Brevet FR2903703A1 — publié le 20080118

GENES CODANT POUR LA CIS-LABDA-12,14-DIEN-8 ALPHA-OL (CIS- ABIÉNOL) SYNTHASE ET LA SYN-COPALYL-8-OL DIPHOSPHATE SYNTHASE ET LEURS UTILISATIONS Domaine de l'Invention La présente invention se rapporte à des gènes impliqués dans la synthèse du cis-abiénol et leur utilisation pour la préparation de celui-ci dans des organismes vivants tels que les bactéries, les levures, les cellules animales et les plantes. Introduction Les terpènes forment une classe nombreuse de molécules naturelles que l'on trouve dans tous les organismes vivants (bactéries, champignons, animaux, plantes). Chez les plantes, ils jouent des rôles variés, notamment dans l'attraction d'insectes bénéfiques pour la plante, et dans la défense vis-à-vis de pathogènes (bactéries, champignons, insectes). Les terpènes sont constitués de multiples d'unités isoprényles à 5 carbones. Le nombre d'unités isoprényles permet de les classer notamment en monoterpènes (composés à dix atomes de carbone ou C10), sesquiterpènes (C15), diterpènes (C20), triterpènes (C30), tetraterpènes (C40) et polyterpènes (>C45). Les voies de biosynthèse des précurseurs des terpènes ont largement été décrites dans la littérature (voir par exemple, Eisenreich et al., 2004). Les précurseurs universels de tous les terpènes sont l'isopentenyl diphosphate (IPP) et le diméthylallyl diphosphate (DMAPP). Deux voies distinctes conduisent à la formation de l'IPP et du DMAPP. L'une, la voie du mévalonate (MEV) est localisée dans le cytoplasme alors que l'autre, la voie du méthyl-erythritol (MEP), n'existe que chez certaines bactéries et les plantes où elle localisée dans les plastes. Toutes les étapes et les gènes codant les enzymes de ces deux voies sont connus. A partir des précurseurs, la première étape de la biosynthèse des terpènes est réalisée par des trans-prényltransférases qui vont par condensation des deux précurseurs, l'IPP et le DMAPP, générer des chaînes de carbones constituées d'unités isoprényles (C5) de longueur variable. Ainsi, l'addition séquentielle d'une unité d'IPP à un DMAPP produit du trans-géranyl diphosphate (GPP, C10), puis à partir du GPP du trans, trans-farnésyl diphosphate (FPP, C15) et enfin à partir du FPP du trans, trans, trans-géranyl géranyl diphosphate (GGPP, C20). Ces chaînes de prényl diphosphates de longueur variable sont les substrats d'une classe d'enzyme, les terpènes synthases qui permettent la formation du squelette de base des terpènes cycliques ou acycliques en C 10 (monoterpène), C15 (sesquiterpène), C20 (diterpène), C30 (triterpène) 2903703 2 (Cane, 1999; McMillan and Beale, 1999; Wise and Croteau, 1999). La diversité de réaction de ces enzymes est à l'origine de la diversité des squelettes terpéniques cycliques que l'on retrouve dans la nature. 5 Le tabac cultivé (Nicotiana tabacum) produit au niveau de ses trichomes, ou poils sécréteurs, une sécrétion dont plus de la moitié est composée de diterpènes appartenant à deux classes, les cembranes et les labdanes. Parmi les labdanes, le cis-abiénol est le composé majoritairement produit par un grand nombre de variétés de tabac (N. tabacum). Chez certaines variétés, la quantité de cis-abiénol peut représenter plus de 1% de la matière 10 fraîche des feuilles. Le cis-abiénol participe positivement aux caractéristiques aromatiques des feuilles de tabac. Il peut également être utilisé comme précurseur dans la synthèse d'ambroxides, molécules utilisées dans l'industrie de la parfumerie. Dans la famille des labdanes, d'autres molécules ont été caractérisées comme par 15 exemple : (i) le sclaréol qui est présent dans les tissus floraux de la sauge sclarée (Salvia sclarea) mais également produit dans le tabac en réponse aux pathogènes ; (ii) les oryzalexines et les phytocassanes produites chez le riz en réponse aux 20 attaques de pathogènes ; et (iii) les gibbérellines et leur précurseur, la ent-kaurene. Il a été démontré que la biosynthèse du squelette labdanoïde à partir du GGPP nécessite deux étapes. Dans une première étape, le GGPP est transformé en ent- ou syncopalyldiphosphate (ent- ou syn-CDP) par la ent- ou syncopalyldiphosphate synthase (entou syn-CPS), respectivement. Dans une seconde étape, le CDP est transformé en une oléfine labdanoïde par une labdane synthase. Les gènes codant pour ces deux types d'enzymes ont été clonés chez de nombreuses plantes. Par exemple, chez Arabidopsis, les gènes AtGAJ (Sun et al., 1994) et AtGA2 (Yamaguchi et al., 1998) sont impliqués dans la 30 biosynthèse des gibbérellines et codent pour la ent-copalyldiphosphate synthase (ent-CPS) et la ent-kaurene synthase, respectivement. Chez le riz, deux gènes codent pour la ent-CPS (OsCPS1 et OsCPS2) et un gène pour la syn-CPS (OsCPS3). OsCPS1 est responsable de la biosynthèse du précurseur des gibbérellines, la ent-kaurene (Sakamoto et al., 2004). OsCPS2 et OsCPS3 sont impliqués dans la biosynthèse des précurseurs de plusieurs 2903703 3 phytoallexines de type labdane (ent-cassa-12 ;15- diene ; ent-sandaracopimaradiene ; Stemar-13-ene ; 9J3-pimara-7,15-diene). Il existe dans le génome du riz neuf gènes homologues à la kaurene synthase d'Arabidopsis, notés OsKS 1 à 9 (Sakamoto et al., 2004). L'analyse de mutants déficients en acide gibbérellique a permis de démontrer que 5 OsKS 1 code pour la ent-kaurene synthase (Sakamoto et al., 2004). Par ailleurs, la fonction de plusieurs OsKS a été déterminée in vitro après expression chez E. coll. Par exemple, OsKS7 et OsKS 10 codent pour la ent-cassa-12,15-diene et la ent-sandaracopimaradiene, respectivement. 10 Chez le tabac, une activité de type cis-abiénol synthase a été détectée dans des cellules extraites à partir de trichomes. Cependant, les gènes codant pour la biosynthèse du cisabiénol à partir du GGPP n'ont pas été identifiés. Comme pour l'ensemble des labdanoïdes, une molécule de type CDP est un intermédiaire probable dans la biosynthèse du cis-abiénol (Fig. 1). Plus particulièrement, la structure du cis-abiénol suggère que 15 l'intermédiaire soit le syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) (Carman and Duffield, 1993, Guo et al., 1994). D'autres diterpènes labdanoïdes sont dérivés du copalyl-8-ol diphosphate, comme le sclaréol ou le (13E)-labdene-8,15-diol. La syn-CODP synthase, dont la séquence était inconnue à ce jour, constituerait donc la première étape de biosynthèse de ces molécules à partir du GGPP. 20 Il existe une forte demande de procédés qui permettraient de produire à moindre coût des terpènes d'intérêt tels que 1'abiénol ou le sclaréol qui sont difficilement accessibles à la synthèse. La caractérisation de la voie de synthèse du cis-abiénol permettrait de mettre au point des méthodes de production de cette molécule, très utile en parfumerie, ainsi que 25 d'autres diterpènes labdanoïdes pouvant être préparés par cette voie de synthèse. Résumé de l'Invention L'invention concerne les activités enzymatiques, les séquences peptidiques responsables de ces activités et les séquences d'acide nucléique correspondantes, responsables de la 30 biosynthèse du cis-abiénol à partir de GGPP. L'invention concerne également des méthodes de production du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci utilisant ces activités enzymatiques. 2903703 4 La présente invention concerne donc une méthode de production du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de géranyl géranyl diphosphate (GGPP) dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette 5 d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS), ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol (= cis-abiénol) synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; 10 b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, c) facultativement, la récolte du cisabiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture. 15 La présente invention concerne également une protéine isolée ou recombinante ayant une activité cis-abiénol synthase et ayant une séquence présentant au moins 95 % d'identité avec la SEQ ID No 24. Elle concerne aussi un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une telle protéine, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des conditions stringentes et ayant une activité cis-abiénol synthase. 20 La présente invention concerne en outre une protéine isolée ou recombinante ayant une activité syn-COPS et ayant une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22. Elle concerne aussi un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une telle protéine, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des 25 conditions stringentes et ayant une activité syn-COPS. La présente invention concerne une cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la présente invention, un vecteur comprenant une cassette d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention, une cellule hôte comprenant un vecteur, une cassette 30 d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention, et un organisme transgénique non-humain comprenant une cellule, un vecteur, une cassette d'expression ou un acide nucléique selon la présente invention. 2903703 5 La présente invention concerne l'utilisation d'une protéine, d'un acide nucléique, d'une cellule hôte ou d'un organisme transgénique selon la présente invention pour la préparation de syn-CODP ou de cis-abiénol ou de dérivés de ceux-ci. 5 La présente invention concerne enfin une cellule ou un organisme transgénique non-humain, caractérisé en ce que la voie de synthèse du cis-abiénol est bloquée par inactivation du gène codant pour une syn-COPS selon la présente invention ou du gène codant pour une cis-abiénol synthase selon la présente invention ou des deux gènes. 10 Brève Description des Figures Figure 1 : Schéma de la biosynthèse du cis-abiénol à partir du géranylgéranyl diphosphate selon Carman and Duffield (1993). syn-CODP : syn-copalyl-8-ol diphosphate; cis-abiénol : cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol ; A : syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS) ; 15 B : cis-abiénol synthase (ABS) C : Phosphatase. Figure 2 : Niveau d'expression de fragment de gènes de tabac codant pour des protéines apparentées aux CPS et aux KS. L'analyse quantitative de l'expression a été réalisée sur des ADNc par PCR quantitative en temps réel avec des amorces spécifiques de chacun des 20 gènes. Les ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN totaux isolés de feuilles et de trichomes de feuilles de tabac. Figure 2A) Niveau d'expression des gènes dans les trichomes par rapport à celui des feuilles. L'axe des ordonnées représente le rapport de la valeur obtenue dans les trichomes sur celle obtenue dans les feuilles. Figure 2B) Niveau d'expression des gènes par rapport au gène NtCBTS-02 dont l'expression est trichome 25 spécifique. L'axe des ordonnées représente le rapport des valeurs obtenues dans les trichomes sur la valeur obtenue pour le gène CBTS dans les trichomes. NtCBTS-02 : CBT-ol synthase (NID:AF401234) ; NtCYP71 D 16B : CBT-ol hydroxylase similaire à CYP71D16 (NID : AF166332). 30 Figure 3 : Représentation schématique des ADN-T portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. km : gène de résistance à la kanamycine ; e35S : amplificateur du promoteur 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur. CBTSter : terminateur du gène CBTS ; eCBTS 1.0 : promoteur de 1 kb du gène CBTS fusionné avec l'amplificateur du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur. NtCPS2 : phase codante du gène codant pour la 2903703 6 CPS de tabac (N. tabacum) ; NtKSL3 : phase codante du gène codant pour la CPS de tabac (N. tabacum). Figure 3A) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO58 ; Figure 3B) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO68 ; Figure 3C) fragment ADN-T du vecteur binaire pLIBRO69. 5 Figure 4 : Analyse des exsudats de plantes par chromatographie en phase gazeuse. Les exsudats des feuilles de plantes ont été extraits avec une solution de pentane et analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse. Exemple de profils chromatographiques obtenus à partir d'extraits de feuilles de N. tabacum [Figure 10 4A], N. sylvestris [Figure 4B] et d'une lignée transgénique TO #3513 portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3 [Figure 4C]. La lignée transgénique #3513 a été obtenue à partir d'une lignée transgénique portant un transgène antisense de type ihpRNAi du gène CBTS. [1] cis-abiénol. Temps de rétention = 40.5 min ; [2] CBT-diol Temps de rétention = 43 min. 15 Figure 5: Spectre de masse du pic correspondant au cis-abiénol obtenu après chromatographie en phase gazeuse réalisée à partir des exsudats de la plante #3513 portant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. Figure 5A) Spectre de masse d'un standard de cisabiénol. Figure 5B) Spectre de masse correspondant au pic N 1 de la figure N 4. 20 Figure 6 : Analyse des tests d'activité réalisés in vitro avec NtCPS2. Figure 6A) GC/MS des composés extraits du milieu de réaction. Figure 6B) GC/MS des exsudats des feuilles de N tabacum extraits avec une solution de pentane. [1] cis-abiénol, temps de rétention = 41 min ; [2] CBT-diol, temps de rétention = 43,4 min ; [3] 9-beta labda-13-en-8,15-diol, 25 temps de rétention = 48,1 min. Figure 7 : Spectre de masse du pic N 3 de la figure 6 correspondant au 9-beta labda-13-en-8,15-diol Figure 7A) Exsudats de N tabacum . Figure 7B) Test d'activité réalisé avec NtCPS2. Abréviations CBT-ol : cembratrien-ol CBTS : cembratrien-ol synthase cis-abiénol : cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol 30 2903703 7 syn-CODP : le 9-béta labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate ou le syn-copalyl-8-ol diphosphate syn-COPS : syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase ou 9-béta labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate synthase ou syn-CODP synthase 5 CPS : copalyl diphophosphate synthase GC : chromatographie gazeuse GGPP : géranyl géranyl diphosphate KS : kaurene synthase ihpRNAi : intron hairpin ARN interférent 10 MS : spectrométrie de masse RACE : rapid amplification of cDNA ends SSC : Sodium chloride-Sodium Citrate Description Détaillée de l'Invention 15 La présente invention décrit donc pour la première fois les gènes codant pour les enzymes impliquées dans la voie de synthèse du cis-abiénol. En particulier, la présente invention concerne la caractérisation de la cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase (cis-abiénol synthase, ABS) de tabac qui permet la production de cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol (cisabiénol), un diterpène appartenant à la famille des labdanes, à partir du 9-beta-labda-13-en- 20 8-o1-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODP). En outre, elle concerne également la caractérisation de la syn-copalyl-8-ol diphosphate synthase (syn-COPS) de tabac qui permet la production de 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODP) à partir de GGPP. Ces enzymes peuvent être utilisées pour la production de cis-abiénol ou de syn-CODP, in vitro 25 ou in vivo dans des organismes transgéniques ou des cellules ou micro-organismes recombinants. Les organismes transgéniques, cellules ou micro-organismes tels que les bactéries, les levures, les cellules animales, d'insectes ou de plantes et les plantes ou animaux transgéniques sont considérés. Elles permettent également la production de composés dérivés du syn-CODP. Les procédés de la présente invention sont plus 30 particulièrement applicables à la production de cis-abiénol dans les plantes possédant des trichomes glanduleux de type sécréteurs. La production de cis-abiénol peut également être diminuée ou supprimée dans des plantes, par exemple le tabac, par des techniques d'extinction de gènes. 2903703 8 La présente invention concerne donc une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette 5 d'expression comprenant un gène codant pour une syn-COPS, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une cis-abiénol synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; 10 b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, c) facultativement, la récolte du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier, le cis-abiénol produit est récolté à l'étape c). Dans 15 un autre mode de réalisation particulier, le cis-abiénol produit est le produit de départ pour obtenir un autre composé d'intérêt comme l'Ambrox . Par syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase ou syn-COPS est entendue une enzyme capable de produire du 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate 20 (syn-copalyl-8-ol-diphosphate, syn-CODP) à partit du GGPP (géranyl géranyl diphosphate). Par cis-labda-12,14-dien8 alpha-ol synthase ou cis-abiénol synthase ou ABS est entendue une enzyme capable de produire du cis-abiénol ou cis-labda-12,14-dien-8 alpha25 ol à partir du 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate. Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule produit du GGPP. Dans un autre mode de réalisation, le GGPP est fourni à la cellule. 30 Dans un mode de réalisation particulier, les deux cassettes d'expression sont portées par une même construction. Dans un autre mode de réalisation, les deux cassettes d'expression sont portées par deux constructions distinctes. 2903703 9 La présente invention concerne donc une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule recombinante ayant une source de GGPP et comprenant un gène hétérologue codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et un 5 gène hétérologue codant pour une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24. Par hétérologue est entendu que ce gène a été introduit par génie génétique dans la cellule. Il peut y être présent sous forme épisomale ou chromosomique. L'origine du gène peut être différente de la cellule dans laquelle il est introduit. Par exemple, le gène est dit hétérologue car il est sous le contrôle d'un promoteur 10 autre que son promoteur naturel, il est introduit dans un endroit différent de celui-ci où il est situé naturellement. La cellule hôte peut contenir une copie du gène endogène au préalable de l'introduction du gène hétérologue ou elle peut ne pas contenir de copie endogène. 15 La présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. De préférence, le polypeptide présente au moins 90 ou 95% d'identité avec la SEQ ID No 22. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 20 22. Ce polypeptide présente probablement une séquence d'adressage vers les plastes. Elle est située à l'extrémité N-terminale de la protéine et comprend généralement environ les 50 premiers acides aminés. Un tel polypeptide tronqué de la séquence d'adressage vers les plastes est également considéré. Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide selon la présente invention présentant une délétion des 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 25 55 acides aminés N-terminaux. Ce polypeptide peut également comprendre une séquence additionnelle permettant de faciliter la purification de l'enzyme, par exemple une séquence étiquette comprenant plusieurs acides aminés histidine consécutifs. La présente invention concerne également un acide nucléique isolé comprenant une 30 séquence nucléotidique codant un polypeptide ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. Un exemple d'acide nucléique est l'acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 21 ou une séquence complémentaire de celle-2903703 10 ci. La présente invention concerne un acide nucléique isolé capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence à un acide nucléique qui code un polypeptide ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. Dans un mode 5 de réalisation particulier, l'acide nucléique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 21. La présente invention concerne également une cassette d'expression, un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique selon la présente invention. Les conditions de forte stringence incluent une étape de lavage d'environ 0,1 x SSC à 65 C. 10 Les acides nucléiques peuvent être des ADN génomiques, des ADN complémentaires (ADNc) ou des ADN synthétiques. Ils peuvent être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des deux. Dans le cadre de la présente invention, les acides nucléiques transcrits sont de préférence des ADNc dénués d'introns. Les acides nucléiques 15 transcrits peuvent être des molécules synthétiques ou semi-synthétiques, recombinantes, éventuellement amplifiées ou clonées dans des vecteurs, modifiées chimiquement ou comprenant des bases non naturelles. Il s'agit typiquement de molécules d'ADN isolées, synthétisées par des techniques recombinantes bien connues en soi de l'homme du métier. 20 La présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une activité de cis-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 24. Ce polypeptide présente probablement une séquence d'adressage vers les plastes. Elle est souvent située à l'extrémité N-terminale de 25 la protéine et comprend généralement environ les 50 premiers acides aminés. Un tel polypeptide tronqué de la séquence d'adressage vers les plastes est également considéré. Ainsi, la présente invention concerne un polypeptide selon la présente invention présentant une délétion des 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 55 acides aminés N-terminaux. Dans ce cas, la présente invention concerne un polypeptide isolé ou recombinant ayant une 30 activité de cis-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Ce polypeptide peut également comprendre une séquence additionnelle permettant de faciliter la purification de l'enzyme, par exemple une séquence étiquette comprenant plusieurs acides aminés histidine consécutifs. 2903703 11 La présente invention concerne également un acide nucléique isolé comprenant une séquence nucléotidique codant un polypeptide ayant une activité de cis-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Un exemple d'acide nucléique est l'acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence 5 présentant au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 23 ou une séquence complémentaire de celle-ci. La présente invention concerne un acide nucléique isolé capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence à un acide nucléique qui code un polypeptide ayant une activité de cis-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24. Dans un mode de réalisation 10 particulier, l'acide nucléique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID No 23. La présente invention concerne également une cassette d'expression, un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique selon la présente invention. 15 La présente invention concerne tout particulièrement un vecteur, une cellule hôte ou un organisme transgénique comprenant un acide nucléique comprenant une séquence hétérologue codant un polypeptide ayant une activité de cis-abiénol synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 24 et un acide nucléique comprenant une séquence hétérologue codant un polypeptide 20 ayant une activité de syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase et dont la séquence présente au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec la SEQ ID No 22. De préférence, l'organisme transgénique est une plante, en particulier une plante à trichomes glanduleux. 25 La présente invention concerne une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP comprenant la mise en contact du GGPP avec une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 dans des conditions appropriées et la récolte du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci 30 obtenus. Elle concerne l'utilisation d'une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 pour la préparation de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP. 2903703 12 La présente invention concerne une méthode de production de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir du GGPP comprenant la mise en contact du GGPP avec une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 dans des conditions appropriées et la récolte du syn- 5 copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci obtenus. Facultativement, la méthode comprend en outre l'incubation du syn-copalyl-8-ol diphosphate obtenu avec une phosphatase et la récolte du 9-beta-labda-13-en-8,15-diol. La présente invention concerne l'utilisation d'une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 pour la préparation de 9-beta-labda-13-en-8-ol-15- 10 yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP. La présente invention concerne une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate comprenant la mise en contact du syncopalyl-8-ol diphosphate avec une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % 15 d'identité avec la SEQ ID No 24 dans des conditions appropriées et la récolte du cisabiénol ou de dérivés de celui-ci obtenus. Elle concerne l'utilisation d'une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 pour la préparation de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate. 20 De manière générale, une cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à la transcription et traduction du gène en une protéine. Notamment, elle comprend un promoteur, éventuellement un amplificateur, un terminateur de transcription et les éléments permettant la traduction. 25 Le promoteur est adapté à la cellule hôte. Par exemple, si la cellule est procaryote, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les promoteurs d'ARNpolymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le promoteur PR ou PL du phage lambda. Si la cellule est eucaryote et animale, le promoteur peut être sélectionné parmi les promoteurs suivants : 30 promoteur précoce du CMV, promoteur de la thymidine kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la métallothionéineL de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et Russell (2000) ou encore aux techniques décrites dans l'ouvrage d'Ausubel et al. (2006) 2903703 13 Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un cosmide, un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc. Le vecteur peut comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une origine de réplication, un site de clonage 5 multiple et un marqueur. Le marqueur peut être un gène rapporteur qui engendre un signal détectable. Le signal détectable peut être un signal fluorescent, une coloration, une émission de lumière. Le marqueur pourra donc être GFP, EGFP, DsRed, la bétagalactosidase, la luciférase, etc... Le marqueur est de préférence un marqueur de sélection procurant à la cellule une résistance à un antibiotique. Par exemple, le gène peut être un 10 gène de résistance à la kanamycine, néomycine, etc...Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples de vecteurs procaryotes figurent dans la liste suivante qui n'est pas exhaustive : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), 15 pET (Novagen) et pQE30 (QIAGEN). Des exemples de vecteurs eucaryotes figurent dans la liste suivante qui n'est pas exhaustive : pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia);. Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive des adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc. De préférence, le vecteur 20 d'expression est un plasmide ou un vecteur viral. La cellule hôte peut être un procaryote, par exemple Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp, et Pseudomonas sp ou un eucaryote. L'eucaryote peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, Saccharomyces cerevisiae) ou un champignon 25 filamenteux (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme une cellule d'insecte, de mammifère ou de plante. La cellule peut être une cellule mammifère, par exemple COS, CHO (US 4,889,803 ; US 5,047,335). Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire. La cellule peut être isolée, par exemple dans un milieu de culture. Les cellules peuvent également être comprises dans des 30 organismes, par exemple des animaux non-humains transgéniques ou des plantes transgéniques. 2903703 14 La présente invention concerne donc une méthode de production de 9-beta-labda-13-en-8-ol-l5-yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir du GGPP dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette 5 d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase, ladite synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression du gène ; et, 10 c) facultativement, la récolte du syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier, le syn-copalyl-8-ol diphosphate produit est récolté à l'étape c). Dans un autre mode de réalisation particulier, le syn-copalyl-8-ol diphosphate produit est le produit de départ pour obtenir un autre composé d'intérêt comme le 9-beta- 15 labda-13-en-8,15-diol. Par exemple, le syn-copalyl-8-ol diphosphate peut être transformé en 9-beta-labda-13-en-8,15-diol par une phosphatase. Ainsi, la méthode peut comprendre en outre à l'étape a) l'introduction d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une phosphatase, permettant ainsi la récolte de 9-betalabda-13-en-8,15-diol à l'étape c). Parmi d'autres dérivés d'intérêt du syn-copalyl-8-ol 20 diphosphate figure le sclaréol. La présente invention concerne donc une méthode de production de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de dérivés de celui-ci à partir de GGPP dans une cellule recombinante ayant une source de GGPP et comprenant un gène hétérologue codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22. 25 La présente invention concerne donc une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syn-copalyl-8-ol diphosphate dans une cellule ayant une source de 9 syn-copalyl-8-ol diphosphate, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette 30 d'expression comprenant un gène codant pour une cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, 2903703 15 c) facultativement, la récolte du cis-abiénol ou de dérivés de celuici contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture. Dans un mode de réalisation particulier, le cis-abiénol produit est récolté à l'étape c). Dans un autre mode de réalisation particulier, le cis-abiénol produit est le produit de départ pour 5 obtenir un autre composé d'intérêt comme 1'Ambrox . La présente invention concerne donc une méthode de production de cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de syncopalyl-8-ol diphosphate dans une cellule recombinante ayant une source de syn-copalyl-8-ol diphosphate et comprenant un gène hétérologue codant pour une une cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24. 10 La cellule peut également être partie d'un organisme multicellulaire, par exemple une plante ou un animal non-humain. Dans ce cas, la méthode comprend : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol 15 diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des 20 organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, c) la récolte du cis-abiénol produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques. Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non-humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de 25 réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes glanduleux. La méthode permet de faire produire du cis-abiénol à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de cis-abiénol produit par des organismes le produisant déjà. 30 La présente invention concerne également une méthode de production de 9-beta-labda-13-en-8-ol-15-yl trihydrogen diphosphate ou de dérivés de celui-ci comprenant : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol 2903703 16 diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, 5 c) la récolte du syn-copalyl-8-ol diphosphate produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques. Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non-humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes 10 glanduleux. La méthode permet de faire produire du syn-copalyl-8-ol diphosphate à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de syn-copalyl-8-ol diphosphate produit par des organismes. La présente invention concerne également une méthode de production de cis-abiénol ou de 15 dérivés de celui-ci comprenant : a) l'introduction dans une cellule de l'organisme d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une cis-abiénol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la reconstitution d'un organisme à partir de ladite cellule et la sélection des 20 organismes transgéniques exprimant les deux gènes introduits ; et, c) la récolte du cis-abiénol produit ou de dérivés de celui-ci dans lesdits organismes transgéniques. Dans un mode de réalisation, l'organisme est un animal non-humain. Par exemple, l'organisme peut être une souris, un rat, un cobaye, un lapin, etc. Dans un autre mode de 25 réalisation préféré, l'organisme est une plante, de préférence une plante à trichomes glanduleux. La méthode permet de faire produire du cis-abiénol à des organismes ne produisant pas ce composé ou d'augmenter la quantité de cis-abiénol produit par des organismes. 30 L'invention est notamment applicable à toutes les plantes de familles possédant des trichomes glanduleux, par exemple les Astéracées (tournesol, etc.), Solanacées (tomate, tabac, pomme de terre, poivron, aubergine, etc.), Cannabacées (ex Cannabis sativa) et Lamiacées (menthe, basilic, lavande, thym, etc.). Elle est particulièrement adaptée aux plantes de la famille des Solanacées, telles que par exemple des genres Solanum, 2903703 17 Capsicum, Petunia, Datura, Atropa, etc., et en particulier du genre Nicotiana par exemple le tabac cultivé (Nicotiana tabacum), et plus particulièrement le tabac sauvage Nicotiana sylvestris. De manière non limitative, l'invention peut s'appliquer aux plantes des genres suivants : Populus, Nicotiana, Cannabis, Pharbitis, Apteria, Psychotria, Mercurialis, 5 Chrysanthemum, Polypodium, Pelargonium, Mimulus, Matricaria, Monarda, Solanum, Achillea, Valeriana, Ocimum, Medicago, Aesculus, Plumbago, Pityrogramma, Phacelia, Avicennia, Tamarix, Frankenia, Limonium, Foeniculum, Thymus, Salvia, Kadsura, Beyeria, Humulus, Mentha, Artemisia, Nepta, Geraea, Pogostemon, Majorana, Cleome, Cnicus, Parthenium, Ricinocarpos, Hymennaea, Larrea, Primula, Phacelia, Dryopteris, 10 Plectranthus, Cypripedium, Petunia, Datura, Mucuna, Ricinus, Hypericum, Myoporum, Acacia, Diplopeltis, Dodonaea, Halgania, Cyanostegia, Prostanthera, Anthocercis, Olearia, Viscaria. De préférence, la plante est une plante de la famille des Asteracées, Cannabacées, Solanacées ou Lamiacées. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la plante est du genre Nicotiana, de préférence Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tabacum. 15 Dans ce mode de réalisation, les gènes sont placés sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression, de préférence spécifique, dans les trichomes de la plante. De tels promoteurs sont connus par l'homme du métier. 20 Au sens de l'invention, on entend par promoteur "spécifique" un promoteur principalement actif dans un tissu ou un groupe cellulaire donné. Il est entendu qu'une expression résiduelle, généralement plus faible, dans d'autres tissus ou cellules ne peut être entièrement exclue. Une caractéristique particulière de l'invention réside dans la capacité de construire des promoteurs spécifiques des cellules sécrétrices des trichomes glanduleux, 25 permettant une modification de la composition des sécrétions foliaires de la plante, et notamment d'y exprimer les gènes de la présente invention permettant de préparer le cisabiénol. Ainsi, le syn-copalyl-8-ol diphosphate, le cis-abiénol ou des dérivés de ceux-ci peuvent être récoltés au niveau des trichomes de ces plantes, en particulier dans l'exsudat des trichomes. 30 Par exemple, il a été montré qu'une séquence régulatrice de 1852 pb, située en amont de l'ATG du gène CYP71D16, permet de diriger l'expression du gène rapporteur uidA spécifiquement dans les cellules sécrétrices de trichomes de tabac (demande US2003/0100050 Al, Wagner et al., 2003). D'autre part, plusieurs séquences promotrices 2903703 18 extraites de différentes espèces ont été identifiées comme étant capables de diriger l'expression d'un gène hétérologue dans les trichomes de tabac. Gène Nom du gène Plantes Références Abréviation LTP3 Lipid transfer protein Cotton Liu et al., 2000, BBA, 1487:106111 LTP6 Cotton Hsu et al., 1999, Plant science, 143:6370 wax9D B. oleracea Pyee and Kolattukudy, 1995, Plant J. 7:4559 LTP 1 Arabidopsis Thoma et al., 1994, Plant Physiol. 105 3545 CYC71D16 CBTo1 hydroxylase Tobacco Wang et al., 2002, J.of Exp. Bot. 18911897 Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le promoteur utilisé dans la 5 cassette est dérivé des gènes NsTPS-02a, 02b, 03, et 04 de l'espèce Nicotiana sylvestris possédant une forte similarité de séquence avec CYC-2 (CBT-ol cyclase; NID : AF401234). Ces séquences promotrices sont plus amplement décrites dans la demande de brevet WO2006040479. 10 Parmi les séquences terminateurs préférées, on peut citer le terminateur NOS (Bevan et al., 1983), et le terminateur du gène d'histone (EPO 633 317). Dans un mode de réalisation particulier, la cassette d'expression peut comprendre une séquence permettant d'augmenter l'expression ( amplificateur ), par exemple certains 15 éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5 290 924). De préférence, les éléments activateurs du promoteur CaMV35S sont utilisés. L'introduction des constructions portant un ou les deux gènes de l'invention dans une cellule ou un tissu végétal, y compris une graine ou plante, peut être réalisée par toute 20 technique connue de l'homme du métier, y compris sous forme épisomale ou chromosomique. Les techniques de transgenèse végétale sont bien connues dans le domaine, et comprennent par exemple l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, l'électroporation, des techniques biolistiques, transfection par un vecteur viral notamment, et toute autre technique connue de l'homme du métier. 25 Une technique communément utilisée repose sur l'utilisation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, qui consiste essentiellement à introduire la construction d'intérêt (acide 2903703 19 nucléique, cassette, vecteur, etc.) dans la bactérie A. tumefaciens, puis à mettre en contact cette bactérie transformée avec des disques de feuilles de la plante choisie. L'introduction de la cassette d'expression dans la bactérie est typiquement réalisée en utilisant comme vecteur le plasmide Ti (ou T-DNA), qui peut être transféré dans la bactérie par exemple par 5 choc thermique. L'incubation de la bactérie transformée avec les disques foliaires permet d'obtenir le transfert du plasmide Ti dans le génome des cellules des disques. Ceux-ci peuvent éventuellement être cultivés dans des conditions appropriées pour reconstituer une plante transgénique dont les cellules comprennent la construction de l'invention. Pour plus de détails ou des variantes de mise en oeuvre de la technique de transformation par A. 10 tumefaciens, on peut se référer par exemple à Horsch et al. (1985) ou Hooykaas and Schilperoort (1992). Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la cassette d'expression ainsi constituée est insérée entre les bordures gauche et droite de l'ADN de transfert (T-DNA) d'un plasmide 15 Ti désarmé pour le transfert dans des cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens. Le T-DNA comprend également un gène dont l'expression confère une résistance à un antibiotique ou un herbicide et qui permet la sélection des transformants. Une fois régénérées, les plantes transgéniques peuvent être testées pour l'expression 20 hétérologue des gènes de la présente invention ou la production du cis-abiénol ou du syncopalyl-8-ol diphosphate dans les trichomes. Ceci peut être réalisé en récoltant l'exsudat des feuilles et en testant la présence du produit d'intérêt dans cet exsudat. Ceci peut également être fait en analysant la présence d'une ou des enzymes hétérologues de la présente invention dans les feuilles et, plus particulièrement, dans les cellules de trichome 25 (par exemple en analysant les ARNm ou l'ADN génomique au moyen de sondes ou d'amorces spécifiques). Les plantes peuvent éventuellement être sélectionnées, croisées, traitées, etc. pour obtenir des plantes présentant des niveaux d'expression améliorés. Un autre objet de l'invention réside également dans une plante ou graine comprenant un 30 acide nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur tels que définis précédemment. La présente invention concerne enfin une cellule ou un organisme transgénique non-humain, caractérisé en ce que la voie de synthèse du cis-abiénol est bloquée par inactivation du gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase 2903703 20 selon la présente invention ou du gène codant pour cis-abiénol synthase selon la présente invention ou des deux gènes. L'expression de ces gènes peut être bloquée par de nombreuses techniques disponibles et connues par l'homme du métier. Les gènes peuvent être délétés, mutés (par exemple par mutagenèse chimique par Ethyl Methane Sulfonate ou 5 par rayonnements ionisants) ou interrompus (mutagenèse insertionnelle). Par ailleurs, le blocage de l'expression de ces gènes peut également être réalisé par extinction de gènes en exprimant un transcrit inhibiteur. Le transcrit inhibiteur est un ARN qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double brin, d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité 10 avec le transcrit du gène à bloquer. La présente invention concerne également un acide nucléique capable de diminuer ou de supprimer l'expression d'un gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase. En effet, un ARN inhibiteur qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double 15 brin, d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase peut être préparé sur la base de l'enseignement de la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne un ARN inhibiteur du gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase comprenant au moins 30, 20 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 21 ou d'une séquence complémentaire de celle-ci. De même, elle concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 21 ou d'une séquence complémentaire de celle-ci pour inhiber l'expression du gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) 25 synthase. L'inhibition de cette enzyme peut être utile pour stopper ou ralentir la voie de synthèse du cis-abiénol et rendre le GGPP disponible pour une autre voie de synthèse d'intérêt nécessitant un apport en GGPP. Par exemple, l'inhibition de cette enzyme peut permettre d'augmenter le taux de production du CBT-diol par les cellules glandulaires des trichomes de feuilles de tabac. La présente invention concerne donc des cellules ou des 30 organismes transgéniques dans lesquels le gène codant une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase a été inactivé. L'inactivation peut être effectuée par des techniques d'ARN interférent, de délétion de gène, de mutation chimique ou d'inactivation par recombinaison homologue. Ainsi le taux de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de cis-abiénol peut être diminué dans ces cellules ou organismes transgéniques. 2903703 21 En outre, la présente invention concerne également un acide nucléique capable de diminuer ou de supprimer l'expression d'un gène codant une cis-abiénol synthase. En effet, un ARN inhibiteur qui peut se présenter sous la forme d'un ARN double brin, d'un ARN antisens, 5 d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le gène codant une cis-abiénol synthase peut être préparé sur la base de l'enseignement de la présente invention. Ainsi, la présente invention concerne un ARN inhibiteur du gène codant une cis-abiénol synthase comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 23. De même, 10 elle concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant au moins 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucléotides consécutifs de la SEQ ID No 23 pour inhiber l'expression du gène codant une cis-abiénol synthase. L'inhibition de cette enzyme peut être utile pour stopper la voie de synthèse du cis-abiénol et rendre le syn-copalyl-8-ol diphosphate disponible pour une autre voie de synthèse d'intérêt nécessitant un apport en ce composé, par exemple pour 15 préparer des dérivés du syn-copalyl-8-ol diphosphate, par exemple, du sclaréol, ou du 9-béta labda-13-en-8,15-diol. Le sclaréol est utilisé industriellement pour la synthèse d'ambroxides, comme l'Ambrox , qui sont des ingrédients de l'industrie de la parfumerie. La présente invention concerne donc des cellules ou des organismes transgéniques dans lesquels le gène codant une cis-abiénol synthase est inactivé. L'inactivation peut être 20 effectuée par des techniques d'ARN interférent, de délétion de gène, de mutation chimique ou d'inactivation par recombinaison homologue. Ainsi le taux de cis-abiénol peut être diminué dans ces cellules ou organismes transgéniques. D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des 25 exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. 2903703 22 Exemples Identification de fragments de gènes candidats codant pour une CPS et une KS de tabac spécifiquement exprimés dans les cellules de trichomes de tabac. Les séquences codant pour les enzymes apparentées aux kaurene-synthases (KS) et aux 5 copalyl-diphosphate synthases (CPS) appartiennent à la même famille phylogénétique tout en constituant deux groupes distincts. Les séquences protéiques des membres représentatifs de ces deux familles ont été alignées avec le logiciel ClustalX (Thompson et al., 1997). L'alignement a permis de définir un motif conservé, YDTAWV (motif A ; SEQ ID No 1), pour les deux familles et des motifs conservés pour chacune des deux familles, à savoir 10 PWYASL (motif B ; SEQ ID No 2) pour la famille CPS et CAMAFR (motif C ; SEQ ID No 3) pour la famille KS. Des amorces dégénérées correspondant aux motifs conservés A, B, et C, respectivement, ont été conçues (Tableau 1). Une amplification d'ADN a été réalisée par PCR avec les 15 couples d'amorces correspondant aux motifs A / B et A / C à partir d'ADNc de trichomes de feuilles de tabac (N. tabacum) pour amplifier des fragments d'ADNc codant pour des séquences de type CPS et KS, respectivement. Deux et trois séquences ayant une forte homologie avec les séquences CPS et KS respectivement ont été identifiées et respectivement notées NtCPS1, NtCPS2, NtKSL1, NtKSL2, NtKSL3. 20 Tableau 1 : Séquences des amorces dégénérées correspondant aux motifs conservés des protéines codant pour des CPS et des KS. Motif AA Motif # Famille Séquence amorce 5' --> 3' SEQ ID No YDTAWV A CPS/KSL_ TAYGAYACNGCNTGGGT 4 PWYASL B CPS AGNGANGCRTACCANGG 5 PWYASL B CPS YAANGANGCRTACCANGG 6 PWYASL B CPS AGRCTNGCRTACCANGG 7 PWYASL B CPS AARCTNGCRTACCANGG 8 CAMAFR C KSL CGRAANGCCATNGCRCA 9 CAMAFR C KSL CTRAANGCCATNGCRCA 10 25 Des amorces spécifiques de chacun des gènes ont été définies pour déterminer le niveau d'expression des gènes dans les feuilles et les trichomes. L'analyse a été réalisée par PCR quantitative en temps réel à partir d'ADNc de feuilles et de trichomes de tabac (N. tabacum). Les gènes codant pour la cembratriene-ol synthase (CBTS-02) (NID: AF401234), et la CBT-ol hydroxylase (CYP71D16B) (NID: AF166332), qui s'expriment 2903703 23 fortement et spécifiquement dans les cellules glandulaires de trichomes de tabac, ont été utilisés comme témoins positifs. La figure 2A montre que le gène NtCPS2 s'exprime plus spécifiquement dans les trichomes de tabac que dans la feuille alors que le niveau d'expression du gène NtCPS1 est pratiquement identique dans les deux tissus. La figure 5 2A montre également que les gènes NtKSL2 et NtKSL3 s'expriment spécifiquement dans les trichomes, alors que NtKSL1 n'est pas spécifique des trichomes. La figure 2B indique que l'expression du gène NtCPS2 dans les trichomes est comparable à celui des gènes CBTS et CYP71D16B étant donné que le rapport d'expression du gène NtCPS2 sur CBTS est proche de 1 à la différence du rapport NtCPS1 sur CBTS qui est très faible (104). La 10 même analyse a permit de conclure que le gène NtKSL3 s'exprime fortement et spécifiquement dans les cellules de trichomes de feuilles de tabac (Fig. 2A et 2B). Identification des séquences nucléiques codantes complètes de NtCPS2 et NtKSL3. Les séquences nucléiques codantes et complètes pour les deux gènes NtCPS2 et NtKSL3 15 ont été identifiées par les techniques classiques de 5' RACE et 3' RACE PCR en utilisant des amorces spécifiques de chaque séquence (Tableau 2). Des ADNc isolés à partir de trichomes de feuilles de tabac (N. tabacum) ont été utilisés comme matrice pour l'amplification PCR. Les fragments 5' et 3' obtenus pour chacun des différents gènes ont été assemblés pour former les séquences codantes NtCPS2 de 2409 bases (SEQ ID N 21) 20 et de NtKSL3 (SEQ ID N 23) de 2379 bases codant respectivement pour des protéines de 802 AA (SEQ ID N 22) et 792 AA (SEQ ID N 24). Les séquences similaires à NtKSL3 ont été recherchées dans la banque de protéine SwissProt en utilisant le programme BlastP (Altschul et al., 1997). Le meilleur pourcentage d'identité a été obtenue avec la entkaurene synthase de citrouille (45%) et de l'arabette (44%) (Tableau 3). On peut noter 25 également que la séquence NtKSL3 possède un très fort degré d'identité (90 %) avec une terpène cyclase putative de tabac (Wang and Wagner, 2005, PID AAS98912.1). En effet, le segment 1-722 de cette séquence de 759 résidus correspond au segment 46-766 de la séquence NtKSL3, le segment restant 723-759 n'ayant aucun rapport avec la séquence NtKSL3. La fonction de cette protéine n'a cependant pas été démontrée. 30 5 10 2903703 24 Tableau 2 : Séquence des amorces pour amplifier les régions 5' et 3' des phases codantes des gènes NtCPS2 et NtKSL3. Cible Nom Description Séquence amorce 5' --> 3' SEQ ID No NtCPS2 8E03 5' RACE AAGACAAGATGGAAACATAGGTCTTTGA 11 NtCPS2 8E04 5' RACE CTCCCCATGAACCATCAGAAAGTTGA 12 NtCPS2 8E05 5' RACE GCAGAATACAATCTCCTCTCCCCATGA 13 NtCPS2 8C01 3' RACE CCTGATGGTTCATTCTTAATATCCCCTG 14 NtCPS2 8CO2 3' RACE CAATACCCGTTCGACTTGGTAACACGA 15 NtKSL3 8G04 5' RACE ATGCTGTGTCATAGGAAGAAGGAGATAG 16 NtKSL3 8G05 5' RACE AACATGGTTGGTTCATAGAATATCTTGA 17 NtKSL3 8G06 5' RACE GTCTTTTACAAGCAATGGATGGCTAGGA 18 NtKSL3 8CO5 3' RACE CCTGCATGATCAACTATGCAGAGAAACTTA 19 NtKSL3 8C06 3' RACE CCTTGTAAATATGATGCTCTGCGAACGT 20 Tableau 3 : Séquences présentant le meilleur pourcentage d'identité obtenu par recherche d'homologie avec le programme BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) contre la banque SwissProt avec la séquence NtKSL3. Description Organisme N accession Fonction %d'identité CmKS entKaurene B Cucurbita maxima L. AAB39482 ent-kaurene synthase 45 AtGA2 Arabidopsis thaliana AAC39443 ent-kaurene synthase 44 AgE-a-bisabolene synthase Abies grandis AAC24191 E-alpha-bisabolene synthase 34 AgAbietadiene synthase Abies grandis AAB05407 Abietadiene synthase 27 TbTaxadiene synthase taxus baccata Q93YA3 Taxadiene synthase 26 5 2903703 25 Tableau 4 : Séquences présentant le meilleur pourcentage d'identité obtenu par recherche d'homologie avec le programme BlastP 2.2.13 (Altschul et al., 1997) contre la banque SwissProt et Genbank, respectivement, avec la séquence NtCPS2. Description Organisme Entkaurene synthase A, Pisum sativum chloroplast precursor ent-kaurene synthase A, Arabidopsis thaliana chloroplast precursor Abietadiene synthase, Abies grandis chloroplast precursor Alpha-bisabolene synthase Abies grandis Description Organisme copalyldiphosphate Lactuca sativa synthase No1 copalyl pyrophosphate Stevia rebaudiana synthase copalyl diphosphate Croton sublyratus copalyl diphosphate Lycopersicon synthase esculentum putative copalyl Scoparia dulcis diphosphate synthase N Fonction % identité / accession NtCPS2 004408 Ent-copalyldiphosphate synthase 44 Q38802 Ent-copalyldiphosphate synthase 45 Q38710 Abietadiene synthase 42 081086 (E)-alpha-bisabolene synthase 34 N Fonction % identité accession avec NtCPS2 BAB12440.1 Putative copalyldiphosphate 48 synthase AAB87091.1 Putative copalyldiphosphate 48 synthase BAA95612.1 Putative copalyldiphosphate 48 synthase BAA84918.1 Putative copalyldiphosphate 47 synthase BAD91286.1 Ent-copalyldiphosphate synthase 46 Identification de la fonction de la protéine codée par NtCPS2 10 Afin d'établir la fonction de la protéine NtCPS2, la production de l'enzyme recombinante NtCPS2-HisTAG par E. coli a été réalisée, pour identifier son (ses) activité(s) potentielle(s). La séquence nucléique codant pour NtCPS2 (séquence ID N 21) a été introduite dans le vecteur d'expression pET-30b (Novagen). Pour faciliter la purification de la protéine, le codon STOP de la séquence a été éliminé pour créer une protéine de 15 fusion avec une queue de 5 histidines en position C-terminale. Le vecteur NtCPS2-pET30b a été introduit par électroporation dans des cellules E. Coli d'expression (BL21-CodonPlus, Stratagene). La production de la protéine dans ces cellules a été induite par addition d'IPTG 1 mM, à 16 C, à partir de 500 ml de culture. Après 18 heures d'induction, les cellules sont collectées par centrifugation, et lysées par un choc de 20 dépression (AP: 19 bar). Les protéines solubles dessalées sur une colonne PD10 (Amersham), sont appliquées sur une résine d'affinité nickel-nitrilotriacetique d'agarose (Ni-NTA) selon le protocole du fabriquant (Qiagen). Les tests d'activité ont été réalisés sur la fraction protéique enrichie en NtCPS2-HisTag dans un tampon contenant 50 mM Hepes, 2903703 26 100 mM KC1, 7,5 mM MgC12, 5% glycérol, et 5 mM DTT. Les substrats suivants GPP, FPP, GGPP ont été testés séparément à une concentration de 65 M avec 25 ou 50 g de protéines, incubés à 32 C pendant 2 heures. Les produits de la réaction ont ensuite été déphosphorylés par ajout de 20 unités de phosphatase alkaline d'intestin de veau (New 5 England Biolabs) pendant 1 heure à 37 C. Les produits ont été extraits par une mélange chloroforme:méthanol:eau (5:1:4). Les phases aqueuse et organique sont séparées par centrifugation, la phase organique est séchée sous courant d'azote, reprise dans du pentane et analysée par GC/MS. 10 La fonction enzymatique de NtCPS2 a été étudiée par la production de l'enzyme recombinante NtCPS2-HisTAG depuis E. coll. Le mélange d'enzyme soluble obtenu de la disruption de E. coli a ensuite été chargé sur colonne d'affinité. Un facteur d'enrichissement de 15 à 20 est évalué par électrophorèse sur gel SDS. Pour démontrer sa fonction, NtCPS2-HisTAG a été incubé avec 3 différents substrats : GPP, FPP et GGPP. 15 Aucun nouveau produit n'a été détecté avec le GPP ou le FPP montrant que NtCPS2-HisTAG n'utilise pas ces substrats. En revanche, lorsque le GGPP a été utilisé, un nouveau diterpen-diol apparaît. L'ion moléculaire 308 est très minoritaire, mais l'ion 290 correspondant à la perte d'une fonction alcool par élimination d'une molécule d'eau (M-18) est identifiable sur le spectre de masse (Figure 7). Le pic a été identifié comme étant le 20 9-beta labda-l3-en-8,15-diol par comparaison avec le pic de 9-beta labda-13-en-8,15-diol naturellement produit dans l'exsudat des feuilles de N. tabacum (Figure 6). Le spectre de masse et le temps de rétention du nouveau composé sont identiques à celui présent chez N. tabacum (Fig. 7). Le produit obtenu correspond au produit de déphosphorylation du 9-beta labda-13-en-8-o1-15-y1 trihydrogen diphosphate (syn-CODP). 25 Identification de la fonction des protéines codées par NtKSL3 et NtCPS2. Pour déterminer la fonction des gènes NtKSL3 et NtCPS2, leurs séquences ont été introduites par transformation génétique dans N sylvestris, un tabac sauvage qui ne produit pas de cis-abiénol et dans une lignée transgénique de N sylvestris (lignée source ihpCBTS) 30 dont l'expression du gène CBTS a été inhibée par ARN interférence (Tissier et al., 2005). Dans cette lignée, la quantité de CBT-diol des feuilles est très réduite. Un promoteur de tabac trichome spécifique (eCBTS1.0, Tissier et al., 2004) a été mis en amont des séquences codantes NtCPS2 et NtKSL3 pour former les constructions eCBTS 1.0-NtCPS2 [#1] et eCBTS1.0-NtKSL3 [#2]. Ces deux constructions ont été introduites dans un même 2903703 27 vecteur binaire contenant un gène de résistance à la kanamycine pour donner le vecteur binaire pLIBRO-58 (Fig. 3A). Les constructions #1 et #2 ont également été introduites de manière indépendante dans le même vecteur pour former les vecteurs binaires pLIBRO-68 (Fig. 3B) et pLIBRO-69 (Fig. 3C), respectivement. Les vecteurs ont été introduits dans la 5 souche d'Agrobacterium LBA4404 par électroporation. Les souches contenant les différents vecteurs ont été utilisées pour réaliser la transformation génétique de N. sylvestris par la méthode des disques foliaires (Horsch et al., 1985). Environ 25 plantes résistantes à la kanamycine ont été obtenues pour chaque construction. La présence des transgènes dans chaque plante a été confirmée par PCR à partir d'ADN génomique de 10 feuilles. Le niveau d'expression des transgènes a été vérifié par RT-PCR à partir d'ARNm de feuilles de tabac. Les exsudats des plantes qui expriment les transgènes ont été extraits par immersion dans une solution de pentane pendant 1 min. Les extraits ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectre de masse (GC/MS). Un exemple de profil chromatographique des exsudats de plantes obtenues par GCIMS est 15 présenté sur la figure 4. Il montre que l'exsudat d'une lignée transgénique contenant les gènes NtCPS2 et NtKSL3 contient un pic supplémentaire noté n l' à 40,5 min. L'exacte superposition des temps de rétention et des spectres de masse du pic 1 à 40,5 min avec celui du cis-abiénol naturellement produit par N. tabacum (figures 4A et 5A), démontre l'authenticité du pic n 1 comme étant le cis-abiénol. Les plantes qui expriment les deux 20 transgènes NtCPS2 et NtKSL3 produisent des quantités importantes de cis-abiénol dans la lignée ihpCBTS (Tableau 5). Les lignées transgéniques ayant intégré le gène NtCPS2 seul ou le gène NtKSL3 seul ne produisent pas de cis-abiénol. Ces résultats indiquent que la présence des deux gènes est nécessaire à la synthèse de cis-abiénol. En conclusion, NtKSL3 et NtCPS2 permettent la biosynthèse de cis-abiénol à partir de GGPP. 25 2903703 28 Tableau 5 : Taux de cis-abiénol et de CBT-diol dans les exsudats des plantes transgéniques ayant intégré et exprimant les transgènes NtCPS2 et NtKSL3. La quantification de cis-abiénol a 5 été réalisée par GC/MS par comparaison avec un standard de cis-abiénol purifié à partir d'exsudat de feuilles de N. tabacum. N sylvestris ihpCBTS : Lignée transgénique dont l'expression du gène CBTS a été inhibée par ARN interférence. Plants Original plant cis-abienol CBT-diol [pgIG Fie] [pgIG FW-1] 3385 N. sylvestris ihpCBTS 117 158 3408 N. sylvestris ihpCBTS 55 586 3380 N. sylvestris ihpCBTS 49 734 3379 N. sylvestris ihpCBTS 45 1033 3396 N. sylvestris ihpCBTS 44 8 3387 N. sylvestris ihpCBTS 29 99 3398 N. sylvestris ihpCBTS 14 169 3403 N. sylvestris ihpCBTS 13 53 3388 N. sylvestris ihpCBTS 8 550 3397 N. sylvestris ihpCBTS 7 5 Références Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schàffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. 15 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. (2006) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Bevan M, Barnes WM, Chilton MD. (1983) Structure and transcription of the nopaline 20 synthase gene region of T-DNA. Nucleic Acids Res. 11: 369-385. Cane DE. 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Plant Physiol. 1998 116(4):1271-8. 15 Revendications 1- Méthode de production du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci à partir de géranyl géranyl diphosphate (GGPP) dans une cellule ayant une source de GGPP, comprenant : a) l'introduction dans ladite cellule d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22 et d'une construction portant une cassette d'expression comprenant un gène codant pour une cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 24 ; b) la culture de la cellule transformée dans des conditions appropriées pour l'expression des gènes ; et, a) facultativement, la récolte du cis-abiénol ou de dérivés de celui-ci contenus dans ladite cellule et/ou dans le milieu de culture. 2- Protéine isolée ou recombinante ayant une activité cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase et ayant une séquence présentant au moins 95 % d'identité avec la SEQ ID No 24. 3- Protéine isolée ou recombinante ayant une activité syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-20 CODP) synthase et ayant une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID No 22. 4- Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 2, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des conditions 25 stringentes et ayant une activité cis-labda-12,14-dien-8 alpha-ol synthase. 5- Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine selon la revendication 3, ou une séquence capable de s'hybrider à celui-ci dans des conditions stringentes et ayant une activité syn-copalyl-8-ol diphosphate (syn-CODP) synthase. 6- Cassette d'expression comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5. 7- Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5 ou une cassette d'expression selon la revendication 6. 31 30 2903703 32 8- Cellule hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5, une cassette d'expression selon la revendication 6, ou un vecteur selon la revendication 7. 9- Organisme transgénique non-humain comprenant un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5, une cassette d'expression selon la revendication 6, un vecteur selon la revendication 7, ou une cellule selon la revendication 8. 10- Organisme transgénique selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'organisme est une plante à trachomes glanduleux, de préférence du genre Nicotiana. 11- Utilisation d'une protéine selon la revendication 2 ou 3, d'un acide nucléique selon la revendication 4 ou 5, d'une cellule hôte selon la revendication 8 ou d'un organisme transgénique selon la revendication 9 ou 10 pour la préparation de syn-copalyl-8-ol diphosphate ou de cis-abiénol ou de dérivés de ceux-ci. 12- Cellule ou organisme transgénique non-humain, caractérisé en ce que la voie de synthèse du cis-abiénol est bloquée par inactivation du gène codant pour une protéine selon la revendication 2 ou du gène codant pour une protéine selon la revendication 3 ou des deux gènes.