et 0, 2 M de chaque amorce oligonucléotidique sens (Tableau III, exemple 2) et antisens du transcrit étudié. Les amorces 20 antisens des transcrits NT3 et NT4 étaient respectivement : l'amorce NT3 rev (CCT CCA GAA TCG CCC T û SEQ ID N 13) hybridant avec la séquence de jonction des exons 5 et 6, et l'amorce NT4 rev (CAG TCC AGG TAG CGG CAG û SEQ ID N 14) dont la séquence ciblée se trouve dans l'exon 6. Les mesures de quantification du gène de ménage codant la sous-unité ribosomique 25 18S ont été effectuées dans le milieu réactionnel suivant : 0,5 ng d'ARN total rétro-transcrit, 1 unité de FastStart Taq DNA Polymérase, du SYBR Green 0,2 fois concentré, du tampon de réaction une fois concentré (50 mM Tris-HC1 pH 8.3, 10 mM KC1, 5 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgCI) auxquels ont été ajoutés 2 mM MgCh, des dNTP à la concentration chacun de 0,2 mM et 0,56 M de chaque amorce sens (CGC GGT TCT ATT TTG TTG GTT TT û 2906537 24 SEQ ID N 15) et antisens (TTC GCT CTG GTC CGT CTT GC û SEQ ID N 16). Les conditions d'amplification pour la PCR quantitative des différents transcrits sont indiqués dans le Tableau 4. Tableau 4 Nombre de Etape Durée Température Transcrits cycle(s) 1 cycle Dénaturation 5 min 95 C NT3, NT4, 18S Dénaturation 10 s 95 C NT3, NT4, 18S 50 cycles Hybridation 10 s 59 C NT3 lO s 61 C NT4 lO s 65 C 18S Elongation 15 s 72 C NT3, NT4 20 s 72 C 18S Acquisition de 15 s 81 C NT3, NT4 fluorescence 15 s 84 C 18S 5 Les quantifications ont été réalisées à partir d'échantillons de tissus tumoraux prélevés sur les pièces d'exérèse chirurgicale de patients opérés d'un cancer broncho-pulmonaire entre janvier 2002 et juin 2004. La cohorte étudiée comportait 60 patients dont l'âge variait de 45 à 83 ans avec un âge médian égal à 65 ans (voir Tableau 5). 10 Tableau 5 Type tumoral Nombre de patients Adénocarcinome 33 Carcinomes épidermoïde 16 Carcinome à grandes cellules 5 Carcinome muco-épidermoïde 1 Carcinome neuro- endocrine 1 Tumeur carcinoïde 4 2906537 25 Trente-huit patients avaient un cancer de stade 1 ou 2 selon la classification pTNM24, et 24 patients, un cancer de stade 3 ou 4. L' analyse de la survie a été réalisée en collectant les informations relatives à leur état de santé en janvier 2006. Nous avons enregistré 26 décès 5 dans la période de l'étude. Pour les valeurs normalisées de NT3 et NT4 exprimées en unités arbitraires (UA), nous avons déterminé, à l'aide d'un test de x2, une valeur seuil permettant de prédire au mieux la survie globale de la population. La valeur seuil est de 50 UA pour NT3 (x2= 7,54 ; P=0,006) et de 1000 UA pour NT4 (x2= 7,54 ; P=0,006). Ces valeurs, représentant les 10 45ème et 46ème percentiles, ont été utilisées pour les analyses ultérieures. Les patients ont été classés en deux groupes : un groupe correspond aux individus présentant un niveau d'expression inférieur à la valeur seuil déterminée (Expression faible ; on parle de NT3 ou NT4 faible), et un groupe ayant un niveau d'expression supérieur (Expression forte ; on parle de NT3 ou NT3 faible). Pour chaque groupe, une courbe de 15 survie a été construite selon la méthode de Kaplan Meier et la significativité des différences entre les courbes a été évaluée par le log rank test. L'impact de l'expression des transcrits (comparaison expression forte versus expression faible) sur la survie globale des patients a été évalué par le HR (risque relatif de décès) qui a été calculé avec le modèle de Cox (Cox proportional hazards regression model). L'analyse a été réalisée de manière univariée. Elle a 20 également été réalisée après ajustement avec le stade tumoral (ce qui permet d'éliminer la variable stade ) puisque cette variable est fortement liée à la survie des patients (on parle alors de NT3 ou NT4 fort ajusté). Les résultats sont indiqués dans le Tableau 6. 2906537 Tableau 6 Variables Kaplan-Meier et Modèle de Cox log rank test P HR 95% IC P NT3 fort vs NT3 faible 0,015 2,860 1,147 û 7,128 0,0241 Stades 3+4 vs stades 1+2 3,609 1,583-8,229 0,0023 NT3 fort ajusté vs NT3 NC 2,300 0,911-5,804 0,0779 faible ajusté NT4 fort vs NT4 faible 0,005 3,608 1,448-8,994 0,0059 Stades 3 +4 vs stades 1+2 4,253 1,861-9,719 0,0006 NT4 fort ajusté vs stades NC 3,712 1,478-9,323 0,0052 1+2 NC : non calculé et IC : intervalle de confiance, vs = versus Les courbes de survie de Kaplan-Meier démontrent des différences significatives de survie (log rank test, Tableau 6) entre les patients exprimant fortement NT3 ou NT4 (NT3 ou 5 NT4 fort) et lespatients exprimant faiblement ces transcrits (P calculé par rapport à NT3 ou NT4 faible). Le modèle de Cox permet de conclure que les patients exprimant fortement les transcrits ont une survie significativement inférieure aux autres patients. En effet, l'analyse de Cox montre que l'augmentation du risque de décès liée à une expression forte de NT3 10 (augmenté d'un facteur 2,860 ; HR, Tableau 6) ou de NT4 (augmenté d'un facteur 3,608 ; HR ,Tableau 6) est statistiquement significative. Les niveaux d'expression de ces transcrits constituent donc des indicateurs pronostiques de la survie des patients pour le cancer du poumon. Après ajustement avec le stade tumoral (NT3 ou NT4 fort ajusté), on constate que 15 l'augmentation du risque de décès lié à NT3 fort perd de la significativité statistique (P=0,0779). Ceci indique que les deux variables (expression de NT3 et stade tumoral) seraient liées dans cette étude. 26 2906537 27 Néanmoins, la forte tendance à la significativité de NT3 fort ajusté suggère que les deux variables pouffaient se révéler indépendantes dans une étude plus robuste comportant un plus grand nombre d'évènements. La situation est différente pour la variable NT4 fort puisque l'ajustement avec le 5 stade tumoral ne modifie pas la significativité statistique de l'augmentation du risque de décès. Ce résultat prouve que la variable NT4 est un indicateur pronostique indépendant du stade tumoral. Exemple 4: Dosage des transcrits NT3 ou NT4 en association avec le dosage de 10 transcrits d'autres gènes des kallicréines. La stratégie de dosage des transcrits d'autres gènes des kallicréines s'exprimant dans le poumon (KLK5, KLK6, KLK7, KLK10, KLK11, KLK13 et KLK14) est identique à celle décrite dans l'exemple 3. En résumé, la quantité de produits issus de l'amplification des ADNc et des contrôles a été déterminée après chaque cycle à l'aide de l'incorporation de 15 SYBR green. Des courbes étalons ont été réalisées à partir d'ADN plasmidique provenant de clones d'ADNc des différents gènes. Les valeurs trouvées pour chaque patient et chaque gène ont été normalisées avec les valeurs du 18S ribosomique et exprimées en unité arbitraire. Les conditions réactionnelles étaient identiques à celles décrites pour NT3 et NT4 (Exemple 3). Les amorces de PCR utilisées sont décrites dans la Tableau 7. 20 2906537 Tableau 7 Nom Séquences gènes orientations SEQ ID N K5. 398_for GCC ACT ACT CCC TGT CAC CA KLK5 Sens 17 K5.682_rev GCA TCC TCG CAC CTT TTC TG antisens 18 256.K6_for TGA TGG TGG TGC TGA GT KLK6 Sens 19 393.K6_rev ACA GTG GAT GGA TAA GGA C antisens 20 547.K7_for GAG CCC AGA TGT GAC CTT KLK7 Sens 21 615.K7_rev TCC TTG TAA ACC TTC GTG C antisens 22 2K10. 210_for GGA CCC CGA AGC CTA TG KLK10 Sens 23 2K10.442_rev CCT GAG CCC TGG TGG TA antisens 24 K11_for2 CAG GAT CAT CAA GGG GTT CG KLK11 Sens 25 Ki 1 rev2 CAT TGC GGT GGT CTT TGT TG antisens 26 576.K13_for GTG CCA ACA TCC AAC TTC G KLK13 Sens 27 672.K13_rev CCC TCA CAG GAG TCT TTG C antisens 28 448.K14_for TGG GTC ATC ACT GCT GCT C KLK14 Sens 29 500.K14_rev CTC CTC AGG TTG TGC TTG C antisens 30 28 2906537 Tableau 8 Nombre de Etape Durée Température Transcrits cycle(s) 1 cycle Dénaturation 5 min 95 C tous Dénaturation 10 s 95 C tous 50 cycles Hybridation 15 s 57 C KLK10 et 11 lO s 59 C KLK14 lO s 60 C KLK7 15 s 65 C KLK5, 6 15 s 68 C KLK13 Elongation 15 s 72 C KLK10 et 14 20 s 72 C KLK5, 6, 7, 11 et 13 Acquisition de 15 s 80 C KLK7 fluorescence 15 s 81 C KLK14 15 s 84 C KLK6, 11 , 13 15 s 86 C KLK5, 10 Les cohortes utilisées pour le dosage des transcrits des différents gènes proviennent de la population étudiée dans l'exemple 3. La répartition des types histologiques tumoraux au sein des cohortes étudiées est donnée dans le Tableau 9. 5 Tableau 9 Type tumoral KLK5, 7 KLK6 KLK10,11,13 KLK14 Adénocarcinome 29 33 28 33 Carcinomes épidermoïde 16 16 16 15 Carcinome à grandes cellules 4 5 3 5 Carcinome muco-épidermoïde 1 1 1 1 Carcinome neuro- endocrine 1 1 1 1 Tumeur carcinoïde 3 4 1 4 Nombre total 54 60 50 59 Pour chaque patient, le niveau d'expression des différents transcrits a été déterminé puis a servi à calculer un rapport avec NT3 ou avec NT4 (Tableau 10 pour NT3 et Tableau 29 5 2906537 11 pour NT4). Pour chaque rapport, nous avons ensuite déterminé une valeur seuil permettant de prédire au mieux la survie globale de la population à l'aide de la méthode décrite dans l'exemple 3. Tableau 10 Variable Seuil x2 P percentile décès NT3/KLK5 0,05 5,54 0,019 46 26 NT3/KLK6 0,005 5,54 0,019 42 26 NT3/KLK7 0,001 7,54 0,006 37 26 NT3/KLK10 0,01 10,66 0,001 36 24 NT3/KLK11 0,0015 8,17 0,004 40 24 NT3/KLK13 0,008 8,17 0,004 40 24 NT3/KLK14 0,10 6,00 0,014 53 24 Tableau 11 Variable Seuil x 2 P percentile décès NT4/KLK5 2 3,84 0,049 53 26 NT4/KLK6 2 3,84 0,049 43 26 NT4/KLK7 0,1 7,50 0,006 39 26 NT4/KLK10 0,4 5,99 0,014 42 24 NT4/KLK11 0,1 10,66 0,001 44 24 NT4/KLK13 0,7 8,17 0,004 46 24 NT4/KLK14 0,5 5,99 0,014 52 24 Comme dans l'exemple 3, les patients ont été classés en deux groupes : un groupe correspond aux individus présentant un niveau d'expression inférieur à la valeur seuil déterminée (Expression faible), et un groupe ayant un niveau d'expression supérieur 10 (Expression forte). Pour chaque groupe, une courbe de survie a été construite selon la méthode de Kaplan-Meier et la significativité des différences entre les courbes a été évaluée par le log rank test. Le risque relatif de décès (HR) a été calculé avec le modèle de Cox 2906537 31 (Cox proportional hazards regression model). L'analyse a été réalisée après ajustement avec le stade tumoral puisque cette variable est fortement liée à la survie des patients. Les résultats pour NT3 sont donnés dans le Tableau 12. 2906537 Tableau 12 Variables Kaplan-Meier et Modèle de Cox log rank test P HR 95% IC P NT3/KLK5 fort vs 0,0214 NC NC NC NT3/KLK5 faible Stades 3+4 vs stades 1+2 NC 3,549 1,553 û 8,110 0,0027 NT3/KLK5 fort ajusté vs NT3/KLK5 faible ajusté .......................................................................... DTD: .......................................................................... DTD: .......................................................................... DTD: ...................... 1,064 û 6,211 0,0360 2,570 • 11 •-•- 1 1 11 1 • 11 •- •- 111 1 1 11 • • •- •- •- 111 • •- \ 1 11 1 • 11: a•- •- •- ~ 1 111 1 \ • 11~ a••-•- ~ 1 111 1 ~ 11 • NT3/KLK14 fort vs 0,0205 NC NC NC NT3/KLK14 faible 32 2906537 33 Stades 3+4 vs stades 1+2 3,669 1,604 ù 8,392 0,0021 NC NT3/KLK14 fort ajusté vs 1,823 0,814 ù 4,082 0,1444 NT3/KLK14 faible ajusté NC : non calculé et IC : intervalle de confiance Cette étude établit que les patients ayant des rapports NT3/KLKx supérieurs à la valeur seuil présentent un taux de survie significativement diminué par rapport à ceux dont la valeur du rapport est inférieure à la valeur seuil (à l'exception de NT3/KLK7 ; log rank test). 5 Les résultats du test de Cox montre que les rapports NT3/ KLK5, NT3/KLK11, NT3/KLK13 sont des indicateurs pronostiques indépendants du stade tumoral (P seuil ; expression faible ..DTD: .......................................................................... DTD: .......................................................................... DTD: ...................................................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stade 3+4 vs stade 1+2 3,824 1,684 - 8,684 0,0013 KLK8/KLK7 fort ajustée vs 3,152 0,938 - 10,585 0,0633 KLK8/KLK7 faible Stades 3+4 vs stades 1+2 4,152 1,833 - 9,401 0 00 KLK8/NT4 fort ajustée vs 0,851 0,290 - 2,501 0,7695 KLK8/NT4 Stades 3+4 vs stades 1+2 3,952 1,742 - 8,964 0,0010 KLK8/KLK10 fort ajustée vs..DTD: .......................................................................... DTD: .......................................................................... DTD: ...................................................... 1,320 - 7,062 0,0091 KLK8/KLK10 faible ajusté 3,054 . Stades 3+4 vs stades 1+2 3,725 1,639 - 8,470 0,0017 KLK8/KLK11 fort ajustée vs 3,247 1,352 - 7,797 0,0084 KLK8/KLK11 faible Stades 3+4 vs stades 1+2 3,268 1,423 - 7,504 0,0052 KLK8/KLK13 fort ajustée vs 3,415 1,265 - 9,218 0,0153 KLK8/KLK13 faible ajustée..DTD: .......................................................................... DTD: .......................................................................... DTD: ..................................................... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stades 3+4 vs stades 1+2 3,249 1,487 - 7,911 0,0039 KLK8/KLK14 fort ajustée vs 2,178 0,852 - 5,573 0,1042 KLK8/KLK14 faible ajustée IC, intervalle de confiance 2906537 38 Les patients ayant une forte valeur de la variable KLK8 ont une survie inférieure aux autres (log rank test, P= 0.0353) ; cependant cette variable est liée à la variable stade tumoral comme le montre le P non significatif de la variable ajustée (Tableau 17). La variable KLK8 devient indépendante lorsqu'elle est combinée sous forme de 5 rapport avec les niveaux d'expression d'autres gènes de kallicréine (P REVENDICATIONS 1. Procédé de diagnostic in vitro du cancer broncho-pulmonaire, notamment du cancer bronchique non à petites cellules, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de détection, dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint dudit cancer broncho-pulmonaire, d'au moins un des transcrits majoritaires alternatifs du gène KLK8 codant la kallicréine 8. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les transcrits majoritaires alternatifs du gène 1 KLK8 sont choisis parmi les transcrits NT3 et NT4. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les étapes consistant à : i) déterminer la quantité de transcrit majoritaire alternatif dans l'échantillon biologique, ii) comparer la quantité de transcrit majoritaire alternatif dans l'échantillon biologique à une valeur-seuil prédéterminée, choisie selon le type de dosage utilisé et représentative de la limite de détection de la pathologie et iii) établir le diagnostic. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend également l'étape de détection d'au moins un autre transcrit alternatif du gène KLK8. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les étapes consistant à : i) déterminer la quantité de transcrit majoritaire alternatif du gène KLK8 et la quantité de l'autre transcrit alternatif du gène KLK8 dans le même échantillon biologique, et ii) comparer la quantité obtenue à une valeur-seuil prédéterminée, choisie selon le type de dosage utilisé et représentative de la limite de détection de la 2906537 pathologie et iii) établir le diagnostic. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend 5 également l'étape de détection d'au moins un transcrit d'un gène codant une autre kallicréine. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les étapes consistant à : 10 i) déterminer la quantité de transcrit majoritaire alternatif du gène KLK8 et éventuellement de l'autre transcrit alternatif du gène KLK8 dans l'échantillon biologique Q1, ii) déterminer la quantité du transcrit du gène codant l'autre kallicréine dans le même échantillon Q2, 15 iii) calculer le rapport Q1/Q2 ou Q2/Q1, iv) comparer ledit rapport à une valeur-seuil prédéterminée, choisie selon le type de dosage utilisé et représentative de la limite de détection de la pathologie et v) établir le diagnostic. 20 8. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend également l'étape de détection d'au moins un transcrit d'un autre gène s'exprimant dans le poumon non gène codant une kallicréine. 25 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre les étapes consistant à : i) déterminer la quantité de transcrit majoritaire alternatif du gène KLK8 dans l'échantillon biologique Q1, ii) déterminer la quantité du transcrit de l'autre gène s'exprimant dans le 30 poumondans le même échantillon Q3, iii) calculer le rapport Q1/Q3 ou Q3/Q1, T 42 5 2906537 43 iv) comparer ledit rapport à une valeur-seuil prédéterminée, choisie selon le type de dosage utilisé et représentative de la limite de détection de la pathologie et v) établir le diagnostic. 10. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 dans le pronostic de survie des patients atteints de cancer broncho-pulmonaire. 11. Kit de diagnostic comprenant des partenaires de liaison des transcrits lo majoritaires alternatifs du gène KLK8, de préférence des sondes nucléiques ou des amorces d'amplification.