Brevet FR2901707A1 — publié le 20071207

La présente invention se rapporte à un facteur VII recombinant ou transgénique obtenu sous forme d'une composition de facteur VII, chaque molécule de facteur VII possédant deux sites de N-glycosylation à motifs glycanniques définis, ainsi qu'à son utilisation comme médicament. Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le facteur X et le facteur IX en présence de calcium et du facteur tissulaire. Le FVII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus, dont le poids moléculaire est d'environ 50 kDa. Le FVII comporte quatre domaines structuraux distincts : le domaine y-carboxylique (Gla) N-terminal, deux domaines "epidermal growth factor (EGF)-like", ainsi qu'un domaine sérine protéase. L'activation du FVII en FVIIa est caractérisée par la coupure de la liaison Arg152-Ile153 (Arginine 152-Isoleucine 153). Le FVIIa est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de poids moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de poids moléculaire d'environ 30 kDa) liées entre elles par un seul pont disulfure (Cys135-Cys262) Le FVIIa plasmatique comporte plusieurs modifications post-traductionnelles : les dix premiers acides glutamiques sont y-carboxylés, l'Asp63 est partiellement hydroxylé, la Ser52 (Sérine 52) et la Ser60 (Sérine 60) sont 0-glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose(Xylose)0_2 et Fucose, l'Asn145 (Asparagine 145) et l'Asn322 (Asparagine 322) sont N-glycosylées majoritairement par des structures complexes biantennées bisialylées. Le FVII est utilisé dans le traitement des patients atteints d'hémophilie, présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B), ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des facteurs de coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Il est donc nécessaire de disposer de concentrés de FVIIa injectables. La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en la purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du fractionnement. Le document EP 0 346 241 décrit, à cet effet, la préparation d'une fraction enrichie en FVIIa, obtenue après adsorption puis élution d'un sous-produit du fractionnement de protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines telles les facteurs IX (FIX), X (FX) et II (FII), notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII, P = proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur antihémophilique B ou FIX). L'inconvénient de ce procédé est que le FVII obtenu contient encore quelques traces d'autres facteurs de coagulation. De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs vitamine K dépendants et du FVIII. Le FVII obtenu par ce procédé, malgré sa pureté, présente une activité thrombogénique résiduelle. Ainsi, l'un des inconvénients majeurs de ces procédés est qu'ils ne permettent d'obtenir que de faibles quantités de produits. Par ailleurs, il demeure difficile d'obtenir un produit totalement dépourvu d'autres protéines présentes dans le plasma. Enfin, bien que de nombreuses précautions soient prises à tous les stades de l'élaboration des facteurs plasmatiques de la coagulation pour assurer leur sécurité virale et bactérienne (suivis des donneurs de sang, tests pour détecter les contaminants viraux et bactériens connus, traitements rigoureux de purification et d'inactivation virale pour réduire au maximum le risque de transmission d'agents pathogènes véhiculés par le sang), tout risque de contamination par des agents pathogènes n'est pas néanmoins écarté. De plus, l'émergence de la nouvelle variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob a fait resurgir les craintes de transmission d'agents pathogènes non conventionnels par les produits issus du sang. En outre, le volume de plasma collecté auprès des donneurs de sang reste limité. C'est pourquoi, dés les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a été isolé (Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83 (8) :2412-6) et exprimé dans les cellules de mammifères BHK (Baby Hamster Kidney) (document EP 0 200 421). Si cette méthode de production de FVII a pour avantage de contrôler le milieu dans lequel la protéine d'intérêt est produite, il est connu que les cellules de hamster confèrent aux protéines qu'elles expriment des motifs Galal,3Gal, (Spiro RG et al, J. Biol. Chem, 1984, vol. 259, N 15, 9858 et Furukawa K. et al, J. Biol. Chem, 1992, vol. 267, N 12, 8012), dont l'immunogénicité est démontrée. Le facteur VII recombinant est donc susceptible de conférer des effets secondaires non négligeables chez les patients auxquels il est administré. Il a été établi que 1% des lymphocytes B circulants chez l'homme produisent des anticorps dirigés contre l'épitote Galîl,3Gal (Galili et al, Blood, 1993, vol. 82, 2485). L'épitope et l'anticorps forment alors un complexe activant le complément et conduisant à des réactions immunitaires sévères, telles que les rejets aigus de greffes suite aux xenotransplantations. Il a été démontré que 15 à 20% des hémophiles traités à l'aide d'un FVII produit en cellule de hamster développent une réaction immunitaire (Prowse C.V et al, Blood Reviews, 1998, vol. 12, 99). Ce type de réaction immunitaire est dramatique dans le cas des hémophiles, car les FVII et FVIII devenus immunogènes vont entraîner des hémorragies très difficilement traitables. 1.0 Ainsi, il demeure nécessaire d'obtenir une composition de FVIIa recombinant ou transgénique dont l'immunogénicité est réduite, tout en étant la plus faible possible, et viralement sécurisé. C'est pourquoi la Demanderesse a cherché à mettre au point une composition de FVII, viralement sécurisée, présentant une immunogénicité très réduite. 20 Ainsi, l'invention se rapporte à une composition de facteur VII recombinant ou transgénique, chaque molécule de facteur VII de la composition présentant deux sites de N-glycosylation, caractérisée en ce que parmi toutes les molécules de FVII de la composition, 25 le taux de motifs glycanniques Ga1î1,3Gal est compris entre 0 et 4%. La Demanderesse a trouvé de manière surprenante qu'un tel taux de motifs glycanniques Galal,3Gal dans 30 le FVII de la composition de l'invention n'est pas immunogène lors de traitements de patients. Le FVII de l'invention est sous forme d'une composition. En effet, tout FVII, qu'il soit plasmatique, recombinant ou transgénique, se présente 35 sous forme d'un mélange de plusieurs protéines de FVII, ces protéines se différenciant entre elles notamment en ne présentant pas la même glycosylation. 15 Cette glycosylation est due à une maturation posttraductionnelle effectuée par les organites cellulaires au cours du transfert de la protéine de FVII entre les différents compartiments cellulaires. Cette modification biochimique modifie profondément la protéine, de telle sorte que la protéine finale est bien différente de la molécule directement codée par le gène. Cette modification chimique contribue à la régulation de l'activité de la protéine, ainsi qu'à sa localisation. Ainsi, aux fins de l'invention, les expressions FVII et composition de FVII sont équivalentes. Par FVII recombinant ou transgénique , on désigne tout FVII issu du génie génétique et présentant les caractéristiques de glycosylation énoncées, c'est-à-dire un taux nul ou très faible de Galal,3Gal dans la composition de FVII, ou encore assez faible pour ne pas être immunogène. Par opposition, le FVII de l'invention n'est pas un FVII plasmatique, c'est-à-dire qu'il n'est pas un produit purifié à partir de plasma humain ou animal. Le motif Galal,3Gal est une structure composée de deux galactoses liés en al,3. Il est situé à l'extrémité des antennes oligosaccharidiques des structures N-liées. Ce motif est connu pour son immunogénicité. En effet, ce motif glycannique est absent chez l'homme ainsi que chez certains singes, car le gène codant pour l'enzyme permettant sa synthèse (l'îl,3galactosyltransférase) a été inactivé. C'est pourquoi l'administration, chez l'homme, d'une protéine présentant un tel motif provoque l'apparition d'anticorps dirigés contre la protéine ainsi glycosylée. Il est donc éminemment souhaitable de ne pas trouver un tel motif immunogène dans les protéines pharmaceutiques. De préférence, la composition est caractérisé par une absence des motifs glycanniques Galal,3Gal dans toutes les molécules de facteur VII qui y sont présentes. On entend ainsi désigner un FVII dont le taux de structures Galal,3Gal est nul ou si faible qu'il ne peut être distingué du bruit de fond obtenu par les mesures mises en œuvre par les appareillages l.0 d'analyses actuellement disponibles, ou dont le taux n'est pas détectable notamment par une méthode de détection en lectine-blot avec révélation au 4-chloro-1-naphtol. Cette méthode de quantification est illustrée dans la partie Exemples . Cette 15 expression désigne de manière équivalente tout FVII recombinant ou transgénique dont le taux de Galal,3Gal est proche de celui du FVII plasmatique. En tout état de cause, le taux de Galal,3Gal de la composition de FVII de l'invention n'est pas immunogène pour l'homme. 20 A l'inverse, un FVII recombinant disponible dans le commerce, tel que Novoseven (Novo Nordisk TM) présente un taux de Galal,3Gal qui est détectable, qui peut donc être distingué du bruit de fond obtenu par les appareillages d'analyse. 25 Ainsi, selon la méthode de quantification utilisée, le motif Galal,3Gal pourra être soit totalement absent, soit présent à une taux inférieur à 4%, ou encore inférieur à 3,5%, ou encore à un taux 30 inférieur à 3%, ce taux ne pouvant être distingué du bruit de fond. Avantageusement, le taux de motif Galal,3Gal est présent à un taux identique ou quasi-identique à celui du FVII plasmatique. 35 Le FVII de l'invention est un polypeptide dont la séquence peptidique peut être celle du FVII humain naturel, c'est-à-dire la séquence présente chez les humains ne présentant pas de troubles liés au FVII. Une telle séquence peut être codée par exemple par la séquence lb décrite dans le document EP 0 200 421. Avantageusement, la sequence du FVII de l'invention est la séquence SEQ ID NO : 1. Dans un autre mode de réalisation, le FVII de l'invention peut être un variant du FVII humain naturel, dans la mesure où ce variant n'est pas plus immunogène que le FVII naturel. Ainsi, la séquence peptidique de ce variant peut posséder au moins 70% d'identité, et de manière avantageuse au moins 80% ou 90%, et de manière encore plus avantageuse au moins 99% d'identité avec la séquence du FVII humain naturel, un tel variant possédant essentiellement la même activité biologique que le FVII naturel. Par ailleurs, le FVII de l'invention désigne également tout FVII dont l'activité biologique a été modifiée ou réduite par rapport à celle du FVII naturel. A titre d'exemple, on peut citer le FVII humain recombinant inactivé FFR-FVIIa, utilisé pour le traitement ou la prévention des thromboses (Holst et al, Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg., 1998 Jun, 15(6) : 515-520). De tels FVII sont des polypeptides qui possèdent une séquence en acides aminés qui diffère de la séquence du FVII naturel par l'insertion, la délétion ou la substitution d'un ou de plusieurs acides aminés. Enfin, dans un autre mode de réalisation, le FVII de l'invention peut être activé (FVIIa). Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII lorsque ce dernier interagit en lieu et place du premier avec le facteur tissulaire (FT). L'activation du FVII résulte du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa est le facteur de la coagulation responsable de l'hémostase chez les hémophiles ayant des anticorps circulants par exemple. D'une manière particulièrement avantageuse, le FVII de l'invention est totalement activé. Le FVIIa de l'invention comporte plusieurs modifications post-traductionnelles : les neuf ou dix premiers acides glutamiques N-terminaux sont y - carboxylés, l'Asp63 est partiellement hydroxylé, la Ser52 et la Ser60 sont 0-glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose(Xylose)0_2 et Fucose, l' Asn145 et l' Asn322 sont N-glycosylées majoritairement par des structures complexes biantennées monosialylées. L'activité biologique du FVII de l'invention peut être quantifiée en mesurant la capacité d'une composition de FVII à induire la coagulation sanguine au moyen d'un plasma déficient en FVII et de la thromboplastine, comme par exemple décrit dans le brevet US 5,997,864. Dans le test décrit dans ce brevet, l'activité biologique est exprimée par une réduction du temps de coagulation par rapport à l'échantillon contrôle, et est convertie en unités de FVII par comparaison avec un standard de sérum humain (pool) contenant 1 unité/ml d'activité de FVII. Le FVII recombinant de l'invention peut être obtenu au moyen des techniques standard, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une protéine dans un système biologique. Le FVII de l'invention peut être exprimé dans tout micro-organisme, plante ou animal conférant les caractéristiques de glycosylation énoncées, c'est-à- dire un taux très faible ou nul de Galal,3Gal dans la composition de FVII. Par micro-organisme, on entend tout système bactérien, fongique, viral ou cellulaire, les cellules pouvant être des cellules de plantes ou de mammifères. Les cellules de mammifères peuvent être des cellules animales ou humaines. Il peut s'agir également de toute cellule KnockOut pour 1 'a 1, 3galactosyltransférase. Le FVII de l'invention peut également être produit dans des animaux ou des plantes transgéniques, dans la mesure où ces animaux ou plantes confèrent au FVII ou à la composition de FVII les caractéristiques de glycosylation énoncées, c'est-à-dire une absence ou un très faible taux de Galal,3Gal dans la composition de FVII. Les animaux peuvent être le lapin, le porc, le mouton, la chèvre, le boeuf, la poule, ou tout animal KnockOut pour l'al,3galactosyltransférase, cette liste n'étant pas limitative. Le FVII de l'invention comporte, comme le FVII humain, deux sites de N-glycosylation, en position 145 et 322, et 2 sites de 0-glycosylation, en position 52 et 60. Dans un site de N-glycosylation, les chaînes d'oligosaccharides sont liées à une asparagine (N-liées). Dans un site de 0-glycosylation, les chaînes d'oligosaccharides sont liées à une sérine. Les motifs liés sur ces acides aminés seront différents pour chaque protéine de la composition. Toutefois, on peut quantifier, pour la totalité de la composition, le taux de chaque motif glycannique, ou encore de chaque sucre. Les pourcentages des différents glycannes donnés dans la présente demande ne tiennent pas compte de la 0-glycosylation. De préférence, la composition de FVII est caractérisée en ce que, parmi tous les motifs glycanniques de la composition, au moins 40% sont des des formes glycanniques biantennées, monosialylées. Dans un autre mode de réalisation, les formes monosialylées sont présentes à au moins 50%. Dans un 3.5 autre mode de réalisation, les formes monosialylées sont présentes à au moins 60%. Avantageusement, les formes glycanniques biantennées, monosialylées sont majoritaires. La composition de FVII se caractérise en ce que au moins certains des acides sialiques du facteur VII 5 impliquent des liaisons a2-6. De façon particulièrement préférée, tous les acides sialiques impliquent des liaisons a2,6, c'est-à-dire que tous les acides sialiques sont liés au galactose par une liaison a2,6, et, en particulier, au 10 moins 90% des acides sialiques du FVII impliquent des liaisons î2,6. La composition de FVII selon l'invention peut en outre comprendre des acides sialiques de liaisons a2-3. 15 Le fait que des acides sialiques du FVII de la composition impliquent des branchements a2,6 est un des avantages du FVII de l'invention. En effet, les acides sialiques du FVII recombinant disponible dans le commerce impliquent uniquement des liaisons a2,3. 20 Or, le FVII plasmatique est un mélange de ces deux isomères. Toutefois, ce dernier comporte plus de liaisons a2,6, ce qui rapproche encore le FVII de l'invention du FVII plasmatique. 25 Avantageusement, parmi les formes glycanniques biantennées monosialylées, les formes glycanniques majoritaires sont non fucosylées. De préférence, ces formes glycanniques biantennées monosialylées non fucosylées sont 30 présentes dans le FVII de la composition de l'invention à un taux au moins supérieur à 20%. Avantageusement, ce taux est au moins supérieur à 25%, ou encore à au moins 40%. 35 D'une manière particulièrement avantageuse, le taux de fucosylation de la composition de FVII de l'invention est compris entre 20% et 50%. Dans un mode de réalisation de l'invention, ce taux peut être inférieur à 15%. Cette caractéristique est l'un des avantages du FVII de l'invention. En effet, le FVII recombinant disponible dans le commerce présente un taux de fucosylation de 100%, alors que le FVII plasmatique possède un taux de fucosylation de 16% environ. Ainsi, la fucosylation du FVII de l'invention est proche de celle du FVII plasmatique, ce qui confère un avantage au FVII de l'invention en terme d'immunogénicité. Avantageusement, le FVII de l'invention est un FVII transgénique. Ainsi, le FVII de l'invention est avantageusement un FVII recombinant produit de manière transgénique. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le FVII transgénique de l'invention est produit dans le lait d'un animal transgénique. Une telle production de protéines peut être réalisée en greffant le gène codant pour la protéine d'intérêt sur la région régulatrice d'un des gènes de synthèse de protéines du lait qui va diriger celle-ci spécifiquement dans la glande mammaire puis sa sécrétion dans le lait. De manière particulièrement avantageuse, le FVII de l'invention est produit par le lapin. Cette espèce est particulièrement avantageuse car le lapin ne semble pas sensible aux prions, notamment à l'encéphalopathie spongiforme subaiguë transmissible, qui constitue un problème de santé publique majeur. De plus, la barrière d'espèce entre le lapin et l'homme est importante. A l'inverse, la barrière d'espèce entre l'homme et le hamster, qui est le système biologique dans lequel est produit le FVII recombinant disponible dans le commerce, est moins importante. Ainsi, la production du FVII dans le lapin est avantageuse en terme de sécurité quant à la 5 transmission d'agents pathogènes. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le FVII de l'invention est produit dans les glandes mammaires de lapines. 10 La sécrétion par les glandes mammaires de la protéine d'intérêt, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique est une technique bien connue de l'homme du métier, qui implique le contrôle de l'expression de la protéine recombinante de manière 15 tissus-dépendante. Le contrôle tissulaire de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Ces séquences sont notamment les séquences promoteur, 20 ainsi que les séquences peptides signal. Des exemples de promoteurs permettant l'expression d'une protéine d'intérêt dans les glandes mammaires sont le promoteur WAP (whey acidic protein), le promoteur de la caséine, le promoteur de la 0lactoglobuline, cette liste n'étant pas limitative. Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule 30 d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour le FVII humain, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une 35 femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le FVII transgénique d'intérêt. Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063, dont l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine d'intérêt de l'invention. Un plasmide contenant le promoteur WAP est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le gène codant pour le FVII humain est intégré, et placé sous la dépendance du promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la protéine d'intérêt sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapins. Les embryons sont ensuite transférés dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des transgènes est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. Le FVII transgénique produit par la lapine dans son lait est obtenu sous forme d'une composition où chaque molécule de facteur VII de la composition présente deux sites de N-glycosylation, caractérisé en ce que parmi toutes les molécules de FVII de la composition, le taux de motifs glycanniques Galal,3Gal est inférieur à 4%, voire nul. Ainsi, de manière avantageuse, le FVII transgénique produit par la lapine ne possède pas de motif glycannique Galal,3Gal. De préférence, la composition de FVII transgénique de lapine de l'invention est caractérisée en ce que, parmi tous les motifs glycanniques de la composition, au moins 40% sont des des formes glycanniques biantennées, monosialylées. Dans un autre mode de réalisation, les formes monosialylées sont présentes à au moins 50%. Dans un autre mode de réalisation, les formes monosialylées sont présentes à au moins 60%. Avantageusement, les formes glycanniques biantennées, monosialylées sont majoritaires. La composition de FVII se caractérise en ce que au moins certains des acides sialiques du facteur VII impliquent des liaisons a2-6. De façon particulièrement préférée, tous les acides sialiques impliquent des liaisons a2,6, et, en particulier, au moins 90% des acides sialiques du FVII impliquent des liaisons x2,6. La composition de FVII selon l'invention peut en outre comprendre des acides sialiques de liaisons a2-3. De préférence, parmi les formes glycanniques biantennées, monosialylées, les formes glycanniques majoritaires sont non fucosylées. Avantageusement, ces formes glycanniques biantennées, monosialylées non fucosylées sont présentes dans le FVII de cette composition à un taux au moins supérieur à 20%. Avantageusement, ce taux est au moins supérieur à 25%, ou encore à au moins 40%. De préférence, le taux de fucosylation du FVII de cette composition de l'invention est compris entre 20% 30 et 50%. Dans un mode de réalisation de l'invention, ce taux peut être inférieur à 15%. Le FVIIa transgénique de l'invention comporte plusieurs modifications post-traductionnelles : les 35 neuf ou dix premiers acides glutamiques N-terminaux sont y -carboxylés, l'Asp63 (Asparagine63) est partiellement hydroxylé, la Ser52 (Sérine 52) et la Ser60 (Sérine 60) sont 0glycosylées et portent respectivement les motifs Glucose(Xylose)0_2 et Fucose, l'Asn145 et l'Asn322 sont N-glycosylées majoritairement par des structures complexes biantennées monosialylées. Le FVII de l'invention peut être purifié à partir du lait par des techniques connues de l'homme du métier. Par exemple, une méthode de purification d'une protéine d'intérêt à partir de lait, telle que décrite dans le brevet US 6,268,487, peut comprendre les étapes suivantes consistant à : a) soumettre le lait à une filtration tangentielle sur une membrane de porosité suffisante pour former un rétentat et un perméat, le perméat contenant la protéine exogène, b) soumettre le perméat à un appareil de capture par chromatographie de manière à déplacer la protéine exogène et obtenir un effluent, c) combiner l'effluent et le rétentat, d) répéter les étapes a) à c) jusqu'à ce que le FVII soit séparé des lipides, des micelles de caséines, et que le FVII soit récupéré à au moins 75%. Avantageusement, le FVII de l'invention est activé. Le FVIIa résulte, in vivo, du clivage du zymogène par différentes protéases (FIXa, FXa, FVIIa) en deux chaînes réunies par un pont disulfure. Le FVIIa seul a très peu d'activité enzymatique, mais complexé avec son cofacteur, le facteur tissulaire (FT), il déclenche le processus de la coagulation en activant le FX et le FIX. Le FVIIa de l'invention est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides aminés de poids moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés de poids moléculaire d'environ 30 kDa) liées entre elles par un seul pont disulfure (Cys135-Cys262) Ainsi, le FVII de l'invention est un FVII activé 5 possédant une activité et une structure proche du FVII plasmatique. Le FVIIa présente une activité coagulante 25 à 100 fois supérieure à celle du FVII lorsqu'ils 10 interagissent avec le facteur tissulaire (FT). Dans un mode de réalisation de l'invention, le FVII peut être activé in vitro par les facteurs Xa, VIIa, IIa, IXa et XIIa. Le FVII de l'invention peut également être activé 15 pendant son procédé de purification. La Demanderesse a constaté de manière surprenante que le FVII, même placé sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine naturellement produite dans 20 le lactosérum, comme le promoteur WAP par exemple, est néanmoins susceptible de se trouver associé aux ions calcium du lait, et donc aux micelles de caséines. Ainsi, il sera très avantageux de mettre au point 25 un procédé d'extraction et de purification du FVII, susceptible de capter cette protéine qu'elle soit associée dans des complexes du lactosérun ou engagée dans des micelles de caséines, le FVII présentant une affinité pour les ions calcium du lait. 30 Très avantageusement, un procédé d'extraction et de purification du FVII selon l'invention, contenu dans du lait d'un animal transgénique, comprend les étapes suivantes consistant à : 3.5 a) extraire le FVII à partir du lait, le facteur VII étant lié aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait, par la précipitation de composés de calcium obtenue par ajout dans le lait d'un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former lesdits composés de calcium insolubles pour ainsi libérer le facteur VII desdits sels et/ou complexes, le facteur VII étant présent dans une phase liquide, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, c) soumettre la phase aqueuse non lipidique à une étape de chromatographie d'affinité, en utilisant un tampon d'élution à base d'un sel de phosphate à une concentration prédéterminée, et d) soumettre l'éluat de facteur VII, obtenu selon l'étape c), à deux ou trois étapes de chromatographie sur descolonnes échangeuses d'anions de type base faible utilisant des tampons appropriés pour des élutions successives du facteur VII retenu sur lesdites colonnes. La Demanderesse a constaté de manière surprenante qu'un tel procédé faisait intervenir une étape d'extraction du FVII lié aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait par précipitation de composés insolubles de calcium obtenus par ajout d'un sel soluble dans le lait, dont l'anion est choisi pour sa capacité à former des précipités de composés de calcium, alors que le FVII est libéré de ces sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait et se retrouve en solution dans la phase liquide. Le FVII est lié aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait, ce qui signifie que le FVII présente une affinité pour ces sels et/ou complexes de calcium. Le FVII présente donc un nombre suffisant de sites de fixation à ces sels et/ou complexes pour y être lié, totalement ou partiellement. Les sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium du lait représentent les sels phosphocalciques en interaction avec les micelles colloïdales de caséines. Les différentes caséines forment un complexe micellaire colloïdal, pouvant atteindre des diamètres d'environ 0,5 m, avec des sels phosphocalciques, se présentant par exemple sous la forme d'agrégats ( clusters ) de phosphate tricalcique, soit Ca9(PO4)6. De telles micelles sont formées de sous-unités de caséines constituées d'une couche hydrophile riche en caséine-K entourant un noyau hydrophobe, les sels phosphocalciques étant liés par interaction électrostatique sur la couche hydrophile. Ces sels phosphocalciques peuvent également être présents dans le volume interne de la micelle sans être liés à la caséine. Ces sels et/ou complexes sont également présents dans le lait sous forme de phosphate monocalcique et/ou de phosphate dicalcique, qui sont en équilibre avec les autres formes ioniques de calcium en fonction des réactions chimiques et biochimiques mises en œuvre. Ces sels et/ou complexes de calcium peuvent être présents dans le volume interne de la micelle de caséine. Une telle affinité du FVII pour les sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium peut résulter des interactions de la protéine non modifiée ou modifiée in vivo ou in vitro par exemple par des modifications post-traductionnelles. On entend par composés de calcium insolubles, des sels ou complexes de calcium dont la solubilité dans 5 le lait est inférieure à 0,5%. Le FVII est majoritairement associé aux sels phosphocalciques des micelles de caséines. Le FVII présente une forte affinité pour le calcium, dont la constante d'affinité est élevée, c'est-à-dire qu'au 10 moins 70% jusqu'à 90% du FVII étant piégés dans les micelles de caséine. Le reste du FVII présente une affinité pour les autres formes les sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium mentionnés plus haut. 15 Sans être liée par une quelconque interprétation des mécanismes observés, la Demanderesse suppose que l'ajout du sel soluble déplace l'équilibre des sels phosphocalciques des micelles, provoquant ainsi leur 20 déstructuration et la précipitation d'agrégats de sous-unités de caséines. Le FVII associé aux sels phosphocalciques piégé dans et/ou sur les micelles est libéré dans le milieu lors de cette déstructuration. De plus, le FVII est alors également libéré ou 25 dissocié des sels phosphocalciques, car ceux-ci précipitent sous la forme de composés de calcium insolubles sous l'effet du sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention. De même, le FVII associé aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de 30 calcium solubles en serait également dissocié, par le même type de réaction (voir figure 9). Dans le cadre de l'invention, le sel soluble représente tout sel permettant d'obtenir l'effet 35 voulu. Le sel soluble utilisé dans le procédé de l'invention peut être présent dans le lait à une concentration choisie par l'homme du métier pour parvenir à la séparation du FVII à partir des sels et/ou complexes de calcium. A ce titre, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la séparation d'au moins 20%, ou avantageusement d'au moins 30% jusqu'à 50% du FVII. De façon particulièrement avantageuse, il s'agit d'une concentration suffisante pour permettre la séparation d'au moins 60% jusqu'à 80%, ou d'au moins 90% du FVII. Le procédé de l'invention permet la précipitation notamment des agrégats de sous-unités de caséines. Cette précipitation est due à la déstructuration des micelles de caséines, comme indiqué plus haut. La mise en œuvre du procédé de l'invention déstabilise, par la précipitation, l'état colloïdal dans lequel se trouve le lait. Le procédé de l'invention est donc un procédé permettant le passage du lait d'un état colloïdal à un état liquide, ce qui correspond à une extraction directe colloïdes/liquides. Le procédé de l'invention permet également d'obtenir le lactosérum dont la coloration est plus claire que celle du lait de départ. En effet, ce sont les caséines qui donnent leur couleur blanche au lait. Une fois précipitées, elles ne peuvent plus conférer cette couleur au lait. Par sel soluble selon l'invention on entent' d'un 30 sel dont la solubilité dans le lait est d'au moins 0,5 partie de sel par partie de lait (p/p). Avantageusement, le sel soluble, utilisé dans le procédé, est un sel de phosphate. Le sel peut être dans une solution aqueuse qui est ensuite ajoutée au 35 lait, ou il peut être ajouté directement au lait sous forme de poudre. De préférence, le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le phosphate de sodium. En variante, le sel utilisé pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention peut être un oxalate d'un métal alcalin, en particulier l'oxalate de sodium ou de potassium, ou un carbonate d'un métal alcalin, en particulier, le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange. Avantageusement, la concentration du sel en solution aqueuse, qui est ainsi préparée pour la mise en oeuvre du procédé, est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM. Le lait dans lequel se trouve le FVII à extraire peut être du lait brut non écrémé ou du lait écrémé. L'avantage d'appliquer le procédé de l'invention à du lait écrémé réside dans le fait qu'il contient une quantité plus faible de lipides. Le procédé peut aussi être appliqué à du lait frais ou congelé. Le procédé comprend une étape b) de séparation de la phase liquide en une phase lipidique et une phase 2.5 aqueuse non lipidique comprenant la protéine qui est de préférence effectuée par centrifugation. La phase aqueuse non lipidique est en fait le lactosérum. Cette étape de séparation permet également d'isoler les agrégats de sous-unités micellaires de caséines et le 30 précipité de composés de calcium. Le procédé peut en outre comprendre, après l'étape de séparation, une étape de filtration de la phase aqueuse non lipidique effectuée successivement sur des filtres de porosité décroissante, de 35 préférence, de 1 m puis de 0,45 m. L'utilisation de ces filtres, tels qu'à base de fibres de verre, permet de réduire la teneur en lipides, globules gras et de phospholipides naturellement présents dans le lait. Une porosité inférieure à 0,5 m des filtres permet de maintenir la qualité bactériologique de la phase aqueuse non lipidique, ainsi que des supports de purification mis en oeuvre postérieurement (ultrafiltres, colonne de chromatographie etc.) (voir plus loin). La phase lipidique est, de préférence, filtrée à travers ces filtres qui retiennent ainsi complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair. Elle peut être suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration. La concentration permet de réduire le volume de la phase aqueuse non lipidique en vue de sa conservation. La membrane d'ultrafiltration est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques de la protéine d'intérêt. De façon générale, un seuil de coupure dont la taille des pores est inférieure ou égale au poids moléculaire du FVII permet de concentrer le produit sans perte notable. Par exemple, une membrane de taille de pores à 50 kDa permet de concentrer sans perte du FVII dont le poids moléculaire est de 50 kDa. La dialyse est destinée à conditionner la phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII pour des étapes ultérieures de purification, notamment par chromatographie. Elle permet également d'éliminer les composants de faible taille moléculaire, comme les lactoses, les sels, les peptides, les protéoses peptones et tout agent pouvant nuire à la conservation du produit. A cet effet, on utilise préférentiellement une membrane ayant un seuil de rétention de 50 kDa, de sorte que le FVII n'est pas filtré à travers la membrane. De préférence, le tampon de dialyse est une solution de phosphate de sodium 0,025 M-0,050 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse non lipidique obtenue après l'étape b) ou, le cas échéant, telle qu'obtenue après les étapes de filtration et/ou de concentration/dialyse, peut être congelée et stockée à une température de -30 C dans l'attente de la mise en oeuvre d'étapes ultérieures de leur purification. La phase aqueuse non lipidique obtenue selon l'étape b) est ensuite soumise à une étape c) de chromatographie d'affinité avantageusement mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d' hydroxyapatite (Calo(PO4)6(OH)2) ou un gel de fluoroapatite (Calo(PO4)6F2). Ainsi, le FVII de la phase aqueuse est retenu par le support, la majeure partie des protéines lactiques non retenue étant éliminée. On utilise de préférence une colonne chromatographique qui est équilibrée en tampon A à base de phosphate de sodium 0,025 M-0,035 M, pH 7,5-8,5. La phase aqueuse enrichie en FVII est injectée sur la colonne, ce qui permet la rétention du FVII. La fraction non retenue est éliminée par percolation du tampon A jusqu'au retour à la ligne de base (RLB), ce qui assure une bonne élimination des composés indésirables, telles que les protéines lactiques. L'élutlon du FVII selon l'étape c) est effectuée par un tampon à base d'un sel de phosphate, tel que le phosphate de sodium ou de potassium ou leur mélange, à une concentration prédéterminée, de préférence représentant un tampon B à base de phosphate de sodium 0,25 M-0,35 M, pH 7,5-8,5. La fraction éluée est collectée jusqu'au RLB. Grâce à cette étape, plus de 90% du total des protéines lactiques sont éliminés et plus de 90% des du FVII sont récupérées. La pureté de cette fraction éluée de FVII est d'environ 5% à cette étape. La pureté est définie comme étant le rapport massique entre le FVII et les protéines totales 5 présentes dans l'échantillon, la fraction ou l'éluat considéré. Avantageusement, l'activité spécifique du FVII est accrû d'un facteur 10 à 25 du fait de l'affinité 10 du FVII au support chromatographique. L'éluat de FVII obtenu à l'issue de l'étape c) est ensuite avantageusement soumis à une filtration tangentielle. 15 La membrane de filtration tangentielle est choisie par l'homme du métier en fonction des caractéristiques du FVII. De façon générale, un seuil de coupure dont la taille des pores est deux fois supérieure au poids moléculaire du FVII permet de le 20 filtrer. Par conséquent, une membrane de tailles de pores de 100 kDa permet de filtrer le FVII avec un bon rendement. Le but de cette étape de filtration est de réduire la charge notamment en protéines de poids 25 moléculaire supérieur à celui du FVII et, en particulier, d'éliminer les formes atypiques du FVII (par exemple du FVII sous forme polymérisée), ainsi que des protéases susceptibles, à terme, de le dégrader. A cette fin, on utilise très avantageusement 30 une membrane de seuil de rétention de composés de 100 kDa. Avantageusement, l'éluat de FVII filtré obtenu est ensuite concentré et dialysé par ultrafitration sur des membranes de seuil de rétention de 50 kDa. Le 35 tampon de dialyse est de préférence une solution de chlorure de sodium 0,15 M-0,20 M. L'éluat de FVII obtenu à l'issue de l'étape c), éventuellement filtré, concentré et dialysé, est ensuite soumis à deux ou trois étapes de chromatographie (étape d)) sur des colonnes échangeuses d'anions de type base faible utilisant des tampons appropriés pour des élutions successives du facteur VII retenu sur lesdites colonnes. Ces étapes permettent une purification supplémentaire du FVII. La première étape chromatographique d'échange d'anions est avantageusement mise en oeuvre grâce à un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel le facteur VII est retenu, selon les conditions opératoires préférentielles qui suivent. Ce support est lavé par un tampon Tris 0,05 M, pH 7,0- 7,5. La fraction non retenue est éliminée par le tampon de lavage. L'élution du FVII est effectuée par un tampon à base de Tris 0,05 M et de chlorure de calcium 0,025 M-0,05 M, de préférence 0,05 M, pH 7,0-8,0, afin d'obtenir un premier éluat de facteur VII. Par cette étape, il est récupéré au moins 70% du FVII et celle-ci permet une élimination d'environ 80% de protéines accompagnantes. L'éluat de FVII peut ensuite être soumis à une étape de dialyse, comme décrit précédemment, dont le tampon est une solution de chlorure de sodium 0,15-0,20 M. La deuxième étape chromatographique est avantageusement mise en oeuvre grâce un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel est injecté le premier éluat de FVII, obtenu par la première étape chromatographique sur échangeur d'anions, selon les conditions opératoires préférentielles qui suivent. Le support est lavé par un tampon Tris 0,05 M, pH 7,0-7,5. La fraction non retenue est éliminée par le tampon de lavage. L'élution du FVII, retenu sur le support, est effectuée par un tampon à base de Tris 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,0-8,0, pour l'obtention d'un deuxième éluat de facteur VII de haute pureté, soit d'une purété supérieure à 90%. La deuxième étape chromatographique est destinée à limiter une éventuelle dégradation protéolytique de la protéine. A ce stade, la pureté de l'éluat est d'environ 90%, et plus de 95% de protéines accompagnantes sont éliminées. Il peut ensuite être soumis à une étape de dialyse, comme décrit précédemment, dont le tampon est une solution de chlorure de sodium 0,15-0,20 M. Selon une mise en oeuvre très préférée de l'invention, le procédé comprend trois étapes de chromatographie sur des colonnes échangeuses d'anions de type base faible utilisant des tampons appropriés pour des élutions successives du facteur VII à partir desdites colonnes. Il est ainsi mis en œuvre, après les deux étapes chromatographiques d'échange d'anions, une troisième étape chromatographique d'échange d'anions. Cette étape permet la formulation de la composition enrichie en la protéine, de manière à la rendre adaptée à une utilisation médicale. La troisième étape chromatographique est avantageusement mise en oeuvre grâce à un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel est injecté le deuxième éluat de FVII, obtenu par la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions, selon les conditions opératoires préférentielles qui suivent. Le deuxième éluat obtenu par la deuxième étape chromatographique d'échange d'anions est injecté, de préférence après dilution par 1 à 5 volumes d'eau purifiée pour injection (PPI), sur une colonne remplie de support de type gel Q-Sepharose FF sur lequel le facteur VII est retenu. Ce support est lavé par un tampon Tris 0,05 M, pH 7,0-7,5. La fraction non retenue est éliminée par le tampon de lavage. L'élution du FVII, retenu sur le support, est effectuée par un tampon à base de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,20-0,30 M, de préférence 0,28 M, pH 6,5-7,5. La composition de FVII trangénique ainsi obtenue a une pureté supérieure à 95%. Très avantageusement, la composition se présente sous la forme d'un concentré de FVII. La mise en oeuvre du procédé conduit à un rendement cumulé de 20 à 25%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII/litre de lait traité. Par conséquent, les trois étapes de chromatographies sur gel échangeur d'anions permettent de purifier encore davantage le FVII. De plus, elles permettent la concentration et la formulation de la composition de FVII. L'activation du FVII intervient au cours du 20 procédé, selon toute vraisemblance au cours de la première étape de chromatographie d'échange d'anions. Le procédé de l'invention peut comprendre également au moins l'une des étapes suivantes de 25 formulation, inactivation virale et stérilisation De façon générale, le procédé peut comprendre, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est avantageusement effectuée par solvant/détergent, en particulier en 30 présence d'un mélange de Tween 80 (1% p/v) et de TnBP (tri-n-butylphosphate)(0,3% v/v,), ce qui permet d'inactiver les virus enveloppés. En outre, l'éluat de FVII issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est de préférence soumis à une 35 étape de nanofiltration pour une élimination efficace des virus, en particulier des virus non enveloppés, tels que le parvovirus B19. Il est possible d'utiliser des filtres ASAHI PLANOVATMI5 permettant la rétention des virus ayant une taille supérieure à 15 nm. Un autre objet de l'invention est la composition 5 de FVII de l'invention pour une utilisation comme médicament. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de la composition de FVII selon l'invention pour la 10 préparation d'un médicament destiné au traitement des patients atteints d'hémophilie. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de la composition de FVII selon l'invention pour la 15 préparation d'un médicament destiné au traitement des traumatismes hémorragiques multiples. Un autre objet de l'invention est l'utilisation de la composition de FVII selon l'invention pour la 20 préparation d'un médicament destiné au traitement des saignements massifs non contrôlables par une hémostase chirurgicale. Un autre objet de l'invention est l'utilisation 2.5 de la composition de FVII pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hémorragies dues à un surdosage en anticoagulants. Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant le facteur VII selon 30 l'invention et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables. L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique ou tamponnée, ainsi que toute suspension, gel ou poudre, 3.5 compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants et conservateurs. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs. Par ailleurs, les compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être réalisée par toute voie classique pour ce type d'approche thérapeutique, comme notamment par voie systémique, en particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire ou intraartérielle. On peut citer par exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur. Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade d'évolution de la pathologie, etc. D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention. Abbréviations FVII-tg : FVII transgénique selon l'invention FVII-rec : FVII recombinant disponible dans le commerce MALDI-TOF : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight HPCE-LIF : High Performance Capillary Electrophoresis-Laser Induced Fluorescence (Electrophorèse capillaire haute performance-fluorescence induite par laser) ESI-MS : Spectrométrie de masse-Ionisation Electrospray . LC-ESIMS : Chromatographie liquide- Spectrométrie de masse-Ionisation Electrospray NP-HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance de Partage Classique PNGase F : Peptide : N-glycosidase F Description des figures Figure 1 : schéma d'un exemple du procédé d'extraction 10 et de purification/activation du FVII transgénique selon l'invention produit dans le lait de lapine. Figure 2 : Spectres de masse ESI déconvolués des peptides porteurs des sites de N-glycosylation. 15 Figure 3 : Electrophérogrammes HPCE-LIF après déglycosylation du FVII par la PNGase F ; Légende les deux électrophérogrammes du milieu : FVII-tg ; (4) fucose, (1) GlcNAc, (1') mannose, (•) 20 galactose, (A) acide sialique. Figure 4 : Caractérisation du FVII-tg (chromatogramme du milieu) par NP-HPLC et du FVII-rec (chromatogramme du bas). Légende : idem figure 3. Figure 5 : Identification des formes glycanniques majoritaires du FVII-tg par MALDI-TOFMS. Légende : idem figure 3 30 Figure 6 : Analyse en HPCE-LIF des oligosaccharides de la Thyroglobuline. Légende : idem figure 3 Figure 7 : Analyse en HPCE-LIF des oligosaccharides du FVII transgénique. Légende : idem figure 3 25 35 Figure 8 : Quantification des structures Galal,3Gal. Figure 9 : Exemple d'un mécanisme d'extraction du FVII Exemple 1 : Production de lapines transgéniques produisant une protéine de FVII humain dans leur lait 5 On prépare tout d'abord un plasmide pl en introduisant la séquence Bam Hl-Hind III (fragment 6,3 Kb) du gène WAP (décrite dans le document Devinoy et al., Nucleic Acids Research, vol. 16, no. 16, 25 août 10 1988, p. 8180) dans le polylinker du vecteur p-poly III-I (décrit dans le document Lathe et al., Gene (1987) 57, 193-201), entre les séquences Bam Hl et Hind III. Au cours de ce clonage, le site Bam Hl a été 15 supprimé et remplacé par le site Cla I qui figure dans le vecteur pl. Le vecteur pl est donc un plasmide capable de recevoir un gène étranger placé sous la dépendance du promoteur WAP 6, 3 Kb. L'introduction du gène étranger peut se faire par exemple dans le site 20 Sal I du poly linker. Les inserts contenant la totalité du promoteur et des gènes étrangers peuvent être isolés du plasmide après une coupure aux deux sites Not 1 qui sont aux extrémités du poly linker du plasmide p- poly III-I. 25 Le plasmide p2, obtenu à partir du plasmide pl, contient le promoteur du gène de la WAP de lapin (6,3 Kb) et le gène du FVII humain. Le fragment utilisé pour obtenir les lapines transgéniques est compris entre les deux sites Notl. 30 Un site Hind III a été introduit dans la séquence de tête du gène (leader) par mutagénèse dirigée pour servir de site de clonage. Les lapines transgéniques ont été obtenues par la 35 technique classique de microinjection (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 4438-4442). 1-2 pl contenant 500 copies du gène ont été injectés dans le pronucleus mâle d'embryons de souris. Les constructions ont été réalisées dans le vecteur p-poly III-I (Lathe et al., Gene (1987) 57, 193-201). Les fragments Not 1 - Not 1 de ce vecteur contenant les gènes recombinés ont été microinjectés. Les embryons ont ensuite été transférés dans l'oviducte de femelles adoptives hormonalement préparées. Environ 10% des embryons manipulés ont donné naissance à des lapereaux et 2-5 % des embryons manipulés à des lapereaux transgéniques. La présence des transgènes a été révélée par la technique de transfert de Southern à partir de l'ADN extrait des queues des lapins. Les concentrations de FVII dans le sang et dans le lait des animaux ont été évaluées à l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques. L'activité biologique du FVII a été évaluée en ajoutant du lait au milieu de culture de cellules ou d'expiants mammaires de lapin. La technique utilisée pour l'obtention de lapines transgéniques produisant dans leur lait le FVII de l'invention est décrite plus en détails dans le document EP 0 527 063. Exemple 2 : Extraction et purification du FVII obtenu a) Extraction du FVII On considère 500 ml de lait brut non écrémé qui sont dilués par 9 volumes de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à température ambiante, la phase aqueuse enrichie en FVII est centrifugée à 10 000g durant 1 heure à 15 C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min - rotor SLC-6000). 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires. Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII (phase majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non solubles et de composés de calcium). La phase aqueuse non lipidique FVII est 5 collectée à la pompe péristaltique jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse est collectée à part. La phase solide (précipité) est éliminée. La phase aqueuse non lipidique, comprenant 10 toutefois encore de très faibles quantités de lipides, est filtrée sur une séquence de filtres (Pall SLK7002UO10ZP - préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 m - puis Pall SLK7002NXP - Nylon 66 de taille de pores de 0,45 m). En fin de 15 filtration, la phase lipidique est passée sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules lipidiques du lait, et le filtrat est clair. La phase aqueuse non lipidique filtrée est 20 ensuite dialysée sur membrane d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible avec la phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne filtre pas à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres 25 et peptides du lait. Dans un premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis une dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer les électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de 30 chromatographie. Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2. On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du lactosérum enrichi 35 en FVII-tg. Cette préparation est stockée à -30 C avant la poursuite du procédé. Le rendement global de récupération du FVII par cette étape est très satisfaisant : 90% (91% extraction au phosphate + 99% Dialyse/concentration). La phase aqueuse non lipidique comprenant le 5 FVII à l'issue de cette étape est parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques qui font suite. Environ 93 000 UI de FVII-tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de cette préparation est de 10 l'ordre de 0,2%. b) Purification du FVII 1. Chromatographie sur gel d'hydroxyapatite 15 Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) est remplie avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I (CHT-I). Le gel est équilibré en tampon A constitué d'un 20 mélange de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la préparation conservée à -30 C est décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'àdissolution complète du glaçon puis est injectée sur le gel (débit linéaire 100 25 cm/h, soit 105 ml/min). La fraction non-retenue est éliminée par passage d'un tampon constitué de phosphate de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à la ligne de base (RLB). 30 L'élution de la fraction contenant le FVII-tg se fait par le tampon B constitué de phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction éluée est collectée jusqu'au retour à la 3.5 ligne de base. Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII-tg, tout en éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A.S.) est multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII-tg de pureté de 4% sont disponibles à ce stade. 2. Filtration tangentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa La totalité de l'éluat de l'étape précédente est filtrée en mode tangentiel sur une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (Pall OMEGA SC 100K - 0,1 m2). Le FVII est filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa ne sont pas filtrables. La fraction filtrée est ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. A ce stade du procédé, le produit est stocké à - 30 C avant passage en chromatographie d'échange d'ions. Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes. Le traitement membranaire 100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut poids moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII-tg, soit 82 000 UI de FVII-tg. Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des étapes avales. 3. Chromatographies sur gel Q-Sepharose FF Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-Sepharose Fast Flow (QSFF) sont réalisées pour purifier le principe actif, permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer et formuler la composition en FVII. 3.1 Etape Q-Sepharose FF 1 - élution High Calcium Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de 10 section) est remplie de 100 ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. 15 La totalité de fraction conservée à -30 C est décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction est diluée au [v/v] avec le tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit linéaire de 150 20 cm/h), puis la fraction non retenue est éliminée par passage du tampon jusqu'au RLB. Une première fraction protéique à faible teneur en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un 25 tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M, pH 7,5, et est ensuite éliminée. Une deuxième fraction protéique riche en FVII est éluée à 9 ml/min (soit 100 cm/h) par un tampon de 30 Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,05 M, pH 7,5. Cette deuxième fraction est dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. 35 Cette fraction est conservée à +4 C durant une nuit avant le 2ème passage en chromatographie d'échange d'anions. Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI de FVII-tg), tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes. Elle permet également 5 l'activation du FVII en FVIIa. 3.2 Etape Q-Sepharose FF 2 - élution Low Calcium Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 30 ml de gel Q-Sepharose FF 10 (GE Healthcare). Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée précédente (deuxième fraction), conservée à +4 C, est diluée avant 15 injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100 cm/h). Une fraction contenant du FVII de très haute pureté est éluée à 4,5 ml/min (soit 50 cm/h) en 20 tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,5. Environ 23 000 UI de FVII-tg ont été purifiées, soit 12 mg de FVII-tg. Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des 25 protéines accompagnantes (protéines du lait de lapine). Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques structurales et fonctionnelles proches des molécules naturelles du FVII humain. Il 30 est concentré et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions. 3.3 Etape Q-Sepharose FF 3 - élution Sodium Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) est remplie de 10 ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare). Le gel est équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5. La fraction éluée purifiée de l'étape précédente est diluée cinq fois avec de l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5 ml/min, soit débit linéaire de 50 cm/h). Le FVII-tg est ensuite élué à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0. Une composition de FVII-tg sous forme de concentré a été préparée dont la pureté est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie intraveineuse. Le procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de purifier au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en oeuvre. Le FVII-tg de la composition est ensuite soumis à différentes analyses structurales, telles que développées dans les exemples qui suivent. Exemple 3 : Caractérisation des sites de glycosylation 25 et des glycopeptides par ESI-MS Les sites de N-glycosylation du FVII-tg ont été identifiés par LC-ESIMS(/MS), confirmés par MALDITOFMS, et la microhétérogénéité a été déterminée par 30 LC-ESIMS. La figure 2 représente les spectres ESI déconvolués des glycopeptides contenant les deux résidus Asn glycosylés. La localisation des sites de glycosylation a été confirmée par MALDI-TOF(/TOF) 35 ainsi que par séquençage d'Edman. L'analyse des spectres de masse des glycopeptides [D123-R152] et [K31.6-R353] du FVII-tg, possédant respectivement les sites de N-glycosylation Asn145 et Asn322, révèle la présence de structures biantennées, bisialylées non fucosylés (A2) (masse observée du glycopeptide : 5563,8 Da) et fucosylées (A2F) (masse observée : 5709,7 Da). On note également la présence majoritaire d'oligosaccharides, situés sur l'Asn14s, monosialylés non fucosylés (Al) (masse observée : 5272,3 Da) et fucosylés (A1F) (masse observée : 5418,7 Da). Les formes triantennées sont peu représentées. Pour ce qui concerne les glycoformes majoritaires de l'Asn322, on observe les mêmes structures glycanniques dans des proportions différentes. La figure 2 révèle la présence de formes moins matures (moins antennées et sialylées) que sur l'Asn145. Par exemple, les structures triantennées sont absentes sur le FVII-tg. Il faut noter également que les Asn 145 et 322 sont glycosylées à 100%. Bien que semiquantitatifs, ces résultats sont en accord avec les données quantitatives obtenues par HPCE-LIF et NPHPLC. Exemple 4 : Quantification des N-glycannes par HPCELIF Les profils glycaniques de deux lots (A et B) de FVII-tg (cf figure 3-les deux électrophérogrammes du milieu) révèlent la présence de structures de type biantennés, monosialylés, fucosylés ou- non (A1F, Al), et biantennés, bisialylés, fucosylés ou non (A2, A2F). 3`5 Tableau 1. Récapitulatif du pourcentage des structures sialylées issues des échantillons natifs et celles issues des échantillons désialylés des différents lots de FVII Pourcentages FVII-tg FVII-tg Lot A Lot B Natif 19.3 13.9 A2 A2F 14.8 21.5 Al 38.4 25.2 A1F 11.7 22.2 Total A2+A2F 34.1 35.4 Total Al+AlF 50.1 47.4 Désialylé 57.5 37.2 G2 G2F 18 38.1 G3 4.6 3.0 G3F 1.3 3.0 Autres espèces 2.9 3.0 non fucosylées Autres espèces 3.6 7.5 * fucosylées G2FB - *espèce bifucosylée L'analyse quantitative des différentes structures 10 glycanniques (Tableau 1) montre que le FVII-tg (lots A et B) a 35% de formes biantennées bisialylées et seulement 6% de formes triantennés sialylées. Les formes majoritaires sont monosialylées avec 50% de structures Al et A1F. 15 On note pour le FVII-rec le faible taux de structures non fucosylées.5 Tableau 2. Taux de fucosylation des différents FVII FVII-tg FVII-tg FVII-rec Lot A Lot B Taux de 23.6 41.8 100 fucosylation (%) Les résultats montrent un taux de fucosylation de 5 24 à 42% pour le FVII-tg et une fucosylation de 100% pour le FVII-rec. Exemple 5 : Quantification des N-glycannes par NP-HPLC 10 L'analyse qualitative et quantitative de la N-glycosylation du FVII-tg a été étudiée par NP-HPLC. Le profil chromatographique du FVII-tg (figure 4- chromatogramme du milieu) confirme la présence d'oligosaccharides majoritairement de type Al, à un 15 taux de 27%. Les structures A1F, A2 et A2F sont moins représentées et les formes triantennées sont présentes à l'état de traces. Le profil du FVII-rec (figure 4-chromatogramme du bas) révèle des temps de migration atypiques pour les différentes structures (A1F,A2F) 20 observées. Exemple 6 : Identification par MALDI-TOFMS 25 Afin d'identifier les structures glycanniques présentes dans le FVII-tg, des analyses MALDI-TOF MS ont été réalisées à partir de fractions d'élutions issus de NP-HPLC préparative (figure 5). L'analyse MALDI-TOF du FVII-tg a permis de 30 confirmer l'identification des glycannes séparés par NP-HPLC, à savoir des structures majoritairement monosialylées Al et des formes minoritaires de type A1F, A2F et A2. Cette étude a permis également d'identifier les formes minoritaires de type triantennées bisialylées 5 et trisialylées, des formes hybrides et oligomannoses de type Mans et Man6-P-HexNAc. Afin d'identifier d'autres structures glycanniques, une analyse par MALDI-TOF MS du facteur 10 FVII-tg après désialylation a été faite. On observe après désialylation deux formes majoritaires G2 et G2F présentes respectivement à des taux de 35% et de 28% (quantification NP-HPLC). Ces 15 résultats sont en accord avec l'identification des structures du produit natif . Les autres formes identifiées sont quantitativement minoritaires et essentiellement de type oligomannose, Man6-P-HexNAc et Man7-P-HexNAc, et 20 de type hydride. On note la présence de formes bifucosylées. Exemple 7 : Analyse HPCE-LIF de la liaison des acides sialiques - galactose 25 Des analyses ont montré que le FVII-rec possède des structures glycaniques biantennées sialylées fucosylées avec des formes A2F majoritaires, et biantennées monosialylées fucosylées (A1F). On note 30 des temps de migration atypiques pour ces structures A2F et A1F par rapport aux temps de migration habituellement rencontrés pour ces structures. Notamment, ces structures oligosaccharidiques sialylées présentent des temps de migration atypiques 35 en HPCE-LIF et NP-HPLC par rapport à ceux du FVII-tg. D'autre part, l'analyse de la composition en monosaccharides n'a -pas révélé d'acide sialique particulier autre que NeuSAc et les outils de spectrométrie de masse révèlent des glycannes de masse conforme à des types bisialylés. Enfin, la desialylation des glycannes du FVII-rec permet de retrouver des comportements chromatographique et electrophorétique équivalents à ceux des oligosaccharides du FVII-tg. Ces différences de comportements électrophorétique et chromatographique peuvent donc s'expliquer par un branchement différent des acides sialiques. Cette hypothèse a été évaluée par les différentes approches d'HPCE-LIF et de MS. Les résultats sont résumés dans le Tableau 3 ci-15 dessous. Tableau 3 : branchements des acides sialiques sur les différents lots de FVII. Sialylation (%) a2-3 (%) a2-6 (%) a2-8 (%) FVII-rec 91 100 0 0 FVII-tg Lot C~ 96 0 100 0 20 Les résultats montrent des isoméries distinctes au niveau des acides sialiques entre les deux FVII. En effet, les acides sialiques du FVII-rec impliquent des liaisons a2-3 alors que le FVII-tg présente des branchements a2-6. 25 Les différences de comportements en HPCE-LIF et en NP-HPLC observés pour les glycannes du FVII-rec par rapport au FVII-tg sont liées à ces différences d'isomérie au niveau des acides sialiques. 30 Exemple 8 : Etude de la présence des structures Galal,3Gal Afin d'étudier la présence éventuelle des structures Galal,3Gal dans les FVII-tg, on utilise comme témoin positif la thyroglobuline bovine contenant des structures Galal,3Gal. Les produits sont, après déglycosylation par la PNGase F, traités par des sialidase, fucosidase et agalactosidase spécifique des branchements Galal,3Gal. La figure 6 présente l'étude réalisée sur la thyroglobuline bovine avec la superposition du profil natif et du profil désialylé, défucosylé et adégalactosylé. Le profil glycanique obtenu après adégalactosylation montre que cette structure disparaît totalement après traitement par l'enzyme prouvant ainsi que a-galactosidase utilisée est parfaitement active. Le taux de structure Galal,3Gal obtenu de 17.8 % est cohérent avec le taux attendu. La figure 7 présente la superposition des électrophorégrammes du produit désialylé et défucosylé du FVII-tg avec le produit désialylé, défucosylé et adégalactosylé. On observe que les deux profils sont parfaitement superposables. Ces résultats suggèrent 25 l'absence de structures Galal,3Gal dans le FVII-tg. Exemple 9 : Quantification des motifs saccharidiques Galal,3Gal 30 10 g des FVII humain, recombinant et transgénique ont été transférés sur une membrane de nitrocellulose après séparation en SDS-PAGE réduit. Un échantillon de thyroglobuline bovine (Sigma, T1001, 35 Thyroglobulin from bovin thyroid) est utilisé comme contrôle positif du fait de sa forte teneur en épitope alpha(1,3) galactosyl. La présence du motif a-Gal (Galactose-alphal-3Galactose-(3)4G1cNAc-R) est révélée par la lectine purifiée Marasmius oreades agglutinin (EY laboratoiries, H-9001, MOA-HRP) marquée à la peroxydase et spécifique de l'épitope a-Gal. L'activité peroxydasique est ensuite détectée par un substrat chromogénique (Fluka, 4-chloro-l-naphtol) et quantifiée par numérisation du signal (Bio-Rad, Quantity-one). Une membrane identique est traitée avec une alpha-galactosidase (Prozyme, Green coffee bean) de façon à confirmer la spécificité du signal. En parallèle, la quantité de protéine totale est également estimée par coloration d'un gel SDS-PAGE identique, coloré au bleu de Coomassie. Les résultats montrent la spécificité la lectine Marasmius oreades (MOA) du fait du fort signal observé pour la thyroglobuline bovine et de sa disparition suivant le traitement avec une alpha-galactosidase. Les résultats exprimés en rapport d'intensité de signal MOA divisée par l'intensité du signal correspondant à la quantité de protéine analysée démontrent un niveau de signal a-Gal résiduel (2,3 à 3,7) pour l'échantillon de FVII-tg alors que le FVII recombinant présente une valeur supérieure. Ces résultats (cf figure 8) démontrent l'absence ou la très faible prévalence de l'épitope a-Gal sur le FVII transgénique exprimé chez le lapin, comparativement à un FVII recombinant produit par des cellules de hamster par exemple. Le Tableau A résume les étapes du procédé selon une mise en œuvre préférée de l'invention pour fournir la composition de FVII de l'invention, et fournit les différents rendements, la pureté et les activités spécifiques obtenus à chaque étape. Tableau A lot t 4 Q3O Value (ni) Q Qe ité Rdt FVII/ RI FVlI/ AS R éFVII atitécle m- ( ( /) and M (UI ~ Ptntéir~es (n Rd delait hut 500 42750 1 450 1OY/o 1OY/o 2,4 q12% C7arific fia lite 4785 rD 93650 91% 91% Gnce tcati n/ Llaly ([F SOI j 661 2%10 93233 9~/0 93)/o 3,1 Q 2Y/0 Flint 1 Ijci Revendications 1. Composition de facteur VII recombinant ou transgénique, chaque molécule de facteur VII de la composition présentant deux sites de N-glycosylation, caractérisée en ce que parmi toutes les molécules de FVII de la composition, le taux de motifs glycanniques Galal,3Gal est compris entre 0 et 4%. 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle au moins certains des acides sialiques du facteur VII impliquent des liaisons a2-6. 3. Composition selon la revendication 2, dans 15 laquelle tous les acides sialiques du facteur VII impliquent des liaisons a2-6. 4. Composition selon la revendication 2, dans laquelle le facteur VII de ladite composition comprend 20 en outre des acides sialiques de liaisons a2-3. 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que, parmi tous les motifs glycanniques du facteur VII de la composition, au 25 moins 40% sont des formes glycanniques biantennées, monosialylées. 6. Composition selon la revendication 5, dans laquelle les formes glycanniques biantennées, 30 monosialylées du facteur VII sont majoritaires. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce que, parmi les formes glycanniques biantennées, monosialylées du facteur VII, les formes 35 glycanniques majoritaires sont non fucosylées. 8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle le taux de fucose du facteur VII est compris entre 20% et 50%. 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce le facteur VII de la composition est produit par des lapines transgéniques. 10. Composition selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le facteur VII est activé. 11. Composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour son utilisation comme 15 médicament. 12. Utilisation d'une composition facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des 20 patients atteints d'hémophilie. 13. Utilisation d'une composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement 25 des traumatismes hémorragiques multiples. 14. Utilisation d'une composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement 30 des saignements massifs non contrôlables par une hémostase chirurgicale. 15. Utilisation d'une composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour 35 la préparation d'un médicament destiné au traitement des hémorragies dues à un surdosage en anticoagulants. 16. Composition pharmaceutique comprenant un facteur VII tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables. 17. Procédé d'extraction et de purification du FVII tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, contenu dans du lait d'un animal trangénique, comprenant les étapes suivantes consistant à : a) extraire le FVII à partir du lait, le facteur VII étant lié aux sels et/ou complexes organiques et/ou inorganiques de calcium dudit lait, par la précipitation de composés de calcium obtenue par ajout dans le lait d'un sel soluble, dont l'anion est choisi pour son aptitude à former lesdits composés de calcium insolubles pour ainsi libérer le facteur VII desdits sels et/ou complexes, le facteur VII étant présent dans une phase liquide, b) séparer la phase liquide enrichie en la protéine du précipité de composés de calcium, ladite phase liquide étant en outre séparée en une phase lipidique et une phase aqueuse non lipidique comprenant la protéine, c) soumettre la phase aqueuse non lipidique à une étape de chromatographie d'affinité, en utilisant un tampon d'élution à base d'un sel de phosphate à une concentration prédéterminée, et d) soumettre l'éluat de facteur VII, obtenu selon l'étape c), à deux ou trois étapes de chromatographie sur des colonnes échangeuses d'anions de type base faible utilisant des tampons appropriés pour des élutions successives du facteur VII retenu sur lesdites colonnes. 18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel le sel soluble est un sel de phosphate. 19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, dans lequel le sel de phosphate est choisi dans le groupe constitué par le phosphate de sodium, le phosphate de lithium, le phosphate de potassium, le phosphate de rubidium et le phosphate de césium, et est, en particulier, le phosphate de sodium. 20. Procédé selon la revendication 17, dans lequel le sel soluble est un oxalate d'un métal alcalin, en particulier l'oxalate de sodium ou de potassium, ou un carbonate d'un métal alcalin, en particulier le carbonate de sodium ou de potassium, ou leur mélange. 21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, dans lequel la concentration du sel soluble en solution aqueuse est comprise entre 100 mM et 3 M, de façon plus préférée, entre 200 mM et 500 mM et, en particulier, entre 200 mM et 300 mM. 22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, dans lequel dans lequel l'étape b) est effectuée par centrifugation. 23. Procédé selon l'une des revendications 17 à 22, comprenant, après l'étape de séparation, une étape de filtration de la phase aqueuse non lipidique effectuée successivement sur des filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 gm puis de 0,45 m, suivie d'une étape de concentration/dialyse par ultrafiltration. 24. Procédé selon l'une des revendications 17 à 23, dans lequel la phase lipidique est filtrée à travers des filtres de porosité décroissante, de préférence de 1 m puis de 0,45 m. 25. Procédé selon l'une des revendications 17 à 24, dans lequel la chromatographie d'affinité est mise en oeuvre sur une colonne chromatographique dont le support est un gel d'hydroxyapatite (Calo(PO4)6(OH)2) ou un gel de fluoroapatite (Calo(PO4)6F2), et le tampon d'élution est un tampon à base de phosphate de sodium 0,25 M-0,35 M, pH 7,5-8,5. 26. Procédé selon l'une des revendications 17 à 25, dans lequel l'éluat de FVII obtenu à l'issue de l'étape c) est ensuite soumis à une filtration tangentielle. 27. Procédé selon l'une des revendications 17 à 26, dans lequel, la première étape chromatographique est mise en œuvre par un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF. 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel l'élution du FVII est effectuée par un tampon à base de Tris 0,05 M et de chlorure de calcium 0,02 M-0,05 M, pH 7,0-8,0. 29. Procédé selon l'une des revendications 17 à 28, dans lequel, la deuxième étape chromatographique est mise en œuvre par un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel est injecté le premier éluat de FVII, obtenu par la première étape chromatographique sur échangeur d'anions. 30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel l'élution du FVII est effectuée par un tampon à basede Tris 0,05 M et de chlorure de calcium 0,005 M, pH 7,0-8,0. 31. Procédé selon l'une des revendications 17 à 30, dans lequel la troisième étape chromatographique est mise en oeuvre par un support chromatographique de type gel Q-Sepharose FF sur lequel est injecté le deuxième éluat de FVIII, obtenu par la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions. 32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel l'élution du FVII est effectuée par un tampon à base de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,20-0,30 M, de préférence 0,28 M, pH 6,5-7,5. 33. Procédé selon l'une des revendications 17 à 32, comprenant au moins l'une des étapes suivantes de formulation, inactivation virale et stérilisation. 20 34. Procédé selon l'une des revendications 17 à 33, comprenant, avant l'étape de chromatographie d'affinité, une étape de traitement anti-viral qui est effectuée par solvant/détergent. 25 35. Procédé selon l'une des revendications 17 à 33, dans lequel l'éluat issu de la deuxième étape chromatographique sur échangeur d'anions est soumis à une étape de nanofiltration. 30 35