Brevet FR2899471A1 — publié le 20071012

L'invention se place dans le domaine du traitement préventif et/ou curatif des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus par les cellules des épithélia de ces voies respiratoires. La mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF) est une maladie génétique autosomique récessive due à une mutation du gène CFTR, gène de 250 kb qui code pour une protéine de 1480 acides aminés appelée protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Cette protéine fait partie de la famille des canaux chlorures. A ce jour plus de 1000 mutations responsables de la maladie ont été décrites, mais la plus fréquente, (découverte en 1989), appelée AF508, est présente chez environ 70% des malades. Cette mutation consiste en la délétion d'un acide aminé, une phénylalanine en position 508, due à une mutation portant sur le dixième exon du gène. L'incidence des mutations dans la population se situe aux environs de 1 sur 3000 naissances, mais seuls les sujets homozygotes sont malades. L'espérance de vie est autour de 35 ans dans les pays développés. Les hétérozygotes ou porteurs sains, phénotypiquement normaux, représentent environ 4 % de la population générale. Une des principales conséquences de cette maladie est la modification de la composition du mucus (dont viscosité devient plus élevée que la normale) secrété principalement par les épithélia sécrétoires des muqueuses respiratoires et digestives. En effet, l'altération du canal CFTR provoque des changements des flux trans-épithéliaux d'ions qui rendent le mucus plus visqueux et plus épais, empêchant ainsi sa progression vers la glotte, chez les patients mucoviscidosiques. Cet excès de mucus et l'absence de clairance mucociliaire favorisent l'infection chronique par des bactéries opportunistes (Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Haemophilus influenzae), ce qui peut engendrer une réponse inflammatoire exacerbée au niveau des voies aériennes, caractérisée par un afflux massif de neutrophiles. Ces agents pathogènes sont responsables de la plupart des épisodes d'infections bronchiques. L'absence de contrôle de ce processus inflammatoire, souvent associé à une obstruction bronchique, provoque la destruction des tissus pulmonaires entraînant ainsi une perte progressive de la fonction respiratoire jusqu'au décès du malade. Cette maladie est également caractérisée par des troubles digestifs dus essentiellement à une insuffisance pancréatique exocrine présente chez 90 % des malades. Ces manifestations respiratoires et digestives dominent le tableau clinique, mais l'atteinte respiratoire conditionne le pronostic viral des patients. L'infection chronique à P. aeruginosa constitue le problème infectieux principal et marque le plus souvent un tournant évolutif péjoratif de la maladie. Certaines souches dites "mucoïdes" se développent au sein du mucus sous la forme de microcolonies entourées d'une matrice exopolysaccharidique. Ce caractère mucoïde est pratiquement spécifique de l'infection. L'incidence des souches mucoïdes augmente avec l'âge et l'évolutivité de la maladie respiratoire. L'atteinte bronchopulmonaire évolue par poussées qui conduisent en quelques mois ou plusieurs dizaines d'années à l'insuffisance respiratoire chronique. Des complications comme les pneumothorax récidivants ou des hémoptysies peuvent aggraver le pronostic vital. Le décès survient en règle générale à la suite d'une exacerbation des signes respiratoires d'allure infectieuse accompagnés de signes d'insuffisance cardiaque droite ou globale dans environ 1/3 des cas. A l'heure actuelle la mucoviscidose ne peut être traitée que de façon symptomatique. La prise en charge repose essentiellement sur la kinésithérapie respiratoire et un traitement anti-infectieux par antibiothérapie. Outre sa lourdeur, ce traitement doit être suivi à vie. L'antibiothérapie doit obéir à un certain nombre de principes généraux contraignants : choix approprié des antibiotiques, prévention des résistances du fait de la chronicité de l'infection bronchique, fortes posologies sur des cures de longues durées (cieux semaines au minimum), voie d'administration uniquement parentérale pour les antibiotiques antipyocyaniques. Des molécules permettent de fluidifier le mucus et notamment la rhDNase, enzyme catalytique d'hydrolyse de l'ADN extracellulaire qui permet de diminuer la viscosité du mucus alors plus facile à évacuer par la kinésithérapie. En cas d'insuffisance respiratoire chronique évoluée, une oxygénothérapie nocturne devient nécessaire. Mais, la transplantation pulmonaire reste l'ultime recours. II existe donc toujours une demande pour un traitement préventif et/ou curatif des symptômes qui n'aurait pas la lourdeur des traitements actuels (sans parler de la transplantation) et qui conférerait aux patients une amélioration de leurs conditions de vie. C'est un des buts de la présente invention. L'infection par un agent pathogène comme Pseudomonas aeruginosa entraîne l'activation de protéines inflammatoires comme la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2). Cette dernière se déplace vers la membrane plasmique pour hydrolyser les phospholipides et libérer de l'acide arachidonique (AA). L'AA est alors métabolisé par deux voies enzymatiques distinctes, impliquées dans l'inflammation : la voie des cyclooxygénases (COX) qui aboutit à la production de prostaglandines, en particulier la prostaglandine E2 (PGE2) ; et la voie des lipooxygénases qui aboutit à la production des leukotriènes, en particulier le leukotriène B4 (LTB4). Des études antérieures avaient montré la présence d'une quantité augmenté de leukotriène B4 (LTB4) et de prostaglandine E2 (PGE2) dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA) des patients atteints de mucoviscidose (patients CF). Cette augmentation a aussi été retrouvée dans un modèle animal de mucoviscidose chez des souris KO (Knock Out) dont le gène codant pour CFTR a été délété, donc ne produisant pas de protéine CFTR (souris mutantes dites CFTR'-). Il a par ailleurs été établi que le LTB4 et la PGE2 sont capables d'induire la sécrétion de mucus Les inventeurs ont montré que des souris CFTR' stimulées par instillation avec du lipopolysaccharide (LPS) de Pseudomonas aeruginosa qui provoque une inflammation des voies respiratoires, secrètent plus de mucus que des souris sauvages. Les inventeurs ont également montré que cette sécrétion de mucus est inhibée par l'aspirine, un inhibiteur des COX. Par instillation on entend une administration par voie aérienne, plus précisément par voie intratrachéale. Par ailleurs l'étude par les inventeurs de la sécrétion de mucus dans les voies respiratoires des souris KO dont le gène codant pour la cPLA2 a été délété (souris mutante cPLA24-) montre que celle-ci est totalement abolie. La cPLA2 joue donc également un rôle dans la régulation de sécrétion du mucus dans les voies respiratoires. Le mucus est constitué essentiellement de mucines (glycoprotéines) et MUC5AC est l'une des mucines les plus abondantes dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose. Là encore, les inventeurs ont pu montrer par marquage immunohistochimique que MUC5AC est bien exprimée chez les souris CFTR"'" qui présentent une augmentation de la quantité de mucus dans les voies respiratoires. À la lumière de ces résultats, la cPLA2 semble avoir une activité accrue chez les souris CFTR"/- et serait alors impliquée dans les voies de signalisation induisant une sécrétion excessive de mucus dans le poumon. Enfin, les inventeurs ont pu montrer que l'administration par voie intrapéritonéale d'un inhibiteur spécifique de la cPLA2 abolit totalement la sécrétion de mucus dans les voies respiratoires, sécrétion préalablement induite par instillation de LPS de Pseudomonas aeruginosa chez les souris CFTR'-, qui expriment la cPLA2 à des niveaux élevés par rapport aux souris CFTR+i+ Ces résultats, surprenants et inattendus, permettent de penser à un rôle thérapeutique pour les inhibiteurs de la cPLA2 dans les maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus comme par exemple la mucoviscidose, l'asthme, les maladies pulmonaires chroniques obstructives (MPOC) comme par exemple les laryngites et pharyngites, les pneumonies, les grippes, les pneumoconioses, la bronchite chronique et l'emphysème ou encore l'asthme aspergillaire. Ainsi l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traiternent des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus. Par inhibiteur de la cPLA2 on entend toute molécule chimique ou biologique, naturelle ou synthétique, toute composition qui, quel qu'en soit le mécanisme, induit après administration une diminution, voir une inhibition complète de l'activité de la cPLA2 ou l'expression du gène de la cPLA2. A titre d'exemple on peut citer comme inhibiteur de la cPLA2, l'ATK (Arachidonyl Trifluoromethyl Ketone ; Ackermann et al., J. Biol. Chem., 1995; 270 : 445-50), la Pyrrolidine-1 (Seno et al., J. Med. Chem. 2000 ; 43: 1041-44), le MAFP (Methyl arachidonyl fluorophosphonate : Lio et al., Biochim. Biophys. Acta ; 1996 ; 1302: 55-60), le ML3196 (Lehr, J. Med. Chem., 1997, 40 : 2694-2705), le BMS-229724 (4-[4-[2-[2-[bis(4-chlorophényl)méthoxy]éthylsulfonyl]éthoxy]phényl]-1,1, 1-trifluoro-2-butanone) (Burke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 298: 376-85), l'acide 3,3-Dimethyl-6-(3-lauroylureido)-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3,2,0] heptane-2-carboxylique ou encore les indoles décrits dans la demande internationale WO 03/048122. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, l'inhibiteur de la cPLA2 est un siRNA interférant avec l'expression du gène de la cPLA2. Préférentiellement, l'inhibiteur de la cPLA2 utilisé selon l'invention est I'ATK. Selon une autre forme de mise en oeuvre de l'invention, il est possible d'utiliser une combinaison d'inhibiteurs de la cPLA2 (2 ou plus) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus. Selon l'invention, l'inhibiteur de la cPLA2 est utilisé dans la préparation d'un médicament destiné au traitement de la mucoviscidose, l'asthme, les maladies pulmonaires chroniques obstructives (MPOC) comme par exemple les laryngites et pharyngites, les pneumonies, les grippes, les pneumoconioses, la bronchite chronique et l'emphysème ou encore l'asthme aspergillaire. Selon l'invention l'inhibiteur de la cPLA2 peut être utilisé dans le médicament en une quantité comprise entre 0,01 mg à 2g, préférentiellement de 1 mg à 1g, très préférentiellement de 10mg à 500mg. Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres ingrédients ou traitements, tels que notamment d'autres composés actifs pour traiter les pathologies ou traumatismes spécifiés dans la présente demande. Le médicament selon l'invention peut prendre toutes les formes imaginables pour son administration. Par exemple il peut être liquide comme un sirop ou une solution pour injection intramusculaire ou intraveineuse ou solide comme par exemple une poudre ou un comprimé. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée. S'agissant d'un traitement à long terme, la voie d'administration préférée sera sublinguale, orale ou transcutanée. En général la dose journalière d'inhibiteur de la cPLA2 utilisée selon l'invention sera la dose minimum pour obtenir l'effet thérapeutique recherché. Cette dose dépendra de différents facteurs comme du poids du sujet à traiter. Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le composé, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine. Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint d'une pathologie tel que définie ci-dessus. Les médicaments selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est-à-dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les médicaments peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons. Les exemples qui suivent illustrent l'invention sans la limiter aucunement. Matériel et Méthodes ^ Modèles animaux Les études ont été effectuées sur un modèle de mucoviscidose établi chez des souris C57BL/6J (souris Cft?'u"c) maintenues sur un fond génétique mixte par le "Centre de Distribution, de Typage et d'Archivage Animal" UPS44 CNRS à Orléans. Les souris sauvages CFTR+'+ et mutantes CFTR-'" ont été sevrées à 3-4 semaines et nourries avec une alimentation supplémentée avec un laxatif commercial, le Movicol . En effet, en absence de laxatif les souris CFTR"'" décèdent rapidement après le sevrage, suite à des occlusions intestinales consécutives à une altération de la sécrétion de fluides dans le tractus digestif. Les expériences ont été menées sur des groupes d'au moins 5 souris par catégories de traitement, âgées de 5-7 semaines. Des souris mutantes cPLA24- et leurs homologues sauvages cPLA2+'+, de même fond génétiques ont été obtenues auprès du "Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Tokyo" (Uozomi et al., Nature, 1997). Ces souris étaient âgées de 6-8 semaines au moment de l'expérience. ^ Produits et réactifs utilisés Xylazine (Rompum, Bayer-France) Kétamine (Irnalgènel000 Merial, Lyon-France) LPS de P. aeruginosa, sérotype 10 (Sigma, St.Louis, MO) EDTA, phénylméthylsulphoxide et dithiothréitol (Sigma, St.Louis, MO) Anticorps anti-MUC5AC (clone 45 M1, Neomarkers, Fermont, CA, USA) Anticorps anti-IgG de souris (Dako Cytomation Envision System). Amino Ethyl Carbazol (Sigma, St. Louis, MO). ^ Protocole expérimental Les produits utilisés ont été dissous dans de la solution saline injectable (ou sérum physiologique) et injectés par voie intratrachéale (i.t.) ou intrapéritonéale (i.p.). Le protocole d'utilisation était le suivant : 1) Aspirine (50 mg/Kg, i.p.), 30 min avant le LPS, ensuite chaque jour, une fois par jour ; 2) ATK (20 rng/Kg, i.p.), 30 min avant le LPS et 24 h après. Les souris ont été anesthésiées avec la Xylazine 2 % (8 mg/Kg) et la Kétamine 1000 (40 mg/Kg) avant l'instillation du LPS (330 pg/Kg, i.t.). Les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et les prélèvements des poumons ont été effectués 4 jours après l'instillation du LPS, comme indiqué ci-dessous : ^ Lavages bronchoalvéolaires Les souris ont été anesthésiées avec du Pentobarbital (i.p.) à 200 mg/Kg et leurs trachées incisées et canulées. Les LBA ont été effectués avec des lavages successifs par 1 ml de solution saline injectable contenant 5 mM d'EDTA et des inhibiteurs de protéases (phénylméthylsulphoxide : 5 mM, dithiothréitol 5 mM). Le comptage des cellules a été effectué par un compteur automatique Counter ZM (Coultronic, Margency, France). Cela permet de mettre en évidence l'état d'inflammation des poumons. L'identification des types cellulaires a été obtenue par coloration Diff-Quick (Baxter Dade AG, Dudingen, Germany) après cytocentrifugation (Hettich-Universal). Cela permet de compter la proportion des cellules polynucléaires neutrophiles qui reflètent l'inflammation. Les résultats sont exprimés en nombre de cellules par ml de LBA. ^ Fixation des poumons et analyses histologiques Les poumons ont été perfusés par du formaldéhyde à 4%, pour éliminer le sang et immergés dans 4 % de formaldéhyde pendant 48 h à 4 C avant d'être inclus dans la paraffine. Des coupes de 5 pm d'épaisseur ont été colorées avec l'Hemotoxylin/Eosin, le periodic acid-Schiff (PAS) et le bleu Alcian (Alcian blue : AB ; pH 2,4) selon les méthodologies standards (Histologie Normale et Pathologique. P. GANTER & G. Jolies, éditions Gauthier-Villars). Après lecture au microscope des coupes colorées au bleu Alcian, qui colore le mucus, un comptage des bronches et des cellules positives est réalisé. Le rapport nombre de bronches positives / nombre de cellules positives permet d'établir le score qui sert à évaluer les résultats des études de production de mucus (voir infra). ^ Immunohistochimie Les sections de paraffine ont été traitées avec l'anticorps dirigé contre MU5AC (clone 45 M1) pendant 2 h à température ambiante, à la concentration de 8 pg/ml dans du PBS 1X. Ces sections ont été ensuite lavées avec du PBS et incubés 30 min avec 15 l'anticorps anti-IgG de souris, conjugué avec de la peroxydase. Les révélations ont été effectuées avec de l'Amino Ethyl Carbazo. Résultats : - Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+i+ et CFTR'" au 4ième jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. 20 aeruginosa. Les souris contrôle ont reçu une dose de sérum physiologique. Tableau 1 : J4 Score Moyen CFTR+'+ . Contrôle 0 CFTR+~+ LPS 0,8 CFTR-- Contrôle 2 CIFTR-- LPS 5 Ces résultats montrent l'implication du gène CFTR et de la protéine CFTR 25 dans la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique. > Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+i+ et CFTR'- au 4tème jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa et avec administration d'aspirine (asp) Les souris contrôle ont reçu une dose de sérum physiologique et une dose d'aspirine. Tableau 2 J4 Score Moyen CFTR+'+ Contrôle+ asp 0,25 CFTR+'+ LPS + asp 0 CFTR"'" Contrôle + asp 0,5 CFTR"'" LPS + asp 0 Les scores obtenus sont à comparer aux scores correspondants du tableau 1. Ces résultats montrent qu'un inhibiteur de COX entraîne une inhibition de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique, et confirme l'implication des COX dans cette production. - Production de mucus dans les voies respiratoires de souris CFTR+'+ et CTFR"'" au 4ième jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa et administration d'ATK. Les souris contrôle ont reçu une dose de sérum physiologique et une dose d'ATK. Tableau 3 J4 Score Moyen CFTR+'+ Contrôle + ATK 0 CFTR+'+ LPS + ATK 0,5 CFTR"'" Contrôle + ATK 0 CFTR"'" LPS + ATK 0,17 Les scores obtenus sont à comparer aux scores correspondants du tableau 1. Ces résultats montrent qu'un inhibiteur de la cPLA2 entraîne une inhibition de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique. > Production de mucus dans les voies respiratoires de souris cPLA2+'+ et cPLA2"'" au 4ième jour avec ou sans stimulation par le LPS de P. aeruginosa. Les souris contrôle ont reçu une dose de sérum physiologique. Tableau 4 J4 Score Moyen cPLA2+'+ Contrôle 1,5 cPLA2+'+ LPS 3,33 cPLA2-'- Contrôle 0 cPLA2-'- LPS 0 Ces résultats démontrent l'implication de la cPLA2 dans la production de 5 mucus par les cellules de l'épithélium bronchique. Analyses histologiques et études immunohistochimiques Les analyses histologiques ou immunohistochimiques, pratiquées sur des coupes des poumons des souris confirment les résultats obtenus dans les 10 mesures de la production de mucus par les cellules de l'épithélium bronchique. REVENDICATIONS 1. Utilisation d'au moins un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2) dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies des voies respiratoires conduisant à une sécrétion accrue de mucus. 2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est toute molécule chimique ou biologique, naturelle ou synthétique, ou toute composition qui induit après administration une diminution, voir une inhibition complète de l'activité de la cPLA2 ou de l'expression du gène codant pour la cPLA2. 3. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est choisi parmi l'ATK, la Pyrrolidine-1, le MAFP, le ML3196, le BMS-229724, l'acide 3,3-Dimethyl-6-(3- lauroylureido)-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3,2,0] heptane-2-carboxylique, un siRNA ou encore des indoles 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est l'ATK. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans le traitement de la mucoviscidose, l'asthme, les maladies pulmonaires chroniques obstructives (MPOC) comme par exemple les laryngites et pharyngites, les pneumonies, les grippes, les pneumoconioses, la bronchite chronique et l'emphysème ou encore l'asthme aspergillaire. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la cPLA2 est utilisé dans le médicament en une quantité cornprise 0,01 mg à 2g, préférentiellement de 1 mg à 1 g, très préférentiellement de 10mg à 500mg. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans un traitement préventif, curatif ou palliatif, ainsi que dans la prise en charge des patients. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le médicament est liquide ou solide, comme par exemple une poudre ou un comprimé.9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le médicament est destiné à être administré par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intrathécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire.