Brevet FR2906816A1 — publié le 20080411

VARIANTS DE BACTERIES LACTIQUES UTILES POUR PRODUIRE LA VITAMINE K2 ET LEURS APPLICATIONS A LA PREPARATION DE PRODUITS ALIMENTAIRES La présente invention se rapporte au domaine des produits alimentaires riches en nutriments, vitamines et/ou oligo-éléments afin d'améliorer la teneur et l'équilibre qualitatif et quantitatif des apports nutritionnels chez l'homme. L'invention s'intéresse plus particulièrement aux moyens d'enrichir les aliments en vitamine K. Plus précisément, la présente invention concerne des variants de souches de bactéries lactiques qui produisent, dans des conditions de fermentation standard, au moins environ 1,2 fois plus de vitamine K2 que les souches de bactéries lactiques de départ cultivées dans les mêmes conditions, et les ferments comprenant ces variants. En outre, la présente invention vise un procédé d'obtention de tels variants. L'invention concerne également un procédé de préparation de produits alimentaires, notamment de produits fermentés et/ou de produits laitiers frais, enrichis en vitamine K2, ainsi que les produits alimentaires ainsi obtenus. La vitamine K est une vitamine liposoluble qui se présente sous deux formes naturelles : la vitamine KI (ou phylloquinone) et la vitamine K2 (ou ménaquinone) La vitamine KI est synthétisée par les végétaux. On la trouve principalement dans les légumes verts (légumes-feuilles) et l'huile de soja. La vitamine KI intervient plus directement dans le processus de coagulation du sang. La vitamine K2, quant à elle, est produite par les bactéries de la flore intestinale. Elle apparaît également en faibles quantités dans certains aliments à la suite d'un processus de fermentation (fromage, produits 2906816 2 asiatiques typiques tels que le miso et le natto japonais, à base de soja fermenté, etc.). De nombreuses bactéries sont capables de synthétiser la vitamine K2. Ainsi, outre les bactéries de la flore intestinale et, notamment, les espèces Escherichia coli, Bacillus subtilis et Bacteroides 5 spp., on peut citer certaines espèces ou sous-espèces de bactéries lactiques telles que Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides et Propionibacterium sp. La quantité de vitamine K2 synthétisée par ces bactéries varie généralement d'environ 29 à 90 pg/l de lait fermenté 10 (Morishita et al., 1999). Il est important de souligner que les mesures de production de vitamine K2 sont le plus souvent réalisées à partir de lyophilisats de culots cellulaires et les résultats de ces mesures révèle une grande hétérogénéité des niveaux de production en fonction des souches testées, pouvant varier du simple à plus du triple (Morishita et al., 1999 ; 15 Parker et al., 2003). En ternies d'activité biologique, la vitamine K2 est surtout connue pour son action sur la calcification des tissus mous. La vitamine K a initialement été décrite pour son rôle essentiel dans le processus de coagulation du sang. Ainsi, de fortes carences en vitamine K entraînent des hémorragies, avec allongement anormal du 20 temps de coagulation, et des ecchymoses. On a longtemps considéré que les carences fortes en vitamine K étaient plutôt rares chez l'adulte, les besoins pouvant être en principe couverts de manière satisfaisante par une alimentation variée et équilibrée et grâce à la production endogène de la vitamine par les bactéries coliques. A cet égard, les personnes à risque 25 sont typiquement : les nouveaux-nés, dont les intestins ne possèdent pas à la naissance les bactéries productrices de vitamine K ; les personnes dont les fonctions hépatiques, biliaires ou intestinales sont perturbées (maladies hépatiques, 30 mucoviscidose, colites, dysenteries...) ; et celles qui prennent des antibiotiques au long cours. 2906816 3 Plus récemment, on a découvert que l'impact de la vitamine K sur la santé humaine ne se limitait pas à son rôle dans les mécanismes de coagulation sanguine. En effet, depuis les années 80, la vitamine K est également reconnue pour son rôle dans le métabolisme osseux (Hart et 5 al., 1984 ; Hart et al., 1985). Cette vitamine joue le rôle de cofacteur dans une réaction enzymatique conditionnant l'activité de l'ostéocalcine dans le cadre de la régulation de la formation osseuse (Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996). Son rôle consiste plus précisément à conditionner la 10 carboxylation de l'ostéocalcine, protéine-clé qui régule le processus de formation osseuse. En cas de déficience en vitamine K, cette réaction n'a pas lieu, entraînant l'augmentation du ratio sanguin ostéocalcine décarboxylée sur ostéocalcine carboxylée (Vâànànen et al., 1999). L'évolution démographique des pays occidentaux s'est traduite par 15 un vieillissement progressif des populations, associé en corollaire à une augmentation de la prévalence des pathologies dégénératives, notamment de l'ostéoporose. A ce titre, l'ostéoporose est désormais reconnue comme un problème majeur de santé publique. Les estimations démographiques établies dans les années 90 ont 20 tiré la sonnette d'alarme en prévoyant une augmentation considérable de l'incidence de cette pathologie dans les 50 ans à venir, notamment chez les seniors. S'est donc rapidement imposée la nécessité et l'urgence d'entreprendre des actions afin de prévenir cette pathologie, jusque-là rarement dépistée et prise en charge tardivement. 25 Il est désormais reconnu que la prévention de l'ostéoporose doit commencer dès l'enfance, au travers d'une croissance osseuse optimale, et se poursuivre toute la vie par un maintien de la masse osseuse. On sait que les facteurs nutritionnels jouent un rôle important dans le développement et le maintien du patrimoine osseux. Jusqu'à présent, les 30 stratégies nutritionnelles envisagées ou proposées pour prévenir l'ostéoporose reposent essentiellement sur deux facteurs clés qui sont le 2906816 4 calcium et la vitamine D. Pourtant, on sait aujourd'hui que d'autres facteurs nutritionnels pourraient présenter un intérêt notable. De par son rôle majeur dans la formation osseuse, la vitamine K apparaît de plus en plus dans la littérature comme une piste prometteuse 5 pour préserver la santé osseuse de l'homme tout au long de sa vie. Les apports nutritionnels recommandés en vitamine K chez l'homme (1,5 pg/j/kg de poids) ont été établis en ne prenant en considération que son rôle dans les phénomènes de coagulation. Or, des études récentes suggèrent que ces apports nutritionnels recommandés 10 sont finalement sous-estimés si l'on prend également en compte l'activité de la vitamine K dans le métabolisme osseux (Ronden et al., 1998). Si les besoins en vitamine K sont encore mal connus, il n'en demeure pas moins que de faibles apports sont associés à une faible masse osseuse et à un risque accru de fractures chez l'adulte (Hart et al., 15 1985 ; Knapen et al., 1989 ; Szulc et al., 1993 ; Booth et al, 2000). De plus, des études d'intervention chez les femmes ménopausées ont montré que la vitamine K pouvait permettre de diminuer les pertes osseuses pour cette cible (Shiraki et al., 2000 ; Braam et al., 2003). Enfin, des études chez l'animal suggèrent qu'elle pourrait jouer un rôle favorable au cours 20 du pic de masse osseuse et ce, d'autant mieux en cas d'association synergique avec la vitamine D. Cependant, les études reliant clairement la vitamine K et la croissance osseuse n'ont pour l'heure été menées que chez l'animal. De plus, des études récentes ont permis d'apporter des arguments 25 supplémentaires en faveur de l'impact de la vitamine K sur le métabolisme osseux et, en particulier, sur la constitution et la préservation de la masse osseuse (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano et Ishi, 2002). Contrairement à l'adulte, peu de données sont encore disponibles 30 en ce qui concerne les effets bénéfiques de la vitamine K sur le métabolisme osseux de l'enfant. On sait seulement qu'il est essentiel 2906816 5 d'optimiser la masse osseuse pendant la période de croissance, afin de constituer un réservoir osseux maximal et de protéger l'adulte contre le risque d'ostéoporose à venir. En tout état de cause, il ressort de l'ensemble des données 5 disponibles à ce jour que l'amélioration de la teneur en vitamine K des produits alimentaires est une piste particulièrement intéressante et prometteuse pour permettre à l'individu de construire et maintenir une bonne constitution osseuse. Dans ce contexte, il existe déjà des produits industriels sur le 10 marché de l'alimentaire contenant une quantité notable de vitamine K. On peut notamment citer certains produits laitiers renfermant des bactéries lactiques, tels que les Petits Gervais aux Fruits commercialisés en France par la Demanderesse. On notera néanmoins que, d'une part, la teneur de ces produits en vitamine K dépend généralement du type de 15 ferments utilisés et, d'autre part, les souches de Lactococcus lactis classiquement utilisées dans les produits laitiers ne produisent pas une quantité suffisante de vitamine K pour véritablement combler les besoins de la population, voire pour aider à pallier d'éventuelles carences en vitamine K. 20 Il existe donc un besoin dans la technique actuelle pour des produits alimentaires, notamment des produits fermentés et/ou des produits laitiers frais, qui renferment de la vitamine K en quantités suffisantes pour contribuer à satisfaire les besoins et, si nécessaire, à combler les carences, tant chez l'enfant et l'adolescent, que chez l'adulte 25 et la personne âgée. Dans ce qui suit, les termes vitamine K2 et vitamine K sont utilisés indifféremment pour désigner la vitamine K2. La présente invention vise donc à répondre à ce besoin en proposant de préparer des produits alimentaires, notamment des produits 30 fermentés et/ou des produits laitiers frais, en utilisant de nouveaux variants de souches de bactéries lactiques, qui produisent des quantités 2906816 6 de vitamine K significativement supérieures à celles produites par les souches desquelles ils dérivent. En outre, au cours de leurs travaux, les Inventeurs ont mis au point des conditions de mise en oeuvre des bactéries lactiques qui favorisent de 5 manière tout à fait sensible la production de vitamine K par rapport aux conditions de production classiques (voir les Exemples ci-dessous). Ainsi, aux fins de la préparation de produits alimentaires, tels que des produits fermentés et/ou des produits laitiers frais, enrichis en vitamine K2, on pourra avantageusement utiliser les variants surproducteurs de 10 vitamine K qui font l'objet de la présente invention dans les conditions de mise en oeuvre identifiées par les Inventeurs comme étant particulièrement favorables à la production de vitamine K. Selon un premier aspect, la présente invention concerne un variant d'une souche de bactérie lactique produisant, dans des conditions de 15 fermentation standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions, ainsi que les cultures et fractions de cultures biologiquement pures dudit variant. Le terme variant couvre ici : les variants naturels, c'est-à-dire obtenus spontanément à partir d'une souche de bactérie lactique de référence sous l'effet d'une pression de sélection ; les variants naturels ne subissent donc aucune manipulation génétique, mais sont obtenus principalement par mutation et sélection à partir de la souche de référence ; et les mutants comprenant une ou plusieurs mutations dans leur génome, qui ont été induites par génie génétique, c'est-à-dire par des techniques de mutagénèse dirigée, notamment par transformation génétique à l'aide de vecteurs, appliquées à la souche de référence. 20 25 30 2906816 7 On notera que, dans certains pays (notamment en Europe), des précautions doivent être prises par les industriels de l'alimentaire lorsqu'ils développent des produits destinés à l'alimentation humaine et/ou animale, dans lesquels sont incorporés des microorganismes, plus 5 particulièrement des microorganismes vivants. En effet, les organismes (ici, microorganismes) génétiquement modifiés (OGM ou mutants) peuvent susciter un sentiment de crainte et d'appréhension chez les consommateurs. Cette image négative dont souffrent les OGM dans certains pays est telle que le public a tendance à boycotter les 10 aliments contenant des OGM. Aussi, dans un contexte où les consommateurs exigent toujours plus de transparence aux niveaux du contenu des produits alimentaires qui leur sont proposés et de l'origine des ingrédients que ces produits contiennent, les industriels peuvent être amenés à proposer des produits quasi-exclusivement, voire 15 exclusivement, sans OGM. Dans le contexte de la présente invention, il peut donc être avantageux que les produits alimentaires issus de l'industrie et contenant des microorganismes soient préparés en utilisant exclusivement des souches naturelles ou des variants naturels de souches naturelles. 20 En tous les cas, les variants sont, au sens de l'invention, des souches de bactéries lactiques capables de produire plus de vitamine K2 que les souches dont elles sont issues. Plus précisément, les variants selon la présente invention sont capables de produire au moins environ 1,2 fois plus de vitamine K2 que les souches 25 de départ. De préférence, la quantité de vitamine K2 produite par un variant conforme à la présente invention est supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,5, à celle obtenue en cultivant la souche de bactérie lactique de départ dans les mêmes conditions de fermentation standard. Ce facteur est de manière encore préférée au moins égal à 30 environ 1,7, plus préférentiellement au moins égal à environ 1,8, plus préférentiellement encore au moins égal à environ 1,9. Des valeurs de ce 2906816 8 facteur encore davantage préférées sont d'au moins environ 2 ; 2,2 ; 2,4 ; 2,5;2,7;2,82,9;3. Les souches de bactéries lactiques de référence ou de départ sont les souches à partir desquelles les variants selon l'invention 5 sont obtenus. Ces souches peuvent être naturelles ou bien être elles- mêmes des variants, c'est-à-dire des variants naturels ou des mutants. En particulier, un variant conforme à la présente invention produit, dans des conditions de laboratoire (ou conditions de fermentation standard) : - au moins environ 1,5 fois plus, de préférence au moins environ 2 fois plus, 10 de préférence encore au moins environ 3 fois plus, de vitamine K2 que le ferment CHN-12 commercialisé par CHR. Hansen A/S (Horsholm, DK) ; et/ou - au moins environ 1,5 fois plus, de préférence au moins environ 2 fois plus, de préférence encore au moins environ 3 fois plus et, avantageusement 15 jusqu'à au moins environ 10 fois plus, de vitamine K2 que la souche naturelle modèle Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 déposée au CBS (Baam, NL) sous le numéro CBS 364.89. Cette souche modèle de Lactococcus lactis ssp. cremoris est parfaitement connue de l'homme du métier. Elle a été décrite pour la première fois par Gasson en 1983 (Gasson 20 M., 1983). Dans le cadre de la présente invention, les conditions de laboratoire sont des conditions de fermentation tout à fait standard et bien connues de l'homme du métier. Ainsi, les expressions conditions de laboratoire et conditions de fermentation standard sont ici 25 parfaitement synonymes. Les conditions de laboratoire préférées au sens de la présente invention sont les suivantes : une préculture de la souche est réalisée sur milieu commercial M17 (DifcoTM M17 Agar) ou sur un milieu équivalent, additionné de 20pl/mI d'une solution d'hémine à 0,5mg/ml dans de la soude 0,1 M. Pour la culture qui suit, 30 l'ensemencement est réalisé à 1% à l'aide de la préculture. La température d'incubation est de 30 C environ. L'aération est assurée par 2906816 9 simple agitation. On retiendra que les conditions de laboratoire peuvent être modifiées en cas de besoin par l'homme du métier, sur la base de ses connaissances générales et, éventuellement, après des expériences de mises au point de routine. Toutefois, on veillera à systématiquement 5 préserver les trois critères essentiels suivants : (i) le milieu de culture est un milieu approprié pour cultiver les souches de bactéries lactiques, notamment les souches de Lactococcus spp. ; (ii) au moins un composé contenant un noyau hémique (par exemple, de l'hémine, de la catalase ou des dérivés de chlorophylle) est ajouté dans le milieu de préculture et/ou 10 de culture (de préférence, à la fois dans le milieu de préculture et dans le milieu de culture) ; et (iii) la préculture et/ou la culture (de préférence, la préculture et la culture) est(sont) mise(s) en oeuvre sous agitation. Selon un mode de réalisation préféré, la souche naturelle de bactérie lactique est choisie parmi les genres Lactococcus, Leuconostoc, 15 Enterococcus et Propionibacterium. Elle est plus particulièrement choisie parmi les espèces Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium, Propionibacterium sp. Avantageusement, si la quantité de vitamine K2 produite par les 20 variants est d'au moins 5,5 pg environ pour 100g de lait fermenté dans des conditions de fermentation standard, on pourra parler de variant surproducteur de vitamine K2. En particulier, un variant naturel au sens de la présente invention produit au moins 5,7 pg environ, de préférence encore au moins 5,9 pg environ, de manière encore préférée au moins 6,1 25 pg environ, et, mieux, au moins 6,3 pg environ de vitamine K2 pour 100g de lait fermenté dans des conditions de fermentation standard. Plus préférentiellement, un variant naturel selon la présente invention produit au moins 6,5 pg environ, de préférence au moins 7 pg environ, de préférence encore au moins 7,5 pg environ, de manière plus préférée au 30 moins 8 pg environ, de manière plus préférée encore au moins 8,5 pg environ, de manière encore davantage préférée au moins 9 pg environ, 2906816 10 mieux, au moins 9,5 pg environ et, encore mieux, au moins 10 pg environ de vitamine K2 pour 100g de lait fermenté dans des conditions de fermentation standard. En accord avec la définition de variant naturel donnée plus haut, 5 un variant selon la présente invention est, de préférence, un variant naturel obtenu par pression de sélection sur un milieu de culture approprié. Plusieurs exemples de tels variants naturels obtenus par pression de sélection sont fournis dans la présente demande. Brièvement (pour plus de détails, voir la partie Exemples ci-dessous), des exemples préférés de 10 variants naturels et méthodes pour les obtenir sont les suivants. Selon un premier mode de réalisation, un variant naturel conforme à l'invention est obtenu par pression de sélection sur un milieu de culture contenant de la bacitracine. En fonction des souches de départ, la concentration de bacitracine dans le milieu peut être, par exemple, d'au 15 moins 0,4 mg/I environ, de préférence d'au moins 1 mg/I environ, de préférence encore d'au moins 2 mg/I environ, de manière encore préférée d'au moins 3 mg/I environ et de manière préférée entre toutes d'au moins 4 mg/I environ. Cependant, il est clair pour l'homme du métier que la concentration de bacitracine à utiliser pour obtenir des variants naturels 20 conformes à l'invention, sera déterminée en fonction du niveau de résistance à la bacitracine de la souche de bactérie lactique utilisée au départ. Si nécessaire, l'homme du métier travaillera à plusieurs concentrations différentes qu'il choisira en fonction des propriétés de la souche de départ. De manière avantageuse, l'homme du métier pourra 25 travailler avec des gammes de concentrations de bacitracine. Un variant naturel particulièrement intéressant présente essentiellement les mêmes propriétés biologiques que le variant naturel 1-3557, déposé à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, 30 France) le 20/01/2006. 2906816 11 Par l'expression un variant A présente essentiellement les mêmes propriétés biologiques que le variant naturel 1-3557 , on entend ici que le variant A est un variant naturel obtenu par pression de sélection sur un milieu comprenant de la bacitracine. Toutefois, la concentration de 5 bacitracine mise en oeuvre dans le milieu pour obtenir le variant A n'est pas déterminante pour satisfaire à la présente définition. La condition déterminante, en revanche, est que le variant A soit capable de produire, dans les conditions de laboratoire, approximativement autant, de préférence au moins autant, de vitamine K2 que le variant 1-3557. Un variant naturel au 10 sens de l'invention est de préférence le variant naturel I-3557. Dans un deuxième mode de réalisation, un variant naturel selon la présente invention est obtenu par pression de sélection sur un milieu de culture contenant au moins un agent oxydant. Par exemple, l'agent oxydant peut être choisi parmi le péroxyde, les ions hyperchloriques, les ions ferreux, 15 la ménadione, le paraquat, l'oxygène ou n'importe quel autre composé oxydant approprié. De préférence, l'agent oxydant est du péroxyde. Comme pour la bacitracine, la concentration de péroxyde dans le milieu est déterminée en fonction de la souche de bactérie lactique de départ. Par exemple, on pourra tester une ou plusieurs concentrations de péroxyde 20 dans les gammes suivantes : au moins 20, 25, 27, 28,5 mg/I environ. Encore une fois, l'homme du métier déterminera une ou plusieurs concentrations, voire une ou plusieurs gammes de concentrations, appropriées de péroxyde qu'il testera expérimentalement comme il en a l'habitude. Avantageusement, un variant naturel conforme à l'invention présente 25 essentiellement les mêmes propriétés biologiques que le variant naturel 1-3558 (déposé à la CNCM le 20/01/2006). La définition de l'expression un variant A présente essentiellement les mêmes propriétés biologiques que le variant naturel I-3557 donnée plus haut, s'applique ici mutatis mutandis (péroxyde au lieu de bacitracine ; variant 1-3558 au lieu du variant I-3557). 30 De préférence, un tel variant est le variant naturel l-3558. 2906816 12 Selon un troisième mode de réalisation, on obtient un variant naturel conforme à l'invention par pression de sélection sur un milieu de culture contenant des analogues structuraux des acides aminés aromatiques. A titre d'exemples de tels analogues, on citera notamment la m- 5 fluorophénylalanine, la p-fluorophénylalanine, la m-fluorotyrosine et le phénylalaninamide. Ainsi, de préférence, le milieu de sélection de tels variants naturels comprendra au moins un analogue choisi parmi la mfluorophénylalanine, la p-fluorophénylalanine, la m-fluorotyrosine, le phénylalaninamide et leurs combinaisons. Des protocoles de sélection de 10 variants bactériens sur un milieu contenant des analogues structuraux des acides aminés aromatiques ont déjà été décrits et sont bien connus de l'homme du métier (Tsukamoto et al., 2001). Ainsi, l'homme du métier pourra, par exemple, mettre en oeuvre la procédure expérimentale rapportée dans la partie Exemples ci-dessous qu'il modifiera en cas de besoin, en 15 faisant appel à ses connaissances générales et à des mises au point de routine. Un exemple préféré d'un variant naturel obtenu sur un milieu de culture contenant des analogues structuraux des acides aminés aromatiques présente essentiellement les mêmes propriétés biologiques 20 que le variant naturel 1-3626, déposé à la CNCM le 19/06/2006. Comme précédemment, la définition de l'expression un variant A présente essentiellement les mêmes propriétés biologiques que le variant naturel 1-3557 donnée plus haut, s'applique ici mutatis mutandis (analogues structuraux des acides aminés aromatiques au lieu de bacitracine ; variant I- 25 3626 au lieu du variant 1-3557). En particulier, ce variant est le variant naturel 1-3626. Un deuxième aspect de la présente invention vise un procédé d'obtention d'un variant naturel d'une souche de bactérie lactique tel que décrit plus haut, ledit procédé comprenant au moins : 30 a) la culture de la souche de bactérie lactique dans des conditions de fermentation standard sur un milieu de sélection approprié ; et 2906816 13 b) la sélection dudit variant s'il produit au moins environ 1,2 fois plus de vitamine K2 que la souche de bactérie lactique de départ, cultivée dans les mêmes conditions. De préférence, le variant est sélectionné à l'étape b) s'il produit, dans 5 des conditions de fermentation standard : - au moins 1,5 fois plus environ, de préférence au moins 2 fois plus environ, de préférence encore au moins 3 fois plus environ, de vitamine K2 que le ferment CHN-12 ; et/ou - au moins 1,5 fois plus environ, de préférence au moins 2 fois plus environ, 10 de préférence encore au moins 3 fois plus environ et, avantageusement jusqu'à au moins 10 fois plus environ, de vitamine K2 que la souche naturelle modèle MG1363. Des milieux de sélection appropriés sont, par exemple, des milieux de culture contenant de la bacitracine, ou un agent oxydant tel que le 15 péroxyde, ou encore des analogues structuraux des acides aminés aromatiques. Avantageusement, le variant est sélectionné à l'étape b) s'il produit, dans des conditions de fermentation standard, au moins 5,5 pg environ de vitamine K2 pour 100g de lait fermenté. 20 Dans un troisième aspect, la présente invention concerne un variant naturel d'une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenu par un procédé tel que décrit ci-dessus, ledit variant produisant, dans des conditions de fermentation standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par la 25 souche de bactérie lactique de départ cultivée dans les mêmes conditions. Les caractéristiques particulières des variants décrites plus haut peuvent également s'appliquer aux variants naturels susceptibles d'être ainsi obtenus. Par exemple, de tels variants naturels sont avantageusement capables de produire au moins 5,5 pg environ de vitamine K2 pour 100g de 30 lait fermenté dans des conditions de fermentation standard. 2906816 14 Un quatrième aspect de la présente invention vise des utilisations de conditions de sélection particulières pour obtenir des variants naturels de souches de bactéries lactiques qui, conformément à la description qui précède, produisent, dans des conditions de fermentation standard, au 5 moins 1,2 fois plus environ de vitamine K2 que les souches de départ cultivées dans les mêmes conditions.. Ces utilisations sont notamment : - l'utilisation de la résistance à la bacitracine ; et/ou -l'utilisation de la résistance à un agent oxydant, tel que le péroxyde ; et/ou 10 - l'utilisation de la résistance aux analogues structuraux des acides aminés aromatiques. Comme indiqué précédemment, lesdits variants naturels sont avantageusement capables de produire au moins 5,5 pg environ de vitamine K2 pour 100g de lait fermenté dans des conditions de fermentation standard. 15 Un cinquième aspect de la présente invention a trait à un ferment lactique qui comprend au moins un variant tel que décrit supra. Selon un sixième aspect, la présente invention concerne un procédé de production d'un produit alimentaire enrichi en vitamine K2, comprenant au moins : 20 a) la mise en oeuvre d'au moins un variant et/ou au moins un ferment tel(s) que décrit(s) plus haut, dans une préparation intermédiaire dudit produit ; et b) l'obtention dudit produit enrichi en vitamine K2. Alternativement, un procédé pour augmenter la teneur en vitamine K2 d'un produit alimentaire comprend au moins : 25 a) la mise en oeuvre d'au moins un variant et/ou au moins un ferment tel(s) quedécrit(s) plus haut, dans une préparation intermédiaire dudit produit ; et b) l'obtention dudit produit enrichi en vitamine K2. Les variants et/ou le ferment lactique peuvent notamment être mis en oeuvre en utilisant des concentrats de bactéries précultivées sur place 30 (sur le site de production des produits alimentaires), ou en utilisant des bactéries précultivées par un fournisseur de ferments, puis conditionnées 2906816 15 et expédiées vers le(s) site(s) de production des produits alimentaires. Les fournisseurs peuvent conditionner les bactéries à l'état frais ou congelé ; alternativement, les bactéries peuvent être séchées ou lyophilisées. Les bactéries sont, dans tous les cas, ajoutées à la masse laitière de manière 5 tout à fait classique (comme n'importe quel autre ferment lactique connu). Un septième aspect de la présente invention vise un produit alimentaire enrichi en vitamine K2 susceptible d'être obtenu par un procédé tel que divulgué ci-dessus. L'invention s'intéresse aux produits alimentaires pour l'homme et/ou l'animal, avec une préférence pour les 10 produits destinés à l'alimentation humaine. Avantageusement, un tel produit alimentaire enrichi en vitamine K2 renforce la solidité des os de la personne qui le consomme. Cette personne est, de manière préférée, un enfant. De préférence, un produit alimentaire au sens de l'invention est 15 choisi parmi les produits fermentés, les produits laitiers frais fermentés ou non, les produits à base de jus d'origine végétale (fruits, légumes, céréales, soja, etc.) fermentés ou non, et leurs combinaisons. De manière plus particulièrement préférée, un produit alimentaire au sens de l'invention est un produit fermenté et/ou un produit laitier frais. 20 Dans le contexte de l'invention, les produits laitiers frais désignent plus particulièrement des produits laitiers frais et fermentés, prêts à la consommation humaine, c'est-à-dire des aliments laitiers frais et fermentés. Dans la présente demande, sont plus particulièrement visés les laits fermentés et yoghourts. Lesdits aliments laitiers frais et fermentés 25 peuvent alternativement être des fromages blancs ou des petits-suisses. On donne aux termes laits fermentés et yoghourts leurs significations usuelles dans le domaine de l'industrie laitière, c'est-à-dire des produits qui sont destinés à la consommation humaine et qui sont issus de la fermentation lactique acidifiante d'un substrat laitier. Ces 30 produits peuvent contenir des ingrédients secondaires tels que fruits, végétaux, sucre, etc. On peut, par exemple, se reporter au Décret français 2906816 16 n 88-1203 du 30 décembre 1988 relatif aux laits fermentés et au yaourt ou yoghourt, publié au Journal Officiel de la République Française du 31 décembre 1988. On peut également se reporter au Codex Alimentarius (préparé 5 par la Commission du Codex Alimentarius sous l'égide de la FAO et de l'OMS, et publié par la Division Information de la FAO, disponible en ligne sur http://www.codexalimentarius.net; cf. plus particulièrement le volume 12 du Codex Alimentarius Normes Codex pour le lait et les produits laitiers , et la norme CODEX STAN A -1 1(a)-1975 ). 10 L'expression lait fermenté est ainsi réservée dans la présente demande au produit laitier préparé avec un substrat laitier qui a subi un traitement au moins équivalent à la pasteurisation, ensemencé avec des microorganismes appartenant à l'espèce ou aux espèces caractéristique(s) de chaque produit. Un lait fermenté n'a subi aucun 15 traitement permettant de soustraire un élément constitutif du substrat laitier mis en oeuvre et n'a notamment pas subi un égouttage du coagulum. La coagulation des laits fermentés ne doit pas être obtenue par d'autres moyens que ceux qui résultent de l'activité des microorganismes utilisés. 20 Le terme yoghourt est quant à lui réservé au lait fermenté obtenu, selon les usages locaux et constants, par le développement des bactéries lactiques thermophiles spécifiques dites Lactobacillus bulgaricus et Streptococcus thermophilus, qui doivent se retrouver vivantes dans le produit fini, à raison d'au moins 10 millions de bactéries par gramme 25 rapportées à la partie lactée. Dans certains pays, la réglementation autorise l'ajout d'autres bactéries lactiques dans la production de yoghourt, et notamment l'utilisation additionnelle de souches de Bifidobacterium et/ou Lactobacillus acidophilus et/ou Lactobacillus casei. Ces souches lactiques 30 additionnelles sont destinées à conférer au produit fini diverses propriétés, 2906816 17 telles que celle de favoriser l'équilibre de la flore intestinale ou de moduler le système immunitaire. Dans la pratique, l'expression lait fermenté est donc généralement utilisée pour désigner les laits fermentés autres que les 5 yoghourts. Elle peut d'ailleurs prendre, selon les pays, des noms aussi divers que, par exemple, Kefir , Kumiss , Lassi , Dahi , Leben , Filmjôlk , Villi , Acidophilus milk . S'agissant des laits fermentés, la quantité d'acide lactique libre contenue dans le substrat laitier fermenté ne doit pas être inférieure à 10 0,6 g pour 100 g lors de la vente au consommateur, et la teneur en matière protéique apportée à la partie lactée ne doit pas être inférieure à celle d'un lait normal. Enfin, la dénomination fromage blanc ou petit-suisse est, dans la présente demande, réservée à un fromage non affiné, non salé, 15 qui a subi une fermentation par des bactéries lactiques uniquement (et aucune autre fermentation que la fermentation lactique). La teneur en matière sèche des fromages blancs peut être abaissée jusqu'à 15 g ou 10 g pour 100 g de fromage blanc, selon que leur teneur en matières grasses est supérieure à 20 g, ou au plus égale à 20 g pour 100 g de fromage 20 blanc, après complète dessication. La teneur en matière sèche d'un fromage blanc est comprise entre 13 et 20 %. La teneur en matière sèche d'un petit-suisse quant à elle n'est pas inférieure à 23 g pour 100 g de petit-suisse. Elle est généralement comprise entre 25 et 30 %. Les fromages blancs et petits-suisses sont généralement regroupés sous la 25 dénomination fromages frais , utilisée de manière classique dans le domaine technique de la présente invention. Dans un huitième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un variant et/ou au moins un ferment comme décrit(s) plus haut, pour préparer un produit alimentaire enrichi en vitamine K2. 30 Avantageusement, un tel produit alimentaire enrichi en vitamine K2 renforce la solidité des os de la personne qui le consomme. Cette 2906816 18 personne est, de manière préférée, un enfant. Les figures suivantes illustrent la présente invention, sans néanmoins en limiter ni l'objet ni la portée. - Figure 1 : Histogramme illustrant l'influence de la concentration en 5 matière grasse des laits sur la production de vitamine K2 par les bactéries lactiques. Souches 1 et 2: exemples de souches naturelles de Lactococcus lactis ssp. cremoris. - Figure 2 : Exemples de cinétique de production de la vitamine K2 sur lait entier et de cinétique d'acidification (cadre supérieur gauche) pour une 10 souche naturelle de bactérie lactique (souche n 1). - Figure 3 : Histogramme présentant la production de vitamine K2 par des cultures en resting celas à différentes températures. Témoin : culture dans des conditions de croissance standard. - Figure 4: Histogramme présentant l'influence des conditions de 15 préculture sur la production de vitamine K2 selon les souches. - Fiqure 5 : Graphique illustrant l'influence de la population bactérienne initiale du variant naturel 1-3558 sur la production de vitamine K2 pendant la phase de resting celas , réalisée en lait classique ou en lait tamponné. Sans respiration : préculture classique puis culture en 20 conditions de resting cells en lait entier. Respiration labo : préculture dans des conditions de respiration réalisée en tube puis culture en conditions de resting cells en lait entier. Respiration labo en lait tamponné : préculture dans des conditions de respiration puis culture en conditions de resting cells en lait tamponné par le 6- 25 glycérolphosphate. Respiration en fermenteur : préculture dans des conditions de respiration réalisée en fermenteur suivie d'une culture en conditions de resting cells en lait classique. - Figure 6: Histogramme présentant l'influence de la viabilité bactérienne du variant naturel 1-3558 sur la production de vitamine K2 pendant la 30 phase de resting cells . VitK STZ : préculture en conditions de respiration traitée à la streptozotocine puis culture en conditions de 2906816 19 resting cells en lait entier additionné d'érythromycine. VitK R+ : préculture dans des conditions de respiration réalisée en tube puis culture en conditions de resting cells en lait entier. II est clair que la présente invention ne se limite pas à la seule 5 description ci-dessus. D'autres modes de réalisation et avantages de l'invention pourront ressortir à la lecture des exemples ci-dessous, fournis à titre purement illustratif. EXEMPLES 10 PARTIE A : OBTENTION DE VARIANTS NATURELS DE SOUCHES NATURELLES DE BACTERIES LACTIQUES CAPABLES DE PRODUIRE DES QUANTITES AVANTAGEUSES DE VITAMINE K A titre de remarques préliminaires, il est à noter que les protocoles 15 d'obtention de variants naturels décrits ci-dessous sont applicables à n'importe quel type de souche de bactérie lactique de départ. En fonction des souches de départ que l'homme du métier utilisera, il pourra éventuellement être amené, pour des raisons essentiellement pratiques, à modifier certaines des conditions expérimentales mises au point par les 20 Inventeurs. En tout état de cause, les modifications que l'homme du métier sera susceptible d'apporter aux procédures ci-dessous seront mineures et nécessiteront uniquement de simples manipulations de routine n'impliquant aucune activité inventive. 25 A-I- Obtention et utilisation de variants naturels résistants à la bacitracine Bien qu'une exposition à des agents tels que la bacitracine ou le péroxyde soit connu pour permettre de sélectionner des souches bactériennes qui présentent une résistance accrue à ces agents, il n'a 30 jamais été établi de lien dans la littérature entre la résistance à la 2906816 20 bacitracine ou au péroxyde et les niveaux de production de vitamine K2 par les bactéries. Dans le cadre de leurs travaux, les Inventeurs ont découvert de manière tout à fait inattendue que les bactéries étaient capables de 5 développer un mécanisme original de résistance à certains agents tels que la bacitracine ou le péroxyde, impliquant une augmentation de la production de vitamine K2. Les Inventeurs ont envisagé de mettre à profit cette découverte aux fins de l'obtention, en utilisant la bacitracine ou le péroxyde, par exemple, comme agent de sélection, de variants naturels 10 de souches de bactéries lactiques (notamment Lactococcus lactis) capables de surproduire la vitamine K2. A-I-1- Protocole d'obtention de variants résistants à la bacitracine 15 Une préculture a été réalisée à partir d'un cristal d'une souche naturelle de Lactococcus lactis en présence de 2 mL de milieu de culture commercial classique M17 (milieu M17 Agar, DifcoTM) additionné de lactose à 5g/l (ci-après, milieu M17 Lac) et d'hémine (20 pL/mL) (ci-après, milieu M17 Lac + hémine). L'incubation a été effectuée sous agitation à 20 30 C. La préculture a servi à ensemencer 2 mL de M17 Lac + hémine supplémenté en bacitracine (4pg/mL). Le taux d'ensemencement était de 1 %. La culture a ensuite été incubée pendant 48H sous agitation à 30 C. Puis, 100 pL de cette suspension ont été déposés sur une gélose 25 de M17 Lac. Un disque de papier imbibé avec 2,5 mg de bacitracine a été déposé au centre de la boîte. La gélose a été incubée 48H à 30 C. Les clones proches du disque de papier ont été cultivés en présence de bacitracine (4pg/mL) dans 2mL de M17 Lac + hémine. L'incubation a duré 24H sous agitation à 30 C. 30 Les cellules ont été isolées sur gélose M17 Lac en présence de bacitracine (2pg/mL) après une incubation de 48H à 30 C. Les clones 2906816 21 isolés ont été cultivés en M17 Lac + hémine, puis incubés pendant 24H sous agitation à 30 C. Cette suspension a servi à l'élaboration du stock congelé. Ces expériences ont permis aux Inventeurs de sélectionner le 5 variant naturel Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3557 déposé à la CNCM le 20/01/2006. A-I-2- Protocole de réalisation d'un exemple de produit laitier avec le variant bacitracine 10 Une préculture a été réalisée à partir d'un cristal de la souche dans 2 mL de M17 Lac. La préculture a servi à ensemencer, à 1%, 50 mL de lait entier UHT qui ont été incubés à 30 C pendant 24H. Le Tableau I ci-dessous donne le résultat du dosage de vitamine 15 K2 exprimé en pg Equivalent MK4/100g de produit, pour le variant bacitracine-résistant et la souche correspondante sauvage. Tableau Souche 1-3557 sauvage Vitamine K 8,90 3, 32 (en pg/100g) Le variant bacitracine-résistant surproduit donc, à raison d'un facteur 3, la 20 vitamine K lorsqu'on le compare à la souche sauvage de départ. A-II- Obtention et utilisation de variants naturels résistants au peroxyde La respiration de Lactococcus lactis a été mise en évidence assez 25 récemment (Duwat et al., 2001). Le séquençage du génome d'une souche de L. lactis (ILI 403) a confirmé la présence des gènes codant les fonctions nécessaires à la respiration aérobie (Bolotin et al., 2001). L. lactis possède en effet les opérons men et cytABCD codant les protéines 2906816 22 nécessaires à la synthèse de ménaquinone et à la biogenèse du cytochrome D. Cette espèce possède également les trois gènes impliqués dans les dernières étapes de la synthèse d'hème (hemH, hemK et hemN, qui sont requis dans l'oxydation de la porphyrine pour l'attachement du fer 5 à l'hème), mais ne possède pas les gènes impliqués dans les premières étapes de ce processus. Toutefois, L. lactis est capable de réaliser une phosphorylation oxydative en présence de protoporphyrinogène. On a également montré que L. lactis pouvait respirer en présence d'oxygène et d'hème dans le milieu de culture. Cette respiration permet 10 aux cellules d'atteindre une biomasse plus importante et le pH final observé est plus élevé que celui habituellement obtenu. Des cultures en présence d'oxygène et/ou d'hème permettent d'obtenir des courbes de croissances comparables pendant approximativement les 6 ou 7 premières heures de fermentation. Ensuite, la consommation de glucose 15 diminue dans le cas des cultures en présence d'oxygène et d'hème, et la production de lactate est alors moindre. Cela traduit un shift de métabolisme qui se produit assez tardivement au cours de la culture. La respiration de L. lactis se fait donc vers la fin de la phase exponentielle de croissance (Duwat et al., 2001). 20 Le rôle de la respiration de L. lactis n'est pas encore connu, pas plus que le rôle que peut tenir la vitamine K2 chez cette espèce à métabolisme plutôt fermentaire. Les Inventeurs ont d'ailleurs constaté que la vitamine K2 était produite par des souches de L. lactis alors que la respiration n'était pas induite dans les conditions testées (pas d'hème 25 dans le milieu et pas d'agitation permettant une bonne oxygénation du milieu). Dans le cytoplasme, les protéines ne présentent que peu de ponts disulfures contrairement aux protéines extracellulaires. Il existe un système enzymatique largement répandu qui permet de limiter le nombre 30 de ponts disulfures. Les liaisons S-S sont réduites en fonction SH par 2906816 23 l'intermédiaire d'une enzyme, la thioredoxine. Cette enzyme est régénérée par la thioredoxine réductase. Vido et al (2005) ont créé par génie génétique un mutant trx81 de L. lactis. Le gène trx81 code pour la thioredoxine réductase. L'étude par électrophorèse bi-dimensionnelle des 5 protéines synthétisées par ce mutant a montré qu'il surproduisait certaines des enzymes de la voie de synthèse de la vitamine K2, à savoir les enzymes MenB et MenD. Au vu de ces données ainsi que d'après des observations personnelles, les Inventeurs ont supposé que l'une des voies possibles 10 pour améliorer la production de vitamine K2 par L. lactis pourrait être d'induire la respiration. Une autre piste pourrait être de tenter de mobiliser la vitamine K2 pour répondre à un stress oxydatif. Les Inventeurs ont donc cherché à obtenir des variants naturels résistants à un stress oxydatif. 15 A-II-1- Protocole d'obtention de variants résistants à un stress oxydatif Le péroxyde a été choisi comme exemple d'agent oxydant utilisable. Bien entendu, d'autres agents oxydants tels que les ions 20 hyperchloriques, les ions ferreux, la ménadione, le paraquat, l'oxygène ou n'importe quel autre composé oxydant approprié, pourraient être utilisés dans des conditions similaires. Après une préculture sur milieu M17 Lac, les souches naturelles de départ ont été repiquées sur le même milieu contenant des concentrations 25 croissantes de péroxyde (par exemple, une gamme allant de au moins 20 à au moins 25, 27, 28,5 mg/I environ). Les cultures ont été incubées à 30 C. Après 24h, les premiers tubes de la gamme de concentration ne présentant pas de croissance ont été remis à incuber pendant 24h supplémentaires. Les clones ont ensuite été isolés par épuisement sur 30 milieu gélosé. Un clone a été sélectionné pour une concentration de 2906816 24 péroxyde de 27 mg/I. Les Inventeurs ont noté qu'au-delà d'une concentration de péroxyde de 28,5 mg/I, il n'y avait pas de croissance. Ces expériences ont ainsi permis aux Inventeurs de sélectionner le variant naturel Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3558 déposé à la 5 CNCM le 20/01/2006. A-II-2- Protocole de réalisation d'un exemple de produit laitier avec le variant péroxyde Le clone sélectionné a été mis en croissance dans du lait entier 10 pendant 24h. Des échantillons ont ensuite été prélevés et congelés à û 80 C pour un dosage ultérieur de vitamine K. Le Tableau II ci-dessous indique la quantité de vitamine K2 produite par le variant résistant au péroxyde, comparée à la quantité produite par la souche de départ (quantités exprimées en pg Equivalent MK-4/100g de 15 lait fermenté). Tableau Il Souche Vitamine K (pg/100g) Sauvage 2,92 0,45 1-3558 5,94 0,76 Comme le montre le Tableau II ci-dessus, le variant produit environ deux fois plus de vitamine K2 que la souche sauvage correspondante. 20 A-III- Obtention et utilisation de variants naturels résistants à des analogues structuraux des acides aminés aromatiques Les acides aminés aromatiques exercent un feed-back négatif sur leur propre voie de synthèse, au niveau d'une étape commune avec 25 les voies de synthèse de la vitamine K et des folates. Lorsque ces acides aminés sont présents dans le milieu, ces voies ne sont pas activées. Les Inventeurs ont donc cherché à lever cette régulation négative. 2906816 25 A-III-1- Protocole d'obtention de variants résistants à des analogues structuraux des acides aminés aromatiques Une souche naturelle de L. lactis a été étalée sur un milieu gélosé chimiquement défini (Cocaign-Bousquet, M., et al., 1995) ne contenant ni 5 tryptophane, ni phénylalanine, ni tyrosine. Les termes "milieu chimiquement défini sont parfaitement compris de l'homme de l'art. Il s'agit d'un milieu ne contenant que des composés simples et clairement définis (par exemple : vitamine B9, vitamine B12, adénine, tyrosine...), contrairement à un milieu semi-synthétique qui contient des composés 10 complexes (par exemple : extrait de levure, hydrolysat de caséine...). Un coupon buvard a été disposé au centre des boîtes de pétri et imbibé de 80p1 d'une solution contenant 50mM des composés suivants : m-fluorophénylalanine, p-fluorophénylalanine, m-fluorotyrosine et phénylalaminamide. Ces composés sont des analogues structuraux des 15 acides aminés aromatiques. Les boîtes ont été incubées à 30 C. Une zone d'inhibition de croissance est apparue autour des disques. Après 48h, des clones résistants sont apparus dans cette zone. Ces clones ont été remis en croissance sur le milieu chimiquement défini ne contenant pas d'acides aminés aromatiques. Le milieu a été additionné d'une 20 solution contenant les analogues structuraux de ces acides aminés. La concentration finale de chacun de ces composés était de 1 mM. A-III-2- Protocole de réalisation d'un exemple de produit laitier avec les clones acides aminés aromatiques 25 Les cultures obtenues conformément au paragraphe A-III-1 supra ont servi à ensemencer 50m1 de milieu M17 Lac (taux d'ensemencement de 1%) additionné de l ml d'une solution d'hémine (500mg/l). Les mêmes cultures ont servi à ensemencer un milieu ne contenant pas d'hémine, mais placé sous agitation. Un dernier type de culture a été réalisé. Un 30 milieu M17L a été ensemencé et placé à 30 C sans agitation. Les cultures ont été placées une nuit à 30 C sous agitation (250rpm). Ces cultures ont 2906816 26 ensuite été centrifugées 5 min à 6000g. Le surnageant a été retiré et remplacé par 50m1 de lait entier. Après 24h, les laits fermentés ont été placés à -80 C en attendant le dosage de la vitamine K2 (voir paragraphe B-VI ci-dessous). 5 Les expériences de dosage de la vitamine K2 ont permis aux Inventeurs de sélectionner un des clones comme étant un variant naturel surproduisant la vitamine K2 (voir paragraphe B-VI ci-dessous) : il s'agit du variant naturel Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3626 déposé à la CNCM le 19/06/2006. 10 PARTIE B : MISE AU POINT DES CONDITIONS DE MISE EN OEUVRE DES BACTERIES LACTIQUES POUR FAVORISER LA PRODUCTION DE VITAMINE K 15 B-IL'influence de la matière cirasse dans le milieu Lors de dosages effectués sur différents produits, les Inventeurs ont constaté que le produit contenant le plus de vitamine K2 était la crème fermentée. De plus, la vitamine K2 est fortement hydrophobe. Les Inventeurs ont donc émis l'hypothèse que la présence de matière grasse, 20 ou pour le moins, un environnement hydrophobe, pouvait favoriser la production de vitamine K2. Des fermentations ont donc été réalisées sur des laits contenant différentes concentrations de matière grasse. Les précultures ont été réalisées sur milieu M17 Lac. Les laits ont été ensemencés à 1%. La 25 fermentation a été maintenue à 30 C pendant 24h. Ensuite, des échantillons ont été congelés en attendant un dosage ultérieur. Les résultats sont représentés dans la figure 1, pour deux souches naturelles de L. lactis subsp. cremoris (souches n 1 et 2). Si l'on considère les résultats obtenus avec l'une des deux souches 30 naturelles étudiées à titre d'exemples, l'utilisation d'un lait demi-écrémé (à 1,5% de matière grasse environ) au lieu d'un lait écrémé permettait 2906816 27 d'augmenter la production de vitamine K2 d'un facteur 4. Le passage d'un lait demi-écrémé à un lait entier (3,5% de matière grasse environ) permettait de gagner un facteur 2. Cette tendance était la même quelle que soit la souche naturelle 5 considérée. Cependant, l'augmentation de la quantité de vitamine K2 produite avec celle de la teneur du milieu en matière grasse semble asymptotique puisque la fermentation d'une crème à 40% de matière grasse environ n'a pas permis d'obtenir des quantités de vitamine K2 supérieures à celles 10 obtenues sur un lait entier (données non montrées). B-II- L'influence du taux de croissance des bactéries lactiques Lors de la croissance en lait d'une souche naturelle de L. lactis subsp. cremoris (souche naturelle n 1), les Inventeurs ont réalisé un suivi 15 de la cinétique de la production de vitamine K2 . Comme le montre la figure 2, la production de vitamine ne démarrait que lorsque la croissance ralentissait. La vitesse de croissance pouvait être appréhendée par le suivi de la cinétique d'acidification. Lorsque la vitesse maximale d'acidification était atteinte, la bactérie entrait 20 en phase de ralentissement. Ce type de comportement est relativement classique lors de la synthèse de métabolites secondaires. Différents paramètres peuvent être étudiés afin de diminuer le taux de croissance : des conditions physico-chimiques sub-optimales (pH, température...), des composés 25 bactériostatiques (antibiotiques), la culture en resting cells . Cette dernière technique consiste à réaliser un ensemencement avec une quantité de cellules correspondant au moins à celle obtenue normalement en fin de fermentation classique. Dans ce cas, il n'y a pas de croissance bactérienne, le taux de croissance est nul. 30 Les Inventeurs ont ainsi cherché à combiner culture en resting cells et effet de la température. 2906816 28 Un lait entier a été ensemencé avec un FED (Ferment à Ensemencement Direct) contenant 1011UFC/g à raison de 10g/I. Le lait a ensuite été mis à incuber à différentes températures. Comme le montre la figure 3, l'abaissement de la température 5 n'avait pas un impact positif sur la production de vitamine K2. En revanche, le fait de cultiver les bactéries en resting cells a permis de multiplier la production par un facteur 2 environ : 20pg/100g contre 10pg/100g pour une fermentation classique avec croissance. 10 B-III- L'influence de la mise en oeuvre de la préculture en conditions de respiration La vitamine K2 participe à la chaîne respiratoire. L. lactis est capable de respirer mais cette respiration n'intervient qu'en fin de fermentation, c'est-à-dire lorsque le flux métabolique se ralentit. Cette 15 propriété peut être rapprochée de ce qui a été observé lors des cinétiques de production de la vitamine K2. Il est important de noter que fabriquer entièrement un produit alimentaire en conditions de respiration paraît difficilement réalisable à l'échelle industrielle. En effet, se poseraient alors des problèmes 20 d'aération, d'agitation, de mousse, etc., difficiles à surmonter sans revoir les appareillages et procédés de fabrication usuels, ce qui nécessiterait des investissements très importants et générerait des surcoûts de production inacceptables pour l'industrie agro-alimentaire. En revanche, le cas échéant, la préculture pourrait être réalisée en 25 conditions de respiration sans que cela pose trop de difficultés aux industriels. Les Inventeurs ont donc étudié l'impact de la préculture en conditions de respiration sur la production de vitamine K2 par les bactéries lactiques. 30 Pour ce faire, des précultures ont été réalisées sur milieu M17 Lac additionné de 20pl/ml d'une solution d'hémine à 0,5mg/ml dans de la 2906816 29 soude 0,1 M. L'ensemencement a été réalisé à 1% et la température d'incubation était de 30 C. L'aération était assurée par simple agitation. Dans un premier temps, ces précultures ont permis d'ensemencer du lait entier à 1%, soit une fermentation classique. Dans ces conditions, 5 aucun impact positif sur la production de vitamine K2 n'a été observé (données non montrées). Ces précultures ont ensuite été utilisées pour réaliser des fermentations en conditions de resting cells . Les précultures ont été réalisées comme décrites précédemment et maintenues pendant une nuit. 10 Des échantillons de 50m1 ont été centrifugés à 6000g pendant 5 min. Le surnageant a été retiré et remplacé par du lait entier. Le lait a ensuite été incubé à 30 C pendant 24h. Les échantillons ont été congelés à -80 C pour un dosage ultérieur. Comme le montre la figure 4, le comportement observé était 15 différent selon les souches. La préculture en conditions de respiration n'a pas eu d'impact sur la production de vitamine K2 par la souche naturelle de L. lactis subsp. cremoris n 1. En revanche, elle a permis d'augmenter d'un facteur 2, la production de vitamine K2 par le variant naturel 1-3558. La piste dela préculture en conditions de respiration est donc 20 apparue comme intéressante pour certaines souches au moins. Toutefois, en pratique, il est important de pouvoir disposer, non pas de précultures fraîches mais de ferments congelés. De plus, afin de réaliser des fermentations en conditions de resting cells , il convient de disposer de ferments concentrés. 25 B-IV- Résultats complémentaires concernant l'effet stimulant de la respiration sur la production de vitamine K2 Ces résultats sont à mettre en relation avec le paragraphe A-III ci-dessus. 30 Comme indiqué dans le paragraphe A-III-2 supra, la culture du variant naturel 1-3626 sélectionné en présence d'analogues structuraux 2906816 30 des acides aminés aromatiques a servi à ensemencer 50m1 de milieu M17 Lac (taux d'ensemencement de 1%) additionné de 1 ml d'une solution d'hémine (500mg/l). La même culture a servi à ensemencer un milieu ne contenant pas d'hémine mais placé sous agitation. Un dernier type de 5 culture a été réalisé. Un milieu M17 Lac a été ensemencé et placé à 30 C sans agitation. Les cultures ont été placées une nuit à 30 C sous agitation (250rpm). Ces cultures ont ensuite été centrifugées 5 min à 6000g. Le surnageant a été retiré et remplacé par 50ml de lait entier. Après 24h, les laits fermentés ont été placés à -80 C en attendant le dosage de vitamine 10 K2. Le Tableau III ci-dessous donne les résultats de production de la vitamine K2 par le variant naturel 1-3626 en fonction des conditions de mise en oeuvre. La quantité de vitamine K2 est exprimée en pg Equivalent MK-4 pour 100g de lait fermenté. 15 Tableau III Type de Sans agitation Avec agitation préculture Sans hémine Avec hémine Vitamine K2 0,77 25,77 Ces résultats montrent que la respiration (présence d'hémine sous agitation) a un impact très important sur la production de vitamine K2. 20 Dans ces conditions, la production de vitamine est multipliée par 5. La souche mère produisait 21,5pg/100g après une préculture sans respiration (données non montrées). Lorsque la préculture était réalisée en conditions de respiration, la production chutait à 10,3pg/100g (données non montrées). Ainsi, pour la souche mère, la préculture en conditions de 25 respiration avait un effet négatif sur la production de vitamine K2. 2906816 31 B-V-L'influence de la dose d'ensemencement, de la population bactérienne finale et du pH du lait 5 Dans les conditions de resting cells décrites précédemment pour une préculture en respiration, la population bactérienne initiale s'élève à environ 1010UFC/mL. Cette dose d'ensemencement étant difficilement applicable dans le cadre d'un procédé industriel, les Inventeurs ont étudié l'influence précise 10 de la quantité initiale de cellules sur la production de vitamine K2 pendant la phase de fermentation en lait. Par ailleurs, la quantité de cellules étant plus élevée dans une préculture en conditions de respiration que dans une préculture classique, les Inventeurs ont cherché à déterminer si le gain de production observé 15 pour les précultures en conditions de respiration était dû à une simple augmentation de la dose d'ensemencement, ou bien à un apport spécifique du processus de respiration. Les Inventeurs ont également cherché à déterminer si la population bactérienne finale, après la phase de resting cells , jouait un rôle 20 déterminant sur la quantité de vitamine K2 obtenue. Sachant qu'il existe une certaine mortalité bactérienne due, entre autres, à la diminution du pH pendant la fermentation, les Inventeurs ont étudié l'impact de l'utilisation d'un lait tamponné sur le niveau de production de vitamine K2. Afin de répondre à ces différentes questions, des essais ont été 25 réalisés en conditions de resting cells , en lait classique ou tamponné, avec des doses d'ensemencement allant de 106UFC/mL à 1010UFC/mL environ, et ce, à partir de précultures classiques ou en respiration. Les précultures de la souche 1-3558 ont été réalisées sur milieu M17 Lac à 30 C. Pour les expériences en conditions de respiration, le 30 milieu a été additionné de 20pL/ml d'une solution d'hémine à 0,5mg/ml (dans de la soude 0,1M) et la préculture a été agitée pendant l'incubation 2906816 32 sur une nuit. Différents volumes de ces précultures (voir Tableau IV ci-dessous) ont ensuite été centrifugés à 10000g pendant 10min. Tableau IV Ensemencement Volume Volume préculture R+ préculture R- 100% 40mL 160mL 75% 30mL 120mL 50% 20mL 80mL 30% 12mL 48mL 20% 8mL 32mL 10% 4mL 16mL 5% 2mL 8mL 1% 0,4mL 1,6mL 0,01% 0,04mL 0,16mL 5 Le surnageant a été retiré et soit remplacé par 40mL de lait entier classique (précultures R+ et R-), soit additionné de (3-glycérophosphate à 0,075M final (préculture R+ uniquement). Les échantillons ont ensuite été incubés à 30 C pendant 24h. Un aliquote a été prélevé pour effectuer un dénombrement puis les échantillons ont été congelés à -80 C pour un 10 dosage ultérieur. Les résultats du dosage et des dénombrements réalisés avant et après la phase de resting cells sont indiqués dans le tableau V ci-dessous. Ce tableau fournit les résultats du dosage de vitamine K2 et des dénombrements effectués avant (TO) et après la phase de resting cells (Tf) à partir de pré-cultures classiques ou en respiration. 15 20 2906816 33 Tableau V dose TO R- Tf R-VitK R- TO R+ Tf R+ VitK R+ TO R+ TP Tf R+ TP VitK R+TP 100% 1,08E+10 9,70E+09 44,47 3,40E+09 2,65E+09 3,40E+09 5,30E+09 35,9 75% 8,10E+09 4,30E+09 29,01 2,55E+09 2,40E+09 2,55E+09 5,80E+09 50% 5,40E+09 4,15E+09 18,58 1,70E+09 1,64E+09 19,82 1,70E+09 6,40E+09 26,7 30% 3,24E+09 4,25E+ 09 13,72 1,02E+09 1,20E+09 16,75 1,02E+09 7,70E+09 20% 2,16E+09 2,10E+09 9, 13 6,80E+08 ,60E+09 14,09 6,80E+08 6,40E+09 18,55 10% 1,08E+09 2,10E+09 3,40E+08 1,17E+09 3,40E+08 4,60E+09 5% 5,40E+08 1,10E+09 6,4 1`,70E+08 1,29E+09 9,41 1,70E+08 3,60E+09 13,666 1% 1,08E+08 2,15E+09 6,88 3,40E+07 1,25E+09 6,35 3,40E+07 4,20E+09 0.1% 1,08E+07 1,50E+09 6,26 3,40E+06 1,27E+09 6,19 3,40E+06 4,80E+09 R- = préculture classique R+ = préculture en respiration TP = fermentation en lait tamponné par le (3-glycérophosphate 5 TO = population bactérienne initiale en Cfu/mL de culture Tf = population bactérienne finale en Cfu/mL de culture VitK = dosage de la vitamine K2 en dag Equivalent MK-4/100g de produit. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 5. Y sont 10 également représentés, à titre indicatif, les résultats obtenus avec une préculture en conditions de respiration, réalisée en fermenteur suivie d'une phase de resting cells en lait classique (courbe respiration en fermenteur ). Les résultats sont comparables à ceux obtenus avec des précultures en tube (courbe respiration labo ). 15 Les résultats obtenus (Tableau V et figure 5) indiquaient que : La teneur en vitamine K2 dépendait de la dose d'ensemencement ; - La pente de la courbe était plus importante pour une préculture en conditions de respiration que pour une préculture classique. Ainsi, pour une population bactérienne donnée, la production de vitamine K2 était 20 plus importante lorsque la préculture était réalisée en conditions de respiration. Le gain observé en conditions de respiration semblait donc 2906816 34 dû à un apport spécifique du processus de respiration plutôt qu'à une simple augmentation de la dose d'ensemencement, ce qui a confirmé l'intérêt de cette piste ; La production de vitamine K2 était plus importante lorsque la phase de 5 resting cells était réalisée en lait tamponné. Ceci pourrait être dû soit à une meilleure survie des bactéries dans ce milieu, puisque pour une même population initiale, la population finale était de 2 à 6 fois plus élevée en lait tamponné qu'en lait classique (voir tableau V), soit à une meilleure extraction de la vitamine K2 en lait tamponné. 10 2906816 REFERENCES Bolotin et aI. 2001. Genome Research 11, 731-753 Duwat et al. 2001. J. Bacteriol. 183(15), 4509-16 5 Morishita et aI. 1999. J. Dairy Sci. 82, 1897-1903 Parker et al. 2003. Journal of Food Science 68(7), 2325-2330 Vido et al. 2005. J. Bact. 187, 601-10 Gasson M. 1983. J. Bact. 154, 1-9 Hart JP, et al. [letter]. 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Procédé d'obtention d'un variant naturel d'une souche de bactérie lactique produisant, dans des conditions de fermentation standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions, ainsi que les cultures et fractions de cultures biologiquement pures dudit variant, ledit procédé comprenant au moins : a) la culture de ladite souche de bactérie lactique dans des conditions de fermentation standard, sur un milieu de sélection approprié ; et b) la sélection dudit variant s'il produit au moins environ 1,2 fois plus de vitamine K2 que ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi les genres Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus et Propionibacterium. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche de bactérie lactique est choisie parmi les espèces Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium, Propionibacterium sp. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit milieu de sélection approprié est choisi parmi des milieux de culture contenant de la bacitracine, ou un agent oxydant tel que le péroxyde, ou encore des analogues structuraux des acides aminés aromatiques. 5. Variant naturel d'une souche de bactérie lactique susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 37 2906816 6. Variant naturel selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est le variant naturel 1-3557 déposé à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) le 20/01/2006. 7. Variant naturel selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est le variant naturel 1-3558 déposé à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) le 20/01/2006. 8. Variant naturel selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est le variant naturel 1-3626 déposé à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France) le 20/01/2006. 9. Utilisation de la résistance à la bacitracine pour obtenir des variants naturels de souches de bactéries lactiques produisant, dans des conditions de fermentation standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions. 10. Utilisation de la résistance à un agent oxydant, tel que le péroxyde, pour obtenir des variants naturels de souches de bactéries lactiques produisant, dans des conditions de fermentation standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions. 11. Utilisation de la résistance aux analogues structuraux des acides aminés aromatiques pour obtenir des variants naturels de souches de bactéries lactiques produisant, dans des conditions de fermentation 38 2906816 standard, une quantité de vitamine K2 supérieure, d'un facteur au moins égal à environ 1,2, à celle produite par ladite souche de bactérie lactique cultivée dans les mêmes conditions. 12. Ferment lactique comprenant au moins un variant selon l'une quelconque des revendications 5 à 8. 13. Procédé de production d'un produit alimentaire enrichi en vitamine K2 comprenant au moins : a) la mise en oeuvre d'au moins un variant selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, et/ou au moins un ferment selon la revendication 12, dans une préparation intermédiaire dudit produit ; et b) l'obtention dudit produit enrichi en vitamine K2. 14. Produit alimentaire enrichi en vitamine K2 susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 13. 15. Produit alimentaire selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est un produit fermenté et/ou un produit laitier frais. 16. Utilisation d'au moins un variant selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, et/ou au moins un ferment selon la revendication 12, pour préparer un produit alimentaire enrichi en vitamine K2. 17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit produit alimentaire enrichi en vitamine K2 renforce la solidité des os du consommateur.