Brevet FR2909553A1 — publié le 20080613

OLIGO-f3(1-3)-GLUCANES À EFFET INHIBITEUR DES RÉACTIONS ALLERGIQUES, ET APPLICATIONS L'invention relève du domaine des traitements curatifs préventifs et/ou palliatifs des allergies. Elle concerne plus particulièrement des compositions, telles qu'un médicament, un complément alimentaire et/ou un alicament, destinées à prévenir et/ou à bloquer les réactions allergiques. Les changements de mode de vie intervenus au cours des trente dernières années sont responsables d'un accroissement explosif des phénomènes allergiques dans les pays industrialisés. En effet, les allergies, qui atteignaient un européen sur dix il y a vingt ans, sont en constante progression. Et, selon l'Organisation Mondiale de la Santé, elles pourraient affecter, à titres divers, près d'un européen sur deux en 2020. L'allergie est l'expression pathologique d'une réaction d'hypersensibilité de l'organisme à différentes substances, dites allergènes, qui sont présentes soit naturellement dans le milieu environnant (pollens, venins, les déjections d'insectes, phanères animaux...) soit artificiellement à la suite des activités humaines (polluants industriels, produits chimiques, aliments transformés, médicaments...). Dans la plupart des cas, l'allergie survient lors d'un premier contact sensibilisant avec un allergène qui induit une réponse d'hypersensibilité supportées par des immunoglobulines de classe E (IgE). Un titre anormalement élevé d'IgE totale sérique chez un individu constitue un indice d'état allergique qui, à l'occasion d'un deuxième contact révélateur avec l'allergène initial concerné, sera confirmé par des manifèstations cliniques plus ou moins violentes (asthme, conjonctivite, rhinites, sinusites, alvéolites, urticaire, eczéma, oedèmes, choc anaphylactique...), et dont la nature et la gravité dépendent essentiellement du type d'allergie et de l'allergène en cause. Malgré leur grande diversité étiologique, les allergies traduisent toutes un état pathologique qui, au niveau cellulaire et moléculaire, est étroitement lié à la présence et à l'activité des IgE. Lors d'un second contact avec 2909553 2 l'allergène, les IgE déjà formées se lient à l'allergène selon une réaction antigène- anticorps. Ce complexe allergène-anticorps se fixe sur les récepteurs membranaires des basophiles et mastocytes et provoque leur dégranulation avec libération massive de médiateurs allergéniques responsables des manifestations 5 cliniques de l'allergie. Parmi les approches thérapeutiques actuellement proposées pour traiter l'allergie, la désensibilisation est considérée pour l'heure comme l'unique traitement véritablement curatif. La désensibilisation, ou immunothérapie spécifique (on 10 parle aussi de vaccinothérapie allergénique), consiste à administrer régulièrement au patient, par voie sous-cutanée ou sublinguale, des extraits de la substance allergisante à des doses régulièrement croissantes. Elle se déroule en deux phases : une phase d'accoutumance (ou d'induction), d'une durée 15 généralement de 3 à 4 mois, lors de laquelle la dose d'allergène administrée augmente progressivement, passant d'une dose initialement très minime (généralement 1 000 fois inférieure à la charge d'allergène à laquelle le patient est susceptible d'être confronté) jusqu'à la dose d'entretien (évaluée par le praticien, au cas par cas), la fréquence des administrations passant de 1-3 fois par semaine, 20 à 1 fois par mois, . une phase d'entretien (ou de maintenance), d'une durée moyenne de 3 à 5 ans, au cours de laquelle, tout les mois, une dose d'entretien est administrée au patient. Particulièrement efficace à l'égard des acariens, de la 25 poussière, du venin d'hyménoptères et des pollens, la désensibilisation s'est révélée néanmoins inopérante pour traiter nombre d'allergies aux animaux, aux moisissures... Une connaissance insuffisante de l'allergène ou des allergènes en cause ainsi que le nombre relativement limité d'extraits d'allergène appropriés disponibles, sont les premières causes des médiocres résultats obtenus jusqu'à 30 présent. 2909553 3 En alternative et/ou en complément à la désensibilisation, des traitements palliatifs sont prévus pour traiter les manifestations cliniques relatives à l'allergie. En fonction du type de manifestations cliniques (asthme, 5 conjonctivite, rhinites, sinusites, alvéolites, urticaire, eczéma, oedèmes, choc anaphylactique...), le médecin pourra prescrire un protocole de traitement spécifique. Une large gamme de médicaments (cromoglycate de sodium, glucocorticoïdes méthyl-xanthines, agonistes Pi-adrénergiques, anti- histaminiques...) est disponible. L'efficacité de ces médicaments n'est plus à 10 démontrer, mais leur administration répétitive peut s'accompagner, selon les patients, d'effets indésirables (cromoglycate de sodium : irritation de la gorge, goût désagréable, nausées, toux ou respiration sifflante... ; glucocorticoïdes : atrophie cutanée, inhibition de la multiplication cellulaire, retard de la cicatrisation, dépigmentation, risque de passage systémique en application 15 topique... ; méthyl-xanthines : anorexie, nausées, douleurs épigastriques (tératogénie constatée chez la souris)... ; agonistes 13-adrénergiques : tachycardie, palpitations, tremblements, sudation, et exceptionnellement oedème pulmonaire, ischémie myocardique, arythmies cardiaques...). Pour les allergies alimentaires, les allergies 20 médicamenteuses et les allergies aux venins qui donnent souvent lieu à des chocs anaphylactiques violents susceptibles de conduire à la mort du sujet, un traitement doit être dispensé en urgence au sujet (injections d'adrénaline, d'antivenimeux...) pour éviter toute séquelle irréversible ; une hospitalisation s'avère souvent indispensable. 25 L'éviction des allergènes est une troisième méthode de lutte contre les allergies. Elle est considérée comme un traitement préventif à part entière. A l'égard des allergies alimentaires, médicamenteuses et aux venins, cette approche préventive est privilégiée par rapport aux tentatives de 30 désensibilisation et aux approches palliatives, précédemment évoquées. Sa mise en oeuvre est relativement aisée et conduit à des résultats généralement très 2909553 4 satisfaisants. Tel n'est pas le cas pour les allergies respiratoires et, éventuellement pour les allergies de contact, du fait de l'ubiquité et de la nature de certains allergènes en cause (acariens, pollens, poussière, pollution...). Mais, quel que soit le type d'allergie concerné, l'éviction des allergènes n'est réellement 5 envisageable que dans la mesure où le sujet est parfaitement conscient de son état à risque et de la nature de l'allergie. Ce qui, en pratique, est rarement le cas. L'invention a pour objectif de proposer une nouvelle approche de traitement de l'allergie qui puisse être appliquée de manière générale à tous types d'allergies. A cet effet, l'invention vise à proposer de nouveaux 10 agents actifs susceptibles d'intervenir sur les mécanismes cellulaires et/ou moléculaires impliqués dans l'établissement de la réaction allergique, en général. L'invention vise principalement à prévenir, à atténuer, voire à bloquer les réactions allergiques, notamment en inhibant au moins partiellement la libération et/ou les effets des médiateurs réaginiques. 15 En particulier, l'invention vise à proposer des agents actifs capables d'atténuer, voire de bloquer, la synthèse des IgE réaginiques et/ou les effets de ces IgE réaginiques, notamment à l'égard de la dégranulation des mastocytes. L'invention a également pour objectif de proposer une 20 utilisation particulière de ces agents actifs pour la préparation d'un médicament, d'un complément alimentaire et/ou d'un alicament, dont l'administration ponctuelle ou régulière ne présente aucun effet toxique. A cet effet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligosaccharide X3(1-3)-glucane comprenant une chaîne principale de degré de 25 polymérisation de 3 à 6, dit oligo-I3(1-3)-glucane, pour la préparation d'une composition pour traiter l'allergie. Une composition préparée selon l'invention, peut consister en un complément alimentaire et/ou un alicament. Elle peut consister également en un médicament ; 30 l'invention peut alors être définie comme un procédé de préparation d'un médicament pour traiter l'allergie, dans lequel on utilise au moins un 2909553 5 oligosaccharide 13(1-3)-glucane comprenant une chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-3(193)-glucane. La quantité totale d'oligo-f3(1-3)-glucane(s) utilisée pour préparer ladite composition est choisie po ur permettre au moins une inhibition 5 significative de la synthèse des IgE réaginiques, chez le sujet, après administration. Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est destinée au traitement des allergies de type choisi parmi : les allergies respiratoires, les allergies de contact, les allergies alimentaires, les allergies 10 médicamenteuses, les allergies aux venins. Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est destinée à prévenir les réactions allergiques. Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est adaptée pour pouvoir atténuer la synthèse et/ou les effets réaginiques des IgE. 15 Les inventeurs ont démontré que les oligosaccharides P(l-3)-glucane, linéaires ou ramifiés, dont la chaîne principale est de degré de polymérisation égale à 3, 4, 5 ou 6, présentent une efficacité significative pour modérer ou pour inhiber, les mécanismes immunitaires impliqués dans le déclenchement des réactions allergiques, y compris les chocs anaphylactiques. 20 Outre une inhibition de la synthèse des IgE réaginiques, responsables de la dégranulation des mastocytes et de la synthèse et/ou la libération massive des médiateurs allergéniques, des tests in vitro entrepris par les inventeurs sur des leucocytes humains ont permis de mettre en évidence que l'effet biologique des oligo-13(1-3)-glucanes visés par l'invention se traduit 25 également par : . une stimulation de la libération des immunoglobulines de classe A (IgA), connues pour leur action antagoniste vis-à-vis des IgE réaginiques, • une stimulation de la sécrétion et de l'activité 30 physiologique de l'interféron y (INFy), une cytokine produite par les 2909553 6 lymphocytes T, CD4-Thl et CD8, qui antagonise l'interleukine de type 4 (IL-4) en inhibant la production d'IgE et les réactions allergiques qui leur sont liées. . une stimulation de la sécrétion et de l'activité physiologique de l'interleukine de type 10 (IL-10), une cytokine anti- 5 inflammatoire produite par les lymphocytes T, Thl et Th2, par les lymphocytes B et les monocytes, qui induit la différenciation terminale de plasmocytes et stimule la synthèse des immunoglobulines de classes G (IgG) et A (IgA). Enfin, des tests in vivo réalisés par les inventeurs sur des cobayes ont permis, d'une part, de confirmer les propriétés anti-allergie des oligo- 10 P(143)-glucanes visés par l'invention et, d'autre part, de constater, notamment : . une protection efficace des cobayes à l'égard des chocs anaphylactiques, . une absence de toxicité, aigüe et chronique, aussi bien chez les cobayes traités quotidiennement par voie orale avec des oligo-P(1-*3)- 15 glucanes, que chez les cobayes traités par des injections intra-péritonéale de ces mêmes d'oligo-X3(1-*3)-glucanes. En outre, pour préparer une composition pour traiter l'allergie conformément à l'invention, on utilise avantageusement des oligo-R14)-glucanes linéaires. On peut aussi utiliser des oligo-P(1a3)-glucanes 20 ramifiés ; en particulier des oligo-X3(1-*3)-glucanes de poids moléculaire inférieur à 2 000 Da, comprenant au moins une ramification en (3(1-*6). Egalement, on peut aussi utiliser un mélange d'oligo-13(1-*3)-glucanes linéaires et d'oligo-33(1-*3)-glucanes ramifiés en 13(1-*6). Avantageusement, le(s) oligo-P(1-*3)-glucane(s), linéaire(s) 25 et/ou ramifié(s), utilisé(s) dans le cadre de l'invention sont solubles dans un milieu aqueux -notamment un liquide physiologique-. Le faible degré de polymérisation et une éventuelle ramification des oligo-X3(1-*3)-glucanes visés par l'invention conditionnent avantageusement leur solubilité dans l'eau et dans les liquides physiologiques, ainsi que leurs activités biologiques sur les 30 différentes composantes du système immunitaire. 2909553 7 De manière connue, les oligo-J3(1-3)-glucanes visés par l'invention peuvent être préparés à partir de P-glucanes de haut poids moléculaire de chaîne principale f3(1-3), éventuellement ramifiée p(16). Pour ce faire, ces 1i-glucanes de haut poids moléculaires peuvent être soumis à une digestion par 5 des enzymes à activité Pi(14)-glucanase et 13(1->6)-glucanase, et/ou à une hydrolyse acide (par exemple, une hydrolyse à chaud par l'acide formique). Avantageusement, pour la mise en oeuvre de l'invention, on utilise des oligo-(3(l- 3)-glucanes préalablement préparés à partir de polymères 3(1-*3)-glucane provenant d'une source choisie parmi : la paroi de levure, le son 10 d'avoine, le curdlan. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition anti-allergie préparée conformément à l'invention est destinée à être administrée par voie orale, sous la forme d'un médicament per os, un complément alimentaire, ou un alicament. 15 Selon ce mode de réalisation particulier, on utilise une quantité efficace d'oligo-X3(1-*3)-glucane(s) correspondant à une prise journalière d'oligo-(3(1-*3)-glucane(s) de l'ordre de 100-1 000 mg, de préférence de l'ordre de 400 mg, pour un adulte de 65 kg. Selon ce premier mode de réalisation, une composition à 20 administration par voie orale (notamment lorsqu'il s'agit d'un médicament per os ou d'un complément alimentaire) peut être réalisée sous des formes galéniques et des formulations très diverses : • sous la forme d'un mélange de particules solides et divisées, par exemple une poudre effervescente ou non effervescente, et dont la 25 prise nécessite qu'elle soit mélangée à de l'eau, . sous la forme d'un comprimé effervescent ou non, à avaler avec un peu d'eau, à sucer ou à croquer, • sous forme d'une solution, par exemple, une suspension, un sirop, une composition liquide enrobée dans une capsule dure ou molle. 2909553 8 Selon une variante de mise en oeuvre d'une composition à administration par voie orale préparée conformément à l'invention, celle-ci consiste avantageusement en un alicament, c'est-à-dire une composition alimentaire, solide et/ou liquide, qui incorpore au moins un oligo-13(143)-glucane 5 visé par l'invention, en quantité efficace. Selon un second mode de réalisation de l'invention, la composition anti-allergie préparée conformément à l'invention, est avantageusement adaptée pour pouvoir être administrée par voie topique (par exemple, sous la forme d'une crème, d'un gel...). 10 Quelle que soit la forme dans laquelle se concrétise la présente invention (médicament per os, complément alimentaire, alicament), outre ladite quantité d'oligo-13(1- 3)-glucane(s), une composition préparée selon l'invention, de manière classique, peut nécessiter l'adjonction d'additifs et/ou d'excipients d'ordre pharmaceutique ou d'ordre alimentaire, traditionnels. Ces 15 additifs et/ou excipients, rentrant éventuellement dans la formulation d'une composition conforme à l'invention, sont par exemple des liants, des lubrifiants, des édulcorants, des diluants, des excipients, des agents effervescents, des agents d'enrobage... L'invention concerne également l'utilisation d'oligo-13(1->3)- 20 glucanes visés par l'invention pour la préparation de compositions à administration par voie orale, destinées à prévenir et/ou à atténuer les réactions allergiques, ainsi qu'un procédé de traitement préventif et/ou palliatif des réactions allergiques, dans lequel on administre au sujet, ponctuellement ou de façon répétée, une quantité efficace d'oligo-3(1-3)-glucane(s), caractérisés en 25 combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci-après. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et qui concerne la préparation d'oligosaccharides 13(1-3)-glucane et la caractérisation des propriétés 30 anti-allergie des oligo-13(1-0)-glucanes. La description relative aux méthodes de 2909553 9 préparation et d'analyse des oligosaccharides P(l-3)-glucane fait notamment référence aux figures 1 à 6, annexées, qui en présentent les profils d'élution. 1/ - PRÉPARATION D'OLIGOSACCHARIDES ET D'OLIGO-13(I-3)-GLUCANES ANTI-ALLERGIE 5 De manière connue, les oligosaccharides X3(1-3)-glucane peuvent être préparés à partir de (3-glucanes de haut poids moléculaire. A titre d'exemple de méthodes pouvant être utilisées pour ce faire, on peut citer JP 2005/110675, WO 99/52920. Les oligosaccharides X3(143)-glucane étudiés par les 10 inventeurs ont été obtenus par extractions et fractionnements réalisés à partir de différents produits commerciaux disponibles en industries agro-alimentaires tels que le curdlan bactérien, les levures et le son d'avoine. a) Suivant un premier exemple de produit de départ utilisé pour la préparation d'oligo-X3(1-3)-glucanes visés par l'invention, on utilise le 15 curdlan d'origine bactérienne, constitué d'homopolymères de glucose, de chaîne principale t3(1-3), linéaire et de degré de polymérisation élevé. Le curdlan est disponible sous forme purifiée dans le commerce. Des étapes de purification, préalables à l'étape d'hydrolyse 20 de ces homopolymères, peuvent s'avérer nécessaires en vue d'éliminer les sels et autres petites molécules éventuellement présents dans le produit commercial. A cet effet, on peut réaliser une dialyse contre de l'eau du produit en solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Deux procédés d'hydrolyse et de purification ont été mis en 25 oeuvre sur le curdlan, pour obtenir les ol:igo-3-glucanes visés par l'invention. • Le premier procédé est basé sur une hydrolyse enzymatique. Le système enzymatique choisi est un mélange de P(1->3)-glucanase et de X3(1-*6)-glucanase, commercialisé sous la dénomination GLUCANEX (NOVO-Nordisk). Ce système enzymatique a été sélectionné pour 30 son activité 3(1-*3)-glucanase. 2909553 10 Le curdlan est soumis à une hydrolyse enzymatique en présence de GLUCANEX, dans un milieu aqueux à un pH de l'ordre de 4 et à une température de l'ordre 40 C. La concentration enzymatique est de 2 unités pour 50 mg de curdlan. 5 La réaction d'hydrolyse est réalisée dans une cellule de concentration permettant l'extraction en continu des oligosaccharides formés par ultrafiltration sur une membrane de 10 000 Da à une pression de 1,5 Bars. Les oligosaccharides libérés sont ensuite séparés par chromatographie d'exclusion stérique permettant d'obtenir cinq fractions 10 d'oligo-X3(1-3)-glucanes, notées I-A à I-F et reprises dans le tableau 1 ci-après. Les conditions opératoires de cette chromatographie d'exclusion stériques sont les suivantes : - la colonne d'exclusion stérique utilisée est une colonne Bio-Gel P2 (210 x 1,5 cm ; seuil de coupure 100-1 80 Da), 15 l'éluant est de l'eau distillée, le débit est de 40 ml.min i, le suivi de l'élution est réalisé par un réfractomètre RID Iota, - la quantité d''échantillon injectée est de 0,5 ml, - les fractions recueillies sont concentrées et 20 lyophilisées. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 1. Fractions d'oligosaccharides Rendement massique Degré de polymérisation (3(1- 3)-glucanes de curdlan (par hydrolyse enzymatique) I-A 1,4% DP>10 I-B 1 % DP 5 I-C 1,6% DP 4 I-D 3,8% DP 3 I-F 5,2% DP 2 Tableau 1 25 30 2909553 11 . Le deuxième procédé d'hydrolyse du curdlan est basé sur une hydrolyse chimique. Le curdlan est soumis à une hydrolyse acide à chaud en présence d'acide formique 50 % à 100 C pendant 2 heures. Le culot résiduel issu 5 de l'hydrolyse est soumis à un nouveau traitement en présence d'acide formique (pendant 2 heures à 100 C). Les surnageants obtenus à l'issue des deux hydrolyses successives sont réunis et séchés sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif Les hydrolysats sont solubilisés dans l'eau distillée. 10 L'ensemble est porté à ébullition pendant 3 heures afin d'éliminer les substituants formyle. Les oligosaccharides déformylés sont alors lavés et séchés par évaporation sous vide. L'extrait obtenu est ensuite fractionné par chromatographie sur une colonne d'exclusion stérique de type Bio-Gel P2 permettant d'obtenir 15 neuf fractions d'oligosacchrides 13(133)-glucane. Ces différentes fractions sont notées I-A à I-I et sont reprises dans le tableau 2 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 2. L'hydrolyse chimique non spécifique des 3-glucanes du curdlan permet d'obtenir des oligosaccharides 13(1-3)-glucane linéaires avec une 20 plus large gamme de degré de polymérisation. 25 30 2909553 12 Fractions d'oligosaccharides Rendement massique Degré de polymérisation (3(1-3)-glucanes de curdlan (par hydrolyse chimique) I-A 12 % DP>10 IG 3,8 % DP 9 (présumé) I-H 1,2 % DP 8 (présumé) I-I 1,2 % DP 7 (présumé) I- J 2,6 % DP 6 I-B 4,2% DP5 I-C 2,4 % DP 4 I-D 3% DP3 I-F 1,8% DP2 Tableau 2 15 b) Suivant un deuxième exemple de méthode permettant d'obtenir des oligo-f3(1-3)-glucanes visés par l'invention, on utilise la paroi de levures constituée d'homopolymères de glucose hautement polymérisés, à chaîne principale [3(1-3), éventuellement parfois ramifiée en [3(1-6). A cet effet, un extrait total de levure est solubilisé en milieu 20 alcalin dans de l'urée (5%) en présence de soude à 4 C, pendant 12 heures. Cette étape a pour objectif d'extraire les [3(143)-glucanes ramifiés en [3(146). Par centrifugation, on élimine la fraction insoluble dans l'urée/NaOH. Cette fraction est composée principalement de solutés de nature non polysaccharidique, tels que les sels et les protéines. 25 La solution est ensuite traitée avec de l'acide acétique afin d'éliminer le reste des composés non pariétaux solubles. L'ajout d'acide acétique provoque la précipitation des [3(1-3)-glucanes ramifiés en R(146), sous la forme d'un gel. Les derniers composés solubles sont éliminés par dialyse. 30 Une ultrafiltration fine ou une nanofiltration peuvent également être mises en oeuvre à cet effet. 5 10 2909553 13 Les [3(143)-glucanes ramifiés en 13(1-6) ainsi purifiés sont par la suite lyophilisés, puis soumis à une hydrolyse acide à chaud en présence d'acide formique 50 % à 100 C, pendant 2 heures. Deux cycles de ce traitement acide, sous reflux et agitation, 5 sont nécessaires pour obtenir une majorité d'oligosaccharides 13(143)-glucane, éventuellement ramifiés en 13(146). Le surnageant récupéré par centrifugation est évaporé sous vide et soumis à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique. Les hydrolysats sont solubilisés dans l'eau distillée et 10 portés à ébullition pendant 3 heures afin d'éliminer les substituants formyle. Les oligosaccharides déformylés sont alors lavés et séchés par évaporation sous vide. L'extrait obtenu est ensuite fractionné par chromatographie sur une colonne d'exclusion stérique de type Bio-Gel P2 permettant d'obtenir huit fractions d' oligosaccharides 13(143)->3)éventuellement ramifiés en 15 13(146), notées II-A à II-H et reprises dans le tableau 3 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 3. Fractions d'oligosaccharides Rendement massique Degré de polymérisation (3(143)-glucanes de levures (de la chaîne principale) (par hydrolyse chimique) II-A 19,7% DP>10 II-B 3,0 % 10>DP>4 (estimé) II-C 2,0 % II-D 2,7 % II-E 1,3 % II-F 2,7 % II-G 2,7% DP4 II-H 2,0 % DP 3) de degré de polymérisation 5 majoritairement inférieur à 10. c) Suivant un troisième exemple, la préparation d'oligo-(3(1-v3)-glucanes visés par l'invention est mise en oeuvre à partir du son d'avoine. Les polymères f3-glucanes de son d'avoine sont des polymères linéaires à liaisons (3(1-*3) et (3(1-4). 10 Le procédé d'extraction de ces polymères est inspiré du protocole mis au point par Aspinall et Carpenter (Aspinall G.O. and Carpenter R.C. : Carbohydrate Polymers (1984) 4:271-282). Il a permis d'isoler deux fractions de polymères (3(1-3),(1-4)-,glucanes ; l'une comprend des polymères solubles dans le DMSO, et l'autre, des polymères solubles dans l'eau après une 15 action d'une a-amylase permettant l'hydrolyse de l'amidon. Les polymères de cette dernière fraction sont dégradés par un procédé enzymatique pour faciliter la purification des (3(1-3),(1-.4)-glucanes. Les propriétés de solubilité différentes des polymères de ces fractions sont liées à leur rapport (3(1-0)-glucose/(3(144)-glucose. 20 Ce procédé de purification a permis d'obtenir un rendement de production de 7 % pour les (3(14),(14)-glucanes solubles dans le DMSO et un rendement de production de 2,5% pour les (3(143),(1->4)-glucanes solubles dans l'eau. Préalablement au traitement de l'amidon, le son d'avoine 25 est soumis à une extraction Eau/Ethanol (1:9) à 100 C pendant 14 heures. L'extrait hydroalcoolique est lyophilisé puis soumis à une hydrolyse enzymatique en présence d'aamylase afin de dégrader l'amidon. Le mélange est soumis à une centrifugation donnant lieu à une fraction insoluble (culot) et une fraction soluble (surnageant). 2909553 15 La fraction insoluble est lavée en présence d'eau et mise en solution dans le DMSO. Le surnageant obtenu après centrifugation est dialysé et lyophilisé. Le traitement de cette fraction insoluble donne lieu à la fraction de X3(1-0),(1- 4)-glucanes solubles dans le DMSO avec un rendement de 7 % du son 5 d'avoine. La fraction de I3(1-3),(1-4)-glucanes solubles obtenue après dégradation de l'amidon subit un traitement thermique à 100 C pendant 1 heure. Le surnageant obtenu après centrifugation est par la suite dialysé et lyophilisé. L'extrait séché est traité en présence de 20 % de sulfate d'ammonium 10 (NH4)2SO4 afin de précipiter les (3-glucanes et le culot obtenu après centrifugation est dialysé en présence d'eau puis lyophilisé. Le traitement de cette fraction de X3(1-3),(1-4)-glucanes solubles donne lieu à la fraction de 3-(1-3),(1-4)-glucanes solubles dans :l'eau avec un rendement de 2,5 % du son d'avoine. 15 Les deux fractions de polymères solubles dans le DMSO et solubles dans l'eau obtenues à partir du son d'avoine sont par la suite soumises à une hydrolyse chimique en vue d'extraire et de purifier les oligo-P-glucanes liés en i3-(13) et/ou en t3-(1-4). Ces fractions sont soumises à une hydrolyse acide à chaud 20 en présence d'acide formique 50 % à 100 C pendant 2 heures. Deux cycles de traitement sous reflux et agitation sont nécessaires pour obtenir la majorité des oligo-R-glucanes. Le surnageant est par la suite récupéré par centrifugation, évaporé sous vide et soumis à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique. 25 L'extrait obtenu à partir de la fraction de (3(1-3),(1-4)-glucanes solubles dans le DMSO est ensuite fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir sept fractions d' oligosaccharides 13-glucane. Les différentes fractions d'oligosaccharides (3-glucane obtenues, notées IV-A à IV-G, sont reprises dans le tableau 4 ci-après. Le profil 30 d'élution correspondant est présenté à la figure 4. 2909553 16 Fractions d'oligosaccharides R-glucaneobtenues à partir de Rendement massique Degré de polymérisation polysaccharides de son d'avoine, (de la chaîne principale) solubles dans le DMSO (par hydrolyse chimique) IV-A 9,7% DP > 10 IV-B 6,7 % DP 8-10 (estimé) IV-C 1,3 % DP 7 (estimé) IV-D 1,7 % DP 6 IV-E 1,7% DP 5 IV-F 1, 7% DP 4 IV-G 1,3% DP 3 Tableau 4 15 L'extrait obtenu à partir de la fraction de [3(1- 3),(1- 4)-glucanes solubles dans l'eau est ensuite fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir quatre fractions d'oligosaccharides 3-glucane. Les fractions d'oligosaccharides ~3- glucanes ainsi obtenues sont rapportées dans le tableau 5 ci-après. Le profil d'élution correspondant est 20 présenté à la figure 5. Fractions d'oligosaccharides R-glucane obtenues à partir de Rendement massique Degré de polymérisation polysaccharides de son d'avoine, (de la chaîne principale) solubles dans l'eau (par hydrolyse chimique) V-A 15,3 % DP>10 V-B 1,3 % DP 9 (estimé) V-D 1,7 % DP 7 (estimé) V-E 0,7% DP6 Tableau 5 5 10 25 30 2909553 17 d) Suivant un exemple particulier, la préparation d' oligo-[i(1-*3)-glucanes visés par l'invention est mise en oeuvre par hydrolyse chimique et enzymatique. A titre d'exemple, la combinaison de l'hydrolyse 5 enzymatique et de l'hydrolyse chimique est réalisée sur le curdlan purifié. En premier lieu, l'hydrolyse acide est réalisée à l'aide d'une solution d'acide formique à 50 0/ à 100 C (30 ml pour 50 mg de curdlan) pendant 1 heure. Un seul cycle de traitement sous reflux et agitation est appliqué. Le surnageant est par la suite récupéré par centrifugation, évaporé sous vide et 10 porté à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique. L'extrait obtenu est ensuite soumis à une hydrolyse enzymatique avec la GLUCANEX (2 unités pour 50 mg de curdlan) à pH 4 et à 40 C pendant 30 minutes. La réaction enzymatique est réalisée dans une cellule de concentration sur une membrane de 10 000 Da à une pression de 1,5 Bars. 15 L'extrait obtenu est concentré et fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir neuf fractions d'oligo-(3-glucanes. Les différentes fractions obtenues sont reprises dans le tableau 6 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 6. La combinaison des hydrolyses chimique et enzymatique 20 permet de générer les oligosaccharides définis par des degrés de polymérisation équivalents à ceux obtenus par les traitements individuels mais améliore le rendement de 2 à 3 fois par rapport à une simple hydrolyse chimique. 25 30 2909553 18 Fractions d'oligosaccharides Rendement massique Degré de polymérisation 6(1- 3)-glucanes de curdlan (de la chaîne principale) (hydrolyse chimique et enzymatique) I-A 11 % DP>10 I-G 2,6 % DP 9 (estimé) I-H 2,2 % DP 8 (estimé) I-1 2,4 % DP 7(estimé) I-J 3 % DP 6 I-B 4% DP5 I-C 7,3% DP4 I-D 8,9% DP3 I-F 8,7% DP2 Tableau 6 2/ - CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE DES OLIGOSACCHARIDES X3(1-3)-GLUCANES PRÉPARÉS a) Effet des oligosaccharides (3(1- 3)-glucane préparés sur 20 la synthèse d'immunoglobulines par les leucocytes. Les oligo-3(1--3)-glucanes selon l'invention présentent la propriété de moduler la synthèse des différentes classes d'immunoglobulines. Cette activité modulatrice a été mise en évidence sur une culture in vitro de leucocytes humains, isolés sur gradient de Ficoll à partir de prélèvements 25 sanguins effectués sur des donneurs sains. Les leucocytes, mis en suspension en milieu RPMI complet, sont répartis en plusieurs séries de tubes de 1 ml de volume, à raison de 150 000 cellules par tube. . Effet des oligosaccharides 13(1- 3)-glucane sur la synthèse 5 10 15 30 des IgE. 2909553 19 Les leucocytes sont cultivés en présence d' interleukine 4 (I1-4), à raison de 20 ng/ml. L'IL-4, produites par les lymphocytes T, est un facteur de croissance des lymphocytes, des basophiles et des mastocytes. L'Il-4 joue un rôle prépondérant dans l'induction de la production d'IgE par les 5 plasmocytes. Chaque tube de culture reçoit aussi 10 g de l'une des fractions d'oligosaccharides (3(143)-glucane précédemment préparées. Les leucocytes sont ainsi cultivés pendant 1.3 jours à 37 C. Le dosage des IgE totales sécrétées par les leucocytes dans 10 le milieu surnageant de culture de chaque série est effectué par une technique immunoenzymatique de type sandwich faisant appel à des anticorps marqués anti-IgE humaine. Les résultats obtenus sont recueillis dans le tableau 7 ci-après. 15 Ces résultats démontrent, après analyse statistique (Statistique Wilcoxon test, * : p 10 0,150 0,01 7,440 0,525 I-B DP 5 0,075 0,02 a 2,712 0,812 *** I-C DP 4 0,070 0,01 1,600 0,325 *** I-D DP 3 0,101 0,07 b 6,725 0,210 * I-F DP 2 0,125 0,06 7,025 0, 312 II-A DP>10 0,150 0,01 8,321 0,920 II-B ND 0,138 0,02 8,025 0,512 II-C ND 0,143 0,03 7,510 0,413 II-D ND 0,152 0,07 6,680 0,712 II-E DP 4-10 (estimé) 0,100 0,01 5,720 0,312 * II-F DP 4-5 (estimé) 0,090 0,01 =a 1,712 0,101 ** II-G DP4 0,080 0,01 b 1,025 0,050 *** W-A DP > 10 0,150 0,02 7,510 0,210 W-B DP 8-10 0,160 0,01 7,025 0,310 W-C DP 7 0,170 0,02 7,165 0,400 W-D DP 6 0,150 0,03 b 6,025 0,150 W-E DP 5 0,140 0,01 a 5,215 0,220 ** W-F DP4 0,152 0,01 b 5,310 0,200 ** IV-G DP 3 0,125 0,01 a 4,210 0,320 ** V-A DP 0,125 0,01 7125 0,120 V-B DP 0,128 0,02 7012 0,130 V-D DP 0,137 0,03 6530 0,210 V-E DP 6 0,150 0,01 b 4250 0,300 ** V-F DP 5 0,150 0,01 7525 0,800 Tableau 7 25 . Effet des oligosaccharides (3(1-0)-glucane sur la synthèse des IgA. Les fractions d'oligosaccharides (3-glucane aptes à diminuer la synthèse d'IgE, précédemment décelées, ont été testées pour leur effet potentiel sur la synthèse d'IgA. 30 Les séries de tubes de culture destinées au titrage des IgA reçoivent 10 g de l'une des préparations de (3(1- >3)-glucanes, et sont cultivés pendant 13 jours à 37 C. 5 10 15 20 2909553 21 Le dosage des IgA totales dans les surnageants de culture est effectué par une technique immunoenzymatique de type sandwich faisant appel à des anticorps marqués anti-Ig A humaine. Les résultats obtenus sont recueillis dans le tableau 8 ci-5 après. Glucanes Série expérimentale Fractions à 10 pg/ml. IgA (ng/ml) Témoin 12,750 0,920 I-B DP 5 ' 19,612 0,800 ** I-C DP 4 25,666 1,021 *** I-D DP 3 13,220 0,825 II-E DP 4-10 (estirné) =a 12,620 0,825 ** II-F DP 4-5 (estimé) 20,125 0,820 * * * II-G DP 4 26,640 0,518 IV-E DP 5 13,720 1,025 IV-F DP 4 13,608 0,820 IV-G DP 3 12,625 0,612 V-E DP 6 a 17,725 0,125 * Tableau 8 Les séries de résultats obtenus ci-dessus permettent, après analyses statistiques (Statistique Wilcoxon test, * : p 3)-glucanes dans la prévention des états allergiques est évaluée sur des cobayes. Pour ce faire, de jeunes cobayes albinos en bonne santé, de 300 g environ, sont répartis en deux lots séparés (Lot 1 - Expérimental, et Lot 2 - Témoin), de cinq animaux chacun. Au jour zéro du test, tous les animaux reçoivent par injections sous-cutanées en 2 points distincts, un volume de 0,20 ml d'une 2909553 24 solution commerciale isotonique d'allergènes extraits de pollens de graminées, un volume de 0,20 ml d'oligosaccharides f3(1-3)-glucane, la solution étant à une concentration de 20 mg/ml. Les trois semaines suivantes, les animaux du lot 1 5 reçoivent, par sonde oesophagienne, une dose quotidienne de 0,5 ml d'oligo-(3-glucanes (I-C, II-G,) en solution à 20 mg/ml. Les animaux du lot 2 reçoivent quant à eux 0,5 ml d'eau isotonique. Au 21 ème jour du test, tous les animaux sont soumis à un prick-test par inoculation épidermique de 100 l de la solution d'allergènes de 10 pollens. Le prick-test cutané, utilisé pour révéler une éventuelle sensibilisation IgE dépendante comporte un témoin négatif et un témoin positif à la codéine. L'apparition rapide, en 30 minutes, au point d'inoculation d'un oedème entouré d'un érythème d'une taille équivalente à celle du test témoin positif signe la positivité d'un état allergique aux pollens chez les cobayes. 15 Les résultats obtenus sur cobayes permettent d'observer des prick-tests positifs aux allergènes de pollens sur les animaux témoins du lot 2 et des prick-tests négatifs sur les animaux du lot 1. Les résultats de tests, répétés sur plusieurs lots successifs de cobayes, selon des posologies déterminées des différentes fractions I-B, I-C, 20 I-D, II-E, II-F, II-G, IV-E, IV-F, IV-G et V-E, permettent de conclure que les oligo-f (1-3)-glucane visés par l'invention se caractérisent par le fait que : - leurs ingestions quotidiennes et répétées pendant trois semaines ne révèlent pas de toxicité aigiiie ou chronique, pour le cobaye, - leurs administrations orales quotidiennes et répétées selon 25 des posologies déterminées protègent le cobaye sensibilisé du choc anaphylactique. REVENDICATIONS 1/ - Utilisation d'au moins un oligosaccharide X3(1->3)- glucane comprenant une chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-X3(1-3)-glucane, pour la préparation d'une composition pour traiter 5 l'allergie. 2/ - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-R(1->3)-glucane est linéaire. 3/ - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-3(143)-glucane est de poids moléculaire inférieur à 10 2 000 Da et comprend au moins une ramification en P(1-->6). 4/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-X3(1-0)-glucane est soluble dans un milieu aqueux. 5/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, 15 caractérisée en ce qu'au moins un oligo-P(1-*3)-glucane a été préalablement préparé à partir de polymères 3(143)-glucane provenant d'une source choisie parmi : la paroi de levure, le son d'avoine, le curdlan. 6/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à être administrée par voie 20 orale, sous une forme choisie parmi : un médicament per os, un complément alimentaire, un alicament. 7/ - Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise une quantité d'oligo-P(1->3)-glucane(s) totale correspondant à une prise journalière déterminée pour une prise journalière d'oligo-X3(1-3)-glucane(s) 25 de l'ordre de 100-1 000 mg, pour un adulte de 65 kg. 8/ - Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise une quantité d'oligo-3(1-*:3)-glucane(s) totale correspondant à une prise journalière d'oligo-3(143)-glucane(s) de l'ordre de 400 mg, pour un adulte de 65 kg. 2909553 26 9/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition est adaptée pour pouvoir être administrée par voie topique. 10/ -Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement des allergies de type choisi parmi : les allergies respiratoires, les allergies de contact, les allergies alimentaires, les allergies médicamenteuses, les allergies aux venins. 11/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir les réactions allergiques. 12/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite composition est adaptée pour pouvoir atténuer la néosynthèse et/ou les effets réaginiques des IgE.