Brevet FR2908996A1 — publié le 20080530

Nouveau procédé d'extraction de principes actifs et l'utilisation de ceux-ci en thérapeutique L'invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement au domaine de la pharmacotechnie. Elle a plus particulièrement pour objet un nouveau procédé d'extraction de principes actifs au départ de plantes riches en flavonoïdes et en diacylphloroglucinols, dont l'oxydabilité présente un inconvénient majeur pour leur conservation au stockage et pour leur utilisation pharmaceutique. L'invention concerne plus spécifiquement un procédé d'extraction et de concentration en principes actifs sous une forme stable et enrichie en un ou plusieurs principes actifs, au départ de sommités florales de Millepertuis (Hypericum perforatum). 20 Le millepertuis est en effet une plante médicinale dont les propriétés tranquillisants et anti-stress sont de mieux en mieux connues en raison de nombreux travaux scientifiques récents, notamment les publications intervenues dans différents pays européens 25 comme il est fréquent en phytothérapie. Selon la littérature (voir notamment USP 6 280 736), l'effet général anti-dépressif du millepertuis ne peut pas être attribué avec certitude à un ou plusieurs composants déterminés, mais il apparaît 30 clairement que parmi ceux-ci, les hyperforines fournissent un apport considérable à la mise en place de cette efficacité (cf. EP-A-0599 307) sans doute supérieur à celui des hypéricines de formule (I) : 10 15 2908996 OH O OH OH O OH Il s'agit de molécules très oxydables et facilement labiles. 5 La drogue médicinale brute est formée des parties aériennes d'Hypericum perforatum qui contiennent entre autres des composés du type hypéricine et des composés du type hyperforine (cf. J. H5lzl et al Pharmajentische Zeitung 139 (46) 3959-3977 (1994)). Une préparation d'extrait de Millepertuis ayant une teneur plus élevée en hypéricine est décrite dans le brevet allemand DE-1569849 ainsi que dans S. Niesel et H. Schilcher Arch. Pharm. 323 (1990) 755. Cependant le problème de la conservation de ces principes actifs a été posé par R. Berghâfer et J.Hôlzl dans Deutsche Apotheker Zeitung 126 (47) (1987) 2569-2573 qui ont constaté que l'hyperforine dans les extraits de Millepertuis, était complètement dégradée après une semaine, bien qu'elle devrait être plus stable dans des extraits obtenus à partir de plantes fraîches. Ces auteurs émettent l'hypothèse que les plantes fraîches contiennent un agent stabilisant pour l'hyperforine mais dont l'efficacité serait de courte durée. C'est pourquoi les auteurs concluent qu'aussi bien dans la drogue que dans les extraits conventionnels de Millepertuis, la teneur en Hyperforine diminue d'une manière spectaculaire allant jusqu'à la disparition de la dite substance en l'espace de quelques mois lors du stockage conventionnel (Marsenbacher P. Thèse de Doctorat (1991), Tubingen). Ces auteurs ont préconisé le stockage de la plante sous argon par addition d'antioxydants (octyldodecanol, BHT, BHA) pour améliorer la stabilité des extraits. (I) 2908996 Déjà les extractions des Millepertuis par des solvants conventionnels comme l'eau et l'alcool, conduisent à des compositions pharmaceutiques qui contiennent moins de 1 % d'hyperforine. Au cours du stockage, cette valeur diminue d'une manière évidente et peut même 5 revenir à zéro en fonction des conditions de stockage par suite de phénomènes d'oxydation qui décomposent l'hyperforine. Selon le brevet US n 6.280.736, ce problème pourrait être résolu par addition aux extraits de Millepertuis, d'agents antioxydants et/ou d'agents stabilisants qui fixent l'oxygène ou encore d' 10 agents réducteurs. Le déposant de ce brevet recommande également d'opérer l'extraction sous atmosphère inerte et/ou à l'abri de la lumière ou encore en procédant à l'extraction à l'aide d'un solvant présentant une teneur réduite en oxygène. 15 Une autre méthode de préservation de l'hyperforine est celle décrite par Orth HC, Rentel C et Schmidt PC dans J. Pharm. Pharmacol (1999) 51 193-200 qui recommandent l'élimination des peroxydes à chaque étape de l'extraction. Ces auteurs concluent en 20 indiquant que la conservation à 30 C sous atmosphère normale et à - 20 C, 4 C et 20 C sous azote et encore dans l'azote à -196 C n'a pas donné de résultats différents en ce qui concerne la stabilité de l'hyperforine et que le procédé de conservation à -70 C sous azote fournissait de meilleurs résultats pour un stockage à long terme. 25 Le même problème se pose pour des préparations topiques d'extrait de Millepertuis, notamment sous forme de gels comme agent cicatrisant ou anti-viral (cf. US publication 2004/0137 088). Le problème de la stabilité des hyperforines a également été envisagé en réalisant des hyperforines synthétiques décrites dans le brevet US (Indena) 6.656.510. 2908996 4 Les hyperforines correspondent à la formule (II), hyperforine : R = CH3 5 adhyperforine : R = CH2-CH3 et dans laquelle R^ est un radical acyle ou de l'hydrogène. Elles sont décrites comme étant plus stables et plus 10 actives dans les tests d'action anti-dépressive. Cette méthode d'hemisynthèse nécessite l'extraction de l'hyperforine à partir de Millepertuis par un gaz supercritique pour obtenir une huile riche en hyperforine. Cependant les rendements d'estérification sont particulièrement faibles. Par ailleurs, l'extraction par fluide 15 supercritique est une opération délicate nécessitant un appareillage résistant aux très hautes pressions et aux températures élevées. On a également décrit des produits d'hydrogénation de la chaîne allylique des hyperforines. Les composés cétoniques hexahydro 20 et octahydrogénés résultant s'énolisent pour donner des énolates métalliques ou des esters d'enol (voir brevet PCT n 03/091191 et n 99/64 388). C'est pourquoi malgré un intérêt thérapeutique toujours croissant, les extraits de Millepertuis n'ont pas été utilisés jusqu'ici dans une mesure correspondante en raison de la facile décomposition 25 des principes actifs et de la perte d'activité progressive qui en résulte. 2908996 5 Le procédé selon l'invention vise à améliorer les procédés déjà décrits et à conduire à des extraits de Millepertuis plus stables donc plus actifs. Le procédé selon l'invention vise également à obtenir des extraits plus riches en hyperforines et appauvris en dérivés 5 d'hypericine. D'une manière plus générale, l'invention se rapporte à de nouveaux procédés d'extraction de plantes, plus spécialement celles contenant des iridoides, des dérivés quinoléiques et particulièrement des 10 acylphloroglucinols, des flavonoïdes et des naphtodianthrones, comme dans l'Hypericum perforatum, qui permettent d'obtenir des extraits stables et pharmaceutiquement acceptables, enrichis en hyperforine et appauvris si possible en dérivés d'hypéricine. 15 Ces procédés d'extraction se caractérisent principalement par une recherche de pH des milieux d'extraction où les actifs sont les plus stables et permettent d'obtenir après séchage par déshydratation sous vide à basse température sur zéolites, procédé également appelée zéodratation, des extraits sous la forme d'une poudre cristalline. Ces 20 procédés permettent d'augmenter les taux d'hyperforine dans les extraits de plante obtenus et de conserver ou même de diminuer les taux de pseudohypericine et d'hypéricine. Ces extraits sont conservés soit sous forme de poudres cristallines lorsque l'hyperforine est sous sa forme salifiée par un sel métallique, soit sous forme amorphe lorsqu'elle est 25 sous forme de base en présence ou non d'un acide organique comme par exemple l'acide citrique, soit encore fixés sur des sucres comme une maltodextrine ou un support similaire pour avoir une poudre pharmacotechniquement manipulable. 30 Le choix des nouveaux procédés d'extraction est choisi parmi ceux décrits en fonction des taux recherchés et nécessaires en hyperforine et hypéricine ainsi que leurs quantités nécessaires aux fabrications des formulations pharmaceutiques. L'invention concerne également des préparations pharmaceutiques ou para-pharmaceutiques contenant ces différents extraits obtenus par les procédés de l'invention. lo 15 2908996 6 Pour certains produits, le pH pourra se situer entre 1 et 2 ou 6,4 et 12 comme pour le Millepertuis en fonction des quantités d'actif à extraire (entre 3 et 5 pour le plus défavorable). Pour d'autres contenant des iridoides (Globulaire, etc...), le pH devra se situer entre 6,5 et 8. 5 Dans tous les cas, ces types d'extraits étant sensibles aux élévations de température, à l'oxydation ou à la lumière, seront déshydratés et séchés par déshydratation sous vide à basse température sur zéolites, procédé également appelé zéodratation. On sait que la plante à l'état humide et selon sa provenance contient selon les différents auteurs 2 à 4 % d'hyperforine. Ce taux ne cesse de décroître au fur et à mesure des différentes manipulations comme le temps de macération avant extraction, la concentration des extraits, le temps de stockage des extraits, etc... Dans l'arsenal, des différents moyens connus et utilisés devant ces problèmes d'instabilité, il est fait appel aux méthodes classiques comme : 20 la nature des solvants d'extraction utilisables en pharmacie ^ l'usage d'anti-oxydants sous forme acide, sels ou esters ^ l'abri de la lumière ^ l'usage d'agents réducteurs ^ l'usage d'agents chélateurs 25 l'usage de gaz inerte lors de différentes manipulations ^ l'emploi de basses températures lors des différentes manipulations. En raison de la structure chimique des dérivés 30 phl.orogluciniques et plus particulièrement des fonctions hydroxyallyliques et cétoniques de l'hyperforine, il est normal de penser à bloquer celles-ci pour apporter une meilleure stabilité de l'ensemble de la molécule. 35 Ceci est très bien décrit par Chatterjee et coll dans le brevet US 6.444.662 du 3 septembre 2002 qui décrit trois modes de préparation de sels dans des solvants appropriés en fonction des types de metallation 2908996 7 utilisées sur le mélange adhyforine et hyperforine, par des alcoolates en milieu anhydre ou en présence d'hydroxydes correspondants. L'objet de l'invention est de réaliser des procédés qui mettent 5 en oeuvre la stabilité des dérivés phlorogluciniques au cours du procédé d'extraction sans altérer les autres constituants de l'extrait et obtenir un produit final pharmaceutiquement acceptable enrichi en hyperforine contenant de 2 à au moins 5 % et contenant les autres constituants comme les flavonoïdes, les naphtodianthrones aux taux habituels comme 1 o pour l'hypéricine (inf. à o,5 %). Différents agents d'alcalinisation ou d'acidification peuvent être utilisés (soude, hydroxyde de magnésium et autres agents alcalins, etc...) et acides (tout acide minéral ou organique) dans le procédé selon 15 l'invention. Une étude qualitative a été réalisée à partir d'un même lot de plante pour évaluer l'influence des différents milieux d'extraction tel qu'un milieu basique (la soude) ou un milieu acide (les acides phosphoriques ou/et 20 citrique). Les modes opératoires sont identiques dans tous les cas et ont donné les résultats suivants. Tableau I pH du EtOH Eau NaOH Q :HpF PseudoHpR HpR pH de solvant iN l'extrait 7.74 60 40 0 550 290 250 4.83 12.21 60 40 1 600 280 196 6.04 12.48 60 40 2 750 240 256 6.80 12.55 60 40 3 850 210 320 7.53 12.67 60 40 4 1000 20 200 8.81 12.71 60 40 5 1050 0 160 8.95 pH du EtOH Eau H3PO4 Q :HpF PseudoHpR HpR pH de solvant l'extrait 3.11 60 40 0.1 % 500 175 80 3.33 pH du EtOH Eau Ac. Q:HpF PseudoHpR HpR pH de solvant Citriq. l'extrait 2.66 60 40 4 % 550 200 130 4.46 2908996 8 HpF = Hyperforine PseudoHp = PseudoHypéricine HpR = Hypérine On constate que pour un même solvant Ethanol/Eau 60/40, les extractions diffèrent selon le pH utilisé. 5 Aux pH acides, les quantités d'hyperforine extraites sont similaires aux quantités extraites par ce même solvant en milieu neutre mais par contre la pseudo-hypéricine et l'hypéricine ont grandement diminué. Le pH des extraits est légèrement plus acide en fin d'extraction comparé aux pH de l'extraction neutre dont les extractions ont tendance to à s'acidifier : pH initial 7,74 pH des extraits 4,83 pH solv H3PO4 3,11 pH des extraits 3,33 pH solv Ac. Citrique 2,66 pH des extraits 4,46 15 Pour les extractions en milieu alcalin, les quantités d'extraits s'enrichissent en hyperforine en fonction de la quantité d'agent alcalin utilisée alors qu'en même temps les quantités de pseudo- 20 hypéricine et d'hypéricine diminuent. Cet enrichissement en hyperforine peut atteindre le double alors que les quantités de dérivés d'hypéricine peuvent diminuer de moitié. Pour mieux évaluer les modes opératoires, on a comparé 25 les extractions alcalines en présence d'un témoin d'extraction sans action alcaline et on a comparé son influence sur la plante humide et/ou séchée ainsi que la stabilité des extraits obtenus. Le mode opératoire décrit a donné les résultats suivants : À TO : 1) on procède à deux extractions sur 23 g de plante humide (extraction alcaline et extraction neutre). 2) on sèche 150 gr de plante humide puis on fait 2 extractions 35 sur le produit séché correspondant à 23 g de plante humide. 3) on met en atmosphère humide contrôlée 60 g de plante humide. 30 2908996 9 À Ti : 1) on effectue 2 extractions sur 23 g de plante humide conservée (alcaline et neutre). 2) on effectue 2 extractions sur 23 g de plante sèche conservée (alcaline et neutre). Soit au total 4 extractions à TO 10 4 extractions à T 1 mois Le schéma opératoire suivant résume les différentes opérations (Tableau II). 15 Cette approche a permis d'évaluer et de choisir un procédé qui peut être le milieu alcalin lorsque l'on veut faire croître le taux d'hyperforine dans les extraits et stable, ou le milieu acide lorsque l'on désire obtenir un extrait standard et stabilisé en diminuant les taux de dérivés 20 d'hypéricine. On sait qu'en milieu acide et hydro-alcoolique, ces dérivés précipitent du fait de leur faible solubilité à ces pH et du fait de la transformation de la pseudo-hypéricine en isopseudo hypéricine à ce pH. L'incidence des pH du milieu d'extraction et surtout son effet sur la stabilité de certains composés d'extraits ainsi que la transformation d'autres composés a permis d'étudier plus profondément ces possibilités d'extraction en vue de réaliser des procédés industriels. Description des procédés : Une première étude d'extraction est réalisée au laboratoire à partir d'un même lot de plante afin de comparer l'influence de 35 l'alcalinisation sur le milieu d'extraction par rapport aux extractions classiques réalisées avec des solvants hydro-alcooliques. 5 25 30 2908996 10 Schéma du procédé : (Tableau II) 1 Partie de plante séchée 5 10 15 20 30 10 vol H2O/EtOH PH=6,5 24 H à T amb Filtrer 1 Concentrer sous vide T 9,0- 24H à T amb Filtrer Concentrer sous vide T REVENDICATIONS 1 - Nouveau procédé d'extraction de principes actifs à partir de plantes qui permet d'augmenter le taux d'acylphloroglucinols dans ces extraits et d'assurer leur stabilisation dans lequel on soumet les extraits de plante à une zone de pH appropriée puis à un séchage par déshydratation sous vide à basse température sur zéolites. 2 - Procédé selon la revendication 1 qui permet d'augmenter le taux 10 d'acylphloroglucinols et d'assurer leur stabilisation dans lequel l'extrait de plante est un extrait d'Hypericum perforatum. 3 - Procédé selon les revendications 1 et 2 dont les extraits obtenus ont une concentration en hyperforine qui est comprise entre 2 et 8 %. 4 - Procédé selon les revendications 1 à 3 dans lequel les extraits obtenus contenant en moyenne 3 à 5 % d'hyperforine. 5 - Procédé selon les revendications 1 à 3 dans lequel la stabilisation 20 des acylphloroglucinols est obtenue par salification des acylphloroglucinols par des hydroxydes métalliques en début d'extraction.. 6 - Procédé selon les revendications 1 à 3 et 8 dans lequel la 25 salification peut être effectuée par des bases organiques comme des amines primaires ou secondaires, des amino-acides comme l'arginine ou d'autres bases. 7 -Procédé selon les revendications 1 à 3 et 8 et 9 dans lequel l'extrait 30 sous forme de sel est transformé en base par acidification contrôlée des solutions d'extraction avant isolement.. 8 - Procédé selon les revendications 1 à 3 dans lequel l'extrait sous forme salifiée est isolé et ensuite additionné d'acides citrique et/ ou 35 ascorbique ou d'autres anti-oxydants, pour améliorer son état physique. 9 - Procédé selon les revendications précédentes dans lequel on ajoute pour faciliter la mise en forme pharmaceutique, des additifs de dilution 2908996 21 comme les maltodextrines, des agents de lubrification comme les stéarates métalliques, des agents de glissement comme l'acide citrique ou un acide silicique. 5 10 - Extrait obtenu selon le procédé des revendications 1 à 3 contenant en moyenne 2 à 8 % d'hyperforine en association avec un sel minéral 11 - Extrait obtenu selon le procédé des revendications 1 à 3 contenant plus particulièrement de 3 à 5 % d'hyperforine en association avec un sel de magnésium en quantité correspondant à 5 à 100 mg de magnésium élément. 12 - Extrait obtenu selon le procédé des revendications 1 à 3 contenant de 3 à 5 % et plus particulièrement 4 % d'hyperforine 13 - Compositions à base d'extraits obtenus selon les revendications 1 à 3 utilisées en vue de l'usage thérapeutique et/ou para-pharmaceutique. 14 - Compositions à base d'extraits obtenus selon les revendications 1 à 20 3 utilisées en vue d'usages thérapeutiques et ou para-pharmaceutiques contenant plus particulièrement 300 mg d'extrait à environ 2 % d'hyperforine et en outre 10 mg d'élément magnésium apporté sous forme de différents sels de magnésium. 25 15 - Compositions à base d'extraits obtenus selon le procédé des revendications 1 à 3 dans lesquelles l'élément magnésium est sous forme d'un sel choisi parmi le citrate, le lactate, le pidolate, l'ascorbate, le phosphate et le carbonate de magnésium. 30 16 - Compositions à base d'extraits de plante obtenus selon le procédé des revendications 1 à 3 dans lesquelles on incorpore en outre un ou des principes actifs agissant dans la sphère gastro-intestinale. 17 - Compositions à base d'extraits de plante obtenus selon le procédé 35 des revendications 1 à 3 dans lesquelles on ajoute un acide gras polyinsaturé de la série des acides Oméga-3.15