Brevet FR2899111A1 — publié le 20071005

- 1 - L'invention concerne un nouveau médicament destiné au traitement du chikungunya, à savoir un concentré d'immunoglobulines spécifiques du chikungunya ainsi que son procédé de préparation. Introduction Le chikungunya (en abrégé CHIK), est une maladie infectieuse tropicale, due à un arbovirus (alphavirus de la famille des Togavirid), transmise par des moustiques du genre Aedes. Le nom est d'origine bantoue et signifie : qui se recourbe, qui se recroqueville, ou maladie de l'homme courbé car elle occasionne de très fortes douleurs articulaires associées à une raideur, ce qui donne aux patients infectés une attitude courbée très caractéristique. Les virus faisant intervenir dans leur cycle des arthropodes vecteurs sont regroupés sous le terme général d'arbovirus. Les arbovirus sont définis par l'OMS comme des virus qui subsistent dans la nature essentiellement ou en grande partie grâce à la transmission biologique entre hôtes vertébrés sensibles par des arthropodes hématophacies ; ils se multiplient et provoquent une virémie chez le vertébré, prolifèrent dans les tissus de l'arthropode et sont transmis à un nouveau vertébré par l'arthropode piqueur après une période d'incubation extrinsèque. La transmission du virus d'un hôte virémique à un moustique adulte femelle se fait par le sang aspiré lors de la piqûre. Le virus se multiplie dans le moustique, il traverse la frontière stomacale de l'animal et se retrouve dans ses glandes salivaires. La contamination d'un homme sain est réalisée par la salive anti-coagulante de moustique libérée juste avant la piqûre dans un vaisseau sanguin. La fenêtre pendant laquelle une personne est un hôte virémique avant de devenir malade n'est que de quelques jours. Parmi plus de 950 espèces de moustiques, plusieurs d'entre elles sont susceptibles de transmettre le chikungunya, mais seules Aedes aegypti et Aedes albopictus ont été à ce jour identifiées comme vecteurs épidémiques, à cause de leur adaptation aux zones d'habitat humain. Ces mêmes espèces sont également impliquées dans la transmission d'autres arbovirus : dengue, fièvre dengue hémorragique (DHF), fièvre jaune, etc. Le tableau clinique est dominé par une fièvre élevée comme celle de la dengue (dengue et chikungunya ont souvent été confondues) associée à des douleurs articulaires invalidantes et parfois une éruption cutanée. Mais il y a des formes sévères ignorées jusque-là : des hépatites fulminantes, des attaques du muscle cardiaque, des méningo-encéphalites... De nombreux autres arbovirus du genre alphavirus (capside d'environ 30kD et ARN polyadénylé en 3') comme Ross River, O'nyong-nyong, et Mayaro ont été associés à des symptômes similaires. L'incubation de la maladie dure de quatre à sept jours en moyenne. La virémie, c'est-à-dire la période de présence du virus dans le sang et donc de transmission possible, s'étale sur environ cinq jours. Les anticorps se déclarent ensuite. Ils restent dans le sang. L'immunité est donc normalement acquise à vie ou tout au moins un an (cf. ci-dessous l'essai phase II). Art antérieur Il n'existe pour l'instant aucun traitement virucide et aucun vaccin ayant reçu une autorisation de mise sur le marché. Le traitement est purement symptomatique pour faire 35 tomber la fièvre et réduire la douleur. Une phase I et une phase II ont été menées aux Etats-Unis pour un vaccin _anti-chikungunya par le United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. La phase II (Edelman R et al "Phase II safety and immunogenicity study of live chikungunya virus vaccine" TSI-GSD-218. Juin 2000; Am J Trop Med Hyg, 62:681-5) randomisée, en double-aveugle, versus placebo, consistait en l'étude de la sécurité et de l'immunogénicité d'un vaccine de chikungunya (CHIK) vivant purifié sur plaque chez 73 volontaires adultes en bonne santé. 59 volontaires ont été immunises une fois en sous-cutané avec le vaccin CHIK et 14 ont été immunisés avec le placebo. 57 (98%) des 58 vaccinés ont développé des anticorps neutralisants anti-CHIK au jour 28, et 85% des vaccinés étaient séropositifs un an après. L'association de deux antiviraux, la ribavirine et l'interféron alpha, a également été testée sur le chikungunya (Briolant S et al., "In vitro inhibition of Chikungunya and Semliki Forest viruses replication by antiviral compounds synergistic effect of interferon-alpha and ribavirin combination", Antiviral Res., 2004 Feb ; 61(2):111-7. Cette combinaison de IFN-alpha2b et de ribavirine présente un effet antiviral synergique sur le chikungunya, suffisamment prometteur pour l'envisager en thérapie. Cependant, un tel traitement serait extrêmement coûteux, répétitif et présenterait les nombreux effets secondaires connus de l'interféron. Résumé de l'invention Devant une telle absence de traitement établi, un vaccin qui se fait attendre et de lourds traitements antiviraux, le Demandeur a cherché à proposer un nouveau traitement contre le chikungunya. Le Demandeur a montré de façon surprenante que l'administration d'un concentré d'immunoglobulines spécifiques du chikungunya permet de résoudre ce problème technique. Définitions On appelle concentré un produit obtenu par élimination de certains constituants. Un concentré d'immunoglobulines est obtenu par élimination de certains constituants du plasma pour aller vers une fraction plasmatique enrichie en immunoglobulines. On appelle immunoglobuline une globuline naturelle présente surtout dans le plasma, ayant des fonctions d'anticorps et utilisable à titre curatif ou préventif. Les immunoglobulines sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHI, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs Fc^R et le Clq. Les IgG sont les immunoglobulines les plus abondantes (75 à 80 % des anticorps circulants). Elles protègent l'organisme contre les bactéries, les virus, et les toxines qui circulent dans le sang et la lymphe. D'autre part, elles fixent rapidement le complément 2899111 - 5 - (un des constituants du système immunitaire). Elles participent également à la réponse mémoire, base de l'immunité sur laquelle repose le mécanisme de la vaccination. Enfin, les immunoglobulines G traversent 5 le placenta et, de ce fait, entraînent une immunité passive chez le foetus. Les IgA se trouvent essentiellement dans les sécrétions comme la salive, le suc intestinal, la 10 sueur et le lait maternel. Le rôle essentiel des immunoglobulines A est d'empêcher les agents pathogènes de se lier à la cellule et plus spécifiquement aux cellules de recouvrement constituant les muqueuses et l'épiderme. 15 Les IgM sont des immunoglobulines sécrétées lors du premier contact de l'organisme avec un antigène. C'est la première classe d'immunoglobulines libérée par les plasmocytes. La présence d'IgM dans le sang indique 20 une infection en cours. La protéolyse enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et un 25 fragment Fc (fraction cristallisable). Le fragment Fc est le support des fonctions effectrices des immunoglobulines. Par protéolyse à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où les deux fragments Fab restent liés par 30 deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' (un fragment Fab' consistant en un Fab et une région charnière), liés par des ponts disulfure intercaténaires pour former un F(ab')2. 35 On appelle chromatographie une méthode de séparation des constituants d'un mélange fondée sur leur adsorption sélective par un support approprié. Description détaillée de l'invention En premier lieu, l'invention concerne un concentré d'immunoglobulines spécifiques du virus chikungunya en tant que médicament. L'utilisation de fractions de plasma humain enrichies en immunoglobulines pour le traitement de diverses infections ou déficiences congénitales est connue depuis la mise au point du procédé de précipitation à l'éthanol par Cohn (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al. 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541). En particulier, le concentré selon l'invention est constitué d'un concentré d'immunoglobulines A, G, et M, ou d'un concentré d'immunoglobulines G exclusivement, ou d'un concentré d'immunoglobulines M exclusivement, spécifiques du virus chikungunya en tant que médicament. De manière particulièrement préférée, le concentré selon l'invention contient 90 à 98% d'immunoglobulines. Le concentré selon l'invention peut contenir, en plus des immunoglobulines complètes spécifiques du virus chikungunya, des fragments F(ab)'2 et/ou Fab spécifiques du virus chikungunya, en particulier de 5 à 50% de F(ab)'2 et/ou Fab, en particulier au moins 50 à 60 g/L d'Ig et de fragments pour une préparation pharmaceutique. De tels fragments F(ab)'2 ou Fab, qui contiennent le site de liaison de l'anticorps, peuvent avoir perdu un certain nombre de propriétés de l'anticorps entier duquel ils sont issus, comme la capacité de lier les récepteurs Fcgamma. Le concentré selon l'invention peut contenir, en plus des immunoglobulines complètes spécifiques du virus chikungunya, des fragments F(ab)'2 ou Fab spécifiques du virus chikungunya provenant exclusivement d'IgG et d'IgM. Le concentré selon l'invention peut être additionné de 1 à 10 mmol de magnésium et/ou de zinc. Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un concentré selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du chikungunya. Ce traitement est prophylactique ou curatif. Il permet soit de transférer une immunité passive les personnes non encore touchées dans une région épidémique, soit de soigner les patients déjà touchés par le virus. Le médicament en question est administré par voie topique, sous-cutanée, orale, intramusculaire ou intraveineuse. Son efficacité est de plusieurs dizaines de jours, environ 21 jours, et au-delà l'administration doit être répétée si l'épidémie ou les symptômes persistent. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un concentré selon l'invention. La lère étape de ce procédé est la constitution d'un lot d'au moins 1000 dons de plasma, chaque don présentant un titre suffisant en Ig anti--chikungunya. Ces dons proviennent de personnes ayant été en contact avec la maladie, voire de patients ayant développé la maladie. Le titrage peut être effectué selon C. van de Water et al., Journal of Immunological Methods, 166(1993), 157-164 Afin d'enrichir ce lot de plasma en immunoglobulines, les autres constituants du plasma, appelés contaminants lipidiques et protéiques sont précipités en une seule étape. Cette purification par précipitation en une seule étape peut avoir lieu en diluant le plasma dans les conditions de la précipitation selon Steinbuch (Steinbuch M., Archiv. Biochem. Biophys., 134, 279-284) par l'acide caprylique et en y ajoutant de l'acide caprylique. Elle peut également avoir lieu par des agents de précipitation tels que le Rivanol, le chlorure d'Aluminium, le chlorure de cétylpyridinium, l'acide octanoïque, les polyphosphates et en présence d'agents d'adsorption par le phosphate tricalcique, la bentonite. Le surnageant peut constituer le concentré d'immunoglobulines selon l'invention. Il contient alors un mélange d'IgG, A et M. Celui-ci est récupéré, par exemple par centrifugation ou filtration, éventuellement en ajoutant au moins un adjuvant de filtration. Le surnageant peut subir un traitement d'inactivation virale classique par solvant/détergent (Triton X100). Si la précipitation était une précipitation caprylique, les résidus d'acide caprylique dans le surnageant sont éliminés par PO4 calcium. Afin d'obtenir un concentré d'IgG ou d'IgA ou d'IgM, l'enseignement du brevet EP02727688.0 peut être appliqué. Le surnageant subit alors une étape supplémentaire de purification par chromatographie sur un échangeur d'anions effectuée à pH alcalin. En particulier, le pH du surnageant est préalablement ajusté à un pH entre 8,9 et 9,1 et la colonne est équilibrée en tampon à pH 8,9 à 9,1. L'étape de chromatographie permet l'adsorption des immunoglobulines et le passage des protéines non adsorbées dans l'effluent. La chromatographie peut être effectuée sur un gel de polysaccharide réticulé ou de polymère vinylique, greffé de groupements DEAE, TMAE ou QAE. Après un lavage de la colonne avec le même tampon que le tampon d'équilibrage pour éliminer les protéines non adsorbées, les immunoglobulines G sont éluées par du tampon phosphate à pH compris entre 4 et 7, de préférence à pH 6,2. Une élution subséquente éventuelle par le même tampon phosphate additionné de NaCl 100 à 175 mM, de préférence 150 mM, à un pH de 6 à 6,3, permet de recueillir les IgA. Une élution subséquente éventuelle par le même tampon ajusté à un pH de 6 à 7 et additionné de NaCl 250 à 350 mM, de préférence 300 mM permet d'éluer les IgM. Tout type de mélange entre les IgA, les IgG et les IgM peut être envisagé en mélangeant les concentrés tels que décrits ci-dessus. Les immunoglobulines ainsi éluées et récoltées peuvent être concentrées par ultrafiltration et soumises à une filtration stérilisante conventionnelle puis à une filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nanomètres. La solution d'immunoglobulines concentrée et filtrée est additionnée d'un stabilisant pharmaceutiquement acceptable puis elle est conditionnée à l'état de solution stérile et éventuellement congelée et lyophilisée. L'application d'une nanofiltration permet d'éliminer 20 des virus résistants au traitement par solvant-détergent. Afin de préparer un concentré d'Ig et de fragments F(ab)'2 ou Fab spécifiques du virus chikungunya, on prépare un concentré d'immunoglobulines (1) : un 25 mélange A, G et M ou bien un mélange G et M, ou bien exclusivement des G, ou bien exclusivement des M, tel que décrit précédemment, puis dans une deuxième étape, on digère une partie du concentré d'Ig obtenu pour obtenir des fragments F(ab)'2 ou Fab (2), et dans une 30 troisième étape on mélange les concentrés (1) et (2). Pour obtenir des fragments F(ab)'2, la protéolyse a lieu en pepsine 1% en poids de protéines à pH 4 et 35 C (protocole IGLOO). Pour obtenir des fragments Fab, la protéolyse a lieu 35 en papaïne. REVENDICATIONS 1. Concentré d'immunoglobulines spécifiques du virus chikungunya en tant que médicament. 2. Concentré selon la revendication 1, 5 caractérisé en ce qu'il est constitué d'un concentré d'immunoglobulines A, G, et M. 3. Concentré selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un concentré d'immunoglobulines G. 10 4. Concentré selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un concentré d'immunoglobulines M. 5. Concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il contient 15 90 à 98% d'immunoglobulines. 6. Concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient en outre des fragments F(ab)'2 spécifiques du virus chikungunya. 20 7. Concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il contient en outre des fragments Fab spécifiques du virus chikungunya. 8. Concentré selon la revendication 7, 25 caractérisé en ce qu'il contient 5 à 50% de F(ab)'2 et/ou de Fab. 9. Concentré selon la revendication 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que les fragments F(ab)'2 ou Fab sont des fragments F(ab)'2 ou Fab d'IgG et d'IgM. 30 10. Concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, additionné de 1 à 10 mmol de magnésium. 11. Concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, additionné de 1 à 10 mmol de 35 zinc. 12. Utilisation d'un concentré tel que 2899111 - 11 - défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du chikungunya. 13. Utilisation selon la revendication 12, pour la fabrication d'un médicament sous forme administrable par voie topique, sous-cutanée, orale, intramusculaire ou intraveineuse. 14. Procédé de préparation d'un concentré selon la revendication 1 ou 2, caractérisé 10 par les étapes suivantes : - constitution d'un lot d'au moins 1000 dons de plasma, chaque don présentant un titre suffisant en Ig anti-chikungunya - précipitation des contaminants lipidiques et 15 protéiques en une seule étape - récupération du concentré d'Ig dans le surnageant. 15. Procédé de préparation d'un concentré selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par les étapes suivantes : 20 -constitution d'un lot d'au moins 1000 dons de plasma, chaque don présentant un titre suffisant en IgG anti-chikungunya - précipitation des contaminants lipidiques et protéiques en une seule étape 25 -chromatographie du surnageant sur un échangeur d'anions à pH alcalin -élution des IgG par du tampon phosphate à pH compris entre 4 et 7, de préférence à pH 6,2 - éventuellement élution subséquente des IgA par le 30 même tampon phosphate additionné de NaCl 100 à 175 mM, et de préférence 150 mM, à un pH de 6 à 6,3 - éventuellement élution subséquente des IgM par le même tampon phosphate à pH compris entre 6 et 7 additionné de NaCl 250 à 350 mM 35 - éventuellement mélange des concentrés d'IgG, d'IgA et d'IgM. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que_le pH du surnageant est ajusté 2899111 - 12 - entre 8, 9 et 9, 1 et la colonne de chromatographie est équilibrée en tampon à pH 8,9 à 9,1 préalablement à la chromatographie. 17. Procédé de préparation d'un 5 concentré selon la revendication 6, 7 ou 8, caractérisé par les étapes suivantes : (1) préparation d'un concentré d'Ig selon la revendication 14 ou 15, ou d'IgG selon la revendication 15 ou 16, ou d'IgM selon la revendication 15 ou 16, (2) protéolyse d'une partie du concentré précédent pour obtenir des fragments F(ab)'2 ou Fab, (3) mélange des fractions (1) et (2). 18. Procédé de préparation d'un concentré selon la revendication 9, caractérisé par les étapes suivantes : (1) préparation d'un concentré d'IgG selon la revendication 15 ou 16, (2) préparation d'un concentré d'IgM selon la revendication 15 ou 16, (3) mélange des fractions (1) et (2), (4) protéolyse d'une partie du mélange précédent pour obtenir des fragments F(ab)'2 ou des Fab d'IgG et d'IgM, (5) mélange de (3) et (4). 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que la protéolyse a lieu en pepsine 1% en poids de protéines à pH 4 et 35 C pour obtenir des fragments F(ab)'2. 20. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que la protéolyse pour obtenir des fragments Fab a lieu en papaïne. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que la précipitation est une précipitation caprylique et en ce que les résidus d'acide caprylique dans le surnageant sont éliminés par PO4 calcium. 22. Procédé selon l'une quelconque des 2899111 - 13 - revendications 14 à 21, caractérisé en ce que le précipité est séparé par filtration après ajout d'au moins un adjuvant de filtration. 23. Procédé selon l'une quelconque des 5 revendications 14 à 22, caractérisé en ce que le surnageant est traité par solvant/détergent. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 23, caractérisé en ce que les immunoglobulines éluées sont concentrées par 10 ultrafiltration et soumises à une filtration stérilisante conventionnelle puis à une filtration au travers de filtres nanométriques de porosité décroissante de 100 à 15 nanomètres. 25. Procédé selon l'une quelconque des 15 revendications 15 à 24, caractérisé en ce que la solution d'immunoglobulines concentrée et filtrée est additionnée d'un stabilisant pharmaceutiquement acceptable puis elle est conditionnée à l'état de solution stérile et éventuellement congelée et 20 lyophilisée.