Brevet FR2909672A1 — publié le 20080613

Polypeptide chimérique de type sélectine-intégrine destiné à réguler l'adhésion des leucocytes à l'endothélium L'invention a pour objet un polypeptide chimérique appelé "sélégrine", combinant une fonction sélectine et une fonction intégrine. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un polypeptide chimérique tel que décrit dans la présente demande, par la mise en oeuvre de techniques de génie génétique, notamment sous la forme d'un polypeptide recombinant. L'invention a également pour objet la mise en oeuvre des propriétés dudit polypeptide chimérique vis-à-vis des réactions inflammatoires, en particulier pour moduler l'afflux des leucocytes dans les sites inflammatoires, et plus particulièrement pour moduler l'ancrage et l'adhésion ferme des leucocytes aux endothéliums vasculaires. L'invention concerne également l'utilisation dudit polypeptide chimérique comme médicament, en particulier comme agent anti- inflammatoire ainsi que pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir les lésions tissulaires de nature inflammatoire. La réaction inflammatoire, qui est une composante du système immunitaire, est une réponse de l'organisme à une agression tissulaire, visant à isoler la zone agressée, à éliminer les débris cellulaires et les éventuels agents pathogènes et à réparer les lésions tissulaires. L'origine de la réaction inflammatoire peut être infectieuse (infection bactérienne, virale, parasitaire ou mycotique), tumorale, traumatique (blessure, intervention chirurgicale), physique (brûlure, irradiation), immunologique (maladie auto-immune, rejet de greffe), secondaire à une nécrose tissulaire (infarctus du myocarde), ou encore chimique (agents caustiques, toxines, venins). Localement, les quatre signes majeurs de l'inflammation sont la rougeur, la chaleur, le gonflement (tuméfaction) et la douleur. L'agression tissulaire déclenche la libération de médiateurs 1 2909672 chimiques (médiateurs pro-inflammatoires), ce qui a notamment pour effet d'attirer, au niveau du site de l'agression, les cellules immunitaires compétentes (les leucocytes) nécessaires à la lutte contre les agents pathogènes et au déclenchement de la réparation tissulaire. Ainsi, au 5 niveau du site d'inflammation, les leucocytes (essentiellement les polynucléaires neutrophiles et les macrophages puis, ultérieurement, les lymphocytes et les monocytes) quittent la circulation sanguine et s'infiltrent dans le tissu enflammé. Dans la plupart des cas, cette réaction de défense est bénéfique 10 pour l'organisme; une fois les agents étrangers ou infectieux éliminés, des médiateurs anti-inflammatoires sont produits, mettant fin à l'infiltration des leucocytes et permettant la cicatrisation. Cependant, il arrive que l'inflammation devienne excessive et néfaste, du fait de l'agressivité de l'agent pathogène, de sa persistance, du 15 siège de l'inflammation, par anomalies des régulations du processus inflammatoire, ou par anomalie quantitative ou qualitative des cellules intervenant dans l'inflammation. Une réponse inflammatoire inadaptée ou mal contrôlée peut provoquer de sérieux dommages et être impliquée dans de nombreuses manifestations cliniques humaines telles que brûlures, choc 20 hémorragique, psoriasis, syndrome de détresse respiratoire de l'adulte, pancréatite aiguë, arthrite aiguë, asthme, syndrome de défaillance multiviscérale, ou encore des pathologies thromboemboliques ou cardiovasculaires (athérosclérose; infarctus du rnyocarde), de même que des formes graves d'ischémie-reperfusion. Un traitement permettant de 25 réduire les dommages de l'inflammation ou les effets indésirables de l'inflammation (douleurs en particulier), sans en rnodifier les conséquences réparatrices bénéfiques est alors nécessaire. Des modèles animaux de l'inflammation ont démontré que la déplétion des leucocytes de la circulation s'accompagne d'une réduction 30 des lésions tissulaires (Romson et al, 1983; Hernandez et al, 1987). Cependant, chez l'homme, la déplétion des neutrophiles de la circulation 2 2909672 n'est pas concevable, les neutrophiles étant nécessaires au développement d'une réponse immunitaire localisée. Une alternative thérapeutique consiste à inhiber l'infiltration des leucocytes dans le tissu enflammé. 5 Pour pouvoir affluer au site de lésion ou d'infection, les leucocytes doivent migrer à travers l'endothélium, ce qui nécessite que les leucocytes puissent adhérer à l'endothélium vasculaire. A cet effet, les leucocytes et les cellules endothéliales possèdent de nombreuses molécules d'adhésion cellulaire, dont des sélectines, des intégrines et des molécules de la 10 superfamille des immunoglobulines; les médiateurs chimiques libérés suite à l'agression tissulaire stimulent la migration transendothéliale des leucocytes (ou diapédèse) en induisant soit sur les leucocytes, soit sur les cellules endothéliales, l'expression de nouvelles molécules d'adhésion, en augmentant leur nombre, ou en modifiant leur affinité. 15 L'adhésion cellulaire débute par une liaison faible entre les leucocytes et les cellules endothéliales vasculaires. Cette phase d'attachement ("tethering") est réversible et fait principalement intervenir les sélectines, en particulier la L-sélectine, qui est exprimée sur les leucocytes (Issekutz et Issekutz, 1992; Lasky, 1992; Springer, 1994; Kansas et al., 20 1996). Cette faible et brève interaction, combinée au flux sanguin, résulte en un mouvement de roulement ("rolling") des leucocytes à la surface de l'endothélium. Bien que ces interactions adhésives soient trop faibles pour promouvoir la sortie des leucocytes de la circulation sanguine, elles sont essentielles pour l'initiation d'interactions plus fortes lors de la seconde 25 étape de la migration leucocytaire. Alors que les leucocytes roulent sur l'endothélium, les cellules endothéliales relarguent des cytokines (chémokines, IL8 en particulier), lesquelles activent, grâce à un signal intracellulaire, des intégrines présentes à la surface des leucocytes, en particulier LFA-1 (CD11 a/CD18) 30 et Mac-1 (CD11 b/CD18); alors que dans le cas des cellules assemblées en tissu, les intégrines sont toujours dans un état activé (ce qui permet un bon 3 2909672 ancrage cellulaire), les intégrines exprimées à la surface des leucocytes, mais aussi sur les plaquettes circulant dans le sang, se trouvent dans un état inactivé (ou état de faible affinité), qui ne leur permet qu'une reconnaissance de base de leurs ligands. 5 L'activation des intégrines par les chémokines s'accompagne d'un changement conformationnel de la partie extracellulaire de ces intégrines leucocytaires. Des interactions de forte affinité s'établissent alors entre les intégrines LFA-1 et Mac-1 activées et des molécules de la superfamille des immunoglobulines telles que I-CAM-1 ("Intercellular Adhesion Molecule-1 "), 10 qui est fortement exprimée sur l'endothélium vasculaire au site d'inflammation. En conséquence, les leucocytes s'attachent fermement sur l'endothélium (phase d'adhésion ferme) et se trouvent alors totalement immobilisés. Après les étapes de roulement et d'adhésion ferme sur 15 l'endothélium, les leucocytes se déforment et se glissent entre les cellules endothéliales (extravasation). Cette étape aussi implique notamment les intégrines leucocytaires LFA-1 et Mac-1. Lors de cette étape, LFA-1 interagit avec un autre ligand, JAM-1 (Junctional Adhesion Molecule-1; Ostermann et al., 2002), une protéine endothéliale de la superfamille des 20 immunoglobulines, qui est essentiellement exprimée au niveau des jonctions serrées des cellules endothéliales ou des cellules épithéliales. Après avoir traversé la paroi endothéliale, les leucocytes peuvent migrer jusqu'au tissu endommagé ou infecté pour initier la reconstruction du tissu endommagé et, en cas de lésion septique, éliminer les agents pathogènes. 25 Le rôle précoce joué par les sélectines dans l'adhésion leucocytaire fait d'elles une cible privilégiée pour la thérapie anti-adhésive. Les sélectines, ou molécules d'adhésion intercellulaire de type lectine (LECCAMS) appartiennent à la famille des lectines de type C, la classe des lectines animales qui se lient aux carbohydrates et dont la 30 fonction est calcium-dépendante (Drickamer 1988); l'utilisation d'un chélateur d'ions Cal+ a pour effet de bloquer l'adhésion par les sélectines 4 2909672 (Kansas et al., 1994). Il existe au moins trois sélectines: la L-sélectine (ou CD62L, anciennement MEL-14, LAM-1, LECAM-1, Leu-8, Mel-14 antigen, gp90 mel ou Leu8/TQ-1; 74 à 100 kDa), la E-sélectine (ou CD62E, anciennement 5 ELAM-1 ou LECAM-2) et la P-sélectine (ou CD62P, anciennement GMP-140 ou PADGEM; 140 kDa). Ce sont des protéines de type I ayant une même structure de base, à savoir : un domaine lectine de type C en position N-terminale et extracellulaire, lié a un domaine homologue aux motifs EGF ("Epidermal Growth Factor"), suivi d'une série de petites 10 séquences répétitives consensus CR ("Consensus Repeat"), d'une région transmembranaire hydrophobe et d'une courte queue cytoplasmique C-terminale (Bevilacqua et Nelson, 1993; Kansas, 1996). La L-sélectine contient 2 séquences CR alors que la E et la P sélectine en contiennent 4 à 9 selon les espèces. 15 Le domaine lectine de type C des trois sélectines d'une même espèce présente environ 52% d'identité. De plus, l'homologie de séquence entre une même sélectine de différentes espèces (humain, souris et vache) est d'environ 72% (Lasky, 1992; Kansas, 1996). Le domaine lectine de type C joue un rôle prépondérant dans 20 l'adhésion et la spécificité des sélectines. Ainsi, la plupart des anticorps monoclonaux qui permettent de bloquer l'adhésion des sélectines correspondent à des épitopes localisés dans le domaine lectine (Bowen et al., 1990; Geng et al., 1990; Kishimoto et al., 1990; Walz et al., 1990; Kansas et al., 1991; Pigott et al., 1991). De plus, l'échange des domaines 25 lectines entre les sélectines s'accompagne d'un échange des spécificités adhésives (Kansas et al., 1991; Kansas et al., 1994; Gibson 1995; WO 94/17193). En outre, des études réalisées avec une sélectine soluble contenant seulement le domaine lectine et le domaine EGF de la E-sélectine ont démontré que le domaine lectine et le domaine EGF sont 30 nécessaires et suffisants pour permettre l'adhésion cellulaire (Li et al, 1994; Pigott et al 1991). 5 2909672 Les sélectines reconnaissent des épitopes formés d'hydrates de carbone fucosylés, en particulier le Lewis X (Lex), le sialyl Lewis X (sLex ou CD15s) et les structures apparentées du type Lewis A (LeA), ou leurs dérivés (Nishida Y. 2000). 5 La L-sélectine est exprimée de façon constitutive sur les granulocytes, les monocytes, les éosinophiles et quelques lymphocytes circulants. Elle se lie in vivo à des contre-récepteurs qui portent des carbohydrates sulfatés, sialylés et/ou fucosylés (chaînes de oglycosylation) tels que le sialyl Lewis X sulfaté (Berg et al., 1992; Foxall et 10 al., 1992; Green et al., 1992). Les contre-récepteurs de la L-sélectine sont notamment des molécules semblables à la mucine appelées adressines vasculaires, exprimées sur l'endothélium vasculaire : le CD34 (Baumheter et al., 1993) et la GlyCam-1 (glycosylated mucin-like protein-1; Imai et,al., 1991; Lasky et al., 1992), sont exprimées sur les cellules endothéliales 15 cubiques des veinules des ganglions lymphatiques, alors que la MadCam-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule; Berg et al., 1993) est exprimée sur l'endothélium des muqueuses et guide l'entrée des lymphocytes dans le tissu lymphoïde muqueux tel que celui de l'intestin. La L-sélectine se lie également à la podocalyxin (Sasseti et al., 1998) et au 20 PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1; Sperandio et al., 2003). L'importance de la L-sélectine dans le recrutement des leucocytes au niveau de sites inflammatoires a été démontrée in vivo dans plusieurs modèles d'inflammation et de maladies impliquant les leucocytes. En particulier, l'invalidation du gène de la L-sélectine chez la souris (souris 25 "knockout") réduit de 80% le roulement des leucocytes sur l'endothélium au site d'inflammation (Arbones et al., 1994) et a un effet anti-inflammatoire dans plusieurs modèles d'inflammation chronique, incluant des réactions d'hypersensibilité de type retardé (DTH) et le choc toxique induit par les lipopolysaccharides (Tedder et al., 1995). 30 Outre son implication dans les interactions leucocyte-endothélium, la L-sélectine semble jouer un rôle important dans les interactions 6 2909672 dynamiques leucocyte-leucocyte, en particulier dans les interactions neutrophile-neutrophile, lesquelles interactions sont probablement impliquées dans l'amplification de la réponse inflammatoire. En effet, in vitro, des neutrophiles sont capables de rouler sur d'autres neutrophiles 5 fixés à la surface endothéliale ou sur une membrane en plastique, lequel roulement peut être bloqué par des anticorps monoclonaux dirigés contre la L-sélectine (Kansas, 1996). La P-sélectine est exprimée par les plaquettes et les cellules endothéliales activées. Son expression est stimulée par les LPS et les 10 cytokines pro-inflammatoires. La P-sélectine reconnaît des carbohydrates tels que le sialyl Lewis X sialylé (Polley et al., 1991). Le PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) et le CD24 sont deux ligands de la P-sélectine. Le PSGL-1 est exprimé de façon constitutive à la surface de tous les leucocytes. Par sa liaison au PSGL-1, la P-sélectine joue un rôle majeur 15 dans le phénomène de roulement et peut initier la phase de capture en absence de L-sélectine (Walter et Issekutz, 1997 ; Robinson et al., 1999). La E-sélectine est induite à la surface des cellules endothéliales dans les sites inflammatoires et après activation par des interleukines comme l'IL-1, le TNF-a ou des lipopolysaccharides (LPS). Elle se lie aux 20 oligosaccharides sialyl Lewis X (Phillips et al., 1990; Walz et al., 1990; Polley et al., 1991) et N-acétyl- lactosamine glycosylée présents sur les glycoprotéines des neutrophiles, sur des monocytes et sur quelques cellules T CD4+ mémoire. La E-sélectine est capable de se lier à des structures membranaires des leucocytes (Walter et Issekutz, 1997), en 25 particulier au PSGL-1. Les intégrines leucocytaires LFA-1 (CD11 a/CD18) et Mac-1 (CDI 1 b/CD18) constituent également un site de blocage intéressant, dans la mesure où elles sont responsables non seulement de l'adhésion (LFA-1 et mac-1) mais également de l'activation (mac-1 seulement) des 30 neutrophiles (Diamond et Springer,, 1993). Les intégrines sont des glycoprotéines hétérodimériques de la 7 2909672 membrane plasmique. Elles sont composées d'une grande sous-unité a (120 à 170 kDa; plus de 940 acides aminés) et d'une petite sous-unité f3 (90 à 100 kDa; plus de 640 acides aminés), associées de façon non covalente. Les sous-unités a et [3 présentent plusieurs types (il existe au 5 moins 19 sous-unités a et 8 sous-unités (3 différentes chez les mammifères), qui sont susceptibles de former diverses combinaisons, qui déterminent la spécificité de liaison à un ou plusieurs contre-récepteur(s) donné(s) (chez les mammifères on compte au moins 25 intégrines différentes; Arnaout, 2002; Shimaoka et al., 2002). 10 Les intégrines se lient à un grand nombre de protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine, fibrinogène, laminine, collagène, thrombospondine, vitronectine et facteur de Von Willebrand) et à des membres de la superfamille des immunoglobulines. Certaines interactions entre les intégrine et leur(s) ligands se font par de courtes séquences 15 tripeptidiques RDG ou tétrapeptidiques (exemple RGDS, RGDA, RGDT, RADS, RFDS...) appelées adhésitopes. Les cations divalents sont essentiels à la fonction des intégrines ; ils sont nécessaires à la stabilisation des complexes a(3 et sont également indispensables pour la fixation des ligands des intégrines. De plus, ils 20 influent également sur l'affinité et la spécificité de la fixation du ligand; la partie N-terminale de la chaîne a contient 3 à 7 sites de fixation de cations bivalents formés par 3 à 7 séquences répétées (Asp-X-Asp-X-Asp-X-Gly-XX-Asp, où X représente un acide aminé quelconque). Les intégrines sont classées en trois sous-familles principales selon 25 le type de leur chaîne p : R1 (ou CD29), f32 (ou CD18) ou f33. Les intégrines pl ou VLA (\/ery Late Antigens) 1 interviennent dans la liaison des cellules à la matrice extracellulaire. Elles sont constituées d'une chaîne a (al à a11 ou aV) associée à une chaîne (31 commune, CD29. Elles sont exprimées à la surface des lymphocytes T à un stade très 30 tardif après l'activation lymphocytaire (Hemler, 1990). Cette sous-famille 8 2909672 inclut les récepteurs du collagène (VLA-2 et VLA-3), de la laminine (VLA-3 et VLA-6) et de la fibronectine (VLA-3, VLA-4 (CD49a/CD29) et VLA-5). La famille des intégrines [32 est impliquée dans l'adhérence des leucocytes à l'endothélium ou à d'autres cellules immunitaires (Dustin et al., 5 1991). Cette famille est composée d'au moins 4 membres, chacun ayant une sous-unité a CD11 a (ou (L; 180 kDa), CD11 b (ou aM; 165 kDa), CD11c (ou aX; 150 kDa) ou CDI1d (ou aD) associée à une sous-unité (32 commune, CD18 (95kDa) (Arnaout, 1990a). L'intégrine 132 CDI 1 a/CD18, également appelée LFA-1 (Lymphocyte 10 Fonction-Associated Antigen-1), est exprimée en forte densité sur tous les leucocytes et sur les plaquettes (Issekutz et al., 1992). Elle peut se lier aux molécules de la superfamille des immunoglobulines ICAMI (CD54), ICAM2 (CD102), ICAM3 (CD50) à iC3b (le récepteur de type 3 du complément) et à JAM-1 (Smith et al., 1989; Arnaout, 1990a; Ostermann et al., 2002). 15 L'intégrine 132 CD11b/CD18, également appelée Mac-1, ou Mol, est exprimée sur les monocytes, les macrophages et les neutrophiles. Elle se lie au contre-récepteur ICAM-1 (Smith et al., 1989; Diamond, 1990). En outre, Mac-1 est le récepteur CR3 (récepteur de type 3 du complément) de iC3b (Beller et al., 1982; Wright et al., 1987; Mosser et al., 1992) et iC4b, 20 du facteur X de coagulation (Altieri et al., 1990a), du fibrinogène (Hammerschmidt et al., 1980; Wright et al., 1988; Altieri et al., 1990b) et de constituants bactériens tels que les LPS. L'intégrine 132 CD11 c/CD18, également appelée p150,95, est le récepteur CR4 de iC3b et iC4b (Arnaout, 1990a). Elle est exprimée sur les 25 macrophages tissulaires. L'intégrine 132 CD11d/CD18, est exprimée sur certaines cellules T et certains macrophages tissulaires. Elle se lie à ICAM-3 (Danilenko et al., 1995). Les intégrines p3 (cytoadhésines) interviennent dans les interactions 30 des plaquettes et des neutrophiles dans les foyers inflammatoires ou dans 9 2909672 les sites de lésions vasculaires (Dustin et al., 1991). Elles sont constituées d'une chaîne aV ou allb associée à une chaîne 133 commune, gplla. Environ la moitié des sous-unités a des intégrines, et en particulier les sous-unités al (CD49a), a2, a10 (CD49b), a11, aE, al_ (CD11 a), aM 5 (CD11 b), aX (CD11 c) et aD (CD11 d), contiennent des domaines d'environ 200 acides aminés identiques ou similaires (différents par leur composition mais conservant la fonction du domaine décrite dans la présente demande) au domaine A de von Willebrand (domaines de type domaine A de von Willebrand), appelés domaines A ou domaines I (le "I" signifiant "inserted"), 10 qui sont localisés dans la partie extracellulaire N-terminale de la sous-unité a (Corbi et al., 1988; Arnaout et al., 1988, 1990; Takada et al, 1989; Brisewitz et al 1993; Zhou et al., 1994; Xie et al., 1995; Whittaker et Hynes, 2002;). Les domaines de type domaine A de von Willebrand sont des 15 domaines conservés et répétés une ou plusieurs fois dans diverses protéines impliquées dans des interactions adhésives, en particulier dans le facteur de von Willebrand (Colombatti et Bonaldo, 1991). Leur structure tridimensionnelle forme un pli de liaison à dinucléotide, ou pli de Rossmann, avec un feuillet 13 parallèle central entouré d'hélices a 20 amphipathiques (Lee et al., 1995a; Arnaout et al., 2002). Le domaine A constitue le site majeur de fixation des ligands dans les intégrines qui contiennent des domaines de type domaine A de von Willebrand (Weisel et al., 1992; Diamond et al., 1993; Hantgan et al., 1993; Michishita et al., 1993; Shimaoka et al., 2002). C'est une métalloprotéinase 25 (Michishita et al., 1993), qui comporte un site de fixation des cations divalents appelé motif MIDAS ("metal ion-dependent adhesion site"), qui confère aux intégrines leur spécificité vis-à-vis du ligand et leur dépendance vis-à-vis de cations divalents; le site MIDAS permet une coordination mutuelle d'ions métalliques et d'un résidu négativement 30 chargé du ligand, par exemple un carboxylate (Lee et al., 1995a; Emsley et al., 2000, Xiong et al., 2002). 10 2909672 Le motif MIDAS du domaine A est parfaitement conservé dans toutes les sous-unités a des intégrines. Il est localisé à l'extrémité C terminale du feuillet bêta du domaine A, au niveau de trois boucles dont les chaînes latérales permettent la coordination d'un ion métallique. Il consiste 5 en une séquence en acides aminés non contiguë du type DXSXS....T....D (Lee et al., 1995) : la séquence DXSXS, où X représente un acide aminé quelconque, est localisée au niveau d'une première boucle (résidus en position 140 à 144 dans le cas de Mac-1), et la thréonine (T) et l'aspartate (D) sont localisés au niveau des deux autres boucles formées par la chaîne 10 (résidus en position 209 et 242 respectivement dans le cas de Mac-1). Des mutations dans ces résidus de coordination bloquent la fixation de l'intégrine CDI 1 b/CD18 à son ligand iC3b (Michishita et al., 1993). Le domaine A de la sous-unité a des intégrines est associé à des changements conformationnels impliqués dans la modulation de l'affinité de 15 liaison de l'intégrine à son contre-récepteur; ce domaine a pu être cristallisé dans deux conformations différentes, appelées conformation fermée et conformation ouverte, qui représentent une conformation de basse affinité (conformation dans l'état inactivé) et une conformation de haute affinité (conformation dans l'état activé) respectivement, la conformation ouverte 20 n'étant observée qu'en présence de ligand (Rui et al., 1998; Shimaoka et al., 2001, 2002; Ma et al., 2002). Dans la structure ouverte, un résidu acide du ligand est coordonné à un ion métallique dans le site MIDAS, alors qu'aucun contact avec le ligand n'a pu être observé dans les structures fermées qui ont été cristallisées (Lee et al., 1995b; Emsley et al., 2000). 25 Le domaine A peut être synthétisé et sécrété sous forme d'une unité structurelle et fonctionnelle indépendante capable d'assurer des fonctions adhésives : des domaines A recombinants des sous-unités a d'intégrines conservent leur spécificité de fixation vis à vis du ligand et leur dépendance vis à vis des cations divalents (Randi et Hogg, 1994; Ueda et al., 1994; 30 Shimaoka et al., 2002). En outre, un domaine A recombinant de Mac-1 ou de LFA-1 est la cible de la plupart des anticorps rnonoclonaux anti-intégrine 11 2909672 bloquant la fonction de Mac-1 ou de LFA-1 (Diamond et al., 1993a; Diamond et al., 1993b; Hogg et al., 1994; Randi et Hogg, 1994; Zhou et ai., 1994). De plus, un domaine A recombinant de LFA-1 est capable de fixer les cations divalents (Michishita et al, 1993) et de se lier directement et à 5 certains ligands de LFA-1, en particulier à ICAM-1, au fibrinogène (Randi et Hogg, 1994; Zhou et al., 1994) et à iC3b (Ueda et al., 1994), et d'inhiber l'adhésion des cellules T à ICAM-1 (Randi et Hogg, 1994). Les sous-unités (3 des intégrines contiennent également des domaines de type domaine A de von Willebrand. Ces domaines, appelés 10 domaines A-like (ou I-like), comprennent environ 240 acides aminés et s'étendent approximativement des résidus 100 à 340 des sous-unités R. Le domaine A-like ressemble fortement au domaine A des chaînes a des intégrines ; il comporte une séquence putative de liaison des ions métalliques similaire à celle du site MIDAS du domaine A (séquence 15 DXSXS ou X est un acide aminé quelconque) et présente une structure secondaire similaire à celle du domaine A, ainsi qu'une similarité de séquence avec le domaine A. Ce domaine A-like semble lier directement le ligand des intégrines dont la sous-unité a ne contient pas de domaine A, et réguler indirectement la fixation du ligand aux intégrines dont la sous-unité 20 a contient un domaine A (Takagi et Springer, 2002). L'importance des intégrines, et en particulier des intégrines 82 est illustrée par la déficience LAD-1 (Leucocyte Adhesion Deficiency Type 1), un syndrome rare caractérisé par des infections bactériennes récurrentes qui peuvent mettre en jeu la vie du patient et provoquer des problèmes de 25 cicatrisation (Anderson et Springer, 1987). Les défauts moléculaires sous-jacents à cette maladie sont des défauts dans la sous-unité (32 des intégrines leucocytaires (Kishimoto et al., 1987; Arnaout et al., 1990). En conséquence, les phagocytes circulants sont incapables d'extravaser au niveau des tissus infectés et d'éliminer les pathogènes (Arnaout, 1990b). 30 Bien qu'essentielle pour la survie de l'hôte, la réaction inflammatoire et en particulier l'action des intégrines 82 exacerbe souvent les lésions 12 2909672 pathologiques locales et les blessures tissulaires dans le cas de nombreuses maladies non-infectieuses telles que le choc hémorragique, les brûlures, en particulier les brûlures du deuxième et du troisième degré, l'athérosclérose, et le rejet hyper aigu (Albelda et al., 1994; Arnaout 1990a). 5 De nombreuses études se sont concentrées sur l'inhibition de l'adhésion cellulaire, qui s'est révélée extrêrnement intéressante, en particulier au vu des résultats suivants : - l'utilisation d'oligonucléotides antisens dirigés contre ICAM-1 (ligand des intégrines LFA-1 et Mac-1) dans un modèle animal de 10 pneumonie induite par des endotoxines permet d'inhiber efficacement l'augmentation de l'expression d'ICAM-1 et la migration des leucocytes dans les tissus enflammés (Kumasaka et al, 1996); - l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre une molécule d'adhésion spécifique ou contre un de ses ligands, qui constitue une 15 méthode de choix pour inhiber la fonction des protéines ciblées, s'est avérée particulièrement efficace dans la réduction des lésions tissulaires. Par exemple, des anticorps dirigés contre des épitopes fonctionnels de la L-sélectine sont capables de réduire les dommages provoqués par la réaction inflammatoire et en particulier d'inhiber les blessures 20 d'ischémie/reperfusion dans plusieurs modèles animaux (Ma et al., 1993; Kurose et al.; 1994; Mihelcic et al.; 1994; Kubes et al., 1995; Seekamp et al., 1997). En outre, l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre la P-sélectine humaine, l'anticorps PB1.3, également connu sous le nom de Cy-1747 (Cytel Corporation, San Diego, Californie), a permis de 25 diminuer la séquestration des neutrophiles et ainsi de réduire les lésions tissulaires au niveau des poumons d'un rat exposé aux facteurs venimeux du cobra responsables du syndrome du stress respiratoire (Mulligan et al, 1995). Par ailleurs, dans de nombreux modèles d'inflammation, des anticorps monoclonaux dirigés contre LFA-1 ou d'autres intégrines 132 30 réduisent nettement l'afflux et les fonctions inflammatoires des leucocytes, préservant ainsi l'intégrité et la survie de l'hôte (Carlos et Harlan, 1990). 13 2909672 Cependant, l'utilisation thérapeutique d'anticorps monoclonaux pour bloquer l'adhésion leucocytaire présente des limites. En particulier, l'administration à l'homme d'anticorps générés en utilisant des animaux (anticorps murins par exemple) va de paire avec des risques de 5 contamination par des endotoxines ou des virus, des effets cliniquesimprévisibles et une sensibilisation (les anticorps monoclonaux sont susceptibles de provoquer des réactions anaphylactiques dans le cas d'administrations répétées). Certaines manifestations cliniques imprévisibles sont imputables à la partie effectrice de l'immunoglobuline 10 (partie Fc). Ainsi, la neutropénie observée suite à l'administration d'un anticorps dirigé contre la L-sélectine peut s'expliquer par une séquestration des neutrophiles reconnus par l'anticorps dans le système réticulo-endothélial. L'élimination de la partie Fc des anticorps a pour effet de réduire ces effets adverses mais ceci s'accompagne d'une vitesse de 15 clearance élevée, ce qui implique des administrations d'anticorps plus fréquentes. Par ailleurs, les anticorps monoclonaux peuvent provoquer la génération d'anticorps anti-idiotypes pouvant abolir l'activité des anticorps monoclonaux administrés et ainsi bloquer l'effet thérapeutique recherché, La présente invention est basée sur une autre stratégie, à savoir la 20 production de molécules d'adhésion solubles, qui soient susceptibles de moduler la fonction des sélectines endogènes et celle des intégrines endogènes. En particulier, cette modulation peut être le fait de la liaison de molécules d'adhésion chimères solubles selon l'invention aux ligands de sélectines et aux ligands d'intégrines. 25 Des formes circulantes des L-, E- et P-sélectines et de molécules de la superfamille des immunoglobulines (VCAM-1 et ICAM-1) ont été détectées dans le sérum et les autres fluides corporels de patients sains (Schleiffenbaum et al., 1992; Gearing et Newman, 1993; Newman et al., 1993; Ishiwata et al., 1994; Seekamp et al., 2001). Ces molécules solubles 30 peuvent être le résultat d'un détachement de molécules d'adhésion de la cellule par clivage endoprotéolytique (cas de la L-sélectine, qui se détache 14 2909672 de la membrane des leucocytes après l'étape de roulement pour permettre aux leucocytes d'adhérer fermement à l'endothélium), ou être produites sous forme sécrétée par un mécanisme d'épissage alternatif qui exclut la partie trans-membranaire du récepteur (cas de la P-sélectine). La 5 concentration des sélectines circulante varie (généralement elle augmente mais parfois, elle diminue) dans le sérum de patients présentant des pathologies inflammatoires (Gearing et Newman, 1993; Newman et al., 1993; Blann et al., 1995; Semenov et al., 1999; Seekamp et al., 2001). Les sélectines solubles présentes dans la circulation sanguine sont 10 biologiquement actives; en effet, la P-sélectine soluble est capable d'interagir avec des anticorps anti-sélectine dirigés contre le domaine cytoplasmique de la P-sélectine (Ishiwata et al., 1994; Semenov et al., 1999) et les L-, E- et P-sélectines solubles sont capables de se lier à leurs contre-récepteurs (Seekamp et al., 2001; Newman et al., 1993 et Gamble 15 et al., 1990 respectivement). En outre, en présence de concentrations croissantes de L-sélectine soluble, les sites potentiels de liaison à l'endothélium se trouvent saturés, ce qui a pour conséquence une diminution de l'adhérence des leucocytes (Tu et al., 2002). Ceci suggère que les sélectines solubles entrent en compétition avec les sélectines 20 exprimées sur la surface cellulaire et pourraient ainsi être impliquées dans la régulation de la réponse inflammatoire. Cependant, le niveau systémique des molécules d'adhésion solubles est généralement trop peu élevé pour pouvoir observer un effet antiadhésif (Blann et al., 1995). Des études précédentes ont décrit la production de sélectines 25 solubles recombinantes contenant le domaine extracellulaire de la E-, P- ou L-sélectine, en particulier le domaine lectine de type C. Ainsi, dans Pigott et al (1991) et Li et al. (1994), des sélectines solubles contenant le domaine lectine et le domaine EGF de la E-sélectine ont été obtenues par délétion des domaines CR et de la partie C-terminale. Par ailleurs, le domaine 30 lectine de la L-sélectine de souris (Bowen et al., 1990; Watson, 1991) ou de la E-sélectine de souris (Levinovitz et al., 1993) a été fusionné à la région 15 2909672 constante de l'IgGl humaine afin d'augmenter la demi-vie de la molécule chimérique circulante; une telle L-sélectine chimérique est capable de bloquer la migration des neutrophiles vers un péritoine irrité par du thioglycollate chez la souris et empêche le roulement des neutrophiles sur 5 les veinules mésentériques du rat (Kansas et al., 1993). Des intégrines recombinantes ont également été décrites, en particulier un domaine A recombinant de la sous-unité CD11 b humaine (US5,424,399; W091/19511). De plus, le domaine A de la sous-unité CD11 a ou CD11 d a été fusionné au fragment Fc de l'immunoglobuline 10 IgG1 humaine (Randi et Hogg et W095/17412 respectivement). Enfin, le domaine A de la sous-unité CD11 b humaine ou de rat et été fusionné à la Gluthation-S-Tranférase (Michita et al., 1993; Rieu et al., 1994; Ueda et al., 1994; Zhou et al, 1994; Zerria et al., 2002 et 2C)06;). Ainsi, les inventeurs ont précédemment démontré qu'une forme soluble recombinante du 15 domaine A de la sous-unité CD11 b de rat fusionnée à la GST est capable d'agir comme un antagoniste compétitif de l'intégrine CD11 b/CD18 in vivo ; l'administration (par voie intraveineuse) de cette construction à des rats ayant subi un traumatisme inflammatoire du muscle squelettique a eu pour effet de diminuer de façon significative l'infiltration des leucocytes circulants 20 et a permis de préserver les tissus voisins des dommages provoqués par la réaction inflammatoire (Zerria et al., 2006). Une telle protéine soluble, qui permet de cibler l'étape d'adhésion ferme de la transmigration endothéliale, bloque transitoirement l'afflux des leucocytes dans le site inflammatoire. La nature transitoire de ce blocage est attribuée au fait que le domaine A 25 utilisé est sous une forme conformationnelle non activée; l'utilisation d'une forme activée du domaine A (forme de haute affinité) permettrait de bloquer de façon prolongée la migration leucocytaire. L'invention concerne des polypeptides chimériques qui se distinguent des molécules d'adhésion recombinantes précédemment 30 décrites en ce qu'ils sont capables de et destinés à cibler de façon concomitante deux étapes de la diapédèse, à savoir d'une part le 16 2909672 recrutement et le roulement des leucocytes sur l'endothélium (étape faisant intervenir les sélectines) et d'autre part l'adhésion ferme des leucocytes à l'endothélium (étape impliquant les intégrines). Cibler seulement une étape du processus de transmigration au 5 niveau du tissu agressé peut s'avérer insuffisant pour inhiber la réaction inflammatoire. En effet, dans des modèles animaux, certains antagonistes des sélectines tels que le fucoidin (un carbohydrate se liant aux sélectines) ou des anticorps monoclonaux dirigés contre la L ou la P sélectine, se sont montrés efficaces pour réduire le recrutement de leucocytes sur 10 l'endothélium uniquement lorsque le roulement leucocytaire était réduit de plus de 90% (Kubes et al, 1995); il semble qu'une fois que quelques neutrophiles adhèrent, ceux-ci soient capables de recruter d'autres neutrophiles, probablement par un mécanisme d'amplification (Tan et al, 1999). 15 La présente invention a pour objet un nouveau polypeptide chimérique comprenant une entité de type sélectine et une entité de type intégrine, appelé "sélegrine", destiné à cibler de façon concomitante les étapes de roulement des leucocytes et d'adhésion ferme des leucocytes à l'endothélium vasculaire. 20 Les polypeptides chimériques selon l'invention agissent à la fois comme antagonistes d'une ou plusieurs sélectine(s) et comme antagonistes d'une ou plusieurs intégrines ; ils sont destinés à saturer les contre-récepteurs d'une ou plusieurs sélectines et les contre-récepteurs d'une ou plusieurs intégrines, ces contre-récepteurs pouvant être exprimés 25 par des leucocytes et/ou par d'autres types cellulaires, en particulier par des cellules épithéliales. Ainsi, en liant et en particulier en saturant les contre-récepteurs épithéliaux de sélectines leucocytaires et d'intégrines leucocytaires, les polypeptides chimériques selon l'invention empêchent les leucocytes de s'attacher puis d'adhérer à l'épithélium. Par ailleurs, en liant, 30 en particulier en saturant les contre-récepteurs leucocytaires de sélectines leucocytaires et d'intégrines leucocytaires, les polypeptides chimériques 17 2909672 selon l'invention empêchent les leucocytes d'adhérer les uns aux autres. Les polypeptides chimériques selon l'invention sont décrits selon différents modes de réalisation particuliers qui peuvent être combinés entre eux, de même que les caractéristiques de ces modes de réalisation 5 particuliers. Le polypeptide chimérique selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en au moins une entité (i) constituée par au moins un domaine lectine de type C d'une sélectine et/ou au moins une portion du domaine lectine de 10 type C d'une sélectine, ce domaine ou cette portion de domaine permettant de fixer les ligands de ladite sélectine de façon calcium-dépendante, et au moins une entité (ii) constituée par au moins un domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine et/ou au moins une portion du domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine, ce domaine 15 et/ou cette portion de domaine, contenant le motif MIDAS ou un motif de type MIDAS, et (iii) au moins une molécule de liaison (ou linker), un linker liant - une entité (i) soit à une entité (ii) soit à une autre entité (i) ou 20 - une entité (ii) à une autre entité (ii), ou - un ensemble d'entités de type (i) à un ensemble d'entités de type (ii). Lorsque le polypeptide chimérique selon l'invention comprend de multiples (au moins deux) domaines ou portions de domaines lectine de 25 type C et/ou de multiples (au moins deux) domaines ou portions de domaine(s) de type domaine A de von Willebrand, ledit polypeptide chimérique peut présenter une alternance de domaines de chacune des deux catégories de domaine et/ou une succession de domaines d'une même catégorie. Par ailleurs, les multiples domaines lectine et/ou portions 30 de domaine lectine peuvent provenir de la même sélectine ou de sélectine différentes. De même, les multiples domaines de type A de von 18 2909672 Willenbrand et/ou portions de domaine de type A de von Willenbrand peuvent provenir de la même intégrine ou d'intégrines différentes. La présence d'un linker est indispensable à la fonction de la sélegrine. Le terme linker inclut tout élément permettant d'espacer une 5 entité de type sélectine et une entité de type intégrine, ou une entité de type sélectine et une autre entité de type sélectine, ou encore une entité de type intégrine et une autre entité de type intégrine, pour qu'elles puissent se replier correctement et exercer indépendamment et de façon concomitante leurs fonctions adhésives. Ledit linker peut-être de longueur 10 et de nature variable. Il est avantageusement suffisamment flexible pour ne pas entraver le repliement des entités de type sélectine et de type intégrine. De préférence, le linker est très peu, voire pas du tout, immunogène. Par exemple, le linker n'est pas une séquence du soi. Le ou les entités de type sélectine et le ou les entités de type 15 intégrine peuvent être liées génétiquement ou chimiquement par l'intermédiaire dudit linker. Selon un mode de réalisation particulier, deux entités selon l'invention sont liées (ou fusionnées) de façon covalente, par exemple par l'intermédiaire de liaisons peptidiques. Ainsi, selon un mode de réalisation 20 particulier, ledit linker est un polypeptide en particulier un peptide. Selon un mode de réalisation particulier, le linker polypeptidique consiste en une séquence d'acides aminés ayant de 3 à 100 résidus ou pour les linkers peptidiques ayant de 3 à 50, par exemple 3 à 20, ou 10 à 20 résidus d'acides aminés. 25 Un linker particulièrement approprié est un peptide ou un polypeptide de liaison flexible. Selon un mode de réalisation particulier, le linker comprend ou consiste en la séquence 3(GGGGS); le peptide 3(GGGGS) est un peptide de 15 acides aminés constitué d'un motif de 4 Glycines et une Serine 30 successives, ce motif étant répété 3 fois (SEQ ID NO.16). 19 2909672 Par chimérique , on entend un polypeptide qui associe des entités qui proviennent de molécules distinctes. Un polypeptide chimérique selon l'invention peut être le produit d'expression d'un polynucléotide recombinant et peut être exprimé par voie recombinante dans une cellule 5 hôte. Les différents domaines constituant une Sélégrine selon l'invention peuvent aussi être produits synthétiquement ou isolés à partir protéines purifiées et associés dans le polypeptide chimérique. Le terme sélectine au sens de la présente demande inclut toute sélectine, en particulier la L-, la P- et la E-sélectine. Selon un mode de 10 réalisation particulier, ladite sélectine ou au moins une desdites sélectines est une sélectine exprimée à la surface de leucocytes (sélectine leucocytaire), en particulier la L-sélectine. Le terme intégrine inclut toute intégrine, et en particulier les intégrines exprimées à la surface de leucocytes (intégrines leucocytaires) 15 et les intégrines exprimées à la surfaces des cellules endothéliales. Ladite intégrine leucocytaire ou au moins une desdites intégrines leucocytaires est en particulier une intégrine dont la sous-unité R est CD18 (intégrine de type [32). Selon un mode de réalisation particulier, ladite intégrine ou au moins une desdites intégrines est choisie parmi le groupe constitué des sous- 20 unités CD11 a (aL), CD11 b (aM), CD11 c (aX) et CD11 d (aD). A titre d'exemple, ladite intégrine ou au moins une desdites intégrines est choisie parmi le groupe constitué des intégrines CD11 a/CD18, CD11 b/CD18, CD11 c/CD18 et CD11 d/CD18, par exemple l'intégrine CD11 b/CD18. Ladite ou lesdites sélectine(s) et ladite ou lesdites intégrine(s) selon 25 l'invention peuvent être des protéines de mammifère non humain ou des protéines humaines. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le polypeptide chimérique consiste en un domaine lectine de type C ou une portion d'un tel domaine lié par un linker à un domaine de type A de von Willebrand ou 30 une portion de ce domaine. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide 20 2909672 chimérique comprend au moins deux domaines lectines de type C ou portions de ces domaines et/ou au moins deux domaines de type domaine A de von Willebrand ou portions de ces domaines. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le polypeptide 5 chimérique comprend 3, 4, 5 ou 6 domaines lectines de type C ou portions de ces domaines et/ou 3, 4, 5 ou 6 domaines de type domaine A de von Willebrand ou portions de ces domaines. Le nombre des domaines ou portions de domaines de chaque type peut être identique ou différent dans le polypeptide chimérique. 10 Lorsque les domaines lectines de type C ou leurs portions et/ou les domaines de type domaine A de von Willebrand ou leurs portions sont multiples, ils sont identiques ou différents entre eux, c'est-à-dire qu'il peuvent provenir de la même sélectine ou de la même intégrine ou de protéines différentes. 15 Selon un mode de réalisation particulier, le ou les domaine(s) lectine de type C et/ou la ou les portion(s) de domaine lectine de type C est (sont) en position NH2-terminale et le ou les domaine(s) de type domaine A de von Willebrand et/ou la ou les portion(s) de domaine de type domaine A de von Willebrand est (sont) en position COOH-terminale du polypeptide 20 chimérique. Par domaines lectines de type C d'une sélectine , on entend un domaine tel que défini ci-dessus, dont la composition et la structure permettent à une sélectine qui le contient de se lier de façon calcium-dépendante sur un groupement carbohydrate d'un ligand, en particulier sur 25 un groupement carbohydrate du PSGL-1. Par portion du domaine lectine de type C d'une sélectine , on entend un fragment composé d'acides aminés contigus dudit domaine lectine de type C d'une sélectine qui conserve la fonction de fixation du ligand précité de la sélectine de façon calcium-dépendante, fonction 30 normalement attachée au domaine lectine de type C des sélectines ou des acides aminés formant des fragments dont l'ensemble conserve la susdite 21 2909672 fonction. Le terme ligand tel qu'utilisé dans la présente demande désigne à la fois les ligands solubles et les ligands membranaires (ou contre-récepteurs) d'une sélectine ou d'une intégrine. 5 La capacité du domaine lectine de type C ou d'une portion du domaine lectine de type C à fixer son ou ses ligand(s), et en particulier le ligand PSGL-1, peut-être mise en évidence in vitro par toute technique permettant de démontrer des interactions entre une protéine et son ligand, par exemple, par des expériences de coimrnunoprécipitation, la co- 10 immunoprécipitation du domaine lectine de type C ou d'une portion du domaine lectine de type C avec son ou ses ligand(s) pouvant être mise en évidence par exemple par électrophorèse Page-SDS ou par transfert de type Western (Western Blot). Selon un mode de réalisation particulier, le domaine lectine de type 15 C est le domaine lectine de type C d'une sélectine exprimée par les cellules endothéliales, en particulier le domaine lectine de type C de la P-sélectine ou de la E-sélectine, et plus particulièrement le domaine lectine de type C de la P-sélectine humaine ou de la E-sélectine humaine. Selon un autre mode de réalisation, la séquence du domaine lectine 20 de type C est la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine, ou une séquence modifiée par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.2, ladite séquence modifiée conservant la fonction de fixation du ligand, en particulier du ligand PSGL-1, de façon calcium-dépendante 25 normalement attachée au domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine. Par domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine , on entend un domaine identique ou similaire (c'est-à-dire dont la séquence d'acides aminés est distincte de celle du domaine A de von 30 Willebrand mais qui en conserve la fonction ci-dessous rappelée), à un domaine A du facteur de von Willebrand, ledit domaine provenant d'une 22 2909672 intégrine. Un tel domaine inclut les domaines A des sous-unités a des intégrines, qui contiennent un motif MIDAS tel que défini plus haut, qui permet de coordonner conjointement un ligand d'une intégrine et des cations divalents. Un tel domaine inclut également les domaines A-like des 5 sous-unités 3 des intégrines, qui contiennent également un motif de type MIDAS et sont également capables de coordonner des ions métalliques et de réguler la fixation du ligand normalement attachée au domaine A-like de ladite intégrine. Par portion du domaine de type domaine A de von Willebrand 10 d'une intégrine , on entend un fragment composés d'acides aminés contigus dudit domaine de type domaine A de von Willebrand, en particulier un fragment d'un domaine A de la sous-unités a d'une intégrine, qui contient un motif MIDAS et donc conserve la capacité à coordonner un ligand d'une intégrine et des cations divalents, ou un fragment d'un 15 domaine A-Iike de la sous-unité 13 d'une intégrine, qui contient un motif de type MIDAS et qui conserve la capacité à coordonner des ions métalliques et à réguler la fixation du ligand à l'intégrine ou des acides aminés formant des fragments dont l'ensemble conserve l'une desdites fonctions. Selon un mode de réalisation particulier, la portion du domaine de 20 type domaine A de von Willebrand contient un motif MIDAS dans son intégralité. Selon un autre mode de réalisation, la portion du domaine de type domaine A de von Willebrand contient une portion d'un motif MIDAS, ladite portion de motif MIDAS conservant la fonction dudit site MIDAS. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine ou au moins un 25 des domaines de type domaine A de von Willebrand est le domaine A de la sous-unité a d'une intégrine de type [32, en particulier le domaine A de la sous-unité aL (CD11 a), aM (CD11 b), aX (CD11 c) ou aD (CD11d), et plus particulièrement, le domaine A de la sous-unité aM (CD11 b). A titre d'exemple, la séquence en acides aminés du domaine de type 30 domaine A de von Willebrand est la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine, ou une séquence modifiée par 23 2909672 insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.6, ladite séquence modifiée conservant la capacité à coordonner un ligand de l'intégrine (en particulier le ligand ICAM-1 ou le ligand iC3b) et des cations divalents attachée au domaine A de la sous- 5 unité a CD11 b humaine. A titre d'exemple également, une portion du domaine de type domaine A de von Willebrand selon l'invention comprend ou consiste en au moins le fragment correspondant aux acides aminés en position 140 à 242 de la sous-unité a CD11b humaine (SEQ ID NO.7) ou un domaine ayant au 10 moins 90% ou au moins 70% d'identité avec ledit fragment lorsque les deux séquences sont alignées. Par exemple, la séquence d'une portion du domaine de type domaine A de von Willebrand est la séquence SEQ ID NO.7 correspondant aux acides aminés en position 140 à 242 de la SEQ ID NO.5. 15 Selon un autre mode de réalisation, la séquence en acides aminés du domaine ou d'au moins un des domaines de type domaine A de von Willebrand est la séquence du domaine A de la sous-unité a de l'intégrine CD11a/CD18 humaine (SEQ ID NO.10), CD11c/CD18 humaine (SEQ ID NO.13) ou CDI 1 d/CD18 humaine, ou une séquence modifiée par insertion, 20 délétion ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.10 ou SEQ ID NO.13 ou dans la séquence du domaine A de la sous-unité a CD1ld humaine, ladite séquence modifiée conservant la capacité à coordonner un ligand de ladite intégrine et des cations divalents attachée au domaine A de la sous-unité a CD11 a, CD11 c 25 ou CDIld humaines respectivement. Un des ligands coordonnés par ledit domaine ou fragment dudit domaine de type domaine A de von Willebrand est en particulier ICAM-1 ou iC3b dans le cas de l'intégrine CD11 a/CD18, iC3b dans le cas de l'intégrine CD11c/CD18 humaine, et ICAM-3 dans le cas de l'intégrine CD11d/CD18 humaine. 30 Selon un autre mode de réalisation, le domaine ou au moins un des domaines de type domaine A de von Willebrand est le domaine A-like de la 24 2909672 sous-unité 82 (CD18), en particulier le domaine A-like de la sous-unité 32 humaine. Selon un mode de réalisation particulier, le domaine ou au moins un des domaines de type domaine A de von Willebrand et/ou la portion ou au 5 moins une des portions dudit domaine est dans une conformation non activée, qui correspond à l'état d'activité de base (conformation fermée, qui ne permet pas de fixer le ligand) telle que définie plus haut. Un polypeptide chimérique comprenant un domaine ou une portion dudit domaine de type domaine A de von Willebrand en conformation non activée permet de ne 10 pas inhiber l'adhésion cellulaire de façon constitutive et de moduler et non bloquer l'afflux des leucocytes. En effet, la migration des leucocytes vers les tissus agressés étant nécessaire au développement d'une réponse immunitaire localisée, il est préférable de n'interférer que temporairement avec la capacité des leucocytes, en particulier des neutrophiles, à 15 extravaser et tuer les bactéries au niveau du site d'infection; l'objectif est diminuer les aspects pathologiques de la réaction inflammatoire sans provoquer une immunosuppression significative. Alternativement, le domaine de type domaine A de von Willebrand ou la portion dudit domaine est dans une conformation activée 20 (conformation ouverte). Cette conformation peut être obtenue en introduisant dans le domaine de type domaine A de von Willebrand de la sélégrine une mutation ponctuelle qui permet de passer à un état de haute activité et d'affinité élevée. Par exemple, dans le cas du domaine A de CD11 b, le passage d'une forme inactive vers une forme active ouverte de 25 haute affinité peut être induit par délétion d'une Isoleucine C-terminale invariable, l'Isoleucine 316, ou par substitution de cette l'Isoleucine 316 par une glycine (Xiong et al, 2000). Une telle forme active peut être synthétisée par mutagenèse dirigée, par exemple en utilisant la technique mise au point par les inventeurs et décrite dans Rabhi et al., 2004. 30 Selon un mode de réalisation particulier, le domaine de type domaine A de von Willebrand ou la portion dudit domaine est verrouillé 25 2909672 (naturellement ou artificiellement) dans la conformation de haute affinité, de façon à obtenir un effet anti-inflammatoire de plus longue durée. Alternativement, on peut également prolonger l'effet anti-inflammatoire du polypeptide chimérique selon l'invention en le fusionnant à 5 une molécule qui permet d'augmenter la demi-vie de la molécule chimérique circulante, telle que la région constante de l'IgG1 humaine. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique selon la présente invention comprend ou consiste en le domaine lectine de type C de la L-, E- ou P- sélectine, en particulier de la L-, E- ou P- sélectine 10 humaine, lié par un linker selon l'invention (i) au domaine A de la sous-unité aL (CD11 a), aM (CD11 b), aX (CD11 c) ou aD (CD11 d) d'une intégrine, en particulier d'une intégrine humaine ou (ii) au domaine A-like de la sous-unité p2 (CD18) d'une intégrine, en particulier d'une intégrine humaine. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique 15 selon l'invention comprend : en tant que domaine lectine de type C d'une sélectine, un polypeptide consistant en la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine, ou la séquence SEQ ID NO.2 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés dès lors 20 que ladite séquence conserve la fonction de fixation des ligands de façon calcium-dépendante normalement attachée au domaine lectine de type C de ladite sélectine, et - en tant que domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine, (i) un polypeptide consistant en la séquence SEQ ID NO.6 du 25 domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine, ou la séquence SEQ ID NO.6 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que la séquence modifiée conserve la capacité à coordonner un ligand d'une intégrine et des cations divalents normalement attachée au domaine A de ladite sous-unité a, ou (ii) un polypeptide 30 consistant en la séquence du domaine A-like de la sous-unité CD18 (f32) humaine, ou la séquence du domaine A-Iike de la sous-unité CD18 26 2909672 humaine modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que la séquence modifiée conserve la capacité à réguler la fixation du ligand à l'intégrine normalement attachée au domaine A-Iike de ladite intégrine. 5 Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique selon l'invention comprend : - en tant que portion dérivée du domaine lectine de type C d'une sélectine, un polypeptide consistant en un fragment de la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine ou un fragment de la 10 séquence SEQ ID NO.2 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que ledit fragment conserve la fonction de fixation des ligands de façon calcium-dépendante normalement attachée au domaine lectine de type C de ladite sélectine, et - en tant que portion dérivée du domaine de typedomaine A de von 15 Willebrand d'une intégrine, (i) un polypeptide consistant en un fragment de la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine, ou un fragment de la séquence SEQ ID NO.6 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que ledit fragment conserve la capacité à coordonner un ligand d'une 20 intégrine et des cations divalents normalement attachée au domaine A de ladite intégrine ou (ii) un polypeptide consistant en un fragment de la séquence du domaine A-Iike de la sous-unité CD18 ((32) humaine, ou un fragment de la séquence du domaine A-Iike de la sous-unité CD18 humaine modifiée par substitution, délétion ou insertion d'un ou plusieurs 25 acides aminés dès lors que ledit fragment conserve la capacité à réguler la fixation du ligand à l'intégrine normalement attachée au domaine A-Iike de ladite intégrine. A titre d'exemple, la séquence d'un des polypeptides chimériques selon la présente invention comprend ou consiste en la séquence SEQ ID 30 NO.17, qui correspond à la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine liée par un peptide de liaison 3(GGGGS) 27 2909672 (SEQ ID NO. 16) à la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine. A titre d'exemple également, la séquence d'un des polypeptides chimériques selon la présente invention comprend ou consiste en la 5 séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine liée par un peptide de liaison 3(GGGGS) (SEQ ID NO. 16) à la séquence du domaine A-like de la sous-unité 132 (CD18) humaine. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique comprend en outre une séquence tag, qui permet de purifier le polypeptide 10 chimérique. De préférence, ladite séquence tag comprend une pluralité d'acides aminés histidine liés consécutivement, en particulier une séquence de 6 histidines consécutives (séquence (Histidine)6). Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique comprend en outre un marqueur permettant de détecter le polypeptide 15 chimérique par ELISA ou en Western Blot. De préférence, ledit marqueur est un épitope reconnu par un anticorps monoclonal spécifique, par exemple un épitope myc. La présente invention a également pour objet un polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide chimérique selon la 20 présente invention, selon le code génétique universel, et en tenant compte de la dégénérescence de ce code. A titre d'exemple, la séquence nucléotidique dudit polynucléotide comprend ou consiste en la séquence codant pour le polypeptide chimérique de séquence SEQ ID NO.17 ou une séquence modifiée par 25 insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs nucléotide(s) dans la séquence codant pour le polypeptide chimérique de séquence SEQ ID NO.17, ladite séquence codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO.17 ou pour un polypeptide modifié ayant la même fonction que le polypeptide de séquence SEQ ID NO.17. 30 La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend un insert 28 2909672 polynucléotidique sous le contrôle de ses éléments de régulation, de clonage ou d'expression constitué par un polynucléotide selon l'invention. Outre l'insert polynucléotidique précité, le vecteur comprend les éléments caractéristiques des vecteurs de clonage ou d'expression, énoncés et 5 illustrés dans les exemples. Le vecteur de clonage ou d'expression selon l'invention est par exemple le plasmide pPICZaB tel que représenté en figure 6. pPICZaB est un vecteur de la famille des vecteurs pPICZa, vecteurs particulièrement bien adapté pour la transformation des cellules de levures telles que Pichia 10 pastoris. Sa taille est de 3,6kb. Il contient le gène de résistance à la zéocine, qui remplace les gènes His4 et de résistance à l'ampicilline, ce qui permet une sélection plus simple et directe des clones positifs et une réduction de la taille du vecteur de clonage. Dans la région C-terminale des protéines produites en utilisant ce vecteur, on trouve : 15 - une queue poly-Histidine (6 histidines), permettant une purification et une détection rapides des protéines recombinantes exprimées dans Pichia pastoris; - un épitope myc pour une détection rapide des protéines recombinantes par ELISA ou par Western Blot. 20 Le vecteur pPICZaB présente les locus suivants : - un promoteur AOX1 inductible destiné à obtenir un taux élevé d'expression de protéine recombinante; - un a-facteur de Saccharomyces cerevisiae permettant de transporter les protéines de fusion jusqu'au surnageant de culture et 25 simplifiant ainsi l'extraction des protéines recombinantes; - un gène de résistance à la zéocine, sous le contrôle du promoteur EM7 pour une sélection dans Escherichia coli et sous le contrôle du promoteur TEF1 pour une sélection dans Pichia pastoris; - une origine de réplication dans Escherichia coli, ColE1. 30 Le vecteur décrit dans la partie exemples comprend un insert 29 2909672 polynucléotidique codant pour la protéine chimérique (sélégrine) de séquence SEQ ID NO. 17. Cependant, cet insert peut être remplacé par tout insert polynucléotidique constitué par un polynucléotide selon l'invention. En outre, il est possible de rajouter des éléments régulateurs. 5 La présente invention a également pour objet une culture cellulaire sélectionnée parmi le groupe comprenant les cultures cellulaires primaires de bactéries, les cultures cellulaires primaires de cellules eucaryotes animales et les lignées cellulaires, ladite culture cellulaire contenant un polynucléotide selon la présente invention. De préférence, ladite culture 10 cellulaire est une culture cellulaire de levure, en particulier une culture cellulaire de levure Pichia pastoris. Un procédé de production d'un polypeptide chimérique tel que défini ci-dessus fait également partie de la présente invention. Ledit procédé comprend les étapes suivantes : 15 a) l'introduction, par les techniques classiques de génie génétique, d'un polynucléotide selon l'invention dans une cellule hôte sélectionnée parmi le groupe comprenant les microorganismes de type bactérie, les cellules eucaryotes animales et les cellules d'une lignée cellulaire; b) l'expression dudit polynucléotide dans ladite cellule hôte; 20 c) la récupération du polypeptide exprimé. Un procédé particulier selon l'invention est caractérisé en ce que ledit polynucléotide utilisé à l'étape a) est assemblé par PCR. Par exemple, ledit nucléotide peut être assemblé en utilisant les amorces L2F/R1 F décrites ci-dessous. 25 Selon un mode de réalisation particulier, l'expression dudit polynucléotide dans ladite cellule hôte comprend une étape de culture à haute densité cellulaire en fermenteur. Une telle étape permet de produire un polypeptide chimérique avec un meilleur rendement. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique 30 selon l'invention est exprimé sous forme recombinante, dans le système d'expression de levure Pichia pastoris. La souche de levure Pichia pastoris 30 2909672 KM71 H est particulièrement, appropriée pour exprimer le polypeptide chimérique de l'invention sous forme recombinante. Cette souche est de phénotype arg4 aoxl:ARG4 et de génotype Muts, Arg+. Elle est fournie par Invitrogen et utilisée sous licence. Cette levure présente plusieurs 5 avantages pour l'expression de protéines recombinantes par rapport aux systèmes classiques, à savoir : - un taux d'expression élevé de protéine de fusion, pouvant aller jusqu'à 12 g/I; - un passage à l'expression en fermenteur plus facile qu'avec des 10 bactéries ou d'autres cellules; pichia pastoris s'adapte plus facilement aux conditions de fermentation que ce soit dans des petits volumes (inférieurs à 1 litre) ou dans des grands volumes (supérieurs à 10 000 litres); - une expression nettement moins coûteuse que dans d'autres systèmes d'expression en comparaison à son taux élevé d'expression; 15 - un système de sélection simple, varié et efficace. En outre, Pichia pastoris est un système d'expression eucaryote et est capable de réaliser les modifications post-traductionnelles des protéines eucaryotes. Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide chimérique 20 selon l'invention est produit sous forme recombinante chez la levure Pichia pastoris par culture à haute densité cellulaire dans un fermenteur. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un sérum polyclonal dirigé contre un polypeptide chimérique tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes 25 suivantes : -immunisation d'un animal avec ledit polypeptide chimérique associé ou non à un adjuvant, le cas échéant au moyen d'administrations répétées dudit polypeptide; - récupération des anticorps formés, capables de reconnaître le polypeptide 30 chimérique utilisé pour l'immunisation. 31 2909672 La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'anticorps monoclonaux reconnaissant un polypeptide chimérique selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : - immunisation d'un animal, par exemple une souris Balb/c, avec ledit 5 polypeptide chimérique, l'immunisation étant le cas échéant réalisée au moyen d'administrations répétées du polypeptide; - fusion des cellules spléniques de l'animal immunisé avec des cellules de myélome pour former un hybridome; - culture de l'hybridome dans des conditions permettant la production 10 d'anticorps; - récupération des anticorps dirigés contre le polypeptide chimérique utilisé pour l'immunisation. Une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide chimérique selon l'invention et un diluant ou un véhicule pharmaceutiquement 15 acceptable fait également partie de l'invention. Une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides chimériques selon l'invention et ou plusieurs véhicule(s), diluant(s), excipient(s), et/ou adjuvant(s) pharmaceutiquement acceptables fait également partie de l'invention. 20 Une composition pharmaceutique particulière selon l'invention comprend en outre un second agent thérapeutique, en particulier un agent anti-inflammatoire. La présente demande a également pour objet l'utilisation du polypeptide chimérique ou de la composition pharmaceutique selon 25 l'invention pour moduler l'adhésion des leucocytes aux endothéliums vasculaires, et en particulier pour moduler l'ancrage et l'adhésion ferme des leucocytes aux endothéliums vasculaires, comme défini ci-dessus. Le terme leucocytes tel qu'utilisé dans la présente demande est susceptible de désigner tout type de leucocytes; il peut s'agir de leucocytes 30 polynucléaires (également appelés basophiles), en particulier de neutrophiles, d'éosinophiles et/ou de basophiles, et/ou de leucocytes 32 2909672 mononucléaires, en particulier de lymphocytes, de monocytes et/ou de macrophages. Le terme lymphocytes inclut les lymphocytes T, en particulier les lymphocytes T CD4+ et les lymphocytes T CD8+, et les lymphocytes B. Selon un mode de réalisation particulier, le terme 5 leucocytes désigne les leucocytes circulants, en particulier les neutrophiles. Par moduler , on entend diminuer le niveau des symptômes observés ou les effets de la pathologie en cause ou supprimer complètement les symptômes observés ou les effets de la pathologie en cause. La modulation de la diapédèse peut-être permanente ou transitoire. 10 Cette modulation peut être mesurée par tout test, en particulier tout test in vitro, permettant de quantifier et/ou qualifier l'inhibition de l'adhésion cellulaire. On peut par exemple utiliser le test de la chambre de Boyden, qui consiste à disposer les cellules endothéliales entre deux compartiments de la chambre de Boyden et à suivre le passage des leucocytes d'un 15 compartiment à l'autre. Une telle méthode est décrite par exemple dans Lee et al., 2006. En outre, le polypeptide chimérique ou la composition pharmaceutique selon l'invention peut être utilisé(e) comme médicament, en particulier comme agent anti-inflammatoire. Par agent anti- 20 inflammatoire , on entend un agent permettant de prévenir ou de diminuer, voire inhiber, la réaction inflammatoire, qu'il s'agisse d'une inflammation aigüe ou chronique. En particulier, le polypeptide chimérique ou la composition selon l'invention peut être utilisé(e) pour moduler l'afflux des leucocytes dans les 25 sites inflammatoires, en particulier pour prévenir les lésions tissulaires de nature inflammatoire. Ainsi, le polypeptide chimérique ou la composition pharmaceutique selon l'invention peut être administré(e) à un animal non humain ou à un humain qui présente des risques de développer une réaction inflammatoire, 30 en particulier une réaction inflammatoire excessive, ou à un animal non 33 2909672 humain ou un patient développant une réaction inflammatoire, en particulier une réaction inflammatoire excessive. Le polypeptide chimérique selon l'invention ou la composition le comprenant sont susceptibles d'être administrés à un animal ou à un 5 humain sous la forme d'une solution ou d'une suspension liquide, de comprimés, de gélules, de poudres, de suppositoires, de capsules polymères ou de microvésicules, de liposomes, et d'une solution injectable ou infusible. Les voies d'administration incluent les voies entérale, parentérale, sous-cutanée, transdermique, intradermique, intramusculaire, 10 intraveineuse, rectale, orale et intra-nasale ainsi que l'inhalation et le patch. La quantité de substance active administrée à un animal ou à un humain est une quantité thérapeutiquement efficace, c'est-à-dire une quantité active, à des posologies et pendant des périodes de temps nécessaires pour obtenir l'effet thérapeutique désiré, tel que, par exemple, 15 l'inhibition significative de l'adhésion des leucocytes aux endothéliums vasculaires. La quantité thérapeutiquement efficace varie en fonction de facteurs tels que l'importance de la réaction inflammatoire, rage, le sexe ou le poids de l'animal ou de l'individu humain. Les régimes posologiques peuvent être ajustés de façon à obtenir un effet thérapeutique optimum. 20 Une quantité thérapeutiquement efficace est également une quantité pour laquelle les effets bénéfiques l'emportent sur un quelconque effet toxique ou néfaste de la ou des substance(s) active(s). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide chimérique ou d'une composition selon l'invention pour la 25 fabrication d'un médicament destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des lésions tissulaires de nature inflammatoire, que la réaction inflammatoire soit aigüe ou chronique. En particulier, le polypeptide chimérique ou la composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être utilisés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des 30 brûlures du deuxième et du troisième degré. 34 2909672 Le terme prophylaxie des lésions tissulaires de nature inflammatoire désigne tout degré de retardement dans le moment d'apparition de lésions tissulaires provoquées par la réaction inflammatoire, ainsi que tout degré d'inhibition de la sévérité de ces lésions tissulaires, y 5 compris, la prévention totale de lésions tissulaires. Ceci nécessite que l'inhibiteur ou la composition pharmaceutique selon l'invention soit administrée(e) à l'animal ou au patient avant l'apparition de toute lésion tissulaire de nature inflammatoire. Une telle adrninistration prophylactique sert à empêcher, améliorer, et/ou réduire la sévérité de n'importe quelle 10 lésion tissulaire résultant de la réaction inflammatoire. Le terme traitement signifie que le polypeptide chimérique ou la composition pharmaceutique selon l'invention est administré(e) à un animal ou à un humain à l'apparition ou après l'apparition de lésions tissulaires. Ce terme inclut toute réduction ou résorption des lésions tissulaires, obtenue 15 grâce au polypeptide chimérique ou à la composition selon l'invention, ainsi que l'amélioration de la condition de l'animal ou du patient. Le terme traitement couvre le ralentissement, l'interruption et l'arrêt de la migration des leucocytes au site d'inflammation, ainsi que l'arrêt de la propagation de l'inflammation et/ou des conséquences néfastes de 20 l'inflammation; un traitement n'exige pas nécessairement l'élimination complète de tous les signes ou symptômes de la réaction inflammatoire et en particulier de toutes les lésions tissulaires provoquées par la réaction inflammatoire. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un 25 polypeptide chimérique ou d'une composition selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des maladies auto-immunes telles que le psoriasis. Enfin, la présente invention a également pour objet un kit qui comprend un polynucléotide selon l'invention et le couple d'amorces L2F/R1 F. 30 D'autres caractéristiques et avantages de la présente l'invention apparaissent dans les exemples et les figures qui suivent. 2909672 DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1 : Séquence en acides aminés de la sous-unité CD11 b humaine (A) et de la sous-unité CD11 c humaine (B). Les acides aminés soulignés 5 dans la partie N-terminale chaque protéine constituent le peptide signal. VWA : Domaine A ; TM : domaine transmembranaire. Figure 2 : Alignement des séquences en acides aminés des domaines A du CD11 b humain (H), du rat (R) et de la souris (S). Les résidus impliqués dans la fixation des cations bivalents, qui forment le site MIDAS sont 10 indiqués par une flèche. Figure 3 : Représentation des vecteurs d'expression procaryotes pGEX-4T-1 (A) et pGEX-2T (B) utilisés pour transformer une souche de bactérie Escherichia coll. Figure 4 : Représentation du vecteur d'expression pPICZaB utilisé pour le 15 clonage chez Escherichia coli Top10F' et pour la transformation d'une souche de levure Pichia pastoris. Figure 5: Analyse de la phase soluble des sonicats de production du domaine A soluble chez Escherichia coli BL21 (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant à la construction 20 domaine A de la sous unité CD11 b humaine - GST. Figure 6 : Analyse de la phase soluble des éluas après purification sur colonne d'affinité Glutathione-Sépharose (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant à la construction domaine A de la sous unité CD11 b humaine - GST. 25 Figure 7 : Analyse du domaine A recombinant obtenu après digestion par la thrombine et purification sur colonne d'affinité Glutathione Sépharose (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant au domaine A de la sous unité CD11 b humaine. 36 2909672 Figure 8 : Analyse du produit d'extraction de l'ARN total à partir de polynucléaires de sang humain (électrophorèse en gel d'agarose). 1 : ARN à haut poids moléculaire (entre 7 kb et 15 kb) ; 2 : ARN ribosomal 28S et 18S (entre environ 5 kb et environ 2 kb); 3 : ARN transfert 5S (entre environ 5 0,1 kb à environ 0, 3kb) Figure 9 : Contrôle de la taille du domaine de type C de la L-sélectine humaine obtenu par RT-PCR (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant au domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine (411 pb). 10 Figure 10: Résultat du séquençage du fragment correspondant à la séquence de type C de la L-sélectine humaine. Figure 11 : Représentation du clonage dans le vecteur pGEX-4T de la séquence nucléotidique correspondant au domaine lectine de type C de la L-sélectine. 15 Figure 12 : Criblage par colonie PCR et électrophorèse en gel d'agarose des clones bactériens transformés; les clones positifs sont les clones contenant un plasmide pPl pGEX-4T contenant le domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine (domaine de 411 pb indiqué par une flèche). Figure 13 : Contrôle de la production de la protéine de fusion GST - 20 domaine lectine de type C (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant à la protéine de fusion GST - domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine. Figure 14: Analyse par électrophorèse en gel d'agarose (A) et par Western blot (B) de la protéine de fusion GST -domaine lectine de type C 25 purifiée. La flèche indique la bande correspondant à la protéine de fusion GST û domaine lectine-like. Figure 15: Représentation du principe d'assemblage polynucléotide 37 2909672 chimérique sélégrine par PCR (A) et analyse du produit de PCR d'assemblage par électrophorèse en gel d'agarose (B). Figure 16 : Résultat du séquençage du fragment correspondant au polynucléotide chimérique sélégrine. 5 Figure 17 : Représentation du clonage de la séquence correspondant au polynucléotide chimérique sélégrine dans le vecteur pPICZaB. Figure 18 : Criblage par colonie PCR et électrophorèse en gel d'agarose des clones bactériens Top10F' transformés avec le vecteur pPICZaB; les clones positifs sont les clones contenant un plasmide pPICZaB contenant 10 l'insert polynucléotidique chimérique (bande à 1055 pb). Figure 19 : Analyse de la taille des fragments obtenus après extraction de l'ADN plasmidique d'un clone positif puis digestion de l'ADN plasmidique extrait par Sacll et Notl (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant à la protéine chimérique sélectine-intégrine 15 (sélégrine) de séquence SEQ ID NO. 17. Figure 20 : Analyse du surnageant de culture obtenu après production du polypeptide chimérique Sélegrine dans Pichia pastoris (électrophorèse en gel d'agarose). La flèche indique la bande correspondant à la protéine de fusion GST - domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine. La 20 flèche indique la bande correspondant à la taille estimée de la chimère(43 kDa). Figure 21 : Analyse de la taille du polypeptide chimérique obtenu après purification sur colonne d'afinité His-Trap. La flèche indique la bande correspondant à la taille estimée de la chimère (43 kDa). 25 Figure 22 : Analyse par western Blot du polypeptide chimérique purifié (pistes 1 et 2) et non purifié (pistes 3 et 4). 38 2909672 Figure 23: Etude de la flexibilité du polypeptide chimérique. La flèche indique la région de haute flexibilité (position du Linker : résidus 139-153). Figure 24 : Essai de modélisation du polypeptide chimérique. La séquence protéique a été saisie dans le serveur 3D-PSSM. La Séquence protéique + 5 1 ido + 1 kjb a été saisie dans la base de donnée Swiss-model. Figure 25 : Représentation de la structure tridirnensionnelle obtenue par modélisation du polypeptide chimérique. Figure 26 : Analyse du résultat de la modélisation du polypeptide chimérique : diagramme de Ramachandran 39 2909672 EXEMPLES A. MATERIEL A-1. Souches de bactéries et de levure Les souches bactériennes d'Escherichia col/ utilisées sont les 5 souches commerciales suivantes: JM109 (Invitrogen), de phénotype F' (traD36 proAB+ laclQ /acZAM15) e14- (McrA-) recAl endAl gyrA96 thl-1 hsdR17(rK_ mK+) supE44 relAl A(lac-proAB); - BL21 (Invitrogen), de phénotype E.coll B F-dcm ompT hsdS (rB_ 10 MB_) gal; et Top10F' (Invitrogen), de phénotype F' [laclQ Tn10(TetR)] mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) 480/acZAM15 AlacX74 deoR recAl araD139 A(ara-leu)7697 galU galK rspL. (StrR) endAl nupG2^.. La souche de la levure Pichia pastoris utilisée est la souche 15 commerciale KM71 H (Invitrogen) telle que définie ci-dessus. Elle a pour phénotype arg4 aoxl:ARG4 et pour génotype Muts, Arg+. Elle est fournie par Invitrogen et utilisée sous licence. A-2. Vecteurs de clonage et d'expression 20 Les vecteurs utilisés sont : - pGEX-4T1 et pGEX-2T, pour le clonage et l'expression chez Escherichia col/ J M 109 et Escherichia col/ B L21 -pPICZaB pour le clonage chez Escherichia colt Top10F' et pour l'expression chez Pichia pastoris KM7H. 25 pGEX-4T-1 et pGEX-2T (figure 3) : Comme tous les vecteurs classiques d'expression dans Escherichia col/, pGEX-4T-1 et pGEX-2T contiennent tous les éléments indispensables à la multiplication et au contrôle de l'expression des gènes (voir figure 3), à savoir : 2909672 - une origine de réplication : la réplication du plasmide dans E.coli, comme tout élément extra chromosomique indépendant, est contrôlée par son origine de réplication (ori), qui provient de pBR322; un marqueur de sélection : il est représenté ici par le gène de 5 résistance à l'ampicilline Ampr; ce marqueur code pour une 13-lactamase qui confère la résistance à l'ampicilline et aux autres antibiotiques f3-lactame; - un promoteur, un opérateur et un répresseur de transcription, qui sont des éléments essentiels des vecteurs d'expression; ils constituent les 10 sites de fixation de l'ARN polymérase et des protéines régulatrices de la transcription; le promoteur tac est contrôlé par la fixation du répresseur lac (produit du gène lacl) à la séquence de l'opérateur dans la région du promoteur et est induit par addition d'Isopropyl-R-D-thiogalactopyranoside (IPTG), un analogue du lactose non métabolisable qui se fixe sur le 15 répresseur lac et empêche sa fixation sur l'opérateur; - un signal de terminaison de traduction, qui est représenté par plusieurs codons stop dans les trois cadres de lecture. Ce type de vecteur d'expression procaryote permet de cloner l'ADN en aval du gène codant pour la Gluthatione-S-Tranférase (GST) afin de 20 produire une protéine de fusion constituée de la protéine à exprimer et de la GST, séparées par une séquence d'acides aminés constituant le site de coupure de la thrombine. La présence de la GST à un double intérêt : elle protége la protéine d'intérêt de la protéolyse et facilite le repérage et la purification de ladite protéine. 25 pPICZaB (figure 4) est tel que décrit ci-dessus. A-3. Kits - Kit de purification d'ADN à partir de gel d'agarose : QIAEX II Gel Extraction Kit cat N 20051 (QIAGEN); 30 - Kit de purification d'ADN plasmidique (mini préparation de plasmides) : QlAprep Spin Miniprep Kit cat N 27104 (Qiagen); 41 2909672 - Kit de purification de la GST : (Glutathione-Sepharose-Transferase) Redipack GST Purification Module. 27-4570-02 (Pharmacia Biotech); - ECL: (Enhanced ChimioLuminiscence) Western Blotting 5 Protocols (Amersham Life Science) - Réf. : RPN2108. A-4. Marqueurs de poids moléculaire - RPN 756 (Amersham) - RPN 800 (Amersham) 10 A-5. Tampons et milieux de culture - PBS (Phosphate buffered saline) : 1.4M NaCl, 27mM KCI, 101 mM Na2HPO4, KH2PO4 (pH7.3) - RPMI 15 -TE : Tris EDTA : 10mM Tris HCI (pH 8), 1 mM EDTA (pH8). - TBE 5X (Tris Borate EDTA) : 0.045mM Tris Borate, 0.001M EDTA. TAE 1X (Tris Acetate EDTA) : 0.04M Tris Acetate, 0.001 M EDTA - LB (Luria Bertani Medium) : milieu de culture riche pour bactérie, 20 ayant pour composition 10g de Bactotryptone, 5g d'extrait de levure, 10g de NaCl. Le milieu est stérilisé par autoclavage 20 min à 121 C à une pression de 1.5 Bar. A-6. Amorces de PCR : 25 - Le couple d'amorces L1 F/L1 R est utilisé pour amplifier par PCR et cloner le domaine lectine de type C dans le plasmide pGEX-4T-1 entre les sites de restriction EcoRl et Xhol. - Le couple d'amorces Al F/R1 F est utilisé pour l'amplification par PCR du domaine-A humain; l'amorce R1 F contient la séquence du site de 30 restriction Not1. - Le couple d'amorces L2F/R1F est utilisé pour la PCR 42 2909672 d'assemblage, ainsi que pour les PCR de clonage de la construction chimérique entre les sites de restriction Sacll et Notl dans le plasmide pPICZaB. - Le couple d'amorces AOX1 F/AOXI R est utilisé pour la colonie 5 PCR de la chimère dans pPICZaB. Ce couple génère une séquence de 592pb dans pPICZaB vide. - Le couple d'amorces LINKF/LINKR code pour le linker 3(GGGGS), qui flanque le domaine A et le domaine lectine de type C dans le polynucleotide chimérique. 10 Les amorces utilisées pour réaliser la PCR d'assemblage mise au point par les inventeurs sont plus longues que lesamorces de 18 ou 20 mer utilisées dans le cas des techniques de PCR classiques. Ainsi, la séquence de l'amorce LINKF est la suivante : 15 CTAAAGGCAGCCCTCTGTTACACAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGG TGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTGTCCTCAAGAGGATAGTGACATT. B. METHODES 20 B-1. Extraction de l'ARN total des neutrophiles B-1 a. Purification des polynucléaires (technique du PLASMAGEL) On a récupéré 20 ml de sang frais humain dans un tube hépariné. On a centrifugé 10 min à 1600 tours par minutes et à température ambiante; on a ajouté au culot 2 volumes de RPMI à 37 C et 3 volumes de 25 PLASMAGEL et on a incubé à 37 C pendant 1 à 2 heures. On a observé alors la formation de deux phases, une phase inférieure formée par les hématies et une phase supérieure formée par les leucocytes, cette dernière phase étant récupérée. On a ajouté 40 ml de PBS à 0,01 M et on a centrifugé 7 à 10 minutes à 1200 tours par minute à température ambiante. 30 Le culot a ensuite été récupéré dans 1,5 ml de tampon de lyse et incubé à 43 2909672 température ambiante 8 à 10 minutes selon la concentration en hématies. On a alors ajouté 15 ml de PBS et on a centrifugé 7 minutes à 1200 tours par minute à température ambiante. On a ensuite fait 2 rinçages successifs avec 10 ml de PBS (1200 tours par minute pendant 7 minutes à 5 température ambiante) et pendant le second lavage, on a effectué un comptage des hématies sur un hémocytomètre. B-1 b. Purification de l'ARN total L'extraction de l'ARN total a été réalisée en utilisant du Trizol, un 10 réactif permettant d'isoler, en une seule étape, l'ARN total à partir de cellules ou de tissus. Le Trizol est un mélange monophasique de phénol et d'isothiocyanate de guanidine (Chomezynski et Sacchi, 1987). Il permet de garder l'intégralité de l'ARN tout en dissolvant les autres composantes cellulaires. 15 L'ajout de Chloroforme permet de séparer., après centrifugation, une phase aqueuse d'une phase organique. La phase aqueuse est récupérée et l'ARN est précipité à l'isopropanol. Les cellules récupérées ont été centrifugées 10 minutes à 1200 tours par minute à température ambiante. Le culot a ensuite été rincé 2 fois 20 au PBS à température ambiante. Le Trizol a été rajouté à raison de 500p1 pour 5 à 10 millions de cellules. On a homogénéisé pendant quelques secondes, puis on a incubé 5 minutes dans la glace pour permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques. On a ajouté alors 200pl de chloroforme pour 1 ml de Trizol puis, à nouveau, on a 25 homogénéisé pendant 30 secondes et on a incubé 5 min dans la glace. Après centrifugation pendant 30 minutes à 13 000 tours par minute à 4 C, on a observé la formation de 3 phases : - une phase phénol-chloroforme inférieure rose, qui contient les protéines cellulaires; 30 - une interphase, où se concentre l'ADN génomique; une phase supérieure aqueuse, qui contient l'ARN. 44 2909672 La phase supérieure aqueuse a été récupérée dans un tube puis on a ajouté un volume équivalent d'isopropanol pour précipiter l'ARN et on a incubé pendant une nuit à -80 C. On a centrifugé le mélange pendant 30 min à 13 000 tours par minute à 4 C puis on a rincé le culot 2 fois de suite 5 avec 500pl d'éthanol 70%, et on a centrifugé pendant 10 min à 13 000 tours par minute à 4 C. Le culot a ensuite été séché complètement et on s'est assuré qu'il ne restait aucune trace de compartiments protéiques et d'ADN génomique, ce qui pourrait affecter la qualité de l'ARN extrait. Le culot d'ARN total a été resuspendu dans un minimum d'eau-DEPC (eau 10 traitée au diétylpyrocarbonate). Cette technique a permis d'isoler 3 principales formes d'ARN dans la phase aqueuse précipitée à l'isopropanol : - un ARN de haut poids moléculaire : 7 à 15kb; - des ARN ribosomaux : ARN 28S (environ 5kb) et ARN 18S 15 (environ 2kb); - un ARN de faible poids moléculaire : 0,1 à 0,3kb (tRNA, 5S). B-2. RT-PCR et PCR II s'agissait de faire une synthèse d'ADN complémentaire (cDNA) à 20 partir d'ARN en utilisant une transcriptase réverse. Deux kits de RT-PCR ont été utilisés, le kit de la société Stratagene et le kit de la société Promega (I'ARN étant répartis dans 4 tubes numérotés 1-4 dans le tableau ci-dessous) : 2909672 Kit Stratagene Kit Promega Vf 25Ni Vf 20111 (eau-DEPC) (eau-DEPC) 1 2 3 ---- 4 -10pl ARN (5-10ng) -10 pI ARN (5-10ng) -10p1 ARN (5- -10 pl ARN (5- -3pI Random -1,5p1 Random 10ng) 10ng) Primers(lOmM) Primers(lOmM) -1,5p1 Oligo (dT) -1,5pI Reverse (10mM) L1 R (20mM) lectine 5 minutes à 65 C et 10 minutes à température ambiante - 2,5 pI Tp 10X First - 5 pI Tp 5X Strand Buffer - 1 pI RNasin(40U/pI) - 1 pl Rnase (40U/pl) - 2p1 dNTP (25mM) - l pl dNTP (25mM) - 4p1 AMV (50U/pI) - l pl StrataScript (50U/p1) transcriptase réverse 1 heure à 42 C et 10 minutes à 8 C La transcription réverse a été suivie d'une PCR pour amplifier le 5 fragment spécifique recherché; les conditions de la PCR étaient les mêmes pour les tubes 1 à 4 : - cDNA (produit de la RT-PCR) (50ng) : 10p1 Tampon 10X : 5p1 dNTP (25mM) : l pl 10 - L1 F (20 pM) : l pl LI R (20 pM) : 1 pl - Taq Polymerase (5 U/pl) : 1 pl - H20 : Vf 50pl 46 2909672 Les cycles d'amplification étaient : 30 cycles : - 1 minute à 94 C - 1 minute à 57 C - 1 minute 30 secondes à 72 C 5 Pour améliorer la qualité du produit de la RT-PCR, on a effectué une seconde PCR à partir des produits d'amplification de chaque tube de la première PCR, dans les conditions suivantes : Produit PCR (non purifié) : 5 pl Tampon 10X : 5p1 10 - dNTP (25mM) : 5pl - Amorce sens (20 NM) : l pl - Amorce antisens (20 pM) : l pl - Taq Polymerase (5 U/pl) : l pl Les cycles d'amplification étaient les suivants: 15 - 2 minutes à 94 C cycles : 1 minute à 94 C - 1 minute à 55 C - 1 minute à 72 C - 7 minute à 72 C. 20 Colonie PCR : c'est une PCR qui s'effectue directement sur une colonie de bactéries ou de levures, permettant un criblage rapide et fiable des clones transformés; Colonie PCR sur clone bactérien : une colonie de bactéries a été 25 resuspendue directement dans le mélange de PCR; on a chauffé à 95 C pendant 5 minutes puis on a effectué une PCR classique. - Colonie PCR sur clone de levure : une colonie de levures a été resuspendue dans 5p1 d'une solution de lyticase 5U/pl, incubée à 30 C pendant 10 à 20 minutes puis à -80 C pendant 10 minutes; la lyticase a 30 permis de dégrader la paroi épaisse de la levure et de libérer l'ADN 47 2909672 génomique; on a réalisé alors une PCR sur le produit de lyse. PCR d'assemblage : Le mélange réactionnel contenait : 5 - Domaine A de von de Willebrand de la CD11 b humaine: 40ng. - Domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine : 27,5ng. Ces deux domaines ont été clonés par RT-PCR, à partir d'ARN extrait de leucocytes humains. - Couple d'amorces LLINKF/LINKR : 16 ng de chaque amorce 1MgCl2 : 4mM Tampon 10X : 1X final dNTP : 1.25mM Taq polymerase : 0.2U H2O : Vf 50pl Les cycles d'amplification étaient les suivants : 7 cycles : 1 minute à 94 C 4 minutes à 63 C 30 cycles : l minute à 94 C 1 minute à 55 C 1 minute à 72 C 1 cycle : 7 minutes à 72 C B-3. Electrophorèse sur gel d'agarose 25 Le profil électrophorétique des produits a été analysé par électrophorèse sur un gel d'agarose 0,7-1,5%, TETE 1X. Les échantillons ont été contrôlés sur gel après avoir été mélangés à un tampon d'échantillon (50% glycérol, 10 mM EDTA et bleu de bromophénol à 1%) à une dilution finale de 1/6. ' N'ajoute t-on pas aussi les amorces L2F/R1F indiquée au point A-6 ? 10 15 20 48 2909672 B-4. Purification des fragments à partir du gel d'agarose Le kit Qiagen permet de purifier, à partir d'un gel d'agarose, des fragments d'ADN qui seront utilisés pour le clonage ou le séquençage. 5 La purification a été faite sur une colonne Tip-20 (colonne de silice chargée positivement) en utilisant les réactifs du kit. L'élution s'est faite avec 50p1 de tris-HCI pH 8 ou avec 50pl d'eau bidistillée. On a alors contrôlé la purification des produits obtenus par 10 électrophorèse sur gel d'agarose. B-5. Ligation pour constituer le vecteur de clonage On a utilisé la T4 ADN ligase, qui catalyse la formation d'une liaison phospho-diester entre deux fragments d'ADN, l'un engagé par son 15 extrémité 3'-OH libre, et l'autre par son extrémité 5'-phosphate, en présence d'ATP. Le mélange réactionnel était le suivant : - ADN plasmidique, coupé par les enzymes de restriction appropriées et purifié 20 - insert à cloner dans le plasmide, coupé par les enzymes de restriction appropriées et purifié - tampon de la T4 ADN ligase, dilué à 1/10 (dilution finale) - Ligase (5 U/pl) (1 UI de T4 DNA ligase permet de lier 1 pg d'ADN) La réaction de ligation a été réalisée à 16 C pendant une nuit. 25 B-6. Préparation de cellules compétentes Le plasmide à amplifier a été introduit dans une souche de bactéries JM109 sensibles aux antibiotiques (bactéries compétentes d'Escherichia coli; Proméga). C'est une souche Rec Al et End Al, c'est à dire mutante 30 pour les gènes de la recombinase et de l'endonucléase (avec lesquels les souches seront transformées), qui permet d'avoir un très faible risque de 49 2909672 recombinaison ou une dégradation endonucléasique de l'ADN plasmidique. La souche BL21 a été utilisée pour assurer l'expression des protéines recombinantes produites chez E. coll. Plusieurs méthodes de préparation de cellules compétentes ont été 5 utilisées pour transformer ces souches bactériennes : B-6a. Méthode du CaCl2 (Maniatis, 1982) On a utilisé des stocks de souches d'Escherichia col/ JM109 conservées à -20 C dans du milieu LB à 15% de glycérol; une boîte de milieu LB contenant 1,5% d'agar a été ensemencée puis incubée à 37 C 10 pendant la nuit. Une colonie isolée a ensuite été repiquée dans un tube stérile contenant 5 ml de milieu LB et incubée à 37 C pendant la nuit, sous agitation à 220 tours par minute. Un millilitre de cette culture saturée a alors été transféré dans un flacon stérile de 500 ml contenant 100 ml de milieu LB. Les cellules ont été incubées à 37 C et sous agitation à 220 tours par 15 minute, jusqu'à obtention d'une DO600nrn de 0,36 unités. Le flacon a alors été incubé sur la glace pendant 10 minutes. Les cellules ont ensuite été centrifugées à 1200g pendant 5 minutes à 4 C. Le culot a été resuspendu dans 10 ml d'une solution stérile de CaCl2 50 mM puis on a complété à 25 ml et on a incubé sur la glace pendant 20 minutes. Les cellules ont à 20 nouveau été centrifugées à 1200g pendant 5 minutes à 4 C. Le culot a alors été resuspendu dans 3,3 ml de CaCl2 50 mM et incubé à 4 C pendant la nuit. Les cellules ont été réparties dans des tubes à raison de 200pl par tube, puis immédiatement plongées dans l'azote liquide et conservées à - 80 C. 25 B-6b. Méthode du tampon TSS ("Transformation and Storaqe Solution") Les bactéries ont été ensemencées sur un milieu LB contenant 1,5% d'agar et incubées à 37 C pendant la nuit. Une colonie isolée a ensuite été resuspendue stérilement dans 5 ml de milieu LB et mise en culture à 37 C 30 pendant la nuit, sous agitation à 220 tours par minute. Un ml de cette 2909672 culture a été transféré dans un flacon de 500 ml stérile contenant 100 ml de milieu LB. Les cellules ont été incubées à 37 C sous agitation à 220 tours par minute jusqu'à ce que la DO600nm atteigne 0,5 unités. Le flacon a alors été incubé sur la glace pendant 10 minutes. Les cellules ont ensuite 5 été centrifugées 5 minutes à 1200g à 4 C. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 10 ml de solution TSS froide (voir ci-dessous), puis réparti dans des tubes à raison de 200p1 par tube. Les bactéries ainsi transformées peuvent être conservées à -80 C pendant un mois. Tampon TSS : LB 0.17 g PolyEthylène Glycol (PEG) 1 g MgCl2 1 M 0.5 ml - H2O 9.5 ml Cette solution est stérilisée par autoclavage (20 minutes à 121 C 15 sous une pression de 1.5 bar). Après refroidissement de la solution, on ajoute stérilement 0.5 ml de diméthyl sulfo-oxyde (DMSO). B-7. Transformation des bactéries Les cellules compétentes ont été incubées avec 10ng d'ADN 20 plasmidique sur la glace pendant 30 minutes puis dans un bain-marie à 42 C pendant 1 minute (choc thermique) puis à nouveau sur la glace. On a ajouté 800p1 de milieu LB et on a incubé pendant 45 à 60 minutes à 37 C (pour permettre l'expression du gène de résistance à l'ampicilline codant pour la R lactamase). 100p1 ont ensuite été étalés sur milieu LB contenant 25 1,5 % d'agar + 100pg/ml d'ampicilline et on a incubé à 37 C pendant la nuit. Test de compétence : on compte le nombre (n) de colonies par boite de Pétri; le degré de compétence (DC), qui représente le nombre de bactéries transformées par pg d'ADN plasmidique est calculé de la manière 30 suivante : 10 51 2909672 n .1ml DC = • = n.103 100pI . 10-2 pg d'ADN utilisé Les bactéries sont considérées comme étant compétentes, si le 5 degré de compétence est supérieur à 105. B-8. Préparation du plasmide d'intérêt B-8a. Préculture bactérienne Il est de bon usage bactériologique de partir d'un stock de bactéries 10 congelées; on a ensemencé une boîte de milieu LB contenant 15% d'agar et de l'ampicilline à 100pg par ml avec des bactéries transformées de manière à obtenir des colonies isolées. Après 16 heures d'incubation dans une étuve à 37 C, on a réalisé une préculture de 5 ml de milieu LB à 100pg par ml d'ampicilline à partir d'une colonie isolée sur la boîte. 50 ml du milieu 15 LB liquide ont ensuite été ensemencés avec la préculture et incubés pendant 16h à 37 C sous agitation. B-8b. Extraction de l'ADN plasmidique Deux kits d'extractions d'ADN plasmidique de chez Qiagen ont été utilisés : le kit miniprep et le kit midiprep. La technique d'extraction est 20 fondée sur la lyse alcaline des cellules bactériennes. Le kit midiprep permet d'extraire une quantité plus importante de plasmide que le kit miniprep. B-8c. Quantification de l'ADN extrait Le dosage de l'ADN a été effectué par spectrophotométrie UV à 260 nm. On a utilisé la relation selon laquelle une unité de densité optique 25 correspond à une solution d'ADN de concentration égale à 50pg/ml. La pureté de l'ADN a été estimée par une lecture à 280 nm, le rapport DO260/280 devant être compris entre 1,6 et 2. B-9. Séquençage automatique des clones positifs 30 Le séquençage automatique des clones se fait soit à partir d'une 52 2909672 amorce de séquençage des plasmides, soit à partir d'une amorce spécifique de la séquence clonée et par un séquenceur automatique, ABI PRISMTM sequencer, de chez PERKIN ELMER Applied Systems. 5 B-10. Production et purification d'une protéine recombinante chez Escherichia coli Une colonie fraîche de bactéries d'Escherichia coli contenant la construction d'intérêt a été inoculée avec 5ml de milieu LB-ampicilline et les bactéries ont été incubées pendant la nuit à 37 C sous agitation. La 10 préculture a ensuite été diluée en la partageant sur deux erlens de 2 litres contenant chacun 50 ml de LB-ampicilline, puis incubée sous agitation vigoureuse à 37 C jusqu'à ce qu'on obtienne une DO600nm de 0,5. On a alors ajouté de l'IPTG 100mM dans chaque erlen de façon à obtenir une concentration finale de 0,lmM. Après une incubation à 30 C pendant 5 à 8 15 heures, les bactéries ont été récupérées par centrifugation à 3500 tours par minute pendant 15 minutes à 4 C. Chaque culot bactérien provenant de la centrifugation de 100mI de culture a été resuspendu dans 5 ml de PBS 0,01M froid. Les cellules ont ensuite été lysées par sonication. Celle-ci a été réalisée sur la glace, par des impulsions de courte durée séparées par 20 une homogénéisation. On a ajouté ensuite dans chaque tube du triton 20% de façon à obtenir une concentration finale de 19/o. Après une incubation à 4 C sous agitation faible, les lysats obtenus ont été centrifugés à 13000 tours par minute pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant a alors été transféré dans un autre tube et les fractions solubles et insolubles ont été 25 conservées à -80 C. Les surnageants ont été purifiés sur une colonne d'affinité Glutathione-Sépharose, selon la technique classiquement utilisée pour purifier les protéines de fusion exprimant la GST. B-11. Western Blot 30 B-11 a. Electrophorèse des protéines sur qel de polyacrylamide en présence de SDS : SDS-PAGE ("SDS-Polyacrylarnid Gel Electrophoresis") 53 2909672 Pour un gel de migration, on prévoit 15ml de gel de séparation et 5ml de gel de concentration. Gel de séparation : - Solution stock de 30% Acrylamide -0,8% Bisacrylamide 7,5 ml - Tris HCI / SDS 4X pH 8,8 4 ml H2O bidistillée 3,24 ml - SDS 0,150 ml - Persulfate d'Ammonium 10% 0,150 ml -TEMED 0,015 ml Gel de concentration : - Solution stock de 30% Acrylamide - 0,8% Bisacrylamide 0,65 ml - Tris HCI / SDS 4X pH 6,8 1,25 ml - H2O bidistillée 3 ml - SDS 0,100 ml - Persulfate d'Ammonium 10% 0,07 ml - TEMED 0,007 ml 15 20 Après avoir monté les plaques sur le support de polymérisation, on a coulé 5ml de gel de séparation (jusqu'au premier écran du support). On a ajouté de l'eau au dessus du gel pour aplanir la surface du gel et éviter que le gel ne se dessèche. Après polymérisation du premier gel, on a éliminé 25 l'eau avec du papier filtre et on a coulé le gel de concentration au dessus du gel de séparation. On ajoute le peigne permettant de former des puits dans le gel de concentration, ainsi que de l'eau au dessus du gel et on a laissé le gel polymériser. Après polymérisation, on a placé le montage sur le support de 30 migration et on a posé l'ensemble dans la cuve vide (sans tampon). On a 54 2909672 coulé ensuite le tampon de migration 1X. Enfin, on a déposé dans les puits les échantillons préalablement additionnés de 1/3 de tampon d'échantillon 3X et dénaturés 5 minutes à 100 C. On a déposé également le marqueur de taille RainBow (3pl). On a 5 fait migrer le gel pendant environ 45 minutes sous un voltage de 200V. Après la migration, les protéines, qui ont été séparées en fonction de leur poids moléculaire, étaient soit colorées avec du bleu de Coomassie, soit transférées sur membrane de nitrocellulose (technique d'immunotransfert). 10 B-12b. Immunotransfert ("immunoblot") et révélation par ECL ("Enhanced ChemiLuminescence") Après séparation des protéines sur gel par SDS-PAGE, le gel obtenu a été mis en contact avec une feuille de Nitrocellulose et entre 4 feuilles de 15 papier Wattman imbibées avec une solution de transfert 1X (1,89g de TRIS HCI, 9g de Glycine, 20% de méthanol, 0,1% de SDS, Vf : 1litre), de façon à ce que les protéines puissent être transférées du gel à la membrane de nitrocellulose. Le transfert s'est fait pendant 1 heure à 100mA. La membrane de nitrocellulose a ensuite été saturée avec une 20 solution de blocage (PBS 1X, 5% de lait écrémé, 0.2% de Tween 20) pendant une nuit et à 4 C. La membrane a alors lavée sous agitation dans du tampon PBS 1X, 1% de Tween20. On a incubé la membrane avec l'anticorps approprié (couplé à l'HRP, ("horseradish peroxidase")) pendant 1 à 16 heures, selon la 25 sensibilité de l'anticorps utilisé. L'anticorps utilisé est soit l'anticorps monoclonal 107 de chez Pharmingen (Rui et al., 2002), qui est dirigé contre le domaine A de la sous-unité CD11, soit l'anticorps anti CD62L de chez Pharmingen. On a effectué ensuite des lavages pour éliminer l'excès d'anticorps. 30 Enfin, on a révélé l'immunomarquage par autoradiographie en utilisant le kit ECL d'Amersham; le système western Blot ECL (AMERSHAM) est une 2909672 méthode non radioactive d'émission de lumière, qui permet la détection d'antigènes spécifiques immobilisés, conjugués directement ou indirectement à des anticorps qui sont couplés à I'HRP. Ce système permet une détection rapide, de moins de lpg d'antigènes et est de ce fait 10 fois 5 plus sensible que les autres systèmes de détection radioactifs. La membrane de nitrocellulose a été incubée dans la solution d'ECL pendant 1 minute. L'excès de produit a été éliminé. La membrane de nitrocellulose a été protégée avec du film Saran , placée dans une casette possédant des écrans amplificateurs du signal et mise en contact avec un film ECL qui a 10 ensuite été récupéré pour la révélation. B-13. Electroporation de la levure Pichia pastoris L'électroporation a permis d'internaliser le vecteur de clonage propre à Pichia dans cellules de levures. Une fois dans la cellule, ce vecteur 15 s'intègre dans le génome de la levure par une recombinaison dirigée par le promoteur de l'alcool oxydase (AOX1). On a réalisé une préculture dans 5 ml de BMGY (Buffered complex medium containig glycerol), pendant une nuit à 37 C et à 250 tours par minute, cette préculture devant servir d'inoculum pour une culture de 100 20 ml de BMGY arrêté vers une DO600nm comprise entre 2 et 6. Le culot de la culture a été récupéré après centrifugation à 3500 tours par minute pendant 5min, et lavé avec 2x50 ml d'eau distillée stérile froide. On a resuspendu de nouveau le culot dans 4 ml de sorbitol 1M. On a centrifugé et lavé le culot avec 2x 250 pl de Sorbitol 1M. 25 B-14. Production de protéine recombinante chimère chez Pichia pastoris : Une préculture a été réalisée dans un volume de 5ml de BMGY (Buffered complex medium containig glycerol), qui contenait 1% d'extrait de 30 levure, 2% de pepetone, 100mM de phosphate de potatium pH6, 1.34% de Yeast Nitrogen Base (YNB) et 1% de glycérol. La préculture a ensuite été 56 2909672 transférée dans un volume de 50 ml jusqu'à ce qu'on obtienne une DO à 600nm comprise entre 2 et 6. La biomasse a été récupérée après centrifugation dans 5ml de milieu BMMY (Buffered Methanol û complex Medium; même composition 5 que le BMGY mais on remplace le glycérol par 1 ou 2% de méthanol) et on a maintenu une induction avec 1 ou 2% de méthanol pendant 72 h (une induction toutes les 24 heures). Les cellules ont ensuite été lysées par sonication comme décrit ci-dessus. 10 C. RESULTATS Avant de produire la Sélégrine dans la levure Pichia pastoris (partie C-3), le domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine (partie C-1) et le 15 domaine lectine-like de la L-sélectine humaine (partie C-2) ont été clonés, exprimés chez Escherichia coli puis purifiés. Ceci a permis de vérifier que chacune des séquences clonées permet de produire le domaine souhaité. C-1. Production et purification d'une forme recombinante soluble du 20 domaine A de la sous-unité a CD11b humaine Le domaine A de la sous-unité a CD11b humaine (SEQ ID NO. 6) a été cloné dans le vecteur de clonage et d'expression procaryote pGEX-2T. Des bactéries Escherichia coli compétentes de la souche BL21 ont ensuite été transformées avec le plasmide pGEX-2T contenant le domaine A de la 25 CD11 b humaine. Les clones obtenus ont ensuite été criblés par colonie PCR afin d'identifier des clones positifs (des clones ayant effectivement intégré le vecteur). Une protéine de fusion entre la GST et le domaine A de la CD11 b humaine a été produite à partir d'un clone positif et la phase soluble des 30 sonicats obtenus et a alors été analysée par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 5); la masse théorique du polynucléotide recombinant 57 2909672 soluble GST-domaine A est d'environ 52 kDa (29kDa pour la GST + 23 kDa pour le domaine A). Le polynucléotide soluble de 52 kDa a été purifié sur colonne d'affinité Glutathione-Sépharose. A l'issu de la purification, la phase soluble des éluas obtenus a été analysée par électrophorèse sur gel 5 d'agarose (figure 6). Après une digestion par la Thrombine, suivie d'une purification sur colonne d'affinité Glutathione-Sépharose, le polypeptide recombinant a été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 7). Une bande unique a été obtenue à approximativement 23 kDa. Cette bande correspond au domaine A recombinant soluble de la sous-unité a 10 CD11 b humaine. Ce domaine soluble purifié a été caractérisé au sein du laboratoire par des tests fonctionnels, en particulier par un test d'adhésion en phase solide, ainsi que par Western blot. C-2. Clonage, production et purification d'une forme recombinante 15 soluble du domaine lectine-like de la L-sélectine humaine Des polynucléaires ont été isolés à partir de sang total par la technique du PLASMAGEL. L'ARN total des polynucléaires isolés a ensuite été extrait et analysé par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 8). Le domaine lectine de type C de la L-sélectine (SEQ ID NO. 2) a 20 ensuite été amplifié par RT-PCR et PCR en utilisant le couple d'amorces L1 F/L1 R. L'analyse du produit d'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose a montré une bande unique d'ADN de 411 pb (voir figure 9), qui correspond au domaine lectine de type C de la L-sélectine. Ce fragment a ensuite été séquencé (voir figure 10) puis cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 25 (figure 11). Des bactéries Escherichia coli de la souche Souche BL21 ont ensuite été transformées avec le plasmide pGEX-4T-1. Les clones positifs ont été identifiés par colonie PCR et électrophorèse sur gel d'agarose; le domaine lectine de type C de la L sélectine correspond à une bande 30 d'environ 411 pb (voir figure 12). La protéine de fusion GST-domaine lectine de type C a été produite 58 2909672 à partir d'un des clones positifs. L'analyse de la phase soluble des sonicats par électrophorèse sur gel d'agarose révèle une bande à environ 43 kDa, qui correspond à la taille de la protéine de fusion attendue. La protéine de fusion a alors été purifiée sur colonne d'affinité Glutathione-Sépharose. 5 La protéine purifiée a été analysée par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 14A), puis par Western Blot (figure 14B). Dans les deux cas, on obtenait une bande d'environ 43 kDa. C-3. Construction, production et purification de la chimère domaine 10 lectine de type C (L-sélectine) - domaine A (CD11 b humaine) C-3-a. Construction de la chimère par ingénierie génétique Le domaine A de la sous-unité CD11 b humaine (582 pb) et le domaine lectine de type C de la L-sélectine (411 pb) ont été clonés par RTPCR, à partir d'ARN extrait de leucocytes humains. 15 Une forme recombinante chimère du domaine lectine de type C de la L-sélectine et du domaine A de la sous-unité CD11 b de l'intégrine CD11 b/CD18 humaine a été produite la technique de PCR d'assemblage en associant le domaine lectine de type C et le domaine A par l'intermédiaire d'un peptide de liaison flexible 3(GGGGS), comme 20 représenté en figure 15A. La construction chimérique sélectine-intégrine obtenue à l'issu de la PCR, qui correspond à un polynucléotide de 1055 pb, a été analysée par électrophorèse sur gel d'agarose (figure 15B), puis séquencée (voir figure 16). La construction chimérique sélectine-intégrine (sélégrine) a été 25 clonée dans le vecteur pPICZaB (voir figure 17). Des bactéries d'Escherichia coli Top 10F' ont ensuite été transformées avec le plasmide pPICZaB contenant la construction pPICZaB-sélégrine. Les clones Top 10F' ont ensuite été amplifiés par colonie PCR, puis analysés par électrophorèse sur gel d'agarose de façon 30 à identifier les clones positifs, à savoir les clones présentant un fragment d'environ 1055 pb (voir figure 18). Une préparation de plasmide a ensuite 59 2909672 été réalisée à partir d'un clone d'ADN positif. L'ADN plasmidique extrait a alors été analysé par électrophorèse sur gel d'agarose après digestion par Sacll et Notl (figure 19), de façon à vérifier la présence d'une bande à 1055pb. 5 C-3-b. Expression de la séleqrine dans le système d'expression eucaryote Pichia pastoris Après linéarisation de l'ADN plasmidique par BstXI, la souche de levure Pichia pastoris KM71H a été transformée avec l'ADN plasmidique 10 par électroporation. Les clones transformés ont été cribblés par colonie-PCR et électrophorèse sur gel d'agarose. Un clone positif a été utilisé pour produire la protéine chimère Sélectine-Intégrine sous formed'une protéine de fusion Sélectine-Intégrineépitope myc-(Histidine)6. L'analyse du surnageant de culture obtenu par 15 électrophorèse sur gel d'agarose a révélé une bande correspondant à la taille théorique de la chimère : 43 kDa (figure 20). La chimère a ensuite été purifiée sur colonne His-Trap. La taille de la chimère a ensuite été contrôlée sur gel (figure 21). 20 C-4. Caractérisation structurale et physico-chimique de la sélegrine C-4a. Caractérisation structurale Un western Blot à été réalisé à partir la protéine chimère purifiée (figure 22, pistes 1 et 2) et non purifiée (figure 22, pistes 3 et 4). Cette analyse a révélé que la chimère est reconnue par l'anticorps 25 monoclonal 107 (Pharmingen) dirigé contre le site MIDAS du domaine A, c'est-à-dire dirigé contre le site actif du domaine A (l'anticorps mime le ligand). Ainsi, le site MIDAS reste intact et dégagé. Ceci démontre que dans la protéine chimère, le domaine A conserve son intégrité structurale et par conséquent sa fonction et suggère que le domaine lectine de type C 30 reste lui aussi fonctionnel. 2909672 C-4b. Caractérisation physico-chimique de la séleqrine par prédiction de la protéine chimère produite Poids moléculaire théorique : 39,5037 kDa Point isoélectrique théorique : 8.29 5 Index théorique d'instabilité : 36,3 on leucocyte. Annu. Rev. Immunol; 8: 365-400. 64 2909672 Hernandez LA, Grisham MB, Twohig B, Arfors KE, Harlan JM, Granger DN. (1987). 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Polypeptide chimérique appelé "sélégrine", caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en : au moins une entité (i) constituée par au moins un domaine lectine de type C d'une sélectine et/ou au moins une portion du domaine lectine de type C d'une sélectine, ce domaine ou cette portion de domaine permettant de fixer les ligands de ladite sélectine de façon calcium-dépendante, et au moins une entité (ii) constituée par au moins un domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine et/ou au moins une portion du domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine, ce domaine et/ou cette portion de domaine, contenant le motif MIDAS ou un motif de type MIDAS, et (iii) au moins une molécule de liaison (ou linker), un linker liant - une entité (i) à une entité (ii) ou, lorsque ledit polypeptide chimérique comprend de multiples entités (i) et/ou de multiples entités (ii), - une entité (i) à une autre entité (i), ou - une entité (ii) à une autre entité (ii), ou - un ensemble d'entités de type (i) à un ensemble d'entités de type (ii). 2. Polypeptide chimérique selon la revendication 1, dans lequel le linker est un polypeptide, en particulier un peptide. 3. Polypeptide chimérique selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le linker comprend ou consiste en la séquence 3(GGGGS). 4. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en un domaine lectine de type C ou une portion d'un tel domaine lié par un linker à un domaine de type A de von Willebrand ou une portion de ce domaine. 71 2909672 5. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux domaines lectines de type C ou portions de ces domaines et/ou au moins deux domaines de type domaine A de von Willebrand ou portions de ces 5 domaines. 6. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend 3, 4, 5 ou 6 domaines lectines de type C ou portions de ces domaines et/ou 3, 4, 5 ou 6 domaines de type domaine A de von Willebrand ou portions de ces 10 domaines. 7. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le ou les domaine(s) lectine de type C et/ou la ou les portion(s) de domaine lectine de type C est (sont) en position NH2-terminale et le ou les domaine(s) de type domaine A de von 15 Willebrand et/ou la ou les portion(s) de domaine de type domaine A de von Willebrand est (sont) en position COOH-terminale du polypeptide. 8. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le domaine ou un des domaines lectine de type C est le domaine lectine de type C de la L-sélectine, de la P- 20 sélectine ou de la E-sélectine. 9. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel dans lequel le domaine ou un des domaines lectine de type C est le domaine lectine de type C d'une sélectine endothéliale, en particulier de la P-sélectine ou de la E-sélectine. 25 10. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le domaine ou un des domaines lectine de type C est le domaine lectine de type C d'une sélectine leucocytaire, en particulier de la L-sélectine. 72 2909672 11. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans lequel ladite ou une desdites intégrine(s) est une intégrine endothéliale. 12. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 11, dans lequel ladite ou une desdites intégrine(s) est une intégrine leucocytaire, en particulier une intégrine dont la sous-unité R est la sous-unité CD18 ((32). 13. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans ladite intégrine est une intégrine dont la sous- 10 unité a est choisie parmi le groupe constitué des sous-unités CD11 a (aL), CD11 b (aM), CD11 c (aX) et CD11 d (aD). 14. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans lequel ladite ou lesdites sélectine(s) et ladite ou lesdites intégrine(s) sont des protéines humaines. 15 15. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans lequel la séquence en acides aminés du domaine ou d'au moins un des domaines lectine de type C est la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine, ou une séquence modifiée par insertion, délétion ou substitution d'un ou 20 plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.2, ladite séquence modifiée conservant la fonction de fixation du ligand de façon calcium-dépendante attachée au domaine lectine de type C de la L- sélectine humaine. 16. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 15, dans lequel le domaine ou au moins un des domaines de type domaine A de von Willebrand est le domaine A de la sous-unité a d'une intégrine, en particulier le domaine A de la sous-unité a CD11 b. 73 2909672 17. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le domaine ou au moins un des domaines de type domaine A de von Willebrand est le domaine A-like de la sous- unité f3 d'une intégrine, en particulier le domaine A-like de la sous- 5 unité (32 (CD18). 18. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans lequel la séquence en acide aminés dudit domaine ou d'un desdits domaines de type domaine A de von Willebrand est la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b de 10 l'intégrine CD11 b/CD18 humaine ou une séquence modifiée par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.6, ladite séquence modifiée conservant la capacité à coordonner un ligand de l'intégrine et des cations divalents attachée au domaine A de la sous unité a l'intégrine CD11 b/CDI 8 humaine. 15 19. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel la portion ou au moins une des portions du domaine ou de type domaine A de von Willebrand selon l'invention comprend ou consiste en au moins le fragment correspondant aux acides aminés en position 140 à 242 de la séquence SEQ ID NO.5 de la sous- 20 unité a CD 11 b de l'intégrine CD11 b/CD18 humaine ou un domaine ayant au moins 90% ou au moins 70% d'identité avec ledit fragment lorsque les deux séquences sont alignées. 20. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel la portion ou au moins une des portions 25 du domaine de type domaine A de von Willebrand est la séquence SEQ ID NO.7 correspondant aux acides aminés en position 140 à 242 de la SEQ ID NO. 5 de la sous-unité a CD11 b de l'intégrine CD11 b/CD18 humaine. 21. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans lequel la séquence en acides aminés du 30 domaine ou d'au moins un des domaines de type domaine A de von 74 2909672 Willebrand est la séquence du domaine A de la sous-unité a de l'intégrine CD11a/CD18 humaine (SEQ ID NO.10), ou CDI IcICD18 humaine (SEQ ID NO.13) ou une séquence modifiée par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) dans la séquence SEQ ID NO.10 ou 5 SEQ ID NO.13, ladite séquence modifiée conservant la capacité à coordonner un ligand de ladite intégrine et des cations divalents attachée au domaine A de la sous-unité a CD1 la ou CD11c respectivement. 22. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que au moins un des domaines ou 10 au moins une des portions de domaine de type domaine A de von Willebrand est dans une conformation non activée. 23. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que au moins un des domaines ou au moins une des portions de type domaine A de von Willebrand est dans 15 une conformation activée. 24. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, comprenant - en tant que domaine lectine de type C d'une sélectine, un polypeptide consistant la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L- 20 sélectine humaine, ou la séquence SEQ ID NO.2 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'un ou plusieurs acides aminés dès lors que la séquence modifiée conserve la fonction de fixation des ligands de façon calcium-dépendante normalement attachée au domaine lectine de type C de ladite sélectine, et 25 - en tant que domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine, un polypeptide consistant en la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine, ou la séquence SEQ ID NO.6 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que la séquence modifiée conserve la capacité à 75 2909672 coordonner un ligand d'une intégrine et des cations divalents normalement attachée au domaine A de ladite intégrine. 25. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, comprenant 5 - en tant que portion dérivée du domaine lectine de type C d'une sélectine, un polypeptide consistant en un fragment de la séquence SEQ ID NO.2 du domaine lectine de type C de la L-sélectine humaine ou un fragment de la séquence SEQ ID NO.2 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que ledit fragment conserve la 10 fonction de fixation des ligands de façon calcium-dépendante normalement attachée au domaine lectine de type C de ladite sélectine, et - en tant que portion dérivée du domaine de type domaine A de von Willebrand d'une intégrine, un polypeptide consistant en un fragment de la séquence SEQ ID NO.6 du domaine A de la sous-unité a CD11 b humaine, 15 ou un fragment de la séquence SEQ ID NO.6 modifiée par substitution, délétion ou insertion d'une ou plusieurs acides aminés dès lors que ledit fragment conserve la capacité à coordonner un ligand d'une intégrine et des cations divalents normalement attachée au domaine A de ladite intégrine. 20 26. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, caractérisé en ce que sa séquence en acide aminés comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO.17. 27. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une 25 séquence tag, qui permet de purifier le polypeptide chimérique. 28. Polypeptide chimérique selon la revendication 27, caractérisé en ce que ladite séquence tag comprend une pluralité d'acides aminés histidine liés consécutivement. 76 2909672 29. Polypeptide chimérique selon la revendication 27 ou 28, caractérisé en ce que ladite séquence tag comprend la séquence (Histidine)6. 30. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 29, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un marqueur permettant de détecter le polypeptide chimérique par ELISA ou en Western Blot. 31. Polypeptide chimérique selon la revendication 30, caractérisé en ce ledit marqueur est un épitope reconnu par un anticorps monoclonal 10 spécifique. 32. Polypeptide chimérique selon la revendication 30 ou 31, caractérisé en ce ledit marqueur est un épitope myc. 33. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32. 15 34. Vecteur de clonage ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend un insert polynucléotidique sous le contrôle de ses éléments de régulation, de clonage ou d'expression constitué par un polynucléotide selon la revendication 33. 35. Vecteur de clonage ou d'expression selon la revendication 34, 20 caractérisé en ce que ledit vecteur est le plasmide pPICZaB tel que représenté à la figure 4. 36. Culture cellulaire sélectionnée parmi le groupe comprenant les cultures cellulaires primaires de bactéries, les cultures cellulaires primaires de cellules eucaryotes animales et les lignées cellulaires, 25 caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide selon la revendication 33 ou un vecteur selon la revendication 34 ou 35. 37. Culture cellulaire selon la revendication 36, caractérisée en ce que ladite cellule est une culture cellulaire de levure Pichia pastoris. 77 2909672 38. Procédé de production d'un polypeptide chimérique selon l'une des revendications 1 à 32, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'introduction du polynucléotide selon la revendication 33 dans une 5 cellule hôte sélectionnée parmi le groupe comprenant les microorganismes de type bactérie, les cellules eucaryotes animales et les cellules d'une lignée cellulaire; b) l'expression dudit polynucléotide dans ladite cellule hôte; c) la récupération du polypeptide exprimé. 10 39. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que ledit polynucléotide est assemblé par PCR. 40. Procédé selon la revendication 38 ou 39, caractérisé en ce que l'expression dudit polynucléotide dans ladite cellule hôte comprend une étape de fermentation en haute densité cellulaire. 15 41. Procédé selon l'une des revendications 38 à 40, caractérisé en ce que ladite cellule hôte est une cellule de levure Pichia pastoris. 42. Procédé selon la revendication 41, caractérisé en ce que ladite cellule de levure Pichia pastoris est une cellule d'une souche permettant une expression par fermentation en haute densité cellulaire, en 20 particulier une cellule de la souche KM71 H. 43. Procédé de préparation d'un sérum polyclonal dirigé contre le polypeptide chimérique selon l'une des revendications 1 à 32, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - immunisation d'un animal avec le polypeptide chimérique selon l'une des 25 revendications 1 à 32 associé ou non à un adjuvant; le cas échéant au moyen d'administrations répétées dudit polypeptide; - récupération des anticorps formés, capables de reconnaître le polypeptide chimérique utilisé pour l'immunisation. 78 2909672 44. Procédé de préparation d'anticorps monoclonaux reconnaissant un polypeptide chimérique selon l'une des revendications 1 à 32, comprenant les étapes suivantes : - immunisation d'un animal, par exemple une souris Balb/c, avec un 5 polypeptide chimérique selon l'une des revendications 1 à 32, l'immunisation étant le cas échéant réalisée au moyen d'administrations répétées du polypeptide; - fusion des cellules spléniques de l'animal immunisé avec des cellules de myélome pour former un hybridome; 10 - culture de l'hybridome dans des conditions permettant la production d'anticorps; - récupération des anticorps dirigés contre le polypeptide chimérique utilisé pour l'immunisation. 45. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle 15 comprend un polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 et un diluant ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 46. Composition pharmaceutique selon la revendication 45, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un second agent 20 thérapeutique, en particulier un agent anti-inflammatoire. 47. Composition pharmaceutique selon la revendication 45 ou 46, caractérisée en ce qu'elle est formulée pour une administration parentérale, orale, sous-cutanée ou intraveineuse. 48. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des 25 revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour une utilisation pour moduler l'adhésion des leucocytes aux endothéliums vasculaires. 49. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une 79 2909672 quelconque des revendications 45 à 47, pour une utilisation pour moduler l'ancrage et l'adhésion ferme des leucocytes aux endothéliums vasculaires. 50. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une 5 quelconque des revendications 45 à 47, pour une utilisation comme médicament. 51. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour une utilisation comme agent 10 anti-inflammatoire. 52. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour une utilisation pour moduler l'afflux des leucocytes dans les sites inflammatoires. 15 53. Polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour la prophylaxie et/ou le traitement les lésions tissulaires de nature inflammatoire. 54. Utilisation d'un polypeptide chimérique selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des lésions tissulaires de nature inflammatoire. 55. Utilisation d'un polypeptide chimérique selon l'une quelconque 25 des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement des brûlures du deuxième et du troisième degré. 80 2909672 56. Utilisation d'un polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 32 ou composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 45 à 47, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prophylaxie et/ou au traitement des maladies 5 auto-immunes telles que le psoriasis. 57. Kit qui comprend un polynucléotide selon la revendication 33 et le couple d'amorces L2F/R1 F. 81