Brevet FR2900343A1 — publié le 20071102

La présente invention concerne une composition inhibitrice de protéases et un procédé d'extraction de molécules inhibitrices de protéases. ARRIERE PLAN DE L'INVENTION On. sait que les protéases peuvent avoir un effet négatif sur la santé des humains ou des animaux en provo-quant soit un développement anormal soit une dégradation des cellules humaines ou animales, notamment dans certaines pathologies telles que l'ostéoporose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde en dégradant la matrice osseuse et/ou cartilagineuse, ou encore dans le développement de maladies virales telle que la dengue ou parasitaires tel-les que le paludisme. Il existe donc un besoin constant de trouver de nouvelles molécules inhibitrices de protéases plus particulièrement adaptées à certaines protéases et pouvant être utilisées soit directement telles qu'obtenues par la mise en ouvre d'un procédé d'extraction soit synthétisées. Pour qu'une synthèse soit plus accessible, il est en outre préférable de rechercher des molécules de faible poids moléculaire. OBJET DE L'INVENTION Un but de l'invention est de proposer une composition inhibitrice de protéases, notamment des protéases à csytéine, telles que la papaïne, la cathépsine K ou la cathépsine B, sans que cette liste soit exhaustive. RESUME DE L'INVENTION A cet effet, on propose selon l'invention une composition inhibitrice de protéases comportant le prin- cipe actif comprenant des molécules extraites de nacre ou de coquille de mollusque et ayant une masse moléculaire comprise entre 100 Da et 400 Da. Il a été en effet constaté qu'une composition de ce type permet d'obtenir une inhibition pouvant aller jusqu'à 90% sur la papaïne et la cathépsine B. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci concerne un procédé d'extraction de molécules inhibitrices de protéases comportant les étapes d'extraire les molécules à partir de poudre de nacre ou de coquille de mollusque au moyen d'une solution aqueuse, de purifier l'extrait obtenu selon des fractions de différents poids moléculaires et de sélectionner des fractions ayant une activité inhibitrice de protéases. De préférence, la solution aqueuse initiale corn- prend 40 à 60 % de solvant organique, en particulier un solvant organique choisi dans le groupe comprenant l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone et le n-butanol. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION D'autres caractéristiques et avantages de l'in- vention apparaîtront à la lecture de la description qui suit d'un mode de mise en oeuvre particulier non limitatif du procédé d'extraction selon l'invention et de la composition obtenue. A titre d'exemple, le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre de la façon suivante . des coquilles d'huîtres Pinctada margaritifera débarrassées de leur calcite ont été réduites en poudre selon une granulométrie comprise entre 1 et 200 m. 500 grammes de cette poudre ont. été mélangés avec un litre de solution compor- tant 50 % d'eau et 50 % d'isopropanol. Le mélange obtenu a été agité pendant trente minutes à température ambiante puis la suspension a été centrifugée et le filtrat a été évaporé sous vide à 40 . Les inhibiteurs de protéases présents dans l'ex- trait sec ainsi obtenu ont été purifiés selon trois étapes de purification : Etape 1 L'extrait sec obtenu a été mélangé avec une solution comprenant un volume d'isopropanol pour neuf volumes d'eau, à raison de 10 mg d'extrait sec pour 1 ml de solu- tion. Un volume de ce mélange a été introduit dans une colonne chromatographique en phase inversée de type C8 qui a par ailleurs été alimentée avec un éluant A comprenant un mélange à 0,1% d'acide trifluoroacétique dans de l'eau pure, et un éluant B comprenant un mélange à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'acétonitrile. L'élution a été commencée avec un solvant contenant 5 % d'éluant B à un débit de 2 ml/mn et un gradient d'élution amenant le pourcentage d'éluant B à 40 % au bout de 60 mn. Des fractions ont été prélevées toutes les minutes. Les fractions obtenues ont été lyophilisées. Les résidus sont dissous dans l'eau puis un échantillon de chaque fraction est soumis au test d'inhibition de la papaïne, de la cathépsine B et de la cathépsine K. Les meilleurs résultats d'inhibition ont été obtenus avec les fractions correspondant à une élution comprise entre 5 % et 6 %. Ces fractions ont été lyophilisées. La. colonne chromatographique a ensuite été lavée de façon connue en soi en portant l'élution à 80 % d'éluant B puis en réduisant sa proportion à 5 % pour préparer la colonne à la deuxième étape. Etape 2 L'extrait sélectionné dans l'étape 1 a été redilué à raison de 20 mg/ml dans l'éluant A et un volume de ce mélange a été introduit dans la colonne chromatographique avec un éluant A comprenant une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'eau pure et un éluant B comprenant un mélange à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'acétonitrile. L'élution a été commencée à un taux de 5 % d'éluant B avec un débit de 0,7 ml/mn, c'est-à-dire environ un quart du débit de l'étape 1. L'élution a été maintenue à un taux de 5 % d'éluant B pendant 15 mn puis progressivement augmentée jusqu'à 20 % au bout de 45 mn. Des fractions ont été prélevées toutes les 30 se- condes, soit à une fréquence double de l'étape 1. Les 4 fractions obtenues ont été lyophilisées puis des échantillons ont été redilués et soumis au test d'inhibition des protéases. L'inhibition la plus forte a été obtenue avec la fraction correspondant à une élution comprise en- tre 5 % et 6 %. Les fractions retenues ont été lyophilisées. La colonne chromatographique a été lavée comme précédemment puis ramenée à un taux d'élution de 5 % et un débit de 0,7 ml/mn. Etape 3 La dernière étape de purification est réalisée à un pH de 7 sur une colonne chromatographique en phase in-versée de type Ça qui est alimentée avec un éluant A comprenant un mélange de 95 % d'acétate de triéthylamine 100 mM ajusté à un pH 7 par de l'acide acétique, et de 5 % d'acétonitrile, et un éluant B comprenant un mélange de 5 % d'acétate de triéthylamine 100 mM, pH 7 et de 95 % d'acétonitrile. Les fractions contenant les inhibiteurs de pro- téases recueillis à l'issue de l'étape 2 sont introduites dans la colonne chromatographique. L''éluti.on a été commencée à un taux de 5 % d'éluant B et maintenue pendant 15 mn à un débit de 0,7 ml/mn, le taux d'élution a ensuite été augmenté réguliè-rement pour atteindre 12 % d'éluant B au bout de 30 mn. Une fraction a été prélevée toutes les 30 secondes puis les tests d'inhibition des protéases ont été effectués de la même façon que précédemment avec les différentes fractions prélevées. Les tests les plus favora- bles ont été obtenus avec les fractions 44 et 45 correspondant à une élution comprise entre 7 % et 9 %. Les fractions finalement sélectionnées se sont révélées efficaces lors de tests d'inhibition effectués sur la cathépsine B bovine et la cathépsine K humaine re- combinante. Des mesures effectuées au spectromètre de masse ont révélé que ces fractions correspondaient à des molécules ayant un poids moléculaire compris entre 100 Da et 400 Da. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de mise en œuvre du procédé décrit et est susceptible de variantes de réalisation qui apparaîtront à l'homme de métier sans sortir du cadre de l'invention tel que défini par les revendications. En particulier, bien que l'invention ait été décrite en relation avec un extrait de nacre d'huître Pinctada marga:ritifera, on peut également utiliser de la poudre de coquille entière de mollusques nacriers ou non nacriers tels que des gastéropodes. Le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre en utilisant un solvant organique compris dans le groupe comprenant l'éthanol, l'acétone ou ne nbutanol. Bien que des meilleurs résultats d'inhibition aient été obtenus avec une solution aqueuse d'extraction comprenant 40 % à 60 % de solvant organique dans l'eau, une activité inhibitrice a également été révélée après extraction avec de l'eau pure ou une solution comportant un mélange d'eau et de solvant organique selon un taux compris entre 0 et 80 %. Au-delà de 80 %, le rendement d'extraction devient très faible voire nul. Bien que l'invention ait été décrite en relation avec des étapes de purification réalisées immédiatement après l'extraction, on peut prévoir une étape de dialyse entre l'extraction et la purification afin de sélection- ner une gamme de poids moléculaire déterminée préalable- ment à la purification. Une étape de purification sur une résine échangeuse d'ions (anions ou cations) peut être introduite dans le procédé entre l'étape d'extraction et les étapes de purification ou entre deux étapes de purification afin d'éliminer des contaminants et enrichir les extraits en inhibiteurs. Bien que le procédé selon l'invention ait été décrit selon une mise en oeuvre permettant d'isoler des mo- lécules actives ayant un poids moléculaire compris entre 100 Da et 400 Da, le même procédé peut être mis en oeuvre selon des conditions adaptées pour isoler des molécules actives de poids moléculaire plus élevé pouvant aller jusqu'à 100.000 Da voire même 200.000 Da. REVENDICATIONS 1. Composition inhibitrice de protéases caractérisée en ce qu'elle comporte un principe actif constitué de molécules extraites de nacre ou de coquille de mollusque et ayant une masse moléculaire comprise entre 100 Da et 400 Da. 2. Procédé d'extraction de molécules inhibitrices de protéases caractérisé en ce qu'il comporte les étapes d'extraire des molécules à partir d'une poudre de nacre ou de coquille de mollusque au moyen d'une solution aqueuse, de purifier l'extrait obtenu selon des fractions de différents poids moléculaires, et de sélectionner des fractions ayant une activité inhibitrice de protéases. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la solution aqueuse comprend de 0 à 80 %, de préférence 40 à 60 % de solvant organique. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le solvant organique est choisi dans le groupe comprenant l'éthanol, l'isopropanol, l'acétone et le n- butanol, de préférence l'isopropanol. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de réaliser un extrait sec initial à partir de l'extrait obtenu lors de l'extrac- tion, et de purifier l'extrait sec initial selon trois étapes de purification successives en utilisant une colonne chromatographique selon les conditions suivantes : Etape 1 - réaliser à partir de l'extrait sec initial une solution à 10 mg/ml d'extrait sec dans un mé- lange de 9 volumes d'eau et un volume de solvant organique, réaliser une élution avec un éluant A comprenant un mélange à 0,1% d'acide trifluoroacétique dans de l'eau pure, et un éluant B comprenant un mélange à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'acétonitrile et sé- 8 lectionner les fractions pour une élution comprise entre 5 % et 6 %, Etape 2 - à partir d'une fraction sélectionnée, réaliser une solution à 20 mg/ml d'extrait sec dans un mélange de 9 volumes d'eau et un volume de solvant organique, démarrer une élution à un débit d'éluant égal à environ un quart d'un débit de l'étape 1 avec un éluant A comprenant une solution à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'eau pure et un éluant B comprenant un mélange à 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'acétonitrile et recueillir des fractions éluées à une fréquence deux fois plus élevée que dans l'étape 1, et sélectionner des fractions pour une élution comprise entre 5 % et 6 %. Etape 3 - réaliser à partir d'une fraction sélec- tionnée à l'étape 2 une solution de 20 mg/ml d'extrait sec dans un mélange de neuf volumes d'eau et un volume de solvant organique, démarrer une élution avec un éluant A comprenant un mélange de 95 % d'acétate de triétylamine 100 mM, et de 5 % d'acétonitrile ; et un éluant B compre- nant un mélange de 5 % d'acétate de triétylamine 100 mM, et de 95 % d'acétonitrile, et sélectionner des fractions ayant une élution comprise entre 7 % et 9 %. 6. Procédé selon la revendication 58, caractérisé en ce que l'étape 3 est réalisée avec des éluants à un pH7.