Brevet FR2901135A1 — publié le 20071123

La présente invention concerne des agents capables de diminuer et/ou inhiber la prolifération des kératinocytes, et leur utilisation pour le traitement de désordres de la prolifération ou de la différenciation des kératinocytes; elle concerne la modulation de l'équilibre entre différenciation et prolifération des kératinocytes en vue d'améliorer l'aspect esthétique d'un individu, notamment dans des compositions cosmétqiues pour ralentir la croissance des poils. Elle concerne également le traitement des désordres d'hyper prolifération de la peau ou du cheveu tel que des désordres dermatologiques comme le psoriasis ou encore l'hirsutisme. La peau est constituée de deux compartiments, l'un superficiel, l'épiderme, et un plus profond, le derme, qui interagissent. L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau, notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures appelé "fonction barrière". L'épiderme est conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes constituant la couche germinative de l'épiderme, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyédriques disposées sur les couches germinatives, une à trois couches dites granuleuses constituées de cellules aplaties contenant des inclusions cytoplasmiques distinctes, les grains de kératohyaline et enfin la couche cornée (ou stratum corneum), constituée d'un ensemble de couches de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes. Les cornéocytes sont des cellules anucléées principalement constituées d'une matière fibreuse contenant des cytokératines, entourée d'une enveloppe cornée. Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée majoritairement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale. Ces composants sont synthétisés par les fibroblastes. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. Enfin, le derme est traversé par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses. La cohésion entre l'épiderme et le derme est assurée par la jonction dermo-épidermique. Il y a en permanence dans l'épiderme une production de nouveaux kératinocytes pour compenser la perte en continu de cellules épidermiques au niveau de la couche cornée. L'équilibre entre le mécanisme de prolifération des cellules de la couche basale et la différenciation des cellules épidermiques, ou homéostasie épidermique, permet le maintien de la peau dans un état physiologique et assure une épaisseur constante de l'épiderme. Cet équilibre peut être perturbé au profit de la prolifération cellulaire, aboutissant à un épaississement anormal de l'épiderme. Cette anomalie est observée dans certaines pathologies telles que le psoriasis. Par ailleurs, on peut souhaiter réguler les mécanismes de prolifération des cellules de la couche basale pour moduler certaines caractéristiques, et en particulier pour lutter contre la pilosité excessive et l'hirsutisme ou pour freiner et/ou ralentir la repousse du poil sur certaines zones corporelles que l'on désire maintenir lisse dans un but esthétique. Il existe donc toujours un besoin de trouver de nouveaux agent pour limiter la prolifération des cellules épithéliales de l'épiderme de la peau encore du follicule pileux. Dans ce dernier cas la couche basale étant remplacée par une tige pilaire. C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse, pour la préparation d'une composition destinée à diminuer et/ou retarder les désordres liés à une hyperprolifération des cellules épidermiques; la composition contient généralement un milieu physiologiquement acceptable. En effet, il a été trouvé de manière inattendue dans le cadre de l'invention, que de tels composés peuvent limiter la prolifération des kératinocytes. Les inventeurs ont en effet mis en évidence que la glycolyse anaérobie est maximale dans les kératinocytes au cours de la phase de prolifération. En revanche, la différenciation se caractérise par une diminution importante de la glycolyse, sans modification qualitative de celle-ci. La glycolyse permet la production d'énergie dans la cellule par oxydation du glucose et formation de pyruvate; le sort du pyruvate sera différent selon les cellules dans lesquelles il est formé et selon le type de métabolisme (aérobique ou anaérobique) réalisé dans ces cellules. Par composé inhibiteur de glycolyse, on entend des composés diminuant la réaction par laquelle le glucose est métabolisé dans les cellules, c'est-à-dire assimilé, utilisé ou consommé par les cellules. Cette diminution peut intervenir par le biais des différents effecteurs de la réaction, notamment en diminuant la quantité de substrat disponible, ou en inhibant des enzymes la catalysant. Le transport du glucose dans la plupart des cellules de mammifères est régulé par une famille de protéines membranaires appelé "glucose transporter", aussi désigné par GLUT. Au moins 13 protéines sont codées par une famille de gènes apparentés, ces protéines présentant différents domaines transmembranaires. L'expression des différentes isoformes de GLUT varie en fonction du tissu et des conditions hormonales et environnementales. Les kératinocytes expriment au moins 4 types de transporteurs de glucose, GLUT-1, 2, 3 et 5. Shen et al (J. Invest. Dermatol., 2000) ont décrit les variations de taux de transporteurs dans des kératinocytes murins. Lors de la différenciation, ils observent une augmentation de l'expression de GLUT-3 et une diminution de celle de GLUT-1, 2 et 5. Ils indiquent que la stimulation des kératinocytes en cours de différentiation par l'insuline ou l'IGF n'a pas d'effet sur l'expression de ces GLUT. En revanche, l'insuline active la translocation (du cytoplasme à la fraction membranaire) des GLUT-1 et 5, et l'IGF-1 active la translocation des GLUT-2 et 3 pendant la phase de prolifération. Les auteurs concluent qu'il serait intéressant de comparer les variations entre une peau normale et la peau de sujets diabétiques. US 2003/0187036 propose l'utilisation de dérivés de biguanides pour favoriser la cicatrisation des lésions cutanées telles que les ulcères survenant chez les diabétiques, ou d'autres blessures. US 2005/0037440 se rapporte à l'identification de facteurs de longévité chez les mammifères, et au rôle du facteur cJUN et de la modulation du signal JNK. Il suggère ainsi d'utiliser des agents diminuant l'activité d'un indicateur comme DAF-14, la superoxyde-dismutase, GLUT-1 ou GLUT-4 pour lutter contre les signes du vieillissement causés principalement par le stress oxydatifs. DE 10259966 décrit des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques contenant des acides aminés de type mycosporine et améliorant la capture de l'oxygène; ces composés induisent notamment une réduction de l'expression de GLUT-1. Les compositions peuvent notamment être appliquées pour le traitement du vieillissement de la peau.35 Cependant, à la connaissance des inventeurs, il n'a jamais été proposé d'utiliser des composés inhibiteurs de la glycolyse pour corriger des désordres cutanés caractérisés par des états d'hyper prolifération épidermique. Selon l'un des aspects de l'invention, au moins un inhibiteur de glycolyse est un inhibiteur des peptides transporteur du glucose (GLUT). Par composé inhibiteur des peptides transporteurs du glucose on entend à la fois des composés diminuant la quantité de GLUT et des agents diminuant leur activité intrinsèque. Les agents diminuant la quantité de GLUT sont notamment des composés diminuant sa synthèse, en particulier en diminuant l'expression ou la transcription du gène correspondant. Les agents diminuant l'activité intrinsèque de GLUT sont notamment des agents empêchant la translocation de la protéine dans la membrane cellulaire ou l'entrée du glucose dans ce système de transport actif. De préférence, les inhibiteurs de peptides transporteurs GLUT sont des inhibiteurs de GLUT-1, GLUT-2 et/ou GLUT-3, en particulier ils sont inhibiteurs de GLUT-1. Il peut s'agir d'inhibiteur spécifique d'un ou plusieurs de ces transporteurs, ou d'inhibiteurs non spécifiques. Il a été montré dans le cadre de l'invention que les transporteurs de glucose, en particulier GLUT-1 et GLUT-2, varient en fonction de l'état de prolifération / différenciation des kératinocytes et sont impliqués dans l'homéostasie épidermique. La modification de leur activité peut donc influer sur le contrôle de l'équilibre prolifération/ différenciation. Selon un autre aspect de l'invention, au moins un composé inhibiteur de glycolyse est un inhibiteur d'au moins une enzyme choisie parmi l'hexokinase, les phosphofructo kinases (PFK) et la pyruvate kinase. La glycolyse, appelée aussi phase anaérobie de l'oxydation du glucose, comprend deux phases principales: une première chaîne de réaction aboutit à la formation de 1,6 fructose di-phosphate, qui est ensuite dégradé en pyruvate, avec la production d'ATP. La première phase fait intervenir des kinases plus ou moins spécifiques, telles que l'hexokinase; lors de la seconde phase, la pyruvate kinase catalyse le transfert du groupe phosphate pour former de l'ATP et du pyruvate. En conditions anaérobies, la LDH catalyse ensuite la transformation du pyruvate en lactate. La PFK-1 (phosphofructo kinase 1) est une enzyme clé de la glycolyse. Elle phosphoryle le fructose-6-phosphate en fructose-1,-6 bis-phosphate avant la transformation de ce dernier en pyruvate. Cette phosphorylation est donc une étape de contrôle de la glycolyse. L'activité du PFK-1 est contrôlée par de nombreux effecteurs allostériques, parmi lesquels, le fructose-2,6-bisphosphate (Fru-2,6-P2) est le plus puissant stimulateur connu et résulte de la phosphorylation du fructose-6- phosphate par la PFK-2. Les mesures de concentration en Fru-2,6-P2, réalisées sur des kératinocytes en culture, montrent qu'elle est maximale en prolifération pour atteindre des valeurs minimales en différenciation. De plus, un parallélisme assez strict entre les variations du flux glycolytique et la concentration en Fru-2,6-phosphate est observé. Il a été montré dans le cadre de l'invention que la diminution de la synthèse de Fru-2,6-P2 et la réduction de l'activation qu'exerce Fru-2,6-P2 sur PFK1, se traduit par une diminution des paramètres de prolifération épidermique. Les composés inhibiteurs d'enzymes utiles selon l'invention peuvent choisis dans le groupe comprenant les agents diminuant la synthèse desdites enzymes et les agents diminuant leur activité intrinsèque. Il peut s'agir d'agents diminuant l'expression ou la traduction du gène correspondant, ou encore d'inhibiteurs fonctionnels compétitifs ou non compétitifs de l'enzyme. Des exemples de composés inhibiteurs de glycolyse utiles pour la mise en oeuvre de l'invention peuvent être choisis parmi l' iodoacétamide, les agents alkylants, la 5- aminoimidazole-4-carboxamide-1-b- ribofuranosyl 5'-monophosphate (AICAR), les analogues de l'AMP, le 2-deoxyglucose, les inhibiteurs de la voie du facteur 1 inductible par l'hypoxie , les inhibiteurs de la PI 3- kinase, la tunicamycine, cyclohexamide, cytochalasine-B, phlorétine, phlorizine et glucuronide de phlorizine et 4-deoxyphlorétine-2-D-glucose et tout composé inhibiteur fonctionnel de la glycolyse épidermique. D'autres composés utiles selon l'invention pourront être identifiés par le procédé comprenant les étapes suivantes: a) mise en culture de kératinocytes b) ajout du composé à tester dans le milieu de culture c) comparaison du taux de glycolyse dans les kératinocytes en présence du composé à tester avec le taux de glycolyse dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester d) sélection du composé qui provoque une diminution significative du taux de glycolyse, notamment une diminution d'au moins 25% du taux de glycolyse, voire d'au moins 30%. L'étape a) peut être effectuée selon des modalités connues de l'homme du métier, par exemple en milieu autocrine ou en milieu complet en présence de facteurs de croissance tels que EGF, insuline, et extraits de glande hypophysaire. Lors de l'étape b), le composé à tester est ajouté à des concentrations compatibles avec la viabilité des cellules et généralement de 10-2 à 10-9 M. II sera laissé en contact avec la culture cellulaire pendant un temps suffisant pour être métabolisé par les cellules, généralement supérieur ou égal à 12 heures. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le taux de glycolyse à l'étape c) sera mesuré dans des kératinocytes en phase de prolifération. Selon un autre mode de réalisation, une mesure de ce taux de glycolyse et de sa variation induite par le composé à tester sera également effectuée dans une population de kératinocytes en phase de différenciation. La diminution du taux de glycolyse sera mesurée par comparaison à celui observé dans un échantillon témoin cultivé en l'absence de composé à tester; toutes les autres conditions de culture de l'échantillon témoin sont identiques. Cette étape de mesure de la glycolyse épidermique, peut le cas échéant, être directement quantifiée soit par la mesure de l'activité PFK1 et/ou soit par la mesure de la consommation et/ou du transport de glucose et/ou soit par la mesure du taux de GLUT exprimé par les cellules et/ou soit par le taux de lactate (produit final de réaction) produit au cours de la réaction globale. A l'étape d), on sélectionne les composés provoquant une diminution significative de la glycolyse épidermique, quantifiée notamment par la mesure de l'un des paramètres ci-dessus. Les effets des composés identifiés par le procédé décrit ci-dessus sur le niveau d'expression de GLUT-1 pourront être évalués dans une deuxième temps. Cette évaluation pourrait être réalisé selon les étapes suivantes : a) mise en culture de kératinocytes b) ajout du composé à tester dans le milieu de culture c) comparaison du niveau d'expression de GLUT-1 dans les kératinocytes en présence du composé à tester, avec le niveau d'expression dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester d) sélection du composé qui diminue d'au moins 25% de l'expression de GLUT-1. 5 L'étape a) peut être effectuée selon des modalités connues de l'homme du métier, par exemple en milieu autocrine ou en milieu complet en présence de facteurs de croissance tels que EGF, insuline, et extraits de glande hypophysaire. Lors de l'étape b), le composé à tester est ajouté à des concentrations compatibles avec 10 la viabilité des cellules et généralement de 10-2 à 10-9 M. II sera laissé en contact avec la culture cellulaire pendant un temps suffisant pour être métabolisé par les cellules. Ce temps est généralement supérieur ou égal à 12 heures. Le niveau d'expression à l'étape c) sera mesuré de préférence dans des kératinocytes en phase de prolifération; cette expression sera comparée à celle-ci observée dans un 15 échantillon témoin cultivé en l'absence de composé à tester, toutes les autres conditions de culture étant identiques. Cette étape de mesure du niveau d'expression de GLUT-1, sera effectuée par des méthodes connues de l'homme du métier. L'expression peut, par exemple, être directement quantifiée soit par la quantification du signal suite aux immunomarquages des 20 kératinocytes avec un anticorps spécifique pour le GLUT-1, soit par la quantification par RT-PCR des mRNA codant pour le GLUT-1 et/ou soit par la mesure de l'expression de la protéine par Western blot. A l'étape d) on sélectionne les composés induisant une diminution de l'expression de GLUT-1 et/ou la diminution d'au moins un des paramètres décrits ci-dessus. 25 L'invention comprend également des procédés de criblage de composés inhibiteurs de glycolyse comprenant les étapes permettant de mesurer la variation du taux de glycolyse ou du niveau d'expression de GLUT-1 telles que décrites dans ce qui précède. 30 Des composés régulant le métabolisme du glucose en diminuant le transport du glucose dans les cellules, plus particulièrement dans les kératinocytes, peuvent inhiber leur prolifération. Cette inhibition est objectivée notamment par diminution de l'incorporation de thymidine tritiée Les compositions selon l'invention seront ainsi utiles pour lutter contre les désordres de la prolifération et seront notamment destinées au traitement du psoriasis ou de l'hirsutisme. Les composés inhibiteurs de glycolyse selon l'invention seront également utiles comme agent cosmétique pour lutter contre l'apparition des poils et/ou ralentir leur croissance sur la peau et ses annexes, et pour prévenir ou diminuer la pousse des poils. Ils seront ainsi utiles en complément d'une épilation, qu'ils soient utilisés avant, en même temps ou après l'étape d'épilation par une méthode physique ou chimique d'élimination des poils, en particulier à visée esthétique. Par peau, on entend désigner dans le présent texte, la peau, les muqueuses et/ou le cuir chevelu. Par annexes de la peau on entend en particulier les phanères, c'est-à-dire les poils, les cils, les cheveux et/ou les ongles. Les compositions selon l'invention peuvent être des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, en particulier des compositions dermatologiques. Par milieu physiologiquement acceptable, on entend un milieu compatible avec la peau, les muqueuses ou les phanères. Il s'agit notamment d'un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable. La quantité de composé inhibiteur de glycolyse dans les compositions dépend de l'effet recherché et sera adapté par l'homme du métier pour obtenir une diminution de la prolifération des kératinocytes. A titre d'exemple, la quantité d'agent inhibiteur de glycolyse ou du transport du glucose peut varier de 0,0001% à 10% et de préférence de 0,001 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition. De préférence les compositions sont des compositions cosmétiques, c'est-à-dire destinée à améliorer l'aspect de l'individu. Pour une administration par la voie orale, la composition de l'invention peut se présenter sous toutes les formes adaptées, particulièrement sous forme d'une solution buvable, d'un comprimé, d'une gélule, d'une capsule ou encore d'un aliment nutritionnel ou d'un complément nutritionnel. 35 Ladite composition comprend en outre au moins un excipient approprié adapté à l'administration orale. Pour une administration par application topique sur la peau, les cheveux et/ou les muqueuses, la composition selon l'invention comprend bien évidemment un support cosmétiquement acceptable, c'est à dire un support compatible avec la peau, les muqueuses, les ongles, les cheveux et peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une application topique, notamment sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou multiple, d'un gel aqueux ou huileux, d'un produit anhydre liquide, pâteux ou solide, d'une suspension ou d'une dispersion; par exemple une dispersion d'huile dans une phase aqueuse à l'aide de sphérules, ces sphérules pouvant être des nanoparticules polymériques telles que les nanosphères et les nanocapsules ou mieux des vésicules lipidiques de type ionique et/ou non-ionique. Cette composition peut être plus ou moins fluide et avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, d'une pâte, d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol. Elle peut également se présenter sous forme solide, et par exemple sous forme de stick. Elle peut être utilisée comme produit de soin, comme produit de nettoyage ou comme produit de maquillage. De façon connue, la composition de l'invention peut contenir les adjuvants habituels dans les domaines cosmétiques et dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les pigments, les agents chélateurs, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 % à 20 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse, dans les vésicules lipidiques et/ou dans les nanoparticules. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en poids, et de préférence de 5 % à 50 % du poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. L'émulsionnant et le coémulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 0/0 à 20 % du poids total de la composition. Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales, les huiles d'origine végétale (huile d'abricot, huile de tournesol), les huiles d'origine animale, les huiles de synthèse, les huiles siliconées et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut aussi utiliser comme matières grasses des alcools gras (alcool cétylique), des acides gras, des cires (cire d'abeilles). Comme émulsionnants et coémulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple les esters d'acide gras et de polyéthylène glycol tels que le stéarate de PEG-40, le stéarate de PEG-100, les esters d'acide gras et de polyol tels que le stéarate de glycéryle et le tristéarate de sorbitane. Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer en particulier les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras, la silice hydrophobe et les polyéthylènes. La composition peut contenir en outre au moins un autre actif choisi parmi les filtres anti- UV, les agents hydratants, les dépigmentants, les agents anti-glycation, les inhibiteurs de NO synthase, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou épidermiques et/ou empêchant leur dégradation, les agents stimulant la prolifération des fibroblastes ou la différenciation des kératinocytes, les agent myorelaxant ou dermodécontractant, les agents tenseurs, les agents anti-pollution ou anti-radicalaire, les agents apaisants et les actifs sur le métabolisme énergétique des cellules. Les agents stimulant la différenciation des kératinocytes comprennent par exemple les minéraux tels que le calcium ; un extrait peptidique de lupin tel que celui commercialisé par la société SILAB sous la dénomination commerciale Structurine ; le beta-sitosteryl sulfate de sodium tel que celui commercialisé par la société SEPORGA sous la dénomination commerciale Phytocohésine ; et un extrait hydrosoluble de maïs tel que celui commercialisé par la société SOLABIA sous la dénomination commerciale Phytovityl ; un extrait peptidique de Voandzeia substerranea tel que celui commercialisé par la société Laboratoires Sérobiologiques sous la dénomination commerciale Filladyn LS 9397 ; et les lignanes tels que le sécoisolaricirésinol. L'invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique pour prévenir ou diminuer la prolifération des kératinocytes en vue d'améliorer l'aspect d'un individu, et notamment pour ralentir ou empêcher la pousse des poils, dans lequel on applique sur la peau ou ses annexes au moins un composé inhibiteur de glycolyse tel que défini précédemment. Le composé sera de préférence appliqué dans une composition cosmétique, l'application pouvant être quotidienne, pluri-quotidienne ou hebdomadaire. Elle pourra être poursuivie pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines, par exemple pendant 1 à 2 mois puis reprise après une interruption, ou bien être continue. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes Figure 1: Coupes histologiques de peau humaine montrant l'expression différentielle des transporteurs GLUT-1 et GLUT-2 dans l'épiderme. GLUT-1 est exprimé en phase de prolifération et GLUT-2 en phase de différenciation. GLUT-1 est visualisé dans les couches basales de l'épiderme et GLUT-2 dans les couches différenciées jusqu'au stratum corneum. Figure 2: Concentrations du fructose-2,6-bisphosphate (Fru-2,6-P2) mesurées dans des kératinocytes en phase de prolifération ou de différenciation. Figure 3: Effet de l'AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-b-ribofuranosyl 5'-monophosphate), un inhibiteur du transport du glucose, sur la prolifération des kératinocytes. Exemple 1: Evolution de la glycolyse dans les kératinocytes Les kératinocytes épidermiques humains sont isolés, selon la technique décrite par Wille et al. (1984), à partir d'échantillons de peau normale provenant d'abdominoplastie. Les kératinocytes sont tout d'abord cultivés en culture primaire dans un milieu complet sans sérum (milieu de base KBM, Cambrex, additionné d'EGF, d'insuline, d'hydrocortisone, d'extrait de glande hypophysaire bovine et de gentamycine). Les kératinocytes en prolifération provenant de cultures sous-confluentes sont trypsinisés (trypsine/EDTA 1X, Invitrogen) et ensemencées à raison de 10 X 103 cellules/cm2 dans le même milieu complet. Lorsque les cellules recouvrent environ 40% de la surface de culture, les kératinocytes synthétisent leurs propres facteurs de croissance en quantité suffisante. Le milieu complet est alors remplacé par un milieu autocrine contenant uniquement le milieu de base, l'hydrocortisone et la gentamycine. Les cultures sous-confluentes de kératinocytes en prolifération correspondent à 24h de culture autocrine. L'entrée en confluence des cellules (3 jours après la mise en culture autocrine) induit l'arrêt de la prolifération cellulaire et marque l'initiation du processus de différenciation (Poumay et Pittelkow, 1995 ; Poumay et al., 1999a). Les cultures post-confluentes de kératinocytes en différenciation correspondent à 6 jours de culture autocrine (ou 3 jours de culture confluente). Le taux de glycolyse est mesuré par la mesure de la détritiation du [2-3H]Glucose (uptake de glucose) et du [3-3H]Glucose (flux glycolytique). La capture de glucose (transport et phosphorylation du glucose) est évalué par la vitesse de détritiation du [2-3H]glucose tandis que le flux gycolytique au travers de la PFK1 est estimé par la vitesse de détritiation du [3-3H]glucose. Les kératinocytes cultivés en condition autocrine sont incubés en présence de milieu frais contenant 6 mM de glucose. Après 2 heures, le tracer radioactif ([2-3H]glucose ou [3-3H]glucose) est ajouté au milieu de culture (0,25 Ci/ml). Après 30 à 60 minutes d'incubation, le milieu de culture est récupéré pour mesurer la formation de 3H2O. Ces échantillons sont tout d'abord déprotéinisé sur glace par de l'acide perchlorique (7% final). Après neutralisation par duKOH/KHCO3 3M/3M, les échantillons sont centrifugés (1000g, 10 min, 4 C). Le 3H2O est séparé du glucose radioactif par chromatographie sur colonne (résine échangeuse AGX8 sous forme borate). Les résultats sont exprimés en nmole de glucose détritié par heure et par pg de protéines. Dosage du lactate. Le dosage du lactate s'effectue par mesure de la formation de NADH (lecture à 340 nm) par la lactate dehydrogenase (LDH). La réaction s'effectue en présence de 25 à 100 pl de milieu de culture déprotéinisé et neutralisé (voir Mesure du [2-3H]Glucose et du [3-3H] Glucose ), de tampon hydrazine pH 9,3 (hydrazine sulfate 0,4 M, Glycine 1M, EDTA 5 mM), de 2 mM final de NAD. Après une première lecture à 340 nm (E0), la réaction est initié par 50 pg LDH. La deuxième lecture à 340 nm s'effectue au plateau de réaction (après environ 30 min) (El). On observe les résultats suivants : Le tableau 1 montre le métabolisme du glucose dans les kératinocytes en prolifération et en différenciation, en présence ou non de facteurs de croissance (respectivement culture autocrine et culture en milieu complet). Les valeurs sont exprimées en nmoles/ g protéines/h et représentent la moyenne SD d'au moins 3 expériences indépendantes. Transport de Flux glycolytique Production de glucose lactate Autocrine en prolifération 0,65 0,07 0,99 0,19 1,62 0,20 Autocrine en 0,20 0,05 0,21 0,05 0,43 0,05 différenciation Complet en prolifération 1,17 0,11 1,52 0,21 3,04 0,33 (facteurs de croissance) Complet en 0,53 0,13 0,43 0,03 0,75 0,05 différenciation (facteurs de croissance) a) au cours des phases de prolifération la glycolyse est maximale dans des kératinocytes. Cette glycolyse est de type anaérobie avec une production de 2 lactates pour un glucose consommé. Quelques soient les conditions expérimentales, la glycolyse épidermique est de type anaérobie et conduit à la production de deux lactates par molécule de glucose. Les valeurs obtenues sont comparables à celles observées dans des cellules à très haut degré énergétique comme les cellules musculaires en contraction : cellules des muscles striés ou du muscle cardiaque. b) La différenciation induit une diminution importante de la glycolyse. En conclusion, les phases de prolifération puis de différenciation de l'épithélium cutané sont corrélées au métabolisme du glucose. Au cours du passage en différenciation cette glycolyse diminue.25 Exemple 2: Contrôle de la glycolyse dans l'épiderme : Expression des Glut-1 et Glut- 2 Le transport du glucose s'effectue par diffusion facilitée via des transporteurs transmembranaires, les GLUTs (GLUT-1-12 et HIMT), dont l'expression varie en fonction des tissus et des conditions hormonales et environnementales. Les kératinocytes expriment au moins 4 types de transporteurs de glucose (GLUT-1,2 3 et 5). Détection en immunofluorescence de l'expression des GLUTs. Les échantillons de peau congelés dans un milieu d'enrobage et conservés à -80 C sont coupés au cryostat. Les coupes sont fixées dans l'acétone à 4 C pendant 10 min puis séchées à l'air. Les sites non spécifiques sont saturés par incubation dans un tampon PBS sans Ca/Mg (ICN Biomedicals) additionné de 0,1% de triton-X-100 et 10% de BSA (Albumine Bovine fraction V, MP Biomedicals) pendant 1h à 37 C en chambre humide. Les coupes sont ensuite incubées en présence de l'anticorps primaire spécifique (anti-GLUT-1, rabbit, Santa Cruz, 1/100 ; Ac anti-GLUT-2, rabbit, Santa Cruz, 1/100) dilué dans du PBS/BSA 1%/0,01% Triton-X-100) pendant 1h à 37 C en chambre humide. Après lavages dans le PBS, les coupes sont incubées en présence de l'anticorps secondaire anti-rabbit-Alexa Fluor 598 (Molecular Probe, 1/800, PBS/1% BSA/0,01% Triton-X-100) pendant 1h à 37 C en chambre humide. Les noyaux sont marqués par une incubation de 10 min avec du Hoescht (1/1000, PBS/BSA 1%/0,01% Triton-X-100). Les coupes sont à nouveau lavées dans le PBS, montées et observées au microscope à fluorescence. Analyse, par Western blot, de l'expression des GLUTs dans des kératinocytes en culture. Les kératinocytes sont cultivés selon le protocole décrit en examplel . Les kératinocytes en prolifération sont prélevés à 1 jour de culture autocrine. Les kératinocytes en différenciation sont prélevés à 6 jours de culture autocrine. Pour la détection de GLUT-1, les kératinocytes sont lysés dans un tampon triton (Hepes 20 mM, pH 7.6, NaF 20 mM, KCI 30 mM, EDTA 1 mM, inhibiteurs de protéases et phosphatases, triton 1%). Pour la détection de GLUT-2, les kératinocytes sont lysés dans un tampon SDS (Tris 62,5 mM, pH 7.5, SDS 1%). Les protéines (15 pg/piste) sont séparées par gel SDS-Page 10% et transférées sur membrane de PVDF. Saturation des sites pendant 1h dans du TBS/Tween 0,1 %/lait 5%. L'anticorps primaire est incubé pendant l h dans le tampon de saturation (Anti-Glucose Transporter-1, Human (rabbit) Calbiochem, réf 400060, 1/1000 ; Anti-Glucose Transporter-2, rat (rabbit) Calbiochem, réf 400061, 1/1000). L'anticorps secondaire est incubé pendant 1 h (anticorps anti-rabbit/peroxydase Sigma A-0545, 1/20000) dans du TBS/ Tween 0,1%. Utilisation du kit ECL (Roche) pour la révélation. L'expression des transporteurs GLUT-1 et GLUT-2 est observée sur coupes d'épiderme de varier en fonction de la localisation épidermique : GLUT-1 est exprimée surtout dans les cellules en prolifération û la couche basale - alors que GLUT-2 est exprimée préférentiellement dans les cellules en différenciation (couches jusqu'au stratum corneum). L' expression préférentielle du GLUT-1 en phase de prolifération et du GLUT- 2 en phase de différenciation est également observée par technique des Western Blots où l'on observe une bande à 51 kDa. Les résultats sont présentés sur la figure 1 en annexe. Exemple 3: Modification de la prolifération cellulaire par un inhibiteur connu du transport du glucose : AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1 -b-ribofuranosyl-5'-monophosphate). Test de prolifération des kératinocytes par incorporation de thymidine tritiée. Les kératinocytes en culture autocrine sont incubés pendant 24 h en présence de 1 Ci de [3H]thymidine (Amersham). Après incubation, l'excès de thymidine tritiée est éliminé par lavages dans du PBS et le matériel cellulaire est précipité par l'acide trichloroacétique (TCA) 10 %. Les cellules sont ensuite lysées dans du SDS1%/NaOH 0,3 N. La radioactivité incorporée par les cellules est alors analysée par comptage de la radioactivité du lysat dans un compteur à scintillation B. Les résultats sont présentés sur la figure 3. Une diminution de la prolifération est constaté 72 heures après traitement des kératinocytes avec l'AICAR à la concentration de 1 mM. En accord avec ce résultat, on constate une diminution de l'expression du K10, un marqueurs des kératinocytes en phase de proliferation. Revendications 1- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse, pour la préparation d'une composition destinée à diminuer et/ou retarder les désordres liés à une 5 hyperprolifération des cellules épidermiques. 2- Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un composé inhibiteur de glycolyse est un inhibiteur des peptides transporteurs du glucose (GLUT) 3- Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins un composé inhibiteur de GLUT est choisi dans le groupe comprenant les agents diminuant la synthèse de GLUT et les agents diminuant son activité intrinsèque . 15 4- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un inhibiteur de GLUT-1, et/ou GLUT-3. 5- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une quelconque 20 des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé est un inhibiteur d'au moins une enzyme choisie parmi l'hexokinase, les phosphofructo kinases (PFK) et la pyruvate kinase. 6- Utilisation selon la revendication 5 caractérisé en ce que les composés inhibiteurs 25 d'au moins une enzyme sont choisis dans le groupe comprenant les agents diminuant la synthèse desdites enzymes et les agents diminuant leur activité intrinsèque. 7- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une quelconque 30 des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'au moins un composé est choisi parmi la l'iodoacétamide, les agents alkylants, la 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-b-ribofuranosyl 5'-monophosphate (AICAR), les analogues de l'AMP, le 2-deoxyglucose, les inhibiteurs de la voie du facteur 1 inductible par l'hypoxie, les inhibiteurs de la PI 3- kinase, la tunicamycine, cyclohexamide, 10cytochalasine-B, phlorétine, phlorizine et glucuronide de phlorizine et 4-deoxyphlorétine-2-D-glucose. 8- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être identifié par le procédé comprenant les étapes suivantes: a. Mise en culture de kératinocytes b. ajout du composé à tester dans le milieu de culture c. Comparaison du niveau de glycolyse dans les kératinocytes en présence du composé à tester, avec le taux de glycolyse dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester. d. sélection du composé qui provoque une diminution d'au moins 25% du taux de glycolyse. 9- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ce composé est susceptible d'être identifié par le procédé comprenant les étapes suivantes: i) mise en culture de kératinocytes ii) ajout du composé à tester dans le milieu de culture iii) comparaison du niveau d'expression du GLUT-1 dans les kératinocytes en présence du composé à tester avec le niveau d'expression dans un échantillon témoin cultivé sans composé à tester iv) sélection du composé qui diminue d'au moins 25 % l'expression de GLUT-1 10- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition est destinée au traitement d'un désordre choisi parmi le psoriasis et l'hirsutisme. 11- Utilisation d'au moins un composé inhibiteur de glycolyse tel que défini dans l'une des revendications 2 à 9 comme agent pour prévenir ou diminuer la pousse des poils. 12- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le composé inducteur de glycolyse est dans une composition cosmétique et/ou dermatologique. 13- Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition est destinée à une application topique sur la peau ou ses annexes. 14- Utilisation selon l'une au moins des revendications 12 ou 13, caractérisée en ce que la composition contient en outre au moins un autre actif choisi parmi les filtres anti-UV, les agents hydratants, les dépigmentants, les agents anti-glycation, les inhibiteurs de NO synthase, les agents stimulant la synthèse de macromolécules dermiques ou épidermiques et/ou empêchant leur dégradation, les agents stimulant la prolifération des fibroblastes ou stimulant la différenciation des kératinocytes, les agent myorelaxant ou dermo-décontractant, les agents tenseurs, les agents anti-pollution ou anti-radicalaire, les agents apaisants et les actifs sur le métabolisme énergétique des cellules.15