Brevet FR2906536A1 — publié le 20080404

Cluster génétique de souches de Streptococcus thermophilus présentant des propriétés acidifiantes et texturantes appropriées pour les fermentations laitières L'invention concerne un cluster génétique de souches de Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) présentant des propriétés acidifiantes et texturantes appropriées pour les fermentations laitières. Les bactériophages sont des virus capables d'attaquer les bactéries. Lors de ces attaques virales, les bactériophages infectent la culture bactérienne, se multiplient pour finalement détruire cette culture. L'impact technologique dans l'industrie de transformation du lait (fabrication de fromage, de yaourt, de lait fermenté) de ces bactériophages est conséquent puisqu'ils peuvent provoquer un arrêt complet de la fermentation et donc empêcher la production de ces produits dérivés du lait. Une façon de lutter contre les problèmes liés à l'infection des fermentations par les bactériophages est l'utilisation de souches présentant des spectres de sensibilité aux phages appropriés. En particulier, les producteurs de ferments laitiers ont développé des stratégies de lutte contre les bactériophages en construisant des ferments constitués de plusieurs souches présentant des lysotypes distincts, et en utilisant en rotation plusieurs de ces ferments. Il est clair que pour pouvoir assumer cette stratégie il est important de posséder une diversité de souches présentant les mêmes fonctionnalités (comme par exemple l'acidification, le pouvoir épaississant, l'aromatisation...) mais des lysotypes distincts. Les S. thermophilus sont utilisés de façon extensive seuls ou en association avec d'autres bactéries pour la fabrication de produits alimentaires fermentés. Ils entrent en particulier dans la formulation des ferments utilisés pour la fabrication des yaourts. On attend des souches de S. thermophilus qu'elles participent à la formation du caillé lactique par acidification du lait et à l'élaboration de la texture du produit fermenté. On distingue généralement 4 groupes de S. thermophilus en fonction de ces propriétés fonctionnelles : 1) les souches non texturantes et non acidifiantes, 2) les souches non texturantes et acidifiantes, 3) les souches 2906536 2 texturantes et non acidifiantes, et 4) les souches texturantes et acidifiantes. Une souche texturante est une souche permettant d'obtenir des laits fermentés dont les gels peuvent être décrits par leurs propriétés rhéologiques. Jusqu'à présent, seulement quatre souches de S. thermophilus répondant aux 5 critères de souche acidifiante et texturante ont été décrites dans la littérature : Sfi39, CNCM I-2423, CNCM I-2426 et la souche CNCM I-2980 décrite dans la demande WO2004/085607. La rareté de telles souches (rapides en acidification et texturantes) rend difficile la lutte contre les bactériophages lors de la fermentation du lait. En effet, idéalement 10 la lutte contre les bactériophages consisterait dans l'association dans un même ferment de souches qui présentent des propriétés technologiques similaires mais des lysotypes distincts, puis dans l'utilisation en rotation de ferments de ce type. Les ferments utilisés en rotation devraient également présenter des lysotypes distincts mais des propriétés technologiques similaires. Dans le cas des ferments 15 texturants et rapides en acidification, cette approche est difficile vu le faible nombre de souches présentant ces qualités fonctionnelles. Ainsi un des problèmes que se propose de résoudre l'invention est de fournir de nouvelles souches de S. thermophilus qui présentent un lysotype distinct des souches actuellement utilisées, en particulier des souches qui soient acidifiantes et 20 texturantes. Dans ce but, l'invention concerne les souches de S. thermophilus d'un cluster génétique qui présentent un lysotype distinct de celui des souches de S. thermophilus acidifiantes et texturantes actuellement utilisées. Au sein de ce 25 cluster ont été identifiées de nouvelles souches acidifiantes et texturantes. L'invention décrit également une méthode permettant de prédire l'appartenance d'une souche à une famille de souches présentant des lysotypes identiques ou apparentés. Cette méthode analyse le polymorphisme de restriction de la région epsA-B-C-D du génome de S. thermophilus. 30 On appelle région epsA-B-C-D la région du chromosome de S. thermophilus chevauchant les gènes epsA à epsD du locus eps. Le fragment d'ADN 2906536 3 correspondant à cette région, appelé fragment epsAD, peut être obtenu par réaction de PCR sur l'ADN chromosomique de S. thermophilus en utilisant comme amorces les oligonucléotides de SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2. 5 La présente invention a pour objet une souche de Streptococcus thermophilus dont le fragment epsAD présente après digestion par les enzymes de restriction Mn II, FokI et HindI1l un profil de restriction caractérisé par des fragments d'ADN de 34412 paires de bases (pb), 34112 pb, 30512 pb, 29912 pb, 27712 pb, 21012 pb, 16012 pb, 14212 pb, 10012 pb, 7912 pb, 7512 pb, 6612 pb, 4212 pb, 2312 pb et 10 912 pb. Le profil de restriction du fragment epsAD est déterminé par séquençage classique du fragment epsAD suivi d'une détermination in silico du profil de restriction. Typiquement le séquençage pourra être effectué avec l'appareillage CEQ8000 (Beckman) et la détermination in silico du profil de restriction pourra être 15 effectuée à partir de la séquence du fragment epsAD à l'aide de l'outil NEBcutter V2.0 accessible sur internet via le site http://tools.neb.com/. Typiquement une souche selon l'invention comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 80% préférentiellement au moins 90%, au moins 95% ou au 20 moins 97% et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence nucléotidique de SEQ ID N 4. Typiquement une souche selon l'invention comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 80% préférentiellement au moins 90%, au moins 95% ou au moins 97% et encore plus préférentiellement 100% d'identité avec la séquence 25 nucléotidique de SEQ ID N 5. Pour calculer le pourcentage d'identité, l'homme du métier utilisera par exemple l'outil "BLAST 2 Sequences" (Tatusova & Madden, 1999 ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) avec les paramètres par défaut du 30 programme "blastn" (pour l'alignement de séquences nucléotidiques) ou du programme "blastp" (pour l'alignement de séquences protéiques). Le calcul du 2906536 4 pourcentage de similarité entre deux séquences protéiques fait intervenir la matrice BLOSUM62. Préférentiellement la souche selon l'invention est texturante. Préférentiellement la 5 souche selon l'invention est rapide en acidification. Encore plus préférentiellement la souche selon l'invention est texturante et rapide en acidification. On entend par souche de Streptococcus thermophilus texturante une souche qui génère des laits fermentés ayant, dans les conditions décrites en exemple, une 10 viscosité supérieure à environ 35 Pa.s, une aire de thixotropie inférieure à environ 2000 Pals et/ou un seuil d'écoulement inférieur à environ 14 Pa. Par souche rapide en acidification, on entend une souche qui présente dans les conditions décrites en exemple, une Vm inférieure à -0,0100 upH/min. 15 Préférentiellement, une souche selon l'invention est la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 14 juin 2006 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro CNCM I-3617 ou une souche mutante susceptible d'être obtenue à partir de celle-ci. Typiquement pour obtenir de telles souches mutantes, l'homme du métier pourra 20 utiliser les techniques usuelles de mutagenèse telles que l'irradiation aux rayonnements UV ou l'exposition à des produits chimiques mutagènes (éthylméthane-sulfonate, nitrosoguanidine, acide nitreux...). Préférentiellement, l'invention a pour objet la souche de Streptococcus 25 thermophilus déposée le 14 juin 2006 au nom de Danisco France SAS, 20 rue de Brunel, 75017 Paris à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro CNCM I-3617. L'homme du métier à partir des profils de restriction décrits précédemment et/ou des séquences de SEQ ID N 4 et/ou N 5 pourra identifier les souches qui 30 appartiennent au même cluster génétique que la souche CNCM I-3617. 2906536 5 Typiquement pour ce faire, il pourra utiliser les techniques de PCR et/ou d'hybridation et/ou de séquençage d'ADN. L'invention a également pour objet une composition bactérienne comprenant au 5 moins une souche selon l'invention. Par composition bactérienne on entend un mélange de différentes souches, notamment un ferment, ou un levain. Les mélanges de souches préférés selon l'invention sont des mélanges de Streptococcus thermophilus avec d'autres Streptococcus thermophilus, ou des mélanges de Streptococcus thermophilus avec Lactobacillus delbrueckii subsp. 10 bulgaricus, ou des mélanges de Streptococcus thermophilus avec d'autres Lactobacillus et/ou avec Bifidobacterium, ou des mélanges de Streptococcus thermophilus avec Lactococcus, ou des mélanges de Streptococcus thermophilus avec d'autres souches de bactéries lactiques et/ou des levures. L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un produit 15 alimentaire, d'un complément alimentaire, d'un supplément diététique ou d'un produit aux propriétés probiotiques, comprenant une étape dans laquelle une souche selon l'invention est utilisée. Typiquement le produit alimentaire, le complément alimentaire, le supplément diététique ou le produit aux propriétés probiotiques est un produit laitier, un 20 produit carné, un produit céréalier, une boisson, une mousse ou une poudre. Préférentiellement le produit alimentaire, le complément alimentaire, le supplément diététique ou le produit aux propriétés probiotiques est un produit laitier. Il s'agit par exemple d'un lait fermenté, d'un yaourt, d'une crème maturée, d'un fromage, d'un fromage frais, d'une boisson lactée, d'un rétentat de produit 25 laitier, d'un fromage fondu, d'une crème dessert, d'un fromage du cottage ou d'un lait infantile. Typiquement le produit laitier comprend du lait d'origine animale et/ou végétale. L'invention a également pour objet un produit alimentaire, un complément alimentaire, un supplément diététique ou un produit aux propriétés probiotiques 30 comprenant au moins une souche selon l'invention ou la composition bactérienne décrite précédemment. 2906536 6 L'invention décrit également une méthode pour prédire le lysotype d'une souche de S. thermophilus à partir de l'analyse du polymorphisme de restriction de la région epsA-B-C-D de son génome, comprenant les étapes suivantes : a) amplification du fragment epsAD par réaction de PCR sur l'ADN 5 chromosomique de S. thermophilus en utilisant comme amorces les oligonucléotides de SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 ; b) séquençage du fragment epsAD ; c) détermination in silico du profil de restriction du fragment epsAD après digestion par les enzymes de restriction Mnll, Fokl et HindlIl ; et 10 d) comparaison du profil de restriction obtenu à l'étape c) avec les profils de restriction de la région epsAD de souches de S. thermophilus dont le lysotype est connu. Des exemples de souches de S. thermophilus dont le lysotype est connu sont listés dans le tableau 3. 15 La présente invention sera mieux illustrée ci-après à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Brèves descriptions des figures : 20 Figure 1 : représentation schématique du locus eps de divers S. thermophilus présentant les similitudes d'organisation et de séquence de la région 5' incluant les gènes epsA, epsB, epsC et epsD. Les numéros d'accès GENBANK des séquences nucléotidiques sont indiqués entre parenthèses. Figure 2 : Alignement de séquences partielles des gènes epsA (A) et epsD (B) au 25 niveau des régions ciblées par les amorces de SEQ ID N 1 (dans le gène epsA) et SEQ ID N 2 (dans le gène epsD). Figure 3 : Détermination in silico des profils obtenus selon la méthode epsAD des diverses souches de S. thermophilus dont la séquence du locus eps est décrite dans la littérature. Les images des profils de restriction ont été générées à l'aide de 30 l'outil NEBcutter (http://tools.neb.com/) avec les paramètres suivants : Gel Type = 2% agarose ; Marker = 100 bp DNA Ladder ; DNA Type = Unmethylated ; L = 2906536 7 102 mm. Les numéros d'accès GENBANK de ces souches sont : AF448502 (MTC310), AF373595 (Sfi39), AF410175 (TypeI), AJ289861 (IP6757), AF454496 (TypeV), Y17900 (NCFB 2393), AJ272341 (FI9186), AF454497 (TypeVI), NZ_AAGS01000017 (LMD-9), AF454501 (TypeXI), AF454498 5 (TypeVII), AF454495 (TypeIV), AF454500 (TypeX), AF454499 (TypeIX), AY057915 (TypelIl), CP000023 (LMG 18311), CP000024 (CNRZ 1066), AF434993 (MTC360), AF430847 (MTC330), AY061649 (MR-2C), U40830 (Sfi6), Z98171 (CNRZ 368), AF448249 (MR-1C). La séquence eps de la souche CNCM I-2980 est décrite dans la demande WO2004/085607. 10 Figure 4 : Représentation schématique de l'organisation du locus eps de la souche CNCM I-3617, correspondant à la séquence SEQ ID N 3. Les cadres ouverts de lecture (ORF) représentés par des hachures verticales (région 1) présentent des similarités importantes avec les gènes epsA-epsB-epsC-epsD situés en début de locus eps dans la grande majorité des souches de S. thermophilus. Les ORFs 15 représentés par des hachures horizontales (région 2) présentent des similarités importantes avec les gènes eps11E, epsllF, epsllG et eps11H de la souche typeXI. L'ORF représenté par un damier (région 4) présente des similarités importantes avec le gène eps4F de la souche typelV. Le rectangle gris entre les régions 2 et 3 représente une région non codante présentant des homologies de 20 séquence avec une région du locus eps de la souche tpeIV. Les ORFs représentés par des hachures diagonales (région 6) présentent des similarités importantes avec les gènes epsP, epsQ, epsS, epsR et epsT de la souche CNRZ368. Les ORFs non colorés (régions 3 et 5) ne présentent pas de similarités importantes avec les gènes eps décrits pour d'autres S. thermophilus. Les deux barres noires au bas de la 25 figure représentent la position des séquences SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5. Exemples Matériel biologique Le tableau 1 et le tableau 3 présentent une partie des souches utilisées pour l'étude. Une partie de ces souches provient de la collection de souches et de 30 phages de Danisco (DGCC : Danisco Global Culture Collection). La préparation 2906536 8 de cultures de ces souches a été réalisée selon les méthodes classiques de microbiologie. Tableau 1 : Description d'une partie des souches utilisées pour l'étude Souche Autre Propriété Propriété Souches Références nom texturante a acidifiante a apparentées b bibliographiques ` CNCM I-3617 Oui Oui Inconnue Aucune CNCM I-2980 Oui Oui DGCC2056, WO2004/085607 DGCC8013, DGCC8015 CNCM I-2423 MTC310 Oui Oui Sfi39, SY102 Lemoine et al. (1997) ; FI9186, Typel, Germond et al. (2001) ; DGCC945 Marshall et al. (2001) CNCM I-2978 MTC360 Oui Non Sfi6, CNCM ILemoine et al. (1997) ; 733, CNCM I- Doco et al. (1990) ; 734, CNCM IMarshall et al. (2001) ; 735, IMDO1, 2, Stingele et al. (1996) 3, NCFB859, EU21, MR-2C, DGCC7773 CNCM I-2432 TypeIV Oui Non Inconnue Rallu et al. (2002) CNCM I-2429 TypeVII Oui Non Inconnue Rallu et al. (2002) CNCM I-2979 Oui Non CNRZ368, MR- Bourgoin et al. (1999) ; 1C Low et al. (1998) DGCC7966 Oui Non Inconnue Aucune DGCC7919 Non Oui Inconnue Aucune DGCC7766 Non Non Inconnue Aucune a : sur la base d'utilisation industrielle et de la présente étude. 5 b : sur la base de résultats publiés de séquence du locus eps et/ou de la structure du polysaccharide et de données internes à Danisco. c : sur la souche étudiée et/ou sur les souches apparentées. La souche CNCM I-3617 appartient à un nouveau cluster génétique 10 La détermination récente de la séquence complète du chromosome de deux souches de S. thermophilus CNRZ1066 et LMG18311 a montré un niveau élevé 2906536 9 de conservation du contenu génétique et de l'organisation des gènes chez cette espèce (Bolotin et al., 2004). Une des rares régions présentant des différences génétiques majeures entre ces deux souches correspond au locus eps qui code pour les gènes intervenant dans la biosynthèse d'exopolysaccharides. De plus, une 5 grande diversité était déjà décrite au niveau de ce locus génétique (cf. figure 1) puisque plusieurs séquences eps avaient été déterminées pour diverses souches de S. thermophilus (pour une revue, voir Broadbent et al., 2003). Flanqués des gènes deoD (codant pour une purine-nucléoside phosphorylase) et pgm (codant pour une phospho-glucomutase), tous les clusters de gènes eps chez S. thermophilus sont 10 composés d'une région proximale conservée (du gène epsA au gène epsD) et d'une région distale hautement variable. En dépit d'une organisation conservée des gènes epsA-B-C-D, il existe un polymorphisme de séquence significatif dans cette région. Le polymorphisme de cette région a été utilisé pour développer un outil de groupage génétique des souches de S. thermophilus : la méthode epsAD. 15 Méthode epsAD : L'outil développé repose sur l'amplification spécifique (PCR) de la région epsA-B-C-D suivie de l'analyse de son polymorphisme de restriction (RFLP). Pour cela des amorces (primers) ont été déterminées qui permettent l'amplification par PCR de cette région pour une grande majorité des souches de 20 S. thermophilus. Elles ont été déterminées par l'alignement des séquences de la région epsAD (cf. figure 2) et permettent l'amplification d'un fragment d'ADN d'environ 2480 paires de bases (pb). L'ADN génomique de S. thermophilus est purifié à l'aide du kit "DNeasy Tissue Kit" (Qiagen), puis la région epsAD est amplifiée par PCR selon les paramètres suivants : 25 Composition du mélange réactionnel (50 L) : tampon pour l'ADN polymérase x l, MgC12 2 mM, dNTP 200 M chaque, ADN génomique 100 à 500 ng, amorce EPSA632 (5'-AAATgAATTCAgAgCAAgCACTTg-3' (SEQ ID N 1)) 200 nM, amorce EPSD1064 (5'-gTCATgTCAACTTTATTAAggACg-3' (SEQ ID N 2)) 200 nM, ADN polymérase 1,25 unité, H2O qsp 50 L. 30 Paramètres d'amplification : - prédénaturation à 94 C pendant 1 min 2906536 10 cycles alternant dénaturation à 94 C pendant 30 s, hybridation à 56 C pendant 30 s, élongation à 72 C pendant 3 min - post-élongation à 72 C pendant 6 min. Après amplification, le produit de PCR est contrôlé par électrophorèse en gel 5 d'agarose à 1,5 %. La taille du produit amplifié est d'environ 2480 pb. La séquence du fragment PCR est déterminée (selon une méthode dérivée de Sanger et al., 1977) avec un appareillage CEQ8000 (Beckman). La séquence est traitée par l'outil NEBcutter (par exemple, http://tools.neb.com/) en sélectionnant 10 les enzymes de restriction Mnll, Fokl et HindIII pour établir son profil de restriction in silico, et en particulier pour définir la taille des fragments de restriction. Pour les souches de S. thermophilus dont la séquence du locus eps est partiellement ou complètement disponible dans les banques publiques 15 (GENBANK par exemple), l'analyse in silico des produits théoriques de restriction du fragment PCR d'environ 2480 pb avec les enzymes de restriction Mnll, Fokl et HindIII génère les profils de restriction présentés dans la figure 3. Ces profils de restriction ont été établis in silico sur la base des tailles des fragments de restriction fournies par l'outil NEBcutter (cf. tableau 2). 20 Tableau 2 : Taille des fragments d'ADN déterminés par digestion in silico du fragment epsAD par les enzymes de restriction Mnll, FokI et HindIII, pour les souches de S. thermophilus dont la séquence des gènes epsA-B-C-D est disponible. Souche de Numéro d'accès Taille des fragments de digestion par Mn1I, Fokl et S. thermophilus GENBANK du locus eps, ou autre référence HindlIl de la région epsAD (taille en paires de bases déterminée par NEBcutter, http://tools.neb.comn MTC310 AF448502 778 ; 371 ; 344 ; 299 ; 175 ; 142 ; 100 ; 79 ; 75 ; 42 ; 35;23;9 Sfi39 AF373595 778 ; 371 ; 344 ; 299 ; 175 ; 142 ; 100 ; 79 ; 75 ; 42 ; 35;23;9 Typel AF410175 778 ; 371 ; 344 ; 299 ; 175 ; 142 ; 100 ; 79 ; 75 ; 42 ; 2906536 11 35;23;9 IP6757 AJ289861 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 175 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 35;23;9;3 TypeV AF454496 1264 ; 374 ; 305 ; 210 ; 123 ; 76 ; 66 ; 42 ; 9 ; 3 NCFB2393 Y17900 1264 ; 374 ; 305 ; 210 ; 123 ; 76 ; 66 ; 42 ; 9 ; 3 FI9186 AJ272341 1264 ; 374 ; 305 ; 210 ; 123 ; 76 ; 66 ; 42 ; 9 ; 3 TypeVI AF454497 1286;305;277;210; 100;76;75;66;42;23;9; 3 LMD-9 NZ_AAGS01000017 848 ; 655 ; 371 ; 175 ; 111 ; 100 ; 75 ; 60 ; 42 ; 23 ; 9 ; 3 TypeXl AF454501 851 ; 356 ; 305 ; 299 ; 175 ; 111 ; 100 ; 75 ; 60 ; 46 ; 42;23;20;9;3 CNCM I-3617 SEQ ID N 3 344 ; 341 ; 305 ; 299 ; 277 ; 210 ; 160 ; 142 ; 100 ; 79;75;66;42;23;9 TypeVII AF454498 486 ; 341 ; 305 ; 299 ; 277 ; 210 ; 160 ; 100 ; 76 ; 75 ; 66;42;23;9;3 TypeIV AF454495 618 ; 551 ; 305 ; 299 ; 210 ; 100 ; 95 ; 79 ; 75 ; 46 ; 42;23;20;9 TypeX AF454500 571 ; 356 ; 305 ; 299 ; 277 ; 210 ; 100 ; 79 ; 75 ; 66 ; 60;42;23;9 TypeIX AF454499 987 ; 305 ; 299 ; 277 ; 210 ; 100 ; 79 ; 75 ; 66 ; 42 ; 23 ; 9 Type1II AY057915 341 ; 305 ; 299 ; 277 ; 247 ; 239 ; 210 ; 160 ; 100 ; 76;75;66;42;23;9;3 CNCM I-2980 WO2004/085607 778 ; 374 ; 305 ; 247 ; 239 ; 210 ; 123 ; 76 ; 66 ; 42 ; 9;3 LMG18311 CP000023 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 210 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 23 ; 9 ; 3 CNRZ 1066 CP000024 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 175 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 35;23;9;3 MTC360 AF434993 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 175 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 35;23;9;3 MTC330 AF430847 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 175 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 35;23;9;3 MR-2C AY061649 778;371 ;299;247;239; 175; 100;76;75;42; 35;23;9;3 2906536 12 Sfi6 U40830 778 ; 371 ; 299 ; 247 ; 239 ; 175 ; 100 ; 76 ; 75 ; 42 ; 35;23;9;3 CNRZ368 Z98171 691 ;371;312;305;239; 112; 100;76;75;63; 42;35;23;22;9;3 MR-1C AF448249 691 ; 371 ; 312 ; 305 ; 239 ; 112 ; 100 ; 76 ; 75 ; 63 ; 42;35;23;22;9;3 Alternativement, le produit de PCR peut être digéré par les enzymes de restriction Mnll, Fokl et HindIII dans les conditions suivantes : produit de PCR 15 à 30 L, tampon 2 (New England Biolabs) x 1, sérum-albumine bovine (New England 5 Biolabs) x 1, enzyme Mnll (New England Biolabs) 1 unité, enzyme Fokl (New England Biolabs) 1 unité, enzyme HindlIl (New England Biolabs) 1 unité, H2O qsp 50 L. Incubation à 37 C pendant 1 heure. Les fragments de restriction sont ensuite analysés par électrophorèse. Une électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée. Cependant, pour pallier le 10 faible pouvoir de résolution de ce type d'électrophorèse (précision à +/- 10%) et la difficulté de visualiser les fragments de taille inférieure à 100 pb, on peut lui préférer des méthodes plus résolutives (de +1- 0,1 à 1%) telles que l'électrophorèse micro-fluidique (Agilent) ou l'électrophorèse capillaire. Ces méthodes (analyse in silico du profil de restriction ou analyse par 15 électrophorèse des fragments de restriction) ont été appliquées à plusieurs centaines de souches de la collection de souches de S. thermophilus de Danisco et à des souches de référence décrites dans la littérature. Les souches qui présentent le même profil de restriction ont été regroupées en clusters génétiques (ou groupes génétiques) notés CL-1 à CL-12. La comparaison 20 des profils de restrictions a été effectuée grâce au logiciel Bionumerics version 3.5. Le tableau 3 synthétise une partie des résultats obtenus. Tableau 3 : Synthèse des résultats de génotypage et de lysotypage Souche Génotype Lysotype Propriétaire Texturante CNCM I3617 CL-1 Résistante Danisco OUI CNCM I-2423 CL-2 LT-2 Danisco OUI 2906536 13 CNCM I-2426 Danisco OUI Danisco OUI CNCM I-2424 Collection privée OUI Sfi39 Danisco OUI DGCC945 CNCM I-2432 CL-3 LT-4 Danisco OUI Danisco OUI CNCM I-2978 CL-4 Danisco OUI DGCC7773 Collection publique OUI CNRZ1066 Danisco OUI DGCC7785 Danisco OUI DGCC7788 Danisco OUI DGCC7966 Danisco OUI DGCC47 CNCM I-2980 CL-5 LT-5 Danisco OUI Danisco OUI DGCC2056 Danisco OUI DGCC8013 Danisco OUI DGCC8015 DGCC7790 CL-6 LT-6 Danisco OUI Danisco OUI DGCC7813 Danisco OUI CNCM I-2979 Collection publique OUI CNRZ368 Université OUI MR-1 C CNCM I-2429 CL-7 LT-7 Danisco OUI ATCC BAA-491 CL-8 LT-8 Collection publique NON Danisco NON DGCC7689 Danisco NON DGCC 1086 Université NON SMQ-301 CL-9 Danisco NON DGCC7853 DGCC7919 CL-10 LT-10 Danisco NON DGCC7766 CL-11 LT-11 Danisco NON DGCC7809 CL-12 LT-12 Danisco NON Méthode pour déterminer la sensibilité d'une souche à un bactériophage : La sensibilité d'une souche à un bactériophage est établie par la méthode des plages de lyse. 100 l d'une culture de la souche à tester et 100 tl d'une dilution 5 appropriée d'un sérum contenant le bactériophage à étudier sont utilisés pour 2906536 14 ensemencer 5 ml d'un milieu gélosé en surfusion (0,6 % agar poids/volume) M17+glucose supplémenté à 10 mM en CaC12. L'ensemble est versé à la surface d'un milieu gélosé solidifié (1, 5 % agar poids/volume) M17+glucose supplémenté à 10 mM en CaC12. Après incubation une nuit à 42 C, la sensibilité de la souche 5 au bactériophage est évaluée par la présence de plages de lyse. L'absence de plage de lyse signifie la résistance de cette souche aux bactériophages testés. Le spectre de sensibilité d'une souche aux bactériophages, aussi appelé lysotype, est constitué par l'ensemble des sensibilités et résistances aux bactériophages étudiés. Un référentiel d'une soixantaine de phages a été mis en oeuvre pour établir le 10 lysotype des souches de S. thermophilus de la collection de Danisco. Les souches qui présentent le même lysotype ont été regroupées en différents groupes notés LT-n. Une partie des résultats est donnée au tableau 3. Il met en particulier en évidence 15 que les souches d'un même cluster génétique présentent quasiment toujours le même lysotype. La souche CNCM I-3617 appartient à un nouveau groupe génétique appelé CL-1 qui présente le lysotype très particulier d'être résistant à tous les bactériophages testés. 20 Séquence du locus eps Les connaissances génétiques acquises sur les S. thermophilus ont montré que le locus eps est un des sites majeurs d'hétérogénéité entre souches. Cette particularité a déjà été exploitée en partie pour développer la méthode de génotypage citée ci-dessus qui utilise la diversité dans la région epsA-B-C-D qui 25 est la région proximale du locus eps. Une diversité encore plus importante apparaît dans la région distale du locus eps (région codant les glycosyltransférases, voir figure 1). Cette région donne la spécificité de l'exopolysaccharide et induit donc au moins en partie la spécificité du pouvoir épaississant de la souche. C'est donc une région du chromosome particulièrement 30 indiquée pour décrire sans équivoque la souche CNCM I-3617 et les souches qui lui sont apparentées. La séquence nucléotidique du locus eps de la souche CNCM 2906536 15 I3617 (à partir du gène epsA) a été obtenue à partir d'un fragment d'ADN synthétique. Ce fragment a été synthétisé par PCR sur une matrice d'ADN génomique purifié de la souche CNCM I-3617 en utilisant deux amorces spécifiques de gènes conservés (deoD codant une purine-nucléotide 5 phosphorylase, et orf14.9 de fonction inconnue) encadrant généralement le locus eps chez les S. thermophilus décrits dans la littérature. La séquence de 16037 pb issue de la souche CNCM I-3617 correspond à la SEQ ID N 3. Les séquences de SEQ ID N 4 et SEQ ID N 5 (cf. figure 4) correspondent respectivement aux positions 6592 à 9391 et 10331 à 11373 de SEQ ID N 3. 10 Organisation génétique du locus eps La figure 4 schématise la structure génétique du locus eps de la souche CNCM I-3617 établie par analyse de sa séquence nucléotidique. La partie en amont du cadre ouvert de lecture (ORF) epsA, la séquence du début de l'ORF epsA, et la 15 partieen aval de l'ORF epsT ne sont pas connues. L'analyse de la séquence met en évidence 20 ORF qui sont tous orientés dans le même sens. De par leur similitude de séquence avec d'autres gènes connus, et/ou par la présence de motifs protéiques spécifiques au sein des produits déduits de ces ORF, il est possible de leur attribuer une fonction putative. 20 L'analyse structurale du locus eps de la souche CNCM I-3617 montre qu'il possède une organisation globale similaire à celle des loci eps déjà connus (cf figure 1). Les résultats de comparaison de séquences entre les protéines potentielles déduites des ORF du locus eps de CNCM I-3617 et celles disponibles dans les bases 25 publiques de données (GENBANK) sont synthétisés dans le tableau 4. Le locus eps de la souche CNCM I-3617 code pour des protéines potentiellement impliquées dans la synthèse de polysaccharide comme par exemple des glycosyltransférases. Sur la base de ces données, 6 régions peuvent être distinguées (région 1 à région 30 6, de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' du locus eps ; voir figure 4) : 2906536 16 • Région 1 : cette région est formée de 4 ORF (epsA, epsB, epsC, epsD) pour lesquels les protéines déduites présentent des similarités très élevées (entre 95,7 et 99,6%) avec les protéines déduites d'ORF situés dans le locus eps de souches de S. thermophilus. 5 • Région 2 : cette région est formée de 5 ORF (epsE, epsF, epsG, epsG' et epsH) pour lesquels les protéines déduites présentent des similarités très élevées (entre 96,6 et 99,3%) avec les protéines déduites d'ORF situés dans le locus eps de la souche typeXI (numéro d'accès GENBANK AF454501). 10 • Région 3 : cette région est formée de 3 ORF (epsJ, epsK et epsL) pour lesquels les protéines déduites présentent des similarités suffisantes (inférieures à 81%) avec des protéines décrites dans la littérature pour leur affecter une fonction probable. Cependant ces ORF sont clairement distincts d'ORF déjà décrits dans la littérature. 15 • Région 4: cette région est formée d'un ORF (epsM) pour lequel la protéine déduite présente des similarités très élevées (95,4%) avec la protéine déduite de dORF eps4F situé dans le locus eps de la souche typelV. • Région 5 : cette région est formée de 2 ORF (epsN et epsO) pour lesquels 20 les protéines déduites présentent des similarités suffisantes (inférieures à 91%) avec des protéines de lactobacilles décrites dans la littérature pour leur affecter une fonction probable. Cependant ces ORF sont clairement distincts d'ORF déjà décrits dans la littérature chez les S. thermophilus. • Région 6 : cette région est formée de 5 ORF (epsP, epsQ, epsS, epsR et 25 eps7) pour lesquels les protéines déduites présentent des similarités très élevées (entre 98,9 et 100%) avec les protéines déduites d'ORF situés dans le locus eps de la souche CNRZ368 (numéro d'accès GENBANK Z98171). Globalement, la partie distale du locus eps ressemble à un assemblage hybride de 30 gènes dont certains n'avaient jamais été décrits auparavant. 2906536 17 Tableau 4 : Analyse des ORF du locus eps de la souche CNCM I-3617. La position correspond aux nucléotides de début et de fin d'ORF dans la séquence SEQ ID N 3. La fonction probable est celle des protéines déduites de la séquence des ORF. La meilleure similarité est la protéine ou la protéine déduite (le numéro 5 d'accès GENBANK de la séquence protéique est indiqué entre parenthèses) présentant la plus grande similarité avec la protéine déduite de l'ORF. Le score est le pourcentage de similarité obtenu pour la meilleure similarité à l'aide de l'outil "blastp" (Protein-protein BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). ORF Position Fonction probable Meilleure Similarité Score epsA 1 à 491 Régulateur transcriptionnel EpslOA (AAN63761), S. thermophilus 99,4 TypeX epsB 492 à Polymérisation et/ou Eps5B (AAN63698), S. thermophilus 99,6 1223 export des polysaccharides TypeV epsC 1232 à Polymérisation et/ou EpslC (AAN63508), S. thermophilus 97,0 1924 export des polysaccharides TypeI epsD 1934 à Polymérisation et/ou Eps5D (AAN63700), S. thermophilus 99,2 2674 export des polysaccharides TypeV epsE 2731 à Undecaprenyl-phosphate Eps11E (AAN63787), S. thermophilus 98,9 4098 glycosyl-l-phosphate TypeXI transferase epsF 4131 à Rhamnosyltransferase Epsl 1F (AAN63788), S. thermophilus 99,3 4574 TypeXl epsG 4546 à Epimerase Eps11G (AAN63789), S. thermophilus 96,6 5073 TypeXI epsG' 5089 à Epimerase Epsl IG (AAN63789), S. thermophilus 96,8 5553 TypeXI epsH 5644 à UDP-glucose 6- Eps11H (AAN63790), S. thermophilus 98,9 5940 dehydrogenase TypeXI epsJ 6661 à UDP-galactopyranose Glf (ZP_00045853), Lactobacillus 81,1 7812 mutase gasseri ATCC 33323 epsK 7814 à Glycosyltransferase EpsF (AAG44710), Lactobacillus 64,9 8896 delbrueckii subsp. bulgaricus Lfi5 epsL 8896 à Glycosyltransferase CpsI (CAC81257), S. thermophilus 65,7 9441 FI9186 2906536 18 8896 à Eps4F (AAN63682), S. thermophilus epsM Glycosyltransferase 95,4 9441 TypeIV 9540 à dTDP-4-dehydrorhamnose RfbD (YP 619620), Lactobacillus epsN delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 81,4 10370 reductase 11842 10955 à dTDP-4-dehydrorhamnose RfbC (NP_964906), Lactobacillus epsO 90,6 11563 3,5-epimerase johnsonii NCC 533 11580 à EpsP (CAB52238), S. thermophilus epsP Glycosyltransferase 99,3 12422 CNRZ368 12519 à EpsQ (CAB52237), S. thermophilus epsQ Glycosyltransferase 98,9 13358 CNRZ368 13355 à EpsS (CAB52236), S. thermophilus epsS inconnue 99,5 14641 CNRZ368 14648 à EpsR (CAB52235), S. thermophilus epsR Glycosyltransferase 100 15790 CNRZ368 15790 à EpsT (CAB52234), S. thermophilus epsT inconnue 100 16037 CNRZ368 Propriété acidifiante Le support de fermentation est obtenu en supplémentant 100 ml de lait UHT 5 demi-écrémé (Le Petit Vendéen ) par 3% (poids/volume) de poudre de lait écrémé (SUP'R TOP , Eurial Poitouraine). La stérilité de la solution est obtenue par une pasteurisation de 10 min à 90 C (à coeur). Le support de fermentation ainsi obtenu est inoculé avec la souche à tester à raison de 106 ufc/ml, puis incubé à 43 C (au bain-marie). Le pH est suivi en continu grâce à l'utilisation d'un 10 CINAC (Ysebaert). Les propriétés acidifiantes des souches de S. thermophilus peuvent être décrites par la vitesse maximale d'acidification, Vm (unité pH/min (upH/min)), calculée par la valeur maximale de la dérivée première de la courbe pH en fonction du 15 temps. Dans ces conditions opératoires, il est estimé que cette grandeur est caractéristique de la souche. Sa valeur est constante quelque soit l'état physiologique du micro-organisme à l'inoculation du lait et le niveau 2906536 19 d'ensemencement. On distingue deux groupes de souches, les souches dites lentes en acidification, dont la Vm est supérieure à ù 0,0100 upH/min, et les souches dites rapides en acidification dont la Vm est inférieure à -0,0100 upH/min. La souche CNCM I-3617 appartient clairement au groupe des souches dites rapides 5 en acidification (Tableau 5). Cette propriété est très souvent liée à la présence dans le génome des souches d'un gène codant la protéase de paroi PrtS qui a pu être détecté dans le génome de CNCM I-3617. Tableau 5: Vitesse maximale d'acidification de différentes souches de 10 Streptococcus thermophilus évaluée dans les conditions opératoires décrites. Vitesse maximale ( x -1.E5 upH/min) Souche Moyenne Ecart-type Gène prtS CNCM I-2429 66 24 absent DGCC7966 68 12 absent absent CNCM I-2432 80 13 DGCC7766 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 82 13 absent CNCM I-2978 88 12 absent DGCC7773 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 92 17 absent CNCM I-2979 102 33 absent CNCM I-2423 129 24 présent CNCM I-3617 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ présent CNCM I-2980 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ présent DGCC7919 190 présent 144 7 167 27 22 Propriété texturante Le support de fermentation est obtenu en supplémentant 100 ml de lait UHT demi-écrémé (Le Petit Vendéen ) par 3% (poids/volume) de poudre de lait 15 écrémé (SUP'R TOP , Eurial Poitouraine). La stérilité de la solution est obtenue par une pasteurisation de 10 min à 90 C (à cœur). Le support de fermentation ainsi obtenu est inoculé avec la souche à tester à raison de 106 ufc/ml, puis incubé à 43 C (au bain-marie) jusqu'à l'obtention d'un pH de 4,6. Le suivi du pH est réalisé en continu grâce à l'utilisation d'un CINAC (Ysebaert). Les laits fermentés 2906536 20 ainsi obtenus sont placés dans une étuve ventilée à 6 C, jusqu'à leur analyse. Deux types de mesures rhéologiques sont effectués : viscosité et écoulement. Les mesures de viscosité sont réalisées à une température de 8 C sur des laits fermentés, après 1, 7, 14 et 28 jours de stockage à 6 C. L'appareillage utilisé est 5 un viscosimètre Brookfield de type RVF (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.) monté sur pied Helipath (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.). Le viscosimètre est équipé d'une aiguille de type C et la vitesse d'oscillation appliquée à l'aiguille est de 10 tours/min. Les mesures d'écoulement sont effectuées à une température de 8 C sur des laits fermentés préalablement brassés, 10 après 14 jours de stockage à 6 C. L'appareillage utilisé est un rhéomètre AR1000-N (TA Instrument) équipé de cylindres co-axiaux (Rayon 1 = 15 mm, Rayon 2 = 13,83 mm, Hauteur = 32 mm, Entrefer = 2 mm). Pour le segment de montée, la contrainte appliquée en balayage continu varie de 0 à 60 Pa pendant une durée de 1 min selon un mode linéaire. Pour le segment de descente, la contrainte 15 appliquée en balayage continu varie de 60 à 0 Pa pendant une durée de 1 min selon un mode linéaire. Les valeurs prises en compte sont l'aire de thixotropie et le seuil d'écoulement ; ce dernier est calculé selon le modèle de Casson. Le potentiel texturant d'une souche peut être évalué dans un premier temps par une mesure de viscosité du caillé obtenu dans les conditions opératoires décrites 20 ci-dessus. Les souches reconnues non texturantes fournissent des valeurs de viscosité proches de 30 Pa.s alors que les souches texturantes dépassent les 40 Pa.s. Ce potentiel texturant peut être plus ou moins marqué (Tableau 6). Par exemple la souche CNCM I-2979 produit un caillé dont la viscosité atteint 42 Pa.s, et la souche DGCC7966 permet, elle, d'obtenir une viscosité nettement plus 25 élevée, de 70 Pa.s. La souche CNCM I-3617 fournit des caillés dont la viscosité s'élève à 54 Pa.s (Tableau 6). Cette valeur place cette souche parmi le groupe des souches à potentiel texturant tout-à-fait comparable aux souches industrielles actuellement utilisées pour concevoir des ferments lactiques pour la fabrication des yaourts et des laits fermentés. 30 2906536 21 Tableau 6 : Viscosité des laits fermentés obtenus avec les différentes souches testées, après un stockage à 6 C pendant 14 jours. Viscosité en Pa.s Souche Moyenne Ecart-type DGCC7966 70,0 Nd ------------------------------------------------------------------------------------------------------ DGCC7773 55,0 3,3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ CNCM I-3617 54,0 2,5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ CNCM I-2980 53,0 2,9 CNCM I-2429 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 51,0 3,1 CNCM I-2978 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 49,6 4,2 CNCM I-2432 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 43,0 4,0 CNCM I-2979 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 42,2 3,0 CNCM I-2423 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 42,0 4,6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ DGCC7919 28,0 Nd DGCC7766 30,0 Nd Nd : non déterminé 5 Les analyses rhéologiques en utilisant le rhéomètre AR1000-N ont permis de mesurer deux descripteurs rhéologiques pertinents pour qualifier les laits fermentés : le seuil d'écoulement du produit (Pa) et l'aire de thixotropie (Pais). Ces mesures sont reportées dans le tableau 7 pour chacune des souches. Pour le lait fermenté avec la souche CNCM I-3617, les valeurs moyennes sont 10 respectivement de 11,25 Pa et de 352 Pais. Ces valeurs sont significativement différentes de celles mesurées sur des caillés obtenus avec des souches réputées non texturantes (DGCC7766 ou DGCC7919). Tableau 7: Valeurs de seuil d'écoulement et aire de thixotropie, modèle de 15 Casson, mesurés par l'AR1000-N sur des laits fermentés produits avec différentes souches après stockage durant 14 jours à 6 C. Seuil d'écoulement (Pa) Aire de thixotropie ( Pais) Souche Moyenne Ecart-type Moyenne Ecart-type CNCM I-2980 5,89 0,9 488 107 CNCM I-2423 8,86 0,9 1344 574 2906536 22 CNCM I-2978 10,51 0,4 728 153 CNCM I-3617 11,25 0,4 352 53 CNCM I-2432 12,27 1,3 1245 181 CNCM I-2429 13,32 1,2 1215 255 CNCM I-2979 13,56 Nd 1786 250 DGCC7773 14,00 Nd 60 Nd DGCC7966 15,00 Nd 43 Nd DGCC7919 15,91 0,2 33100 1415 DGCC7766 17,01 0,1 17083 1520 Nd : non déterminé Conclusion La souche CNCM I-3617 présente plusieurs caractéristiques d'intérêt pour la 5 construction de ferments et en particulier pour des ferments utilisés lors de la production de yaourts ou de laits fermentés. Elle présente une association rare de propriétés fonctionnelles (souche acidifiante et épaississante) et son lysotype est distinct de celui des autres souches classiquement utilisées pour ces applications. 10 Références bibliographiques Bolotin A, Quinquis B, Renault P, Sorokin A, Ehrlich SD, Kulakauskas S, Lapidus A, Goltsman E, Mazur M, Pusch GD, Fonstein M, Overbeek R, Kyprides N, Purnelle B, Prozzi D, Ngui K, Masuy D, Hancy F, Burteau S, Boutry M, Delcour J, Goffeau A, Hols P (2004). 15 Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Nat Biotechnol. 22(12), 1554-1558. Bourgoin F, Pluvinet A, Gintz B, Decaris B, Guedon G (1999). 20 Are horizontal transfers involved in the evolution of the Streptococcus thermophilus exopolysaccharide synthesis loci? Gene. 233(1-2), 151-161. 2906536 23 Broadbent JR, McMahon DJ, Welker DL, Oberg CJ, Moineau S (2003). 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BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol Lett. 174(2), 247-250. 10 20 Revendications 1. Souche de Streptococcus thermophilus dont le fragment epsAD présente après digestion par les enzymes de restriction Mnll, FokI et HindII1 un profil de restriction caractérisé par des fragments d'ADN de 34412 pb, 34112 pb, 30512 pb, 29912 pb, 27712 pb, 21012 pb, 16012 pb, 14212 pb, 10012 pb, 7912 pb, 7512 pb, 6612 pb, 4212 pb, 2312 pb et 912 pb. 2. Souche selon la revendication 1 comprenant une séquence nucléotidique 10 présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique de SEQ ID N 4. 3. Souche selon l'une des revendications 1 à 2 comprenant une séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité avec la séquence nucléotidique 15 de SEQ ID N 5. 4. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est texturante. 20 5. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle est rapide en acidification. 6. Souche selon l'une des revendications précédentes caractérisée en que la souche est la souche de Streptococcus thermophilus déposée le 14 juin 2006 à la 25 Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro CNCM I-3617 ou une souche mutante susceptible d'être obtenue à partir de celle-ci. 7. Souche de Streptococcus thermophilus déposée le 14 juin 2006 à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes sous le numéro CNCM I-3617. 25 30 2906536 26 8. Composition bactérienne comprenant au moins une souche selon l'une des revendications précédentes. 9. Procédé de fabrication d'un produit alimentaire, d'un complément alimentaire, 5 d'un supplément diététique ou d'un produit aux propriétés probiotiques comprenant une étape dans laquelle la souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 est utilisée. 10. Procédé selon la revendication 9 dans lequel le produit alimentaire, le complément alimentaire, le supplément diététique ou le produit aux propriétés probiotiques est un produit laitier, un produit camé, un produit céréalier, une boisson, une mousse ou une poudre. 11. Produit alimentaire, complément alimentaire, supplément diététique ou produit aux propriétés probiotiques comprenant au moins une souche selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou la composition bactérienne selon la revendication 8. 12. Produit laitier comprenant au moins la souche selon les revendications 1 à 7 ou la composition bactérienne selon la revendication 8. 13. Produit laitier selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un lait fermenté, d'un yaourt, d'une crème maturée, d'un fromage, d'un fromage frais, d'une boisson lactée, d'un rétentat de produit laitier, d'un fromage fondu, d'une crème dessert, d'un fromage du cottage ou d'un lait infantile. 14. Produit laitier selon la revendications 12 ou 13 caractérisé en ce qu'il comprend du lait d'origine animale et/ou végétale.