Brevet FR2901479A1 — publié le 20071130

séquences de protéines survient par une liaison covalente entre un groupe d'amine secondaire d'acides aminé basiques et la molécule, qui change le pliage des protéines de manière irréversible, et qui mène à un nouveau réseau de protéines. Par exemple, les phosphatidylinositol phosphates ne se lient plus aux séquences qu'ils régulent habituellement lorsqu'elles sont modifiées en présence d'acide xanthurénique. La calmoduline ne régule une protéine que lorsqu'elle est liée de façon électrostatique à une séquence régulatrice. Par contre, les séquences modifiées de façon covalente se lient avec la calmoduline de manière covalente. Des protéines mal pliées ont des nouvelles interactions avec les protéines cellulaires. Elles changent les lieux et les rôles dans les cellules, dépendamment du degré de modification de la protéine (Malins et autres BBRC 2003, BMC Oeil Biology 2004.) Les interactions covalentes des protéines ayant les séquences modifié conduisent à un nouveau réseau pathologique de protéines. Le mécanisme de la dérégulation du réseau de protéines est général, car la régulation par le phosphatidylinositol phosphates, et les protéines comme la calmoduline, est général. Une culture primaire des cellules en présence d'acide xanthurénique est un modèle pour le développement des maladies. Les résultats observés sont comparables avec les effets in vivo dans les animaux et les humains. Par contre, des lignes cellulaires transformées par un virus, ou des cellules avec un ou plusieurs gènes supprimés, ont des interactions !différentes entre leurs protéines de celles existant dans les cellules de culture sauvage. La modification des protéines et le développement des maladies sont fonction de l'acide xanthurénique accumulé, et de l'ancienneté de cette accumulation. L'augmentation de l'accumulation de l'acide xanthurénique a pu être provoqué par les protéines animales dans la nutrition - qui peuvent contenir des protéines modifiées - et par une augmentation de l'IDO, qui est associé avec différentes conditions de stress (le régime oxydant, la fréquence des maladies infectieuses, et l'effort motif) Des protéines mal pliées sont présentes dans les leucocytes du sang. L'accumulation de cens protéines dans le sang peut être contrôlée avec des anticorps contre des protéines mal pliées. Le test d'accumulation des protéines mal pliées dans le sang est un bon outil pour le diagnostic des maladies, et il a pu être utilisé pour le diagnostic et la prévention précoce du développement de maladies. Les anticorps contre des protéines mal pliées ont bloqué la signalisation des protéines mal pliées dans des membranes cellulaire, et ont conduit à une suppression des pathologies dans les cellules mammifères en culture, chez les souris et chez les humains. L'élimination des protéines mal pliées rétablit une signalisation normale dans les cellules et stoppe la pathologie cellulaire. Des protéines avec des séquences régulatrices modifiées conduisent, en parallèle, à la 35 désorganisation des protéines impliquées dans la signalisation cellulaire. La modification des 2 séquences responsables de la liaison avec la calmoduline ou le phosphatidylinositol phosphates est l'événement principal responsable du processus dégénératif dans le réseau des protéines liées aux pathologies. Les anticorps préparés selon cette invention, obtenus contre ces séquences régulatrices modifiées, sont efficaces dans la prévention du désordre métabolique. Nous avons observé que le processus dégénératif peut être arrêté par l'anticorps contre les séquences modifiés. La présente invention décrit les séquences responsables de la perturbation du réseau de protéines qui mène à une dérégulation de la physiologie cellulaire. La invention est liée à la création d'un anticorps contre les peptides modifiés qui créent des liaisons covalentes avec d'autres protéines dans la cellule, menant à une pathologie cellulaire. La I O modification des peptides peut être effectuée par l'acide xanthurénique ou une autre molécule qui se lie de manière covalente à un acide aminé basique de ce peptide. Toutes les substances qui rendent impossibles les interactions électrostatiques de la calmoduline et phosphatidylinositol phosphates avec les protéines, et conduisent à de nouvelles interactions covalentes entre les protéines, peuvent être utilisées pour la modification de ce peptide, comme 15 par exemple, l'acide xanthurénique et les produits de sa dégradation. Ces modifications surviennent généralement dans un groupe de quatre acides aminés dont au moins trois sont basiques : la lysine (K), l'arginine (R) ou l'histidine (H). De plus, ces modifications surviennent lorsqu'un acide aminé basique se trouve dans le voisinage d'un acide aminé polaire, par exemple phosphorylé, telle la séquence K (lysine) S (serine) G (glutamine) où 20 le S a été phosphorylé. En particulier, la possibilité de l'interaction électrostatique avec une séquence régulée par une molécule (par exemple un phosphatidylinositol phosphate ou une protéine comme la calmoduline) après une ou plusieurs modifications covalentes n'est plus possible, le phosphatidylinositol phosphate ou la calmoduline ne pouvant plus être attachés de façon électrostatique à cette séquence. Par contre, une liaison électrostatique peut être remplacée 25 par une liaison covalente. Des séquences modifiées par l'acide xanthurénique ou une autre molécule, qui peuvent modifier des groupes amines secondaires de protéines, peuvent conduire à une modification des séquences stratégiques pour la régulation de la physiologie cellulaire, et changer le réseau des protéines menant à la pathologie. La base de cette invention est la modification du réseau de protéines par la formation de 30 protéines mal pliées, due à la modification covalente des séquences responsables des interactions entre les protéines. Cette méthode est employée pour la préparation d'anticorps contre tout désordre métabolique associé au vieillissement, ou contre une dégénérescence des tissus liée à une infection. Les revendications portent sur l'utilisation de l'anticorps contre des séquences modifiées pour 35 restaurer l'immunité dans le tissu d'un organisme vivant infecté, ou endommagé, par des 3 radiations ou des traitements chimiques, les cancers et la thérapie des cancers, la cardiomyopathie, l'hypertension, la congestion cérébrale, l'athérosclérose, les maladies à prions, le Parkinson, l'Alzheimer,et toute autre maladie associée à l'accumulation du beta-amyloïde, telle que la dégénération du rein, les maladies ophtalmiques, l'ostéoporose, et les dysfonctionnements des canaux ioniques. Il est revendiqué une utilisation des anticorps contre les séquences modifiées dans le diagnostique et la thérapie des maladies. Exemple 1. L'acide xanthurénique a modifié la lysine, l'arginine et l'histidine. La N-tert-butoxycarbonyl-llysine (Boc-lysine), la Boc-arginine ou la Boc-histidine à la concentration de 1mM ont été incubées avec de l'acide xanthurénique de 1 mM (1 : 1) en 0.5 M NaHCO3 pendant 4 semaines à température ambiante en milieu stérile (filtration par filtre Millipore de 0.22 micromètre.) Après ce temps, les produits de la réaction ont été analysés par chromatographie en couche mince sur gel de silice sans indicateur fluorescent dans du n-butanol : de l'acide acétique : de l'eau 4:1:5. Il a été observé de nouveaux composés fluorescents différents de l'acide xanthurénique. Les produits sont fluorescents car ils contiennent le noyau aromatique de l'acide xanthurénique, mais leur masse moléculaire indique que le noyau hétérocyclique est dégradé. Cette dégradation conduit à la formation de quinone substituée avec un oxo groupe. La réaction de l'oxygène d'oxo, keto ou quinone, avec des groupes d'amines secondaires de l'acide aminé, a conduit à une formation d'un conjugué covalent de cet acide aminé. Une incubation d'un peptide contenant des acides aminés basiques, lysines (-KKKK-), a conduit à la formation d'un conjugué de ce peptide et des produits de la dégradation de l'acide xanthurénique. Exemple 2. La séquence de protéine Bax -KKLSECLKR- se lie à phosphatidylinositol phosphates de façon électrostatique. Après modification par l'acide xanthurénique, cette séquence se lie avec la 25 calmoduline de façon covalente. Le peptide correspondant à la séquence de protéine Bax (56-65) -KKLSECLKR- a été incubé avec de l'acide xanthurénique (1 : 5) dans une solution de bicarbonate de soude de 0.2 M (NaHCO3) (pH 7.6.) Après un mois d'incubation, un échantillon correspondant à 400 microgrammes a été injecté dans un lapin pour induire la production de l'anticorps. Les lapins 30 ont été immunisée par le peptide, chaque mois, pendent 3 mois. Le 4eme mois les lapins ont produit l'anticorps souhaité contre la séquence Bax modifiée par l'acide xanthurénique, comme il a été démontré par l'analyse de Western blot (l'anticorps a reconnu la séquence Bax dans un échantillon de protéines et de cellules qui n'ont pas été cultivées en présence d'acide xanthurénique, mais pas dans les cultures de contrôle.) Un protocole standard a été utilisé pour la 35 préparation du plasma, et l'anticorps a été purifié du plasma par Sepharose conjuguée avec la 4 protéine G. L'anticorps a identifié le Bax dans des mitochondries dans une culture de cellules primaires (les cellules de muscle lisses, et des cellules épithéliales de la rétine et de cristallin qui ont été cultivées en présence d'acide xanthurénique à une concentration de 10 micromoles pendant 96 heures.). Les protéines immunoprécipitées de l'extrait de culture cellulaire en présence de l'acide xanthurénique avec cet anticorps, sont reconnues par l'anticorps contre la calmoduline. Ce résultat montre que l'acide xanthurénique lie la calmoduline avec cette séquence de la protéine Bax de façon covalente. Exemple 3 La séquence ED de la protéine MARCKS, qui se lie à la calmoduline et au phosphatidylinositol 10 phosphate de manière électrostatique, et se lie à la calmoduline de façon covalente lorsqu'elle est modifiée en présence d'acide xanthurénique. Le peptide ayant la séquence correspondant à la séquence ED de MARCKS, régulé par la calmoduline -KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKKNKK- a été synthétisé et incubé avec de l'acide xanthurénique comme décrit dans l'exemple 2. Les anticorps anti-séquence ED de 15 MARCKS ont été utilisés pour l'immunoprécipitation. Les analyses des protéines immunoprécipités par Western blot en utilisant un anticorps contre la calmoduline, ont montré que ces peptides se lient à la cahnoduline de manière covalente. Le conjugué des protéines MARCKS et calmoduline est situé aux niveau des membranes cellulaire. Cette séquence modifiée de MARCKS est accumulée par exemple dans les membranes des leucocytes du sang 20 des sujets diabétiques. Exemple 4. La séquence -CKKPKP-, se lie à la calmoduline de façon covalente lorsqu'elle est modifiée en présence d'acide xanthurénique. Cette séquence -CKKPKP- de la partie N-tenninale de la protéine précurseur du prion, modifiée 25 par l'acide xanthurénique, conduit à la formation d'aggrégats de la protéine du prion. Le peptide 1 (CKKPKP) de la protéine du prion et le peptide 2 (CKKPPKP) ont été incubés avec de l'acide xanthurénique comme décrit dans l'exemple 2. Des anticorps ont été préparés contre ces peptides. Le peptide 1 correspond à la séquence N-terminale de la protéine du prion et le peptide 2 diffère de cette séquence de protéine par une proline. Contrairement aux anticorps 30 contre les peptide 2, les anticorps contre les peptide 1, ont mis en évidence la présence d'agrégats de prion formés en présence d'acide xanthurénique dans des cultures d'astrocytes de rétine humaine et astrocytes de cerveau de rat. Ceci a prouvé que la méthode de préparation permet une production d'anticorps très spécifiques. L'anticorps contre la séquence 1 a détecté la protéine du prion par une analyse de Western blot 35 et une microscopie par immunofluorescence. Les agrégats de la protéine de prions ont été 5 détectés dans le sang des sujets atteints par la maladie de Parkinson. Ces résultats montrent que des agrégats des protéines du prion sont formés par la modification covalente de cette séquence peptidique basique. Exemple 5. La modification covalente de la séquence gelsoline, correspondant par exemple à la séquence humaine 162-187 (KSGLKYKKGGVASGFKHVVPNEVVV), régulée par le phosphatidylinositol phosphate. Les cellules cultivées en présence d'acide xanthurénique perdent la possibilité d'attacher le phosphatidylinositol phosphate de façon électrostatique. Le peptide correspondant à la partie de la séquence de la gelsoline 162-187, et les peptides faisant partie de cette séquence (KSGL et KYKK), ont été préparés et modifiés par l'acide xanthurénique comme indiqué dans l'exemple 2, et injectés dans des lapins. Les anticorps contre ces peptides ont été utilisés pour la thérapie in vivo. Les anticorps ont été employés pour la thérapie de souris présentant des plaies infectées avec un Staphylocoque doré. Les anticorps ont éliminé l'infection. Les analyses des leucocytes ont montré une activation du système immunitaire des souris. Les anticorps éliminent également les infections chez les sujets humains infectés par le Staphylocoque doré résistant aux antibiotiques. Les souris contrôlées présentaient une infection aiguë. Les mêmes anticorps ont restitué le système immunitaire des souris après traitement par de l'Endoxan (cycloheximide.) Les anticorps ont empêché la prolifération dérégulée de lymphocytes en présence de mitogènes. Ces anticorps ont éliminé le beta-amyloide agrégé formé en présence d'acide xanthurénique dans les cultures de cellules humaines. L'accumulation de ces séquences modifiées a été observée dans le sang des sujets atteints d'athérosclérose. Exemple 6. La partie de la séquence gelsoline régulée par le phosphatidylinositol phosphate, et notamment la séquence -KYKK-, a été phosphorylé sur Y (tyrosine), et a été incubée avec de l'acide xanthurénique comme dans l'exemple 2. La séquence modifiée a été injectée dans des lapins. L'anticorps a provoqué l'agrégation de PI-3 kinase-p85 dans une culture de cellules primaires menant à la mort de cellules. Exemple 7. La partie de la séquence de gelsoline régulée par phosphatidylinositol phosphate, notamment la séquence -FKSGL- a été phoshorylé sur S (serine) et modifiée comme dans l'exemple 2. L'anticorps préparé dans le lapin, et purifié sur la Sepharose G, a provoqué une filamentation des cellules épithéliales humaines dans une culture de cellules primaires menant à la mort des cellules. 6 Revendications 1. Composé destiné à provoquer des réactions immunitaires par introduction dans un organisme vivant caractérisé en ce qu'il est le produit d'un peptide modifié de façon covalente, de manière à ce qu'il modifie les interactions entre phosphatidylinositol phosphates et/ou calmoduline et les protéines qu'ils régulent. 2. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide correspond à une séquence régulée par le phosphatidylinositol phosphate et qu'il a perdu la faculté de se lier au phosphatidylinositol phosphate de façon électrostatique à la suite de cette modification. 3. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide correspond a une séquence régulée par la calmoduline, et se lie à la calmoduline de façon covalente à la suite de cette modification. 4. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide contient la séquence -KSG- (lysine-serine-glutamine). 5. Composé selon la revendication 1 à caractérisé en ce qu'il contient le peptide ayant dans sa séquence une groupe de quatre acides aminés contenant au moins trois acides aminés basiques. 6. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide contient la séquence - KYKK- (-lysine-tyrosine-lysine-lysine-). 7. Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide contient la séquence - KKPK- (lysine-lysine-proline-lysines). Composé selon la revendication 1 caractérisé en ce que ce peptide contient la séquence - KKKK- (lysine-lysine-lysine-lysine). 9. Composé préparé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que sa fabrication conduit à la préparation d'un produit pour le diagnostique ou la production de médicaments pour l'élimination de protéines mal pliées associées à l'apparition de maladies dégénératives, pour l'activation du système immunitaire, la thérapie des cancers, la cardiomyopathie, l'hypertension, la congestion cérébrale, l'athérosclérose, les maladies à prions, le Parkinson, l'Alzheimer, et toute autre maladie associée à l'accumulation du beta-amyloïde telles que la dégénération du rein, les maladies ophtalmiques, l'ostéoporose, et les dysfonctionnements des canaux ioniques. 7