Brevet FR2908889A1 — publié le 20080523

Nouveaux polypeptides pour le diagnostic in vitro et la prévention des infections à Staphylococcus aureus et/ou Staphylococcus epidermidis sur prothèses articulaires et autres matériels étrangers implantés. La présente invention concerne un outil de diagnostic sérologique des infections staphylococciques sur prothèses articulaires (par exemple : infection sur prothèse de hanche, coude, genou, cheville,...) et, plus généralement, des infections staphylococciques sur matériel étranger implanté dans le corps. L'invention comprend, en particulier, l'identification, la production, l'optimisation et l'utilisation de deux nouveaux polynucléotides et polypeptides dans le domaine du diagnostic des infections sur matériel étranger (prothèses articulaires par exemple), infections impliquant S. aureus et/ou S. epidermidis. Des centaines de milliers de prothèses articulaires sont posées annuellement dans le monde (Lew et Waldvogel. 1997. Osteomyelitis. N Engl J Med 336:999-1007) . Les infections sur prothèses articulaires (en abrégé, IPA) constituent, à ce jour, un problème majeur de santé publique. Le diagnostic d'une IPA repose sur un faisceau d'arguments cliniques, paracliniques et microbiologiques. Actuellement, aucun de ces éléments pris isolément ne peut apporter de diagnostic formel. La symptomatologie clinique peut parfois suffire à affirmer l'infection (fistule) et, dans la grande majorité des cas, elle a comme rôle fondamental d'alerter le clinicien et de lui permettre d'initier les examens complémentaires qui vont amener le diagnostic. Malgré des progrès considérables enregistrés au cours de ces dernières années, les IPA restent une complication fréquente, avec des taux de 0,3 à 1,8% pour les prothèses totales de hanche (Berbari et al., 1998, Clin Infect. Dis., 27:1247-1254 ; Lidgren. 2001. Joint prosthetic infections: a success story. Acta Othop Scand 72:553- 556) et de 0,5 à 5% pour les prothèses totales du genou (Bengtson et Knutson. 1991. The infected knee arthroplasty. A 6-year follow-up of 357 cases. Acta Othop Scand 62:301-311 ; Eveillard et al. 2002. Risque infectieux après 2908889 2 implantation de prothèses de genou. Etude des infections profondes pour une série continue de 210 prothèses totales de genou en première intention. B E H n 13) . L'IPA apparaît donc être une complication redoutable, ayant pour conséquences non seulement la nécessité d'une ou 5 plusieurs ré-interventions et d'une antibiothérapie au long cours, mais aussi un handicap prolongé, un risque d'amputation et même de décès, d'où l'importance pour le patient d'un diagnostic fiable et précoce. Les staphylocoques 10 Les bactéries du genre Staphylococcus sont des coques (cocci) à Gram positif, immobiles, non sporulés, à catalase positive et oxydase négative. Staphylococcus aureus se distingue généralement des autres espèces de staphylocoques existantes par la production d'une enzyme de type 15 coagulase. Le réservoir naturel de S. aureus est l'homme et les animaux à sang chaud. Le site de colonisation préférentielle chez l'homme est la muqueuse nasale : jusqu'à 30% des adultes hébergent S. aureus de façon 20 permanente dans leurs narines, et 50% de façon intermittente. A partir de ce site de portage, S. aureus colonise la peau et, en particulier, les zones humides (aisselles, périnée) et les mains. S. aureus est aussi retrouvé en petites quantités dans l'intestin. Enfin, 25 l'environnement immédiat de l'homme est également une source de contamination potentielle, du fait de la persistance de S. aureus après son élimination dans le milieu extérieur. S. aureus est responsable d'infections très diverses 30 (infections telles que folliculites, impétigo, furoncles, anthrax, panaris, cellulites, sinusites ou otites). Ces infections peuvent se compliquer par extension locorégionale ou par diffusion hématogène des bactéries. S. aureus est ainsi responsable de septicémies, 35 d'endocardites, de pneumopathies, d'ostéomyélites, d'arthrites et de méningites. Ces infections peuvent engager le pronostic vital par elles-mêmes (par exemple, 2908889 3 atteinte d'une valve cardiaque) ou lors de choc toxique associé. S. epidermidis représente avec les autres staphylocoques le principal commensal de la peau avec une 5 densité de colonisation plus dense au niveau des zones humides. La transmission intra- ou interhumaine s'opère généralement par contact direct (manuportage). Plus rarement, elle peut être indirecte à partir d'une source environnementale (vêtements, draps, matériels médicaux). 10 S. epidermidis est, de loin, le staphylocoque le plus fréquemment isolé dans les infections sur matériel étranger. Infections à staphylocoques sur matériel étranger Les staphylocoques sont les principaux agents des IPA 15 et des autres infections sur matériels étrangers. Ce sont les germes les plus fréquemment retrouvés, puisqu'ils représentent jusqu'à 75% des bactéries isolées, S. aureus et S. epidermidis étant les espèces prévalentes. D'une façon générale, les IPA et autres infections 20 sur matériel étranger dues à S. aureus sont plus souvent aiguës et suppuratives, en rapport avec la production de nombreuses enzymes et toxines par cette espèce (Nair et al. 2000. Advances in our understanding of the bone and joint pathology caused by Staphylococcus aureus infection. Rheumatology (Oxford) 39:821-834) . 25 Les infections staphylococciques sur matériel étranger se distinguent clairement des infections hors matériel étranger (par exemple, septicémies, méningites, sinusites, otites...), par l'organisation des bactéries sous forme de b i o film (Costerton, et al. 1999. Bacterial biofilms: a common 30 cause of persistent infections. Science 284:1318-22) décrit chez de nombreux staphylocoques, notamment S. aureus et étudié surtout chez S. epidermidis ( Tormo MA, Marti M, Valle J, Manna AC, Cheung AL, Lasa I et Penades JR. 2005. SarA is an essential positive regulator of Staphylococcus epidermidis biofilm development. J Bacteriol; 187:2348-56.) . Le biofilm est une 35 structure tridimensionnelle complexe associée au matériel étranger et où les cellules bactériennes sont enveloppées dans une matrice extracellulaire de nature 2908889 4 polysaccharidique appelée slime ou glycocalyx (Davey et O'Toole. 2000. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64:847-867) . Comparativement à leurs congénères vivant sous forme libre (ou "planctonique"), ces 5 bactéries sont dans un état de quiescence marqué par une faible activité métabolique (Yao et al. 2005. Genomewide analysis of gene expression in Staphylococcus epidermidis biofilms: insights into the pathophysiology of S. epidermidis biofilms and the role of phenol-soluble modulins in formation of biofilms. J Infect Dis 191:289-298) . 10 Les infections sur matériel étranger, y compris les IPA, associées à la formation de biofilm présentent donc un certain nombre de caractéristiques qui les distinguent totalement des infections hors matériel étranger. En effet, ces infections sont le plus souvent pauci-bactériennes 15 (faible nombre de bactéries) et volontiers polymicrobiennes (association de plusieurs espèces). Comme indiqué plus haut, dans les infections sur matériel étranger, les bactéries ont un métabolisme très ralenti qui les maintient dans un état proche de la dormance, et les 20 gènes qu'elles expriment sont différents de ceux mis en action chez les formes planctoniques (Yao et al. 2005 [déjà cité]) . L'état de dormance des bactéries et la présence du biofilm réduisent considérablement la réaction inflammatoire et l'attraction des cellules immunitaires au site de 25 l'infection (Vuong et al. 2004. Crucial role for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation, immune evasion, and virulence. J. Biol. Chem. 279, 52:54881-54886 ; Fux et al. 2003. Bacterial biofilms: a diagnostic and therapeutic challenge. Expert Rev Anti Infect Ther. 1:667-83) . La présence d'une réponse immunitaire de type IgA est également tout à fait 30 surprenante considérant la localisation de l'infection, c'est-à-dire le matériel étranger implanté. Enfin, pour les mêmes raisons, les bactéries sont en grande partie protégées de l'action des antibiotiques (Costerton et al. 1995 [déjà cité]). 35 Diagnostic et suivi des IPA à staphylocoques Diagnostic bactériologique 2908889 5 Le diagnostic bactériologique d'infection à staphylocoque est, aujourd'hui, quasi exclusivement direct, par mise en évidence de la bactérie à partir de prélèvements pertinents. L'examen microscopique permet la 5 recherche de cocci réguliers, à Gram positif, groupés en amas. Cet examen est très peu sensible et ne fournit aucune indication sur l'espèce en cause. L'interprétation du résultat obtenu lors de ce diagnostic direct reste toutefois soumis aux contaminations éventuelles puisque les 10 staphylocoques sont des contaminants fréquents. Diagnostic sérologique Le diagnostic indirect d'infection staphylococcique par recherche des anticorps circulants est aujourd'hui très peu développé et ne concerne que le diagnostic de certaines 15 infections sévères à S. aureus hors matériel étranger : endocardites, septicémies, infections ostéo-articulaires hématogènes (Sôderquist et al. 1993. Staphylococcal alpha toxin in septicaemic patients; detection in serum, antibody response and production in isolated strains. Serodiagn Immunother Infect Dis 5:139-144 ; Nordin et al. 1995. Antibody response in 2 0 patients with osteomyelitis of the mandible. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 79:429-435 ; Kanclerski et al. 1996. Selim antibody response to Staphylococcus aureus enterotoxins and TSST-1 in patients with septicaemia. J Med Microbiol 44:171-177 ; Colque-Navarro et al. 1998. Antibody response in Staphylococcus aureus septicemia û a prospective study. J Med Microbiol 47:217-22.5 ; Colque-Navarro & 25 Môllby. 1999. Usefulness of staphylococcal serology. J Med Microbiol 48:107-109 ; Ellis et al. 2003. Role of staphylococcal enterotoxin A in a fatal case of endocarditis. J Med Microbiol 52:109-112) . On notera que US 6 703 492, US 6 380 370 et WO 01/34809 proposent des outils de diagnostic sérologique pour la mise en évidence de S. epidermidis et 30 indiquent, certes, que ce germe affecte, notamment, les prothèses et cathéters, mais l'enseignement de ces brevets s'applique, en fait, aux infections hors matériel étranger. Les tests actuels reposent sur la recherche d'anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques de 35 S. aureus ou produits à partir de S. aureus : anticorps anti-a-toxine (ou antistaphylolysines alpha), anti-acide p-ribitol téichoïque, anti-entérotoxines et anti-toxine 1 2908889 6 de choc toxique staphylococcique (anti-TSST1), et anticorps anti-capsulaires ; la détection des anticorps se fait par inhibition d'hémolyse, électrosynérèse ou ELISA (Bornstein et al. 1992. Immune response to staphylococcal toxins and ribitol teichoic acid in 5 Staphylococcus aureus infections. Med Microbiol Lett 1:111-119 ; Christensson et al. 1993. Diagnosing Staphylococcus aureus endocarditis by detecting antibodies against S. aureus capsular polysaccharides types 5 and 8. J Infect Dis 163:530-533 ; Kanclerski et al. 1996 [déjà cité]) . Ces tests sont globalement peu sensibles et peu spécifiques, et donnent des résultats variables 10 selon les souches responsables des infections, notamment en fonction des toxines qu'elles produisent (par exemple : réponse plus forte pour les souches entérotoxines B et/ou C positives que pour les souches entérotoxine A et/ou TSST1 positives) (Kanclerski et al. 1996 [déjà cité]). Enfin, il 15 n'existe pas à ce jour de tests utilisant des polypeptides et permettant d'identifier la classe des anticorps produits, et notamment s'il s'agit d'IgG ou d'IgA. En ce qui concerne l'IPA, il est essentiel de pouvoir la diagnostiquer avec certitude. En effet, le traitement 20 d'une IPA, lourd et coûteux, est associé à un retentissement fonctionnel important et n'est pas dénué de risque vital. En général, le traitement consiste en un débridement chirurgical extensif et méticuleux associé à une antibiothérapie adaptée et prolongée ; les principales 25 options chirurgicales sont l'échange en un temps de la prothèse, le débridement avec rétention de la prothèse et la réimplantation de la prothèse en deux temps, ce qui nécessite des temps d'hospitalisation plus longs (Garvin et Hanssen. 1995. Current concepts review. Infection after total hip arthroplasty. Past, 30 present, and future. J Bone Joint Surg 77-A:1576-1588) . La mortalité associée à l'intervention chirurgicale pour IPA est de 0,4 à 1,2% pour les patients de 65 ans et de 2 à 7% pour les patients de 80 ans (Lentino. Prosthetic joint infections: bane of orthopedists, challenge for infectious disease specialists. Clin Infect Dis 36:1157-1161) . 35 Ainsi, aucune des méthodes de diagnostic actuelles n'a recours à l'utilisation d'antigène purifié, spécifique et sensible, pour mettre en évidence une infection à 2908889 7 S. aureus et/ou à S. epidermidis sur prothèse articulaire ou matériel étranger. Par ailleurs, les méthodes sérologiques existantes ne permettent ni de réaliser de suivis thérapeutiques ni de réaliser des diagnostics post- 5 implantatoires. Il existe, dans ce domaine, un très grand besoin en une technique de diagnostic sérologique, spécifique et sensible, d'infection "naturelle" afin de réaliser des tests rapides, peu coûteux et non invasifs. Idéalement ces 10 tests devraient permettre d'identifier S. aureus et/ou S. epidermidis comme étant le germe en cause, germe dont le pouvoir de destruction tissulaire est très important. Il est précisé que l'expression "infection naturelle" est utilisée par opposition à "hyperimmunisation" ou 15 "immunisation" par exemple de type vaccin. L'immunisation, ou vaccination, consiste en effet en des injections qui renforcent le système de défense du corps ou système immunitaire contre certaines infections chez l'homme ou chez l'animal. En général, les injections contiennent des 20 formes atténuées ou inactives de certains microorganismes. La vaccination stimule le système immunitaire afin qu'il produise des anticorps capables de fixer lesdits microorganismes. Il existe deux types de vaccin - les vaccins vivants et les vaccins morts ou inactivés. Un 25 vaccin vivant est réalisé à partir d'une forme atténuée du microorganisme. Un vaccin inactivé ou mort est réalisé à partir du microorganisme tué ou de fragments de celui-ci (protéines, sucres, lipides, etc...) ou encore des protéines recombinantes qui miment les protéines naturelles 30 dudit microorganisme (voir par exemple Eloit M., 1998.. Vaccins traditionnels et vaccins recombinants. INRA Prod. Anim., 11, 5-13) . Les quantités de protéines utilisées pour la vaccination sont très variables mais comprises entre 10 microgrammes et 50 milligrammes par dose. Ces quantités ne sont en rien comparables à la 35 quantité d'une protéine donnée présente lors d'une infection "naturelle", quantité qui est bien inférieure. Ainsi, la probabilité que cette protéine soit présentée au 2908889 8 système immunitaire est donc considérablement plus faible. Ceci est d'autant plus avéré lorsqu'il s'agit d'une infection sur matériel étranger par une bactérie formant un biofilm protecteur (voir plus haut). 5 La difficulté d'identifier des antigènes révélant un processus infectieux est attestée par des études effectuées dans le laboratoire de la Déposante qui ont montré que de nombreux antigènes de S. aureus et/ou S. epidermidis, dont des exemples sont donnés plus loin, ne sont pas des 10 marqueurs d'infection, les témoins répondant dans les mêmes proportions que les malades avérés. Par ailleurs sur les quelques 2700 gènes que comporte le génome de la souche de S. aureus et/ou S. epidermidis, la Déposante a identifié deux antigènes marqueurs d'infection sur prothèse 15 articulaire ou autre matériel étranger, dont l'utilisation est à ce jour inconnue en sérologie. L'utilisation de ces antigènes pourrait également permettre un diagnostic précoce d'IPA et, donc, éviter une prise en charge chirurgicale systématique à un stade 20 d'infection débutante. Ceci pourrait être réalisé par un suivi sérologique longitudinal des patients, c'est-à-dire un suivi sur une période de temps substantielle, après pose de prothèse (diagnostic post-implantatoire), notamment chez les patients présentant un risque élevé d'IPA. 25 Enfin, dans l'avenir, en cas de développement d'approches vaccinales visant à prévenir les IPA staphylococciques, notamment, mais non exclusivement, celles dues à S. aureus et/ou S. epidermidis, la conduite de tests sérologiques seront indispensables pour détecter 30 les échecs de vaccination. La présente invention a pour objectif de résoudre les problèmes posés par l'absence de tests sérologiques permettant la mise en évidence d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger, notamment sur 35 prothèse articulaire, par la détection d'anticorps circulants présents en faible quantité dans le sérum, 2908889 9 anticorps produits lors d'une infection naturelle par des bactéries protégées du système immunitaire par un biofilm. L'invention a, pour objectif supplémentaire, de permettre une analyse plus précise et plus complète de 5 l'infection grâce à la détection des différents isotypes d'anticorps spécifiques des polypeptides. Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans 10 cette description. On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un 15 ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange 20 d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme 25 polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent, les ADN ou ARN avec des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres 30 raisons sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les 35 polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides 2908889 10 comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au 5 moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée. Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines. 10 Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par 15 des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino- 20 terminales. Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturel ou synthétique, qui sont bien 25 connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation 30 covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation 35 de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la 2908889 11 méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telles que l'arginylation ou 5 l' ubiquitination (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 10 182:626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)) . On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques 15 entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou 20 polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette 25 comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10 . 0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman et Wunsch (1970). J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. 3 0 Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley) . Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux 35 séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. 2908889 12 Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polynucléotide ID SEQ N 1 est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à ladite 5 séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides de la séquence ID SEQ N l peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou jusqu'à 5% du nombre total de nucléotides de la séquence ID SEQ N 1 peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces modifications peuvent être 10 positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. Par analogie, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est 15 un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou jusqu'à 5% du nombre 20 total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2 peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou 25 plusieurs emplacements . (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 30 1987) . La "similarité" est, quant à elle, calculée de la même façon que l'identité, excepté que les acides aminés des caractéristiques considérés comme par "fragment de polypeptide" un polypeptide comprenant au moins "n" acides aminés non identiques, mais présentant physico-chimiques communes, sont 35 identiques. On entend 2908889 13 consécutifs issus des polypeptides ID SEQ N 2 et 4, où, selon les séquences, n sera égal à 7 acides aminés ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50 ou plus acides aminés). Préférentiellement, lesdits fragments 5 comportent un épitope de la séquence ID SEQ N 2 ou 4. Ces épitopes de type B ou T peuvent être déterminés par un logiciel (par exemple, PEOPLE [Alix, 1999], PREDITOP [Pellequer et Westhof, 1993] ou TEST [Zao et al., 2001]) ou expérimentalement par des techniques classiques [par 10 exemple, épitope mapping (cartographie d'épitope) ou protéolyse ménagée]. On entend par "fragment de polynucléotide" un polynucléotide comprenant au moins "n" nucléotides consécutifs issus des polynucléotides ID SEQ N 1 ou 3, où, 15 selon les séquences, n sera égal à 21 nucléotides ou plus (par exemple, 22, 23, 24, 25, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 90, 120, 150 ou plus nucléotides). On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de 20 transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le 25 lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. 30 On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de Staphylococcus aureus et/ou de Staphylococcus epidermidis, et la fonction d'un 35 polynucléotide conforme à l'invention est celle de coder ce polypeptide. La fonction d'une combinaison d'antigènes est de permettre d'établir un diagnostic d'une infection sur 2908889 14 matériel étranger et, en particulier, sur prothèse ostéoarticulaire, mais aussi de réaliser des suivis postimplantatoire, des suivis thérapeutiques et, enfin, de préciser s'il s'agit d'une infection active ou aiguë par, 5 par exemple, l'utilisation de la détection de différents isotypes d'anticorps. On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette 10 définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène. On entend par "analogiestructurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la 15 structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) . (BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995) . 20 On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même 25 fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent 30 conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique. Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide 35 initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un 2908889 15 variant non-naturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique 5 complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui 10 permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier. On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, 15 polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné suivie d'une récupération des 20 anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide. Le terme "immunospécifique" appliqué au terme 25 anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. On entend par "molécules immunospécifiques", par 30 exemple, des récepteurs de cellules T (TCR) comme récemment décrit (Li Y, Moysey R, Molloy PE, Vuidepot AL, Mahon T, Baston E, Dunn S, Liddy N, Jacob J, Jakobsen BK, Boulter JM. Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display. Nat Biotechnol. 2005, 23:349-54) ou des molécules caractérisées par leur fixation spécifique 2908889 16 à un polypeptide donné, par exemple de séquence ID SEQ N 2 ou 4, à un fragment ou à un variant de ce polypeptide. Ces molécules peuvent être, par exemple sélectionnées par évolution dirigée (voir, par exemple, Conrad U, Scheller J. Considerations on 5 antibody-phage display methodology. Comb Chem High Throughput Screen. 2005, 8:117-26) . On entend par "fixation spécifique" d'une molécule à un polypeptide, par exemple de séquence ID SEQ N 2 ou 4, ou à un fragment ou à un variant de ce polypeptide, une interaction de ladite molécule avec ledit polypeptide, 10 fragment ou variant, présentant une affinité de l'ordre de 106M, 5.106M, 10'M, 5.107M, 108M, 5.108M, 109M ou supérieure. Par "affinité", on entend à la fois une complémentarité structurale et une complémentarité électrostatique entre deux molécules au sens d'une 15 définition communément admise (voir, par exemple, Klotz IM. Ligandprotein binding affinities. In Protein Function, a Practical Approach (T. E. Creighton, Ed.). 1989; 25-35. IRL Press, Oxford, ou encore Ajay, Murcko MA. Computational methods to predict binding free energy in ligand-receptor complexes. J Med Chem. 1995 ;38:4953-67). 20 Par sérum "positif", on entend un sérum contenant des anticorps, produits à la suite d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis sur prothèse articulaire, identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention. 25 On entend par "sensibilité" la proportion de malades infectés, diagnostiqués selon l'art antérieur et donnés positifs par le diagnostic selon l'invention. On entend par "spécificité", la proportion de donneurs de sang, testés comme témoins, soumis au 30 diagnostic selon l'invention et donnés négatifs par le diagnostic selon l'invention. On entend par "kit de diagnostic" un ensemble contenant au moins l'un des produits selon l'invention (polypeptide, polynucléotide, anticorps, molécule 2908889 17 immunospécifique) et un diluant convenable , rassemblés dans un contenant approprié fait dans un matériau adapté. Ce contenant peut rassembler les différents moyens complémentaires nécessaires au test sérologique (par 5 exemple, des réactifs marqués, des tampons, des solutions qui contiennent des ions adaptés, etc...) ainsi que les instructions requises pour réaliser le test. La présente invention répond aux objectifs qu'elle s'est fixés plus haut en apportant de nouveaux 10 polynucléotides et de nouveaux polypeptides pour le diagnostic sérologique d'infections à S. aureus et/ou S. epidermidis sur prothèse ou matériel étranger implanté dans le corps humain. L'invention a pour objet l'utilisation, in vitro, de 15 l'une au moins des protéines de séquence ID SEQ N 2 ou 4 d'un fragment ou d'un variant de cette protéine, de cellules hôtes comprenant des vecteurs incluant un polynucléotide codant pour l'une au moins desdites protéines ou un variant desdites protéines, dans la 20 production d'anticorps et le domaine du diagnostic in vitro de S. aureus et/ou S. epidermidis. L'invention a également pour objet un kit de diagnostic et une composition pharmaceutique, comprenant, comme principe actif : 25 • l'un au moins des polypeptides selon l'invention, ou . l'un au moins des polynucléotides codant pour lesdits polypeptides selon l'invention, . ou l'un au moins des anticorps immunospécifique desdits polypeptides selon l'invention, ou 30 . l'une au moins des molécules immunospécifiques desdits polypeptides selon l'invention. Utilisation des polypeptides Comme indiqué plus haut, le laboratoire de la Déposante a constaté que tous les polypeptides issus de 35 S. aureus ne permettent pas systématiquement de pronostiquer une infection à S. aureus et/ou à S. epidermidis, sur matériel étranger, notamment sur 2908889 18 prothèse articulaire (par exemple, les antigènes recombinants LytA (amidase), Trigger factor (prolyl isomérase) ou SrtA (sortase A) sont impropres à un tel pronostic). 5 La Déposante a, par contre, découvert, de façon tout à fait inattendue, qu'un tel pronostic était possible en utilisant d'autres polypeptides issus de S. aureus qu'elle a spécifiquement identifiés. L'identification des polypeptides selon l'invention 10 est le résultat d'un crible et d'études approfondies que les séquences issues des programmes de génomique de S. aureus ne laissaient pas envisager. Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le 15 domaine du diagnostic in vitro d'infections naturelles à S. aureus et/ou S. epidermidis, d'au moins un polypeptide comprenant : - la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine 5G1), codée par la séquence polynucléotidique 20 ID SEQ N 1 ; ou - la séquence d'acides aminés ID SEQ N 4 (appelée protéine 5H1), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 3. La présente invention vise également l'utilisation 25 d'au moins un polypeptide comprenant : a) un fragment de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou 4 ayant la même fonction que ladite séquence, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% 30 d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec l'une des séquences d'acides aminés ID SEQ N 2 ou 4, ou avec le fragment de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que ladite séquence. 35 Grâce aux polypeptides définis ci-dessus, l'invention permet la détection d'anticorps naturellement produits lors 2908889 19 d'infections à S. aureus et/ou S. epidermidis sur prothèse articulaire. L'invention vise, en outre, l'utilisation des polypeptides selon l'invention, pour détecter, 5 périodiquement, in vitro, les anticorps dirigés contre S. aureus et/ou S. epidermidis et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Les polypeptides sont utilisables comme sonde, car il s'agit de biomarqueurs naturels d'infection à 10 S. aureus et/ou S. epidermidis sur prothèse articulaire. Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs 15 constituants (par exemple, le sérum). Le diagnostic in vitro d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis est effectué, par exemple, par des tests classiques de réactions immunologiques, tels que l'ELISA ou le Western Blot. Ces tests utilisent l'un des 20 polypeptides selon l'invention qui fixe, de manière spécifique, les anticorps immunospécifiques présents dans les échantillons biologiques et produits lors d'une infection naturelle à S. aureus et/ou S. epidermidis. Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules 25 hôtes La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polypeptide préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide. 30 De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments 35 d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, 2908889 20 les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence 5 polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de 10 l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide selon l'invention et la traduction d'un polypeptide selon l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes 15 mises en oeuvre. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides 20 cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection. Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes, telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de 25 Bacillus subtilis ; des cellules de champignons, telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus ; des cellules de Streptomyces ; des cellules d'insectes, telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9 ; des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, 30 HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales. Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate 35 d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la 2908889 21 chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. 5 Utilisation des polynucléotides La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans la production d'anticorps et dans le diagnostic d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis, d'au moins un polynucléotide comprenant la 10 séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou 3, codant, respectivement, pour le polypeptide ID SEQ N 2 ou 4. L'invention vise également l'utilisation d'au moins un polynucléotide comprenant : a) un fragment de la séquence ID SEQ N 1 ou 3 et 15 ayant la même fonction que ladite séquence, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou 3 ou avec le fragment de séquence tel que 20 défini sous a), et ayant la même fonction que ladite séquence, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou 3 ou au fragment de séquence défini sous a) ou à la séquence définie sous 25 b). Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN. Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent 30 également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes 35 ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. Utilisations des anticorps selon l'invention 2908889 22 L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'antigènes de S. aureus et/ou S. epidermidis. 5 L'invention vise, en outre, l'utilisation d'anticorps selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, les antigènes de S. aureus et/ou S. epidermidis et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. 10 Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues 15 de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des 20 hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Isotypes d'anticorps et affinité Les immunoglobulines (ou anticorps) sont constituées de deux chaînes polypeptidiques différentes : deux chaînes 25 légères (L) d'isotypes [kappa] ou [lambda], et deux chaînes lourdes (H) d'isotypes [gamma], [alpha], [mu], [delta] ou [epsilon]. Ces quatre chaînes sont liées de façon covalente par des ponts disulfure. Les deux types de chaînes H ou L possèdent des régions qui contribuent à la fixation des 30 antigènes et sont très variables d'une immunoglobuline à une autre. Ces régions déterminent l'affinité des anticorps pour leur ligand. Les isotypes des chaînes lourdes permettent de définir la classe de l'immunoglobuline ; il existe donc 35 5 isotypes d'anticorps (IgA, IgM, IgD, IgE et IgG). Des sous-classes, par exemple IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4 sont définies par des différences de séquence de la chaîne 2908889 23 lourde. Les différentes classes d'immunoglobulines ont des propriétés physicochimiques propres et leur synthèse dépend directement des phases et des niveaux d'activation de la réponse immunitaire. 5 Chez l'homme, les IgG représentent la principale classe d'immunoglobulines : leur concentration sérique chez l'adulte varie de 8 à 16 g/1. Leur demi-vie plasmatique est d'environ 3 semaines. Les IgA constituent la deuxième classe 10 d'immunoglobulines sériques, après les IgG, en terme de concentration (2 à 4 g/1). En revanche, elles représentent la classe prépondérante des immunoglobulines dans les sécrétions (sécrétions respiratoires, salivaires, digestives..., lait, colostrum, larmes). Sur le plan 15 structural, les IgA ont la particularité de se présenter sous plusieurs formes moléculaires : - dans le sérum, les IgA peuvent se présenter sous forme de monomères (forme prépondérante) ou sous forme de dimères associés à une chaîne J (chaîne de jonction). La 20 chaîne J est un peptide riche en cystéine de 137 acides aminés (poids moléculaire : 15 kDa), d'origine plasmocytaire ; la sous-classe IgAl est prépondérante dans le sérum ; - dans les sécrétions, les IgA, appelées IgA 25 sécrétoires, sont sous forme de dimères ; elles sont donc associées à une chaîne J, mais elles comportent également un composant sécrétoire. Les IgA produites par les lymphocytes B sont captées par les cellules épithéliales, par un récepteur (polyIgR) situé au pôle basal de la 30 cellule. C'est pendant le transfert de l'IgA à travers la cellule épithéliale, vers le pôle apical de la cellule, que le composant sécrétoire (poids moléculaire : 70 kDa), ou pièce sécrétoire, est ajouté. Le rôle de la pièce sécrétoire est de protéger les IgA sécrétoires vis-à-vis 35 des enzymes protéolytiques présents dans les sécrétions. Comme les IgA, les IgM peuvent se présenter sous 2 formes moléculaires distinctes : 2908889 24 - une forme monomérique : c'est la forme sous laquelle les IgM sont synthétisées et insérées dans la membrane du lymphocytes B ; - une forme pentamérique : c'est la forme sous 5 laquelle les IgM sont sécrétées. Les 5 monomères de bases sont reliés par des ponts disulfures. De plus, une chaîne J relie l'extrémité de 2 monomères. Les IgD représentent moins de 1 % des immunoglobulines sériques. Elles sont habituellement 10 coexprimées avec les IgM à la surface des lymphocytes B où elles semblent jouer un rôle de récepteur pour les antigènes. Chez un sujet sain, les IgE ne sont présentes qu'à l'état de traces. 15 Cinétique d'apparition des anticorps et affinité La cinétique d'apparition d'anticorps spécifiques et d'un isotype donné est aujourd'hui encore mal comprise. D'une façon générale, les cellules B, dites naïves, synthétisent différents IgM qui constituent un large 20 répertoire de molécules capables de fixer des antigènes ( Steven A. Frank., Immunology and Evolution of Infectious Disease. (2002), Princeton University Press, Princeton, USA) . Ainsi, lors de la première exposition à un antigène, celui-ci va se fixer avec une faible affinité à différents IgM du système immunitaire. 25 Cette interaction va néanmoins stimuler la division de la cellule B naïve correspondante. La division est d'autant plus rapide que l'affinité de l'IgM est forte, ce qui permet une sélection initiale des meilleurs clones De plus, lors de la division, les réarrangements génétiques 30 permettent l'augmentation de l'affinité des anticorps. La région constante des immunoglobulines change également afin de produire des IgG dans le système circulatoire et des IgA à la surface des muqueuses (Steven et Frank 2002. Immunology and Evolution of Infectious Disease. Princeton University Press, Princeton, USA) . 35 Il peut donc être déduit par l'homme de l'art que la présence d'une ou plusieurs classes d'anticorps et l'affinité particulière des anticorps ont différentes 2908889 25 implications d'un point de vue du diagnostic médical dans la différentiation des infections récurrentes ou non, d'une infection active, aiguë, chronique, latente, et récente. Les kits 5 L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant, d'une part : . au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention, ou . au moins l'un des polynucléotides codant pour lesdits 10 polypeptides, ou au moins l'un des anticorps conformes à l'invention, ou . l'une au moins des molécules immunospécifiques conformes à l'invention, et, d'autre part, au moins un diluant (par exemple, un 15 tampon, une solution saline...). Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un des 20 polypeptide, polynucléotide, vecteur recombinant ou cellule hôte selon l'invention, et un excipient pharmaceutiquement acceptable (par exemple, une solution stérile aqueuse ou non, pouvant contenir un antioxydant ou un tampon ou un soluté rendant la composition isotonique pour les fluides 25 corporels). Partie expérimentale A) Protocoles d'obtention des antigènes A.1. Clonage de la séquence codant pour les polypeptides ID SEQ N 2 ou 4 30 Les gènes codant pour les séquences des polypeptides, qui sont des antigènes, sont obtenus par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique des bactéries Staphylococcus aureus (souche MU50, ATCC 700699) en utilisant, respectivement, des amorces spécifiques des 35 séquences ID SEQ N 1 ou 3. On entend par amorces spécifiques de courtes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité 2908889 26 des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire ; ces amorces sont choisies par l'homme de l'art de façon à encadrer la séquence d'ADN et à l'amplifier spécifiquement (par exemple ID SEQ N 1 ou 3). 5 Le fragment correspondant, ainsi amplifié, est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside 10 (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux polypeptides ID SEQ N 2 ou 4. A.2. Expression des protéines Une souche d'Escherichia coli est transformée par les vecteurs d'expression précédemment décrits. Les bactéries 15 sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C sous agitation dans 30 ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50kme 20 dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml qui est incubée à 30 C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine 25 est induite par l'isopropyl-thiogalactoside (en abrégé, IPTG) à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5. 30 A.3. Purification des protéines Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique 35 (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF. La suspension est incubée 30 minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C 2908889 27 à 15500xg. Le culot est congelé à -20 C pendant au moins une nuit. A.4. Exemple : purification de 5G1 (ID SEQ N 2) Après décongélation, les bactéries sont reprises dans 5 un tampon Mes 25 mM à pH 5,5, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 pm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP- 10 Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes 25 mM à pH 5,5 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du 15 sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/l. La solution est laissée au moins une nuit à 4 C puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 p1 de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM pH 8,0 contenant du NaCl 20 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple Superdex HR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté jusqu'à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20 C 25 jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace et al. 1995. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science 30 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse. B) Test de diagnostic in vitro Il a été utilisé des sérums provenant de patients 35 ayant eu une infection ostéoarticulaire documentée (collection du laboratoire) à S. aureus ou S. epidermidis. 2908889 28 Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire). B.1. Protocole du test pour les polypeptides de séquence ID SEQ N 2 ou 4 (ELISA) 5 La fixation des anticorps présents dans les sérums a été évaluée par des tests ELISA. Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4 C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéine recombinante 5G1) dans du "tampon salin phosphate" (PBS). Après quatre lavages par du 10 PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure à 37 C par du PBS contenant 4% de sérum albumine bovine (abrégée en BSA) (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 pl de chaque sérum, à la dilution adéquate (soit 15 1/400ème en IgG et 1/50ème en IgA pour 5G1) dans du tampon PBS contenant 4 % de BSA, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25 C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps (secondaires) de chèvre anti-immunoglobulines G ou A, humaines marqués à 20 la phosphatase alcaline (par exemple 170-6462, Biorad) sont ajoutés et incubés pendant 30 minutes à 25 C après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS contenant 4 % de BSA. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat (phosphate de p- 25 nitrophényle), pNPP, par exemple A-3469, Sigma) sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm de chacun des puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37 C. B.2. Résultats et interprétation 30 Les essais ont été réalisés sur des protéines recombinantes issues de purifications indépendantes. Exemple B.2.1 Résultats obtenus en utilisant des anti-IgG ou anti-IgA comme anticorps secondaires : 35 détection d'isotype d'anticorps dans les sérums (ELISA) Des résultats types sont présentés dans les tableaux 1 et 2. 2908889 29 Tableau 1 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgG comme anticorps secondaires Polypeptide testé 5G1 Proportion de sérums 40,0% "positifs" parmi les 20 sérums de malades infectés par S. aureus diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Proportion de sérums 44,0% "positifs" parmi les 19 sérums de malades infectés par S. epidermidis diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnosticselon l'invention Proportion de sérums 96,6% "négatifs" parmi les 88 sérums de donneurs de sang testés comme témoins 5 Tableau 2 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgA comme anticorps secondaires Polypeptide testé 5G1 Proportion de sérums "positifs" 30,0% parmi les 20 sérums de malades infectés par S. aureus diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Proportion de sérums "positifs" 0,0% parmi les 19 sérums de malades infectés par S. epidermidis diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Proportion de sérums "négatifs" 96,6% parmi les 89 sérums de donneurs de sang testés comme témoins Il en découle que les polypeptides selon l'invention 10 peuvent être utilisés pour mettre en évidence des 2908889 30 infections à S. aureus et/ou S. epidermidis sur des prothèses articulaires par la mise en évidence de certains isotypes d'anticorps. Comme indiqué dans le tableau 2, l'utilisation du 5 polypeptide permet de distinguer entre les espèces de staphylocoques. En effet, la mise en évidence d'anticorps d'isotype IgA n'est possible que dans le cas d'une infection à S. aureus. Ainsi, après avoir démontré l'existence d'une infection staphylococcique (Tableau 1, 10 révélation d'IgG), le polypeptide selon l'invention permet de distinguer une infection à S. aureus d'une infection à S. epidermidis (Tableau 2, révélation d'IgA). Exemple B.2.2 : Résultats obtenus lors de la 15 détection de plusieurs isotypes d'anticorps avec un polypeptide selon l'invention pour le diagnostic in vitro d' IPA La détection de plusieurs isotypes d'anticorps permet d'augmenter la sensibilité de la méthode (Tableau 3). Tableau 3 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant 5G1 comme polypeptide et en détectant les anticorps grâce à différents anticorps secondaires Anticorps secondaire utilisé IgA IgG IgG et A Proportion de sérums "positifs" 40% 45% 50% parmi les 20 sérums de malades infectés par S. aureus diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Proportion de sérums "négatifs" 89% 93% 91% parmi les 89 sérums de donneurs de sang testés comme témoins 20 25 2908889 31 En conclusion, la présente invention décrit des polypeptides choisis, quant à leur sensibilité et à leur spécificité, parmi un très grand nombre, pour une utilisation comme sonde (antigène) dans des tests 5 sérologiques. L'invention permet, sans intervention chirurgicale, le diagnostic d'infections naturelles à S. aureus et/ou S. epidermidis, sur matériel étranger, tel que prothèses ostéo-articulaires, notamment des infections non diagnostiquées par culture de prélèvements per- 10 opératoires profonds. REVENDICATIONS 1. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger implanté dans le corps, d'au moins un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou 4. 2. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger implanté dans le corps, d'au moins un polypeptide comprenant : a) un fragment d'une des séquences d'acides aminés telles que définies selon la revendication 1 et ayant la 15 même fonction que ladite séquence, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec l'une des séquences d'acides aminés telles que définies selon la revendication 1 ou avec un fragment d'une des séquences telles que définies sous a), et ayant 20 la même fonction que ladite séquence. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que au moins un polypeptide est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour 25 ledit polypeptide et par isolement dudit polypeptide du milieu de culture. 4. Utilisation selon la revendication 3, quand elle dépend de la revendication 1, caractérisée en ce que le polynucléotide est de séquence ID SEQ N 1 ou 3. 30 5. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger implanté dans le corps, d'au moins un polynucléotide de séquence ID SEQ N 1 ou 3. 35 6. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à S. aureus et/ou S. epidermidis 2908889 33 sur matériel étranger implanté dans le corps, d'au moins un polynucléotide comprenant a) un fragment d'une des séquences telles que définies selon la revendication 5 et ayant la même fonction 5 que ladite séquence, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec une séquence polynucléotidique telle que définie selon la revendication 5 ou avec un fragment d'une des séquences telles que définies sous a), et ayant la même 10 fonction que ladite séquence, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à une des séquences polynucléotidiques telles que définies selon la revendication 5 ou selon la revendication 6a) ou 6b). 7. Utilisation d'anticorps pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger implanté dans le corps, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 3. 8. Utilisation de molécules immunospécifiques pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par S. aureus et/ou S. epidermidis sur matériel étranger implanté dans le corps, caractérisée en ce que lesdites molécules présentent une affinité de l'ordre de 106M, 5 106M, 107M, 5 107M, 108M, 5 108M, 109M ou supérieure, pour un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 3. 9. Kit de diagnostic pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides ou l'un desdits polynucléotides codant pour lesdits polypeptides associé à au moins un diluant. 10. Kit de diagnostic pour l'utilisation selon la 35 revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps associé à au moins un diluant. 2908889 34 11. Kit de diagnostic pour l'utilisation selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'une desdites molécules immunospécifiques associée à au moins un diluant. 5 12. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant, à titre de principe actif, au moins : a) un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou 4, ou b) un polypeptide dont la séquence est un fragment de 10 l'une des séquences d'acides aminés telles que définies sous a) et ayant la même fonction que ladite séquence, ou c) un polypeptide dont la séquence est une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec l'une des séquences d'acides aminés telles que définies sous a) 15 ou avec le fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction que ladite séquence, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable. 13. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant, à titre de principe actif, au moins : 20 a) un polynucléotide de séquence ID SEQ N 1 ou 3, ou b) un polynucléotide dont la séquence est un fragment de l'une des séquences polynucléotidiques telles que définies sous a) et ayant la même fonction que ladite séquence, ou 25 c) un polynucléotide dont la séquence est une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec l'une des séquences polynucléotidiques telles que définies sous a) ou avec un fragment de l'une des séquences telles que définies sous b), et ayant la même fonction que 30 ladite séquence, ou d) un polynucléotide dont la séquence est une séquence polynucléotidique complémentaire à l'une des séquences polynucléotidiques telles que définies sous a), b) ou c) ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.