Brevet FR2906725A1 — publié le 20080411

La présente invention concerne le nettoyage et la décontamination des objets usuels et plus particulièrement ceux destinés à la petite enfance. La flore buccale représente une importante source de contamination inter et infra individus (Barsotti O. In: Actualités permanentes en Bactériologie Clinique. J. Freney, F. Renaud, R. Leclerc, Ph. Riegel (eds), ESKA, Paris, France, 2006, Section III, chapitre 6 ; Wilson M. In: Wilson M (ed.). Microbial Inhabitants of Humans. Cambridge, UK: University Press, 2005; 333-339). En effet, les multiples microorganismes présents dans la bouche (Streptococcus, Actinomyces, Eubacterium, Lactobacillus, Bfdobacterium, Staphyloccocus, Neisseria, Haemophilus, Capnocytophaga, Eikenella, Leptotrichia, Porphyromonas, Fusobacterium, Candida ... ), pathogènes, pathogènes opportunistes ou commensaux, avec l'aide du mucus et des nombreuses substances organiques présentes dans la salive, adhèrent très facilement aux surfaces et forment des biofilms (Watnick P et al. J. Bacteriol. 2000; 182: 2675û2679). La première surface sujette à l'adhésion bactérienne est bien sûr l'émail dentaire, siège du développement des caries. Les mains peuvent également être vecteurs de microorganismes d'origine buccale, mais leur persistance est faible du fait du renouvellement régulier des cellules dermiques. Les surfaces les plus contaminées et responsables de transmission et/ou de persistance 20 d'infection sont tous les objets portés à la bouche : sucettes de bébés, tétines, jouets, appareils dentaires, etc... Nous avons montré par exemple que, sur 25 sucettes de bébés usagées récupérées dans des crèches, toutes étaient contaminées par un biofilm bactérien à un stade plus ou 25 moins avancé de développement (Comma E et al. Nursing and Health Sciences, 2006 : in press). Les biofilms se formant sur les objets portés à la bouche, même s'ils ne contiennent à l'origine que des germes non pathogènes originaires de la flore buccale résidente, peuvent héberger et protéger d'autres microorganismes pathogènes, notamment les 30 virus ou levures. De nombreuses pathologies liées aux sucettes sont décrites dans la littérature (otites, candidoses, parasitoses...) (Brook I et al. J. Laryngol. Otol. 1997; 111: 614-615; Hanafin S et al. Br. J. Commun. Nurs. 2002; 7: 206û211; Mattos-Graner RO et al. J. Dent. Child 2001; 68: 33û36; 011ia P et al. Acta Odontol. Scand 1997; 55: 9û13; Pedroso RS et al. J. Pediatr. 1997; 73: 21û25). 35 2906725 2 Nous avons par exemple noté la présence de Candida sur de nombreuses sucettes de bébés. Ainsi, ces biofilms peuvent être la cause soit de la transmission d'infections d'un individu à l'autre par échange de ces objets (ex : jouets de bébés dans la bac à doudous de l'école maternelle), ou augmenter la durée et la fréquence des infections 5 chez un même individu (ex : recontamination permanente par le virus de la gastro-entérite hébergé dans le biofilm de la sucette ou de l'appareil dentaire). Les objets portés à la bouche se décontaminent aujourd'hui par désinfection à froid ou à chaud. La désinfection à froid est la méthode la plus répandue et consiste en un simple trempage de l'objet dans un produit biocide pendant un temps défini. La 10 désinfection à chaud est utilisée pour les objets de puériculture (essentiellement les biberons, tétines et sucettes) et consiste en l'utilisation de l'eau bouillante (casserole d'eau ou stérilisateur électrique) comme agent antibactérien pour tuer les bactéries présentes sur les surfaces. 15 Ces méthodes présentent toutes deux les trois mêmes inconvénients majeurs : 1) l'inefficacité du traitement en profondeur : les désinfectants (produits chimiques ou eau chaude) exercent leur action uniquement sur les couches superficielles du biofilm en tuant les bactéries que les composent ; par contre, du fait de leur difficultés de pénétration dans les couches profondes, les germes camouflés en profondeur restent vivants (Marion-Ferey K et al. Journal of Hospital Infection, 2003: 53: 64-71). 2) La faible efficacité sur le décrochage des microorganismes adhérents. La vocation d'un biocide est de tuer les microorganismes et non pas de les décrocher. Or, la façon la plus efficace de lutter contre un biofilm est de décrocher les bactéries adhérentes de leur support afin de réduire au maximum leur accumulation. En effet, les bactéries résiduelles fixées, vivantes ou mortes, augmentent la rugosité du support et apportent des nutriments à de nouvelles bactéries qui peuvent venir à leur tour coloniser le biofilm. Les résidus bactériens entretiennent les contaminations des surfaces (Marion-Ferey K et al. Journal of Hospital Infection, 2003: 53: 64-71). 3) Leur important temps de contact qui monopolise l'objet et l'exclut de son usage habituel pendant au moins 15 minutes. 2906725 3 La présente invention a pour objectif de proposer un procédé de traitement efficace, simple et rapide de nettoyage préventif des surfaces contaminées par décrochage régulier des microorganismes adhérents. Ainsi, le traitement régulier de ces surfaces pourra contribuer à la réduction de la durée et de la fréquence des infections et 5 à limitation de leur transmission. La présente invention concerne un procédé de traitement caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'application d'un produit antibiofilm à action décrochante suivie d'une étape physique de décrochage. 10 Ladite étape de décrochage est choisie parmi le brossage, le grattage, le polissage. Ledit produit antibiofilm à action décrochante est choisi parmi les solutions détergentes, les solutions détergentes-désinfectantes, les produits enzymatiques (protéases, lipases, amylases, seules ou en association), les solutions enzymo- 15 détergentes, les chelateurs (type EDTA), les surfactant. Parmi les solutions détergentes, on citera le Pronetron (Kazieltys laboratoire) ; parmi les produits enzymatiques on citera le Pronetron a (Kazieltys laboratoire), parmi les chelateurs on citera l'EDTA (Sigma), et parmi les surfactants on citera le Tween, le Dodecyl sulfate de sodium (Sigma). 20 La présente invention s'applique à tout objet en contact plus ou moins direct avec la bouche : sucettes de bébés, tétines de biberons, biberons, jouets, appareils dentaires (prothèses dentaires de remplacement ou appareil pour correction en orthodontie)... 25 Dans un mode de réalisation le procédé selon invention est caractérisé en ce que l'étape d'application du produit antibiofilm à action décrochante est effectuée par vaporisation. Le procédé selon l'invention est dans un mode de réalisation, caractérisé en ce 30 que l'étape physique de décrochage a une durées de moins de 5 minutes Un produit anti-biofilm à action décrochante (Marion K. Brevet n PCT n PCT/FTR 03/03246, 30 Octobre 2003 ; Marion K et al. Blood Purf. 2005; 23: 339-348; Williams R. Nature Clin. Pract. Nephrol. 2005), par exemple solution détergente, se présente 35 sous forme de spray. Le produit est vaporisé sur l'objet à décontaminer ; la surface est frottée pendant quelques secondes à une minute maximum à l'aide d'un écouvillon, 2906725 4 d'une éponge à gratter ou tout autre ustensile approprié. Le produit et le biofilm décroché sont éliminés par rinçage à l'eau du robinet. La surface est parfaitement propre en moins d'une minute. L'efficacité préventive de la présente invention a été démontrée 5 scientifiquement à l'aide d'un modèle de laboratoire développant des biofilms sur des sucettes de bébés. Des essais comparatifs ont été réalisés versus le stérilisateur électrique. 10 1) Méthodologie • Bioréacteur Trois souches (Staphyloccocus epidermidis, Kocuria varians et Sphingomonas 15 paucimobilis) ont été isolées de biofilms s'étant développé sur des sucettes de bébés récupérées dans des crèches. Un corps de réacteur a été rempli de salive artificielle (solution de Phosphate Buffer Saline contenant 150 mmol/L of Na+et Cl-, 5 mmolIL de K+, chlorure de magnésium, gluconate de calcium et 0,01 % de mucine) et inoculé avec les 3 souches préalablement isolées. Le milieu a été supplémenté par du bouillon LB 20 (Luria Bertani) pour accélérer la croissance du biofilm. Le système a été maintenu à 37 C dans un bain-marie. Les bactéries se sont développées toute une nuit, puis 5 quarts de sucettes en latex fixés au bouchon du corps de réacteur ont été mis à tremper dans le milieu contaminant. De la salive artificielle fraîche supplémentée en bouillon LB était régulièrement apportée au réacteur à l'aide d'une pompe péristaltique. Chaque 25 matin, les quarts de sucette subissaient l'un des traitements décrits ci-dessous. Après traitement, elles étaient rincées à l'eau du robinet et ré-immergées dans le milieu contaminant jusqu'au prochain traitement, et ce pendant une durée totale de 7 jours. 30 • Expériences et traitements - Exp I : Un premier essai a été réalisé dans les pires conditions à savoir en présence d'un milieu contaminant très riche (supplémenté par 10 % de bouillon LB) permettant le développement d'un biofilm très dense. Les 4 traitements décrits ci- 35 dessous ont été testés (tableau I). 1 échantillon a été conservé non traité pour constituer le témoin. 2906725 5 Tableau I: Différents traitements testés et conditions expérimentales Traitement Produit Méthode Durée du traitement 1 Pronetron (3*, 2% Simple immersion 1 min 2 Pronetron (3, 2% Vaporisation et brossage avec une 1 min brosse dentaire (Crinex ) 3 Pronetron (3, 2% Spray dentaire électrique (Calor) 1 min 4 Pasteurisation Stérilisateur électrique à biberons 30 min (Remond) * le Pronetron J3 est une solution détergente moussante alcaline contenant hydrates, sels minéraux actifs, phosphates, polyphosphates, tensioactifs, hydroxyde de sodium. 5 - Exp II : Un second essai a été réalisé dans des conditions plus proches de la réalité. Pour cela, la concentration en bouillon LB apporté au milieu a été réduite à 1%. Le traitement ayant donné les meilleurs résultats dans l'expérience précédente a été répété 4 fois sur 4 quarts de sucettes, la cinquième étant conservée comme témoin. 10 • Analyse des échantillons après traitement. Les quarts de sucettes traitées et le témoin non traité ont été découpées en deux parties égales, l'une destinée à l'observation microscopique et l'analyse d'image 15 (détermination de la surface couverte), l'autre destinée à la numération des bactéries viables cultivables. Les méthodes utilisées sont celles décrites par Marion-Ferey (Marion-Ferey K et al. Artif. Organs 2003; 27: 658-664). 20 25 2906725 2) Résultats • Exp I : Un biofilm témoin contenant 8.107 UFC/cm2 a été obtenu après 7 jours de fonctionnement du bioréacteur. Les différents traitements appliqués ont permis plus ou moins significativement la prévention du développement du biofilm sur les sucettes. Ceci est illustré par les photographies de la figure 1. Nous constatons une excellente efficacité du traitement n 2 (vaporisation de Pronetron 13 et brossage de la surface â l'aide d'une brosse dentaire) par rapport aux deux autres traitements. Le stérilisateur de biberons électrique est le traitement qui laisse persister le plus de résidus en surface. Ceci est confirmé par les données chiffrées du tableau II. 20 Tableau II: Pourcentage de surface couverte résiduelle après traitements et nombre de bactéries viables cultivables. Traitement n Surface couverte Bactéries cultivables (%) (UFC/cm2) 1 10,08 2.104 2 2,79 9.103 3 6,85 105 4 42,54 104 Témoin 78,04 8.107 Le traitement le plus efficace, laissant persister le moins de bactéries viables cultivables permettant d'obtenir la surface la plus propre est le traitement n 2. Le stérilisateur de 25 biberons électrique laisse ne permet pas une élimination significative du biofilm (encore 42% de surface couverte après traitement) ni la mortalité de toutes les bactéries qui le constituent. 6 5 10 15 2906725 • Exp Il Dans l'expérience II où l'apport de nutriments a été réduit, le biofilm témoin contenait 2.105 UFCIcm2. Le traitement n 2, le plus efficace, a été appliqué sur 4 échantillons. 5 La surface après traitement était parfaitement propre (figure 2). Le tableau III présente les résultats quantitatifs (pourcentage de surface couverte, pourcentage résiduel de surface couverte par rapport au témoin et bactéries 10 viables cultivables) obtenus après nettoyage des 4 échantillons de sucettes par le traitement n 2. Afin de montrer la reproductibilité infra-essai de ce traitement, les écart-types ont été calculés. Leur très faible valeur ( REVENDICATIONS 1. Procédé de traitement caractérisé en ce qu'il comprend une étape 5 d'application d'un produit antibiofilm à action décrochante suivie d'une étape physique de décrochage. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape de décrochage est choisie parmi le brossage, le grattage, le polissage. 10 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ledit produit antibiofilm à action décrochante est choisi parmi les solutions détergentes, les solutions détergentes-désinfectantes, les produits enzymatiques (protéases, lipases, amylases, seules ou en association), les solutions enzymo- 15 détergentes, les chelateurs (type EDTA), les surfactant. Parmi les solutions détergentes, on citera le Pronetron (Kazieltys laboratoire) ; parmi les produits enzymatiques on citera le Pronetron a (Kazieltys laboratoire), parmi les chelateurs on citera l'EDTA (Sigma), et parmi les surfactants on citera le Tween, le Dodecyl sulfate de sodium (Sigma). 20 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape d'application du produit antibiofilm à action décrochante est effectuée par vaporisation. 25 5 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape physique de décrochage a une durées de moins de 5 minutes.